MX2013002172A - Anticuerpos anti-ox40 y metodos para usarlos. - Google Patents

Abstract

Se describen los anticuerpos humanos, de preferencia los anticuerpos humanos recombinantes, tanto los humanizados como los quiméricos, que se unen específicamente a 0X40 humano; los anticuerpos preferidos tienen una alta afinidad por el receptor 0X40 y activan el receptor in vitro e in vivo; el anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa o una porción de unión a antígeno del mismo; los anticuerpos, o las porciones de anticuerpo, son útiles para modular la actividad del receptor, por ejemplo, en un sujeto humano que sufre de un trastorno en el que es nociva la actividad de 0X40; se proporcionan ácidos nucleicos, vectores y células hospederas para expresar los anticuerpos humanos recombinantes, y también se proporcionan métodos para sintetizar los anticuerpos humanos recombinantes.

Description

ANTICUERPOS ANTI-OX40 Y MÉTODOS PARA USARLOS CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere generalmente a la modulación de la activación del receptor OX40 y más particularmente, a la modulación del receptor OX40 para inhibir la función inmunosupresora de interleucina 10 (IL-10) que produce células T reguladoras tipo 1 CD4+ ("células Tr1 ") y células T reguladoras que expresan Foxp3+ (a veces también referidas en la presente como células "T-reg Foxp3+") y la generación de células Tr1 de células CD4+ o células naíve y producción de IL-10.

REFERENCIA CRUZADA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio y prioridad de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Serie No. 61/375,999 presentada el 23 de agosto de 2010 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Serie No. 61/380,827 presentada el 08 de septiembre de 2010. Ambas solicitudes se incorporan en la presente por referencia.

DECLARACIÓN CON RESPECTO AL DESARROLLO O INVESTIGACIÓN FEDERALMENTE PATROCINADA Esta invención se hizo con el apoyo del gobierno bajo R01 ??061645-0? , R01 AI062888-01 y U19 AI071130-01 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

LOS NOMBRES DE LAS PARTES CONTRATANTES EN UN ACUERDO DE INVESTIGACIÓN CONJUNTA Ninguno Referencia a la lista de secuencias Esta descripción incluye un listado de secuencias presentado como un archivo de texto de acuerdo con 37 C.F.R. § 1.52(e)(v) nombrado sequence listing.txt, creado el 23 de agosto de 2011 , con un tamaño de 13,836 bytes, el cual se incorpora en la presente por referencia. Las descripciones de secuencia y Listado de Secuencias adjuntos cumplen con las reglas que rigen las descripciones de secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos en las solicitudes de patente como se describe en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825. El listado de secuencias contiene el código de una letra para caracteres de secuencia de nucleótidos y los códigos de tres letras para aminoácidos como se define de conformidad con los estándares de la IUPAC- IUBMB descritos en Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) y en Biochemical J. 219 (No. 2):345-373 (1984). Los símbolos y el formato utilizados para los datos de secuencia de nucleótidos y aminoácidos cumplen con las reglas descritas en 37 C.F.R. §1.822.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células Tr1 tienen un papel crítico en la tolerancia periférica. Las células Tr1 son particularmente importantes para limitar el daño de tejido al huésped durante las respuestas inmunes inflamatorias. La generación de células Tr1 acompaña las respuestas inmunes tanto TH1 como TH2 in vivo e in vitro.

Las células Tr1 se generan de células T CD4+ na'íve durante una respuesta inmune de células T conducida por antígeno. Las células Tr1 son anérgicas en respuesta a la señalización a través de receptores TCR, CD28 e IL-2 y tienen la capacidad de suprimir la proliferación conducida por antígeno de células T CD4+ na'íve in vivo e in vitro. Las células Tr1 tienen la capacidad de inhibir el desarrollo de enfermedades autoinmunes y limitar la magnitud de las respuestas inmunes a los patógenos microbianos.

Mientras que se han estudiado las señales moleculares que conducen a las células Tr1 , poco se sabe acerca de las señales moleculares que regulan negativamente la generación de estas células. Aunque los fármacos inmunosupresores, citocinas, moléculas coestimulantes, y DCs se han implicado en la inducción de células Tr1 , las señales que regulan negativamente la generación de células Tr1 siguen siendo difíciles de alcanzar.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La activación del receptor OX40 bloquea la generación de Tr1 de células T CD4+ de memoria o na'íve así como también la producción de IL-10 de células Tr1 y la función inmunosupresora de las células Tr1. La activación del receptor OX40 también bloquea la producción de IL-10 por Células T-reg Foxp3+ y la función inmunosupresora. Como tal, presentados en la presente están anticuerpos de agonista que enlazan al receptor OX40, por lo que el agonista modula la activación del receptor OX40 para bloquear la secreción de citocina IL-10 y/o las células Tr1 y T-reg Foxp3+ en la función inmunosupresora total. Esencialmente, los anticuerpos pueden imitar el ligando OX40 y activar el receptor OX40 en células Tr1 y/o células T reguladoras naturales ("nTregs"), también referidas como "T-regs. Foxp3+" Como se muestra en las solicitudes de patente co-pendientes de los Estados Unidos Series Nos. 11/659,266 y 12/861 ,135, OX40L inhibe la generación y función de células Tr1 que producen IL-10 de células T CD4+ na'íve y de memoria que fueron inducidas por los fármacos inmunosupresores dexametasona y vitamina D3. Se descubrió que OX40L inhibe la generación y función de células T reguladoras que producen IL-10. Estos descubrimientos demuestran que la señalización de OX40 por OX40L suprime la generación de Células T humanas inmunosupresoras que producen IL-10 en cultivo. Esta función única de OX40L no es compartida por otros dos miembros de la familia de TNF coestimulantes, ligando GITR y ligando 4-1 BB. OX40L fuertemente también inhibe la generación y función de células Tr1 que producen IL-10 inducidas por dos estímulos fisiológicos proporcionados por DCs inmaduras y de ligando co-estimulante inducible. La señalización del receptor OX40 en células T humanas por anticuerpos monoclonales, moléculas pequeñas, o por el OX40L, o proteína que tiene al menos 90 por ciento de homología con estos, modula y regula la generación y función de células T inmunosupresoras que producen IL-10.

El descubrimiento se presta a numerosas aplicaciones de tratamiento. Por ejemplo, anticuerpos agonísticos, moléculas pequeñas o OX40L podrían ser utilizados para suprimir la generación y la función de células T inmunosupresoras que producen IL-10 y por lo tanto podrían utilizarse para mejorar la respuesta inmune para tratar cáncer y enfermedades infecciosas, o como un adyuvante para vacunas contra cáncer. Los anticuerpos antagonistas para OX40 u OX40L, o moléculas pequeñas antagonistas, podrían utilizarse para mejorar la generación y la función de células T inmunosupresoras que producen IL-10 y por lo tanto podrían ser utilizados para el desarrollo de terapias para enfermedades autoinmunes y enfermedades de injerto versus huésped. Nuestro descubrimiento también proporciona métodos de alto rendimiento para la selección de anticuerpos o moléculas pequeñas activando ya sea el receptor OX40 (o por el contrario bloqueando la señalización de OX40) en las células T para el desarrollo de terapias para el cáncer, o alternativamente, enfermedades autoinmunes, y enfermedades de injerto versus huésped.

Los anticuerpos monoclonales y humanos (algunas veces referidos en la presente como un "anticuerpo anti-OX40" y/o otras variaciones del mismo) que enlazan el receptor OX40 humano se proporcionan en la presente. Estos anticuerpos son útiles en el tratamiento o prevención de enfermedades agudas o crónicas o afecciones cuya patología implica OX40. En un aspecto, se describe un anticuerpo humano aislado, o una porción de enlace de antígeno del mismo, que enlaza al OX40 humano y es efectivo como un tratamiento para el cáncer o tratamiento contra una enfermedad autoinmune. Cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente puede utilizarse como un medicamento. Uno o más de los anticuerpos anti-OX40 pueden utilizarse para tratar uno o más de una variedad de cánceres o enfermedades autoinmunes descritas en la presente.

Los anticuerpos humanizados aislados que enlazan al OX40 se proporcionan en la presente. Los anticuerpos aislados como se describe en la presente enlazan a OX40, y pueden enlazar a OX40 codificado de los genes siguientes: Número de Acceso de NCBI NP_003317, Número de Acceso de Genpept P23510, o genes que tienen 90 por ciento de homología con estos. El anticuerpo aislado proporcionado en la presente puede enlazar adicionalmente al receptor OX40 que tiene uno de los siguientes Número de Acceso de GenBank: AAB39944, CAE11757, o AAI05071.

Como se enseña en la presente, un ejemplo es un anticuerpo aislado el cual enlaza a OX40 que comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 7; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 8; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 9.

Además, otro ejemplo es un anticuerpo aislado el cual enlaza a OX40 que comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 15; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 19; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 20; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 21.

Alternativamente, un anticuerpo aislado puede tener una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 13; una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 14; y/o una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o 15, o una región variable de cadena pesada CDR que tiene 90 por ciento de homología con esta.

Además, un anticuerpo aislado puede tener una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o 19; una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 20 y/o una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o 21 , o una región variable de cadena pesada que tiene 90 por ciento de homología con esta.

El anticuerpo aislado puede tener una región variable de cadena ligera ("VL") que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 1 1 , 22 o 23, o una secuencia de aminoácidos con al menos 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, 1 1 , 22 o 23. El anticuerpo aislado puede tener una región variable de cadena pesada ("VH") que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5, 16 y 17, o una secuencia de aminoácidos con al menos 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 5, 16 y 17. Como tal, como un ejemplo, el anticuerpo aislado puede comprender una secuencia pesada vanable de SEQ ID NO: 5 y una secuencia ligera variable de SEQ ID NO: 1 1 , o una secuencia que tiene 90 por ciento de homología con esta. De manera similar, el anticuerpo aislado puede tener una secuencia pesada variable de SEQ ID NO: 17 y una secuencia ligera variable de SEQ ID NO: 23 o una secuencia que tiene 90 por ciento de homología con esta.

El anticuerpo aislado puede tener cadena ligera variable codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 12, o 24, o una secuencia de ácido nucleico con al menos 90 por ciento de identidad con las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 12 o 24. El anticuerpo aislado puede tener cadena pesada variable codificada por una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 o 18, o una secuencia de ácido nucleico con al menos 90 por ciento de identidad con las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 6 o 18.

En la presente también se proporcionan anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden tener una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 22, o una secuencia de aminoácidos con al menos 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o 22. Además se proporcionan anticuerpos monoclonales que tienen una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o 16, o una secuencia de aminoácidos con al menos 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o 16.

En la presente también se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 enseñados en la presente. Además en la presente se proporcionan células huéspedes, cada una comprende ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente. Adicionalmente se proporcionan métodos para producir un anticuerpo (tal como la célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica cualquiera de los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente) que comprenden cultivar la célula huésped de modo que el anticuerpo se produce, y/o recuperar el anticuerpo de la célula huésped.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS A fin que la manera en la cual las características, aspectos y ventajas de la invención citadas anteriormente, así como otras que llegarán a ser evidentes, se logre y se pueda entender en detalle, la descripción más particular de la invención brevemente resumida anteriormente se puede tener por referencia a las modalidades de la misma que se ilustran en las figuras que forman una parte de esta especificación. Se observará, sin embargo, que las figuras anexas ilustran algunas modalidades de la invención y, por lo tanto, no serán consideradas limitantes del alcance de la invención, para que la invención pueda admitir otras modalidades igualmente efectivas.

La FIG. 1 muestra que Tejidos de linfoma folicular (FL) humanos infiltrados con Tregs FOXP3+ y co-localizados con las células B de tumor y monocitos. Izquierda: Doble inmunotinción de Tregs FOXP3+ (rojo) y células de linfoma B CD20+ (verde); Derecha: Tregs FOXP3+ (rojo) y monocitos/macrófagos/DC CD1 1 c+ (verde).

Las FIGS. 2A y 2B muestran números incrementados de Tregs CD4+FOXP3+ en pacientes con FL. Las células de tumor y PBMCs se obtuvieron de seis pacientes con FL en el diagnóstico inicial antes de la terapia. También se obtuvieron PBMCs de seis donantes normales para comparación. Los porcentajes de las células T reguladoras sobre células T CD4+ totales se determinaron por análisis citométrico de flujo de Tregs CD4+CD25+CD127bajaFOXP3+. La FIG. 2A muestra análisis FACS representativo de Tregs. PBMC de FL y células de tumor de FL se dividieron del mismo paciente. La FIG. 2B muestra el porcentaje de Tregs de todos los donantes. La barra horizontal indica medias.

La FIG. 3 muestra el aislamiento de Tregs ICOS+FOXP3+ o ICOS"FOXP3+ de FL. La suspensión de célula única se obtuvo de un espécimen de bazo antes de cualquier tratamiento. Las células se descongelaron en el día del ensayo. Células T CD4+CD8"CD14~CD16"CD56" CDU c TCRyó" se dividieron en subconjuntos CD25baja y CD25al,a. Las Tregs CD4+CD25al,aFOXP3+ adicionalmente se clasificaron en subconjuntos ICOSalta e ICOSbaja con base en la expresión superficial de ICOS. En todos los subconjuntos se determinó la expresión intracelular de FOXP3.

La FIG. 4 muestra Tregs intratumorales que inhiben la proliferación de células T CD4+CD25~ infiltrantes en FL y la inhibición podría ser parcialmente bloqueada por anticuerpos de neutralización anti-IL-10. Las células T infiltrantes de tumor CD4+CD25" etiquetadas con CFSE se cultivaron con células de tumor autólogas preactivadas por CD40L recombinante en la presencia o ausencia de Tregs ICOS+FOXP3+ o Tregs ICOS OXP3+, o anti-IL- 0 (10 pg/ml). Después de 72 horas de cultivo, la proliferación de células CD4+CD25" se determinó por análisis citométrico de flujo de dilución de CFSE.

La FIG. 5A muestra el análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ naíve como se determina por citometría de flujo de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 5B muestra la producción de citocina por células T CD4+ naíve como se determina por ELISA de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 5C muestra la función supresora por células Tr1 que producen IL-10 como se determina por la incorporación de [3H]timidina de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 6A muestra el análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ de memoria como se determina por citometría de flujo de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 6B muestra la producción de IL-10 por células T CD4+ de memoria como se determina por ELISA de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 7A muestra el análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ naíve como se determina por citometría de flujo de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 7B muestra la producción de IL-10 por células T CD4+ naíve como se determina por ELISA de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 7C muestra el número de células T viables contadas de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 8A muestra el análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ naíve como se determina por citometría de flujo de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 8B muestra la producción de IL-10 por células T CD4+ naíve como se determina por ELISA de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 8C muestra el análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ de memoria como se determina por citometría de flujo de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 8D muestra la producción de IL-10 por células T CD4+ de memoria como se determina por ELISA de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 8E muestra el análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ naíve como se determina por citometría de flujo de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 8F muestra la producción de IL-10 por células T CD4+ naíve como se determina por ELISA de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 9 muestra la producción de IL-10 por células T reguladoras como se determina por ELISA de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 10 muestra los resultados de la selección de sobrenadantes de hibridoma de OX40 anti-humano contra L-OX40 versus células L parentales como se determina por ELISA.

La FIG. 1 muestra la selección de anticuerpos monoclonales específicos de OX40 humano como se determina por análisis de citometría de flujo de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

La FIG. 12 muestra la confirmación de la especificidad de los anticuerpos monoclonales anti-hOX40 mediante el uso de células SUPM2 que expresan OX40 (SUPM2-OX40) de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

Las FIGS. 13A y 13B muestran anticuerpos monoclonales específicos de OX40 que pueden inhibir la generación de células que producen IL-10 (Tr1) de células T CD4+ estimuladas por vit D3 (0.1 pM)/Dex (50 nm), CD32L/ICOSL y anti-CD3/CD28 (0.2 g/ml) de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención. Los datos de la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS) se muestran en la FIG. 13A y los porcentajes de células que producen IL-10 para todos los tratamientos de anticuerpos monoclonales OX40 se muestran en la FIG. 13B.

La FIG. 14 muestra los resultados que los anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 que inhiben la generación de células Tr1 también estimulan la proliferación de células T CD4+ de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

Las FIGS. 15A y 15B detallan la titulación de anticuerpos monoclonales de OX40 para su capacidad de inhibir la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención. Los datos representativos de FACS se muestran en la FIG. 15A y el porcentaje de células Tr1 después del tratamiento con nueve anticuerpos monoclonales de OX40 se muestra en la FIG. 15B.

Las FIGS. 16A-16C muestran que los anticuerpos monoclonales específicos de OX40 que inhiben la generación de células Tr1 que producen IL-10 a partir de células T CD4+ también inhiben la producción de IL-10 de Treg ICOS+CD4+CD25al,aCD127" y función inmunosupresora. Las Tregs ICOS+CD4+CD25altaCD127" (ICOS+Tregs) recientemente clasificadas se estimularon con anti-CD3 (02 pg/ml) en la presencia de células de CD32L/ICOSL y células CD32L/OX40L (FIG. 16A) o anticuerpos monoclonales de OX40 o anticuerpo de control (FIG. 16B) durante cinco días. Las células luego se volvieron a estimular con anti-CD3/CD28 por 24 horas y los sobrenadantes se sometieron a ensayo por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA). La FIG. 16C es un ensayo de proliferación basado en monocitos que muestra que dos de los anticuerpos bloquean la función de ICOS+Treg.

Las FIGS. 17A y 17B muestran la identificación de anticuerpos monoclonales ant¡-hOX40 que inhiben la generación de células Tr1 y bloquean la función de Treg FOXP3+CD4+CD25alta de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención. Los análisis de citometría de flujo representativos se muestran en la FIG. 17A. Los datos para seis anticuerpos monoclonales se muestran en la FIG. 17B.

La FIG. 18 demuestra la identificación de los anticuerpos monoclonales anti-hOX40 que no inhiben la generación de células Tr1 pero bloquean la función de Treg FOXP3+CD4+CD25al,a de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención.

Las FIGS. 19A y 19B muestran los anticuerpos agonistas anti-hOX40 que bloquean la función de Treg CD4+CD25al,a derivada de linfoma de acuerdo con una modalidad de un método de la presente invención. Los análisis de FACS representativos se muestran en la FIG. 19A y los datos para todos los experimentos se muestran en la FIG. 19B.

La FIG. 20 muestra que los anticuerpos monoclonales anti-hOX40 pueden enlazar células T CD4+ de mono rhesus. Como se muestra, seis de los mAbs anti-hOX40 pueden enlazar células T CD4+ activadas de mono rhesus y enlazarán OX40 de rhesus y activarán la señalización de OX40.

La FIG. 21 muestra que cada uno de los anticuerpos Hu 106-222 Lote I y II del Ejemplo I está comprendido de una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kD. La pureza de los anticuerpos Hu106- 222 Lote I y II parece ser más de 95%.

