KR20220079590A - Fc 돌연변이 및 부위-특이적인 접합 성질을 포함하는 항체 조성물 - Google Patents

Fc 돌연변이 및 부위-특이적인 접합 성질을 포함하는 항체 조성물 Download PDF

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소혜 강
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Abstract

L234A, L235A, 및 L328C에서 삼중 돌연변이를 함유하는, Her2, EGFR, Trop2, CDH3 또는 다른 TAA에 결합하는 항체, 및 이러한 삼중 돌연변이된 항체의 제조 방법이 본원에 개시된다. 결론적으로, 삼중 돌연변이된 항체는 Fc 침묵을 통해 변형된 이펙터 기능을 함유하고, L328C에서 부위-특이적으로 접합하여 항체-약물-접합체 (ADC)를 형성할 수 있으며, 이는 환자에게 투여될 수 있고, 암, 면역학적 및 신경학적 장애의 치료 방법을 제공할 수 있다.

Description

Fc 돌연변이 및 부위-특이적인 접합 성질을 포함하는 항체 조성물
관련 출원의 상호 참고
본 출원은 2019년 10월 4일에 출원한 미국 가특허 출원 번호 62/973,475를 우선권 주장하며, 이는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록의 제출
종이 사본으로 하기 제출 내용은 그의 전문이 본원에 완전히 포함된다: 2020년 10월 2일에 기록된 서열 목록의 종이 사본
연방 지원하에 이루어진 본 발명에 대한 권리의 진술
해당 없음.
기술분야
본원에 기재된 발명은 Fc 침묵 및 부위-특이적인 접합을 비롯하여 여러 개의 기능적 성질을 포함하도록 조작된 항체, 그의 항원-결합 단편, 항체 약물 접합체 (ADC), 및 항체 붕소 접합체 (ABC)에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 암 및 면역학적 및 신경학적 장애의 치료에 유용한 예후적, 예방적 및 치료적 방법 및 조성물에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 관상동맥 질환에 이어 두 번째 주요 사망 원인이다. 매년 수백만 명이 암으로 사망하고, 미국에서만 매년 50만 명이 넘는 사람들이 사망하며, 2017년도에 1,688,780 건의 새로운 암 사례가 진단되었다 (미국 암 학회(American Cancer Society)). 심장 질환으로 인한 사망이 크게 감소하고 있지만, 암으로 인한 사망은 전반적으로 증가하고 있다. 2040년도까지 전세계적으로 매년 1,600만 명이 넘는 암 사망이 있을 것으로 추정되며 (출처; 국제 암 연구 기관(International Agency for Research on Cancer, 2018), 따라서 의료 발달이 현재의 추세를 변화시키지 않는다면 주요 사망 원인으로서 심장 질환을 능가할 것이다.
몇몇 암은 사망률이 높은 것으로 두드러진다. 특히, 폐 (모든 암 사망의 18.4%), 유방 (모든 암 사망의 6.6%), 결장직장 (모든 암 사망의 9.2%), 간 (모든 암 사망의 8.2%), 및 위 (모든 암 사망의 8.2%)의 암종이 전세계적으로 모든 연령에서 남녀 모두의 주요 암 사망 원인으로 나타난다 (GLOBOCAN 2018). 이들 및 거의 모든 다른 암종은 극히 소수의 예외를 제외하고는 원발성 종양으로부터 멀리 떨어져 있는 부위로 전이한다는 점에서 공통적인 치명성을 공유한다. 더욱이, 초기에 그들의 원발성 암으로부터 생존한 암 환자의 경우에도, 그들의 삶이 극적으로 변경되는 공통된 경험을 나타내었다. 여러 암 환자는 재발 또는 치료 실패 가능성에 대한 인식으로 인해 유도되는 강한 불안을 경험한다. 여러 암 환자는 또한 치료 후 신체적 쇠약을 경험한다. 추가로, 여러 암 환자는 그들의 질환의 재발을 경험한다.
암 요법이 지난 수십 년에 걸쳐 개선되었고, 생존율이 증가되었지만, 암의 이질성은 여러 치료 방식을 이용하는 새로운 치료 전략을 여전히 요구한다. 이는 때때로 표준 방사선요법 및/또는 화학요법으로 제한되는 해부학적으로 중요한 부위에서의 고형 종양 (예를 들어, 교모세포종, 두경부의 편평상피 암종, 및 폐 선암종)을 치료하는 경우에 특히 그렇다. 그럼에도 불구하고, 이들 요법의 해로운 효과는 화학- 및 방사선 내성이며, 이는 환자의 삶의 질을 감소시키는 중증 부작용 외에도 국소 재발, 원격 전이 및 두번째 원발성 종양을 촉진시킨다.
암 및 다른 의학적 상태와 싸우는데 있어서, 모노클로날 항체 (mAb)의 치료적 유용성 (G. KOHLER and C. MILSTEIN, Nature 256:495-497 (1975))이 실현되고 있다. MAb는 이제 이식, 암, 감염성 질환, 심혈관 질환 및 염증에서의 치료법으로 승인되었다. 상이한 이소타입은 상이한 이펙터 기능을 갖는다. 기능에서의 이러한 차이는 다양한 면역글로불린 이소타입에 대한 뚜렷한 3차원 구조에서 반영된다 (P. M. ALZARI et al., Annual Rev. Immunol., 6:555-580 (1988)).
일반적으로, 항체는 수많은 메카니즘에 의해 작용하며, 대부분은 면역계의 다른 부문과 관련이 있다. 항체는 단순히 분자의 상호작용을 차단할 수 있거나, 또는 이들은 C1 복합체 상의 C1q와 클러스터화된 항체 사이의 상호작용에 의해 전형적인 보체 경로 (보체 의존성 세포독성 또는 CDC로 공지됨)를 활성화시킬 수 있다. 결정적으로, 항체는 또한 Fc 수용체의 결합을 통해 항체-매개된 및 세포-매개된 면역 반응 사이의 연결 고리의 역할을 한다.
Fc 조작 접근법을 이용하여, Fc 도메인과 Fc 감마 수용체 및 C1q의 주요 상호작용 부위를 결정한 다음, 이들 위치를 돌연변이시켜서, 이펙터 기능 조절 및 감소된 독성 등과 같은 치료적 성질을 개선시키기 위한 노력으로 결합을 감소시키거나 또는 제거하였다. [HEZAREH, et al., J. Virol. 75(24):12161-8 (Dec. 2001) 및 OGANESYAN, et al., Acta Crystallographica. D. Biol Crystallogr, 64:(Pt. 6):700-4 (Jun 2008)]을 참고한다.
또한, 항체-약물 접합체 (ADC)는 전통적인 화학요법에 비해 개선된 치료 지수를 갖는 표적화된 치료제의 신흥 부류이다. 약물 및 링커는 (모노클로날) 항체 (mAb) 및 표적 선택 외에도 ADC 발달에 중점을 두었다. 그러나, 최근에, 접합체 동질성의 중요성이 연구되었다. 항체로 조작된 표면-노출된 시스테인 잔기를 사용한 다음, 링커 약물에 접합시켜, 정의된 약물-대-항체 비 (DAR)를 갖는 부위-특이적으로 접합된 ADC를 생성하는 부위-특이적인 접합 기술을 적용시킴으로써 ADC의 약리학적 프로파일이 개선될 수 있는 것으로 보고되었다. 통상적인 리신 및 시스테인 접합 방법론을 이용하여 생성된 이질성 혼합물과 비교하여, 부위-특이적으로 접합된 ADC는 일반적으로 적어도 동등한 생체내 효능, 개서된 PK, 및 확장된 치료 범위를 입증하였다.
선행 기술은 부위 특이적인 접합을 수득하고 ADC를 생성하기 위한 몇몇 접근법을 개시한다. 예를 들어, WO2006/034488 (제넨테크(Genentech)), [SUTHERLAND, et al., Blood 122(8):1455-1463 (2013)], WO2014/124316 (노바티스(Novartis)), 및 US2017/0080103 (신톤 바이오파마슈티컬즈(Synthon Biopharmaceuticals)) 등을 참고한다.
지금까지 개시된 모든 선행 기술 방법에서는, 동질성 및 약동학적 성질을 개선시키기 위한 목적으로, 표면/용매-노출된 위치에서, 높은 티올 반응성을 나타내는 위치에서 및 특이적으로 모노클로날 항체의 불변 영역의 위치에서 링커 약물을 접합시키는 부위에 중점을 두었다.
상기 기재된 통상적인 리신 및 시스테인 접합 방법이 FDA-승인된 항체-약물 접합체를 유도하였고, 이들이 현재 임상전 및 임상 실험 중인 수많은 ADC의 대부분을 구축하는데 사용되고 있지만, 허용가능한 항원 결합 성질, 생체내 효능, 치료 지수, 및/또는 안정성을 갖는 ADC를 수득하기 위해서는 ADC의 물리화학적, 약동학적, 약리학적 및/또는 독성학적 성질을 (추가로) 개선시키기 위한 목적으로 새로운 접합 전략이 여전히 요구된다.
상기 언급으로부터, 암 및 면역학적 질환을 치료하기 위해 새로운 치료 패러다임이 필요하다는 것이 관련 기술분야의 기술자에게 용이하게 자명할 것이다. 최신의 항체 조직 기술 뿐만 아니라 새로운 접합 방법론을 이용함으로써, 더욱 효과적인 치료, 감소된 부작용 및 보다 낮은 생산 비용을 전반적인 목적으로 하는 새로운 부류의 항체가 달성될 수 있다.
관련 기술분야에 공지된 현재의 결함을 감안할 때, 본 발명의 목적은 항체 이펙터 기능을 감소시키고 부위 특이적인 접합점을 포함하기 위해 삼중 돌연변이를 갖도록 조작된 항체를 이용하여 새롭고 개선된 항체 및 결합 리간드, 및 암(들), 면역학적 장애 및 다른 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 Her2, EGFR, Trop2, CDH3을 비롯하여 이로 제한되지 않는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 단백질의 폴리펩티드 단편을 비롯하여 이로 제한되지 않는 단백질에 결합하는 항체, 항원-결합 단편, 항체 약물 접합체 (ADC), 항체 면역 변형 접합체, 및 항체 붕소 접합체 (ABC)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 치료제와 접합된 완전 인간 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 보릴화된 화합물과 접합된 완전 인간 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fc 침묵을 통해 이펙터 기능을 감소시키도록 조작되었다. 일부 실시양태에서, 항체는 약물 모이어티에 접합할 수 있는 부위-특이적인 돌연변이를 함유한다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fc가 침묵되고, 약물 모이어티와의 접합을 위해 부위-특이적인 돌연변이가 삽입되게 하는 삼중 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 삼중 돌연변이는 L234A, L235A, L328C를 포함한다.
본 발명은 추가로 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 종양 관련 항원 (TAA), 예컨대 표 IV에 나열된 것들을 발현하는 암을 치료하기 위한 다양한 면역원성 또는 치료적 조성물, 예컨대 항체, 항체 약물 접합체, 및 전략을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 삼중 돌연변이체 항체를 합성하는 방법을 교시한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 삼중 돌연변이체 항체를 합성하고, 약물 모이어티를 그에 대한 부위-특이적인 위치에서 접합시키는 방법을 교시한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 단일 돌연변이체 항체를 합성하는 방법을 교시한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 단일 돌연변이체 항체를 합성하고, 약물 모이어티를 그에 대한 부위-특이적인 위치에서 접합시키는 방법을 교시한다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 인간에서 암(들), 면역학적 장애 및 다른 질환을 치료하는 방법을 교시한다.
도 1. 항-Her2 Mab 및 Fc 변이체: Fc 변이체는 표적 결합에 영향을 미치지 않는다.
도 2. 항-EGFR Mab No. 1 및 Fc 변이체: Fc 변이체는 표적 결합에 영향을 미치지 않는다.
도 3. 항-EGFR Mab No. 2 및 Fc 변이체: Fc 변이체는 표적 결합에 영향을 미치지 않는다.
도 4. 항-EGFR Mab No. 3 및 Fc 변이체: Fc 변이체는 표적 결합에 영향을 미치지 않는다.
도 5. 항-Trop2 Mab 및 Fc 변이체: Fc 변이체는 표적 결합에 영향을 미치지 않는다.
도 6. 항-CDH3 Mab 및 Fc 변이체: Fc 변이체는 표적 결합에 영향을 미치지 않는다.
도 7. 항-Her2 Mab 및 Fc 변이체: FcγRI 결합의 완전한 억제가 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 8. 항-EGFR Mab No. 1 및 Fc 변이체: FcγRI 결합의 완전한 억제가 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 9. 항-EGFR Mab No. 2 및 Fc 변이체: FcγRI 결합의 완전한 억제가 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 10. 항-EGFR Mab No. 3 및 Fc 변이체: FcγRI 결합의 거의 완전한 억제가 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 11. 항-Trop2 Mab 및 Fc 변이체: FcγRI 결합의 완전한 억제가 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 12. 항-CDH3 Mab 및 Fc 변이체: FcγRI 결합의 거의 완전한 억제가 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 13. 항-Her2 Mab 및 Fc 변이체: FcγRIIA 결합의 억제가 단일 및 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 14. 항-EGFR Mab No. 1 및 Fc 변이체: FcγRIIA 결합의 억제가 단일 및 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 15. 항-Trop2 Mab 및 Fc 변이체: FcγRIIA 결합의 억제가 단일 및 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 16. 항-CDH3 Mab 및 Fc 변이체: FcγRIIA 결합의 억제가 단일 및 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 17. 항-Her2 Mab 및 Fc 변이체: FcγRIIIa 결합의 억제가 단일 및 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 18. 항-EGFR Mab No. 1 및 Fc 변이체: FcγRIIIa 결합의 억제가 단일 및 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 19. 항-EGFR Mab No. 2 및 Fc 변이체: FcγRIIIa 결합의 억제가 단일 및 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 20. 항-EGFR Mab No. 3 및 Fc 변이체: FcγRIIIa 결합의 억제가 단일 및 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 21. 항-Trop2 Mab 및 Fc 변이체: FcγRIIIa 결합의 억제가 단일 및 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 22. 항-CDH3 Mab 및 Fc 변이체: FcγRIIIa 결합의 억제가 단일 및 삼중 돌연변이체에 대해 관찰된다.
도 23. 항-Her2 Mab 및 Fc 변이체: FcRn 결합에서의 실질적인 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰되지 않는다.
도 24. 항-EGFR Mab No. 1 및 Fc 변이체: FcRn 결합에서의 실질적인 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰되지 않는다.
도 25. 항-EGFR Mab No. 2 및 Fc 변이체: FcRn 결합에서의 실질적인 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰되지 않는다.
도 26. 항-EGFR Mab No. 3 및 Fc 변이체: FcRn 결합에서의 실질적인 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰되지 않는다.
도 27. 항-Trop2 Mab 및 Fc 변이체: FcRn 결합에서의 실질적인 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰되지 않는다.
도 28. 항-CDH3 Mab 및 Fc 변이체: FcRn 결합에서의 실질적인 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰되지 않는다.
도 29. FcγRI, IIA, IIB, IIIA, IIIB 및 FcRn에 대한 항-Her2 항체 및 Fc 변이체의 결합 동역학 분석. 삼중 돌연변이체는 모든 FcγR 이소형에 대해 실질적인 결합 억제를 나타내지만, FcRn에 대해서는 그렇지 않다.
도 30. FcγRI에 대한 항-Her2 항체 및 Fc 변이체의 결합 동역학 분석. 해리 속도는 야생형 및 단일 돌연변이와 비교하여 삼중 돌연변이의 경우에 더 빠르다.
도 31. 항-HER2 mAb 및 Fc 변이체: ADCC에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 32. 항-EGFR mAb No. 1 및 Fc 변이체: ADCC에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 33. 항-Trop2 mAb 및 Fc 변이체: ADCC에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 34. 항-CDH3 mAb 및 Fc 변이체: ADCC에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 35. 항-HER2 mAb 및 Fc 변이체: CDC에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 36. 항-EGFR mAb No. 1 및 Fc 변이체: CDC에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 37. 항-Trop2 mAb 및 Fc 변이체: CDC에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 38. 항-CDH3 mAb 및 Fc 변이체: CDC에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 39. 항-HER2 mAb 및 Fc 변이체: C1q 결합에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 40. 항-EGFR mAb No. 1 및 Fc 변이체: C1q 결합에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 41. 항-Trop2 mAb 및 Fc 변이체: C1q 결합에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 42. 항-CDH3 mAb 및 Fc 변이체: C1q 결합에서의 감소가 Fc 변이체에 의해 관찰된다.
도 43. 독점 페이로드 (LOL1)와 접합된 항-Her2 Mab 삼중 돌연변이체의 역상 컬럼 크로마토그래피 프로파일. 접합되지 않은 삼중 돌연변이체 항-HER2 mAb (피크 1) 접합된 삼중 돌연변이체 항-HER2 mAb (피크 2)의 겹쳐진 UV 추적.
도 44. LOL1-접합된 삼중 돌연변이체 항-HER2 mAb의 온전한 질량 분석을 통해, 접합체가 100% 부위-특이적임을 확인하였다. (A). 전체 스펙트럼, (B). 확대된 LC 영역, (C). 확대된 HC 영역.
도 45. vcMMAE와 접합된 항-HER2 (A) 및 항-EGFR mAb (B)의 L328C 변이체에 대한 역상 컬럼 크로마토그래피 프로파일. 단일 페이로드를 갖는 중쇄 (H1)가 주요 종이며, 이는 접합이 부위-특이적이고, 페이로드가 힌지 영역 내가 아니라 Cys328 상에 존재함을 시사한다.
도 46. vcMMAE와 접합된 항-TROP2 mAb의 L328C 변이체에 대한 역상 컬럼 크로마토그래피 프로파일. (A). 경쇄 (피크 1), 접합되지 않은 중쇄 (피크 2), 1개의 페이로드를 갖는 접합된 중쇄 (피크 3); 2 및 3개의 페이로드를 갖는 접합된 중쇄 (피크 4-5). (B). mAb 및 ADC의 겹쳐진 UV214nm 추적. 항-TROP2 항체의 접합되지 않은 L328C 변이체 (흑색); 항-TROP2 항체의 vcMMAE 접합된 L328C 변이체 (적색).
도 47. vcMMAE와 접합된 삼중 돌연변이체 항-TROP2 mAb의 역상 HPLC 분석. (A). 경쇄 (피크 1), 접합되지 않은 중쇄 (피크 2), 1개의 페이로드를 갖는 접합된 중쇄 (피크 3); 각각 2 및 3개의 페이로드를 갖는 접합된 중쇄 (피크 4-5). (B). mAb 및 ADC의 겹쳐진 UV214nm 추적. 항-TROP2 항체의 접합되지 않은 L328C 변이체 (흑색); 항-TROP2 항체의 vcMMAE 접합된 L328C 변이체 (적색).
도 48. vcMMAE와 접합된 항-EGFR mAb의 L234A, L235A, L328C 변이체에 대한 역상 컬럼 크로마토그래피 프로파일. (A). 삼중 Fc 돌연변이를 갖는 접합되지 않은 항-EGFR mAb No. 3에 대한 프로파일. (B). 삼중 Fc 돌연변이를 갖는 접합되지 않은 항-EGFR mAb No. 1에 대한 프로파일. (C). 삼중 Fc 돌연변이를 갖는 vcMMAE 접합된 항-EGFR mAb No. 3에 대한 프로파일. (D). 삼중 Fc 돌연변이를 갖는 vcMMAE 접합된 항-EGFR mAb No. 1에 대한 프로파일.
도 49. 역상 컬럼 크로마토그래피 데이터를 기반으로 하는 피크 배치 및 DAR 계산의 예 (도 48에 제공됨). 접합되지 않은 mAb (대조군)를 사용하여, 체류 시간, 및 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 UV250/280 비 모두 확인하였다. 이들 파라미터는 정확한 피크 배치 및 DAR 결정을 위해 필요하였다.
도 50. 생성된 ADC의 분석 속성의 요약: 평균 DAR, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의한 % 단량체, 및 DAR1 중쇄의 %가 단일 또는 삼중 Fc 변이체를 갖는 vcMMAE 또는 LOL1 접합된 mAb에 대해 도시된다.
도 51. vcMMAE-펩티드의 단편화 이후 특징적인 딸 이온.
도 52. vcMMAE와 접합된 삼중 돌연변이체를 갖는 항-EGFR 항체 No.1의 서열 적용범위. (A). 중쇄, (B). 경쇄.
도 53. (A). 삼중 돌연변이를 갖는 접합되지 않은 항-EGFR 항체 No. 1, (B) 삼중 돌연변이를 갖는 vcMMAE-접합된 항-EGFR 항체 No. 1에 대해 트립신에 의한 소화 후에 펩티드의 대표적인 TIC 크로마토그램.
도 54. 삼중 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체 No. 1에 대한 접합 부위는 ACPAPIEK 중쇄 펩티드의 MS/MS를 통해 확인하였다. ACPAPIEK-카르바미도메틸 (예를 들어 알킬화된 mAb, A, B) 및 ACPAPIEK-vcMMAE (C,D) 펩티드의 전체 MS (A, C) 및 MS/MS에 의한 단편화 (B, D)가 도시된다. 펩티드 또는 vcMMAE를 나타내는 단편은 각각 채워진 또는 빈 화살표로 표시된다.
도 55. ACPAPIEK 중쇄 펩티드의 MS/MS를 통해 단일 돌연변이 ADC를 갖는 항-EGFR 항체 No. 1에서 접합 부위의 확인. ACPAPIEK-카르바미도메틸 (예를 들어 알킬화된 mAb, A,B) 및 ACPAPIEK-vcMMAE (C,D) 펩티드의 전체 MS (A, C) 및 MS/MS에 의한 단편화 (B, D)가 도시된다. 펩티드 또는 vcMMAE를 나타내는 단편은 각각 채워진 또는 빈 화살표로 표시된다.
도 56. vcMMAE와 접합된 항-HER2 항체의 L328C 변이체에 의해 매개된 세포독성. HCC1954 (Her2/neu 양성) 세포를 72 내지 96 시간 동안 인큐베이션하였고, 생존 세포의 %를 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 세포 생존력 검정을 이용하여 측정하였다.
도 57. vcMMAE와 접합된 항-EGFR 항체 No.1의 L328C 변이체에 의해 매개된 세포독성. MDA-MB-468 (EGFR 양성) 세포를 72 내지 96 시간 동안 인큐베이션하였고, 생존 세포의 %를 셀타이터-글로 세포 생존력 검정을 이용하여 측정하였다.
도 58. vcMMAE와 접합된 항-EGFR 항체 No. 1의 L234A, L235A, L328C 변이체에 의해 매개된 세포독성. MDA-MB-468 (EGFR 양성) 세포를 72 내지 96 시간 동안 인큐베이션하였고, 생존 세포의 %를 셀타이터-글로 세포 생존력 검정을 이용하여 측정하였다.
도 59. vcMMAE와 접합된 항-EGFR 항체 No. 3의 L234A, L235A, L328C 변이체에 의해 매개된 세포독성. MDA-MB-468 (EGFR 양성) 세포를 72 내지 96 시간 동안 인큐베이션하였고, 생존 세포의 %를 셀타이터-글로 세포 생존력 검정을 이용하여 측정하였다.
도 60. vcMMAE와 접합된 항-Trop2 항체의 L328C 변이체에 의해 매개된 세포독성. SK BR3 (TROP2 양성) 세포를 72 내지 96 시간 동안 인큐베이션하였고, 생존 세포의 %를 셀타이터-글로 세포 생존력 검정을 이용하여 측정하였다.
도 61. vcMMAE와 접합된 항-Trop2 항체의 L234A, L235A, L328C 변이체에 의해 매개된 세포독성. SK BR3 (TROP2 양성) 세포를 72 내지 96 시간 동안 인큐베이션하였고, 생존 세포의 %를 셀타이터-글로 세포 생존력 검정을 이용하여 측정하였다.
섹션 개요
I.) 정의
II.) 항체
III.) 이펙터 기능을 변형시키기 위한 Fc 돌연변이
IV.) 항체-약물-접합체
V.) ADC에 대한 부위-특이적인 접합 포맷
VI.) 링커 단위
VII.) 스트레처 단위
VIII.) 아미노산 단위
IX.) 스페이서 단위
X.) 약물 단위
XI.) ADC의 세포독성 효과를 결정하는 방법
XII.) Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 TAA를 발현하는 암(들)의 치료
XIII.) 조합 요법
XIV.) 키트/제조 물품
I.) 정의:
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술분야의 용어, 표기법 및 다른 과학적 용어 또는 전문용어는 문맥상 명백히 달리 나타내지 않는다면 본 발명이 속한 기술분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어들은 명확성을 위해 및/또는 용이한 참고를 위해 본원에서 정의되며, 본원에서 이러한 정의의 포함은 관련 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에서 상표명이 사용되는 경우, 상표명에 대한 언급은 문맥상 달리 나타내지 않는다면 제품 제형, 제네릭 약물, 및 상표명 제품의 활성 제약 성분(들) 또한 지칭한다.
용어 "진행된 암", "국소적으로 진행된 암", "진행된 질환" 및 "국소적으로 진행된 질환"은 관련 조직 캡슐을 통해 확장된 암을 의미하며, 미국 비뇨기과 학회(American Urological Association, AUA) 시스템하의 단계 C 질환, 위트모어-쥬벳(Whitmore-Jewett) 시스템하의 단계 C1-C2 질환, 및 TNM (종양, 결절, 전이) 시스템하의 단계 T3-T4 및 N+ 질환을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 국소적으로 진행된 질환을 가진 환자에게는 수술이 권장되지 않고, 이들 환자는 임상적으로 국소화된 (장기-국한된) 암을 가진 환자와 비교하여 실질적으로 덜 유리한 결과를 갖는다.
