JP2022109934A - 癌治療のために免疫チェックポイントを調節する単一特異性および二重特異性タンパク質 - Google Patents
癌治療のために免疫チェックポイントを調節する単一特異性および二重特異性タンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022109934A JP2022109934A JP2022067239A JP2022067239A JP2022109934A JP 2022109934 A JP2022109934 A JP 2022109934A JP 2022067239 A JP2022067239 A JP 2022067239A JP 2022067239 A JP2022067239 A JP 2022067239A JP 2022109934 A JP2022109934 A JP 2022109934A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- seq
- amino acids
- antigen
- chain variable
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000037982 Immune checkpoint proteins Human genes 0.000 title claims description 13
- 108091008036 Immune checkpoint proteins Proteins 0.000 title claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 20
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 title description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 106
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims abstract description 98
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims abstract description 92
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 43
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 101000679851 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 91
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 39
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 claims description 26
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 claims description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 10
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 9
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 9
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 claims description 8
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 7
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 6
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 101001137987 Homo sapiens Lymphocyte activation gene 3 protein Proteins 0.000 claims description 5
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 5
- 102100020862 Lymphocyte activation gene 3 protein Human genes 0.000 claims description 5
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 claims description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 5
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 4
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 3
- 102000008096 B7-H1 Antigen Human genes 0.000 abstract 3
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 38
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 34
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 31
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 28
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 28
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 24
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 15
