CN1243021C - 白细胞介素－18结合蛋白质及其制备和用途 - Google Patents

Abstract

提供了能够结合IL-18和/或调节和/或封闭IL-18的活性的白细胞介素-18结合蛋白质。也提供了它们分离和重组产生的方法，编码它们的DNA，表达它们的DNA载体，用于在人和其它哺乳动物中表达它们的载体，抗它们的抗体。

Description

白细胞介素-18结合蛋白质及其制备和用途

发明领域

本发明涉及能够结合IL-18的白细胞介素-18(IL-18)结合蛋白质，以下简称IL-18BP。这一发明涉及从体液中获得的可溶性IL-18BP，涉及宿主细胞中通过适当的DNA载体表达得到的可溶性IL-18BP，涉及宿主细胞中通过适当DNA载体表达可得的IL-18BP的病毒编码的同系物，涉及用于在人和其它哺乳动物中表达IL-18BP的载体，涉及抗IL-18BP的抗体，涉及所述的IL-18BP通过调节和/或封闭IL-18活性的治疗用途，涉及所述的表达载体在调节和/或封闭IL-18活性中的治疗用途和涉及抗体的用途。

发明背景

在1989年，公开了从小鼠脾细胞中获得的诱导干扰素γ(IFN-γ)的外毒素诱导的血清活性(27)。这一血清活性的功能不是IFN-γ的直接诱导物而是与IL-2或促分裂原一起的共同刺激物。从外毒素处理后的对小鼠的血清活性的纯化尝试表明显然同源的50～55千道尔顿(kDa)蛋白质(26)。因为其它细胞因子可以作为IFN-γ产生的共刺激物，IL-1，IL-4，IL-5，IL-6或TNF的中和抗体中及血清活性的失败表明它是不同的因子。在1995年，同样这些科学家证明IFN-γ产生的外毒素诱导的共刺激物存在于利用P.acnes(31)预处理的小鼠的肝提取物。在这一实例中，肝巨嗜细胞群体(Kupffer细胞)扩展并且在这些小鼠中，在非预处理小鼠中非致命的低剂量细菌脂多糖(LPS)变成致命的。从1,200克P.acnes处理的小鼠肝将命名为IFN-γ-诱导的因子(IGIF)和后来命名为白细胞介素-18(IL-18)纯化成匀浆物。利用起源于纯化的IL-18的氨基酸序列的简并寡核苷酸克隆小鼠IL-18cDNA(31)。IL-18是157个氨基酸的18～19千道尔顿蛋白质，它与数据库中的任何肽没有明显的相似性。在Kupffer细胞和活化的巨嗜细胞中是容易检测到IL-18和白细胞介素-12(IL-12)的信使RNA。重组IL-18显然通过独立的途径比IL-12更具潜力地诱导IFN-γ(31)。与外毒素诱导的血清活性相似，IL-18本身不诱导IFN-γ，但初级功能是与促分裂原或IL-2一起作为共刺激物。IL-18显然通过IL-2独立途径增强T细胞增殖，并且增强Th1细胞因子的体外产生并且当将IL-12与增强的IFN-γ产生结合时显示了协同作用(24)。

小鼠IL-18的中和抗体显示了能够在P.acnes预处理的小鼠中预防低剂量LPS的致死。在预处理的小鼠中其它人已经报道了IFN-γ作为LPS致死的介导物的重要性。例如，中和抗IFN-γ抗体保护小鼠不会Shwartzman状休克(16)，并且IFN-γ受体缺陷的半乳糖胺处理的小鼠是抗LPS诱导的死亡的(7)。所以，不能预期小鼠IL-18的中和抗体保护P.acnes预处理小鼠抵抗致死LPS(31)。抗小鼠IL-18处理也保护生存的小鼠抵抗严重的肝细胞毒性。

在克隆小鼠形成后，在1996年报道了IL-18的人cDNA序列(38)。重组的人IL-18显示了天然的IL-18活性(38)。人重组IL-18在人T细胞上没有直接的IFN-γ诱导活性，但作用是生产IFN-γ和其它T辅助细胞-1(Th1)细胞因子的共刺激物(38)。到目前为止，认为IL-18可初步作为Th1细胞因子产生(IFN-γ，IL-2和粒细胞巨嗜细胞菌落刺激因子)的共刺激物(20)，并且也作为小鼠天然杀死细胞克隆的FAS配体介导的细胞毒性的共刺激物(37)。

通过克隆来自受感染组织的IL-18和研究IL-18基因表达，发现了这一细胞因子与自身免疫疾病紧密相关。非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠自发发展了自身免疫胰岛炎和糖尿病，这两种病在单独注射了环磷酰胺时得到加速和同步。在早期胰岛炎过程中，在NOD小鼠胰腺中通过逆转录酶PCR证明了IL-18mRNA。在环磷酰胺处理后快速增加了IL-18mRNA的水平并且在此之前，IFN-γmRNA升高了，随后发展成糖尿病。有趣的是，这些动力学模仿了导致与单个mRNA水平紧密联系的IL-12-p40mRNA。在测序之后从胰腺RNA克隆IL-18cDNA表明从Kupffer细胞克隆的IL-18序列和体内预活化巨嗜细胞的同一性。当没有平行处理来自Balb/c的巨嗜细胞，同样NOD小鼠巨嗜细胞通过IL-18基因表达应答环磷酰胺。所以，在自身免疫NOD小鼠中IL-18表达非正常地调节，并且与糖尿病发展紧密相关(32)。

通过增大Th1细胞上Fas配体的功能活性，IL-18在免疫调节或炎症中起潜在作用。在肾上腺皮层中也表达了IL-18，所以可以是分泌的神经免疫调节物，在压力实验之后orchestrating免疫系统中起重要作用(9)。

在体内，通过裂解pro-IL-18形成了IL-18，它的内源活性似乎是依赖于P.acnes中的IFN-γ的产生和由LPS介导的致死。因为它的活性，在人疾病中封闭IL-18的生物学活性是许多疾病的治疗方案。利用可溶性受体或封闭细胞结合IL-18受体的抗体可以达到这一目的。

细胞因子结合蛋白质(可溶性细胞因子受体)对应于它们各自的细胞表面细胞因子受体的细胞外配体结合区。与细胞表面受体相同，通过前mRNA的可替代拼接或通过细胞表面受体的蛋白水解的裂解可以派生它们。这样的可溶性受体在过去已经叙述过，包括其它的可溶性IL-6受体和IFN-γ(30)，TNF(11，12)，IL-1和IL-4(21)，IFN-α/β(28，29)和其它。命名为骨原素(OPG，已知是破骨细胞抑制因子-OCIF)的一个细胞因子结合蛋白质，TNFR/Fas家族的成员似乎是只作为分泌蛋白质存在的可溶性受体的第一个例子(1，34，39)。

发明概要

本发明提供了IL-18结合蛋白质(IL-18BP)和病毒编码的IL-18BP同系物(以下简称病毒IL-18BP)，和融合蛋白质，突变蛋白，功能衍生物，活性片断和其循环的完全变化的衍生物，这些物质能够结合IL-18。本发明也提供了从人体液分离IL-18BP的方法，通过重组手段获得它们的方法。本发明还提供了适于在人和其它哺乳动物中表达IL-18BP的IL-18BP的表达载体。本发明的特定的IL-18BP，病毒编码的IL-18BP同系物，融合蛋白质，突变蛋白，功能衍生物，活性片断和循环变化的衍生物可用于调节和/或封闭IL-18的生物活性。

同时提供了含有适于在宿主细胞中表达各种IL-18BP的DNA的可复制表达载体，本发明转化的宿主细胞和这样的宿主表达产生的蛋白质和多肽。

本发明进一步提供了含有适当载体和IL-18BP或病毒IL-18BP或在人和其它哺乳动物中表达它们的载体的药物组合物，用于治疗需要调节或封闭IL-18活性的疾病或症状。

本发明进一步提供适于亲和纯化和免疫测试它们的IL-18BP和病毒IL-18BP的抗体。

附图的说明

图1显示了配体亲和纯化IL-18结合蛋白质的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)。将粗尿蛋白质(通过超滤500升正常人尿浓缩)加载到IL-18琼脂糖柱上。洗涤，在pH2.2洗脱结合的蛋白质。中和洗脱的部分，通过在非还原条件下进行SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分析，并且银染。这些道是：1：粗尿蛋白质(1.5微克，加载到凝胶上)；2～9：分别来自IL-18琼脂糖柱的洗脱物1～8；10：分子量标记，千道尔顿，正如右边的表明。箭头表明对应于IL-18BP的带。

图2显示了含有¹²⁵I-IL-18(表观分子量19千道尔顿)的复合物的SDS-PAGE(7.5％丙烯酰胺)的放射自显影，这些复合物与可溶性的IL-18结合蛋白质的制剂交联：道1：IL-18亲和柱的洗涤物。道2：IL-18亲和柱的洗脱物2。道3：IL-18亲和柱的洗脱物3。分子量标记表明在右边(千道尔顿)。箭头表示交联产物(58千道尔顿)。

图3A～图3E显示了IL-18BP抑制IL-18诱导的IFN-γ的产生。

图3A在直接加入，或在与尿IL-18BP预混合(1小时，37℃)后，利用标明的LPS(1微克/毫升)和人IL-18(5纳克/毫升)刺激(24小时，37℃)小鼠脾细胞。在24小时后确定培养物中muIFN-γ的水平。

图3B将小鼠脾细胞与LPS(1微克/毫升)以及与浓度增加的人IL-18BP预混合(1小时，37℃)的小鼠IL-18(10纳克/毫升)温育24小时。

图3C将小鼠脾细胞与LPS(10微克/毫升)以及浓度增加的人IL-18BP一起温育(24小时)。

图3D将小鼠脾细胞与Con A(1微克/毫升)以及浓度增加的人IL-18BP一起温育(24小时)。

图3E利用单独加入或在与尿IL-18BP预混合(1小时，37℃)后的TNF-α(20纳克/毫升)和huIL-18(25纳克/毫升)刺激人KG-1细胞。

图4和图4A显示了人IL-18BPa cDNA和蛋白质的序列，信号肽下面已划线。

图5和图5A显示了人IL-18BPb cDNA和蛋白质的序列，信号肽下面已划线。

图6，图6A～图6E显示了人IL-18BPc cDNA和蛋白质的序列。信号肽下面已划线。

图7和图7A显示了人IL-18BPd cDNA和蛋白质的序列。信号肽下面已划线。

图8，图8A～图8F显示了人IL-18BP基因的序列。确定了人基因组克隆(7.1kb)的序列并且与从3个cDNA文库分离的各种cDNA克隆比较。共同的翻译起始密码子是核苷酸683～685。将NuMA1基因定位于负链，从核苷酸3578到末端。

图9A～图9D显示了重组IL-18BP对人和小鼠IL-18活性的影响。

在COS7细胞中短暂表达了His₆-标记的IL-18BPa，并且纯化。

图9A将人IL-18(5纳克/毫升)与His₆-标记-IL-18BPa或RPMI预混合，并且与LPS(1微克/毫升)一起加入小鼠脾细胞。在24小时后测量IFN-γ产生。

图9B将小鼠IL-18(10纳克/毫升)与His₆-标记-IL-18BPa或RPMI预混合，并且与LPS(1微克/毫升)一起加入小鼠脾细胞。在24小时后测量IFN-γ产生。

图9C将人IL-18(25纳克/毫升)与COS7-IL-18BPa或RPMI一起预混合，并且加入存在IL-12(10纳克/毫升)的人PBMC。

图9D将人IL-18(25纳克/毫升)与COS7-IL-18BPa或RPMI预混合，并且在存在TNF-α(20纳克/毫升)时加入人KG-1细胞。

本发明的详细说明

本发明涉及结合IL-18的各种IL-18BP和病毒IL-18BP。这样的IL-18BP能够调节和/或封闭IL-18的生物活性。术语“IL-18BP和病毒IL-18BP”包括成熟蛋白质(没有信号序列)，含有信号序列的蛋白质，IL-18BP的突变蛋白和病毒IL-18BP，IL-18BP的衍生物和病毒IL-18BP和IL-18BP的截短形式和病毒IL-18BP及其盐。

本发明进一步涉及适于在宿主细胞和宿主细菌中表达各种IL-18BP或病毒IL-18BP的可复制表达载体。本发明进一步涉及适于在人和其它哺乳动物中表达各种IL-18BP或病毒IL-18BP的表达载体。

本发明进一步涉及编码各种IL-18BP，病毒IL-18BP，突变蛋白，融合蛋白质，功能衍生物，活性部分及其混合物的DNA。所述的DNA可以是基因组DNA，cDNA合成DNA，PCR产物或其联合。根据本发明这些DNA可以插入可复制的表达载体用于在宿主细胞中表达各种IL-18BP和病毒IL-18BP。在本发明中同时包括了在严格条件下与上面的DNA杂交的和编码的蛋白质或多肽的DNA。

一个这样的DNA编码包括SEQ ID NO：10的氨基酸序列并且在它3’末端提供终止密码子的IL-18BP。

适于在人和其它哺乳动物中表达各种IL-18BP或病毒IL-18BP用于基因治疗的表达载体可以是以在人或其它哺乳动物中能够有效表达IL-18BP或病毒IL-18BP的方式插入编码病毒IL-18BP的IL-18BP基因或IL-18BP cDNA或DNA的病毒载体或其它类型的载体。本发明也包括了在严格条件下与上面的DNA杂交和编码能够结合IL-18的蛋白质或多肽的DNA分子。

根据本发明，例如通过人体液，如尿或血清，通过IL-18偶联的层析柱，并且然后洗脱结合的IL-18BP可以进行IL-18BP的分离。

通过重组手段，即，在适当宿主中，允许正确方向表达，适于特别宿主利用的可操作连接的启动子，表达增强子，调节序列等的IL-18BP表达可以制备各种IL-18BP和病毒IL-18BP。

在治疗和减轻IL-18参与或过量外源给药或外源产生的IL-18引起的疾病中可以利用在人和其它哺乳动物中表达IL-18BP的各种IL-18BP和病毒IL-18BP和载体。这样的病症可以是自身免疫疾病，I型糖尿病，类风湿关节炎，移植排斥，肠炎疾病，脓毒，多发性硬化，局部缺血性心脏病(包括心脏病发作)，局部缺血性脑损伤，慢性肝炎，牛皮癣，慢性胰腺炎，急性胰腺炎等。

根据本发明，通过一个层析步骤从正常人尿分离IL-18BP。将从500升正常人尿浓缩的粗人尿蛋白质制剂加载到含有结合琼脂糖的人IL-18的柱。洗涤，在低pH洗脱结合的蛋白质。中和洗脱的部分，在非还原条件下通过SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分析等分试样和银染。在洗脱部分特异地获得了约40千道尔顿的蛋白质带(图1)。

如IL-18结合蛋白质，通过它与¹²⁵I-IL-18特异地交联的能力鉴定在第一步中获得的约40千道尔顿蛋白质(图2)。通过N末端蛋白质序列分析进一步鉴定了约40千道尔顿蛋白质。将来自洗脱蛋白质的等分试样进行SDS-PAGE，电印到PVDF膜上，进行蛋白质微序列分析。同样，将来自洗脱蛋白质的等分试样进行直接的蛋白质微序列分析。在两种情况中，获得了两个多肽序列。大序列和小序列，后者对应于人防卫素(登记号p11398)的片断，在氨基酸65开始。减去已知的防卫素序列提供了下面的序列：

T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A

1 ···5····10 ··

其中x代表仍未确定的氨基酸。

为了获得更长或更准确的序列，和为了鉴定潜在的半胱氨酸残基，在变性条件下利用DTT还原洗脱部分的等分试样，与4-乙烯吡啶反应，通过微超滤装置脱盐(Ultrafree，截止分子量10,000Da，Millipore)并且进行蛋白质微序列分析。在序列循环1号后，将残留的蛋白质与邻苯二醛反应以便封闭所有N末端多肽而不是Pro并且然后恢复测序。在这一方法中，获得了下面的单个蛋白质序列：

TPVSQXXXAA XASVRSTKDP  CPSQPPVFPA  AKQCPALEVT

1       10         20          30          40

(T＝Thr；P＝Pro；V＝Val；S＝Ser；Q＝Gln；X＝未知；A＝Ala；R＝Arg；K＝Lys；D＝Asp；C＝Cys；F＝Phe；L＝Leu；E＝Glu)

