JP2016500251A - 免疫調節Ｆｃ融合タンパク質の抗癌活性の増強 - Google Patents

Abstract

本開示は、癌または感染性物質により生じた疾患に罹患した対象のT細胞の標的、例えばリガンドの共阻害または強刺激レセプターと特異的に結合することにより、免疫調節標的の活性を変化させ、癌細胞または感染性物質に対する内因性免疫応答を増強するFc融合タンパク質の抗腫瘍効果を増強する方法であって、活性化Fcレセプター（FcR)に対する該Fc領域の結合を増強するようにFc融合タンパク質のFc領域を選択、設計、または修飾することを含む方法を提供する。該開示は、対象の癌細胞または感染性物質に対する内因性免疫応答を増強する能力を増大させる該方法により製造されるFc融合タンパク質も提供する。該開示は、さらに治療的有効量のFc融合タンパク質を対象に投与することを含む対象の治療方法であって、Fc領域の活性化FcRに対する結合が増加するようにFc融合タンパク質のFc領域が選択、設計、または修飾される方法を提供する。

Description

本願を通して、種々の刊行物は、著者名と日付または特許番号もしくは特許公開番号を括弧で示す。これら刊行物の完全な引用は、特許請求の範囲の直前の本明細書の最後に記載している。これら刊行物の開示は本明細書の一部を構成し、本明細書および特許請求の範囲に記載の発明の日における当業者に知られた当該分野の状態をより完全に説明する。しかしながら、本明細書の参考文献の引用は、該参考文献が本発明の先行技術であると認めるものと解釈すべきではない。

本開示は、抗腫瘍治療の有効性に対する免疫調節Fc融合タンパク質のFc領域の効果、および有効性を最適化するためのFc領域の変更の技術に関する。

免疫系は、腫瘍の発現を調節し、腫瘍の退縮をもたらすことができる。これには、腫瘍抗原特異的T細胞の発生と活性化が必要である。多様なT細胞共刺激レセプターおよびT細胞負調節因子、または共阻害レセプターは、T細胞活性化、増殖、およびエフェクター機能の増加または損失を調節するように作用する。最も古い最も良く特徴づけられたT細胞共刺激および共阻害分子はCD28とCTLA-4である(Rudd et al.、2009)。CD28は、抗原提示細胞上のB7-1およびB7-2リガンドとの結合によりT細胞レセプターのエンゲージメントに対する共刺激シグナルをもたらすが、CTLA-4は、T細胞の増殖と機能を下方調節する負のシグナルをもたらす。B7-1(CD80)およびB7-2(CD86)リガンドとも結合し、CD28より高い親和性を有するCTLA-4は、細胞自律（または内因性）および細胞非自律（または外因性）経路を介したT細胞機能の負の調節因子として作用する。CD8およびCD4 Tエフェクター(T_eff)機能の内因性調節は、T細胞活性化の結果としてのCTLA-4の誘導性表面発現と、対立細胞におけるB7リガンドの多価エンゲージメントによるT細胞増殖およびサイトカイン増殖の阻害により仲介される(Peggs et al.、2008)。

T細胞反応を調節する種々の他の共刺激および阻害レセプターおよびリガンドが同定されている。刺激レセプターの例には、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD27、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質(GITR)、およびヘルペスウイルスエントリーメディエーター(HVEM)が含まれるが、阻害レセプターの例には、プログラムされた死（Programmed Death）-1(PD-1)、BおよびTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、T細胞免疫グロブリン、およびムチンドメイン-3(TIM-3)、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、アデノシンA2aレセプター(A2aR)、キラー細胞レクチン様レセプターG1(KLRG-1)、ナチュラルキラー細胞レセプター2B4(CD244)、CD160、IgおよびITIMドメインを含むT細胞イムノレセプター(TIGIT)、およびT細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)のレセプター、(Mellman et al.、2011；Pardoll、2012b；Baitsch et al.、2012)が含まれる。これらレセプターおよびそのリガンドは、免疫応答を刺激するかまたは抑制を防ぐことにより腫瘍細胞を攻撃するよう設計された治療薬の標的を提供する(Weber、2010；Flies et al.、2011；Mellman et al.、2011；Pardoll、2012b)。刺激レセプターまたはレセプターリガンドはアゴニスト剤の標的であるが、阻害レセプターまたはレセプターリガンドは遮断剤の標的である。免疫療法的抗腫瘍活性を増強する最も有望なアプローチには、免疫系を調節し、二次的組織損傷を最小限にするために周辺組織の生理学的免疫応答の持続時間と大きさを調節し、自己トレランスを維持するのに重要な、阻害情報伝達経路の過剰を表すいわゆる「免疫チェックポイント」の遮断がある(例えば、Weber、2010；Pardoll 2012b参照)。多くの免疫チェックポイントは、リガンド−レセプター相互作用により始まるので、抗体により遮断するか、または組換え型のリガンドまたはレセプターにより調節することが容易である。

抗CTLA-4抗体は架橋するとin vitroでT細胞機能を抑制する(KrummelおよびAllison、1995；Walunas et al.、1994)。CTLA-4を構成的に発現する調節性T細胞(T_regs)は、非細胞自律的にエフェクターT細胞(T_eff)機能を調節する。CTLA-4を欠損しているT_regsは、抑制能力が損なわれており(Wing et al.、2008)、CTLA-4とB7との相互作用を遮断する抗体は、T_reg機能を阻害することができる(Read et al.；2000；Quezada et al.、2006)。最近になって、T_effsは、外因性経路を介してT細胞機能を調節することも示された(Corse et al.；2012；Wang et al.、2012)。T_regsおよびT_effsによるT細胞機能の外因性調節は、抗原提示細胞上のB7リガンドを除去するCTLA-4陽性細胞の能力を介して生じ、それによりそれらの共刺激潜在能力を制限する(Qureshi et al.；2011；Onishi et al.、2008)。CTLA-4/B7相互作用の抗体による遮断は、CTLA-4エンゲージメントにより伝達される負のシグナルとの相互作用によりT_eff活性化を促進すると考えられ、このT細胞活性化および増殖の外因性調節はT_effとT_regの両方の増殖を促進することができる(KrummelおよびAllison、1995；Quezada et al.、2006)。動物モデルを用いた初期の研究において、CTLA-4の抗体による遮断は、自己免疫を悪化させることを示した(Perrin et al.、1996；Hurwitz et al.、1997)。腫瘍免疫への拡大により、樹立腫瘍の退縮をもたらす抗CTLA-4の能力は、CTLA-4遮断の治療的潜在能力の劇的な例となった(Leach et al.、1996)。

ヒトCTLA-4に対するヒト抗体のイピリムマブとトレメリムマブがCTLA-4-B7相互作用を阻害するために選ばれ(Keler et al.、2003；Ribas et al.、2007)、多発性悪性腫瘍の種々の臨床試験で試験されている(Hoos et al.、2003；Acierto et al.、2011)。腫瘍の退縮と疾患の安定化がしばしば観察され、これら抗体による処置は、種々の器官系に影響を及ぼしうる炎症性浸潤を伴う有害事象を伴った。2011年に、IgG1定常領域を有するイピリムマブが、米国と欧州で、先に治療された進行性メラノーマの患者の第III相臨床試験における全体的生存の改善に基づく切除不能または転移性メラノーマの治療に承認された(Hodi et al.、2010)。

ハムスター抗CTLA-4抗体、9H10(シリアンハムスターIgG2b [KrummelおよびAllison、1995])および4F10(アルメニアンハムスターIgG1 [Walunas et al.、1994])、およびヒトCTLA-4トランスジェニックマウスで作製したマウス抗マウスCTLA-4抗体(9D9-ネズミIgG2b)を含む種々の異なる抗体を用い、マウスモデルで抗CTLA-4遮断活性が証明された(Quezada et al.、2006；Peggs et al.、2009)。抗CTLA-4 9D9-IgG2bが、種々のマウス皮下腫瘍モデル、例えばSa1N繊維肉腫、MC38およびCT26結腸腺癌、およびB16メラノーマを用いて試験された。Sa1Nを除いて、抗CTLA-4単独療法は中等度の抗腫瘍活性を示した(Quezada et al.、2006；Mitsui et al.、2010)。ネズミIgG2bは、FcγRIIB、FcγRIII、およびFcγRIVレセプターを含む免疫グロブリンFｃγレセプター（FcγR）と結合することができる(NimmerjahnおよびRavetch、2005)。したがって、T細胞およびFcγR陽性細胞と結合した9D9-IgG2bによるCTLA-4の多価エンゲージメントはアゴニスト的負のシグナルを生じ、この抗体のCTLA-4遮断効果をFcγR結合特性を持たない遮断抗体より低くする可能性がある。

マウス抗CTLA-4抗体の抗腫瘍活性における相対的効力を測定するため、FcγRsに対する親和性が異なる一連の9D9アイソタイプ変異体を作製した。本明細書に記載のデータは、調節性T細胞(T_regs)の枯渇によりCTLA-4遮断が抗腫瘍効果を仲介することを含むメカニズムを明らかにする。これらのメカニズムは、他のもの（例えばPD-1）ではなく、T細胞上のある他の標的（例えば、GITR、OX40、およびICOS）に適用することが示されている。生物学的理解の進歩は、T細胞の免疫調節標的と結合し、その活性を変化させ、免疫調節レセプターをT_reg枯渇メカニズムにより有効に標的化することができることに関する予測を可能にする、Fc融合タンパク質の抗腫瘍活性の増強に関する新たな筋道を開く。

（発明の要約）
本開示は、癌または感染性物質により生じた疾患に罹患した対象のT細胞上の標的（例えば免疫調節標的）と特異的に結合し、該標的の活性を変化させることにより癌細胞または感染性物質に対する内因性免疫応答を増強するFc融合タンパク質の抗腫瘍効果を増強、最適化、または最大化するための方法であって、該Fc領域の活性化Fcレセプターに対する結合を増強するためにFc融合タンパク質のFc領域を選択、設計、または修飾することを含む方法を提供する。ある好ましい態様において、該Fc融合タンパク質は、抗体、例えば、抗CTLA-4、抗GITR、抗OX40、抗ICOS、または抗CD137抗体である。他の好ましい態様において、該標的は、腫瘍部位のT_regsに腫瘍部位のT_effsより高レベルで発現する。

本開示は、癌または感染性物質により生じた疾患に罹患した対象のT細胞上の標的（例えば免疫調節レセプタータンパク質）と特異的に結合し、標的の活性を変化させることにより癌細胞または感染性物質に対する内因性免疫応答を増強するFc融合タンパク質であって、内因性免疫応答を増強する該抗体の能力がFc領域の活性化Fcレセプターに対する結合を増強するようにFc融合タンパク質のFc領域を選択、設計、または修飾することを含む方法により増強、最適化、または最大化する、Fc融合タンパク質を提供する。

本開示は、さらに、治療的有効量のFc融合タンパク質を該対象に投与することを含む、癌または感染性物質により生じた疾患に罹患した対象を治療するために該対象の内因性免疫応答を増強する方法であって、Fc領域の活性化Fcレセプターに対する結合を増強するためにFc融合タンパク質のFc領域が選択、設計、または修飾されている、方法を提供する。

さらに、本開示は、癌または感染性物質により生じる疾患に罹患した対象の免疫療法のための方法であって、(a)免疫療法に適した候補である対象を選択し、該選択が、(i)被験組織試料中の骨髄由来サプレッサー細胞(MDSCs)の存在を評価し、(ii)被験組織試料中のMDSCの存在に基づいて適切な候補として該対象を選択することを含む；(b)治療的有効量の免疫調節Fc融合タンパク質を選択した対象に投与する、ことを含む方法を提供する。

本開示は、対象の癌または感染性物質により生じる疾患を治療するためのキットであって、(a)対象の癌細胞または感染性物質に対する内因性免疫応答を増強する能力の増大をもたらす用量の本開示のFc融合タンパク質、および(b)本明細書に記載の治療方法に該Fc融合タンパク質を用いるための取扱説明書を含むキットも提供する。

本開示の他の特徴および利点は、限定と解すべきではない以下の詳細な説明および実施例から明らかであろう。本明細書で引用しているすべての参考文献、特許、および公開特許公報の内容は本明細書の一部を構成する。

マウス抗マウスCTLA-4抗体、9D9の種々のアイソタイプのCTLA-4⁺細胞に対する結合を示す。 C57BL/6マウスにおける抗CTLA-4アイソタイプの血清濃度の薬物動態分析を示す。 同系CT26腺癌マウスモデル：A、コントロールマウスIgG(他の実験ではマウスIgG1アイソタイプのヒト抗ジフテリア毒抗体もコントロールとして用いた)；B、抗CTLA-4-γ１D265A；C、抗CTLA-4-γ2b；D、抗CTLA-4-γ2aにおける抗腫瘍活性に対するマウス抗マウスCTLA-4抗体、9D9の種々のアイソタイプの効果を示す。無腫瘍(TF)マウス数/群をマウス10匹の各群について示す。 抗CTLA-4処置CT26腫瘍保有マウスにおけるCD45⁺細胞のパーセンテージとしての腫瘍内T細胞の分析を示す：A、CD8⁺ T細胞、B、CD4⁺ T細胞、C、T_regs。 抗CTLA-4処置CT26腫瘍保有マウスにおける腫瘍内CD8⁺ T_effs/T_regs比(A)およびCD4⁺ T_effs/T_regs比(B)を示す。 抗CTLA-4処置CT26腫瘍保有マウスにおける末梢(リンパ節) T_regsの分析を示す。 MC38結腸腺癌腫瘍モデルにおけるこれらアイソタイプで処置した個々のマウスにおける腫瘍体積の変化により測定した4つの異なるマウス抗CTLA-4アイソタイプの抗腫瘍活性を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、抗CTLA-4 IgG1；C、抗CTLA-4 IgG1D265A；D、抗CTLA-4 IgG2a；D、抗CTLA-4 IgG2b。 種々のアイソタイプのマウス抗CTLA-4抗体で処置したマウスの群における同系MC38結腸腺癌腫瘍の平均腫瘍体積(A)および腫瘍体積中央値(B)の変化を示す。 特定の抗CTLA-4抗体で処置したマウスのMC38腫瘍浸潤リンパ球(TILs)のフローサイトメトリー分析を示す。A、CD45⁺細胞のCD4⁺パーセンテージ；B、CD45⁺細胞のCD8⁺パーセンテージ；C、CD4⁺細胞のFoxp3⁺パーセンテージ。 特定の抗CTLA-4 IgGアイソタイプで処置したマウスのMC38腫瘍のCD8およびCD4 T_eff/T_reg比を示す。A、TILsのCD8 T_effs/T_regs比(CD8⁺細胞/CD4⁺ Foxp3⁺細胞)；B、TILsのCD4 T_effs/T_regs比(CD4⁺ Foxp3^-細胞/CD4⁺ Foxp3⁺細胞)。 これらのアイソタイプで処置した個々のマウスの腫瘍体積の変化により測定した同系Sa1N繊維肉腫マウスモデルにおける種々のマウス抗CTLA-4アイソタイプの抗腫瘍活性を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、抗CTLA-4 IgG2a；C、抗CTLA-4 IgG1D265A。 種々のアイソタイプのマウス抗CTLA-4抗体で処置したマウスの群における同系Sa1N繊維肉腫腫瘍の平均腫瘍体積(A)および腫瘍体積中央値(B)の変化を示す。 特定の抗CTLA-4抗体で処置したマウスのSa1NTILsのフローサイトメトリー分析を示す。A、CD45⁺細胞のCD8⁺パーセンテージ；B、CD45⁺細胞のCD4⁺パーセンテージ；C、CD4⁺細胞のFoxp3⁺パーセンテージ。 特定の抗CTLA-4 IgGアイソタイプで処置したマウスの同系Sa1N腫瘍移植片におけるCD8およびCD4 T_eff/T_reg比を示す。A、TILsのCD8 T_effs/T_regs比(CD8⁺細胞/CD4⁺ Foxp3⁺細胞)；B、TILsのCD4 T_effs/T_regs比(CD4⁺ Foxp3^-細胞/CD4⁺ Foxp3⁺細胞)。 種々の抗CTLA-4抗体アイソタイプで処置したMC38腫瘍保有マウスの腫瘍におけるアイソタイプ依存性のMDSCのリクルートメンと(A)およびIL-1α産生(B)を示す。 抗CTLA-4アイソタイプの腫瘍内Th1/2サイトカイン分泌に対する効果を示す。A、IFN-γ；B、IL-13；C、TNF-α；D、IL-10。 MC38結腸腺癌モデルにおけるこれらのアイソタイプで処置した個々のマウスにおける腫瘍体積の変化で測定した、抗腫瘍活性に対するラット抗マウスGITR抗体、DTA-1の種々のアイソタイプの効果を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、抗GITRマウスIgG1；C、抗GITRラットIgG2b；D、抗GITRマウスIgG2a。TFマウス数/群をマウス10匹の各群について示す。 種々のアイソタイプの抗GITR抗体で処置したマウスの群におけるMC38腫瘍の平均腫瘍体積(A)および腫瘍体積中央値(B)の変化を示す。 示した種々の抗GITR(DTA-1)および抗CTLA-4(9D9)アイソタイプおよびコントロール抗体で処置したMC38腫瘍保有マウスの脾臓(A-C)およびTILs(D-F)のフローサイトメトリー分析を示す。A、脾臓中のCD8⁺ T細胞のパーセンテージ；B、脾臓中のCD4⁺細胞のパーセンテージ；C、脾臓中のCD4⁺細胞のFoxp3⁺パーセンテージ；D、TILs中のCD8⁺ T細胞のパーセンテージ；E、TILs中のCD4⁺細胞のパーセンテージ；F、TIL中のCD4⁺細胞のFoxp3⁺パーセンテージ。 MC38モデルにおけるこれらのアイソタイプで処置した個々のマウスにおける腫瘍体積の変化で測定した、凝集が最小限になるよう再操作したラット抗マウスGITR抗体、DTA-1の種々のアイソタイプの抗腫瘍活性に対する効果を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、抗GITRマウスIgG1；C、抗GITRマウスIgG1-D265A；D、抗GITRマウスIgG2a；E、抗GITRマウスIgG2b；F、抗GITRラットIgG2b。TFマウス数/群をマウス9匹の各群について示す。 種々のアイソタイプの再操作された抗GITR抗体で処置したマウスの群におけるMC38腫瘍の平均腫瘍体積(A)および腫瘍体積中央値(B)の変化を示す。 MC38腫瘍保有マウスの脾臓(A)およびTILs(B)中のFoxp3⁺/CD4⁺ T_regsに対する種々の抗GITR(再操作された「mGITR」DTA-1、または最初に操作された「DTA-1」抗体)および抗CTLA-4(9D9)アイソタイプの効果のフローサイトメトリー分析を示す。 これらのアイソタイプで処置した個々のマウスの腫瘍体積の変化で測定したSa1N繊維肉腫マウスモデルにおける種々のマウス抗GITRアイソタイプの抗腫瘍活性を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、抗GITRマウスIgG2a；C、抗GITRラットIgG2b；D、抗GITRマウスIgG1；E、抗GITRマウスIgG1-D265A。TFマウス数/群をマウス10匹以下の各群について示す。 種々のアイソタイプの抗GITR(DTA-1)抗体で処置したマウスの群におけるSa1N腫瘍の平均腫瘍体積(A)および腫瘍体積中央値(B)の変化を示す。 Sa1N腫瘍保有マウスの脾臓(A)およびTILs(B)中のFoxp3⁺/CD4⁺ T_regsに対する種々の抗GITR(DTA-1)および抗CTLA-4(9D9)アイソタイプの効果を示す。 MC38腫瘍モデルにおけるこれらの抗体で処置した個々のマウスの腫瘍体積の変化で測定した抗腫瘍活性に対する抗CTLA-4(9D9)抗体のアフコシル化（afucosylation）の効果を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、抗CTLA-4 IgG1D265A；C、抗CTLA-4 IgG2b；D、非フコシル化(NF) 抗CTLA-4 IgG2b；E、抗CTLA-4 IgG2a；F、抗CTLA-4 IgG2a-NF。TFマウス数/群をマウス12匹の各群について示す。 種々のアイソタイプの抗CTLA-4抗体および非フコシル化変異体で処置したマウスの群におけるMC38腫瘍の平均腫瘍体積(A)および腫瘍体積中央値(B)の変化を示す。 これらのアイソタイプで処置した個々のマウスの腫瘍体積の変化で測定した同系CT26結腸腺癌マウスモデルの種々の抗OX40アイソタイプの抗腫瘍活性を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、抗OX40ラットIgG1；C、抗OX40マウスIgG1；D、抗OX40マウスIgG2a。TFマウス数/群をマウス10匹の各群について示す。 これらのアイソタイプで処置した個々のマウスの腫瘍体積の変化で測定した段階的同系CT26マウス腫瘍モデルにおける種々の 抗OX40アイソタイプの抗腫瘍活性を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、抗OX40マウスIgG1-D265A；C、抗OX40マウスIgG1；D、抗OX40マウスIgG2a。TFマウス数/群をTFマウスを含む群のマウス8匹の各群について示す。 これらのアイソタイプで処置した個々のマウスの腫瘍体積の変化で測定した同系Sa1N肉腫マウスモデルにおける抗ICOS Fc融合タンパク質の種々のアイソタイプの抗腫瘍活性を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、ICOSL-マウスIgG1融合タンパク質；C、ICOSL-ヒトIgG1融合タンパク質；D、ラットIgG2b 抗マウスICOS抗体、17G9。TFマウス数/群をマウス10匹以下の各群について示す。 MC38腫瘍保有マウスの腫瘍中のIgG1 コントロール抗体と比較したFoxp3⁺/CD4⁺(A)およびFoxp3⁺/CD45⁺(B) T_regsに対する抗マウスICOS抗体、17G9の効果を示す。 これらのアイソタイプで処置した個々のマウスの腫瘍体積の変化で測定した同系MC38腫瘍マウスモデルにおける抗マウスPD-1抗体の種々のアイソタイプの抗腫瘍活性の第1試験（実験＃1)を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、抗PD-1 IgG1；C、抗PD-1 IgG1D265A；D、抗PD-1 IgG2a。TFマウス数/群をマウス11匹の各群について示す。 種々のアイソタイプの抗PD-1抗体で処置したマウスの群におけるMC38腫瘍の平均腫瘍体積(A)および腫瘍体積中央値(B)の変化を示す(実験＃1)。 腫瘍保有マウスにおけるMC38腫瘍に浸潤するT細胞サブセットのパーセンテージに対する種々の抗PD-1抗体アイソタイプの効果のフローサイトメトリー分析を示す：A. CD8⁺ T_effs；B、CD4⁺ T_effs； C、Foxp3⁺/CD4⁺ T_regs。 これらのアイソタイプで処置した個々のマウスの腫瘍体積の変化で測定した同系MC38腫瘍マウスモデルにおける抗マウスPD-1抗体の種々のアイソタイプの抗腫瘍活性の第2試験（実験＃2)を示す：A、コントロールマウスIgG1抗体；B、抗PD-1 IgG1；C、抗PD-1 IgG1D265A；D、抗PD-1 IgG2a。TFマウス数/群をマウス11匹の各群について示す。 種々のアイソタイプの抗PD-1抗体で処置したマウスの群におけるMC38腫瘍の平均腫瘍体積(A)および腫瘍体積中央値(B)の変化を示す(実験＃2)。