La FIG. 22 muestra el análisis de anticuerpos 106-122, Ch106 y Hu106-222 (Lote II) de ratón para enlazar a células L/OX40 (Ejemplo I).

La FIG. 23 representa la estructura esquemática del vector de expresión para el anticuerpo Hu106 lgG1/kappa (Vector de expresión). Procediendo en el sentido de las manecillas del reloj desde el sitio Salí en la parte superior, el plásmido contiene la unidad de transcripción de cadena pesada iniciando con el promotor temprano inmediato principal de citomegalovirus humano (CMV) y mejorador (promotor de CMV) para iniciar la transcripción del gen de cadena pesada de anticuerpo. El promotor de CMV es seguido por el exón de VH, una secuencia genómica que contiene la región constante de cadena pesada gamma- humana que incluye los exones CH1 , de bisagra, CH2 y CH3 con los intrones que intervienen, y el sitio de poliadenilación que sigue el exón CH3. Después de la secuencia de gen de cadena pesada, la unidad de transcripción de cadena ligera comienza con el promotor de CMV, seguido por el exón de VL y una secuencia genómica que contiene el exón de región constante de cadena kappa humana (CL) con parte del intrón que le precede, y el sitio de poliadenilación que sigue el exón CL. El gen de cadena ligera luego es seguido por el promotor temprano de SV40 (promotor de SV40), el gen de xantina guanina fosforribosil transferasa de E. coli (gpt), y un segmento que contiene el sitio de poliadenilación de SV40 (sitio de poli(A) de SV40). Finalmente, el plásmido contiene una parte del plásmido pUC19, que comprende el origen bacteriano de replicación (pUC ori) y gen de beta-lactamasa (beta lactamasa). Las ubicaciones de sitios relevantes de enzima de restricción se muestran en la figura.

La FIG. 24 muestra la comparación entre los anticuerpos Hu 106-222 Lote I y II para enlazar a células L/OX40 (Ejemplo I a continuación).

La FIG. 25 muestra que Hu1 19-122 está comprendido de una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kD. La pureza de Hu1 19 parece ser más de 95% (Ejemplo II a continuación).

La FIG. 26 muestra el resultado del análisis de FACS de anticuerpos CM 19-122 y Hu119-122 descritos en la presente (Ejemplo II a continuación).

La FIG. 27 muestra que el clon de mAb de OX40 anti-humano humanizado 1 19-122 (Hu1 19), y su anticuerpo mutado que enlaza a FcR (Hu1 19-AA) mejoró la proliferación de células T CD4+. Hu119-122 produjo mejor actividad estimulante de células T en comparación con el mAb de OX40 anti-humano de ratón parental (Ratón 119-122). Sin embargo, el mAb de OX40 anti-humano quimérico (Ch 19, VH y VL de ratón pero regiones constantes gamma-1 y kappa humanas) no mejoró la proliferación de células T.

La FIG. 28 muestra que el clon de mAb de OX40 anti-humano humanizado mutado que enlaza a FcR 106-222 (Hu222AA) y clon de mAb de OX40 anti-humano quimérico 106-222 (Ch222) mejoraron la proliferación de células T CD4+ naíve estimuladas por anti-CD3. Estos anticuerpos tienen actividad estimulante similar en comparación con el mAb de OX40 antihumano de ratón parental (Ratón 222). Sin embargo, el Ab de OX40 antihumano completamente humanizado, Hu222, no mejora la proliferación de células T en comparación con lgG1 humana.

Las FIGS. 29A y 29B muestran que el clon de mAb de OX40 humanizado y anti-humano de ratón 119-122 bloquea la función supresora de Treg CD4+.

Las FIGS. 30A-30C proporcionan datos que muestran que los anticuerpos de OX40 anti-humanos mejoran la proliferación de células T CD4+ y CD8+ usando anticuerpos unidos a la placa.

Las FIGS. 31 A y 31 B muestran que los anticuerpos de OX40 humanizados y anti-humanos de ratón requieren reticulación para mejorar la proliferación de células T.

Las FIGS. 32A-32C muestran que los anticuerpos de OX40 anti-humanos bloquean la actividad de Tregs CD4+FOXP3+n usando anticuerpos de unión a la placa.

Las FIGS. 33A-33C muestran que una alta concentración de anticuerpos de OX40 anti-humanos de ratón preferentemente matan Tregs FOXP3+.

Las FIGS. 34A y 34B muestran que los mAbs de OX40 antihumanos de ratón actúan directamente ya sea sobre células T efectoras o nTregs para bloquear la función supresora de Tregs.

Las FIGS. 35A-35C muestran los resultados del tratamiento de tumor de mAb ant¡-hOX40 en ratones transferidos adaptativamente con células T hOX40+CD8+. El mAb de OX40 anti-humano promueve la expansión y supervivencia de células T in vivo. El régimen de vacunación terapéutica se muestra en la FIG. 35A. Las imágenes representativas de bioluminiscencia in vivo se muestran en la FIG. 35B. Los resultados del tratamiento de tumor de anticuerpo se muestran en la FIG. 35C.

La FIG. 36 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de 106-222, 106-222 humanizado (Hu106), y se muestran las secuencias de VH de X61012 aceptoras humanas (número de acceso de GenBank). Los residuos de aminoácido se muestran en código de letra única. Los números arriba de las secuencias indican las ubicaciones de acuerdo con Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las mismas secuencias como se reivindican en la presente también se proporcionan en el Listado de Secuencias y los números de posición pueden ser diferentes. En la Figura 36, las secuencias de CDR definidas por Kabat et al. (1991) son subrayadas en VH de 106-222. Los residuos de CDR en VH de X61012 se omiten en la figura. Las secuencias de VH humanas homologas a los armazones de VH de 106-222 se buscaron dentro de la base de datos de GenBank, y la secuencia de VH codificada por el ADNc de X61012 humano (VH de X61012) se eligió como una aceptora para la humanización. Las secuencias de CDR de VH de 106-222 primero se transfirieron a las posiciones correspondientes de VH de X61012. A continuación, en las posiciones de armazón donde el modelo tridimensional de las regiones variables de 106-222 sugiere contacto significativo con las CDRs, los residuos de aminoácido de VH de 106-222 de ratón se sustituyeron por los residuos humanos correspondiente. Estas sustituciones se realizaron en las posiciones 46 y 94 (subrayadas en HV de Hu106). Además, un residuo de armazón humano que se encontró que es atípico en el subgrupo de región V correspondiente se sustituyó con el residuo más típico para reducir la inmunogenicidad potencial. Esta sustitución se realizó en la posición 105 (subrayada doble en VH de Hu106).

La FIG. 37 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de 106-222, 106-222 humanizado (Hu106), y se muestran las secuencias de VL de AJ388641 aceptoras humanas (número de acceso de GenBank). Los residuos de aminoácido se muestran en código de letra única. Los números arriba de las secuencias indican las ubicaciones de acuerdo con Kabat et al. (1991 ). Las mismas secuencias como se reivindican en la presente también se proporcionan en el Listado de Secuencias aunque los números de posición pueden ser diferentes. Las secuencias de CDR definidas por Kabat et al. (1 ) están subrayadas en VH de 106-222. Los residuos de CDR en VL de AJ388641 se omiten en la figura. Las secuencias de VL humanas homologas a los armazones de VL de 106-222 se buscaron dentro de la base de datos de GenBank, y la secuencia de VL codificada por el ADNc de AJ388641 humano (VL de AJ388641) se eligió como una aceptora para humanización. Las secuencias de CDR de VL de 106-222 se transfirieron a las posiciones correspondientes de VL de AJ388641. No se realizaron sustituciones de armazón en la forma humanizada.

La FIG. 38 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de VH de Hu106 flanqueado por los sitios Spel y Hindlll (subrayados) mostrada junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Los residuos de aminoácido se muestran en código de letra única. La secuencia de péptido señal está en cursiva. El residuo de aminoácido N-terminal (Q) de la VH madura está doble subrayado. Las secuencias de CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991) están subrayadas. Las mismas secuencias como se reivindican en la presente también se proporcionan en el Listado de Secuencias y los números de posición pueden ser diferentes en el Listado de Secuencias. La secuencia de intrón está en cursiva. El fragmento de gen de VH de Hu106 digerido con Spel y Hindlll se clonó entre los sitios correspondientes en el Vector de Expresión mostrado en la Figura 23.

La FIG. 39 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de VL de Hu106-222 flanqueado por sitios Nhel y EcoRI (subrayados) mostrada junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Los residuos de aminoácido se muestran en código de letra única. La secuencia de péptido señal está en cursiva. El residuo de aminoácido N-terminal (D) de la VL madura está doble subrayado. Las secuencias de CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991) están subrayadas. La secuencia de intrón está en cursiva. El fragmento de gen de VL de Hu106 digerido con Nhel y EcoRI se clonó entre los sitios correspondientes en el Vector de Expresión mostrado en la FIG. 23.

Las mismas secuencias como se reivindican en la presente también se proporcionan en el Listado de Secuencias aunque los números de posición pueden ser diferentes en el Listado de Secuencias.

La FIG. 40 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de 1 19-122, 1 19-122 humanizado (Hu1 19), y se muestran las secuencias de VH de Z 4189 aceptoras humanas (número de acceso de GenBank). Los residuos de aminoácido se muestran en código de letra única. Los números arriba de las secuencias indican las ubicaciones de acuerdo con Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interests, Fifth edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991). Las secuencias de CDR definidas por Kabat et al. (1991 ) están subrayadas en VH de 1 19-122. Los residuos de CDR en VH de Z14189 se omiten en la figura. Las secuencias de VH humanas homologas a los armazones de VH de 1 19-122 se buscaron en la base de datos de GenBank, y la secuencia de VH codificada por el ADNc de Z14189 humano (VH de Z14189) se eligió como una aceptora para humanización. Las secuencias de CDR de VH de 119-122 primero se transfirieron a las posiciones correspondientes de VH de Z14189. A continuación, en las posiciones de armazón donde el modelo tridimensional de las regiones variables de 1 19-122 sugirió contacto significativo con las CDRs, los residuos de aminoácido de VH de 119-122 de ratón se sustituyeron por los residuos humanos correspondientes. Estas sustituciones se realizaron en las posiciones 26, 27, 28, 30 y 47 (subrayadas en la secuencia de VH de Hu1 19) como se muestra en la figura. Las mismas secuencias como se reivindican en la presente también se proporcionan en el Listado de Secuencias aunque los números de posición pueden ser diferentes en el Listado de Secuencias.

La FIG. 41 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de 1 19-122, 1 19-122 humanizado (Hu1 19), y se muestran las secuencias de VL de M29469 aceptoras humanas (Número de acceso de GenBank). Los residuos de aminoácido se muestran en código de letra única. Los números arriba de las secuencias indican las ubicaciones de acuerdo con Kabat et al. (1991). Las secuencias de CDR definidas por Kabat et al. (1) están subrayadas en VL de 1 19-122. Los residuos de CDR en VL de M29469 se omiten en la secuencia. Las secuencias de VL humanas homologas a los armazones de VL de 1 19-122 se buscaron dentro de la base de datos de GenBank, y la secuencia de VL codificada por el ADNc de M29469 humano (VL de M29469) se eligió como un aceptor para humanización. Las secuencias de CDR de VL de 119-122 se transfirieron a las posiciones correspondientes de VL de M29469. No fueron necesarias sustituciones de armazón en la forma humanizada. Las mismas secuencias como se reivindican en la presente también se proporcionan en el Listado de Secuencias aunque los números de posición pueden ser diferentes en el Listado de Secuencias.

La FIG. 42 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de VH de Hu119 flanqueado por los sitios Spel y Hindlll (subrayados) mostrada junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Los residuos de aminoácido se muestran en código e letra única. La secuencia de péptido señal está en cursiva. El residuo de aminoácido N-terminal (E) de la VH madura es doble subrayado. Las secuencias de CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991 ) están subrayadas. La secuencia de intrón está en cursiva. El fragmento de gen de VH de Hu119 digerido con Spel y Hindlll se clonó entre los sitios correspondientes en el Vector de Expresión mostrado en la FIG. 23. Las mismas secuencias como se reivindican en la presente también se proporcionan en el Listado de Secuencias aunque los números de posición pueden ser diferentes en el Listado de Secuencias.

La FIG. 43 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de VL de Hu1 19 flanqueado por los sitios Nhel y EcoRI (subrayados) mostrada junto con la secuencia de aminoácidos deducida. Los residuos de aminoácido se muestran en código de letra única. La secuencia de péptido señal está en cursiva. El residuo de aminoácido N-terminal (E) de la VL madura es doble subrayado. Las secuencias de CDR de acuerdo con la definición de Kabat et al. (1991 ) están subrayadas. La secuencia de intrón está en cursiva. El fragmento de gen de VL de Hu1 19 digerido con Nhel y EcoRI se clonó entre los sitios correspondientes en el Vector de Expresión mostrado en la FIG. 23. Las mismas secuencias como se reivindican en la presente también se proporcionan en el Listado de Secuencias aunque los números de posición pueden ser diferentes en el Listado de Secuencias.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "anticuerpo" incluye una molécula de inmunoglobulina comprendida de cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada está comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDRs), intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones de armazón (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDRs y cuatro FRs, arregladas de amino-término a carboxi-término en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

El término "porción de enlace de antigeno" de un anticuerpo (o "porción de anticuerpo") incluye fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de enlazar específicamente un antígeno (por ejemplo, hOX40). Se ha mostrado que la función de enlace de antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1 ; (ii) un fragmento de F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, pueden estar unidos, utilizando métodos recombinantes, por un enlazante sintético que les permite estar hecho como una cadena de proteina única en la cual las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv); ver por ejemplo, Bird et al. ( 988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena única también se proponen ser abarcados dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo. También se abarcan otras formas de anticuerpos de cadena única, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos, bivalentes en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una cadena de polipéptido único, pero usando un enlazante que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de enlace de antígeno (ver por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121 -1 123). Aún adicionalmente, un anticuerpo o porción de enlace de antígeno del mismo puede ser parte de unas moléculas de inmunoadhesión grandes, formadas por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más otras proteínas o péptidos. Los ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región de núcleo de estreptavidina para producir una molécula de scFv tetramérico (Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo cisteína, un péptido marcador y una marca de polihistidina C-terminal para producir moléculas de scFv bivalente y biotinilado (Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31 :1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tal como digestión de papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Además, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión se pueden obtener usando técnicas estándares de ADN recombinante, como se describe en la presente. Las porciones de enlace de antígeno preferidas son dominios completos o pares de dominios completos.

OX40/OX40-ligando (Receptor de OX40)/(OX40L) son un par de moléculas coestimulantes críticas para la proliferación de células T, supervivencia, producción de citocina, y generación de células de memoria.

Los experimentos in vitro tempranos demostraron que la señalización a través de OX40 en células T CD4+ condujo a TH2, pero ningún desarrollo de TH1. Estos resultados se soportaron por estudios in vivo que muestran que el bloqueo de la interacción de OX40/OX40L previno la inducción y mantenimiento de respuestas inmunes alérgicas mediadas por TH2. Sin embargo, el bloqueo de la interacción de OX40/OX40L alivia o previene las enfermedades mediadas TH1. Además, la administración de OX40L soluble o transferencia de gen de OX40L en tumores mostró que mejora fuertemente la inmunidad anti-tumor en ratones. Los estudios recientes también sugieren que OX40/OX40L puede jugar un papel en la promoción de respuestas inmunes mediadas por células T CD8. Como se discute en la presente, la señalización de OX40 bloquea la función inhibidora de células T reguladoras que se presentan naturalmente CD4+CD25+ y el par OX407OX40L juega un papel fundamental en la regulación global de inmunidad periférica versus tolerancia.

Los términos "numeración Kabat", "definiciones Kabat" y "etiquetado Kabat" se usan indistintamente en la presente. Estos términos, los cuales son reconocidos en la técnica, se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácidos los cuales son más variables (es decir hipervariables) que otros residuos de aminoácidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o un fragmento de enlace de antígeno del mismo (Kabat et al. (1971 ) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 y, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una genoteca de anticuerpo humano combinatorio, recombinante, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (ver por ejemplo, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucra el empalme de secuencias de gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (ver Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

Un "anticuerpo aislado" incluye un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que específicamente enlaza hOX40 substancialmente está libre de anticuerpos que específicamente enlazan antígenos distintos de hOX40). Un anticuerpo aislado que específicamente enlaza hOX40 puede enlazar moléculas de OX40 de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

El término "actividad" incluye actividades tal como la especificidad/afinidad de enlace de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo OX40 anti-humano que enlaza un antígeno OX40 y/o la potencia de activación de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 cuyo enlace al receptor hOX40 activa la actividad biológica de hOX40 o activación de enlace del receptor en un ensayo de células L/OX40 humanas.

El término "?0#", como se usa en la presente, se propone para referirse a la constante de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno. El término "Kd", como se usa en la presente, se propone para referirse a la constante de disociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular.

La frase "resonancia de plasmón de superficie" incluye un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones bioespecificas en tiempo real por detección de las alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo, utilizando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Para descripciones adicionales, ver Ejemplo 5 y Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51 :19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 1 1 :620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131 ; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

El término "vector" incluye una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha enlazado. Un tipo de vector es un "plásmido", el cual se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el cual los segmentos de ADN adicionales se pueden ligar. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula huésped en la introducción en la célula huésped, y asi se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales se enlazan operativamente. Tales vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la invención se propone que incluya otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), los cuales cumplen funciones equivalentes.

La frase "célula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped") incluye una celda en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que tales términos pretenden referirse no sólo a la célula objeto particular, sino a la progenie de tal célula. Debido a que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones venideras debido ya sea a la mutación o influencias ambientales, tal progenie, de hecho, no puede ser idéntica a la célula de origen, pero aún se incluye dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente.

El término "anticuerpo monoclonal" (anticuerpo monoclonal) se refiere a un anticuerpo, o población de anticuerpos similares, obtenidos de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, y no será interpretado como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular, incluyendo pero no limitado a, anticuerpos monoclonales que se pueden hacer por el método de hibridoma primero descrito por Kohier and Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975), o por métodos de ADN recombinante.

El término "anticuerpo quimérico" (o "inmunoglobulina quimérica") se refiere a una molécula que comprende una cadena pesada y/o ligera la cual es idéntica con u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada (Cabilly et al (1984), infra; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81 :6851 ).