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 15
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 13
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 13
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 10
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 9
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 8
- 101000611936 Homo sapiens Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 8
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 7
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 7
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 101001117317 Homo sapiens Programmed cell death 1 ligand 1 Proteins 0.000 description 6
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 6
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 6
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000048776 human CD274 Human genes 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 5
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000004815 positive regulation of T cell activation Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 4
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000011284 combination treatment Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 102000050320 human TNFRSF4 Human genes 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 2
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 description 2
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 description 2
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 2
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 2
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000048362 human PDCD1 Human genes 0.000 description 2
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 235000020121 low-fat milk Nutrition 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000016412 positive regulation of cytokine production Effects 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 2
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N Endothion Chemical compound COC1=COC(CSP(=O)(OC)OC)=CC1=O YCAGGFXSFQFVQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101100005713 Homo sapiens CD4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000851181 Homo sapiens Epidermal growth factor receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018682 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Human genes 0.000 description 1
- 108010066719 Interleukin Receptor Common gamma Subunit Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 206010051676 Metastases to peritoneum Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- -1 PD-L1 Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N Proflavine Chemical compound C1=CC(N)=CC2=NC3=CC(N)=CC=C3C=C21 WDVSHHCDHLJJJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229960000419 catumaxomab Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000002737 cell proliferation kit Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000004940 costimulation Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 208000037828 epithelial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005746 immune checkpoint blockade Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 208000010918 peritoneal neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000007781 signaling event Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/75—Agonist effect on antigen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
【課題】OX40および/またはPD-L1に特異的に結合する単一特異性および二重特異性タンパク質を提供する。【解決手段】OX40(CD134)に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、特定のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、特定のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。また、PD-L1に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、特定のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、特定のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。さらに、OX40結合部位およびPD-L1結合部位を含む二重特異性抗体を提供する。【選択図】なし
Description
(発明の分野)
本発明は、抗体に関する。より詳細には、本発明は、癌治療のための抗体に関する。
本発明は、抗体に関する。より詳細には、本発明は、癌治療のための抗体に関する。
(関連分野の説明)
ヒトにおけるリンパ球の2つの主要なタイプは、T(胸腺由来)およびB(骨髄由来)である。これらの細胞は、リンパ球発達経路に運命付けられた骨髄および胎児肝臓の造血幹細胞に由来する。これらの幹細胞の後代は、Bリンパ球またはTリンパ球に成熟するための分岐経路に従う。ヒトBリンパ球発達は、完全に骨髄内において生じる。その一方で、T細胞は、骨髄を去って血流によって胸腺まで移動する未成熟前駆体から発達し、そこで、それらは、増殖し、成熟Tリンパ球へと分化する。
ヒトにおけるリンパ球の2つの主要なタイプは、T(胸腺由来)およびB(骨髄由来)である。これらの細胞は、リンパ球発達経路に運命付けられた骨髄および胎児肝臓の造血幹細胞に由来する。これらの幹細胞の後代は、Bリンパ球またはTリンパ球に成熟するための分岐経路に従う。ヒトBリンパ球発達は、完全に骨髄内において生じる。その一方で、T細胞は、骨髄を去って血流によって胸腺まで移動する未成熟前駆体から発達し、そこで、それらは、増殖し、成熟Tリンパ球へと分化する。
(T細胞)
T細胞は、最も大量で(血液リンパ球の約75%)、強力な免疫キラー細胞である。抗腫瘍性免疫応答におけるエフェクターT細胞の役割は、インビトロ研究および、腫瘍のいくつかのタイプにおけるCD8+T細胞の高浸潤が好ましい臨床予後と相関関係を有するという観察によって強く支持される(Fridman et al.,2012)。エフェクターナイーブT細胞の活性化は、少なくとも3つの相補シグナル:(i)共受容体(CD4またはCD8)の支援によるTCR-CD3/Ag-MHC相互作用;(ii)CD80またはCD86などの共刺激性分子のCD28、CD40/CD40Lへの結合;および(iii)サイトカインなどのアクセサリ分子を必要とする。
T細胞は、最も大量で(血液リンパ球の約75%)、強力な免疫キラー細胞である。抗腫瘍性免疫応答におけるエフェクターT細胞の役割は、インビトロ研究および、腫瘍のいくつかのタイプにおけるCD8+T細胞の高浸潤が好ましい臨床予後と相関関係を有するという観察によって強く支持される(Fridman et al.,2012)。エフェクターナイーブT細胞の活性化は、少なくとも3つの相補シグナル:(i)共受容体(CD4またはCD8)の支援によるTCR-CD3/Ag-MHC相互作用;(ii)CD80またはCD86などの共刺激性分子のCD28、CD40/CD40Lへの結合;および(iii)サイトカインなどのアクセサリ分子を必要とする。
T細胞への共刺激または2つの異なるシグナルの提供は、抗原提示細胞(APC)による静止Tリンパ球のリンパ球活性化の、広く受け入れられたモデルである(Lafferty and Cunningham,1975)。このモデルは、さらに、自己と非自己との区別および免疫寛容性を提供する(Bretscher and Cohn,1970;Bretscher,1999;Jenkins and Schwartz,1987)。一次シグナル、または抗原特異的シグナルは、主要組織適合複合体(MHC)との関連において提示される外来抗原ペプチドの認識に従ってT細胞受容体(TCR)を介して変換される。二次または共刺激シグナルが、抗原提示細胞(APC)上に発現した共刺激性分子によってT細胞に届けられ、T細胞に、クローン増殖、サイトカイン分泌、およびエフェクター機能を促進するように仕向ける(Lenschow et al.,1996)。共刺激の不在下において、T細胞は、抗原刺激に対して抵抗性となり得、有効な免疫応答を開始せず、さらに、結果として、外来抗原に対して疲弊または寛容性を生じ得る。
(免疫チェックポイントタンパク質:PD-L1およびOX40)