（発明の詳細な説明）
本開示のある局面は、癌または感染性疾患に罹患した患者におけるT細胞上の標的（例えば免疫調節標的、例えばCTLA-4、GITR、またはICOS）と結合するFc融合タンパク質（例えば抗体）の抗腫瘍効果を増強、最適化、または最大化する方法に関する。しかしながら、該標的は、免疫応答の調節に関与する免疫調節標的である必要はなく、より重要なことは、該標的は、腫瘍部位のT_effsにおける発現レベルに比べて腫瘍部位のT_regsで高レベルに発現する標的である。さらに、該標的は、好ましくは、末梢のT_regsおよびT_effsにおける発現レベルに比べて腫瘍部位のT_regsで高レベルに発現する。ある態様において、該標的は、免疫調節レセプターまたはリガンドであり、Fc融合タンパク質の結合が標的の活性を変化させ癌細胞に対する内因性免疫応答を増強する。

開示した方法は、該Fc領域の活性化Fcレセプター(FcR)との結合を増加させるためにFc融合タンパク質のFc領域を選択、設計、または修飾することを含む。ある態様において、活性化FcRに対するこの結合増加は、例えばADCCにより腫瘍部位で選択的にT_regsの減少を仲介する。腫瘍部位で選択的なT_regsの選択的枯渇を含むこの作用機序は、種々のIgGアイソタイプに対応する変異体Fc領域を含む抗マウスCTLA-4抗体を用いる種々のマウス腫瘍モデルにおいて最初に実証された。該メカニズムは、共刺激レセプター GITR、OX40およびICOSを含む他の免疫調節レセプターと結合するFc融合タンパク質で機能することも示された。したがって、本方法は、抗CTLA-4抗体に限定されず、GITR、OX40およびICOSを含む広範なレセプターと結合する抗体および他のFc融合タンパク質にも適用される。このT_reg枯渇現象の根本的メカニズムは、CD137およびTIGITも良い標的であるが、PD-1、LAG-3、TIM-3およびCD27を含むある種のレセプターは適切な標的ではなさそうであることを示唆する。

本開示は、癌または感染性物質により生じた疾患に罹患した対象のT細胞上の免疫調節標的と特異的に結合するFc融合タンパク質であって、その抗腫瘍または抗感染性物質活性が本明細書に記載の方法により増強される該Fc融合タンパク質も提供する。

本明細書は、癌または感染性物質により生じた疾患に罹患した患者の内因性免疫応答を増強することにより該患者を治療する方法であって、該患者に治療的有効量の抗腫瘍または抗感染性物質のFc融合タンパク質を投与することを含む、癌細胞に対する内因性免疫応答を増強するFc融合タンパク質または抗感染性物質の能力が本明細書に記載の方法のいずれかにより増強される方法も開示する。

用語
本開示をより容易に理解することができるように、いくつかの用語を最初に定義する。特記しないかぎり、本明細書で用いている以下の各用語は、下記の意味を有する。さらなる定義は本願全体に記載する。

「投与する」は、当業者に知られた種々の方法とデリバリーシステムのいずれかを用いて対象に治療薬を含む組成物を物理的に導入することを表す。本発明の抗体の好ましい投与経路には、例えば注射または注入による静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路が含まれる。本明細書で用いている用語「非経口投与」は、通常、注射による腸内および局所投与以外の投与方法を意味し、これには、限定されるものではないが、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病変内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨下（intrasternal）注射および注入、およびin vivoエレクトロポレーションが含まれる。あるいはまた、本発明の抗体は、非非経口的経路、例えば局所、表皮、または粘膜投与経路で、例えば、鼻内、経口、膣内、直腸内、舌下、または局所的に投与することができる。例えば、１回、複数回、および/または1またはそれ以上の長期間にわたり投与を行うこともできる。

「抗体」(Ab)には、限定されるものではないが、抗原と特異的に結合する、ジスルフィド結合で相互に連結した少なくとも2の重（H）鎖と2の軽鎖（L）またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質免疫グロブリンを含む。各H鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略す)と重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、3つのドメインCH1、CH2およびCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略す)と軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は1つのドメインCLからなる。VHおよびVL領域は、さらに相補性決定領域（CDR）と呼ばれる、フレームワーク領域（FR）と呼ばれるより保存された領域が組み込まれた超可変領域に細分することができる。各VHおよびVLは、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順でアミノ末端からカルボキシ末端に並んだ3つのCDRと4つのFRからなる。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。

典型的には、抗体は、親和性解離定数(KD)10⁻⁵〜10⁻¹¹M⁻¹またはそれ以下の高い親和性でその同種抗原と特異的に結合する。約10⁻⁴M⁻¹以上のあらゆるK_D値は、一般的には非特異的結合を示すと考えられる。本明細書で用いている、抗原と「特異的に結合する」抗体は、抗原および実質的に同じ抗原と高親和性（K_D 10⁻⁷Mまたはそれ以下、好ましくは10⁻⁸Mまたはそれ以下、より好ましくは5 x 10⁻⁹Mまたはそれ以下、および最も好ましくは10⁻⁸M〜10⁻¹⁰Mまたはそれ以下を有することを意味する）と結合し、無関係の抗原とは高親和性には結合しない抗体を表す。抗原は、特定の抗原と高度の配列同一性を有する場合、例えば特定の抗原の配列と少なくとも80％、少なくとも90％、好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも97％、またはより好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する場合に該特定の抗原と「実質的に同じ」である。例として、ヒトCTLA-4と特異的に結合する抗体は、ある種の霊長類種由来のCTLA-4抗原と交差反応性を有することもあるが、ある種の齧歯類種由来のCTLA-4抗原またはCTLA-4抗原以外の抗原、または例えばヒトPD-1抗原と交差反応しないかもしれない。

免疫グロブリンは、限定されるものではないが、IgA、分泌型IgA、IgGおよびIgMを含む一般的に知られたアイソタイプのいずれか由来でありうる。IgGアイソタイプは、ある種でサブクラスに、ヒトでIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、およびマウスでIgG1、IgG2a、IgG2b、およびIgG3に分けることができる。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体のクラスを(例えば、IgMまたはIgG1)表す。「抗体」は、例として、天然および非天然抗体；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトまたは非ヒト抗体；完全合成抗体；および1本鎖抗体を含む。「単離された抗体」は、種々の抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を表す。(例えば、CTLA-4と特異的に結合する単離された抗体は、CTLA-4以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、CTLA-4と特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原、例えば種々の種由来のCTLA-4分子と交差反応性を有するかもしれない。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および/または化学物質を実質的に含まないかもしれない。比較すると「単離された」核酸は、天然に存在する核酸と著しく異なる、すなわち、独特な化学的同一性、性質、および有用性を有する核酸組成物を表す。例えば、単離されたDNAは天然DNAと異なり、天然DNAの独立部分であり、天然にみられるより大きな構造複合体の一体部分、染色体ではない。さらに、単離されたDNAは、天然DNAと異なり、PCRプライマー、またはとりわけ疾患を診断もしくは治療効果を予測するための生物マーカー遺伝子または突然変異を検出し遺伝子発現を測定するためのハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。単離された核酸は、当該分野でよく知られた標準的技術を用いて、実質的に他の細胞成分または他の夾雑物、例えば他の細胞の核酸またはタンパク質を含まないように精製することもできる。

用語「抗抗原抗体」、「抗原を認識する抗体」、および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書では用語「抗原と特異的に結合する抗体」と互換性に用いる。

用語「モノクローナル抗体」（「mAb」）は、単一分子組成物の抗体分子、すなわち、一次配列が実質的に同一であり、特定のエピトープに対する単一結合特異性および親和性を有する抗体分子の調製物を表す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、トランスジェニック、または当業者に知られた他の技術により製造することができる。

「ヒト」抗体(HuMAb)は、フレームワークおよびCDR領域が共にヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来の可変領域を有する抗体を表す。さらに、該抗体が定常領域を含む場合は、該定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列由来である。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列がコードしていないアミノ酸残基(例えば、in vitroで無作為または部位特異的突然変異生成によるかまたはin vivo体細胞突然変異により導入された突然変異)を含みうる。しかしながら、本明細書で用いている用語「ヒト抗体」は、別の哺乳動物種（例えばマウス）の生殖細胞系由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を含むことを意図しない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は同義的に用いる。

「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のCDRドメインの外側のアミノ酸のいくらか、ほとんど、またはすべてがヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を表す。ヒト化型の抗体のある態様において、該CDRドメインの外側のアミノ酸のいくらか、ほとんど、またはすべてがヒト免疫グロブリンのアミノ酸で置換されているが、1またはそれ以上のCDR領域内のいくらか、ほとんど、またはすべてのアミノ酸は変化していない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換、または修飾は、特定の抗原と結合する抗体の能力を無効にしない限り許される。「ヒト化」抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持する。「キメラ抗体」は、可変領域がある種由来であり、定常領域が別の種由来である抗体、例えば可変領域がマウス抗体由来であり、定常領域がヒト抗体由来である抗体を表す。

「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原と特異的に結合する能力を保持する完全抗体の「抗原結合部分」（「抗原結合断片」）、またはFcR結合能を保持する抗体のFc領域を含む全抗体の部分を表す。

「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」（「ADCC」）は、FcRsを発現する非特異的細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、好中球および好酸球)が標的細胞の表面抗原と結合した抗体を認識し、実質的に標的細胞の溶解をもたらすin vitroまたはin vivo細胞介在性反応を表す。原則として、活性化FcRを有するあらゆるエフェクター細胞がADCCの仲介をもたらすことができる。

「結合タンパク質」は、特定の部分または標的と高親和性で特異的に結合するタンパク質を表す。結合タンパク質の例には、限定されるものではないが、抗体、抗体の抗原結合断片、アドネクチン、ミニボディ、アフィボディ、アフィリン、レセプターの標的結合領域、細胞接着分子、リガンド、酵素、サイトカイン、およびケモカインが含まれる。本発明の好ましい態様では、結合タンパク質は抗体のFc領域を含む。

「癌」は、体内の異常な細胞の制御不能な増殖を特徴とする種々の疾患の大きなグループを表す。制御不能な細胞分裂および増殖は、隣接組織に侵入し、リンパ系または血流を介して身体の遠位部にも転移しうる悪性腫瘍または細胞の形成をもたらす。

「細胞表面レセプター」は、シグナルを受取り、該シグナルを細胞の原形質膜を横切って伝達することができる分子および分子の複合体を表す。本開示の細胞表面レセプターの例には、CTLA-4、GITR、OX40、ICOS、PD-1、CD127、TIGIT、およびFcRsが含まれる。

「エフェクター細胞」は、1またはそれ以上のFcRsを発現し、1またはそれ以上のエフェクター機能を仲介する免疫系の細胞を表す。好ましくは、該細胞は少なくとも1タイプの活性化Fcレセプター（例えばヒトFcγRIII）を発現し、ADCCエフェクター機能を示す。ADCCを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞(PBMCs)、NK細胞、単核球、マクロファージ、好中球、および好酸球が含まれる。

「エフェクター機能」は、抗体Fc領域とFcレセプターまたはリガンドの相互作用またはそれから生じる生化学的事象を表す。典型的な「エフェクター機能」には、Clq結合、補体依存性細胞傷害(CDC)、Fcレセプター結合、FcγR介在性エフェクター機能、例えばADCCおよび抗体依存性細胞介在性貪食作用(ADCP)、および細胞表面レセプター(例えば、B細胞レセプター；BCR)の下方調節が含まれる。該エフェクター機能は、一般的には結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン)と結合するFc領域を必要とする。

本明細書において「Fc領域を含む結合タンパク質」と互換性に用いる「Fc融合タンパク質」は、その構造内にFc領域と作動可能に結合した結合タンパク質を含む。Fc融合タンパク質の非Fc部分は、標的との結合を仲介し、例えば抗体の可変領域と機能的類似性がある。Fc領域を含む結合タンパク質のよく知られた例には抗体およびイムノアドヘシンが含まれる。

「Fcレセプター」または「FcR」は、免疫グロブリンのFc領域と結合するレセプターである。IgG抗体と結合するFcRsには、対立遺伝子変異体を含むFcγRファミリーのレセプターとこれらのレセプターの選択的スプライス型が含まれる。FcγRファミリーは、3つの活性化(マウスのFcγRI、FcγRIII、およびFcγRIV；ヒトのFcγRIA、FcγRIIA、およびFcγRIIIA)レセプターと1つの阻害(FcγRIIB)レセプターからなる。ヒトFcγRsの種々の特性を表1に要約する。大多数の固有のエフェクター細胞種は、1またはそれ以上の活性化FcγRおよび阻害FcγRIIBを共発現するが、ナチュラルキラー(NK)細胞は1つの活性化Fcレセプター(マウスでFcγRIIIおよびヒトでFcγRIIIA)を選択的に発現するが、マウスおよびヒトでは阻害FcγRIIBを発現しない。

「Fc領域」(断片結晶性領域)または「Fcドメイン」、または「Fc」は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)に局在するFcレセプター、または古典的補体系の第1成分(C1q)との結合を含む、免疫グロブリンと宿主組織または因子の結合を仲介する抗体の重鎖のC末端領域を表す。したがって、Fc領域は、第1定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドである。IgG、IgA、およびIgD抗体アイソタイプのFc領域は、抗体の2つの重鎖の第2(CH2)および第3(CH2)定常ドメイン由来の2つの同じタンパク質断片からなり、IgMおよびIgE Fc領域は各ポリペプチド鎖中に3つの重鎖定常ドメイン(CHドメイン2〜4)を含む。IgGでは、Fc領域は免疫グロブリンドメインCγ2およびCγ3と、Cγ1とCγ2の間にヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は異なるかもしれないが、ヒトIgG重鎖Fc領域は、通常、C226またはP230位のアミノ酸残基から重鎖のカルボキシ末端に伸張するように定義される（ここで、番号付けはKabatのEU指標に従う）。ヒトIgG Fc領域のCH2ドメインは、約アミノ酸231から約アミノ酸340に延長するが、CH3ドメインはFc領域のCH2ドメインのC末端側に位置する。
すなわち、IgGの約アミノ酸341から約アミノ酸447に延長する。本明細書で用いているFc領域は、天然配列Fcまたは変異体Fcでありうる。Fcは、分離して、またはFcを含むタンパク質ポリペプチド、例えば「Fc領域を含む結合タンパク質」（「Fc融合タンパク質」ともいう）(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)の文脈でもこの領域を表しうる。

「悪性血液疾患」は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、またはリンパ性悪性疾患、および脾臓およびリンパ節の癌を含む。典型的なリンパ腫は、B細胞リンパ腫とT細胞リンパ腫を含む。B細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫およびほとんどの非ホジキンリンパ腫を含む。B細胞リンパ腫の非限定的例は、びまん性大B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫(慢性リンパ球性白血病と重複する)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型B細胞リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型B細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症を含む。T細胞リンパ腫の非限定的例は、節外性T細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、および血管免疫芽球性T細胞リンパ腫を含む。悪性血液疾患は、白血病、例えば、限定されるものではないが、二次性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、および急性リンパ芽球性白血病を含む。悪性血液疾患は、さらに骨髄腫、例えば、限定されるものではないが、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫を含む。他の血液学的および/またはB細胞またはT細胞関連癌が用語、悪性血液疾患に含まれる。「免疫応答」は、外来物質に対する脊椎動物内の生体反応であって、該物質およびそれによって生じる疾患から生物を保護する反応を表す。免疫応答は、免疫系の細胞(例えば、Tリンパ球、Bリンパ球、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞、または好中球)およびこれらの細胞または肝臓のいずれかが産生する可溶性高分子(抗体、サイトカイン、および補体を含む)の作用により仲介され、侵入病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌または他の異常細胞、または自己免疫または病的炎症の場合は正常ヒト細胞または組織の選択的標的化、結合、傷害、破壊、および/またはそれらの脊椎動物体内からの排除をもたらす。

「免疫調節物質（immunomodulator）」または「免疫調節剤(immunoregulator)」は、免疫応答の変調、調節、または修飾に関与する情報伝達経路の成分を表す。免疫応答を「変調する」、「調節する」、または「修飾する」は、免疫系の細胞または該細胞の活性のあらゆる変更を表す。そのような調節には、種々の細胞種の数の増加または減少、これらの細胞の活性の増加または減少、または免疫系内に生じ得る他のあらゆる変化によって表されうる免疫系の刺激または抑制が含まれる。阻害および刺激免疫調節物質はどちらも同定されており、そのあるものは腫瘍微小環境における機能を増強するかもしれない。開示した発明の好ましい態様では、該免疫調節物質はT細胞表面に局在する。「免疫調節標的」、または「免疫調節性標的」は、物質、薬剤、部分、化合物、または分子による結合の標的となり、その活性が物質、薬剤、部分、化合物、または分子と結合することにより変化する免疫調節物質である。免疫調節標的には、例えば、細胞表面のレセプター(「免疫調節レセプター」)およびレセプターリガンド(「免疫調節リガンド」)が含まれる。

「免疫調節Fc融合タンパク質」または「免疫調節性Fc融合タンパク質」は、免疫調節物質と結合し、この結合の結果として免疫調節物質の量または活性を増加または阻害するFc融合タンパク質を表す。

「免疫療法」は、免疫応答を増強、抑制、または修飾することを含む方法により疾患に罹患しているか罹患するリスクがあるかまたは再発した対象を治療することをいう。

「内因性免疫応答を増強する」は、対象に存在する免疫応答の効果または効力を増加することを意味する。この効果および効力の増加は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制するメカニズムを克服し、または内因性宿主免疫応答を増強するメカニズムを刺激することにより達成しうる。「タンパク質」は、少なくとも2の連続的に結合したアミノ酸残基を含む鎖を表し、その鎖の長さの上限はない。タンパク質中の1またはそれ以上のアミノ酸残基は、限定されるものではないが、グリコシル化、リン酸化、またはジスルフィド結合形成などの修飾を含みうる。用語「タンパク質」は、本明細書では「ポリペプチド」と互換性に用いる。

「情報伝達経路」（シグナル伝達経路または情報伝達経路）は、ある細胞から別の細胞または細胞のある部分からその細胞の別の部分への情報伝達に役割を果たす2またはそれ以上の化学物質およびそれらの間の生化学的関連を表す。

「対象」には、あらゆるヒトまたは非ヒト動物が含まれる。用語「非ヒト動物」には、限定されるものではないが、脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウサギ、齧歯類、例えばマウス、ラット、およびモルモット、鳥類、例えば鶏、両生類、および爬虫類が含まれる。好ましい態様において、対象は、哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット、または齧歯類である。開示した本発明のあらゆる局面のより好ましい態様において、対象はヒトである。用語「対象」および「患者」は本明細書では互換性に用いる。

本発明のFc融合タンパク質などの医薬または治療薬の「治療的有効量」または「治療的有効用量」は、単独または他の治療薬と組み合わせて用いると、疾患の症状の重症度の減少、疾患の無症状期の頻度および持続時間の増加、または疾病による欠陥または障害の予防を促進するで示される疾患の退行を促進する薬剤のあらゆる量である。薬剤の治療的有効量または用量は、疾患を発症するかまたは疾患が再発するリスクがある対象に単独または別の治療薬と組み合わせて投与すると、疾患の発症または再発を抑制する「予防的有効量」または「予防的有効用量」を含む。疾患の退行を促進するかまたは疾患の発症または再発を抑制する治療薬の能力は、当業者に知られた種々の方法を用い、例えば、臨床試験においてヒト対象で、ヒトでの効果を予測する動物モデル系で、またはin vitroアッセイで該薬剤の活性を評価することにより評価することができる。

例として、抗癌剤は対象での癌の退縮を促進する。好ましい態様において、治療的有効量の薬剤は、癌が除去されるまで癌の退縮を促進する。「癌の退縮を促進する」は、有効量の該薬剤の単独または抗腫瘍薬と組み合わせた投与が、腫瘍の増殖または大きさの減少、腫瘍の壊死、少なくとも1の疾患症状の重症度の減少、無疾患症状期間の頻度および持続時間の増加、疾患の苦痛による障害（impairmentまたはdisability）の予防、または患者の疾患の症状の改善をもたらすことを意味する。さらに、処置に関して用語「有効な」および「有効性」は、薬理学的有効性と生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性は、患者の癌の退縮を促進する薬剤の能力を表す。生理学的安全性は、薬剤投与により生じる細胞、器官、および/または生物レベルの毒性または他の有害な生理学的作用（副作用）のレベルを表す。

腫瘍処置の例として、薬剤の治療的有効量または用量は、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を、非処置対象に対して少なくとも約20％、より好ましくは少なくとも約40％、より好ましくは少なくとも約60％、より好ましくは少なくとも約80％阻害する。最も好ましい態様において、薬剤の治療的有効量または用量は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に抑制する（すなわち、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を100％阻害する）。腫瘍増殖を抑制する化合物の能力は、ヒト腫瘍での有効性を予測させる本明細書に記載の動物モデル系、例えばCT26結腸腺癌、MC38結腸腺癌およびSa1N繊維肉腫マウス腫瘍モデルを用いて評価することができる。あるいはまた、組成物のこの特性は、化合物の細胞増殖を阻害する能力を試験することにより評価することができ、そのような阻害は、当業者に知られたアッセイによりin vitroで測定することができる。本発明の他の好ましい態様において、腫瘍の退縮は、少なくとも約20日間、より好ましくは少なくとも約40日間、またはより好ましくは少なくとも約60日間の期間継続し、観察されうる。