용어 "치환된"은 특정한 기 또는 모이어티가 1개 이상의 치환기를 갖는 것을 의미한다. 용어 "비치환된"은 특정한 기가 치환기를 갖지 않음을 의미한다. 용어 "임의적으로 치환된"은 특정한 기가 비치환되거나 또는 1개 이상의 치환기로 치환된 것을 의미한다. 용어 "치환된"이 구조 시스템을 기재하기 위해 사용되는 경우, 치환은 시스템 상의 임의의 원자가-허용 위치에서 발생함을 의미한다.
용어 "항체"는 명백하게 달리 나타내지 않는다면 가장 넓은 의미로 사용된다. 따라서, "항체"는 천연 발생일 수 있거나, 또는 통상적인 하이브리도마 또는 트렌스제닉 마우스 기술에 의해 생성되는 모노클로날 항체와 같이 인공적일 수 있다. Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및/또는 TAA 항체는 모노클로날 및 폴리클로날 항체 뿐만 아니라, 이들 항체의 항원-결합 도메인 및/또는 1개 이상의 상보성 결정 영역을 함유하는 단편을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 및/또는 임의의 TAA에 특이적으로 결합하고/거나 원하는 생물학적 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체 또는 그의 단편을 지칭하며, 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중 특이적인 항체 (예를 들어, 이중 특이적인 항체), 및 항체 단편 (Her2, EGFR, Trop2, CDH3에 특이적으로 결합하고/거나 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한)을 포함한다. 임의의 특이적인 항체는 본원에 제공된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 용어 "항체"는 경쇄 면역글로불린 분자로부터의 적어도 1개의 가변 영역 및 중쇄 분자로부터의 적어도 1개의 가변 영역을 포함하는 분자를 포괄하며, 이들은 조합되어 표적 항원에 대한 특이적인 결합 부위를 형성한다. 한 실시양태에서, 항체는 IgG 항체이다. 예를 들어, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 본 발명의 방법 및 조성물에서 유용한 항체는 세포 배양물, 파지, 효모, 또는 소, 토끼, 염소, 마우스, 래트, 햄스터, 기니 피그, 양, 개, 고양이, 원숭이, 침팬지 및 유인원을 비롯하여 이로 제한되지 않는 다양한 동물에서 생성될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 포유동물 항체이다. 파지 기술을 이용하여 초기 항체를 단리하거나 또는 변경된 특이성 또는 결합력 특징을 갖는 변이체를 생성할 수 있다. 이러한 기술은 일상적이고, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 항체는 관련 기술분야에 공지된 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 재조합 항체는 항체를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터로 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 생성될 수 있다. 1개 이상의 벡터를 사용하여 숙주 세포에서 적어도 1개의 VL 및 적어도 1개의 VH 영역을 발현하는 DNA 서열을 형질감염시킬 수 있다. 항체 생성 및 생산의 재조합 수단에 대한 예시적인 설명은 [Delves, ANTIBODY PRODUCTION: ESSENTIAL TECHNIQUES (Wiley, 1997); SHEPARD, et al., MONOCLONAL ANTIBODIES (Oxford University Press, 2000); GODING, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (Academic Press, 1993); 및 CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (John Wiley & Sons, most recent edition)]에 포함되어 있다. 본 발명의 항체는 원하는 기능을 매개하는데 있어서 항체의 효능을 증가시키기 위해 재조합 수단에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 항체가 재조합 수단을 이용하여 치환에 의해 변형될 수 있다는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 전형적으로, 치환은 보존적인 치환일 것이다. 예를 들어, 항체의 불변 영역에서 적어도 1개의 아미노산은 상이한 잔기로 대체될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,624,821, 미국 특허 번호 6,194,551, 출원 번호 WO 9958572; 및 [ANGAL, et al., Mol. Immunol. 30: 105-08 (1993)]을 참고한다. 아미노산에서의 변형에는 아미노산의 결실, 부가 및 치환이 포함된다. 일부 경우에, 이러한 변화를 통해 원치않는 활성, 예를 들어 보체-의존성 세포독성을 감소시킨다. 빈번하게는, 항체는 검출가능한 신호를 제공하는 물질에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합함으로써 표지된다. 다양한 표지 및 접합 기술이 공지되어 있고, 과학 및 특허 문헌 둘 다에서 광범위하게 보고되어 있다. 이들 항체는 정상인 또는 결함이 있는 FLT3과의 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, [ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press, 1996)]을 참고한다. 원하는 생물학적 활성을 갖는 적합한 항체는 하기 시험관내 검정, 예컨대 비제한적으로 증식, 이동, 부착, 연한천 성장, 혈관신생, 세포-세포 소통, 아폽토시스, 수송, 신호 변환, 및 하기 생체내 검정, 예컨대 종양 성장 억제를 이용하여 확인될 수 있다. 본원에 제공된 항체는 또한 진단적 적용에 유용할 수 있다. 포획 또는 비-중화 항체로서, 이들은 항원의 수용체-결합 또는 생물학적 활성을 억제하지 않고 특이적인 항원에 결합하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 중화 항체로서, 항체는 경쟁 결합 검정에서 유용할 수 있다. 이들은 또한 Her2, EGFR, Trop2, 및/또는 CDH3 또는 그의 수용체를 정량화하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 단편" 또는 "항체 단편" (또는 간단히 "항체 부분")은 항원 (예를 들어, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및/또는 변이체)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 및/또는 TAA 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편 (WARD et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어, [BIRD et al. (1988) Science 242:423-426; 및 HUSTON et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)] 참고)를 형성하는 것인 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 결합될 수 있다. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 단편" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Fc"는 힌지 영역, CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 영역을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항원"의 임의의 형태를 이용하여, 본 발명의 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 및/또는 임의의 TAA에 대해 특이적인 항체를 생성할 수 있다. 따라서, 유도 항원은 단독으로 또는 관련 기술분야에 공지된 1종 이상의 면역원성 증강제와 조합된 단일 에피토프, 다중 에피토프, 또는 전체 단백질일 수 있다. 유도 항원은 단리된 전장 단백질, 세포 표면 단백질 (예를 들어, 항원의 적어도 일부분으로 형질감염된 세포로 면역화), 또는 가용성 단백질 (예를 들어, 단백질의 세포외 도메인 부분으로만 면역화)일 수 있다. 항원은 유전자 변형된 세포에서 생성될 수 있다. 항원을 코딩하는 DNA는 게놈성 또는 비-게놈성 (예를 들어, cDNA)일 수 있고, 세포외 도메인의 적어도 일부분을 코딩한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항원의 맥락에서 용어 "일부분"은 관심 항원의 면역원성 에피토프를 구성하기 위해 적절한 경우 아미노산 또는 핵산의 최소 개수를 지칭한다. 아데노바이러스성 벡터, 플라스미드, 및 비-바이러스성 벡터, 예컨대 양이온성 지질을 비롯하여 이로 제한되지 않는 관심 세포의 형질전환에 적합한 임의의 유전자 벡터가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원의 방법 및 조성물의 항체는 관심 표적의 세포외 도메인의 적어도 일부분에 특이적으로 결합한다.
본원에 제공된 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 "생물활성제"를 구성할 수 있거나 또는 그의 일부분일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물활성제"는 항원에 결합하고/거나 원하는 생물학적 효과를 증강시키거나 또는 매개하여 세포-사멸 독소를 증강시키는 임의의 합성 또는 천연 발생 화합물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 본 발명에 유용한 결합 단편은 생물학적으로 활성인 단편이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생물학적 활성"은 원하는 항원성 에피토프에 결합할 수 있고, 생물학적 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 발휘할 수 있는 항체 또는 항체 단편을 지칭한다. 직접적인 효과에는 성장 신호의 조절, 자극 및/또는 억제, 항-아폽토시스성 신호의 조절, 자극 및/또는 억제, 아폽토시스성 또는 괴사성 신호의 조절, 자극 및/또는 억제, ADCC 캐스케이드의 조절, 자극 및/또는 억제, 및 CDC 캐스케이드 및/또는 Fc 침묵의 조절, 자극 및/또는 억제가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항원 결합 단백질과 관련하여 용어 "특이적으로 결합한다"는 항원 결합 단백질이 다른 (예를 들어, 관련이 없는) 단백질과 결합하지 않거나 또는 유의하게 결합하지 않고 표적 뿐만 아니라 표적 내의 별개의 도메인 또는 별개의 아미노산 서열에 결합하는 의미한다. 그러나, 이 용어는 항체 또는 그의 결합 단편이 밀접하게 관련된 분자와도 교차 반응성일 수 있다는 사실을 배제하지 않는다. 항체 및 그의 단편 뿐만 아니라, 본원에 기재된 것들을 포함하는 항체 약물 접합체는 밀접하게 관련된 분자와 결합하는 것에 비해 적어도 2, 5, 10, 50, 100 또는 1000배 더 큰 친화도로 본원에 개시된 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 및/또는 TAA에 특이적으로 결합할 수 있다.
"이중 특이적인" 항체 또한 본 발명의 방법 및 조성물에서 유용하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이중 특이적인 항체"는 항체, 전형적으로 적어도 2가지 상이한 항원성 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 에피토프는 동일한 항원으로부터의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 에피토프는 2가지 상이한 항원으로부터의 것이다. 이중 특이적인 항체를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 이중 특이적인 항체는 2가지 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현을 이용하여 재조합적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, [MILSTEIN et al., Nature 305:537-39 (1983)]을 참고한다. 대안적으로, 이중 특이적인 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, [BRENNAN, et al., Science 229:81 (1985)]을 참고한다. 이중 특이적인 항체에는 이중 특이적인 항체 단편이 포함된다. 예를 들어, [HOLLINGER, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-48 (1993), GRUBER, et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)]를 참고한다.
본원에 기재된 모노클로날 항체에는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이지만, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성인 "키메라" 항체, 뿐만 아니라 표적 항원에 특이적으로 결합하고/거나 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편이 포함된다 (미국 특허 번호 4,816,567; 및 [MORRISON et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)]).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "암", "신생물" 및 "종양"은 상호교환가능하게 사용되며, 단수 또는 복수 형태로 숙주 유기체에 대해 병원성이게 만드는 악성의 형질전환을 거친 세포를 지칭한다. 원발성 암 세포 (즉, 악성의 형질전환 부위 근처에서 수득된 세포)는 널리 확립된 기술, 특히 조직학적 실험에 의해 암이 아닌 세포와 용이하게 구별될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 암 세포의 정의에는 원발성 암 세포 뿐만 아니라 암 세포 조상으로부터 유래된 임의의 세포가 포함된다. 여기에는 전이된 암 세포, 및 암 세포로부터 유래된 시험관내 배양물 및 세포주가 포함된다. 일반적으로 고형 종양으로 나타내는 암의 유형을 지칭할 때, "임상적으로 검출가능한" 종양은 예를 들어 CAT 스캔, MR 영상화, X-선, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의해 종양 덩어리를 기반으로 하여 검출가능하고/거나, 환자로부터 입수가능한 샘플에서 하나 이상의 암-특이적인 항원의 발현 때문에 검출가능한 것이다. 종양은 조혈성 종양, 예를 들어 액체 종양을 의미하는 혈액 세포의 종양 등일 수 있다. 이러한 종양을 기반으로 하는 임상 상태의 구체적인 예에는 백혈병, 예컨대 만성 골수구성 백혈병 또는 급성 골수구성 백혈병; 골수종, 예컨대 다발성 골수종; 림프종 등이 포함된다.
용어 "치료제"는 본원에서 정의된 바와 같이 치료적 이익을 제공하고/거나 치료에 효과적인 모든 작용제를 지칭한다. 치료제는 예를 들어 질환, 장애 또는 상태의 진행을 역전시키거나, 향상시키거나, 경감시키거나, 억제하거나 또는 제한하거나, 또는 그의 중증도를 감소시키거나, 또는 암과 같은 질환의 하나 이상의 증상에 영향을 미치거나 또는 그를 개선시키거나 또는 향상시킨다. 이러한 작용제는 세포독성제 또는 세포정지제일 수 있다. 상기 용어에는 본원에서 정의된 바와 같이 화학요법제, 항-신생물제 및 "약물 단위" 작용제가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
용어 "항-신생물제"는 신생물 또는 암의 치료에서 본원에서 정의된 바와 같이 치료적 이익을 제공하고/거나 치료적으로 효과적인 모든 작용제를 지칭한다.
용어 "화학요법제"는 종양 성장을 억제하는데 효과적인 모든 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제의 비제한적인 예에는 알킬화제; 예를 들어 질소 머스타드, 에틸렌이민 화합물 및 알킬 술포네이트; 항대사물, 예를 들어 엽산, 퓨린 또는 피리미딘 길항제; 유사분열 억제제, 예를 들어 항-튜불린제, 예컨대 빈카 알칼로이드, 아우리스타틴 및 포도필로톡신 유도체; 세포독성 항생제; DNA 발현 또는 복제를 손상시키거나 또는 간섭하는 화합물, 예를 들어, DNA 마이너 그루브 결합제; 및 성장 인자 수용체 길항제가 포함된다. 또한, 화학요법제에는 세포독성제 (본원에서 정의된 바와 같음), 항체, 생물학적 분자 및 소분자가 포함된다.
용어 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"은 항원 특이성 및 결합 친화도를 부여하는, 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비연속적인 서열을 지칭하는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에 세 개의 (3) CDR (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) 및 각각의 경쇄 가변 영역에 세 개의 (3) CDR (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)이 있다.
주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 [Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.] ("카바트(Kabat)" 넘버링 방식), [AL-LAZIKANI et al., (1997) JMB 273, 927-948] ("코티아(Chothia)" 넘버링 방식), [MACCALLUM et al.,　J. Mol. Biol.　262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,"　J. Mol. Biol.　262, 732-745."] (접촉" 넘버링 방식), [LEFRANC M. P. et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,"　Dev Comp Immunol,　2003 January; 27(1):55-77] ("IMGT" 넘버링 방식), 및 [HONEGGER A. and PLICKTHUN A., "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,"　J Mol Biol,　2001 Jun. 8; 309(3):657-70] (AHo 넘버링 방식)에 기재된 것들을 비롯하여 임의의 수많은 널리 공지된 방식을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다.
주어진 CDR의 경계는 확인을 위해 사용되는 방식에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 카바트 방식은 구조적 정렬을 기반으로 하는 반면에, 코티아 방식은 구조적 정보를 기반으로 한다. 카바트 및 코티아 방식 둘 다에 대한 넘버링은 가장 공통되는 항체 영역 서열 길이를 기반으로 하며, 삽입은 삽입 문자, 예를 들어 "30a"로 수용되고, 결실은 일부 항체에서 나타난다. 두 방식은 상이한 위치에서 특정한 삽입 및 결실 ("indel")을 배치하여, 구별되는 넘버링을 생성한다. 접촉 방식은 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 하며, 여러 측면에서 코티아 넘버링 방식과 유사하다.
따라서, 달리 명시되지 않는다면, 용어 주어진 항체 또는 그의 영역, 예컨대 가변 영역의 "CDR" 및 "상보성 결정 영역", 뿐만 아니라 항체 또는 그의 영역의 개별 CDR (예를 들어, "CDR-H1, CDR-H2)은 본원에서 상기 기재된 임의의 공지되 방식에 의해 정의되는 바와 같이 상보성 결정 영역을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 예에서, 특정한 CDR 또는 CDR들을 확인하는 방식은 카바트, 코티아 또는 접촉 방법에 의해 정의되는 CDR과 같이 명시된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보존적인 치환"은 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있고 일반적으로 생성된 분자의 생물학적 활성을 변경시키지 않고 이루어질 수 있는 아미노산 및/또는 아미노산 서열의 치환을 지칭한다. 관련 기술분야의 기술자는 일반적으로 폴리펩티드의 비-필수 영역에서 단일 아미노산 치환이 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것을 인식한다 (예를 들어, [WATSON, et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Edition 1987)] 참고). 이러한 예시적인 치환은 바람직하게는 표 II 및 표(들) III에 제시된 것에 따라 이루어진다. 예를 들어, 이러한 변화에는 이소류신 (I), 발린 (V) 및 류신 (L) 중 어느 것이 이들 소수성 아미노산 중 다른 것으로 치환; 아스파르트산 (D)이 글루탐산 (E)으로 치환 및 그 반대로의 치환; 글루타민 (Q)이 아스파라긴 (N)으로 치환 및 그 반대로의 치환; 및 세린 (S)이 트레오닌 (T)으로 치환 및 그 반대로의 치환이 포함된다. 다른 치환 또한 특정한 아미노산의 환경, 및 단백질의 3차원 구조에서 그의 역할에 따라 보존적인 것으로 고려될 수 있다. 예를 들어, 글리신 (G) 및 알라닌 (A)은 알라닌 (A) 및 발린 (V)과 마찬가지로 빈번하게 상호교환가능할 수 있다. 비교적 소수성인 메티오닌 (M)은 빈번하게 류신 및 이소류신과, 때때로 발린과 상호교환될 수 있다. 리신 (K) 및 아르기닌 (R)은 아미노산 잔기의 유의한 특징이 그의 전하인 위치에서 빈번하게 상호교환가능하고, 이들 두 아미노산 잔기의 pK 차이는 유의하지 않다. 여전히 다른 변화는 특정한 환경에서 "보존적인" 것으로 고려될 수 있다 (예를 들어 본원의 표 III; [pages 13-15 "Biochemistry" 2nd ED. Lubert Stryer ed (Stanford University); HENIKOFF et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; LEI et al., J Biol Chem 1995 May 19; 270(20):11882-6] 참고). 다른 치환 또한 허용되며, 경험적으로 또는 공지된 보존적인 치환에 따라 결정될 수 있다.
용어 "세포독성제"는 세포의 발현 활성, 세포의 기능을 억제하거나 또는 방지하고/거나, 세포의 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 상기 용어에는 방사성 동위원소, 화학요법제, 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 효소적으로 활성인 독소, 예컨대 이들의 단편 및/또는 변이체가 포함되는 것으로 의도된다. 세포독성제의 예에는 아우리스타틴, 아우로마이신, 메이탄시노이드, 리신, 리신 A-쇄, 콤브레스타틴, 듀오카르마이신, 돌라스타틴, 독소루비신, 다우노루비신, 탁솔, 시스플라틴, cc1065, 에티듐 브로마이드, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 디히드록시 안트라신 디온, 악티노마이신, 디프테리아 독소, 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소 (PE) A, PE40, 아브린, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 큐리신, 크로틴, 칼리케아미신, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 및 글루코코르티코이드 및 다른 화학요법제, 뿐만 아니라 방사성 동위원소, 예컨대 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212 또는 213, P32, 및 Lu의 방사성 동위원소, 예컨대 Lu177이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 항체를 비롯하여 항체는 또한 상기 언급된 임의의 세포독성제에 접합될 수 있고, 또한 전구-약물을 그의 활성 형태로 전환시킬 수 있는 항암 전구-약물 활성화 효소에 접합될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 지칭하며, 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄 (VH-VL)에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 쇄의 두 도메인 사이에서 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 쌍을 형성하여, 2개의 항원-결합 부위를 생성하게 한다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 [HOLLINGER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48 (1993)]에 더욱 완벽하게 기재되어 있다.
용어 "상동체"는 예를 들어 상응하는 위치에서 동일한 또는 유사한 화학적 잔기의 서열을 가짐으로써 또 다른 분자에 대해 상동성을 나타내는 분자를 지칭한다.
용어 "동일한" 또는 "서열 동일성"은 최적으로 정렬되고 적절한 삽입 또는 결실과 비교할 때 두 핵산 또는 두 아미노산 서열 사이의 동일성 정도를 나타낸다.
두 서열 사이의 "% 동일성"은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 개수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 개수의 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 위치의 개수 / 위치의 총 개수 x 100). 서열의 비교 및 두 서열 사이의 % 동일성의 결정은 하기 기재되는 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다. 두 뉴클레오티드 서열 사이의 % 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 또한 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 있는 [Meyers, et al., Comput. Appi. Biosci., 4:11-17 (1988)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 또한 블로썸(Blossum) 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램에 통합된 [NEEDLEMAN, et al., J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)] 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열은 기준 서열과 100% 동일한 기준 폴리뉴클레오티드 서열과 동일할 수 있거나, 또는 기준 서열과 비교하여 뉴클레오티드 변경을 특정한 정수 개수까지 포함할 수 있으며, 예컨대 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 또는 99% 동일하다. 이러한 변경은 적어도 1개의 뉴클레오티드 결실, 치환, 예컨대 전이 및 전환, 또는 삽입으로부터 선택되고, 상기 변경은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 발생할 수 있거나, 또는 기준 서열의 뉴클레오티드 중에서 개별적으로 산재되어 또는 기준 서열 내의 1개 이상의 연속한 기에서 이들 말단 위치 사이의 어디에서나 발생할 수 있다. 뉴클레오티드 변경의 개수는 본원에 기재된 기준 폴리뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 총 개수를 각각의 % 동일성의 수치 %와 곱하고 (100으로 나눔), 기준 폴리뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 상기 총 개수로부터 해당 산출값을 차감함으로써 결정되거나, 또는 nn≤xn-(xny)에 의해 결정되며, 여기서 nn은 뉴클레오티드 변경의 개수이고, xn은 본원에 기재된 기준 폴리뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오티드의 총 개수이고 (예시적인 기준 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 "서열 목록"에서 핵산 서열 참고), y는 50%의 경우 0.50, 60%의 경우 0.60, 70%의 경우 0.70, 75%의 경우 0.75, 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85, 90%의 경우 0.90, 95%의 경우 0.95, 98%의 경우 0.98, 99%의 경우 0.99 또는 100%의 경우 1.00이고, 곱셉 연산자에 대한 기호이며, xn 및 y의 임의의 비-정수 산출값은 xn으로부터 그를 차감하기 전에 가장 가까운 정수값으로 반올림한다. 유사하게, 폴리펩티드 서열은 본원에 기재된 폴리펩티드 기준 서열과 동일할 수 있고, 즉 100% 동일하거나, 또는 % 동일성이 100% 미만이도록, 예컨대 적어도 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 또는 99% 동일하도록 기준 서열과 비교하여 아미노산 변경을 특정한 정수 개수까지 포함할 수 있다. 이러한 변경은 적어도 1개의 아미노산 결실, 치환, 예컨대 보존적인 및 비-보존적인 치환, 또는 삽입으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 변경은 기준 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치에서 발생할 수 있거나, 또는 기준 서열의 아미노산 중에서 개별적으로 산재되어 또는 기준 서열 내의 1개 이상의 연속한 기에서 이들 말단 위치 사이의 어디에서나 발생할 수 있다. 주어진 % 동일성에 대한 아미노산 변경의 개수는 폴리펩티드 기준 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열에서 아미노산의 총 개수를 각각의 % 동일성의 수치 %와 곱한 다음 (100으로 나눔), 본원에 기재된 폴리펩티드 기준 서열에서 아미노산의 상기 총 개수로부터 해당 산출값을 차감함으로써 결정되거나, 또는 na≤xa-(xay)에 의해 결정되며, 여기서 na는 아미노산 변경의 개수이고, xa는 기준 폴리펩티드 서열에서 아미노산의 총 개수이고, y는 50%의 경우 0.50, 60%의 경우 0.60, 70%의 경우 0.70, 75%의 경우 0.75, 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85, 90%의 경우 0.90, 95%의 경우 0.95, 98%의 경우 0.98, 99%의 경우 0.99 또는 100%의 경우 1.00이고, 곱셉 연산자에 대한 기호이며, xa 및 y의 임의의 비-정수 산출값은 xa로부터 그를 차감하기 전에 가장 가까운 정수값으로 반올림한다. % 동일성은 서열의 길이에 걸쳐 결정될 수 있다. 본원에서 정의된 바와 같이, 용어 "75% 초과로 동일한"에는 75%, 80%, 85%, 95% 및 99% 초과의 동일성 뿐만 아니라, 이 범위 내의 모든 개별 값 및 이산 하위 범위가 포함된다.
한 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 "인간 항체"이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 상보성 결정 영역 (CDR)을 비롯하여 경쇄 및 중쇄 서열의 전체 서열이 본질적으로 인간 유전자로부터의 것인 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 트리오마 기술, 인간 B-세포 기술 (예를 들어, [KOZBOR, et al., Immunol. Today 4: 72 (1983)] 참고), EBV 형질전환 기술 (예를 들어, [COLE et al. MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY 77-96 (1985)] 참고), 또는 파지 디스플레이 (예를 들어, [MARKS et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991)] 참고)에 의해 제조된다. 구체적인 실시양태에서, 인간 항체는 트렌스제닉 마우스에서 생성된다. 이러한 부분 내지 완전 인간 항체를 제조하기 위한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 임의의 이러한 기술이 사용될 수 있다. 한 특히 바람직한 실시양태에 따라, 완전 인간 항체 서열은 인간 중쇄 및 경쇄 항체 유전자를 발현하도록 조작된 트렌스제닉 마우스에서 제조된다. 인간 항체를 생성하는 트렌스제닉 마우스 및 그의 자손을 제조하는 것에 대한 예시적인 설명은 출원 번호 WO 02/43478 및 미국 특허 번호 6,657,103 (아브제닉스(Abgenix))에서 확인된다. 이어서, 원하는 항체를 생성하는 트렌스제닉 마우스로부터의 B 세포는 항체의 연속 생성을 위한 하이브리도마 세포주를 제조하기 위해 융합될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 및 5,545,806; 및 [JAKOBOVITS, Adv. Drug Del. Rev. 31:33-42 (1998); GREEN, et al., J. Exp. Med. 188:483-95 (1998)]을 참고한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체로부터의 서열 뿐만 아니라 인간 항체를 함유하는 항체의 형태를 지칭한다. 이러한 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래되는 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개의 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 서열의 것들이다. 인간화 항체는 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부분을 임의적으로 포함할 것이디. 예를 들어, 카빌리(CABILLY), 미국 특허 번호 4,816,567; [QUEEN, et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033; 및 ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL APPROACH (Oxford University Press 1996)]을 참고한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "억제하다" 또는 "억제"는 측정가능한 양만큼 감소시키거나 또는 완전히 방지하는 것을 의미한다.
