TW202116811A - 調節免疫檢查點作為癌症治療的單特異性蛋白質、其醫藥組成物、其核酸、及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供一種單特異性與雙特異性蛋白質，其特異性結合OX40及/或PD-L1。示例的蛋白質通過PD-L1產生抑制效果並通過OX40刺激T細胞。示例的多價蛋白質包含至少一個OX40結合位點和至少一個PD-L1結合位點。在特定實施方式中，結合位點可以通過免疫球蛋白恆定區連接。另提供了抗OX40和抗PD-L1抗體。

Description

調節免疫檢查點作為癌症治療的單特異性蛋白質、其醫藥組成物、其核酸、及其用途
本發明涉及一種抗體。特別是，本發明是有關於一種用於癌症治療的抗體。
人類中兩種主要類型的淋巴細胞是T淋巴細胞(源自胸腺)和B淋巴細胞(源自骨髓)。這些細胞源自於骨髓和胎兒肝臟中的造血幹細胞，並參與淋巴發育途徑。這些幹細胞的後代依照不同的途徑成熟為B或T淋巴細胞。人類B淋巴細胞的發育完全在骨髓內發生。另一方面，T細胞從未成熟的前驅細胞發展而來，這些前驅細胞離開骨髓並通過血流到達胸腺，在那裡它們增殖並分化成成熟的T淋巴細胞。
T細胞
T細胞是最豐富的(約75%的血液淋巴細胞)且有效的免疫毒殺細胞。效應T細胞(effector T-cells)在抗腫瘤免疫反應中的腳色，獲得體外研究和觀察結果的強烈支持，CD8+ T細胞在幾種類型腫瘤中的高滲透度(infiltration，又稱浸潤)與較佳的臨床預後相關(Fridman等人，2012)。效應初始T細胞的活化需要至少三種互補信號：(i)TCR-CD3/Ag-MHC在共同受體(CD4或CD8)的輔助下的相互作用；(ii)共同刺激分子如CD80或CD86與CD28的結合，CD40與CD40L的結合；及(iii)輔助分子如細胞激素(cytokines)。
共同刺激(co-stimulation)或向T細胞提供兩種不同的信號是抗原呈現細胞(antigen presenting cell，APC)對休止狀態T淋巴細胞活化的廣泛接受模式(Lafferty和Cunningham，1975)。此模式進一步提供了對自我與非自我和免疫耐受的區分(Bretscher和Cohn，1970；Bretscher，1999；Jenkins和Schwartz，1987)。在識別主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex，MHC)下呈現外來抗原胜肽後，通過T細胞受體(TCR)轉換成初級信號或抗原特異性信號。第二種或共同刺激信號藉由在抗原呈現細胞(antigen-presenting cell，APC)上表達共同刺激分子遞送至T細胞，並誘導T細胞促進複製擴增、細胞激素分泌和效應功能(effector function)(Lenschow等，1996)。在沒有共同刺激的情況下，T細胞變得較不受抗原的刺激、不會產生有效的免疫反應，並且還可能導致對外來抗原無反應或具耐受性。
免疫檢查點蛋白：細胞程式死亡-配體1 (programmed cell death protein 1 ligand，PD-L1)
免疫檢查點是關於一群抑制和刺激途徑，主要由配體-受體相互作用引發免疫系統僵化，特別是T細胞介導的免疫，以維持自身耐受並調節外周組織中生理反應的持續時間和幅度，通常便能減少附帶組織損傷(Pardoll，2012)。腫瘤細胞將某些檢查點途徑作為免疫抗性的主要機制。例如，PD-L1的表現量通常在人類癌症腫瘤細胞的表面上增加。PD-L1與其受體PD-1的相互作用在腫瘤浸潤的淋巴細胞(tumor infiltrated lymphocytes，TILs)上表達，特別是在T細胞上，抑制局部T細胞介導的反應以逃避免疫監視(Liang等人，2006；Sznol與Chen，2013)。因此，對癌細胞免疫抑制信號的抑制、或對T細胞直接促效刺激，將導致和/或誘導強烈且持續性的抗腫瘤免疫反應。最近的臨床研究強烈建議藉由抗體免疫檢查點蛋白的阻礙、或由可溶性配體或受體的調節，是最有希望激發治療性抗腫瘤免疫的方式(Topalian等，2014)。目前抗PD-1和抗細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte- associated antigen-4，CTLA-4)抗體已被美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用於治療諸如黑素瘤的疾病。
另一種共同刺激分子OX40受體(CD134)是TNFR超級家族的成員，其為膜結合並且主要在活化的CD4+ T細胞上表達(Paterson等，1987)。通過OX40受體(以下稱為“OX40”)的信息傳遞對效應T細胞而言是共同刺激，並引起T細胞的增殖(Watts，2005；Weinberg等人，1994)。對OX40的研究顯示，其主要作用是規定在初級免疫反應中累積效應T細胞的數量，並因此控制隨後發展和存活記憶T細胞的數量(Croft，2003)。已經有許多體外研究顯示，OX40提供共同刺激信號，導致增強T細胞的增殖和細胞激素的產生。
雙特異性(Bi-specific)/雙功能性(bi-functional)抗體
在1980年代出現了使用雙特異性抗體能有效地將效應免疫細胞重新以腫瘤細胞做為目標的想法(Karpovsky等人，1984；Perez等人，1985；Staerz等人，1985)。基於不存在或存在Fc片段(fragment crystallizable segment，可結晶區域片段)，雙特異性支架(scaffold)通常區分為具有不同藥物動力學特性的兩個主要群組：類免疫球蛋白G (IgG-like)分子和小型重組雙特異性形式，其中大多數衍生自單鏈可變片段(single chain variable fragment，scFv)。通過其小巧的尺寸，抗體片段通常比類IgG分子更能有效地穿透腫瘤，但是這種優勢將因過短的血清半衰期(幾小時)而減少，並限制了它們的整體腫瘤吸收程度和停留時間(Goldenberg等，2007)。相比之下，結合新生兒Fc受體Fc片段的存在，為類IgG形式提供了長血清半衰期(＞10天)並有利於被腫瘤吸收和保留，但限制了對腫瘤的穿透性。
最近的研究強調了免疫療法的治療功效，免疫療法是利用患者自身免疫系統來破壞癌細胞的一類癌症治療方法。在腫瘤內，陰性調節分子家族(統稱為「檢查點抑制劑」)的存在可抑制T細胞功能以抑制抗腫瘤的免疫力。檢查點抑制劑，例如CTLA-4和PD-1，減弱T細胞增殖和細胞激素的產生。用拮抗劑(antagonist)單株抗體(monoclonal antibodies，mAbs)將CTLA-4或PD-1作為目標阻斷並釋放T細胞上的「剎車」，以增強抗腫瘤的免疫力。產生最佳「殺手」CD8 T細胞的反應還需要T細胞受體活化加上共同刺激，如經由結合腫瘤壞死因子受體家族成員包括OX40 (CD134)和4-1BB (CD137)來達成。OX40特別令人感興趣在於其作為活性(促效，agonist，或稱活化)抗OX40單株抗體(mAb)的治療時，可增強T細胞分化和細胞溶解(cytolytic)功能，從而增強針對多種腫瘤的抗腫瘤免疫力。當作為單一藥物時，這些藥物可以在具轉移性疾病患者中誘導有效的臨床和免疫反應(Linch等人，2015)。
本揭示內容的目的在於提供一種具有免疫調節的雙特異性抗體，用於治療患有癌症的患者進行檢查，例如前列腺癌(prostate cancer)、肺癌(lung cancer)、非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)、黑素瘤(melanoma)、淋巴瘤(lymphoma)、乳癌(breast cancer)、頭頸癌(head and neck cancer)、腎細胞癌(Renal cell carcinoma，RCC)或卵巢癌(ovarian cancer)。
本揭示內容提供了一種與OX40 (CD134)結合的抗體或其抗原結合部分，包含：重鏈可變區，包含胺基酸序列，胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10的第128-246個位置胺基酸、及SEQ ID NO:13的第124-241個位置胺基酸所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性；以及輕鏈可變區，包含胺基酸序列，胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:5的第1-108個位置胺基酸、SEQ ID NO:7的第1-108個位置胺基酸、SEQ ID NO:10的第1-112個位置胺基酸、與SEQ ID NO:13的第1-108個位置胺基酸所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合部分係選自於由SEQ ID NOs: 10、11、12及13所組成之群組的單鏈可變片段序列。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合部分是雙特異性抗體。