対象の「処置」または「治療」は、疾患に関連する症状、合併症、病状、または生化学的兆候の発症、進行、発現、重症度、または再発を逆転、緩和、改善、阻害、減速、または抑制するための対象に対して行うあらゆる種類の介入または方法、または薬剤の投与を表す。

抗腫瘍効果およびT細胞サブセットに対する抗CTLA-4抗体のアイソタイプの効果
市販のほとんどの治療的抗体は、他のヒト抗体アイソタイプに比べて強いADCCおよびCDCを誘導することができるヒトIgG1アイソタイプである。さらに、治療的IgG1抗体は、新生児Fcレセプター(FcRn)との結合を介して血液中で長期間安定性を有する。抗CD20 リツキシマブ(RITUXAN（登録商標))(Dall’Ozzo et al.、2004))、抗Her2 トラスツズマブ(HERCEPTIN（登録商標))(Gennari et al.、2004)、抗腫瘍壊死因子-α(抗TNF-α) インフリキシマブ(REMICADE（登録商標))(Louis et al.、2004)、および抗RhD(Miescher et al.、2004)を含む種々の治療的抗体の活性は、少なくとも一部がADCCにより仲介される。CDCもリツキシマブ(Idusogie et al.、2000)およびアレムツズマブ(CAMPATH（登録商標))(Crowe et al.、1992)の抗腫瘍メカニズムの可能性が考えられる。したがって、治療的抗体の有効性を改善する努力が、最近、エフェクター機能、特にADCCおよびCDCの増強に集中していることは驚くべきことではない(Natsume et al.、2009)。Fc領域にアミノ酸突然変異を導入するかまたはFc結合オリゴ糖の修飾により抗体のFc領域のFcγRIIIaまたはC1qに対する結合活性を改善することを含む有効なアプローチが報告されている。

しかしながら、T細胞上の免疫調節標的と結合し、T細胞反応を増大させる抗体などの物質の場合は、ADCC、CDC、またはADCPなどを介してT細胞に細胞傷害性である抗体を利用することは、免疫応答の上方調節におけるこれらT細胞の数および活性を増加させる目的に反するので望ましくないといえる。例えば、ヒト抗CTLA-4抗体のトレメリムマブを開示する米国特許No. 6,682,736は、「細胞を殺す抗体を用いることは好ましくない」、代わりに「単にCTLA-4とそのリガンドとの結合を抑制し、T細胞の下方調節を軽減する」ことが望ましいと記載している。該特許は、さらに、CDCをもたらすことができるヒトIgG1およびIgG3を含む抗体アイソタイプとCDCを仲介しないヒトIgG2およびIgG4を含む他のアイソタイプを同定している。さらに、望ましくない抗体アイソタイプ、例えば、ヒトIgG1またはIgG3を当該分野でよく知られた常套的技術を用いて望ましいIgG2またはIgG4アイソタイプに転換することができることを開示している。これらの開示に一致して、米国特許No. 6,682,736も、トレメリムマブを含むその中で論じたCTLA-4抗体の大部分は、容易にアイソタイプ転換により望ましいIgG4アイソタイプを生じることができる望ましいヒトIgG2アイソタイプであることを開示している。

今では、CTLA-4は、主としてCD4⁺T細胞の2つの主なサブセットに対する2つの異なる効果：(1)ヘルパーT細胞活性の下方調節と(2)調節性T細胞(T_regs)の免疫抑制活性の増強によりその生物学的機能を示すと認識されている(Lenschow et al.、1996；Wing et al.、2008；Peggs et al.、2009)。T_regsは、高レベルの表面CTLA-4を構成的に発現することが知られており、それはこの分子がその調節機能に不可欠であることを示唆する(Takahashi et al.、2000；Birebent et al.、2004)。したがって、T_regポピュレーションはCTLA-4遮断効果に最も感受性であるかもしれない。

CTLA-4遮断がヘルパーT細胞依存性の免疫応答の広範な活性化をもたらすのに対し、T_regsにおけるCTLA-4エンゲージメントはその抑制機能を増強する。したがって、CTLA4遮断の作用メカニズムを考慮すると、エフェクターCD4⁺ T細胞活性の増強とT_reg依存性免疫抑制の阻害は共におそらく重要な因子である。1つのメカニズムは、CTLA-4遮断がCD4⁺および/またはCD8⁺細胞に直接作用してCTLA-4の阻害効果を除去することによりエフェクター機能を増強することかもしれない。あるいはまた、またはさらに、T_regsにおけるCTLA-4の構成的発現は、CTLA-4遮断の臨床効果はT_regsの枯渇または遮断により仲介されるかもしれない可能性を示唆する。これらの別のメカニズムを解明するための研究において、Maker et al.(2005)は、CTLA-4遮断の抗腫瘍作用はT_regsの遮断または枯渇ではなくT細胞活性化の増加によると結論づけた。O’MahonyおよびJanik(2006)およびRosenberg(2006)も参照のこと。しかしながら、T_effまたはT_regコンパートメントのCTLA-4遮断の独立した寄与を評価するための別の試験は、両細胞種におけるCTLA-4の遮断によるT_eff機能の直接的増強とT_reg活性の同時阻害の組み合わせが癌免疫療法時の抗CTLA-4抗体の完全な治療効果を仲介するのに不可欠であると結論づけた(Peggs et al.、2009)。

本研究のある局面は、種々のマウス腫瘍モデルにおける抗体の抗腫瘍活性に対するマウス抗CTLA-4抗体のアイソタイプの影響を評価した。最初に、IgG1、突然変異IgG1D265A、IgG2b、およびIgG2aアイソタイプに対応するマウス抗マウスCTLA-4抗体の4つの変異体を作製し、CTLA-4⁺細胞と同等に結合し、マウス血清において同様の薬物動態挙動を示すことを示した(実施例1)。CT26結腸腺癌腫瘍モデルにおけるマウス抗CTLA-4の4つのアイソタイプの抗腫瘍活性の試験から、IgG2a処置が処置したマウス10中9匹に完全な腫瘍拒絶をもたらすが、IgG2bアイソタイプは中等度の腫瘍増殖阻害を示し、突然変異IgG1D265AアイソタイプはコントロールマウスIgG同様に活性がわずかであることがわかった(実施例2)。

次に、腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節におけるサブセットT細胞ポピュレーションに対する種々の抗CTLA-4アイソタイプの影響をCT26結腸腺癌マウス腫瘍モデルで評価した。抗CTLA-4抗体によるマウスの処置は腫瘍部位におけるCD8⁺ 細胞傷害性T細胞のポピュレーションの増加をもたらし、IgG2aおよびIgG2bアイソタイプにより誘導される増加が最も大きく(実施例4)、IgG2aアイソタイプはCD4⁺Tヘルパー細胞のポピュレーションの減少をもたらした。処置群間の顕著な差がT_regsに対する効果で認められた。IgG2aアイソタイプによる処置は、腫瘍部位のT_regsのポピュレーションを顕著に減少させたが、IgG2bは変化を示さず、IgG1D265はT_reg数の増加をもたらした。CD8⁺ T_effsの増加はIgG2aアイソタイプを有する抗CTLA-4抗体に仲介されるT_regsの減少と相まって腫瘍部位のT_eff/T_reg比の上昇をもたらし、強い抗腫瘍活性を示唆する。

腫瘍部位のT細胞サブポピュレーションの変化と対照的にすべての抗CTLA-4アイソタイプは、腫瘍流入領域リンパ節におけるT_regs数の増加に同様に作用し(実施例4)、これは先の研究から予期しないことであった(Quezada et al.、2006；Maker et al.、2005；Rosenberg、2006)。したがって、この驚くべき結果は、腫瘍部位における選択的なT_regの減少を証明した。同じパターンがMC38結腸腺癌マウス腫瘍モデル(実施例5および6)および免疫原性Sa1N繊維肉腫腫瘍モデル(実施例7および8)でも証明されたので、この予期しない結果はCT26腫瘍モデルの特性でないことを示した。これらの両腫瘍モデルでは、IgG2aアイソタイプは、CD8⁺細胞のパーセンテージの顕著な増加とT_regsレベルの同時の顕著な減少を仲介し、腫瘍増殖に対する最も顕著な阻害作用をもたらした。同じ現象がアゴニスト性抗GITR、OX40およびICOS抗体を含む他の抗体でも観察された(実施例10〜16)が、抗PD-1抗体ではみられなかった(実施例17)。リンパ節中のT_reg数の増加の誘導に対して腫瘍部位のT_regsの枯渇の仲介におけるある種のIgG2a抗体の種々のこの差次的作用の分子基盤は、本明細書に記載のデータから明らかにすることができる。実施例18に記載のごとく、CTLA-4に加えてICOS、GITR、OX40、およびCD137を含む種々のT細胞標的は、末梢より腫瘍部位のT細胞でより高度に発現するだけでなく、CD8およびCD4 T_effsでの発現レベルと比べてT_regsで優先的に発現する。さらに、末梢と比べて腫瘍部位で活性化FcRs、特にFcγRIVを発現するマクロファージなどの細胞の存在が増加した証拠がある(Simpson et al.、2013)。該細胞は、抗CTLA-4抗体療法後の腫瘍に浸潤するT_regsの枯渇に主要な役割を果たすことが示された(Simpson et al.、2013)。したがって、活性化FcRsと結合しADCCを仲介するFc融合タンパク質、例えば抗CTLA-4のマウスIgG2aアイソタイプは、腫瘍部位のCD8およびCD4 T_effsでの発現レベルと比べて高レベルのCTLA-4を差次的に発現する腫瘍部位のT_regsなどの該抗体の標的を特異的に発現するT細胞の枯渇に有効である。

抗体のアイソタイプの違いは、抗体の生物活性に大きな影響があることが示されている(NimmerjahnおよびRavetch、2005；NimmerjahnおよびRavetch、2008；NimmerjahnおよびRavetch、2010)。腫瘍特異抗原、チロシナーゼ関連タンパク質-1(Tyrp1；gp75)に対するTA99抗体の抗腫瘍活性は、B16ネズミメラノーマモデルにおける活性化レセプターFcRIVとの結合を必要とすることを示した(NimmerjahnおよびRavetch、2005)。続く研究は逆の結論に達し、Bevaart et al.(2006)はFcγRIの必須の役割とFcγRIIIまたはFcγRIVが関与しないことをみいだし、Albanesi et al.(2012)はFcγRIおよびFcγRIIIはTA99 治療効果に寄与しFcγRIVは寄与しないと結論した。興味深いことに、本明細書に記載のCT26、MC38、およびSa1N腫瘍モデルにおける抗CTLA-4の抗腫瘍活性(実施例2、5および7)は、抗腫瘍活性における活性化Fcレセプターの必要性を示唆する。活性化レセプターに対する結合の増強と阻害レセプターに対する結合の減少は以下の順番で抗CTLA-4アイソタイプの抗腫瘍活性と関連する：mIgG2a＞＞mIgG2b＞＞mIgG1D265A。この順番は、NimmerjahnおよびRavetch(2005)により定義され、抗体介在ADCC機能について決定された免疫グロブリンFc領域の活性化Fcレセプターとの結合と阻害Fcレセプターとの結合の活性比(A/I比として知られる)に従う。

抗CTLA-4の最大抗腫瘍活性は、腫瘍部位のT_regsの枯渇または排除とT_effsの同時の活性化により達成される(実施例4、6、および8)。特に、活性化T細胞はCTLA-4を発現するが、これらは排除されず、より高い構成レベルの抗CTLA-4を発現することが知られているT_reg(Read et al.、2000；Takahashi et al.、2000；Birebent et al.、2004)は腫瘍部位からなくなる。したがって、ネズミ抗CTLA-4 IgG2aアイソタイプは、抗腫瘍反応を仲介する活性化T_effsを残しながら、他のアイソタイプと比べてT_reg数を最大限に減少させることができる。したがって、IgG2aアイソタイプは、抗腫瘍反応を阻害する細胞のポピュレーションも特異的に減少させながら抗腫瘍エフェクター細胞の活性を増強させることができる。IgG2a 抗CTLA-4抗体により差次的に影響を受けるこれらT細胞ポピュレーションはそれぞれ腫瘍増殖の調節に不可欠である。T_effsおよびT_regsの枯渇に対する特異的感受性は、エフェクター細胞の細胞表面に発現した低レベルのCTLA-4によると思われる(実施例18を参照；Selby et al.、2013も参照のこと)。

この結果は、腫瘍微小環境の細胞の組成物およびそれが発現するFcレセプターが抗CTLA-4の抗腫瘍活性に関与することも示唆する。腫瘍部位に特異的に局在するT_regsの数が減少し、リンパ節中のT_regsは抗CTLA-4のすべてのアイソタイプにより活性化されるという知見は、抗CTLA-4の種々のアイソタイプの活性の組織特異的差を明確に示す。

述べたように、抗CTLA-4-IgG2aおよびそれほどではないが抗CTLA-4-IgG2bは、それらの活性化FcγRsとの結合能と一致して腫瘍部位からのT_regsの排除または枯渇を仲介する。これは、CD8⁺ T_effs(およびCD8⁺ T細胞)の同時の活性化と増殖とともに生じ、CTLA-4-B7相互作用を阻害することにより仲介されると思われる。しかしながら、本明細書に記載のデータは、T_eff活性化が単にT_regの枯渇の結果であることを排除しない。したがって、抗CTLA-4のネズミIgG2aアイソタイプは、他のアイソタイプと比べて、抗腫瘍反応を仲介する活性化T_effsを残しながらT_reg数を強く減少させることができる。実際に、腫瘍部位におけるエフェクターサイトカイン分泌(IFNγ、TNFα、およびIL-13、およびおそらくIL-10(Emmerich et al.、2012；Mumm et al.、2011)の増強の知見は、T_reg抑制の減少と活性化CD8エフェクターの増加と一致する。

MC38およびCT26モデルの治療的処置におけるIgG1およびIgG1-D265Aアイソタイプの抗腫瘍活性の欠如も注目に値する。CTLA-4-B7と抗CTLA-4 IgG1または抗CTLA-4 IgG1D265Aとの相互作用の阻害は、末梢におけるT_regsの活性化と増殖をもたらすが、T_effsのみの遮断(すなわち、T_regの除去なし)は検出可能な抗腫瘍反応を促進するには不十分である。さらに、T_reg機能を減少させることが示されたT_regs上のCTLA-4の遮断も(Quezada et al.、2006；Onishi et al.、2008)、抗腫瘍活性を明らかに増強しない。これに対し、抗CTLA-4(ハムスター抗マウスCTLA-4 9H10)、GVAX療法、およびヒトまたはマウスCTLA-4を発現するT細胞サブセットによる照射レシピエントマウスの再構築を用いるB16メラノーマモデルでは、T_effsとT_regsの両方で完全な抗腫瘍活性にマウスCTLA-4の発現が必要であった(Peggs et al.、2009)。しかしながら、本明細書に記載の試験と異なり、T_effを標的とした抗CTLA-4遮断のみが、このモデルで部分的抗腫瘍作用をもたらした。

抗腫瘍効果に対する抗CTLA-4抗体以外のFc融合タンパク質のアイソタイプの影響
Fc領域の活性化FcγRsとの結合能に一致し、抗腫瘍効果に関連する、ある種の抗CTLA-4アイソタイプ、特にマウスIgG2aアイソタイプ、および程度が低いがマウスIgG2bが、腫瘍部位からのT_regsの排除または枯渇を仲介するという証拠に従って(実施例1〜7)、抗腫瘍活性に対するさらなる抗体および他のFc融合タンパク質のアイソタイプの影響を検討した。

種々の抗GITRアイソタイプの抗腫瘍活性を同系MC38結腸癌およびSa1N肉腫マウスモデルで評価した(実施例10〜12)。抗CTLA-4の結果と同様に、抗GITR IgG1およびIgG1D265Aアイソタイプには実質的に抗腫瘍活性がないが、マウスIgG2aおよびラットIgG2b(マウス活性化FcRsとの結合ではマウスIgG2aと同等に)アイソタイプは最も大きな腫瘍増殖阻害をもたらすことが示された(実施例11)。抗GITR mG2a、mG2bおよびrG2bアイソタイプは、腫瘍増殖阻害と関連する腫瘍環境での顕著なT_regの枯渇を誘導するのに対して末梢のT_regポピュレーションに対してはほとんど影響がないかまたはわずかな増加を誘導した(実施例11および12)。反対に、mIgG2aアイソタイプは腫瘍部位のCD8⁺細胞のパーセンテージの増加をもたらしたが、mIgG1およびrat IgG2bは、CD8⁺細胞のパーセンテージを全くまたはわずかしか増加しなかった。いずれのアイソタイプも末梢のCD8⁺細胞レベルに大きな影響を与えなかった。同様のデータを、最近、Bulliard et al.(2013)が報告した。

一般的に同様のデータが、同系CT26腫瘍マウスモデルで試験した抗OX40アイソタイプ(実施例14)およびSa1NおよびMC38腫瘍モデルで試験した抗ICOSアイソタイプ(実施例15および16)で得られた。しかしながら、MC38腫瘍モデルでの抗PD-1アイソタイプの評価は、抗PD-1 IgG2aアイソタイプはいくらか抗腫瘍活性を示したが抗IgG1またはIgG1D265Aアイソタイプが示す活性より低かったことを示した(実施例17)。抗PD-1 IgG2aアイソタイプがIgG1およびIgG1D265Aアイソタイプと比べて抗腫瘍活性を増強しなかったこれらの結果は、抗CTLA-4、GITR、OX40、およびICOS IgG2a抗体で得られた結果と全く対照的であった。さらに、腫瘍部位のCD8⁺細胞のわずかな増加をもたらし、IgG2aアイソタイプと比べてT_regsのパーセンテージのより小さな増加をもたらしたIgG1およびIgG1D265Aアイソタイプと対照的に、抗PD-1 IgG2aアイソタイプは腫瘍部位のCD8⁺細胞のパーセンテージの減少とT_regsのパーセンテージの増加をもたらした(実施例17)。

腫瘍部位および末梢のT細胞サブセットに対する種々のレセプターの発現レベルの試験は、基礎となるメカニズムの解明を助ける。該データは、ICOS、GITR、CTLA-4、OX40、CD137、CTLA-4およびTIGITを含むある種のT細胞レセプターが、腫瘍部位のCD8およびCD4 T_effsの発現レベルと比べて、腫瘍部位のT_regsを比較的高いレベルで発現することを示す。これらのレセプターも、末梢の同タイプのT細胞における発現レベルと比べて腫瘍部位のT細胞サブタイプでより高レベルで発現する。反対に、PD-1、LAG-3、およびTIM-3を含む他のレセプターは、腫瘍部位のT_regsにおける発現レベルと比べて腫瘍部位のCD8および/またはCD4 T_effsでより高レベルで発現する。CD27は、腫瘍部位および末梢の種々の細胞タイプでほぼ一定レベルの発現を示す。

したがって、活性化FcRsと結合しADCCを仲介する抗CTLA-4などのFc融合タンパク質のマウスIgG2aアイソタイプは、腫瘍部位のCD8およびCD4 T_effsの発現レベルと比べてCTLA-4を差次的に高レベルに発現する腫瘍部位のT_regsなどの該抗体の標的を優先的に発現するT細胞を枯渇させるのに有効である。

抗体などのFc融合タンパク質の抗腫瘍効果を増強するT_regs枯渇メカニズムが、共刺激レセプターと結合するアゴニスト抗体と共阻害レセプターと結合するアンタゴニスト抗体の両方で機能していることは注目に値する。該データは、T細胞表面に発現したあらゆるタンパク質は、その機能に関わらず標的細胞のADCC介在性枯渇を誘導するための活性化FcRsと強い結合を示すFc融合領域、例えばマウスのIgG2aまたはヒトのIgG1と結合するための標的として働くことができる。抗腫瘍抗体などの抗腫瘍Fc融合タンパク質の場合は、標的タンパク質が、腫瘍部位のT_regsの選択的な正味の枯渇と免疫応答の同時刺激があるように腫瘍部位のT_regsで腫瘍部位のT_effsより高レベルで差次的に発現することが望ましい。標的タンパク質が免疫応答を刺激するT_reg枯渇成分が主に腫瘍部位に限定されるように腫瘍部位のT_regsで末梢の他のT細胞より高レベルに差次的に発現することも望ましい。したがって、ICOS、GITR、CTLA-4、OX40、CD137、CTLA-4、およびTIGITを標的とするFc融合タンパク質は、活性化FcRに対するFc領域の結合を増強するための本明細書に記載のFc領域を修飾することによりその抗腫瘍効果を増強するためのよい候補である。CTLA-4と特異的に結合するがその共阻害活性を遮断しない抗CTLA-4抗体などの抗CTLA-4 Fc融合タンパク質は、活性化Fcレセプター（FcR)に対する該Fc領域の結合を増強するためにFc領域の選択、設計、または修飾により抗腫瘍効果の増強を操作するためのよい候補である。そのような増強されたFc融合タンパク質は、末梢における免疫応答を刺激する副作用なしに高い抗腫瘍効果を示すかもしれない。

反対に、標的 PD-1、LAG-3、TIM-3、およびCD27を標的とするFc融合タンパク質は、これらのレセプターは腫瘍部位のT_effsでT_regsより高度に発現するので、開示した方法によりその抗腫瘍効果を増強するためのよい候補ではないと思われる。実施例17の抗PD-1を用いて得られたデータはこの考えを裏付ける。

免疫調節Fc融合タンパク質の抗腫瘍効果の増強方法
本明細書に記載のデータは、抗CTLA-4抗体、ならびに限定されるものではないが、癌患者の治療における共刺激および共阻害レセプターおよびレセプターリガンドを含むT細胞上の免疫調節標的と結合する他のFc融合タンパク質の活性と関連がある。これらのデータは、より効力の高い抗免疫調節抗体を設計する可能性も示唆する。