용어 "포유동물"은 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말 및 인간을 비롯하여 포유동물로 분류되는 임의의 유기체를 지칭한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 포유동물은 마우스이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
용어 "전이성 암" 및 "전이성 질환"은 국소 림프절 또는 멀리 있는 부위로 전파된 암을 의미하며, AUA 시스템하에 단계 D 질환 및 TNM 시스템하에 단계 TxNxM+을 포함하는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형된"은 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드에 대한 변화의 존재를 지칭한다. 이러한 변화 또는 변형은 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 합성후 변형에 의해, 또는 공동-번역에 의해, 또는 천연 아미노산, 비천연 아미노산, 천연 아미노산 폴리펩티드 또는 비천연 아미노산 폴리펩티드의 번역후 변형에 의해 수득될 수 있다.
"분자 인식"은 숙주 분자가 제2 분자 (즉, 손님)와 복합체를 형성할 수 있는 화학적 사건을 의미한다. 이 과정은 수소 결합, 소수성 상호작용, 이온성 상호작용을 비롯하여 이로 제한되지 않는 비-공유적인 화학적 결합을 통해 발생한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득되는 항체를 지칭하며, 즉, 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원성 에피토프에 대해 지시된다. 대조적으로, 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 상이한 에피토프에 대해 지시된 (또는 그에 대해 특이적인) 여러 항체를 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리클로날 항체는 다중 항원성 에피토프를 함유하는 단일 항원 내에서 상이한 에피토프 특이성, 친화도 또는 결합력을 갖는 다수개의 모노클로날 항체를 함유한다. 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종인 집단으로부터 수득되는 항체의 특징을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 [KOHLER et al., Nature 256: 495 (1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참고). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 [CLACKSON et al., Nature 352: 624-628 (1991) 및 MARKS et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 이들 모노클로날 항체는 일반적으로 ELISA에 의해 결정되는 바와 같이 일반적으로 적어도 약 1 μM, 더욱 일반적으로 적어도 약 300 nM, 전형적으로 적어도 약 30 nM, 바람직하게는 적어도 약 10 nM, 더욱 바람직하게는 적어도 약 3 nM 또는 그 초과의 Kd로 결합할 것이다.
"비천연 아미노산" 또는 달리 "nnAA"로 표기되는 것은 이십 개 (20)의 일반적인 아미노산 또는 피로리신 또는 셀레노시스테인 중 하나가 아닌 아미노산을 지칭한다. 용어 nnAA와 동의어로 사용될 수 있는 다른 용어는 "비천연의 코딩된 아미노산", "비천연 아미노산", "비천연 발생 아미노산"이다. 추가로, 용어 nnAA에는 천연 발생하지 않고, 합성에 의해 수득될 수 있거나, 또는 비천연 아미노산의 변형에 의해 수득될 수 있는 아미노산이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
"제약용 부형제"는 아주반트, 담체, pH-조정제 및 완충화제, 장성 조정제, 습윤제, 보존제 등과 같은 물질을 포함한다.
"제약상 허용가능한"은 무독성, 비활성, 및/또는 인간 또는 다른 포유동물과 생리학적으로 상용성인 조성물을 지칭한다.
용어 "폴리펩티드"는 적어도 약 4, 5, 6, 7 또는 8개 아미노산의 중합체를 지칭한다. 명세서에 걸쳐, 아미노산에 대한 표준 3 문자 (표 II 참고) 또는 단일 문자 지정이 사용된다. 관련 기술분야에서, 이 용어는 종종 "펩티드" 또는 "단백질"과 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일-쇄 Fv" 또는 "scFv" 또는 "단일 쇄" 항체는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하며, 이는 sFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 한다. sFv의 검토를 위해, [PLUCKTHUN, THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]를 참고한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적인" 및 "특이적으로 결합한다"는 항체와 표적 항원 에피토프의 선택적인 결합을 지칭한다. 항체는 주어진 조건의 세트하에서 적절한 항원에 대한 결합을 관련이 없는 항원 또는 항원 혼합물에 대한 결합과 비교함으로써 결합의 특이성에 대해 시험될 수 있다. 항체가 관련이 없는 항원 또는 항원 혼합물에 비해 적절한 항원에 적어도 2, 5, 7배, 바람직하게는 10배 넘게 결합하는 경우, 이는 특이적인 것으로 고려된다. 한 실시양태에서, 특이적인 항체는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 항원에만 결합하고, 관련이 없는 항원에는 결합하지 않는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 특이적인 항체는 인간 Her2, EGFR, Trop2, CDH3-4 항원에는 결합하지만, Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 아미노산 상동성을 갖는 비-인간 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원에는 결합하지 않는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 특이적인 항체는 인간 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원에는 결합하지만, Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원의 아미노산 서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 % 동일성을 갖는 비-인간 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원에는 결합하지 않는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 특이적인 항체는 인간 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원에 결합하고 뮤린 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원에 결합하지만, 인간 항원에 더 큰 정도로 결합하는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 특이적인 항체는 인간 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원에 결합하고 영장류 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원에 결합하지만, 인간 항원에 더 높은 정도로 결합하는 것이다. 또 다른 실시양태에서, 특이적인 항체는 인간 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원 및 임의의 비-인간 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 항원에 결합하지만, 인간 항원 또는 이들의 임의의 조합물에 더 높은 정도로 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료하다" 또는 "치료적" 및 문법적으로 관련된 용어는 질환의 임의의 결과의 임의의 개선, 예컨대 연장된 생존, 낮은 이환율, 및/또는 대안적인 치료 방식의 임의의 부산물인 부작용의 감소를 지칭하며; 관련 기술분야에서 용이하게 이해되는 바와 같이, 질환의 완전한 근절이 바람직하지만, 치료 행위에 대한 요건은 아니다.
용어 "변이체"는 구체적으로 기재된 단백질 (예를 들어 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 단백질)의 상응하는 위치(들)에서 1개 이상의 상이한 아미노산 잔기를 갖는 단백질과 같이 기재된 유형 또는 기준으로부터 변화를 나타내는 분자를 지칭하며, 유사체는 변이체 단백질의 예이다. 스플라이스 이소형 및 단일 뉴클레오티드 다형체 (SNP)는 변이체의 추가의 예이다.
II.) 항체
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 개시된 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA에 결합하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3 및 다른 TAA-관련 단백질에 결합하는 항체.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 및 다른 TAA 항체는 암에서 (예를 들어, 표 I 참고), 예후 검정, 영상화, 진단적 및 치료적 방법론을 위해 특히 유용하다. 한 실시양태에서, 암의 검출에서, 예를 들어 면역검정에서 사용되는 본원에 개시된 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA 결합 검정이다. 유사하게, 이러한 항체는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및/또는 다른 TAA가 이들 다른 암에서 또한 발현되거나 또는 과발현되는 정도로 (예를 들어 치료제와 조합될 때, ADC에서, 암 (예를 들어, 표 I에 제시된 암)의 치료 및/또는 진단에서) 유용하다. 더욱이, 세포내에서 발현된 항체 (예를 들어, 단일 쇄 항체)는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 표적의 발현과 관련 있는 암을 치료하는데 치료적으로 유용하다.
항체, 구체적으로 모노클로날 항체의 제조를 위한 다양한 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 항체는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA-관련 단백질, 펩티드, 또는 단편을 이용하여 적합한 포유동물 숙주를 면역화시킴으로써 단리된 또는 면역접합된 형태로 제조될 수 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press, Eds., Harlow, and Lane (1988); Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). 또한, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA의 융합 단백질, 예컨대 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 GST-융합 단백질 또한 사용될 수 있다. 특별한 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3의 모든 또는 대부분의 아미노산 서열을 포함하는 GST 융합 단백질을 생성한 다음, 면역원으로서 사용하여, 적절한 항체를 생성한다. 또 다른 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA-관련 단백질을 합성하여 면역원으로 사용한다.
또한, 관련 기술분야에 공지된 네이키드 DNA 면역화 기술을 이용하여 (정제된 Her2, EGFR, 및 다른 TAA-관련 단백질 또는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA 발현 세포를 사용하거나 또는 사용하지 않고) 코딩된 면역원에 대한 면역 반응을 생성한다 (검토를 위해, [DONNELLY et al., 1997, Ann. Rev. Immunol. 15: 617-648]을 참고한다).
Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA 항체의 생성을 위한 바람직한 방법은 본원에 제공된 실시예에서 추가로 설명된다. 면역원으로 사용하기 위한 단백질 또는 폴리펩티드를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 단백질과 담체, 예컨대 BSA, KLH 또는 또 다른 담체 단백질의 면역원성 접합체를 제조하는 방법 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 일부 상황에서, 예를 들어 카르보디이미드 시약을 사용하는 직접적인 접합이 이용되고; 다른 예에서, 연결 시약, 예컨대 피어스 케미컬 코.(Pierce Chemical Co., 일리노이주 록포드)에 의해 공급된 것들이 효과적이다. 관련 기술분야에서 이해되는 바와 같이, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA 면역원의 투여는 종종 적합한 기간에 걸쳐 적합한 아주반트를 사용하여 주사에 의해 수행된다. 면역화 스케쥴 동안에, 항체의 역가를 취하여 항체 형성의 적절성을 결정할 수 있다.
Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 다양한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 불멸화 세포주는 일반적으로 공지된 바와 같이 콜러(Kohler) 및 밀스테인(Milstein)의 표준 하이브리도마 기술, 또는 항체-생성 B 세포를 불멸화시키는 변형을 이용하여 제조된다. 원하는 항체를 분비하는 불멸화된 세포주는 항원이 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA-관련 단백질인 면역검정에 의해 스크리닝된다. 적절한 불멸화된 세포 배양물이 확인되면, 세포를 확장시킬 수 있고, 항체를 시험관내 배양물로부터 또는 복수액으로부터 생성할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 단편은 또한 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다. Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA 단백질의 원하는 영역에 특이적으로 결합하는 영역 또한 다중 종 기원의 키메라 또는 상보성-결정 영역 (CDR) 그래프팅된 항체의 맥락에서 생성될 수 있다. 인간화 또는 인간 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA 항체 또한 생성될 수 있고, 치료적 맥락에서 사용하기에 바람직하다. 비-인간 항체 CDR 중 1개 이상을 상응하는 인간 항체 서열로 치환시킴으로써 뮤린 및 다른 비-인간 항체를 인간화시키는 방법은 널리 공지되어 있다 (예를 들어, [JONES et al., 1986, Nature 321: 522-525; RIECHMANN et al., 1988, Nature 332: 323-327; VERHOEYEN et al., 1988, Science 239: 1534-1536] 참고). 또한, [CARTER et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 및 SIMS et al., 1993, J. Immunol. 151: 2296]을 참고한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 면역글로불린 중쇄 (VH, DH, 및 JH 세그먼트) 및/또는 카파 경쇄 (VK 및 JK) 유전자좌에서 내인성 마우스 가변 세그먼트를 보유하는 게놈성 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 인간 면역글로불린 중쇄 (VH, DH, 및 JH) 및/또는 카파 경쇄 (VK 및 JK) 유전자좌의 재배열되지 않은 생식계열 가변 세그먼트를 보유하는 인간 게놈성 서열로 대체된 것인 벨로크이뮨(VelocImmune) 마우스를 사용하여 제조될 수 있다 (리제너론(Regeneron, 뉴욕주 테리타운). 예를 들어, 미국 특허 번호 6,586,251, 6,596,541, 7,105,348, 6,528,313, 6,638,768, 및 6,528,314를 참고한다.
또한, 본 발명의 인간 항체는 내인성 뮤 및 카파 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화된 돌연변이와 함께 재배열되지 않은 인간 중쇄 (뮤 및 감마) 및 카파 경쇄 면역글로불린 서열을 코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니 유전자좌를 함유하는 HuMAb 마우스 (메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.))를 사용하여 생성될 수 있다 (예를 들어, [LONBERG, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859] 참고).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 완전 인간 항체는 트랜스진 및 트랜스염색체에 대한 인간 면역글로불린 서열을 보유하는 마우스, 예컨대 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스염색체를 보유하는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 마우스는 본원에서 "KM 마우스"로 지칭되고, 이러한 마우스는 [TOMIZUKA et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727] 및 PCT 공보 WO 02/43478 (TOMIZUKA, et al.)에 기재되어 있다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 인간 면역글로불린 유전자의 라이브러리를 스크리닝하는 파지 디스플레이 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체를 단리하기 위한 이러한 파지 디스플레이 방법은 관련 기술분야에 확립되어 있다. 예를 들어: 미국 특허 번호 5,223,409; 5,403,484; 및 미국 특허 번호 5,571,698 (LADNER et al.); 미국 특허 번호 5,427,908 및 5,580,717 (DOWER et al.); 미국 특허 번호 5,969,108 및 6,172,197 (MCCAFFERTY et al.); 및 미국 특허 번호 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 및 6,593,081 (GRIFFITHS et al.)을 참고한다
본 발명의 인간 모노클로날 항체는 또한 면역화시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포를 재구성한 것인 SCID 마우스를 이용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는 예를 들어 미국 특허 번호 5,476,996 및 5,698,767 (WILSON, et al.)에 기재되어 있다.
추가로, 본 발명의 인간 항체는 크세노마우스(Xenomouse) (암젠 프레몬트, 인크.(Amgen Fremont, Inc.), 이전에는 아브제닉스, 인크.(Abgenix, Inc.))로 지칭되는 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌로 조작되고 항체 생성을 위해 불활성화된 트렌스제닉 마우스를 이용하는 기술에 의해 제조될 수 있다. 인간 항체를 생성하는 트렌스제닉 마우스를 제조하는 것에 대한 예시적인 설명은 미국 특허 번호 6,657,103에서 확인할 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 및 5,545,806; 및 [MENDEZ, et al. Nature Genetics, 15: 146-156 (1998); KELLERMAN, S. A. & GREEN, L. L., Curr. Opin. Biotechnol 13, 593-597 (2002)]을 참고한다.
상기 임의의 생성 방법은 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA에 결합하는 특정한 능력을 갖는 항체, 또는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA와 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 9, 98 또는 99% 서열 동일성을 갖는 상동체 또는 단편 또는 폴리펩티드 서열을 생성한다.
Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA에 대한 항체, 그의 결합 단편, 및 그를 포함하는 항체 약물 접합체의 결합 친화도 (KD)는 1 mM 이하, 100 nM 이하, 10 nM 이하, 2 nM 이하 또는 1 nM 이하일 수 있다. 대안적으로, KD는 5 내지 10 nM; 또는 1 내지 2 nM일 수 있다. KD는 1 마이크로몰 내지 500 마이크로몰 또는 500 마이크로몰 내지 1 nM일 수 있다.
항원 결합 단백질의 결합 친화도는 회합 상수 (Ka) 및 해리 상수 (Kd) (KD=Kd/Ka)에 의해 결정된다. 결합 친화도는 예를 들어 시험 항체를 단백질-A 코팅된 센서 표면 상에 포획시키고, 이 표면 상으로 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA를 흐르게 함으로써 비아코어(BIACORE)에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 결합 친화도는 예를 들어 시험 항체 수용체를 단백질-A 코팅된 니들 상에 포획시키고, 이 표면 상으로 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA를 흐르게 함으로써 포르테바이오(FORTEBIO)에 의해 측정될 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 결합 친화도를 측정하기 위해 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 검정을 확인할 수 있다.
본 발명의 조작된 항체에는 (예를 들어 항체의 성질을 개선시키기 위해) VH 및/또는 VL 내의 프레임워크 잔기에 대해 변형이 이루어진 것들이 포함된다. 전형적으로, 이러한 프레임워크 변형은 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, 한 접근법은 1개 이상의 프레임워크 잔기를 상응하는 생식계열 서열로 "역돌연변이"시키는 것이다. 더욱 구체적으로, 체세포 돌연변이를 겪은 항체는 항체가 유래되는 생식계열 서열과 상이한 프레임워크 잔기를 함유할 수 있다. 이러한 잔기는 항체 프레임워크 서열을 항체가 유래되는 생식계열 서열과 비교함으로써 확인될 수 있다. 프레임워크 영역 서열을 그들의 생식계열 구성으로 되돌리기 위해, 체세포 돌연변이를 예를 들어 부위-지정된 돌연변이유발 또는 PCR-매개된 돌연변이유발에 의해 생식계열 서열로 "역돌연변이"시킬 수 있다 (예를 들어, 류신에서 메티오닌으로 "역돌연변이"됨). 이러한 "역돌연변이된" 항체 또한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
프레임워크 변형의 또 다른 유형은 프레임워크 영역 내의 또는 심지어 1개 이상의 CDR 영역 내의 1개 이상의 잔기를 돌연변이시켜, T-세포 에피토프를 제거함으로써, 항체의 잠재적인 면역원성을 감소시키는 것을 수반한다. 이 접근법은 또한 "탈면역화"로 지칭되며, 미국 특허 공개 번호 2003/0153043 (CARR, et al.)에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어지는 변형에 대해 추가로 또는 대안으로, 본 발명의 항체는 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록, 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 성질, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존성 세포 세포독성을 변경시키도록 조작될 수 있다. 추가로, 본 발명의 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA MAb는 화학적으로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 1개 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음) 또는 그의 글리코실화를 변형시켜, 다시 MAb의 하나 이상의 기능적 성질을 변경시킬 수 있다. 이들 각각의 실시양태는 하기에 더욱 상세하게 기재된다. 한 실시양태에서, CH1의 힌지 영역은 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 개수가 변경되도록, 예를 들어 증가하거나 또는 감소하도록 변형된다. 이 접근법은 미국 특허 번호 5,677,425 (BODMER, et al.)에 추가로 기재된다. CH1의 힌지 영역에서 시스테인 잔기의 개수를 변경시켜서, 예를 들어 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 또는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA MAb의 안정성을 증가 또는 감소시킨다.
또 다른 실시양태에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA MAb의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 더욱 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 SpA 결합에 비해 손상된 스타필로코실 단백질 A (SpA) 결합을 갖도록, 1개 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면 영역에 도입시킨다. 이 접근법은 미국 특허 번호 6,165,745 (WARD, et al.)에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
또 다른 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA MAb는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,277,375 (Ward)에 기재된 바와 같이 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 미국 특허 번호 5,869,046 및 6,121,022 (PRESTA et al.)에 기재된 바와 같이 IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프로부터 취한 샐비지 수용체 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.
여전히 다른 실시양태에서, 적어도 1개의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체하여 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA MAb의 이펙터 기능(들)을 변경시킴으로써 Fc 영역을 변경시킨다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만, 모 항체의 항원-결합 능력을 유지하도록, 아미노산 특이적인 잔기로부터 선택된 1개 이상의 아미노산을 상이한 아미노산 잔기로 대체할 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는 예를 들어 Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이 접근법은 미국 특허 번호 5,624,821 및 5,648,260 (둘 다 Winter, et al.)에 더욱 상세하게 기재되어 있다.
바람직한 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA Mab는 하기 위치에서 삼중 치환을 포함한다: L234A, L235A, L328C.
바람직한 실시양태에서, Her2 Mab는 하기 위치에서 삼중 치환을 포함한다: L234A, L235A, L328C.
바람직한 실시양태에서, EGFR Mab는 하기 위치에서 삼중 치환을 포함한다: L234A, L235A, L328C.
바람직한 실시양태에서, Trop2 Mab는 하기 위치에서 삼중 치환을 포함한다: L234A, L235A, L328C.
바람직한 실시양태에서, CDH3 Mab는 하기 위치에서 삼중 치환을 포함한다: L234A, L235A, L328C.
또 다른 바람직한 실시양태에서, TAA Mab는 하기 위치에서 삼중 치환을 포함한다: L234A, L235A, L328C.
또 다른 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA Mab는 하기 위치에서 단일 치환을 포함한다: L328C.
또 다른 실시양태에서, Her2 Mab는 하기 위치에서 단일 치환을 포함한다: L328C.
또 다른 실시양태에서, EGFR Mab는 하기 위치에서 단일 치환을 포함한다: L328C.
또 다른 실시양태에서, Trop2 Mab는 하기 위치에서 단일 치환을 포함한다: L328C.
또 다른 실시양태에서, CDH3 Mab는 하기 위치에서 단일 치환을 포함한다: L328C.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 TAA Mab는 하기 위치에서 단일 치환을 포함한다: L328C.
또 다른 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA Mab는 하기 위치에서 이중 치환을 포함한다: L234A, L235A.
또 다른 실시양태에서, Her2 Mab는 하기 위치에서 이중 치환을 포함한다: L234A, L235A.
또 다른 실시양태에서, EGFR Mab는 하기 위치에서 이중 치환을 포함한다: L234A, L235A.
또 다른 실시양태에서, Trop2 Mab는 하기 위치에서 이중 치환을 포함한다: L234A, L235A.
또 다른 실시양태에서, CDH3 Mab는 하기 위치에서 이중 치환을 포함한다: L234A, L235A.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 TAA Mab는 하기 위치에서 이중 치환을 포함한다: L234A, L235A.
Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA 항체의 반응성은 적절한 경우 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA-관련 단백질, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA-발현 세포 또는 그의 추출물을 사용하여 웨스턴 블롯, 면역침전, ELISA, 및 FACS 분석을 비롯한 수많은 널리 공지된 수단에 의해 확립될 수 있다. Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA 항체 또는 그의 단편은 검출가능한 마커로 표지될 수 있거나 또는 제2 분자에 접합될 수 있다. 적합한 검출가능한 마커에는 방사선 동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이터 또는 효소가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
III.) 이펙터 기능을 변형시키기 위한 Fc 돌연변이
항체의 Fc 영역 (즉, 도메인 CH2, CH3 및 힌지 영역의 일부분에 걸쳐 있는 항체의 중쇄의 말단)은 가변성이 제한되고, 항체가 수행하는 생리학적 역할에 영향을 미치는데 관여한다. 항체의 Fc 영역에 기인하는 이펙터 기능은 항체의 클래스 및 서브클래스에 따라 다르고, 다양한 생물학적 반응을 촉발시키는 세포 상의 특이적인 Fc 수용체 ("FcR")에 대한 Fc 영역을 통한 항체의 결합을 포함한다.
이들 수용체는 전형적으로 Fc와의 결합을 매개하는 세포외 도메인, 막에 걸쳐 있는 영역, 및 세포 내에서 일부 신호전달 사건을 매개할 수 있는 세포내 도메인을 갖는다. 이들 수용체는 단핵구, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 호산구, 비만 세포, 혈소판, B 세포, 거대 과립 림프구, 랑게르한스 세포, 천연 킬러 (NK) 세포, 및 T 세포를 비롯한 다양한 면역 세포에서 발현된다. Fc/FcγR 복합체의 형성은 이들 이펙터 세포를 결합된 항원 부위로 동원하여, 전형적으로 세포 내에서 신호전달 사건 및 중요한 후속 면역 반응, 예컨대 염증 매개인자의 방출, B 세포 활성화, 엔도시토시스, 식세포작용, 및 세포독성 공격을 일으킨다. 세포독성 및 식세포성 이펙터 기능을 매개하는 능력은 항체가 표적화된 세포를 파괴하는 잠재적인 메카니즘이다. FcγR을 발현하는 비특이적인 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 후속적으로 표적 세포의 용해를 초래하는 세포-매개된 반응은 항체 의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC)으로 지칭된다 ([RAVETCH, et al., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290] 참고). FcγR을 발현하는 비특이적인 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 후속적으로 표적 세포의 식세포작용을 초래하는 세포-매개된 반응은 항체 의존성 세포-매개된 식세포작용 (ADCP)으로 지칭된다. 또한, 분자의 Fc 영역 상의 중첩 부위는 보체에 의해 매개되는 세포 비의존성 세포독성 기능 (보체 의존성 세포독성 (CDC)으로 공지됨)의 활성화를 제어한다.
추가로, 보체 염증성 캐스케이드는 선천성 면역 반응의 일부이며, 개체가 감염을 막는 능력에 중요하다. 또 다른 중요한 Fc 리간드는 보체 단백질 C1q이다. C1q와의 Fc 결합은 보체 의존성 세포독성 (CDC)으로 불리는 과정을 매개한다. C1q는 6개의 항체에 결합할 수 있지만, 2개의 IgG에 대한 결합이 보체 캐스케이드를 활성화시키는데 충분하다. C1q는 C1r 및 C1s 세린 프로테아제와 복합체를 형성하여, 보체 경로의 C1 복합체를 형성한다.
여러 상황에서, 면역글로불린의 Fc 영역에 의해 매개되는 이펙터 기능의 결합 및 자극이 매우 유익하다. 그러나, 특정한 예에서, 이펙터 기능을 감소시키거나 또는 심지어 제거하는 것이 더욱 유리할 수 있다. 이는 표적 세포에 약물 (예를 들어, 독소 및 동위원소)을 전달하도록 설계된 이들 항체의 경우에 특히 그러하며, Fc/FcγR 매개된 이펙터 기능은 건강한 면역 세포가 치명적인 페이로드 근처로 가도록 하여, 표적 세포와 함께 정상 림프구 조직의 고갈을 일으킨다 ([HUTCHINS, et al., PNAS USA 92 (1995) 11980-11984] 참고). 이들 경우에, 보체 또는 이펙터 세포를 잘 동원하지 못하는 항체의 사용은 엄청난 이점이 될 것이다 (미국 특허 번호 6,194,551; 미국 특허 번호 5,885,573 및 PCT 공보 WO 04/029207 또한 참고).
다른 예에서, 예를 들어, 광범위하게 발현되는 수용체와 그의 동족 리간드의 상호작용의 차단이 목적인 경우에는, 원치않는 독성을 감소시키기 위해 모든 항체 이펙터 기능을 감소시키거나 또는 제거하는 것이 유리할 것이다. 추가로, 치료적 항체가 수많은 인간 조직에 걸쳐 난잡한 결합을 나타내는 경우에는, 독성을 제한하기 위해 이펙터 기능의 다양한 조직 세트로의 표적화를 제한하는 것이 현명할 것이다. 마지막으로, 특히 FcγRII 수용체에 대한 항체의 감소된 친화도는 FcγRII 수용체 결합을 통한 혈소판 활성화 및 응집을 유도하는 항체의 경우에 유리할 것이며, 이는 이러한 항체의 심각한 부작용일 것이다. [TAM, et al., Antibodies 6:12 (2017)]을 참고한다. 또한, [WEBER et al., Pharm Res 35:169 (2018)]을 참고한다.