正如研究蛋白质数据库确定的，得到的序列明显不同于任何其它已知蛋白质。但是，通过tblastn研究程序基因组研究所(TIGR)(HTTP：//www.ncbi.nlm.nih.gov)的数据库研究提供了指示为THC123801的cDNA文档，当翻译时，它的开放读码框架(218个密码子)含有与IL-18BP的N末端序列高度同源的序列。

下面显示了同源性：

1.......TPVSQXXXAAXASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVT... 40

            | | |   ||||||||||||||||||||||||||||||||

  51 VTLLVRATXVXQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPE 100

[上面的序列(1～40)是本发明分离的IL-18BP；下面的序列(51～100)是TIGR文档THC123801的cDNA翻译推断的]。

但是，鉴定为THC123801的cDNA序列仅仅是EST(表达序列标记)，即随机选择的cDNA克隆。还从来没有分析这一EST是否含有开放读码框架，蛋白质是否从对应于EST的基因表达或从EST本身表达，甚至也没有鉴定的THC123801编码的蛋白质的任何功能。完全没有得到THC123801含有编码IL-18BP的开放读码框架的信息。

形成了保留结合它的标记配体(¹²⁵I-IL-18)，接着共价交联分子量为58千道尔顿的复合物的能力的亲和纯化尿IL-18BP。这一复合物的分子量对应于1∶1的约40千道尔顿IL-18BP和19千道尔顿的IL-18(图2)。

亲和纯化的尿IL-18BP封闭了人以及小鼠IL-18的生物活性。所以，当在人或小鼠IL-18中加入IL-18BP时，它封闭了IL-18当与脂多糖(LPS)一起加入培养小鼠脾细胞时诱导干扰素γ的生产的能力(图3)。

为了本发明叙述的目的，表达“IL-18的生物活性”特别指至少下面的生物特性的一个：

(i)在各种细胞类型如单核细胞，小鼠脾细胞，人周边血液单核细胞，人KG-1细胞系和T细胞中诱导初步作为与促分裂原，IL-1，IL-12，TNF-α，LPS的共刺激物的IFN-γ，

(ii)增强T细胞的增殖，

(iii)增强初步作为共刺激物体外Th-1细胞因子的产生，

(iv)IL-12与增强IFN-γ产生的协同作用，IFN-γ和其它T辅助细胞-1细胞因子的产生的共刺激作用，

(v)小鼠天然杀死细胞系的FAS配体介导的细胞毒性的共刺激作用，

(vi)在人KG-1细胞中，可能通过诱导50NF-κB同型二聚体和p65/p50NF-κB异型二聚体的形成，诱导NF-κB的活化，

(vii)诱导IL-8。

正如本发明所用，“结合IL-18”的表达指当如本发明实施例2亲和纯化时，正如它结合标记的IL-18表明的，IL-18BP结合IL-18的能力。

正如本发明所用，“调节IL-18的活性”的表达指IL-18BP调节任何IL-18活性而不是封闭的能力，如部分抑制，增强或诸如此类。

正如本发明所用，“封闭IL-18的活性”的表达指IL-18BP封闭至少上面举出的IL-18的生物活性的至少一个的活性。IL-18BP封闭小鼠脾细胞中与IFN-γ的表达相关的IL-18的能力是IL-18封闭IL-18BP的活性的例子。正如下面将详细显示的，调节或封闭IL-18BP的活性部分是由于IL-18BP通过IL-18抑制NF-κB的活性的事实。另外，IL-18BP至少封闭一个下面的IL-18的活性，即在人和小鼠细胞中IFN-γ的诱导，IL-8的诱导和NF-κB的活化。

通过利用特定的有意义和反义引物，和来自人Jurkat T细胞的RNA以及来自TIGR序列的引物的逆转录PCR制备筛选cDNA文库的DNA探针。通过DNA序列分析证实了得到的PCR产物。利用32[P]标记PCR产物，并且用作筛选起源于周边血液单核细胞，Jurkat T细胞系，PBMC和人脾脏的四个人cDNA文库的探针。各种独立的cDNA克隆对应于四个IL-18BP拼接突变体(SEQ ID NO：1，3，5和7)。所有拼接突变体编码推定的可溶性分泌蛋白质。大多数富余的一个(IL-18BPa)具有编码信号肽的192个密码子的开放读码框架，本发明有时称为28个氨基酸残基的“引导序列”，接着成熟的推断的IL-18BPa，该结合蛋白质的开始40个残基完美地匹配了尿IL-18BP的N末端蛋白质序列(SEQ ID NO：2)。半胱氨酸残基的位置表明了这一多肽属于免疫球蛋白(Ig)超家族。有趣的是，在成熟IL-18BPa内的四个Gln残基的每个都是一个潜在的N糖基化位点。三个其它的IL-18BP突变体没有IL-18BPa丰富。它们包括编码接着85个氨基酸残基的成熟蛋白质的28个氨基酸残基的信号肽的更短的1kb IL-18BPb cDNA(SEQ ID NO：4)。编码接着169个氨基酸残基的成熟IL-18BP的28个氨基酸残基的信号肽的2.3kbcDNA表示的是第三个突变体，IL-18BPc(SEQ ID NO：6)。第四个IL-18BPd，是编码接着133个氨基酸残基的成熟IL-18BP的28个氨基酸残基的信号肽(SEQ ID NO：8)。

为了进一步研究可能存在另外的IL-18BP拼接突变体，利用对应于全长IL-18BP cDNA的探针筛选人基因组文库。在这一文库中鉴定了在长度上有区别的5个基因组克隆。就这些克隆利用外部和内部引物进行DNA序列分析。同时，从这些克隆组装了7.8kb序列(SEQ ID NO：9)。在7.8kb序列内没有鉴定跨膜(TM)受体的外显子编码。所有突变体共享共同的翻译起始位点，编码相同的28个氨基酸残基的信号肽和大小变化的可溶性成熟蛋白质和C末端序列。IL-18BP基因座含有编码定位于负链的核有丝分裂器蛋白质1(NUMA1)的其它基因。这一发现将IL-18BP基因定位于人染色体11q13(36)。

利用IL-18BPa的完整蛋白质序列和GenPept数据库(HTTP：//www.ncbi.nlm.nih.gov)进行同源性研究，其中利用了Smith Watermann算法。发现在几个痘病毒中作为前面未知功能的分泌蛋白质表达的IL-18BP同系物。前面已经报道这些病毒编码各种细胞因子受体，并且这样的病毒编码的分子的作用是通过中和其相应的细胞因子抑制免疫应答的引诱受体(Spriggs，MK，1994，当前免疫学评论，6：526～529)。所以，本发明另外涉及了可以作为IL-18的生物活性封闭物或调节物的病毒编码的IL-18BP的同系物。表1提供了病毒编码的IL-18BP的同系物的实施例。

根据本发明，在原核生物或真核生物宿主中可以表达病毒编码的IL-18BP的同系物。正如本发明所用，“病毒编码的IL-18BP同系物”的表达指至少70％的氨基酸残基的序列中至少有50％的相似性。更优选地，在100个氨基酸残基的序列中它具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或最优选地至少90％的相似性。

表1病毒编码的蛋白质显示了与人IL-18BP高度同源

GenPept序列	病毒类型
		MCU60315_54MCU60315_53SWPHLSB_12CV41KBPL_14VVCGAA_5U01161_3 174VVU18340_6VVU18338_7VVU18337_7VARCG_ 7 173MCU60315_51HNABV_1	U60315触染性软疣病毒亚型1U60315触染性软疣病毒亚型1L22013天鹅痘病毒母牛痘病毒天花病毒缺肢病毒(小鼠痘病毒)天花病毒天花病毒天花病毒天花主要病毒触染性软疣病毒新型肝炎非A，非B相关病毒

在猴COS7细胞中表达了IL-18BPa。为了这一目的，在哺乳动物表达载体pEF-BOS中插入了IL-18BPa的cDNA。为了简化重组蛋白质的纯化，在框架内的IL-18BP ORF的3’末端加入编码(His)₆序列的盒子。利用表达载体短暂转染COS7细胞，并且通过金属螯合层析浓缩和纯化这些细胞的无血清培养基(150毫升)。在还原和非还原条件下在银染的SDS-PAGE上IL-18BPa作为单一的带，并且具有与尿IL-18BP相同的表观分子量。这一制剂的蛋白质序列分析表明与尿IL-18BP相同的N末端序列。利用抗尿IL-18BP的抗体免疫影印分析IL-18BPa表明与尿蛋白质相同的分子量带。另外，利用免疫沉淀接着利用SDS-PAGE和放射自显影，IL-18BPa能够取代¹²⁵I-IL-18BP，与抗体结合。所以，IL-18BPa结构上对应于从尿中分离的IL-18BP。

测试粗和纯化的IL-18BPa的抑制IL-18的生物活性的能力。在小鼠脾细胞，PBMC和人KG-1细胞系中IL-18BPa抑制人和小鼠IL-18的活性(图9)。这些结果证实了作为编码生物活性IL-18BP的IL-18BPa cDNA的特征。

本发明还涉及突变蛋白质和IL-18BP的片断，和病毒IL-18BP，涉及含有与其它多肽或蛋白质融合的野生型IL-18BP的融合蛋白质和病毒IL-18BP或它们的突变蛋白或它们的片断并且能够结合IL-18或它的同系物的融合蛋白质。

正如本发明所用，术语“突变蛋白”指其中不同的氨基酸残基替代了天然IL-18BP或病毒IL-18BP的一个或多个氨基酸残基，或缺失一个或多个氨基酸残基，或在IL-18BP，或病毒IL-18BP的天然序列中加入一个或多个氨基酸残基，而与野生型IL-18BP或病毒IL-18BP相比，在得到的产物结合IL-18的能力的IL-18BP的类似物或病毒IL-18BP的类似物上没有相当大地改变。通过已知的合成和/或定位诱变技术，或任何适当的已知技术可以制备这些突变蛋白。

任何这样的突变蛋白质优选地具有足够复制IL-18BP或足够复制病毒IL-18BP的氨基酸序列，以致具有与IL-18BP基本相似的活性。IL-18BP的一个活性是它结合IL-18的能力。只要突变蛋白具有IL-18的基本结合活性，它就可以用于例如通过亲和层析对IL-18进行纯化，所以可以认为基本具有IL-18BP的相似的活性。所以，通过常规实验手段包括将这样的突变蛋白例如进行简单的三明治竞争测试确定是否任何给定的突变蛋白基本具有与IL-18BP相同的活性，以便如放射性免疫测试或ELISA测试确定它是否结合适当标记的IL-18。

在优选的实施例中，任何这样的突变蛋白与IL-18BP或病毒编码的IL-18BP同系物的序列至少具有40％的同一性或同源性。更优选地，它具有至少50％，至少60％，至少70％，至少80％或最优选地至少90％的同一性或同源性。

根据本发明可以利用的IL-18BP多肽的突变蛋白或病毒IL-18BP的突变蛋白，或编码它们的核酸包括没有根据本发明表示的指导和说明进行实验，通过本领域的普通技术人员常规获得的基本对应于替代肽或多肽的有限套序列。对于蛋白质化学和结构的详细说明，参见Schulz，G.E.等人，蛋白质结构的原理，Springer-Verlag，组约，1978；Creighton，T.E.，蛋白质：结构和分子特性，W.H.Freeman和Co，旧金山，1983，将它引入本发明作为参考。对于核苷酸序列替代的表示如密码子优先，参见Ausubel等人，出处同上，在A.1.1～A.1.24，和Sambrook等人，出处同上，在附录C和D中。

本发明的优选的突变蛋白的变化是已知为“保守”的替代。保守的IL-18BP多肽或蛋白质或病毒IL-18BP的氨基酸替代可以在具有足够相似的物理化学特性的基团内包括同义氨基酸，以致基团的成员之间的替代将保留分子的生物学功能，Grantham，科学，185卷，862～864(1974)。清楚的是在上面确定的序列中没有改变它们的功能，特别是如果插入或缺失仅仅包括几个氨基酸，例如30个以下，和优选地10个以下，并且没有除去或替代功能构型的关键氨基酸，例如，半胱氨酸残基，可以进行氨基酸的插入和缺失，Anfinsen，“控制蛋白质链的折叠的原理”，科学，181卷，223～230(1973)。在本发明的范围内出现了这样的缺失和/或插入产生的蛋白质和突变蛋白。

但是，如果为了避免形成可以引起IL-18BP的活性的减弱的不必要的分子内或分子间的二硫键，利用其它残基可以替代生物活性不需要的半胱氨酸。

优选地，同义氨基酸基团已在表I中确定。优选地，同义氨基酸基团已在表II中确定；最优选地同义氨基酸基团已在表III中确定。

表I  同义氨基酸的优选基团

氨基酸                   同义基团

Ser                      Ser，Thr，Gly，Asn

Arg                      Arg，Gln，Lys，Glu，His

Leu                      Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu

Pro                      Gly，Ala，Thr，Pro

Thr                      Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr

Ala                      Gly，Thr，Pro，Ala

Val                      Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val

Gly                      Ala，Thr，Pro，Ser，Gly

Ile                      Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile

Phe                      Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe

Tyr                      Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr

Cys                      Ser，Thr，Cys

His                      Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His

Gln                      Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln

Asn                      Gln，Asp，Ser，Asn

Lys                      Glu，Gln，His，Arg，Lys

Asp                      Glu，Asn，Asp

Glu                      Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu

Met                      Phe，Ile，Val，Leu，Met

Trp                      Trp

表II  同义氨基酸的更优选的基团

氨基酸                   同义基团

Ser                      Ser

Arg                      His，Lys，Arg

Leu                      Leu，Ile，Phe，Met

Pro                      Ala，Pro

Thr                      Thr

Ala                      Pro，Ala

Val                      Val，Met，Ile

Gly                      Gly

Ile                      Ile，Met，Phe，Val，Leu

Phe                      Met，Tyr，Ile，Leu，Phe

Tyr                      Phe，Tyr

Cys                      Cys，Ser

His                      His，Gln，Arg

Gln                      Glu，Gln，His

Asn                      Asp，Asn

Lys                      Lys，Arg

Asp                      Asp，Asn

Glu                      Glu，Gln

Met                      Met，Phe，Ile，Val，Leu

Trp                      Trp

表III  同义氨基酸的最优选的基团

氨基酸                   同义基团

Ser                      Ser

Arg                      Arg

Leu                      Leu，Ile，Met

Pro                      Pro

Thr                      Thr

Ala                      Ala

Val                      Val

Gly                      Gly

Ile                      Ile，Met，Leu

Phe                      Phe

Tyr                      Tyr

Cys                      Cys，Ser

His                      His

Gln                      Gln

Asn                      Asn

Lys                      Lys

Asp                      Asp

Glu                      Glu

Met                      Met，Ile，Leu

Trp                      Met

可以用于获得用于本发明的IL-18BP多肽或蛋白质的突变蛋白或病毒IL-18BP的产生突变蛋白的蛋白质氨基酸取代的实施例包括任何已知的方法步骤，如授予Mark等人的美国专利RE33,653，4,959,314，4,588,585和4,737,462；授予Koths等人的5,116,943；授予Namen等人的4,965,195；授予Chong等人的4,879,111；和授予Lee等人的5,017,691；和美国专利第4,904,584号中表示的赖氨酸取代蛋白质(Shaw等人)。

在本发明的另一个优选地实施例中，IL-18BP或病毒IL-18BP的突变蛋白具有基本对应于IL-18BP或病毒IL-18BP的氨基酸序列。术语“基本对应于”可理解为具有与天然蛋白质的序列变化最小的蛋白质，最小变化不影响特别是它们结合IL-18的能力范围内的天然蛋白质的基本特征。通常认为在“基本对应于”范围内的该类型的变化是来自编码这些蛋白质的DNA的常规诱变技术，导致几个小的修饰，并且以上面讨论的方式筛选需要的活性。除了结合IL-18，突变蛋白也可以调节和/或封闭IL-18活性。

本发明的突变蛋白包括在严格条件下根据本发明与编码IL-18BP或编码病毒IL-18BP的DNA或RNA杂交的核酸如DNA或RNA编码的蛋白质。本发明也包括这样的核酸，它可以在需要的核酸的鉴定和纯化中用作探针。另外，这样的核酸将是确定是否它编码保留本发明的IL-18BP的功能活性的多肽的引物候选物。术语“严格条件”指本领域普通技术人员称为“严格”的杂交和随后的洗涤条件。参见Ausubel等人，分子生物学中的当前方案，出处同上，Interscience，纽约，6.3和6.4章(1987，1992)，和Sambrook等人，出处同上。没有限制地，严格条件的例子包括低于研究的杂交的计算Tm 12～20℃，例如，2×SSC和0.5％SDS5分钟，2×SSC和0.1％SDS15分钟；0.1×SSC和0.5％SDS，在37℃30～60分钟，然后，0.1×SSC和0.5％SDS在68℃30～60分钟的洗涤条件。本领域技术人员理解的那些严格条件也取决于DNA序列，寡核苷酸探针(如10～40碱基)或混合的寡核苷酸探针的长度。如果使用的是混合探针，优选地利用四甲基氯化胺(TMAC)而不是SSC。参见Ausubel，出处同上。