ヒト抗ヒトCTLA-4モノクローナル抗体のイピリムマブは、転移性メラノーマの治療に承認されており、他の癌では臨床試験中である(Hoos et al.、2010；Hodi et al.、2010；Pardoll、2012a)。イピリムマブは、ほとんどのヒトFcレセプターと最も良く結合するヒトIgG1アイソタイプを有し(表1；Bruhns et al.、2009)、それと結合する活性化Fcレセプターのタイプに関してネズミIgG2aと等価であると考えられる。IgG1は、ヒトNK細胞および単核球が発現する活性化レセプターCD16(FcγRIIIa)と結合するので、イピリムマブはADCCを仲介することができる。IgG1アイソタイプのイピリムマブは、最初にハイブリドーマから直接単離されたが、次いでクローニングされ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で発現した。ADCCおよび/またはCDCを仲介するアイソタイプは免疫応答を上方調節しようとするT細胞上のレセプターを標的とする抗体では望ましくないかもしれないにもかかわらず、該抗体のIgG1アイソタイプはカニクイザルにおけるワクチン反応を増強し、機能的であると考えられたため一部保持された。イピリムマブは、例えば、処置後CD4⁺およびCD8⁺細胞の表面のHLA-DRの発現の顕著な増加と絶対リンパ球数の増加で示される血中の活性化T細胞数の増加を示し(Ku et al.、2010；Attia et al.、2005；Maker et al.、2005；Berman et al.、2009；Hamid et al.、2009)、T細胞の枯渇がヒトの末梢で生じないことを示唆する。イピリムマブは、IL-2-活性化PBMCをエフェクター細胞として用いる活性化T細胞のADCCは中程度であった(未発表)が、T_regsを標的として使用する試験は行わなかった。イピリムマブで処置した患者の血中の末梢T_reg頻度のわずかな変化がみられた(Maker et al.、2005)が、腫瘍内T_regsに対するイピリムマブの効果に関する利用可能な情報はほとんどない。しかしながら、イピリムマブで処置した患者の転移性メラノーマ病変の生検における高CD8⁺/T_reg比と腫瘍壊死の正相関が記載されている(Hodi et al.、2008)。さらに、イピリムマブ処置膀胱癌患者の腫瘍組織では非処置膀胱癌患者の腫瘍よりCD4⁺ Foxp3⁺ T細胞のパーセンテージが低かった(Liakou et al.、2008)。これらの結果は、イピリムマブが腫瘍部位におけるT_regの減少を仲介するという本明細書に記載のデータと一致する。

これに対し、トレメリムマブは、FcγRIIa変異体H131を除くFcレセプターと効率的に結合しないIgG2アイソタイプである(Bruhns et al.、2009)。トレメリムマブは、CTLA-4とB7の阻害的相互作用を遮断することによりT細胞反応を増強する能力を有するが、本明細書に記載のデータは、トレメリムマブは腫瘍のT_regsの枯渇の仲介に限られるかもしれず、その上でイピリムマブと比べて抗腫瘍活性の低下を示すと予期されることを示唆する。投与計画が互いに異なるのでこれら2つの抗体の臨床的活性を直接比較するのは困難であった(例えば、 Ascierto et al.、2011参照)。トレメリムマブはイピリムマブ同様に明らかな抗腫瘍活性を有する(Ribas、2010)。興味深いことに、トレメリムマブの作用メカニズムの研究は、免疫組織化学で分析した限られた数の試料において、腫瘍浸潤CD8 T細胞の増加が治療の結果として生じるが治療後の腫瘍のFoxp3⁺細胞数には変化がないことを示す(Comin-Anduix et al.、2008；Huang et al.、2011)。あるいはまた、T_reg機能の阻害は、TLA-4/B7相互作用を遮断することにより達成されるかもしれない。

抗CTLA-4、抗GITR、抗OX40、および抗ICOS抗体を含むT細胞上の標的に対する抗体の作用メカニズムとこれら抗体の活性に対するアイソタイプの効果に関する本明細書に記載の実験データに基づいて、本開示は、癌または感染性物質により生じた疾患に罹患した対象のT細胞上の標的と特異的に結合するFc融合タンパク質の抗腫瘍効果を増強、最適化、または最大化する方法であって、活性化Fcレセプター（FcR)に対する該Fc領域の結合を増強するためにFc融合タンパク質のFc領域を修飾することを含む方法を提供する。抗体の活性化FcRとのそのような結合の増強が、ある標的において、腫瘍環境におけるT_regsの枯渇と該抗体の抗腫瘍活性の増加をもたらすことが示された。好ましい態様において、該標的は免疫調節レセプターまたはリガンドであり、Fc融合タンパク質の結合は標的の活性を変化させることにより癌細胞に対する内因性免疫応答を増強する。

開示した本発明の種々の局面は、抗CTLA-4、抗GITR、抗OX40、および抗ICOS抗体を用いて例示されている。しかしながら、本明細書に記載の方法は、免疫調節レセプターの標的化または抗体に限定されない。むしろ、本発明はT細胞表面に発現した種々の標的と結合する広範なFc融合タンパク質に適用可能である。したがって、ある態様において、Fc融合タンパク質は、1本鎖可変断片(scFv)、二価（divalentまたはbivalent）scFvs(di-scFvsまたはbi-scFvs)、ディアボディ、三価トリアボディ、または四価テトラボディ、ミニボディ、または単離されたCDRを含む抗体の抗原結合断片などの結合タンパク質 (さらなる詳細はHollingerおよびHudson、2005；OlafsenおよびWu、2010参照のこと)；アドネクチン；アフィボディ；アフィリン；レセプターのリガンド結合領域；細胞付着分子；レセプターリガンド；酵素；サイトカイン；またはケモカインと作動可能に結合したFc領域を含む。循環から完全抗体より急速に除去される抗体の抗原結合断片のより小さな誘導体などのFc融合タンパク質の使用は、過敏性免疫応答の潜在的毒性の軽減を助け、および/または誘導剤の急速な除去を可能にするかもしれない。ある態様において、Fc融合タンパク質は、レセプターリガンドと作動可能に結合したFc領域を含む。好ましい態様において、Fc融合タンパク質は抗体である。

本発明の方法のある局面において、抗体はIgGアイソタイプである。他の局面において、抗体はモノクローナル抗体である。他の局面において、モノクローナル抗体はキメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。ある好ましい態様において、モノクローナル抗体はヒトIgG抗体である。他の好ましい態様において、ヒトIgG抗体の活性化FcRとの結合が増強される。活性化FcRはFcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターでありうる。ある局面において、ヒトIgG抗体のFcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターとの結合の増強は、腫瘍部位のT_regsの減少を仲介する。

本発明の方法のある態様において、FcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターに対するヒトIgG抗体の結合の増強は、腫瘍部位のエフェクターT細胞(T_effs)の(a)減少を仲介しないか、または(b)増加を仲介する。ある好ましい態様において、標的は、腫瘍部位のT_regsで腫瘍部位のT_effsより高レベルに発現する。他の態様において、標的は、腫瘍部位のT_regsは末梢のT_regsまたはT_effsより高レベルに発現する。

さらに、本発明の方法に用いるFc融合タンパク質は、T細胞上の共刺激または共阻害免疫調節標的と結合することができる。共刺激標的との特異的結合に用いるFc融合タンパク質はアゴニストFc融合タンパク質である。例えば、アゴニストFc融合タンパク質を用いて、T細胞上のGITR、CD134(OX40)、ICOS、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、またはHVEMなどの共刺激免疫調節物質を標的とする。アゴニストFc融合タンパク質の共刺激免疫調節物質との結合は、免疫応答、特にT細胞反応の上方調節をもたらす。本発明の方法のある態様において、Fc融合タンパク質はT細胞上の共刺激免疫調節標的の活性を増強するアゴニスト抗体である。好ましい態様において、共刺激免疫調節標的はGITR、OX40、ICOS、またはCD137である。

反対に、共阻害標的との特異的結合に用いるFc融合タンパク質は阻害またはアンタゴニストFc融合タンパク質である。例えば、阻害Fc融合タンパク質を用いて、限定されるものではないが、T細胞上のCTLA-4、PD-1、PD-L1、BTLA、TIM-3、LAG-3、A2aR、KLRG-1、CD244、CD160、またはVISTAレセプターなどの共阻害免疫調節物質を標的化することができる。Fc融合タンパク質の抗腫瘍効果を増強するための本発明の方法のある態様において、Fc融合タンパク質は、抗CTLA-4抗体、抗BTLA抗体、抗VISTAレセプター抗体、抗A2aR抗体、抗KLRG-1抗体、抗CD244抗体、抗CD160抗体、および抗TIGIT抗体から選ばれるアンタゴニスト抗体である。好ましい態様において、Fc融合タンパク質はT細胞上の共阻害免疫調節標的の活性を遮断するアンタゴニスト抗体である。好ましい態様において、共阻害免疫調節標的はCTLAまたはTIGITである。アンタゴニストFc融合タンパク質の共阻害免疫調節物質との結合は、免疫応答、特にT細胞反応の上方調節をもたらす。

ある好ましい態様において、該抗CTLA-4抗体である。さらに好ましい態様において、抗CTLA-4抗体は、イピリムマブまたはトレメリムマブ、またはFc領域と活性化FcRとの結合を増強するように修飾されたこれらの抗体変異体である。他の態様において、該抗体は抗PD-1抗体である。本開示のあらゆる方法において対象は好ましくはヒトである。

T_regsを特異的に標的化する抗体はまだ製造されていないが、臨床試験で多くの免疫チェックポイント抗体がT_regsの免疫抑制活性の遮断を伴うメカニズムにより抗腫瘍免疫を増強するかもしれない(Pardoll、2012b)。本明細書に示すように、免疫チェックポイント抗体であるマウス抗CTLA-4のIgG2aアイソタイプは、驚くべきことに予期せず腫瘍部位に選択的なT_regsの枯渇を仲介するが、同時に、腫瘍流入領域リンパ節のT_regsの増加と腫瘍内CD8⁺ T_effsの増加を仲介する(実施例4、6、および8)。T_regsは免疫調節Fc融合タンパク質により標的化されうるが、開示した本発明のある局面において、標的化細胞はT_reg以外の種々のタイプの抑制性細胞である。同様に、本開示のFc融合タンパク質はCTLA-4などの共阻害免疫調節物質を標的化しうるが、開示した発明のある局面において、標的化免疫調節物質は、共刺激免疫調節物質、例えばGITR、OX40、CD137、またはICOSである。したがって、本発明のある態様において、Fc融合タンパク質、例えばアゴニストまたはアンタゴニスト抗体は、抑制性細胞ポピュレーションに発現した共刺激または共阻害標的である免疫調節標的と結合し、該細胞ポピュレーションの枯渇または除去を仲介する。好ましい態様において、Fc融合タンパク質と防御細胞ポピュレーションに発現した免疫調節標的との結合は、該免疫調節標的を発現する防御細胞ポピュレーションの活性を増強するかまたは該ポピュレーションに有害作用がない。ある態様において、Fc融合タンパク質が結合するT_regまたは他の免疫抑制性T細胞上の標的は免疫調節標的ではない。

免疫チェックポイントを標的とする免疫療法剤の臨床試験では、持続的臨床反応が、過度に前処置した患者でも、メラノーマ(MEL)、腎細胞癌(RCC)、扁平上皮非小細胞肺癌(NSCLC)、および非扁平上皮NSCLC患者のかなり大きな割合を含む複数の腫瘍タイプで、および肝臓、肺、リンパ節、および骨を含む種々の転移部位において観察された(例えば、 Pardoll、2012b；Topalian et al.、2012；Brahmer et al.、2012；Mellman et al.、2011；Flies et al.、2011参照)。本発明の方法のある態様において、Fc融合タンパク質の効果が増強される癌は以下から選ばれる：骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚、または眼内悪性メラノーマ、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、結直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部癌、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織癌、尿道癌、陰茎癌、小児固形癌、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、環境誘発癌（アスベスト誘発癌を含む）、 血液学的悪性疾患（例えば、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫/原発性縦隔B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、球性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、および前駆Tリンパ芽球性リンパ腫を含む）、および該癌のあらゆる組み合わせ。本発明は、転移癌の治療にも応用できる。ある好ましい態様において、該癌は以下から選ばれる：MEL、RCC、扁平上皮NSCLC、非扁平上皮NSCLC、結直腸癌(CRC)、去勢耐性前立腺癌(CRPC)、頭頸部扁平上皮癌、および食道、卵巣、消化管、および乳房の癌、卵巣癌、胃癌、肝細胞癌、膵臓癌、および悪性血液疾患。他の好ましい態様において、該癌はMELである。他の好ましい態様において、該癌はRCCである。あらゆる他の好ましい態様において、該癌は扁平上皮NSCLCである。さらに他の好ましい態様において、該癌は非扁平上皮NSCLCである。

本明細書に記載の結果は、T細胞上の免疫調節標的を標的とするFc融合タンパク質の臨床的活性をヒト患者で用いるために増強することができることを明確に示す。種々の戦略が、癌治療のためのFc融合タンパク質のADCCおよびCDCエフェクター機能を増加し、特にVおよびFアロタイプではFcRγIIIaに対するIgG1抗体の結合を増加させるために利用可能である(例えば、 Natsume et al.、2009参照のこと)。実際に、FcγIIIAに対する特異的結合を改善してADCCを増強するために治療的抗体を操作することは、改善された臨床効果を有する次世代の治療的抗体の開発において重要な役割を果たすと予期される(Natsume et al.、2009；Albanesi et al.、2012)。しかし、治療的Fc融合タンパク質の臨床効果におけるADCC、ADCP、およびCDCなどのエフェクター機能の重要性は今や広く認識されているが、そのようなエフェクター機能は、T細胞上の免疫調節標的と結合するFc融合タンパク質を用いるT細胞反応を上方調節する戦略には望ましくないと今まで考えられていた(例えば、米国特許No. 6,682,736参照)。

ヒト治療的Fc融合タンパク質を操作するあるアプローチは、活性化FcγRに対する結合を増強する1またはそれ以上の突然変異をIgG1 Fc領域に導入することである(NimmerjahnおよびRavetch、2012)。例えば、IgG1三重突然変異体(S298A/E333A/L334A)は、FcγRIIIa結合およびADCC活性の増強を示すことがわかっている(Shields et al.、2001)。FcγRIIIaに対する親和性の最大の増加、FcγRIIb結合の減少、およびカニクイザルにおける強い細胞傷害性活性を示すS239D/I332EおよびS239D/I332E/A330L突然変異を有する変異体を含むFcγRIIIaに対する強い増強された結合を示す他のIgG1変異体が同定された(Lazar et al.、2006)。アレムツズマブ(CD52特異的)、トラスツズマブ(HER2/neu特異的)、リツキシマブ(CD20特異的)、およびセツキシマブ(EGFR特異的)などの抗体への三重突然変異の導入は、in vitroでのADCC活性の最大の増強をもたらし、S239D/I332E変異体はサルにおけるB細胞を枯渇させる能力の増強を示した(Lazar et al.、2006)。さらに、B細胞悪性腫瘍および乳癌のモデルのヒトFcγRIIIaを発現するトランスジェニックマウスでFcγRIIIaに対する結合の増強と、同時にADCC活性の増強を示すL235V、F243L、R292P、Y300L、およびP396L突然変異を含むIgG1突然変異体が同定された(Stavenhagen et al.、2007；Nordstrom et al.、2011)。

新生児FcレセプターFcRnに対するIgGの親和性を増加させるようFc領域を突然変異させ、抗体のin vivo半減期の延長と抗腫瘍活性の増加をもたらすこともできる。例えば、ベバシズマブ(VEGF特異的)およびセツキシマブ(EGFR特異的)のFc領域へのM428L/N434S突然変異の導入は、サルで抗体半減期を増加し、マウスで抗腫瘍反応を改善した(Zalevsky et al.、2010)。

抗体とFcγRsとの相互作用は、N297残基に各Fc断片が結合したグリカン部分を修飾することにより増強することもできる。特に、分岐フコース残基の欠如は、抗原結合またはCDCを変化させずにIgGの活性化FcγRIIIAに対する結合を改善することによりADCCを強く増強する(Natsume et al.、2009)。アフコシル化腫瘍特異抗体がマウスモデルにおけるin vivo治療活性の増強をもたらす有力な証拠がある(NimmerjahnおよびRavetch、2005；Mossner et al.、2010；実施例13参照)。

抗体のグリコシル化修飾は、グリコシル化機構が変化した宿主細胞で該抗体を発現させることにより達成することができる。グリコシル化機構が変化した細胞は当該分野で記載されており、本開示の組換え抗体を発現し、グリコシル化が変化した抗体を生成する宿主細胞として用いることができる。例えば、細胞株Ms704、Ms705、およびMs709は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、FUT8(α-(1,6) フコシルトランスフェラーゼ；米国特許公報No. 20040110704；Yamane-Ohnuki et al.、2004参照)を欠き、これらの細胞株で発現した抗体はその炭水化物にフコースを欠く。別の例として、EP 1176195も、FUT8遺伝子が機能的に破壊された細胞株、および抗体のFc領域と結合するN-アセチルグルコサミンにフコースを付加するための活性がほとんどまたは全くない細胞株、例えば、ラット骨髄腫細胞株YB2/0(ATCC CRL 1662)を開示している。PCT公開公報WO 03/035835は、Asn(297)結合炭水化物に対するフコース結合能が低下した、宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化ももたらす変異体CHO細胞株Lec13を開示している(Shields、et al.、2002も参照のこと)。修飾グリコシル化プロフィールを有する抗体はPCT公開公報WO 2006/089231に記載のごとくニワトリの卵で製造することもできる。あるいはまた、修飾グリコシル化プロフィールを有する抗体は植物細胞、例えばアオウキクサ（Lemna）を用いて製造することができる(例えば米国特許公開公報No. 2012/0276086参照)。PCT公開公報WO 99/54342は、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII))を発現するよう操作した細胞株を開示しており、操作した細胞株中で発現した抗体は抗体のADCC活性の増加をもたらす二分GlcNac構造の増加を示す(Umana et al.、1999も参照のこと)。あるいはまた、該抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断することができる。例えば、酵素α-L-フコシダーゼは抗体からフコシル残基を除去する(Tarentino et al.、1975)。

補体カスケードのC1q成分の細胞と結合した抗体のFc領域との結合は次の補体活性化の強度にも影響し、種々のアプローチがFc領域のC1qとの結合を増強することによりCDCを増強することに成功した。用いる戦略は、Fcまたはヒンジ領域内のアミノ酸突然変異を操作し、または重鎖定常領域内のIgG1およびIgG3配列をシャッフリングすることを含む(Natsume et al.、2009)。

本明細書に記載のin vivoデータは、T細胞上の免疫調節レセプターを標的とするT細胞反応を増強する種々のFc融合タンパク質(抗体)を修飾してIgG1のFcγRIIIaに対する結合を増加させると、抗腫瘍活性の増強が生じることを示唆する。IgG1のFcγRIIIaに対する結合を増加させるための本明細書に記載のあらゆる方法を用いることができる。本発明の方法のある態様において、該Fc融合タンパク質はIgG1アイソタイプではなく、Fc領域の修飾によりFc融合タンパク質をIgG1アイソタイプに変換する。例として、トレメリムマブ、IgG2抗CTLA-4抗体の抗腫瘍効果は、これらの抗体のFc領域を修飾して修飾Fc領域のFcγRIIIaに対する結合が増加したIgG1アイソタイプを生成することを含む方法により増強することができる。本明細書に記載のデータに基づいてそのような修飾は、腫瘍部位のT_regsの枯渇とCD8⁺ CTLsの同時の増加を仲介し、抗腫瘍効果の増強をもたらす。

別の態様において、Fc領域の選択、設計、または修飾は、Fc領域の低フコシル化または非フコシル化をもたらす。さらに別の態様において、Fc領域の選択、設計、または修飾は、Fc領域の活性化FcRレセプターとの結合の増加をもたらす少なくとも1のアミノ置換を含む。したがって、例えば本発明の方法のある態様は、S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L、およびM428L/N434S突然変異から選ばれるアミノ酸突然変異を含むようFc領域を選択、設計、または修飾することを含む。

例として、上記アイソタイプスイッチングにより増強されうるトレメリムマブのIgG1アイソタイプの抗腫瘍効果は、さらに、Fc領域のFcγRIIIaとの結合の増強をもたらす少なくとも1のアミノ置換を導入するためにFc領域を修飾し、および/またはFcγRIIIaに対する結合の増加を示す低フコシル化または非フコシル化Fc領域を得るためにFc領域を修飾することを含む方法により増強することができる。

抗免疫調節物質Fc融合タンパク質
本開示のFc融合タンパク質は、T細胞上の標的と特異的かつ高親和性に結合するFc領域を含む結合タンパク質である。好ましい態様において、該Fc融合タンパク質は、末梢のT_regsおよびT_effsでの発現レベルと比べて腫瘍環境のT_regsで高レベルに発現する免疫調節標的と結合する。ある態様において、抗免疫調節物質のFc融合タンパク質はCTLA-4と特異的に結合する抗CTLA-4結合タンパク質である。好ましい態様において、抗CTLA-4結合タンパク質は遮断抗体である。他のある態様において、免疫調節物質のFc融合タンパク質は、GITR、OX40、またはICOSと特異的に結合する抗GITR、抗OX40、または抗ICOS結合タンパク質である。好ましい態様において、抗GITR、抗OX40、またはICOS結合タンパク質はアゴニスト抗体である。

CTLA-4の細胞外ドメインを認識し結合するモノクローナル抗体が米国特許No. 5,977,318に記載されている。本開示のヒトモノクローナル抗体は、マウス系でなくヒト免疫系の部分を保持するトランスジェニックまたはトランスクロモソミックマウスを用いるか、またはファージまたは酵母ディスプレイなどのin vitroディスプレイ技術などの種々の方法を用いて作製することができる(例えば、Bradbury et al.、2011参照)。トランスジェニックおよびトランスクロモソミックマウスは、本明細書でそれぞれHUMAB MOUSE（登録商標)(Lonberg et al.、1994)およびKM MOUSE（登録商標)(WO 02/43478)というマウスを含む。本開示の典型的ヒト抗ヒトCTLA-4抗体の製造は、米国特許No. 6,984,720および7,605,238に詳述されている。これら特許で10D1で示されるヒトIgG1抗CTLA-4抗体はイピリムマブ(以前にMDX-010およびBMS-734016としても知られている)としても知られており、YERVOY（登録商標)として市販されている。本開示の他の典型的ヒト抗CTLA-4抗体は米国特許No. 6,682,736に記載されており、ヒトIgG2抗ヒトCTLA-4抗体のトレメリムマブ(以前はチシリムマブ；CP-675,206)が含まれる。