免疫チェックポイントは、通常、付随的な組織損傷を最小限に抑えるため、自己寛容性を維持し、末梢組織における生理学的応答の持続期間および振幅を調節するために、免疫系、具体的にはT細胞媒介性免疫を張り巡らせるリガンド-受容体相互作用によって開始される、阻害性および刺激性経路のグループを意味する(Pardoll,2012)。腫瘍細胞は、免疫抵抗性の主要メカニズムとして、ある特定のチェックポイント経路を選出する。例えば、プログラム細胞死タンパク質1リガンドのPD-L1は、一般的に、ヒト癌の腫瘍細胞表面において上方制御される。PD-L1と、腫瘍浸透リンパ球(TIL)、特にT細胞、において発現される、その受容体であるPD-1との相互作用は、局所的T細胞媒介性応答を阻害することにより、免疫監視から逃れる(Liang et al.,2006;Sznol and Chen,2013)。したがって、癌細胞での免疫抑制性シグナルの阻害、またはT細胞の直接的アゴニスト刺激は、強い持続性の抗腫瘍免疫応答を生じるおよび/または誘起する。最近の臨床研究は、抗体を介した、または可溶性リガンドまたは受容体によって調節される、免疫チェックポイントタンパク質の遮断が、治療的抗腫瘍免疫の達成に対する最も有望なアプローチであることを強く示唆した(Topalian et al.,2014)。現在、抗PD-1および抗CTLA-4(細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4)抗体が、黒色腫などの疾患を治療するために、FDAによって承認されている。
免疫チェックポイントは、通常、付随的な組織損傷を最小限に抑えるため、自己寛容性を維持し、末梢組織における生理学的応答の持続期間および振幅を調節するために、免疫系、具体的にはT細胞媒介性免疫を張り巡らせるリガンド-受容体相互作用によって開始される、阻害性および刺激性経路のグループを意味する(Pardoll,2012)。腫瘍細胞は、免疫抵抗性の主要メカニズムとして、ある特定のチェックポイント経路を選出する。例えば、プログラム細胞死タンパク質1リガンドのPD-L1は、一般的に、ヒト癌の腫瘍細胞表面において上方制御される。PD-L1と、腫瘍浸透リンパ球(TIL)、特にT細胞、において発現される、その受容体であるPD-1との相互作用は、局所的T細胞媒介性応答を阻害することにより、免疫監視から逃れる(Liang et al.,2006;Sznol and Chen,2013)。したがって、癌細胞での免疫抑制性シグナルの阻害、またはT細胞の直接的アゴニスト刺激は、強い持続性の抗腫瘍免疫応答を生じるおよび/または誘起する。最近の臨床研究は、抗体を介した、または可溶性リガンドまたは受容体によって調節される、免疫チェックポイントタンパク質の遮断が、治療的抗腫瘍免疫の達成に対する最も有望なアプローチであることを強く示唆した(Topalian et al.,2014)。現在、抗PD-1および抗CTLA-4(細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4)抗体が、黒色腫などの疾患を治療するために、FDAによって承認されている。
別の共刺激性分子は、OX40受容体(CD134)であり、これは、TNFRスーパーファミリーのメンバであり、膜結合性で、主に、活性化されたCD4+T細胞において発現される(Paterson et al.,1987)。OX40受容体(本明細書の以下において、「OX40」)によるシグナル伝達は、エフェクターT細胞に対して共刺激性であり、T細胞の増殖を引き起こす(Watts,2005;Weinberg et al.,1994)。OX40の研究は、その主な役割が、一次免疫応答において蓄積するエフェクターT細胞の数を決定すること、およびその結果、続いて増殖し生き残る記憶T細胞の数を支配することであることを示唆している(Croft,2003)。いくつかのインビトロ研究は、OX40が、共刺激シグナルを提供し、結果として、増強されたT細胞増殖およびサイトカイン産生を生じることを示していた。
(二重特異性/二官能性抗体)
エフェクター免疫細胞に腫瘍細胞を効率的に再標的化させるために二重特異性抗体を使用するアイデアは、1980年代に現れた(Karpovsky et al.,1984;Perez et al.,1985;Staerz et al.,1985)。二重特異性抗体は、一般的に、Fc断片、IgG様分子、および小さい組換え二重特異性形式(それらの大部分は、単鎖可変断片(scFv)に由来する)の有無に基づいて、異なる薬物動力学特性を有する2つの主要な群に分類される。抗体断片は、それらのコンパクトなサイズにより、通常、IgG様分子よりも効率的に腫瘍に浸透するが、この利点は、それらの全体的腫瘍取り込みおよび滞留時間を制限する短い血清半減期(数時間)によって緩和される(Goldenberg et al.,2007)。対照的に、新生児Fc受容体に結合するFc断片の存在は、IgG様形式に対して長い血清半減期(>10日)を提供し、これは、腫瘍取り込みおよび滞留に有利に働くが、腫瘍浸透を制限する。
エフェクター免疫細胞に腫瘍細胞を効率的に再標的化させるために二重特異性抗体を使用するアイデアは、1980年代に現れた(Karpovsky et al.,1984;Perez et al.,1985;Staerz et al.,1985)。二重特異性抗体は、一般的に、Fc断片、IgG様分子、および小さい組換え二重特異性形式(それらの大部分は、単鎖可変断片(scFv)に由来する)の有無に基づいて、異なる薬物動力学特性を有する2つの主要な群に分類される。抗体断片は、それらのコンパクトなサイズにより、通常、IgG様分子よりも効率的に腫瘍に浸透するが、この利点は、それらの全体的腫瘍取り込みおよび滞留時間を制限する短い血清半減期(数時間)によって緩和される(Goldenberg et al.,2007)。対照的に、新生児Fc受容体に結合するFc断片の存在は、IgG様形式に対して長い血清半減期(>10日)を提供し、これは、腫瘍取り込みおよび滞留に有利に働くが、腫瘍浸透を制限する。