특이적인 이펙터 기능이 결여된 인간 면역글로불린의 특정한 서브클래스가 있지만, 모든 이펙터 기능이 결여된 천연 발생 면역글로불린은 공지되어 있지 않다. 대안적인 접근법은 이펙터 기능을 담당하는 Fc 영역에서 중요한 잔기를 조작하거나 또는 돌연변이시키는 것이다. [SCHLOTHAUER, et al., Protein Eng. Design, and Selection, vol. 29, no. 10 pp 457-466 (2016) & WANG, et al., Protein Cell, 9(1) pp 63-73 (2018)]을 참고한다. 실제로, 몇몇 연구 기관은 이러한 노력을 시도하였다. 예를 들어, PCT 공보 WO 2009/100309 (메드이뮨(Medimmune)), WO 2006/076594 (젠코(Xencor)), WO 1999/58572 (유니버시티 캠브리지(Univ. Cambridge)), US 2006/0134709 (마크로제닉스(Macrogenics)), WO 2006/047350 (젠코), WO 2006/053301 (젠코), 미국 특허 번호 6,737,056 (제넨테크), 미국 특허 번호 5,624,821 (스코트젠 파마슈티컬즈(Scotgen Pharmaceuticals)), US 2010/0166740 (로슈(Roche)), 및 US 8,969,526 (로슈 글리카트 아게(Roche Glycart AG))을 참고한다.
IgG와 활성화 및 억제성 Fcγ 수용체 또는 보체의 첫번째 성분 (C1q)의 결합은 힌지 영역 및 CH2 도메인에 위치하는 잔기에 따라 좌우된다. CH2 도메인의 두 영역이 FcγR 및 보체 C1q 결합에 중요하며, 독특한 서열을 갖는다. 위치 233-236에서 인간 IgG1 및 IgG2 잔기 및 위치 327, 330 및 331에서 IgG4 잔기의 치환은 ADCC 및 CDC를 크게 감소시켰다 ([ARMOUR, et al., Eur. J. Immunol. 29(8) (1999) 2613-2624; SHIELDS, et al., J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591-6604] 참고).
또한, [IDUSOGIE, et al., J. Immunol. 166 (2000) 2571-2575]는 리툭산(RITUXAN)에 대한 C1q 결합 부위를 맵핑하였고, Pro329Ala는 리툭시맙이 C1q에 결합하여 보체를 활성화시키는 능력을 감소시켰음을 나타내었다. 또한, Pro329의 Ala로의 치환은 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIA 수용체에 대한 결합을 감소시키는 것으로 보고되었다 ([SHIELDS, et al., J. Biol. Chem. 276(9) (2001) 6591-6604] 참고). 그러나, 이 돌연변이는 또한 FcγRI 및 FcγRII에 대한 야생형-유사 결합 및 FcγRIIIA 수용체에 대한 결합에서 단지 매우 작은 감소를 나타내는 것으로 기재되었다 (EP 1,068,241 (제넨테크) 참고).
추가로, [OGANESYAN, et al., Acta Cristallographica D64 (2008) 700-704]는 하부 힌지 및 C2H 도메인으로 삼중 돌연변이 L234F/L235E/P331S를 도입시켰고, 인간 C1q 수용체, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIIIA에 대한 인간 IgG1 분자의 결합 활성의 감소를 나타내었다.
전술한 배경에 대해, 본 발명은 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이며, Fc는 침묵되고/거나 억제된다. "모", "출발", "비변이체" 또는 "야생형" 폴리펩티드는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체를 생성하기 위해 관련 기술분야에서 이용가능한 기술을 이용하여 제조된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 모 폴리펩티드는 항체이고, 예시적인 항체 생성 방법은 본 개시내용에서 더욱 상세하게 기재된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 야생형 폴리펩티드는 본 개시내용의 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및/또는 임의의 TAA에 결합하는 항체이다 (표 IV 참고).
본 발명의 한 실시양태는 항체의 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, Fc 영역에 대해 적어도 1개의 아미노산 잔기의 부가, 치환 또는 결실을 포함하여, 적어도 하나의 Fc 수용체에 대해 감소된 또는 제거된 친화도를 생성한다. Fc 영역은 Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA), 보체 단백질 C1q, 및 다른 분자, 예컨대 단백질 A 및 G를 비롯하여 이로 제한되지 않는 수많은 수용체 또는 리간드와 상호작용한다. 본 개시내용에서 언급된 바와 같이, 이들 상호작용은 항체 의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC), 항체-의존성 세포 식세포작용 (ADCP) 및 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 비롯하여 이로 제한되지 않는 다양한 이펙터 기능 및 하류 신호전달 사건에 필수적이다.
따라서, 특정한 실시양태에서 본 발명의 변이체는 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖지만, Fc 영역에 대해 적어도 1개의 아미노산 잔기의 부가, 치환 또는 결실을 포함하지 않는 폴리펩티드 (본원에서 "야생형 폴리펩티드"로도 지칭됨)와 비교하여 이펙터 기능을 담당하는 Fc 수용체에 대해 감소된 또는 제거된 친화도를 갖는다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 하기 성질 중 적어도 하나 이상을 포함한다: 감소된 또는 제거된 이펙터 (ADCC 및/또는 CDC 및/또는 ADCP) 기능, Fc 수용체에 대한 감소된 또는 제거된 결합, C1q에 대한 감소된 또는 제거된 결합, 또는 감소된 또는 제거된 독성. 더욱 구체적으로, 본 발명의 실시양태는 Fcγ 수용체 (예를 들어 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB ) 및/또는 보체 단백질 C1q에 대해 감소된 친화도를 갖는 항-Her2, 항-EGFR, 항-Trop2, 항-CDH3, 및 항-TAA (종양 관련 항원 (표 IV)) 항체를 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 삼중 돌연변이를 포함하는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 TAA MAb를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 위치 328에서 아미노산 잔기의 적어도 1개의 부가, 치환 또는 결실을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 불변 영역의 넘버링 시스템은 [KABAT, et al., NIH Publication 91 (1991) 3242, National Technical Information Service, Springfield, Va]에 제시된 EU 인덱스의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 위치 234에서 아미노산 잔기의 적어도 1개의 부가, 치환 또는 결실을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 불변 영역의 넘버링 시스템은 [KABAT, et al., NIH Publication 91 (1991) 3242, National Technical Information Service, Springfield, Va]에 제시된 EU 인덱스의 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 위치 235에서 아미노산 잔기의 적어도 1개의 부가, 치환 또는 결실을 포함하는 Fc 영역을 포함하며, 불변 영역의 넘버링 시스템은 [KABAT, et al., NIH Publication 91 (1991) 3242, National Technical Information Service, Springfield, Va]에 제시된 EU 인덱스의 것이다.
본 발명의 특정한 측면에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 항체를 포함한다. 본 발명의 여전히 또 다른 측면에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 Fc 영역을 포함한다. 본 발명의 여전히 추가의 측면에서, 변이체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다.
추가의 구체적인 실시양태에서, 상기 언급된 폴리펩티드는 인간 IgG1 영역을 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 야생형 인간 Fc 폴리펩티드의 Fc 변이체를 포함하고, 상기 변이체는 위치 L328C에서 아미노산 치환을 포함하며, IgG Fc 영역에서 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 인덱스의 것이다. 여전히 또 다른 실시양태에서, 상기 변이체는 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 여전히 또 다른 실시양태에서, 상기 변이체는 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환을 포함한다. 여전히 또 다른 실시양태에서, 상기 변이체는 L234A, L235A, 및 L328C에서 세 개의 (3) 아미노산 치환(들)을 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항-Her2 MAb는 L234A, L235A, 및 L328C에서 세 개의 (3) 아미노산 치환을 포함하는 야생형 인간 Fc Her2 Mab의 Fc 변이체를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항-EGFR MAb는 L234A, L235A, 및 L328C에서 세 개의 (3) 아미노산 치환을 포함하는 야생형 인간 Fc EGFR Mab의 Fc 변이체를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항-Trop2 MAb는 L234A, L235A, 및 L328C에서 세 개의 (3) 아미노산 치환을 포함하는 야생형 인간 Fc Trop2 Mab의 Fc 변이체를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 항-CDH3 MAb는 L234A, L235A, 및 L328C에서 세 개의 (3) 아미노산 치환을 포함하는 야생형 인간 Fc CDH3 Mab의 Fc 변이체를 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 TAA MAb는 L234A, L235A, 및 L328C에서 세 개의 (3) 아미노산 치환을 포함하는 야생형 인간 Fc TAA Mab의 Fc 변이체를 포함한다.
한 측면에서, Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 비변형된 항체와 비교하여 표적 결합에 영향을 미치지 않는다.
한 측면에서, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 비변형된 항체와 비교하여 FcγRI 결합의 억제를 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 비변형된 항체와 비교하여 FcγRII 결합의 억제를 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 비변형된 항체와 비교하여 FcγRIIIa 결합의 억제를 나타낸다.
한 측면에서, 본 발명의 Fc 변이체를 포함하는 폴리펩티드는 비변형된 항체와 비교하여 실질적으로 FcRn 결합에 영향을 미치지 않는다.
관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 본 발명에 의해 발견된 놀라운 인식을 통해, 삼중 돌연변이 및 구체적으로 L234A 및 L235A에서 아미노산 치환(들)의 부가의 필요가 하기 관찰(들)로 인한 것임이 확인되었다. 첫째로, L328C 자체는 Fc 이펙터 기능의 부분적인 감소만을 나타낸다. 더 큰 정도의 Fc 침묵은 추가의 돌연변이를 조합함으로써 달성될 수 있다. L234 및 L235가 힌지 영역에 가깝게 위치하고, 알라닌으로 돌연변이될 때 FcγR 결합을 부분적으로 감소시킬 수 있기 때문에, 이들 잔기가 선택되었다. L234A 및 L235A와 L328C의 조합은 시험한 모든 이소형에 대해 FcγR 상호작용의 거의 완전한 억제를 나타내었다.
관찰된 바와 같이, FcγR 결합의 완전한 제거에도 불구하고, 야생형 대응물과 비교할 때 비슷한 결합 활성이 관찰되었기 때문에, 삼중 돌연변이 (L234A/L235A와 조합된 L328C)는 표적 항원 결합에 영향을 미치지 않았다 . 항체 안정성 및 발현 또한 야생형 항체와 유사하게 유지되었다. 따라서, 삼중 돌연변이는 표적 특이성, 항체 품질, 및 수율을 손상시키지 않고 Fc 이펙터 기능의 완전한 억제를 가능하게 한다.
또한, 하기에서 논의되는 바와 같이, 특이적인 삼중 돌연변이는 효율적인 부위-특이적인 접합을 용이하게 할 수 있다.
IV.) 항체 약물 접합체
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료제에 접합된 항체를 포함하는 항체-약물 접합체 (ADC)를 제공한다. 치료제는 세포독성제, 세포정지제, 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물, 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성-접합체)일 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 ADC를 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 한 측면에서, ADC는 세포독성제 또는 검출가능한 작용제에 공유적으로 부착되거나 또는 옥심을 통해 부착된 임의의 상기 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA MAb를 포함한다.
추가의 실시양태에서, ADC는 하기 위치: L234A, L235A, L328C에서 삼중 치환을 추가로 포함하는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA Mab를 포함한다.
바람직한 실시양태에서, ADC는 하기 위치: L234A, L235A, L328C에서 삼중 치환을 추가로 포함하고, L328C에서 부위-특이적인 접합을 추가로 포함하는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA Mab를 포함한다.
배경으로, 세포독성제 또는 세포정지제의 국소 전달을 위한 항체-약물 접합체, 즉, 암 치료에서 종양 세포를 사멸시키거나 또는 억제하는 약물의 사용 ([Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; NICULESCU-DUVAZ and SPRINGER (1997) Adv. Drg. Del. Rev. 26:151-172]; 미국 특허 번호 4,975,278)은 종양으로 약물 모이어티의 표적화된 전달, 및 그 안에서 세포내 축적을 가능하게 하고, 이들 접합되지 않은 약물 작용제의 전신 투여는 정상 세포 뿐만 아니라 제거하고자 하는 종양 세포에 대해 허용 불가능한 수준의 독성을 일으킬 수 있다 (BALDWIN et al., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, A. PINCHERA et al. (ed.), pp. 475-506). 최소의 독성으로 최대의 효능이 추구된다. 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 둘 다 이들 전략에서 유용한 것으로 보고되었다 (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). 이들 방법에서 사용되는 약물에는 다우노마이신, 독소루비신, 메토트렉세이트, 및 빈데신이 포함된다 (ROWLAND et al., (1986) supra). 항체-독소 접합체에서 사용되는 독소에는 박테리아 독소, 예컨대 디프테리아 독소, 식물 독소, 예컨대 리신, 소분자 독소, 예컨대 겔다나마이신 (MANDLER et al. (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581; MANDLER et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; MANDLER et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791),메이탄시노이드 (EP 1391213; [LIU et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623]), 및 칼리케아미신 (LODE et al. (1998) Cancer Res. 58:2928; HINMAN et al. (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)이 포함된다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합, 또는 토포아이소머라제 억제를 비롯한 메카니즘에 의한 그들의 세포독성 및 세포정지 효과에 영향을 미칠 수 있다. 일부 세포독성 약물은 거대 항체 또는 단백질 수용체 리간드에 접합될 때 불활성이거나 또는 덜 활성이 되는 경향이 있다.
항체 약물 접합체의 예는 아드세트리스(ADCETRIS) (브렌툭시맙 베도틴, 시애틀 제네틱스(Seattle Genetics)), 제발린(ZEVALIN)® (이브리투모맙 티욱센탄, 바이오젠(Biogen)/아이덱(Idec)), 밀로타르그(MYLOTARG)™ (겜투주맙 오조가미신, 와이어스 파마슈티컬즈(Wyeth Pharmaceuticals)), 카드실라(KADCYLA)® (아도-트라스투주맙 엠탄신, 제넨테크), 베스폰사(BESPONSA)® (이노투주맙 오조가미신, 화이자(Pfizer)/와이어스(Wyeth)), 폴리비(POLIVY) (폴라투주맙 베도틴, 제넨테크/로슈), 칸투주맙 메르탄신 (이뮤노젠 인크.(Immunogen Inc.)), 및 MLN-2704 (밀레니엄 팜(Millennium Pharm.), 비지엘 바이올로직스(BZL Biologics), 이뮤노젠 인크.)이다.
추가로, ADC의 생성에서 유용한 화학요법제를 비롯하여 이로 제한되지 않는 치료제가 본원에 기재된다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, 1993년 10월 28일에 공개된 WO 93/21232를 참고한다. 다양한 방사성 핵종이 방사성-접합된 항체의 생성을 위해 이용가능하다. 그 예에는 212Bi, 131I, 131In, 90Y, 및 186Re가 포함된다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스 (p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 제조된다. 예를 들어, 리신 면역독소는 [Vitetta et al. (1987) Science, 238:1098]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성 뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이팅제이다 (WO94/11026). 본 발명의 항체에 접합될 수 있는 다른 항종양제에는 BCNU, 스트렙토조이신, 빈크리스틴 및 5-플루오로우라실, 미국 특허 번호 5,053,394, 5,770,710에 기재된 LL-E33288 복합체로 집합적으로 공지된 작용제의 패밀리, 뿐만 아니라 에스페라미신 (미국 특허 번호 5,877,296)이 포함된다.
사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다. 예를 들어, WO 93/21232 (1993년 10월 28일 공개)을 참고한다.
본 발명은 추가로 항체와 핵산 분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 ADC를 고려한다.
종양의 선택적인 파괴를 위해, 항체는 고도로 방사성인 원자를 포함할 수 있다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성-접합된 항체의 생성에 이용가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re88, Sm53, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 접합체가 검출을 위해 사용되는 경우, 이는 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 다시 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
방사성- 또는 다른 표지가 공지된 방식으로 접합체에 포함될 수 있다. 예를 들어, 펩티드는 생합성될 수 있거나, 또는 수소 대신에 예를 들어 플루오린-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 표지는 펩티드에서 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨-90은 리신 잔기를 통해 부착될 수 있다. 아이오도겐(IODOGEN) 방법 (FRAKER et al. (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57)을 이용하여 아이오딘-123을 포함시킬 수 있다. ["Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (CHATAL, CRC Press 1989)]는 다른 방법을 상세하게 기재한다.
본 발명은 무엇보다도 치료제의 표적화된 전달을 위한 항체-약물 접합체 화합물을 제공한다. 본 발명자들은 항체-약물 접합체 화합물이 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 다른 TAA를 발현하는 세포에 대해 강력한 세포독성 및/또는 세포정지 활성을 갖는다는 것을 발견하였다.
항체-약물 접합체 화합물은 적어도 하나의 약물 단위에 공유적으로 연결된 항체 단위를 포함한다. 약물 단위는 항체 단위에 공유적으로 직접 연결되거나 또는 링커 단위 (-LU-)를 통해 연결될 수 있다. 추가로, 약물 단위는 L328C에서 부위-특이적인 위치에서 접합된다.
일부 실시양태에서, 항체 약물 접합체 화합물은 하기 화학식 또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 용매화물을 갖는다:
L-(LU-D)p (I)
상기 식에서:
o L은 본 발명의 항체 단위, 예를 들어 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 또 다른 TAA MAb이고; MAb는 하기 위치에서 삼중 돌연변이를 포함하고: L234A, L235A, 및 L328C;
o (LU-D)는 링커 단위-약물 단위 모이어티이고, 여기서:
o LU-는 링커 단위이고,
o -D는 표적 세포에 대해 세포정지 또는 세포독성 활성을 갖는 약물 단위이고;
o p는 1 내지 20 또는 대안적으로 1-50의 범위이다.
추가로, 약물 단위 모이어티는 L328C에서 MAb 상의 부위-특이적인 위치에 접합된다.
일부 실시양태에서, 항체 약물 접합체 화합물은 하기 화학식 또는 그의 제약상 허용가능한 염 또는 용매화물을 갖는다:
L-(Aa-Ww-Yy-D)p (II)
상기 식에서:
o L은 항체 단위, 예를 들어, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 또 다른 TAA MAb이고, MAb는 하기 위치에서 삼중 돌연변이를 포함하고: L234A, L235A, 및 L328C;
o -Aa-Ww-Yy-는 링커 단위 (LU)이고, 여기서:
o -A-는 스트레처 단위이고,
o a는 0 또는 1 또는 2 또는 3이고,
o 각각의 -W-는 독립적으로 아미노산 단위이고,
o w는 0 내지 12 범위의 정수이고,
o -Y-는 자가-희생성 스페이서 단위이고,
o y는 0, 1 또는 2이고;
o -D는 표적 세포에 대해 세포정지 또는 세포독성 활성을 갖는 약물 단위이고;
o p는 1 내지 20 또는 대안적으로 1-50의 정수이다.
추가로, 약물 단위 모이어티는 L328C에서 MAb 상의 부위-특이적인 위치에서 접합된다.
다수개의 항체를 포함하는 조성물의 경우, 약물 로딩은 p로 표시되며, 항체당 약물 분자의 평균 개수이다. 약물 로딩은 항체당 1 내지 20개 약물 (D)의 범위일 수 있다. 접합 반응의 준비시에 항체당 약물의 평균 개수는 통상적인 수단, 예컨대 질량 분광분석법, ELISA 검정, 및 HPLC에 의해 특징분석될 수 있다. p의 측면에서 항체-약물-접합체의 정량적인 분포가 결정될 수 있다. 일부 예에서, p가 다른 약물 로딩을 갖는 항체-약물-접합체로부터의 특정한 값인 동질의 항체-약물-접합체의 분리, 정제 및 특징분석은 역상 HPLC 또는 전기영동과 같은 수단에 의해 달성될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, p는 2 내지 8이다.
항체-약물 접합체 화합물의 생성은 기술자에게 공지된 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 간략히, 항체-약물 접합체 화합물은 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 또 다른 TAA MAb를 포함하고, MAb는 항체 단위로서 하기 위치에서 삼중 돌연변이: L234A, L235A, 및 L328C, 약물, 및 임의적으로 약물과 결합제를 연결하는 링커를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 약물 단위는 L328C에서 부위-특이적인 위치에서 접합된다.
약물 및/또는 링커와 결합제의 공유적인 부착을 위해 수많은 상이한 반응이 이용가능하다. 이는 종종 결합제, 예를 들어 항체 분자의 아미노산 잔기, 예컨대 리신의 아민 기, 글루탐산 및 아스파르트산의 유리 카르복실산 기, 시스테인의 술프히드릴 기 및 방향족 아미노산의 다양한 모이어티의 반응에 의해 달성된다. 공유적인 부착의 가장 일반적으로 이용되는 비-특이적인 방법 중 하나는 화합물의 카르복시 (또는 아미노) 기를 항체의 아미노 (또는 카르복시) 기에 연결시키기 위한 카르보디이미드 반응이다. 추가로, 이관능성 작용제, 예컨대 디알데히드 또는 이미도에스테르를 이용하여 화합물의 아미노 기를 항체 분자의 아미노 기에 연결시켰다. 약물과 결합제의 부착을 위해 쉬프 염기 반응 또한 이용가능하다. 이 방법은 글리콜 또는 히드록시 기를 함유하는 약물의 과아이오딘산염 산화를 수반하여, 알데히드를 형성하고, 이어서 이를 결합제와 반응시킨다. 부착은 결합제의 아미노 기와 함께 쉬프 염기의 형성을 통해 발생한다. 이소티오시아네이트 또한 약물을 결합제에 공유적으로 부착시키기 위한 커플링제로서 사용될 수 있다. 다른 기술이 기술자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 범위 내에 있다.
특정한 실시양태에서, 링커의 전구체인 중간체를 적절한 조건하에 약물과 반응시킨다. 특정한 실시양태에서, 약물 및/또는 중간체 상에서 반응성 기가 사용된다. 약물과 중간체 사이의 반응 생성물, 또는 유도체화된 약물을 후속적으로 적절한 조건하에 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb와 반응시킨다.
V.) ADC에 대한 부위-특이적인 접합 포맷
관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, ADC의 맥락에서 페이로드 배치 및 접합체 조성을 최적화시키는 능력은 유리한 노력이다. [ABHIJIIT, et al., Bioprocess Int., Mab Upstream Processing (Oct 2014)]을 참고한다.
일반적으로, 생체-접합 전략은 단백질 또는 펩티드 (생물제제)를 소분자, 탄수화물, 올리고뉴클레오티드, 합성 중합체, 또는 또 다른 단백질/펩티드와 공유적으로 연결시키는 것을 수반한다. 이 접근법은 경쟁이 치열한 생물제제 시장에서 차별화를 만들고 제품 개발을 유도하는데 중요할 수 있다. 이들 전략은 고도로 성공적인 접합체 백신, 예컨대 프레브나르(Prevnar) 13, 메낙트라(Menactra), 메노뮨(Menomune), 및 히브타이터(HibTITER) 개발의 근본이었다. 이들 네 가지 (4)는 면역원성 담체 단백질에 박테리아 다당류를 접합시킴으로써 생성되었다. 유사하게, 반감기-연장 중합체성 담체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 대한 셍체접합을 적용하여, 현재의 시판 약물 - 예를 들어 세르토질루맙 (심지아(Cimzia)), 페그필그라스팀 (뉴라스타(Neulasta)), 및 페그비소만트 (소마베르트(Somavert))를 생성하며, 이들은 접합되지 않은 그들의 대응물에 비해 더 긴 작용 기간 및 환자 순응성을 용이하게 하는 투여 레지멘을 갖는다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 1세대 ADC의 제조를 위한 링커 및 접합 화학의 선택은 단백질을 사용하는 작업의 제한에 따라 좌우되었다. 따라서, 천연 아미노산, 예컨대 시스테인 (티올) 또는 리신 (아민)에 속하는 표면-접근가능한 친핵성 아미노산 측쇄와 특이적으로 반응하도록 설계된 반응성 기로 링커를 관능화시켰다.
그러나, 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 (DTT) 또는 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 (TCEP)으로 항체의 처리는 이들 디술피드 결합을 파괴하고, 유리 티올을 노출시킬 수 있으며, 이어서 말레이미드-함유 링커와 용이하게 접합될 수 있다. 4개 이하의 쇄간 디술피드 결합을 환원시켜, 접합을 위해 8개 이하의 반응성 티올 기를 노출시킬 수 있다. 티올 화학적 접합을 위해 개발된 조건은 디술피드 결합의 완전한 또는 부분적인 감소를 유도하고, 이 방법을 이용하여 제조된 접합체는 항체 분자당 0, 2, 4, 6 또는 8개의 약물을 함유할 수 있다.
항체 분자당 약물의 개수 외에도, 또 다른 수준의 이질성이 접합 부위에서 발생한다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 따라서, 시스테인 접합에 의해 생성된 특이적인 약물-대-항체 비 (DAR)를 갖는 ADC는 여전히 상이한 접합 부위를 갖는 접합체의 이질성 혼합물이다. 그러나, 8개의 부위만이 시스테인 접합을 위해 이용가능하기 때문에 (리신-지정 화학의 경우 80개 이하가 이용가능한 것과 비교하여), 시스테인 접합 접근법은 접합 부위에 대한 더 큰 제어를 제공하여, 더 나은 특징분석을 용이하게 한다고 말하는 것이 타당하다. 제어된 환원-알킬화 전략은 현재 임상 실험 중인 수많은 다른 ADC와 함께 승인된 아드세트리스 (시애틀 제네틱스, 워싱턴주 보텔) 제품을 제조하는데 성공적으로 사용되었다.