本明細書に記載の方法により増強することができる抗GITR Fc融合タンパク質には、PCT公開公報WO 2006/105021およびWO2011/028683、および日本公開公報No. 2008278814に記載の抗体が含まれる。

本明細書に記載の方法により増強することができる抗ICOS Fc融合タンパク質には、米国特許No. 7,030,225、7,932,358、6,803,039、および7,722,872、および米国公開公報No. 2013/0142783に記載の抗体が含まれる。

本明細書に記載の方法により増強することができる抗OX40 Fc融合タンパク質には、PCT公開公報No. WO 95/12673、WO 99/42585、WO 03/106498、WO 2007/062245、WO 2009/079335、WO 2010/096418、WO 2012/027328、WO 2013/028231、WO 2013/008171、およびWO 2013/038191に記載の抗体が含まれる。

本開示は、Fc融合タンパク質のFc領域を修飾して該Fc領域と活性化Fcレセプターとの結合を増加させることを含むFc融合タンパク質の抗腫瘍効果を増強する方法を提供する。本開示は、癌または感染性物質により生じる疾患に罹患した対象のT細胞上の共阻害または共刺激免疫調節レセプターと特異的に結合し、共阻害レセプターの活性を遮断するかまたは共刺激レセプターの活性を増強することにより、癌細胞または感染性物質に対する内因性免疫応答を増強するFc融合タンパク質であって、内因性免疫応答を増強する抗体の能力が本明細書に記載の方法を用いて増強されるFc融合タンパク質も提供する。好ましい態様において、免疫応答を増強する能力が増強されたFc融合タンパク質は抗体(「増強された抗体」)である。ある態様において、この抗体はIgGアイソタイプである。ある他の態様において、該増強された抗体はモノクローナル抗体である。さらなる態様において、該増強された抗体はキメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。

本発明のある局面において、該増強されたFc融合タンパク質はヒトIgG抗体である。このヒトIgG抗体のある態様では、FcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターに対する結合が増強される。他の態様において、そのようなFcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターに対する結合の増強はADCCの増加をもたらす。ある好ましい態様において、修飾されたFcのFcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターとの結合の増強は腫瘍部位のT_regsの減少を仲介する。このT_regsの減少は、ADCC、または末梢ではなく腫瘍部位のT_regsを差次的に減少させる種々のメカニズムにより仲介されるかもしれない。

本発明のFc融合タンパク質のある態様において、FcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターに対するヒトIgG抗体の結合の増強は腫瘍部位のT_regsの減少を仲介する。他の態様において、FcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターに対するヒトIgG抗体の結合の増強は、腫瘍部位のT_effsの(a)減少を仲介しないか、または(b)増加を仲介する。好ましい態様において、該標的は腫瘍部位のT_regsで腫瘍部位のT_effsより高レベルで発現する。さらなる態様において、該標的は腫瘍部位のT_regsで末梢のT_regsまたはT_effsより高レベルで発現する。ある他の態様において、該Fc融合タンパク質は、T細胞上の共阻害免疫調節標的の活性を遮断するアンタゴニスト抗体である。さらなる態様において、該共阻害免疫調節標的はCTLAまたはTIGITである。

本発明のある他の局面において、増強されたFc融合タンパク質はT細胞上の共刺激免疫調節標的の活性を増強するアゴニスト抗体である。さらなる態様において、該共刺激免疫調節標的はGITR、OX40、ICOS、CD137である。他の態様において、増強された抗体は、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体、抗OX40抗体、抗ICOSレセプター抗体、抗KLRG-1抗体、抗CD244抗体、抗CD160抗体、または抗TIGIT抗体である。ある好ましい態様において、増強された抗体は、抗CTLA-4抗体、抗GITR抗体、抗OX40抗体、抗ICOSレセプター抗体である。抗CTLA-4抗体は、例えばイピリムマブの増強された変異体またはトレメリムマブの増強された変異体でありうる。ある態様において、そのような増強された変異体はイピリムマブまたはトレメリムマブのアフコシル化または低フコシル化変異体である。他の態様において、そのようなイピリムマブまたはトレメリムマブの増強された変異体には、S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/ P396L、およびM428L/N434S突然変異から選ばれるアミノ酸突然変異が含まれる。

本発明の他の局面において、増強されたFc融合タンパク質はT細胞上の共阻害免疫調節標的の活性を増強するアンタゴニスト抗体である。ある態様において、該抗体は、抗CTLA-4抗体、抗BTLA抗体、抗VISTAレセプター抗体、抗A2aR抗体、抗KLRG-1抗体、抗CD244抗体、抗CD160抗体、および抗TIGIT抗体から選ばれる。好ましい態様において、該抗体は抗CTLA-4抗体または抗TIGIT抗体である。

増強されたFc融合タンパク質のある他の局面において、該対象は以下から選ばれる癌に罹患している：骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚、または眼内悪性メラノーマ、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、結直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部癌、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織癌、尿道癌、陰茎癌、小児固形癌、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫,腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、環境誘発癌（アスベスト誘発癌を含む）、 血液学的悪性疾患（例えば、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫/原発性縦隔B細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性リンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、濾胞性リンパ腫、びまん性大B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Bリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、球性リンパ芽球性白血病、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、および前駆Tリンパ芽球性リンパ腫を含む）、および該癌のあらゆる組み合わせ。本発明は、転移癌の治療にも応用できる。好ましい態様において、該癌は、MEL、RCC、扁平上皮NSCLC、非扁平上皮NSCLC、CRC、CRPC、頭頸部扁平上皮癌、食道、卵巣、消化管、および乳房の癌、卵巣癌、胃癌、肝細胞癌、膵臓癌、および悪性血液疾患から選ばれる。

本発明の抗体をコードする核酸分子
本開示の別の局面は、T細胞上の標的、例えば、免疫調節レセプターまたはリガンドと結合する本開示のFc融合タンパク質のいずれかをコードする単離された核酸分子に関する。好ましい態様において、これらの単離された核酸分子は、阻害性免疫調節レセプターを標的とし遮断する抗体をコードする。該核酸は、全細胞、細胞溶解物、または部分精製されるかもしくは実質的に純粋な形中に存在しうる。該核酸は、例えばDNAまたはRNAであり得、イントロン配列を含んでいてもいなくてもよい。ある態様において、該DNAは、ゲノムDNA、cDNA、または合成DNA、すなわち、研究室で、例えばポリメラーゼ連鎖反応または化学合成により合成されたDNAである。好ましい態様において、該核酸はcDNAである。

本開示の核酸は、標準的分子生物学的技術を用いて得ることができる。本開示は、本明細書に記載のFc融合タンパク質のいずれかをコードする単離された核酸分子を提供する。本開示は、該単離された核酸分子を含む発現ベクターも提供する。本開示は、さらに、開示した発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞を提供する。そのような宿主細胞は、当該分野でよく知られた方法を用いて、例えば、宿主細胞におけるFc融合タンパク質の発現、より好ましくは宿主細胞が増殖する培養液中への抗体の分泌を可能にするのに充分な時間、宿主細胞を培養することにより本明細書に記載のFc融合タンパク質のいずれかを製造するのに用いることができる。該Fc融合タンパク質は、当該分野でよく知られた標準的タンパク質精製法を用いて培養液から回収することができる。

医薬組成物
本発明のFc融合タンパク質は、結合タンパク質（例えば抗体またはその断片）と医薬的に許容される担体を含む組成物（例えば医薬組成物）に構成することができる。本明細書で用いている「医薬的に許容される担体」には、生物学的に互換性のあらゆるすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、該担体は、静脈内、皮下、筋肉内、非経口的、脊髄、または表皮投与(例えば、注射または注入による)に適している。本発明の医薬組成物は、1またはそれ以上の医薬的に許容される塩、抗酸化剤、水性および非水性担体、および/またはアジュバント、例えば保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤を含みうる。

投与計画は、最適な望ましい反応（例えば治療的反応）が得られ、または副作用が最小限となるよう調整される。典型的には、一定レベルの抗癌効果を達成するのに必要な本開示の増強された抗体の用量は、非修飾抗体より低い。さらに、そのような低用量は、典型的には、副作用の低い発生率または重症度をもたらす。T細胞上の標的と特異的に結合する本開示の抗体を投与するための用量は、対象の体重の約0.00001〜約100mg/kg、通常約0.0001〜約20mg/kg、より通常約0.001〜約10mg/kgの範囲である。好ましくは、該用量は、0.01〜10mg/kg体重の範囲内である。例えば、用量は、0.01、0.05、0.1、0.3、1、3、または10mg/kg体重、より好ましくは0.1、0.3、1、または3mg/kg体重でありうる。投与スケジュールは、典型的には抗体の典型的薬物動態特性に基づいてレセプターの持続的占有が達成されるように設計される。典型的治療計画は、1回/週、1回/2週、1回/3週、1回/4週、1回/月、1回/3月、または1回/3〜6月の投与を伴う。

本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、患者に対する過度な毒性がなしに、特定の患者、組成物、および投与方法において望む治療反応を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変化しうる。選択した用量レベルは、以下を含む種々の薬物動態的因子に依存するだろう：用いる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、治療期間、用いる特定の組成物と組み合わせ用いる他の薬剤、化合物、および/または物質、治療する患者の年齢、性別、体重、病状、一般的健康状態、および病歴、および医薬分野でよく知られた因子。当業者は、対象の大きさ、対象の症状の重症度、および選択した特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて適切な用量を決定することができるだろう。本発明の組成物は、当該分野でよく知られた種々の方法の1またはそれ以上を用いて1またはそれ以上の投与経路を介して投与することができる。

ある態様において、該Fc融合タンパク質の用量は、患者の大きさや体重に関わらず固定される固定定用量である。例えば、該Fc融合タンパク質は、患者の体重に関わらず5、20、35、75、200、350、750、または1500mgの固定用量で投与されうる。本明細書で用いている用語「定用量」、「固定用量」、および「固定定用量」は互換性に用いられ、患者の体重や体表面積と無関係に患者に投与される用量を表す。したがって、定用量または固定用量は、mg/kg用量ではなく、Fc融合タンパク質(例えば抗CTLA-4抗体)の絶対量で提供される。当業者が理解するように、投与する用量、投与経路、および/または投与方法は目的とする結果に応じて変化するだろう。

本発明の治療的使用および方法
本開示のFc融合タンパク質、組成物、および方法は、癌および感染性疾患の治療を含む多くの治療的有用性を有する。

癌免疫療法
本開示は、治療的有効量の本明細書に記載のFc融合タンパク質のいずれかを対象に投与することを含む、癌に罹患した対象の内因性免疫応答を増強して該対象を治療する方法であって、Fc融合タンパク質のFc領域が該Fc領域と活性化Fcレセプターとの結合を増強するように選択、設計、または修飾されている方法を提供する。本明細書に記載の方法において、該Fc領域は必ずしも修飾されておらず、例えば、適切なFc領域は活性化FcRsと結合するよう選択または設計することができる。同様に、FcRに対する結合は、必ずしも増加しておらず、高いように選択または設計することができる。ある態様において、該Fc融合タンパク質は抗体である。好ましい態様において、該抗体はIgGアイソタイプである。ある他の態様において、該抗体はモノクローナル抗体である。さらなる態様において、該モノクローナル抗体はキメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。さらに他の態様において、該モノクローナル抗体はヒトIgG抗体である。本発明の方法のある好ましい局面において、FcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターに対するヒトIgG抗体の結合が増強される。好ましくは、ヒトIgG抗体のFcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターとの結合の増強はADCCの増加をもたらす。ある態様において、該抗体はT細胞上の共阻害免疫調節標的の活性を遮断するアンタゴニスト抗体である。好ましい態様において、該共阻害免疫調節標的はCTLAまたはTIGITである。

標的、例えば、T細胞上の共刺激および共阻害免疫調節標的の両方が局在する広範囲のT細胞、好ましくはT_regsまたは他の免疫抑制細胞と結合するFc融合タンパク質を本発明の免疫療法に用いることができる。ある態様において、該Fc融合タンパク質はアンタゴニスト抗体、例えば抗CTLA-4抗体または抗TIGIT抗体である。ある好ましい態様において、該抗体は抗CTLA-4抗体である。さらに好ましい態様において、該抗CTLA-4抗体はイピリムマブまたはトレメリムマブである。より好ましい態様において、該抗CTLA-4抗体は、Fc融合タンパク質のFc領域が該Fc領域の活性化Fcレセプターとの結合を増強するように選択、設計、または修飾されている抗体、例えばイピリムマブまたはトレメリムマブの増強された変異体である。ある態様において、そのような増強された変異体は、イピリムマブまたはトレメリムマブのアフコシル化または低フコシル化変異体である。他の態様において、そのようなイピリムマブまたはトレメリムマブの増強された変異体には、S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/ P396L、およびM428L/N434S突然変異から選ばれるアミノ酸突然変異が含まれる。

他の態様において、該抗体はT細胞上の共刺激免疫調節標的の活性を増強するアゴニスト抗体である。好ましい態様において、該共刺激免疫調節標的はGITR、OX40、ICOS、またはCD137である。さらなる態様において、該抗GITR、OX40、ICOS、またはCD137抗体はアフコシル化または低フコシル化変異体である。さらなる態様において、該抗GITR、OX40、ICOS、またはCD137抗体は、S298A/E333A/L334A、S239D/I332E、S239D/I332E/A330L、L235V/F243L/R292P/Y300L/ P396L、およびM428L/N434S突然変異から選ばれる1またはそれ以上のアミノ酸突然変異を含む増強された変異体である。

本発明の免疫療法の好ましい態様において、該対象はヒトである。

本開示の免疫療法を用いて治療することができる他の癌のれいには以下のものが含まれる：骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、皮膚、または眼内悪性メラノーマ、腎臓癌、子宮癌、卵巣癌、結直腸癌、結腸癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部癌、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織癌、尿道癌、陰茎癌、悪性血液疾患、小児固形癌、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎盂癌、中枢神経系(CNS)の新生物、原発性CNSリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹グリオーマ、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮癌、環境誘発癌（アスベスト誘発癌を含む）、転移癌、および該癌のあらゆる組み合わせ。好ましい態様において、該癌は、MEL、RCC、扁平上皮NSCLC、非扁平上皮NSCLC、CRC、CRPC、頭頸部扁平上皮癌、および食道、卵巣、消化管、および乳房の癌から選ばれる。本発明の方法は、転移癌の治療にも応用することができる。

本開示のFc融合タンパク質は、免疫原性物質、例えば、癌細胞、精製腫瘍抗原(組換えタンパク質、ペプチド、および炭化水素分子を含む)、細胞、および免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子で形質移入した細胞と組み合わせることができる(He et al.、2004；Mellman et al.、2011)。用いることができる腫瘍ワクチンの非限定的例には、メラノーマ抗原のペプチド、例えば、gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1および/またはチロシナーゼのペプチド、またはサイトカインGM-CSFを発現するように形質移入した腫瘍細胞が含まれる。

これらの癌患者の治療方法のある態様では、該Fc融合タンパク質を単独療法として対象に投与するが、他の態様では、免疫調節標的の刺激または遮断を、化学療法計画、放射線療法、外科手術、ホルモン除去、および血管新生阻害剤を含む標準的癌治療と効果的に組み合わせることができる。該Fc融合タンパク質は、抗腫瘍剤（免疫コンジュゲートとして）と結合するかまたは該薬剤と別々に投与することができる。後者の場合（別々に投与）は、該抗体は該薬剤の前、後、または同時に投与するか、または他の既知の治療薬と同時に投与することができる。化学療法剤には、とりわけ以下のものが含まれる：ドキソルビシン(ADRIAMYCIN（登録商標))、シスプラチン、カルボプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル(LEUKERAN（登録商標))、シクロホスファミド(CYTOXAN（登録商標)；NEOSAR（登録商標))、レナリドミド(REVLIMID（登録商標))、ボルテゾミブ(VELCADE（登録商標))、デキサメタゾン、ミトキサントロン、エトポシド、シタラビン、ベンダムスチン(TREANDA（登録商標))、リツキシマブ(RITUXAN（登録商標))、イフォスファミド、ビンクリスチン(ONCOVIN（登録商標))、フルダラビン(FLUDARA（登録商標))、タリドミド(THALOMID（登録商標))、アレムツズマブ(CAMPATH（登録商標))、オファツムマブ(ARZERRA（登録商標))、エベロリムス(AFINITOR（登録商標)、ZORTRESS（登録商標))、およびカルフィルゾミブ(KYPROLISTM)。種々のメカニズムを介して作用する抗癌剤の同時投与は、薬剤耐性の発現または腫瘍細胞の抗原性の変化の克服を助けることができる。

他の態様において、該患者は、例えば対象をサイトカインで治療することによりFcγRの発現または活性を修飾（例えば増強または阻害）する薬剤でさらに治療することができる。Fc融合タンパク質での治療時に投与する好ましいサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、インターフェロン-γ(IFN-γ)および腫瘍壊死因子(TNF)が含まれる。

本発明のある局面は、癌に罹患した対象の免疫療法のための医薬を製造するための本開示のあらゆるFc融合タンパク質の使用である。医薬を製造するための本開示のあらゆるFc融合タンパク質の使用は、本明細書に記載のすべての範囲の癌に広く応用可能である。本開示は、本明細書に記載のFc融合タンパク質を用いるあらゆる治療方法に用いるための本発明のFc融合タンパク質も提供する。

感染性疾患の治療
本発明の他の方法を用い、特定の毒素または病原体に暴露した患者を治療する。したがって、本発明の別の局面は、例えば感染性疾患に罹患した対象の内因性免疫応答を増強することによる対象の感染性疾患の治療方法であって、治療的有効量の本開示のFc融合タンパク質を対象に投与することを含む、Fc融合タンパク質のFc領域が該Fc領域と活性化Fcレセプターとの結合を増強するように選択、設計、または修飾されている方法を提供する。

ある好ましい態様において、該Fc融合タンパク質は抗体である。この治療的アプローチが特に有用な感染性疾患の例には、現在、有効なワクチンがない病原体や通常のワクチンが十分に有効ではない病原体によって生じる疾患が含まれる。これには、限定されるものではないが、HIV、肝炎(A、B、およびC)、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルディア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、および緑膿菌が含まれる。ある好ましい態様において、該病原体はウイルス病原体である。本明細書に記載の免疫療法的アプローチは、特に、感染中に抗原の変化を生じる病原体（例えばHIV）による確立した感染症に対して特に有用である。

上記腫瘍に対する応用と同様に、本明細書に記載の免疫療法的アプローチは、単独で、またはワクチンと組み合わせてアジュバントとして病原体、毒素、および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために用いることができる。このアプローチは、他の形の免疫療法、例えばサイトカイン処置(例えば、インターフェロン、GM-CSF、G-CSF、またはIL-2の投与)と組み合わせることができる。

抗CTLA-4免疫療法の可能なバイオマーカー
本明細書に記載のデータは、抗CTLA-4抗体による免疫療法の候補患者の適切さを予測し、および/またはそのような抗体の抗腫瘍効果を予測するための可能なバイオマーカーも示唆する。例えば、抗CTLA-4のIgG1アイソタイプがT_regの枯渇を仲介する知見は、FCRG3A(CD16)多形性が、リツキシマブ(WengおよびLevy、2003；Cartron et al.、2004)およびトラスツズマブ(HERCEPTIN（登録商標)) Musolino et al.、2008；Tamura et al.、2011)の活性で観察されたようにイピリムマブの活性と関連しうることを示唆する。FcγRIIIaとの結合がイピリムマブの活性に必要であれば、F158変異体より高い親和性でIgG1と結合するホモ接合FcγRIIIa V158変異体を有する個体は、よりよい生存および/または反応を示すと予期される(Cartron et al.、2004)。さらに、FcγRIIaとの結合がイピリムマブの活性に必要であれば、R131変異体より高い親和性でIgG1と結合するFcγRIIa H131変異体を有する個体はよりよい生存および/または反応を示すと予期される(WengおよびLevy、2003)。

本データは、腫瘍部位に増加した数のT_regsを含む腫瘍で抗CTLA-4が最も良く機能することも示唆する。T_regsの存在は、腫瘍抗原に対して現在生じている免疫応答の結果であると思われる。実際に、イピリムマブに対する反応は、腫瘍浸潤リンパ球の存在と関連があった(Hamid et al.、2011；Ji et al.、2012)。また、イピリムマブ療法は、腫瘍抗原に対する既存反応を有する患者でより有効である（例えば、NY-ESO-1(Yuan et al.、2011)）。さらに、T_regの除去は、腫瘍微小環境における特定細胞種の存在に依存するかもしれない。本データは、関連Fcγレセプターを保持する単核球、マクロファージ、またはNK細胞などの腫瘍中に存在するマクロファージ様細胞または骨髄系の他の細胞が抗CTLA-4の抗腫瘍効果に必要であることを示唆する。

したがって、本開示は、マクロファージ様細胞または腫瘍中の骨髄系統の他の細胞の存在をスクリーニングすることを含む、抗CTLA-4抗体などのFc融合タンパク質を用いる免疫療法のための候補患者の適切さを予測し、および/または該抗体の抗腫瘍効果を予測する方法を提供する。

本開示は、癌に罹患した対象の免疫療法であって、(a)免疫療法の適切な候補である対象を選択し、該選択が(i)被験組織試料中のマクロファージ様細胞または骨髄系統の他の細胞の存在を評価し、(ii)被験組織試料中のマクロファージ様細胞または骨髄系統の他の細胞の存在に基づいて適切な候補として対象を選択することを含み、(b)選択した対象に治療的有効量の免疫調節Fc融合タンパク質を投与することを含む方法も提供する。ある好ましい態様において、免疫調節Fc融合タンパク質は、抗CTLA-4、抗TIGIT、抗GITR、抗OX40、抗CD137、または抗ICOS抗体である。