最近の研究は、癌細胞を破壊するために患者自身の免疫系を利用する癌治療の類である免疫療法の治療有効性を強調している。腫瘍内において、まとめて「チェックポイント阻害因子」として知られるネガティブ調節分子のファミリーの存在は、抗腫瘍免疫を抑制するT細胞の機能を阻害することができる。CTLA-4およびPD-1などのチェックポイント阻害因子は、T細胞増殖およびサイトカイン産生を減少させる。アンタゴニストモノクローナル抗体(mAb)によるCTLA-4およびPD-1の標的化された遮断は、抗腫瘍免疫を高めるために、T細胞上に「ブレーキ」を放出する。最適な「キラー」CD8+T細胞応答を生じさせるには、T細胞受容体活性化と共刺激も必要とし、それらは、OX40(CD134)および4-1BB(CD137)を含む、腫瘍壊死因子受容体のファミリーメンバのライゲーションによって提供することができる。OX40は、様々な腫瘍に対する高められた抗腫瘍免疫を生じるT細胞分化およびサイトカイン機能を増加させる賦活性(アゴニスト)抗OX40mAbによる治療として、特に関心が高い。単剤として使用される場合、これらの薬物は、転移性疾患を患う患者において、強力な臨床および免疫性応答を引き起こすことができる(Linch et al.,2015)。
本開示は、前立腺癌、肺癌、NSCLC、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、RCC、または卵巣癌などの癌を患う患者の治療を目的とする免疫調節する二重特異性抗体を調査するために設定された。
本開示は、OX40(CD134)に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号6、配列番号8、配列番号10のアミノ酸128~246、および配列番号13のアミノ酸124~241からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5のアミノ酸1~108、配列番号7のアミノ酸1~108、配列番号10のアミノ酸1~112、および配列番号13のアミノ酸1~108からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。
一実施形態において、当該抗体またはその抗原結合性部分は、配列番号10、11、12、および13からなる群より選択される単鎖可変断片(scFv)配列である。
一実施形態において、当該抗体またはその抗原結合性部分は、二重特異性抗体である。
一実施形態において、当該二重特異性抗体は、免疫チェックポイントタンパク質結合部位を含む。
一実施形態において、当該免疫チェックポイントタンパク質結合部位は、プログラム細胞死タンパク質1リガンド(PD-L1)結合部位、PD-1結合部位、上皮増殖因子受容体(EGFR)結合部位、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)結合部位、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)結合部位、またはリンパ球活性化遺伝子3(LAG3)結合部位を含む。
本開示は、PD-L1に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、配列番号2および配列番号4からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号1のアミノ酸1~111および配列番号3のアミノ酸1~110からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む抗体またはその抗原結合性部分も提供する。
本開示は、少なくとも1つのポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体も提供し、この場合、当該ポリペプチド鎖は、OX40結合部位およびPD-L1結合部位を含む。当該OX40結合部位は、配列番号6、配列番号8、配列番号10のアミノ酸128~246、および配列番号13のアミノ酸124~241からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5のアミノ酸1~108、配列番号7のアミノ酸1~108、配列番号10のアミノ酸1~112、および配列番号13のアミノ酸1~108からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。当該PD-L1結合部位は、配列番号2および配列番号4からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の配列相同性のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号1のアミノ酸1~111および配列番号3のアミノ酸1~110からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の相同性のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
一実施形態において、当該ポリペプチド鎖は、さらに、Fcドメイン、Fab断片、およびscFvを含む。当該Fab断片は、FcドメインのN末端に接続されており、ならびに当該Fab断片は、PD-L1結合部位を含む。当該scFvは、当該FcドメインのC末端に接続されており、ならびに当該scFvは、OX40結合部位を含む。
一実施形態において、当該ペプチド鎖は、さらに、FcドメインとscFvとの間にリンカーを含む。
一実施形態において、当該scFvは、配列番号18のアミノ酸455~707、配列番号19のアミノ酸455~708、配列番号20のアミノ酸455~701、配列番号21のアミノ酸455~706、配列番号22のアミノ酸455~706、配列番号23のアミノ酸455~706、配列番号24のアミノ酸455~706、配列番号25のアミノ酸455~706、配列番号26のアミノ酸455~706、配列番号27のアミノ酸455~706、配列番号28のアミノ酸455~706、および配列番号29のアミノ酸455~706からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、当該二重特異性抗体は、一対のポリペプチド鎖を含む。
一実施形態において、当該二重特異性抗体は、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、またはIgY抗体である。
一実施形態において、当該二重特異性抗体は、IgG抗体である。
一実施形態において、当該IgG抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4抗体である。
