CN112812184A - FcγRIIb特异性Fc抗体 - Google Patents

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井川智之
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Abstract

本发明的课题在于提供：与亲本多肽相比含有下述Fc区的多肽，该Fc区与FcγRIIa的遗传多态性即H型、R型的任一种的结合活性维持或降低，且与FcγRIIb的结合活性增强；含有该多肽的药物组合物；含该药物组合物的免疫炎性疾病的治疗剂或预防剂；以及它们的制造方法；进一步提供与任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性维持或降低且与FcγRIIb的结合活性增强的方法。具体来说，发现了含有抗体Fc区的多肽，该Fc区含有EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变、EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变，该多肽与FcγRIIb的结合活性增强，与FcγRIIa的遗传多态性即H型、R型的任一种的结合活性均维持或降低。进一步发现含有抗体Fc区的多肽，该Fc区含有EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变以及其它改变，该多肽与FcγRIIb的结合活性增强，与H型和R型中任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性均维持或降低。

Description

FcγRIIb特异性Fc抗体
本申请是国际申请号PCT/JP2012/054624，国际申请日2012年2月24日，中国申请号201280020170.5，发明名称为“FcγRIIb特异性Fc抗体”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及：与亲本多肽相比含有IgG Fc区的多肽，通过向该Fc区导入氨基酸置换，其与FcγRIIa中EU编号第131位氨基酸为His的H型和为Arg的R型中任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性维持或降低，并且与FcγRIIb的结合活性增强；含有该多肽的药物组合物；含有该多肽的免疫炎性疾病的治疗剂或预防剂；以及它们的制造方法。本发明还涉及：与亲本多肽相比，维持或降低与FcγRIIa中EU编号第131位氨基酸为His的H型和为Arg的R型的任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性，并且增强与FcγRIIb的结合活性的方法；以及在给予生物体时，与亲本多肽相比，抑制抗体的产生的方法。本发明进一步涉及：制造制造多肽的方法，该多肽与亲本多肽相比，与FcγRIIa中第131位氨基酸为His的H型和为Arg的R型的任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性维持或降低，并且与FcγRIIb的结合活性增强；以及制造在给予生物体时与亲本多肽相比抑制抗体产生的多肽的方法。
背景技术
抗体在血液中的稳定性高、副作用也少，因此作为药物受到关注(非专利文献1、非专利文献2)。目前市场销售的抗体药物几乎都是人IgG1亚类的抗体。已知IgG类抗体的功能之一是抗体依赖性细胞毒活性(以下标记为ADCC活性)(非专利文献3)。抗体为了发挥ADCC活性，抗体的Fc区必须与存在于杀伤细胞、天然杀伤细胞、活化的巨噬细胞等效应细胞表面上的抗体结合受体Fcγ受体(以下标记为FcγR)结合。
在人的FcγR蛋白质家族中已报告的有FcγRIa(CD64A)、FcγRIIa(CD32A)、FcγRIIb(CD32B)、FcγRIIIa(CD16A)、FcγRIIIb(CD16B)的同种型，还报告了各自的同种异型(非专利文献7)。FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa具有免疫活性的功能，因此被称为活性型FcγR，FcγRIIb具有免疫抑制功能，被称为抑制型FcγR(非专利文献8)。
关于Fc区与FcγR的结合，显示抗体的铰链区和CH2结构域内的几个氨基酸残基、以及连接于与CH2结构域结合的EU编号第297位的Asn上的糖链是重要的(非专利文献4、非专利文献5、非专利文献6)。以向这些位置导入了突变所得的抗体为中心，目前研究了具有各种FcγR结合特性的变体，得到了与活性型FcγR具有更高的结合活性的Fc区变体(专利文献1、专利文献2、专利文献3、专利文献4)。
活性型FcγR通过免疫复合物进行交联，则引起胞内结构域或作为相互作用对象的FcR共同γ链中所含的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的磷酸化，激活信号转导物质SYK，引发激活信号级联，由此引发炎性免疫反应(非专利文献9)。
FcγRIIb是在B细胞中表达的唯一的FcγR(非专利文献10)。有报告通过抗体的Fc区与FcγRIIb相互作用来抑制B细胞的初次免疫(非专利文献11)。还有报告称：B细胞上的FcγRIIb和B细胞受体(BCR)经由血液中的免疫复合物进行交联，则B细胞的活化受到抑制，B细胞的抗体产生受到抑制(非专利文献12)。在由该BCR和FcγRIIb介导的免疫抑制性信号转导中，FcγRIIb的胞内结构域中所含的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)是必需的(非专利文献13、非专利文献14)。有信号进入、ITIM被磷酸化，则募集含SH2的肌醇多磷酸5-磷酸酶(SHIP)，抑制其它的活性型FcγR的信号级联的转导，抑制炎性免疫反应(非专利文献15)。还有报告称，即使只FcγRIIb缔合，BCR非依赖性地，在不使产生IgM的B细胞凋亡的情况下，也瞬时抑制B细胞的增殖和BCR交联导致的钙流入(非专利文献16)。
FcγRIIb也在树突细胞、巨噬细胞、活化中性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞中表达。在这些细胞中，FcγRIIb也抑制吞噬作用或炎性细胞因子的释放等的活性型FcγR的功能，抑制炎性免疫反应(非专利文献8)。
关于FcγRIIb的免疫抑制性功能的重要性，目前已通过使用FcγRIIb敲除小鼠的研究阐明。有如下的报告：在FcγRIIb敲除小鼠中，体液免疫未受到适当控制(非专利文献17)，对胶原诱导关节炎(CIA)的感受性增加(非专利文献18)，呈现狼疮样的症状，或呈现肺出血肾炎综合征样的症状(非专利文献19)。
还有报告称，FcγRIIb的调节缺陷与人的自身免疫疾病相关。例如有报告指出：FcγRIIb的启动子区或细胞跨膜区的遗传多态性与系统性红斑狼疮(SLE)的发病频率相关(非专利文献20、非专利文献21、非专利文献22、非专利文献23、非专利文献24)、或SLE患者的B细胞表面的FcγRIIb的表达低下(非专利文献25、非专利文献26)。
如上所述，由小鼠模型和临床上的认识可以认为，以与B细胞的关系为中心，FcγRIIb发挥着控制自身免疫疾病、炎性疾病的作用，是有望用于控制自身免疫疾病、炎性疾病的靶分子。
已知作为市售的抗体药物主要使用的IgG1不仅与FcγRIIb，还与活性型FcγR强力结合(非专利文献27)。考虑了通过利用与FcγRIIb的结合增强，或者与活性型相比、与FcγRIIb的结合选择性提高的Fc区，开发与IgG1相比具有免疫抑制性性质的抗体药物的可能性。例如暗示了通过利用具有与BCR结合的可变区和与FcγRIIb的结合增强的Fc的抗体，抑制B细胞活化的可能性(非专利文献28)。B细胞上的FcγRIIb和与B细胞受体结合的IgE发生交联，由此，抑制了B细胞向浆细胞的分化，结果抑制IgE产生，在移植了人PBMC的小鼠中，可维持人IgG或IgM浓度，但人IgE浓度降低(非专利文献29)。还有报告指出：不仅是IgE，在使形成B细胞受体复合物的CD79和FcγRIIb通过抗体交联时，体外B细胞的增殖受到抑制，在胶原关节炎模型中症状缓和(非专利文献30)。
有人报告，除B细胞以外，使用将与作为IgE的受体的FcεRI结合的IgE的Fc部分、和与FcγRIIb的结合增强的IgG的Fc部分融合而成的分子，使浆细胞上的FcεRI与FcγRIIb交联，从而引起FcγRIIb的磷酸化，抑制FcεRI依赖性的钙的流入，这暗示：通过增强与FcγRIIb的结合，可以抑制FcγRIIb刺激介导的脱粒(非专利文献31)。
由此暗示，具有与FcγRIIb的结合活性提高的Fc的抗体有望作为自身免疫疾病等炎性疾病的治疗药物。
另外暗示，与FcγRIIb结合增强的变体除有望作为自身免疫疾病等炎性疾病的治疗剂之外，还有望作为癌症治疗剂。目前已经阐明，FcγRIIb在抗TNF受体家族的激动性抗体的激动活性中也发挥重要作用。具体来说，在TNF受体家族中所含的CD40、DR4、DR5、CD30、CD137的抗体的激动活性中，暗示与FcγRIIb的相互作用是必需的(非专利文献32、33、34、35、36、37)。非专利文献32中，通过使用与FcγRIIb的结合增强的抗体，显示抗CD40抗体的抗肿瘤效果增强。由此可以期待，与FcγRIIb的结合增强的抗体具有增强以抗TNF受体家族的抗体为代表的激动性抗体的激动作用的效果。
目前已报告了具有与FcγRIIb的结合活性提高的Fc的抗体(非专利文献28)。该文献中，通过在抗体的Fc区加入S267E/L328F、G236D/S267E、S239D/S267E等改变，使其与FcγRIIb的结合活性提高。其中，导入了S267E/L328F突变的抗体与FcγRIIb的结合最强，且与FcγRIa和FcγRIIa的H型的结合维持为与天然型IgG1同等程度。但是根据另外的报告，对于该改变，与FcγRIIa的R型的结合和与FcγRIIb的结合是相同程度地增强数百倍，与FcγRIIa的R型相比时，与FcγRIIb的结合选择性并未提高(专利文献5)。
即使与FcγRIIb的结合比IgG1增强，但对于不表达FcγRIIb而是表达FcγRIIa的血小板等细胞(非专利文献8)，可以认为没有与FcγRIIb的结合增强的效果，只是与FcγRIIa的结合增强的效果产生影响。例如，已知在给予VEGF抗体贝伐单抗(bevacizumab)的患者组中，血栓栓塞的风险升高(非专利文献38)。还在抗CD40配体的抗体的临床开发试验中同样观察到血栓栓塞，临床试验终止(非专利文献39)。在这些抗体中任一种的情况下，使用动物模型等的之后的研究暗示，通过所给予的抗体与血小板上的FcγRIIa结合，使血小板凝集，形成血栓(非专利文献40、非专利文献41)。还有报告指出：在自身免疫疾病之一的系统性红斑狼疮中，通过FcγRIIa依赖性机理，血小板活化，血小板的活化与严重程度相关(非专利文献42)。对于上述血栓栓塞发病风险原本较高的患者，给予与FcγRIIa的结合增强的抗体，即使与FcγRIIb的结合增强，也使血栓栓塞的发病风险进一步提高，极为危险。
还报告了，对于与FcγRIIa的结合增强的抗体，巨噬细胞介导的抗体依赖性吞噬活性(ADCP)增强(非专利文献43)。抗体的抗原被巨噬细胞吞噬，同时抗体自身也被吞噬，这种情况下，可以认为来自该抗体的肽片段也进行抗原呈递，抗原性变高，使得抗抗体的抗体(抗抗体)的产生风险升高。即，如果与FcγRIIa的结合增强，则抗抗体的抗体的产生风险提高，作为药物的价值显著降低。
即，如果与FcγRIIa的结合增强，则血小板凝集介导的血栓形成风险升高，抗原性也变高，抗抗体产生的风险提高，由于这一点，作为药物的价值显著降低。
从上述观点来看，对于之前的与FcγRIIb的结合增强的Fc，与天然型IgG1相比，与FcγRIIaR型的结合显著增强，因此作为用于保有FcγRIIaR型的患者的药物，其价值显著降低。FcγRIIa的H型和R型在高加索人和非裔美洲人中以大致相同程度的频率被观察到(非专利文献44、非专利文献45)。由此，将该Fc用于自身免疫疾病的治疗时，享受药物效果的同时可安全利用的患者的数目是有限的。
还报告了，在缺失FcγRIIb的树突细胞或者由于抗FcγRIIb抗体而FcγRIIb与抗体Fc部分的相互作用受抑制的树突细胞中，树突细胞的成熟自发发生(非专利文献46、非专利文献47)。该报告暗示，在未发生炎症等的稳定状态下，FcγRIIb主动地抑制树突细胞的成熟。除FcγRIIb之外，树突细胞表面还表达FcγRIIa，由此可以认为，即使例如与抑制型FcγRIIb的结合增强，如果与活性型FcγRIIa等的结合也增强，那么结果仍是促进树突细胞的成熟。即，可以认为，不仅与FcγRIIb的结合活性，而且改善与FcγRIIb的结合活性相对于与FcγRIIa的结合活性的比例，在使抗体产生免疫抑制性作用方面是重要的。
由此，在考虑开发利用FcγRIIb结合介导的免疫抑制性作用的药物方面，合乎需要的Fc不仅增强与FcγRIIb的结合活性，而且将与FcγRIIaH型、R型中任意遗传多态性的结合维持为与天然型IgG1相同程度或减弱至较低。
与此相对，目前已报告了通过在Fc区导入氨基酸改变，使其与FcγRIIb的结合选择性升高的实例(非专利文献48)。但是该文献中报告的据称对FcγRIIb的选择性改善的任何变体与天然型IgG1相比，与FcγRIIb的结合均降低。因此可以认为，这些变体实际上难以引起FcγRIIb介导的免疫抑制性反应至IgG1以上。
另外，之前所述的激动性抗体中FcγRIIb也发挥重要作用，因此期望通过增强其结合活性来增强激动活性。但是，与FcγRIIa的结合也同样增强，使得非所需的ADCC活性或ADCP活性等得到发挥，可能出现副作用。从上述角度考虑，优选可以选择性增强与FcγRIIb的结合活性。
由这些结果可知，在开发利用FcγRIIb的、以自身免疫疾病治疗或癌症治疗为目标的抗体药物时，与天然型IgG相比，维持或降低与FcγRIIa的任意遗传多态性的结合活性，且增强与FcγRIIb的结合活性是重要的。但是，FcγRIIb与活性型FcγR之一的FcγRIIa，胞外区序列有93％同一性，结构极为类似，并且作为遗传多态性，FcγRIIa中存在第131位氨基酸为His的H型和为Arg的R型，与抗体的相互作用各不相同(非专利文献49)。因此认为，在制作与FcγRIIb选择性结合的Fc区时，最困难的课题是赋予抗体Fc区与FcγRIIb的结合活性选择性提高的性质，即区分这些类似的序列，不增加或降低与FcγRIIa的各遗传多态性的结合活性，而增加与FcγRIIb的结合活性，目前尚未获得对FcγRIIb具有充分选择性的变体。专利文献5中也报告了与FcγRIIb的结合活性增强的变体，但其程度弱，期望开发具有上述性质的变体。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2000/42072
专利文献2：WO 2006/019447
专利文献3：WO 2004/99249
专利文献4：WO 2004/29207
专利文献5：US2009/0136485
非专利文献
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非专利文献4：J Biol Chem,276(19),16478-16483,2001
非专利文献5：Eur J Immunol,23(5),1098-1104,1993
非专利文献6：Immunology,86(2),319-324,1995
非专利文献7：Immunol Lett,82(1-2),57-65,2002
非专利文献8：Nat Rev Immunol,10(5),328-343,2010
非专利文献9：Nat Rev Immunol,8(1),34-47,2008
非专利文献10：Eur J Immunol,19(8),1379-1385,1989
非专利文献11：J Exp Med,129(6),1183-1201,1969
非专利文献12：Immunol Lett,88(2),157-161,2003
非专利文献13：Science,256(5065),1808-1812,1992
非专利文献14：Nature,368(6466),70-73,1994
非专利文献15：Science,290(5489),84-89,2000
非专利文献16:J Immunol,181(8),5350-5359 2008
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非专利文献33：Cancer Cell,19(1),101-113,2011
非专利文献34：J Clin Invest,2012Feb 13.pii:61226.doi:10.1172/JCI61226.in press(PMID:22326955)
非专利文献35：J Immunol,171(2),562-568,2003
非专利文献36：Blood,108(2),705-710,2006
非专利文献37：J Immunol,166(8),4891-4898,2001
非专利文献38:J Natl Cancer Inst,99(16),1232-1239,2007
非专利文献39：Arthritis Rheum,48(3),719-727,2003
非专利文献40：J Thromb Haemost,7(1),171-181,2008
非专利文献41：J Immunol,185(3),1577-1583,2010
非专利文献42：Sci Transl Med,2(47),47-63,2010
非专利文献43：Mol Cancer Ther,7(8),2517-2527,2008
非专利文献44：J Clin Invest,97(5),1348-1354,1996
非专利文献45：Arthritis Rheum,41(7),1181-1189,1998
非专利文献46：J Clin Invest,115(10),2914-2923,2005
非专利文献47：Proc Natl Acad Sci USA,102(8),2910-2915,2005
非专利文献48：Mol Immunol,40(9),585-593,2003
非专利文献49：J Exp Med,172,19-25,1990。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明鉴于上述情况而完成，其目的在于提供：与亲本多肽相比含有IgG Fc区的多肽，通过向该Fc区导入氨基酸置换，其与FcγRIIa中EU编号第131位氨基酸为His的H型和为Arg的R型中任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性维持或降低，并且与FcγRIIb的结合活性增强；含有该多肽的药物组合物；含有该多肽的免疫炎性疾病的治疗剂或预防剂；以及它们的制造方法。还在于提供：与亲本多肽相比，维持或降低与FcγRIIa中EU编号第131位氨基酸为His的H型和为Arg的R型中任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性，并且增强与FcγRIIb的结合活性的方法；以及在给予生物体时，与亲本多肽相比，抑制抗体的产生的方法。本发明进一步提供：制造多肽的方法，该多肽与亲本多肽相比，与FcγRIIa中第131位氨基酸为His的H型和为Arg的R型中任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性维持或降低，并且与FcγRIIb的结合活性增强；以及制造在给予生物体时与亲本多肽相比抑制抗体产生的多肽的方法。
解决问题的方法
本发明人对与亲本多肽相比含有Fc介导的与FcγRIIa的结合降低且与FcγRIIb的结合增强的Fc区的多肽进行了努力研究。结果本发明人发现：对于包含含有EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变或EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变的抗体Fc区的多肽，其与FcγRIIb的结合活性增强，与H型和R型中任意遗传多态性的FcγRIIa的Fc区介导的结合活性降低。还发现：对于包含含有EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变和其它几个改变的抗体Fc区的多肽，其与FcγRIIb的结合活性增强，与H型和R型中任意遗传多态性的FcγRIIa的Fc区介导的结合活性维持或降低。
即本发明涉及以下内容。
[1]多肽，该多肽是含有至少一个氨基酸发生改变的抗体Fc区的多肽变体，其中，该多肽与亲本多肽相比，与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性维持或降低，与FcγRIIb的结合活性增强，且[多肽变体对FcγRIIa(R型)的KD值]/[多肽变体对FcγRIIb的KD值]之值为1.2以上。
[2][1]的多肽，其中，[多肽变体对FcγRIIa(H型)的KD值]/[多肽变体对FcγRIIb的KD值]之值为4.2以上。
[3][1]或[2]的多肽，其中，[亲本多肽对FcγRIIb的KD值]/[多肽变体对FcγRIIb的KD值]之值为1.6以上。
[4][1]-[3]中任一项的多肽，其中，[多肽变体与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性中强的一方的KD值]/[亲本多肽与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性中强的一方的KD值]之值为0.7以上。
[5][1]-[4]中任一项的多肽，其中，该多肽与亲本多肽相比，与FcγRIIIa的结合活性维持或降低。
[6][1]-[5]中任一项的多肽，其中，该多肽与亲本多肽相比，与FcγRIa的结合活性维持或降低。
[7][1]-[6]中任一项的多肽，其中，氨基酸改变是EU编号第238位的Pro置换为Asp或EU编号第328位的Leu置换为Glu。
[8][1]-[7]中任一项的多肽，其中，氨基酸改变是选自以下的至少一个置换：EU编号第238位的Pro置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Trp、EU编号第237位的Gly置换为Phe、EU编号第267位的Ser置换为Val、EU编号第267位的Ser置换为Gln、EU编号第268位的His置换为Asn、EU编号第271位的Pro置换为Gly、EU编号第326位的Lys置换为Leu、EU编号第326位的Lys置换为Gln、EU编号第326位的Lys置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Met、EU编号第239位的Ser置换为Asp、EU编号第267位的Ser置换为Ala、EU编号第234位的Leu置换为Trp、EU编号第234位的Leu置换为Tyr、EU编号第237位的Gly置换为Ala、EU编号第237位的Gly置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Glu、EU编号第237位的Gly置换为Leu、EU编号第237位的Gly置换为Met、EU编号第237位的Gly置换为Tyr、EU编号第330位的Ala置换为Lys、EU编号第330位的Ala置换为Arg、EU编号第233位的Glu置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ser、EU编号第326位的Lys置换为Thr、EU编号第323位的Val置换为Ile、EU编号第323位的Val置换为Leu、EU编号第323位的Val置换为Met、EU编号第296位的Tyr置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ala、EU编号第326位的Lys置换为Asn、和EU编号第330位的Ala置换为Met。