キット
本開示のあらゆるFc融合タンパク質またはその組成物と使用説明書を含むキットも本開示の範囲内である。したがって、本開示は、対象の癌または感染性物質で生じた疾患を治療するためのキットであって、(a) 1またはそれ以上の用量の、対象の癌細胞または感染性物質に対する内因性免疫応答を増強する能力が増強している本開示のあらゆるFc融合タンパク質、および(b)本明細書に記載のいずれかの治療方法に該Fc融合タンパク質を用いるための使用説明書を含むキットを提供する。例えば、ある態様において、キット中のFc融合タンパク質は、T細胞上の共阻害免疫調節標的の活性を遮断するアンタゴニストFc融合タンパク質である。さらなる態様において、共阻害免疫調節標的はCTLAまたはTIGITである。他の態様において、アンタゴニストFc融合タンパク質は抗体である。さらなる態様において、抗体は抗CTLA-4または抗TIGIT抗体である。さらなる態様において、抗CTLA-4抗体はイピリムマブまたはトレメリムマブの増強変異体である。

ある他の態様において、該Fc融合タンパク質はT細胞上の共刺激免疫調節標的の活性を増強するアゴニストタンパク質である。さらなる態様において、共刺激免疫調節標的はGITR、OX40、ICOS、またはCD137である。他の態様において、アゴニスト性Fc融合タンパク質は抗体である。さらなる態様において、該抗体は抗GITR、OX40、ICOS、またはCD137抗体である。

該キットは、さらに1またはそれ以上のさらなる治療用薬剤を含みうる。例えば、癌治療では1またはそれ以上のさらなる薬剤は、免疫抑制用薬剤、化学療法剤、または放射能毒性剤、または種々の抗原を標的とする1またはそれ以上のさらなるFc融合タンパク質でありうる。

キットは、典型的には、キットの内容物の意図する用途を示すラベルと使用説明書を含む。用語、ラベルは、キット上またはキットと共に供給されるかまたはキットに添付したあらゆる文書または記録物を含む。医薬キットのある態様において、該Fc融合タンパク質は単位剤形の他の治療薬と同梱することができる。

本発明をさらに以下の実施例により説明するが、これは限定と理解すべきではない。本明細書において引用するすべての図、すべての参考文献、特許、および特許公開公報の内容は本明細書の一部を構成する。

種々の抗mCTLA-4抗体アイソタイプの作製
抗腫瘍活性における抗CTLA-4の種々のアイソタイプの相対的効力を決定するため、マウス抗マウスCTLA-4抗体、9D9の4つのアイソタイプ変異体を作製し、CHO形質移入体または親ハイブリドーマから精製した。これら抗CTLA-4変異体には、非FcγR結合突然変異体であるD265A突然変異(IgG1-D265A) を含むIgG1アイソタイプ(Clynes et al.、2000)、IgG1、IgG2b(ハイブリドーマ由来の9D9の元のアイソタイプ)、およびIgG2aが含まれた。9D9 ハイブリドーマ(J. Allison、University of Texas、MD Anderson、Houston、Texasから好意により提供された)は、ヒトCTLA-4トランスジェニックマウスをマウスCTLA-4で免疫して誘導したマウス抗マウスCTLA-4抗体である(Peggs et al.、2009)。9D9は、ネズミCTLA-4-IgのB7-1陽性細胞への結合を遮断する(データ示さず)。

9D9アイソタイプを作製するため、全RNAを9D9ハイブリドーマ細胞からRNeasy Miniキット(Qiagen、Valencia、CA、USA)を用いて調製した。cDNAを、SMARTer RACE cDNA増幅およびアドバンテージ2PCRキット(Clontech Laboratories、Inc.、Mountain View、CA、USA)を用い、5’-RACEプロトコールにより調製した。可変領域は、5’RACEユニバーサルプライマー混合物と組み合わせた3’ネズミ特異的定常領域プライマーを用いて増幅した。V領域を含むPCR生成物をpCR4-TOPOベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA) にクローニングし、次いでE. coli株TOP10(Invitrogen)に形質転換した。Templiphi(GE Healthcare Biosciences、Piscataway、NJ、USA)試料を調製し、DNAシーケンシングにかけた(Sequetech、Mountain View、CA、USA)。

組換え抗体(マウスIgG2a、マウスIgG1、およびマウスIgG1-D265Aアイソタイプ)を発現させるため、9D9可変領域をPCRで増幅してクローニング部位に導入し、オステオネクチンシグナル配列と望む定常領域を含むUCOE発現ベクター(EMD Millipore、Billerica、MA、USA)にクローニングした。重および軽鎖ベクターを線状化し、次いでCHO-S細胞(Invitrogen)に共遺伝子導入した。安定なプールおよび/またはクローンを選択した。マウスIgG2aについてはBALB/cアロタイプのIgG2a^a(ハプロタイプIgh-1^a)配列を用いた。

9D9ハイブリドーマまたはCHO細胞形質導入体の培養上清を抗体を製造するために回収した。抗体を標準的方法によりプロテインAまたはプロテインGを用いて精製し、PBSで透析した。すべての抗体はエンドトキシン不含(＜0.05EU/mg)であり、サイズ排除クロマトグラフィ/HPLC測定では凝集物が＜5％であった。各CTLA-4アイソタイプのCTLA-4(58α-β-CTLA-4/CD3ζ)を構成的に発現する細胞との結合をフローサイトメトリーで評価した。58α-β-CTLA-4/CD3ζは、CD3ζと融合したネズミCTLA-4を発現するネズミT細胞ハイブリドーマであり、ヒトCTLA-4の同様の構築物と類似している(Keler et al.、2003)。FACS緩衝液(1x DPBS [CellGro]、0.02％アジ化ナトリウム、2％FBS [Hyclone]、および1mM EDTA)中の細胞(1 x 10⁵/ウェル)を20μg/mlで出発する抗体の連続希釈で染色し、4℃で30分間インキュベーションした。細胞を洗浄し、第2抗体(R-PEロバ抗マウスIgG[Jackson ImmunoLabs])を加え、4℃で30分間インキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、FACS緩衝液に再浮遊し、BD FACS Cantoフローサイトメトリーで分析した。

図1に示すように、各抗CTLA-4アイソタイプ変異体はマウスCTLA-4を構成的に発現する細胞と同等に結合する。抗体標識mIgG1、mIgG2aおよびmIgG2bは市販のマウスアイソタイプコントロール抗体である。

上記一般的手順は、マウスGITR、OX40およびICOSレセプターと結合するアゴニスト抗体、およびマウスPD-1と結合するアンタゴニスト抗体の種々のアイソタイプ変異体を構築するのにも用いた。

薬物動態分析
抗CTLA-4抗体の薬物動態を特徴付けるため、9匹の雌C57BL/6マウスに10mg/kgの各抗CTLA-4アイソタイプ(IgG1、IgG1-D265A、IgG2a、またはIgG2b)を腹腔内注射した。血液試料を、1、6、24、48、72、120、168、336、および504hに採取し、血清をELISAで分析した。化学発光ELISAを用いて抗CTLA-4モノクローナル抗体の血清レベルを測定した。組換えマウスCTLA-4-Igをヤギ抗マウスIgG(軽鎖特異的)ポリクローナル抗体のHRPコンジュゲートと組み合わせて捕捉物として用いた。標準品、コントロール、および試料を1％BSA/PBS/0.05％Tween 20で100倍に希釈した。マウス血清試料中の抗CTLA-4抗体濃度を、対応する抗CTLA-4抗体較正装置から作成した5-パラメーターロジスティック(5-PL)較正曲線を用いてM5プレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)で測定した発光強度から計算した。

表2および図2に示すように、4アイソタイプの全身的暴露はほとんど同様であったが、IgG1-D265A(185μM・h)およびIgG2b(170μM・h)の濃度下面積対時間曲線(AUC)はIgG1(119μM・h)およびIgG2a(125μM・h)よりわずかに高かった。該抗体の最終半減期も同様であった(156〜174h)が、第2週〜第3週にIgG2aにのみ最終減衰の促進がみられ、これはBalb/c IgG2a^a定常領域とここで試験したC57BL/6マウスのそれとのアロタイプの違いの結果として抗薬剤抗体が形成されたことによると思われる(Schreier et al.、1981)。したがって、抗CTLA-4アイソタイプの抗腫瘍効果の差は薬剤暴露の違いで説明できない。

IgG2aでは最終減衰の促進が336h〜504hでみられ、これはおそらく抗薬剤抗体の形成による(下記参照)。IgG2aアロタイプはBALB/cマウス由来であることに留意のこと。504hのタイムポイントはT_1/2の評価から除外した。

結合親和性
各抗CTLA-4アイソタイプを、表面プラズモン共鳴による可溶型のFcγRI、FcγRIIB、FcγRIIIおよびFcγRIV、およびFcRnに対する結合で特徴づけた。種々の抗CTLA-4アイソタイプのFcγRsに対する親和性を先に記載のごとく測定した(NimmerjahnおよびRavetch、2005)。FcγRsはFcγRIを除いてR&D Systemsから入手した。FcγRIの発現については、細胞外ドメインをPCRで増幅し、UCOE発現ベクター(EMD Millipore、USA)中にオステオネクチンシグナル配列およびC末端6xHis-タグおよび終止コドンとインフレームにクローニングした。CHO-S細胞(Invitrogen)をAmaxa Nucleofector II(Lonza Group、AG)を用いて形質移入し、安定なプールおよびクローンを選択して増殖させ、次いで上清を精製用に回収した。可溶性組換えタンパク質を、固定化金属ニッケルアフィニティクロマトグラフィ(IMAC Life Technologies Corporation)ニッケル荷電樹脂カラムを用いる標準的技術を用いて精製した。

FcγR相互作用を、CM5チップに該抗体を約1500RUの密度で直接コーティングし、平衡が達成されるまで該固定抗体上に下記8濃度のmFcRsを流して測定した。平衡反応単位(RU)をGraphPad Prismを用いるFcR濃度に応じてプロットし、平衡K_Dを得た。あるいはまた、6xHis標識FcRsを抗His抗体コートしたCM5表面上に捕捉し（約200RUsに）、FcγR捕捉表面上に8濃度の該抗体を流した。このアプローチで得られた平衡K_Dは、抗体を該表面に直接コーティングすると存在する多価結合がないため約4倍低かった。FcRn相互作用を、CM5チップに500RUsのmo FcRnをコーティングし、50mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸、150mM NaCl操作緩衝液中、pH6.0でFcRnコーティング表面上に8濃度の抗体を流して特徴付けた。抗体結合表面をpH8.0トリス緩衝液を用いて再生した。結合親和性を表3に示す。

ネズミCT26結腸腺癌腫瘍モデルにおける変異体抗CTLA-4アイソタイプの抗腫瘍活性
多くの異なる抗体を用いて、抗CTLA-4抗体（ハムスター抗CTLA-4抗体、9H10(KrummelおよびAllison、1995)および4F10(Walunas et al.、1994)、およびマウス抗マウスCTLA-4抗体、9D9(Peggs et al.、2009)を含む）の活性を証明した。抗腫瘍活性における抗CTLA-4の種々のアイソタイプの相対的有効性を決定するため、作製した抗CTLA-4抗体9D9の4つのアイソタイプ変異体のうちの3つ(実施例1に記載のごとくCTLA-4+細胞と等しく良好に結合する抗CTLA-4-γ1D265A、抗CTLA-4-γ2b、および抗CTLA-4-γ2a)の同系CT26結腸腺癌モデルにおける抗腫瘍活性をマウスIgG1アイソタイプコントロールと共に試験した。試験に用いたコントロール抗体は、マウスIgG1アイソタイプの組換えヒト抗ジフテリア毒素抗体である。10匹のBALB/cマウスに1 x 10⁶個のCT26腫瘍細胞を第0日に皮下注射した。移植後第7日に処置を開始した。腫瘍を測定し、同等な平均腫瘍体積(45〜50mm³/2)となるよう処置群に無作為化し、次いで、示した抗体(200μg/用量)を再度第10、14、および17日に腹腔内（IP）投与した。腫瘍体積を週に2回測定した。図3に示すように、抗CTLA-4 9D9-IgG2aは処置したマウス10匹中9匹に腫瘍拒絶を生じたが、9D9-IgG2bは中等度の腫瘍増殖阻害を示し、50日後まで処置マウス10匹のうち腫瘍がなくなったものは0匹であった。驚くべきことに、抗CTLA-4 IgG1D265Aアイソタイプはほとんど活性を示さず、コントロールIgGと同等であった(図3)。

CT26腫瘍内T細胞サブセットおよび末梢T細胞ポピュレーションに対する抗CTLA-4アイソタイプの効果
リンパ球染色分析
種々の抗CTLA-4アイソタイプのT細胞ポピュレーションに対する効果を測定するため、種々の抗体で処置したマウスから単離したT細胞のCD8、CD4、CD45、およびFoxp3マーカーの存在について染色した。腫瘍移植後第15日にすべてのマウスを屠殺し、腫瘍と流入領域リンパ節を分析用に回収した。単細胞浮遊液を腫瘍とリンパ節を24ウェルプレート中でシリンジの後ろで解離させて調製した。細胞浮遊液を70μmフィルターに通し、ペレットにし、再浮遊させ、次いで算定した。次に、細胞を染色用に1 x 10⁶細胞/ウェルで96ウェルプレートに播いた。細胞を24G.2(BioXcell)で処理して、FcγRIIBおよびFcγRIIIに対するFcの結合を遮断し、次いでCD8に対する抗体(クローン53-6.7；Biolegend)、CD4に対する抗体(クローンGK1.5；Biolegend)、およびCD45に対する抗体(クローン30-F11；Biolegend)、またはCD11cに対する抗体(クローンN418；eBioscience)、CD45、CD8、CD11bに対する抗体(クローンM1/70 Biolegend)、およびGr-1に対する抗体(クローンRb6-8C5；eBioscience)で染色した。細胞内染色用に試料を固定し、透過化し、次いでFoxp3に対する抗体(クローンFJK-16s；eBioscience)、Ki67に対する抗体(クローンSolA15；eBioscience)、およびCTLA-4に対する抗体(クローン4F10；BD Pharmingen)で染色した。次に、試料をFACS Cantoフローサイトメーター(BD)で分析した。この一般的フローサイトメトリー法を用いて下記実施例に記載のごとく種々のT細胞のポピュレーションに対する種々のFc融合タンパク質の効果を測定した。

CD45は、赤血球および形質細胞を除くすべての分化した造血細胞に種々の形で高レベルに発現するI型貫膜タンパク質である。T細胞レセプター(TCR)のコレセプターであるCD8は、主に細胞傷害性T細胞の表面に発現し、NK細胞、皮質胸腺細胞、および樹状細胞にもみられることがあるが、CD4は、主としてTヘルパー細胞、ならびに他の免疫細胞、例えば単核球、マクロファージ、および樹状細胞の表面にみられる糖タンパク質である。フォークヘッドまたは翼状らせんファミリーの転写因子の転写抑制因子であるFoxp3は、非特異的マーカー、例えばCD25またはCD45RB(B決定基をコードするエクソン5スプライシングを有するCD45のアイソフォーム)により先に同定されたT_regsの特異マーカーとして役立つ。Foxp3は、すべてのCD4⁺ T_regsに発現することが解っているが、このマーカーの染色には該細胞の固定と透過化が必要である。

抗CTLA-4アイソタイプのT細胞ポピュレーションに対する効果
CTLA-4は、活性化T_eff/T記憶細胞およびT_regサブセットの両方に発現し、機能的役割を有するので、種々の位置からの多様な細胞ポピュレーションをモニターした。以前のデータは、抗CTLA-4抗体遮断は、処置マウスのリンパ節(LN)におけるT_regsの増殖をもたらすことを示した(Quezada et al.、2006)。CTLA-4抗体アイソタイプの末梢T_reg増殖に対する効果を、CT26結腸腺癌腫瘍保有マウスを用い、該マウスの抗体処置後第16日の腫瘍および腫瘍流入領域リンパ節中のT細胞サブセットを分析することにより評価した。統計分析はGraphPad Prismを用いて行った。誤差バーはPrismを用いて計算した平均の標準誤差を示す。用いた具体的統計的検定は、対象のないt検定と一元配置分散分析であった。＜0.05、0.01、および0.001のP値は、各図中にそれぞれ*、**、および***で示す。

すべての抗体は、脾臓、または末梢の他の部位、例えばLNまたは血液中のT_regsの数を増加させた（典型的FACSプロット）。さらに、抗CTLA-4で処置した動物中のT_regsも増殖のマーカーであるKi-67の高い発現を示し、CTLA-4遮断が抗体アイソタイプに関わらず阻害シグナルを除去することを示唆した。各抗CTLA-4アイソタイプで処置した非腫瘍保有マウス由来のLNの分析で同様の結果が得られた（データ示さず）。

予期したように、マウスの抗CTLA-4抗体による処置は、腫瘍部位のCD8⁺CD45⁺細胞の割合の増加をもたらし、2aおよび2bアイソタイプにより誘導された増加は最も大きく、G1D265A群により誘導された増加はわずかであった（図4A）。腫瘍の総CD8⁺ T細胞数は、割合の変化と一致した（データ示さず）。

腫瘍内CD4⁺細胞の割合の分析は、2aアイソタイプの抗CTLA-4がCD4⁺ T細胞の減少をもたらすことを示した(図4B)。

腫瘍内T細胞のT_regsをFoxp3およびCD4を染色して分析すると、各処置群で顕著な差がみられた（図4C)。2aアイソタイプの抗CTLA-4による処置は、腫瘍におけるT_regs数の顕著な減少をもたらしたが、2bは変化を示さず、IgG1D265はT_reg数の増加をもたらした。

これらの各抗CTLA-4アイソタイプ介在性のTエフェクター細胞(T_eff)およびT_reg数の変化は、腫瘍内CD8⁺ T細胞/T_reg比およびCD4⁺T_eff/T_reg比の顕著な差をもたらした（図5AおよびB)。抗CTLA-IgG2aアイソタイプは最も高いT_eff/T_reg比を示した。高いCD8⁺ T細胞/T_regs比は強力な抗腫瘍活性を反映すると考えられる。

腫瘍内T細胞の分析とは対照的に、末梢におけるT細胞サブセットの評価では該アイソタイプ間の差はわずかであった。すべての抗体が腫瘍流入領域リンパ節のT_regs数を増加させた（図6）。これらのデータは、抗CTLA-4が抗CTLA-4処置マウスのLN中のT_regsの増殖をもたらす先の知見と一致し(Quezada et al.、2006)、一般的に、CTLA-4遮断の抗腫瘍効果が末梢T_regsの枯渇によるのではないという先の結論と一致する(Maker et al.、2005；Rosenberg、2006)。ICOSを発現するCD4⁺細胞の割合の増加は、すべてのCTLA-4アイソタイプで処置した動物でも観察され（データ示さず）、T_effsの活性化の増加が抗体アイソタイプに依存しないことを示唆する。まとめてこれらのデータは、T_regの損失が腫瘍部位に限られることを示す。

MC38ネズミ結腸腺癌腫瘍モデルにおける変異体抗CTLA-4アイソタイプの抗腫瘍活性
実施例3に記載のCT26腫瘍モデルに加え、種々の抗CTLA-4アイソタイプの抗腫瘍活性をMC38結腸腺癌腫瘍モデルで評価した。C57BL/6マウスにそれぞれ2 x 10⁶個のMC38腫瘍細胞を皮下注射した。7日後に腫瘍体積を測定し、マウスを平均腫瘍体積(44.7〜49.2mm³/2)が同等になるように処置群に無作為化した。PBS中で処方した4つの異なるアイソタイプ(IgG1、IgG1D265A、IgG2a、およびIgG2b)の抗CTLA-4抗体を、第7、10、および14日に容量200μl中200μg/用量でIP投与した。腫瘍体積を1週間に3回記録した。

図7BおよびCは、IgG1およびIgG1D265A 抗CTLA-4処置腫瘍がマウスIgG1コントロール処置腫瘍の増殖速度と同等の速度で急速に増殖したことを示す（図7A)。反対に、マウスをIgG2a 抗CTLA-4抗体で処置すると(図7D)、完全な阻害を達成するレベルに腫瘍増殖速度が劇的に低下した。IgG2b抗CTLA-4抗体も腫瘍増殖を顕著に阻害したが(図7E)、IgG2aアイソタイプより程度は低かった。

種々の抗CTLA-4アイソタイプで処置したマウス群の平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値の変化を図8AおよびBにプロットする。該プロットは、図7に示す個々のマウスのデータを確認し、抗CTLA-4抗体のIgG2aアイソタイプがMC38腫瘍増殖に対する阻害作用が最も強く、次いでIgG2bアイソタイプの順であったことを明確に示す。IgG1およびIgG1D265Aアイソタイプは、マウスIgG1コントロールと同様にほとんどまたは全く腫瘍増殖阻害を示さない。腫瘍移植後の種々の時点における4つの抗CTLA-4アイソタイプによる平均腫瘍増殖阻害パーセンテージを表4に示す。

まとめると、図7および8および表4のデータは、IgG1および突然変異マウスIgG1抗CTLA-4アイソタイプがこのステージの(治療的)MC38腫瘍モデルにおいてマウスIgGアイソタイプコントロールと比べて抗腫瘍活性を示さないことを示す。反対に、顕著な抗腫瘍活性がIgG2aおよびIgG2bアイソタイプで明らかであり、前者では腫瘍増殖のほぼ完全な阻害が達成され、後者よりはるかに強力であった。

抗CTLA-4アイソタイプのMC38腫瘍内T細胞サブセットに対する効果
種々の抗CTLA-4アイソタイプで処置したマウスから得たMC38腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のT細胞サブセットを分析した。IgG2aおよび突然変異IgG1D265Aアイソタイプは、マウスIgG1アイソタイプコントロールと比べてCD4⁺細胞の割合のわずかな増加をもたらした(図9A)。しかしながら、CD8⁺細胞のレベルを分析すると、IgG2a 抗CTLA-4抗体による処置は、マウスIgG1アイソタイプおよび突然変異IgG1 抗CTLA-4の両方と比べてCD8⁺細胞のパーセンテージの顕著（約2.5倍）増加をもたらした(図9B)。IgG2a 抗CTLA-4抗体は、IgG1アイソタイプおよび突然変異IgG1 抗CTLA-4と比べてT_regsレベルの約5倍の低下ももたらした(図9C)。