本发明进一步包括编码本发明的IL-18BP，但由于遗传密码的简并性而在密码子序列中有区别的核酸。在严格条件下与图4到图7显示的DNA序列可能不杂交，但能够编码本发明的IL-18BP的DNA也包括在本发明中。

术语“融合蛋白质”指含有与在体液中具有延长的残留时间的另一个蛋白质融合的IL-18BP或病毒IL-18BP或其突变蛋白的多肽。所以，IL-18BP或病毒IL-18BP可以与另一个蛋白质，多肽或诸如此类，例如免疫球蛋白或其片断融合。它也可以与聚乙二醇(PEG)融合以便延长残留时间。

本发明的术语“盐”指IL-18BP，病毒IL-18BP，突变蛋白或其融合蛋白质的羧基基团的盐和氨基基团的酸加入盐。羧基基团的盐可以通过本领域已知的手段形成，并且包括无机盐例如，钠，钙，铵，铁或锌盐等，和正如与胺如三乙醇胺，精氨酸，或赖氨酸，哌啶，普鲁卡因和诸如此类形成的那些有机碱的盐。酸加入盐包括例如与例如盐酸，或硫酸的矿物质酸形成的盐，和含有例如乙酸或草酸有机酸的盐。当然，任何这样的盐必须基本具有与IL-18BP相似的活性。

如本发明所用的“功能衍生物”覆盖了可以通过本领域的已知手段从作为残基或N或C末端基团上的侧链存在的功能基团制备，和只要它们保留药物可接受即它们不破坏与IL-18BP或病毒IL-18BP的活性基本相似的蛋白质的活性，并且不给予含有它的组合物毒性的特点就包括在本发明的IL-18BP，或病毒IL-18BP或它们的突变蛋白质和融合蛋白的衍生物。这些衍生物可以例如包括聚乙二醇侧链，该侧链可以模拟抗原位点和在体液中延长IL-18BP或病毒IL-18BP的残留。其它衍生物包括羧基的脂肪族酯，通过与胺或与初级或次级胺反应形成羧基的酰胺，与酰基成份(例如，阿尔卡诺或碳环芳香基团)形成的氨基酸残基的无氨基基团的N酰基衍生物或与酰基成份形成的游离羟基(例如，丝氨酰或苏氨酰残基)的O-酰基衍生物。

关于IL-18BP，突变蛋白和融合蛋白质的“活性部分”，假如所述部分基本保留了结合IL-18的能力，本发明覆盖了蛋白质分子单独或与相关分子或其连接的残基，例如，糖或磷酸残基，或蛋白质分子或糖残基本身的聚集体的多肽链的融合片断或前体。

本发明所用的术语“环变化的衍生物”指其中末端已经直接或通过接头连接在一起以便产生环状分子的线性分子，然后环状分子在另一个位置打开以便产生新的线性分子，其末端不同于原始分子的末端。环状变化包括那些结构等同于已经环化和然后打开的分子的分子。所以，可以重新作为线性分子合成环状变化分子，并且从不进行环化和打开步骤。WO95/27732中公开了环状变化衍生物的制备。

各种重组细胞如原核细胞例如大肠杆菌，或其它真核细胞如酵母或昆虫细胞可以产生IL-18BP或病毒IL-18BP。为了产生重组IL-18BP或病毒IL-18BP，构建携带编码IL-18BP并且适于转染(例如，大肠杆菌，哺乳动物细胞和酵母细胞)或感染昆虫细胞的DNA的适当载体的方法是本领域已知的。参见例如，Ausubel等人，“分子生物学中的当前方案”当前方案，1993，和Sambrook等人，“分子克隆，实验室手册”第二版，科尔德斯普林港出版社，1989。

为了表达IL-18BP蛋白质或病毒IL-18BP，将编码IL-18BP或病毒IL-18BP，它们的片断，突变蛋白或融合蛋白质和可操作地连接的转录和翻译调节信号的DNA插入能够在宿主细胞染色体中整合需要的基因序列的载体中。为了能够选择已经在它们的染色体中稳定整合导入的DNA的细胞，利用了允许选择含有表达载体的宿主细胞的一个或多个标记。该标记可以提供营养缺陷型宿主原养型杀生物抗性，例如抗生素，或重金属抗性例如铜或诸如此类。可选择标记基因可以直接与表达的DNA基因序列连接或通过转染导入同样的细胞。其它元素也是单链结合蛋白质mRNA的最佳合成所需要的。这些元素可以包括拼接信号，以及转录启动子，增强子和终止信号。

优选地将导入选择的细胞的所述的DNA分子掺入能够在受体宿主中自身复制的质粒或病毒载体中。优选的原核质粒是pBr322的衍生物。优选的真核载体包括BPV，疫苗，SV40，2-微米环等，或它们的衍生物。这样的质粒和载体是本领域已知的(2～5，22)。一旦已经制备了用于表达的含有构建体的载体或DNA序列，可以将表达载体通过任何种类的适当手段，如转化，转染，脂转染，共轭，原生质体融合，电穿孔，磷酸钙沉淀，直接微注射等导入适当的宿主细胞。

在本发明中所利用的宿主细胞可以是原核或真核的。优选的原核宿主包括细菌如大肠杆菌，芽胞杆菌，链霉菌，假单胞菌，沙门氏菌，沙雷氏菌等。最优选地宿主是大肠杆菌。特别有利的细菌宿主包括大肠杆菌K12菌株294(ATCC 31446)，大肠杆菌X1776(ATCC 31537)，大肠杆菌W3110(F-，λ-，向光性(ATCC27325)。在这样的条件下，蛋白质将不糖基化。原核宿主必须与复制子和表达质粒中的控制序列相容。

但是，因为天然IL-18BP是糖基化蛋白质，真核宿主比原核宿主优选。优选的真核宿主是哺乳动物细胞，例如，人，猴，小鼠，和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为它们提供蛋白质分子翻译后修饰，包括正确的折叠，正确的二硫键形成，以及在正确的位点糖基化。同样酵母细胞和昆虫细胞可以进行翻译后肽修饰包括高甘露糖糖基化。

存在许多重组DNA方案，它们利用了强启动子序列和高拷贝数的质粒，它们可以用于在酵母和昆虫细胞中产生需要的蛋白质。酵母和昆虫细胞识别了克隆的哺乳动物基因产物上的引导序列和分泌成熟的IL-18BP。在导入载体后，在选择含有载体的细胞的生长的选择性培养基中可以生长宿主细胞。克隆的基因序列的表达导致产生了IL-18BP，病毒IL-18BP，融合蛋白质，或其突变蛋白或片断。在下面的实施例中详细叙述了上面提到的克隆，克隆分离，鉴定，定性和测序方法。

然后通过任何常规方法包括提取，沉淀，亲和层析，电泳或诸如此类或通过利用例如固定在柱内包含的凝胶基质上的抗IL-18BP单克隆抗体的亲和层析分离和纯化表达的蛋白质。含有所述的重组IL-18BP的粗制剂通过柱，因此IL-18BP将通过特异的抗体结合柱，而不纯物质通过柱。在洗涤后，在通常用于该目的的条件下，即在高或低pH，例如pH11或pH2从凝胶洗脱蛋白质。

本发明进一步涉及用于在哺乳动物，和更具体地说在人中，表达IL-18BP或病毒IL-18或它们的衍生物的载体。在哺乳动物中短期和长期表达基因的载体在文献中已有记载。研究已经表明将基因释放到例如，骨骼肌肉，血管平滑肌和肝导致的治疗的蛋白质在系统水平。骨骼肌肉是有用的靶，因为它的大质量，血管供应和易接近性。但是，已经成功地利用了其它靶和特定地免疫细胞的骨髓前体。例如在肌肉中表达蛋白质的目前可得载体包括质粒DNA，脂质体，蛋白质-DNA共轭物和基于腺病毒，腺相关病毒和肝炎病毒的载体。在这些之间，关于基因表达的时间和水平和出于安全性考虑，基于腺相关的病毒(AAV)的载体已经是最成功的(Kessler，P.D.1996，美国科学院院刊，93，14082～4087)。

在Snyder等人，1996，人遗传学中的当前方案，12.1.1～12.1.17章，John Wiley和Sons中详细叙述了AAV基础的载体的构建方法，并且引入本发明中。简要地说，利用限制酶XbaI裂解含有野生型AAV基因组的质粒psub201，并且与含有有效的真核生物启动子，例如，巨细胞病毒启动子，Kozak同感序列，编码IL-18BP或病毒IL-18BP的DNA序列，或它们的突变蛋白或融合蛋白质或其片断，适当的3’未翻译区和多聚腺苷酸化信号，例如，猴病毒40的多聚腺苷酸化信号的构建体连接。利用辅助AAV质粒，例如pAAV/Ad将得到的重组质粒共转染进入哺乳动物细胞，例如人T293细胞。然后，利用腺病毒作为辅助病毒感染培养物，并且在48～60小时后收集培养上清液。通过硫酸铵沉淀分级分离上清液，在CsCl密度梯度上纯化，透析，然后在56℃加热以便破坏任何腺病毒，而得到能够表达IL-18BP或病毒IL-18BP或它们的突变蛋白或融合蛋白质的重组AAV在这一步骤保持稳定。

迄今为止，还没有确立可溶性细胞因子的受体的生理作用。可溶性受体结合它们的特异的配体，并且在大多数情况中抑制它们的生物活性，正如TNF系统中显示的(11，12)。在很少的情况中，例如IL-6，可溶性受体增强生物活性。在动物模型中发现重组可溶性TNF受体也已知为TBP(TNF结合蛋白质)能够预防败血性休克，同时发现IL-1受体的可溶性形式对小鼠异嫁接受体中体内同种异体反应性的发展具有深远的抑制效果。

同样，可以发现本发明的IL-18BP和病毒IL-18BP在I型糖尿病中，在脓毒血症，在自身免疫疾病，在移植排斥，类风湿关节炎，肠炎疾病，脓毒血症，多发性硬化，局部缺血性心脏病，包括急性心脏病发作，局部缺血性脑损伤，慢性肝炎，牛皮癣，慢性肝炎和急性肝炎中用作调节IL-18活性的调节物。所以，它们可以用于任何疾病，其中内源产生或外源给药IL-18诱导疾病或恶化病人的情况。

本发明进一步涉及含有药物可接受载体和本发明的IL-18BP或病毒IL-18BP或它们的活性突变蛋白，融合蛋白质及其盐，功能衍生物或其活性部分的药物组合物。

本发明进一步涉及含有药物可接受载体和例如，病毒载体如任何一个所述的基于AAV的病毒载体或表达IL-18BP或病毒IL-18BP或它们的突变蛋白，其片断或融合蛋白质和适于为了表达体内本发明的IL-18BP和病毒IL-18BP或它们的突变蛋白片断或融合蛋白质，对人和其它哺乳动物给药，用于基因治疗的另一个载体的药物组合物。

通过将IL-18BP，或病毒IL-18BP或它们的衍生物，或表达它们的载体与生理可接受载体，和/或稳定剂和/或赋形剂混合，并且通过在剂量小瓶中冻干制备成剂量形式制备用于给药的本发明的药物组合物。给药的方法可以是通过相似试剂的给药的任何可接受方式，并且将取决于待治疗的病症，例如，静脉内，肌肉内，皮下，通过局部注射或局部应用，或连续输入等。给药的活性化合物的量将取决于给药的途径，待治疗的疾病和病人的症状。例如局部注射将在体重基础上比静脉内输入需要的蛋白质的量更低。

因此，表明IL-18BP，或病毒IL-18BP或体内表达它们的载体用于治疗自身免疫疾病，I型糖尿病，类风湿关节炎，移植排斥，肠炎疾病，脓毒血症，多发性硬化，局部缺血性心脏病包括急性心脏病发作，局部缺血性脑损伤，慢性肝炎，牛皮癣，慢性胰腺炎，急性胰腺炎，和相似的疾病，其中存在IL-18的异常表达，导致过量的IL-18或由于外源给药IL-18引起的并发症的情况。

本发明也包括抗IL-18BP或病毒IL-18BP，以及抗它们的突变蛋白，融合蛋白质，盐，功能衍生物和活性部分的抗体。术语“抗体”指包括在可溶或结合形式中可以标记的多克隆抗体，单克隆抗体(MAbs)，嵌合抗体，抗独特型(抗Id)抗体的抗体，以及任何现有技术如并不限于酶裂解，肽合成或重组技术提供的人化抗体及其片断。

多克隆抗体是起源于利用抗原免疫的动物的血清的抗体分子的异源群体。单克隆抗体基本含有特异于抗原的抗体的同源群体，该群体基本含有相似的表位结合位点。通过本领域普通技术人员已知的方法可以获得MAbs。参见例如，Kohler和Milstein，自然，256：495～497(1975)；美国专利第4,376,110号；Ausubel等人，出处同上，编辑，Harlow和Lane，抗体，实验室手册，科尔德斯普林港实验室，(1988)；和Colligan等人编辑，在免疫学中的当前方案，Greene出版协会，和WileyInterscience纽约(1992，1993)，将这些参考文献的内容全部引入本发明作为参考。这样的抗体可以是任何免疫球蛋白的类别包括IgG，IgM，IgE，IgA，GILD和其任何亚类。产生本发明的MAb的杂交瘤可以在体外，原位或体内培养。体内或与原位产生高效价的Mab使这成为目前优选的生产方法。

嵌合抗体是不同部分起源于不同动物种类，如具有起源于小鼠MAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。将嵌合抗体初步用于减弱应用中的免疫原性，和增强生产的产量，例如小鼠Mab在杂交瘤中有较高的产量，但在人中具有更高的免疫原性，以致利用了人/小鼠嵌合MAb。嵌合抗体和它们生产的方法是本领域公知的(Cabilly等人，美国科学院院刊，81：3273～3277(1984)；Morrison等人，美国科学院院刊，81：6851～6855(1984)；Boulianne等人，自然，312：643～646(1984)；Cabilly等人，欧洲专利申请125023(1984年11月14日公开)；Neuberger等人，自然，314：268～270(1985)；Taniguchi等人，欧洲专利申请171496(1985年2月19日公开)；Morrison等人，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Neuberger等人，PCT申请WO8601533(1986年3月13日公开)；Kudo等人，欧洲专利申请184187(1986年6月11日公开)；Morrison等人，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Sahagan等人，免疫学杂志，137：1066～1074(1986)；Robinson等人，国际专利申请WO9702671(1987年5月7日公开)；Liu等人，美国科学院院刊，84：3439～3443(1987)；Sun等人，美国科学院院刊84：214～218(1987)；Better等人，科学，240：1041～1043(1988)；和Harlow和Lane，抗体，实验室手册，出处同上。这些参考完全引入本发明。

抗独特型(抗Id)抗体是识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特的决定簇的抗体。通过利用抗Id正在制备的MAb免疫作为MAb来源的相同种类的动物和基因型(例如，小鼠菌株)可以制备Id抗体。免疫的动物通过产生抗这些独特型决定簇的抗体(抗Id抗体)识别和应答免疫抗体的独特型决定簇。参见例如，美国专利第4,699,880号，将它全部引入本发明。

抗Id抗体也可以用作“免疫原”以便在产生所谓抗-抗Id抗体的另一个动物中诱导免疫应答。抗-抗Id的表位相同于诱导抗-Id的原始MAb。所以，通过来源于MAb的独特型决定簇的抗体，有可能鉴定表达相同特异性的抗体的其它克隆。

因此，可以利用抗IL-18BP产生的MAb和本发明的相关蛋白质在适当的动物中，例如BALB/c小鼠中诱导抗-Id抗体。将来自这样的免疫小鼠的脾细胞用于产生分泌抗-Id MAb的抗-Id杂交瘤。另外，抗Id Mab可以与载体如匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联，并且用于免疫其它BALB/c小鼠。来自这些小鼠的血清将含有具有特异于IL-18BP表位或病毒IL-18BP的表位的原始MAb的结合特性的抗-抗Id抗体。

