EA005242B1 - Способ лечения артрита при использовании блокирующего моноклонального антитела к интегрину vla-1 или его фрагмента - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу лечения артрита. Способ включает введение блокирующего функцию α1β1 антитела или его фрагмента, которые способны связываться с эпитопом α1-I-домена антигена "очень поздней активации" (VLA-1) семейства интегринов, включающим аминокислотные остатки 91-96, показанные на фиг. 15. Указанным антителом является моноклональное антитело AJH10.

Description

Известный уровень техники

Интегрины являются комплексами белков клеточной поверхности, которые образуют большой класс молекул клеточной поверхности, опосредующих адгезию клеток друг к другу и к их окружению. Клетки нуждаются в адгезии друг к другу и к другим молекулам в их окружении при многих физиологических процессах и при процессах развития. Примеры включают создание тканей и органов и поддержание их целостности. Воспалительные заболевания находятся среди данных физиологических процессов.

Одна из ключевых стадий воспалительного процесса включает выход клеток из кровеносных сосудов в ткани по направлению к месту инфекции. Роль адгезивных молекул в данном процессе часто разбивается на три этапа, включающих первоначальное перекатывание лейкоцитов по воспаленному эндотелию, за которым следует стойкое прикрепление, приводящее к трансэндотелиальной миграции лейкоцитов в воспаленные ткани (Нупек, КО. 1992 Се11 69:1125; 8ргшдег, Т.А. 1992 Се11 76:301-314). Дополнительная критическая стадия воспалительного каскада, та, что не изучалась интенсивно, возникает в периферических тканях, в которых инфильтрирующие клетки, а также клетки-резиденты, которым необходимо мигрировать к месту воспаления, узнают чужеродный антиген и подвергаются клеточной активации для выполнения своих эффекторных функций. Для прямой оценки важности интерстициальных адгезивных взаимодействий в воспалении независимо от роли, которую играют адгезивные взаимодействия в рекрутировании лейкоцитов, заявители сконцентрировались на важности адгезивных молекул семейства интегринов и их фрагментов и их роли в животных моделях воспаления, особенно артрита.

Краткое изложение существа изобретения

В настоящем изобретении предлагается способ лечения воспалительных заболеваний у субъекта. Конкретно, в изобретении предлагается способ лечения артрита.

Более конкретно, в изобретении предлагается способ лечения артрита у субъекта, включающий введение субъекту фармацевтической композиции, включающей эффективное количество антитела, блокирующего функцию α1 β 1, или фрагмента указанного антитела, где антитело, блокирующее функцию α 1 β 1, или его фрагмент способны связываться с эпитопом домена α1-Ι антигена очень поздней активации (УЬА-1) семейства интегринов, включающим аминокислотные остатки 91-96 фиг. 15, Уа1-61и-Агд-61уО1у-Атд.

Антитело к интегрину может быть выбрано из группы, состоящей из антитела человека, химерного антитела, антитела, приближенного к человеческому, и их фрагментов. Антитело к интегрину может быть моноклональным или поликлональным антителом.

В изобретении дополнительно предлагается способ лечения воспалительных заболеваний у субъекта, который является человеком или животным.

Вся литература, цитированная в предыдущем разделе, а также литература, цитирование которой включено в последующее раскрытие изобретения, включена в данное описание в качестве ссылки.

Описание фигур

Фиг. 1. Связывающие коллаген интегрины α1β1 и α2β1 на активированных лейкоцитах. А. Анализ с помощью проточной цитометрии экспрессии интегринов α1 и α2β1 на спленоцитах, активированных ИЛ-2 (б 11). Клетки метили либо анти-сН тАЬ, анти-α2 тАЬ, либо не связывающим контрольным тАЬ (серые линии) с последующей обработкой меченными ФИТЦ антителами к иммуноглобулинам хомячка. В. Эффект анти-α1 и анти-α2 тАЬ на адгезию лейкоцитов к коллагену. 10⁵ спленоцитов, активированных ИЛ-2, обрабатывали указанными тАЬ в течение 15 мин перед посевом в планшеты, покрытые коллагеном либо типа IV, либо типа I, в течение 1 ч при 37°С. Адгезию рассчитывали, как продемонстрировано в примере 1, и выражали как % адгезии по отношению к клеткам, обработанным контрольными тАЬ. Определение адгезии осуществляли в трех параллелях и выполняли, по меньшей мере, в трех независимых экспериментах. Представлен один показательный пример.

Фиг. 2. Эффект тАЬ к интегрину на эффекторную фазу гиперчувствительности замедленного типа. Мышам, сенсибилизированным эритроцитами барана, вводили в.б. указанные тАЬ за 1 ч до повторного введения эритроцитов барана. Толщину подушечек лап измеряли через 20 ч после повторного введения антигена и результаты представляли как % увеличения толщины подушечек лап ±8ЕМ (ст.ош.), как проиллюстрировано в примере 2. Эти данные представляют сумму восьми экспериментов с п=79 (ФСБ), 68 (контрольные 1д хомяка), 68 (антиα1), 29 (анти-оС). 18 (анти-α1+анти-α2), 45 (анти-о4), 18 (анти-α5), 20 (анти-α6) и 10 (антиβ1). Использованные тАЬ представляли собой На4/8 (контрольные 1д хомяка группы 2), На31/8 (анти-αθ, На1/29 (анти^), Р8/2 (антиα4), 5Н10-27 (анти-α5), ОоН3 (анти-α6) и НМв1-1 (анти-βΟ.

Фиг. 3. Эффект тАЬ к интегрину на эффекторную фазу контактной гиперчувствительности. Мышам, сенсибилизированным ФИТЦ, вводили в.б. указанные тАЬ за 4 ч до повторного нанесения ФИТЦ. Толщину ушей измеряли исходно и через 24 ч и результаты представляли как % увеличения толщины ушей ±8ЕМ, как проиллюстрировано в примере 3. Эти данные представляют сумму девяти экспериментов с п=74 (ФСБ), 60 (контрольные 1д хомяка), 26 (анти-1САМ-1), 44 (анти-αΙ), 44 (анти-а2), 38 (анти-а1+анти-а2), 36 (анти-а4), 16 (анти-а5), 26 (анти-а4+анти-а5), 24 (анти-а6) и 22 (антиβ1). Использованные тАЬ хомяка представляли собой На4/8 (контрольные 1д хомяка группы 2), На31/8 (анти-а1), На1/29 (анти-а2), НМв1-1 (анти-βί), 3Е2 (анти-1САМ-1); использованные тАЬ крысы представляли собой Κ35-95 и В35-38 (контрольные 1§С2а крысы и 1дС2Ь крысы, соответственно), Р8/2 (анти-а4), 5Н10-27 (анти-а5), СоН3 (анти-а6).

Фиг. 4. Ответы контактной гиперчувствительности у а1-дефицитных мышей в сравнении с мышами дикого типа. Мышам, сенсибилизированным ФИТЦ, вводили в.б. указанные тАЬ за 4 ч до повторного нанесения ФИТЦ. Толщину ушей измеряли исходно и через 24 ч и результаты представляли как % увеличения толщины ушей ±8ЕМ, как проиллюстрировано в примере 4. Использовали группы из 4-5 мышей на состояние и все эксперименты выполняли как минимум 3 раза. Представлен один показательный пример.

Фиг. 5. Эффект анти-а1 и анти-а2 тАЬ на неспецифическое воспаление, вызванное кротоновым маслом. Мышам вводили в.б. указанные тАЬ за 4 ч до нанесения кротонового масла на уши. Толщину ушей измеряли исходно и через 24 ч и результаты представляли как % увеличения толщины ушей ±8ЕМ, как проиллюстрировано в примере 5. Использовали группы из 4-5 мышей на состояние и все эксперименты выполняли как минимум 3 раза. Представлен один показательный пример.

Фиг. 6. Эффект анти-а1 и а2 тАЬ при артрите, индуцированном тАЬ к коллагену. Мышам вводили в. б. тАЬ к коллагену в день 0 с последующим введением ЛПС в день 3. Мышам вводили в.б. указанные тАЬ каждый 3-ий день, начиная с дня 0. Клинически артрит выявлялся через 2-3 дня после введения ЛПС и продолжался в течение нескольких недель. Каждую конечность оценивали по шкале от 0 до 4 каждый 3-ий день, как проиллюстрировано в примере 6, и результаты представляли как средний показатель артрита между 9 и 15 днями (±8ЕМ) для всех четырех конечностей. Эти данные представляют собой сумму из четырех экспериментов, причем каждый эксперимент включал группы из 3-4 мышей на условие.

Фиг. 7. Введение анти-а1 или анти-а2 тАЬ тормозит инфильтрацию лейкоцитов в подушечки лап при ответе ΌΤΗ (гиперчувствительности замедленного типа). Эксперимент выполняли, как описано в фиг. 2. Подушечки лап иссекали через 20 ч после повторного введения антигена и срезы ткани окрашивали гематоксилином и эозином. Срезы ткани были из подушечек лап либо инъецированных повторно мышей (А), либо мышей, сенсибилизированных эритроцитами барана и повторно инъецированных данным антителом (В-Н). Мышей за 1 ч до повторного введения обрабатывали либо ФСБ (В), контрольными 1д хомяка (С, О), анти-а1 (Ό), анти-а2 (Е), либо сочетанием анти-а1 и анти-а2 тАЬ (Т, Н). Увеличение: х100 (А-Р), х400 (О-Н).

Фиг. 8. а 1 β 1 экспрессируются на лейкоцитах, инфильтрирующихся в подушечки лап, в течение ответа ΌΤΗ. Иммуногистохимическое окрашивание инфильтрирующих лейкоцитов из необработанной воспаленной подушечки лапы через 20 ч после повторного введения антигена. А. Серийные срезы, окрашенные непосредственно А1еха488-конъюгированными контрольными тАЬ и анти-а1 тАЬ. В. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание А1еха488конъюгированными анти-а1 тАЬ и фикоэритрин (РЕ)-конъюгированными тАЬ, специфичными для клеточных линий. Применяемые РЕконъюгированные тАЬ были специфичны для гранулоцитов/моноцитов (анти-СЭ11Ь), нейтрофилов (анти-ЬуО/От-1) и Т-лимфоцитов (анти-СИ3). Увеличение: х400.

Фиг. 9. Эффект анти-а1 и а2 тАЬ при артрите, индуцированном тАЬ к коллагену. А. Профилактическая обработка мышей либо анти-а1, либо анти-а2 тАЬ снижает показатель артрита. Мышей обрабатывали тАЬ к коллагену в день 0 с последующим введением ЛПС в день 3. Артрит выявлялся на 6-ой день и продолжался в течение нескольких недель. Мышам вводили указанные тАЬ каждый 3-ий день, начиная с дня 0. Каждую конечность оценивали, снимая показатель по шкале от 0 до 4 каждый 3-ий день. Результаты представляли как средний показатель артрита между 9 и 15 днями (±8ЕМ) для всех четырех конечностей (максимальный показатель 16). Использовали группы из 4 мышей на состояние; показано среднее из 12 экспериментов. В. а1-дефицитные мыши имеют сниженный показатель артрита, сравнимый с таковым мышей дикого типа, обработанных анти-а1 тАЬ. Подробности экспериментов и снятие показателей очерчены выше. Применяли группы из 4 мышей на состояние; показано среднее из двух экспериментов.

Фиг. 10. Эффект обработки анти-а1 тАЬ на иммунопатологию пораженных артритом суставов. Обработка анти-а1 тАЬ снижает инфильтрацию лейкоцитов, адгезию клеток к поверхности суставов и разрушение хряща, о чем свидетельствует потеря протеогликанов. Задние конечности нормальных мышей (А-Ό) или мышей с артритом (8-ой день), получавших либо контрольные 1д хомяка (Е-Н), либо обработанных анти-а1 тАЬ (Ι-Ь). Конечности фотографировали (А, Е, I), иссекали и срезы тканей окрашивали либо гематоксилином/эозином (В-С, ΤΟ, Σ-Κ). либо толуидином синим для определе ния протеогликанов (Ό, Н, Ь). Увеличение: х16 (В, Р, I); х160 (С, 6, К); х200 (Ό, Н, Ь).

Фиг. 11. Развитие артрита задерживается в отсутствие лимфоцитов, и ингибирование артрита анти-а1 тЛЬ наступает в отсутствие лимфоцитов. Мышей дикого типа В6,129 или мышей В6,129, дефицитных по РЛС-1, обрабатывали тАЬ к коллагену в день 0 с последующим введением ЛПС в день 3. Артрит выявлялся на 6-ой день и продолжался в течение нескольких недель. Мышам вводили указанные тАЬ каждый 3-ий день, начиная с дня 0. Каждую конечность оценивали, снимая показатель по шкале от 0 до 4 каждый 3-ий день. Результаты представляли как средний показатель артрита на конечность (максимальный показатель 4). Использовали группы из 4 мышей на состояние.

Фиг. 12. Ингибирование артрита в зависимости от дозы анти-а1 тАЬ. Мышей дикого типа Ва1Ь/с обрабатывали новыми тАЬ к коллагену в день 0 с последующим введением ЛПС в день 3. Артрит выявлялся на 6-ой день и продолжался в течение нескольких недель. Мышам вводили в.б. указанную дозу либо На4/8 (контрольный изотип), или На31/8 (анти-а1) тАЬ каждый 3-ий день, начиная с дня 0. Каждую конечность оценивали, снимая показатель по шкале от 0 до 4 каждый 3-ий день. Результаты представляли как средний показатель артрита на конечность (максимальный показатель 4). Использовали группы из 4 мышей на состояние.