在一些實施方式中，雙特異性抗體包含免疫檢查點蛋白結合位點。
在一些實施方式中，免疫檢查點蛋白結合位點包含細胞程式死亡-配體1 (PD-L1)結合位點、PD-1結合位點、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)結合位點、人類表皮生長因子受體2 (human epidermal growth factor receptor 2，HER2)結合位點、細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)結合位點、或淋巴細胞活化基因3 (lymphocyte activation gene 3，LAG3)結合位點。
本揭示內容另提供了一種與PD-L1結合的抗體或其抗原結合部分，包含：重鏈可變區，包含胺基酸序列，胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性；以及輕鏈可變區，包含胺基酸序列，胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:1的第1-111個位置胺基酸及SEQ ID NO:3的第1-110個位置胺基酸所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性。
本揭示內容另提供了一種雙特異性抗體，包含至少一多肽鏈，其中所述多肽鏈包含：OX40結合位點以及PD-L1結合位點。OX40結合位點包含重鏈可變區，包含胺基酸序列，胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10的第128-246個位置胺基酸、及SEQ ID NO:13的第124-241個位置胺基酸所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性；以及輕鏈可變區，包含胺基酸序列，胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:5的第1-108個位置胺基酸、SEQ ID NO:7的第1-108個位置胺基酸、SEQ ID NO:10的第1-112個位置胺基酸、及SEQ ID NO:13的第1-108個位置胺基酸所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性。PD-L1結合位點包含重鏈可變區，包含胺基酸序列，胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性；以及輕鏈可變區，包含胺基酸序列，胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:1的第1-111個位置胺基酸及SEQ ID NO:3的第1-110個位置胺基酸所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性。
在一些實施方式中，多肽鏈更包含Fc區、抗體結合片段(fragment-antigen binding segment，Fab片段)以及scFv。Fab片段與Fc區的N端連接，且Fab片段包含PD-L1結合位點。scFv與Fc區的C端連接，且scFv包含OX40結合位點。
在一些實施方式中，多肽鏈更包含連接子界於Fc區和scFv之間。
在一些實施方式中，scFv包含胺基酸序列係選自於由SEQ ID NO:18的第455-707個位置胺基酸、SEQ ID NO:19的第455-708個位置胺基酸、SEQ ID NO:20的第455-701個位置胺基酸、SEQ ID NO:21的第455-706個位置胺基酸、SEQ ID NO:22的第455-706個位置胺基酸、SEQ ID NO:23的第455-706個位置胺基酸、SEQ ID NO:24的第455-706個位置胺基酸、SEQ ID NO:25的第455-706個位置胺基酸、SEQ ID NO:26的第455-706個位置胺基酸、SEQ ID NO:27的第455-706個位置胺基酸、SEQ ID NO:28的第455-706個位置胺基酸、及SEQ ID NO:29的第455-706個位置胺基酸所組成之群組。
在一些實施方式中，雙特異性抗體包含一對多肽鏈。
在一些實施方式中，雙特異性抗體為IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、或IgY抗體。
在一些實施方式中，雙特異性抗體為IgG抗體。
在一些實施方式中，IgG抗體為IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4抗體。
本揭示內容另提供了一種抗體藥物複合體，包含治療劑；以及抗體或其抗原結合部分，其係與PD-L1和/或OX40結合，其中治療劑藉由連接子與抗體或其抗原結合部分共價接合。
在一些實施方式中，抗體或其抗原結合部分選自於如前述之抗體或其抗原結合部分。
本揭示內容另提供了一種醫藥組成物，包含如前述之抗體、其抗原結合部分、或雙特異性抗體；以及至少一藥學上可接受的載劑。
本揭示內容另提供了一種治療癌症的方法，方法包含對有需要之個體施予有效劑量之如前述之抗體、其抗原結合部分或雙特異性抗體。
在一些實施方式中，癌症係選自於由前列腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、乳癌、頭頸癌、腎細胞癌和卵巢癌所組成之群組。
本揭示內容另提供了一種核酸分子，其編碼如前述之抗體、其抗原結合部分或雙特異性抗體。
應理解，前面的一般性描述和以下的詳細描述都是基於實施例，並且旨在針對要求保護的本發明提供進一步的說明。
現在將參照本發明的實施方案詳細地進行說明，本發明實施方案的實例將結合附圖進行說明。只要有可能，在附圖和說明書中使用相同的附圖標記表示相同或相似的部分。
本發明描述了分離具功能性促效OX40 scFv的雙功能性蛋白質的表達、純化和特徵，所述OX40 scFv與抗免疫檢查點蛋白質抗體的Fc區的C端融合。這些蛋白質與其相應的檢查點相互作用，並傳遞抑制或刺激信號以調節T細胞參與免疫。本發明中Fc融合蛋白的組成皆源自於人類，因此預期是非免疫原性的(non-immunogenic)並且可以用於人類的治療。
雙特異性分子如雙特異性抗體(bispecific antibodies，BsAb)提供了用單一治療劑、同時將相同分子標的或不同標的上的多個抗原決定基(epitopes)做為目標的手段。作為癌症療法，它們具有潛力賦予新的或更有效的活性、降低商品成本、並促進新治療方案的開發，而不是兩種單株抗體的混合物(Chames和Baty，2009；Thakur和 Lum，2010)。最近，catumaxomab是一種以人類上皮細胞黏附分子(human epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)和CD3作為目標的三功能雙特異性抗體，其已顯示出對上皮癌的腹膜癌(peritoneal carcinomatosis of epithelial cancers)患者有明顯的臨床益處(Heiss等人，2010)。對CD19和CD3具有雙重特異性結合能力的雙特異性T細胞結合抗體(bispecific T-cell engaging antibody，BiTE Ab)在CD19表達惡性血液病(hematological malignancies)的患者中，也表現出令人鼓舞的臨床活性(Bargou等人，2008)。儘管人們對開發作為癌症治療劑的雙特異性分子非常感興趣，但是過去在生產具穩定和活性的雙特異性分子技術中面臨挑戰，並阻礙了大多數雙特異性形式的臨床評價。許多工程化抗體(engineered Abs)形式，包括類IgG雙特異性抗體已經克服穩定性或溶解度的問題(Bargou等人，2008；Demarest和Glaser，2008；Lu等人，2005)。此外，已經採取了幾種策略來提高雙特異性分子的產品質量和體內穩定性，包括PEG化(PEGylation)、與人類血清白蛋白接合、以及Fc的工程化(Muller等人，2007；Ridgway等人，1996)。上述一般形式的雙特異性單鏈抗體具有以下優點：編碼四個可變異區(variable region)的核苷酸序列、兩個連接子、或一個間隔子(spacer)可以在單個啟動子的控制下於合適的宿主表達生物中。這增加了設計這些結構的靈活性以及實驗者在其生產過程中的控制程度。此外，IgG的Fc對用於設計新療法中是非常具有吸引力的架構，因為它包含除結合能力之外的所有抗體功能。Fc的工程對於提高雙特異性抗體有效性而言是至關重要的。因此，以IgG為基礎的結構在本發明中用於免疫細胞或免疫治療標的細胞，作為兩個獨立的目標。