所以，抗-Id MAb具有它们自己的独特型表位，或结构相似于评估的表位如IL-18BP或病毒IL-18BP的“独特性”。

术语“人化抗体”指包括例如，通过基因工程方法操作小鼠抗体获得的抗体，以便与人体更相容。这样的人化抗体在人中具有减弱的免疫原性和提高的药物动力学。通过本领域公知的技术，例如在分子免疫学30卷，16号，1443～1453，1993对于人化抗TNF抗体叙述的可以制备它们。

术语“抗体”也指包括能够结合抗原的完整分子及其片断如Fab和F(ab’)2。Fab和F(ab’)2片断缺乏显然更快速循环的完整抗体的Fc片断，并且可以比完整抗体具有更少的非特异组织结合[Wahl等人，核酸方法杂志，24：316～325(1983)]。令人满意的是用于本发明的抗体的Fab和F(ab’)2和其它片断可以根据本发明公开的完整抗体分子的方法检测和定量IL-18BP或病毒IL-18BP。这样的片断通常是通过利用酶如木瓜蛋白酶(产生Fab片断)或胰蛋白酶[产生F(ab’)2片断]裂解蛋白质产生的。

如果能够与分子特异反应而将分子结合于抗体，就认为抗体“能够结合”分子。术语“表位”指能够通过也被那个抗体识别的抗体结合的任何分子的部分。表位或“抗原决定簇”通常含有分子如氨基酸或糖侧链的化学活性表面基团并且具有特异的三维结构特征以及特异的电荷特征。

“抗原”是能够通过抗体结合的分子或分子的部分，该抗体另外能够诱导动物产生能够结合抗原的表位的抗体。抗原可以具有一个或一个以上的表位。特异的反应在上面表示抗原将以高度选择性的方式与它对应的抗体反应而不与大量的其它抗原引起的其它抗体反应。

抗体，包括抗体的片断可用于本发明的定量或定性检测样品中的IL-18BP或病毒IL-18BP或相关蛋白质，或检测表达这样的本发明的蛋白质的细胞的存在。通过利用与光显微镜的，流式细胞计或荧光计的检测偶联的荧光标记的抗体(参见下面)的免疫荧光技术可以完成这一检测。

用于本发明的抗体(或其片断)可以在组织学上如在免疫荧光或免疫电子显微镜中用于本发明的IL-18BP或病毒IL-18BP和相关蛋白质的原位检测。通过从病人中移取组织样品，并且给这样的样品提供本发明的标记抗体可以完成原位检测。通过在生物学样品中应用或覆盖标记抗体(或片断)优选地提供了抗体(或片断)。通过利用这样的方法，不仅确定IL-18BP或病毒IL-18BP或相关蛋白质的存在，而且也可确定它在检测的组织上的分布。利用本发明，那些本领域普通技术人员将容易地发现，为了完成这样的原位检测可以修饰任何种类的组织学方法(如染色方法)。

本发明的IL-18BP或病毒IL-18BP，或相关蛋白质的这样的测试通常包括在存在能够鉴定IL-18BP或相关蛋白质的可检测标记抗体时，温育生物学样品如生物液体，组织提取物，新鲜收集的细胞如淋巴细胞或白细胞，或已经在组织培养中温育的细胞，和通过任何的许多本领域公知的技术检测抗体。

利用固相支持物或载体如纤维素，或其它固体支持物或能够固定细胞的载体，细胞颗粒或可溶性蛋白质可以处理生物样品。然后利用适当的缓冲液可以洗涤支持物或载体，接着利用本发明的可检测标记的抗体处理。然后第二次利用缓冲液洗涤固相支持物或载体以便除去未结合的抗体。然后，通过常规方法检测所述的固体支持物或载体上结合标记的量。

通过“固相支持物”，“固相载体”，“固体支持物”，“固体载体”，“支持物”或“载体”是指能够结合抗原或抗体的任何支持物或载体。公知的支持物或载体包括玻璃，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龙淀粉酶，天然和修饰的纤维素，聚丙烯酰胺，辉长岩和磁铁矿(magnetite)。载体的特性可以是为了本发明的目的溶解到一定程度或不溶。事实上，支持物质可以具有任何可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。所以，支持物或载体构型正如在小珠中或圆筒中，正如在测试管的内部表面，或棒的外部表面可以是球形。可替代地，表面可以是平的，正如纸，测试条等。优选的支持物或载体包括聚苯乙烯小珠。那些本领域的普通技术人员将知道许多结合抗体或抗原的其它适当载体，或将能够通过利用常规实验确定它们。

根据公知的方法可以确定本发明的给定的许多抗体的结合活性。本领域的普通技术人员能够通过利用常规实验确定每个测试的可操作和最佳测试条件。

正如特定的条件下所常用或需要的，在测试中可以增加其它的这样的步骤如洗涤，搅拌，振摇，过滤等。

可检测地标记本发明的抗体的一个方法是将它与酶连接，并且用于酶免疫测试(EIA)中。当后来与适当的底物接触时，该酶依次以这样的方式与底物反应以致产生可以通过分光光度计，荧光计或通过肉眼可见的方法检测的化学成份。可以用于可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-类固醇异构酶，酵母乙醇脱氢酶，α-甘油磷酸脱氢酶，磷酸丙糖异构酶，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶，核糖核酸酶，脲酶，触酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡糖淀粉酶和乙酰胆碱脂酶。通过利用酶的色原底物的比色计方法可以完成检测。在与相似的制备标准的比较中，通过肉眼比较底物的酶反应程度也可以完成检测。

通过任何的其它免疫测试可以完成检测。例如，通过放射性标记抗体或抗体片断，能够通过利用放射性免疫测试(RIA)检测IL-18BP或病毒IL-18BP。在分子生物学中的实验室技术和生物化学，Work，T.S.等人，北荷兰出版公司，纽约(1978)，特定的参考章节的标题是“放射性免疫测试和相关技术的介绍”Chard，T.，(引入本发明作为参考)中可以发现对RIA的很好的叙述。当利用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影这些手段可以检测放射性的同位素。

利用荧光化合物标记本发明的抗体也是可能的。当荧光标记抗体与适当波长的光接触时，然后由于荧光可以检测它的存在。最通常利用的荧光标记化合物是，异硫氰酸荧光素，罗丹明，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，邻苯二醛和荧光胺。

利用荧光辐射金属如¹⁵²Eu，或镧系其它物质也可检测地标记抗体。利用如二亚乙基三胺五乙酸(ETPA)的金属螯合基团，可以将这些金属附着于抗体上。

通过将它与生物素偶联也可以检测性地标记抗体。然后，通过与荧光化合物或如过氧化物酶的酶或放射性同位素和诸如此类偶联的抗生物素蛋白或链霉抗生物素可以检测生物素化的抗体。

通过将它与化学荧光化合物偶联也可以可检测地标记抗体。然后通过检测在化学反应过程中产生的荧光的存在确定化学荧光标记的抗体的存在。特定的利用的化学荧光标记化合物的例子是鲁米诺，异鲁米诺，热吖啶酯，咪唑，吖啶盐和草酸酯。

同样，生物荧光化合物也可以用于标记本发明的抗体。生物荧光是在催化蛋白质增强化学荧光反应的效率的生物系统中发现的化学荧光的类型。通过检测荧光的存在确定了生物荧光蛋白质的存在。标记的重要生物荧光化合物是荧光素，荧光素酶和水母发光蛋白。

本发明的抗体分子可以适用于在immunometric测试，也已知为“2位点”或“三明治”测试中利用。在典型的immunometric测试中，将一定量的未标记的抗体(或抗体片断)结合于固体支持物或载体，并且加入一定量的可检测的标记可溶抗体允许检测和/或定量在固相抗体，抗原和标记的抗体之间形成的三元复合物。

通常，并且优选的，immunometric测试包括“正向”测试，其中将结合固相上的抗体首先与待测试的样品接触，以便通过形成二元固相抗体-抗原复合物从样品中提取抗原。在适当温育期后，洗涤固体支持物或载体以便除去液体样品的残基包括如果有任何未反应的抗原，然后与含有未知量的标记抗体(作用是“受体分子”)的溶液接触。在允许标记抗体与通过未标记抗体结合于固体支持物或载体的抗原的复合物第二个温育时期后，第二次洗涤固体支持物或载体以便除去未反应的标记抗体。

在也可以用于本发明的抗原的另一类型的“三明治”测试中，利用了所谓的“同时”和“反相”测试。“同时”测试包括单一的温育步骤，因为抗体结合于同时在待测试的样品中加入的固相支持物或载体和标记的抗体。在温育完成后，洗涤固体支持物或载体以便除去液体样品的残基和未复合的标记抗体。然后，正如它是在常规的“正向”三明治测试，确定了与固体支持物或载体结合的标记抗体的存在。

在“反相”测试中，在利用了适当的温育期之后，首先在液体样品中逐步加入标记抗体的溶液，接着加入结合于固体支持物或载体上的未标记抗体。在第二次温育之后，以常规方式洗涤固相使它脱离待测试的样品的残基和未反应的标记抗体溶液。然后正如在“同时”和“正向”测试中确定结合固体支持物或载体的标记抗体的测试。

正如上面确定的，本发明也提供编码本发明的任何蛋白质的DNA分子，含有任何这样的DNA分子的可复制表达载体，利用任何这样的表达载体转化的宿主细胞包括原核生物、真核生物和宿主细胞，优选CHO细胞。本发明也包括为了在人和其它哺乳动物中表达的目的，产生编码本发明的任何蛋白质的表达载体的方法。

本发明也包括通过培养本发明的转化细胞，和回收DNA分子和在这样的转化宿主细胞内的表达载体编码的蛋白质产生本发明的任何蛋白质的方法。

除了在调节IL-18的活性中利用IL-18BP或病毒IL-18BP，当然它们也可以用于纯化IL-18BP本身。为了这一目的，将IL-18BP或病毒IL-18BP与亲和柱偶联，并且通过粗IL-18。然后，通过例如在低pH洗脱从柱回收IL-18。

通过下面的非限制性实施例可以说明本发明：

实施例1：分离IL-18结合蛋白

根据制造商的说明，将大肠杆菌IL-18(2.5毫升，Peprotech，NJ)与亲和凝胶-10(0.5毫升，BioRad)偶联，填充进入柱中。以流速0.25毫升/分钟，将粗尿蛋白质(100倍浓缩，500毫升)加载到柱上。利用250毫升磷酸缓冲液(PBS)中的0.5摩尔/升的NaCl洗涤柱。然后立即用1摩尔/升Na₂CO₃中和的25毫摩尔/升柠檬酸，pH2.2和苯甲脒(1毫摩尔/升)洗脱结合的蛋白质。收集1摩尔/升的部分。通过SDS-PAGE分析各部分，并且银染。在组份2～8中，IL-18结合蛋白质作为约40,000道尔顿蛋白质洗脱(图1)。对应于IL-18BP的约40千道尔顿的带在银染时展示明显的黄色。通过正如实施例2中所述与¹²⁵I-IL-18交联，SDS-PAGE和放射自显影分析各种部分。在组份2～8发现IL-18结合蛋白质，从IL-18琼脂糖柱洗脱(图2)。

实施例2：亲和纯化的IL-18BP与标记的IL-18的交联

将来自亲和纯化步骤的IL-18BP的样品(40微升)与¹²⁵I-IL-18(5,000,000cpm)一起温育(70分钟，4℃)。然后加入溶解于二甲基亚砜(Me₂SO，20毫摩尔/升)的disuccinimidylsuberate(DSS)到最后浓度为2毫摩尔/升，并且将混合物在4℃保留20分钟。通过加入pH7.5的1摩尔/升Tris-HCl和1摩尔/升NaCl到最后浓度为100毫摩尔/升终止反应。加入含有二硫苏糖醇(DTT，25毫摩尔/升最后)的样品缓冲液，通过SDS-PAGE(7.5丙烯酰胺)接着放射自显影分析混合物(图2)。

在从IL-18亲和柱(道2和3)洗脱的部分，但不是在含有所有其它粗尿蛋白质的柱洗液(道1)中观察到了可能含有与约20千道尔顿¹²⁵I-IL-18交联的约40千道尔顿蛋白质的分子量为58千道尔顿的特异带。

实施例3：蛋白质序列分析

在非还原条件下，通过SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分辨实施例1的亲和柱洗脱的各部分，在PVDF膜(Pro-Blot，应用生物系统，USA)上电影印。利用考马斯蓝染色膜，切出约40千道尔顿的带，通过Procise微序列仪(应用生物系统，USA)进行蛋白质序列分析。获得下面大的序列：

T-P-V-S-Q-Q-x-x-x-A-A-A

1···5····10 ··

其中x代表尚未确定的氨基酸。

另外，获得了小的序列：

A-x-Y-x-R-I-P-A-x-A-I-A

1···5···· 10 ··

因为这一双倍体序列，不可能获得更长的序列数据。鉴定了小序列为人防卫素的片断(登记号p11398)，开始在防卫素的氨基酸65。大序列不能与任何其它已知的蛋白质结合，正如通过blastp和tblastn研究程序研究NCBI和TIGR中所有可得数据库确定的。

为了获得更长和更精确的序列，和为了鉴定潜在的半胱氨酸残基，在6摩尔/升盐酸胍中利用DTT还原从IL-18琼脂糖柱洗脱的组份的另一个等分试样，与4丙烯吡啶反应，通过微超滤装置(Ultrafree，截止分子量10,000道尔顿，Millipore)脱盐，进行蛋白质微序列的分析。在测序的1号循环后，将滤纸与邻苯二醛反应封闭N末端多肽而不是Pro。以这一方式，仅获得如下大

序列：

TPVSQXXXAA  XASVRSTKDP  CPSQPPVFPA  AKQCPALEVT

1       10          20          30          40

(T＝Thr；P＝Pro；V＝Val；S＝Ser；Q＝Gln；X＝未知；A＝Ala；R＝Arg；K＝Lys；D＝Asp；C＝Cys；F＝Phe；L＝Leu；E＝Glu)

在循环6，7，8和11中，获得了低水平的Thr信号。因为这一低水平，我们认为在所述的循环中不指派特定的氨基酸残基是更加谨慎的。

正如研究蛋白质数据库确定的，得到的序列明显不同于任何其它已知蛋白质。但是，通过tblastn研究程序研究TIGR数据库提供了cDNA文档，称为THC123801，它的开放读码框架(218个密码子)当翻译时，含有与IL-18BP的N末端序列高度同源的序列。下面显示了同源性：

1.......TPVSQXXXAAXASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVT... 40

            | | |   || |||||||||||||||||||||||||||||

  51 VTLLVRATXVXQTTTAATASVRSTKDPCPSQPPVFPAAKQCPALEVTWPE 100

[上面的序列(1～40)是本发明分离的IL-18BP；下面的序列(51～100)是通过TIGR文档THC123801的cDNA的翻译推断的]。

在IL-18BP的残基2和4，翻译文档THC123801获得的推定的蛋白质序列是模糊的。它证明了IL-18BP的氨基酸残基6，7和8作为Thr的特征，并且似乎对残基11也一样。

实施例4：IL-18BP是糖蛋白

通过在Superose 12柱(1×30厘米，Pharmacia，瑞典)上排斥大小层析进一步纯化实施例1中洗脱组份的等分试样(0.3毫升)。预平衡柱，并且利用磷酸缓冲液和叠氮化钠(0.02％)流速0.5毫升/分钟洗脱。1分钟收集组份。正如SDS-PAGE和银染确定的，在组份20～25作为约40,000道尔顿的蛋白质洗脱IL-18BP结合蛋白质。根据制造商的说明，将含有约40,000道尔顿的蛋白质的样品(23，50微升组份，约50纳克蛋白质)与N糖苷酶F(PNGase F，Biolab)反应。简言之，通过在5％SDS煮沸10分钟，10×G7缓冲液(2.5微升)，10％NP-40(2.5微升)，和PNGase F(1微升)在37℃1小时变性等分试样。在非还原条件下通过SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)分析样品，并且与来自相同的Superose12柱的未消化的IL-18BP比较。发现在PNGase-处理的部分，约40千道尔顿的IL-18BP带消失了。获得了新的对应于30千道尔顿(正如在PNGase带上面)和20千道尔顿的带。约40千道尔顿的带的消失表明该带是N糖基化蛋白质。