IgG2a 抗CTLA-4アイソタイプが介在するCD8⁺ T_effsの増加とT_regsの低下の複合効果をT_eff/T_reg比に変換すると(図10A)、IgG1アイソタイプまたはIgG1D265A 抗CTLA-4抗体による処置で得られたT_eff/T_reg比よりはるかに（8倍以上）高かった(図10A)。CT26結腸腺癌モデル同様に、この高いT_eff/T_reg比は強い抗腫瘍活性を反映する。IgG2a抗体による処置で得られたCD4⁺ T_eff/T_reg比も該アイソタイプまたはIgG1D265A抗体で得られたT_eff/T_reg比より約5倍高かった(図10B)。

免疫原性Sa1Nネズミ繊維肉腫腫瘍モデルにおける変異体抗CTLA-4アイソタイプの抗腫瘍活性
抗CTLA-4の抗腫瘍活性を免疫原性Sa1N繊維肉腫腫瘍モデルでも評価した。A/Jマウスに2x 10⁶個のSa1N腫瘍細胞を皮下注射した。7日間後、腫瘍体積を測定し、平均腫瘍体積が同等になるように(132.4〜146.5mm³/2)マウスを処置群に無作為化した。IgG1、突然変異IgG1D265A、およびIgG2aアイソタイプを有する抗CTLA-4(9D9)抗体をPBSで処方し、容量200μl中200μg/用量を第7、11、および14日にIP投与した。腫瘍体積を1週間に2回記録した。

図11に示すように、IgG2a 抗CTLA-4抗体でマウスを処置すると腫瘍増殖が顕著に阻害されたが(図11B)、IgG1D265A処置腫瘍(図11C)はIgG1アイソタイプコントロール処置腫瘍の増殖が阻害されなかったのと同様に急速に増殖し続けた(図11A)。図12AおよびBに示す種々の抗CTLA-4アイソタイプおよびコントロールで処置した群のマウスの平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値の変化は、IgG1D265AアイソタイプおよびマウスIgG1コントロールによって生じる腫瘍増殖の阻害の相対的欠如と比べて、IgG2a抗体の腫瘍増殖に対する明確な阻害効果を確認する。腫瘍移植後の種々の時点におけるIgG2aおよび突然変異IgG1D265Aアイソタイプによる腫瘍増殖阻害パーセンテージの比較を表5に示す。

まとめると、図11および12および表5のデータは、抗CTLA-4抗体のIgG2aアイソタイプはIgG1アイソタイプコントロールと同様に抗腫瘍活性を欠く突然変異IgG1抗CTLA-4抗体と対照的に、このステージの（治療的）Sa1N腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を有することを示す。

抗CTLA-4アイソタイプのSa1N腫瘍内T細胞サブセットに対する効果
IgG1アイソタイプコントロールと共にIgG2aおよび突然変異IgG1抗CTLA-4アイソタイプで処置したマウスから得たSa1N腫瘍TILsのT細胞サブセットを分析した。試験した抗体はいずれも、CD4⁺細胞の割合にいかなる有意な変化ももたらさなかった(図13A)。反対に、2aアイソタイプを有する抗CTLA-4による処置は、CD8⁺細胞(図13B)の割合の顕著な増加と、同時にT_regsレベルの顕著な低下をもたらした(図13C)。IgG2a 抗CTLA-4アイソタイプにより介在されるCD8⁺T_effsの増加とT_regsの低下をT_eff/T_reg比に変換すると(図14A)、IgG1アイソタイプまたはIgG1D265A 抗CTLA-4抗体による処置で得られたT_eff/T_reg比より顕著に高かった（少なくとも約6倍高かった）(図14A)。CT26およびMC38腫瘍モデルと一致して、この高いT_eff/T_reg比は強い抗腫瘍活性を示す。IgG2a抗体による処置で得られたCD4⁺ T_eff/T_reg比も、アイソタイプコントロールまたはIgG1D265A 抗CTLA-4抗体で得られたT_eff/T_reg比より高かった(図14B)。しかしながら、IgG2a抗体は、IgG1コントロールまたはIgG1D265Aと比べてCD4⁺細胞の増加をもたらさなかったので、T_eff/T_reg比の増加は、CD8⁺ T_eff/T_reg比のように断言されなかった。

CTLA-4に対する抗体(ハムスター；Leach et al.、1996)および9D9に対する抗体(アイソタイプ2b(本発明者らの未公開データ))は、単独療法で、大きな腫瘍を保有する場合でもSa1N繊維肉腫に有効であることが先に示されたので、T_effsの活性化が、免疫原性の高い腫瘍における抗CTLA-4抗体療法の抗腫瘍効果をもたらしているだけかもしれないと予期された。しかしながら、上記データは、Sa1Nモデルにおける抗CTLA-4の活性は、少なくとも一部があるアイソタイプ、特にIgG2aアイソタイプの腫瘍部位のT_regs数を減少させる能力により仲介されることを示す。CD8⁺ T_effsの同時の増加は、T_eff/T_reg比の顕著な増加をもたらす。それにも関わらず、予備データ（示さず）も、負担の低い免疫原性腫瘍、例えば同系Sa1N腫瘍を保有するマウスにおける抗CTLA-4抗体による抗腫瘍反応の活性化は、アイソタイプに関わらず、CTLA-4の遮断によってのみ仲介されるかもしれないことを示唆する。この状況において、T_reg数のいかなる同時の低下もなしに腫瘍を排除するのにT_effsの活性化のみで充分であるかもしれない。

抗CTLA-4処置の骨髄由来サプレッサー細胞に対する効果
T細胞に加えて、表面マーカーCD11bおよびGr-1の発現により定義される骨髄由来サプレッサー細胞(MDSC)を、抗CTLA-4抗体処置MC38腫瘍保有マウスの腫瘍および脾臓において分析した。MC38結腸腫瘍細胞(2x 10⁶)をC57BL/6マウスの皮下に移植した。移植後第７日に、腫瘍保有マウスを無作為化し、3日毎に3用量の抗体を腹腔内注射(10 mg/kg)した。移植後第15日に、腫瘍を回収し、手作業で解離して単細胞浮遊液とし、腫瘍内サイトカインレベルをビーズベースのサイトカインアレイで評価した(FlowCytomix；Ebioscience、San Diego、CA)。図15は、CD45⁺細胞中のMDSCs(CD11b⁺Gr-1⁺)数(図15A)およびインターロイキン1α(IL-1α)レベル(図15B)の評価を示す。データは、(A)＞3マウス/群の2つの独立した実験、または(B)＞5マウス/群/実験の3つの独立した実験の典型である。抗CTLA-4アイソタイプのいずれについても脾臓MDSCの変化はみられなかった（データ示さず）。しかしながら、これに対してMDSC数は、IgG2aアイソタイプ処置マウスの腫瘍で実質的に増加した(図15A)。

抗CTLA-4処置に応じた腫瘍内サイトカイン発現
腫瘍浸潤T_regsの減少と付随するエフェクターCD8数の増加がT細胞機能の変化と関連があるか否かを検討するため、MC38腫瘍保有マウスにおける各処置群の腫瘍微小環境内に存在するサイトカインレベルを測定した。腫瘍を24ウェルプレート中の1mlの完全T細胞培地(10％加熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびβ-メルカプトエタノール添加RPMI-1640(Life Technologies、Grand Island、NY))中の回収し、手動で解離させて単細胞浮遊液とした。細胞およびデブリを遠心沈殿させて上清を回収し、試料をバッチ処理するために凍結した。解凍し、各試料の上清25μlについて腫瘍内IL-1α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-21、IL-22、IL-27、IP-10、GM-CSF、TNF-α、およびIFN-γ濃度をビーズベースのサイトカインアレイを使用説明書に従って用い(FlowCytomix；eBioscience、San Diego、CA)、デュプリケートで評価した。

抗CTLA-4-IgG2a処置は、T-ヘルパー(TH)1およびTH2 サイトカイン両方の腫瘍内レベルの最も顕著な増加をもたらし、IFN-γ、TNF-α、IL-13、およびIL-10は他のアイソタイプ変異体のそれぞれに比べて顕著に増加した(図16)。興味深いことに、IL-1αのレベルも、他のすべてのアイソタイプに比べてCTLA-4-IgG2a処置したマウスの腫瘍において特異的かつ顕著に高かった(図15B)。このIL-1αの増加は同様の抗腫瘍効果とT_effsの増殖をもたらす（データ示さず）抗PD-1および抗CTLA-4-IgG2b抗体の組み合わせで処置したMC38腫瘍保有マウスではみられなかったので、この上方調節は、IgG2a変異体による処置に特有であり、腫瘍の破壊と退縮にはまったく関連がなかった。

種々の抗mGITR抗体アイソタイプの作製
GITR(グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子(TNF)レセプター)、他のTNFレセプターファミリーメンバー（例えば、OX40、CD27、および4-1BB）との相同性を有するI型貫膜タンパク質(NocentiniおよびRiccardi、2005)。ヒトではGITRは、通常、静止CD4⁺Foxp3^-およびCD8⁺ T細胞に低レベルで発現するが、CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ T_regsに高レベルで構成的に発現する。発現は、3サブポピュレーションすべてでT細胞活性化後に増加する(Cohen et al.、2010)。本発明者らのデータは、マウスではGITRがすべてのT細胞サブセットで高レベルに構成的に発現することを示す(実施例18参照)。

DTA-1は、アゴニスト性ラット抗マウスGITR抗体である(Shimizu et al.、2002；eBioscience、San Diego、CA)。このIgG2b抗体は、B16メラノーマの処置中T_regsとT_effsの両方を調節することを示した。さらに、T_effsとT_regsの両方によるGITR発現は、DTA-1の完全な効果に必要であった。Cohen et al.(2010)は、DTA-1によるGITRの連結はT_regの抑制活性を全体的に無効にしないが、T_reg腫瘍浸潤を減少させ、腫瘍内T_regs内のFoxp3の発現低下をもたらし、抑制の局所的無効化を示唆することを示した。最終結果は、腫瘍内T_eff：T_reg比の増加と、腫瘍内のより大きいT_eff活性化および機能である。

DTA-1は、GITRとGITRリガンド(GITRL)の相互作用を遮断し、該可溶性抗体は、in vitroの細胞反応を促進するのに有効である。DTA-1は、種々の腫瘍モデルで腫瘍増殖を阻害するのにも有効である(例えば、Turk et al.、2004；Cohen et al.、2010参照)。実施例1に9D9について記載のごとく、DTA-1の4つのアイソタイプ変異体、すなわち、mIgG1、mIgG1-D265A、mIgG2a、およびrIgG2b(マウスIgG2aと等価なオリジナルラットアイソタイプ)を作製した。

MC38腫瘍モデルにおける変異体抗GITRアイソタイプの抗腫瘍活性
実験MC38＃1
種々の抗GITR(DTA-1)アイソタイプの抗腫瘍活性を、実施例4に記載のごとく段階的MC38結腸腺癌腫瘍モデルで評価した。C57BL/6マウスにそれぞれ2x 10⁶ MC38腫瘍細胞を皮下注射した。7日後、該マウスを5処置群に無作為化し、容量200μl中200μg/用量の試験抗体を以下のごとく第7、10および14日にIP投与した：再操作：グループ１：マウスIgG1コントロール(IgG)；グループ2：抗CTLA-4マウスIgG2a Ab(9D9-m2a)；グループ3：抗GITRラットIgG2b Ab(DTA-r2b)；グループ4：抗GITRマウスIgG1 Ab(DTA-mg1)；およびグループ5：抗GITRマウスIgG2a Ab(DTA-m2a)。腫瘍および脾臓を第15日に回収した。（生物物理学的分析(SECによる)は、DTA-r2b抗体を除くすべての再設計DTA-1モノクローナル抗体の凝集性が高いことを示し、後で、下記実験MC38＃2のごとくこの実験を反復することを促した。）

図17Bは、IgG1 抗GITR処置腫瘍はマウスIgG1 コントロールで処置した腫瘍と同程度に増殖し(図17A)、10匹のマウスはいずれもマウスのモニター終了時まで腫瘍なし（TF）ではなかったことを示す。しかしながら、IgG2aおよびIgG2b 抗CTLA-4抗体でみられたパターンと同様に、DTA-r2b(図17C)およびDTA-m2a(図17D)は、腫瘍増殖速度を顕著に低下させ、マウス10匹中それぞれ3および2匹がTFであった。

種々の抗GITRアイソタイプで処置した群のマウスの平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値の変化を図18AおよびBにプロットする。これらのプロットは、抗GITR抗体のIgG2bアイソタイプはMC38腫瘍増殖に対する最も強い阻害効果を示し、IgG2aアイソタイプの強さがわずかに低い、図17に示す個々のマウスのデータを確認する。IgG1アイソタイプは、腫瘍増殖の阻害をほとんど示さず、平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値がマウスIgGコントロールで処置したマウスと同様であることを示す。

TILsおよび脾臓におけるMC38 T細胞サブセットに対する抗GITRアイソタイプの効果
種々の抗GITRアイソタイプで処置したマウスのMC38 TILsおよび脾臓中のT細胞サブセットのポピュレーションを比較した。脾臓ではDTA-m2aおよびDTA-r2bがCD8⁺細胞レベルのわずかな低下をもたらし、9D9-m2aおよびDTA-m1はCD8⁺ T細胞レベルを変化させなかった(図19A)。試験したアイソタイプ変異体はいずれも、脾臓中のCD4⁺またはCD4⁺Foxp3⁺細胞のパーセンテージに顕著な効果がなかった(図19BおよびC)。

TILでは9D9-m2aが、実施例5の結果と一致して、両マウスIgG1コントロールに比べてCD8⁺細胞のパーセンテージの少なくとも2倍の増加をもたらした(図19D)。DTA-m2aは効果がそれより弱く、CD8⁺細胞のパーセンテージを約50％増加したが、DTA-m1およびDTA-r2bは、マウスIgG1アイソタイプコントロールに比べてCD8⁺細胞のパーセンテージを全くまたはわずかしか増加しなかった(図19D)。9D9-m2aは、マウスIgG1アイソタイプコントロールに比べてCD4⁺細胞のパーセンテージのわずかな増加をもたらしたが、DTA-m1はCD4⁺の変化をもたらさなかった(図19E)。反対に、DTA-m2aおよびDTA-r2bは共に、両マウスIgG1アイソタイプに比べてCD4⁺パーセンテージを40〜50％低下させた(図19E)。

最も劇的な効果が、TILs中のCD4⁺Foxp3⁺ T_regsレベルでみられた。DTA-m1はT細胞のこのポピュレーションに効果がなかったが、9D9-m2aおよびDTA-m2aは、IgG1アイソタイプおよびDTA-m1に比べてCD4⁺Foxp3⁺ T_regsレベルの約6倍の低下をもたらした(図19F)。これらのデータは、IgG2a 抗CTLA-4アイソタイプについての実施例5に示す効果を確認し、抗GITRのIgG2a変異体が腫瘍環境においてT_regsのレベルを特異的に同様に低下させることを示す。したがって、IgG2a 抗CTLA-4アイソタイプと同様に、IgG2a 抗GITRアイソタイプも腫瘍部位におけるCD8⁺ T_effsの増加とT_regsの減少をもたらし、これは強い抗腫瘍活性を示すT_eff/T_reg比の上昇に置き換えられる。DTA-r2bは、ラットIgG2b Fc領域のネズミ活性化FcγRsに対する低い結合と一致して、9D9-m2aおよびDTA-m2aがもたらすのほどの顕著な低下ではないが、IgG1 コントロールに比べてCD4⁺Foxp3⁺ T_regsレベルの顕著な低下をもたらした。これらのデータは、アゴニスト抗GITR抗体は、アンタゴニスト抗CTLA-4抗体と同様に、枯渇活性に活性化FcγRsのエンゲージメントを必要とすると考えられる。

MC38 TILsおよび脾臓中のT細胞の種々のサブセットにおけるGITR発現レベルのフローサイトメトリー測定は、GITRが腫瘍部位のT_regsで最も高く発現し、その発現レベルは、末梢のT_regsまたは腫瘍部位のCD8⁺ T_effsより高く、同様に末梢のCD8⁺またはCD4⁺ T_effsより高い発現を示すことを示した(実施例18参照)。最も低い相対的GITR発現レベルが腫瘍部位のCD4⁺ T_effsにみられた。これらのデータは、Fc融合タンパク質の標的が、腫瘍部位のT_regsで、腫瘍部位のT_effsにおける標的の発現に比べて高く発現し、該Fc融合タンパク質が標的細胞の枯渇を仲介する活性化FcRと結合すると、T細胞枯渇活性がT細胞反応の刺激を促進することによりFc融合タンパク質の抗腫瘍効果を増強するメカニズムを示唆する。

実験MC38＃2
DTA-1変異体(市販のオリジナル型のDTA-r2bを除く)で凝集がみられたため、新たな一連のアイソタイプ変異体を再操作して、凝集しないDTA-1抗体を得た。観察された凝集は、操作されたアイソタイプ変異体の軽鎖に不注意に組み込まれた余分なアミノ酸によることが突き止められ、この無関係なアミノ酸を除去することによりこの問題は軽減された。該再操作された抗体を本実験＃2に用いた。再操作された抗GITR(DTA-1；GITR.7シリーズ)アイソタイプの抗腫瘍活性を段階的MC38モデルを用いて評価した。C57BL/6マウスに2x 10⁶個のMC38細胞を皮下移植した。7日後に、平均腫瘍体積が同等（約148mm³/2)となるようにマウスを7処置群に無作為化し、試験抗体の200μg/用量を以下のごとく第7、10、および14日にIP投与した（用量200μgを投与したmIgG コントロールを除く)：グループ1：マウスIgG1 コントロール(mIgG、または「アイソタイプ」)；グループ2：抗GITRマウスIgG1Ab(mGITR.7.mg1)；グループ3：抗GITRマウスIgG1D265Aアイソタイプ(mGITR.7.mg1-D265A)；グループ4：抗GITRマウスIgG2a Ab(mGITR.7.mg2a)；グループ5：抗GITRマウスIgG2b Ab(mGITR.7.mg2b)；グループ6：抗GITRラットIgG2b Ab(mGITR.7.r2b、またはDTA-1-rG2b)；およびグループ7：抗CTLA-4マウスIgG2a Ab(9D9-mg2a)。腫瘍および脾臓を第15日に採取した。

図20BおよびCは、IgG1およびIgG1-D265A 抗GITR処置腫瘍がマウスIgG1 コントロールで処置した腫瘍と同程度に増殖したことを示す(図20A)。各例で、移植後35日間のマウスのモニター終了までにマウス9匹中にTFは見られなかった。しかしながら、実験MC38＃1の結果と同様に、mGITR.7.mg2a(図20D)が最大の腫瘍増殖阻害をもたらし、マウス9匹中2匹がTFであった。マウスおよびラット抗GITR-2b抗体も、同程度に腫瘍増殖速度を顕著に減少させたが(図20EおよびF)、ラット2b抗体はTFマウスを1匹生じ、マウス2b抗体は移植後35日間にTFマウスを生じなかった。

平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値の変化を図21AおよびBに示す。傾向は、抗CTLA-4抗体で得られたデータと同様にIgG2a 抗GITRアイソタイプがMC38腫瘍増殖の最も強力な阻害剤であったことを除き、MC38実験1でみられたものと同様であり、IgG2bアイソタイプは顕著であるが、より効力の低い腫瘍増殖阻害を示した。IgG1およびIgG1-D265Aアイソタイプは、マウスIgGコントロールに比べて低レベルの腫瘍増殖阻害を示した。

MC38腫瘍モデルにおけるT_regポピュレーションに対する抗GITRアイソタイプの効果
処置したマウスのTILsおよび脾臓におけるT_regsのポピュレーションに対する種々の抗GITRアイソタイプの効果を図22に示す。実験＃1に示すように、試験したアイソタイプ変異体のいずれも脾臓中のCD4⁺Foxp3⁺ T_regsのパーセンテージに対する大きな効果を示さず、最も強い効果は、ラット抗GITR IgG2bアイソタイプによる処置で生じた40％増加より少なく、マウス抗GITR IgG2bアイソタイプはCD4⁺Foxp3⁺ T_regsのパーセンテージをわずかに低下させた。試験したその他の抗GITRアイソタイプおよび抗CTLA-4はT_regsのパーセンテージをわずかに増加させた(図22A)。

反対に、TILsでは、アイソタイプコントロールと比べて変化がなかったIgG1アイソタイプを除き、試験した抗体すべてがT_regsのパーセンテージの顕著な減少をもたらした。抗CTLA-4抗体 9D9-mG2aは、IgG1アイソタイプと比べてCD4⁺Foxp3⁺ T_regsレベルの約4倍の減少を生じ、抗GITRマウス2aおよび2bアイソタイプおよびラット2bアイソタイプはすべてT_regsレベルを約2倍減少させ、IgG1-D265A突然変異体はわずかに低い減少をもたらした(図22B)。これらのデータは、抗GITR mG2a、mG2bおよびrG2bアイソタイプが腫瘍増殖阻害と関連する腫瘍環境における顕著なT_regs枯渇をもたらすことを示す実験＃1に示す効果を確認する。

実験MC38＃2で得られたデータは、該抗体の凝集が抗体の活性に過度に干渉しなかったことを示唆する実験＃1で得られたデータとほぼ一致する。おそらく、凝集した抗体は、マウス中で急速に流れるので、抗体の凝集は本in vivoアッセイでは大きな問題ではないかもしれない。

段階的Sa1N腫瘍モデルにおける変異体抗GITRアイソタイプの抗腫瘍活性
また、抗GITRの抗腫瘍活性をA/JマウスのSa1N肉腫モデルで評価した。該マウスに2x 10⁶ Sa1N細胞/移植を皮下注射した。7日後、腫瘍体積を測定し、マウスを平均腫瘍体積(約75mm³/2)が同等になるように処置群に無作為化した。実施例11、実験MC38＃1に記載のごとく種々のアイソタイプを持つように操作した抗GITR(DTA-1)抗体を第7、10、および12日に200μg/用量でIP投与した。