Фиг. 13. Терапевтическое лечение анти-а1 тАЬ может снижать показатель артрита. Мышей дикого типа Ва1Ь/с обрабатывали тАЬ к коллагену в день 0 с последующим введением ЛПС в день 3. Артрит выявлялся на 6-ой день и продолжался в течение нескольких недель. Мышам вводили в.б. тАЬ (250 мкг) или гибридный 1д белок (200 мкг) каждый 3-ий день, начиная с дня 4. Мыши получали либо тАЬ (контрольный изотип На4/8 или анти-а1 На31/8), либо гибридный 1д белок (контрольный изотип 1д или ΤΝΡ-Κ.55-Ι§), либо сочетание обоих (250 мкг На31/8 и 200 мкг ΤΝΡ-Β55-Ι§). Каждую конечность оценивали, снимая показатель по шкале от 0 до 4 каждый 3-ий день. Результаты представляли как средний показатель артрита на конечность (максимальный показатель 4). Использовали группы из 4 мышей на состояние.

Фиг. 14. Локализация эпитопа для блокирующих тАЬ к а1-1-домену. А. Аминокислотная последовательность а 1-1-домена крысы (вверху) и человека (внизу). Остатки, которые включают мотив МГОА8 (сайт адгезии, зависимый от иона металла), отмечены жирным шрифтом. Аминокислоты человека, которые замещали соответствующие остатки крысы (РАН), показаны ниже последовательности крысы в рамке. Для ясности, нумерация остатков в тексте относится к данной фигуре. В. Увеличивающиеся концентрации тАЬ АШ10 (АТСС

ΝΟ. РТА-3580) связывались с лунками, покрытыми 30 мкг/мл а1-1 домена человека (кружки), крысы (треугольники) или РАН (квадраты). Показанные данные представляют три эксперимента.

Фиг. 15. Аминокислотная последовательность а1-1 домена человека. Аминокислотная последовательность эпитопа для блокирующих тАЬ к а 1-1-домену включает аминокислоты 9196, показанные в рамке на данной фигуре, (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 8).

Фиг. 16. Идентификация блокирующего антитела к а1-1 домену. А. Увеличивающиеся концентрации тАЬ АЕР3 (треугольники) или А1Н10 (АТСС ΝΟ. РТА-3580) (кружки) связывали с планшетами, покрытыми 30 мкг/мл а 1-1доменом. В. а1-1-домен обрабатывали увеличивающимися концентрациями тАЬ АШ10 (АТСС ΝΟ. РТА-3580) (ромбы) или тАЬ ВСС5 (квадраты) и давали связываться с планшетами, покрытыми коллагеном IV (2 мкг/мл). С. Клетки К562-а1 обрабатывали увеличивающимися концентрациями тАЬ АЕР3 (треугольники) или А1Н10 (АТСС ΝΟ. РТА-3580) (кружки) и давали связываться с планшетами, покрытыми коллагеном IV (5 мкг/мл). 45-50% клеток, добавленных в каждую лунку, прикреплялись к коллагену IV. Показанные данные представляют три независимых эксперимента.

Фиг. 17. Видовая перекрестная реактивность блокирующих тАЬ. А. Детергентные лизаты из (1) гладкой мышцы сосуда овцы, (2) клеток лейкоза человека К562-а1 или (3) очищенный РАН С8Т-1-домен; (4) С8Т-а1 Ι-домен крысы; (5) С8Т-а1 Ι-домен человека разделяли с помощью электрофореза в 10-20% ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях и проводили иммуноблоттинг с блокирующими функцию тАЬ А1Н10 (АТСС ΝΟ. РТА-3580). Слева показаны маркеры молекулярной массы; невосстановленный интегрин а1 β1 мигрирует с М_г ~180 кДа; С8ТЧ-домен мигрирует с М_г ~45 кДа. В. Клетки гладких мышц сосуда кролика инкубировали либо с тАЬ А1Н10 (АТСС ΝΟ. РТА-3580) (низ), либо с контрольными Ι§6 мыши (верх) и анализировали с помощью лазерного анализатора клеток по интенсивности (РАС8).

Фиг. 18. а14-домен связывает коллаген. А. Увеличивающиеся концентрации а 1-Ι домена человека связывали с планшетами, предварительно покрытыми 1 мкг/мл коллагена Ι (квадраты) или коллагена Ιν (кружки). Представленные величины скорректированы на фоновое связывание с БСА. В. 2 мкг/мл а14-домена человека смешивали с увеличивающимися концентрациями антитела 5Ε8Ό9 к интегрину а1 человека (квадраты) или антитела А2ПЕ10 к интегрину а2 человека (кружки) и затем давали связываться с планшетами, предварительно покрытыми 1 мкг/мл коллагена Ιν. С. Планшеты покрывали 1 мкг/мл коллагена IV или 3% БСА. Затем α 1-Ι домену (2 мкг/мл) давали взаимодействовать с покрытыми планшетами в присутствии 1 мМ Мп²⁺, 1 мМ Мд²' или 5 мМ ЭДТА. Показанные данные представляют три независимых эксперимента.

Подробное описание изобретения

Открытием настоящего изобретения является то, что антитело к интегрину и его фрагменту, особенно к αΐ-интегриновой субъединице, может блокировать взаимодействие провоспалительных лейкоцитов с компонентами внеклеточного матрикса, включая, но не ограничиваясь ими, коллагены, ламинин и фибронектин. При отсутствии намерений ограничивать изобретение любым единственным механизмом действия предполагается, что нарушение взаимодействия между интегрином, а также его фрагментом и окружающим матриксом может снижать экспрессию провоспалительных цитокинов. Дополнительно предполагается, что антитела к интегринам и их фрагментам могут быть модуляторами эффекторных фаз воспалительных ответов путем действия на уровне антигенспецифичной Т-клетки. Кроме того, предполагается, что антитела к интегринам и их фрагментам могут действовать с помощью нарушения миграции клеток в тканях и/или влиять на клеточное примирование и активацию внутри тканей.

Данное открытие иллюстрирует важность адгезивных молекул семейства интегринов, особенно αϊβΐ, в окружении периферических тканей при состояниях, относящихся к воспалению. Оно также распространяется на роль семейства интегринов и их фрагментов в воспалении после прикрепления лейкоцитов и их выхода на поверхность эндотелия в результате освещения важности обогащения матриксом окружения периферических тканей для иммунных ответов, и оно выдвигает периферические ткани как новую точку приложения терапии, основанной на адгезии.

Способы настоящего изобретения рассматривают применение антител к интегринам, где рассматриваемые интегрины включают молекулы, которые включают β-цепь, включающую, но не ограничивающуюся βΐ, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, нековалентно связанную с αцепью, включающей, но не ограничивающейся αΐ, α2, α3, α4, α5, α6, α7, α8, α9, α10, αν, аЬ, αΜ, αΧ, α.Ό. αΕ, αΙΙΕ. Примеры различных интегринов, рассматриваемых для применения в исследовании, включают, но не ограничиваются этим:

α1β1, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, α6β1, α7β1, α8β1, α9β1, α10β1, ανβ1, αΕβ1, αΜβ1, αΧβ1, αϋβ1, αΠόβ1, αΕβ1;

α1β2, α2β2, α3β2, α4β2, α5β2, α6β2, α7β2, α8β2, α9β2, α10β2, ανβ2, αΕβ2, αΜβ2, αΧβ2, αΌβ2, αΠόβ2, αΕβ2;

α1β3, α2β3, α3β3, α4β3, α5β3, α6β3, α7β3, α8β3, α9β3, α10β3, ανβ3, αΕβ3, αΜβ3, αΧβ3, αΌβ3, αΠ6β3, αΕβ3;

α1β4, α2β4, α3β4, α4β4, α5β4, α6β4, α7β4, α8β4, α9β4, α10β4, ανβ4, αΕβ4, αΜβ4, αΧβ4, αΌβ4, αΠ6β4, αΕβ4;

α1β5, α2β5, α3β5, α4β5, α5β5, α6β5, α7β5, α8β5, α9β5, α10β5, ανβ5, αΕβ5, αМβ5, αХβ5, αΌβ5, αΠ6β5, αΕβ5;

α1β6, α2β6, α3β6, α4β6, α5β6, α6β6, α7β6, α8β6, α9β6, α10β6, ανβ6, αΕβ6, αМβ6, αХβ6, αΌβ6, αΠόβό, αΒβ6;

α1β7, α2β7, α3β7, α4β7, α5β7, α6β7, α7β7, α8β7, α9β7, α10β7, ανβ7, αΕβ7, αΜβ7, αΧβ7, αΌβ7, αΠ6β7, αΕβ7;

α1β8, α2β8, α3β8, α4β8, α5β8, α6β8, α7β8, α8β8, α9β8, α10β8, ανβ8, αΕβ8, αΜβ8, αΧβ8, αΌβ8, αΠ6β8, αΕβ8.

Способы настоящего изобретения также охватывают применение антител к фрагментам интегринов, включая, например, антитела к одной β-цепи, включающей, но не ограничивающейся β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, так же как к одной α-цепи, включающей, но не ограничивающейся α1, α2, α3, α4, α5, α6, α7, α8, α9, α10, αν, αΕ, αΜ, αΧ, αΌ, αΕ, αΙΙΕ. Кроме того, способы настоящего изобретения дополнительно охватывают применение антител к фрагментам интегринов, включая, например, антитела к домену I α-цепи, включая, но не ограничиваясь этим, домен I α1β1 (Впскс\\'Цх е! а1., 1993 I. ΒίοΙ. СНет. 268:2989); α2β1 (Такаба апб Нет1ег, 1989 I. Се11 Βΐο1. 109:397), αΕα2 (Ьагкоп е! а1., 1989 I. Се11. Βΐο1. 108:703), αΜβ2 (СогЫ е! а1., 1988 I. Βΐο1. СНет. 263:12403), αΧβ2 (СогЫ е! а1., 1987 ΕΜΒΟ I. 6:4023), αϋβ2 (Огаукоп е! а1., 1988 I. Εχρ. Μеб. 188:2187), αΕβ7 (8Нам е! а1., 1994 I. Βίο1. СНет. 269:6016). В предпочтительном осуществлении антигенная детерминанта α1-Ι домена включает аминокислотную последовательность из, по меньшей мере, 6 расположенных подряд аминокислот, где последовательность из расположенных подряд аминокислот найдена в последовательности фиг. 15. Более того, в предпочтительном осуществлении смежная последовательность из расположенных подряд аминокислот представляет собой νη1-Ο1πАгд-О1у-О1у-Агд.

Способы получения интегринов для применения в настоящем изобретении известны специалистам в данной области техники (см., например, 8ргшдег е! а1. 1990, Ыа!иге 346:425434).

Осуществления настоящего изобретения дополнительно включают поликлональные и моноклональные антитела к интегрину. Предпочтительные осуществления настоящего изобретения включают моноклональное антитело, такое как моноклональное антитело к α1.

Антитело, блокирующее функцию α1β1, в данном случае относится к антителу, которое взаимодействует с доменом α1-Ι, конкретно с эпитопом, формируемым аминокислотами 91-96 фиг. 15, и блокирует функцию α1β1, что проверяется, например, по его способности ингибировать К562-а1-зависимую адгезию к коллагену IV (см. пример 15).

Предпочтительные антитела и гомологи для лечения, в частности для лечения человека, включают гомологи антител человека, гомологи антител, приближенные к человеческим, химерные гомологи антител, фрагменты антител ГаЬ, ГаЬ', Г(аЬ')2 и Γ(ν) и мономеры или димеры тяжелых или легких цепей антитела или их смеси. Таким образом, моноклональные антитела к молекуле интегрина и ее фрагменту представляют собой предпочтительный связывающий агент в способе изобретения.

Используемый термин гомолог антитела включает интактные антитела, состоящие из легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, связанных дисульфидными мостиками. Термин гомолог антитела также предназначен для охвата белка, включающего один или более полипептидов, выбранных из легких цепей иммуноглобулинов, тяжелых цепей иммуноглобулинов и их антигенсвязывающих фрагментов, которые способны взаимодействовать с одним или более антигенами (т.е. α1, α2, α6 или альфа-Ι доменом, содержащим субъединицы интегринов). Полипептидные компоненты гомолога антитела, состоящие из более чем одного полипептида, могут необязательно быть связаны с помощью дисульфидного мостика или других ковалентных связей.

В связи с этим, следовательно, гомологи антител включают интактные иммуноглобулины типов ΙβΛ. 1дС. ЦЕ. Ι§Ό, 1дМ (так же, как и их подтипы), где легкие цепи иммуноглобулинов могут быть типа каппа или лямбда.

Гомологи антител также включают части интактных антител, которые сохраняют антигенсвязывающую специфичность, например ГаЬ-фрагменты, ГаЬ'-фрагменты, Г(аЬ')2-фрагменты, Ε(ν(-фрагменты, мономеры или димеры тяжелых цепей, мономеры или димеры легких цепей, димеры, состоящие из одной тяжелой и одной легкой цепей, и тому подобное. Таким образом, антигенсвязывающие фрагменты, так же как полноразмерные димерные или тримерные полипептиды, происходящие из описанных выше антител, полезны сами по себе.

Используемый термин гомолог антитела, приближенный к человеческому представляет собой гомолог антитела, полученный с помощью метода рекомбинантной ДНК, в котором некоторые или все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина человека, которые не требуются для связывания антигена, замещены соответствующими аминокислотами легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина млекопитающего, не являющегося человеком.

Используемый термин химерный гомолог антитела представляет собой гомолог антитела, полученный с помощью метода рекомбинантной ДНК, в котором все или часть шарнирной и константной области легкой цепи, тяжелой цепи или обеих цепей иммуноглобулина замещены соответствующими областями от легкой или тяжелой цепи другого иммуноглобулина. В другом варианте изобретение характеризует вариант химерной молекулы, которая включает (1) часть-мишень для интегрина; (2) необязательно второй пептид, например такой, который увеличивает растворимость или время жизни ίη νίνο части-мишени для интегрина, например член суперсемейства иммуноглобулинов или его фрагмент или часть, например часть или фрагмент 1дС, например константную область тяжелой цепи ЦС1 человека, например СН2 и СН3 шарнирные области; и часть токсина. Химерная молекула может быть применена для лечения субъекта, например человека, при риске нарушения, относящегося к пролиферации эпителиальных клеток, таких как волосяные фолликулы и тому подобное.