연구자들은 CD30+ 종양 세포를 표적화하는 ADC (항체 분자당 2, 4 및 8개의 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 독소를 가짐)의 생체내 효과를 연구하였고, 약물 로딩의 화학량론이 약물의 약동학 (PK), 효능, 및 독성에 유의한 영향을 미쳤음을 입증하였다. 햄블렛(HAMBLETT) 등은 그들의 시스템에서, 항체당 4개의 약물을 갖는 ADC가 2개를 갖는 것이 비해 더 강력하지만, 8개 약물/항체를 갖는 것과는 비슷한 효능을 갖고, 그에 비해 더 나은 내약성을 가짐을 발견하였다. 결과는 일반적으로 더 높은 약물 로딩을 갖는 ADC가 더 양호한 제거율, 더 큰 효능, 및 증가된 독성을 가짐을 나타내었다. 이는 각각의 ADC가 효능 및 독성의 올바른 균형으로 최적의 약물 로딩을 가질 것임을 의미한다.
그 중대한 작업은 DAR이 ADC에 대한 핵심 설계 파라미터라는 개념을 확립시켰다. 천연 시스테인 또는 리신 잔기와의 화학적 접합이 이질성 ADC 혼합물을 생성하기 때문에, 이는 최적이 아니라는 것이 명백해졌다. 이질성은 DAR 및 접합 부위에서의 차이로 인해 발생하고, 효능이 적고, 더 독성이며, 상이한 배열 및 PK 성질을 가질 수 있는 ADC 하위 집단을 생성한다. 또한, 분석적 특징분석 및 제조하는 동안에 배치간 가변성의 제어는 이러한 비선택적인 접합 방법에서 유의한 과제로 남는다. 이들 제한을 극복하기 위해, 초기에는 동질의 ADC를 생성하고, DAR 및 접합 부위를 제어하는 것을 목표로 하여 부위-특이적인 접합의 개념이 발전하였다.
다양한 기술 (예를 들어, 티오맙(ThioMab) (제넨테크), 시애틀 제네틱스, 및 암브릭스, 인크.(Ambrx, Inc.) 참고)을 이용하여 페이로드 배치를 최적화하는 몇몇 부위-특이적인 접합 기술이 실행되었다.
티오맙에 대해 보고된 작업은 또 다른 근본적인 개념을 밝혀내었다: ADC 동질성은 개선된 생물물리학적 및 치료적 성질의 핵심일 뿐만 아니라, 항체 백본 상의 실제 접합 부위 또한 ADC 분자의 생체내 거동에 큰 영향을 미친다. 센(SHEN) 등은 MMAE 페이로드를 사용하여 HER2-표적화 항체와의 다중 동질성 TDC 접합체를 제조하였고, 접합을 위해 조작된 시스테인은 항체의 경쇄 (LC), 중쇄 (HC), 또는 Fc 영역에 위치하였다. 모든 접합체는 비슷한 시험관내 효능을 입증하였지만, 저자는 그들의 생체내 효능 및 PK 성질에 있어서 유의한 차이를 보고한다.
LC 접합체는 마우스 이종이식편 모델에서 연구할 때 가장 높은 효능을 입증하였고, HC 접합체는 중간 정도의 활성을 가졌고, Fc 접합체는 활성이 거의 없거나 전혀 없었다. 마우스 PK 연구는 가장 높은 안정성 및 가장 낮은 제거율을 입증하는 LC 접합체에 이어서 HC 접합체와 유사한 경향을 밝혀 내었고, Fc-접합된 ADC는 가장 빨리 제거되었고, 가장 낮은 ADC 노출을 제공하였다. 이들 결과는 상이한 부위에서 링커 시스템의 차등 안정성에 기여하는 국소 미세환경 및 용매 접근성에서의 차이에서 기인한다.
1세대 리신 및 시스테인 접합에 비해 동질의 ADC를 전달하는 것을 목적으로 하여 몇몇 추가의 부위-특이적인 생물접합 방법이 보고되었지만, 이들 기술 중 하위 집합만이 주어진 항체-페이로드 조합물에 대한 최적의 접합 부위를 찾는데 있어서 더 큰 다양성을 제공한다. 이들에는 유전자-코드 변형에 의해 도입된 비천연 아미노산 (nnAA)에 의한 접합이 포함된다 (암브릭스(Ambrx, 캘리포니아주 라호이아); 수트로 바이오 파마(Sutro Biopharma, 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코); 메드이뮨에 의해 인수된 알로진(Allozyne, 워싱턴주 시애틀)). 또한, 트랜스글루타미나제 (TG)는 조작된 글루타민 태그와의 접합을 매개하였다 (화이자, 뉴욕주 뉴욕). 또한, 알데히드-태그 부착된 항체와의 접합은 공동 발현된 포르밀글리신-생성 효소 (FGE)에 의해 생성되었다 (카탈렌트 파마 솔루션즈(Catalent Pharma Solutions)에 의해 인수된 레드우드 바이오사이언스(Redwood Bioscience, 캘리포니아주 에머리빌)).
상기 내용을 기반으로 하여, 융통성 있는 부위-특이적인 접합의 옵션을 제공하는 기술에 대한 연구는 접합 부위가 ADC의 약리학적 성질에 유의한 영향을 미침을 확고하게 확립하였다. 따라서, 이는 제품 설계에서 중요한 파라미터로서 고려되어야 하고, 특정한 페이로드-항체 조합물에 대한 최적의 부위를 찾는 능력은 제품 또는 제품(들)의 개발의 성공에 중요할 수 있다. [SCHUMACHER, et al., J. Clin. Immunol, 36 (Suppl 1):S100-S107 (2016); DEONARAIN, et al., Expert Opin. Drug Discov, 10(5) (2015); ZHOU, Biomedicines, 5:64 (2017); PANOWSKI, et al., mAbs 6:1 pp 34-45 (Jan/Feb 2014)]; PCT 특허 공보 WO2018/20081, 및 미국 특허 공보 번호: 2017/0080103을 참고한다.
한 실시양태에서, 모노클로날 항체의 Fc 도메인에서 Leu-328에서 Cys로의 전환을 통한 부위-특이적인 접합 접근법은 표적 결합에 영향을 미치지 않고 제어된 접합을 가능하게 한다. 더욱이, 항체의 발현 수준 및 안정성이 L328C의 도입에 의해 손상되지 않는 것으로 나타난다.
추가의 실시양태에서, Her2 항체의 Fc 도메인에서 Leu-328에서 Cys로의 전환을 통한 부위-특이적인 접합 접근법은 표적 결합에 영향을 미치지 않고 제어된 접합을 가능하게 한다. 더욱이, 항체의 발현 수준 및 안정성이 L328C의 도입에 의해 손상되지 않는 것으로 나타난다.
추가의 실시양태에서, EGFR 항체의 Fc 도메인에서 Leu-328에서 Cys로의 전환을 통한 부위-특이적인 접합 접근법은 표적 결합에 영향을 미치지 않고 제어된 접합을 가능하게 한다. 더욱이, 항체의 발현 수준 및 안정성이 L328C의 도입에 의해 손상되지 않는 것으로 나타난다.
추가의 실시양태에서, Trop2 항체의 Fc 도메인에서 Leu-328에서 Cys로의 전환을 통한 부위-특이적인 접합 접근법은 표적 결합에 영향을 미치지 않고 제어된 접합을 가능하게 한다. 더욱이, 항체의 발현 수준 및 안정성이 L328C의 도입에 의해 손상되지 않는 것으로 나타날 수 있다.
추가의 실시양태에서, CDH3 항체의 Fc 도메인에서 Leu-328에서 Cys로의 전환을 통한 부위-특이적인 접합 접근법은 표적 결합에 영향을 미치지 않고 제어된 접합을 가능하게 한다. 더욱이, 항체의 발현 수준 및 안정성이 L328C의 도입에 의해 손상되지 않는 것으로 나타난다.
추가의 실시양태에서, TAA 항체 (예컨대 표 IV에 제시된 TAA)의 Fc 도메인에서 Leu-328에서 Cys로의 전환을 통한 부위-특이적인 접합 접근법은 표적 결합에 영향을 미치지 않고 제어된 접합을 가능하게 한다. 더욱이, 항체의 발현 수준 및 안정성이 L328C의 도입에 의해 손상되지 않는 것으로 나타난다.
L328C에 의해 매개되는 부위-특이적인 접합 접근법은 더욱 동질의 약물 생성물 및 개선된 접합 효율을 가능하게 하도록 선택되었다. 항체 약물 접합체 (ADC)를 비롯한 다양한 치료 방식은 생체내 효능 및 치료 지수에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 이질성 혼합물의 형성을 방지할 수 있기 때문에, 이는 부위-특이적인 접합으로부터 이익을 얻을 수 있다. 유사하게, 항체 분자의 특이적으로 정의된 부위로 붕소-함유 개체의 부착은 암 치료를 위한 비침습적인 치료 방식인 붕소 중성자 포획 요법 (BNCT)의 효능을 개선시킬 수 있다.
모노클로날 항체의 Fc 도메인에서 Leu-328에서 Cys로의 전환은 표적 결합에 영향을 미치지 않고 제어된 접합을 가능하게 한다. 더욱이, 항체의 발현 수준 및 안정성 모두 L328C 도입에 의해 손상되지 않는다. 크기-배제 크로마토그래피를 통한 품질 평가는 야생형 대응물과 비교하여 >99% 주요 피크를 나타낸다. 따라서, 쌍을 형성하지 않은 시스테인의 도입과 종종 관련이 있는 응집 성향은 L328C의 경우에 관찰되지 않는다. L328C에 의해 매개되는 100% 접합 효율로 균일한 생성물 형성은 비-특이적으로 접합된 대응물에 필요한 복잡하고 비효율적인 생성 공정과 비교하여 더욱 간단한 제조 공정을 의미한다. 훨씬 감소된 치료 부담 및 더욱 간단한 제조 공정을 갖는, L328C 접합을 통해 매개되는 정의된 동질의 조성물은 BNCT의 적용을 위해 ADC 및 항체 붕소 접합체의 가속된 발견 및 개발을 가능하게 한다.
추가로, L328C는 또한 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 추가의 이익을 나타낸다. 치료적 모노클로날 항체에 의해 촉발되는 주입 반응과 관련된 안전성 부담 및 FcγR과의 그들의 상호작용이 보고되었다. 항체 안정성을 손상시키지 않고 Fc 이펙터 기능을 부분적으로 침묵시키는 능력은 L328C의 매력적인 특징이다. 개선된 임상 안전성 프로파일에 대한 잠재적인 완화 전략은 L328C-매개된 접합을 위해 또는 네이키드 항체로서 추가로 개발될 수 있고, 이전에 Fc 이펙터 기능을 감소시키는 것으로 확인된 다른 변이와 조합이 가능하다.
VI.) 링커 단위
전형적으로, 항체-약물 접합체 화합물은 약물 단위와 항체 단위 사이에 링커 단위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 세포내 조건하에 절단가능하여, 링커의 절단은 세포내 환경에서 항체로부터 약물 단위를 방출시킨다. 여전히 다른 실시양태에서, 링커 단위는 절단 불가능하고, 약물은 예를 들어 항체 분해에 의해 방출된다.
바람직한 실시양태에서, 링커는 부위-특이적인 위치 L328C에서 접합된다.
일부 실시양태에서, 링커는 세포내 환경에 (예를 들어, 리소좀 또는 엔도좀 또는 카베올레아 내에) 존재하는 절단제에 의해 절단가능하다. 링커는 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 비롯하여 이로 제한되지 않는 세포내 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다. 링커는 또한 세포외 환경에 (예를 들어, 세포 막 또는 조직 공간 부근에) 존재하는 절단제에 의해 절단될 수 있다. 링커는 예를 들어 카텝신 패밀리 효소 또는 매트릭스 메탈로프로테이나제를 비롯하여 이로 제한되지 않는 세포외 펩티다제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있다.
다른 실시양태에서, 절단가능한 링커는 pH-민감성, 즉, 특정한 pH 값에서 가수분해에 대해 민감성이다. 전형적으로, pH-민감성 링커는 산성 조건하에 가수분해가능하다. 예를 들어, 리소좀에서 가수분해가능한 산-불안정성 링커 (예를 들어, 옥심, 히드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니트산 아미드, 오르토에스테르, 아세탈, 케탈 등)가 사용될 수 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; [DUBOWCHIK AND WALKER, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; NEVILLE et al., 1989, Biol. Chem.　264:14653-14661.] 참고)
여전히 다른 실시양태에서, 링커는 관련 기술분야에 공지된 환원 조건하에 절단가능하다. (예를 들어, [Thorpe et al., 1987, Cancer Res.　47:5924-5931; WAWRZYNCZAK et al., In　Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer　(C. W. VOGEL ed., Oxford U. Press, 1987]을 참고한다. 미국 특허 번호 4,880,935 또한 참고). 링커는 또한 세포내에서 (또는 세포외에서) 발견되는 환원 조건하에 절단될 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 특이적인 링커 N-O 결합은 형식적으로 환원되고 절단되어, 링커를 절단시킬 수 있다.
여전히 다른 실시양태에서, 링커 단위는 절단 불가능하고, 약물은 항체 분해에 의해 방출된다. (모든 목적을 위해 전문이 본원에 참고로 포함된 PCT 공보 번호 WO2012/166560 (암브릭스, 인크.) 참고).
상호 배타적이지 않은 다른 실시양태에서, 링커는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 세포 내재화를 촉진시킨다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있는 다양한 예시적인 링커가 WO 2004/010957, 미국 공개 번호 2006/0074008, 미국 공개 번호 20050238649, 및 미국 공개 번호 2006/0024317 (이들 각각은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참고로 포함됨)에 기재되어 있다.
VII.) 스트레처 단위
존재하는 경우 스트레처 단위 (A)는 항체 단위를 존재하는 경우 아미노산 단위 (-W-)에, 존재하는 경우 스페이서 단위 (-Y-)에; 또는 약물 단위 (-D)에 연결시킬 수 있다. 천연적으로 또는 화학적 조작을 통해 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb 상에 존재할 수 있는 유용한 관능기에는 케토, 알데히드, 술프히드릴, 아미노, 히드록실, 탄수화물의 방향족 히드록실 기, 및 카르복실이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 적합한 관능기는 케토, 알데히드, 술프히드릴, 및 아미노이다. 한 예에서, 케토 기는 본 발명의 Mab에 포함된 비천연 아미노산 (nnAA) 상에 있다. 추가의 예에서, 알데히드 기는 본 발명의 Mab에 포함된 nnAA 상에 있다. 또 다른 예에서, 술프히드릴 기는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb의 분자내 디술피드 결합의 감소에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 술프히드릴 기는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb의 리신 모이어티의 아미노 기와 2-이미노티올란 (트라우트(Traut) 시약) 또는 다른 술프히드릴 생성 시약의 반응에 의해 생성될 수 있다. 특정한 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb는 재조합 항체이고, 1개 이상의 리신을 갖도록 조작된다. 특정한 다른 실시양태에서, 재조합 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb는 추가의 술프히드릴 기, 예를 들어, 추가의 시스테인을 갖도록 조작된다.
바람직한 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb는 L234A, L235A에서 Fc 변형을 포함하고, L328C에서 또 다른 변형을 추가로 포함하고, L328C에서 부위-특이적인 접합을 추가로 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 스트레처 단위는 L328C에 위치한다.
VIII.) 아미노산 단위
존재하는 경우 아미노산 단위 (-W-)는 스페이서 단위가 존재하는 경우 스트레처 단위를 스페이서 단위에 연결시키고, 스페이서 단위가 부재하는 경우 스트레처 단위를 약물 모이어티에 연결시키고, 스트레처 단위 및 스페이서 단위가 부재하는 경우 항체 단위를 약물 단위에 연결시킨다.
특정한 실시양태에서, 아미노산 단위는 천연 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 아미노산 단위는 비천연 아미노산을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아미노산 단위는 암 또는 종양-연관된 프로테아제를 비롯한 하나 이상의 효소에 의해 효소적으로 절단되어, 약물 단위 (-D)를 유리시킬 수 있으며, 한 실시양태에서 이는 방출시 생체내에서 양성자화되어 약물 (D)을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 아미노산 단위는 L328C에 존재한다.
IX.) 스페이서 단위
존재하는 경우 스페이서 단위 (-Y-)는 아미노산 단위가 존재하는 경우 아미노산 단위를 약물 단위에 연결시킨다. 대안적으로, 스페이서 단위는 아미노산 단위가 부재하는 경우 스트레처 단위를 약물 단위에 연결시킨다. 스페이서 단위는 또한 아미노산 단위 및 스트레처 단위 둘 다 부재하는 경우 약물 단위를 항체 단위에 연결시킨다. 스페이서 단위는 2가지 일반적인 유형을 갖는다: 비자가-희생성 또는 자가-희생성. 본 발명의 가능한 스페이서의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있다. [TOKI et al., 2002, J. Org. Chem. 67:1866-1872 and Nature Biotechnology 21(7):778-784)]를 참고한다.
자가-희생성 스페이서의 다른 예에는 PAB 기, 예컨대 2-아미노이미다졸-5-메탄올 유도체 (HAY et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett.　9:2237) 및 오르토 또는 파라-아미노벤질아세탈과 전자적으로 유사한 방향족 화합물이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 아미드 결합 가수분해시 고리화를 겪는 스페이서, 예컨대 치환된 및 비치환된 4-아미노부티르산 아미드 (RODRIGUES et al., 1995, Chemistry Biology　2:223), 적절하게 치환된 비시클로[2.2.1] 및 비시클로[2.2.2] 고리계 (STORM et al., 1972, J. Amer. Chem. Soc.　94:5815) 및 2-아미노페닐프로피온산 아미드 (AMSBERRY et al., 1990, J. Org. Chem.　55:5867)가 사용될 수 있다. 글리신의 a-위치에서 치환된 아민-함유 약물의 제거 (KINGSBURY et al., 1984, J. Med. Chem.　27:1447) 또한 자가-희생성 스페이서의 예이다.
바람직한 실시양태에서, 아미노산 단위는 L328C에 존재한다.
X.) 약물 단위
약물 단위 (D)는 임의의 치료제일 수 있다. 예를 들어, 약물 단위는 세포독성제, 세포정지제 또는 면역조절제 (예를 들어, 면역억제제) 또는 화학요법제인 모이어티일 수 있다. D는 스페이서 단위 (존재하는 경우), 아미노산 단위 (존재하는 경우), 스트레처 단위 (존재하는 경우) 또는 항체 단위와 결합을 형성할 수 있는 원자를 갖는 약물 단위 (모이어티)이다. 일부 실시양태에서, 약물 단위 D는 스페이서 단위 (사용되는 경우)와 결합을 형성할 수 있는 질소 원자를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약물 단위" 및 "약물 모이어티"는 동의어이고, 상호교환가능하게 사용된다.
XI.) ADC의 세포독성 효과를 결정하는 방법
약물 또는 항체-약물 접합체가 세포에 대해 세포정지 및/또는 세포독성 효과를 발휘하는지 여부를 결정하는 방법은 공지되어 있다. 일반적으로, ADC의 세포독성 또는 세포정지 활성은 세포 배양 배지에서 항체 약물 접합체의 표적 단백질을 발현하는 포유동물 세포를 노출시키고; 세포를 약 6 시간 내지 약 5 일 동안 배양하고; 세포 생존력을 측정함으로써 측정될 수 있다. 세포-기반 시험관내 검정을 이용하여 항체 약물 접합체의 생존력 (증식), 세포독성, 및 아폽토시스 유도 (캐스케이드 활성화)를 측정할 수 있다.
ADC가 세포정지 효과를 발휘하는지 여부를 결정하기 위해, 티미딘 혼입 검정을 이용할 수 있다. 예를 들어, 96-웰 플레이트의 웰당 5,000 세포의 밀도로 표적 항원을 발현하는 암 세포를 72 시간 동안 배양하고, 72 시간 중 마지막 8 시간 동안 0.5 μCi의 3H-티미딘에 노출시킬 수 있다. 배양물의 세포에 3H-티미딘의 혼입은 ADC의 존재 및 부재하에 측정된다.
세포독성을 결정하기 위해, 괴사 또는 아폽토시스 (프로그래밍된 세포 사멸)를 측정할 수 있다. 괴사는 전형적으로 원형질 막의 투과성 증가; 세포의 팽창, 및 원형질 막의 파열을 동반한다. 아폽토시스는 전형적으로 막 수포화, 세포질 응축, 및 내인성 엔도뉴클레아제의 활성화를 특징으로 한다. 암 세포에 대한 임의의 이들 효과의 결정은 ADC가 암 치료에 유용함을 나타낸다.
세포 생존력은 세포에서 뉴트럴 레드, 트립판 블루, 또는 알라마(ALAMAR)™ 블루와 같은 염료의 흡수를 결정함으로써 측정될 수 있다 (예를 들어, [PAGE et al., 1993, Intl. J. Oncology　3:473-476] 참고). 이러한 검정에서는, 염료를 함유하는 배지에서 세포를 인큐베이션하고, 세포를 세척하고, 염료의 세포 흡수를 반영하는 나머지 염료를 분광광도계를 측정한다. 단백질-결합 염료 술포로다민 B (SRB) 또한 사용하여 세포독성을 측정할 수 있다 (SKEHAN et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst.　82:1107-12).
대안적으로, 테트라졸륨 염, 예컨대 MTT는 죽지 않고 살아있는 세포를 검출함으로써 포유동물 세포 생존 및 증식에 대한 정량적인 비색 검정에서 사용된다 (예를 들어, [MOSMANN, 1983, J. Immunol. Methods　65:55-63] 참고).
아폽토시스는 예를 들어 DNA 단편화를 측정함으로써 정량화될 수 있다.
DNA 단편화의 정량적인 시험관내 결정을 위해 상업적인 광도측정 방법이 이용가능하다. 튜넬(TUNEL) (단편화된 DNA에서 표지된 뉴클레오티드의 혼입을 검출함) 및 ELISA-기반 검정을 비롯한 이러한 검정의 예는 [Biochemica,　1999, no. 2, pp. 34-37 (Roche Molecular Biochemicals)]에 기재되어 있다.
아폽토시스는 또한 세포에서 형태학적 변화를 측정함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 괴사에서와 같이, 원형질 막 온전성의 손실은 특정한 염료 (예를 들어, 형광 염료, 예컨대, 예를 들어, 아크리딘 오렌지 또는 에티듐 브로마이드)의 흡수를 측정함으로써 결정될 수 있다. 아폽토시스성 세포 개수를 측정하는 방법은 [Duke and Cohen, Current Protocols in Immunology (COLIGAN et al. eds., 1992, pp. 3.17.1-3.17.16)]에 기재되어 있다. 세포는 또한 DNA 염료 (예를 들어, 아크리딘 오렌지, 에티듐 브로마이드, 또는 프로피듐 아이오다이드)로 표지될 수 있고, 내부 핵막을 따라 염색질 응축 및 변연화에 대해 세포를 관찰할 수 있다. 아폽토시스를 결정하기 위해 측정될 수 있는 다른 형태학적 변화에는 예를 들어 세포질 응축, 증가된 막 수포화 및 세포 수축이 포함된다.
아폽토시스성 세포의 존재는 배양물의 부착된 및 "부유하는" 구획 둘 다에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 상청액을 제거하고, 부착된 세포를 트립신 처리하고, 원심분리 세척 단계 (예를 들어, 2000 rpm에서 10 분) 후에 제조물을 합하고, (예를 들어, DNA 단편화를 측정함으로써) 아폽토시스를 검출함으로써 두 구획 모두 수집할 수 있다. (예를 들어, [PIAZZA et al., 1995, Cancer Research　55:3110-16] 참고).
생체내에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb 치료적 조성물의 효과는 적합한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 이종성 암 모델을 이용할 수 있으며, 암 외식편 또는 계대된 이종이식편 조직을 면역 손상된 동물, 예컨대 누드 또는 SCID 마우스에 도입시킨다 (KLEIN et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). 예를 들어, PCT 특허 출원 WO98/16628 및 미국 특허 번호 6,107,540은 원발성 종양의 발달, 미세전이, 및 후기 단계 질환의 특징인 골모세포 전이의 형성을 되풀이할 수 있는 인간 전립선암의 다양한 이종이식편 모델을 기재한다. 효능은 종양 형성, 종양 퇴행 또는 전이 등의 억제를 측정하는 검정을 이용하여 예측될 수 있다.
아폽토시스의 촉진을 평가하는 생체내 검정은 치료적 조성물을 평가하는데 유용하다. 한 실시양태에서, 치료적 조성물로 처리된 종양 보유 마우스로부터의 이종이식편을 아폽토시스성 병소의 존재에 대해 실험하고, 비처리 대조군 이종이식편-보유 마우스와 비교할 수 있다. 아폽토시스성 병소가 처리된 마우스의 종양에서 발견되는 정도는 조성물의 치료 효능에 대한 지표를 제공한다.
상기 방법의 실시에서 사용되는 치료적 조성물은 원하는 전달 방법에 적합한 담체를 포함하는 제약 조성물로 제형화될 수 있다. 적합한 담체에는 치료적 조성물과 조합될 때 치료적 조성물의 항-종양 기능을 유지하고, 일반적으로 환자의 면역계에 대해 비-반응성인 임의의 물질이 포함된다. 예로는 임의의 수많은 표준 제약용 담체, 예컨대 멸균성 인산염 완충된 식염수 용액, 정균수 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다 (일반적으로, [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980] 참고).
치료적 제형은 가용화되어, 종양 부위로 치료적 조성물을 전달할 수 있는 임의의 경로를 통해 투여될 수 있다. 잠재적으로 효과적인 투여 경로에는 정맥내, 비경구, 복강내, 근육내, 종양내, 피내, 장기내, 정위 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 정맥내 주사에 바람직한 제형은 보존된 정균수, 멸균성의 비보존수의 용액 중에 치료적 조성물을 포함하고/거나, 0.9% 주사용 멸균성 염화나트륨, USP를 함유하는 폴리비닐클로라이드 또는 폴리에틸렌 백에서 희석된다. 치료적 단백질 제조물은 동결건조되고, 바람직하게는 진공하에 멸균성 분말로서 보관된 다음, 주사하기 전에 정균수 (예를 들어, 벤질 알콜 보존제) 중에서 또는 멸균성 주사용수에서 재구성될 수 있다.