实施例5：通过IL-18BP封闭IL-18的生物活性

通过测量在单核细胞中IL-18诱导的IFN-γ的产生确定从尿中分离的IL-18BP封闭IL-18活性的能力。当与低浓度的LPS，IL-12，IL-2或其它刺激物一起加入时，IL-18诱导IFN-γ。在小鼠脾细胞，在人周边血液单核细胞(PBMC)和在人KG-1细胞系中测试IL-18的活性。从健康的小鼠制备脾细胞，洗涤和在补充了10％胎牛血清的RPMI1640中以5×10⁶细胞/毫升悬浮。利用LPS(0.5微克/毫升或1微克/毫升)以及重组人或小鼠IL-18(0.5纳克/毫升或5纳克/毫升)刺激1.0毫升培养物。在加入脾细胞之前，在重组IL-18中加入人IL-18结合蛋白质(0，5或50纳克/毫升)。在培养24小时后，将脾细胞进行三次冷冻(-70℃)和解冻(室温)循环，通过离心除去细胞碎片，对于小鼠IFN-γ(内源)，利用ELISA试剂盒测试上清液的IFN-γ。正如图3A所示，IL-18BP以依赖剂量的方式，封闭小鼠脾细胞中的huIL-18的活性。相反，作为对照，可溶性的干扰素-α/β受体没有效果。重组小鼠IL-18的活性相似地受到人IL-18BP的抑制，表明人IL-18BP识别小鼠IL-18(图3B)。通过高浓度的LPS在小鼠脾细胞中诱导内源的IL-18，导致IFN-γ的产生。实际上，尿IL-18BP也抑制LPS(10微克/毫升)诱导IFN-γ(图3C)。伴刀豆球蛋白A(conA)活化T细胞以便在缺乏IL-18时产生IFN-γ(13)。确实，IL-18BP甚至在高浓度不抑制ConA诱导IFN-γ(图3D)。这一观察证明了IL-18BP是IL-18生物活性的特异抑制剂而不是IFN-γ产生的非特异抑制剂。IL-18BP也抑制了IL-18和TNF-α的联合诱导的人KG-1细胞中人IL-18的活性(图3E)。

正如在人和小鼠单核细胞中IFN-γ的共诱导确定的，上面的数据证明了尿IL-18BP抑制人以及小鼠IL-18的活性。减弱IL-18活性＞90％的IL-18BP的浓度是可以与IL-18本身比较的，表明在这两个蛋白质之间的高亲和相互作用。

实施例6：编码IL-18BP的cDNA克隆的分离

利用SuperScript RNase H^-逆转录酶(Gibco-BRL)和随机引物(Promega，麦迪生WI)逆转录来自Jurkat T细胞(CRL 8163，美国类型培养物收藏中心)的总RNA。然后，通过PCR，利用TaqDNA聚合酶(西格玛)和对应于TIGR克隆THC123801核苷酸24～44(有意义)和500～481(反义)的引物扩增得到的cDNA片断。在30个退火(55℃，2分钟)和扩展(70℃，1分钟)循环中进行扩增。通过琼脂糖(1％)凝胶电泳分辨PCR产物，洗脱和克隆进入pGEM-Teasy TA克隆载体(Promega)。利用T7和SP6引物测序来自单个克隆的DNA。

通过随机引导³²P标记得到的477bp片断。将这一探针用于筛选各种人cDNA和基因组文库。取出复制的硝酸纤维素滤纸，并且与探针在60℃，在含有6×SSC，10×Denhardt’s溶液，0.1％SDS和100微克/毫升鲑精DNA的缓冲液中杂交。洗涤滤纸和在-80℃过夜曝光到Kodak XAR胶片上。菌斑纯化双倍阳性克隆。从λpCEV9克隆切出质粒，并且自身连接。根据制造商的说明分离来自其它文库的cDNA克隆。利用有意义和反义引物和373A和377序列仪(应用生物系统)进行分离的克隆的自动DNA序列分析(33)。这些克隆程序使用标准方案。

筛选下面的文库：T.Miki友好提供的，λpCEV9克隆载体(15)中构建的人单核细胞cDNA文库；人Jurkat白血病T细胞cDNA文库，人周边血液白细胞cDNA文库，和人脾cDNA文库，所有来自Clontech(Palo Alto，CA)。在λFIXII载体中的人胎盘基因组文库是来自Stratagene(La Jolla，CA)。

获得和鉴定了对应于四个不同的IL-18BP拼接变异体的所有cDNA克隆。所有拼接的变异体编码推定的可溶性分泌蛋白质。最丰富的一个(IL-18BPa)具有192个密码子的开放读码框架，编码了28个氨基酸残基的信号肽，接着成熟的推定的IL-18BPa，它的开始40个残基(SEQ ID NO：10)完美地匹配了尿IL-18BP(SEQ ID NO：2)的N末端蛋白质序列。半胱氨酸残基的位置表明了这一多肽属于免疫球蛋白(Ig)超家族。在成熟IL-18BPa内的四个Gln残基的每一个都是潜在的N糖基化位点。IL-18BP的其它三个拼接变异体明显更不丰富。

另一个1kb IL-18BPb cDNA编码85个氨基酸残基的成熟蛋白质(SEQ ID NO：4)。编码169个氨基酸残基(SEQ ID NO：6)的成熟IL-18BP的2.3kb cDNA表示第三个变异体IL-18BPc.第四个变异体，IL-18BPd编码133个氨基酸残基的成熟IL-18BP(SEQ ID NO：8)。外显子内的拼接存在于沿着前mRNA的两个位点。这些事件和在IL-18BPd中的另外的5’外显子在各种cDNA克隆中产生3个不同的5’UTR。所以，应答不同的转录调节信号有可能产生不同的IL-18BP变异体。

迄今为止，没有发现编码含有跨膜区的受体的cDNA。

实施例7：哺乳动物表达载体的构建，重组IL-18BP的产 生和重组IL-18BP的生物活性的评估

通过PCR，利用有意义引物5’TATATCTAGAGCCACCATGAGACACAACTGGACACCA和反义引物：5’ATATCTAGATTAATGATGATGATGATGATGACCCTGCTGCTGTGGACTGC扩增IL-18BPa cDNA的编码区。利用XbaI裂解PCR产物，克隆进入pEF-BOS表达载体(25)的XbaI位点以便产生pEF-BOS-IL-18BPa。通过DNA测序证明了构建体。

在室温下，如所述(35)温育含有pEF-BOS-IL-18BPa质粒DNA(10微克)和DEAE-葡聚糖(120微克)的1.4毫升TD缓冲液中的6×10⁷个COS7细胞30分钟。然后，利用DMEM-10％FBS洗涤细胞，在DMEM-10中涂布4小时，洗涤和在无血清的DMEM中温育3～5天。收集培养基，通过超滤(10千道尔顿截止分子量)浓缩6倍并且在Talon柱(Clontech)上。利用咪唑作为洗脱剂，根据制造商的说明分离IL-18BP-His₆。

如下评估尿和COS7表达的IL-18BP的免疫交联反应性：将利用¹²⁵I通过氯胺T方法标记尿IL-18BP(5微克)。将COS7细胞的上清液(250微升)与尿IL-18BP的抗体混合(1小时，室温，最后体积500微升)，在磷酸缓冲盐(PBS)，0.05％吐温20和0.5％牛血清白蛋白(洗涤缓冲液)中稀释1∶1000。然后加入¹²⁵I标记的尿IL-18BP(10⁶cpm)，在1小时后，加入蛋白质G-琼脂糖(20微升)。将混合物悬浮(1.5小时，4℃)，然后分离小珠，在3×洗涤缓冲液中洗涤，再次利用PBS洗涤。然后利用样品缓冲液洗脱小珠，通过SDS-PAGE分辨(10％丙烯酰胺，在还原条件下，接着放射自显影)。

在还原条件下和非还原条件下利用银染，IL-18BP跑成单一的带，并且具有如尿IL-18BP相同表观分子量(数据未显示)。这一制剂的蛋白质序列分析表明如尿IL-18BP相同的N末端的序列，表明后者不在N末端降解。

利用抗尿IL-18BP的抗体免疫影印分析IL-18BPa表明与尿蛋白质具有相同的分子量。另外，利用免疫沉淀，接着SDS-PAGE和放射自显影，IL-18BPa能够替代尿¹²⁵I-IL-18BP结合抗体。所以，IL-18BPa在结构上对应于尿IL-18BP。

测试粗和纯化的IL-18BPa抑制IL-18的生物活性的能力。IL-18BPa以依赖剂量的方式抑制IFN-γ在小鼠脾细胞，PBMC和人KG-1细胞系中诱导人和小鼠IL-18的活性(图9)。

各种生物测试以及迁移变换测试的结果(实施例8)证实抑制IL-18活性的是克隆的IL-18BP，不是尿IL-18BP的任何附带不纯物质，如共洗脱的防卫素片断的内在特性。

实施例8：电泳迁移变换测试

同时研究了尿和重组IL-18BP对在人KG-1细胞中IL-18诱导的NF-κB的活性的影响。利用huIL-18(10纳克/毫升)或与IL-18BP预混合的huIL-18刺激人KG-1细胞(4×10⁶，在1毫升RMPI中)(20分钟，室温)。在37℃20分钟后，利用冰冷的PBS洗涤三次，立即在液氮中冷冻。将细胞碎片再悬浮在缓冲液A[20毫摩尔/升Tris pH7.6，0.4摩尔/升NaCl，0.2毫摩尔/升EDTA，甘油(20％体积)，1.5毫摩尔/升MgCl₂，2毫摩尔/升二硫苏糖醇(DTT)，0.4毫摩尔/升PMSF，1毫摩尔/升Na₃VO₄，2微克/毫升每种亮抑酶肽，抑胃酶肽，和抑酶肽]中的3倍紧密细胞体积中。通过离心除去细胞碎片(15,000×g，15分钟)。在液氮中冷冻上清液的等分试样，并且储藏在-80℃。利用小牛血清白蛋白作为标准通过Bradford测试(Bio-Rad)确定蛋白质浓度。利用[³²P]dCTP(300居里/毫摩尔)和T4聚核苷酸激酶(新英格兰实验室)标记对应于NF-κB结合元素的双链寡核苷酸(10皮摩尔，普鲁美格)。通过旋转柱除去游离的核苷酸。将利用IL-18或IL-18+IL-18BP处理的细胞的提取物(10微克蛋白质)与标记探针(3×10⁴cpm)以及聚dl.dC(500纳克，Pharmacia)一起温育(15分钟，室温)并且在20微升含有HEPES(pH7.5，10毫摩尔/升)，60毫摩尔/升KCl，1毫摩尔/升MgCl₂，2毫摩尔/升EDTA，1毫摩尔/升DTT和甘油(5％体积)的缓冲液中变性鲑精DNA(100纳克，西格玛)。然后，在5％非变性聚丙烯酰胺凝胶上加载混合物。在185V，在0.5×TBE(40毫摩尔/升Tris HCl，45毫摩尔/升硼酸，和2.5毫摩尔/升EDTA)中进行电泳。真空干燥凝胶并且在-80℃过夜放射自显影。发现IL-18诱导p50-NF-κB同源二聚体和p65/p50NF-κB异源二聚体的形成。正如利用结合对应于NF-κB同感序列的放射性标记的寡核苷酸的KG-1细胞提取物的电泳迁移变换测试确定的，尿以及重组IL-18BP通过IL-18抑制NF-κB的活化。

实施例9：在大肠杆菌，酵母和昆虫细胞中表达IL-18BP

通过其它重组细胞如原核生物细胞例如大肠杆菌或其它真核生物细胞如酵母和昆虫细胞也可以产生IL-18BP。构建适当的携带编码IL-18BP的DNA和适于转化大肠杆菌和酵母细胞或感染昆虫细胞的载体以便产生重组IL-18BP的已知方法是可得的。为了在酵母细胞中表达，切出编码IL-18BP的DNA(实施例6)并且插入适于转染酵母细胞的表达载体。为了在昆虫细胞中表达，将编码IL-18BP的DNA插入杆状病毒，并且利用所述的重组杆状病毒感染昆虫细胞。为了在大肠杆菌中表达，将编码IL-18BP的DNA利用适当的寡核苷酸进行定位诱变，以致将起始的ATG密码子刚刚插入在成熟的IL-18BP的第一个密码子之前。可替代地，通过PCR，利用适当的有意义和反义引物可以制备这样的DNA。然后，将得到的cDNA构建体通过本领域公知的技术插入在适当构建的原核表达载体(23)。

实施例10：构建体内表达IL-18BPa的腺结合表达载体

根据质粒pcDNA3构建编码IL-18BPa的功能基因(InVitrogen，圣迭戈，CA)。将在5’末端含有Kozak同感序列的IL-18BP cDNA以破坏限制位点的方式连接进入pcDNA3的XbaI位点。在新霉素盒(原始pcDNA3序列的碱基2151)之前和在SV40多聚腺苷酸化信号(原始pcDNA3序列的域基3372)之后，通过定位诱变插入新的XbaI位点。然后利用XbaI裂解构建体，并且将得到的4.7kb小基因如上所述插入在质粒psub201的XbaI位点(Snyder等人，1996，人遗传学中的当前方案，12.1.1～12.1.17章，John Wiley和Sons)。利用辅助AAV质粒pAAV/Ad将得到的重组质粒共转染进入人T293细胞。然后，利用腺病毒作为辅助病毒感染培养物，在温育48～60小时后收集细胞。将细胞进行3个冷冻-解冻循环，通过离心除去细胞碎片，利用硫酸铵将上清液饱和33％。然后离心混合物，通过将硫酸铵饱和50％从上清液中沉淀rAAV。通过CsCl进一步纯化该病毒，在56℃最后加热15分钟以便破坏任何腺病毒。

实施例11：构建IL-18BP的重组融合蛋白质

如下可以进行含有与IgG2重链的恒定区融合的IL-18BP的蛋白质的生产：利用适当的寡核苷酸将IL-18BP的DNA进行定位诱变，以致在编码序列之前和之后立即导入独特的限制位点。将含有IgG2重链的恒定区的质粒，例如pRKCO42FcI(6)进行相同的定位诱变以便在尽可能接近IgG1重链的Asp 216处以允许在融合蛋白质的时期中翻译的方式导入相同的独特位点。通过在独特的限制位点消化，或可替代地通过利用适当设计的引物的PCR可以制备含有5’非翻译序列和编码IL-18BP的dsDNA片断。相似地消化突变的pRKCD42Fc1产生含有质粒和IgG1序列的大片断。然后，将两个片断连接产生编码含有IL-18BP和IgG重链的约227个C末端氨基酸(铰链区和CH2和CH3区)的多肽的前体的新质粒。可以利用适当的限制酶通过消化从质粒中分离编码融合蛋白质的DNA，然后插入有效的原核或真核表达载体。

实施例12：生产化学修饰的IL-18BP

为了增强质粒中IL-18BP的半衰期，可以制造利用聚乙二醇(PEG)化学修饰的IL-18BP。通过将PEG与IL-18BP分子的半胱氨酸残基交联可以进行修饰。可以构建含有IL-18BP的氨基末端的外半胱氨酸残基，糖基化位点，羧基末端的突变体IL-18BP。通过利用含有需要的突变的寡核苷酸的PCR可以进行诱变。以本领域公知的常用方法表达这些突变蛋白质。将进行这些蛋白质的Pegylation并且将评估活性。

实施例13：制备抗IL-18BP的多克隆抗体

利用在完全Freund佐剂中乳化的5微克尿IL-18BP的纯净制剂皮下开始皮下注射兔。3星期后，利用5微克在不完全Freund佐剂中的IL-18BP制剂皮下再次注射它们。在10天的间隔给予另外两次注射正如在PBS中的溶液的IL-18BP。在最后免疫后10天取兔血。在发展抗体水平后进行放射免疫测试。将¹²⁵I-标记的IL-18BP(166,000cpm)与各种稀释度(1∶50，1∶500，1∶5,000和1∶50,000)的兔血清混合。在总体积200微升中加入蛋白质-G琼脂糖小珠的悬浮液(20微升，Pharmacia)。在室温保留混合物1小时，然后洗涤小珠三次，计数结合的放射活性。将人Ieptin的兔抗血清用作阴性对照。IL-18R的抗血清的效价是在1∶500和1∶5,000之间，而阴性对照的效价小于1∶50。

实施例14：制备IL-18BP的单克隆抗体

首先利用在完全Freund佐剂的乳液中的2微克纯化的IL-18BP注射雌性Balb/C小鼠(3个月大)，并且3个星期后，在不完全Freund佐剂中皮下注射。在10天的间隔，在PBS中皮下给予另外三次注射。在融合之前4和3天给予正如IRIA(参见如下)确定的显示最高结合效价的小鼠腹膜内最后加强免疫。利用NSO/1黑色素瘤细胞系和作为融合参与者的从动物的脾和淋巴结制备的淋巴细胞进行融合。在微培养平板中分配融合细胞，在补充HAT和15％马血清的DMEM中选择杂交瘤。将发现产生IL-18BP的抗体的杂交瘤通过限制稀释亚克隆，并且注射进入已经利用降植烷引导产生腹水的Balb/C小鼠。利用市场可得的ELISA试剂盒确定抗体的同型(Amersham，英国)。