Используемый термин гомолог антитела человека представляет собой гомолог антитела, полученный с помощью метода рекомбинантной ДНК, в котором все аминокислоты легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина происходят из человеческого источника.

Используемый термин воспалительное заболевание включает, но не ограничивается ими, такие состояния, как состояния, связанные с кожей, такие как псориаз, экзема, ожог и дерматит. Другие воспалительные заболевания, предназначаемые для лечения с помощью способов настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, астму, бронхит, менструальные спазмы, тендинит, бурсит и боли и головную боль, а также способы изобретения могут служить в качестве жаропонижающего при лечении лихорадки. Способы изобретения также могли бы быть полезны для лечения желудочнокишечных нарушений, таких как воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, гастрит, синдром раздраженного кишечника и язвенный колит и для профилактики рака толстой кишки. Способы изобретения должны быть полезны для лечения воспалительных нарушений при таких заболеваниях, как сосудистые заболевания, головные боли при мигрени, нодозный периартериит, тиреоидит, апластическая анемия, болезнь Ходжкина, ревматоидная лихорадка, диабет типа I, псевдопаралитическая миастения, множественный склероз, саркоидоз, нефротический синдром, синдром Бехчета, полимиозит, гингивит, гиперчувствительность, конъюнктивит, отеки после ушиба, ишемия миокарда и тому подобное. Способы изобретения также полезны для лечения аллергического ри нита, синдрома респираторного дистресса, синдрома эндотоксического шока и атеросклероза.

В предпочтительном осуществлении способы изобретения полезны для лечения артрита, включая, например, ревматоидный артрит и остеоартрит.

Эффективное количество представляет собой количество, достаточное для благоприятных или желаемых клинических результатов. Эффективное количество может быть введено за 1 или более раз. В плане лечения воспалительного заболевания эффективное количество антитела к интегрину представляет собой количество, достаточное для смягчения, улучшения, стабилизации, обратного развития, замедления или отсрочки прогрессии состояния, относящегося к воспалению, в соответствии с клинически приемлемыми стандартами для нарушений, подвергаемых лечению, или для косметических целей. Определение и измерение показателей эффективности может быть осуществлено с помощью большого числа доступных диагностических способов, включая, но не ограничиваясь этим, например, медицинский осмотр, включая анализы крови, легочные функциональные тесты и рентген грудной клетки; сканирование с помощью СТ (компьютерной томографии); бронхоскопию; бронхоальвеолярный лаваж; биопсию легких и сканирование с помощью СТ.

Технология получения моноклональных антител, включая, например, моноклональные антитела к интегрину, хорошо известна. См., например, Мепбпск е1 а1. 1995, ЬаЬ. 1пуск1. 72:367-375 (тАЬ к анти-αΐβΐ и анти-а2в1 мыши); ЗоппепЬетд е1 а1. 1987 1. Βίο1. СЬет. 262:10376-10383 (тАЬ к анти-а6в1 мыши); Уао с! а1. 1996, 1. Се11 8ά. 1996 109:3139-50 (тАЬ к анти-а7в1 мыши); Нет1ег е! а1. 1984, 1.

1ттипо1. 132:3011-8 (тАЬ к α1β1 человека); Р1ксЬе1 е! а1. 1987 1. 1ттипо1. 138:226-33 (тАЬ к α2β1 человека); ХУаупег е! а1. 1988, 1. Се11 Вю1. 107:1881-91 (тАЬ к α3β1 человека); Нет1ег е! а1. 1987 1. Вю1. СЬет. 262:11478-85 (тАЬ к α4β1 человека); Уаупег е! а1. 1988 1. Се11 Вю1. 107:1881-91 (тАЬ к α5β1 человека); 8опиепЬегд е! а1. 1987, 1. Вю1. СЬет. 262:10376-10383 (тАЬ к α6β1 человека); А ХУапд е! а1. 1996 Ат. 1. Искри. Се11 Мо1. Вю1. 15:664-672 (тАЬ к α9β1 человека); Эа\зек е! а1. 1989 1. Се11 Вю1. 109:1817-26 (тАЬ к ανβ1 человека); ЗапсйехМабпб е! а1. 1982, Ргос. №111. Асаб. 8с! И8А 79:7489-93 (тАЬ к αΕβ2 человека); П1атопб е! а1. 1993, 1. Се11 Вю1. 120:1031-43 (тАЬ к α\1β2 человека); 8!аскег е! а1. 1991, 1. 1ттипо1. 146:648-55 (тАЬ к αΚβ2 человека); Vаи бег V^е^еи е! а1. 1995 1ттипйу 3:683-90 (тАЬ к αΌβ2 человека); Веппе!! е! а1. 1983 Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 80:2417-21 (тАЬ к αΙΙ6β3 человека); Некк1е е! а1. 1984, ОГГегепШШоп 26:49-54 (тАЬ к α6β4 человека); ХУешаскег е! а1. 1994 1.

Вю1. СЬет. 269:6940-8 (тАЬ к ανα5 человека); ХУешаскег е! а1. 1994, 1. Вю1. СЬет. 269:6940-8 (тАЬ к ανβ6 человека); СегГ-Вепкиккап е! а1. 1992 Еиг. 1. 1ттипо1. 22:273-7 (тАЬ к αЕβ7 человека); №кЫтша е! а1. 1994 1. Вю1. СЬет. 269:28708-15 (тАЬ к ανβ8 человека); Вокку е! а1. 1991 ЕМВО 1. 10:2375-85 (поликлональная антисыворотка к α8β1 человека); Сатрег е! а1. 1998, 1. Вю1. СЬет. 273:20383-20389 (поликлональная антисыворотка к α10β1 человека).

В общем виде иммортализованную клеточную линию (обычно клетки миеломы) сливают с лимфоцитами (обычно спленоцитами) от млекопитающего, иммунизированного целыми клетками, экспрессирующими данный антиген, например интегрин, и супернатанты культур полученных гибридомных клеток проверяют на наличие антител к антигену. См. в общем смысле КоЫет е! а1., 1975, Ыа!иге 265: 295-467, Соп!шиоик Си1!игек оГ Еикеб Се11к ЗесгеШщ АпйЬобу оГ РтебеГшеб 8ресШсйу.

Иммунизация может быть осуществлена с помощью стандартных процедур. Единица дозы и схема введения зависят от вида иммунизируемого млекопитающего, его иммунного статуса, веса тела млекопитающего и т.п. Обычно у иммунизированного млекопитающего берут кровь и сыворотку от каждого образца крови тестируют на конкретные антитела с применением соответствующих способов скрининга. Например, антитела к интегрину могут быть идентифицированы с помощью иммунопреципитации меченных 125Ι лизатов клеток, экспрессирующих интегрин. Антитела, включая, например, антитела к интегрину, могут также быть идентифицированы с помощью проточной цитометрии, например, путем измерения флуоресцентного окрашивания клеток, экспрессирующих антитело, проинкубированных с антителом, которое, как считается, узнает молекулы интегрина. Лимфоциты, применяемые при получении гибридомных клеток, обычно выделяют из иммунизированных млекопитающих, чьи сыворотки уже протестированы как позитивные на присутствие антител к интегрину с применением таких способов скрининга.

Обычно иммортализованная клеточная линия (например, миеломная клеточная линия) происходит из тех же видов млекопитающих, что и лимфоциты. Предпочтительными иммортализованными клеточными линиями являются мышиные миеломные клеточные линии, которые чувствительны к культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ-среда). Обычно ГАТ-чувствительные мышиные миеломные клетки сливают с мышиными спленоцитами, применяя полиэтиленгликоль с молекулярной массой 1500 (ПЭГ 1500). Гибридомные клетки, полученные после слияния, затем отбирают с применением ГАТ-среды, которая уничтожает неслитые и не продуктивно слитые миеломные клетки (неслитые спленоциты умирают через несколько дней, потому что они не трансформированы). Гибридомы, продуцирующие желаемое антитело, определяют путем скрининга культуральных супернатантов гибридом. Например, гибридомы, полученные для продукции антител к интегрину, могут быть проверены путем тестирования гибридомного культурального супернатанта на секретируемые антитела, обладающие способностью взаимодействовать с рекомбинантной клеточной линией, экспрессирующей интегрин.

Для получения гомологов антител, включая, например, гомологи антител к интегрину, которые представляют собой интактные иммуноглобулины, гибридомные клетки, которые протестированы как позитивные в таких тестах скрининга, культивируют в питательной среде в условиях и в течение времени, достаточных для секреции гибридомными клетками моноклональных антител в культуральную среду. Способы культивирования тканей и культуральные среды, которые подходят для гибридомных клеток, хорошо известны. Полученный в результате супернатант гибридомной культуры может быть собран, и антитела к интегрину необязательно могут быть дополнительно очищены с помощью хорошо известных способов.

В противоположном варианте желаемое антитело может быть получено путем введения гибридомных клеток в брюшную полость неиммунизированной мыши. Гибридомные клетки пролиферируют в брюшной полости, секретируя антитело, которое аккумулируется в виде асцитной жидкости. Антитело может быть собрано путем удаления асцитной жидкости из брюшной полости с помощью шприца.

Полностью человеческие гомологи моноклонального антитела против, например, интегринов представляют собой другой предпочтительный связывающий агент, который может блокировать антигены в способе изобретения. В своей интактной форме они могут быть получены с применением примированных ίη νίίτο спленоцитов человека, как описано Воегпег е! а1., 1991, 1. 1ттипо1. 147:86-95, Ргобисбоп оП Апбдеп-кресШс Нитап Мопос1опа1 АпНЬобпек йот 1п УНго-Ргптеб Нитап 8р1епосу1ек.

В противоположном варианте они могут быть получены с помощью спектрального клонирования, как описано Регккоп е1 а1., 1991, Ргос. №11. Асаб. 8сЕ И8А 88: 2432-2436, Сепегайоп оП бАегке Ыдй-аЕПшйу Нитап топос1опа1 апНЬобпек Ьу герейопге с1ошпд и Ниапд апб 81о11аг, 1991, 1. 1ттипо1. Ме1Нобк 141: 227-236, Сопк1гисНоп оП гергекеп1айуе 1ттипод1оЬи1т \'апаЬ1е гедюп сПЫА НЬгапек Пгот Нитап репПега1 Ь1ооб 1утрНосу1ек теННои! т тйго кбти1а1юп. Патент США 5798230 (25 авг. 1998, Ргосекк Пог 1Не ргерагабоп оП Нитап топос1опа1 апНЬобпек апб 1Непг ике) описывает получение моноклональных антител человека из В-клеток человека. В соответствии с данным способом В-клетки человека, продуцирующие антитела, иммортализуют с помощью заражения вирусом Эпштейна-Барра или его производным, которое экспрессирует ядерный антиген 2 вируса Эпштейна-Барра (ΕΒΝΛ2). Функция ΕВNА2, которая необходима для иммортализации, впоследствии выключается, что ведет к увеличению продукции антитела.

Еще в одном способе получения полностью человеческих антител патент Соединенных Штатов 5789650 (4 авг. 1998, Тгапкдешс поп-Нитап ашта1к Пог ргобистд Не1его1одоик апНЬобпек) описывает трансгенных животных, не являющихся человеком, способных продуцировать гетерологичные антитела, и трансгенных животных, не являющихся человеком, имеющих инактивированные гены эндогенных иммуноглобулинов. Гены эндогенных иммуноглобулинов подавляют с помощью антисмысловых полинуклеотидов и/или с помощью антисыворотки, направленной против эндогенных иммуноглобулинов. Гетерологичные антитела кодируются генами иммуноглобулинов, которые в норме не присутствуют в геноме данных видов животных, не являющихся человеком. Один или более трансгенов, содержащих последовательности неаранжированных гетерологичных тяжелых цепей иммуноглобулина человека, вводят животному, не являющемуся человеком, формируя в результате этого трансгенное животное, способное функционально реаранжировывать последовательности трансгенного иммуноглобулина и продуцировать спектр антител различных изотипов, кодируемых генами иммуноглобулинов человека. Такие гетерологичные антитела человека продуцируются в В-клетках, которые после этого иммортализуют, например, с помощью слияния с иммортализующей клеточной линией, такой как миелома, или путем воздействия на такие В-клетки с помощью других способов для иммортализации клеточной линии, способной продуцировать моноклональный гетерологичный гомолог полностью человеческого антитела.

Еще один предпочтительный связывающий агент, который может блокировать антигены интегрина или его фрагментов в способе изобретения, представляет собой гомолог антитела, приближенного к человеческому, обладающий способностью связывать белок интегрин или его фрагменты. После ранних способов получения химерных антител в патенте ЕР 0239400 (Аш1ег е1 а1.) описан новый подход, при котором антитела изменяют путем замещения их участков, определяющих комплементарность (СЭКк). от одного вида участками от другого вида. Данный процесс может быть применен, например, для замещения СЭК из доменов вариабельных областей тяжелой и легкой цепи 1д человека альтернативными СЭК из доменов вариабельных областей мыши. Данные измененные вариабельные области !д можно затем комбинировать с константными области 1д человека для создания антител, которые являются полностью человеческими, за исключением замещенных мышиных СЭВ. Можно предсказать, что такие СЭВ-замещенные антитела менее вероятно вызовут иммунный ответ у человека по сравнению с химерными антителами, поскольку СЭВ-замещенные антитела содержат значительно меньше компонентов, не являющихся человеческими. Способ получения моноклональных антител, приближенных к человеческим, путем трансплантации СЭВ назван реконструирование (В1есйшапп е! а1., 1988 Ыа!иге 332: 323-327, Векйаршд йитап ап11Ьоб1ек £от !йегару; Уетйоеуеп е! а1., 1988, 8с1епсе 239: 1534-1536, Векйаршд о£ йитап ап11Ьоб1ек иктд СОВ-дгайшд т Мопос1опа1 АпйЬоб1ек.