[9][1]-[8]中任一项的多肽，其中，上述含有抗体Fc区的多肽为IgG抗体。
[10][1]-[8]中任一项的多肽，其中，上述含有抗体Fc区的多肽是Fc融合蛋白质分子。
[11]与亲本多肽相比，维持或降低含有抗体Fc区的多肽与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性且增强与FcγRIIb的结合活性的方法，该方法包括在该Fc区加入至少一个氨基酸改变，其中，该氨基酸改变是EU编号第238位的Pro置换为Asp或EU编号第328位的Leu置换为Glu。
[12]在给予生物体时，与亲本多肽相比，抑制抗含有抗体Fc区的多肽的抗体产生的方法，该方法包括在该Fc区中加入至少一个氨基酸改变，其中，该氨基酸改变是EU编号第238位的Pro置换为Asp或EU编号第328位的Leu置换为Glu。
[13][11]或[12]的方法，其中，氨基酸改变是选自以下的至少一个置换：EU编号第238位的Pro置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Trp、EU编号第237位的Gly置换为Phe、EU编号第267位的Ser置换为Val、EU编号第267位的Ser置换为Gln、EU编号第268位的His置换为Asn、EU编号第271位的Pro置换为Gly、EU编号第326位的Lys置换为Leu、EU编号第326位的Lys置换为Gln、EU编号第326位的Lys置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Met、EU编号第239位的Ser置换为Asp、EU编号第267位的Ser置换为Ala、EU编号第234位的Leu置换为Trp、EU编号第234位的Leu置换为Tyr、EU编号第237位的Gly置换为Ala、EU编号第237位的Gly置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Glu、EU编号第237位的Gly置换为Leu、EU编号第237位的Gly置换为Met、EU编号第237位的Gly置换为Tyr、EU编号第330位的Ala置换为Lys、EU编号第330位的Ala置换为Arg、EU编号第233位的Glu置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ser、EU编号第326位的Lys置换为Thr、EU编号第323位的Val置换为Ile、EU编号第323位的Val置换为Leu、EU编号第323位的Val置换为Met、EU编号第296位的Tyr置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ala、EU编号第326位的Lys置换为Asn、和EU编号第330位的Ala置换为Met。
[14][11]-[13]中任一项的方法，其中，上述含有抗体Fc区的多肽为IgG抗体。
[15][11]-[13]中任一项的方法，其中，上述含有抗体Fc区的多肽为Fc融合蛋白质分子。
[16]与亲本多肽相比，与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性维持或降低且与FcγRIIb的结合活性增强的含有抗体Fc区的多肽的制造方法，该方法包括在该Fc区加入至少一个氨基酸改变，其中，该氨基酸改变是EU编号第238位的Pro置换为Asp或EU编号第328位的Leu置换为Glu。
[17]在给予生物体时，与亲本多肽相比，抗含有抗体Fc区的多肽的抗体产生受抑制的该多肽的制造方法，该方法包括在该Fc区加入至少一个氨基酸改变，其中，该氨基酸改变是EU编号第238位的Pro置换为Asp或EU编号第328位的Leu置换为Glu。
[18][16]或[17]的方法，其中，氨基酸改变是选自以下的至少一个置换：EU编号第238位的Pro置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Trp、EU编号第237位的Gly置换为Phe、EU编号第267位的Ser置换为Val、EU编号第267位的Ser置换为Gln、EU编号第268位的His置换为Asn、EU编号第271位的Pro置换为Gly、EU编号第326位的Lys置换为Leu、EU编号第326位的Lys置换为Gln、EU编号第326位的Lys置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Met、EU编号第239位的Ser置换为Asp、EU编号第267位的Ser置换为Ala、EU编号第234位的Leu置换为Trp、EU编号第234位的Leu置换为Tyr、EU编号第237位的Gly置换为Ala、EU编号第237位的Gly置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Glu、EU编号第237位的Gly置换为Leu、EU编号第237位的Gly置换为Met、EU编号第237位的Gly置换为Tyr、EU编号第330位的Ala置换为Lys、EU编号第330位的Ala置换为Arg、EU编号第233位的Glu置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ser、EU编号第326位的Lys置换为Thr、EU编号第323位的Val置换为Ile、EU编号第323位的Val置换为Leu、EU编号第323位的Val置换为Met、EU编号第296位的Tyr置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ala、EU编号第326位的Lys置换为Asn、和EU编号第330位的Ala置换为Met。
[19][16]-[18]中任一项的方法，其中，上述含有抗体Fc区的多肽为IgG抗体。
[20][16]-[18]中任一项的方法，其中，上述含有抗体Fc区的多肽为Fc融合蛋白质分子。
[21]多肽，该多肽由[16]-[20]中任一项的方法制造。
[22]药物组合物，该药物组合物含有[1]-[10]、[21]中任一项的多肽。
[23]B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制剂，该活化抑制剂含有[1]-[10]、[21]中任一项的多肽。
[24]免疫炎性疾病的治疗剂或预防剂，其含有[1]-[10]、[21]中任一项的多肽。
[25][24]的治疗剂或预防剂，其中，免疫炎性疾病是自身免疫疾病，是被认为原因是产生抗自身抗原的抗体的疾病。
[26]疾病治疗剂，该疾病治疗剂含有[1]-[10]、[21]中任一项的多肽，其中，该疾病是生物体所需蛋白质缺乏的疾病。
[27]抗病毒剂，该抗病毒剂含有[1]-[10]、[21]中任一项的多肽。
本发明还涉及免疫炎性疾病的治疗方法或预防方法，所述方法包括将本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽给予对象的步骤。本发明还涉及用于本发明的治疗方法或预防方法的试剂盒，该试剂盒含有本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽、或本发明的药物组合物。本发明还涉及本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽在免疫炎性疾病的治疗剂或预防剂的制造中的应用。本发明还涉及用于本发明的治疗方法或预防方法的本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽。本发明还涉及B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制方法，该方法包括将本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽给予对象的步骤。本发明还涉及用于本发明的抑制方法的试剂盒，该试剂盒含有本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽、或本发明的药物组合物。本发明还涉及本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽在B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化抑制剂的制造中的应用。本发明还涉及用于本发明的抑制方法的本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽。本发明还涉及生物体所需蛋白质缺乏的疾病的治疗方法，该方法包括将本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽给予对象的步骤。本发明还涉及用于本发明的治疗方法的试剂盒，该试剂盒含有本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽、或本发明的药物组合物。本发明还涉及本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽在生物体所需蛋白质缺乏的疾病的治疗剂的制造中的应用。本发明还涉及用于本发明的治疗方法的本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽。本发明还涉及病毒的抑制方法，该方法包括将本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽给予对象的步骤。本发明还涉及用于本发明的抑制方法的试剂盒，该试剂盒含有本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽、或本发明的药物组合物。本发明还涉及本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽在抗病毒剂的制造中的应用。本发明还涉及用于本发明的抑制方法的本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽。
发明效果
根据本发明，提供与亲本多肽相比含有下述Fc区的多肽，其与H型和R型中任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性维持或降低，并且与FcγRIIb的结合活性增强。通过使用相对于FcγRIIa的任意遗传多态性(H型、R型)与FcγRIIb的结合选择性增强的该多肽，对于具有R型和H型中任意遗传多态性的患者，均可以转导FcγRIIb的ITIM磷酸化介导的炎性免疫反应的抑制性信号。还可通过赋予抗体Fc选择性结合FcγRIIb的性质，通过FcγRIIb介导的免疫抑制性作用，抑制抗抗体的产生。
附图简述
图1是表示与FcγRIa和FcγRIIb的结合比较的图，对EU编号第238位的Pro置换为Asp的抗体和EU编号第328位的Leu置换为Glu的抗体的结合进行了标记。“突变A”是指EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，“突变B”是指EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变。
图2是表示与FcγRIIa H型和FcγRIIb的结合比较的图，对EU编号第238位的Pro置换为Asp的抗体和EU编号第328位的Leu置换为Glu的抗体的结合进行了标记。“突变A”是指EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，“突变B”是指EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变。
图3是表示与FcγRIIa R型和FcγRIIb的结合比较的图，对EU编号第238位的Pro置换为Asp的抗体和EU编号第328位的Leu置换为Glu的抗体的结合进行了标记。“突变A”是指EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，“突变B”是指EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变。
图4是表示与FcγRIIIa和FcγRIIb的结合比较的图，对EU编号第238位的Pro置换为Asp的抗体和EU编号第328位的Leu置换为Glu的抗体的结合进行了标记。“突变A”是指EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，“突变B”是指EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变。
图5表示构成IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的Fc区的氨基酸残基与EU编号(本说明书中也称为EU索引)的关系。
图6横轴表示各PD变体与FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各PD变体与FcγRIIa R型的相对结合活性的值。将各PD变体与各FcγR的结合量的值，除以作为对照的导入改变前的抗体IL6R-F652(EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变Fc)与各FcγR的结合量的值，再扩大100倍，得到的值作为各PD变体与各FcγR的相对结合活性的值。图中的点F652表示IL6R-F652的值。
图7纵轴表示将各改变导入不具有P238D改变的GpH7-B3所得的变体与FcγRIIb的相对结合活性的值，横轴表示将各改变导入具有P238D改变的IL6R-F652所得的变体与FcγRIIb的相对结合活性的值。需要说明的是，将各变体与FcγRIIb的结合量的值除以导入改变前的抗体与FcγRIIb的结合量的值，再扩大100倍，得到的值作为相对结合活性的值。这里，导入到不具有P238D的GpH7-B3时，与导入到具有P238D的IL6R-F652时一样，发挥与FcγRIIb的结合增强效果的改变包含在区域A中；导入到不具有P238D的GpH7-B3时发挥与FcγRIIb的结合增强效果，但导入到具有P238D的IL6R-F652时不发挥与FcγRIIb的结合增强效果的改变包含在区域B中。
图8表示Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构。
图9表示通过基于Cα原子间距的最小二乘法将Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构和Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合物的模型结构相对于FcγR IIb胞外区以及FcCH2结构域A叠合的图。
图10表示对于Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构和Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合物的模型结构，在Fc CH2结构域A和Fc CH2结构域B各自单独的情况下通过基于Cα原子间距的最小二乘法进行叠合，比较P238D附近的详细结构的图。
图11是表示在Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构中，在Fc CH2结构域A的EU编号第237位的Gly主链和FcγRIIb的第160位Tyr之间可见氢键的图。
图12是表示在Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构中，在Fc CH2结构域B的EU编号第270位的Asp和FcγRIIb的第131位Arg之间可见静电相互作用的图。
图13横轴表示各2B变体与FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各2B变体与FcγRIIa R型的相对结合活性的值。将各2B变体与各FcγR的结合量的值，除以作为对照的导入改变前的抗体(EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变Fc)与各FcγR的结合量的值，再扩大100倍，得到的值作为各2B变体与各FcγR的相对结合活性的值。
图14是表示在Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构中，Fc链A的EU编号第233位Glu和FcγRIIb胞外区中其周边残基的图。
图15是表示在Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构中，Fc链A的EU编号第330位Ala和FcγRIIb胞外区中其周边残基的图。
图16是表示通过基于Cα原子间距的最小二乘法将Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物和Fc(WT)/FcγRIIIa胞外区复合物的晶体结构相对于Fc链B叠合后Fc链B的EU编号第271位Pro结构的图。
实施发明的方案
本发明提供与亲本多肽相比含有下述IgG Fc区的多肽，通过向该Fc区导入氨基酸置换，其与FcγRIIa的结合活性维持或降低，并且与FcγRIIb的结合活性增强。
更具体地说，提供：含有抗体Fc区的多肽，该抗体Fc区含有EU编号第238位的Pro置换为Asp或EU编号第328位的Leu置换为Glu；和含有抗体Fc区的多肽，该抗体Fc区含有EU编号第238位的Pro置换为Asp与几个特定的氨基酸置换的组合。并且本发明提供：与亲本多肽相比，维持或降低与任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性，且增强与FcγRIIb的结合活性的方法。本发明还提供：在给予生物体时，与亲本多肽相比，抑制抗体的产生的方法。
本发明中的多肽通常指具有10个氨基酸左右以上长度的肽以及蛋白质。通常是来自生物的多肽，但没有特别限定，例如可以是包含人工设计的序列的多肽。也可以是天然多肽或合成多肽、重组多肽等任意多肽。
Fcγ受体(本说明书中有时记为Fcγ受体或FcγR)是指可与IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体的Fc区结合的受体，实质上也指由Fcγ受体基因编码的蛋白质家族中的任何成员。对于人，该家族包括：含有同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc的FcγRI(CD64)；含有同种型FcγRIIa(包含同种异型H131(H型)和R131(R型))、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc的FcγRII(CD32)；以及含有同种型FcγRIIIa(包含同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包含同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)的FcγRIII(CD16)；以及任何未发现的人FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限于此。FcγR包括来自人、小鼠、大鼠、兔和猴的FcγR，但并不限于此，可以来自任何生物。小鼠FcγR类包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR类或FcγR同种型或同种异型，但并不限于此。这样的Fcγ受体的优选实例可举出：人FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16)和/或FcγRIIIB(CD16)。
FcγRI的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:1(NM_000566.3)和2(NP_000557.1)；
FcγRIIA的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:3(BC020823.1)和4(AAH20823.1)；
FcγRIIB的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:5(BC146678.1)和6(AAI46679.1)；
FcγRIIIA的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:7(BC033678.1)和8(AAH33678.1)；以及
FcγRIIIB的多核苷酸序列和氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:9(BC128562.1)和10(AAI28563.1)(括号内表示RefSeq登录号)。
需说明的是，FcγRIIa存在FcγRIIa的第131位氨基酸被置换为组氨酸(H型)或精氨酸(R型)的2种遗传多态性(J.Exp.Med,172:19-25,1990)。
本说明书中，“亲本多肽”是指作为本发明的含抗体Fc区的多肽的制作基础的多肽。即，是含有抗体Fc区的多肽，可以是该Fc区中的至少一个氨基酸发生改变之前的多肽。本发明中的亲本多肽例如可以是含有天然型IgG的Fc区的多肽，还可以是含有在天然型IgG中加入了本发明的氨基酸改变之外的改变得到的IgG的Fc区的多肽。
天然型IgG是指包含与天然存在的IgG相同的氨基酸序列，属于实质上由免疫球蛋白γ基因编码的抗体类的多肽。例如天然型人IgG是指天然型人IgG1、天然型人IgG2、天然型人IgG3、天然型人IgG4等。天然型IgG也包括由此天然产生的变体等。
天然型IgG的Fc区是指包含与以天然存在的IgG为起源的Fc区相同的氨基酸序列的Fc区。天然型IgG的Fc区如图5(SEQ ID NO:11-14)所示，例如是指以天然型人IgG1为起源的Fc区、以天然型人IgG2为起源的Fc区、以天然型人IgG3为起源的Fc区、以天然型人IgG4为起源的Fc区。天然型IgG的Fc区也包括由此天然产生的变体等。