如下进行产生抗IL-18BP的单克隆抗体的杂交瘤的筛选：通过反向固相放射性免疫测试(IRIA)测试杂交瘤上清液中抗IL-18BP抗体的存在。利用Talon-纯化的IL-18BPa-His₆(10微克/毫升，100微升/孔)包衣ELISA平板(Dynatech实验室，Alexandria，VA)。在4℃温育过夜后，利用含有BSA(0.5％)和吐温20(0.05％)的PBS洗涤平板两次，在洗涤溶液中在37℃封闭至少2小时。加入杂交瘤培养上清液(100微升/孔)并且在37℃温育平板4小时。洗涤平板三次，在室温下在2小时加入山羊抗小鼠辣根过氧化物酶共轭物(HRP，Jackson实验室，1∶10,000，100微升/孔)。洗涤平板四次，通过作为底物的含有H₂O₂的ABTS[2’，2’-连氮基-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸，西格玛)]展色。通过自动ELISA读数器对平板读数。认为至少比阴性对照的值高5倍的读数的样品是阳性的。

实施例15：利用单克隆抗体亲和层析IL-18BP

通过亲和层析将抗IL-18BP的抗体用于IL-18BP的纯化。在50％饱和度沉淀硫酸铵，接着对PBS扩展透析纯化杂交瘤分泌的含有单克隆抗体的腹水液体。正如制造商特指的，将约10毫克免疫球蛋白结合于1毫升亲和凝胶10(BioRad USA)。

在4℃，流速0.25毫升/分钟在0.5毫升抗IL-18BP抗体柱上加载250毫升人尿蛋白质(相当于250升粗尿)。利用PBS洗涤柱直到在洗液中检测不到蛋白质。利用25毫摩尔/升柠檬酸缓冲液，pH2.2(8×1柱体积部分)洗脱IL-18BP，通过1摩尔/升Na₂CO₃立即中和。通过大小排除层析获得这一制剂的进一步的纯化。

实施例16：ELISA测试

利用抗IL-18BP单克隆抗体(无血清杂交瘤上清液或腹水免疫球蛋白)在4℃过夜包衣微滴平板(Dynatech或Maxisorb，Nunc)。利用含有BSA(0.5％)和吐温20(0.05％)的PBS洗涤平板，在37℃在同样的溶液中至少封闭2小时。在封闭溶液中稀释测试样品，在37℃加入孔中(100微升/孔)4小时。然后，利用含有吐温20(0.05％)的PBS洗涤平板三次，接着加入兔抗IL-18BP血清(1∶1,000，100微升/孔)在4℃进一步温育过夜。洗涤平板三次，并且在室温，在2小时加入山羊抗兔辣根过氧化物酶的共轭物(HRP，Jackson实验室，1∶10,000，100微升/孔)。洗涤平板四次，通过含有H₂O₂的作为底物的ABTS[2’，2’-连氮基-双(3-乙基苯噻唑-6磺酸，西格玛)]展色。通过自动ELISA读数器对平板读数。

实施例17：非糖基化人IL-18BP是具有生物活性的

测试纯化的重组IL-18BPa的抑制IL-18的生物活性的能力。IL-18BPa以依赖于剂量的方式抑制在小鼠脾细胞，PBMC和人KG-1细胞系中IFN-γ诱导人和小鼠IL-18的活性。

将在C末端具有His₆标记的纯化IL-18BPa(1.5微克，50微升)的pH调节到7.5，并且与N糖苷酶F(3微升，500,000单位/毫升，PNGase F，新英格兰实验室)混合。在37℃，在非变性条件下温育混合物24小时。通过在非还原条件下，SDS-PAGE，接着利用IL-18BP的抗体免疫影印分析来自样品和来自未消化IL-18BP-His₆的等分试样。发现IL-18BP-His₆的约40千道尔顿的带在PNGase处理的组份中消失，获得了新的约20千道尔顿的带。PNGase F的产物的分子量和特异性表明IL-18BP-His₆完全糖基化。

在Talon小珠上分别吸收缓冲液中的PNGase处理的组份，未消化的IL-18BP-His₆和含有PNGase的对照样品，利用磷酸缓冲液洗涤，利用咪唑(100毫摩尔/升)洗脱。利用人IL-18(20纳克/毫升)，LPS(2微克/毫升)和小鼠脾细胞将洗脱组份进行生物测试。在下面的表中显示了结果：

样品	IFN-γng/ml(纳克/毫升)
		对照	7.5
非消化IL-18BP-His6	0
		PNGase处理的IL-18BP-His6	0

所以，结论是糖基化的IL-18BP作为IL-18活性的调节物是具有生物活性的。

前面的特异实施例的叙述表明本发明的一般特性，以致通过应用当前的知识，其它人可以容易地修饰和/或采用各种应用，如不脱离一般概念的特异实施例，并且，这样的采用过程和修饰应该可理解为在本实施例的等当实施例的一样和范围内。需要理解的是本发明利用的表达方式或术语是用于叙述而不是限制。

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                           序列表

<110>Novick，Daniela

     Dinarello，Charles

     Rubinstein，Menachem

     Kim，Soo Hyun

     Yeda研究和开发有限公司

<120>白细胞介素-18结合蛋白及其制备和用途

     Use

<130>IL-18 Rubinstein

<140>

<141>

<150>125463

<151>1998-07-22

<150>122134

<151>1997-11-06

<150>121869

<151>1997-09-29

<150>121639

<151>1997-08-27

<150>121554

<151>1997-08-14

<160>10

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>1348

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

gagaagagga cgttgtcaca gataaagagc caggctcacc agctcctgac gcatgcatca 60

tgaccatgag acacaactgg acaccagacc tcagcccttt gtgggtcctg ctcctgtgtg 120

cccacgtcgt cactctcctg gtcagagcca cacctgtctc gcagaccacc acagctgcca 180

ctgcctcagt tagaagcaca aaggacccct gcccctccca gcccccagtg ttcccagcag 240

ctaagcagtg tccagcattg gaagtgacct ggccagaggt ggaagtgcca ctgaatggaa 300

cgctgagctt atcctgtgtg gcctgcagcc gcttccccaa cttcagcatc ctctactggc 360

tgggcaatgg ttccttcatt gagcacctcc caggccgact gtgggagggg agcaccagcc 420

gggaacgtgg gagcacaggt acgcagctgt gcaaggcctt ggtgctggag cagctgaccc 480

ctgccctgca cagcaccaac ttctcctgtg tgctcgtgga ccctgaacag gttgtccagc 540

gtcacgtcgt cctggcccag ctctgggctg ggctgagggc aaccttgccc cccacccaag 600

aagccctgcc ctccagccac agcagtccac agcagcaggg ttaagactca gcacagggcc 660

agcagcagca caaccttgac cagagcttgg gtcctacctg tctacctgga gtgaacagtc 720

cctgactgcc tgtaggctgc gtggatgcgc aacacacccc ctccttctct gctttgggtc 780

ccttctctca ccaaattcaa actccattcc cacctaccta gaaaatcaca gcctccttat 840

aatgcctcct cctcctgcca ttctctctcc acctatccat tagccttcct aacgtcctac 900

tcctcacact gctctactgc tcagaaacca ccaagactgt tgatgcctta gccttgcact 960

ccagggccct acctgcattt cccacatgac tttctggaag cctcccaact attcttgctt 1020

ttcccagaca gctcccactc ccatgtctct gctcatttag tcccgtcttc ctcaccgccc 1080

cagcagggga acgctcaagc ctggttgaaa tgctgcctct tcagtgaagt catcctcttt 1140

cagctctggc cgcattctgc agacttccta tcttcgtgct gtatgttttt tttttccccc 1200

ttcactctaa tggactgttc cagggaaggg atgggggcac cagctgcttc ggatccacac 1260

tgtatctgtg tcatccccac atgggtcctc ataaaggatt attcaatgga aaaaaaaaaa 1320

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa                                    1348

<210>2

<211>192

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>信号

<222>(1)..(28)

<400>2

Met Arg His Asn Trp Thr Pro Asp Leu Ser Pro Leu Trp Val Leu Leu

  1               5                  10                  15

Leu Cys Ala His Val Val Thr Leu Leu Val Arg Ala Thr Pro Val Ser

             20                  25                  30

Gln Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ser Val Arg Ser Thr Lys Asp Pro

         35                  40                  45

Cys Pro Ser Gln Pro Pro Val Phe Pro Ala Ala Lys Gln Cys Pro Ala

     50                  55                  60

Leu Glu Val Thr Trp Pro Glu Val Glu Val Pro Leu Asn Gly Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Ser Leu Ser Cys Val Ala Cys Ser Arg Phe Pro Asn Phe Ser Ile Leu

                 85                  90                  95

Tyr Trp Leu Gly Asn Gly Ser Phe Ile Glu His Leu Pro Gly Arg Leu

            100                 105                 110

Trp Glu Gly Ser Thr Ser Arg Glu Arg Gly Ser Thr Gly Thr Gln Leu

        115                 120                 125

Cys Lys Ala Leu Val Leu Glu Gln Leu Thr Pro Ala Leu His Ser Thr

    130                 135                 140

Asn Phe Ser Cys Val Leu Val Asp Pro Glu Gln Val Val Gln Arg His

145                 150                 155                 160

Val Val Leu Ala Gln Leu Trp Ala Gly Leu Arg Ala Thr Leu Pro Pro

                165                 170                 175

Thr Gln Glu Ala Leu Pro Ser Ser His Ser Ser Pro Gln Gln Gln Gly

            180                 185                 190

<210>3

<211>1038

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

gagaagagga cgttgtcaca gataaagagc caggctcacc agctcctgac gcatgcatca 60

tgaccatgag acacaactgg acaccagacc tcagcccttt gtgggtcctg ctcctgtgtg 120

cccacgtcgt cactctcctg gtcagagcca cacctgtctc gcagaccacc acagctgcca 180

ctgcctcagt tagaagcaca aaggacccct gcccctccca gcccccagtg ttcccagcag 240

ctaagcagtg tccagcattg gaagtgacct ggccagaggt ggaagtgcca ctgagctggg 300

ctgagggcaa ccttgccccc cacccaagaa gccctgccct ccagccacag cagtccacag 360

cagcagggtt aagactcagc acagggccag cagcagcaca accttgacca gagcttgggt 420

cctacctgtc tacctggagt gaacagtccc tgactgcctg taggctgcgt ggatgcgcaa 480

cacaccccct ccttctctgc tttgggtccc ttctctcacc aaattcaaac tccattccca 540

cctacctaga aaatcacagc ctccttataa tgcctcctcc tcctgccatt ctctctccac 600

ctatccatta gccttcctaa cgtcctactc ctcacactgc tctactgctc agaaaccacc 660

aagactgttg atgccttagc cttgcactcc agggccctac ctgcatttcc cacatgactt 720

tctggaagcc tcccaactat tcttgctttt cccagacagc tcccactccc atgtctctgc 780

tcatttagtc ccgtcttcct caccgcccca gcaggggaac gctcaagcct ggttgaaatg 840

ctgcctcttc agtgaagtca tcctctttca gctctggccg cattctgcag acttcctatc 900

ttcgtgctgt atgttttttt tttccccctt cactctaatg gactgttcca gggaagggat 960

gggggcacca gctgcttcgg atccacactg tatctgtgtc atccccacat gggtcctcat 1020

aaaggattat tcaatgga                                               1038

<210>4

<211>113

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>信号

<222>(1)..(28)

<400>4

Met Arg His Asn Trp Thr Pro Asp Leu Ser Pro Leu Trp Val Leu Leu

  1               5                  10                  15

Leu Cys Ala His Val Val Thr Leu Leu Val Arg Ala Thr Pro Val Ser

             20                  25                  30

Gln Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ser Val Arg Ser Thr Lys Asp Pro