Обычно участки, определяющие комплементарность (СЭВ), антитела мыши пересаживают в соответствующие участки антитела человека, так как СЭВ (три в тяжелых цепях антитела, три в легких цепях) являются участками антитела мыши, которые связывают специфический антиген. Трансплантация СЭВ достигается с помощью генной инженерии, в результате чего определяют последовательности ДНК СЭВ с помощью клонирования сегментов генов вариабельных (V) областей тяжелой и легкой цепей мыши и затем перемещают соответствующие Vобласти человека с помощью сайт-направленного мутагенеза. На конечной стадии процесса добавляют сегменты гена константной области человека желаемого изотипа (обычно гамма I для СН и каппа для СЬ) и гены тяжелой и легкой цепей, приближенных к человеческим, коэкспрессируют в клетках млекопитающих для получения растворимого антитела, приближенного к человеческому.

Перенос данных СЭВ в антитело человека придает данному антителу антигенсвязывающие свойства природного мышиного антитела. Шесть СЭВ в антителе мыши структурно монтируются в каркасные участки ν-области. Причина успешности трансплантации СЭВ заключается в том, что каркасные участки между антителами мыши и человека могут иметь очень сходные 3Ό структуры со сходными точками прикрепления СЭВ, так что СЭВ могут быть взаимно заменены. Такие гомологи антител, приближенные к человеческим, могут быть получены, например, как у 1опек е! а1., 1986 Ыа!иге 321: 522-525, Вер1асшд !йе сотр1етеп1атйубе1егтйипд гещопк ш а йитап апбЬобу пйй !йоке £гот а тоике; В1есйтапп, 1988, Ыа!иге 332: 323327, Векйаршд йитап апйЬоб1ек £ог !йегару; Онееп е! а1., 1989, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 86:10029, А йиташхеб апйЬобу !йа! Ьшбк Ю !йе т!ег1еикт 2 гесер!ог; и Ог1апб1 е! а1., 1989, Ргос. На!1. Асаб. 8ск И8А 86:3833 С1ошпд 1ттипод1оЬийп уапаЫе боташк £ог ехргеккюп Ьу !йе ро1утетаке сйаш геасОоп.

Несмотря на это, определенные аминокислоты в каркасных участках, как предполагается, взаимодействуют с СЭВ и влияют на общую антигенсвязывающую аффинность. Прямой перенос СЭВ из антитела мыши для получения антитела, приближенного к человеческому, без каких-либо модификаций каркаса ν-области человека часто ведет к частичной или полной потере связывающей аффинности. В ряде случаев, по-видимому, критическим является изменение остатков в каркасных участках акцепторного антитела для получения связывающей активности.

Онееп е! а1., 1989, Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А 86: 10029-10033, А йиташхеб апйЬобу !йа! Ьшбк !о !йе т!ег1еикт 2 гесер!ог и патентная заявка XVО 90/07861 (Рто!еш Оекщп ЬаЬк 1пс.) описали получение антитела, приближенного к человеческому, которое содержит модифицированные остатки в каркасных участках акцепторного антитела, путем сочетания СЭВ тАЬ мыши (анти-Тас) с каркасом иммуноглобулина человека и константными областями. Они продемонстрировали одно решение проблемы потери связывающей аффинности, которая часто возникает в результате прямого переноса СЭВ без каких-либо модификаций остатков каркаса ν-области человека; данное решение включает две ключевых стадии. Во-первых, каркасные участки ν-области человека выбирают с помощью компьютерного анализа для оптимальной гомологии последовательности белка каркасных участков ν-области природного мышиного антитела, в данном случае антиТас МаЬ. На второй стадии с помощью компьютера моделируется третичная структура νобласти мыши для того, чтобы визуализировать аминокислотные остатки каркасного участка, которые, скорее всего, взаимодействуют с мышиными СЭВ, и данные мышиные аминокислотные остатки затем накладывают на гомологичный каскадный участок человека. Их подход к применению гомологичных каркасных участков человека с предполагаемыми контактирующими остатками мыши привел к получению антител, приближенных к человеческим, с величинами связывающей аффинности, сходными с природным антителом мыши, что показано в отношении антител, специфичных для рецептора интерлейкина 2 (Онееп е! а1., 1989 [выше]), а также для антител, специфичных для вируса герпеса простого (Ηδν) (Со. е! а1., 1991, Ргос. Ыа11. Асаб. 8οΐ. И8А 88: 2869-2873, Ншпашхеб ап11Ьоб1ек £от апйу1та1 !йегару.

В соответствии с описанным выше двухступенчатым подходом в заявке ν090/07861 Онееп е! а1. выделяют несколько критериев для конструирования иммуноглобулинов, приближенных к человеческим. Первым критерием является применение в качестве человеческого акцептора каркаса от конкретного иммуноглобулина человека, который обычно гомологичен иммуноглобулину-донору не от человека, который приближают к человеческому, или применение консенсусного каркаса от многих антител человека. Вторым критерием является применение донорской аминокислоты, предпочтительнее акцепторной, если остаток акцептора человека является необычным, а донорский остаток типичен для последовательностей человека в конкретном остатке каркаса. Третьим критерием является применение остатка аминокислоты донорского каркаса, предпочтительнее акцепторного, в положениях, непосредственно прилегающих к СЭВ.

Можно использовать другой подход (см. Тетрек!, 1991, Вю1есНпо1оду 9: 266-271, Векйаршд а Нита η топос1опа1 апЕЬобу ΐο ίηΙιίΗΗ йитаи гекрйаЮгу 8уисуйа1 νίπικ тГесЕоп ίη у1уо) и применять в качестве стандарта рамки Vобласти, которые происходят от ΝΕΑΜ и ΚΕΙ тяжелой и легкой цепей, соответственно, для трансплантации СОВ без радикального введения мышиных остатков. Преимущество применения подхода Тетрек! е! а1., 1991 для конструирования антител, приближенных к человеческим, на основе ΝΕΑΜ и ΒΕΙ состоит в том, что 3-мерные структуры вариабельных районов ΝΕΑΜ и ΒΕΙ известны из рентгеноструктурной кристаллографии и, таким образом, можно смоделировать специфические взаимодействия между СЭВк и остатками рамки ν-области.

Лечение субъектов является эффективным как для человека, так и для животных, страдающих от данных состояний. Субъекты-животные, к которым применимо изобретение, включают как домашних животных, так и домашний скот, которых разводят либо в качестве комнатных животных, либо для коммерческих целей. Примерами являются собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи и козы.

В способах изобретения антитела, включая, например, анти^ЕА-1 антитело, могут быть введены парентерально. Применяемый здесь термин парентеральный включает подкожный, внутривенный, внутримышечный, внутрисуставный, внутрисиновиальный, внутригрудинный, внутриоболочечный, внутрипеченочный, внутриочаговый и внутричерепной способы введения или инфузии.

Фармацевтические композиции данного изобретения включают любое из соединений настоящего изобретения или их фармацевтически приемлемые производные совместно с фармацевтически приемлемым носителем. Применяемый здесь термин носитель включает известные приемлемые адъюванты и носители.

В соответствии с данным изобретением фармацевтические композиции могут быть в форме стерильных препаратов для инъекций, например стерильной водной или маслянистой суспензии для инъекций. Данная суспензия может быть составлена в соответствии со способами, известными в данной области техники, с применением подходящих диспергирующих и увлажняющих агентов, а также суспендирующих агентов.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно давать перорально. При пероральном приеме их можно вводить в любой лекарственной форме, приемлемой для перорального введения, включая, но не ограничиваясь этим, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы.

Для местного применения фармацевтические композиции могут быть составлены в виде подходящей мази, содержащей активный компонент, суспендированный или растворенный в одном или более носителей.

Фармацевтические композиции настоящего изобретения можно также вводить с помощью интраназального аэрозоля или ингаляции при использовании распылителя, ингалятора сухого порошка или ингалятора с фиксированными дозировками.

Дозировка и величина доз соединений настоящего изобретения, эффективных для оказания желаемых эффектов, должны зависеть от множества факторов, таких как природа ингибитора, размер субъекта, цель лечения, природа патологии, подвергаемой лечению, конкретной применяемой фармацевтической композиции и заключения лечащего врача. Применим уровень доз активного ингредиента между приблизительно 0,001 и приблизительно 100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно между приблизительно 0,1 и приблизительно 50 мг/кг массы тела в день. Более предпочтительно, чтобы гомологи антител вводили в интервале доз между приблизительно 0,1 и приблизительно 20 мг/кг массы тела/день, предпочтительно в интервале между приблизительно 0,1 и приблизительно 10 мг/кг массы тела/день с интервалами каждые 114 дней. В другом предпочтительном осуществлении антитело вводят в дозе от приблизительно 0,3 до 1 мг/кг при в.б. введении. В другом предпочтительном осуществлении антитело вводят в дозе от приблизительно 5 до 12,5 мг/кг при в. в. введении. Предпочтительно композицию антител вводят в количестве, эффективном для обеспечения уровня антитела в плазме, по меньшей мере, 1 мкг/мл.

Специалисты в данной области техники могут легко протестировать, имеет ли антагонист изобретения подразумеваемый эффект. Например, клетки, содержащиеся в образце эпителия индивидуума, тестируют на присутствие агента ίη νίΙΐΌ (или ех νί\Ό) с применением второго реагента для обнаружения введенного агента. Например, это может быть антитело, меченное флуорохромом, специфичное для введенного агента, который затем измеряют путем стандартного анализа с помощью ЕАС8 (лазерный анализатор клеток по интенсивности флуоресценции). В противоположном варианте присутствие введенного агента определяют ίη ν Иго (или ех νίνο) по отсутствию способности или сниженной способности клеток индивидуума связывать тот же агент, который сам был промечен (например, с помощью флуорохрома). Предпочтительная дозировка должна вызывать определяемое покрытие огромного большинства «сж»-позитивных клеток. В случае гомолога антитела предпочтительно, чтобы покрытие поддерживалось в течение периода 1-14 дней.

Практика настоящего изобретения, если не указано иначе, должна применять традиционные способы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, техники рекомбинантной ДНК, белковой химии и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие способы описаны в литературе. См., например, Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬога!огу Мапиа1, 2пб еб1ίίοπ. (8атЬгоок, ЕгбксБ апб МашаБк, ебк.), Со1б 8ргшд НагЬог БаЬога!огу Ргекк, 1989; ΌΝΑ С1ошпд, Уо1итек I аиб II (Ό.Ν. С1о\^гег. еб.), 1985; О1щогшс1еоббе 8уп!Бек1к, (М.1. Сай, еб.), 1984; патент США № 4683195 (МиШк е! а1.,); №с1ек Ас1б НуЬпб|/а1юп (В. И. Натек апб 8.1. Нфщпк ебк.), 1984; Тгапкспр!юп апб Тгапк1а!юп (Β.Ό. Натек апб 8.1. Нфдшк, ебк.), 1984; СиНиге о! Ашта1 Се11к (К.Б РгекБпеу, еб.), А1ап К. Ыкк, 1пс., 1987; ИптоБШ/еб Се11к апб Еп/утек, 1КБ Ргекк, 1986; А Ргасбса1 Сшбе !о Мо1еси1аг С1ошпд (Β. РегЬа1), 1984; Ме!Бобк 1п Епхуто1оду, Уо1итек 154 апб 155 (\Си е! а1., ебк.), Асабетю Ргекк, Νονν Уогк; Сепе ТгапкБег Уес!огк Бог Маттайап Се11к (1.Н. МШег апб М.Р. Са1ок, ебк.), 1987, Со1б 8рппд НагЬог БаЬога!огу; 1ттипосйет1са1 Ме!Бобк ш Се11 апб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апб ^а1кег, ебк.). Асабетю Ргекк, Бопбоп, 1987; НапбЬоок о! Ехрептеп! 1ттипо1оду, Уо1итек 1-1У (Э.М. \СеБ апб С.С. В1аскте11, ебк.), 1986; Машри1а1тд !Бе Мойке ЕтЬгуо, Со1б 8ргтд НагЬог БаЬога!огу Ргекк, 1986.

Следующие примеры предлагаются для иллюстрации настоящего изобретения и не должны толковаться как ограничивающие его.

Примеры

Химические реактивы

Флуоресцеина изотиоцианат (ФИТЦ) приобретен у 8щта СБетка1 Со. (81. Бошк, МО). Кротоновое масло приобретено у Κ.’Ν ВюсБетъ са1к (Аигога, ОН). Цельную кровь овец в растворе А1ке\^гегк получали от Еак! Асгек Вю1офса1к (8ои!БЬг1бде, МА). Коллаген типа I из хвоста крысы и коллаген типа ГУ мыши приобретали у Со11аЬога1гуе КекеагсБ Шс. (ВебГогб, МА) и С1Ьсо (СаББегкЬигд, МО), соответственно.

Мышей-самок линии Ва1Ь/с в возрасте 6-8 недель приобретали у Тасошс (Сегтап!о^п, ΝΥ), а мыши на основе Ва1Ь/с с недостаточностью α 1 β 1 интегрина были описаны ранее (3).

Пример 1.

Моноклональные антитела.