本開示は、治療薬と、PD-L1および/またはOX40に結合する抗体または抗原結合性部分とを含む抗体-薬物コンジュゲートであって、当該治療薬は、リンカーによって、当該抗体または当該抗原結合性部分に共有結合的にコンジュゲートされている、抗体-薬物コンジュゲートも提供する。
一実施形態において、当該抗体または抗原結合性部分は、上記において言及した抗体または抗原結合性部分から選択される。
本開示は、上記において言及した抗体、その抗原結合性部分、または二重特異性抗体と、少なくとも1種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。
本開示は、上記において言及した抗体、その抗原結合性部分、または二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、癌を治療する方法も提供する。
一実施形態において、当該癌は、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫(RCC)、および卵巣癌からなる群より選択される。
本開示は、上記において言及した抗体、その抗原結合性部分、または二重特異性抗体、をコードする核酸分子も提供する。
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明はいずれも、一例であり、請求項に係る本発明のさらなる説明を提供することが意図されることは理解されるべきである。
本発明は、以下の添付の図面に対する言及と共に、実施形態についての以下の詳細な説明を読むことによって、より完全に理解することができる。
(詳細な説明)
参照は、以下において、本発明の本実施形態に対して詳細になされ、その例は、添付の図面に示される。同じまたは同様の部分を参照するために、図面および説明において、可能な限り、同じ参照番号が使用される。
参照は、以下において、本発明の本実施形態に対して詳細になされ、その例は、添付の図面に示される。同じまたは同様の部分を参照するために、図面および説明において、可能な限り、同じ参照番号が使用される。
本発明は、抗免疫チェックポイントタンパク質抗体のFcドメインのC末端に融合された単離された機能性アゴニストOX40 scFvを用いた二官能性タンパク質の発現、精製、および特徴付けについて説明する。これらのタンパク質は、T細胞関与免疫を調節するために阻害性または刺激性シグナルを伝達するその対応するチェックポイント標的と相互作用する。本発明におけるFc融合タンパク質の成分は、全てヒト起源であり、したがって、非免疫原性であることが期待され、ならびにヒトの治療に使用することができる。
二重特異性抗体(BsAb)などの二重特異性分子は、単一の治療薬によって、同じ分子標的または異なる標的上の複数のエピトープを同時に標的化する手段を提供する。癌治療として、それらは、2種のmAbの混合物とは対照的に、新規のまたはより強力な活性を付与し、商品コストを下げ、新規の治療計画の開発を促進する、可能性を有する(Chames and Baty,2009;Hollander,2009;Thakur and Lum,2010)。最近、ヒト上皮細胞接着分子(EpCAM)およびCD3を標的とする三官能性二重特異性抗体であるカツマキソマブが、上皮癌の腹膜癌症を患う患者において明確な臨床的有益性を示し(Heiss et al.,2010)、CD19およびCD3に対する二重特異性を有する二重特性T細胞誘導(bispecific T-cell engaging:BiTE)抗体も、CD19を発現する血液悪性腫瘍を患う患者において、臨床的活性を高めることを実証した(Bargou et al.,2008)。癌治療としての二重特異性分子の開発に対する強い関心にもかかわらず、安定で活性な二重特異性分子の製造における技術的課題は、過去において、ほとんどの二重特異性形式の臨床評価を妨げてきた。IgG様二重特異性抗体を含む多くの遺伝子改変抗体形式は、安定性または溶解性を妥協してきた(Bargou et al.,2008;Demarest and Glaser,2008;Lu et al.,2005)。その上、二重特異性分子の製造物品質およびインビボ安定性を増加させるために、ペグ化、ヒト血清アルブミンとのコンジュゲート化、およびFc遺伝子改変を含む、いくつかの戦略が取られてきた(Muller et al.,2007;Ridgway et al.,1996)。上記において説明される一般的な形式の二重特異性単鎖抗体は、4つのVドメインをコードするヌクレオチド配列、2つのリンカー、および1つのスペーサーを、単一のプロモータの制御下において、好適な宿主発現生物に組み込むことができるという利点を有する。このことは、作製の際の実験者による制御の度合いと同様に、これらの構築物を設計する際のフレキシビリティーを増加させる。さらに、IgGのFcは、結合能力を除く全ての抗体の機能を含むため、新規の治療法を設計するための非常に魅力的な別の足場である。Fc遺伝子改変は、当該二重特異性抗体の有効性を向上させるために重要である。したがって、本発明では、免疫療法における免疫細胞または標的細胞上の2つの非依存性標的に対して、IgGベースの立体配座を使用している。
免疫チェックポイントタンパク質の標的化は、抗腫瘍免疫を活性化するための、将来有望なアプローチである。抗チェックポイントタンパク質(例えば、PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3など)は、現在、臨床的に評価されている(図1)。免疫チェックポイントタンパク質の遮断剤による予備的データは、持続性の臨床反応を生じさせる可能性を有する抗腫瘍免疫を増加させることができることが分かっている。しかしながら、多くの悪性腫瘍におけるこれらの薬剤の顕著な臨床有効性にもかかわらず、それらが、多くの患者にとって十分に有効ではないことが明らかになった。多数の追加の免疫調節経路ならび、腫瘍内微小環境において骨髄細胞または間質細胞によって発現または分泌される阻害因子は、免疫チェックポイント遮断との相乗作用のための潜在的標的である。したがって、抗癌療法または二重特異性抗体療法を組み合わせることは、癌を患う患者に対して完全な寛解および回復を達成するために不可欠であった。
本発明は、異なる免疫チェックポイントタンパク質特異的scFvタンパク質と融合した抗免疫チェックポイントタンパク質抗体Fcの構築、発現、およびキャラクタリゼーションについて説明する。例えば、融合の相手方が、免疫系増強剤(例えば、抗EGFR、抗HER2、または抗CTLA-4抗体など)である場合、融合構築物においてC末端に位置されたOX40 scFvは、OX40活性化アプローチを超える融合タンパク質の力の拡張を可能にする。