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a las formas de anticuerpos que contienen secuencias de anticuerpos no-humanos (por ejemplo, murinos) así como también anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado puede incluir sustituciones de aminoácidos conservadoras o residuos no naturales de las mismas o diferentes especies que no alteran significativamente su actividad biológica y/o enlace. Tales anticuerpos son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulinas no humanas. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son reemplazados por los residuos de una CDR de una especie no-humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, camello, bovino, cabra, o conejo que tiene las propiedades deseadas. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las secuencias de CDR o armazón importadas. Estas modificaciones se realizan para adicionalmente refinar y maximizar el rendimiento del anticuerpo. Así, en general, un anticuerpo humanizado comprenderá todos o sustancialmente todos de al menos uno, y en un aspecto dos,, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones de FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), o aquella de una inmunoglobulina humana (ver, por ejemplo, Cabilly et al., Patente de Estados Unidos. No. 4,816,567; Cabilly et al., Patente Europea No. 0,125,023 B1 ; Boss et al., Patente de Estados Unidos No. 4,816,397; Boss et al., Patente Europea No. 0,120,694 B1 ; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., Patente Europea No. 0,194,276 B1 ; Winter, Patente de Estados Unidos No. 5,225,539; Winter, Patente Europea No. 0,239,400 B1 ; Padlan, E. A. et al., Solicitud de Patente Europea No. 0,519,596 A1 ; Queen et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol 86:10029-10033).

Cada uno de los anticuerpos descritos y reivindicados en la presente se pueden referir, en singular o plural, como: "anticuerpo anti-OX40"; "anticuerpo anti-hOX40"; "anticuerpo monoclonal anti-hOX40"; "anticuerpo OX40 anti-humano"; "mAb OX40 anti-humano"; "mAb anti-hOX40"; "anticuerpo monoclonal específico de hOX40"; "anticuerpo anti-OX40L"; "anticuerpo anti-hOX40L"; "anticuerpo OX40L anti-humano"; "anticuerpo específico de OX40 humano"; "anticuerpo monoclonal específico de OX40 humano"; "anticuerpo específico de OX40 humano"; "anticuerpo específico de OX40 anti-humano"; "anticuerpo monoclonal específico de OX40 anti-humano"; "anticuerpo específico de h-OX40"; "anticuerpo monoclonal específico de h-OX40"; "anticuerpo agonista de hOX40"; "agonista de hOX40" y/u otras variaciones similares de los mismos.

Como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 1 1/659,266 titulada "Methods to Treat Disease States by Influencing the Signaling of ??-40-Receptors and High Throughput Screening Methods and Identifying Substrates Thereof la cual se incorpora en la presente por referencia, se descubrió que una función de OX40L es la regulación negativa de la generación de células Tr1 inducida por agentes inmunosupresores Dex y vit D3, ICOSL, o DCs inmaduras. Este descubrimiento demuestra un mecanismo general por el cual OX40L mejora inmunidad y rompe la tolerancia inmunológica.

Con el uso de análisis inmunohistológico (FIG. 1), la tinción intracelular (FIGS. 2A y 2B), y clasificación de células (FIG. 3), se ha mostrado que tanto las Tregs que producen ICOS+IL-10 como Tregs que producen ICOS-TGF-ß se infiltran en tejidos de FL humanos. Estas Tregs FOXP3+ derivadas de FL pueden inhibir fuertemente la proliferación de células T infiltrantes de tumor FOXP3XD4+CD25~ en respuesta a células de linfoma autológas pre-activadas de ligando CD40" (FIG. 4). La actividad supresora de Tregs ICOS+ podría ser parcialmente bloqueada por un anticuerpo anti-IL-10 neutralizante, confirmando el papel de Tregs que producen ICOS+IL-10 en FL (FIG. 4). En el experimento de las FIGS. 2A y 2B, las células de tumor y PBMCS se obtuvieron de 7 pacientes con un diagnóstico inicial antes de la terapia. Las PMBC también se obtuvieron de 7 donantes sanos para comparación. Los porcentajes de las células T reguladoras sobre células T CD4+ totales se determinaron mediante análisis citométrico de flujo de Tregs CD4+CD25+CD127ba)aFOXP3+. La FIG. 2A proporciona análisis FACS representativo de Tregs, mientras que la FIG. 2B muestra el porcentaje de Tregs de todos los donantes.

También se descubrió que OX40L inhibe la generación de células Tr1 de células T CD4+ inducida por Dex y vit D3. Se sabe que una combinación de fármacos inmunosupresores Dex y vit D3 consistentemente induce la diferenciación de células T CD4+ na'íve en células Tr1. Para investigar si OX40L puede inhibir la generación y la función de células Tr1 , las células T CD4+ na'íve se cultivaron con anticuerpos monoclonales anti-CD3 más ant¡-CD28 en la presencia o ausencia de células L transfectadas con OX40L en cuatro diferentes condiciones de cultivo incluyendo: (1) Tr1 (Dex y vit D3)¡ (2) TH1 (IL-12); (3) TH2 (IL-4); o (4) neutral (solo medio) durante 7 días (FIG. 5A). La producción de IL-10 por las células T cebadas se analizó mediante tinción de citocina intracelular y ELISA.

En los experimentos de la FIG. 5A, un análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ na'íve se realizó mediante citometría de flujo. Las células T CD4+ na'íve se cultivaron con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 en la presencia de IL-2 en células L parentales o células OX40L-L con las citocinas recombinantes o reactivos indicados durante 7 días. Los porcentajes de las células T que producen citocina respectivas se indican en cada perfil de mancha de punto. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ na'íve inducida por las diferentes señales de polarización. Como se muestra en la FIG. 5A, entre 2% a 4% de células Tr1 se generaron de células T CD4+ na'íve cultivadas en condiciones neutrales o TH1 o TH2.

Más de 15% de células Tr1 se generaron en cultivo con Dex más vit D3. La adición de OX40L completamente bloqueó la generación de células Tr1 , mientras promovió la generación de células T que producen TNF-a en todas las condiciones de cultivo.

Estos datos fueron confirmados por datos de ELISA (FIG. 5B).

En los experimentos de la FIG. 5B, la producción de citocina por células CD4+ na'íve en sobrenadantes después de la reestimulación con los anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 horas se midió mediante ELISA. Las células T CD4+ na'íve se cultivaron con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 en la presencia de IL-2 en células L parentales o células OX40L-L con las citocinas recombinantes o reactivos indicados durante 7 días. Los datos se muestran como media ± error estándar de la media (SEM) de cuatro experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ na'íve inducida por las diferentes señales de polarización.

Las células T CD4+ na'íve cebadas con condición de Tr1 (Dex más vit D3) fueron anérgicas y tuvieron la capacidad de suprimir la proliferación de células T CD4+ naíve en respuesta a los anticuerpos monoclonales anti-CD3 más anti-CD28 (FIGS. 5A-5C). En los experimentos de las FIGS. 5A-5C, la función supresora en las células T se midió por incorporación de [3H]timidina. Las mezclas de las poblaciones de células T indicadas se volvieron a estimular por los anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28. Las barras de error representan la SEM de cavidades por triplicado. Se descubrió que las células T CD4+ naíve cebadas con la misma condición de Tr1 en la presencia de OX40L proliferaron vigorosamente y no inhibieron la proliferación de células T CD4+ naíve en respuesta a los anticuerpos monoclonales anti-CD3 más anti-CD28. Los datos sugieren que OX40L bloquea la generación de células Tr1 funcionales a partir de células T CD4+ naíve inducida por Dex y vit D3.

Se descubrió que las células Tr1 pueden generarse a partir de células T CD4+CD45RA"CD45RO+ de memoria, y que OX40L puede inhibir la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ de memoria. Las células T CD4+CD45RA"CD45RO+ de memoria se cultivaron durante 7 días con los anticuerpos monoclonales anti-CD3 más anti-CD28 en la presencia o ausencia de condición de Tr1 de células L transfectadas con OX40L (Dex más vit D3). En los experimentos de la FIG. 6A, un análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ de memoria se llevó a cabo mediante citometría de flujo. Las células T CD4+CD45RO+CD25 de memoria se cultivaron con los anticuerpos monoclonales ant¡-CD3, anti-CD28, e IL-2 en células L parentales o células OX40L-L en la presencia o ausencia de Dex más vit D3 durante 7 días. Los porcentajes de las células T que producen citocina respectivas se indican en cada perfil de mancha de punto. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de células Tr1 de células T CD4+ de memoria bajo una condición con Dex más vit D3. La FIG. 6A muestra que se generaron número grandes de células Tr1 (> 20%) a partir de células T CD4+ de memoria en cultivo con Dex más vit D3. La adición de OX40L bloqueó completamente la generación de células Tr1 y promovió la generación de células que producen TNF-a a partir de células T CD4+ de memoria.

La capacidad de Dex más vit D3 para promover la producción de IL-10 a partir de células T CD4+ de memoria, y que esta capacidad puede ser inhibida por OX40L, se confirmó por análisis de ELISA de IL-10 (FIG. 6B). En los experimentos de la FIG. 6B, la producción de IL-10 por células T CD4+ de memoria se midió en sobrenadantes después de la reestimulación con los anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 h por ELISA. Los datos se muestran como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ de memoria bajo una condición con Dex más vit D3.

Además se descubrió que OX40L inhibe la generación de células Tr1 , mientras que otros miembros de la familia de TNF (GITRL y 4-1 BBL) no. Dentro de la superfamilia de TNF, OX40L, ligando de receptor de TNF inducido por glucocorticoide (GITRL), y ligando de 4-1 BB (4-1 BBL) tienen función coestimulante para células T. Para investigar si OX40L fue el único en la inhibición de células Tr1 , las células T CD4+ na'íve se cultivaron con anticuerpos monoclonales anti-CD3 más anti-CD28 con Dex más vit D3, con células L parentales o células L transfectadas con OX40L, GITRL, o 4-1 BBL durante 7 días. Mientras que OX40L, GITRL, y 4-1 BBL todos promovieron la generación de células que producen TNF-a, solamente OX40L inhibió la generación de células Tr1 (FIGS. 7A y 7B).

En los experimentos de la FIG. 7A, un análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ na'íve se realizó mediante citometría de flujo. Las células T CD4+ naíve se cultivaron con los anticuerpos monoclonales anti-CD3, anti-CD28, e IL-2 en células L parentales, células OX40L-L, células GITRL-L, o células 4-1 BBL-L en la presencia de Dex más vit D3 durante 7 días. Los porcentajes de las células T que producen citocina respectivas se indican en cada perfil de mancha de punto. Los resultados muestran que OX40L pero no GITRL ni 4-1 BBL inhibe la generación de células Tr1.

En los experimentos de la FIG. 7B, IL-10 por células CD4+ naíve se midió en sobrenadantes después de la reestimulación con los anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 h por ELISA. Los datos se muestran como media ± SEM de cuatro experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L pero no GITRL ni 4-1 BBL inhibe la generación de células Tr1.

OX40L, GITRL y 4-1 BBL todos promovieron la expansión de números totales de células T (FIG. 7C). En los experimentos de la FIG. 7C, se contó el número de células T viables. Los datos se muestran como media ± SEM de cuatro experimentos independientes.

Como es entendido por los expertos en la técnica, los resultados de las FIGS. 7A-7C muestran que OX40L, pero no GITRL ni 4-1 BBL, inhibe la generación de células Tr1. Estos datos sugieren que entre los tres miembros de la superfamilia de TNF se sabe que coestimulan las células T, OX40L tiene una nueva y única función en la inhibición de la generación de células Tr1.

Además se descubrió que OX40L inhibe la generación de células Tr1 inducida por ICOSL o DCs inmaduras. ICOS y CD28 representan los dos receptores coestimulantes positivos dentro de la familia CD28 expresados en las células T. La señalización a través de ICOS por anticuerpos agonistas o ICOSL se ha mostrado que promueve las células T CD4+ para producir IL-10. Para investigar si OX40L puede inhibir la capacidad de ICOs para inducir la producción de IL-10 por células T CD4+, las células T CD4+ na'íve y de memoria se cultivaron con anti-CD3 en la presencia de células L transfectadas con ICOSL o células L transfectadas con ICOSL en la presencia de OX40L durante 7 días.

En los experimentos de la FIG. 8A, un análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ na'íve se realizó mediante citometría de flujo. Las células T CD4+ na'íve se cultivaron durante 7 días en células L parentales, en una mezcla de células ICOSL-L y células L, o en una mezcla de células ICOSL-L y células OX40L-L, las cuales fueron pre-recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los porcentajes de las células T que producen citocina respectivas se indican en cada perfil de mancha de punto. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ na'íve inducida por ICOSL.

En los experimentos de la FIG. 8B, la producción de IL-10 por células CD4+ na'íve se midió en sobrenadantes después de la reestimulación con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 por 24 h se midió mediante ELISA. Las células T CD4+ na'íve se cultivaron durante 7 días en células L parentales, en una mezcla de células ICOSL-L y células L, o en una mezcla de células ICOSL-L y células OX40L-L, las cuales fueron pre-recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los datos se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ naíve inducida por ICOSL.

En los experimentos de la FIG. 8C, un análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ de memoria se realizó mediante citometría de flujo. Las células T CD4+ de memoria se cultivaron durante 7 días en células L parentales, en una mezcla de células ICOSL-L y células L, o en una mezcla de células ICOSL-L y células OX40L-L, las cuales fueron pre-recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Los porcentajes de las células T que producen citocina respectivas se indican en cada perfil de mancha de punto. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ de memoria inducida por ICOSL.

En los experimentos de la FIG. 8D, la producción de IL-10 por células T CD4+ de memoria en sobrenadantes después de la reestimulación con anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 por 24 h se midió mediante ELISA. Las células T CD4+ de memoria se cultivaron durante 7 días en células L parentales, en una mezcla de células ICOSL-L y células L, o en una mezcla de células ICOSL-L y células OX40L-L, las cuales fueron pre- recubiertas con anticuerpo monoclonal ant¡-CD3. Los datos se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ de memoria inducida por ICOSL.

Los resultados de los experimentos de las FIGS. 8A-8D muestran que ICOSL promueve significativamente la generación de células Tr1 a partir tanto de células T CD4+ naíve como de memoria. La adición de OX40L inhibe completamente la generación de células Tr1 a partir tanto de células T CD4+ naíve como de memoria, mientras promueve fuertemente la generación de células que producen TNF-a.

Se sabe que las DCs inmaduras o DCs tratadas con IFN-a o IL-10 pueden inducir células T CD4+ naíve para diferenciarse en células Tr1. Se investigó si OX40L podría inhibir la generación de células Tr1 inducida por DCs. Como se muestra en la FIG. 8E, las DCs inmaduras o DCs tratadas con IL-10 o IFN-a todas inducen la generación de más de 10% de células Tr1 a partir de células T CD4+ naíve. Por el contrario, las DCs activadas por CD40L inducen una fuerte respuesta de TH1 , acompañada por la generación de aproximadamente 3% de células Tr1. La adición de OX40L recombinante en cultivos de células DC-T inhibe completamente la generación de células Tr1 inducida por DCs inmaduras y DCs tratadas con IL-10 e IFN-a. Además, OX40L también inhibe la generación del número residual de células Tr1 inducida por las DCs maduras activadas por CD40L. En los experimentos de la FIG. 8E, un análisis intracelular de la producción de citocina por células T CD4+ naíve se realizó mediante citometría de flujo. Las células T CD4+ naíve se co-cultivaron en la presencia o ausencia de OX40L recombinante soluble durante 7 días con DCs inmaduras o DCs cultivadas con IFN-a, IL-10, y CD40L. Los porcentajes de las células T que producen citocina respectivas se indican en cada perfil de mancha de punto. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de células Tr1 de células T CD4+ inducida por DCs.

La capacidad de OX40L para inhibir la generación de células Tr1 inducida por DCs se confirmó por los datos de ELISA (FIG. 8F). En los experimentos de la FIG. 8F, la producción de IL-10 por células CD4+ naíve se midió en sobrenadantes después de la reestimulación con los anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 durante 24 h por ELISA. Las células T CD4+ naíve se co-cultivaron en la presencia o ausencia de OX40L recombinante soluble durante 7 días con DCs inmaduras o DCs cultivadas con IFN-a, IL-10, y CD40L. Los datos se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes. Los resultados muestran que OX40L inhibe la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ inducida por DCs. Por lo tanto, estos datos demuestran que OX40L podría inhibir la generación de células Tr1 inducida por más señales fisiológicas proporcionadas por ICOSL y DCs.

Se ha sugerido previamente que las células T reguladoras están altamente representadas en el área de linfoma no de Hodgkin de células B y que las células B están involucradas en el reclutamiento de células T reguladoras en el área del linfoma. Se investigó si la influencia en la señalización de receptores OX40, tal como por OX40L, podría proporcionar una terapia contra el linfoma de células B. Las muestras crioconservadas de pacientes con linfoma de células B se utilizaron para estimar la capacidad de OX40L para cerrar las células Tr1. Las muestras utilizadas fueron linfoma folicular obtenido de un espécimen de bazo previo a cualquier tratamiento. Las células se descongelaron, con 400x106 células congeladas que produjeron 127x106 células vivas y 33.9x106 células muertas (79% de viabilidad). Un número suficiente de células CD25+ se identificaron por tinción de FACS. En los experimentos de la FIG. 9, la secreción de IL-10 de Tregs que producen ICOS+IL-10 se determinó por ELISA. Las células Treg se cultivaron bajo dos condiciones diferentes. En la condición 1 , las células CD25+/ICOS+ se cultivaron con anti-CD3 en la presencia de IL-2 (900 µ?/ml) en células L parentales o células OX40L-L con anticuerpo anti-ICOS durante 3-6 días. En la condición 2, las células CD25+/ICOS+ se cultivaron con anti-CD3 en la presencia de IL-2 (900 µ?/ml) en células ICOS-L-L o una mezcla de células OX40L-L e ICOS-L-L durante 3-6 dias. La producción de citocina en los sobrenadantes se midió mediante ELISA. Los resultados muestran que OX40L inhibe grandemente la producción de IL-10 por células Treg.

Los hallazgos, que OX40L tiene la capacidad de inhibir la generación y función de células Tr1 inducidas por los fármacos inmunosupresores Dex más vit D3, ICOSL, o DCs, destacan un nuevo mecanismo por el cual OX40L promueve la inmunidad y rompe la tolerancia durante diferentes formas de respuestas inmunes mediadas por CD4- o CD8-, como se entendería por un experto en la técnica. La capacidad de OX40L para inhibir la generación de células Tr1 durante ambas respuestas de TH1 inducida por IL-2 o TH2 inducida por IL-4 sugiere que OX40L puede controlar la magnitud de las respuestas inmunes mediadas por TH1 o TH2. Además, la capacidad de OX40L para inhibir la generación de células Tr1 parece ser una propiedad única de OX40L, debido a que los otros dos miembros de la familia de TNF, GITRL y 4-1 BBL no tienen esta propiedad funcional. Además, la capacidad de OX40L para inhibir la producción de IL-10 por células Treg identifica OX40L como un potente tratamiento para el linfoma de células B y otros cánceres.