本发明中，本发明的多肽或Fc区与各种FcγR的结合活性是增强或者是结合活性维持或降低，这例如可如本实施例所示，使用利用表面等离子体共振(SPR)现象的相互作用分析仪器BIACORE，根据由传感图谱的分析结果得到的解离常数(KD)值是降低或是增加来判断，其中，传感图谱是以各种FcγR作为被分析物，使其与传感芯片相互作用得到的，传感芯片上固定有抗体，或者是被A蛋白、L蛋白、A/G蛋白、G蛋白、抗λ链抗体、抗κ链抗体、抗原肽、抗原蛋白等捕获的抗体。或者也根据以下的值是降低或是增加来判断：以各种FcγR作为被分析物，使其与传感芯片上固定的或者被A蛋白、L蛋白、A/G蛋白、G蛋白、抗λ链抗体、抗κ链抗体、抗原肽、抗原蛋白等捕获的传感芯片上的抗体相互作用，将相互作用前后的传感图谱上共振单位(RU)值的变化量除以将抗体固定或捕获在传感芯片上前后的共振单位(RU)的变化量得到的值。还可以使用将FcγR直接固定在传感芯片上或者经由抗标签抗体等固定的传感芯片，以待评价的抗体等的试样作为被分析物进行相互作用得到传感图谱，根据由传感图谱的分析得到的解离常数(KD)值是降低或是增加来判断。或者以待评价的抗体等的试样作为被分析物，使其与将FcγR直接固定在传感芯片上或经由抗标签抗体等固定的传感芯片相互作用，根据相互作用前后的传感图谱的值的变化量是降低或是增加来判断。
具体来说，除了ELISA或FACS(荧光激活细胞分选术)之外，Fc区与Fcγ受体的结合活性还可以通过ALPHA筛选(放大发光接近匀相测定(Amplified Luminescent ProximityHomogeneous Assay))或利用表面等离子体共振(SPR)现象的BIACORE法等测定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2006)103(11):4005-4010)。
ALPHA筛选是通过使用供体和受体两种珠的ALPHA技术基于下述原理实施。与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子发生生物学相互作用，只在两种珠接近的状态时才可检测出发光信号。由激光激发的供体珠内的光敏剂将周边的氧转换为激发状态的单线态氧。单线态氧扩散到供体珠周边，到达相接近的受体珠，则引起珠内的化学发光反应，最终发出光。与供体珠结合的分子和与受体珠结合的分子不发生相互作用时，供体珠产生的单线态氧不到达受体珠，因此不引起化学发光反应。
例如，使生物素标记的多肽缔合物与供体珠结合，使谷胱甘肽S转移酶(GST)标记的Fcγ受体与受体珠结合。在竞争性的含有突变Fc区的多肽缔合物不存在下，含有野生型Fc区的多肽缔合物与Fcγ受体相互作用，产生520-620nm的信号。未标记的含有突变Fc区的多肽缔合物与含有野生型Fc区的多肽缔合物竞争与Fcγ受体之间的相互作用。通过对竞争的结果所表现出的荧光降低进行定量，可确定相对结合活性。使用Sulfo-NHS-生物素等将抗体等的多肽缔合物生物素化是公知的。将Fcγ受体用GST标记的方法可适当采用以下方法等：将编码Fcγ受体的多核苷酸与编码GST的多核苷酸框内融合，将由此得到的融合基因保持在可表达的载体上，在细胞等中表达，使用谷胱甘肽柱纯化。所得信号例如可使用GRAPHPAD PRISM(GraphPad，San Diego)等软件，通过拟合利用非线性回归分析的单一位点竞争(one-site competition)模型来适当分析。
将观察相互作用的物质的一方(配体)固定在传感芯片的金薄膜上，从传感芯片的背面照射光，使得在金薄膜与玻璃的界面发生全反射，反射光的一部分形成了反射强度降低的部分(SPR信号)。将观察相互作用的物质的另一方(被分析物)流过传感芯片的表面，被分析物与配体结合，则被固定的配体分子的质量增加，传感芯片表面的溶剂的折射率发生变化。由于该折射率的变化，SPR信号的位置发生位移(相反，如果结合解离，则信号的位置恢复)。Biacore系统是以上述位移量，即传感芯片表面的质量变化为纵轴，以质量的时间变化作为测定数据表示(传感图谱)。可由传感图谱求出被分析物与被捕获到传感芯片表面的配体的结合量。另外，由传感图谱的曲线可求出动力学参数：结合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)，由该常数之比求出解离常数(KD)。在BIACORE法中，也适合采用抑制测定法。抑制测定法的实例记载于Proc.Natl.Acad.Sci USA(2006)103(11):4005-4010。
与FcγR的结合活性降低的多肽是指：在使亲本多肽以及在亲本多肽的Fc区含有至少一个氨基酸改变的多肽(也称为多肽变体)的量本质上相同地进行测定时，以比亲本多肽本质上更弱的结合活性与FcγR结合。
例如，上述测定法测定的KD值中，KD值比(多肽变体的KD值/亲本多肽的KD值)优选为1.25以上、2以上、3以上。进一步优选5以上、10以上、100以上、1000以上、10000以上。
上述测定方法测定的KD值中，优选KD值增加1μM以上，进一步优选增加2μM以上、3μM以上、5μM以上、10μM以上、20μM以上、50μM以上、100μM以上。通过上述测定法测定的KD值中，优选KD值为0.0001μM以上，进一步优选为0.001μM以上、0.01μM以上、0.1μM以上、0.5μM以上、1μM以上、2μM以上、3μM以上、5μM以上、10μM以上、100μM以上、1000μM以上。
与FcγR的结合活性增强的多肽是指：在使亲本多肽的量和多肽变体的量本质上相同地进行测定时，以比亲本多肽本质上更强的结合活性与FcγR结合。
例如上述测定方法测定的KD值中，KD值比(亲本多肽的KD值/多肽变体的KD值)优选为1.25以上、2以上、3以上。进一步优选5以上、10以上、100以上、1000以上、10000以上。
上述测定法测定的KD值中，优选KD值降低0.001μM以上，进一步优选低0.01μM、0.1μM、1μM以上、2μM以上、3μM以上、5μM以上、10μM以上、20μM以上、50μM以上、100μM以上。
上述测定方法测定的KD值中，优选KD值为5μM以下，进一步优选为3μM以下、1μM以下、0.5μM以下、0.1μM以下、0.01μM以下、0.001μM以下、0.0001μM以下。
维持与FcγR的结合活性(得到维持)的多肽是指：在使亲本多肽和在亲本多肽的Fc区含有至少一个氨基酸改变的多肽(也称为多肽变体)的量本质上相同地进行测定时，以与亲本多肽相比没有本质变化的同等的结合活性与FcγR结合。
是否为与FcγRIIa的结合活性维持或降低且与FcγRIIb的结合活性增强的多肽，这可以通过使用根据上述实例求出的该多肽对FcγRIIa的KD值和该多肽对FcγRIIb的KD值来判断。例如以下情形：本发明的多肽对FcγRIIb的KD值比亲本多肽对FcγRIIb的KD值降低，本发明的多肽对FcγRIIa(R型、H型)的KD值比亲本多肽对FcγRIIa(R型、H型)的KD值增加或维持。还可以将根据上述实例求出的该多肽对FcγRIa的KD值、对FcγRIIIa的KD值适当组合来判断。
本发明中，与FcγRIIb的结合活性增强是指：例如在上述测定方法测定的KD值中，[亲本多肽的KD值]/[多肽变体的KD值]的KD值比优选为1.6以上、2以上、3以上，进一步优选5以上、10以上、20以上、30以上、50以上。
另外，与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性维持或降低是指：例如在上述测定方法测定的KD值中，[多肽变体与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性中强的一方的KD值]/[亲本多肽与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性中强的一方的KD值]的KD值比优选为0.7以上、1以上、2以上、3以上，进一步优选5以上、10以上、20以上、30以上、50以上。
本发明的多肽优选与FcγRIIa R型和FcγRIIa H型的结合活性维持或降低。更优选与FcγRIIa R型和FcγRIIa H型的结合活性维持或降低，与FcγRIIIa的结合活性维持或降低。进一步优选与FcγRIa的结合活性也维持或降低。
与FcγRIIIa或FcγRIa的结合活性维持或降低是指：例如在上述测定方法测定的KD值中，[多肽变体的KD值]/[亲本多肽的KD值]的KD值比优选为1以上、2以上、3以上，进一步优选5以上、10以上、20以上、30以上、50以上。
本发明的多肽是否为与FcγRIIa相比与FcγRIIb的结合选择性提高的多肽，这可以通过比较下述比值来判断：根据上述实例求出的本发明多肽对FcγRIIa的KD值和对FcγRIIb的KD值之比(对FcγRIIa的KD值/对FcγRIIb的KD值)，以及亲本多肽对FcγRIIa的KD值和对FcγRIIb的KD值之比(对FcγRIIa的KD值/对FcγRIIb的KD值)。具体来说，与亲本多肽相比，上述KD值比的值是本发明的多肽的大时，则可以判断，与亲本多肽相比，本发明的多肽与FcγRIIb相对于FcγRIIa的结合选择性提高。
作为FcγRIIa(R型)和FcγRIIb之间的结合选择性，例如在上述测定方法测定的KD值中，[多肽变体对FcγRIIa(R型)的KD值]/[多肽变体对FcγRIIb的KD值]的KD值比优选为1.2以上、2以上、3以上。进一步优选5以上、10以上、20以上、30以上。
作为FcγRIIa(H型)和FcγRIIb之间的结合选择性，例如在上述测定方法测定的KD值中，[多肽变体对FcγRIIa(H型)的KD值]/[多肽变体对FcγRIIb的KD值]的KD值比优选为4.2以上、5以上、10以上。进一步优选20以上、30以上、50以上、100以上、200以上。
本发明的多肽与各种FcγR的结合活性是维持、增强或降低，这也可以通过根据上述实例求出的各种FcγR与本发明多肽的结合量的增减来判断。这里，各种FcγR与多肽的结合量是指：使作为被分析物的各种FcγR与各多肽相互作用，将相互作用前后变化了的传感图谱中RU值的差除以在传感芯片上捕获多肽前后变化了的传感图谱中RU值的差得到的值。
本发明的多肽是否为与FcγRIIa(R型、H型)的结合活性维持或降低且与FcγRIIb的结合活性增强的多肽，这可以通过使用根据上述实例求出的该多肽与FcγRIIa的结合量和该多肽与FcγRIIb的结合量来判断。
例如以下情形：本发明的多肽与FcγRIIb的结合量比亲本多肽与FcγRIIb的结合量增加，本发明的多肽与FcγRIIa(R型、H型)的结合量比亲本多肽与FcγRIIa(R型、H型)的结合量同等(得到维持)、优选降低。也可以将根据上述实例求出的该多肽与FcγRIa的结合量、与FcγRIIIa的结合量适当组合来判断。
“Fc区”是指抗体分子中含有由铰链或其一部分、CH2、CH3结构域组成的片段的区。IgG类的Fc区是指EU编号(本说明书中也称为EU索引)(参照图5)的例如第226位半胱氨酸至C末端或者第230位的脯氨酸至C末端，但并不限于此。
对于Fc区，可优选通过将IgG1、IgG2、IgG3、IgG4单克隆抗体等用胃蛋白酶等蛋白质分解酶部分消化，然后再洗脱吸附于A蛋白柱上的流分来获得。所述蛋白质分解酶只要是通过适当设定pH等酶的反应条件，可限制性地消化全长抗体，产生Fab或F(ab’)2，就无特别限定，例如可例举胃蛋白酶或木瓜蛋白酶等。
本发明提供含有Fc区的抗体恒定区，相对于人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)，该Fc区含有EU编号第238位Pro置换为Asp的改变或者EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变。通过向人IgG导入EU编号第238位Pro置换为Asp的改变或者EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变，与亲本多肽相比，可提供与FcγRIa、FcγRIIIa和FcγRIIa的R型、H型中任意遗传多态性的结合活性维持或降低，且与FcγRIIb的结合活性增强的多肽。
本发明对于含有EU编号第238位Pro置换为Asp的改变或者EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变的人IgG，可以进一步加入另外的至少一个对Fc区的改变。这里，改变是指置换、缺失、添加、插入的任意一种或它们的组合。除这些改变之外，可进一步含有附加性的改变。附加性的改变例如可以从氨基酸置换、缺失或修饰等的任意一种或它们的组合中选择。例如可以加入与FcγRIIb的结合活性增强且与FcγRIIa(H型)和FcγRIIa(R型)的结合活性维持或降低的改变。通过加入上述改变，与FcγRIIa相比，与FcγRIIb的结合选择性提高。
其中，优选与FcγRIIa(R型)相比，与FcγRIIb的结合选择性提高的改变，进一步优选与FcγRIIa(H型)相比，与FcγRIIb的结合选择性提高的改变。作为上述改变，优选的氨基酸置换例如可举出：EU编号第237位的Gly置换为Trp的改变、EU编号第237位的Gly置换为Phe的改变、EU编号第238位的Pro置换为Phe的改变、EU编号第325位的Asn置换为Met的改变、EU编号第267位的Ser置换为Ile的改变、EU编号第328位的Leu置换为Asp的改变、EU编号第267位的Ser置换为Val的改变、EU编号第328位的Leu置换为Trp的改变、EU编号第267位的Ser置换为Gln的改变、EU编号第267位的Ser置换为Met的改变、EU编号第236位的Gly置换为Asp的改变、EU编号第327位的Ala置换为Asn的改变、EU编号第325位的Asn置换为Ser的改变、EU编号第235位的Leu置换为Tyr的改变、EU编号第266位的Val置换为Met的改变、EU编号第328位的Leu置换为Tyr的改变、EU编号第235位的Leu置换为Trp的改变、EU编号第235位的Leu置换为Phe的改变、EU编号第239位的Ser置换为Gly的改变、EU编号第327位的Ala置换为Glu的改变、EU编号第327位的Ala置换为Gly的改变、EU编号第238位的Pro置换为Leu的改变、EU编号第239位的Ser置换为Leu的改变、EU编号第328位的Leu置换为Thr的改变、EU编号第328位的Leu置换为Ser的改变、EU编号第328位的Leu置换为Met的改变、EU编号第331位的Pro置换为Trp的改变、EU编号第331位的Pro置换为Tyr的改变、EU编号第331位的Pro置换为Phe的改变、EU编号第327位的Ala置换为Asp的改变、EU编号第328位的Leu置换为Phe的改变、EU编号第271位的Pro置换为Leu的改变、EU编号第267位的Ser置换为Glu的改变、EU编号第328位的Leu置换为Ala的改变、EU编号第328位的Leu置换为Ile的改变、EU编号第328位的Leu置换为Gln的改变、EU编号第328位的Leu置换为Val的改变、EU编号第326位的Lys置换为Trp的改变、EU编号第334位的Lys置换为Arg的改变、EU编号第268位的His置换为Gly的改变、EU编号第268位的His置换为Asn的改变、EU编号第324位的Ser置换为Val的改变、EU编号第266位的Val置换为Leu的改变、EU编号第271位的Pro置换为Gly的改变、EU编号第332位的Ile置换为Phe的改变、EU编号第324位的Ser置换为Ile的改变、EU编号第333位的Glu置换为Pro的改变、EU编号第300位的Tyr置换为Asp的改变、EU编号第337位的Ser置换为Asp的改变、EU编号第300位的Tyr置换为Gln的改变、EU编号第335位的Thr置换为Asp的改变、EU编号第239位的Ser置换为Asn的改变、EU编号第326位的Lys置换为Leu的改变、EU编号第326位的Lys置换为Ile的改变、EU编号第239位的Ser置换为Glu的改变、EU编号第326位的Lys置换为Phe的改变、EU编号第326位的Lys置换为Val的改变、EU编号第326位的Lys置换为Tyr的改变、EU编号第267位的Ser置换为Asp的改变、EU编号第326位的Lys置换为Pro的改变、EU编号第326位的Lys置换为His的改变、EU编号第334位的Lys置换为Ala的改变、EU编号第334位的Lys置换为Trp的改变、EU编号第268位的His置换为Gln的改变、EU编号第326位的Lys置换为Gln的改变、EU编号第326位的Lys置换为Glu的改变、EU编号第326位的Lys置换为Met的改变、EU编号第266位的Val置换为Ile的改变、EU编号第334位的Lys置换为Glu的改变、EU编号第300位的Tyr置换为Glu的改变、EU编号第334位的Lys置换为Met的改变、EU编号第334位的Lys置换为Val的改变、EU编号第334位的Lys置换为Thr的改变、EU编号第334位的Lys置换为Ser的改变、EU编号第334位的Lys置换为His的改变、EU编号第334位的Lys置换为Phe的改变、EU编号第334位的Lys置换为Gln的改变、EU编号第334位的Lys置换为Pro的改变、EU编号第334位的Lys置换为Tyr的改变、EU编号第334位的Lys置换为Ile的改变、EU编号第295位的Gln置换为Leu的改变、EU编号第334位的Lys置换为Leu的改变、EU编号第334位的Lys置换为Asn的改变、EU编号第268位的His置换为Ala的改变、EU编号第239位的Ser置换为Asp的改变、EU编号第267位的Ser置换为Ala的改变、EU编号第234位的Leu置换为Trp的改变、EU编号第234位的Leu置换为Tyr的改变、EU编号第237位的Gly置换为Ala的改变、EU编号第237位的Gly置换为Asp的改变、EU编号第237位的Gly置换为Glu的改变、EU编号第237位的Gly置换为Leu的改变、EU编号第237位的Gly置换为Met的改变、EU编号第237位的Gly置换为Tyr的改变、EU编号第330位的Ala置换为Lys的改变、EU编号第330位的Ala置换为Arg的改变、EU编号第233位的Glu置换为Asp的改变、EU编号第268位的His置换为Asp的改变、EU编号第268位的His置换为Glu的改变、EU编号第326位的Lys置换为Asp的改变、EU编号第326位的Lys置换为Ser的改变、EU编号第326位的Lys置换为Thr的改变、EU编号第323位的Val置换为Ile的改变、EU编号第323位的Val置换为Leu的改变、EU编号第323位的Val置换为Met的改变、EU编号第296位的Tyr置换为Asp的改变、EU编号第326位的Lys置换为Ala的改变、EU编号第326位的Lys置换为Asn的改变、EU编号第330位的Ala置换为Met的改变。
这些改变中进一步优选的氨基酸置换例如可举出：EU编号第237位的Gly置换为Trp的改变、EU编号第237位的Gly置换为Phe的改变、EU编号第267位的Ser置换为Val的改变、EU编号第267位的Ser置换为Gln的改变、EU编号第268位的His置换为Asn的改变、EU编号第271位的Pro置换为Gly的改变、EU编号第326位的Lys置换为Leu的改变、EU编号第326位的Lys置换为Gln的改变、EU编号第326位的Lys置换为Glu的改变、EU编号第326位的Lys置换为Met的改变、EU编号第239位的Ser置换为Asp的改变、EU编号第267位的Ser置换为Ala的改变、EU编号第234位的Leu置换为Trp的改变、EU编号第234位的Leu置换为Tyr的改变、EU编号第237位的Gly置换为Ala的改变、EU编号第237位的Gly置换为Asp的改变、EU编号第237位的Gly置换为Glu的改变、EU编号第237位的Gly置换为Leu的改变、EU编号第237位的Gly置换为Met的改变、EU编号第237位的Gly置换为Tyr的改变、EU编号第330位的Ala置换为Lys的改变、EU编号第330位的Ala置换为Arg的改变、EU编号第233位的Glu置换为Asp的改变、EU编号第268位的His置换为Asp的改变、EU编号第268位的His置换为Glu的改变、EU编号第326位的Lys置换为Asp的改变、EU编号第326位的Lys置换为Ser的改变、EU编号第326位的Lys置换为Thr的改变、EU编号第323位的Val置换为Ile的改变、EU编号第323位的Val置换为Leu的改变、EU编号第323位的Val置换为Met的改变、EU编号第296位的Tyr置换为Asp的改变、EU编号第326位的Lys置换为Ala的改变、EU编号第326位的Lys置换为Asn的改变、EU编号第330位的Ala置换为Met的改变。
上述改变可以是1处，也可以是2处以上的组合。这样的改变中优选的实例可举出表6-7、表9-12所述的改变。
抗体恒定区部分可以加入例如与FcRn的结合活性提高的氨基酸置换(J.Immunol.2006Jan 1；176(1):346-56、J Biol Chem.2006Aug 18；281(33):23514-24、Int.Immunol.2006Dec、18(12):1759-69、Nat Biotechnol.2010Feb；28(2):157-9.、WO/2006/019447、WO/2006/053301、WO/2009/086320)、用于使抗体的异质性和稳定性提高的氨基酸置换(WO/2009/041613)。或者本发明也包括对本发明多肽赋予WO2011/122011、PCT/JP2011/072550所述的用于促进抗原消失的性质而得的多肽，或赋予WO2009/125825、PCT/JP2011/077619所述的用于与多个分子的抗原反复结合的性质而得的多肽。
本发明的多肽的优选实例可举出IgG抗体。使用IgG抗体作为抗体时，其恒定区的种类没有限定，可以使用IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等同种型(亚类)的IgG。本发明的IgG抗体优选人IgG，进一步优选人IgG1、IgG4，人IgG1和人IgG4的重链恒定区的氨基酸序列是公知的。作为人IgG1恒定区，由于遗传多态性所致的多个同种异型序列记载于Sequences ofProteins of Immunological Interest,NIH Publication No.91-3242，本发明中可以是其中任意一种。
<置换>
置换氨基酸残基时，其目的是通过置换为另外的氨基酸残基，例如对以下(a)-(c)几点进行改变。
(a)片层结构或螺旋结构区中的多肽的主链结构；
(b)靶部位的电荷或疏水性；或
(c)侧链的大小。
氨基酸残基根据一般侧链的特性，分成以下各组：
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；
(3)酸性：asp、glu；
(4)碱性：his、lys、arg；
(5)影响链的取向的残基：gly、pro；以及
(6)芳族性：trp、tyr、phe。
这些各组内的氨基酸残基的置换被称为保守性置换，而在其它组之间的氨基酸残基的置换被称为非保守性置换。本发明的置换可以是保守性置换，也可以是非保守性置换，还可以是保守性置换与非保守性置换的组合。
氨基酸序列的改变可根据本领域公知的各种方法制备。这些方法中，可通过部位特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh,T,Mizuno,T,Ogasahara,Y,和Nakagawa,M.(1995)Anoligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directedmutagenesis.Gene 152:271-275、Zoller,MJ,和Smith,M.(1983)Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.MethodsEnzymol.100:468-500、Kramer,W,Drutsa,V,Jansen,HW,Kramer,B,15Pflugfelder,M,和Fritz,HJ(1984)The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedmutation construction.Nucleic Acids Res.12:9441-9456、Kramer W,和Fritz HJ(1987)Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplexDNA Methods.Enzymol.154,350-367、Kunkel,TA(1985)Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U SA.82:488-492)、PCR突变法、盒突变法等方法进行，但不限于此。