以免疫檢查點蛋白為目標是活化抗腫瘤免疫中備受期待的方法。目前臨床上評估了抗檢查點蛋白，例如PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3等(第1圖)。初步的實驗數據已顯示免疫檢查點蛋白抑制劑能夠增強抗腫瘤免疫力，並在臨床反應上具有藥效持久性的潛力。然而，儘管這些藥物在許多惡性腫瘤中具有顯著的臨床功效，但很明顯它們對許多患者來說仍不夠有效。許多其他免疫調節途徑，如由骨髓表達或分泌的抑制因子、以及腫瘤微環境中的基質細胞(stromal cell)，是與免疫檢查點阻礙物協同作用的潛在標的。因此，結合抗癌或雙特異性抗體療法對於實現癌症患者的完全緩解和治療是不可或缺的。
本發明描述了不同免疫檢查點蛋白特異性scFv蛋白與抗免疫檢查點蛋白抗體Fc融合的結構、表達和特徵。如果融合對應物是免疫增強劑，例如抗EGFR、抗HER2、或抗CTLA-4抗體，則位於融合結構C端的OX40 scFv將會增強融合蛋白的免疫力，並超過單獨以OX40本身活化免疫力的方式。
自OmniMab庫產生的抗體
為了產生針對PD-L1或OX40具療效的抗體，進行了OmniMab噬菌粒庫(phagemid library)的選擇。噬菌粒庫由AP Biosciences公司(APBio Inc.)從超過100個健康捐贈者B細胞收集產生。在第一輪篩選中使用之噬菌體係以Hyperphage (M13Κ07ΔρΙΙΙ，德國海德堡Progen公司)製備。針對PD-L1或OX40的固相篩選和細胞篩選是用於選擇PD-L1或OX40特異性結合物，並從OmniMab庫中分離。在第一輪選擇中使用重組人類PD-L1-Fc或OX40-Fc (APBio Inc.)進行固相篩選，然後將表達PD-L1或OX40的HEK293細胞用於另外兩至三輪的富集過程(enrichment)。在三輪選擇後，特異性PD-L1或OX40結合物藉由使用相應的重組蛋白以直接或細胞基底ELISA篩选和分離(第2A、2B、3A及3B圖)。預先塗覆的PD-L1-Fc重組蛋白或表現OX40的293細胞以含有補救噬菌體(rescued phages)的上清液印漬(blot) 1小時，並用含有0.1% Tween-20的磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)洗滌三次。噬菌體藉由辣根過氧化物酶接合的抗M13抗體(Roche)檢測，並以TMB受質(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine substrate，TMB substrate)做為信號產生，並記錄OD450 讀值。分離陽性結合物並送定序以確認重鏈和輕鏈的序列和多樣性。對PD-L1或OX40專一的重鏈和輕鏈可變區如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:8所示：SEQ ID NO:1是PD-L1殖株6的輕鏈、SEQ ID NO:2是PD-L1殖株6的重鏈可變區、SEQ ID NO:3是PD-L1殖株32的輕鏈、SEQ ID NO:4是PD-L1殖株32的重鏈可變區、SEQ ID NO:5是OX40殖株B17的輕鏈、SEQ ID NO:6是OX40殖株B17的重鏈可變區、SEQ ID NO:7是OX40殖株B19的輕鏈、SEQ ID NO:8是OX40殖株B19的重鏈可變區。如第2A、2B、3A與3B圖所示，與陰性對照組相比，許多殖株被分離出並且已知其特異性地識別相應的抗原。
次選殖(subcloning)和表達/純化作為IgG形式篩選出的PD-L1或OX40特異性結合物
為了便於快速篩選具有T細胞活化功能的特異性結合物，由ELISA篩選出PD-L1或OX40的陽性結合物的重鏈和輕鏈，接著進行擴增、分解(digest)與次選殖到攜帶IgG4恆定區(constant region)的APBio特異性IgG表達載體中(SEQ ID NO:9)。在序列驗證後，製備質體(plasmid)並使用293 fectin轉染試劑(Invitrogen)轉染到HEK293細胞中以表現抗體。培養4天後，藉由蛋白G層析(Protein G chromatography)將分泌到無血清培養基的抗體從培養基上清液中親和純化出。純化的抗體接著濃縮，並於PBS緩衝液中透析。透析蛋白的最終濃度藉由NanoDrop2000分光光度計測定，且在有或沒有還原劑的條件下以SDS-PAGE測定純度和完整性，如第4及5圖所示。各種純化的抗體先導物(PD-L1專一或OX40專一)、參考抗體(MPDL3280A辨識PD-L1、GSK3174998辨識OX40)的完整性在HEK293細胞中是正常的。
在一些實施方式中，本揭示內容提供一種與OX40 (CD134)結合的抗體或其抗原結合部分，包含重鏈可變區以及輕鏈可變區。重鏈可變區包含胺基酸序列，此胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10的第128-246個位置胺基酸、與SEQ ID NO:13的第124-241個位置胺基酸所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性。在一些實施例中，重鏈可變區與前述的胺基酸序列具有至少約85%、90%或95%的序列同源性。輕鏈可變區包含一胺基酸序列，此胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:5的第1-108個位置胺基酸、SEQ ID NO:7的第1-108個位置胺基酸、SEQ ID NO:10的第1-112個位置胺基酸、與SEQ ID NO:13的第1-108個位置胺基酸所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性。在一些實施例中，輕鏈可變區包含與前述的胺基酸序列具有至少約85%、90%或95%的序列同源性。
在一些實施方式中，本揭示內容提供一種與PD-L1結合的抗體或其抗原結合部分，包含重鏈可變區以及輕鏈可變區。重鏈可變區包含一胺基酸序列，此胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:4所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性。在一些實施例中，重鏈可變區與前述的胺基酸序列具有至少約85%、90%或95%的序列同源性。輕鏈可變區，包含一胺基酸序列，胺基酸序列與選自於由SEQ ID NO:1的第1-111個位置胺基酸與SEQ ID NO:3的第1-110個位置胺基酸所組成之群組的胺基酸序列具有至少約80%的序列同源性。在一些實施例中，輕鏈可變區包含與前述的胺基酸序列具有至少約85%、90%或95%的序列同源性。
由直接ELISA測定PD-L1或OX40特異性IgG先導物的結合活性
PD-L1或OX40的純化抗體先導物(抗PD-L1或OX40抗體先導物)於人類PD-L1-Fc或OX40-Fc直接塗覆的裝置中進行ELISA結合特徵分析。第6及7圖分別顯示抗PD-L1抗體與抗OX40抗體的ELISA結合結果。對於PD-L1特異性抗體，大多數先導物顯示出與參考抗體(Ref Ab，MPDL3280A，Roche)相似或更好的結合活性。