Se han identificado muchas moléculas que promueven la generación de células Tr1 , incluyendo IL-10, IFN-a, ICOSL y compuestos inmunosupresores tales como Dex más vit D3. OX40L representa un potente inhibidor para la generación de células Tr1 no sólo de células T CD4+ naíve, sino también de células T CD4+ de memoria y células T reguladoras. Esta nueva propiedad de OX40/OX40L puede explicar un reporte reciente que muestra que la señalización de OX40 permite que las células T aurorreactivas anérgicas adquieran las funciones de células efectoras. La dirección de OX40/OX40L por consiguiente proporciona tratamientos para enfermedades alérgicas y autoinmunes humanas y así como también para el desarrollo de tratamientos para enfermedades infecciosas humanas y cáncer incluyendo, pero no limitado a melanoma, cáncer de cerebro, cáncer de huesos, leucemia, linfoma, neoplasia derivada de células epiteliales (carcinoma epitelial) tal como carcinoma de células básales, adenocarcinoma, cáncer gastrointestinal tal como cáncer de labios, cáncer de la boca, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado y cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de ovarios, cáncer cervical, cáncer de pulmón, cáncer de mama y cáncer de piel, tales como células escamosas y cánceres de células básales, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, y otros cánceres conocidos.

Los trastornos o afecciones que se pueden prevenir o tratar por los anticuerpos y métodos descritos en la presente incluyen la prevención o tratamiento de cáncer, tal como leucemia de células T cutánea, tumores de cabeza y cuello, cáncer pancreático, cáncer de vejiga, gliomas de alto grado, metástasis de cerebro, melanoma, cáncer de piel, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de colon, leucemia, síndrome mielodisplásico (una afección de pre-leucemia), y mieloma múltiple. En general, la metástasis de cualquier cáncer se puede prevenir o tratar con los métodos y compuestos descritos en la presente. Los anticuerpos también se pueden utilizar para prevenir o tratar afecciones angiogénicas proliferativas incluyendo telangectasia, angiomas venosos, hemangioblastoma. Otros trastornos, enfermedades o afecciones incluyen enfermedades virales, algunas de las cuales se pueden considerar tradicionalmente "intratables". Los anticuerpos, por ejemplo, también se pueden utilizar para clasificar las cepas de un solo patógeno. Los investigadores pueden utilizar los anticuerpos descritos en la presente para identificar y rastrear las células o moléculas específicas en el organismo.

En general, los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en los mamíferos que típicamente se caracteriza por el crecimiento celular no regulado. Más específicamente, los cánceres que se pueden tratar o prevenir usando uno o más de los anticuerpos descritos en la presente o una variante de los mismos, incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen, pero no se limitan a, cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón), cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de la glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, melanoma, melanoma de propagación superficial, melanoma maligno lentigo, melanoma lentiginoso acral, melanomas nodulares, así como también linfoma de células B (incluyendo linfoma de bajo grado/ non de Hodgkin folicular (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de células de manto; linfoma relacionado con SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post-transplante (PTLD), así como también la proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como aquel asociado con tumores de cerebro), y síndrome de Meigs.

Los métodos para tratar o prevenir un trastorno inmune también se proporcionan en la presente. Estos métodos comprenden la administración de una cantidad efectiva del anticuerpo a un sujeto en necesidad de tal tratamiento. En algunas modalidades, el trastorno inmune es un trastorno inmune o un trastorno autoinmune. El trastorno es asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, GVHD, y/o lupus eritematoso sístémico. En algunas modalidades, el trastorno es una enfermedad asociada con virus, bacterias u otro agente infeccioso.

Además, los anticuerpos y métodos que se describen en la presente se pueden utilizar para prevenir o tratar afecciones y enfermedades inflamatorias, tales como osteoartritis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, y enfermedades autoinmunes tal como lupus y enfermedad autoinmune mezclada. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en la presente pueden ser útiles en el tratamiento de una variedad de enfermedades autoinmunes e inflamatorias que comprenden la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo a un sujeto en necesidad de la misma, en donde la enfermedad autoinmune o enfermedad inflamatoria es una o más de las siguientes enfermedades: diabetes mellitus insulino-dependiente (IDDM), diabetes mellitus, esclerosis múltiple, encefalomielitis autoinmune experimental, encefalomielitis diseminada aguda, artritis, artritis reumatoide, artritis autoinmune experimental, miastenia grave, tiroiditis, enfermedad de Hashimoto, mixedema primario, tirotoxicosis, anemia perniciosa, gastritis atrófica autoinmune, enfermedad de Addison, menopausia prematura, infertilidad masculina, diabetes juvenil, síndrome de Goodpasture, pénfigo vulgar, penfigoide, oftalmía simpática, uveítis facogénica, hemoliticanemia autoinmune, leucofenia ¡diopática, cirrosis biliar primaria, hepatitis crónica activa Hbs-vve, cirrosis criptogénica, colitis ulcerosa, síndrome de Sjogren, escleroderma, granulomatosis de Wegener, poli/dermatomiositis, LE discoide, lupus eritematoso sístémico, enfermedad de Chron, psoriasis, espondilitis anquilosante, síndrome de anticuerpo antifosfolípido, anemia aplásica, hepatitis autoinmune, enfermedad celiaca, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre (GBS), púrpura trombocitopénica idiopática, síndrome de ppsoclono-míoclono (OMS), neuritis óptica, tiroiditis de ORd, pénfigo, poliartritis, cirrosis biliar primaría, síndrome de Reiter, Takayasu, arteritis temporal, anemia hemolítica autoinmune por anticuerpo caliente, granulomatosis de Wegener, alopecia universal, enfermedad de Behcet, enfermedad de Chagas, síndrome de fatiga crónica, disautonomía, endometriosis, hidradenitis supurativa, cistitis intersticial, neuromiotonia, sarcoidosis, escleroderma, colitis ulcerosa, vitíligo, vulvodinia, enfermedades inflamatorias de la piel, dermatitis alérgica por contacto, gastritis H. pylori, enfermedad inflamatoria nasal crónica, arterieesclerosis y enfermedad de injerto versus huésped.

Más específicamente, una "enfermedad autoinmune" como es referida en la presente es una enfermedad o trastorno que surge y se dirige contra un tejido u órgano propio del individuo o un co-segregado o manifestación del mismo o afección que resulta de esto. La enfermedad autoinmune puede referirse a una afección que resulta de, o se agrava por, la producción de células B de anticuerpos que son reactivas con antígenos y tejidos corporales normales. Además, una enfermedad autoinmune es una que puede implicar la secreción de un autoanticuerpo que es específica para un epítope de un auto-antígeno (por ejemplo, un antígeno nuclear).

Las enfermedades autoinmunes o trastornos que son tratables y/o prevenibles por uno o más de los anticuerpos descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a, artritis (artritis reumatoide tal como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, gota o artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inmunológica aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis inducida por colágeno tipo II, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, enfermedad de Still, artrosis vertebral, y artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis crónica progrediente, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, y espondilitis anquilosante), enfermedades de la piel hiperproliferativas inflamatorias, psoriasis tal como psoriasis de las placas, psoriasis gutatta, psoriasis pustulosa, y psoriasis de las uñas, atopia, incluyendo enfermedades atópicas tal como fiebre del heno y síndrome de Job, dermatitis incluyendo dermatitis por contacto, dermatitis crónica por contacto, dermatitis exfoliativa, dermatitis alérgica, dermatitis alérgica por contacto, dermatitis herpetiforme, dermatitis numular, dermatitis seborreica, dermatitis no específica, dermatitis por contacto irritante primaria, y dermatitis atópica, síndrome de hiper IgM x-enlazada, enfermedades inflamatorias infraoculares alérgicas, urticaria tal como urticaria crónica alérgica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria crónica autoinmune, miositis, polimiositis, dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, escleroderma (incluyendo esclerodermia sistémica), esclerosis tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (EM) tal como MS espino-óptica, MS primaria progresiva (PPMS), y MS de remisión recurrente (RRMS), esclerosis sistémica progresiva, ateroesclerosis, arterioesclerosis, esclerosis diseminata, esclerosis atáxica, neuromielitis óptica (NMO), enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales autoinmuno-mediadas, tal como colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colagenosa, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante, y colitis transmural, y enfermedad inflamatoria autoinmune del intestino), inflamación del intestino, pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangitis esclerosante primaria, síndrome de dificultad respiratoria, incluyendo síndrome de dificultad respiratoria agudo o en adultos (ARDS), meningitis, inflamación de todo o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un desorden hematológico autoinmune, espondilitis reumatoide, sinovitis reumatoide, angioedema hereditario, deño del nervio craneal como en meningitis, herpes gestacional, penfigoide gestacional, prurito de escroto, falla ovárica prematura autoinmune, pérdida de la audición súbita debido a una afección autoinmune, enfermedades mediadas por IgE tal como anafilaxia y rinitis alérgica y atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica y/o del tallo cerebral, uveítis, tal como uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior, o uveítis autoinmune, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda tal como GN primaria, GN inmuno-mediada, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN proliferativa membrano- o membranosa (MPGN), incluyendo tipo I y tipo II, y GN rápidamente progresiva, nefritis proliferativa, falla endocrina poliglandular autoinmune, balanitis incluyendo balanitis plasmacelularis circunscripta, balanopostitis, eritema anular centrífugo, eritema discrómico perstans, eritema multiforme, granuloma anular, liquen nitidus, liquen escleroso y atrófico, liquen simple crónico, liquen espinuloso, liquen plano, ictiosis laminar, hiperqueratosis epidermolítica, queratosis premaligna, pioderma gangrenoso, afecciones y respuestas alérticas, reacción alérgica, eczema incluyendo eczema alérgico o atópico, eczema asteatótico, eczema dishidrótico, y eczema vesicular palmoplantar, asma tal como asma bronquial, asma de bronquios, y asma autoinmune, afecciones que involucran la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, reacciones inmunes contra antígenos extraños tales como grupos sanguíneos A-B-0 fetales durante el embarazo, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmune, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus, incluyendo la nefritis de lupus, lupus cerebritis, lupus pediátrico, lupus no renal, lupus extra-renal, lupus discoide y lupus eritematoso discoide, lupus de alopecia, lupus eritematoso sistémico (SLE) tal como SLE cutáneo o SLE cutáneo subagudo, síndrome de lupus neonatal (NLE), y lupus eritematoso sistémico diseminado, diabetes juvenil (tipo I), diabetes mellitus, incluyendo diabetes mellitus insulino-dependiente pediátrica (IDDM), diabetes mellitus en adultos (diabetes tipo II), diabetes autoinmune, diabetes idiopática insípida, retinopatía diabética, nefropatía diabética, trastorno diabético de arteria grande, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis, vasculitis de vasos grandes (incluyendo arteritis de células gigantes (Takayasu) y polimialgia reumática), vasculitis de vasos medianos (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa/periarteritis nodosa), poliarterítis microscópica, inmunovasculitis, vasculitis del SNC, vasculitis cutánea, vasculitis de hipersensibilidad, vasculitis necrotízante tal como vasculitis necrotizante sistémica, y vasculitis asociada a ANCA, tal como vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (CSS) y vasculitis de vasos pequeños asociada a ANCA, arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmune, anemia positiva de Coombs, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune incluyendo anemia hemolítica autoinmune (AIHA), anemia perniciosa (anemia perniciosa), enfermedad de Addison, anemia de glóbulos rojos puros o aplasia (PRCA), deficiencia del Factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapedesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del SNC, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, síndrome de lesión de múltiples órganos tales como aquellas secundarias a la septicemia, trauma o hemorragia, enfermedades mediadas por complejos de antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana basal anti-glomerular, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, neuritis alérgica, enfermedad/síndrome de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tal como penfigoide buloso y penfigoide de piel, pénfigo (incluyendo pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo penfigoide de membrana mucosa, y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, lesión térmica, preeclampsia, un trastorno de complejo inmune tal como nefritis compleja inmune, nefritis mediada por anticuerpos, polineuropatías, neuropatía crónica tal como polineuropatías de IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (como se desarrolla por pacientes con infarto al miocardio, por ejemplo), incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura de post-transfusión (PTP), trombocitopenia inducida por heparina, y trombocitopenia autoinmune o inmuno-mediada tal como púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) incluyendo ITP crónica o aguda, escleritis tal como cerato-escleritis idiopática, episcleritis, enfermedad autoinmune de los testículos y ovarios incluyendo orquitis y ooforitis, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunes incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), o tiroiditis subaguda, enfermedad de tiroides autoinmune, hipotiroidismo idiopático, de Grave, síndromes poliglandulares tal como síndromes poliglandulares autoinmunes (o síndromes de endocrinopatia poliglandular), síndromes paraneoplásicos, incluyendo síndromes paraneoplásicos neurológicos tal como síndrome miasténico de Lambert-Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome del hombre rígido o persona rígida, encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia grave tal como miastenia grave asociada con timoma, degeneración cerebelar, neuromiotonia, síndrome de opsoclono u opsoclono-mioclono (OMS), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multífocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmune, neumonitis intersticial linfoide (LIP), bronquiolitis obliterante (sin trasplante) vs NSIP, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Berger (nefropatía de IgA), nefropatía de IgA idiopática, dermatosis lineal de IgA, dermatosis neutrofílica febril aguda, dermatosis pustular subcorneal, dermatosis acantolítica transitoria, cirrosis tal como cirrosis biliar primaria y neumonocirrosis, síndrome de enteropatia autoinmune, enfermedad celíaca o coeliaca, esprúe celíaco (enteropatia por gluten), esprúe refractario, esprúe idiopático, crioglobulinemia, esclerosis lateral amilotrófica (ALS; enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad de arteria coronaria, enfermedad autoinmune del oído tal como enfermedad autoinmune del oído interno (AIED), pérdida de audición autoinmune, policondritis tal como policondritis refractaria o recidivante o de recaída, proteinosis alveolar pulmonar, queratitis intersticial no sifilítica/síndrome de Cogan, parálisis de Bell, enfermedad/síndrome de Sweet, rosácea autoinmune, dolor asociado con herpes zoster, amiloidosis, una linfocitosis no cancerosa, una linfocitosis primaria, la cual incluye linfocitosis de células B monoclonales (por ejemplo, gammopatía monoclonal benigna y gammopatía monoclonal de significancia indeterminada, MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías tal como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC, autísmo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis focal o segmentaria o focal segmentaria (FSGS), oftalmopatia endocrina, uveorretinitis, coriorretinitis, trastorno hepatológico autoinmune, fibromialgia, falla endocrina múltiple, síndrome de Schmídt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielínizantes tal como enfermedades desmielinizantes autoinmunes y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Dressler, alopecia greata, alopecia total, síndrome de CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactilia, y telangiectasia), infertilidad autoinmune masculina y femenina, por ejemplo, debido a anticuerpos anti-espermatozoides, enfermedad del tejido conectivo mezclado, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón del granjero, eritema multiforme, síndrome post-cardiotomía, síndrome de Cushing, pulmón de criadores de aves, angiitis granulomatosa alérgica, angiitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tal como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción a la transfusión, lepra, malaria, enfermedades parasitarias tales como leishmaniosis, quipanosomiasis, esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis intersticial pulmonar, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis, eritema elevatum et diutinum, eritroblastosis fetal, faciitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariasis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis (aguda o crónica), o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección por virus de inmunodeficjencia humana (VIH), SCID, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), infección por ecovirus, sepsis, endotoxemia, pancreatitis, tiroxicosis, infección por parvovirus, infección por virus de la rubéola, síndromes de post-vacunación, infección por rubéola congénita, infección por virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmune, corea de Sydenham, nefritis post-estreptocócica, tromboangitis ubiterans, tirotoxicosis, tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de células gigantes, neumonitis por hipersensibilidad crónica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía de cambios mínimos, lesión por isquemia-reperfusión y benigna familiar, reperfusión por trasplante de órgano, autoinmunidad retinal, inflamación articular, bronquitis, enfermedad crónica obstructiva pulmonar/de las vías respiratorias, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioesclerótícos, asperniogenese, hemolisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nodoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebres reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida de la audición sensoneural, hemoglobinuria paroxismática, hipogonadismo, ileítis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, mixedema idiopático primario, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tireoiditis de Quervain, atrofia espénica adquirida, timoma no maligno, vitíligo, síndrome de choque tóxico, intoxicación alimentaria, afecciones que involucran la infiltración de células T, deficiencia de adhesión de leucocito, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapedesis leucocitaria, síndrome de lesión de múltiples órganos, enfermedades mediadas por complejo de antígeno- anticuerpo, enfermedad de membrana basal antiglomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunes, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmune, oftalmía simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad del tejido conectivo mezclado, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, síndrome poliglandular autoinmune tipo I, hipoparatiroidismo idiopático del adulto (AOIH), cardiomiopatía tal como cardiomiopatía dilatada, epidermolisis bulosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoidal, frontal, maxilar o esfenoidal, un trastorno relacionado con eosinófilos tal como eosinofilia, eosinofilia por infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, pulmonía eosinófila crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma, o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxia, espondiloartritis seronegativas, enfermedad autoinmune poliendocrina, colangitis esclerosante, candidiasis mucocutánea esclerótica, episclerótica, crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrích, síndrome de ataxia telangiectasia, angiectasis, trastornos autoinmunes asociados con enfermedad de colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, linfadenitis, reducción de la respuesta de la presión arterial, disfunción vascular, lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral, y vascularización que acompaña a la enfermedad, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, trastorno de reperfusión isquémica, lesión por reperfusión del miocardio u otros tejidos, traqueobronquitis linfomatosa, dermatosis inflamatorias, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, insuficiencia de órganos múltiples, enfermedades bulosas, necrosis renal cortical, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, síndromes asociados con la transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, narcolepsia, inflamación grave aguda, inflamación crónica intratable, pielitis, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulitis, y endometriosis.

Los anticuerpos descritos en la presente pueden tener una variedad de usos académicos, médicos y comerciales. Los anticuerpos pueden ser utilizados en diferentes tipos de pruebas de diagnóstico, por ejemplo, para detectar una amplia variedad de enfermedades o la presencia de fármacos (productos farmacéuticos), toxinas u otras proteínas incluyendo hormonas, ya sea in vitro o in vivo. Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser útiles en las pruebas para la enfermedad, por ejemplo, en suero o sangre de los pacientes. La enfermedad puede incluir enfermedades relacionadas con OX40 o enfermedades o indicaciones no relacionadas con OX40 incluyendo varios cánceres, enfermedad inflamatoria o autoinmune. Los anticuerpos pueden usarse también en la radioimmuno-detección y radioimmuno-terapia del cáncer y algunos nuevos métodos de pruebas pueden utilizar estos anticuerpos descritos para dirigirse sólo a las membranas celulares de tipos celulares específicos, es decir, cáncer.