(OmniMabライブラリからの抗体生成)
PD-L1またはOX40に対する治療抗体の生成のために、OmniMabファージミドライブラリによる選択を実施した。当該ファージミドライブラリは、百を超える健康なドナーB細胞のコレクションからAP Biosciences Inc.(APBio Inc.)によって生成される。パンニングの第一ラウンドのためのファージを、Hyperphage(Μ13Κ07ΔρΙΙΙ、Progen,ハイデルベルク,ドイツ)によって調製した。PD-L1またはOX40特異的バインダー選択およびOmniMabライブラリからの単離に対して、PD-L1またはOX40に対する固相パンニングおよび細胞パンニングを適用した。固相パンニングは、第一ラウンド選択において組換えヒトPD-L1-FcまたはOX40-Fc(APBio Inc.)を使用して実施し、次いで、第二および第三ラウンドの濃縮に対して、PD-L1またはOX40を発現したHEK293細胞を使用した。3つのラウンド選択の後、当該特異的PD-L1またはOX40バインダーをスクリーニングし、対応する組換えタンパク質による直接的ELISAまたは細胞ベースELISAによって単離した(図2A、2B、3A、および3B)。予めコーティングしたPD-L1-Fc組換えタンパク質またはOX40発現293細胞を、レスキューされたファージを含有する上清を用いて1時間ブロットし、0.1%のTween-20を含有するPBSで3回洗浄した。結合したファージを、HRP標識抗M13抗体(Roche)によって検出し、シグナル発生のために、TMB基質を使用した。OD450の読み取り値を記録した。ポジティブバインダーを単離し、重鎖および軽鎖の配列および多様性を確認するために配列決定を行った。PD-L1またはOX40に対して特異的な重鎖および軽鎖の可変領域は、配列番号1から配列番号8で記述され:この場合、配列番号1は、PD-L1クローン6の軽鎖であり、配列番号2は、PD-L1クローン6の重鎖の可変領域であり、配列番号3は、PD-L1クローン32の軽鎖であり、配列番号4は、PD-L1クローン32の重鎖の可変領域であり、配列番号5は、OX40クローンB17の軽鎖であり、配列番号6は、OX40クローンB17の重鎖の可変領域であり、配列番号7は、OX40クローンB19の軽鎖であり、配列番号8は、OX40クローンB19の重鎖の可変領域である。図2A、2B、3A、および3Bに示されるように、いくつかのクローンを単離し、それらは、ネガティブコントロールと比較して、対応する抗原に対して特異的に認識されることが分かった。
PD-L1またはOX40に対する治療抗体の生成のために、OmniMabファージミドライブラリによる選択を実施した。当該ファージミドライブラリは、百を超える健康なドナーB細胞のコレクションからAP Biosciences Inc.(APBio Inc.)によって生成される。パンニングの第一ラウンドのためのファージを、Hyperphage(Μ13Κ07ΔρΙΙΙ、Progen,ハイデルベルク,ドイツ)によって調製した。PD-L1またはOX40特異的バインダー選択およびOmniMabライブラリからの単離に対して、PD-L1またはOX40に対する固相パンニングおよび細胞パンニングを適用した。固相パンニングは、第一ラウンド選択において組換えヒトPD-L1-FcまたはOX40-Fc(APBio Inc.)を使用して実施し、次いで、第二および第三ラウンドの濃縮に対して、PD-L1またはOX40を発現したHEK293細胞を使用した。3つのラウンド選択の後、当該特異的PD-L1またはOX40バインダーをスクリーニングし、対応する組換えタンパク質による直接的ELISAまたは細胞ベースELISAによって単離した(図2A、2B、3A、および3B)。予めコーティングしたPD-L1-Fc組換えタンパク質またはOX40発現293細胞を、レスキューされたファージを含有する上清を用いて1時間ブロットし、0.1%のTween-20を含有するPBSで3回洗浄した。結合したファージを、HRP標識抗M13抗体(Roche)によって検出し、シグナル発生のために、TMB基質を使用した。OD450の読み取り値を記録した。ポジティブバインダーを単離し、重鎖および軽鎖の配列および多様性を確認するために配列決定を行った。PD-L1またはOX40に対して特異的な重鎖および軽鎖の可変領域は、配列番号1から配列番号8で記述され:この場合、配列番号1は、PD-L1クローン6の軽鎖であり、配列番号2は、PD-L1クローン6の重鎖の可変領域であり、配列番号3は、PD-L1クローン32の軽鎖であり、配列番号4は、PD-L1クローン32の重鎖の可変領域であり、配列番号5は、OX40クローンB17の軽鎖であり、配列番号6は、OX40クローンB17の重鎖の可変領域であり、配列番号7は、OX40クローンB19の軽鎖であり、配列番号8は、OX40クローンB19の重鎖の可変領域である。図2A、2B、3A、および3Bに示されるように、いくつかのクローンを単離し、それらは、ネガティブコントロールと比較して、対応する抗原に対して特異的に認識されることが分かった。
(IgG形式としての選択されたPD-L1またはOX40特異的バインダーのサブクローニングおよび発現/精製)
T細胞活性化における機能性を有する特異的バインダーの迅速なスクリーニングを容易にするために、ELISAによるPD-L1またはOX40に対するポジティブバインダーの重鎖および軽鎖を増幅し、消化し、IgG4定常領域(配列番号9)を保持するAPBio専用IgG発現ベクター中へサブクローニングした。配列検証後、プラスミドを調製し、抗体発現のために、293フェクチントランスフェクション試薬(Invitrogen)によってHEK293細胞中へとトランスフェクトした。4日間の培養後、無血清培地中に分泌された抗体を、タンパク質Gクロマトグラフィによって、培養上清から親和性により精製した。次いで、精製された抗体を濃縮し、その後、PBS緩衝液において透析した。透析したタンパク質の最終濃度を、NanoDrop2000分光光度計によって特定し、図4および5に示されるように、還元試薬を用いてまたは用いずに、SDS-PAGEによって純度および完全性を特定した。精製された様々な抗体リード、PD-L1またはOX40特異的のどちらか、の完全性は、基準抗体、PD-L1に対してはMPDL3280AまたはOX40に対してはGSK3174998、と同様に、HEK293細胞において正常である。