本发明的氨基酸修饰包含翻译后修饰。具体的翻译后修饰可示出糖链的添加或缺失。例如在由SEQ ID NO:11所述的氨基酸序列组成的IgG1恒定区中，EU编号第297位的氨基酸残基可以用糖链修饰。进行修饰的糖链结构没有限定。通常，在真核细胞中表达的抗体在恒定区含有糖链修饰。因此，在以下细胞中表达的抗体通常是被一些糖链修饰。
·哺乳动物的抗体产生细胞
·用含有编码抗体的DNA的表达载体转化的真核细胞
这里示出的真核细胞包括酵母或动物细胞。例如CHO细胞或HEK293H细胞是用于含有编码抗体的DNA的表达载体转化的代表性的动物细胞。另一方面，在该位置没有糖链修饰的恒定区也包括在本发明的恒定区中。恒定区未被糖链修饰的抗体可以是将编码抗体的基因在大肠杆菌等原核细胞中表达获得。
更具体地说，例如可以是在Fc区的糖链上添加唾液酸(MAbs.2010Sep-Oct；2(5):519-27)。
<抗体>
本发明进一步提供含有上述任一项所述的氨基酸序列发生改变的Fc区的抗体。
本发明中的“抗体”术语以最广泛意义使用，只要显示所需生物学活性即可，包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、抗体变体、抗体片段、多特异性抗体(多重特异性抗体)(例如双特异性抗体(双重特异性抗体))、嵌合抗体、人源化抗体等任何的抗体。
对于本发明的抗体，抗原种类、抗体的来源等没有限定，可以是任何抗体。抗体的来源没有特别限定，可举出人抗体、小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体等。
制作抗体的方法是本领域技术人员熟知的，例如单克隆抗体可通过杂交瘤法(Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975))、重组法(美国专利第4,816,567号)制造。还可以从噬菌体抗体文库中分离(Clackson等人.,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991))。
人源化抗体也称为重构人抗体。具体来说，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中得到的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的常规基因重组方法也是已知的。具体来说，作为将小鼠的抗体的CDR移植到人的FR中的方法，例如重叠延伸PCR是公知的。
通过将编码3个CDR和4个FR连接而成的抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA以框内融合方式插入表达载体中，可制作人源化抗体表达用载体。将该重组载体导入宿主，建立重组细胞，然后培养该重组细胞，使编码该人源化抗体的DNA表达，由此使该人源化抗体在该培养细胞的培养物中产生(参照欧洲专利公开EP239400、国际公开WO1996/002576)。
还可以根据需要置换FR的氨基酸残基，使重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位。例如，应用在将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，可向FR中导入氨基酸序列的突变。
具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物(参照国际公开WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO 1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735)作为免疫动物，可以通过DNA免疫获得所需的人抗体。
还已知使用人抗体文库，通过淘选获取人抗体的技术。例如，人抗体的V区作为单链抗体(scFv)通过噬菌体展示法在噬菌体表面表达。可选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对所选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体的V区的DNA序列。确定了与抗原结合的scFv的DNA序列后，使该V区序列与所需的人抗体C区的序列框内融合，然后插入适当的表达载体，由此可制作表达载体。将该表达载体导入上述例举的优选的表达细胞中，使编码该人抗体的基因表达，由此可获得该人抗体。这些方法均已公知(参照国际公开WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/15388)。
构成本发明的抗体的可变区可以是识别任意抗原的可变区。
本说明书中，抗原没有特别限定，可以是任何抗原。抗原的实例例如可优选举出：配体(细胞因子、趋化因子等)、受体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫球蛋白和部分地含有免疫球蛋白的免疫复合物。
细胞因子的实例可举出：白细胞介素1-18、集落刺激因子(G-CSF、M-CSF、GM-CSF等)、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、生长因子(EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、TGF、HGF等)、肿瘤坏死因子(TNF-α、TNF-β)、淋巴毒素、促红细胞生成素、瘦蛋白、SCF、TPO、MCAF、BMP。
趋化因子的实例可举出CCL1-CCL28等的CC趋化因子、CXCL1-CXCL17等的CXC趋化因子、XCL1-XCL2等的C趋化因子、CX3CL1等的CX3C趋化因子。
受体的实例例如可举出：造血因子受体家族、细胞因子受体家族、酪氨酸激酶型受体家族、丝氨酸/苏氨酸激酶型受体家族、TNF受体家族、G蛋白偶联型受体家族、GPI锚型受体家族、酪氨酸磷酸酶型受体家族、粘着因子家族、激素受体家族等属于受体家族的受体等。这些属于受体家族的受体及其特征在很多文献中有记载，例如Cooke BA.,King RJB.,van der Molen HJ.ed.New Comprehesive Biochemistry Vol.18B“Hormones and theirActions Part II”pp.1-46(1988)Elsevier Science Publishers BV、Patthy(Cell(1990)61(1):13-14)、Ullrich等人.(Cell(1990)61(2):203-212)、Massagué(Cell(1992)69(6):1067-1070)、Miyajima等人.(Annu.Rev.Immunol.(1992)10:295-331)、Taga等人.(FASEBJ.(1992)6,3387-3396)、Fantl等人.(Annu.Rev.Biochem.(1993),62:453-481)、Smith等人.(Cell(1994)76(6):959-962)、Flower DR.(Biochim.Biophys.Acta(1999)1422(3):207-234)等。
属于上述受体家族的具体受体例如可优选举出：人或小鼠促红细胞生成素(EPO)受体(Blood(1990)76(1):31-35、Cell(1989)57(2):277-285)、人或小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1990)87(22):8702-8706、mG-CSFR、Cell(1990)61(2):341-350)、人或小鼠血小板生成素(TPO)受体(Proc Natl Acad Sci U S A.(1992)89(12):5640-5644、EMBO J.(1993)12(7):2645-53)、人或小鼠胰岛素受体(Nature(1985)313(6005):756-761)、人或小鼠Flt-3配体受体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1994)91(2):459-463)、人或小鼠血小板来源的生长因子(PDGF)受体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1988)85(10):3435-3439)、人或小鼠干扰素(IFN)-α、β受体(Cell(1990)60(2):225-234和Cell(1994)77(3):391-400)、人或小鼠瘦蛋白受体、人或小鼠生长激素(GH)受体、人或小鼠白细胞介素(IL)-10受体、人或小鼠胰岛素样生长因子(IGF)-I受体、人或小鼠白血病抑制因子(LIF)受体、人或小鼠睫状神经营养因子(CNTF)受体等。
癌抗原是伴随着细胞的恶化而表达的抗原，也称为肿瘤特异性抗原。细胞癌化时，出现在细胞表面或蛋白质分子上的异常的糖链也是癌抗原，也称为癌糖链抗原。癌抗原的实例例如可优选举出：作为上述受体属于GPI锚型受体家族、在以肝癌为代表的几种癌症中表达的GPC3(Int J Cancer.(2003)103(4):455-65),)、在以肺癌为代表的多种癌症中表达的EpCAM(Proc Natl Acad Sci USA.(1989)86(1):27-31)、CA19-9、CA15-3、唾液酸SSEA-1(SLX)等。
MHC抗原主要分类为MHC I类抗原和MHC II类抗原，MHC I类抗原包括HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-H，MHC II类抗原包括HLA-DR、-DQ、-DP。
分化抗原可包括CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130。
免疫球蛋白包括IgA、IgM、IgD、IgG、IgE。免疫复合物至少包含免疫球蛋白的任意成分。
其它的抗原可例举下述分子：17-IA、4-1BB、4Dc、6-keto-PGF1a、8-iso-PGF2a、8-oxo-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、活化素、活化素A、活化素AB、活化素B、活化素C、活化素RIA、活化素RIA ALK-2、活化素RIB ALK-4、活化素RIIA、活化素RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗剂、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、artemin、抗Id、ASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3整联蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨素、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a,OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、铃蟾肽、骨源性神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体调节因子(衰变加速因子)、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮缩血管肽受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸性粒细胞趋化因子1、EpCAM、ephrinB2/EphB4、EPO、ERCC、E-选择蛋白、ET-1、IIa因子、VII因子、VIIIc因子、IX因子、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、血纤蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵泡刺激素、fractalkine、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(myostatin)、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap or NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep Bgp120、类肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIV IIIB gp 120V3环、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5(αV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层粘连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜在TGF-1、潜在TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、lefty、Lewis-Y抗原、Lewis-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体生成素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、副中肾管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-钙粘蛋白、NCA90、NCAM、NCAM、中性溶酶、神经营养蛋白-3、-4或-6、neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙粘蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、C蛋白、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T细胞受体(例如T细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-βPan Specific、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK R FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFCR)、TNFRSF4(OX40 ACT35、TXGP1 R)、TNFRSF5(CD40 p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3 M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a连接蛋白、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA125、肿瘤相关抗原表达Lewis-Y相关糖、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙粘蛋白、VE-钙粘蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、von Willebrand因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、前激肽释放酶、RON、TMEM16F、SOD1、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、tau、VAP1、高分子量激肽原、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、B因子、D因子、H因子、备解素、硬化蛋白(sclerostin)、血纤蛋白原、血纤蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、V因子、Va因子、VII因子、VIIa因子、VIII因子、VIIIa因子、IX因子、IXa因子、X因子、Xa因子、XI因子、XIa因子、XII因子、XIIa因子、XIII因子、XIIIa因子、TFPI、抗凝血酶III、EPCR、血栓调节蛋白、TAPI、tPA、纤溶酶原、纤溶酶、PAI-1、PAI-2、GPC3、多配体聚糖-1、多配体聚糖-2、多配体聚糖-3、多配体聚糖-4、LPA、S1P以及激素和生长因子的受体。
对于构成可变区的氨基酸序列，只要维持其抗原结合活性，就可允许1或多个氨基酸残基的改变。使可变区的氨基酸序列改变时，改变的部位或改变的氨基酸数目没有特别限定。例如可以将存在于CDR和/或FR的氨基酸适当改变。使可变区的氨基酸改变时没有特别限定，优选维持结合活性，例如与改变前相比，优选具有50％以上、优选80％以上、进一步优选100％以上的结合活性。另外，可以通过氨基酸改变使结合活性升高，例如结合活性与改变前相比，可以是2倍、5倍、10倍等。本发明的抗体中，氨基酸序列的改变可以是氨基酸残基的置换、添加、缺失和修饰中的至少1种。
例如，可变区N末端的谷氨酰胺通过焦谷氨酰化而修饰为焦谷氨酸，这是本领域技术人员熟知的修饰。因此，当N末端为谷氨酰胺时，本发明的抗体重链包含谷氨酰胺被修饰为焦谷氨酸的可变区。
本发明的抗体的可变区可以是任意的序列，可以是小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、骆驼抗体以及将这些非人抗体人源化而成的人源化抗体、以及人抗体等任何来源的抗体的可变区。“人源化抗体”也称为重构人抗体，是将来自人以外的哺乳动物的抗体、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的CDR所得。鉴定CDR的方法是公知的(Kabat等人.,Sequence of Proteins of Immunological Interest(1987),NationalInstitute of Health,Bethesda,Md.；Chothia等人.,Nature(1989)342:877)。另外，其常规基因重组方法也是公知的(参照欧洲专利申请公开号EP125023号公报、WO96/02576号公报)。另外，对于这些抗体的可变区，为了改善与抗原的结合、药物动力学、稳定性、抗原性，可以导入各种氨基酸置换。本发明的抗体的可变区与抗原的结合具有pH依赖性，因此可以与抗原反复结合(WO2009/125825)。
抗体的轻链恒定区存在κ链和λ链类型的恒定区，可以是任何轻链恒定区。并且本发明中，轻链恒定区可以是进行了氨基酸置换、缺失、添加和/或插入等改变的轻链恒定区。
本发明的抗体的重链恒定区例如可以使用人IgG抗体的重链恒定区，优选为人IgG1抗体、人IgG4抗体的重链恒定区。
本发明的多肽可以与其它蛋白质、生理活性肽等结合，制成Fc融合蛋白质分子。
其它蛋白质、生理活性肽例如可举出受体、粘着分子、配体、酶，但并不限于这些。
本发明的Fc融合蛋白质分子的优选实例可举出使Fc结构域与结合靶标的受体蛋白融合所得的蛋白质，例如可举出TNFR-Fc融合蛋白质、IL1R-Fc融合蛋白质、VEGFR-Fc融合蛋白质、CTLA4-Fc融合蛋白质等(Nat Med.2003Jan；9(1):47-52、BioDrugs.2006；20(3):151-60)。另外，与本发明的多肽融合的蛋白质只要与靶分子结合即可，可以是任何分子，例如可举出：scFv分子(WO2005/037989)、单结构域抗体分子(WO2004/058821、WO2003/002609)、抗体样分子(Current Opinion in Biotechnology 2006,17:653-658、CurrentOpinion in Biotechnology 2007,18:1-10、Current Opinion in Structural Biology1997,7:463-469、Protein Science 2006,15:14-27)例如DARPins(WO2002/020565)、Affibody(WO1995/001937)、Avimer(WO2004/044011、WO2005/040229)、Adnectin(WO2002/032925)等。抗体和Fc融合蛋白质分子还可以是与多种靶分子或表位结合的多特异性抗体。
本发明的抗体也包括抗体修饰物。抗体修饰物的实例例如可举出：与聚乙二醇(PEG)或细胞毒性物质等各种分子结合的抗体。上述抗体修饰物可通过对本发明的抗体实施化学修饰获得。抗体修饰方法在该领域中已经建立。
并且，本发明的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体是指在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体，该表位可以存在于不同分子中，也可以存在于同一分子中。
本发明的多肽可按照本领域技术人员公知的方法制造。例如抗体可按照以下方法制作，但并不限于此。
表达编码抗体重链的DNA和编码抗体轻链的DNA，编码抗体重链的DNA是编码Fc区中的1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸的重链的DNA。编码Fc区中的1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸的重链的DNA例如可如下获得：获得编码天然型重链的DNA的Fc区部分，适当导入置换，使编码该Fc区中特定的氨基酸的密码子编码其它目标氨基酸。
另外，预先设计DNA，使其编码天然型重链的Fc区中的1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸的蛋白质，化学合成该DNA，由此也可以获得编码Fc区中的1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸的重链的DNA。氨基酸的置换部位、置换的种类没有特别限定。另外并不限于置换，也可以是缺失、添加、插入的任意一种或它们的组合。
另外，编码Fc区中1或多个氨基酸残基被置换为其它目标氨基酸的重链的DNA可以分成部分DNA来制造。部分DNA的组合例如可举出：编码可变区的DNA与编码恒定区的DNA，或者编码Fab区的DNA与编码Fc区的DNA等，但并不限于这些组合。编码轻链的DNA也同样可以分成部分DNA来制造。
表达上述DNA的方法可举出以下方法。例如，将编码重链可变区的DNA与编码重链恒定区的DNA一起掺入表达载体中，构建重链表达载体。同样，将编码轻链可变区的DNA与编码轻链恒定区的DNA一起掺入到表达载体中，构建轻链表达载体。也可以将这些重链、轻链的基因掺入到单一的载体中。