Los anticuerpos descritos en la presente podrían hacerse parte de un kit o u otro paquete de diagnóstico. Como tal, en la presente se proporciona un kit de diagnóstico, o artículo de manufactura para uso con el método de tratamiento en la presente. El kit de diagnóstico puede comprender uno o más de los siguientes: material de referencia de antagonista/anticuerpo/fármaco; anticuerpo neutralizante de control positivo (preferiblemente de cabra o mono cynomolgus); columna de Proteína A + G (por ejemplo, columna de proteína A/G); reactivo de deslipidación; amortiguadores de purificación de afinidad de inmunoglobulina (por ejemplo, amortiguadores de enlace, elución y neutralización); suero de complemento; diluyente de ensayo para células; literatura o manual de instrucciones; vial de células congeladas (por ejemplo, células WIL2); reactivo de etiquetado de células (tal como CELL TITER GLO.RTM.), etc.. Por vía de ejemplo, el kit de diganóstico puede incluir pero no se limita a: (a) reactivo de deslipidación; (b) amortiguadores (por ejemplo, amortiguadores de enlace y elución) para purificación de afinidad de inmunoglobulinas; y (c) manual de instrucciones que da instrucciones al usuario del kit de diagnóstico para usar el kit para pre-tratar una muestra biológica de una enfermedad autoinmuno o cáncer objeto antes de conducir un bioensayo basado en células (tal como un ensayo de anticuerpo neutralizante) en la muestra (por ejemplo, para evitar el problema de interferencia de suero). El kit de diagnóstico opcionalmente comprende adicionalmente alguno o más de: material de referencia de fármaco, anticuerpo neutralizante de control positivo, suero de complemento, diluyente de ensayo para células, y reactivo de etiquetado de células, etc.

Los anticuerpos y otros descubrimientos descritos en la presente también proporcionan métodos de selección de alto rendimiento. Más específicamente, y como se entiende por los expertos en la técnica, los métodos de alto rendimiento para seleccionar anticuerpos monoclonales antagonistas o agonistas o moléculas pequeñas que enlaza a receptores OX40, y que pueden inhibir la generación y función de células Tr1 o promueven la generación y función de células Tr1 , se hacen posible. En tal método, una línea de células T humana (SU-DHL-1 ) que tiene la capacidad de producir IL-10 se transfectó con el gen de OX40 humano (SUOX40). 100,000 células de SUOX40 se cultivaron ya sea con 100,000 células de fibroblasto de ratón (células L) o 100,000 células de fibroblasto de ratón que expresan el ligando de OX40 humano (células L de ligando de OX40) en placas de 96 cavidades. Después de 48 horas de cultivo, los sobrenadantes de cultivo se colectaron para la medición de IL-10 por ELISA específico de IL-10. En un experimento representativo, 100,000 células de SUOX40 produjeron hasta 6,000 pg/ml de IL-10 cultivada en la ausencia de ligando de OX40. En la presencia de ligando de OX40, 100,000 células de SUOX40 produjeron menos de 1 ,000 pg/ml de IL-10. Este método de cultivo se puede utilizar para seleccionar, ínter alia, anticuerpos monoclonales antagonistas o moléculas pequeñas que bloquean la capacidad de ligando de OX40 para inhibir la producción de IL-10 por células de SUOX40. Alternativamente, este método de cultivo se puede modificar reemplazando las células L que expresan el ligando de OX40 con anticuerpos monoclonales agonistas potenciales o moléculas pequeñas específicas para OX40 para determinar, ¡nter alia, su capacidad de inhibir la producción de IL-10 por células de SUOX40.

Los anticuerpos anti-OX40 descritos en la presente se pueden usar como un ensayo o en un ensayo para probar o medir la actividad de un fármaco u otra molécula encontrada en un organismo o muestra orgánica. También se podrían usar en un ensayo cuantitativo para medir la cantidad de una sustancia en una muestra. Los bioensayos e inmunoensayos están entre las muchas variedades de ensayos bioquímicos especializados por los cuales estos anticuerpos se pueden usar. Los anticuerpos anti-OX40 enseñados en la presente se pueden usar en otros ensayos para medir los procesos tal como actividad enzimática, captura de antígeno, actividad de células madre, y enlace de proteína competitivo.

Las células L que expresan GITRL, OX40L, 4-1 BBL, ICOSL humanos se generaron por transducción mediada por retrovirus, como se entiende por los expertos en la técnica. Brevemente, la secuencia codificante de longitud completa para GITRL (Acceso # NM_005092), OX40L (Acceso # NM_003326), 4-1 BBL (Acceso # NM_00381 1 ), ICOSL (Acceso # NM_015259) humanos se amplificó por RT-PCR con ARN preparado de PBMCs estimuladas por HSV-1. Subsecuentemente, los ADNc se clonaron en un vector retroviral basado en MSCV pMIGW2 y los plásmidos resultantes se verificaron por digestión de enzima de restricción y secuenciación de ADN.

Para producir el retrovirus recombinante, cada vector fue co-transfectado con constructos de empaquetado pCL-gp (gag/pol) y pHCMV-VSVg (envoltura de glicoproteína VSV) en células HEK293T. Dos días más tarde, los sobrenadantes de cultivo que contienen virus se recolectaron y se utilizaron para infectar las células L CD32 a 100. Bajo esta condición > 95% de células fueron transducidas productivamente.

Los monocitos de CD14+ aislados (pureza > 94%) se cultivaron en la presencia de 100 ng/ml de GM-CSF y 50 ng/ml de IL-4 (ambos de R&D) durante 5 días, como se entiende por los expertos en la técnica. Las DCs inmaduras resultantes se lavaron y cultivaron durante 24 h con IFN-a (1000 U/ml, PBL Biomedical Laboratories), IL-10 (10 ng/ml, R&D), y se irradiaron las células L transfectadas con CD40L (relación de DC a células L, 4:1) para obtener DCs maduras, como se entiende por los expertos en la técnica.

Las células T CD4+ na'ive y células T CD4+ de memoria (cada pureza > 99%) se aislaron de PBMCs usando kit de aislamiento II de células T CD4+ (Miltenyi Biotec) seguido por clasificación celular (fracción de CD4+CD45RA+CD45RO"CD25 como células T naíve y fracción de CD4+CD45RA"CD45RO+CD25" como células T de memoria), como se entiende por los expertos en la técnica. 4 x 104 células T CD4+ naíve alogénicas recientemente purificadas se co-cultivaron con DCs inmaduras o cultivadas (relación de DC a T, 1 :10) en la presencia o ausencia de OX40L humano recombinante (R&D, 100 ng/ml) en placas de cultivo de 96 cavidades de fondo redondo durante 7 días, como se entiende por los expertos en la técnica. Las células T CD4+ purificadas también se cultivaron con IL-12 (10 ng/ml, R&D), IL-4 (25 ng/ml, R&D), o combinación de dexametasona (5x10"8 M, Life Technologies) y 1alfa,25-dihidroxivitamina D3 (10"7 M) durante 7 días en la presencia de anticuerpo monoclonal anti-CD28 soluble (CD28.2, 1 pg/ml) e IL-2 (50 U/ml, R&D) en las células CD32/OX40L-L irradiadas, células CD32/GITRL-L, células CD32/4-1 BBL-L, o células CD32-L parentales las cualse se han pre-recubierto con anticuerpo monoclonal anti-CD3 (OKT3, 0.2 pg/ml) en placas de cultivo de 48 cavidades (relación de células T a células L, 2.5:1), como se entiende por los expertos en la técnica. En algunos experimentos, las células T CD4+ se cultivaron durante 7 días en las células CD32-L, mezcla de células CD32-L y células CD32/ICOSL-L (relación 1 :1 ), o mezcla de células CD32/ICOSL-L y células CD32/OX40L-L (relación 1 : 1 ) pre-recubiertas con anticuerpo monoclonal anti-CD3 (0.2 pg/ml) en placas de cultivo de 48 cavidades, como se entiende por los expertos en la técnica. Se utilizó RPMI 1640 y se suplemento con 10% FCS, 2 mM L-glutamina, 1 mM piruvato de sodio, penicilina G, y estreptomicina para los cultivos, como se entiende por los expertos en la técnica.

Las células T cultivadas se colectaron y se lavaron, y luego se reestimularon con anti-CD3 de unión a la placa (5 pg/ml) y anti-CD28 soluble (2 pg/ml) a una concentración de 1x106 células/ml durante 24 horas, como se entiende por los expertos en la técnica. Los niveles de IL-4, IL-10, TNF-a, e IFN-a en los sobrenadantes se midieron por ELISA (todos los kits de R&D), como se entiende por los expertos en la técnica. Para la producción de citocina intracelular, las células T cultivadas se reestimularon con 50 ng/ml de PMA más 2 pg/ml de yonomicina durante 6 h. La brefeldin A (10 pg/ml) se agregó durante las última 2 h, como se entiende por los expertos en la técnica. Las células se tiñeron con una combinación de anticuerpos monoclonales etiquetados con PE a anticuerpos monoclonales etiquetados con FITC de IL-4 o TNF-a a anti-IL-10 etiquetado con APC e IFN-a (todos de BD) usando el kit FIX y PERM (CALTAG), como se entiende por los expertos en la técnica.

Las células T se recolectaron y resuspendieron en un medio que contiene EDTA para disociar los agolpamientos, como se entiende por los expertos en la técnica. Las células viables se contaron por exclusión de azul de tripano de las células muertas, como se entiende por los expertos en la técnica. Para el ensayo de función supresora, las células T CD4+ na'íve (A) y células Tr1 generadas de células T CD4+ na'íve por anticuerpo monoclonal anti-CD3, anticuerpo monoclonal anti-CD28, IL-2, Dex, y vit D3 en la presencia de las células L parentales (B) o células OX40L-L (C), estos tres tipos de células y sus mezclas a una relación 1 : 1 luego se reestimularon durante 5 días por cultivo en la presencia de 5 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD3 y 1 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-CD28, después de este tiempo la proliferación celular se evaluó por incorporación de [3H], como se entiende por los expertos en la técnica.

Generación de anticuerpos monoclonales específicos de OX40 anti-humano Se generaron múltiples anticuerpos monoclonales de ratón agonistas contra OX40 humano. La especificidad de enlace de antígeno de los anticuerpos se confirmó por citometria de flujo (FIGS. 10-12). La actividad agonista de los anticuerpos se validó a través de ensayos funcionales. Se encontró que nueve de los 20 anticuerpos específicos de OX40 podrían bloquear la generación mediada por vitamina D3/dexametasona de células Tr1 a partir de células T CD4+ (FIGS. 13A y 13B), mejorar la proliferación de células T CD4+ (FIG. 14), y suprimir la producción de IL-10 de Treg ICOS+CD4+CD25altaFOXP3+ (FIGS. 16A-16C). Se titularon los anticuerpos y se encontró que cinco poseen actividad en la supresión de la generación de células Tr1 a concentraciones tan bajas como 4 ng/ml (FIGS. 15A y 15B).

Los anticuerpos OX40 inhiben la función de Treg CD4*CD25allaFOXP3* Algunos de los anticuerpos monoclonales de OX40 inhiben la función supresora de Treg FOXP3+ (FIGS. 17A y 17B). De los cinco anticuerpos (119-8B, 1 19-43, 1 19-122, 119-173B, y 106-222) que potentemente inhiben la producción de IL-10 de células Tr1 y Tregs CD4+CD25al,aCD127+FOXP3\ tres (1 19-43, 119-122, y 106-222) fueron potentes en el bloqueo de la función de Treg CD4+CD25al,aCD127+FOXP3+ (FIGS. 17A y 17B). Sin embargo, dos (119-33 y 120-140A) de los 1 1 anticuerpos que no tienen actividad contra la producción de IL-10, bloquean la función de Treg CD4+CD25al,aFOXP3+ (Fig.18).

Anticuerpos monoclonales OX40 anti-humanos La generación de anticuerpos monoclonales OX40 anti-humanos se realizó por ejemplo, inmunizando ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad con una línea celular de ratón transfectada con OX40 humano siguiendo los protocolos establecidos. Los clones de hibridoma que segregan el anticuerpo monoclonal de hibridoma que específicamente manchó células OX40+ se establecieron y se analizaron adicionalmente.

Se diseñó una selección exhaustiva para detectar aquellos clons que activan la señalización de OX40 (es decir, anticuerpos agonistas) inhibiendo la generación y función de células Tr1. Aquellos clones se purificaron adicionalmente. Los anticuerpos agonistas contra hOX40 se pueden humanizar y usar en protocolos clínicos para terapia anti-tumor humana, ya sea solos o en combinación con vacunación anti-tumor y otros adyuvantes. Diversos tipos de tumor diferentes podrían ser el objetivo de estos anticuerpos, incluyendo melanoma, linfoma y cáncer de mama.

En otra modalidad, se utilizaron ratones hembra BALB/c de 6-8 semanas de edad para inmunización subcutánea o en almohadilla plantar. Cada ratón se inyectó con 5 millones de células L murinas transfectadas con OX40 humano (L-OX40) 6 veces a intervalos de 3 días. Tres días después de la sexta inyección, los ratones se sacrificaron y los nodulos linfáticos popliteales (de la inmunización en almohadilla plantar) o bazo (de la inmunización subcutánea) se removieron y las células se fusionaron con células de mieloma SP2.0 o mieloma NSO a una relación de 1 a 1 para generar clones de hibridoma usando protocolos establecidos. Los clones de hibridoma que segregan anticuerpo monoclonal luego se seleccionaron para su especificad de enlace a células L-hOX40 por ensayos de ELISA. Los sobrenadantes de hibridoma que enlazan a células L-hOX40 y no células L parentales se confirmaron adicionalmente para enlace en células L-hOX40 y SUPM2-hOX40 por análisis de citometría de flujo.

En el experimento de la FIG. 10, los sobrenadantes de hibridoma de hOX40 se seleccionaron contra células L-hOX40 versus células parentales L por ELISA. Veinte anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 se seleccionaron. Veinte millones de células L o células L que expresan OX40 humano (L-hOX40) se recubrieron en una placa de 96 cavidades mezclando las células con 0.01 % cloruro de magnesio y calcio en PBS y se dejaron secar durante la noche en una campana laminar. Las placas luego se congelaron a -20°C por al menos un día antes del uso. Para ensayos de enlace de anticuerpo, las células congeladas se rehidrataron con PBS y se lavaron con amortiguador de lavado que contiene PBS más 0.05% Twen 20, y se bloquearon con 2% BSA en amortiguador de lavado. Las células acondicionadas luego se usaron para enlace a sobrenadantes de anticuerpo OX40. El enlace de anticuerpo a células luego se detectó con un anticuerpo secundario, FC HRP de IgG anti-ratón. Los sobrenadantes de hibridoma específico de hOX40 reconocen las células L que expresan OX40 pero no células L parentales.

En el experimento de la FIG. 1 1 , los anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 se seleccionaron por análisis de citometría de flujo. Números iguales (100k) de células L y L-hOX40 se mezclaron en amortiguador de FACS (1% FCS/2mM EDTA/PBS) y se incubaron con 0.5 pg de anticuerpos purificados FPLC (Proteína A HiTrap/Amortiguador de elución de Ag/Ab Ligero). Las células luego se lavaron y tiñeron con un anticuerpo secundario, IgG anti-ratón conjugado con PE. Dos picos indican tinción positiva y negativa por anticuerpo monoclonal anti-hOX40. Un pico único sugiere no enlace o ningún enlace específico de anticuerpos. Veinte anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 se confirmaron por análisis de citometría de flujo.

En el experimento de la FIG. 12, la especificidad de anticuerpos monoclonales hOX40 se confirmó usando células SUPM2 que expresan hOX40 (SUPM2-hOX40). Números iguales (100k) de células SUP 2 y SUPM2-hOX40 se mezclaron en amortiguador de FACS (1 % FACS/2mM EDTA/PBS) y se utilizaron para enlace de anticuerpo monoclonal hOX40 como en la FIG. 1 1. La especificidad de enlace de cada anticuerpo se analizó por citometría de flujo. Dos picos indican tinción positiva y negativa por anticuerpo monoclonal anti-hOX40, mientras que un pico único sugiere no enlace o ningún enlace específico por anticuerpos. Veinte anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 se confirmaron.

En el experimento de las FIGS. 13A y 13B, se buscó identificar anticuerpos monoclonales específicos de OX40 humano que pueden inhibir la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+ estimulada por VitD3 (10 micromoles mM)/Dex (50 nanoM), CD32IJICOSL y anti-CD3/CD28 (0.2 microgramos/ml). Los anticuerpos monoclonales anti-hOX40 se agregaron en el día 0 del cultivo celular y las células T CD4+ después de 7 días de estimulación se sometieron a tinción intracelular de IL-10 seguida por análisis de citometría de flujo. Los datos representativos de Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS) se muestran en A y los porcentajes de las células Tr1 para todos los tratamientos de anticuerpos monoclonales anti-hOX40 se muestran en B. Usando las células obtenidas de este experimento, se buscó identificar los anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 que estimulan la proliferación de células T CD4+ (FIG. 14, las células se contaron en el día 7 después de la estimulación) e inhibir la generación de Tr1 a partir de CD4+ (FIGS. 13A y 13B).

Para identificar tales anticuerpos monoclonales hOX40 para su capacidad de inhibir la generación de células Tr1 a partir de células T CD4+, las células Tr1 se generaron y cultivaron como se describe en los experimentos para las FIGS. 13A y 3B anteriores. Los datos representativos de FACS se muestran en A y el porcentaje de células Tr1 después del tratamiento con nueve anticuerpos monoclonales anti-hOX40 se muestra en B. Cinco anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 inhibieron fuertemente la generación de células Tr1 a concentración de 4 ng/ml (FIGS. 15A y 15B).

En el experimento de las FIGS. 16A-16C, las células T ICOS+CD4+CD127 CD25al,a recientemente clasificadas se estimularon con anti-CD3 (0.2 pg/ml) en la presencia de células CD32L/ICOSL y células CD32/hOX40L o anticuerpos monoclonales anti-hOX40 o anticuerpo de control durante 5 días. Luego, las células se contaron y 5x104 células se reestimularon con anti-CD3/CD28 durante 4 horas y los sobrenadantes se sometieron a ensayo para secreción de IL-10 con un kit de Elisa. Se identificaron los anticuerpos monoclonales específicos de hOX40 que inhiben la generación de Tr1 a partir de células T CD4+ que también inhiben la producción de IL-10 naturalmente de células T ICOS+CD4+CD2al,a. Las Tregs ICOS+ICOS CD4+CD127'CD25al,a se cultivaron con células CD4+CD25baja etiquetadas con CFSE en la presencia de monocitos irradiados y anti-CD3 (0.3 pg/ml) y mAbs anti-hOX40. Después de 3.5 días de cultivo, la proliferación celular se evaluó para dilución de CFSE en células por FACS (FIG. 16C).

Las FIGS. 17A y 17B muestran la identificación de anticuerpos monoclonales anti-hOX40 que inhiben la generación de células Tr1 y bloquean la función de Treg FOXP3+CD4+CD25alta. Las células T FOXP3+CD4+CD127"CD25alta recientemente clasificadas (3.5 x 104) se cultivaron con células CD4+CD25baja etiquetadas con CFSE (7 x 104) en la presencia de monocitos irradiados (7 x 104, 6000 rad) y 0.3 g/ml de anti-CD3 y varias concentraciones de anticuerpo monoclonal anti-hOX40. Después de 3 a 4 días de cultivo, se evaluó la proliferación celular para la dilución de CFSE en células por análisis de citometría de flujo. El porcentaje de células divididas se indicó. Los análisis de citometría de flujo representativos se muestran en la FIG. 17A. Los datos para 6 anticuerpos monoclonales se muestran en la FIG. 17B.