純化的人類PD-L1或OX40 IgG1 Fc嵌合體(PD-L1-Fc 或OX40-Fc chimera，APBio)在PBS中透析，調整濃度至1 mg/mL，然後再用PBS稀釋至最終濃度為1 μg/mL。將Nunc-Immuno Maxisorp 96孔盤以每孔0.1 mL重組PD-L1-Fc或OX40-Fc嵌合體塗覆，留下空孔用於非特異性結合的對照組，並在4ºC隔夜培養。移除PD-L1-Fc或OX40-Fc嵌合體溶液，孔盤用0.4 mL沖洗緩衝液(wash buffer，含0.1% Tween-20的PBS溶液)洗滌三次。將孔盤中所有的孔槽加入0.4 mL阻斷緩衝液(blocking buffer)(含5%低脂奶粉的PBS)，並在室溫下培養混合1小時。移除阻斷緩衝液後，用0.4 mL沖洗緩衝液洗滌孔盤三次。在PBS中製備PD-L1或OX40測試抗體的連續稀釋液，每孔加入0.1 mL稀釋的抗體。將孔盤在室溫下培養1小時。移除抗體溶液，每孔用0.4 mL沖洗緩衝液洗滌孔盤三次。辣根過氧化物酶標記的山羊抗人類IgG F(ab')2 特異性F(ab')2 抗體(Jackson Immunoresearch＃109-036-097)用PBS以1：2000稀釋，每孔加入0.1 mL。將孔盤於室溫下培養1小時，並用每孔0.4 mL的沖洗緩衝液洗滌。加入0.1 mL TMB試劑(Invitrogen)並在室溫下培養1至5分鐘。藉由加入0.05 mL 1N 鹽酸(HCl)終止反應，並在Bio-Tek Spectra上於450 nm處讀取吸光值。計算抗PD-L1抗體先導物對PD-L1的EC50 並顯示，由直接ELISA偵測出大多數先導物具有良好的結合活性，MPDL3280A(Ref Ab)也呈現相同的結果(第6圖)。相對的，大多數抗OX40抗體先導物顯示較參考抗體(Ref Ab，GSK3174998)低的結合活性(第7圖)。
通過FACS確認PD-L1與OX40特異性IgG先導物的結合活性
純化的抗體先導物(抗PD-L1或OX40抗體先導物)也用於流式細胞技術，以確定和比較先導物與PD-L1或OX40表達的HEK293細胞的結合活性。第8及9圖顯示，穩定表達PD-L1或OX40的HEK293細胞經FACS可知相應抗體先導物的結合活性。
FACS分析以抗PD-L1抗體先導物將穩定表達PD-L1的293細胞進行染色，以檢測PD-L1結合活性。穩定表達的293細胞與1 μg/mL純化的抗PD-L1抗體先導物、參考抗體(Ref Ab MPDL3280A)、或作為陰性對照的同型抗體在冰上培養1小時。用1倍PBS洗滌細胞三次，然後在冰上與Alexa® -488接合的山羊抗人類IgG (H+L)(Invitrogen Inc.)再一起培養1小時。染色後，用1倍PBS洗滌細胞三次，並重新懸浮於1倍PBS/2%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)中，然後通過FACS Calibur (BD Biosciences，Inc)和FlowJo(TreeStar，LLC)分析。相似的情形，於第9圖中對於穩定表現OX40的HEK293細胞而言，抗OX40抗體先導物的結合能力也使用相同的方法分析如前所述。如第8圖所示，大多數抗PD-L1抗體先導物與參考抗體皆具有良好的結合活性。這顯示選自OmniMab庫的噬菌體殖株確實可識別細胞中原始的PD-L1。
此情形也同時在抗OX40抗體先導物中被觀察到如第9圖所示。以FACS分析OX40穩定表達的293細胞殖株2D5用純化的抗OX40抗體先導物染色，以檢測O40的結合能力。穩定表達的細胞以2 μg/mL的抗OX40參考抗體(OX40 ref.)或抗CD137參考抗體(CD137 ref.)作為對照組抗體在冰上培養1小時。這些細胞以1倍的PBS洗滌3次，並以Alexa® -488接合山羊抗人類IgG (H+L) (Invitrogen Inc.)於冰上再培養1小時。染色後，這些細胞以1倍的PBS洗滌3次，懸浮於含2% FBS的1倍PBS中準備以FACS Calibur (BD Biosciences，Inc)和FlowJo (TreeStar，LLC)分析。
配體競爭結合(ELISA測定)
抗體先導物所顯示的結合選擇性和親和力測定，是用於評價本發明的抗PD-L1抗體先導物阻斷PD-L1與PD-1結合的能力。
抗體藉由ELISA測試阻斷人類PD-L1-Fc嵌合體(PD-L1-Fc)與重組人類PD-1/His(hPD-1/His)結合的能力。將純化的重組hPD-1/His(APBio)在PBS中透析至1 mg/mL，然後在與生物素(Abcam)結合。將Nunc Maxisorp 96孔盤用在PBS中的250 ng hPD-1/His塗覆過夜。移除hPD-1/His溶液，用0.4 mL沖洗緩衝液(0.1% Tween-20的PBS溶液)洗滌孔盤三次。所有孔槽中加入0.4 mL阻斷緩衝液(含5%低脂奶粉的PBS)，在室溫下培養1小時並混合。在阻斷步驟期間，將抗體原液(antibody stocks)在PBS中以200 nM至0 nM的範圍以2倍連續稀釋。將純化的重組具生物素的PD-L1-Fc嵌合體在PBS中稀釋至4 μg/mL。用0.2 mL沖洗緩衝液(0.1% Tween-20的PBS溶液)洗滌以PD-1/His塗覆的孔盤三次。將60 μL抗體稀釋液(抗PD-L1抗體先導物或參考抗體Ref Ab MPDL3280A)單獨加入60 μL具生物素的PD-L1-Fc嵌合體，並在室溫下培養1小時。孔盤被洗滌的方式如前所述。將鏈黴親合素-辣根過氧化物酶在PBS中以1：2000稀釋，將100 μL所得溶液加入到經洗滌的孔盤的孔槽中，並在室溫下培養1小時。孔盤被洗滌的方式如前所述，每個孔槽中加入100 μL TMB受質溶液並培養10分鐘。用50 μL 1N HCl終止反應，並使用Bio-Tek讀數器讀取450 nm處的吸光值如第10圖所示。部分抗體先導物藉由競爭ELISA (competition ELISA)抑制PD-1-PD-L1之間的相互作用。與參考抗體(Ref Ab MPDL3280A)相比，大多數抗體先導物顯示出類似的阻斷活性。
藉由抗PD-L1抗體抑制PD-1：PD-L1配體相互作用以增強刺激T細胞活化
PD-1信息傳導途徑抑制中度TCR/CD28共同刺激信號，首先減少細胞激素產生而T細胞增殖則沒有減少。隨著TCR/CD28共同刺激信號減弱，PD-1途徑占主導地位，細胞激素的產生大幅減少，同時也伴隨著增殖的減少。因此，為了藉由抑制PD-1與PD-L1的相互作用來確認PD-1的抑制情形，本發明的人類抗體增強T細胞活化，並進行混合淋巴細胞反應(MLR)。
通過RosetteSep™人類單核細胞富集組(產品型號15068)富集來自人類全血的單核細胞，並在分化培養基含10% FBS RPMI 1640、100 ng/mL (1000U/mL) GM-CSF、100 ng/mL (500 U/mL)中培養6天。由DC-SIGN-PE、與異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)抗體接合的抗CD14、與PE抗體接合的抗CD83、或與FITC抗體接合的抗CD80檢查從單核細胞分化的樹突細胞(dendritic cells，DC)，以在混合淋巴細胞反應中驗證分化情形與驗證曾經為抗原呈現細胞(antigen-presenting cell，APC)。
藉由RosetteSepTM 人類CD4+ T細胞富集組(商品型號15062)分離來自人類全血的異體(Allogenic) CD4+ T細胞。用抗CD4接合的APC抗體檢查CD4+ T細胞的純度以確保純度高於95%，然後用1 μM CFSE (CellTraceTM CFSE細胞增殖試劑盒，Life technologies，商品型號C34554)標記T細胞增殖試驗。標記的CD4+ T細胞用於與未成熟的樹突細胞及不同的抗體先導物共同培養3天和5天，以觀察抗體先導物是否可以通過阻斷PD-1和PD-L1之間的相互作用來恢復T細胞活化。培養3天和5天後，收集上清液中的細胞激素，例如藉由ELISA定量的IL-2和IFN-γ。與同型IgG (iso#1，#2)處理的培養物相比(如第11A和11B圖所示)，向未成熟樹突細胞和異體T細胞培養物中添加抗PD-L1抗體先導物(殖株6、32、28、51、64、27和37)預期會導致T細胞增殖和細胞激素產生增加。在第3天(第11A圖)或第5天(第11B圖)抗體施予後與同型抗體相比，MLR中IL-2和IFN-γ產生顯著增加，特別是對於抗PD-L1抗體殖株6的結果。抗體治療5天後，細胞激素的增加仍然顯著，其結果與參考抗體(ref) MPDL3280A相似。這顯示抗PD-L1抗體殖株6應該是雙特異性抗體複合物的潛在先導物之一。
抗OX40抗體的促效活性分析
為了活化以OX40共同刺激的T細胞增殖和細胞激素的產生，純化的抗體先導物以增強細胞激素產生、增殖和誘導人類CD3+ T細胞增殖的能力作為功能性篩選。抗CD3抗體(OKT3，BioLegend 商品型號317304)和抗OX40抗體先導物(殖株B6、B70、B120、A4、B17、B19和B30)、參考抗體(GSK3174998)或同型抗體(iso# 1號、#2)塗覆在Maxisorp 96孔盤中。同時，使用商業上可獲得的RosetteSepTM 人類T細胞富集組(STEMCELL商品型號15061)，從健康成人願自願者的血液中分離出天然的人類CD3+ T細胞。然後通過CFSE (CellTraceTM CFSE細胞增殖試劑盒，Life technologies，商品型號C34554)標記分離的CD3+ T細胞，並以每毫升1×106 個細胞接種到含有RPMI 1640培養基、10% FBS和2.5 mM L-麩醯胺酸的預先塗覆抗體的孔槽中，以確定細胞增殖和細胞激素的產生。培養3天後，通過流式細胞儀收集細胞用於增殖測定，然後藉由定量ELISA分析培養基中IL-2和IFN-γ產量。