将编码目标抗体的DNA掺入到表达载体中时，以在表达控制区例如增强子、启动子的控制下进行表达的方式掺入表达载体中。接着，用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。此时，可以使用适当的宿主与表达载体的组合。
载体的实例可举出：M13载体、pUC载体、pBR322、pBluescript和pCR-Script等。另外，以cDNA的亚克隆、切除为目的时，除上述载体之外，例如还可以使用pGEM-T、pDIRECT、pT7等。
在生产本发明的多肽的目的中使用载体时，表达载体特别有用。作为表达载体，例如在宿主为JM109、DH5α、HB101、XL1-Blue等大肠杆菌时，具有可在大肠杆菌中高效表达的启动子是不可缺少的，例如lacZ启动子(Ward等人,Nature(1989)341:544-546；FASEB J.(1992)6:2422-2427；其全文通过参照结合到本说明书中)、araB启动子(Better等人,Science(1988)240:1041-1043，其全文通过参照结合到本说明书中)或T7启动子等。除上述载体之外，这样的载体还可举出pGEX-5X-1(Pharmacia)、“QIAexpress system”(QIAGEN)、pEGFP或pET(这种情况下，宿主优选为表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。
载体中还可以含有用于多肽分泌的信号序列。作为用于多肽分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei,S.P.等人J.Bacteriol.(1987)20169:4379，其全文通过参照结合到本说明书中)。载体向宿主细胞的导入例如可以采用脂质转染法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法进行。
除大肠杆菌表达载体之外，例如用于制造本发明的多肽的载体可举出：来自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)或pEGF-BOS(Nucleic Acids.Res.1990,18(17):p5322，其全文通过参照结合到本说明书中)、pEF、pCDM8)，来自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(Gibco-BRL)、pBacPAK8)，来自植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)，来自动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)，来自反转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)，来自酵母的表达载体(例如“Pichia Expression Kit”(Invitrogen)、pNV11、SP-Q01)，来自枯草杆菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。
以在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中的表达为目的时，具有在细胞内表达所必需的启动子是不可缺少的，例如SV40启动子(Mulligan等人.,Nature(1979)277,108，其全文通过参照结合到本说明书中)、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人,Nucleic Acids Res.(1980)18,5322，其全文通过参照结合到本说明书中)、CAG启动子(Gene.(1991)108,193，其全文通过参照结合到本说明书中)、CMV启动子等，进一步优选具有用于筛选转化细胞的基因(例如可通过药物(新霉素、G418等)判别的耐药性基因)。具有上述特性的载体例如可举出：pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。
此外，以稳定表达基因和扩增细胞内的基因拷贝数目为目的时，可举出以下方法：在核酸合成途径缺失的CHO细胞中导入具有补偿该缺失的DHFR基因的载体(例如pCHOI等)，通过氨甲蝶呤(MTX)扩增；另外，以基因的瞬时表达为目的时，可以举出以下方法：使用在染色体上具有表达SV40 T抗原的基因的COS细胞，用具有SV40的复制起点的载体(pcD等)进行转化。复制起点还可以使用来自多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。并且，为了在宿主细胞体系内扩增基因拷贝数目，表达载体可以含有氨基葡糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志物。
抗体的回收例如可通过培养转化的细胞，然后从分子转化的细胞的细胞内或培养液分离来进行。对于抗体的分离、纯化，可以将离心、硫酸铵分级分离、盐析、超滤、1q、FcRn、A蛋白、G蛋白柱、亲和柱色谱、离子交换色谱、凝胶过滤色谱等方法适当组合进行。
此外，本发明提供含有抗体Fc区的多肽的制造方法，该多肽与亲本多肽相比，与FcγRIIa的结合活性维持或降低，且与FcγRIIb的结合活性增强，该方法包括在该Fc区加入至少一个氨基酸改变。
例如可举出包括以下步骤的制造方法：
(a)在含有抗体Fc区的多肽中，在该Fc区加入至少一个氨基酸改变的步骤；
(b)测定上述步骤(a)中改变的多肽与FcγRIIa的结合活性和与FcγRIIb的结合活性的步骤；以及
(c)选择与亲本多肽相比与FcγRIIa的结合活性维持或降低且与FcγRIIb的结合活性增强的多肽的步骤。
优选的方案是含有抗体Fc区的多肽的制造方法，该方法包括：
(a)改变编码该多肽的核酸，使得与亲本多肽相比，与FcγRIIa的结合活性维持或降低，且与FcγRIIb的结合活性增强的步骤。
(b)向宿主细胞中导入该核酸，培养以表达的步骤；
(c)从宿主细胞培养物中回收该多肽的步骤。
并且，通过该制造方法制造的抗体和Fc融合蛋白质分子也包含在本发明中。
本发明提供含有抗体Fc区的多肽的制造方法，该多肽在给予生物体时，与亲本多肽相比，抑制抗该多肽的抗体的产生，该方法包括在该Fc区加入至少一个氨基酸改变。
例如可举出包括以下步骤的制造方法：
(a)在含有抗体Fc区的多肽中，在该Fc区加入至少一个氨基酸改变的步骤，以及
(b)将上述步骤(a)中改变的多肽给予生物体时，与亲本多肽相比，确认抗体的产生受到抑制的步骤。
抗该多肽的抗体的产生是否受到抑制，这可通过对动物实际给予多肽等方法确认。或者，也可测定与FcγRIIa的结合活性和与FcγRIIb的结合活性，如果对FcγRIIa的KD值除以对FcγRIIb的KD值所得的值增加，则判断抗体的产生受到抑制。上述多肽可在不活化活性型FcγR的情况下抑制抗体的产生，因此可以认为可用作药物。
上述制造方法中，优选使得与FcγRIIb的结合活性增强，且与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性维持或降低，进一步优选使得与FcγRIa或/和FcγRIIIa的结合活性降低。
作为上述制造方法中的优选方案，例如改变含有人IgG的Fc区的多肽，使得该多肽中EU编号第238位的Pro置换为Asp或EU编号第328位的Leu置换为Glu。作为其它的优选方案，改变该多肽，使得除了EU编号第238位的Pro置换为Asp之外，还进行选自以下的至少一个置换：EU编号第237位的Gly置换为Trp、EU编号第237位的Gly置换为Phe、EU编号第267位的Ser置换为Val、EU编号第267位的Ser置换为Gln、EU编号第268位的His置换为Asn、EU编号第271位的Pro置换为Gly、EU编号第326位的Lys置换为Leu、EU编号第326位的Lys置换为Gln、EU编号第326位的Lys置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Met、EU编号第239位的Ser置换为Asp、EU编号第267位的Ser置换为Ala、EU编号第234位的Leu置换为Trp、EU编号第234位的Leu置换为Tyr、EU编号第237位的Gly置换为Ala、EU编号第237位的Gly置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Glu、EU编号第237位的Gly置换为Leu、EU编号第237位的Gly置换为Met、EU编号第237位的Gly置换为Tyr、EU编号第330位的Ala置换为Lys、EU编号第330位的Ala置换为Arg、EU编号第233位的Glu置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ser、EU编号第326位的Lys置换为Thr、EU编号第323位的Val置换为Ile、EU编号第323位的Val置换为Leu、EU编号第323位的Val置换为Met、EU编号第296位的Tyr置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ala、EU编号第326位的Lys置换为Asn、EU编号第330位的Ala置换为Met。
本发明还提供改变多肽的方法，该方法用于制造与亲本多肽相比，与FcγRIIa的结合活性维持或降低且与FcγRIIb的结合活性增强的多肽。
本发明还提供改变多肽的方法，该方法用于制造在给予生物体时与亲本多肽相比抗体的产生受到抑制的多肽。
作为优选的方案，例如改变含有人IgG的Fc区的多肽，使得EU编号第238位的Pro置换为Asp或EU编号第328位的Leu置换为Glu。作为其它的优选方案，改变该多肽，使得除了EU编号第238位的Pro置换为Asp之外，还进行选自以下的至少一个置换：EU编号第237位的Gly置换为Trp、EU编号第237位的Gly置换为Phe、EU编号第267位的Ser置换为Val、EU编号第267位的Ser置换为Gln、EU编号第268位的His置换为Asn、EU编号第271位的Pro置换为Gly、EU编号第326位的Lys置换为Leu、EU编号第326位的Lys置换为Gln、EU编号第326位的Lys置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Met、EU编号第239位的Ser置换为Asp、EU编号第267位的Ser置换为Ala、EU编号第234位的Leu置换为Trp、EU编号第234位的Leu置换为Tyr、EU编号第237位的Gly置换为Ala、EU编号第237位的Gly置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Glu、EU编号第237位的Gly置换为Leu、EU编号第237位的Gly置换为Met、EU编号第237位的Gly置换为Tyr、EU编号第330位的Ala置换为Lys、EU编号第330位的Ala置换为Arg、EU编号第233位的Glu置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ser、EU编号第326位的Lys置换为Thr、EU编号第323位的Val置换为Ile、EU编号第323位的Val置换为Leu、EU编号第323位的Val置换为Met、EU编号第296位的Tyr置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ala、EU编号第326位的Lys置换为Asn、EU编号第330位的Ala置换为Met。
本发明还提供编码含有抗体Fc区的多肽的核酸，该多肽的至少一个氨基酸发生改变，与亲本多肽相比，与FcγRIIa的结合活性维持或降低，且与FcγRIIb的结合活性增强。本发明的该核酸可以是DNA、RNA等任意形式。
本发明还提供含有上述本发明的核酸的载体。对于载体的种类，根据导入载体的宿主细胞，本领域技术人员可适当选择，例如可使用上述的载体。
本发明还涉及由上述本发明的载体转化的宿主细胞。对于宿主细胞，本领域技术人员可适当选择，例如可使用上述宿主细胞。
本发明还提供：与亲本多肽相比，维持或降低含有抗体Fc区的多肽与FcγRIIa的结合活性，且增强与FcγRIIb的结合活性的方法，该方法包括在该Fc区加入至少一个氨基酸改变。
本发明还提供：在给予生物体时，与亲本多肽相比，抑制抗含有抗体Fc区的多肽的抗体产生的方法，该方法包括在该Fc区加入至少一个氨基酸改变。
作为优选的方案，例如改变含有人IgG的Fc区的多肽，使得该多肽中EU编号第238位的Pro置换为Asp或EU编号第328位的Leu置换为Glu。作为其它的优选方案，改变该多肽，使得除了EU编号第238位的Pro置换为Asp之外，还进行选自以下的至少一个置换：EU编号第237位的Gly置换为Trp、EU编号第237位的Gly置换为Phe、EU编号第267位的Ser置换为Val、EU编号第267位的Ser置换为Gln、EU编号第268位的His置换为Asn、EU编号第271位的Pro置换为Gly、EU编号第326位的Lys置换为Leu、EU编号第326位的Lys置换为Gln、EU编号第326位的Lys置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Met、EU编号第239位的Ser置换为Asp、EU编号第267位的Ser置换为Ala、EU编号第234位的Leu置换为Trp、EU编号第234位的Leu置换为Tyr、EU编号第237位的Gly置换为Ala、EU编号第237位的Gly置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Glu、EU编号第237位的Gly置换为Leu、EU编号第237位的Gly置换为Met、EU编号第237位的Gly置换为Tyr、EU编号第330位的Ala置换为Lys、EU编号第330位的Ala置换为Arg、EU编号第233位的Glu置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ser、EU编号第326位的Lys置换为Thr、EU编号第323位的Val置换为Ile、EU编号第323位的Val置换为Leu、EU编号第323位的Val置换为Met、EU编号第296位的Tyr置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ala、EU编号第326位的Lys置换为Asn、EU编号第330位的Ala置换为Met。
上述方法中，优选与FcγRIIb的结合活性增强，且与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性维持或降低，进一步优选与FcγRIa或/和FcγRIIIa的结合活性维持或降低。
通过上述任意方法制造的多肽也包含在本发明中。
<药物组合物>
本发明提供含有本发明的多肽的药物组合物。
对于本发明的药物组合物，除了本发明的上述抗体或Fc融合蛋白质分子之外，还可以导入药学上可接受的载体，按照公知的方法制成制剂。例如可以以与水或其它药学上可接受的液体的无菌溶液或混悬液剂的注射剂形式非口服地使用。例如，可以考虑将药理学上可接受的载体或介质，具体而言将无菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等适当组合，以通常认可的制药实践所要求的单位用量形式进行混合，由此制成制剂。具体来说，载体可举出轻质硅酸酐、乳糖、结晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯基缩醛二乙基氨基乙酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐类等。这些制剂中的有效成分量是可以获得所指示的范围的适当用量。
对于用于注射的无菌组合物，可以使用注射用蒸馏水等的载体，按照通常的制剂实践来配制。
注射用的水溶液例如可举出：含有生理盐水、含有葡萄糖或其它辅料的等渗液，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，也可以结合使用适当的助溶剂，例如：醇，具体来说乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇；非离子性表面活性剂，例如聚山梨酯80(TM)、HCO-50。
油性液体可举出：芝麻油、大豆油，助溶剂可结合使用苯甲酸苄基酯、苄基醇。还可以掺混缓冲剂例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液，镇痛剂例如盐酸普鲁卡因、稳定剂例如苄基醇、苯酚、抗氧化剂。所制备的注射液通常填充于安瓿瓶中。
给予优选为非口服给予，具体可举出：注射剂型、经鼻给予剂型、经肺给予剂型、经皮给予剂型等。注射剂型例如可以通过静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行全身或局部性给予。
本发明的药物组合物可以根据患者的年龄、症状选择适当的给予方法。含有抗体或编码抗体的多核苷酸的药物组合物的给予量例如可以是在每次每1kg体重为0.0001mg-1000mg的范围内选择。或者例如在每位患者为0.001-100000mg/机体的范围内选择给予量，这些数值没有限定。给予量、给予方法根据患者的体重或年龄、症状等变化，本领域技术人员可适当选择。
上述本发明的多肽可用作抑制B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞活化的药物的有效成分。本发明的多肽并不活化活性型FcγR，而是选择性地作用于FcγRIIb，可抑制B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化。B细胞的活化包括增殖、IgE产生、IgM产生、IgA产生等。上述本发明的多肽通过使FcγRIIb与IgE交联来抑制B细胞的IgE产生，通过与IgM交联来抑制B细胞的IgM产生，通过与IgA交联来抑制IgA产生。除此之外，通过使BCR、CD19、CD79b等的B细胞上表达的、在细胞内含有ITAM结构域或者与ITAM结构域相互作用的分子与FcγRIIb直接或间接交联，可发挥与上述同样的抑制作用。肥大细胞的活化包括增殖、IgE等引起的活化、脱粒等。在肥大细胞中，上述本发明的多肽可通过使IgE受体FcεRI、DAP12、CD200R3等的在肥大细胞上表达的、含有ITAM结构域或者与ITAM结构域相互作用的分子与FcγRIIb直接、间接交联，抑制增殖、IgE等引起的活化、脱粒。嗜碱性粒细胞的活化包括增殖、脱粒等。在嗜碱性粒细胞中，上述本发明的多肽可通过使FcγRIIb与细胞膜上的、在细胞内含有ITAM结构域或者与ITAM结构域相互作用的分子直接或间接交联，抑制活化、脱粒、增殖。树突细胞的活化包括增殖、脱粒等。在树突细胞中，上述本发明的多肽也可通过使细胞膜上的、在细胞内含有ITAM结构域或与ITAM结构域相互作用的分子与FcγRIIb直接或间接交联，抑制活化、脱粒、增殖。
本发明中，上述本发明的多肽作为免疫炎性疾病的治疗剂或预防剂的有效成分有用。如上所述，本发明的多肽可以抑制B细胞、肥大细胞、树突细胞和/或嗜碱性粒细胞的活化，因此，通过给予本发明的多肽，可以治疗或预防免疫炎性疾病。“免疫炎性疾病”包括但不限于以下疾病：类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性疱病、自身免疫性肾上腺皮质炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、巨红细胞性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性受体病、自身免疫性不孕、慢性活动性肝炎、肾小球肾炎、间质性肺纤维化、多发性硬化症、帕哲病、骨质疏松症、多发性骨髓瘤、葡萄膜炎、急性和慢性脊椎炎、痛风性关节炎、炎性肠病、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、银屑病、克罗恩病、巴塞杜氏病、青少年糖尿病、阿狄森氏病、重症肌无力、晶体性葡萄膜炎、系统性红斑狼疮、变应性鼻炎、变应性皮肤炎、溃疡性结肠炎、超敏感症、肌变性、恶病质、系统性硬皮病、局限性硬皮病、干燥综合征、白塞病、赖特综合征、I型和II型糖尿病、骨吸收障碍、移植物抗宿主反应、缺血性再灌注损伤、动脉粥样硬化、脑损伤、脑型疟、败血症、败血性休克、中毒性休克综合征、发热、染色引发的肌痛、再生障碍性贫血、溶血性贫血、突发性血小板降低、肺出血肾炎综合征、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、天疱疮、IgA肾病、花粉病、抗磷脂抗体综合征、多发性肌炎、韦格纳肉芽肿、结节性多动脉炎、混合性结缔组织病、纤维肌痛症、哮喘、特应性皮炎、慢性萎缩性胃炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰腺炎、大动脉炎综合征、急进性肾小球肾炎、巨幼红细胞性贫血、特发性血小板减少性紫癜、原发性甲状腺功能减退、特发性阿狄森病、胰岛素依赖型糖尿病、慢性盘状红斑狼疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线状IgA大泡性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、圆形脱毛症、寻常性白斑、白斑、Sutton离心性后天性白斑、原田氏病、自身免疫性视神经病、特发性无精症、习惯性流产、低血糖症、慢性荨麻疹、强直性脊椎炎、银屑病性关节炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、韧带附着端病、过敏性肠综合征、慢性疲劳综合征、皮肌炎、包涵体肌炎、施密特综合征、格雷夫斯病、恶性贫血、类狼疮性肝炎、初老期痴呆、阿尔茨海默病、脱髓鞘疾病、肌萎缩性侧索硬化症、副甲状腺功能减退、心肌梗死后综合征、肌无力综合征、疱疹样皮炎、脱毛症、进行性系统性硬化病、CREST综合征(钙沉着、雷诺现象、食道蠕动障碍、指端硬皮、毛细血管扩张)、结节病、风湿热、多形性红斑、库欣综合征、输血反应、麻风病、多发性大动脉炎、类风湿性多发性肌痛症、颞动脉炎、巨细胞动脉炎、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、川崎病、心内膜炎、心内膜心肌纤维化症、眼内炎、胎儿幼红细胞增多症、嗜酸细胞性筋膜炎、费尔蒂综合征、过敏性紫癜、移植排斥反应、流行性腮腺炎、心肌病、化脓性关节炎、家族性地中海热、穆-韦二氏综合征、高IgD综合征。