腫瘍増殖に対する効果を図23に示す。IgG2a抗GITR抗体による処置は腫瘍増殖を完全に阻害し、マウス10匹すべてが移植後約20日までにTFであり(図23B)、ラットIgG2bアイソタイプは約第20日までにマウス10匹中9匹がTFであり同様の効果を示した(図23C)。IgG1(図23D)およびIgG1D265A(図23E)アイソタイプは、IgG1アイソタイプコントロール処置腫瘍の増殖阻害なしに比べてある程度腫瘍を抑制したが(図23A)、これはmIgG2aおよびrIgG2bアイソタイプでみられた阻害よりはるかに少なかった。図24AおよびBでみられた平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値の変化は、mIgG1およびmIgG1-D265Aアイソタイプでみられたはるかに低い腫瘍増殖阻害に比べてmIgG2aおよびrIgG2b抗体の腫瘍増殖に対する実質的に完全な阻害を確認する。まとめると、図23および24のデータは、はるかに低い抗腫瘍活性を示すmIgG1(およびmIgG1-D265A)アイソタイプと対照的に、抗GITR mIgG2aおよびrIgG2bアイソタイプが強い抗腫瘍活性を示すMC38腫瘍モデル(実施例11)で得られたデータを確認する。

Sa1N腫瘍モデルにおけるT_reg ポピュレーションに対する抗GITRアイソタイプの効果
処置マウスのSa1NTILsおよび脾臓のT_regポピュレーションに対する種々の抗GITRアイソタイプの効果を図25に示す。試験したすべての抗GITRアイソタイプ変異体は、脾臓におけるCD4⁺Foxp3⁺ T_regsレベルの約20〜40％の比較的小さな増加をもたらした。最も高い増加は、マウス抗GITR IgG2aアイソタイプによる処置で得られ、これは抗CTLA-4 IgG2bおよびIgG1-D265A抗体による処置と同じ増加をもたらした(図25A)。T_reg枯渇がIgG2bアイソタイプで先にみられたので、このGITR試験では後者の抗CTLA-4アイソタイプを陽性コントロールとして用いた。

末梢におけるT_regsの効果と対照的に、抗GITR m2aおよびr2bアイソタイプおよび抗CTLA-4 2bアイソタイプはすべて腫瘍部位のT_regsレベルは少なくとも3.5倍低かった(図25B)。抗GITR IgG1アイソタイプおよびIgG1-D265A突然変異体は共に、T_regsのパーセンテージの約35％のより小さな減少をもたらしたが、抗CTLA-4 IgG1-D265A突然変異体は、TILsのT_regsのパーセンテージに変化を生じなかった(図25B)。したがって、MC38腫瘍モデルでみられたように、抗GITR mG2aおよびrG2bアイソタイプは、IgG1およびIgG1-D265A抗体より顕著な腫瘍環境における腫瘍増殖阻害に対応する著しいT_reg枯渇をもたらす。

MC38腫瘍モデルにおける変異体抗CTLA-4アイソタイプの抗腫瘍活性に対するアフコシル化の効果
非フコシル化(NF)抗CTLA-4(9D9)アイソタイプの抗腫瘍活性をMC38腫瘍モデルで評価した。これらの非フコシル化変異体を、フコシルトランスフェラーゼ欠損CHO細胞株を用いて形質移入のために作製した。C57BL/6マウスに2x 10⁶ MC38腫瘍細胞/移植を皮下注射し、11日後にマウスを平均腫瘍体積約230mm³/2を有する処置群に無作為化した。抗CTLA-4抗体の4つの種々のアイソタイプ(IgG1D265A、IgG2a、IgG2a-NF、IgG2bおよびIgG2b-NF)を、容量200μl中200μg/用量で第11、13、および15日にIP投与した。

先に示されたように(実施例4参照)、IgG1D265A突然変異体(図26B)は、マウスIgG1コントロールに比べて腫瘍増殖阻害に対する効果がわずかであったが(図26A)、IgG2bアイソタイプは、TFマウス12匹のうち10匹に生じる腫瘍増殖速度の強い低下を示したIgG2aより程度は低いものの(図26E)、腫瘍増殖を顕著に阻害した(図27C)。IgG2bアイソタイプのアフコシル化は、その腫瘍抑制活性を顕著に増強し(図26D)、IgG2aアイソタイプでみられた活性と同様にTFマウス12匹中10匹にみられた。これらのデータは、Fc領域の活性化FcRsに対する結合を増強することが知られているアフコシル化を用いて腫瘍部位のT_regsの枯渇を増加し、T_reg標的化Fc融合タンパク質の抗腫瘍効果を改善することができる。非フコシル化IgG2aアイソタイプは、正常IgG2aアイソタイプ(図26E)と同様の腫瘍増殖阻害を示した(図26F)。該IgG2aアイソタイプの腫瘍増殖阻害は強く、IgG2a-NF変異体で増強はみられない。

マウスの処置群における平均および腫瘍体積の変化を図27AおよびBに示す。これらは、図26に示す個々のマウスデータを確認し、IgG1D265AおよびIgG1アイソタイプと比べてIgG2b-NF、IgG2a、およびIgG2a-NFアイソタイプの効果が高いことを示す。

ネズミCT26腫瘍モデルにおける変異体抗OX40アイソタイプの抗腫瘍活性
アゴニスト性抗OX40抗体の種々のアイソタイプの相対的抗腫瘍効果を決定するため、抗OX40抗体OX86の以下の3つのアイソタイプ変異体(Al-Shamkhani et al.、1996)を操作した：抗OX40ラットIgG1(OX40-rg1)、抗OX40-マウスIgG1(OX40-mg1)、および抗OX40マウスIgG2a(OX40-mg2a)。これらのアイソタイプ変異体とマウスIgG1アイソタイプコントロール(マウスIgG1アイソタイプの組換えヒト抗ジフテリア毒素抗体)の同系CT26結腸癌マウスモデルにおける抗腫瘍活性を試験した。BALB/cマウスに1 x 10⁶ CT26腫瘍細胞を皮下注射した。マウスを、容量200μl中200μg/用量のPBSで処方した該抗体を第3、7、および10日にIP処置した。腫瘍耐性を1週間に2回測定した。

図28に示すように、抗OX40ラットIgG1アイソタイプはコントロールIgG(図28A)に比べて中等度の腫瘍増殖阻害(図28B)を示し、35日後までにOX40-rg1処置マウス10匹中3匹がTFであったが、OX40-mg1アイソタイプは顕著な腫瘍増殖阻害を示し、OX40-mg1処置マウス10匹中6匹がTFであった(図28C)。しかしながら、抗CTLAおよび抗GITR抗体でみられたように、OX40-m2aアイソタイプは最も強い抗腫瘍活性を示し、OX40-mg2a処置マウス10匹中8匹がTFであった(図28D)。これらのデータは、活性化マウスFcレセプターと優先的に結合する抗mOX40アイソタイプ(OX40-mg2a)は、CT26腫瘍モデルにおいてネズミ阻害Fcレセプター、FcRIIbと優先的に結合するアイソタイプ変異体(OX40-rG1およびOX40-mG1)より優れた抗腫瘍効果を示す。2 x 10⁶ MC38結腸癌細胞を皮下接種したC57BL/6マウスで同様のデータが得られた（データ示さず）。

該実験を、BALB/cに1 x 10⁶ CT26腫瘍細胞を移植することにより段階的(治療的)モデルを用いて反復した。7日後に腫瘍体積を測定し、マウスを平均腫瘍体積(45〜50mm³/2)が同等になるように処置群に無作為化した。抗体(OX40-mG1、OX40-mG1D265A、OX40-mG1およびaマウスIgG1アイソタイプコントロール)を第7、10、および14日に200μg/用量で腹腔内投与し、腫瘍体積を1週間に2回測定した。腫瘍は抗体投与前長時間増殖することができたため、図29に示す結果は、腫瘍阻害レベルが幾分低かった以外は図28に示したものと一致する。したがって、先にみられたように、OX40-mg1アイソタイプは、コントロールIgG(図29A)に比べて中等度の腫瘍増殖阻害(図29C)を示し、マウス8匹中2匹が42日午後までTFであり、OX40-m2aアイソタイプはより強い抗腫瘍活性を示し、マウス8匹中4匹がTFであった(図28D)。これらのデータは、活性化マウスFcレセプターと優先的に結合する抗OX40アイソタイプ変異体がネズミ阻害Fcレセプターと優先的に結合するアイソタイプより強く腫瘍増殖を阻害するという知見を再確認する。さらに該データは、Fcレセプターと結合することができない変異体として再フォーマットした抗mOX40抗体(OX40-g1D265A)はIgGアイソタイプコントロール(図29A)と比べて抗腫瘍活性(図29B)を示さなかったので、マウスOX40の抗体介在性アゴニズムがFcR介在架橋に依存することを示す。

Sa1N腫瘍モデルにおけるICOS標的化Fc融合タンパク質のアイソタイプ依存性抗腫瘍活性
抗マウスICOS抗体17G9は、ICOSとB7hの結合を遮断するラットIgG2bアゴニストモノクローナル抗体であり、T細胞増殖およびサイトカイン産生を含むT細胞反応を増強することが知られている(McAdam et al.、2000)。ICOSリガンド(ICOSL)は、ICOSと特異的に結合し、T細胞増殖およびサイトカイン分泌の共刺激シグナルとして作用する。ネズミIgG1 Fc(ICOSL-muIgG1)またはヒトIgG1 Fc(ICOSL-hIgG1)と融合したネズミICOSLの細胞外ドメインを含むICOSL-融合タンパク質を作製した。ICOSL-hIgG1および抗体17G9はマウス活性化FcRsと優先的に相互作用するが、ICOSL-mIgG1はマウス阻害FcRと相互作用する。

ICOSと特異的に結合するFc融合タンパク質の種々のアイソタイプの抗腫瘍効果をSa1N肉腫モデルで検討した。A/Jマウスに2 x 10⁶ Sa1N腫瘍細胞を皮下注射した。移植後第7日に、腫瘍保有マウスを無作為化し、10 mg/kgのFc融合タンパク質を3日毎に1度、3回IP注射(Q3D x 3)により投与した。結果を図30に示す。ICOSL-mIgG1は、コントロールマウスIgG1(図30A)と比べて顕著な抗腫瘍活性(図30B)を示さなかった。対照的に、ICOSL-hIgG1(先に抗腫瘍効果を有することが示された；Ara et al.、2003参照)および17G9はいずれも強い抗腫瘍活性を示し、それぞれ10匹中6匹がTFマウスであった(図30CおよびD)。したがって、このマウスSaN1腫瘍モデルにおける顕著な抗腫瘍活性は、マウス活性化FcRsと結合するFc融合タンパク質のFc部分の能力と関連がある。

MC38腫瘍モデルのT_reg ポピュレーションに対するアゴニスト抗ICOS抗体の効果
MC38結腸腫瘍細胞(2 x 10⁶細胞/移植)をC57BL/6マウスに皮下注射した。移植後第7日に、腫瘍保有マウスを無作為化し、10mg/kgのラットIgG2b抗体17G9またはマウスIgG1コントロール抗体をIP注射Q3D x 3により投与した。移植後第15日に、腫瘍を摘出し、分離して単細胞浮遊液とし、フローサイトメトリーのために染色した(実施例3参照)。図31AおよびBに示すように、17G9による処置は、CD4⁺細胞のパーセンテージまたはCD45⁺総リンパ球のパーセンテージで表したMC38腫瘍の腫瘍部位のFoxp3⁺制御性細胞の減少をもたらす。

MC38腫瘍モデル中の変異体抗PD-1アイソタイプの抗腫瘍活性
実験＃1
抗マウスPD-1抗体 4H2の種々のアイソタイプの抗腫瘍活性を先(実施例4)に記載のごとく段階的MC38結腸腫瘍モデルで評価した。4H2は、Fc部分をマウスIgG1アイソタイプのFc部分で置換したラットIgG2a 抗マウスPD-1抗体から構築したキメララット-マウス抗mPD-1抗体である(WO 2006/121168)。4H2は、mPD-L1およびmPD-L2のmPD-1との結合を遮断し、T細胞反応を刺激し、抗腫瘍活性を示す。C57BL/6マウスに2 x 10⁶ MC38腫瘍細胞をそれぞれ皮下注射した。7日後にマウスを4処置群に無作為化し、被験抗体を以下のごとく容量200μlで200μg/用量でIP投与した：グループ1：マウスIgG1 コントロール(IgG)；グループ2：抗PD-1 IgG1；グループ3：抗PD-1 IgG1D265A；グループ4：抗PD-1 IgG2a。

図32に示すように3つの抗PD-1アイソタイプが低レベルの抗腫瘍活性を示し、IgG1処置は11匹中2匹のTFマウスをもたらし(図32B)、IgG1D265A処置も11匹中2匹のTFマウスをもたらしたが、このアイソタイプは一般に抗腫瘍活性がやや大きいようであった(図32C)。IgG2aアイソタイプによる処置は、11匹中TFマウスをもたらさなかったが(図32D)、一般的にマウスIgG1コントロールよりわずかに大きな抗腫瘍活性を示した(図32A)。したがって、抗PD-1 IgG2aアイソタイプはある程度の抗腫瘍活性を示し、これは抗PD-1 IgG1またはIgG1D265Aアイソタイプが示すものより低かった。明らかに、抗CTLA-4、GITR、OX40、およびICOS IgG2a抗体で得られた結果とは対照的に、抗PD-1 IgG2aアイソタイプはG1およびG1D265Aアイソタイプに比べて抗腫瘍活性を増強しなかった。種々の抗PD-1アイソタイプで処置した群のマウスの平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値の変化を図33AおよびBに示す。これらのプロットは、図32に示す個々のマウスデータを裏付け、IgG1D265Aアイソタイプが最も強いMC38腫瘍増殖阻害効果を有することを示す。

TILs中のMC38 T細胞サブセットに対する抗PD-1アイソタイプの効果
種々の抗PD-1アイソタイプで処置したマウスのMC38腫瘍に浸潤するT細胞サブセットのパーセンテージを比較した。図34Aは、4H2-G1およびG1D265Aアイソタイプは両マウスIgG1コントロールと比べてCD8⁺細胞のパーセンテージをそれぞれ約20％および50％の小さな増加をもたらしたが、IgG2aアイソタイプはCD8⁺細胞のパーセンテージの約50％の低下をもたらすことを示す。これら3つの4H2アイソタイプは、実質的にマウスIgG1アイソタイプコントロールと比べてCD4⁺細胞のパーセンテージの変化をもたらさず（図34B）、CD4⁺Foxp3⁺ T_regsのパーセンテージの小さな増加をもたらし、IgG2aアイソタイプが最も顕著な増加をもたらした(図34C)。これらの結果は、対応するアイソタイプ抗CTLA-4、GITR、OX40、およびICOS抗体で得られたものと異なる。

MC38 TILs中のT細胞の種々のサブセットにおけるPD-1発現レベルのフローサイトメトリー測定は、CD8⁺ T_effsにおける発現が最も高く、T_regsおよびCD4⁺ T_effsにおける発現レベルが徐々に低いことを示した(実施例18参照)。

実験＃2
免疫モニタリング実験を除く、MC38腫瘍モデルにおける種々の抗PD-1アイソタイプの抗腫瘍活性の上記試験を反復した。図34および35に示す結果の傾向は、実験＃1と同様であったが顕著であり、腫瘍増殖阻害における種々のアイソタイプ間の差をより明確に示す。抗PD-1 IgG1(図34B)およびIgG1D265A(図34C)処置は、それぞれ10匹中5および6匹のTFマウスをもたらしたが、10匹中TFマウスが0匹であったマウスIgG1 コントロール(図32A)に比べて、IgG2aアイソタイプによる処置は10匹中2匹のTFマウスをもたらした(図34D)。実験＃1と実験＃2の結果の相違を表6にまとめる。

図35AおよびBに示す平均腫瘍体積および腫瘍体積中央値の変化も、gG1D265AアイソタイプのMC38腫瘍増殖に対する阻害効果が最も強く、次いでIgG1アイソタイプであり、IgG2aアイソタイプの抗腫瘍活性がはるかに低いことを明確に裏付ける。

腫瘍保有マウスの腫瘍および脾臓中のT細胞におけるレセプターの発現分析
腫瘍の微小環境におけるT_regsおよび通常のT(Tconv)細胞は、多様な共刺激および共阻害レセプターを発現する。しかしながら、T_regsに対するレセプターのエンゲージメントは、Tconvsに対する同じ標的のエンゲージメントに比べて細胞機能に対する著しく異なる効果があるかもしれない。例えば、OX40に対するアゴニスト抗体は、T_reg機能を阻害しながらTconv活性化を増強する。さらに、各レセプターの発現レベルは、種々のT細胞サブセット間、および腫瘍微小環境または末梢中の同タイプのT細胞で実質的に異なり得る。

T_regsおよびTconvsにおける種々の共刺激および共阻害レセプターの相対的発現レベルを腫瘍部位と脾臓で測定した。CD27、CD137、GITR、OX40、およびICOSの発現レベルを測定するため、9匹の雌の自家繁殖Foxp3^-GFPマウス(C57BL/6バックグラウンド JAX＃：006772)の右脇腹に100μlのPBS中の1 x 10⁶ MC38細胞を皮下注射した。MC38腫瘍細胞移植後14日にマウスを屠殺した。脾臓および腫瘍を摘出し、100μm細胞ストレーナーに押しつけて単細胞浮遊液を得た。ACK溶解緩衝液(10 mM KHCO₃、1mM EDTA、150mM NH4Cl、pH7.3)を用い脾臓試料中の赤血球細胞を溶解した。細胞をカウントし、各試料から得た2 x 10⁶の生細胞を、FACS染色緩衝液(PBS＋2％FBS、2mM EDTA)中の表7に示す抗体を用いて4℃で30分間染色した。細胞をFACS染色緩衝液で2回洗浄し、速やかにフローサイトメトリーで分析した。

並列実験において、CD27、GITR、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3およびTIGITの発現レベルを、A/Jマウスに2 x 10⁶ Sa1N肉腫細胞を皮下移植した後に測定した。移植後第7日に、腫瘍保有マウスを無作為化し、10mg/kgの抗体をIP注射、Q3D x 3により投与した。移植後第15日に腫瘍を摘出し、解離させて単細胞浮遊液を得、次いでフローサイトメトリー用に染色した。このSa1N実験のデータは、MC38腫瘍分析から得たデータを裏付け、補う。

これら2つの実験から決定した相対的発現レベルを表8にまとめている。共刺激レセプター ICOS、OX40、およびCD137については、T_regsにおいてT_convsより高発現であり、腫瘍のT_regsにおける発現は脾臓のT_regsより高かったが、GITRおよびCD27の発現は、腫瘍および脾臓ともにCD8 T_effsおよびT_regsでほぼ高かった。さらに、レセプター発現は、一般的に、腫瘍のT_reg細胞で脾臓のものより高かった。共阻害レセプターについては、腫瘍の種々のT細胞サブセットでの発現は、一般的に脾臓の同じタイプの細胞より高かった。CTLA-4を除いて、共阻害レセプターの発現は、T_regsまたはCD4細胞よりCD8 T_effsで高かった。TIGITの発現は、すべてのT細胞サブセットで非常に低いかまたは検出不能であった。

参考文献

Claims (15)

1. 癌または感染性物質により生じた疾患に罹患した対象のT細胞上の免疫調節標的と特異的に結合して該標的の活性を変化させ、癌細胞または感染性物質に対する内因性免疫応答を増強するFc融合タンパク質の抗腫瘍効果を増強、最適化、または最大にする方法であって、該Fc領域の活性化Fcレセプター（FcR)に対する結合を増強するようにFc融合タンパク質のFc領域を選択、設計、または修飾することを含む方法。
2. 該Fc融合タンパク質が抗体である請求項1記載の方法。
3. 該抗体がヒトIgG抗体である請求項2記載の方法。
4. FcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターに対するヒトIgG抗体の結合を増強する請求項3記載の方法。
5. FcｇγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターに対するヒトIgG抗体の結合の増強が、腫瘍部位における調節性T細胞(T_regs)の減少を仲介する請求項4記載の方法。
6. FcγI、FcγIIa、またはFcγIIIaレセプターに対するヒトIgG抗体の結合の増強が腫瘍部位のエフェクターT細胞(T_effs)の(a)減少を仲介しないかまたは(b)増加を仲介する請求項4記載の方法。
7. 該標的が、腫瘍部位のT_regsに腫瘍部位のT_effsより高レベルに発現する請求項1記載の方法。
8. 該抗体が、T細胞上の共阻害免疫調節標的の活性を遮断するアンタゴニスト抗体である請求項2記載の方法。
9. 該共阻害免疫調節標的がCTLAまたはTIGITである請求項8記載の方法。
10. 該抗体が、T細胞の共刺激免疫調節標的の活性化を増強するアゴニスト抗体である請求項2記載の方法。
11. 該共刺激免疫調節標的がGITR、OX40、ICOS、またはCD137である請求項10記載の方法。
12. 癌または感染性物質により生じた疾患に罹患した対象のT細胞上の免疫調節標的と特異的に結合し、該標的の活性を遮断することにより、癌細胞または感染性物質に対する内因性免疫応答を増強するFc融合タンパク質であって、内因性免疫応答を増強する抗体の能力がFc領域の活性化FcRに対する結合を増強するようにFc融合タンパク質のFc領域を選択、設計、または修飾することを含む方法により増強（最適化または最大化）されているFc融合タンパク質。
13. 癌または感染性物質により生じた疾患に罹患した対象の内因性免疫応答を増強することにより該対象を治療する方法であって、治療的有効量の請求項12記載のFc融合タンパク質を対象に投与することを含む、Fc融合タンパク質のFc領域が該Fc領域の活性化FcRに対する結合を増強するように選択、設計、または修飾されている方法。
14. 癌に罹患した対象の免疫療法のための方法であって、
    (a)免疫療法に適した候補である対象を選択し、
    ここで、該選択は、(i)被験組織試料中の骨髄由来サプレッサー細胞(MDSCs)の存在を評価し、(ii)被験組織試料中のMDSCの存在に基づいて適切な候補として該対象を選択することを含む；
    (b)治療的有効量の免疫調節Fc融合タンパク質を選択した対象に投与する、ことを含む方法。
15. 対象の癌または感染性物質により生じる疾患を治療するためのキットであって、
    (a)対象の癌細胞または感染性物質に対する内因性免疫応答を増強する能力の増大をもたらす用量の請求項12記載のFc融合タンパク質、および
    (b)請求項13に記載の方法に該Fc融合タンパク質を用いるための取扱説明書を含むキット。

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