Блокирующие функциональную активность антигенов мыши тАЬ получали в форме без азида и с низким содержанием эндотоксинов: На31/8 (антитело хомячка к СИ49а; интегрин α1) (Мепбпск е! а1. 1995. БаЬ. Ищек! 72:367375), На1/29 (антитело хомячка к СЭ49Ь; интегрин α2β 1 (Мепбпск е! а1. 1995. БаЬ. ЬкекГ 72:367-375; Мепбпск, О.Б. апб Ц.М. Ке11у 1993 БаЬ. Ищек! 69:690-702), контрольное тАЬ хомячка группы II На4/8 (антитело хомячка к КБН) (Мепбпск, О.Б. апб Ц.М. Ке11у 1993 БаЬ. Ищек! 69:690-702), и Р8/2 (антитело крысы к СИ49б; цепь α4β1 интегрина) (М1уаке е! а1. 1991 I. Ехр. Меб. 173:599-607). Кроме того, следующие блокирующие функциональную активность антигенов мыши тАЬ были приобретены в ферме препаратов без азида и с низким содержанием эндотоксинов у РБагтшдеп (8ап О1едо, СА): НМ|И-1 (антитело хомячка к СИ29; β1 цепь интегрина) (Ко1о е! а1. 1995 ^1. Iттиηο1. 7:835-842), На2/5 (антитело хомячка к СИ29; β1 цепь интегрина) (Мепбпск, И.Б. апб И.М. Ке11у 1993 БаЬ. Ищек! 69:690-702), 3Е2 (антитело хомячка к СИ54; ГСАМ-Ц (8сБеуп1ик е! а1. 1993 I. ^типоЕ 150:655-663), 5Н10-27 (антитело крысы к СИ49е; интегрин α5) (КтакБц Т., апб Т.А. 8ргтдег, 1994, В1ооб Се11к. 2С:25-44), СоН3 (антитело крысы к СИ49Г; интегрин α6) (8оппепЬегд е! а1. 1987 I. Вю1. СБет. 262:10376-10383), и изотипные контрольные тАЬ крысы К35-95 ЦдС2а крысы) и К35-38 ЦдС2Ь крысы).

Исследование адгезии.

Спленоциты от мышей Ва1Ь/с культивировали в присутствии 20 нг/мл ИЛ-2 в течение 712 дней. Адгезию клеток к коллагену типа I и типа IV определяли, как описано ранее (Со1\га1к е! а1. 1996 I. С1ш. Ищек! 97:2469-2477). Вкратце, 96-луночные планшеты Мах1когр (Шпс, №р1егуШе, Ш) покрывали либо 10 мкг/мл коллагена типа IV, либо 5 мкг/мл коллагена типа I и неспецифические сайты блокировали 1% БСА. Активированные ИЛ-2 спленоциты метили 2 мкМ ВСЕСР [2',7'-бис(карбоксиэтил)-5(6)карбоксилфлуоресцинпентаацетоксиметиловым эфиром] (Мо1еси1аг РгоЬек, Еидепе, ОК) и инкубировали с 10 мкг/мл указанных тАЬ в течение 15 мин. После этого в покрытые лунки добавляли 10⁵ клеток в 0,25% БСА в среде КРМI и инкубировали в течение 60 мин при 37°С. Несвязавшиеся клетки удаляли трехкратной промывкой с помощью 0,25% БСА в КРМБ Адгезию количественно определяли с помощью флуоресцентного планшетного ридера Су!оР1иог 2350 (МЛИроге, ВебГогб, МА). Измеряли отношение связавшихся клеток к добавленным клеткам и рассчитывали процент (нормализованный к 100%) адгезии относительно клеток, обработанных контрольным тАЬ. Вычитали фоновые величины, обусловленные адгезией к лункам, покрытым одним БСА.

Экспрессия и функциональная блокада α1β1 и α2β1 на активированных лейкоцитах.

Принимая во внимание ключевую роль лейкоцитов в воспалении, заявители решили проверить, способны ли тЛЬ к α1 и α2 блокировать адгезию лейкоцитов к коллагенам. Для получения лейкоцитов, экспрессирующих высокий уровень как α1, так и α2, Т-клетки мыши стимулировали ίη νίίτο ИЛ-2 в течение 7-12 дней. Данные клетки экспрессировали как α1, так и α2 на высоком уровне (фиг. 1А) и хорошо связывались с поверхностями, покрытыми как коллагеном типа IV, так и коллагеном типа I (фиг. 1В). Адгезия к коллагену типа IV частично подавлялась одним тАЬ к α1, но не подавлялась одним тАЬ к α2. Напротив, адгезия к коллагену типа I полностью подавлялась тАЬ к α2, а одно тАЬ к α1 вызывало лишь частичное ингибирование. Оба тАЬ к β1, а также сочетание тАЬ к α2 и α1 полностью ингибировали адгезию к коллагену типов I и IV. Показав, что интегрины α1β1 и α2β1 экспрессируются на активированных Т-клетках и что тАЬ к α1 и α2 способны функционально блокировать адгезию лейкоцитов к коллагенам, заявители применили эти тАЬ для исследования роли данных интегринов ίη νίνο на животных моделях воспалительных расстройств.

Пример 2. Ингибирование ответов ΌΤΗ под действием тАЬ к интегринам.

Индуцированные эритроцитами барана ответы гиперчувствительности замедленного типа (ΌΤΗ) применяли в адаптированном варианте ранее опубликованной процедуры (Ниг1ге1 с1 а1. 1992 Се11 Iттиηο1. 142:252-263). Вкратце, мышей иммунизировали п/к со спины 2х10⁷ эритроцитов барана в 100 мкл ФСБ в день 0. Мышам давали на день 5 инъекцию 1х10⁸ эритроцитов барана в 25 мкл ФСБ п/к в подушечку правой задней лапы. Толщину подушечки лапы измеряли с помощью инженерного кронциркуля (МЩЦоуо/ МЛ, Рагатик, N1) через 20 ч после повторного введения антигена и рассчитывали набухание подушечки лапы. Результаты выражали в виде среднего процента увеличения толщины подушечки ±8ЕМ и рассчитывали как % увеличения=[1-(толщина подушечки правой лапы через 20 ч после повторного введения антигена/толщина подушечки неинъецированной левой лапы через 20 ч после повторного введения антигена)] х 100%. Для блокирования эффекторной фазы индуцированного эритроцитами барана ответа ΌΤΗ за 1 ч до повторного введения антигена на день 5 в/бр вводили терапевтическое или контрольное тАЬ (100 мкг), которые получали в соответствии со способами, описанными в примере 1.

ΌΤΗ, индуцированная эритроцитами барана, является хорошо охарактеризованной моделью воспаления ίη νίνο, и в частности псориаза, которую применяли для демонстрации значения множества цитокинов и адгезивных молекул для воспаления (Теббег е1 а1. 1995 I. Ехр. Меб. 181:2259-2264, Тегакййа е1 а1. 1996 I. Iттиηο1. 156:4638-4643). Сенсибилизированные эритро цитами барана мыши получали тАЬ к интегринам за 1 ч до повторного введения антигена в подушечку лапы, и оценивали воспаление через 20 ч по результатам измерения увеличенной толщины подушечки лапы. У мышей, получавших ФСБ и контрольный хомячка, показано увеличение толщины подушечки лапы на 6070% через 20 ч после повторного введения антигена (фиг. 2). По сравнению с обработкой контрольным хомячка, тАЬ к α1 или α2 вызывали 68 и 60% ингибирование толщины подушечки лапы, соответственно. Сочетание тАЬ к α1 и α2 приводило к ингибированию на 71%, что свидетельствует о низком аддитивном эффекте по сравнению с тАЬ к α1 или α2, взятыми по отдельности. Лечение другими тАЬ к интегринам было также эффективно в отношении ингибирования эффекторного ответа ΌΤΗ. Степень ингибирования, наблюдавшаяся при лечении различными тАЬ, составляла 49% (анти-сН). 23% (анти-пЭ) и 57% (ΗΜπ-α6). Наконец, блокада с помощью тАЬ общей для интегринов субъединицы β1 (тАЬ ΗΜΒΕ1) тормозила эффекторный ответ ΌΤΗ на 67%.

Пример 3. Ингибирование с помощью тАЬ к интегринам эффекторных ответов ΕΗ8.

Контактную гиперчувствительность (ΟΗ8) к ФИТЦ оценивали, как описано ранее (Сакрап е1 а1. 1991 Ση СиггегИ Рго1осо1к ίη [ттипо1оду. ТЕ. СоЛдащ А.М. КгшкЬеек, Ό.Η. Магдийек, Е.М. 8^асй, апб ЯгоЬег ебНогк. 1о1т \Уйеу & 8опк, №\ν Уогк. 8сс6оп 4.2:1). Вкратце, мышей сенсибилизировали окраской 100 мкл 0,5% ФИТЦ в смеси 1:1 ацетон/дибутилфталат, наносимой на обритую спину в день 0. Через 10 дней животным повторно наносили 5 мкл 0,5% ФИТЦ на обе стороны каждого уха. Ответ набухания ушей определяли по толщине уха, измеренной с помощью инженерного кронциркуля (МШоуо/МТС, Рагатик, N1) во время повторного нанесения антигена (день 10) и через 24 ч, и результаты выражали в виде среднего процента увеличения исходной толщины уха ±8ЕМ. Увеличение толщины уха рассчитывали как % увеличения=[1-(толщина уха через 24 ч после повторного нанесения антигена/толщина уха в момент повторного нанесения антигена)]х100%. Для блокирования эффекторной фазы ответа ΟΗ8 за 4 ч до повторного нанесения антигена на день 10 в/бр вводили терапевтическое или контрольное тАЬ (250 мкг). В качестве негативных контролей (увеличение толщины уха никогда не превышало 2%) служили мыши, сенсибилизированные антигеном, на уши которых повторно наносили только носитель (контроль на носитель), или мыши, уши которых обрабатывали ФИТЦ без предварительной сенсибилизации (контроль на раздражение).

Принимая во внимание, что ΟΗ8 по механизмам отлична от ΌΤΗ и включает иные эффекторные клетки, заявители исследовали дей ствие тЛЬ к интегринам на эффекторную фазу ответа СН8. Мышей сенсибилизировали гаптеном с помощью ФИТЦ, наносимого на их обритую спину, с последующим через 10 дней нанесением ФИТЦ на ухо, вызывающим на следующий день воспалительный ответ. У сенсибилизированных ФИТЦ мышей наблюдалось 60-70% увеличение толщины через 24 ч после повторного нанесения антигена (фиг. 3). В соответствии с опубликованными данными (Зсйеушик с1 а1. 1. 1ттипо1. 150:655-663) обработка тАЬ к 1САМ-1 подводила к 51% ингибированию набухания уха. По сравнению с контрольным тАЬ хомячка обработка мышей тАЬ к α 1 или α2 за 4 ч до повторного нанесения антигена приводила к 37 и 57% ингибированию набухания уха, соответственно (фиг. 3). Сочетание тАЬ к α1 и α2 приводило к слегка более сильному ингибированию набухания уха (65%). Обработка другими тАЬ к β1 интегринам показала, что в то время как тАЬ к α4 и α5 не вызывали ингибирования индуцированного ФИТЦ эффекторного ответа СН8 по сравнению с контрольным тАЬ крысы, обработка тАЬ к α6 приводила к 86% ингибированию эффекторных ответов. Наконец, блокада с помощью тАЬ общей субъединицы β1 интегринов ингибировала эффекторные ответы СН8 на 74%. Сходные результаты в отношении СН8 были получены с применением разных линий мышей (С57/ВЬ6, 129/δν) и другого сенсибилизирующего агента (оксазолона) (данные не показаны). Сходно с результатами, наблюдавшимися в модели ИТН, индуцированной эритроцитами барана, гистологический анализ воспаленных ушей показал, что как образование отека, так и лейкоцитариал инфильтрация ингибировались обработкой тАЬ к α1 и α2.

В соответствии с данными о том, что α1β1 и α2β1 могут экспрессироваться на активированных ИЛ-2 спленоцитах, анализ лимфатических узлов сенсибилизированных антигеном (ФИТЦ или оксазолоном) мышей выявил экспрессию α1β1 и α2β1 исключительно на СИ44¹¹¹ЬРА-1^Ь1-активированных СИ4+- и СИ8+-Т-клетках (результаты не показаны). Обработка мышей тАЬ к α1 и α2 не приводила к исчезновению данных клеток, поскольку не изменялось количество наблюдаемых в ответ на сенсибилизацию антигеном активированных Т-клеток в селезенке и лимфатических узлах в модели СН8. Кроме того, эффекторные клетки не подавлялись и функционально, поскольку продолжительная обработка сенсибилизированных антигеном мышей с помощью тАЬ к α1 и α2 (дни 10-16) не влияла на воспалительный ответ мышей, которым повторно наносили антиген на день 20 (результаты не показаны).

Пример 4.

Эффекторные ответы СН8 снижены у мышей с недостаточностью α1β1. Для того чтобы исключить вероятность того, что ингибиторное действие α1β1 в эффекторном ответе СН8, вызванной ФИТЦ, опосредовалось тАЬ, были проведены эксперименты на мышах дикого типа и мышах с недостаточностью α 1 β 1-интегрина (фиг. 4). Ингибирование с помощью тАЬ эффекторной фазы у мышей дикого типа соответствовало предыдущим результатам с 56% ингибированием толщины уха, наблюдаемым с тАЬ к α1, 56% - с тАЬ к α2 и 62% - с сочетанием тАЬ к α1 и α2. Эффекторная фаза СН8 была значительно уменьшена у необработанных мышей с недостаточностью α1β1 по сравнению с необработанными мышами дикого типа (увеличение толщины уха на 30% против 71%, соответственно). Как и ожидалось, степень набухания уха у необработанных мышей с недостаточностью α1β1 равнялась степени набухания уха, наблюдаемой у мышей дикого типа, обработанных тАЬ к α1. Наконец, блокада α2β1 с помощью тАЬ у мышей с недостаточностью α1β1 приводила лишь к слабому усилению ингибирования набухания уха, что соответствует результатам, наблюдавшимся у мышей дикого типа, обработанных сочетанием тАЬ к α1 и α2.

Пример 5.