在第12A圖中顯示對T細胞活化具有促效活性的抗OX40抗體先導物的篩選。所有抗OX40抗體先導物均顯示通過劑量反應增強CD3+ T細胞活化的能力，參考抗體也呈現相同的結果。高劑量的抗體治療顯示出明顯更高的T細胞活化活性。同時，細胞激素的產生(第12B圖)，例如IL-2和IFN-γ也顯示出相似的T細胞活化反應，特別是對於抗OX40抗體先導物殖株B17。細胞激素在抗OX40抗體先導物B17施予3天後高度誘發。此增強情形遠高於以參考抗體治療的結果，這表示殖株B17應該是雙特異性抗體架構的候選者之一。
如第13A及13B圖的數據顯示，這兩個抗OX40抗體先導物殖株B17和B19經過3天的治療後，在測定中具有更好的促效活性。IL-2的產生或IFN-γ的產生在抗體治療後明顯增加，並顯示出劑量依賴的相關性。在更高劑量的抗體治療中記錄更高細胞激素的產生。
為了評估OX40抗體先導物B17和B19的促效活性，還測定了EC50 以及促效活性檢測，並記錄細胞激素的產生作為比較。
抗PD-L1-OX40 scFv抗體的結構、表達和純化
由於雙特異性被設計為與OX40 scFv融合的IgG，因此抗免疫檢查點抗體Fc端與OX40 scFv融合。抗體可以是抑制性抗免疫檢查點抗體(例如抗PD-L1、抗PD-1、抗CTLA4、抗LAG3等)、或刺激性抗體(例如抗CD28、抗CD137、抗CD27、抗ICOS等)。將連接子置於抗體Fc和OX40 scFv之間以產生雙特異性抗體如第14圖所繪示。
在一些實施方式中，抗PD-L1抗體先導物殖株6被設計為IgG形式，另一方面，抗OX40抗體先導物轉形(transform)為scFv形式以與抗PD-L1抗體先導物殖株6 Fc區的C端融合。由於從抗體到scFv形式的轉形可能導致結合活性或特異性的降低；因此，使用幾種抗OX40抗體先導物進行scFv的轉形。雙功能抗PD-L1抗體Fc與全長OX40 scFv (SEQ ID NO: 10為殖株A4、SEQ ID NO: 11為殖株B17、SEQ ID NO: 12為殖株B19、或SEQ ID NO: 13為殖株B120)融合建構。將短小靈活的多肽連接子(GGGGS)2 (SEQ ID NO:14)置於例如Fc區的抗PD-L1抗體重鏈C端和OX40 scFv的N端之間，以確保正確折疊並儘量減少空間阻礙(steric hindrance)。抗PD-L1-OX40 scFv抗體的編碼序列顯示在SEQ ID NO:16 (抗PD-L1-殖株6重鏈-OX40殖株B17 scFv)和SEQ ID NO:17 (抗PD-L1-殖株6重鏈-OX40殖株B19 scFv)。建構的抗體Fc融合蛋白由信號胜肽(SEQ ID NO:15)引導並由哺乳動物細胞表達，並通過一步蛋白G色譜法(1-step Protein G chromatography)從轉染的細胞培養上清液中純化。如第15圖所示，在單步純化過程中可以獲得大於90%的純度，並且顯示純化的融合蛋白具有正確的分子量(Mw=220kDa)。
在MLR中增強抗PD-L1-OX40 scFv雙特異性抗體先導物對T細胞活化的刺激
通過抑制PD-1和PD-L1之間的相互作用與促效活化OX40的訊息傳遞，來確定雙特異性抗體在增強T細胞活化中的協同作用，雙特異性抗體先導物抗PD-L1-OX40 scFv抗體應用於MLR如前所述。然後在抗體施予3或5天後記錄IL-2和IFN-γ的產生。以等量或等莫爾量(mole)之單一、結合、或雙特異性抗體比較T細胞活化增強中的協同效果，並將同型IgG作為陰性對照組。如第16A和16B圖所示的數據，單一抗PD-L1的抗體先導物顯示在施予3天後IL-2顯著誘發，參考抗體MPDL3280A亦有相同的結果；相對的，無論是施予抗體3天或5天後，抗OX40抗體先導物無法使細胞激素明顯增加。GSK3174998是OX40的參考抗體。然而，抗OX40抗體和抗PD-L1抗體的組合顯示出在抗體處理3和5天後，細胞激素的產生顯著上升。在雙特異性抗體先導物治療中也觀察到協同作用，並且細胞激素產量的增加與組合治療有相關聯。這表示抗PD-L1-OX40 scFv雙特異性抗體先導物也與抗體的組合治療有相同的效果，而在scFv轉形中不損失任何結合活性。
雙特異性抗體的聚集和純度測定
由於純化的抗PD-L1殖株6-OX40殖株B17 scFv抗體在單柱蛋白A層析純化(single column protein A chromatography purification)後通過SEC-HPLC分析顯示出較低的純度(74.07%)，因此產生了幾種抗體變體以提高純度和減少本發明中雙特異性抗體的聚集。如上所述的連接子用於替換在雙特異性抗體抗PD-L1-OX40抗體(SEQ ID NO:16)中的OX40 B17 scFv內的連接子，並從CHO細胞中產生出抗PD-L1-OX40 Ab-V1至V4 (SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:21)。然後純化這些變體並通過XBridge Protein BEH SEC-HPLC柱(Waters，產品型號No.186007640)分析。數據總結如下表1，雙特異性抗體變體之一：抗PD-L1-OX40 Ab-V4顯示抗體純度有顯著改善。純度從74.07%增加到92.27%。因此，抗PD-L1-OX40 Ab-V4用於進一步改進以提高抗體純度。
表1、OX40 B17 scFv中的不同連接子
縮寫 重鏈/輕鏈 在OX40 B17 scFv 中的連接子 參考文獻
Anti-PD-L1-OX40 Ab Anti-PD-L1-6-OX40 B17 scFv-L1 HC/ Anti-PD-L1 6 LC GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 30) Int. J. Mol. Sci. 2014, 15(12), 23658-23671
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V1 Anti-PD-L1-6-OX40 B17 scFv-L2 HC/ Anti-PD-L1 6 LC SSGGGGSGGGGGGSS RSSL (SEQ ID NO: 31) 無
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V2 Anti-PD-L1-6-OX40 B17 scFv-L3 HC/ Anti-PD-L1 6 LC GGKGSGGKGTGGKGS GGKGS (SEQ ID NO: 32) Virol J. 2008; 5:21
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V3 Anti-PD-L1-6-OX40 B17 scFv-L4 HC/ Anti-PD-L1 6 LC GSASAPTLFPLVS (SEQ ID NO: 33) DOI: 10.3892/mmr. 2013.1502
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V4 Anti-PD-L1-6-OX40 B17 scFv-L5 HC/ Anti-PD-L1 6 LC GSTSGSGKPGSGEGS TKG (SEQ ID NO: 34) PMID: 8309948
為了顯示雙特異性抗體的大小分佈，使用Waters Alliance 2695分離模組將樣品裝填到XBridge Protein BEH SEC-HPLC柱(Waters，商品型號186007640)上。使用Water 2996 PDA檢測器在280 nm處檢測蛋白質峰。流動相是等強度的(isocratic) 25 mM磷酸鈉(Sigma，商品型號04272和商品型號04269)與200 mM氯化鈉(AMRESCO，商品型號0241)、pH 6.8、流速為0.4 mL/分鐘。峰值百分比由峰面積(peak area)的部分決定，如第17A至17E圖所示。抗PD-L1-OX40 Ab-V4顯示出純度有顯著改善(第17E圖)。在OX40 B17 scFv片段中進一步將雙特異性抗體工程化以再次提高純度。第18圖中顯示在OX40 B17 scFv中的幾個殘基被不同胺基酸取代(SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:43)，並且重鏈變體與抗PD-L1殖株6輕鏈配對，以產生來自抗PD-L1-OX40 Ab-V5至V12 (SEQ ID NO:22至SEQ ID NO:29)的幾種雙特異性抗體變體，然後如上所述方式進行表達和純化。雙特異性抗體變體的純度總結如下表2，抗PD-L1-OX40 scFv-V5在那些抗體變體中顯示出最佳純度，純度高達96.46%。這顯示工程化雙特異性抗體具有優異的純度，並且還顯示出在未來對於雙特異性抗體具有良好開發能力。如第19圖所示，經由SDS-PAGE分析抗PD-L1-OX40 Ab-V5的完整性，並且在還原和非還原條件下顯示出良好的完整性。