上述本发明的多肽在可认为抗自身抗原的抗体(自身抗体)的产生是疾病原因的自身免疫疾病中，可抑制该自身抗体的产生，可用作治疗或预防该自身免疫疾病的药物的有效成分。有报告称，通过使用重症肌无力的自身抗原AchR与抗体的Fc部分融合所得的分子，抑制了表达识别AchR的BCR的B细胞的增殖，诱导凋亡(J Neuroimmunol,227,35-43,2010)。通过使用自身抗体所识别的抗原与本发明所述的抗体Fc区的融合蛋白质，可以使表达针对该自身抗原的BCR的B细胞的BCR与FcγRIIb交联，抑制表达针对自身抗原的BCR的B细胞的增殖，诱导凋亡。上述自身免疫疾病包括格林-巴利综合征、重症肌无力、慢性萎缩性胃炎、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、自身免疫性胰腺炎、大动脉炎综合征、肺出血肾炎综合征、急进性肾小球肾炎、巨幼红细胞性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、巴塞杜氏病、桥本氏甲状腺炎、原发性甲状腺功能减退、特发性阿狄森病、胰岛素依赖型糖尿病、慢性盘状红斑狼疮、局限性硬皮病、天疱疮、类天疱疮、妊娠疱疹、线状IgA大泡性皮肤病、获得性大疱性表皮松解症、圆形脱毛症、寻常性白斑、Sutton离心性后天性白斑、原田氏病、自身免疫性视神经病、特发性无精症、习惯性流产、II型糖尿病、低血糖症、慢性荨麻疹，但不限于此。
上述本发明的多肽可用作生物体所需的蛋白质缺乏的疾病的治疗剂的有效成分。对于生物体所需蛋白质缺乏的疾病，采用给予该蛋白质作为药物进行补充的治疗方法，但是患者原本就缺乏该蛋白质，因此由外部补充的该蛋白质被识别为异物，致使产生抗该蛋白质的抗体。结果，该蛋白质容易被除去，作为药物的效果减弱。通过使用上述蛋白质与本发明所述的抗体Fc区的融合蛋白质，在识别该蛋白质的B细胞上，使BCR与FcγRIIb交联，可抑制抗该蛋白质的抗体的产生。所补充的蛋白质包括：VIII因子、IX因子、TPO、EPO、α-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、A型类肝素N-硫酸酯酶、B型α-N-乙酰葡糖胺酶、C型乙酰CoA:α-葡糖胺酶乙酰转移酶、D型N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、半乳糖6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、α-半乳糖苷酶、酸性α-半乳糖苷酶、葡糖脑苷脂酶。要补充这些蛋白质的疾病包括血友病、特发性血小板减少性紫癜、肾性贫血、溶酶体病(黏多糖贮积症、法布里病、庞贝氏病、戈谢病)等。但并不限于这些。
上述本发明的多肽可用作抗病毒剂的有效成分。作为抗病毒抗体的含有本发明所述的Fc区的抗体可以抑制在抗病毒抗体中可见的抗体依赖性感染增强。抗体依赖性感染增强是指以下现象：病毒利用抗该病毒的中和抗体，被活性型FcγR介导吞噬，感染表达FcγR的细胞，由此使感染扩大。有报告称，抗登革病毒的中和抗体与FcγRIIb的结合在抑制抗体依赖性感染增强方面发挥重要的作用(Proc Natl Acad Sci USA,108,12479-12484,2011)。登革病毒和抗登革病毒的中和抗体形成的免疫复合物与FcγRIIb交联，由此抑制FcγR介导的吞噬，从而抑制抗体依赖性感染增强。病毒包括登革病毒(DENV1、DENV2、DENV4)或HIV。但并仅限于这些。
上述本发明的多肽可用作动脉硬化预防剂或治疗剂的有效成分。含有本发明所述的Fc区的抗体是抗作为动脉硬化原因的氧化LDL的抗体，可防止FcγRIIa依赖性的炎性细胞粘附。有报告称：抗氧化LDL抗体抑制氧化LDL与CD36的相互作用，但抗氧化LDL抗体与内皮细胞结合，单核细胞以FcγRIIa或FcγRI依赖性方式识别其Fc部分并粘附(ImmunolLett,108,52-61,2007)。对于这样的抗体，可以认为，通过利用含有本发明所述的Fc区的抗体，FcγRIIa依赖性结合受到抑制，且通过FcγRIIb介导的抑制信号来抑制细胞粘附。
本发明中，上述本发明的多肽可用作癌症治疗剂或预防剂的有效成分。如上所述，已知通过增强与FcγRIIb的结合，来增强激动性抗体的激动活性，该抗体所具有的抗肿瘤效果也增强，因此，使用本发明所述的Fc区的激动性抗体可用于癌症的治疗或预防。本发明所述的Fc区可增强抗Aliases、CD120a、CD120b、淋巴毒素β受体、CD134、CD40、FAS、TNFRSF6B、CD27、CD30、CD137、TNFRSF10A、TNFRSF10B、TNFRSF10C、TNFRSF10D、RANK、护骨蛋白、TNFRSF12A、TNFRSF13B、TNFRSF13C、TNFRSF14、神经生长因子受体、TNFRSF17、TNFRSF18、TNFRSF19、TNFRSF21、TNFRSF25、外胚层发育异常蛋白A2受体等TNF受体家族的激动性抗体的激动活性。也增强上述以外的激动性抗体的激动活性。癌症包括但不仅限于：肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺扁平上皮癌)、大肠癌、直肠癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、胆管癌、腹膜癌、间皮瘤、扁平上皮癌、子宫颈癌、子宫癌、膀胱癌、食道癌、头颈癌、鼻咽癌、唾液腺肿瘤、胸腺瘤、皮肤癌、基底细胞瘤、恶性黑素瘤、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、肾母细胞瘤、急性髓性白血病(包括急性髓细胞白血病、急性成粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒单核细胞白血病和急性单核细胞白血病)、慢性髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性淋巴性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、蕈样肉芽肿、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、毛细胞白血病浆细胞瘤、周边T细胞淋巴瘤和成人T细胞白血病/淋巴瘤)、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、脑肿瘤(包括神经胶质瘤、星形细胞瘤、神经胶质母细胞瘤、脑膜瘤和室管膜瘤)、成神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、尤文氏肉瘤、血管肉瘤、血管外皮细胞瘤。
本发明还涉及免疫炎性疾病的治疗方法或预防方法，该方法包括将本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽给予对象(患者)的步骤。
本发明还提供用于本发明的治疗方法或预防方法的试剂盒，该试剂盒至少含有本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽、或本发明的药物组合物。除此之外，该试剂盒中还可包装有药学上可接受的载体、介质、记载使用方法的指示书等。本发明还涉及本发明的多肽或由本发明的制造方法制造的多肽在免疫炎性疾病的治疗剂或预防剂的制造中的应用。本发明还涉及用于本发明的治疗方法或预防方法的本发明的多肽或由本发明制造方法制造的多肽。
本说明书中使用的氨基酸的3字母标记和单字母标记的对应如下：
丙氨酸：Ala(A)
精氨酸：Arg(R)
天冬酰胺：Asn(N)
天冬氨酸：Asp(D)
半胱氨酸：Cys(C)
谷氨酰胺：Gln(Q)
谷氨酸：Glu(E)
甘氨酸：Gly(G)
组氨酸：His(H)
异亮氨酸：Ile(I)
亮氨酸：Leu(L)
赖氨酸：Lys(K)
甲硫氨酸：Met(M)
苯丙氨酸：Phe(F)
脯氨酸：Pro(P)
丝氨酸：Ser(S)
苏氨酸：Thr(T)
色氨酸：Trp(W)
酪氨酸：Tyr(Y)
缬氨酸：Val(V)。
本说明书中引用的全部现有技术文献均作为参照结合到本说明书中。
实施例
本发明通过以下实施例进一步说明，但并不限于下述实施例。
[实施例1]Fc变体与FcγR的结合的综合分析
为了制作以下抗体，向IgG1抗体中引入突变，实施与各FcγR的结合的综合分析：与IgG1相比，其由Fc介导的与活性型FcγR特别是FcγRIIaH型和R型中任意遗传多态性的结合降低，且与FcγRIIb的结合增强。
抗体H链使用含有GpH7的CDR的磷脂酰肌醇聚糖3抗体的可变区(SEQ ID NO:15)，GpH7是在WO2009/041062中公开的血浆动力学改善的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体。同样地，抗体L链共同使用在WO2009/041062中公开的血浆动力学改善的磷脂酰肌醇聚糖3抗体的GpL16-k0(SEQ ID NO:16)。抗体H链恒定区是利用向除去了IgG1的C末端的Gly和Lys的G1d中导入了K439E突变得到的B3(SEQ ID NO:17)。将该H链称为GpH7-B3(SEQ ID NO:18)，L链称为GpL16-k0(SEQ ID NO:16)。
对于GpH7-B3，分别将被认为参与FcγR结合的氨基酸及其周边的氨基酸(EU编号第234位至第239位、第265位至第271位、第295位、第296位、第298位、第300位、第324位至第337位)置换为原来的氨基酸和Cys以外的18种氨基酸。将这些Fc变体称作B3变体。按照参考例1的方法表达并纯化B3变体，按照参考例2的方法综合评价与各FcγR(FcγRIa、FcγRIIaH型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIa)的结合。
关于与各FcγR的相互作用分析结果，按照以下方法制图。将来自各B3变体的抗体与FcγR的结合量的值除以未向B3中导入突变的比较对象抗体(EU编号第234位至第239位、第265位至第271位、第295位、第296位、第298位、第300位、第324位至第337位具有人天然型IgG1的序列的抗体)与FcγR的结合量的值。将该值进一步扩大100倍，将所得值作为各变体与FcγR的相对结合活性的指标。横轴表示各变体与FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各变体与活性型FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIIa)的相对结合活性的值(图1、2、3、4)。
该结果如在图1-4中用标签表示的，发现在全部改变中，如果只导入突变A(EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变)的突变和突变B(EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变)的突变，则效果是，与导入前相比，与FcγRIIb的结合显著增强，与两种类型的FcγRIIa的结合显著受到抑制。
[实施例2]FcγRIIb选择性结合变体的SPR分析
对于实施例1中发现的EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变，更详细分析与各FcγR的结合。
作为IgG1的H链，抗体H链可变区使用WO2009/125825中公开的、抗人白细胞介素6受体的抗体可变区即IL6R-H的可变区(SEQ ID NO:19)，抗体H链恒定区使用具有除去了人IgG1的C末端的Gly和Lys的G1d的IL6R-G1d(SEQ ID NO:20)。制作IL6R-G1d的EU编号第238位的Pro置换为Asp的IL6R-G1d-v1(SEQ ID NO:21)。接着制作EU编号第328位的Leu置换为Glu的IL6R-G1d-v2(SEQ ID NO:23)。为了进行比较，还制作了将非专利文献27所述的IL6R-G1d的EU编号第267位的Ser置换为Glu、EU编号第328位的Leu置换为Phe的IL6R-G1d-v3(SEQID NO:24)。抗体H链共同采用托珠单抗的L链即IL6R-L(SEQ ID NO:22)，与各H链一起，按照参考例1的方法表达并纯化抗体。这里，将得到的具有来自IL6R-G1d、IL6R-G1d-v1、IL6R-G1d-v2、IL6R-G1d-v3的氨基酸序列作为抗体H链的抗体分别称为IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3。
接着，使用BiacoreT100(GE Healthcare)实施这些抗体与FcγR的相互作用的动力学分析。运行缓冲液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，测定温度为25℃。使用通过胺偶联法在S系列传感芯片CM5(GE Healthcare)上固定A蛋白的芯片。将目标抗体捕获于该芯片上，使其与用运行缓冲液稀释的各FcγR相互作用，测定与抗体的结合。测定后，通过用10mM甘氨酸-HCl,pH1.5进行反应，洗涤芯片上捕获的抗体，使芯片再生以重复使用。通过Biacore评价软件(Biacore Evaluation Software)，将作为测定结果得到的传感图谱用1:1Langmuir结合模型进行分析，计算结合速率常数ka(L/mol/s)、解离速率常数kd(1/s)，由这些值计算解离常数KD(mol/L)。
IgG1-v1和IgG1-v2与FcγRIIa H型和FcγRIIIa的结合微弱，因此无法用上述分析方法计算KD等动力学参数。关于它们的相互作用，利用Biacore T100软件手册BR1006-48版本AE中记载的以下1:1结合模型式计算KD。
按照1:1结合模型相互作用的分子在Biacore上的行为可由下式1表示：
[式1]
Req＝C·Rmax/(KD+C)+RIReq：稳态结合水平与被分析物浓度的关系(plot)
C：浓度
RI：样品中的体积折射率(bulk refractive index)贡献
Rmax：表面的被分析物结合能力。
将该式变形，则KD可如下式2表示：
[式2]
KD＝C·Rmax/(Req-RI)-C。
将Rmax、RI、C的值代入该式中，则可计算KD。根据当前的测定条件，可以是RI＝0、C＝2μmol/L。另外，关于Rmax，在对作为IgG1与各FcγR的相互作用分析结果得到的传感图谱用1∶1 Langmuir结合模型进行全局拟合，将此时得到的Rmax的值除以IgG1的捕获量，再乘以IgG1-v1、IgG1-v2的捕获量，所得值作为Rmax。这是基于以下的假设计算的：对于向IgG1导入突变的任意变体，与IgG1相比，各FcγR可结合的极限量没有变化，测定时的Rmax与该测定时芯片上结合的抗体的量成比例。Req是测定时观察到的各FcγR与各传感芯片上的各变体的结合量。
在本次的测定条件下，IgG1-v1、IgG1-v2与FcγRIIa H型的结合量(Req)分别为约2.5、10RU，IgG1-v1、IgG1-v2与FcγRIIIa的结合量(Req)分别为约2.5、5RU。在分析与FcγRIIa H型的相互作用时，IgG1、IgG-v1、IgG-v2的捕获量是452、469.2、444.2RU，在分析与FcγRIIIa的相互作用时，IgG1、IgG-v1、IgG-v2的捕获量是454.5、470.8、447.1RU。另外，在对作为IgG1与FcγRIIa H型、FcγRIIIa的相互作用分析结果得到的传感图谱用1∶1Langmuir结合模型进行全局拟合时，所得的Rmax分别为69.8、63.8RU。使用这些值计算出：IgG-v1、IgG-v2对于FcγRIIa H型的Rmax分别为72.5、68.6RU，IgG-v1、IgG-v2对于FcγRIIIa的Rmax分别为66.0、62.7RU。将这些值代入式2的式子中，计算IgG-v1、IgG-v2对FcγRIIa H型和FcγRIIIa的KD：
[式2]
KD＝C·Rmax/(Req-RI)-C。
IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3对各FcγR的KD值示于表1(各抗体对各FcγR的KD值)，另外，将IgG1对各FcγR的KD值除以IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3对各FcγR的KD值得到的IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v3的相对KD值示于表2(各抗体对各FcγR的相对KD值)。
[表1]
IgG1 IgG1-v1 IgG1-v2 IgG1-v3
FcγRIa 3.4E-10 7.3E-09 4.6E-10 1.9E-10
FcγRIIa R 1.2E-06 1.2E-05 2.9E-06 2.3E-09
FcγRIIa H 7.7E-07 5.6E-05<sup>＊</sup> 1.2E-05<sup>＊</sup> 1.5E-06
FcγRIIb 5.3E-06 1.1E-06 2.3E-06 1.3E-08
FcγRIIIa 3.1E-06 5.1E-05<sup>＊</sup> 2.3E-05<sup>＊</sup> 8.8E-06
(mol/L)
上述表1中，*表示由于未充分观察到FcγR与IgG的结合而利用式2计算出的KD：
[式2]
KD＝C·Rmax/(Req-RI)-C。
[表2]
IgG1-v1 IgG1-v2 IgG1-v3
FcγRIa 0.047 0.74 1.8
FcγRIIa R 0.10 0.41 522
FcγRIIa H 0.014 0.064 0.51
FcγRIIb 4.8 2.3 408
FcγRIIIa 0.061 0.14 0.35
(将IgG1对各FcγR的KD值除以各抗体的IgG1对各FcγR的KD值得到的值)
根据表2，与IgG1相比，IgG1-v1与FcγRIa的结合活性降低至0.047倍，与FcγRIIa的R型的结合活性降低至0.10倍，与FcγRIIa H型的结合活性降低至0.014倍，与FcγRIIIa的结合活性降低至0.061倍。而与FcγRIIb的结合活性提高至4.8倍。
此外，根据表2，与IgG1相比，IgG1-v2与FcγRIa的结合活性降低至0.74倍，与FcγRIIa的R型的结合活性降低至0.41倍，与FcγRIIa H型的结合活性降低至0.064倍，与FcγRIIIa的结合活性降低至0.14倍。而与FcγRIIb的结合活性提高至2.3倍。
即，由该结果可知，具有EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变的IgG1-v1和具有EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变的IgG1-v2具有以下性质：与包括FcγRIIa的两种遗传多态性在内的全部活性型的FcγR的结合减弱，而与抑制型FcγR即FcγRIIb的结合升高。
接着，以与FcγRIIb的结合活性和与FcγRIIa R型或H型的结合活性的比例为指标，评价所得变体对FcγRIIb的选择性。具体来说，将对FcγRIIa R型或H型的KD值除以对FcγRIIb的KD值得到的值为I/A(R)或I/A(H)，将其作为FcγRIIb相对于各FcγRIIa的选择性指标使用。对FcγRIIb的KD值越小或者对FcγRIIa的KD值越大，该指标表示的值越大。即，显示更大值的变体表示：与FcγRIIa相比，与FcγRIIb的相对结合活性提高。对于各变体，将该指标汇总于表3。
[表3]
IgG1 IgG1-v1 IgG1-v2 IgG1-v3
I/A(R) 0.23 11 1.3 0.18
I/A(H) 0.15 51 5.2 115
根据表3的结果，与IgG1相比，应用现有技术的IgG1-v3的I/A(H)显示比IgG1大的值，对FcγRIIb更具有选择性，但其I/A(R)显示比IgG1小的值，对FcγRIIb的选择性得到改善。而本实施例中发现的IgG1-v1和IgG1-v2的I/A(R)和I/A(H)均显示比IgG1大的值，对FcγRIIb的选择性与FcγRIIa的任意遗传多态性相比均得以改善。
具有上述性质的改变目前尚未有报告，实际上如图1、2、3、4所示，是极为稀有的。EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变和EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变在免疫炎性疾病等的治疗药的开发中极为有用。
另外根据表2，非专利文献27所述的IgG1-v3的确与FcγRIIb的结合增强至408倍，与FcγRIIa H型的结合降低至0.51倍，但另一方面，与FcγRIIa R型的结合增强至522倍。根据该结果，IgG1-v1和IgG1-v2抑制了与FcγRIIa R型和H型两者的结合，且增强了与FcγRIIb的结合，因此可以认为，与IgG1-v3相比，是更选择性地与FcγRIIb结合的变体。即，EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变和EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变在免疫炎性疾病的治疗药的开发中极为有用。
[实施例3]选择性结合FcγRIIb的改变与其它的Fc区氨基酸置换的组合产生的效果以实施例1和实施例2中发现的对FcγRIIb的选择性提高的EU编号第238位的Pro置换为Asp的变体为基础，尝试进一步增强对FcγRIIb的选择性。
首先，制作变体IL6R-G1d-v4(SEQ ID NO:25)，其是对于向IL6R-G1d导入了EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变的IL6R-G1d_v1(SEQ ID NO:21)，导入实施例2所述的对FcγRIIb的选择性增强的EU编号第328位的Leu置换为Glu的改变所得，将其与IL6R-L(SEQ IDNO:22)结合，按照参考例1的方法制备。将这里得到的具有来自IL6R-G1d-v4的氨基酸序列作为抗体H链的抗体作为IgG1-v4。按照参考例2的方法评价IgG1、IgG1-v1、IgG1-v2、IgG1-v4与FcγRIIb的结合活性，其结果示于表4。
[表4]
Figure BDA0002903322720000491
由表4的结果可知，因为与IgG1相比，L328E与FcγRIIb的结合活性提高至2.3倍，所以如果再与同样与IgG1相比、与FcγRIIb的结合活性提高至4.8倍的P238D组合，那么有望使得与FcγRIIb的结合活性提高的程度进一步增加，但是实际上，与IgG1相比，将这些改变组合而得的变体与FcγRIIb的结合活性降低至0.47倍。该结果是无法从各自的改变效果预测的效果。
同样，按照参考例1的方法制备变体IL6R-G1d-v5(SEQ ID NO:26)，其是对于向IL6R-G1d中导入了EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变的IL6R-G1d-v1(SEQ ID NO:21)，导入实施例2所述的与FcγRIIb的结合活性提高的EU编号第267位的Ser置换为Glu和EU编号第328位的Leu置换为Phe的改变得到。将这里得到的具有来自IL6R-G1d-v5的氨基酸序列作为抗体H链的抗体作为IgG1-v5。按照参考例2的方法评价IgG1、IgG1-v1、IgG1-v3、IgG1-v5与FcγRIIb的结合活性，其结果示于表5。
向P238D变体导入实施例2中对FcγRIIb具有增强效果的S267E/L328F，评价导入改变前后与FcγRIIb的结合活性，其结果示于表5。
[表5]
Figure BDA0002903322720000501