Для дальнейшего исключения возможности того, что ингибиторное действие тАЬ к интегринам, наблюдаемое в обеих моделях воспаления, ИТН и СН8. обусловлено общим противовоспалительным действием, опосредуемым тАЬ к α1 и α2, исследовали эффект данных тАЬ на вызывающий раздражение дерматит.

Для оценки вызывающего раздражение дерматита мышей красили 5 мкл 0,8% кротонового масла в ацетоне с обеих сторон каждого уха. Лечебные или контрольные антитела давали за 4 ч до нанесения раздражителя. Набухание уха измеряли через 24 ч, как описано выше, и сравнивали с толщиной уха до нанесения кротонового масла. Результаты выражали в виде процента увеличения исходной толщины уха ±8ЕМ, как описано выше. В качестве отрицательного контроля служили мыши, крашенные одним ацетоном (контроль на носитель).

Было обнаружено, что через 24 ч после обработки кротоновым маслом толщина уха мышей значительно возрастает (48%) по сравнению с мышами, получавшими только носитель (ацетон). Токсичное набухание уха, вызванное кротоновым маслом, не изменялось существенно у мышей, предварительно обработанных тАЬ к α1 или α2, по сравнению с животными, обработанными ФСБ или контрольным тАЬ (фиг. 5). Гистологическое исследование ушей, обработанных кротоновым маслом, показало отсутствие различий в количестве или типе инфильтровавшихся клеток или образования отека у мышей, обработанных тАЬ к α1 или α2, по сравнению с мышами, обработанными контрольным тАЬ, или мышами, обработанными ФСБ (результаты не показаны).

Пример 6. Ингибирование артрита с помощью α1β1 и α2β1.

Поскольку α 1 β 1 активно экспрессируется на клетках инфильтровавшихся в синовиальную жидкость больных артритом, заявители решили проверить, будут ли шЛЬ к α1 или α2 оказывать ингибирующее действие в ранее описанной ускоренной модели артрита (ТегаЮ е! а1. 1992 1. 1ттипо1. 148:2103-2108; Тега!о е! а1. 1995 Аи101ттипйу. 22:137-147).

Наборы Аг111годеп-С1А АпНЬобу приобретали у §!га!адепе (Ьа 1о11а. СА) и артрит индуцировали с помощью широко принятого протокола (Тега!о е! а1. 1992 I. 1ттипо1. 148:21032108; Тега!о е! а1. 1995 Аи1о1ттипйу. 22:137147). Вкратце, артрит индуцировали с помощью в/бр введения смеси 4 тАЬ к коллагену типа II (по 1 мг каждого) в день 0 с последующим в/бр введением 50 мкг ЛПС в день 3. На протяжении последующих 3-4 дней у мышей развивалось набухание запястий, лодыжек и пальцев. Лечебное или контрольное тАЬ (250 мкг) вводили в/бр за 4 ч до инъекции тАЬ к коллагену в день 0 и еще раз за 4 ч до введения ЛПС в день 3 с последующим продолжением введения на каждый 3-ий день на протяжении эксперимента. Начиная с дня 3, мышей оценивали на предмет развития артрита. Тяжесть артрита в каждой лапе оценивали с помощью четырехбалльной системы. 0=норма; 1=легкое покраснение, слабое набухание лодыжки или запястья; 2=умеренное набухание лодыжки или запястья; 3=сильное набухание, включая некоторые пальцы, лодыжку и стопу; 4=максимальное воспаление.

Тяжелый артрит у мышей линии Ва1Ь/с развивался в пределах 72 ч после введения ЛПС и сохранялся на протяжении более 3 недель. Ни изолированное введение тАЬ к коллагену, ни изолированное введение ЛПС не индуцировало артрит. У мышей, получавших контрольное тАЬ, наблюдался такой же тяжелый артрит, как и мышей, обработанных ФСБ (фиг. 6). Напротив, обработка одним тАЬ к α1 приводила к значительному снижению (78%) артрита, причем данное снижение сохранялось на протяжении всего эксперимента. Обработка одним тАЬ к α2 также оказывала благоприятное действие, выражающееся в снижении показателя артрита на 32% по сравнению с мышами, обработанными контрольным тАЬ. Сочетание тАЬ к α1 и α2 давало степень ингибирования, сходную с наблюдавшейся при применении одного тАЬ к α1.

Пример 7. Гистологический анализ эффекта обработки с помощью тАЬ к α1 и α2 на воспалительный клеточный инфильтрат.

Последующий гистологический анализ индуцированного эритроцитами барана ответа ΌΊΗ подтвердил способность обработки с помощью тАЬ к α1 и α2 модулировать вызванный воспалительный ответ (фиг. 7). В подушечке лапы мыши, сенсибилизированной эритроцита ми барана, но не инъецированной повторно (фиг. 7 панель А), воспалительный клеточный инфильтрат практически не обнаруживался по сравнению с подушечкой лапы той же мыши, повторно инъецированной эритроцитами барана (фиг. 7 панель В). Обработка сенсибилизированных эритроцитами барана мышей с помощью тАЬ к α1 и α2, взятыми либо по отдельности, либо в сочетании, значительно снижала количество данных инфильтровавшихся клеток, обнаруживаемых в подушечках лап мышей, повторно инъецированных эритроцитами барана, по сравнению с мышами, обработанными контрольным тАЬ (фиг. 7 панель С-Р). Более детальное изучение инфильтровавшихся клеток показало, что большинство клеток составляют нейтрофилы при небольшом количестве присутствующих моноцитов и лимфоцитов, и подтвердило, что обработка тАЬ к α1 и α2 значительно снижает количество данных клеток (фиг. 7 панель С-Η).

Пример 8. Иммуногистохимическое выявление экспрессирующих α1 клеток в воспалительном клеточном инфильтрате.

Иммуногистохимию проводили для более точного определения природы инфильтровавшихся клеток и определения того, экспрессируют ли они связывающие коллаген интегрины (фиг. 8). Инфильтровавшиеся клетки из воспаленной подушечки лапы необработанной мыши исследовали на предмет экспрессии интегрина α1β1 и маркеров клеточной линии (фиг. 8). Было обнаружено, что интегрин α1β1 экспрессируется многими инфильтрованными лейкоцитами (фиг. 8А). Для установления природы инфильтровавшихся клеток и распределения экспрессии α1β1 применяли двойную иммуногистохимию (фиг. 8В). С помощью маркеров клеточных линий было обнаружено, что инфильтрат состоит, главным образом, из гранулоцит/моноцитов (Мас-1+), причем многие из данных клеток являются нейтрофилами (Сг1+), наряду с меньшим количеством Т-лимфоцитов (СИ3+) (фиг. 8В). Экспрессия интегрина α1β1 была обнаружена среди всех трех подтипов клеток, причем α1 экспрессировался на подтипе Мас-1+ - гранулоцит/моноцитов, подтипе Сг1+ нейтрофилов и большинстве инфильтровавшихся СЭ3+ - Т-лимфоцитов (фиг. 8В). Детальный иммуногистохимический анализ показал, что хотя обработка тАЬ к α1 и α2 вызывала снижение количества инфильтровавшихся клеток, изменений клеточного состава инфильтрата не наблюдалось (результаты не показаны). Иммуногистохимическая окраска тАЬ с ФИТЦ против хомячка подтвердила способность тАЬ к α1 и α2 локализоваться в воспаленной подушечке лапы (результаты не показаны).

Пример 9. Подавление артрита с помощью тАЬ к α1β1 и α2β1 у мышей с недостаточностью α1.

Поскольку α1 β 1 активно экспрессируется на клетках, инфильтрующихся в синовиальную жидкость больных артритом, заявители решили проверить, будут ли шЛЬ к α1 или а2 оказывать ингибиторное действие в ранее описанной ускоренной модели артрита (Тега!о е! а1. 1992 1. 1ттипо1. 148:2103-2108; Тега1о е! а1. 1995 АШоиптипЦу 22:137-147). Данная модель включает введение мышам смеси тАЬ к коллагену типа II с последующим введением ЛПС, в результате чего в течение последующих 3-7 дней развивается артрит. Мыши получали данное тАЬ на каждый 3-ий день, начиная с дня 0, и развитие артрита оценивалось на каждый 3-ий день. У всех мышей в течение 72 ч после инъекции ЛПС развивался тяжелый артрит, который сохранялся на протяжении более 3 недель. Введение тАЬ к коллагену или ЛПС по отдельности не индуцировало артрит. У мышей, получавших контрольное антитело, наблюдался артрит такой же степени тяжести, как и у мышей, получавших ФСБ (фиг. 9 А). Напротив, обработка одним тАЬ к а1 вызывала значительное снижение (79% и выше) артрита, причем этот эффект сохранялся на протяжении всего эксперимента. Обработка одним тАЬ к а2 также оказывала благоприятное действие, что выражалось в снижении показателя артрита на 37% по сравнению с мышами, обработанными контрольным тАЬ. Сочетание тАЬ к а1 и а2 вызывало ту же степень ингибирования, что и обработка одним тАЬ к α1. Снижение показателя артрита при обработке тАЬ к α1 наблюдалось у всех мышей и выгодно отличалось от наблюдавшегося при использовании нескольких других основанных на применении тАЬ способов лечения артрита, таких как применение растворимого 1д-гибридного белка к рецептору для ΤΝΡ (Моп е! а1. 1996 I. 1ттипо1. 157:3178-3182) и анти-Мас-1 (Тау1ог е! а1. 1996 1шшипо1оду. 88:315-321), анти-а4 (8е1йде 1996 I. Кйцта!о1. 23:2086-2091) и анти1САМ-1 (Как1то!о е! а1. 1992 Се11 1ттипо1. 142:326-337) (фиг. 9). В соответствии с основанными на тАЬ данными, свидетельствующими о важной роли α1β1 при артрите, у необработанных мышей с недостаточностью α1 наблюдалось значительное снижение показателя артрита по сравнению с мышами дикого типа (фиг. 9В).

Пример 10. Влияние обработки с помощью тАЬ к α1 на иммунопатологию пораженных артритом суставов.

Суставы от мышей дикого типа с артритом (день 8), получавших либо контрольное тАЬ, либо тАЬ к α1, визуально и гистологически сравнивали с суставами нормальной необработанной мыши (фиг. 10). На визуальном уровне суставы мышей, обработанных контрольным тАЬ, проявляли покраснение и набухание всей стопы, включая пальцы, в то время как у мышей, обработанных тАЬ к α1, не наблюдались или наблюдались лишь слабые признаки воспаления суставов или пальцев. Гистологическое исследование показало серьезные изменения в пораженных артритом суставах, обработанных контрольным тАЬ, с обильной инфильтрацией в синовиальную ткань клеток воспаления, адгезией клеток к поверхности сустава и выраженным разрушением хряща, судя по потере протеогликанов (фиг. 10). В соответствии с предшествующими сообщениями (Тега!о е! а1. 1992 I. 1ттипо1. 148:2103-2108; Тега!о е! а1. 1995 Аи!о1ттипйу, 22:137-147), большинство инфильтрующихся клеток при данной модели составляют нейтрофилы. Обработка мышей с помощью тАЬ к α1 резко снижала количество воспалительного инфильтрата и степень разрушения хряща (фиг. 10).

Пример 11.

Развитие артрита задерживается в отсутствие лимфоцитов, а ингибирование артрита под действием тАЬ к α1 происходит в отсутствие лимфоцитов. Для определения того, какие типы клеток могли бы быть важны для модели артрита, индуцированного тАЬ к коллагену, заявители сравнили способность мышей дикого типа линии В6-129 и мышей линии В6-129 с недостаточностью РАС-1 к развитию артрита (фиг. 11). Генетическая делеция гена РАС-1 (гена 1, активирующего рекомбинацию) приводит к полной потере зрелых Т и В-лимфоцитов (МотЬаейк е! а1. 1992 Се11 68:869-877). Артрит развивался как у мышей дикого типа, так и мышей с дефектом КАС-1, хотя кинетика индукции у дефектных по КАС-1 мышей была значительно более медленной (фиг. 11). Данные результаты позволяют предполагать, что, хотя лимфоциты участвуют в данной модели артрита, они не являются необходимыми для развития и прогрессии заболевания. В опубликованных сообщениях, в которых исследовали влияние недостаточности КАС-1 у мышей в других моделях артрита, также было обнаружено, что утрата Т- и В-лимфоцитов задерживает начало артрита (Р1о^5 е! а1. 1999 I. 1ттипо1. 162:1018-1023). Обработка мышей как дикого типа, так и мышей, дефектных по КАС1, с помощью тАЬ к α1 полностью подавляла артрит (фиг. 11). Данные результаты показывают, что эффективность тАЬ к α1 в данной модели не зависит от присутствия лимфоцитов и что, как это предполагалось на основании предыдущих экспериментов (фиг. 9), эффективность тАЬ к α1 в предотвращении заболевания может быть обусловлена его действием на другие экспрессирующие α1 клетки, такие как макрофаги и нейтрофилы.

Пример 12. Ингибирование артрита в зависимости от дозы тАЬ к α1.

Основываясь на ярко выраженном действии обработки тАЬ к α1 в предотвращении артрита, заявители расширили данные исследования для включения анализа зависимости от дозы (фиг. 12). Вводили различные дозы тАЬ в/бр на каждый 3-ий день, начиная с дня 0. В соответствии с предыдущими результатами доза 250 мкг тАЬ к α1 вызывала почти полное предотвращение артрита. Более низкая доза 100 мкг тАЬ к α1 была частично эффективной в предотвращении артрита в данной модели, тогда как более низкие дозы не оказывали заметного действия на показатель артрита (фиг. 12).

Пример 13.