表2、抗體的純度
抗體 由SEC-HPLC 測出的純度 (%)
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V4 92.27
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V5 96.46
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V6 86.36
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V7 88.04
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V8 90.00
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V9 87.89
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V10 86.56
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V11 86.61
Anti-PD-L1-OX40 Ab-V12 84.78
同時，工程化的雙特異性抗體變體也經由直接ELISA應用於人PD-L1和OX40的結合活性評估方法，如第20圖所示。所有雙特異性抗體變體顯示出對人類PD-L1有的相同結合活性(第21圖)，此結合活性與抗PD-L1殖株6抗體相似。在人類OX40結合測試中也觀察到這種現象(第22圖)。與其他變體相比，僅抗PD-L1-OX40 Ab-V10對人類OX40顯示出較弱的結合活性。這顯示OX40 scFv的工程化不會影響OX40的結合活性，PD-L1或OX40保留了結合活性。由於抗PD-L1-OX40 Ab-V5顯示出優異的抗體純度和對PD-L1和OX40的結合活性，因此選擇抗PD-L1-OX40 Ab-V5用於血清穩定性測試。
離體血清穩定性
在人血清(BioreclamationIVT，商品型號HMSRM)中評估穩定性，同時亦針對以及來自相關臨床前物種的血清進行評估：恒河猴(rhesus monkey，BioreclamationIVT，商品型號RHSSRM)和CD1小鼠(BioreclamationIVT，商品型號MSESRM)。將樣品以15 μg/mL的最終濃度加入到不同物種的血清，並在37ºC水浴中培養。在0、1、2、3、7、10和14天的培養時間後收集血清樣品，並在-80ºC下冷凍儲存直至進行分析。
三明治ELISA (sandwich ELISA)定量
取100 μL濃度為1 μg/mL於PBS中的OX40-Fc塗覆於ELISA孔盤(NUNC，商品型號442404)，並在4ºC隔夜培養。沖洗緩衝液為含有0.1% Tween-20 (Sigma，商品型號P2287-500 mL)的PBS，阻斷緩衝液為沖洗緩衝液中添加1%牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA，UniRegion，商品型號AR-BSA001- 100G)。在阻斷緩衝液中用10倍稀釋的方式連續稀釋3次以製備血清樣品，並在阻斷緩衝液中連續稀釋3次以製備出濃度為10 nM的標準品。使用標準操作準則將生物素化的PD-L1-Fc以生物素快速接合試劑盒(abcam，商品型號ab201796)進行標記，並在阻斷緩衝液中製備成30 nM。鏈黴親合素-辣根過氧化物酶(Streptavidin-HRP，Abcam公司，商品型號ab7403)在阻斷緩衝液中製備成濃度為1 μg/mL。以沖洗緩衝液洗滌3次後，將所有樣品以每孔100 μL加入孔盤中，並在室溫下培養1小時。用100 μL TMB溶液(Invitrogen，商品型號00-2023)進行TMB顯色2分鐘，並用100 μL 1N HCl溶液(Merck，商品型號1.00317.1000)終止反應。經由ELISA讀數器(Biotek，Powerwave XS)讀取OD 450 nm的吸收波長。
選擇抗PD-L1-OX40 Ab-V5用於離體血清穩定性，是因為其對於PD-L1和OX40具有優異的純度和結合活性。所述純化的雙特異性抗體與自不同物種，例如人類、小鼠或猴子的血清混合。培養數天後，取出樣品並藉由三明治ELISA分析以確定抗體含量。如第23圖所示，經過14天在37°C的培養後，抗PD-L1-OX40 Ab-V5仍表現出良好的血清穩定性。在人類、小鼠或猴子中的抗體濃度仍高於70%，顯示抗體也具有良好的血清穩定性。
為了測量抗PD-L1-OX40 Ab-V5抗體調節T細胞反應能力，將純化的T細胞與異體的樹突細胞一起培養，並藉由在GM-CSF和IL-4中培養單核細胞幾天來製備。設置平行孔盤以允許在第3天和第5天收集上清液，使用市售ELISA試劑盒分別測量IL-2和IFN-γ。如第24A圖和第24B圖所示，抗體處理3或5天後，在雙特異性抗體處理(V5)以及參考抗體中高度增加了IL-2和IFN-γ的產生。再者，抗PD-L1-OX40 Ab-V5抗體的增強效應，明顯優於單獨使用抗PD-L1抗體或抗OX40抗體的治療。這暗示工程化的雙特異性抗體V5仍然具有促效活性以及如同組合治療般而沒有喪失功能性，並且可以在未來開發為各種實體腫瘤或癌症的治療性抗體。
雙特異性抗體的抗腫瘤活性(體內模式)
由於PD-L1與OX40在雙特異性抗體中缺乏囓齒動物交叉反應性，阻礙了標準鼠同源或人類異種移植腫瘤模型用於評估抗體抗人類腫瘤的功效。因此，使用SCID-Bg小鼠(CB.17/Icr.Cg Pkrdcscid Lystbg /CrI)產生新的huPBL- SCID-Bg異種腫瘤小鼠模型，其含有米色(beige，Bg)突變、缺乏T和B淋巴細胞、與缺乏有功能性的自然殺手細胞(natural killer cell，NK cell)。使用如下所述的模型評估雙特異性抗體抗人腫瘤的功效。
PC-3人類前列腺取自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，並在含有L-麩胺酸(L-glutamine)、丙酮酸鈉(sodium pyruvate)、青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin)和10%熱滅活胎牛血清(heat-inactivated FBS，Gibco商品型號10437號)的RPMI-1640 (Invitrogen)中培養。細胞在T-150 Falcon燒瓶中生長至飽和。隨後，用胰蛋白酶處理細胞(胰蛋白酶0.25%-EDTA；Invitrogen)並將生長放大至足夠的細胞數用於接種。根據製造商的操作準則(STEMCELL Technologies Inc.)，使用LymphoprepTM 將從以肝素處裡之血液(heparinized blood)中分離出外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocytes，PBMC)。將計數的細胞懸浮液進行組合，使得每隻小鼠在PBS中單次推注(single bolus injection) 0.1 mL時，接受0.75×106 個PBMC和3×106 個腫瘤細胞。為了促進在小鼠內生長的腫瘤細胞，接著將另外0.1 mL基質膠(matrigel)與組合細胞懸浮液混合，然後立即注射到製備小鼠。