由表5的结果可知，因为与IgG1相比，S267E/L328F与FcγRIIb的结合活性提高至408倍，所以如果再与同样与IgG1相比、与FcγRIIb的结合活性提高至4.8倍的P238D组合，那么有望使得与FcγRIIb的结合活性提高的程度进一步增加，但是实际上与之前的实例同样，与IgG1相比，将这些改变组合而得的变体与FcγRIIb的结合活性只提高至12倍左右。该结果也是无法从各自的改变效果预测的效果。
这些结果表明，虽然EU编号第238位的Pro置换为Asp这个单独的置换提高与FcγRIIb的结合活性，但是与其它的与FcγRIIb的结合活性提高的改变组合时，并不发挥其效果。可以认为其中的一个原因是：Fc与FcγR的相互作用界面的结构由于EU编号第238位的Pro置换为Asp的导入而发生变化，不反映在天然型抗体中观察到的改变的效果。由此可以认为，以含有EU编号第238位的Pro置换为Asp的置换的Fc为模板，产生对FcγRIIb的选择性更为优异的Fc，这无法活用在天然型抗体中得到的改变效果的信息，是极为困难的。
[实施例4]除P238D改变之外还导入了铰链部分的改变的变体与FcγRIIb的结合的综合分析
如实施例3所示，对于人天然型IgG1，对于EU编号第238位的Pro置换为Asp的Fc，即使将可预测与FcγRIIb的结合提高的其它改变组合，也未得到所期待的组合效果。因此，以EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变Fc为基础，对该Fc综合导入改变，由此进行发现与FcγRIIb的结合增强的变体的研究。作为抗体H链，制作向IL6R-G1d(SEQ ID NO:20)导入EU编号第252位的Met置换为Tyr的改变、EU编号第434位的Asn置换为Tyr的改变得到的IL6R-F11(SEQ ID NO:27)，还制作向其进一步导入EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变得到的IL6R-F652(SEQ ID NO:28)。分别准备表达质粒，该表达质粒含有对于IL6R-F652、将EU编号第238位残基附近的区域(EU编号第234位至第237位、第239位)分别置换为原有氨基酸和半胱氨酸之外的18种氨基酸得到的抗体H链序列。抗体L链共同使用IL6R-L(SEQ ID NO:22)。按照参考例1的方法表达、纯化并表达这些变体。将这些Fc变体称为PD变体。按照参考例2的方法，综合评价各PD变体与FcγRIIa R型和FcγRIIb的相互作用。
关于与各FcγR的相互作用分析结果，按照以下方法制图。将各PD变体与各FcγR的结合量的值除以作为对照的、导入改变前的抗体(EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变即IL6R-F652/IL6R-L)与各FcγR的结合量的值，再乘以100倍，将所得值作为各PD变体与各FcγR的相对结合活性的值。横轴表示各PD变体与FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各PD变体与FcγRIIa R型的相对结合活性的值(图6)。
由该结果发现，与导入改变前的抗体相比，11种改变具有与FcγRIIb的结合增强、与FcγRIIa R型的结合维持或增强的效果。这11种变体与FcγRIIb和FcγRIIa R的结合活性的汇总结果示于表6。表中的SEQ ID NO表示所评价的变体的H链的SEQ ID NO，改变表示向IL6R-F11(SEQ ID NO:27)导入的改变。
[表6]
Figure BDA0002903322720000511
对于导入了P238D的变体进一步追加导入这11种改变时与FcγRIIb的相对结合活性的值，以及在实施例1中将这些改变导入不含有P238D的Fc中时与FcγRIIb的相对结合活性的值，示于图7。对于这11种改变，虽然进一步导入到P238D改变中，与导入前相比，与FcγRIIb的结合量增强，但是除了G237F、G237W、S239D之外的8种改变，与此相反，在导入到实施例1中使用的不含有P238D的变体(GpH7-B3/GpL16-k0)中时，显示与FcγRIIb的结合降低的效果。由实施例3和该结果表明，难以从向天然型IgG1导入的改变的效果来预测向Fc中含有P238D改变的变体导入相同改变时的效果。换言之，这次发现的8种改变是不进行本研究就不可能发现的改变。
按照参考例2的方法测定表6所示的变体对FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb、FcγRIIIaV的KD值，结果汇总于表7中。表中的SEQ ID NO表示所评价的变体的H链的SEQ ID NO，改变表示向IL6R-F11(SEQ ID NO:27)导入的改变。制作IL6R-F11时作为模板的IL6R-G1d/IL6R-L以*表示。另外，表中的KD(IIaR)/KD(IIb)和KD(IIaH)/KD(IIb)分别表示各变体对FcγRIIa R的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值所得的值、各变体对FcγRIIaH的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值所得的值。亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)是指亲本多肽对FcγRIIb的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值所得的值。除此之外，各变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值/亲本多肽与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值示于表7。这里，亲本多肽是指H链具有IL6R-F11(SEQ ID NO:27)的变体。表7中涂以灰色的方格表示FcγR与IgG的结合微弱，在动力学分析中判断为无法准确分析，因此是利用参考例2所述的式2计算的值：
[式2]
KD＝C·Rmax/(Req-RI)-C。
根据表7，与IL6R-F11相比，任何变体对FcγRIIb的亲和性均提高，其提高幅度为1.9倍至5.0倍。各变体对FcγRIIa R的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值之比、以及各变体对FcγRIIa H的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值之比表示相对于与FcγRIIa R和与FcγRIIaH的结合活性的与FcγRIIb的相对结合活性。也就是说，该值是表示各变体对FcγRIIb的结合选择性高度的值，该值越大，则对FcγRIIb的结合选择性越高。亲本多肽IL6R-F11/IL6R-L对FcγRIIa R的KD值/对FcγRIIb的KD值之比、以及对FcγRIIa H的KD值/对FcγRIIb的KD值之比均为0.7，因此，表7的任意变体与亲本多肽相比，对FcγRIIb的结合选择性均提高。变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值/亲本多肽与FcγRIIaR和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值为1以上，这意味着：该变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的结合，和亲本多肽与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的结合为大致同等或更为降低。本次所得的变体中，该值为0.7-5.0，因此可以说，本次所得的变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的结合，和亲本多肽的相比，大致同等或更为降低。由这些结果表明，本次得到的变体中，与亲本多肽相比，与FcγRIIa R型和H型的结合活性维持或降低，同时与FcγRIIb的结合活性增强，对FcγRIIb的选择性提高。另外，与IL6R-F11相比，任意变体对FcγRIa和FcγRIIIaV的亲和性均降低。
[表7]
Figure BDA0002903322720000541
[实施例5]含有P238D的Fc与FcγRIIb胞外区的复合物的X射线晶体结构分析如之前的实施例3所示，明确的是，对于含有P238D的Fc，即使导入与FcγRIIb的结合活性提高或者对FcγRIIb的选择性提高的改变，与FcγRIIb的结合活性也减弱，可以认为其原因是：Fc与FcγRIIb的相互作用界面的结构由于导入P238D而发生了变化。这里，为了弄清楚该现象的原因，通过X射线晶体结构分析来明确具有P238D的突变的IgG1的Fc(以下称为Fc(P238D))与FcγRIIb胞外区的复合物的立体结构，并与天然型IgG1的Fc(以下称为Fc(WT))与FcγRIIb胞外区的复合物的立体结构以及结合方式进行比较。关于Fc与FcγR胞外区的复合物的立体结构，已经有很多报告，分析了Fc(WT)/FcγRIIIb胞外区复合物(Nature,2000,400,267-273；J.Biol.Chem.2011,276,16469-16477)、Fc(WT)/FcγRIIIa胞外区复合物(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011,108,12669-126674)、Fc(WT)/FcγRIIa胞外区复合物(J.Imunol.2011,187,3208-3217)的立体结构。目前尚未分析Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合物的立体结构，不过，对于与Fc(WT)的复合物的立体结构为已知的FcγRIIa和FcγRIIb，在胞外区中氨基酸序列有93％匹配，具有非常高的同源性，因此，Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合物的立体结构可通过建模，由Fc(WT)/FcγRIIa胞外区复合物的晶体结构推定。
关于Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物，通过X射线晶体结构分析以分辨率
Figure BDA0002903322720000551
确定了立体结构。该分析结果的结构示于图8。以两个Fc CH2结构域之间夹持FcγRIIb胞外区的方式结合，与目前分析过的Fc(WT)和FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcγRIIa的各胞外区的复合物的立体结构类似。
下面，为了详细地比较，通过基于Cα原子间距的最小二乘法将Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构和Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合物的模型结构相对于FcγRIIb胞外区以及Fc CH2结构域A进行叠合(图9)。此时可了解，Fc CH2结构域B之间重叠的程度并不良好，该部分存在立体结构差异。进一步使用Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构和Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合物的模型结构，在FcγRIIb胞外区和Fc CH2结构域B之间提取其距离为
Figure BDA0002903322720000552
以下的原子对进行比较，由此在Fc(WT)和Fc(P238D)之间比较FcγRIIb和Fc CH2结构域B之间的原子间相互作用的差别。如表8所示，在Fc(P238D)和Fc(WT)中，Fc CH2结构域B与FcγRIIb之间的原子间相互作用不一致。
[表8]
Figure BDA0002903322720000561
Figure BDA0002903322720000571
此外，对于Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的X射线晶体结构和Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合物的模型结构，在Fc CH2结构域A和Fc CH2结构域B各自单独的情况下，通过基于Cα原子间距的最小二乘法进行叠合，比较P238D附近的详细结构。可知对于Fc(P238D)和Fc(WT)，作为突变导入位置的EU编号第238位的氨基酸残基位置发生变化，与此相伴，自铰链区持续的其附近的环结构在Fc(P238D)和Fc(WT)之间发生变化(图10)。原本在Fc(WT)中，EU编号第238位的Pro位于蛋白的内侧，与周围残基形成疏水性核心，但是它变化为具有电荷的非常亲水的Asp时，继续存在于疏水性核心就脱溶剂化而言在能量方面不利。因此，在Fc(P238D)中，为了消除该能量的不利，EU编号第238位的氨基酸残基变化为朝向溶剂一侧的形状，可以认为这导致其附近的环状结构变化。并且，该环是从通过S-S键交联的铰链区持续，因此推测，该结构变化并未停留于局部的变化，对于Fc CH2结构域A和结构域B的相对排列也产生影响，结果对于FcγRIIb与Fc CH2结构域B之间的原子间相互作用带来不同。因此认为，对于已具有P238D改变的Fc，即使组合在天然型IgG中提高对FcγRIIb的选择性、结合活性的改变，也不能获得预测的效果。
P238D的导入带来的结构变化的结果是，在Fc CH2结构域A中，在相邻的EU编号第237位的Gly主链与FcγRIIb的第160位Tyr之间可见氢键(图11)。相当于该Tyr160的残基在FcγRIIa中是Phe，在与FcγRIIa结合时并不形成该氢键。结合考虑到：第160位氨基酸是在与Fc的相互作用界面中的、FcγRIIa和FcγRIIb之间的少数不同之一，则可推测，在FcγRIIb中特有的该氢键的有无导致Fc(P238D)与FcγRIIb的结合活性提高和与FcγRIIa的结合活性降低，成为选择性提高的原因。另外关于Fc CH2结构域B，在EU编号第270位的Asp和FcγRIIb的第131位Arg之间可见静电相互作用(图12)。在FcγRIIa的同种异型之一的FcγRIIa H型中，对应的残基为His，无法形成该静电相互作用。由此可以说明与FcγRIIa R型相比，FcγRIIa H型与Fc(P238D)的结合活性降低的原因。由上述基于X射线晶体结构分析的结果的研究可以明确，P238D的导入带来的其附近的环结构的变化和与之相伴的结构域排列的相对变化，形成天然型IgG中所没有的新的相互作用，与P238D变体与FcγRIIb的选择性结合概况相关。
[Fc(P238D)的表达纯化]
含有P238D改变的Fc的制备如下进行。首先，将hIL6R-IgG1-v1(SEQ ID NO:21)的EU编号第220位的Cys置换为Ser，将EU编号第236位的Glu至其C末端通过PCR克隆，得到基因序列Fc(238D)，按照参考例1的方法进行表达载体的制作、表达、纯化。EU编号第220位的Cys在通常的IgG1中与L链的Cys形成二硫键，但在制备仅Fc时，由于并不共表达L链，为了避免形成不需要的二硫键而置换为Ser。
[FcγRIIb胞外区的表达纯化]
按照参考例2的方法制备。
[Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的纯化]
在2mg结晶用的所得的FcγRIIb胞外区样品中加入0.29mg作为与谷胱甘肽S转移酶的融合蛋白质、通过大肠杆菌表达纯化的Endo F1(Protein Science 1996,5,2617-2622)，在0.1M Bis-Tris pH6.5缓冲液条件下，在室温下静置3天，由此将N联糖链切断，残留与Asn直接结合的N-乙酰葡糖胺。接着，将实施了该糖链切断处理的FcγRIIb胞外区样品用5000MWCO的超滤膜浓缩，用20mM HEPS pH7.5,0.05M NaCl平衡了的凝胶过滤柱色谱(Superdex200 10/300)纯化。进一步在所得的糖链切断的FcγRIIb胞外区流分中加入Fc(P238D)，使得以摩尔比计FcγRIIb胞外区稍稍过剩，用10000MWCO的超滤膜浓缩，然后用20mM HEPS pH7.5,0.05M NaCl平衡了的凝胶过滤柱色谱(Superdex200 10/300)纯化，得到Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的样品。
[Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的结晶]
将Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的样品用10000MWCO的超滤膜浓缩至约10mg/ml，通过沉滴蒸气扩散法进行结晶。结晶时使用Hydra II Plus One(MATRIX)，对于100mM Bis-Tris pH6.5、17％PEG3350、0.2M乙酸铵、2.7％(w/v)D-半乳糖的储液，按照储液:结晶样品＝0.2μl:0.2μl混合，制作结晶滴，密封后静置于20℃，成功获得薄板状的晶体。
[由Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物晶体测定X射线衍射数据]
将所得的Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的一个单晶浸于100mM Bis-Tris pH6.5、20％PEG3350、乙酸铵、2.7％(w/v)D-半乳糖、22.5％(v/v)乙二醇的溶液中，然后用带有小尼龙环的针从溶液中捞出，在液氮中冷冻，通过日本高能加速器研究机构(高エネルギー加速器研究機構)的同步辐射设备Photon Factory BL-1A进行X射线衍射数据的测定。测定中一直置于-178℃的氮气流中，保持冷冻状态，通过装有光束线(beam line)的CCD检测器Quantum270(ADSC)，使晶体每旋转0.8°得到1张X射线衍射图像，共收集225张。由所得的衍射图像进行的晶胞参数的确定、衍射斑点的系数的确定以及衍射数据的处理，是使用Xia2程序(CCP4软件包)、XDS Package(Walfgang Kabsch)和Scala(CCP4软件包)，得到最终分辨率达到
Figure BDA0002903322720000591
的衍射强度数据。该晶体属于空间群P21，晶胞参数
Figure BDA0002903322720000593
Figure BDA0002903322720000592
α＝90°、β＝100.70°、γ＝90°。
[Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的X射线晶体结构分析]
Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构确定是通过使用Phaser程序(CCP4软件包)的分子置换法进行。由所得晶格的大小和Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的分子量预测到非对称单元中的复合物的数量是一个。从Fc(WT)/FcγRIIIa胞外区复合物的晶体结构即PDB码:3SGJ的结构坐标中取出A链第239-340位以及B链第239-340位的氨基酸残基部分，作为另一坐标，分别用作Fc CH2结构域的探索用模型。同样从PDB码:3SGJ的结构坐标中取出A链第341-444位和B链第341-443位的氨基酸残基部分，作为一个坐标，用作FcCH3结构域的探索用模型。最后，从FcγRIIb胞外区的晶体结构即PDB码:2FCB的结构坐标中取出A链第6-178位的氨基酸残基部分，用作FcγRIIb胞外区的探索用模型。按照Fc CH3结构域、FcγRIIb胞外区、Fc CH2结构域的顺序，由旋转函数和平移函数确定各探索用模型在晶格内的方向和位置，获得了Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物晶体结构的初始模型。对于所得初始模型，在进行使2个Fc CH2结构域、2个Fc CH3结构域以及FcγRIIb胞外区移动的刚体精修时，此刻相对于
Figure BDA0002903322720000594
的衍射强度数据，晶体学的可靠性因子R值为40.4％，自由因子R值为41.9％。进一步根据使用Refmac5程序(CCP4软件包)的结构精修、以及由实验确定的结构因子Fo、和由模型计算的结构因子Fc、以及由模型计算的相位，计算2Fo-Fc、Fo-Fc，一边观察以此为系数的电子密度图一边通过Coot程序(Paul Emsley)进行模型的修正，将这些修正反复进行，由此进行模型的精修。最后，根据以2Fo-Fc、Fo-Fc为系数的电子密度图，将水分子掺入模型中，进行精修，由此，使用最终分辨率为
Figure BDA0002903322720000595
的24291个衍射强度数据，对于含有4846个非氢原子的模型，结晶学可靠性因子R值为23.7％，自由因子R值为27.6％。
[Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合物的模型结构制作]
以Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合物晶体结构即PDB码:3RY6的结构坐标为基础，使用Disovery Studio3.1程序(Accelrys)的构建突变体(Build Mutants)功能，向结构坐标中的FcγRIIa导入突变，使其与FcγRIIb的氨基酸序列匹配。此时，优化水平(Optimization Level)设定为高(High)，截止半径(Cut Radius)为4.5，产生5个模型，采用其中能量评分最好的作为Fc(WT)/FcγRIIb胞外区复合物的模型结构。
[实施例6]根据晶体结构确定了改变位置的Fc变体与FcγR的结合的分析根据实施例5得到的Fc(P238D)与FcγRIIb胞外区的复合物的X射线晶体结构分析结果，在EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变Fc上，对于被预测对与FcγRIIb的相互作用产生影响的部位(EU编号第233位、第240位、第241位、第263位、第265位、第266位、第267位、第268位、第271位、第273位、第295位、第296位、第298位、第300位、第323位、第325位、第326位、第327位、第328位、第330位、第332位、第334位的残基)导入综合改变，进一步研究与FcγRIIb的结合增强的组合变体。
制作向实施例2中制作的IL6R-G1d(SEQ ID NO:20)中导入了EU编号第439位的Lys置换为Glu的改变的IL6R-B3(SEQ ID NO:40)。接着，制作向IL6R-B3导入了EU编号第238位的Pro置换为Asp的改变的IL6R-BF648(SEQ ID NO:41)。共同使用IL6R-L(SEQ ID NO:22)作为抗体L链。按照参考例1的方法将这些变体进行抗体表达、纯化，根据参考例2的方法综合评价与各FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIaV型)的结合。