         35                  40                  45

Cys Pro Ser Gln Pro Pro Val Phe Pro Ala Ala Lys Gln Cys Pro Ala

     50                  55                  60

Leu Glu Val Thr Trp Pro Glu Val Glu Val Pro Leu Ser Trp Ala Glu

 65                  70                  75                  80

Gly Asn Leu Ala Pro His Pro Arg Ser Pro Ala Leu Gln Pro Gln Gln

                 85                  90                  95

Ser Thr Ala Ala Gly Leu Arg Leu Ser Thr Gly Pro Ala Ala Ala Gln

            100                 105                 110

Pro

<210>5

<211>7063

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>5

gaattcgcgg ccgcgtcgac gccagagggg ctaggatgag agacagaggg tgtgatggtg 60

ggtgctggga aatgtacccg accttggggc tggtggctgg gggagtgggt agcctgggaa 120

aggccaggat gtggacggac tggtatggca ttgagcctga agtggtccaa cttggggttc 180

cccagtgcct aggaaagttg tccccttgaa tgtcagtgtg aaggtgaagg aggaagcaga 240

tgcctgttca tatggaaaca aagacctggc tgtgaagagg ggaggcggac accaaagtcc 300

tgacacttgg gcgggacaga attgatctgt gagagactca tctagttcat accctaggtg 360

accctggggg tggcatgggg gtagattaga gatcccagtc tggtatcctc tggagagtag 420

gagtcccagg agctgaaggt ttctggccac tgaactttgg ctaaagcaga ggtgtcacag 480

ctgctcaaga ttccctggtt aaaaagtgaa agtgaaatag agggtcgggg cagtgctttc 540

ccagaaggat tgctcggcat cctgcccttc ccagaagcag ctctggtgct gaagagagca 600

ctgcctccct gtgtgactgg gtgagtccat attctctctt tgggtctcaa ttttgccttc 660

cctaatgaag gggtaagatt ggactaggta agcatcttac aaccatttgt ggtcatgaga 720

gctggggtgg ggaaggattg tcacttgacc cccccagctc tgtttctaag tgctgaaaga 780

gctccaggct atgctacggg aggagaagcc agctactgag gaaaagccag ctactgagaa 840

aaagcgggag tggtttacca ttctcctccc ccacctttca ccagagaaga ggacgttgtc 900

acacataaag agccaggctc accagctcct gacgcatgca tcatgaccat gagacacaac 960

tggacaccag acctcagccc tttgtgggtc ctgctcctgt gtgcccacgt cgtcactctc 1020

ctggtcagag ccacacctgt ctcgcagacc accacagctg ccactgcctc agttagaagc 1080

acaaaggacc cctgcccctc ccagccccca gtgttcccag cagctaagca gtgtccagca 1140

ttggaagtga cctggccaga ggtggaagtg ccactgaatg gaacgctgag cttatcctgt 1200

gtggcctgca gccgcttccc caacttcagc atcctctact ggctgggcaa tggttccttc 1260

attgagcacc tcccaggccg actgtgggag gggagcacca gccgggaacg tgggagcaca 1320

ggtacgcagc tgtgcaaggc cttggtgctg gagcagctga cccctgccct gcacagcacc 1380

aacttctcct gtgtgctcgt ggaccctgaa caggttgtcc agcgtcacgt cgtcctggcc 1440

cagctctggg tgaggagccc aaggagaggc ctccaggaac aggaggagct ctgcttccat 1500

atgtggggag gaaagggtgg gctctgccag agcagcctgt gaactaatgc ccagcattcc 1560

tcaaggtcag ccagacaaaa aggaacttag gtcttgggca gaggaggtgt agcctggggc 1620

aaagtgatga gatgtccctc ctttccttgg cctgatcctt gtctgccttc acttccctag 1680

gctgggctga gggcaacctt gccccccacc caagaagccc tgccctccag ccacagcagt 1740

ccacagcagc agggttaaga ctcagcacag ggccagcagc agcacaacct tgaccagagc 1800

ttgggtccta cctgtctacc tggagtgaac agtccctgac tgcctgtagg ctgcgtggat 1860

gcgcaacaca ccccctcctt ctctgctttg ggtcccttct ctcaccaaat tcaaactcca 1920

ttcccaccta cctagaaaat cacagcctcc ttataatgcc tcctcctcct gccattctct 1980

ctccacctat ccattagcct tcctaacgtc ctactcctca cactgctcta ctgctcagaa 2040

accaccaaga ctgttgatgc cttagccttg cactccaggg ccctacctgc atttcccaca 2100

tgactttctg gaagcctccc aactattctt gcttttccca gacagctccc actcccatgt 2160

ctctgctcat ttagtcccgt cttcctcacc gccccagcag gggaacgctc aagcctggtt 2220

gaaatgctgc ctcttcagtg aagtcatcct ctttcagctc tggccgcatt ctgcagactt 2280

cctatcttcg tgctgtatgt tttttttttc ccccttcact ctaatggact gttccaggga 2340

agggatgggg gcagcagctg cttcggatcc acactgtatc tgtgtcatcc ccacatgggt 2400

cctcataaag gattattcaa tggaggcatc ctgacatctg ttcatttagg cttcagttcc 2460

actcccagga actttgcctg tcccacgagg gagtatggga gagatggact gccacacaga 2520

agctgaagac aacacctgct tcaggggaac acaggcgctt gaaaaagaaa agagagaaca 2580

gcccataatg ctccccggga gcagaggcca ctaatggaga gtgggaagag cctggaaaga 2640

tgtggcctca ggaaaaggga tgagagaaag gaggtggtat ggaagactca gcaggaacaa 2700

ggtaggcttc aaagagccta tattcctctt tttcccacac cgatcaagtc aactcagtac 2760

tcacgggaga aaaatagact ttatttacaa gtaataacat ttagaaaaga tccatccccg 2820

gcccttaaaa accttcccat cactccaaat cccaccccag tgcaagtctg gggaaggtag 2880

ggtgtgagct gctgctgaag gctgtccccc aaccccactc ctgagacaca gggcccatcc 2940

gtcctgggaa agagcatcct ctggcaggtg ctcccaccag gtcagaccca gtcctggact 3000

tcaagagtga gggcccctgc tgggcccagc caccaggaca gcaggaacca gggcctactc 3060

ctcttatggt cccttctaga tccagaggct aagaggaaga ctggccaggc ccaaggaccc 3120

agccatcaaa accagcctca aatctggttg tgatggagaa gtgactttgc tttaagaaaa 3180

aaggaggcaa ggtagggaga gcgcccacac tgtccatgct ccaggccccc tgggccagct 3240

ccgagaaggc gccagtgaag gaccagggac caggccaggg tgcgggcagg catcactgtc 3300

tctaggggtt tggctactgt tggcctggga gctgagagaa ggcactgaga gggacagtag 3360

gcggaggacc aggtgacggc agcatcgggg acacaggtgg ggccactcac tggtactggc 3420

cctttagtgc tttgcctgaa agagacacag tcacatggcc agatgagaac ttgcgatact 3480

agcctgcacc cactggctgg gaagatctct tcctgctccc acgcccctgt ctggatcccc 3540

tcccttgtga gccccagggt tatcagttgc tggctgtgcc tgagcagctc tgggtgctct 3600

ccatgagaat ggggccatct gtcttctctc cttggagagg agctaccagg acagggacac 3660

ctcttacccc acaccctcca gcagcctggc gtggccccat cttggatgct acttggtggg 3720

gcggtctggg gggtgcccat gctctcatcg ggtttccctc ccccatcctg ccagtgcctc 3780

taccttgccc ttggctcgag gggtggcacc aatggcggca gcagtggcgg cgctggctgt 3840

ggtggtggca atgcgcggag aacggcgggt tccactgcga gtgttggggg aagccttgga 3900

cagggccttc tttgaggctc cccgccgcag aaggctgttc cctagcttct tgggtgtgtt 3960

gaggatgctg aaggccatcg actggcgccg gtcagcctgc aaggaagggc tgtcagaccg 4020

ggagacccaa tgctgccttc ccaggccagc gtgctgtgcc acgctgtacc agcaaggtcc 4080

cgccagggcg tcgcttcatc ccccttcagc cccagcctca cctgtttagt agaagctgga 4140

gctgctttct tctgggcctc agtagtgctc tgtttgcgcc cttcatgtcg gtctcgggga 4200

gtcatggggc gtgggaaaca gctggtggcc ttcttagact atggagaaga ggacagttag 4260

gcagacagta gcaagaggag tcacatctga agccaggtgt cttgtcctct cagagctgag 4320

tggaccttgt aagtcaacgt gcaacctgct ccccttccca actctgggcc agatccttcc 4380

cttcccaaca gttcccatcc atgggtcagg cccttggaga gagggaaaga gagggggaag 4440

tgagggaagg agagagaagg ctccctttag tccttggtga gctgggcctg acctgagcac 4500

agtgctggag taacacccag gagccaccgc gcctacctca ggagttccag ggccctggtg 4560

gggctctagg gagacccgtt tgcgctgctg ccgggtggtg atgccagtgc cctcggctat 4620

ctggattggc tgcatgctgg ctcggcgcag ggtctcttgg gggtctccag ttttcatctc 4680

ctcatctgtg atggtgccca ggctcaggga aggctgcatg ggtggaagag gtggtcagtg 4740

gaccatagct gtatggagat ggaggaggac ctggggctgt tccagaactc tacactcgcc 4800

cgacacttat ggtcgggacc cttcctgcct acgaggtaga aagacacaag cctcctttcc 4860

tgttctgctt tctacctaag ccctgggcaa atggcacaag cagtgcagtc ctgaccagat 4920

tcctctctga gctcctgcct acccccaggg acttcacccc tgagtgccct ccagctgtct 4980

gttccacctg gaacatgaga aggtcacccc ttcccctctt cggccagtca gtgatccagg 5040

gccctagtgc tcaggctaga tcagcaggtg ggattccaag gaagggcagg gatgggaggc 5100

cctgcacagt gaccccaggc ctcaccctgg actccaggga tagcaggtct tcagatgtgg 5160

ggggcacact cgattgcgct gctgcagctc tgcaatgcgg ttccagtcat ccagctgctc 5220

aggctcatcc tggcaagtgc ccatgtagaa gctgttcctt cctgtggaag gcagggaagt 5280

gggaacaaat gagcctggag tcggcaggtc acctcctggc cctggcatct tgccagcctt 5340

tgctgccacc taccccataa acttgaagcc cggcacacca gtctgattca gtgccgcagg 5400

tgcaggagta cggcacacag actatttcta tcctaggggc ttgctcacca ccttctccct 5460

ggagagggca gaagaggtca cacgcagaga ctgctactac atcttattca cctgccaagg 5520

cttggtggcc aacacccaga ggaacaaatt aaggaccggg aattaattcc caggggctcc 5580

ctggtgccca aaggacaaga gcttccaaga agagtctggc cagcctggcc tttccagcag 5640

cccatcaccg cctgagaagg gcatggagga ctccccacag ctaagtgtca caattgtgct 5700

gggaatcccg ggcccttaac tctggctaag agtgccccca acacagccag cccctagatg 5760

ggcaggtaag gaaggccctg aggctgcagg aaggaggggc aggtggagct ggatggtagc 5820

aaggaggcca gccttggatt tttaaaaagc tttcctcttt tccctgtgcc acgatccacc 5880

ttccagtcta attttggggt atagtaagtc cctgtagtcc cctcacctgg aggggcccca 5940

ctggacaccc cggcctggga acgacgagca gaactgcgag tggtggggcg gtagccaggc 6000

aagctgagca gggctgagtt gccataatcg ggagaaccca ggcgagctag agactgagta 6060

gaggaggtgg ctcgcaggct agcctgggaa gcaggagcag accgcgtgct gtagaacgat 6120

gagttggcgc tgtctggctc ttccacatct agcttctgga agacagagtg aatctgttgc 6180

agtgtacagt ccctggcact gtacagaagc ttcccattcc cttccgaagc cctcagatcc 6240

cacggcacat ccatgtattc ccaactgctt tgcaaaggtc cttaaagtgt gtgtctgcaa 6300

gaaatgggcc ttgtcgacag aagccctcac aaggtggtgc tgatgttgtc aagactcttc 6360

tacgcatttt tttcatggag tctattcata atgctttgag gtagggaatg cagagtgttt 6420

atcggcccat tttggagatg aagtgcaaag aaataaagtg actagcccca aatcacactg 6480

ctaggaagta tcagagctgg ggctaggccc catgtctcct gactagtcag gctcatccca 6540

cagcctctgc tgtccctcag tccaaacttc cagggccctt accatgttcc agaacttccc 6600

ccaacttctt ggtagcaggg ggcaccctaa acacacaggt cccccctgct gtaccagggg 6660

ccccctctcc cctcctccca aacctcccct tcaagatgtg gaaacaaagg caagggcctg 6720

cagcctgtca ggcagtccac tgggcagcaa caatgcctct cagctgcatg gggcatgctg 6780

ggaggcacag gatgggctgc agcttcgcca cgttctctcc cttcaccctg cacaggctca 6840

gtgctacgca tggagagaat gctagcctta gtcaggaggc agggatctaa tcctagccct 6900

gcctttttct tcagaagtgc ccttaaccaa gtcactgccc tttttaagac ctctcagctt 6960

tcccactgta acatggactg gctgctcatc cctccctgct cctgactgag tgcccagtgc 7020

aaagatgccc ttgagaggaa gtgggaattg ctgacctgtc gac                   7063

<210>6

<211>197

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>信号

<222>(1)..(28)

<400>6

Met Arg His Asn Trp Thr Pro Asp Leu Ser Pro Leu Trp Val Leu Leu

  1               5                  10                  15

Leu Cys Ala His Val Val Thr Leu Leu Val Arg Ala Thr Pro Val Ser

             20                  25                  30

Gln Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ser Val Arg Ser Thr Lys Asp Pro

         35                  40                  45

Cys Pro Ser Gln Pro Pro Val Phe Pro Ala Ala Lys Gln Cys Pro Ala

     50                  55                  60

Leu Glu Val Thr Trp Pro Glu Val Glu Val Pro Leu Asn Gly Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Ser Leu Ser Cys Val Ala Cys Ser Arg Phe Pro Asn Phe Ser Ile Leu

                 85                  90                  95

Tyr Trp Leu Gly Asn Gly Ser Phe Ile Glu His Leu Pro Gly Arg Leu

            100                 105                 110

Trp Glu Gly Ser Thr Ser Arg Glu Arg Gly Ser Thr Gly Thr Gln Leu

        115                 120                 125

Cys Lys Ala Leu Val Leu Glu Gln Leu Thr Pro Ala Leu His Ser Thr

    130                 135                 140

Asn Phe Ser Cys Val Leu Val Asp Pro Glu Gln Val Val Gln Arg His

145                 150                 155                 160

Val Val Leu Ala Gln Leu Trp Val Arg Ser Pro Arg Arg Gly Leu Gln

                165                 170                 175

Glu Gln Glu Glu Leu Cys Phe His Met Trp Gly Gly Lys Gly Gly Leu

            180                 185                 190

Cys Gln Ser Ser Leu

        195

<210>7

<211>1360

<212>DNA

<2l3>Homo sapiens

<400>7

gcggccgcgt cgaccacgca gctaaacaca gctaacttga gtcttggagc tcctaaaggg 60

aagcttctgg aaaggaaggc tcttcaggac ctcttaggag ccaaagaaga ggacgttgtc 120

acagataaag agccaggctc accagctcct gacgcatgca tcatgaccat gagacacaac 180

tggacaccag acctcagccc tttgtgggtc ctgctcctgt gtgcccacgt cgtcactctc 240

ctggtcagag ccacacctgt ctcgcagacc accacagctg ccactgcctc agttagaagc 300

acaaaggacc cctgcccctc ccagccccca gtgttcccag cagctaagca gtgtccagca 360

ttggaagtga cctggccaga ggtggaagtg ccactgaatg gaacgctgag cttatcctgt 420

gtggcctgca gccgcttccc caacttcagc atcctctact ggctgggcaa tggttccttc 480

attgagcacc tcccaggccg actgtgggag gggagcacca gccgggaacg tgggagcaca 540

ggctgggctg agggcaacct tgccccccac ccaagaagcc ctgccctcca gccacagcag 600

tccacagcag cagggttaag actcagcaca gggccagcag cagcacaacc ttgaccagag 660

cttgggtcct acctgtctac ctggagtgaa cagtccctga ctgcctgtag gctgcgtgga 720

tgcgcaacac accccctcct tctctgcttt gggtcccttc tctcaccaaa ttcaaactcc 780

attcccacct acctagaaaa tcacagcctc cttataatgc ctcctcctcc tgccattctc 840

tctccaccta tccattagcc ttcctaacgt cctactcctc acactgctct actgctcaga 900

aaccaccaag actgttgatg ccttagcctt gcactccagg gccctacctg catttcccac 960

atgactttct ggaagcctcc caactattct tgcttttccc agacagctcc cactcccatg 1020

tctctgctca tttagtcccg tcttcctcac cgccccagca ggggaacgct caagcctggt 1080

tgaaatgctg cctcttcagt gaagtcatcc tctttcagct ctggccgcat tctgcagact 1140

tcctatcttc gtgctgtatg tttttttttt cccccttcac tctaatggac tgttccaggg 1200

aagggatggg ggcagcagct gcttcggatc cacactgtat ctgtgtcatc cccacatggg 1260

tcctcataaa ggattattca atggaggcat cctgacatct gtccatttag gcttcagttc 1320

cactcccagg aactttgcct gtcccacgag ggagtatggg                       1360

<210>8

<211>161

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>信号

<222>(1)..(28)

<400>8

Met Arg His Asn Trp Thr Pro Asp Leu Ser Pro Leu Trp Val Leu Leu

  1               5                  10                  15

Leu Cys Ala His Val Val Thr Leu Leu Val Arg Ala Thr Pro Val Ser

             20                  25                  30

Gln Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ser Val Arg Ser Thr Lys Asp Pro