對於每隻小鼠，將0.2 mL體積的組合細胞懸浮液皮下注射到動物的右側腹中。接種14天後，形成實體瘤並達到約250至300 mm3 ，並且每週兩次持續三周以雙特異性抗體(10 mg/kg Anti-PD-L1-OX40 Ab-V5)、PD-L1參考抗體(Ref Ab, MPDL3280A)或對照組抗體(同型抗體，Isotype)以腹腔內注射(intraperitoneal injection，i.p.)的方式進行挑戰(challenged)。在實驗期間每週兩次通過Pressier卡尺進行腫瘤與測試樣品的測量，並且也記錄體重。腫瘤體積使用以下算式計算：長度×寬度2 ×0.44=體積(mm3 )並繪製在第25圖中。在實驗終止之前，腫瘤體積達到2000 mm3 或動物體重減輕20%的情況時將小鼠從研究中移除。當在接種後第7天測量腫瘤時觀察到類似的結果，並且根據腫瘤體積隨機分配動物。對於動物研究，每組包含6隻小鼠。如第25圖中顯示的數據，雙特異性抗體在PC-3異種移植小鼠模型中顯示出顯著的抗腫瘤成效。腫瘤大小在接種後18天有縮小，相同的結果在施予PD-L1參考抗體中也有觀察到，並繼續降低至100 mm3 以下。PC-3異種移植小鼠模型初步證明了雙特異性抗體的抗腫瘤作用，並揭示了其未來治療藥物的潛力。
總體來說，這些結果表示雙特異性抗體在PD-1/PD-L1信號傳導中維持其免疫檢查點阻斷，並對OX40訊號傳遞具促效活性。正在進行的研究將使用適當的動物模型進一步研究這些蛋白質的生物活性，例如人源化NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtmIwjI /SzJ (NSG)模型中的PC-3腫瘤。
本發明中的Fc區可以來自任何免疫球蛋白同型(immunoglobulin isotypes)、亞類(subclasses)、同種異型(allotypes)、或工程化突變體(engineered mutants)，例如鈕與扣的Fc片段(knob and hole Fc fragment)。
實施例
以下實施例描述了產生適合於將人類PD-L1和OX40作為目標與治療目的的單株抗體。從抗PD-L1抗體殖株6與OX40抗體殖株B17分別產生組合的人類抗人類PD-L1和抗OX40抗體。人類變異區(V區)序列的區段源自於與人類抗體(生殖細胞和非生殖細胞，germline and non-germline)無關的序列數據庫。
實施例1 產生與PD-L1和OX40結合的IgG抗體
本發明提供的特定抗體最初由Fabs與人類PD-L1或OX40結合產生。從噬菌體展示庫(phage display library)：OmniMab噬菌粒庫中選擇Fab，接著在交替篩選相應的Fc融合蛋白(PD-L1-Fc或OX40-Fc)和表達人類相應蛋白(PD-L1或OX40)的細胞。在直接ELISA或細胞基底ELISA (cell-based ELISA)篩選後，對陽性殖株的重鏈和輕鏈進行定序。這些Fab包括指定為PD-L1的「OM-PD-L1-6」和「OM-PD-L1-32」等；OX40的「OM- OX40-A4」、「OM-OX40-B17」和「OM-OX40-B19」等。本案揭示的PD-L1抗體：PD-L1-殖株3、PD-L1-殖株6和PD-L1-殖株32，從HEK293細胞或CHO-S細胞中的「OM-PD-L1-6」和「OM-PD-L1-32」產生。在此期間，本案揭示的OX40抗體：「OX40-A4」、「OX40-B17」及「OX40-B19」從HEK293細胞或CHO-S細胞中的「OM-OX40-A4」、「OM-OX40-B17」及「OM-OX40- B19」產生。同時將PD-L1和OX40作為目標的雙特異性抗體被設計為抗PD-L1 6-OX40 scFv B17抗體與抗PD-L1 6-OX40 scFv B19抗體。所提供的Fab之輕鏈可變區和重鏈可變區的胺基酸序列，分別與輕鏈可變區和重鏈可變區的胺基酸序列相同。
實施例2 抗PD-L1-OX40 scFv雙特異性抗體與其相應標的的體外結合
如第14圖所示，建構抗PD-L1-OX40雙特異性抗體並在HEK293細胞或CHO-S細胞中表達。藉由蛋白G層析從培養上清液中親和純化含有雙特異性抗體的培養基。接著濃縮經純化的抗體，然後在PBS緩衝液中透析並藉由SDS-PAGE分析如第15圖所示。為了在ELISA上測試純化的融合蛋白與PD-L1或OX40的直接結合能力，以每孔100 ng濃度的重組PD-L1或OX40塗覆在ELISA 96孔盤中。然後將各種濃度的純化抗PD-L1-OX40抗體加入每個孔槽中並培養1小時。洗滌後，每個孔槽中加入1：5000稀釋的抗Fab或辣根過氧化物酶接合物(Jackson Immunochemicals)並再培養1小時。最後洗滌後，加入TMB受質(Invitrogen Inc.)並測量450 nm處的OD吸光值。使用GraphPad Prism 5通過S形曲線擬合(sigmoidal curve fitting)分析數據和計算EC50 。
實施例3 由FACS分析抗PD-L1-OX40 scFv的抗原結合特異性
為了測試抗PD-L1-OX40 scFv抗體結合特異性，穩定表達PD-L1的293細胞、IFN-γ刺激的A549、或WiDr (結腸直腸腺癌細胞株)以1 μg/mL抗PD-L1-OX40 scFv抗體在冰上染色1小時，然後用1倍PBS洗滌三次。以Alexa® -488接合的山羊抗人類IgG (H+L)檢測結合的抗體融合蛋白，然後進行FACS分析。同型抗體為測試的陰性對照組。結果顯示，與單獨的抗PD-L1相比，抗PD-L1-OX40 scFv抗體維持其抗原結合特異性。還使用穩定表達OX40的293細胞測試了抗PD-L1-OX40 scFv抗體的結合特異性。
實施例4 雙功能性抗體的體外免疫調節作用
為了測量抗PD-L1-OX40 scFv抗體調節T細胞反應能力，將純化的T細胞與異體的樹突細胞一起培養，藉由在GM-CSF和IL-4中培養單核細胞幾天來製備。設置平行孔盤以允許在第3天和第5天收集上清液，使用市售ELISA試劑盒分別測量IL-2和IFN-γ。Genentech/Roche的人源化抗PD-L1 (MPDL3280A)將出現在預定孔盤中並作為陽性對照組。如第16A、16B圖所示，抗體施予3或5天後，雙特異性抗體處理以及組合處理下IL-2和IFN-γ的含量顯著提升。特別的是，由抗PD-L1殖株6抗體和抗OX40殖株B17抗體組成的雙特異性抗體(抗PD-L1-OX40 scFv B17 抗體)、或組合(抗PD-L1殖株6抗體和抗OX40殖株B17抗體)顯示T細胞活化的增強情形高於PD-L1和OX40參照抗體的組合(PD-L1 Ref Ab加上OX40 Ref Ab)。這顯示與參考OX40抗體GSK3174998相比，抗OX40 B17抗體可進行特異性表位(epitope，又稱抗原決定區)結合，從而產生更好的促效活性。
實施例5 體內雙特異性抗體誘導的人類白血球擴增
由於缺乏可檢測PD-L1或OX40抗體與鼠PD-L1或OX40的交叉反應性(cross-reactivity)、和對人免疫細胞存在的要求，因此需要開發用於雙特異性抗體之體內功能評估的模型。具有嚴重聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)突變和缺乏IL-2受體共同γ鏈(通常稱為NSG)的NOD遺傳背景的小鼠，能夠支持大量人類外周白血球(human peripheral blood leukocytes，huPBL)的植入並維持至少30天(King等人，2008)。此小鼠模型，也稱為huPBL-NSG模型，用於評估體內全身施用抗體對人免疫細胞的效果。
具體地，通過靜脈內注射將600萬新鮮分離的人類PBMC轉移到huPBL-NSG小鼠中。PBMC注射9天後，通過腹腔內注射給動物並施用單一1 mg/kg劑量之單株抗體、雙特異性抗體或IgG4同型對照抗體。在PBMC植入後第24至28天，通過流式細胞儀以人和鼠CD45抗體染色評估PBMC。前方和側向散射輪廓用於確定框選淋巴細胞範圍。雙特異性抗體能夠增強人類白血球的擴增，這可藉由移植小鼠外周血中人類CD45+ 細胞比例的增加來證明。每組具有n≥6隻小鼠。
實施例6 由抗PD-L1-OX40 scFv抗體對huPBL-NSG中PC-3或A498腫瘤細胞生長的抑制
屬於PD-L1陽性的人類前列腺癌細胞株PC-3 (ATCC® #CRL-1435)或腎癌細胞株A498 (ATCC® HTB-44TM )，可用於huPBL-NSG小鼠中建立異種移植模型。對於腫瘤形成，如上所述，將每隻小鼠3×106 個PC-3細胞(或A498細胞)以皮下注射到huPBL-NSG小鼠中。為了評估對腫瘤生長的抑制作用，小鼠腫瘤細胞植入14天後，將每週兩次持續4週以靜脈注射不同濃度的抗PD-L1-OX40 scFv抗體、參考抗體、或0.1至3 mg/kg的同型抗體。如Fox Chase SCID® Beige小鼠模型中所述，腫瘤生長將每週測量兩次持續5週。
實施例7 於小鼠和猴子中抗PD-L1-OX40 scFv的藥物動力學評估