关于与各FcγR的相互作用分析结果，按照以下方法制图。将各变体与各FcγR的结合量的值除以作为对照的导入改变前的抗体(EU编号第238位的Pro置换为Asp的IL6R-BF648/IL6R-L)与各FcγR的结合量的值，再扩大100倍，将该值作为各变体与各FcγR的相对结合活性的值。横轴表示各变体与FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各变体与FcγRIIa R型的相对结合活性的值(图13)。
其结果如图13所示，发现在全部改变中的24种改变中，与导入改变前的抗体相比，具有维持或增强了与FcγRIIb的结合的效果。这些变体与各FcγR的结合示于表9。表中的SEQ ID NO表示所评价的变体的H链的SEQ ID NO，改变表示向IL6R-B3(SEQ ID NO:40)导入的改变。制作IL6R-B3时作为模板的IL6R-G1d/IL6R-L用*表示。
[表9]
Figure BDA0002903322720000611
表9所示的变体对FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRIIa H、FcγRIIb、FcγRIIIaV型的KD值是按照参考例2的方法测定，结果汇总于表10。表中的SEQ ID NO表示所评价的变体的H链的SEQ ID NO，改变表示向IL6R-B3(SEQ ID NO:40)导入的改变。制作IL6R-B3时作为模板的IL6R-G1d/IL6R-L用*表示。表中的KD(IIaR)/KD(IIb)和KD(IIaH)/KD(IIb)分别表示各变体对FcγRIIa R的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值所得的值、各变体对FcγRIIa H的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值所得的值。亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)是指：亲本多肽对FcγRIIb的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值所得的值。除此之外，各变体与FcγRIIaR和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值/亲本多肽与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值示于表10。这里，亲本多肽是指H链具有IL6R-B3(SEQ ID NO:40)的变体。表10中涂以灰色的方格表示FcγR与IgG的结合微弱，在动力学分析中判断为无法正确分析，因此是利用参考例2所述的式2计算的值：
[式2]
KD＝C·Rmax/(Req-RI)-C。
根据表10，与IL6R-B3相比，任意变体与FcγRIIb的亲和性提高，其提高的幅度为2.1-9.7倍。各变体对FcγRIIa R的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值之比和各变体对FcγRIIa H的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值之比表示：相对于与FcγRIIa R和与FcγRIIa H的结合活性的与FcγRIIb的相对结合活性。也就是说，该值是表示各变体对FcγRIIb的结合选择性高度的值，该值越大，对FcγRIIb的结合选择性越高。亲本多肽IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIa R的KD值/对FcγRIIb的KD值之比、以及对FcγRIIa H的KD值/对FcγRIIb的KD值之比分别为0.3、0.2，因此，与亲本多肽相比，表10的任意变体对FcγRIIb的结合选择性均提高。变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值/亲本多肽与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值为1以上意味着：该变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的结合、和亲本多肽与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的结合为同等或更为降低。本次所得的变体中，该值为4.6-34.0，因此可以说，本次所得的变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的结合比亲本多肽的更为降低。由这些结果表明，本次得到的变体与亲本多肽相比，与FcγRIIa R型和H型的结合活性维持或降低，同时与FcγRIIb的结合活性增强，对FcγRIIb的选择性提高。另外，与IL6R-B3相比，任意变体对FcγRIa和FcγRIIIaV的亲和性均降低。
[表10]
Figure BDA0002903322720000631
在所得的组合变体中，对于有希望的，由晶体结构考察了其效果的原因。图14表示Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的晶体结构。其中，位于左侧的H链标为Fc链A，位于右侧的H链标为Fc链B。这里，可知Fc链A中的EU编号第233位的部位位于FcγRIIb的EU编号第133位的Lys附近。该晶体结构中，未能良好观察到E233的侧链的电子密度，其处于运动性非常高的状态。因此，EU编号第233位的Glu置换为Asp的改变通过使侧链短一个碳，使侧链的自由度减小，结果，与FcγRIIb的EU编号第133位的Lys形成相互作用时的熵损失降低，结果可以推测，这有助于结合自由能的提高。
图15中表示在同样的Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物的结构中的EU编号第330位部位附近的环境。由该图可知，Fc(P238D)的Fc链A的EU编号第330位部位周边是由FcγRIIb的EU编号第85位的Ser、第86位的Glu、第163位的Lys等构成的亲水性环境。因此可以推测，EU编号第330位的Ala置换为Lys或者置换为Arg的改变有助于强化与FcγRIIb的EU编号第85位的Ser、以及EU编号第86位的Glu的相互作用。
图16表示通过基于Cα原子间距的最小二乘法将Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物以及Fc(WT)/FcγRIIIa胞外区复合物的晶体结构相对于Fc链B叠合后EU编号第271位的Pro的结构。这两种结构良好一致，但在EU编号第271位的Pro的部位形成不同的立体结构。另外，在Fc(P238D)/FcγRIIb胞外区复合物晶体结构中，结合考虑到该周边的电子密度弱，则在Fc(P238D)/FcγRIIb中，由于EU编号第271位是Pro，因此在结构上施加了很大的负荷，由此暗示了该环结构不能获得最佳结构的可能性。因此推测，EU编号第271位的Pro置换为Gly的改变使该环结构具有柔软性，在与FcγRIIb相互作用中，降低了获得最佳结构时的能垒，由此有助于结合增强。
[实施例7]通过与P238D组合来验证与FcγRIIb的结合增强的改变的组合效果实施例4、实施例6中得到的改变中，将可见与FcγRIIb的结合增强的效果，或者维持与FcγRIIb的结合、抑制与其它FcγR的结合的效果的改变相互组合，验证其效果。
与实施例6方法同样，从表6、9中选择特别优异的改变，组合导入抗体H链IL6R-BF648。抗体L链是共同使用IL6R-L，按照参考例1的方法使抗体表达并纯化，按照参考例2的方法综合评价与各FcγR(FcγRIa、FcγRIIa H型、FcγRIIa R型、FcγRIIb、FcγRIIIaV型)的结合。
关于与各FcγR的相互作用分析结果，按照以下方法计算相对结合活性。将各抗体与各FcγR的结合量的值除以作为对照的、导入改变前的抗体(EU编号第238位的Pro置换为Asp的IL6R-BF648/IL6R-L)与各FcγR结合量的值，再扩大100倍，将所得值作为各变体与各FcγR的相对结合活性的值。横轴表示各变体与FcγRIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各变体与FcγRIIa R型的相对结合活性的值(表11)。
表中的SEQ ID NO表示所评价的变体的H链的SEQ ID NO，改变表示向IL6R-B3(SEQID NO:40)导入的改变。制作IL6R-B3时作为模板的IL6R-G1d/IL6R-L用*表示。
[表11]
Figure BDA0002903322720000651
表11所示的变体对FcγRIa、FcγRIIa R、FcγRTIa H、FcγRIIb、FcγRIIIaV型的KD值是按照参考例2的方法测定，结果汇总于表12。表中的SEQ ID NO表示所评价的变体的H链的SEQ ID NO，改变表示向IL6R-B3(SEQ ID NO:40)导入的改变。制作IL6R-B3时作为模板的IL6R-G1d/IL6R-L用*表示。表中的KD(IIaR)/KD(IIb)和KD(IIaH)/KD(IIb)分别表示各变体对FcγRIIa R的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值所得的值、各变体对FcγRIIa H的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值所得的值。亲本多肽的KD(IIb)/改变多肽的KD(IIb)是指：亲本多肽对FcγRIIb的KD值除以各变体对FcγRIIb的KD值所得的值。除此之外，各变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值/亲本多肽与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值示于表12。这里，亲本多肽是指H链具有IL6R-B3(SEQID NO:40)的变体。表12中涂以灰色的方格表示由于FcγR与IgG的结合微弱，在动力学分析中判断为无法正确分析，因此是利用参考例2所述的式2计算的值：
[式2]
KD＝C·Rmax/(Req-RI)-C。
根据表12，与IL6R-B3相比，任意变体与FcγRIIb的亲和性均提高，其提高的幅度为3.0-99.0倍。各变体对FcγRIIa R的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值之比、以及各变体对FcγRIIa H的KD值/各变体对FcγRIIb的KD值之比表示：相对于与FcγRIIa R和FcγRIIaH的结合活性的与FcγRIIb的相对结合活性。也就是说，该值是表示各变体对FcγRIIb的结合选择性高度的值，该值越大，对FcγRIIb的结合选择性越高。亲本多肽IL6R-B3/IL6R-L对FcγRIIa R的KD值/对FcγRIIb的KD值之比、以及对FcγRIIa H的KD值/对FcγRIIb的KD值之比分别为0.3、0.2，因此，表12的任意变体与亲本多肽相比，与FcγRIIb的结合选择性提高。变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值/亲本多肽与FcγRIIaR和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的KD值为1以上意味着：该变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的结合，和亲本多肽与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的结合为同等或更为降低。本次所得的变体中，该值为0.7-29.9，因此可以说，本次所得的变体与FcγRIIa R和FcγRIIa H的结合活性中强的一方的结合与亲本多肽的相比大致同等或更为降低。由这些结果表明，与亲本多肽相比，本次得到的变体与FcγRIIaR型和H型的结合活性维持或降低，同时与FcγRIIb的结合活性增强，与FcγRIIb的选择性提高。另外，与IL6R-B3相比，任意变体对FcγRIa和FcγRIIIaV的亲和性降低。
[表12]
Figure BDA0002903322720000671
Figure BDA0002903322720000681
[参考例1]抗体表达载体的制作和抗体的表达和纯化编码抗体的可变区H链和L链的核苷酸序列的全长基因的合成是使用装配PCR等，按照本领域公知的方法进行。氨基酸置换的导入是使用PCR等，按照本领域公知的方法进行。将所得质粒片段插入动物细胞表达载体中，制作H链表达载体和L链表达载体。所得表达载体的核苷酸序列按照本领域公知的方法确定。将制作的质粒瞬时导入来自人胚肾癌细胞的HEK293H株(Invitrogen)或FreeStyle293细胞(Invitrogen)中，进行抗体的表达。回收所得培养物上清液，然后过0.22μm的过滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)或0.45μm的过滤器MILLEX(R)-GV(Millipore)，获得培养物上清液。使用rProtein A Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)或ProteinGSepharose 4 Fast Flow(GE Healthcare)，按照本领域公知的方法，从所得培养物上清液纯化抗体。对于纯化抗体浓度，使用分光光度计，测定280nm下的吸光度，采用由所得值按照PACE等方法计算的消光系数，计算抗体浓度(Protein Science 1995；4:2411-2423)。
[参考例2]FcγR的制备方法以及改变抗体与FcγR的相互作用分析方法按照以下方法制备FcγR的胞外结构域。首先，按照本领域技术人员公知的方法实施FcγR的胞外结构域的基因的合成。此时，各FcγR的序列根据登记于NCBI的信息制作。具体来说，FcγRI根据NCBI的登录号NM_000566.3的序列、FcγRIIa根据NCBI的登录号NM_001136219.1的序列、FcγRIIb根据NCBI的登录号NM_004001.3的序列、FcγRIIIa根据NCBI的登录号NM_001127593.1的序列、FcγRIIIb根据NCBI的登录号NM_000570.3的序列制作，在C末端连接His标签。另外，已知FcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIb是多态性，关于多态性部位，FcγRIIa是参考J.Exp.Med.,1990,172:19-25，FcγRIIIa是参考J.Clin.Invest.,1997,100(5):1059-1070，FcγRIIIb是参考J.Clin.Invest.,1989,84,1688-1691制作。
将所得基因片段插入动物细胞表达载体中，制作表达载体。将制作的表达载体瞬时导入来自人胚肾癌细胞的FreeSyle293细胞(Invitrogen)，表达目标蛋白。对于在晶体结构分析中使用的FcγRIIb，在终浓度10μg/mL的几夫碱存在下表达目标蛋白，使连接在FcγRIIb上的糖链为高甘露糖型。进行培养，回收所得培养物上清液，然后过0.22μm过滤器，获得培养物上清液。所得培养物上清液原则上按照以下4步纯化。第1步是实施阳离子交换柱色谱(SP Sepharose FF)，第2步是实施对His标签的亲和柱色谱(HisTrap HP)，第3步是实施凝胶过滤柱色谱(Superdex200)，第4步是实施无菌过滤。对于FcγRI，在第1步中实施使用Qsepharose FF的阴离子交换柱色谱。对于纯化的蛋白质，使用分光光度计测定280nm下的吸光度，按照PACE等方法，由所得值计算消光系数，使用该消光系数计算纯化蛋白质的浓度(Protein Science 1995；4:2411-2423)。
使用Biacore T100(GE Healthcare)、Biacore T200(GE Healthcare)、BiacoreA100、Biacore 4000，进行各改变抗体与上述制备的Fcγ受体的相互作用分析。运行缓冲液使用HBS-EP+(GE Healthcare)，测定温度为25℃。使用的芯片如下：通过胺偶联法将抗原肽、A蛋白(Thermo Scientific)、A/G蛋白(Thermo Scientific)、L蛋白(ACTIGEN或BioVision)固定于S系列传感芯片CM5(GE Healthcare)或S系列传感芯片CM4(GEHealthcare)上所得的芯片；或者使预先进行了生物素化的抗原肽与S系列传感芯片SA(经验证的)(GE Healthcare)相互作用并固定的芯片。
将目标抗体捕获在这些传感芯片上，与用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，测定与抗体的结合量，在抗体之间进行比较。Fcγ受体的结合量与被捕获的抗体的量相关，因此，用各抗体的捕获量除Fcγ受体的结合量，用所得校正值进行比较。还用10mM甘氨酸-HCl、pH1.5与其反应，由此洗涤捕获在传感芯片上的抗体，使传感芯片再生，重复使用。
另外，用于计算各改变抗体对FcγR的KD值的动力学分析是按照以下方法实施。首先，将目标抗体捕获在上述传感芯片上，与用运行缓冲液稀释的Fcγ受体相互作用，对于所得的传感图谱，通过Biacore评价软件(Biacore Evaluation Software)，将测定结果用1:1Langmuir结合模型进行全局拟合，计算结合速率常数ka(L/mol/s)、解离速率常数kd(1/s)，由该值计算解离常数KD(mol/L)。
在判断各改变抗体与FcγR的相互作用微弱，用上述动力学分析无法正确分析时，对于该相互作用，是利用Biacore T100软件手册BR1006-48版本AE中记载的以下的1:1结合模型式计算KD。
通过1:1结合模型相互作用的分子在Biacore上的行为可由下式1表示：
[式1]
Req＝C·Rmax/(KD+C)+RI
Req：稳态结合水平与被分析物浓度的关系
C：浓度
RI：样品中的体积折射率贡献
Rmax：表面的被分析物结合能力。
将该式变形，则KD可如下式2表示：
[式2]
KD＝C·Rmax/(Req-RI)-C。
将Rmax、RI、C的值代入该式中，可计算KD。RI、C可由测定结果的传感图谱、测定条件求出其值。关于Rmax的计算是遵循以下方法。对于作为在测定的同时进行评价的比较对象的、相互作用足够强的抗体，在用上述1:1Langmuir结合模型进行全局拟合时得到Rmax的值，将该值除以作为比较对象的抗体在传感芯片上的捕获量，再乘以待评价的改变抗体的捕获量，将所得值作为Rmax。
产业实用性
本发明提供与亲本多肽相比含有下述Fc区的多肽，该Fc区与H型和R型中任意遗传多态性的FcγRIIa的结合活性均维持或降低，且与FcγRIIb的结合活性增强。通过使用相对于FcγRIIa的任意遗传多态性(H型、R型)，对FcγRIIb的结合选择性增强的该多肽，对于具有R型和H型中任意遗传多态性的患者均可以转导FcγRIIb的ITIM的磷酸化介导的炎性免疫反应抑制性信号。另外，通过使抗体的Fc具有与FcγRIIb选择性结合的性质，通过FcγRIIb介导的免疫抑制性作用，存在可抑制抗抗体的产生的可能性。
Figure IDA0002903322790000011
Figure IDA0002903322790000021
Figure IDA0002903322790000031
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Claims (10)

1.多肽，该多肽是含有至少一个氨基酸发生改变的抗体Fc区的多肽变体，其中，该多肽与亲本多肽相比，与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性维持或降低，与FcγRIIb的结合活性增强，且[多肽变体对FcγRIIa(R型)的KD值]/[多肽变体对FcγRIIb的KD值]之值为1.2以上。
2.权利要求1的多肽，其中，[多肽变体对FcγRIIa(H型)的KD值]/[多肽变体对FcγRIIb的KD值]之值为4.2以上。
3.权利要求1或2的多肽，其中，[亲本多肽对FcγRIIb的KD值]/[多肽变体对FcγRIIb的KD值]之值为1.6以上。
4.权利要求1-3中任一项的多肽，其中，[多肽变体与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性中强的一方的KD值]/[亲本多肽与FcγRIIa(R型)和FcγRIIa(H型)的结合活性中强的一方的KD值]之值为0.7以上。
5.权利要求1-4中任一项的多肽，其中，该多肽与亲本多肽相比，与FcγRIIIa的结合活性维持或降低。
6.权利要求1-5中任一项的多肽，其中，该多肽与亲本多肽相比，与FcγRIa的结合活性维持或降低。
7.权利要求1-6中任一项的多肽，其中，氨基酸改变是EU编号第238位的Pro置换为Asp或EU编号第328位的Leu置换为Glu。
8.权利要求1-7中任一项的多肽，其中，氨基酸改变是选自以下的至少一个置换：EU编号第238位的Pro置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Trp、EU编号第237位的Gly置换为Phe、EU编号第267位的Ser置换为Val、EU编号第267位的Ser置换为Gln、EU编号第268位的His置换为Asn、EU编号第271位的Pro置换为Gly、EU编号第326位的Lys置换为Leu、EU编号第326位的Lys置换为Gln、EU编号第326位的Lys置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Met、EU编号第239位的Ser置换为Asp、EU编号第267位的Ser置换为Ala、EU编号第234位的Leu置换为Trp、EU编号第234位的Leu置换为Tyr、EU编号第237位的Gly置换为Ala、EU编号第237位的Gly置换为Asp、EU编号第237位的Gly置换为Glu、EU编号第237位的Gly置换为Leu、EU编号第237位的Gly置换为Met、EU编号第237位的Gly置换为Tyr、EU编号第330位的Ala置换为Lys、EU编号第330位的Ala置换为Arg、EU编号第233位的Glu置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Asp、EU编号第268位的His置换为Glu、EU编号第326位的Lys置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ser、EU编号第326位的Lys置换为Thr、EU编号第323位的Val置换为Ile、EU编号第323位的Val置换为Leu、EU编号第323位的Val置换为Met、EU编号第296位的Tyr置换为Asp、EU编号第326位的Lys置换为Ala、EU编号第326位的Lys置换为Asn、和EU编号第330位的Ala置换为Met。
9.权利要求1-8中任一项的多肽，其中，上述含有抗体Fc区的多肽为IgG抗体。
10.权利要求1-8中任一项的多肽，其中，上述含有抗体Fc区的多肽是Fc融合蛋白质分子。
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