En el experimento de la FIG. 18, las células T FOXP3+CD4+CD127"CD25al,a recientemente clasificadas (3.5 x 104) se cultivaron con células CD4+CD25baja etiquetadas con CFSE (7 x 104) en la presencia de monocitos irradiados (7 x 104, 6000 rad) y 0.3 pg/ml de anti-CD3 y varias concentraciones de anticuerpo monoclonal OX40. Después de 3 a 4 días de cultivo, la proliferación celular se evaluó para la dilución de tinte de CFSE en las células por FACS. Los datos son representativos de dos experimentos. Se identificaron los anticuerpos monoclonales anti-hOX40 que no inhiben la generación de Tr1 pero bloquean la función de Treg FOXP3+CD4+CD25alta.

En el experimento de las FIGS. 19A y 19B, las células T CD4+CD25alla derivadas de linfoma se cultivaron con células CD4+CD25baja etiquetadas con CFSE (7 x 104) aisladas de un donante sano en la presencia de monocitos alogénicos irradiados (7 x 104, 6000 rad) y 0.3 microgramos/ml de anti-CD3 y 25 pg/ml de anticuerpo monoclonal anti-hOX40. Después de 3 a 4 días de cultivo, la proliferación celular se evaluó para la dilución de CFSE por FACS. Los análisis representativos de FACS se muestran en la FIG. 19A y los datos para todos los experimentos se muestran en la FIG. 19B. Se descrubió que los anticuerpos agonistas hOX40 bloquean la función de Treg CD4+CD25alta derivadas de linfoma.

La FIG. 20 muestra la identificación de anticuerpos agonistas OX40 que enlazan específicamente a OX40 de mono rhesus y humano. Las células mononucleares de sangre periférica de mono rhesus se obtuvieron por centrifugación de ficoll. Las células T CD4+ se obtuvieron por microperlas de CD4. Las células T CD4+ se estimularon con 10 pg/ml de lectina de phaseolus vulgaris (PHA). Dos días después de la estimulación, las células se tiñerpn con mAbs ant¡-hOX40 seguido por IgG-APC anti-ratón de cabra y CD69-PE. 106-317 sirvió como un control negativo. Se muestran seis mAbs anti-hOX40 que activan fuertemente la proliferación de células T podrían enlazar las células T CD4+ de mono rhesus activadas. Estos resultados indican que la toxicidad de estos seis anticuerpos monoclonales anti-hOX40 se pueden probar en monos.

Solamente siete de 500 clones positivos a OX40 anti-humano obtenidos usando los protocolos de fusión convencionales, exhibieron las propiedades de activación de OX40, incluyendo pero no limitado a, la capacidad de bloquear la generación de Tr1 que producen IL-10 y función supresora de nTreg como se describe en la Tabla 1.

TABLA 1 Lista de anticuerpos monoclonales específicos de OX40 Los clones de hibridoma 106-222 y 119-122 se seleccionaron con base en tres criterios 1. Inhiben la generación de células Tr1 de células T CD4+ (Treg inducibles) 2. Invierten la función supresora de las células nTreg FOXP3* 3. Exhiben inhibición dependiente de la dosis de cierre de células Tr1 e inversión de la función de Treg FOXP3+ Anticuerpos Quiméricos y Humanizados La humanización (también llamada reorganización o inserción de CDR) es una técnica establecida para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos monoclonales de fuentes xenogeneicas (incluyendo pero no limitado a roedores) y para mejorar su activación del sistema inmune humano. Aunque se conocen los mecanismos de producción de anticuerpo monoclonal modificado genéticamente usando las técnicas de biología molecular, la inserción simple de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) en armazones humanos no siempre reconstituye la afinidad de enlace y la especificidad del anticuerpo monoclonal original.

Para humanizar un anticuerpo, el diseño del anticuerpo humanizado llega a ser la etapa critica en la reproducción de la función de la molécula original. Este diseño incluye varias opciones: las extensiones de las CDR, los armazones humanos a usar y la sustitución de los residuos deel anticuerpo monoclonal de roedor en las regiones de armazón humano (retromutaciones). Las posiciones de estas retromutaciones se han identificado principalmente por análisis de secuencia/estructural o por análisis de un modelo de homología de la estructura 3D de la región variable.

Recientemente, se han utilizado genotecas de fago para variar los aminoácidos en las posiciones elegidas. De manera similar, muchos procedimientos se han utilizado para elegir los armazones humanos más adecuados en los cuales injertar las CDRs de roedor. Los experimentos tempranos utilizaron un subconjunto limitado de anticuerpos monoclonales humanos bien caracterizados (frecuentemente pero no siempre donde la estructura estuvo disponible), sin considerar la identidad de secuencia con el anticuerpo monoclonal de roedor (el procedimiento de armazones fijos asi llamado). Algunos grupos usan regiones variables con alta identidad de secuencia de aminoácido con las regiones variables de roedor (mejor ajuste o igualación de homología); otros usan secuencias de consenso o línea germinal mientras que aún otros seleccionan fragmentos de las secuencias de armazón dentro de cada región variable de cadena ligera o pesada de diversos anticuerpos monoclonales humanos diferentes. También hay procedimientos para la humanización desarrollada la cual reemplaza los residuos de roedor de superficie con los residuos más comúnes encontrados en anticuerpos monoclonales humanos ("recapado" o "chapado") y aquellos los cuales usan diferentes definiciones de las extensiones de las CDRs. Los anticuerpos humanizados se describen a continuación. Sin embargo, un anticuerpo quimérico que comprende las regiones variables pesada y ligera de las SEQ ID NOs: 4 y 10, o, SEQ ID NOs: 16 y 22 también se describen en la presente.

Los anticuerpos monoclonales humanizado se derivaron del anticuerpo anti-OX40 murino.

El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una cadena pesada variable CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 13. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una cadena pesada variable CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 14. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una cadena pesada variable CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o 15.

El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una cadena ligera variable CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o 19. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una cadena ligera variable CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 20. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una cadena ligera variable CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o 21.

El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 o 23, o una secuencia de aminoácidos con al menos 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 1 o 23. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.: 5 o 17, o una secuencia de aminoácidos con al menos 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o 17.

El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una cadena ligera variable codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 12 o 24, o una secuencia de ácido nucleico con al menos 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o 24. El anticuerpo anti-OX40 humanizado aislado puede tener una cadena pesada variable codificada por una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 6 o 18, o una secuencia de ácido nucleico con al menos 90 por ciento de identidad con las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o 18.

Expresión de anticuerpos anti-OX4Q humanizados Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención se puede preparar por expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula huésped. Para expresar un anticuerpo de manera recombinante, una célula huésped se transfectó con uno o más vectores de expresión recombinantes que portan fragmentos de ADN que codifican las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina del anticuerpo de modo que las cadenas ligera y pesada se expresan en la célula huésped y, preferiblemente, se segregan en el medio en el cual las células huéspedes se cultivaron, del medio los anticuerpos se pueden recuperar. Las metodologías de ADN recombinante estándares se usan para obtener los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo, incorporar estos genes en los vectores de expresión recombinantes e introducir los vectores en células huéspedes, tales como aquellas descritas en Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y en la Patente de Estados Unidos No. 4,816,397 de Boss et al.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo y variantes se pueden producir a partir de una variedad de células animales, preferiblemente de células de mamífero, con células murinas y humanas siendo particularmente preferidas. Además, los sistemas de expresión de ADN recombinante podrían incluir aquellos que utilizan células huéspedes y constructos de expresión que se han modificado genéticamente para producir altos niveles de una proteína particular. Tales células huéspedes y constructos de expresión pueden incluir Escherichia coli; constructos de expresión de albergue derivados de plásmidos o virus (bacteriófago); levadura tal como Saccharomyces cerevisieae o Pichia pastoras que albergan constructos de expresión episomal o cromosomalmente integrados; células de insectos y virus tal como células Sf9 y baculovirus; y células de mamífero que albergan constructos de expresión episomal o cromosomalmente integrados (que incluyen pero no se limitan a, retrovirales) (tales métodos, por ejemplo, se pueden ver del manuscrito Verma et al., J. Immunol. Methods 216:165-181 , 1998). Los anticuerpos también se pueden producir en plantas (tales métodos, por ejemplo, se pueden ver de la Patente de Estados Unidos No. 6,046,037; Ma et al., Science 268:716-719, 1995) o por tecnología de expresión en fagos (tales métodos, por ejemplo, se pueden ver de Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994).

Los anticuerpos anti-OX40 humanos que exhiben un nivel de actividad y especificidad/afinidad de enlace que son deseables se pueden manipular adicionalmente por técnicas de ADN recombinante estándares, por ejemplo para convertir los genes de región variable a gen de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento Fab o a un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se enlaza operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazante flexible. El término "operativamente enlazado", como se utiliza en este contexto, se entiende que significa que los dos fragmentos de ADN se unen de modo que las secuencias de aminoácido codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en armazón.

En otro aspecto, el ADN aislado que codifica la región VH se puede convertir a un gen de cadena pesada de longitud completa enlazando operativamente el ADN codificante de VH a otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de cadena pesada (CH1 , CH2, y CH3). Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humanos se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de lgG-1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD y cualquier variante alotípica en la presente como se describe en Kabat (, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), pero muy preferiblemente es una región constante de lgG1 o lgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN codificante de VH se puede enlazar operativamente a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante de cadena pesada CH1.

Además, un anticuerpo humanizado unido al antígeno de superficie puede interactuar con células que portan FcR. Tal interacción puede producir función efectora tal como ADCC y/o mejorar la señalización debido a la reticulación mediada por Fe. La interacción puede ser benéfica o dañina para la terapia. Tales efectos secundarios dañinos incluyen escalofríos, fiebre, hipotensión, y en algunos casos, disnea (Thistlethwaite JR Jr., Cosimi AB, Delmonico FL, et al.).

Ciertos efectos dañinos pueden originarse en el complejo de proteína encontrado en la superficie de una célula T. En la activación de las células T, el complejo de proteína llega a estar involucrado en la transducción de señales generadas vía un receptor de antígeno. En breve, la activación de las células T inicia una cascada de eventos los cuales incluyen la reticulación mejorada del receptor de antigeno. La reticulación del receptor puede contribuir a fuerte señalización mitogénica que conduce a la inducción de ciertas citocinas tal como factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleucina-2 (IL-2) e interferón gamma (IFN-y). Estas citocinas se sabe que son tóxicas si se generan en grandes cantidades.

Por ejemplo, los mAbs anti-CD3 se utilizan actualmente en el tratamiento de enfermedad autoinmune incluyendo diabetes mellitus tipo I en la cual las células T median el ataque contra islotes pancreáticos, productores de insulina (Kaufman A, and Herold K.Anti-CD3 mAbs for treatment of type 1 diabetes Diabetes Metab Res Rev 2009; 25: 302-306). Los anticuerpos anti-CD3 se sabe que inhiben la lisis de objetivos por células T y mejoran la reticulación de la CDR receptora de antígeno. Además, junto con su potente actividad mitogénica, el anticuerpo anti-CD3 se sabe que es un potente inductor de citocinas, específicamente, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interleucina-2 (IL-2) e interferón gamma (IFN-y). La enorme liberación de citocinas, particularmente TNF-a de células T en respuesta al fármaco (Chatenoud L.) produce efectos tóxicos. Estos efectos secundarios indeseables se han atribuido a la reticulación de células T que portan moléculas de CD3 y las células que portan FcR que enlazan la porción Fe de los anticuerpos. La reticulación activa tanto las células T como las células que portan FcR conduciendo a la liberación masiva de citocinas como se mencionó previamente.

De manera similar, los efectos secundarios potenciales indeseables podrían resultar usando anticuerpos anti-OX40. Por ejemplo, los anticuerpos anti-OX40 los cuales enlazan células que expresan OX40 también pueden enlazar células que portan FcR y activar la producción de citocinas que pueden ser benéficas o dañinas para los pacientes tratados con el anticuerpo. Para superar este problema potencial, se han diseñado y presentado en la presente métodos para la mutación de la porción FcR de los anticuerpos anti-OX40 para evitar los efectos tóxicos y proporcionar mutaciones a la porción FcR lo cual puede ser deseable.

Se conoce el sitio de lgG1 humana que interactúa con FcR (CD16, CD32 y CD64). Mapea el dominio CH2 superior. Los aminoácidos más importantes son los dos residuos Leu en las posiciones 234 y 235. Mutando estos dos residuos a dos residuos Ala, son abolidas las interacciones de lgG1 a todas las FcRs. El anti-CD3 humanizado incorpora estas mutaciones (KuOKT3AA), es un fármaco mucho más seguro y tiene un mecanismo de acción que es diferente de aquel de HuOKT3. Ver por ejemplo, Patente de Estados de Unidos No. 6,491 ,916, incorporada para referencia en su totalidad.

Las posiciones del muíante AA se muestran como sigue: — A— P— E— L— L— G— G— P— CH2 superior de lgG1 tipo silvestre — A— P— E— A— A---G— G— P— CH2 superior de IGG1 de Muíante AA Hu222AA y Hu122AA descritos en la presente pueden contener estas mutaciones. Si el sistema de ensayo contiene células que portan FcR, se puede ver la diferencia entre la tipo silvestre y el muíante AA. De otra manera, los dos anticuerpos deben comportarse igual.

El ADN aislado que codifica la región de VL se puede convertir a un gen de cadena ligera de longitud completa (así como también un gen de cadena ligera de Fab) enlazando operativamente el ADN codificante de VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera humanos se conocen en la técnica (ver por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones se pueden obtener por amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se enlazan operativamente a otro fragmento que codifica un enlazante flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly.sub.4-Ser).sub.3, de modo que las secuencias de VH y VL se pueden expresar como una proteína de cadena única contigua, con las regiones de VL y VH unidas por el enlazante flexible (ver por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; cCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554.

Se contemplan las modificaciones de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos descritos en la presente. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleótido apropiados en el ácido nucleico de anticuerpo, o por síntesis de péptido. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de supresión, inserción, y sustitución se hace para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. Las alteraciones de aminoácido se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos de anticuerpo objeto en el momento que se hace la secuencia.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para la mutagénesis es llamado "mutagénesis de barrido de alanina" como se describe por Cunningham and Wells (1989) Science, 244: 1081 -1085. Aquí, se identifica un residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplaza por un aminoácido neutral o negativamente cargado (muy preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígeno. Aquellas ubicaciones de aminoácido que demuestran la sensibilidad funcional a las sustituciones luego se refinan introduciendo variantes adicionales u otras en, o para, los sitios de sustitución. Por consiguiente, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácido se predetermina, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis aleatoria o de barrido ala se conduce en la región o codón objetivo y las inmunoglobulinas expresadas se seleccionan para la actividad deseada.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de amino- y/o carboxilo-terminal que varían de longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cientos o más residuos, asi como también inserciones de intersecuencia de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al N- o C-término del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido el cual incrementa la vida media en suero del anticuerpo. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Tal alteración incluye la supresión de una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables, pero las alteraciones de FR también se contemplan. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 de la Patente de Estados Unidos No. 7,812,133, Col. 43, Is. 55 a Col. 44, I. 49, incorporada en la presente para referencia, y bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones resultan en un cambio de la actividad biológica, entonces los cambios más sustanciales, denominadas "sustituciones ejemplares" en la Tabla 1 , o como se describe adicionalmente a continuación con referencia a las clases de aminoácido, se pueden introducir y los productos se seleccionan.

Además, las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se realizan seleccionando las sustituciones que difieren significativamente de su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación helicoidal u hoja, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que se presentan naturalmente se dividen en grupos basados en propiedades de cadena lateral comunes: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutrales: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe. Las sustituciones no conservadoras ocasionarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Para expresar los anticuerpos, o porciones de anticuerpo descritas en la presente, los ADNs que codifican cadenas ligera y pesada de longitud completa o parcial, obtenidos como se describe anteriormente, se insertan en vectores de expresión de modo que los genes son operativamente enlazados a secuencias de control transcripcionales o traduccionales. En este contexto, el término "operativamente enlazado" se propone que signifique que un gen de anticuerpo es ligado en un vector de modo que las secuencias de control transcripcionales y traduccionales dentro del vector sirven para su función propuesta de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y secuencias de control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula huésped de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en un vector separado o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión por métodos estándares (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el vector y fragmento de gen de anticuerpo, o ligación de extremo romo si no están presentes sitios de restricción).

Como se muestra en la FIG. 23, tal estructura esquemática del vector de expresión para anticuerpo de lgG1/kappa Hu106-222. Procediendo en el sentido de las manecillas del reloj desde el sitio Salí en la parte superior, el plásmido contiene la unidad de transcripción de cadena pesada que inicia con el promotor temprano inmediato principal de citomegalovirus humano (CMV) y mejorador (promotor de CMV) para iniciar la transcripción del gen de cadena pesada de anticuerpo. El promotor de CMV es seguido por el exón de VH, una secuencia genómica que contiene la región constante de cadena pesada gamma-1 humana que incluye los exones CH1 , bisagra, CH2 y CH3 con los intrones que intervienen, y el sitio de poliadenilación que sigue el exón CH3. Después de la secuencia de gen de cadena pesada, la unidad de transcripción de cadena ligera comienza con el promotor de CMV, seguido por el exón de VL y una secuencia genómica que contiene el exón de región constante de cadena kappa humana (CL) con parte del intrón que le precede, y el sitio de poliadenilación que sigue el exón CL. El gen de cadena ligera luego es seguido por el promotor temprano de SV40 (promotor de SV40), el gen de xantina guanina fosforribosil transferasa de E. coli (gpt), y un segmento que contiene el sitio de poliadenilación de SV40 (sitio de poli(A) de SV40). Finalmente, el plásmido contiene una parte del plásmido pUC19, que comprende el origen bacteriano de replicación (pUC ori) y gen de beta-lactamasa (beta lactamasa). Las ubicaciones de sitios relevantes de enzima de restricción se muestran en la figura.

El vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de modo que el péptido señal se enlaza en armazón al amino término del gen de cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no de inmunoglobulina).

Como se señaló anteriormente, además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" se propone que incluya promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Se apreciará que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras puede depender de tales factores como la elección de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión deseado de la proteína, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células huéspedes de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o mejoradores derivados de citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/mejorador de CMV), Virus de Simio 40 (SV40)(tal como el promotor/mejorador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para la descripción adicional de elementos reguladoras virales, y secuencias de los mismos, ver por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 5,168,062 de Stinski, Patente de Estados Unidos No. 4,510,245 de Bell et al. y Patente de Estados Unidos No. 4,968,615 de Schaffner et al., Patente de Estados Unidos No. 5,464,758 de Bujard et al. y Patente de Estados Unidos No. 5,654,168 de Bujard et al.

Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huéspedes (por ejemplo,' orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionares. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huéspedes en las cuales el vector se ha introducido (ver por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la cual el vector se ha introducido. Los genes marcadores seleccionabas preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en dhfr.sup.-células huéspedes con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera son transfectados en una célula huésped por técnicas estándares. Las diversas formas del término "transfección" se proponen que abarquen una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque teóricamente es posible expresar los anticuerpos de la invención en células huéspedes ya sea procariotas o eucariotas, la expresión de anticuerpos en células eucariotas, y muy preferiblemente células huéspedes de mamífero, es la más preferida debido a que tales células eucariotas, y en particular células de mamífero, tienen más probabilidad que las células procariotas se ensamblen y segreguen un anticuerpo ¡nmunológícamente activo y apropiadamente plegado. Las células huéspedes de mamífero para la expresión de los anticuerpos recombinantes descritos en la presente incluyen células de Ovario de Hámster Chino (células CHO)(tales como células dhfr-CHO, descritas en Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los genes de anticuerpo que codifican vectores de expresión recombinantes se introducen en células huéspedes de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células huéspedes por un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huéspedes o, secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual las células huéspedes crecen. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo usando métodos de purificación de proteína estándares.

Las células huéspedes también se pueden utilizar para producir porciones de anticuerpos intactos, tales como fragmentos Fab o moléculas de scFv. Se entenderá que las variaciones en el procedimiento anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula huésped con ADN que codifica ya sea la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo de esta invención. La teconología de ADN recombinante también se puede usar para remover algo o todo el ADN que codifica cualquiera o ambas cadenas ligera y pesada que no son necesarias para el enlace a OX40. Las moléculas expresadas de tales moléculas de ADN truncadas también se abarcan por los anticuerpos de la invención. Además, se pueden producir anticuerpos bifuncionales en los cuales una cadena pesada y una ligera están en un anticuerpo de la invención y la otra cadena pesada y ligera es específica para un antígeno diferente de OX40 reticulando un anticuerpo de la invención a un segundo anticuerpo por métodos de reticulación química estándar.

Composiciones Farmacéuticas y Administración Farmacéutica Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como también combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservadores o amortiguadores, los cuales mejoran la vida en anaquel o efectividad del anticuerpo o porción de anticuerpo.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se pueden incorporar en una composición farmacéutica adecuada para la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semi-sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y aplicación terapéutica propuestos. Las composiciones típicas están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a aquellas usadas para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. El anticuerpo se puede administrar por inyección o infusión intravenosa o inyección intramuscular o subcutánea.

La ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un portador que protegerá el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones son patentados o generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Los compuestos activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones. En ciertas modalidades, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención se co-formula con y/o co-administra con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en los cuales la inactivación de OX40 es nociva. Por ejemplo, un anticuerpo anti-OX40 o porción de anticuerpo de la invención se puede co-formular y/o co-administrar con uno o más anticuerpos adicionales que enlazan otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que enlazan otras citocinas o que enlazan moléculas de superficie celular). Además, uno o más anticuerpos de la invención se pueden usar en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias. Se apreciará por el profesionista experto que cuando los anticuerpos de la invención se usan como parte de una terapia de combinación, una dosificación menor de anticuerpo puede ser deseable que cuando el anticuerpo solo se administra a un sujeto (por ejemplo, un efecto terapéutico sinergista se puede lograr a través del uso de terapia de combinación la cual, a su vez, permite el uso de una dosis inferior del anticuerpo para lograr el efecto terapéutico deseado.

Los anticuerpos descritos en la presente, o porciones de enlace de antígeno de los mismos se pueden usar solos o en combinación para tratar tales enfermedades. Se debe entender que estos anticuerpos o porción de enlace de antígeno de los mismos se pueden usar solos o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, el agente adicional se selecciona por el artesano experto para su propósito propuesto. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como siendo útil para tratar la enfermedad o afección que es tratada por el anticuerpo señalado en la presente. El agente adicional también puede ser un agente el cual imparte un atributo benéfico a la composición terapéutica por ejemplo, un agente el cual rige la viscosidad de la composición.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por período de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo; y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquiera de los efectos tóxicos o nocivos del anticuerpo o porción de anticuerpo se compensa por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado.

Los regímenes de dosificación se pueden ajusfar para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, un bolo único se puede administrar, diversas dosis divididas se pueden administrar con el tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas farmacéuticas unitarias para la fácil administración y uniformidad de dosificación. La forma farmacéutica unitaria como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas farmacéuticas unitarias se dicta por y es directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular a ser logrado, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

EJEMPLO I Los anticuerpos monoclonales de lgG1/kappa 106-222 quiméricos y humanizados (Ch222 y Hu222, respectivamente) se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo de los transfectantes estables NSO correspondientes usando una columna de proteína A como se describe en los Apéndices A y B. Hu222 se eluyó de la columna por dos maneras diferentes. Brevemente, Hu222 Lote I se eluyó con amortiguador de bajo pH y el Lote II con Amortiguador de Elución de Ag/Ab Ligero de Pierce. El rendimiento de Hu222 fue mejor cuando el amortiguador de pH bajo se utilizó para elución. Ch222 se eluyó de la columna con Amortiguador de Elución de Ag/Ab Ligero.

Los anticuerpos de Hu222 Lote I y II purificados se caracterizaron por SDS-PAGE junto con 106-222 de ratón de acuerdo con los procedimientos estándares. Cinco pg de cada anticuerpo se analizaron bajo condiciones de reducción. Como se muestra en la FIG. 21 , cada uno de los anticuerpo Hu222 Lote I y II está comprendido de una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kD. La pureza de los anticuerpos Hu222 Lote I y II parece ser más de 95%.

La contaminación por endotoxina en los anticuerpos humanizados se analizó con kit QCL-1000 de Lisado de Amebocitos de Limulus de Lonza (LAL). El nivel de endotoxina fue menor que 0.5 EU/mg de proteína para ambos anticuerpos Hu222 Lote I y Lote II.

Caracterización de Hu106-222 para enlazar células IJOX40 El enlace de anticuerpos 106-222, Ch106-222 y Hu106-222 de ratón a OX40 se examinó en un ensayo de enlace de FACS con células L/hOX40 esencialmente de acuerdo con el protocolo suministrado por la Dr. Laura Bover. Los anticuerpos enlazados a células L/hOX40 se detectaron con anticuerpo de IgG anti-ratón de cabra etiquetado con PE (para 106-222 de ratón) o anticuerpo de IgG anti-humano de cabra etiquetado con PE (para Ch106 y Hu106).

La FIG. 22 muestra el análisis de anticuerpos 106-222, Ch106 y Hu 106-222 (Lote II) de ratón para enlazar células L/OX40. La curva de titulación de Hu106-222 (Lote II) fue casi idéntica a aquella de Ch106-222, indicando que la afinidad de enlace de antigeno de 106-222 de ratón es retenida en Hu106-222. La curva de titulación de 10-222 de ratón fue similar a aquella de Ch106 y Hu106; sin embargo, debido a la diferencia de los anticuerpos secundarios, los datos solamente indican que la afinidad de 106-222 de ratón es similar a aquella de Hu106-222.

La FIG. 24 muestra la comparación entre los anticuerpos Hu106-222 Lote I y II para enlazar células L/hOX40. Aunque es necesario el análisis adicional, la afinidad de los dos lotes de Hu-106-222 pareció ser similar, si no idéntica, entre sí. Por lo tanto, la elución ácida de Hu106-222 de una columna de proteína A no parece afectar su afinidad.

Purificación de Ch106-222 El transfectante estable NSO C8 creció en 500 mi de medio de Hibridoma SFM de Invitrogen en una botella de cultivo rotatoria hasta el agotamiento. El cultivo se giró en Tubo de Centrífuga de 250 mi de Corning (Cat# 430776) en Centrífuga Allegra X-12R de Beckman Coulter (2000 RPM durante 15 min). El sobrenadante de cultivo se cargó sobre una columna GE Healthcare HíTrap MabSelect SuRe de 1 mi (Cat# 1 1-034-95) usando una bomba Pharmacia P1. La columna se lavó con solución salina amortiguada con Tris (Pierce, Cat# 28379) y se eluyó con Amortiguador de Elución de Ag/Ab Ligero de Pierce (Cat # 21027). Las fracciones (aproximadamente 1 mi) se colectaron y se leyó su OD a 280 nm.

Las fracciones 3 a 6 se agruparon (volumen = 3.0 mi, OD a 280 nm = 0.14). Las fracciones agrupadas se desalaron sobre una columna de medio Sephadex G25 de 10 mi en PBS. Las fracciones de 1 mi se colectaron.

Las fracciones 6 a 9 se agruparon (volumen = 3.0 mi, OD a 280 nm = 0.1 1 ). Las fracciones agrupadas se dializaron durante la noche en PBS. Después de la diálisis, el volumen fue 3.0 mi y la OD a 280 nm fue 0.19. Esta preparación es llamada Ch106, lote 8/31/09, con una concentración de 0.13 mg/ml.

Purificación de Hu106-222 El transfectante estable NS0 1-C6 creció en 500 mi de medio de Hibridoma SFM de Invitrogen en una botella de cultivo rotatoria hasta el agotamiento. El cultivo se giró en Tubo de Centrífuga de 250 mi de Corning (Cat# 430776) en Centrífuga Allegra X-12R de Beckman Coulter (2000 RPM durante 15 min).

Lote 1 : 150 mi del sobrenadante de cultivo se cargaron sobre una columna GE Healthcare HiTrap MabSelect SuRe de 1 mi (Cat# 11-034-95) usando una bomba Pharmacia P1. La columna se lavó con PBS y el anticuerpo enlazado se eluyó con 0.1 M glicina-HCI, 0.1 M NaCI (pH 3.0). Las fracciones eluidas (1 mi cada una) se colectaron en tubos que contienen 50 µ? de 1 M Tris-HCI (pH 8.0).

La fracciones 2 a 5 se agruparon (volumen = 4.2 mi, OD a 280 nm = 1.59). Las fracciones agrupadas se dializaron durante la noche en PBS. Después de la diálisis, el volumen fue 4.2 mi y la OD a 280 nm fue 1.54. La solución de anticuerpo (lote 9/18/09 I; 1.1 mg/ml) se esterilizó en filtró.

Lote II: El sobrenadante de cultivo restante (350 mi) se cargó en una columna GE Healthcare HiTrap MabSelect SuRe de 1 mi usando una bomba Pharmacia P1. La columna se lavó con solución salina amortiguada con Tris y se eluyó con Amortiguador de Elución de Ag/Ab Ligero. Las fracciones (aproximadamente 1 mi) se colectaron y su OD se leyó a 280 nm.

Las fracciones 3 a 7 se agruparon (volumen = 4.2 mi, OD a 280 nm = 1.22). La columna se lavó de nuevo con solución salina amortiguada con Tris y el anticuerpo se eluyó con 0.1 M glicina-HCI, 0.1 M NaCI (pH 3.0) para examinar si la elución por Amortiguador de Elución de Ag/Ab Ligero fue eficiente.

Las fracciones 3 a 7 eluidas con Amortiguador de Elución de Ag/Ab Ligero se agruparon y desalaron sobre una columna de medio Sephadex G25 de 10 mi en PBS. Las fracciones de 1 mi se colectaron.

Las fracciones 5 a 8 se agruparon (volumen = 4.0 mi, OD a 280 nm = 1.12). Las fracciones agrupadas se dializaron durante la noche en PBS. Después de la diálisis, el volumen fue 4.0 mi y la OD a 280 nm fue 1.12. La solución de anticuerpo (lote 9/18/09 II; 0.8 mg/ml) se esterilizó en filtro.

El método de elución de alta sal con Amortiguador de Elución de Ag/Ab Ligero de Pierce no fue tan eficiente como el método de pH bajo para eluir el anticuerpo de lgG1 humano enlazado de la columna de proteína A. Como los anticuerpos no se eluyeron en un pico agudo con Amortiguador de Elución de Ag/Ab Ligero, fue necesario agrupar muchas fracciones para colección de IgG eluida y desalar las fracciones agrupadas antes de la diálisis. El pobre perfil de elución con Amortiguador de Elución de Ag/Ab Ligero y la etapa de purificación extra afectaron el rendimiento del anticuerpo. Se contempló que el método de elución de alta sal se usa solamente si la IgG a ser purificada es inestable al ácido.

EJEMPLO II Purificación de anticuerpos C 19-122 y Hu119-122 El anticuerpo monoclonal de lgG1/kappa 1 19-122 quimérico (Ch1 19) se purificó del sobrenadante de cultivo del transfectante estable NSO correspondiente (clon G11) crecido en medio de Hibridoma-SFM (Invitrogen) usando una columna de proteína A. Después de la elución con Amortiguador de Elución de Ag/Ab Ligero de Pierce, el amortiguador de Ch1 19 se intercambió a PBS por filtración en gel y luego diálisis. La concentración de Ch1 19 fue 0.21 mg/ml.

El anticuerpo monoclonal de lgG1/kappa 119-122 humanizado (Hu122) se purificó del sobrenadante de cultivo del transfectante estable NSO correspondiente (clon 2F5) crecido en medio de Hibridoma-SFM usando una columna de proteína A. El Hu 106-222 se eluyó de la columna con amortiguador de bajo pH, se neutralizó con 1 M Tris-HCI (pH 8.0), y se dializó en PBS. La concentración de Hu122 fue 1.6 mg/ml.

El Hu106-222 purificado se caracterizó por SDS-PAGE junto con 1 19-122 de ratón de acuerdo con los procedimientos estándares. Cinco pg de cada anticuerpo se analizaron bajo condiciones de reducción. Como se muestra en la FIG. 25, Hu1 19-122 está comprendido de una cadena pesada con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y una cadena ligera con un peso molecular de aproximadamente 25 kD. La pureza de Hu1 19 pareció ser más de 95%.

Caracterización de Hu119-122 para enlazar células L/hOX40 El enlace de anticuerpos 1 19-122, Ch1 19-122 y Hu1 19-122 de ratón a OX40 se examinó en un ensayo de enlace de FACS con células L/OX40 esencialmente de acuerdo con el protocolo suministrado por la Dr. Laura Bover. Los anticuerpos enlazados a células L/OX40 se detectaron con anticuerpo de IgG anti-ratón de cabra etiquetado con PE (para 1 19-122 de ratón) o anticuerpo de IgG anti-humano de cabra etiquetado con PE (para CM 19-122 y Hu1 19-122).

La FIG. 26 muestra el resultado del análisis de FACS. La curva de titulación de Hu1 19-122 fue similar a aquella de Ch1 19-122, sugiriendo que la afinidad de enlace de antígeno de 1 19-122 de ratón es retenida en Hu1 19-122. Sin embargo, los valores de MCF a concentraciones de anticuerpo mayores de CM09-122 y Hu1 19-122 no caen rectos en las curvas correspondientes. Después de ajusfar las condiciones experimentales, el análisis de FACS se debe repetir.

EJEMPLO III Para evaluar la capacidad de nuestros anticuerpos OX40 antihumanos humanizados para mejorar la proliferación de células T, se realizaron ensayos de proliferación usando células CD32-L recubiertas con anti-CD3 y células T CD4+ na'íve recientemente clasificadas. La FIG. 27 muestra que el clon de mAb OX40 anti-humano humanizado 1 19-122 (Hu122), y su anticuerpo mutado de enlace de FcR (Hu122-AA) mejoraron la proliferación de células T CD4+ na'íve. Hu122 produjo mejor actividad estimulante de células T en comparación con mAb OX40 anti-humano de ratón parental (122 de ratón) (FIG. 27).

El clon de mAb OX40 anti-humano humanizado mutado de enlace de FcR 106-222 (Hu222-AA) y clon de mAb OX40 anti-humano quimérico 106-222 (Ch222) mejoraron la proliferación de células T CD4+ na'íve estimulada con anti-CD3. Estos anticuerpos tienen actividad estimulante similar en comparación con el mAb OX40 anti-humano de ratón parental (106-222 de ratón). Sin embargo, el Ab OX40 anti-humano completamente humanizado, Hu106, no mejora la proliferación de células T (FIG. 28).

Para evaluar la capacidad de anticuerpos OX40 anti-humanos humanizados para bloquear la función supresora de células T reguladoras (Tregs) CD4+, se realizaron ensayos de proliferación utilizando células T CD4+ na'íve recientemente clasificadas y Tregs CD4+CD25altaCD127baja. Se encontró que el anticuerpo quimérico Ch122 y anticuerpo humanizado mutado de enlace de Fe (Hu122-AA) exhibieron mejor potencia que el mAb OX40 antihumano de ratón parental (122 de ratón) en el bloqueo de la función supresora de Treg CD4+ (FIGs. 29A y 29B).

En el experimento de la FIG. 27, las células T na'íve CD4+CD25bajaCD127+CD45RO"CD45RA+ recientemente clasificadas se estimularon con células L que expresan CD32 (CD32-L) recubiertas con 4 concentraciones de anticuerpos anti-CD3 más 2 pg/ml de anticuerpos 119 de clon de Ab OX40 anti-humano o anticuerpos de control. Tres días después de la estimulación, se agregó radioisótopo tritio y se cultivó por 16-18 horas adicionales antes de la recolección celular. Los datos son un representativo de los experimentos de dos donantes. El ligando de hOX40 que expresa células CD32-L (CD32-L/hOX40L) sirve como control positivo, mientras que la lgG1 humana y de ratón sirven como controles negativos.

En el experimento de la FIG. 28, las células T CD4+ na'íve recientemente clasificadas se estimularon con células CD32-L recubiertas con 4 concentraciones de anticuerpos anti-CD3 más 2 pg/ml de anticuerpos 106-222 de clon de mAb OX40 anti-humano (Hu222) o anticuerpos de control. Tres días después de la estimulación, se agregó el radioisótopo tritio y se cultivó por 16-18 horas adicionales antes de la recolección celular. Los datos son representativos de experimentos de dos donantes. CD32-L/hOX40L sirve como control positivo, mientras que la lgG1 humana y de ratón sirven como controles negativos.

En el experimento de las FIGS. 29A y 29B, las células T CD4+ na'íve recientemente clasificadas se cultivaron en la presencia de Tregs CD4+CD25altaCD127baja a tres relaciones de Tregs:T efectoras y se estimularon con células CD32-L recubiertas con 0.2 pg/ml de anticuerpos anti-CD3 más 10 pg/ml de anticuerpos 119-122 de clon de mAb OX40 anti-humano o anticuerpos de control. Tres días después de la estimulación, se agregó el radioisótopo tritio y se cultivó por 16-18 horas adicionales antes de la recolección celular. Los datos son representativos de tres experimentos. CD32-L/hOX40L sirve como control positivo, mientras que la lgG1 humana y de ratón sirven como controles negativos.