         35                  40                  45

Cys Pro Ser Gln Pro Pro Val Phe Pro Ala Ala Lys Gln Cys Pro Ala

     50                  55                  60

Leu Glu Val Thr Trp Pro Glu Val Glu Val Pro Leu Asn Gly Thr Leu

 65                  70                  75                  80

Ser Leu Ser Cys Val Ala Cys Ser Arg Phe Pro Asn Phe Ser Ile Leu

                 85                  90                  95

Tyr Trp Leu Gly Asn Gly Ser Phe Ile Glu His Leu Pro Gly Arg Leu

            100                 105                 110

 Trp Glu Gly Ser Thr Ser Arg Glu Arg Gly Ser Thr Gly Trp Ala Glu

         115                 l20                 125

 Gly Asn Leu Ala pro His pro Arg Ser Pro Ala Leu Gln Pro Gln Gln

     130                 135                 140

 Ser Thr Ala Ala Gly Leu Arg Leu Ser Thr Gly Pro Ala Ala Ala Gln

 145                 150                 155                 160

Pro

<210>9

<211>7812

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>9

gtcgacggta cccccgggaa agatttaata cgactcacta tagggcggga cagaattgat 60

ctgtgagaga ctcatctagt tcatacccta ggtgaccctg ggggtggcat gggggtagat 120

tagagatccc agtctggtat cctctggaga gtaggagtcc caggagctga aggtttctgg 180

ccactgaact ttggctaaag cagaggtgtc acagctgctc aagattccct ggttaaaaag 240

tgaaagtgaa atagagggtc ggggcagtgc tttcccagaa ggattgctcg gcatcctgcc 300

cttcccagaa gcagctctgg tgctgaagag agcactgcct ccctgtgtga ctgggtgagt 360

ccatattctc tctttgggtc tcaattttgc cttccctaat gaaggggtaa gattggacta 420

ggtaagcatc ttacaaccat ttgtggtcat gagagctggg gtggggaagg attgtcactt 480

gaccccccca gctctgtttc taagtgctga aagagctcca ggctatgcta cgggaggaga 540

agccagctac tgaggaaaag ccagctactg agaaaaagcg ggagtggttt accattctcc 600

tcccccacct ttcaccagag aagaggacgt tgtcacacat aaagagccag gctcaccagc 660

tcctgacgca tgcatcatga ccatgagaca caactggaca ccaggtaggc cttggggcta 720

cgcatgggca ggcggggtag ggtgaggtct atgaacagaa tggagcaatg ggctaacccg 780

gagccttcac tccaaggcaa accacccagc gcacctggtg ctgttgcttt aagaacctgg 840

gcagatattg tagctctggc tccagtctaa agcttctctg tactctgttc aataaagggc 900

taaggggtgg gtgctgaggg gtccctcttc ccgctctgat tccctggcta gaacccagac 960

atctctgggc tggagttaca tccttacccg ggcagcccac tctgtctcca gagccgctga 1020

cctgtaactg tcctttcctc agacctcagc cctttgtggg tcctgctcct gtgtgcccac 1080

gtcgtcactc tcctggtcag agccacacct gtctcgcaga ccaccacagc tgccactgcc 1140

tcagttagaa gcacaaagga cccctgcccc tcccagcccc cagtgttccc agcagctaag 1200

cagtgtccag cattggaagt gacctggcca gaggtggaag tgccactgag taagaagcac 1260

agtggtggag ggtgggctat gggcacagag gttcccaggg tcgggttgac tcctgagcgc 1320

cagtcccctt ctgcccatgt accaccagct gagccagctg ggctgagcac gcaccattct 1380

ccctccccaa cccagtgtca tgggtgcagg cttggcgcag ctcccaagat gctccctatc 1440

aaataggaca gagaactcaa gacataagta atggtcacag gacctcccag agccttggtt 1500

gcagtggacc ccaaggccag cccctccacc cagagcctgc tggcctctgg ccatctcaga 1560

ggagcagcag ccatccagca ctgcctctgt cacctgggct cccaagtcac cgaggctggg 1620

cactagaaaa ggtcatcctg aggagacagg ttcagaagag gattcatcac gtgaaccaag 1680

gaccattcct cacattcccc gtgtttaggg ctagggcctc tcggagacaa ctgcacttct 1740

gtaacggacg ttcccaccta ggtggtgtgc agagcagttc tctaggttcc agatgcatgg 1800

ggactggggg gagctggcag agagggcaca gcagagcagg gtaggggaag ggcctgctct 1860

tctgaagagc taactgctgc ctgtgtccct agatggaacg ctgagcttat cctgtgtggc 1920

ctgcagccgc ttccccaact tcagcatcct ctactggctg ggcaatggtt ccttcattga 1980

gcacctccca ggccgactgt gggaggggag caccaggtga gggtcgcagc agccaggtgg 2040

gtgggaagga agccttctgc ggccttctca tgacctttcc ttcccttccg ctccagccgg 2100

gaacgtggga gcacaggtac gcagctgtgc aaggccttgg tgctggagca gctgacccct 2160

gccctgcaca gcaccaactt ctcctgtgtg ctcgtggacc ctgaacaggt tgtccagcgt 2220

cacgtcgtcc tggcccagct ctgggtgagg agcccaagga gaggcctcca ggaacaggag 2280

gagctctgct tccatatgtg gggaggaaag ggtgggctct gccagagcag cctgtgaact 2340

aatgcccagc attcctcaag gtcagccaga caaaaaggaa cttaggtctt gggcagagga 2400

ggtgtagcct ggggcaaagt gatgagatgt ccctcctttc cttggcctga tccttgtctg 2460

ccttcacttc cctaggctgg gctgagggca accttgcccc ccacccaaga agccctgccc 2520

tccagccaca gcagtccaca gcagcagggt taagactcag cacagggcca gcagcagcac 2580

aaccttgacc agagcttggg tcctacctgt ctacctggag tgaacagtcc ctgactgcct 2640

gtaggctgcg tggatgcgca acacaccccc tccttctctg ctttgggtcc cttctctcac 2700

caaattcaaa ctccattccc acctacctag aaaatcacag cctccttata atgcctcctc 2760

ctcctgccat tctctctcca cctatccatt agccttccta acgtcctact cctcacactg 2820

ctctactgct cagaaaccac caagactgtt gatgccttag ccttgcactc cagggcccta 2880

cctgcatttc ccacatgact ttctggaagc ctcccaacta ttcttgcttt tcccagacag 2940

ctcccactcc catgtctctg ctcatttagt cccgtcttcc tcaccgcccc agcaggggaa 3000

cgctcaagcc tggttgaaat gctgcctctt cagtgaagtc atcctctttc agctctggcc 3060

gcattctgca gacttcctat cttcgtgctg tatgtttttt ttttccccct tcactctaat 3120

ggactgttcc agggaaggga tgggggcagc agctgcttcg gatccacact gtatctgtgt 3180

catccccaca tgggtcctca taaaggatta ttcaatggag gcatcctgac atctgttcat 3240

ttaggcttca gttccactcc caggaacttt gcctgtccca cgagggagta tgggagagat 3300

ggactgccac acagaagctg aagacaacac ctgcttcagg ggaacacagg cgcttgaaaa 3360

agaaaagaga gaacagccca taatgctccc cgggagcaga ggccactaat ggagagtggg 3420

aagagcctgg aaagatgtgg cctcaggaaa agggatgaga gaaaggaggt ggtatggaag 3480

actcagcagg aacaaggtag gcttcaaaga gcctatattc ctctttttcc cacaccgatc 3540

aagtcaactc agtactcacg ggagaaaaat agactttatt tacaagtaat aacatttaga 3600

aaagatccat ccccggccct taaaaacctt cccatcactc caaatcccac cccagtgcaa 3660

gtctggggaa ggtagggtgt gagctgctgc tgaaggctgt cccccaaccc cactcctgag 3720

acacagggcc catccgtcct gggaaagagc atcctctggc aggtgctccc accaggtcag 3780

acccagtcct ggacttcaag agtgagggcc cctgctgggc ccagccacca ggacagcagg 3840

aaccagggcc tactcctctt atggtccctt ctagatccag aggctaagag gaagactggc 3900

caggcccaag gacccagcca tcaaaaccag cctcaaatct ggttgtgatg gagaagtgac 3960

tttgctttaa gaaaaaagga ggcaaggtag ggagagcgcc cacactgtcc atgctccagg 4020

ccccctgggc cagctccgag aaggcgccag tgaaggacca gggaccaggc cagggtgcgg 4080

gcaggcatca ctgtctctag gggtttggct actgttggcc tgggagctga gagaaggcac 4140

tgagagggac agtaggcgga ggaccaggtg acggcagcat cggggacaca ggtggggcca 4200

ctcactggta ctggcccttt agtgctttgc ctgaaagaga cacagtcaca tggccagatg 4260

agaacttgcg atactagcct gcacccactg gctgggaaga tctcttcctg ctcccacgcc 4320

cctgtctgga tcccctccct tgtgagcccc agggttatca gttgctggct gtgcctgagc 4380

agctctgggt gctctccatg agaatggggc catctgtctt ctctccttgg agaggagcta 4440

ccaggacagg gacacctctt accccacacc ctccagcagc ctggcgtggc cccatcttgg 4500

atgctacttg gtggggcggt ctggggggtg cccatgctct catcgggttt ccctccccca 4560

tcctgccagt gcctctacct tgcccttggc tcgaggggtg gcaccaatgg cggcagcagt 4620

ggcggcgctg gctgtggtgg tggcaatgcg cggagaacgg cgggttccac tgcgagtgtt 4680

gggggaagcc ttggacaggg ccttctttga ggctccccgc cgcagaaggc tgttccctag 4740

cttcttgggt gtgttgagga tgctgaaggc catcgactgg cgccggtcag cctgcaagga 4800

agggctgtca gaccgggaga cccaatgctg ccttcccagg ccagcgtgct gtgccacgct 4860

gtaccagcaa ggtcccgcca gggcgtcgct tcatccccct tcagccccag cctcacctgt 4920

ttagtagaag ctggagctgc tttcttctgg gcctcagtag tgctctgttt gcgcccttca 4980

tgtcggtctc ggggagtcat ggggcgtggg aaacagctgg tggccttctt agactatgga 5040

gaagaggaca gttaggcaga cagtagcaag aggagtcaca tctgaagcca ggtgtcttgt 5100

cctctcagag ctgagtggac cttgtaagtc aacgtgcaac ctgctcccct tcccaactct 5160

gggccagatc cttcccttcc caacagttcc catccatggg tcaggccctt ggagagaggg 5220

aaagagaggg ggaagtgagg gaaggagaga gaaggctccc tttagtcctt ggtgagctgg 5280

gcctgacctg agcacagtgc tggagtaaca cccaggagcc accgcgccta cctcaggagt 5340

tccagggccc tggtggggct ctagggagac ccgtttgcgc tgctgccggg tggtgatgcc 5400

agtgccctcg gctatctgga ttggctgcat gctggctcgg cgcagggtct cttgggggtc 5460

tccagttttc atctcctcat ctgtgatggt gcccaggctc agggaaggct gcatgggtgg 5520

aagaggtggt cagtggacca tagctgtatg gagatggagg aggacctggg gctgttccag 5580

aactctacac tcgcccgaca cttatggtcg ggacccttcc tgcctacgag gtagaaagac 5640

acaagcctcc tttcctgttc tgctttctac ctaagccctg ggcaaatggc acaagcagtg 5700

cagtcctgac cagattcctc tctgagctcc tgcctacccc cagggacttc acccctgagt 5760

gccctccagc tgtctgttcc acctggaaca tgagaaggtc accccttccc ctcttcggcc 5820

agtcagtgat ccagggccct agtgctcagg ctagatcagc aggtgggatt ccaaggaagg 5880

gcagggatgg gaggccctgc acagtgaccc caggcctcac cctggactcc agggatagca 5940

ggtcttcaga tgtggggggc acactcgatt gcgctgctgc agctctgcaa tgcggttcca 6000

gtcatccagc tgctcaggct catcctggca agtgcccatg tagaagctgt tccttcctgt 6060

ggaaggcagg gaagtgggaa caaatgagcc tggagtcggc aggtcacctc ctggccctgg 6120

catcttgcca gcctttgctg ccacctaccc cataaacttg aagcccggca caccagtctg 6180

attcagtgcc gcaggtgcag gagtacggca cacagactat ttctatccta ggggcttgct 6240

caccaccttc tccctggaga gggcagaaga ggtcacacgc agagactgct actacatctt 6300

attcacctgc caaggcttgg tggccaacac ccagaggaac aaattaagga ccgggaatta 6360

attcccaggg gctccctggt gcccaaagga caagagcttc caagaagagt ctggccagcc 6420

tggcctttcc agcagcccat caccgcctga gaagggcatg gaggactccc cacagctaag 6480

tgtcacaatt gtgctgggaa tcccgggccc ttaactctgg ctaagagtgc ccccaacaca 6540

gccagcccct agatgggcag gtaaggaagg ccctgaggct gcaggaagga ggggcaggtg 6600

gagctggatg gtagcaagga ggccagcctt ggatttttaa aaagctttcc tcttttccct 6660

gtgccacgat ccaccttcca gtctaatttt ggggtatagt aagtccctgt agtcccctca 6720

cctggagggg ccccactgga caccccggcc tgggaacgac gagcagaact gcgagtggtg 6780

gggcggtagc caggcaagct gagcagggct gagttgccat aatcgggaga acccaggcga 6840

gctagagact gagtagagga ggtggctcgc aggctagcct gggaagcagg agcagaccgc 6900

gtgctgtaga acgatgagtt ggcgctgtct ggctcttcca catctagctt ctggaagaca 6960

gagtgaatct gttgcagtgt acagtccctg gcactgtaca gaagcttccc attcccttcc 7020

gaagccctca gatcccacgg cacatccatg tattcccaac tgctttgcaa aggtccttaa 7080

agtgtgtgtc tgcaagaaat gggccttgtc gacagaagcc ctcacaaggt ggtgctgatg 7140

ttgtcaagac tcttctacgc atttttttca tggagtctat tcataatgct ttgaggtagg 7200

gaatgcagag tgtttatcgg cccattttgg agatgaagtg caaagaaata aagtgactag 7260

ccccaaatca cactgctagg aagtatcaga gctggggcta ggccccatgt ctcctgacta 7320

gtcaggctca tcccacagcc tctgctgtcc ctcagtccaa acttccaggg cccttaccat 7380

gttccagaac ttcccccaac ttcttggtag cagggggcac cctaaacaca caggcccccc 7440

ctgctgtacc aggggccccc tctcccctcc tcccaaacct ccccttcaag atgtggaaac 7500

aaaggcaagg gcctgcagcc tgtcaggcag tccactgggc agcaacaatg cctctcagct 7560

gcatggggca tgctgggagg cacaggatgg gctgcagctt cgccacgttc tctcccttca 7620

ccctgcacag gctcagtgct acgcatggag agaatgctag ccttagtcag gaggcaggga 7680

tctaatccta gccctgcctt tttcttcaga agtgccctta accaagtcac tccccttttt 7740

aagacctctc agctttccca ctgtaacatg gactggctgc tcatccctcc ctgctcctga 7800

ctgagtgccc ag                                                     7812

<210>10

<211>40

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>10

Thr Pro Val Ser Gln Thr Thr Thr Ala Ala Thr Ala Ser Val Arg Ser

  1               5                  10                  15

Thr Lys Asp Pro Cys Pro Ser Gln Pro Pro Val Phe Pro Ala Ala Lys

             20                  25                  30

Gln Cys pro Ala Leu Glu Val Thr

         35                  40

Claims (42)

1.一种分离的IL-18结合蛋白质IL-18BP，其中该IL-18BP含有氨基酸序列SEQ ID NO：10，并且选自：

(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的一个多肽；或

(b)如(a)中定义的多肽，其没有引导序列。

2.根据权利要求1所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽是非病毒蛋白质。

3.根据权利要求1所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽是人蛋白质。

4.根据权利要求1所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽具有40千道尔顿的分子量，在非还原条件下通过SDS-PAGE测得。

5.根据权利要求1所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽是融合蛋白质。

6.根据权利要求1所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽是可溶性形式。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽是非糖基化IL-18BP。

8.一种分离的IL-18BP，选自：

(a)具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的一个多肽；或

(b)如(a)中定义的多肽，其没有引导序列。

9.根据权利要求8所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽是非病毒蛋白质。

10.根据权利要求8所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽是人蛋白质。

11.根据权利要求8所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽具有40千道尔顿的分子量，在非还原条件下通过SDS-PAGE测得。

12.根据权利要求8所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽是融合蛋白质。

13.根据权利要求8所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽是可溶性形式。

14.根据权利要求8～13中任一项所述的分离的IL-18BP，其中所述多肽是非糖基化IL-18BP。

15.一种药物组合物，含有权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP和药物可接受载体。

16.一种药物组合物，含有编码权利要求1～14中任一项所述IL-18BP的DNA。

17.一种DNA，能够在严格条件下杂交，或能够在严格条件下但由于遗传密码的简并性与SEQ ID NO：1的DNA序列杂交，所述的DNA能够编码权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP。

18.编码权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP的DNA，所述分离的IL-18BP包括氨基酸序列SEQ ID NO：10。

19.编码权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP的DNA，所述分离的IL-18BP包括在3’末端提供终止密码子的氨基酸序列SEQ ID NO：10。

20.一种DNA，在严格条件下与权利要求18所述的DNA杂交或由于遗传密码的简并性能够在严格条件下杂交，能够编码权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP。

21.根据权利要求17～20中任一项所述的DNA，可操作地连接其它DNA序列以利于表达。

22.根据权利要求17～21中任一项所述的DNA，其是基因组DNA。

23.根据权利要求17～22中任一项所述的DNA，其是cDNA。

24.根据权利要求23所述的DNA，其中所述cDNA是SEQID NO：1的DNA序列的cDNA序列。

25.根据权利要求23或24所述的DNA，其中所述cDNA适于在细菌宿主中表达。

26.一种可复制表达载体，包括权利要求17～25中任一项所述的DNA。

27.一种转化宿主细胞，含有权利要求26所述的表达载体。

28.根据权利要求27所述的转化宿主细胞，其是真核生物细胞。

29.根据权利要求27所述的转化宿主细胞，其是原核细胞。

30.生产权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP的方法，包括在适于表达IL-18BP的条件下培养权利要求27～29中任一项所述的宿主细胞，并分离所述IL-18BP。

31.根据权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP的抗体。

32.根据权利要求31所述的抗体，其是多克隆抗体。

33.根据权利要求31所述的抗体，其是单克隆抗体。

34.根据权利要求31所述的抗体，其是抗独特型抗体。

35.根据权利要求31所述的抗体，其是嵌合抗体。

36.根据权利要求31所述的抗体，其是人化抗体。

37.分离权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP的方法，包括：

(a)将人液体通过偶联IL-18的层析柱，

(b)洗脱能够结合IL-18的蛋白质，和

(c)纯化所述的蛋白质。

38.权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP在制备药物组合物中的用途，所述药物组合物用于治疗自身免疫疾病、糖尿病、类风湿关节炎、移植排斥、肠炎疾病、脓毒血症、多发性硬化、局部缺血性心脏病、局部缺血性脑损伤、慢性肝炎、牛皮癣、慢性胰腺炎或急性胰腺炎。

39.权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP在纯化IL-18中的用途。

40.权利要求31～36中任一项所述的抗体在对IL-18BP检测的分析中的用途。

41.编码权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP的DNA在制备基因治疗载体中的用途。

42.权利要求17～25中任一项所述的DNA在制造权利要求1～14中任一项所述的分离的IL-18BP中的用途。

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