상기 방법을 이용하여 암을 치료하기 위한 용량 및 투여 프로토콜은 방법 및 표적 암에 따라 다를 것이고, 일반적으로 관련 기술분야에서 인정되는 수많은 다른 인자에 따라 좌우될 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb의 변형으로 인해 본 발명의 ADC 중 1종 초과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 ADC를 포함하는 제약 조성물을 포함하고, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb는 C-말단 리신이 부분적으로 제거된 또는 완전히 제거된 항체, N-말단 번역후 변형을 갖는 항체, 중쇄 C-말단 리신이 결여되고 N-말단 번역후 변형을 갖는 항체, 및/또는 중쇄 C-말단 리신을 갖고 N-말단 번역후 변형을 갖지 않는 항체이다.
바람직한 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb는 L234A, L235A, 및 L328C에서 삼중 돌연변이이고, L328C는 부위-특이적인 접합을 위한 위치이다.
XII.) Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 및 TAA를 발현하는 암(들)의 치료
조직 또는 세포의 제한된 조직에서 일반적으로 발현되지만, 표 I에 나열된 것들과 같은 암에서도 발현되는 단백질(들)로서 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA의 확인은 이러한 암의 치료에 대한 수많은 치료적 접근법을 열어 준다.
주목할만 하게는, 표적화된 항종양 요법은 표적화된 단백질이 정상 조직 또는 세포에서, 심지어 바이탈 정상 장기 조직에서 발현될 때에도 유용하였다. 심장 및 결장과 같은 바이탈 장기는 생명을 유지하는데 필수적인 것이다. 비-바이탈 장기는 제거시 개체가 여전히 생존할 수 있는 것이다. 비-바이탈 장기의 예는 난소, 유방, 및 전립선이다.
정상 조직, 심지어 바이탈 정상 조직에서 표적 단백질의 발현은 단백질이 또한 과발현되는 특정한 종양에 대한 치료제로서 단백질을 위한 표적화제의 유용성을 무효화시키지 않는다. 예를 들어, 바이탈 장기에서의 발현은 그 자체로 해롭지는 않다. 또한, 전립선 및 난소와 같이 없어도 되는 것으로 간주되는 장기는 사망률에 영향을 미치지 않고 제거될 수있다. 최종적으로, 일부 바이탈 장기는 면역특권 때문에 정상 장기 발현에 의해 영향을 받지 않는다. 면역특권 장기는 혈관-장기 장벽에 의해 혈액으로부터 보호되어, 면역요법으로 접근 불가능한 장기이다. 면역특권 장기의 예는 뇌 및 고환이다.
따라서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA 단백질의 활성을 억제하는 치료적 접근법은 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA를 발현하는 암 (예컨대, 예를 들어, 표 I에 제시됨 암)을 앓고 있는 환자에게 유용하다. 이들 치료적 접근법은 일반적으로 3가지 클래스에 속한다. 첫번째 클래스는 종양 세포 성장의 억제 또는 지연을 초래하거나 또는 그의 사멸을 유도하는 종양 세포 성장과 관련이 있기 때문에, 이는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA 기능을 조절한다. 두번째 클래스는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA 단백질과 그의 결합 파트너 또는 다른 단백질의 결합 또는 회합을 억제하는 다양한 방법을 포함한다. 세번째 클래스는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA 유전자의 전사 또는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3 또는 다른 TAA mRNA의 번역을 억제하는 다양한 방법을 포함한다.
따라서, 암 환자는 바람직하게는 종양 조직의 면역조직화학 평가, 정량적인 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA 영상화, 또는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA 발현의 존재 및 정도를 신뢰가능하게 나타내는 다른 기술을 이용하여 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA 발현의 존재 및 수준에 대해 평가될 수 있다. 종양 생검 또는 수술 시편의 면역조직화학 분석이 적용가능한 경우 이러한 목적에 바람직하다. 종양 조직의 면역조직화학 분석 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
XIII.) 조합 요법
한 실시양태에서, 인간 종양을 비롯한 종양을 화학요법제 또는 방사선 또는 이들의 조합과 함께 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC로 처리할 때 상승작용이 있다. 달리 말하면, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC에 의한 종양 성장의 억제는 화학요법제 또는 방사선 또는 이들의 조합과 조합될 때 예상보다 훨씬 증강된다. 상승작용은 예를 들어 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC 단독의 처리로부터 예상되는 것보다, 또는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC 및 화학요법제 또는 방사선에 의한 처리의 상가적 효과보다 조합된 처리에 의해 종양 성장의 더 큰 억제로 나타날 수 있다. 바람직하게는, 상승작용은 암의 관해에 의해 입증되며, 관해는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC에 의한 처리로부터 또는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC 및 화학요법제 또는 방사선의 상가적 조합을 이용하는 처리로부터 예상되지 않는다.
Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC 및 화학요법 또는 방사선 또는 이들 둘다의 조합물을 사용하여 종양 세포의 성장을 억제하는 방법은 화학요법 또는 방사선 요법, 뿐만 아니라 이들의 임의의 조합을 시작하기 전에, 동안에 또는 후에 (즉, 화학요법 및/또는 방사선 요법을 시작하기 전에 및 동안에, 전에 및 후에, 동안에 및 후에, 또는 전에, 동안에 및 후에) Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC는 전형적으로 방사선 요법 및/또는 화학요법을 시작하기 1 내지 60 일, 바람직하게는 3 내지 40 일, 더욱 바람직하게는 5 내지 12 일 전에 투여된다. 그러나, 치료 프로토콜 및 구체적인 환자 요구에 따라, 가장 효과적인 치료를 제공하고 궁극적으로 환자의 수명을 연장시키는 방식으로 방법이 수행된다.
화학요법제의 투여는 비경구 및 경장 경로에 의해 전신을 비롯하여 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 한 실시양태에서, Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC 및 화학요법제는 별도의 분자로서 투여된다. 화학요법제 또는 화학요법의 특정한 예에는 시스플라틴, 다카르바진 (DTIC), 닥티노마이신, 메클로레타민 (질소 머스타드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 카르무스틴 (BCNU), 로무스틴 (CCNU), 독소루비신 (아드리아마이신), 다우노루비신, 프로카르바진, 미토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 파클리탁셀 (탁솔), 도세탁셀 (탁소테레), 알데스류킨, 아스파라기나제, 부술판, 카르보플라틴, 클라드리빈, 다카르바진, 플록수리딘, 플루다라민, 히드록시우레아, 이포스파미드, 인터페론 알파, 류프롤리드, 메게스트롤, 멜팔란, 머캅토퓨린, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파르가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 스트렙토조신, 타목시펜, 테니포시드, 테스토락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스타드, 비노렐빈, 겜시타빈, 클로람부실, 탁솔 및 이들의 조합물이 포함된다.
Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC와 조합되어 사용되는 방사선의 공급원은 치료할 환자의 외부 또는 내부에 있을 수 있다. 공급원이 환자의 외부에 있는 경우, 요법은 외부 빔 방사선 요법 (EBRT)으로 공지된다. 방사선의 공급원이 환자의 내부에 있는 경우, 치료는 근접요법 (BT)으로 지칭된다. 한 실시양태에서, 방사선 요법은 붕소 중성자 포획 요법이다. 한 실시양태에서, 방사선은 양성자 붕소 융합 요법이다.
상기 기재된 치료적 레지멘은 추가의 암 치료제 및/또는 레지멘, 예를 들어 추가의 화학요법, 암 백신, 신호 변환 억제제, 비정상적인 세포 성장 또는 암을 치료하는데 유용한 작용제, IGF-1R에 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체 (예를 들어 WO/2005/092380에 기재된 항-CTLA-4 항체 (화이자)) 또는 다른 리간드, 및 시토카인과 추가로 조합될 수 있다.
포유동물이 추가의 화학요법에 적용될 때, 상기 기재된 화학요법제가 사용될 수 있다. 추가로, 성장 인자 억제제, 생물학적 반응 조절제, 항-호르몬 요법, 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 혈관신생 억제제, 및 항-안드로겐이 사용될 수 있다. 예를 들어, 항-호르몬, 예를 들어 항-에스트로겐, 예컨대 놀바덱스(Nolvadex) (타목시펜) 또는 항-안드로겐, 예컨대 카소덱스(Casodex) (4'-시아노-3-(4-플루오로페닐술포닐)-2-히드록시-2-메틸-3-'-(트리플루오로메틸)프로피온아닐리드)가 사용될 수 있다.
상기 치료적 접근법은 광범위한 수술, 화학요법 또는 방사선 요법 레지멘 중 어느 하나와 조합될 수 있다. 본 발명의 치료적 접근법은 모든 환자, 특히 화학요법제의 독성을 잘 견디지 못하는 환자에 대해 감소된 용량의 화학요법 (또는 다른 요법)의 사용 및/또는 덜 빈번한 투여를 가능하게 할 수 있다.
XIV.) 키트/제조 물품
본원에 기재된 실험실, 예후, 예방, 진단 및 치료적 적용에서 사용하기 위해, 키트는 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 1개 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 담체, 패키지 또는 용기를 포함할 수 있고, 각각의 용기(들)은 본원에 기재된 사용과 같은 사용 지침서를 포함하는 표지 또는 삽입물과 함께 방법에서 사용될 별도의 요소 중 하나를 포함한다. 예를 들어, 용기(들)은 본 개시내용의 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA Mab 또는 몇몇 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA MAb를 포함할 수 있다. 키트는 약물 단위를 포함하는 용기를 포함할 수 있다. 키트는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC 중 모두 또는 일부 및/또는 암 및/또는 다른 면역학적 장애를 검출하기 위한 진단 검정을 포함할 수 있다.
본 발명의 키트는 전형적으로 상기 기재된 용기, 및 완충제, 희석제, 충전제, 니들, 시린지; 담체, 패키지, 용기, 바이알 및/또는 튜브 표지 목록 및/또는 사용 지침서, 및 사용 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 비롯하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 물질을 포함하는 그와 연관된 1개 이상의 다른 용기를 포함할 것이다.
표지는 조성물이 특정한 요법 또는 비-치료적 적용, 예컨대 예후, 예방, 진단 또는 실험실 적용을 위해 사용됨을 나타내기 위해 용기 상에 또는 그와 함께 존재할 수 있고, 본원에 기재된 것과 같이 생체내 또는 시험관내 사용을 위한 지침을 또한 나타낼 수 있다. 지침 및 또는 다른 정보 또한 키트와 함께 또는 키트 상에 포함되는 삽입물(들) 또는 표지(들) 상에 포함될 수 있다. 표지는 용기 상에 또는 그와 연관되어 있을 수 있다. 표지를 형성하는 문자, 숫자 또는 다른 기호가 용기 자체에 성형되거나 또는 에칭되는 경우, 표지는 용기 상에 있을 수 있고; 표지가 예를 들어 패키지 삽입물로서 용기를 또한 보유하는 저장소 또는 담체 내에 존재하는 경우, 표지는 용기와 연관되어 있을 수 있다. 표지는 조성물이 암 또는 다른 면역학적 장애와 같은 상태를 진단, 치료, 예방 또는 예측하는데 사용됨을 나타낼 수 있다.
용어 "키트" 및 "제조 물품"은 동의어로 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물, 예컨대 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC를 포함하는 제조 물품(들). 제조 물품은 전형적으로 적어도 1개의 용기 및 적어도 1개의 표지를 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어 보틀, 바이알, 시린지 및 시험 튜브가 포함된다. 용기는 유리, 금속 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 하나의 또는 몇몇의 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC 및/또는 하나 이상의 치료 용량의 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC를 담을 수 있다.
용기는 대안적으로 상태의 치료, 진단, 예측 또는 예방에 효과적인 조성물을 담을 수 있고, 멸균성 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 니들로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물에서 활성 작용제는 본 개시내용의 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA Mab 또는 ADC일 수 있다.
제조 물품은 제약상 허용가능한 완충제, 예컨대 인산염-완충된 식염수, 링거 용액 및/또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 완충제, 희석제, 충전제, 교반기, 니들, 시린지, 및/또는 사용에 대한 지시 및/또는 지침서를 갖는 패키지 삽입물을 비롯하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
예시적인 실시양태
하기 실시양태가 제공된다:
1) 삼중 돌연변이를 포함하는 항체 조성물이며, 삼중 돌연변이는 L234A 변형, L235A 변형, 및 L328C 변형을 포함하고, 상기 삼중 돌연변이는 Fcγ 수용체 결합 및 항체 이펙터 기능을 변형시키는 것인 항체 조성물.
2) 제1항에 있어서, 항체가 EGFR 항체를 포함하는 것인 항체.
3) 제1항에 있어서, 항체가 Her2 항체를 포함하는 것인 항체.
4) 제1항에 있어서, 항체가 Trop2 항체를 포함하는 것인 항체.
5) 제1항에 있어서, 항체가 CDH3 항체를 포함하는 것인 항체.
6) 제1항에 있어서, 항체가 GPNMB 항체를 포함하는 것인 항체.
7) 제1항에 있어서, 항체가 DLL3 항체를 포함하는 것인 항체.
8) 제1항에 있어서, 항체가 ENPP3 항체를 포함하는 것인 항체.
9) 제1항에 있어서, 항체가 SLITRK6 항체를 포함하는 것인 항체.
10) 제1항에 있어서, 항체가 CA9 항체를 포함하는 것인 항체.
11) 제1항에 있어서, 항체가 PSMA 항체를 포함하는 것인 항체.
12) 제1항에 있어서, 항체가 CDH6 항체를 포함하는 것인 항체.
13) 제1항에 있어서, 항체가 글리피칸 3 항체를 포함하는 것인 항체.
14) 제1항에 있어서, 항체가 EDNRB 항체를 포함하는 것인 항체.
15) 제1항에 있어서, 항체가 넥틴-4 항체를 포함하는 것인 항체.
16) 제1항에 있어서, 항체가 SLC34A2 항체를 포함하는 것인 항체.
17) 제1항에 있어서, 항체가 Her3 항체를 포함하는 것인 항체.
18) 제1항에 있어서, 항체가 NRP1 항체를 포함하는 것인 항체.
19) 제1항에 있어서, 항체가 종양 관련 항원 (TAA) 항체를 포함하는 것인 항체.
20) 제3항에 있어서, 서열식별번호(SEQ ID NO): 2를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 Her2 항체.
21) 제3항에 있어서, 서열식별번호: 3을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 Her2 항체.
22) 제3항에 있어서, 서열식별번호: 4를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 Her2 항체.
23) 제2항에 있어서, 서열식별번호: 7을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 EGFR 항체.
24) 제2항에 있어서, 서열식별번호: 8을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 EGFR 항체.
25) 제2항에 있어서, 서열식별번호: 9를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 EGFR 항체.
26) 제2항에 있어서, 서열식별번호: 12를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 EGFR 항체.
27) 제2항에 있어서, 서열식별번호: 13을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 EGFR 항체.
28) 제2항에 있어서, 서열식별번호: 14를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 EGFR 항체.
29) 제2항에 있어서, 서열식별번호: 17을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 EGFR 항체.
30) 제2항에 있어서, 서열식별번호: 18을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 EGFR 항체.
31) 제2항에 있어서, 서열식별번호: 19를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 EGFR 항체.
32) 제4항에 있어서, 서열식별번호: 22를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 Trop2 항체.
33) 제4항에 있어서, 서열식별번호: 23을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 Trop2 항체.
34) 제4항에 있어서, 서열식별번호: 24를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 Trop2 항체.
35) 제5항에 있어서, 서열식별번호: 27을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 CDH3 항체.
36) 제5항에 있어서, 서열식별번호: 28을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 CDH3 항체.
37) 제5항에 있어서, 서열식별번호: 29를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 CDH3 항체.
38) 하기를 포함하는 항체-약물-접합체 (ADC),
(i) 삼중 돌연변이를 포함하는 항체 조성물, 여기서 삼중 돌연변이는 L234A 변형, L235A 변형, 및 L328C 변형을 포함하고, 상기 삼중 돌연변이는 항체 이펙터 기능을 변형시킴;
(ii) 링커; 및
(iii) 약물 단위, 여기서 상기 약물 단위는 부위 L328C에서 특이적으로 접합됨.
39) 제38항에 있어서, 항체 조성물이 EGFR 항체를 포함하는 것인 ADC.
40) 제38항에 있어서, 항체 조성물이 Her2 항체를 포함하는 것인 ADC.
41) 제38항에 있어서, 항체 조성물이 Trop2 항체를 포함하는 것인 ADC.
42) 제38항에 있어서, 항체가 CDH3 항체를 포함하는 것인 항체.
43) 제38항에 있어서, 항체 조성물이 종양 관련 항원 (TAA) 항체를 포함하는 것인 ADC.
44) 제38항에 있어서, TAA 항체가 표 IV에 제시된 것인 ADC.
45) 제38항에 있어서, 스트레처 단위를 추가로 포함하는 ADC.
46) 제38항에 있어서, 스페이서 단위를 추가로 포함하는 ADC.
47) 제38항에 있어서, 아미노산 단위를 추가로 포함하는 ADC.
48) 제1항의 항체를 포함하는 제조 물품.
49) 제38항의 ADC를 포함하는 제조 물품.
50) 치료 유효량의 제38항의 ADC, 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
51) 치료 유효량의 제1항의 항체, 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
52) (i) 개체에게 치료 유효량의 제38항의 ADC를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법이며, 암은 표 I에 제시된 암을 발현하는 세포를 포함하는 것인 방법.
53) (i) 개체에게 치료 유효량의 제1항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법이며, 암은 표 I에 제시된 암을 발현하는 세포를 포함하는 것인 방법.
54) (i) 개체에게 치료 유효량의 제38항의 ADC를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법이며, 질환은 표 V에 제시된 암을 발현하는 세포를 포함하는 것인 방법.
55) (i) 개체에게 치료 유효량의 제1항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 질환을 치료하는 방법이며, 질환은 표 V에 제시된 암을 발현하는 세포를 포함하는 것인 방법.
56) 하기를 포함하는 항체-붕소-접합체 (ABC),
(i) 삼중 돌연변이를 포함하는 항체 조성물, 여기서 삼중 돌연변이는 L234A 변형, L235A 변형, 및 L328C 변형을 포함하고, 상기 삼중 돌연변이는 항체 이펙터 기능을 변형시킴;
(ii) 링커; 및
(iii) 약물 단위, 여기서 상기 약물 단위는 보릴화된 조성물을 포함하고, 상기 약물 단위는 부위 L328C에서 특이적으로 접합됨.
57) 제56항에 있어서, 항체 조성물이 EGFR 항체를 포함하는 것인 ABC.
58) 제56항에 있어서, 항체 조성물이 Her2 항체를 포함하는 것인 ABC.
59) 제56항에 있어서, 항체 조성물이 Trop2 항체를 포함하는 것인 ABC.
60) 제56항에 있어서, 항체 조성물이 CDH3 항체를 포함하는 것인 ABC.
61) 제56항에 있어서, 항체가 GPNMB 항체를 포함하는 것인 항체.
62) 제56항에 있어서, 항체가 DLL3 항체를 포함하는 것인 항체.
63) 제56항에 있어서, 항체가 ENPP3 항체를 포함하는 것인 항체.
64) 제56항에 있어서, 항체가 SLITRK6 항체를 포함하는 것인 항체.
65) 제56항에 있어서, 항체가 CA9 항체를 포함하는 것인 항체.
66) 제56항에 있어서, 항체가 PSMA 항체를 포함하는 것인 항체.
67) 제56항에 있어서, 항체가 CDH6 항체를 포함하는 것인 항체.
68) 제56항에 있어서, 항체가 글리피칸 3 항체를 포함하는 것인 항체.
69) 제56항에 있어서, 항체가 EDNRB 항체를 포함하는 것인 항체.
70) 제56항에 있어서, 항체가 넥틴-4 항체를 포함하는 것인 항체.
71) 제56항에 있어서, 항체가 SLC34A2 항체를 포함하는 것인 항체.
72) 제56항에 있어서, 항체가 Her3 항체를 포함하는 것인 항체.
73) 제56항에 있어서, 항체가 NRP1 항체를 포함하는 것인 항체.
74) 제56항에 있어서, 항체 조성물이 종양 관련 항원 (TAA) 항체를 포함하는 것인 ABC.
75) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 2를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
76) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 3을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
77) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 4를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
78) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 7을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
79) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 8을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
80) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 9를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
81) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 12를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
82) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 13을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
83) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 14를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
84) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 17을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
85) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 18을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
86) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 19를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
87) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 22를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
88) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 23을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
89) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 24를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
90) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 27을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
91) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 28을 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
92) 제56항에 있어서, 서열식별번호: 29를 포함하는 항체 중쇄를 추가로 포함하는 ABC.
93) 제56항에 있어서, 스트레처 단위를 추가로 포함하는 ABC.
94) 제56항에 있어서, 스페이서 단위를 추가로 포함하는 ABC.
95) 제56항에 있어서, 아미노산 단위를 추가로 포함하는 ABC.
96) 치료 유효량의 제56항의 ABC, 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
97) (i) 개체에게 치료 유효량의 제56항의 ABC를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법이며, 암은 표 I에 제시된 암을 발현하는 세포를 포함하는 것인 방법.
실시예:
본 발명의 다양한 측면이 추가로 기재되고, 하기 몇몇 실시예에 의해 설명되며, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 항체 생성 방법 .
항-Her2, 항-EGFR, 항-Trop2, 및 항-CDH3 MAb는 아미노산 서열을 수득하고, 상응하는 뉴클레오티드 서열에 대한 코돈 최적화를 수행함으로써 생성하였다. (표 VI - 항체 서열 1-30 참고). 유전자 단편을 합성하고, 안정한 발현을 위해 이중 HC 및 LC 발현 벡터 카세트의 제한 효소 부위로 클로닝하였다. 일시적인 구축물의 경우, HC 및 LC에 대한 별도의 발현 벡터를 생성하고, 1 대 3 비의 HC 대 LC로 공동 형질감염시켰다. 부위-지정 돌연변이유발 또는 부분 유전자 단편 합성에 이어서, 관련 기술분야에 공지된 기술을 이용하여 서브클로닝함으로써 Fc 변이체를 구축하였다. 안정한 또는 일시적인 발현 벡터를 구축하고, 형질감염 전에 내독소-무함유 DNA 정제 키트로 정제하였다. 안정하게 형질감염된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포는 재조합 항체 및 Fc 변이체를 발현하는 안정한 풀의 생성에 대한 선택 및 회수 과정을 거쳤다. 항체 생성을 위해, 안정하게 형질감염된 풀의 경우 8 내지 12 일의 전형적인 배양 기간을 갖는 유가식 생성 과정을 이용하였고, 일시적인 발현을 위해, 형질감염된 세포를 수확하기 전에 형질감염 후 6-8 일 동안 배양하였다. 후속적으로, 단백질-A 친화도 정제를 수확된 세포 배양물 유체에 대해 수행하였고, 정제된 물질을 포스페이트-완충된 식염수 (PBS)로 완충제 교환하였다. 재조합 항체의 품질은 크기-배제 크로마토그래피, SDS-PAGE, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해 평가될 수 있다.
실시예 2: 단일 및/또는 삼중 돌연변이체 MAb는 표적 결합에 영향을 미치지 않는다.
표적 항원 결합은 효소 결합 면역검정 (ELISA)을 이용하여 평가하였다. 간략히, 96-웰 ELISA 플레이트를 0.05 - 0.075 ug의 Her2/ErbB2 또는 EGFR 또는 Trop2의 재조합 인간 가용성 세포외 도메인 (ECD) (시노 바이올로지컬스, 인크(Sino Biologicals, Inc), 중국 베이징) 또는 0.075 ug의 재조합 인간 CDH3 전장 (아브노바(Abnova), 대만)으로 코팅하였다. 후속적으로, 플레이트를 세척하고, ELISA 차단 완충제로 차단하였다. 이어서, 플레이트를 항-HER2 및 항-EGFR mAb의 경우 0.0001-6.667nM 및 항-TROP2 및 항-CDH3 mAb의 경우 0.0003-20 nM의 농도 범위에서 1% BSA, 0.05% 트윈-20을 함유하는 1x PBS 중에서 3배 계열 희석된 시험 샘플 (즉, 항-HER2, 항-EGFR, 항-TROP2 및 항-CDH3 mAb의 야생형 또는 Fc 변이체)과 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 결합된 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 염소 항-인간-Fc-특이적인 폴리클로날 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch), 펜실베니아주 웨스트 그로브)에 의해 검출하였다. 결합되지 않은 검출 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 테트라메틸벤지딘 (TMB)의 느린 동역학 기질 용액을 시험 샘플의 양에 비례하여 발색되는 웰에 첨가하였다. 색상의 광학 밀도 (OD)를 650 nm에서 측정하고, 표적 항원에 결합된 시험 샘플의 양을 결정하기 위해 이용하였다. 시험 농도의 범위에 걸쳐 항체의 검출가능한 결합을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)에 의한 단일-부위 결합, 비선형 회귀 분석을 이용하여 분석하였다.
결과는 야생형과 비교할 때, 단일 돌연변이 L328C, 이중 돌연변이 L234A 및 L235A, 및 삼중 돌연변이 L234A, L235A, 및 L328C를 갖는 mAb가 표적에 결합하고, 단일 및 이중 돌연변이의 경우와 마찬가지로 삼중 돌연변이는 표적 결합에 영향을 미치지 않음을 나타낸다 (도(들) 1, 2, 3, 4, 5, 및 6).
실시예 3: FcγRI 결합의 억제가 삼중 돌연변이체 MAb에 대해 관찰된다.