Лечебная обработка тАЬ к α1 может снижать показатель артрита. Основываясь на эффективности тАЬ к α1 в предотвращении артрита, заявители попытались лечить мышей, находящихся на пути к развитию заболевания. Артрит индуцировали у мышей с помощью введения смеси тАЬ к коллагену типа II в день 0 с последующим введением ЛПС в день 3. Затем мышей обрабатывали либо тАЬ к α1, либо растворимым гибридным ^-белком к ΊΝΕрецептору, начиная с дня 4. Прогрессия артрита полностью блокировалась у мышей, получавших, начиная с дня 4, тАЬ к α1, по сравнению с мышами, получавшими, начиная с дня 4, контрольное тАЬ хомячка (фиг. 13). Степень ингибирования, наблюдавшаяся при лечебном введении тАЬ к α1, была полной и была равной той, которая наблюдалась при профилактической обработке с помощью тАЬ к α1 (начинавшейся в день 0) (фиг. 13). Для сравнения, обработка гибридным ^-белком ΤΝΕ-рецептору, начиная с дня 4, приводила к снижению показателя артрита лишь на 60-70% по сравнению с контрольным гибридным ^-белком (фиг. 13). Совместная обработка с помощью тАЬ к α1 и гибридного Ц-белка к ΤΝΕ-рецептору была эффективной при полном подавлении показателя артрита, что неудивительно, имея в виду полную эффективность обработки одним тАЬ к α1 в подавлении артрита. Вместе взятые, данные результаты показывают, что лечебная обработка с помощью тАЬ к α1 эффективна в снижении показателя артрита и выгодно отличается по сравнению с лечебной обработкой антагонистом ΤΝΕ.

Пример 14. Клонирование и мутагенез α1Едомена.

Последовательности домена I интегрина α1 β1 человека и крысы амплифицировали с полноразмерных кДНК (Кет, е1 а1. (1994) I. Бю1. Сйет. 269, 22811-22816; Ιμικιΐιιικ е1 а1. (1990) I. Се11 Βίο1. 111, 709-720) с помощью полимеразной цепной реакции (ПУР) (ПУР СОКЕ Кй; Воейгтдег Маппйе1т, 6тЬН Германия) с применением либо человеческих специфических (5'СА66АТСС6ТСА6ССССАСАТТТСАА-3' [прямого]; 5'-ТССТС6А666СТТ6СА666САААТАТ3' [обратного]) или крысиных специфических (5'-СА66АТСС6ТСА6ТССТАСАТТТСАА-3' [прямого]; 5'-ТССТС6А6С6СТТССААА6С6ААТАТ3' [обратного] ) праймеров. Полученные амплифицированные ПЦР-продукты очищали, лиги ровали в ρ6ΕΧ4ΐ-ί (Рйагтааа) и применяли для трансформации компетентных клеток ΌΗ5α (Ь1Ге Тесйпо1од1ек). Резистентные к ампициллину колонии подвергали скринингу на предмет экспрессии гибридного белка глутатион-8-трансфераза-домен I с М_г ~45 кДа. Последовательности вставок плазмидной ДНК клонов, отобранных для последующей характеристики, были подтверждены с помощью секвенирования ДНК.

Гибридный крыса/человек α1-I-домен (ΚΔΗ) создавали (МОКРН Ми1адепе818 кй; 5 рпте - 3 рпте) путем замены остатков крысы 692, К93, 694 и Ь97 (фиг. 14) на соответствующие остатки человека, V, 6, К и К, соответственно. Клоны, несущие домен КЛН I, идентифицировали по утрате диагностического сайта рестрикции для фермента 8)и 1, а вставки подтверждали секвенированием ДНК. Аминокислотная последовательность человеческого α 14-домена показана на фиг. 15.

Пример 15.

Создание тАЬ, специфичных к αΜ-домену.

Моноклональные антитела зарекомендовали себя в качестве очень полезных зондов при изучении взаимоотношений между структурой и функцией субъединиц интегринов. Например, тАЬ активно применяли для изучения областей субъединицы β1, связанных с активированной конформацией (би, А., апб Ьеайу, Ό. I. (1996) 81гисЦ.1ге 4, 931-942). Таким образом, для выявления потенциальных зондов на конформационные изменения α 14-домена заявители создали панель тАЬ к α 14-домену человека.

Создание моноклональных антител к α14домену.

Самок КоЬейкошап мышей (1асккоп ЬаЬк) иммунизировали внутрибрюшинно (в/бр) 25 мкг очищенного α1β1 человека (Ебтеагбк е) а1. (1995) I. Вю1. Сйет. 270, 12635-12640), эмульгированного с полным адъювантом Фрейнда (ЫГе Тесйпо1од1е8). Их реиммунизировали трижды в/бр введением 25 мкг α1β1, эмульгированного в неполном адъюванте Фрейнда (ЫГе Тесйпо1о§1е8). Мышь с наибольшим титром к α 14-домену реиммунизировали в/бр введением 100 мкг α1 β1 за 3 дня до слияния и внутривенным введением 50 мкг α1β1 за 1 день до слияния. Клетки селезенки сливали с миеломными клетками ГЬ653 в соотношении 1:6 и помещали в количестве по 100000 и 33000 на лунку в 96луночные планшеты для культуры ткани.

Супернатанты оценивали на предмет связывания интегрина α1β1 с помощью одноцветного ГАС8. Перед анализом ГАС8 супернатанты инкубировали с нетрансфицированными клетками К562 для удаления ЦО, которые связываются исключительно с субъединицей β. Затем 3-5х10⁴ клеток К562, трансфицированных субъединицей α1 интегринов (К562-о1) и суспендированных в буфере ГАС8 (1% фетальная телячья сыворотка (РС8) в ФСБ, содержащем 0,5% ΝαΝ₃). инкубировали с супернатантом в течение 45 мин при 4°С, промывали и инкубировали с антимышиным 1дС, конъюгированным с фикоэритрином. После двукратной промывки буфером РЛС8 клетки анализировали в ВесЮп ΌίοΚίηκοη Ρ1ο\ν Су!оте!ег.

Супернатанты полученных гибридом подвергали скринингу на предмет связывания с α1Ι-доменом. Вкратце, лунки 96-луночного планшета (Νιιηο) покрывали в течение ночи при 4°С 50 мкл человеческого домена α 1-1-С8Т-гибрида. 30 мкг/мл в ФСБ. Планшеты промывали ФСБ, блокировали 1% БСА в ФСБ и инкубировали супернатант гибридом с α 1-1-доменом при комнатной температуре в течение 1 ч. После тщательной промывки ФСБ, содержащим 0,03% Твин 20, добавляли еще на час связанный с щелочной фосфатазой антимышиный 1дС (1асккоп 1ттипоЯекеагсй). После окончательной промывки добавляли на 30 мин при комнатной температуре 1 мг/мл паранитрофенилфосфата (ρΝΡΡ) в 0,1 М глицине, 1 мМ ΖπΟ₂ и 1 мМ МдС1₂ и считывали О.П. планшет при 405.

Отобранные супернатанты тестировали на их способность ингибировать зависимую от Κ562-α1 адгезию к коллагену IV. Клетки Κ562-α1 метили с помощью 2 мМ 2',7'-(бис-2-карбоксиэтил-5 и 6)карбоксифлуоресцеинпентаацетоксиметиловым эфиром (ВСЕСР; Мо1еси1аг РгоЬек) в ΌΜΕΜ, содержащей 0,25% БСА, при 37°С в течение 30 мин. Меченые клетки промывали буфером для связывания (10 мМ Нерек, рН 7,4; 0,9% №1С1 и 2% глюкоза) и ресуспендировали в буфере для связывания плюс 5 мМ МдС1₂ при конечной концентрации 1х10⁶ клеток/мл. 50 мкл супернатанта инкубировали с равным объемом 2х10⁵ клеток Κ562-α1 в лунках 96-луночного планшета. Планшет затем центрифугировали и супернатанты удаляли. Клетки ресуспендировали в буфере для связывания, переносили в лунки покрытого коллагеном планшета и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После инкубации несвязавшиеся клетки удаляли трехкратной промывкой буфером для связывания. Прикрепленные клетки анализировали с помощью Су!оДиот (МДИроте).

Заявители сначала идентифицировали 19 гибридом, супернатанты которых связывались с клетками Κ562 лейкоза человека, экспрессирующими интегрин α1β1 (Κ562-α1), и с α1-Ιдоменом. Иммуноглобулины каждой из данных гибридом очищали и тестировали на способность блокировать связывание с коллагеном IV либо Κ562-α1, либо а1-1-домена. МАЬ разделялись на два класса: те, которые блокируют, и те, которые не блокируют функцию α1β1. Например, в то время как тАЬ, продуцированные клонами АЕР3, ВОС5 и А1Н10, связываются с а1-1-доменом (фиг. 16А, для ВОС5 результаты не показаны), лишь тАЬ А1Н10 ингибировали зависимую от а1-1-домена (фиг. 16В) или Κ562α1 (фиг. 16С) адгезию к коллагену IV.

Секвенирование районов, определяющих комплиментарность.

Для установления клонального происхождения данной панели тАЬ заявители амплифицировали с помощью ПЦР и секвенировали СЭЯ 12 из 19 антител (результаты не показаны).

мкг мРНК, выделенной из 10⁷ гибридомных клеток (РайТтаск ιηΡΝΛ йо1а1юп кй, 1п\йгодеп) подвергали обратной транскрипции (Яеабу-То-Со Уои Рпте Ρίτκΐ 8йапб Κίΐ, Рйаттааа Вю1ес11) с помощью 25 пМ каждого из следующих праймеров: тяжелой цепи νΗ1 РОЯ-2 (МюЫкййа е! а1. (1993) Се11 72, 857-867); легкой цепи УК+РОК, который определяет четыре раздельных олигонуклеотида (1<егп е! а1. (1994) I. Вю1. Сйет. 269, 22811-22816). Для каждой гибридомы легкая и тяжелая цепи амплифицировались в четырех независимых реакциях ПЦР с применением различных сочетаний следующих олигонуклеотидов: тяжелая цепь: УН1РК11< (СатаИа е! а1. (1995) I. оГ Вю1. Сйет. 270, 1253112535), УШВАСЮ УШВАЖ (ВакЫп е! а1. (1998) 81гис!иге 6, 923-935), Ун!г1а, Ун!г1Ь, У_н1т1е, ν_Ηίτ1Ε, У_НГг1д (1дпа1шк е! а1. (1990) I. Се11 Вю1. 111, 709-720) или УН 1 РОК-2 (МюЫкййа, М., У1бет, V., апб Агпаои!, М.А. (1993) Се11 72, 857-867); легкая цепь: VΚ1ВАСΚ (Ва1б\\зп е! а1. (1998) 81гис!иге 6, 923-935), '^РОЯ, ШВА® олигонуклеотиды (1<егп е! а1. (1994) I. Вю1. Сйет. 269, 22811-22816), или ^ГНа, ^ГИс, ^Ше, V_ΗГ^ 1Г (1дпа!шк е! а1. (1990) I. Се11 Вю1. 111, 709-720). Продукты амплифицировали (5 мин при 95°С, 50 циклов по 1 мин при 94°С, 2 мин при 55°С, 2 мин при 72°С и конечный цикл 10 мин при 72°С), очищали в геле ^Адшск, 01адеп) и прямо секвенировали с применением различных перечисленных олигонуклеотидов в АВ1 377 8ес.|иепсег.

Последовательности из клонов, продуцирующих блокирующие функцию тАЬ, были практически идентичными на протяжении всех областей, определяющих комплиментарность (СЭЯ), и вставочных рамочных областей, что позволяет предполагать клональное родство данных гибридом.

Пример 16.

Иммуноблоттинг и анализ РАС8.

Последовательности вариабельных областей неблокирующих антител заметно отличались от клонально родственного семейства последовательностей, обнаруженных в блокирующих антителах. Поскольку блокирующие антитела, по-видимому, происходят от единого клона, для последующей характеристики заявители выбрали один клон (А1Н10).

Иммуноблоттинг.

Вырезанный из аорты овцы слой гладкомышечных клеток и клетки Κ562-α1 экстрагировали 1% тритоном Х-100 в 50 мМ Нерек, рН

7,5, 150 мМ №1С1, 10 мМ фенилметилизмофенилфторид (РМ8Е), 20 мкг/мл апротина, 10 мкг/мл лейпептина, 10 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ΕΌΤΑ). Образцы подвергали электрофорезу в 4-20% градиенте ОСН-ПААГ и переносили электроблоттингом на нитроцеллюлозные мембраны. Отпечатки блокировали 5% сухим молоком в ΤΒ8; промывали ΤΒ8, содержащим 0,03% Твин-20, и инкубировали с антителами в блокирующем буфере, содержащем 0,05% №1№ в течение 2 ч. После этого отпечатки промывали, как указано выше, инкубировали с пероксидазой хрена, конъюгированной с антимышиным 1дО в течение 1 ч, вновь промывали и затем обрабатывали реактивом ЕСЬ (АтегкЕат). Отпечатки затем экспонировали на фотопленку (Кобак) в течение от 30 до 60 с и проявляли.

Анализ с помощью иммуноблоттинга (фиг. 17А) и ЕАС8 (фиг. 17В) показывает, что АШ10 взаимодействует с интегрином α1β1 человека, кролика и овцы, но не крысы, что позволяет предполагать, что блокирующие тАЬ связываются с эволюционно консервативным, линейным эпитопом. Неблокирующие тАЬ были неэффективны при иммуноблоттинге и не взаимодействовали с видами, отличными от человека.

Пример 17.

Связывание α 1-1-домена с коллагеном является зависимым от двухвалентных катионов.