EJEMPLO IV Puesto que los anticuerpos encontrarán células mononucleares de sangre periférica totales (PBMCs) cuando se administran a pacientes vía inyección intravenosa, se probó la capacidad de nuestros anticuerpos OX40 anti-humanos para estimular la proliferación de células T usando PBMCs como células que presentan antígeno (APCs) nuestros ensayos de proliferación. Sin embargo, se obtuvieron datos altamente variables con nuestros mAbs OX40 anti humanos de ratón cuando se usan PBMCs como APCs que no se ve cuando se usan monocitos como APCs, sugiriendo que nuestros anticuerpos requieren algún tipo de reticulación para la actividad. Para probar esta posibilidad, las placas se recubrieron con nuestro mAbs OX40 anti-humanos y anti-CD3, se lavaron, y se utilizaron para estimular la proliferación de células T CD4+ o CD8+ en la ausencia de células auxiliares. Las FIGS. 30A-30C muestran los resultados que los anticuerpos OX40 antihumanos mejoran la proliferación de células T CD4+ y CD8+. 1x105 células T naíve CD4+CD25 ajaCD45RO-CD45RA+ recientemente clasificadas (FIG. 30A) o células T CD3+CD8+ (FIG. 30B) se estimularon con anti-CD3 de unión a la placa (3 Mg/ml) y mAb OX40 antihumano de ratón (2 Mg/ml). Se agregó timidina tritiada en el tercer día de cultivo y las células se recolectaron después de otras 15 horas de incubación. La proliferación de células T se evaluó por incorporación de timidina. Los mAbs OX40 anti-humanos se derivaron de tres fusiones de hibridoma. Los números después del número de fusión denotan un anticuerpo específico. lgG1 de ratón y 1 19-42 sirvieron como controles negativos. Cada tratamiento se realizó por triplicado. Se muestran los datos representativos de 4 donantes de células T. (FIG. 30C) Todas las tres versiones de mAbs OX40 anti-humanos humanizados [Hu106-222 y Hu1 19-122; Hu106-222AA y Hu1 19-122AA (AA denota que dos de los residuos de enlace de Fe fueron mutados al aminoácido alanina); y Ch1 19-122 (similar al 1 19-122 humanizado excepto que se mantuvo la región variable de ratón "paratope")] estimularon la proliferación de células T CD4+ naíve. Anti-CD28 sirvió como un control positivo.

Las FIGS. 30A y 30B muestran que los mAbs OX40 antihumanos de ratón de unión a la placa estimulan de manera potente la proliferación de células T CD4+ naíve y células T CD8+ por un rango de 10 a 40 veces. Se extendieron los estudios a nuestros mAbs OX40 anti-humanos humanizados y se encontró que las tres versiones de nuestros anticuerpos humanizados, si son completamente humanizados, quiméricos o tienen mutantes AA en los cuales los residuos responsables del enlace al receptor de Fe se alteraron a alanina, fueron potentes estimulantes de proliferación de células T CD4+ naíve (FIG. 30C).

Las FIGS. 31 A y 31 B muestran que los anticuerpos OX40 antihumanos humanizados y de ratón requieren reticulación para mejorar la proliferación de células T. Las células T CD4+ naíve recientemente clasificadas se estimularon con anti-CD3 de unión a la placa (3 pg/ml) más mAbs OX40 anti-humanos humanizados solubles o de unión a la placa (2 pg/ml) en la ausencia de células auxiliares. La timidina tritiada se agregó en el tercer día del cultivo y las células se recolectaron después de otras 15 horas de incubación. La proliferación de células T se evaluó por incorporación de timidina. lgG1 de ratón y anti-CD28 sirvieron como controles negativo y positivo, respectivamente. Se muestran los datos representativos de dos donantes. Las células T CD4+ naíve se estimularon con anti-CD3 de unión a la placa en la ausencia de células auxiliares. Al siguiente día, el mAb OX40 antihumano 1 19-122 (2 pg/ml) se agregó solo o en combinación con una cantidad igual de un anticuerpo secundario contra FC. La proliferación celular se evaluó como se describe en la FIG. 31A.

La potencia de nuestros mAbs OX40 anti-humanos humanizados Hu106-222 y Hu 19-122 fue comparable con aquella de anti-CD28. En contraste, cuando el anticuerpo OX40 anti-humano soluble se agregó al cultivo de células T, el efecto estimulante se abolió. (FIG. 31A). Sin embargo, cuando el mAb OX40 anti-humano soluble 119-122 se agregó junto con una IgG anti-ratón de cabra de fragmento F(ab')2, el anticuerpo secundario específico de fragmento Fe, el efecto estimulante se restauró (FIG. 31 B). Estos resultados demuestran que los mAbs OX40 anti-humanos requieren la reticulación para sus actividades biológicas.

Para evaluar la capacidad de nuestros mAbs OX40 antihumanos agonistas para bloquear la función supresora de Tregs . alta CD4 CD25 CD12T, se realizaron ensayos de proliferación en la presencia de células T efectoras CD4+CD25bajaCD127+CD45RO+ (Teff) y nTregs CD4+. Usando nuestro sistema de unión a la placa en el cual los mAbs OX40 antihumanos junto con anti-CD3 se recubrieron en una placa y en la ausencia de células auxiliares, doce (222, 132, 8B, 33A, 43, 58B, 122, 157A, 173B, 220C, 140A, 270) de nuestros mAbs OX40 anti-humanos de ratón inhibieron de manera potente la supresión de nTreg (FIGS. 32A y 32B). Aunque la relación de nTregs a células T efectoras usada en estos ensayos fue 1 : 1 , estos anticuerpos fueron capaces de estimular células T efectoras para proliferar 10 a 35 por ciento arriba del porcentaje logrado por las células T efectoras en la ausencia de nTregs. Los mAbs OX40 anti-humanos humanizados también invirtieron la función supresora de nTregs a niveles similares (FIG. 32C). Estos resultados tomados conjuntamente sugieren que los mAbs OX40 antihumanos de ratón son potentes estimulantes de OX40, resultando en el mejoramiento significativo de proliferación de células T e inhibición de la función supresora de nTreg. Además, los mAbs OX40 anti-humanos humanizados mantuvieron las potentes actividades biológicas de sus anticuerpos de ratón parentales.

Las FIGS. 32A-32C muestran que el mAb OX40 anti-humano bloquea la actividad de Tregs CD4+FOXP3+n. Las células T efectoras CD4+CD25"CD45RO+ etiquetadas con CFSE y Tregs CD4+FOXP3+ se derivaron del mismo donante sano. Las células T se estimularon con anti-CD28 soluble (0.5 pg/ml) y anti-CD3 de unión a la placa (3 pg/ml) y mAbs OX40 anti-humanos (2 pg/ml). La proliferación de células T efectoras se evaluó por citometría de flujo para dilución de CFSE. La relación de células nTregs a T efectoras fue 1 :1. lgG1 de ratón sirvió como control negativo. Las células T CD4+ na'íve sirvieron como células T de control para demostrar la inhibición específica de la proliferación de células T efectoras por nTregs. La FIG. 32A son unos datos representativos de FACS que muestran la proliferación de células T efectoras en la presencia de células T CD4+ na'íve, nTregs o nTregs más mAb OX40 anti-humano 1 19-33A. La FIG. 32B muestra el porcentaje de proliferación de células T efectoras en la presencia de nTregs después del tratamiento con un mAb OX40 anti-humano de ratón (20 probados). La FIG. 32C muestra que todas las tres versiones de mAbs OX40 anti-humanos humanizados restauraron la proliferación de células T efectoras.

Un reciente reporte sugiere que la activación de OX40 puede inducir la apoptosis de una línea de células T humanas que expresa OX40 (Yoshiaki Takahashi et al., 200B, Aids Research and human Retroviruses,24). Por lo tanto se probó el efecto de las concentraciones incrementadas del mAb OX40 anti-humano 106-222 más una dosis baja fija de anti-CD3 en la supervivencia de tres subconjuntos de células T en la presencia de monocitos. La FIG. 33A muestra que las altas concentraciones de mAb OX40 antihumano 106-222 (20-30 pg/ml) preferentemente matan nTregs FOXP3+ activadas mientras que las células T CD4+ na'íve y de memoria activadas fueron ya sea resistentes o menos susceptibles a este esfuerzo. Para probar si el mAb OX40 anti-humano actúa directamente en Tregs para inducir la muerte celular, se realizaron nuevos experimentos en la ausencia de células auxiliares. La FIG. 33B muestra que la fuerte señalización de OX40 en combinación con anti-CD3 específicamente mata nTregs en la ausencia de células auxiliares. Para confirmar si los efectos de aniquilación mediados por mAb OX40 anti-humanos imitan la activación de OX40 por ligando de OX40 natural, se utilizó una línea de célula L de fibroblasto de ratón que sobre-expresa hOX40L y se utilizó para estimular nTregs en la presencia de una dosis baja de anti-CD3 y se obtuvieron efectos de aniquilación similares en Tregs (FIG. 33C). Estos resultados sugieren que la fuerte activación de OX40 mata las células Tregs que expresan OX40.

Específicamente, las FIGS. 33A-33C muestran que la alta concentración de mAb OX40 anti-humano preferentemente mata Tregs FOXP3+. En la FIG. 33A, los subconjuntos de células T (na'íve, CD4+CD25baiaCD127+CD45RO"CD45RA+; memoria, CD4+CD25bajaCD127+CD45RA CD45RO+; y nTregs, CD4+CD25al,aCD127baja) se cultivaron con una relación igual de monocitos CD14+ en la presencia de anti-CD3 soluble (0.3 pg/ml) y concentraciones incrementadas del mAb OX40 anti-humano de ratón 106-222. La viabilidad celular se determinó después de 3 días de cultivo por análisis de citometría de flujo, sincronizando los linfocitos viables. Se muestran los datos de dos donantes de células T. Las FIGS. 33B y 33C muestran que la fuerte activación de OX40 mata Tregs CD4+FOXP3+. La FIG. 33B muestra que las Tregs CD4+FOXP3+ se estimularon con anti-CD3 de unión a la placa (2 pg/ml) más mAb 9-122 soluble (30 pg por millón de células) o anticuerpo de control de lgG1 de ratón. Las células vivas negativas a azul de tripano después de un día de cultivo se contaron con un hemacitómetro. La FIG. 33C muestra que las Tregs CD4+FOXP3+ se estimularon con anti-CD3 soluble (0.2 pg/ml) más células L o células L que expresan el ligando de hOX40 (UhOX40L). Las células vivas se contaron después de un día de estimulación.

A continuación se busca determinar si el mAb OX40 anti-humano actúa directamente en células T para bloquear la función supresora de nTreg. Las nTregs o células T efectoras CD4+ recientemente clasificadas se pre-activaron durante la noche con anti-CD3 y luego se pulsaron con mAbs OX40 anti-humanos por 4 horas. Las células T efectoras luego se lavaron, se etiquetaron con CFSE, y se co-cultivaron con nTregs en la presencia de un número igual de monocitos CD14+ y anti-CD3. De manera similar, la nTregs pre-estimuladas se lavaron y cultivaron con células T efectoras etiquetadas con CFSE no tratadas.

Las FIGS. 34A y 34B muestran que los mAbs OX40 antihumanos actúan directamente en células T para bloquear la función supresora de Tregs. La FIG. 34A muestra que el mAb OX40 anti-humano actúa directamente en células T efectoras de memoria para conferirles resistencia a la supresión por nTregs. Las células T de memoria CD4+ CD25bajaCD127+CD45RA"CD45RO+ se estimularon con anti-CD3 de unión a la placa (0.8 pg/ml) en medio de cultivo (RPMI/10% FCS/ P/S más IL-2 a 30 lU/ml) por 12 horas, luego se pulsaron con mAb OX40 anti-humano (1 19-122, 22 pg por 0.5 millones de células) en medio de cultivo, por 4 horas, se lavaron 3 veces, y 8x104 células T efectoras etiquetadas con CFSE se cultivaron con relaciones disminuidas de nTregs. La proliferación de células T efectoras se evaluó por citometría de flujo para dilución de CFSE. El mAb OX40 antihumano actúa en Tregs haciéndolas incapaces de suprimir la proliferación de células T efectoras (FIG. 34B). Las nTregs CD4+CD25al,aCD127baja se pre-estimularon con anti-CD3 de unión a la placa (2 pg/ml) en medio de cultivo por 12 horas, luego se pulsaron con un mAb OX40 anti-humano, 1 19-122 o 106-222, o un anticuerpo de control, anti-ICOS o lgG1 de ratón, como se describe en la FIG. 34A, se lavaron y cultivaron con células T efectoras de memoria etiquetadas con CFSE. La proliferación de células T efectoras se evaluó por citometría de flujo para dilución de CFSE.

Las células T efectoras tratadas con mAb OX40 anti-humano llegaron a ser resistentes a la supresión por células nTreg. (FIG. 34A) En contraste, la proliferación de células T efectoras tratadas con anticuerpo de ratón de lgG1 de ratón permaneció susceptible a la supresión por nTregs. La FIG. 34B muestra que las nTregs tratadas con mAbs OX40 anti-humanos fueron incapaces de suprimir la proliferación de células T efectoras. En contraste, las nTregs tratadas con anticuerpos de control, tales como anti-ICOS o lgG1 de ratón, permanecieron supresoras. Estos resultados sugieren que los mAbs OX40 anti-humanos actúan directamente tanto en células T efectoras como nTregs para restaurar la proliferación de células T efectoras.

EJEMPLO V Los datos preliminares complementarios in vivo muestran que el anticuerpo OX40 anti-humano que funciona en ratones mejora la expansión de células T y rechazo de tumor en ratones. Se mostró previamente que el mAb OX40 anti-humano puede activar específicamente la cascada de NF- B en células T CD8+ de ratón transducidas con OX40 humano. Para determinar si el mAb anti-hOX40 puede mejorar el rechazo de tumor promoviendo la supervivencia de células T efectoras CD8+ y expansión clonal in vivo, las células T Pmel CD8+ transgénicas transducidas con el gen de luciferasa y hOX40 se transfirieron adaptativamente en ratones albinos C57BL/6 que portan tumores MC38 no pigmentados. Después de la transferencia adoptiva de las células T transducidas, los ratones se trataron con Abs. Se encontró que significativamente células T OX40* de luciferasa* Pmel humanas migran en el pulmón en el día 4 en ratones tratados con mAb anti-hOX40 en comparación con ratón tratado con anticuerpo de control de lgG1 (FIG. 35B), indicando que la activación de hOX40 en ratones promovió la expansión de células T CD8+. En el día 8 (datos no mostrados) y día 12 después del tratamiento, se encontró que el mismo grupo de ratones tratados con mAb anti-hOX40 retuvo significativamente más células T de luciferasa+Pmel en el sitio de tumor en comparación con el grupo de control de ratones tratados con lgG1 (FIG. 35B), de nuevo indicando que la activación de hOX40 en ratones promovió la supervivencia de células T CD8+. Finalmente, los tamaños de tumor de ratones que recibieron células T hOX40+Pmel CD8+ y subsecuentemente tratados con mAb anti-hOX40 fueron significativamente menores en comparación con aquellos de ratones que recibieron células T Pmel no transducidas y tratados con mAb anti-hOX40 o células T hOX40+Pmel seguido por tratamiento con anticuerpo de igualación de lgG1 de ratón de control. Estos resultados muestran que la activación de OX40 humano en ratones resulta en efectos biológicos similares a aquellos de OX40 de ratón (Gough MJ et, 2008). Por lo tanto, los datos demuestran la capacidad de mAb OX40 anti-humano para estimular la expansión de células T CD+ y supervivencia in vivo y mejorar el rechazo de tumor.

El mAb OX40 anti-humano promueve la expansión de células T y supervivencia in vivo.

El régimen de vacunación terapéutico se muestra en la FIG. 35A. Ratones albinos C57BL/6 en grupos de 5 se implantaron subcutáneamente (S.C) con 5 x 105 células de tumor MC38/gp100 no pigmentadas (día 0). En el día 6, la linfopenia fue inducida por la administración de una dosis de radiación de 350 cGy. En el día 7, 1 x 106 células T Pmel-1 de luciferasa transducidas con o sin expresión de OX40 humano se transfirieron adoptivamente en ratones que portan tumor (n = 5 por grupo), seguido por inyección intravenosa de 5 x 105 DCs pulsada con péptido Gp100. La IL-2 humana recombinante se administró intraperitonealmente por 3 días después de la transferencia de células T. Los anticuerpos se administraron en los días 7, 9 y 1 1 con 100, 50 y 50 pg, respectivamente, por inyección por ratón (FIG. 35B). Las imágenes de bioluminiscencia in vivo mostraron acumulación de células T CD8+ pmel-1 que expresan luciferasa en el pulmón y sitios de tumor en los días 4 y 12. Se muestran dos de cinco ratones por grupo en el día 4 y día 12 (FIG. 35C). Los tumores respondieron a los tratamientos usando mAb anti-hOX40. El tamaño de tumor se midió cada 3 días. Pmel-1 y Pmel-1 más lgG1 de ratón sirvieron como controles.

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo aislado el cual enlaza OX40, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 7; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 9.

2.- Un anticuerpo aislado el cual enlaza OX40, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) una región variable de cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (c) una región variable de cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 15; (d) una región variable de cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 19; (e) una región variable de cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 20; y (f) una región variable de cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 21.

3. - Un anticuerpo aislado que enlaza OX40, que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 7 o 19, o un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos con 90 por ciento de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o 19.

4. - Un anticuerpo aislado que enlaza OX40, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8 o 20, o un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos con 90 por ciento de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 o 20.

5.- Un anticuerpo aislado que enlaza OX40, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 9 o 21 , o un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos con 90 por ciento de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o 21.

6. - Un anticuerpo aislado que enlaza OX40, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 o 13, o un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos con 90 por ciento de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 13.

7. - Un anticuerpo aislado que enlaza OX40, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 2 o 14, o un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos con 90 por ciento de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o 14.

8. - Un anticuerpo aislado que enlaza OX40, que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 3 o 15, o un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos con 90 por ciento de homología con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o 15.

9. - Un anticuerpo aislado que enlaza un epítope en OX40 reconocido por un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO. 5 o 17 y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 1 o 23, o un anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos con al menos 90 por ciento de homología con esta.

10. - Un anticuerpo aislado el cual enlaza OX40, que comprende una región variable de cadena ligera que tiene CDRs que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o 19, SEQ ID NO: 8 o 20, SEQ ID NO: 9 o 21 , o un anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos con al menos 90 por ciento de homología con esta.

1 1. - Un anticuerpo aislado el cual enlaza OX40, que comprende una región variable de cadena pesada que tiene CDRs que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o 13, SEQ ID NO: 2 o 14, SEQ ID NO: 3 o 15, o un anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos con al menos 90 por ciento de homología con esta.

12. - Ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1.

13. - Una célula huésped, que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. - Un método para producir un anticuerpo, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped como la que se reclama en la reivindicación 13.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende adicionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped.

16. - Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , para usarse como un medicamento.

17. - Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , para usarse en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

18. - Un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , para usarse en el tratamiento de cáncer.

19. - El uso de un anticuerpo como el que se reclama en cualquiera de las reclamaciones 1 a 1 1 , en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de cáncer o una enfermedad autoinmune.