將10 mg/kg至40 mg/kg雙功能蛋白(抗PD-L1-OX40 scFv)通過皮下注射或靜脈注射施予小鼠或猴子。在注射後不同時間點採集血清樣品至15天。使用三明治ELISA測定法測定血清樣品中Fc融合蛋白的濃度。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1圖顯示免疫檢查點調節T細胞介導的免疫。抗體可以依需求使用針對檢查點的促效或拮抗的(agonistic or antagonistic)抗體建構雙功能融合蛋白，例如抗ICOS、抗CD28、抗OX40、抗CD27、抗PD-1、抗CTLA4、抗LAG3、或抗BTLA。 第2A與2B圖顯示藉由直接酵素免疫分析法(direct enzyme-linked immunosorbent assay，direct ELISA)篩選重組PD-L1的噬菌體殖株(clone，又稱為克隆)。 第3A與3B圖顯示藉由細胞基底ELISA篩選表達OX40的人類胚胎腎細胞293 (human embryonic kidney 293 cells，HEK293)之噬菌體殖株。 第4圖顯示通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)以非還原試劑對PD-L1專一性之抗體先導物(antibody lead)純化，以揭示其完整性和純度。 第5圖顯示通過SDS-PAGE以非還原或還原試劑對OX40專一性之抗體先導物純化，以揭示其完整性和純度。NR，非還原型(non-reducing)、R，還原型(reducing)。 第6圖顯示純化的抗免疫檢查點蛋白的直接配體結合活性與抗PD-L1抗體先導物拮抗PD-L1的實施例。首先將以配體預先塗覆(pre-coated)的孔槽與所示各種濃度的抗體先導物一起培養。然後用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)接合(conjugated)的山羊抗人類IgG Fab特異性抗體檢測結合的蛋白質，並依OD450 讀值繪圖。 第7圖顯示純化的抗免疫檢查點蛋白的直接配體結合活性與抗OX40抗體先導物拮抗OX40的實施例。首先將以配體預先塗覆的孔槽與所示各種濃度的抗體先導物一起培養。然後用辣根過氧化物酶接合的山羊抗人類IgG Fab特異性抗體檢測結合的蛋白質，並依OD450 讀值繪圖。 第8圖顯示使用表現PD-L1的293細胞的流式分析(flow analysis)。表現PD-L1的HEK293首先與純化的抗體先導物一起培養，並用Alexa® -488接合的山羊抗人類IgG (重鏈+輕鏈，H+L)檢測結合的抗體，然後進行螢光活化細胞分選儀(fluorescence-activated cell sorter，FACS)分析。 第9圖顯示使用表現OX40的293細胞的流式分析。表現OX40的HEK293首先與純化的抗OX40抗體先導物一起培養，並用Alexa® -488接合的山羊抗人類IgG (H+L)檢測結合的抗體，然後進行螢光活化細胞分選儀分析。NS：沒有染色(no staining)。 第10圖顯示以純化的抗PD-L1抗體阻礙PD-1/PD-L1的相互作用。將所示的純化抗體用於具有生物素的PD-L1-Fc和重組人類PD-1/His (hPD-1/His)以評估PD-1/PD-L1相互作用的抑制活性。藉由鏈黴親合素(streptavidin)-HRP檢測重組PD-L1-Fc與hPD-1/His的結合，並通過ELISA分析。 第11A和11B圖顯示在抗體治療3天(第11A圖)或5天(第11B圖)後，具有1或10微克/毫升(μg/mL)的抗PD-L1抗體先導物於混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)分析中刺激T細胞的增殖與IL-2及/或IFN-γ (干擾素-γ，Interferon-γ)的產生。 第12A圖顯示抗OX40抗體先導物藉由劑量反應(dosage response)增強CD3+ T細胞活化的能力，參考抗體也有相同的結果。第12B圖顯示人類T細胞以結合於孔盤中的抗CD3抗體和幾種濃度的抗OX40抗體先導物刺激3天後，存在於細胞培養基中的人類IL-2和IFN-γ濃度。 第13A和13B圖顯示人類T細胞以結合於孔盤中的抗CD3抗體和幾種濃度的抗OX40抗體先導物經過3天的刺激後，存在於細胞培養基中人類IL-2 (第13A圖)和IFN-γ (第13B圖)的濃度。 第14圖顯示抗體重鏈Fc與OX40特異性scFv區融合的結構。 第15圖顯示抗免疫檢查點抗體-OX40融合蛋白的PAGE凝膠分析的實施例。純化的融合蛋白-抗PD-L1-OX40 scFv融合蛋白顯示分別具有約220千道爾吞(kDa)的分子量(non-reducing，NR，非還原型)，並且皆具有約85 kDa的重鏈和約25 kDa的輕鏈(reducing，R，還原型)。每欄注入3 μg。 第16A和16B圖顯示在單一、結合、或抗PD-L1-OX40 scFv雙特異性抗體治療3天或5天後，雙特異性抗體於MLR分析中協同刺激T細胞活化使IL-2 (第16A圖)及IFN-γ (第16B圖)產生。 第17A至17E圖分別顯示雙特異性抗體：抗PD-L1-OX40抗體、和抗PD-L1-OX40 Ab-V1至V4的聚集和純度測定，且雙特異性抗體在OX40 scFv中具有5種不同的連接子。 第18圖顯示選自OX40殖株B17 scFv的抗PD-L1-OX40 Ab-V4至V12的序列變體(sequence variants)。 第19圖顯示抗免疫檢查點抗體-OX40融合蛋白的PAGE凝膠分析的實施例。純化的融合蛋白-抗PD-L1-OX40 Ab-V5融合蛋白顯示分別具有約220千道爾吞(kDa)的分子量(非還原型)，並且皆具有約80 kDa的重鏈和約30 kDa的輕鏈(還原型)。 第20圖顯示評估雙特異性抗體變體的結合活性的ELISA方法的流程圖。 第21圖顯示雙特異性抗體變體對人類PD-L1的結合活性及其EC50 。 第22圖顯示雙特異性抗體變體對人類OX40的結合活性及其EC50 。 第23圖顯示雙特異性抗體變體：抗PD-L1-OX40 Ab-V5的離體血清穩定性。 第24A和24B圖顯示經單一、結合、或抗PD-L1-OX40 Ab-V5雙特異性抗體調節T細胞後，於治療3天IL-2的產量(第24A圖)與5天IFN-γ的產量(第24B圖)。 第25圖為顯示抗PD-L1-OX40 Ab-V5雙特異性抗體和單株抗體治療於Fox Chase SCID® Beige小鼠中，PC-3腫瘤生長影響的圖式。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無
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Claims (4)

  1. 一種與PD-L1結合的抗體或其抗原結合部分，包含： 一重鏈可變區，包含一胺基酸序列，該胺基酸序列係選自於由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4所組成之群組；以及 一輕鏈可變區，包含一胺基酸序列，該胺基酸序列係選自於由SEQ ID NO:1的第1-111個位置胺基酸及SEQ ID NO:3的第1-110個位置胺基酸所組成之群組； 其中，SEQ ID NO:2與SEQ ID NO:1的第1-111個位置胺基酸為一組，除了該重鏈可變區的互補決定區(complementarity-determining region，CDR)胺基酸序列與該輕鏈可變區的CDR胺基酸序列之外，該重鏈可變區的胺基酸序列及該輕鏈可變區的胺基酸序列分別與SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:1的第1-111個位置具有至少約90%的序列同源性； 其中，SEQ ID NO:4與SEQ ID NO:3的第1-110個位置胺基酸為一組，除了該重鏈可變區的CDR胺基酸序列與該輕鏈可變區的CDR胺基酸序列之外，其該重鏈可變區的胺基酸序列及該輕鏈可變區的胺基酸序列分別與SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:3的第1-110個位置胺基酸具有至少約90%的序列同源性。
  2. 一種醫藥組成物，包含： 一如請求項1所述之抗體或其抗原結合部分；以及 至少一藥學上可接受的載劑。
  3. 一種如請求項1所述之抗體或其抗原結合部分的用途，其係用於製備治療癌症的藥物，其中該癌症係選自於由前列腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、乳癌、頭頸癌、腎細胞癌和卵巢癌所組成之群組。
  4. 一種核酸分子，其編碼如請求項1所述之抗體或其抗原結合部分。
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