A. Очистка а1-1-доменов.

а1-1-Домены экспрессировали в Е. со11 в виде О8Т-(глутатион-8-трансферазы)-гибридных белков, содержащих сайт расщепления тромбином в месте соединения последовательностей. Осветленный супернатант из клеток, лизированных в ФСБ, наносили на колонку глутатионсефарозы 4В (РЕагтааа), которую интенсивно промывали ФСБ. Гибридный белок домен α1-ΙО8Т элюировали 50 мМ Трис-НС1, рН 8,0, 5 мМ глутатион (восстановленный). Для изучения денатурации домен Ι расщепляли тромбином в 50 мМ трис, рН 7,5, и очищали от партнера О8Т по гибриду. Добавляли ΌΤΤ до 2 мМ и образец наносили на колонку глутатион-сефарозы 4В. Незадержанные фракции и промывочные фракции объединяли и наносили на колонку О-сефарозы ЕЕ (РЕагтааа). Домен α1-Ι элюировали 50 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 75 мМ №С1. Очищенный α 14-домен обладал предсказанной массой (Ьее е1 а1. (1995) 81гис1иге 3, 1333-1340, 871 Да) по данным массспектрометрии с электрораспылением-ионизацией (Ε8Ι-Μ8), двигался в виде одной полосы при электрофорезе в ЭСН-ПААГ, а белок элюировался в виде единственного пика соответствующего размера при исключающей по размеру хроматографии на колонке суперозы 6 ЕРЬС (Рйагтас1а).

B. Функциональный анализ.

96-Луночные планшеты покрывали в течение ночи при 4°С 1 мкг/мл коллагена Ιν (8Цта) или коллагена типа Ι (СоПаЬогШе Вютеб1са1), промывали буфером с тритоном (0,1% тритон Х-100; 1 мМ МпС1₂; 25 мМ трис-НС1; 150 мМ №1С1) и блокировали 3% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 25 мМ трис-НС1; 150 мМ №1С1 (ΤΒ8). Последовательные разведения гибридного белка домен α1-Ι-Ο8Τ в ΤΒ8, содержащем 1 мМ МпС1₂ и 3% БСА, инкубировали в покрытых планшетах при комнатной температуре в течение 1 ч и промывали буфером с тритоном. Связанный αΕΙ-домен определяли последовательным добавлением 10 мкг/мл биотинилированного поликлонального антитела к Ο8Τ (РЕагтас1а); Ех1гАу1бт-пероксидаза хрена (81§та), разведенного 1:3000 в ΤΒ8, содержащем 1 мМ МпС1₂ и 3% БСА, и 1-δΐερ ΑΒΤ8 (2,2'азин-ди[3-этилбензтиазолинсульфоната]; Р1егсе). О. П. планшет считывали при 405 на микропланшетном ридере (Мо1еси1аг Ое\зсе5).

Результаты.

α1-Ι-Домены человека и крысы (95% идентичность с человеческим) экспрессировали в Е. со11 в виде гибридных белков с Ο8Τ и очищали на глутатион-сефарозе. Оба белка проверяли на предмет связывания с коллагеном Ι и Ιν с применением описанного ранее варианта анализа, основанного на ИФА (Он, А., апб ЬеаЬу, Ό4. (1995) Ргос. N311. Асаб. 8οΐ. И8А 92, 1027710281). α1-Ι-Домен человека связывает коллаген Ιν с большей эффективностью, чем коллаген Ι (фиг. 18А). Антитело, специфичное в отношении α1-I-домена, но не антитело, специфичное в отношении α2-I-домена (фиг. 18В), подавляло связывание с обоими лигандами (результаты для коллагена Ι не показаны). И Мп²⁺, и Мд²⁺ стимулировали связывание, а ЭДТА снижала связывание до фонового уровня (фиг. 18С). Не было обнаружено заметных различий в связывании лиганда между α 14-доменами человека и крысы, что свидетельствует о том, что видовые различия в последовательностях не имеют функционального значения (результаты не показаны). Таким образом, для эффективного связывания лиганда α 14-доменом необходим, в частности, катион.

Пример 18. Остатки катионзависимого эпитопа рядом с мотивом МГОА8.

Для картирования эпитопа для тАЬ, блокирующих функцию α1β1, заявители использовали наблюдение, что АШ10 распознает последовательности α 14-домена человека, но не крысы. Последовательности человека и крысы различаются лишь по 12 аминокислотам, 4 из которых находятся в кассете из 6 аминокислот (а.к. 92-97, фиг. 14А) рядом с существенным треонином (фиг. 14А, а.к. 98) в мотиве МГОА8. Для проверки гипотезы, что 6 аминокислотных остатков, Vа1-61η-Α^д-61у-61у-Α^д, составляют эпитоп для блокирующих тАЬ, заявители сконструировали гибридный домен Ι (ИАН), заменив остатки крысы 092, И93, 094 и Ь97 на соответ ствующие остатки человека, V, О- В и В, соответственно. А1Н10, наряду со всеми тАЬ, блокирующими функцию, узнает гибридный домен I (ΒΔΗ; фиг. 14В).

Для ориентации данных остатков относительно домена МГОА8 в третичной структуре а1-1-домена заявители смоделировали а1-1домен с применением координат кристаллической структуры а2-1-домена.

Гомологичную модель а1-1-домена человека строили, используя рентгеновскую кристаллическую структуру а2-1-домена человека (Аагб е! а1. (1989) ХаИие 341, 544-546). Модель строили с применением модуля гомологичного моделирования ИъДЫ II (версия 2.3.5; Вюкут Тее1то1оДе5). Программу СНАВММ (С1аск§оп е! а1. (1991) Ыа!иге 352, 624-628) применяли с установкой 22 всех параметров водорода с зависимой от расстояния диэлектрической константой двукратного расстояния между атомами. Заявители сначала прошли 1000 этапов наиболее быстрой минимизации со взвешенными по массе гармоническими ограничениями позиционирования по 1 ккал/(моль А²) для всех атомов а 14-домена. Минимизацию продолжали с помощью еще 1000 этапов грубого приближения и 5000 этапов Лбор1еб-Ва515 №\\1оп Варкой с ограничениями 0,1 ккал/(моль А²) для С-а атомов домена а14 для того, чтобы избежать существенных отклонений от рентгеновской кристаллической структуры а24-домена.

Последовательности а1 β 1 и а2в 1 интегринов проявляют 51% идентичность без вставок и делеций, что позволяет предполагать, что общая структура двух доменов I должна быть сходной. Предсказывается, что сайт координации с металлом в а14-домене и а24-домене является одинаковым, а остатки, которые составляют эпитоп для блокирующих тАЬ, находятся в петле между спиралью а3 и спиралью а4, которая содержит треонин в мотиве МГОА8, важном для связывания катиона. Модель а 14домена предсказывает, что амидный азот 092 (фиг. 14А) образует связь с карбонильной группой Ю3, остатком, соседствующим с 832. Таким образом, содержащая эпитоп петля может играть функциональную роль в стабилизации области МГОА8.

Хотя представленное выше изобретение было описано несколько подробно с целью иллюстрации и примера для ясности понимания, для специалистов должно быть очевидно, что на практике будут осуществляться определенные изменения и модификации. Следовательно, описание и примеры не должны ограничивать объем изобретения, который описан прилагаемой формулой изобретения.

Перечень последовательностей <110> ВЬодеп, 1пс.

Се Гоидего11ез_г Αηίοηϊη боЫаХз, РЫИр ЬоЬЬ, Ноу

КоЬеНапзку, УхсСог <120> Способ лечения воспалительных заболеваний <130> А076РСТ <140> РСТ/и500/15004 <141> 2000-06-01 <150> 60/185336 <151> 2000-02-29 <150> 60/137038 <151> 1999-06-01 <160> 9 <170> ЕазЪЗВД для Ихпдомз версии 4.0 <210> 1 <211> 26 <212> ДНК <213> Человек <400> 1 саддаЬссдС садссссаса ССГсаа <210> 2 <211> 26 <212> ДНК <213> Человек <400> 2

ЬссУсдаддд ЛЪдсадддс аааЪаЪ <210> 3 <211> 26 <212> ДНК <213> крыса <400> 3 садда£ссдЬ садЪссЪаса ьььсаа <210> 4 <211> 26 <212> ДНК <213> крыса <400> 4

ЪссЪсдадсд сЬСссааадс дааЬаЬ <210> 5 <211> 212 <212> РЕТ <213> крыса <400> 5

Уа1

Зег

Рго

ТЬг

РЬе

С1п

Уа1

Уа1

Азп

Зег

РЬе

А1а Рго

Уа1

С1п

С1и

1

5

10

15

Суз

Зег

ТЬг

С1п

Ьеи

Азр

Пе

Уа1

Пе

Уа1

Ьеи

Азр С1у

Зег

Азп

Зег

20

25

30

Не

Туг

Рго

Тгр

С1и

Зег

Уа1

Пе

А1а

РЬе

Ьеи

Азп Азр

Ьеи

Ьеи

Ьуз

35

40

45

Агд

МеС

Азр

Не

С1у

Рго

Ьуз

С1п

ТЬг

С1п

Уа1

С1у Не Уа1 С1п Туг

50

55

60

С1у С1и

Азп

Уа1

ТЬг

ΗΪ3

С1и

РЬе

Азп

Ьеи

Азп

Ьуз Туг Зег Зег

ТЬг

65

70

75

80

С1и

С1и

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

А1а

Ьуз Ьуз

Пе

С1у Агд С1п С1у С1у

Ьеи

85

90

95

С1п

ТЬг

МеС

ТЬг А1а

Ьеи

С1у

Пе

Азр

ТЬг А1а

Агд Ьуз

С1и

А1а

РЬе

100

105

110

ТЬг

С1и

Агд

А1а

Агд Агд С1у

Уа1

Ьуз Ьуз

Уа1

МеС Уа1

Пе

Уа1

ТЬг

115

120

125

Азр (31у

С1и

Зег

ΗΪ3

Азр

Азп

Туг Агд

Ьеи

Ьуз

С1п Уа1

Пе

С1п

Азр

130

135

140

Суз

С1и

Азр

С1и

Азп

Не

С1п

Агд

РЬе

Зег

11е

А1а Не

Ьеи

С1у

Н15

145

150

155

160

Туг

Азп

Агд С1у

Азп

Ьеи

Зег

ТЬг

С1и

Ьуз

РЬе

Уа1 С1и

С1и

Пе

Ьуз

165

170

175

Зег Не А1а Зег С1и Рго ТЬг С1и Ьуз ΗΪ3 РЬе РЬе Азп Уа1 Зег Азр 180 185 190

С1и Ьеи А1а Ьеи 195

Уа1 ТЬг

Не Уа1 Ьуз А1а Ьеи С1у С1и Агд Не РЬе

200

205

А1а

Ьеи С1и А1а 210

<210> 6

<211> 212

<212> РКТ

<213> Человек

<400> 6

Уа1

Зег

Рго

ТЬг

РЬе

С1п

Уа1

Уа1

Азп

Зег

Не

А1а

Рго

Уа1

С1п

С1и

1

5

10

15

Суз

Зег

ТЬг

С1п

Ьеи

Азр

Не

Уа1

Не

Уа1

Ьеи

Азр С1у

Зег

Азп

Зег

20

25

30

Не

Туг

Рго

Тгр Азр

Зег

Уа1

ТЬг

А1а

РЬе

Ьеи

Азп

Азр

Ьеи

Ьеи

Ьуз

35

40

45

Агд

Мес

Азр

Не

С1у

Рго

Ьуз

С1п

ТЬг

61п

Уа1

С1у

Не

Уа1

С1п

Туг

50

55

60

С1у

С1и

Азп

Уа1

ТЬг

Не

С1и

РЬе

Азп

Ьеи

Азп

Ьуз

Туг

Зег

Зег

ТЬг

65

70

75

80

С1и

С1и

Уа1

Ьеи

Уа1

А1а

А1а

Ьуз

Ьуз

Не

Уа1

С1п

Агд С1у С1у Агд

85

90

95

С1п

ТЬг

МеС

ТЬг

А1а

Ьеи

С1у

ТЬг

Азр

ТЬг

А1а

Агд Ьуз

С1и

А1а

РЬе

100

105

но

ТЬг

61и

Агд

А1а

Агд Агд С1у

Уа1

Ьуз Ьуз

Уа1

МеС

Уа1

Не

Уа1

ТЬг

115

120

125

Азр С1у

С1и

Зег

Не

Азр

Азп

Не

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьуз

Уа1

Не

С1п

Азр

130

135

140

Суз

С1и

Азр

С1и

Азп

Не

С1п

Агд

РЬе

Зег

Не

А1а

Не

Ьеи

С1у

Зег

145

150

155

160

Туг

Азп

Агд С1у

Азп

Ьеи

Зег

ТЬг

С1и

Ьуз

РЬе

Уа1

С1и

С1и

11е

Ьуз

165

170

175

Зег

Не

А1а

Зег

С1и

Рго

ТЬг

С1и

Ьуз

Не

РЬе

РЬе

Азп

Уа1

Зег

Азр

180

185

190

С1и

Ьеи

А1а

Ьеи

Уа1

ТЬг

Не

Уа1

Ьуз

ТЬг

Ьеи

31у

С1и

Агд

Не

РЬе

195 200 205

Claims (6)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ лечения артрита, включающий введение субъекту, страдающему артритом, композиции, которая включает моноклональное антитело АШ10 или его фрагмент, взаимодействующие с эпитопом домена σ.1-Ι антигена очень поздней активации (УЕА-1) семейства интегринов, включающим аминокислотные остатки 91-96, показанные на фиг. 15, (8ЕО ΙΌ NО:8), в количестве, эффективном для обеспе чения снижения показателя артрита приблизительно на 65% или более по сравнению с субъектом, получавшим композицию, содержащую контрольное антитело.
2. 2. Способ по п.1, в котором снижение показателя артрита составляет приблизительно 79% или более.
3. 3. Способ по п.1, в котором снижение показателя артрита составляет приблизительно 85% или более.
4. 4. Способ по п.1, в котором снижение показателя артрита составляет приблизительно 90% или более.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором субъектом является человек.
6. 6. Способ по пп.1-5, в котором субъект страдает ревматоидным артритом.