FcγRI 결합은 효소 결합 면역검정 (ELISA)을 이용하여 평가하였다. 간략히, 96-웰 ELISA 플레이트를 1x PBS (pH7.4) 코팅 완충제 중 CD64/FCGRIA의 재조합 인간 가용성 ECD (시노 바이올로지컬스, 인크. 중국 베이징)로 코팅하였다. 후속적으로 플레이트를 세척하고, ELISA 차단 완충제로 차단하였다. 플레이트를 0.005-80 ug/ml (또는 0.002~30ug/ml) 농도 범위에서 1% BSA, 0.05% 트윈-20을 함유하는 1x PBS 중에서 4배 계열 희석된 시험 샘플 (즉, 트라스투주맙, 파니투무맙, 세툭시맙, 니모투주맙, 사시투주맙, 또는 항-CDH3 (5836)의 야생형 또는 Fc 변이체)과 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 결합된 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 염소 항-인간 Fc-특이적인 폴리클로날 항체 (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브)에 의해 검출하였다. 결합되지 않은 검출 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 테트라메틸벤지딘 (TMB)의 느린 동역학 기질 용액을 시험 샘플의 양에 비례하여 발색되는 웰에 첨가하였다. 색상의 광학 밀도 (OD)를 650nm에서 측정하고, FcγRI에 결합된 시험 샘플의 양을 결정하기 위해 이용하였다. 시험 농도 범위에 걸쳐 항체의 검출가능한 결합을 그래프패드 프리즘에 의한 단일-부위 결합, 비선형 회귀 분석을 이용하여 분석하였다.
결과는 야생형의 단일 돌연변이체 L328C, 및 이중 돌연변이체 L234A & L235A와 비교하여 삼중 돌연변이체에 대해 FcγRI 결합의 실질적인 억제가 관찰되었음을 나타낸다 (도(들) 7, 8, 9, 10, 11 및 12).
실시예 4: FcγRIIA (CD32) 결합의 억제가 삼중 돌연변이체 MAb에 대해 관찰되었다.
항체와 낮은 친화도 FcyRIIA 수용체의 결합은 변형된 샌드위치 포맷 ELISA에 의해 결정하였다. 간략히, 미세역가 플레이트를 4 ug/ml에서 항-his 태그 항체 (노부스(Novus), NBP1-25939 lot#A4) 100 ul/웰로 코팅하였다. 이어서, BSA를 함유하는 PBS로 웰을 차단하였다. 이어서, 상이한 비로 FcγRIIa (CD32) (시노 바이올로지컬스, 인크. 중국 베이징, cat# 10374-H08H)와 혼합된 Fc 변이체의 계열 희석액을 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS로 세척한 후, PBS-T + 1% BSA 중 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-표지된 염소 항-hIgG Fc, 잭슨이뮤노리서치)의 1:3,000 희석액을 첨가하여, His-태그 포획된 FcyRIIA 및 Mab 복합체를 검출하였다. 테트라메틸벤지딘 (TMB)을 첨가하여 결과를 시각화하였고, 광학 밀도 (OD)를 650 nm에서 측정하였다. Fc 변이체 시험 농도의 범위에 걸쳐 항-his 태그 Ab에 의해 포획된 FcyRIIA에 대한 항체의 검출가능한 결합을 나타내는 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하는 단일-부위 결합 비선형 회귀 분석에 의해 분석하였다.
결과는 시험된 모든 항체에 대해 야생형 및 이중 돌연변이체 L234A & L235A와 비교하여 삼중 돌연변이체 및 단일 돌연변이체 L328C에 대해 FcγRIIA 결합의 억제가 관찰되었음을 나타낸다 (도(들) 13, 14, 15, 및 16).
실시예 5: FcγRIIIa 결합의 억제가 삼중 돌연변이체 MAb에 대해 관찰되었다.
FcγRIIIa 결합은 효소 결합 면역검정 (ELISA)을 이용하여 평가하였다. 간략히, 96-웰 ELISA 플레이트를 1x PBS (pH7.4) 코팅 완충제 중 hCD16a/FCGRIIIA의 재조합 인간 가용성 ECD (시노 바이올로지컬스, 인크, 중국 베이징)로 코팅하였다. 후속적으로 플레이트를 세척하고, ELISA 차단 완충제로 차단하였다. 플레이트를 0.005-80 ug/ml의 농도 범위에서 1% BSA, 0.05% 트윈-20을 함유하는 1x PBS 중에서 4배 계열 희석된 시험 샘플 (즉, 트라스투주맙, 파니투무맙, 세툭시맙 또는 니모투주맙의 야생형 또는 Fc 변이체)과 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 결합된 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 염소 항-인간 Fc-특이적인 폴리클로날 항체 (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브)에 의해 검출하였다. 결합되지 않은 검출 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 테트라메틸벤지딘 (TMB)의 느린 동역학 기질 용액을 시험 샘플의 양에 비례하여 발색되는 웰에 첨가하였다. 색상의 광학 밀도 (OD)를 650 nm에서 측정하고, FcγRIIa에 결합된 시험 샘플의 양을 결정하기 위해 이용하였다. 시험 농도 범위에 걸쳐 항체의 검출가능한 결합을 그래프패드 프리즘에 의한 단일-부위 결합, 비선형 회귀 분석을 이용하여 분석하였다.
결과는 시험한 모든 항체에 대해 야생형 및 이중 돌연변이체 L234A & L235A와 비교하여 삼중 돌연변이체 및 단일 돌연변이체 L328C에 대해 FcγRIIIa 결합의 실질적인 억제가 관찰되었음을 나타낸다 (도(들) 17, 18, 19, 20, 21, 및 22).
실시예 6: FcRn 결합의 억제는 Fc 변이체 및/또는 삼중 돌연변이체 MAb에 의해 실질적인 영향을 받지 않는다.
FcRn 결합은 효소 결합 면역검정 (ELISA)을 이용하여 평가하였다. 간략히, 96-웰 ELISA 플레이트를 1x PBS (pH 6.0) 코팅 완충제 중 재조합 인간 FcRn (시노 바이올로지컬스, 인크, 중국 베이징)으로 코팅하였다. 후속적으로, 플레이트를 세척하고, ELISA 차단 완충제로 차단하였다. 플레이트를 0.04-90 ug/ml (또는 0.04~30ug/ml)의 농도 범위에서 1% BSA, 0.05% 트윈-20을 함유하는 1x PBS (pH 6.0) 중에서 3배 계열 희석된 시험 샘플 (즉, 트라스투주맙, 파니투무맙, 세툭시맙 또는 니모투주맙, 사시투주맙, 또는 항-CDH3 (5836)의 야생형 또는 Fc 변이체)과 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 결합된 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 염소 항-인간 Fc-특이적인 폴리클로날 항체 (잭슨 이뮤노리서치, 펜실베니아주 웨스트 그로브)에 의해 검출하였다. 결합되지 않은 검출 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 테트라메틸벤지딘 (TMB)의 느린 동역학 기질 용액을 시험 샘플의 양에 비례하여 발색되는 웰에 첨가하였다. 색상의 광학 밀도 (OD)를 650 nm에서 측정하고, FcRn에 결합된 시험 샘플의 양을 결정하기 위해 이용하였다. 시험 농도 범위에 걸쳐 항체의 검출가능한 결합을 그래프패드 프리즘에 의한 단일-부위 결합, 비선형 회귀 분석을 이용하여 분석하였다.
결과는 FcRn 결합의 억제가 야생형 항체와 비교하여 삼중 돌연변이체 항체를 비롯하여 이로 제한되지 않는 Fc 변이체에 의해 실질적인 영향을 받지 않았음을 나타낸다 (도(들) 23, 24, 25, 26, 27, 및 28).
실시예 7: 옥텟(Octet) HTX 시스템을 이용하여 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb, 및 FcRn에 대한 동역학 및 친화도 분석.
항-Her2 항체 및 Fc 변이체에 대한 상이한 Fc 수용체의 결합 친화도는 25℃에서 옥텟 HTX 시스템 (몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices))을 이용하여 수행하였다. 간략히, 인간 FcR His-태그 부착된 재조합 단백질 패널 (FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA-F, FcγRIIIA-V, FcγRIIIB, 및 FcRn)을 항-펜타 His (H1S1K) 바이오센서 상에 로딩하였다. 로딩된 센서를 0.1% BSA, 0.02% 트윈-20 pH7.4 또는 FcRn 분석의 경우에는 pH 6.0을 갖는 PBS로 구성된 완충제 중 Mab 시험 샘플의 계열 희석액 (300 nM 시작, 1:2 희석, 7 점)에 침지시켰다. 동역학 상수는 1가 (1:1) 결합 모델을 이용하여 계산하였다. FcR 패널에 결합하는 것으로 공지된 항체를 양성 대조군으로서 사용하였다. kdis/kon의 비로 정의되는 평형 해리 상수 (KD)는 몇몇 상이한 농도에서 수득된 센소그램 곡선을 분석함으로써 결정되었다.
도 29에 요약된 바와 같이, 결과는 FcyRI, FcyRIIA, FcyRIIB, FcyRIIIA (F158 및 V158 변이체) 및 FcyRIIIB와의 결합에 대한 Fc 도메인에 단일 또는 삼중 돌연변이 도입의 효과, 뿐만 아니라 FcRn 결합에 대한 효과를 나타낸다. FcγRI 결합의 경우, 삼중 돌연변이체에서 관찰된 KD 값에서의 실질적인 감소는 대부분 항체 해리 속도 (kd)의 증가에서 기인한다 (도 29). 삼중 돌연변이체의 경우 그의 항원으로부터 신속한 해리 또한 크로마토그램에 도시된다 (도 30). 야생형 또는 단일 돌연변이체 항체와 비교하여 삼중 돌연변이체에 대해 회합 속도 (kon)에서 약간의 감소만이 관찰되었다. 삼중 돌연변이체의 검출 불가능한 결합으로 인해 다른 Fcγ 수용체에 대한 Kd 값은 결정할 수 없었다 (도 29). 대조적으로, FcRn에 대해 관찰된 KD 값은 삼중 돌연변이체의 경우에 손상되지 않았으며, 이는 삼중 돌연변이체에 대한 결합 친화도의 감소가 Fc 감마 수용체 이소형에 대해 특이적임을 암시한다.
실시예 8: 옥텟을 이용하여 FcγRI에 대한 결합 동역학 분석 (해리 속도).
추가의 결합 실험은 25℃에서 옥텟 HTX 상에서 수행하였다. 간략히, 인간 FcR His-태그 부착된 재조합 단백질 패널 (FcRI)을 항-펜타 His (H1S1K) 바이오센서 상에 로딩하였다. 로딩된 센서를 0.1% BSA, 0.02% 트윈-20 pH7.4 또는 FcRn 분석의 경우에는 pH 6.0을 갖는 PBS로 구성된 완충제 중 Mab 시험 샘플의 계열 희석액 (300 nM 시작, 1:2 희석, 7 점)에 침지시켰다. 동역학 상수는 1가 (1:1) 결합 모델을 이용하여 계산하였다. FcR 패널에 결합하는 것으로 공지된 항체는 양성 대조군으로서 사용되었다.
결과는 삼중 돌연변이체 해리 속도가 야생형 및 단일 돌연변이체와 비교할 때 FcγRI에 대해 더 빠름을 나타낸다 (도 30).
실시예 9: 유세포 분석을 이용하여 Fc 변이체의 ADCC 분석 .
Fc 변이체-매개된 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 평가하기 위해, 유세포 측정 ADCC 평가를 이용하였다. 간략히, 인간 암 세포는 표적 세포로서 사용되었고, 냉동 PBMC는 이펙터 세포로서 사용되었다. 인간 암 세포를 8 uM 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE) 염료 (셀렉켐(Selleckchem), cat#S8269 lot#S826901)로 30 분 동안 표지하고, 세포 배양 배지로 2회 세척하고, U 바닥 96 플레이트에 첨가하였고, 적합한 농도의 Fc 변이체를 첨가하였다. 이펙터 세포로서 인간 PBMC를 첨가하여 ADCC를 개시하였다 (4~8:1의 이펙터:표적 (E:T) 비). 플레이트를 5% CO2, 가습된 분위기에서 37℃에서 밤새 추가로 인큐베이션하였다. 세포를 2회 세척하고, 죽은 세포를 염색하는 고정가능한 생존력 염료 (FVD, 이바이오사이언스(eBioscience), CA)의 1:500 희석액으로 염색하였다. 30 분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS로 세척한 다음, 아튠 엔엑스티.(Attune Nxt.) (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 이용하여 유세포 분석에 적용하였다. 각각의 실험의 경우, 측정을 3회씩 수행하였다. 총 표적 세포 (CFSE 양성)에서 죽은 표적 세포 (CFSE 양성 및 FVD 양성)의 백분율을 이용하여 % 세포독성을 결정하였다. 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 % 세포독성 막대 그래프로 도시된다.
결과는 ADCC에서의 감소가 야생형과 비교하여 각각의 mAb에 대해 현저하게 감소된 삼중 돌연변이체를 갖는 Fc 변이체에 의해 관찰됨을 나타낸다 (도 31, 32, 33, 및 34).
실시예 10: 유세포 분석을 이용하여 Fc 변이체의 CDC 분석.
보체-의존성 세포 세포독성 (CDC)은 보체 공급원으로서 새끼 토끼 혈청 및 표적 세포로서 인간 암 세포를 이용하여 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 방출 검정에 의해 결정하였다. 간략히, 표적 세포 (웰당 20x10e3)를 96-웰 U-바닥 플레이트에 분배하고, Fc 변이체와 함께 얼음 상에서 30 분 동안 사전 인큐베이션하였다. 이어서, 희석된 보체를 첨가하였고, 37℃ (5% CO2, 가습된 분위기)에서 4 시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 검정을 항체를 사용하거나 또는 사용하지 않고 3회씩 수행하였다. 최대 방출은 용해 용액에 의해 용해된 표적 세포를 사용하여 제조되었다. 상청액 LDH 활성은 비방사성 세포독성 검정 키트 (프로메가(Promega) cat#G1781)에 의해 측정하였다. 세포 사멸의 방출된 LDH 활성 지표는 분광광도계 (사이테이션1 바이오텍(Cytation1 Biotek))를 이용하여 490 nm에서 광학 밀도에 의해 결정되었다. 세포독성 백분율은 하기 식에 따라 계산하였다: 세포독성 (%) =100 x (실험적인 방출-자발적인 방출)/(최대 방출-자발적인 방출). 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 생성된 % 세포독성 막대 그래프로 나타낸다.
결과는 CDC에서의 감소가 각각의 MAb에 대해 현저하게 감소된 삼중 돌연변이체를 갖는 Fc 변이체에 의해 관찰된다 (도 35, 36, 37, 및 38).
실시예 11: ELISA를 이용하여 Fc 변이체의 C1q 결합.
C1q 결합은 효소 결합 면역검정 (ELISA)을 이용하여 평가하였다. 간략히, 96-웰 ELISA 플레이트를 1x PBS (pH7.4) 코팅 완충제 중 1 ug/ml 시험 샘플 (즉, 트라스투주맙, 파니투무맙, 사시투주맙 & 항-CDH3-5836의 야생형 또는 Fc 변이체) 60 ul/웰로 코팅하였다. 후속적으로 플레이트를 세척하고, ELISA 차단 완충제 (1% BSA를 함유하는 PBS)로 차단하였다. 플레이트를 0.625-40 ug/ml의 농도 범위에서 1% BSA, 0.05% 트윈-20을 함유하는 1x PBS 중에서 2배 계열 희석된 희석 인간 C1q (시그마(sigma) Cat#C1740 lot#SCC6462)와 함께 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척한 후, PBS 중 1%의 BSA 및 0.05% 트윈 (PBS-T)에서 5 ug/ml의 토끼 항-h C1q (다코 A0136 lot#20047640)를 60 ul/웰로 첨가하고, 실온에서 1.0 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 세척한 후, 결합된 항체를 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 염소 항 토끼 HRP-특이적인 폴리클로날 항체 (잭슨 이뮤노리서치, cat#111-036-046 펜실베니아주 웨스트 그로브)에 의해 검출하였다. 테트라메틸벤지딘 (TMB)의 느린 동역학 기질 용액을 첨가하고, 색상의 광학 밀도 (OD)를 650 nm에서 측정하였다. 시험 농도 범위에 걸쳐 항체의 검출가능한 결합을 나타내는 데이터는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 단일-부위 결합 비선형 회귀 분석에 의해 분석하였다.
결과는 C1q 결합에서의 감소가 Fc 변이체 및 각각의 MAb에 대해 현저하게 감소된 삼중 돌연변이체에 의해 관찰됨을 나타낸다 (도 39, 40, 41, 및 42).
실시예 12: 부위-특이적인 ADC의 생성 및 특징분석
부위-특이적인 티올의 생성
Fc 변이체의 힌지 디술피드를 PBS 중 DTT에 의해 실온에서 15 분 동안 환원시키고, PD-10 컬럼을 사용하여 pH 6.5 완충제로 탈염시킴으로써 항체를 과량의 환원제로부터 정제하였다. 예상되는 유리 티올은 엘만(Ellman) 시험에 의해 확인하였다. 이어서, 항체 농도에 비해 35배 과량의 데히드로아스코르브산 (DHA)을 사용하여 힌지 디술피드를 개질시켰다. 재산화의 진행은 엘만 시험에 의해 모니터링된다. 티올-대-항체 비가 대략 2.0에 도달할 때 말레미드-페이로드를 첨가한다.
접합체 제조
본 발명의 부위-특이적인 ADC를 생성하기 위해, 말레이미드-링커를 활성화된 부위-특이적인 항체에 첨가함으로써 LOL1로 표시된 독점 링커(들)을 사용하여 항체 접합체를 제조하였다. 활성화 과정 (즉, 유리 티올의 유리)은 상기 기재되어 있다 (부위-특이적인 티올의 생성). DMSO 중 링커 용액을 1.2 mol eq.의 링커에서 티올에 첨가한다. 반응을 실온에서 45-60 분 동안 교반한다. 생성된 접합체는 PD-10 또는 유사한 탈염 컬럼을 사용하여 히스티딘 제형 완충제 (pH6)로 정제하고, 분석한다.
접합체 평가
단일 (즉, L328C) 또는 삼중 돌연변이체 (즉, L234A, L235A, L328C) 항체를 사용하여 부위-특이적인 ADC를 생성하는 능력을 검증하기 위해, 3가지 기술을 이용하였다: (i) 온전한 질량 분석, (ii) 펩티드 맵핑 및 (iii) 역상 HPLC. 역상 HPLC는 시스테인-기반 접합체를 해부하는 주요 방법이며, 이를 이용하여, 페이로드가 중쇄에 주로 또는 단독으로 접합되고 중쇄 내의 단일 위치에서만 접합되는 것과, 따라서 생성물이 부위-특이적임을 확인하였다. 질량 분광분석법에 의한 온전한 분석을 이용하여, 접합된 중쇄가 정확하고 예상되는 질량을 가짐을 (즉, HC + 페이로드) 확인한 반면에, 펩티드 맵핑을 통해, 페이로드가 중쇄 내의 특이적인 위치에 테더링됨을 확인한다. 여기서, 온전한 질량 분석을 이용하여, 삼중 돌연변이를 갖는 LOL-1 접합된 항-HER2 mAb가 단일 접합된 중쇄 및 접합되지 않은 경쇄로 구성됨을 입증하였다 (도 44). 단일 또는 삼중 돌연변이를 갖는 단일 및 삼중 돌연변이체 vcMMAE 접합된 항-EGFR mAb No.1 둘 다의 펩티드 맵핑은 중쇄 내의 ACPAPIEK 펩티드가 L328C 돌연변이 부위 및 접합 부위 둘 다임을 밝혀냈다 (도 54, 55).
질량 분석은 저처리량 기술이지만, 역상 HPLC는 ADC의 상대적인 조성을 나타내는 고처리량 기술이다. 모노클로날 항체의 경우 야생형 인간 IgG1에 존재하는 접합에 이용가능한 8개의 시스테인만이 있기 때문에, 이는 시스테인 측쇄를 통해 접합된 접합체 및 ADC의 경우에 특히 유용하다.
일반적으로, 각각의 Cys-기반 ADC는 알아야 될 필요가 있는 유한한 개수의 페이로드를 갖는다. 일반적으로, 페이로드로서 vcMMAE를 사용하는 ADC가 종양 사멸에 효과적이도록 2개 내지 4개의 페이로드를 가져야 하는 것으로 인정된다. 추가로, 그들의 구성은 0개 (접합되지 않은) 내지 8개 (완전히 접합된) 범위의 페이로드 분포이다. 정의된 개수 (전형적으로 mAb당 2개)의 페이로드를 갖도록 조작된 항체 (즉, 분포 및 높은 페이로드-대-mAb 종이 부족한 부위-특이적인 ADC)는 임상 효능, 안전성 또는 안정성에서 유리한 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명자들은 주요 기술로서 역상 크로마토그래피 검정에 의한 분석 방법을 이용하여, vcMMAE의 접합으로부터 ADC의 구성을 해부한다. 각각의 종 (즉, 중쇄, 경쇄, 및 접합된 종)은 체류 시간 및 UV250/280 비 둘 다를 기반으로 하여 확인되며, DAR (약물-대 mAb 비)을 계산한다. 추가로, 본 발명자들은 페이로드가 중쇄에 주로 또는 완전히 테더링되고, 단일 페이로드를 갖는 중쇄가 주요 종이며, 부위-특이적인 접합의 주요 속성임을 나타내었다.
분석 물질 및 방법은 하기에 따라 수행되었다:
온전한 질량 분광 분석
간략히, 1/20 부피의 200mM DTT를 첨가하고, 37℃에서 1 시간 동안 인큐베이션함으로써 샘플을 제조하였다. 애질런트(Agilent) 1260 LC 및 애질런트 6520 Q-TOF 질량 분광계를 사용하여 샘플을 분석하였다. 액체 크로마토그래피 컬럼은 10μm PLRPS 폴리스티렌 역상 팩킹으로 채워진 2mm ID x 10cm 길이 컬럼이었다. 용매는 물 중 0.1% 포름산 (A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (B)이었다. 구배는 1% B에서 1 분 유지, 70% B로 14 분 경사, 90% B로 1 분 경사, 90% B에서 1 분 유지, 및 다시 1% B로 1 분 경사였다. 데이터는 애질런트 질량 헌터 데이터 획득 소프트웨어를 이용하여 수득하고, 바이오컨펌(Bioconfirm)과 함께 애질런트 질량 헌터 정성 분석을 이용하여 분석하였다. 데콘볼루션(Deconvolution)은 최대 엔트로피 모델을 이용하였다.
결과는 삼중 돌연변이를 갖는 LOL1-접합된 항-HER2 항체가 뚜렷한 체류 이동을 생성하였고, 이는 단지 1개의 위치 이성질체가 형성되었으며, 부위-특이적인 접합의 높은 지표임을 시사한다 (도 43). 온전한 질량 분석에 의한 추가의 확인을 통해, 상기 LOL1 접합된 삼중 돌연변이체 항-HER2 항체가 부위-특이적인 것으로 나타났다 (도 44). 23440 달톤 (Da)의 평균 질량을 갖는 접합되지 않은 경쇄 (LC)만이 검출되었다 (도 44). 23462 Da 피크는 LC-MS 시스템에서 일반적으로 형성되는 나트륨 부가물을 나타낸다. 중쇄 (HC)의 경우, 접합된 종은 평균 질량 49487 Da (항체 생성을 위해 사용된 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 배양물 시스템에서 전형적으로 관찰되는 c-말단 리신 결실 (-K)을 반영함) 및 49613 Da 생성물 (온전한 미가공 c-말단 리신 (+K)을 갖는 HC를 반영함)에서 발견된다. 접합되지 않은 HC 종 및 제2 접합 부위를 갖는 HC 모두 발견되지 않는다 (도 44). 종합하면, 온전한 질량 분석은 (i) 단일 LOL1 페이로드만이 중쇄에 접합되고; (ii) 경쇄와의 접합이 검출되지 않고, (iii) 이러한 접합이 임의의 힌지-영역 시스테인이 아니라 조작된 Cys-328에서만 형성될 수 있음을 확인시켜 주었다.
도(들) 43 및 44의 결과는 독점 페이로드 LOL-1과 접합된 ADC가 삼중 Fc 돌연변이체의 경우 L328C에서 100% 부위-특이적임을 확인시켜 준다.
역상 크로마토그래피 분석
추가로, 항체 및/또는 항체 약물 접합체는 하기 프로토콜을 이용하여 역상 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 간략히, ADC 또는 mAb를 DTT에 의해 환원시키고, 워터스 H-클래스 UPLC 시스템을 사용하는 액퀴티(Acquity) C4 넓은 공극 컬럼 (100x2.1 mm, 300Å, 워터스(Waters))을 이용하여 분석하였다. 컬럼을 80℃에서 유지시켰다. mAb 경쇄 및 중쇄는 아세토니트릴 (0.1% TFA) 구배에서 분리되었다.
도 45의 결과는 단일 페이로드를 갖는 중쇄 (H1)가 접합이 부위-특이적임을 시사하는 주요 종이고, 페이로드가 힌지 영역 내가 아니라 Cys328 상에 존재함을 나타낸다. 추가로, 도 46은 vcMMAE와 접합된 항-Trop2 Mab의 L328C 변이체에 대한 역상 컬럼 크로마토그래피 프로파일을 도시한다. 80% 초과의 부위-특이적인 접합이 Cys328 중쇄 상에서 발생하는 것으로 나타난다.
도 47은 vcMMAE와 접합된 항-Trop2 Mab의 L234A, L235A, L328C 삼중 돌연변이체 변이체에 대한 역상 컬럼 크로마토그래피 프로파일을 도시한다. 70% 초과의 부위-특이적인 접합이 Cys328 중쇄 상에서 발생하는 것으로 나타난다. 도 48은 vcMMAE와 접합된 항-EGFR Mab의 L234A, L235A, L328C 변이체에 대한 역상 컬럼 크로마토그래피 프로파일을 도시한다. DAR1이 주요 종이며, 80% - 90% 초과의 부위-특이적인 접합이 Cys328 중쇄 상에서 발생하는 것으로 나타난다.
도 49는 도 49에 제공된 RP-HPLC 데이터를 기반으로 하여 피크 배치 및 DAR 계산을 도시한다. 접합되지 않은 Mab (대조군)를 이용하여, 중쇄 및 경쇄 둘 다에 대한 체류 시간 및 UV250/280 비 둘 다를 확인하였다. 이들 파라미터가 피크 배치 뿐만 아니라 DAR 결정을 위해 필요함을 주목한다. DAR은 하기와 같이 계산되었다:
Figure pct00001
상기 식에서,
LC0, LC1은 각각 LC 접합되지 않은 및 vcMMAE-접합된 AUC이고,
HCn은 각각의 중쇄 종의 AUC이고, n은 vcMMAE 페이로드의 배수이다.
도 50은 평균 DAR, SEC에 의해 결정되는 % 단량체 피크, 및 단일 또는 삼중 Fc 변이체를 갖는 vcMMAE 또는 LOL1 접합된 mAb에 대한 DAR1 종의 %을 비롯한 분석 속성의 요약을 도시한다.
펩티드 맵핑
페이로드가 중쇄 내의 특이적인 위치에 테더링되는지 확인하기 위해, 펩티드 맵핑 분석을 하기 프로토콜을 이용하여 수행하였다.
(i) 샘플 제조:
관련 기술분야에 공지된 절차에 따라 아이오도아세트아미드를 사용하여 알킬화된 Mab(들) 또는 및 ADC(들)을 DTT 및 유리 티올에 의해 환원시켰다. 트립신 소화 펩티드 맵을 수득하기 위해, 상기 항체를 다음과 같이 소화시켰다: 5M 구아니딘을 사용하여 부분적인 변성 조건하에 항체를 DTT에 의해 환원시켰다. 아이오도아세트아미드를 DTT 농도의 2배로 첨가하였다. 제바-스핀(Zeba-Spin) (써모) 컬럼을 이용하여 100 mM 인산염 완충제로 탈염시킴으로써 알킬화된 mAb를 정제하였다. 트립신을 각각의 샘플에 첨가하였고, 샘플을 밤새 37℃에서 인큐베이션하고, 증발 건조시키고, 펠렛을 100 μL의 5% ACN, 95% 물, 0.1% 포름산 중에 재현탁시켰다.
(ii) LC-MS:
샘플을 제조한 후, C18 3μm 벌크 수지 (어클레임 펩맵(Acclaim PepMap) 100, 써모 사이언티픽)로 채워진 75μm x 2 cm 트랩 컬럼 및 C18 2μm 수지 (어클레임 펩맵 RSLC, 써모 사이언티픽)로 채워진 75μm x 15 cm 분석 컬럼을 구비한 얼디메이트(ultimate) 3000 나노 LC에 5.0 μL 샘플을 주입하였다. 나노LC 구배는 300 nL/min의 유속에서 40 분에 걸쳐 3-35% 용매 B (A = 0.1% 포름산을 갖는 H2O; B = 0.1% 포름산을 갖는 아세토니트릴) 및 5 분 내에 35% 내지 85% 용매 B이었다. 나노LC를 큐 이그잭티브 플러스 오르비트랩(Q Exactive Plus orbitrap) 질량 분광계 (써모 피셔 사이언티픽, 캘리포니아주 산호세)에 커플링시켰다. ESI 전압을 1.9 kV로 설정하고, 모세관 온도를 275℃로 설정하였다. 전체 스펙트럼 (m/z 350 - 2000)은 3 x 106의 자동화된 이득 제어 (AGC) 표적으로 m/z 200에서 분해능 70,000에 의한 프로파일 모드에서 획득되었다. 가장 풍부한 15가지 이온을 25의 정규화된 충돌 에너지를 갖는 고에너지 충돌 해리 (HCD)에 의해 단편화에 적용하였다. MS/MS 스펙트럼은 m/z 200에서 분해능 17,500에 의해 중심 모드에서 획득되었다. 단편 이온에 대한 AGC 표적은 50 ms의 최대 주입 시간에 의해 2 x 104로 설정되었다. 전하 상태 1, 7, 8, 및 배정되지 않은 것은 직렬식 MS 실험으로부터 제외된다. 동적 제외는 45.0 s에서 설정되었다.
도 51의 결과는 vcMMAE-펩티드의 단편화 후의 특징적인 딸 이온을 도시한다. 또한, 도 52는 vcMMAE와 접합된 삼중 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체 No 1의 서열 적용범위를 나타낸다. 도 53은 대표적인 TIC 크로마토그램을 도시한다. 차이는 원으로 나타내었다. 도 54는 삼중 돌연변이를 갖는 항-EGFR 항체 No 1에 대한 접합 부위를 함유하는 펩티드의 전하 상태를 도시한다. 접합되지 않은 대조군 mAb는 중쇄로부터의 ACPAPIEK 펩티드와 일치하는 886의 M/z를 갖는 [M+1] 이온을 갖는다 (A). 그의 +2 이온은 삽입도에 도시된다. 486 및 654의 M/z를 갖는 2가지 두드러진 딸 이온은 (B)에 도시된다. vcMMAE 접합체에서, 이 펩티드는 시스테인과의 접합으로 인해 상이한 위치에서 역상 컬럼으로부터 용리된다 (이전 도면 참고). 생성된 생성물은 C에서 확인된다 (+2 및 +3 전하 상태가 도시됨). 단편은 동일한 ACPAPIEK 펩티드임을 확인시켜 주는 상기와 동일한 이온을 함유한다 (D, 채워진 화살표). 686, 506 및 321의 M/z를 갖는 추가의 단편 (D, 빈 화살표)은 VCMMAE에 속하고, 도 52의 것에 상응한다. 마지막으로, 도 55는 단일 돌연변이 (L328C)를 갖는 항-EGFR 항체 No. 1에 대한 접합 부위 또한 중쇄의 ACPAPIEK 펩티드 상에서 확인되었음을 나타낸다.
vcMMAE-접합된 항-EGFR 항체 No.1의 단일 돌연변이체에 대한 펩티드 맵에 대한 항체 단편 및 신뢰 점수의 목록이 표 VII에 제시된다. vcMMAE-접합된 항-EGFR 항체 No. 1의 삼중 돌연변이체에 대한 펩티드 맵에 대한 항체 단편 및 신뢰 점수의 목록은 표 VIII에 제시된다.
실시예 13: vcMMAE의 Fc 단일 돌연변이체 및/또는 삼중 돌연변이체 접합체의 세포독성
종양 세포주에 대해 vcMMAE와 접합된 Fc 단일 돌연변이체 또는 삼중 돌연변이체 항체의 세포독성 효과는 셀타이터-글로 검정 키트 (프로메가 cat#G7571)를 이용하여 측정하였다. 셀타이터-글로® 발광성 세포 생존력 검정은 대사적으로 활성인 세포의 존재를 나타내는 ATP 존재의 정량화를 기반으로 하여 배양물에서 생존가능한 세포의 개수를 결정하기 위한 동질의 방법이다. 간략히, 불투명한 벽을 갖는 다중-웰 플레이트에서 인간 종양 세포 (100 μl 세포 배양 배지 중 6000/웰의 인간 암 세포)를 Fc 단일 돌연변이체 또는 삼중 돌연변이체 항체 vcMMAE 접합체의 계열 희석액과 함께 37℃ (5% CO2, 가습된 분위기)에서 3 내지 4 일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 μl의 셀타이터-글로® 기질을 웰에 첨가하였다. 사이테이션1 (바이오텍) 플레이트 판독기를 이용하여 10 분 후에 발광을 기록하였다. % 생존은 하기 식에 따라 계산하였고: 생존 (%) = 100 x (실험적 RLU - 배지 단독 RLU)/(세포 단독 RLU - 배지 단독 RLU), 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 이용하여 비선형 회귀 로그(억제제) 대 반응 (3가지 파라미터) 곡선 대입에 의해 데이터를 분석하였다. 세포독성 검정에서 시험한 세포주는 검정에서 사용된 mAb의 각각의 표적에 대해 양성인 표면 발현을 갖는다. 구체적으로, HCC1954 세포주를 단일 돌연변이체 (L328C)를 갖는 항-HER2 mAb에 대해 시험하였다. 단일 또는 삼중 돌연변이체를 갖는 항-EGFR mAb의 경우, MDA MB468 세포주를 시험하였다. 단일 또는 삼중 돌연변이체를 갖는 항-TROP2 항체의 경우, SK BR3 세포주를 평가하였다.
도 56, 57, 58, 59, 60, 및 61의 결과는 단일 또는 삼중 Fc 돌연변이체를 갖는 항체의 시험관내 세포독성이 내재화 후 리소좀 카텝신 B에 의해 표적 세포 내에서 효율적이고 선택적인 약물 절단을 용이하게 하는 절단가능한 디펩티드 발린-시트룰린 (vc) 링커를 갖는 MMAE 유도체인 vcMMAE와의 그들의 접합에 의해 증강되었음을 나타낸다. 결과는 vcMMAE를 갖는 부위-특이적인 접합된 mAb가 용량-의존적인 방식으로 항원-양성 종양 세포주에 대해 강력하고 선택적인 세포독성 활성을 나타내었음을 추가로 나타내었다. 대조적으로, 단일 또는 삼중 돌연변이체를 갖는 접합되지 않은 mAb는 세포독성 효과를 실질적으로 적게 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않았다. 이와 함께, 이들 결과는 세포에 의한 결합 및 내재화시에 세포독성 약물의 방출을 가능하게 하는 세포독소에 부위-특이적인 방식으로 공유적으로 연결된 모노클로날 항체로 구성된 ADC의 시험관내 효능을 입증한다.
실시예 14: Her2, EGFR, TROP2, CDH3, 또는 다른 TAA 삼중 돌연변이체 MAb 및 부위-특이적인 접합된 ADC를 사용하여 인간 암종을 치료하기 위한 인간 임상 실험.
종양 세포에서 특이적으로 축적되고, 특정한 종양 및 다른 면역학적 장애 및/또는 다른 질환 (표 I 및 표 V 참고)의 치료에 사용되는 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC는 본 발명에 따라 합성된다. 각각의 이들 징후와 관련하여, 2가지 임상 접근법이 성공적으로 추진된다.
I.) 보조 요법: 보조 요법에서는, 환자를 화학요법제 또는 약제 또는 생물약제 또는 이들의 조합물과 조합하여 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC로 치료한다. 원발성 암 표적은 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC의 추가에 의해 표준 프로토콜하에 치료된다. 프로토콜 설계는 하기 실시예에 의해 평가되는 바와 같이 원발성 또는 전이성 병변의 종양 질량 감소, 증가된 무진행 생존, 전체 생존, 환자 건강 개선, 질환 안정화, 뿐만 아니라 표준 화학요법 및 다른 생물학적 작용제의 사용 용량을 감소시키는 능력을 비롯하여 이로 제한되지 않는 효과를 다룬다. 이들 용량 감소는 화학요법제 또는 생물학적 작용제의 용량-관련 독성을 감소시킴으로써 추가의 및/또는 연장된 요법을 가능하게 한다.
II.) 단독 요법: 종양의 단독 요법에서 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC의 사용과 관련하여, 환자에게 화학요법제 또는 약제 또는 생물학적 작용제가 없이 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC를 투여한다. 한 실시양태에서, 단독 요법은 광범위한 전이성 질환을 갖는 말기 암 환자에서 임상적으로 수행된다. 프로토콜 설계는 하기 실시예에 의해 평가되는 바와 같이 원발성 또는 전이성 병변의 종양 질량 감소, 증가된 무진행 생존, 전체 생존, 환자 건강 개선, 질환 안정화, 뿐만 아니라 표준 화학요법 및 다른 생물학적 작용제의 일반적인 용량을 감소시키는 능력을 비롯하여 이로 제한되지 않는 효과를 다룬다.
용량
용량 레지멘은 최적의 원하는 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC 주사가 투여될 수 있고, 몇몇 나뉘어진 용량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 또는 치료 상황의 긴급성에 따라 용량을 비례적으로 감소시키거나 또는 증가시킬 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "용량 단위 형태"는 치료할 포유동물 대상체에 대해 단일 용량으로 적합한 물리적으로 구별된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 제약용 담체와 함께 원하는 치료적 효과를 제공하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 용량 단위 형태에 대한 사양은 (a) Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC의 고유한 특징, 조사 메카니즘의 개별 역학 (반응기) 및 달성될 특정한 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서 민감성을 치료하기 위해 이러한 화합물을 배합하는 관련 기술분야에 내재된 한계에 의해 지시되고, 그에 직접적으로 의존한다.
임상 발달 계획 (CDP)
CDP는 본 개시내용의 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC를 사용하는 암(들) 및/또는 면역학적 장애 (표 I 및 표 V 참고)의 치료를 따르고 개발한다. 실험은 초기에는 안전성을 입증하고, 그 후에 반복 용량에서 효능을 확인한다. 실험은 표준 화학요법과 표준 요법 + Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC를 비교하는 개방 표지이다. 이해되는 바와 같이, 환자 등록과 관련되어 이용될 수 있는 비제한적인 1가지 기준은 관련 기술분야에 공지된 표준 검출 방법에 의해 결정되는 종양에서 Her2, EGFR, Trop2, CDH3, 또는 다른 TAA ADC의 농도이다.
본 발명은 본원에 개시된 실시양태에 의해 범위가 제한되지 않고, 이는 본 발명의 개별 측면의 단일 예시로 의도되고, 본 발명의 범위 내에서 기능적으로 등가이다. 본원에 기재된 것 외에도 본 발명의 모델, 방법, 및 생활사 방법에 대해 다양한 변형이 상기 설명 및 교시내용으로부터 관련 기술분야의 기술자에게 명백해질 것이고, 유사하게 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 이러한 변형 또는 다른 실시양태는 본 발명의 진정한 범위 및 개념을 벗어나지 않고 실시될 수 있다.
표 I. 치료할 암(들)의 목록
Figure pct00002
표 II. 아미노산 약어.
Figure pct00003
표 III. 아미노산 치환 매트릭스.
Figure pct00004
표 IV. 종양 관련 항원 (TAA).
Figure pct00005
표 V. 치료할 질환 (암이 아님)의 목록.
Figure pct00006
표 VI. 항체 서열
항-HER2 Ab 중쇄 야생형
Figure pct00007
항-HER2 Ab 중쇄 L328C
Figure pct00008
항-HER2 Ab 중쇄 L234A, L235A
Figure pct00009
항-HER2 Ab 중쇄 L234A, L235A, L328C
Figure pct00010
항-HER2 Ab 경쇄 야생형
Figure pct00011
항-EGFR Ab No. 1 중쇄 야생형
Figure pct00012
항-EGFR Ab No. 1 중쇄 L328C
Figure pct00013
항-EGFR Ab No. 1 중쇄 L234A, L235A
Figure pct00014
항-EGFR Ab No. 1 중쇄 L234A, L235A, L328C
Figure pct00015
항-EGFR Ab No. 1 경쇄 야생형
Figure pct00016
항-EGFR Ab No. 2 중쇄 야생형
Figure pct00017
항-EGFR Ab No. 2 중쇄 L328C
Figure pct00018
항-EGFR Ab No. 2 중쇄 L234A, L235A
Figure pct00019
항-EGFR Ab No. 2 중쇄 L234A, L235A, L328C
Figure pct00020
항-EGFR Ab No. 2 경쇄 야생형
Figure pct00021
항-EGFR Ab No. 3 중쇄 야생형
Figure pct00022
항-EGFR Ab No. 3 중쇄 L328C
Figure pct00023
항-EGFR Ab No. 3 중쇄 L234A, L235A
Figure pct00024
항-EGFR Ab No. 3 중쇄 L234A, L235A, L328C
Figure pct00025
항-EGFR Ab No. 3 경쇄 야생형
Figure pct00026
항-Trop2 Ab 중쇄 야생형
Figure pct00027
항-Trop2 Ab 중쇄 L328C
Figure pct00028
항-Trop2 Ab 중쇄 L234A, L235A
Figure pct00029
항-Trop2 Ab 중쇄 L234A, L235A, L328C
Figure pct00030
항-Trop2 Ab 경쇄 야생형
Figure pct00031
항-CDH3 Ab 중쇄 야생형
Figure pct00032
항-CDH3 Ab 중쇄 L328C
Figure pct00033
항-CDH3 Ab 중쇄 L234A, L235A
Figure pct00034
항-CDH3 Ab 중쇄 L234A, L235A, L328C
Figure pct00035
항-CDH3 Ab 경쇄 야생형
Figure pct00036
표 VII. 항-EGFR mAb No. 1의 단일 돌연변이체에 대해 생성된 펩티드 맵핑의 항체 단편 및 신뢰 점수.
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
표 VIII. 항-EGFR mAb No. 1의 삼중 돌연변이체에 대해 생성된 펩티드 맵핑의 항체 단편 및 신뢰 점수. "*"는 접합 부위를 갖는 펩티드를 나타냄을 주목한다.
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
SEQUENCE LISTING <110> TAE Life Sciences, LLC <120> Antibody Compositions Comprising Fc Mutations and Site-Specific Conjugation Properties for Use in Treating Cancer, Immunological Disorders, and Methods Thereof <130> 1221-20004.40 <140> Not Yet Assigned <141> 2020-10-02 <150> US 62/973,475 <151> 2019-10-04 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 2 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Cys Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 3 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 4 <211> 450 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val 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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Cys Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 25 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 26 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Arg Glu Gly Phe Ala Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 27 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Arg Glu Gly Phe Ala Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 225 230 235 240 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Cys Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 28 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Arg Glu Gly Phe Ala Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 225 230 235 240 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 29 <211> 453 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Gln 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Leu Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Gly Tyr Gly Arg Glu Gly Phe Ala Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 225 230 235 240 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Cys Pro Ala 325 330 335 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 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Leu Ser Trp Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (32)

  1. 삼중 돌연변이를 포함하는 항체 조성물이며, 여기서 삼중 돌연변이는 L234A 변형, L235A 변형, 및 L328C 변형을 포함하고, 상기 삼중 돌연변이는 Fcγ 수용체 결합 및 항체 이펙터 기능을 변형시키는 것인 항체 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 EGFR 항체를 포함하는 것인 항체.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 Her2 항체를 포함하는 것인 항체.
  4. 제1항에 있어서, 항체가 Trop2 항체를 포함하는 것인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 항체가 CDH3 항체를 포함하는 것인 항체.
  6. 제1항에 있어서, 항체가 종양 관련 항원 (TAA) 항체를 포함하는 것인 항체.
  7. 제6항에 있어서, TAA가 표 IV에 제시된 것인 항체.
  8. 하기를 포함하는 항체-약물-접합체 (ADC):
    (i) 삼중 돌연변이를 포함하는 항체 조성물, 여기서 삼중 돌연변이는 L234A 변형, L235A 변형, 및 L328C 변형을 포함하고, 상기 삼중 돌연변이는 항체 이펙터 기능을 변형시킴;
    (ii) 링커; 및
    (iii) 약물 단위, 여기서 상기 약물 단위는 부위 L328C에서 특이적으로 접합됨.
    [청구항 8]
    제8항에 있어서, 항체 조성물이 EGFR 항체를 포함하는 것인 ADC.
  9. 제8항에 있어서, 항체 조성물이 Her2 항체를 포함하는 것인 ADC.
  10. 제8항에 있어서, 항체 조성물이 Trop2 항체를 포함하는 것인 ADC.
  11. 제8항에 있어서, 항체가 CDH3 항체를 포함하는 것인 항체.
  12. 제8항에 있어서, 항체 조성물이 종양 관련 항원 (TAA) 항체를 포함하는 것인 ADC.
  13. 제12항에 있어서, TAA가 표 IV에 제시된 것인 항체.
  14. 제8항에 있어서, 스트레처 단위를 추가로 포함하는 ADC.
  15. 제8항에 있어서, 스페이서 단위를 추가로 포함하는 ADC.
  16. 제8항에 있어서, 아미노산 단위를 추가로 포함하는 ADC.
  17. 제1항의 항체를 포함하는 제조 물품.
  18. 제8항의 ADC를 포함하는 제조 물품.
  19. 치료 유효량의 제8항의 ADC, 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  20. 치료 유효량의 제1항의 항체, 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  21. 하기를 포함하는 항체-붕소-접합체 (ABC):
    (i) 삼중 돌연변이를 포함하는 항체 조성물, 여기서 삼중 돌연변이는 L234A 변형, L235A 변형, 및 L328C 변형을 포함하고, 상기 삼중 돌연변이는 항체 이펙터 기능을 변형시킴;
    (ii) 링커; 및
    (iii) 약물 단위, 여기서 상기 약물 단위는 보릴화된 조성물을 포함하고, 상기 약물 단위는 부위 L328C에서 특이적으로 접합됨.
  22. 제21항에 있어서, 항체 조성물이 EGFR 항체를 포함하는 것인 ABC.
  23. 제21항에 있어서, 항체 조성물이 Her2 항체를 포함하는 것인 ABC.
  24. 제21항에 있어서, 항체 조성물이 Trop2 항체를 포함하는 것인 ABC.
  25. 제21항에 있어서, 항체 조성물이 CDH3 항체를 포함하는 것인 ABC.
  26. 제21항에 있어서, 항체 조성물이 종양 관련 항원 (TAA) 항체를 포함하는 것인 ABC.
  27. 제26항에 있어서, TAA가 표 IV에 제시된 것인 항체.
  28. 제21항에 있어서, 스트레처 단위를 추가로 포함하는 ABC.
  29. 제21항에 있어서, 스페이서 단위를 추가로 포함하는 ABC.
  30. 제21항에 있어서, 아미노산 단위를 추가로 포함하는 ABC.
  31. 치료 유효량의 제21항의 ABC, 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  32. (i) 개체에게 치료 유효량의 제21항의 ABC를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암을 치료하는 방법이며, 여기서 암은 표 I에 제시된 암을 발현하는 세포를 포함하는 것인 방법.
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Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4880935A (en) 1986-07-11 1989-11-14 Icrf (Patents) Limited Heterobifunctional linking agents derived from N-succinimido-dithio-alpha methyl-methylene-benzoates
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
FI102355B1 (fi) 1988-02-11 1998-11-30 Bristol Myers Squibb Co Menetelmä yhdistävän välikappaleen omaavien antrasykliini-immunokonjugaattien valmistamiseksi
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US6657103B1 (en) 1990-01-12 2003-12-02 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69233528T2 (de) 1991-11-25 2006-03-16 Enzon, Inc. Verfahren zur Herstellung von multivalenten antigenbindenden Proteinen
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
CA2118508A1 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
JP3095175B2 (ja) 1992-11-13 2000-10-03 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション Ｂ細胞リンパ腫の治療のためのヒトｂリンパ球限定分化抗原に対するキメラ抗体と放射能標識抗体の療法利用
US5885573A (en) 1993-06-01 1999-03-23 Arch Development Corporation Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
DK0871490T3 (da) 1995-12-22 2003-07-07 Bristol Myers Squibb Co Forgrenede hydrazonlinkere
ES2290964T3 (es) 1996-10-15 2008-02-16 The Regents Of The University Of California Modelos animales de la evolucion del cancer de prostata humano.
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2290485C (en) 1997-05-21 2008-08-05 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
DE60131456T2 (de) 2000-11-30 2008-07-10 Medarex, Inc., Milpitas Transchromosomale transgen-nagetiere zur herstellung von humanen antikörpern
ES2369542T3 (es) 2002-07-31 2011-12-01 Seattle Genetics, Inc. Conjugados de auristatina y su uso para tratar cáncer, una enfermedad autoinmune o una enfermedad infecciosa.
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
EP2364996B1 (en) 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
US20090010920A1 (en) * 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
ES2697327T3 (es) 2003-11-06 2019-01-23 Seattle Genetics Inc Compuesto intermedio para la preparación de conjugados que comprenden derivados de auristatina y un enlazador
CA2560919A1 (en) 2004-03-26 2005-10-06 Pfizer Products Inc. Uses of anti-ctla-4 antibodies
RU2402548C2 (ru) 2004-05-19 2010-10-27 Медарекс, Инк. Химические линкеры и их конъюгаты
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
JP4948413B2 (ja) 2004-09-23 2012-06-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド システイン操作抗体および結合体
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
US9200079B2 (en) 2004-11-12 2015-12-01 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US20060275282A1 (en) 2005-01-12 2006-12-07 Xencor, Inc. Antibodies and Fc fusion proteins with altered immunogenicity
EP2250279B1 (en) 2008-02-08 2016-04-13 MedImmune, LLC Anti-ifnar1 antibodies with reduced fc ligand affinity
SG192945A1 (en) * 2011-02-25 2013-09-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcgriib-specific fc antibody
AU2012234335B2 (en) 2011-03-29 2016-09-01 Roche Glycart Ag Antibody Fc variants
CA2834589A1 (en) * 2011-05-25 2012-11-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Method for preparing fc-containing polypeptides having improved properties
CA2837586C (en) 2011-05-27 2018-12-11 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acid linked dolastatin derivatives
WO2014030750A1 (ja) * 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 マウスFcγRII特異的Fc抗体
SI2953976T1 (sl) 2013-02-08 2021-08-31 Novartis Ag Specifična mesta z modificiranje protiteles za izdelavo imunokonjugatov
WO2015177360A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Site-specific conjugation of linker drugs to antibodies and resulting adcs
FI20160191A (fi) 2016-07-29 2018-01-30 Matti Leo Antero Kokkonen Polkupyörän ja muiden ajoneuvojen renkaan puhkeamisen suoja
BR112019011988A2 (pt) * 2016-12-13 2019-11-05 Astellas Pharma Inc anticorpo anti-cd73 humana
EP3692060A1 (en) * 2017-10-03 2020-08-12 Merck Patent GmbH Cysteine engineered antigen-binding molecules
WO2019079357A1 (en) * 2017-10-17 2019-04-25 Silverback Therapeutics, Inc. TNIK MODULATORS, CONJUGATES AND USES THEREOF

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