T細胞活性化における機能性を有する特異的バインダーの迅速なスクリーニングを容易にするために、ELISAによるPD-L1またはOX40に対するポジティブバインダーの重鎖および軽鎖を増幅し、消化し、IgG4定常領域(配列番号9)を保持するAPBio専用IgG発現ベクター中へサブクローニングした。配列検証後、プラスミドを調製し、抗体発現のために、293フェクチントランスフェクション試薬(Invitrogen)によってHEK293細胞中へとトランスフェクトした。4日間の培養後、無血清培地中に分泌された抗体を、タンパク質Gクロマトグラフィによって、培養上清から親和性により精製した。次いで、精製された抗体を濃縮し、その後、PBS緩衝液において透析した。透析したタンパク質の最終濃度を、NanoDrop2000分光光度計によって特定し、図4および5に示されるように、還元試薬を用いてまたは用いずに、SDS-PAGEによって純度および完全性を特定した。精製された様々な抗体リード、PD-L1またはOX40特異的のどちらか、の完全性は、基準抗体、PD-L1に対してはMPDL3280AまたはOX40に対してはGSK3174998、と同様に、HEK293細胞において正常である。
一実施形態において、本開示は、OX40(CD134)に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。当該重鎖可変領域は、配列番号6、配列番号8、配列番号10のアミノ酸128~246、および配列番号13のアミノ酸124~241からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の配列相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該重鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約85%、90%、または95%の配列相同性のアミノ酸配列を含む。当該軽鎖可変領域は、配列番号5のアミノ酸1~108、配列番号7のアミノ酸1~108、配列番号10のアミノ酸1~112、および配列番号13のアミノ酸1~108からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該軽鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約85%、90%、または95%の配列相同性のアミノ酸配列を含む。
一実施形態において、本開示は、PD-L1に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合性部分を提供する。当該重鎖可変ドメインは、配列番号2および配列番号4からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の配列相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該重鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約85%、90%、または95%の配列相同性のアミノ酸配列を含む。当該軽鎖可変ドメインは、配列番号1のアミノ酸1~111および配列番号3のアミノ酸1~110からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の相同性のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施例において、当該軽鎖可変領域は、上記において言及したアミノ酸配列に対して少なくとも約85%、90%、または95%の配列相同性のアミノ酸配列を含む。
(直接的ELISAによるPD-L1、OX40特異的IgGリードの結合活性の特定)
直接的コーティングされた設定において、ヒトPD-L1-FcまたはOX40-Fcに対するELISA結合キャラクタリゼーションのために、PD-L1またはOX40に対する精製された抗体リード(抗PD-L1抗体リードまたは抗OX40抗体リード)を適用した。図6および7は、それぞれ、抗PD-L1および抗OX40抗体に対するELISA結合結果を示した。PD-L1特異的抗体の場合、ほとんどのリードは、基準抗体(Ref Ab,MPDL3280A,Roche)に対して、同様のまたはより良い結合活性を示した。
直接的コーティングされた設定において、ヒトPD-L1-FcまたはOX40-Fcに対するELISA結合キャラクタリゼーションのために、PD-L1またはOX40に対する精製された抗体リード(抗PD-L1抗体リードまたは抗OX40抗体リード)を適用した。図6および7は、それぞれ、抗PD-L1および抗OX40抗体に対するELISA結合結果を示した。PD-L1特異的抗体の場合、ほとんどのリードは、基準抗体(Ref Ab,MPDL3280A,Roche)に対して、同様のまたはより良い結合活性を示した。
精製されたヒトPD-L1またはOX40IgG1Fcキメラ(PD-L1-FcまたはOX40-Fc、APBio)を、リン酸緩衝食塩水(PBS)において透析し、1mg/mLに調節して、次いで、PBSによって1μg/mLの最終濃度へと希釈した。Nunc-Immuno Maxisorp 96ウェルプレートを、ウェルあたり0.1mLにおいて組換えPD-L1-FcまたはOX40-Fcキメラでコーティングし、非特異的結合コントロールに対しては空のウェルのままにして、4℃で一晩インキュベートした。当該PD-L1-FcまたはOX40-Fcキメラ溶液を除去し、当該プレートを0.4mLの洗浄緩衝液(PBS中における0.1%のTween-20)で3回洗浄した。0.4mLのブロッキング緩衝液(PBS中における5%の低脂肪ミルク粉末)を全てのウェルに加え、撹拌しながら室温で1時間インキュベートした。当該ブロッキング緩衝液を除去し、プレートを0.4mLの洗浄緩衝液で3回洗浄した。PBSにおいて当該PD-L1またはOX40試験抗体の段階希釈を調製し、0.1mLの希釈されたAbを各ウェルに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした。抗体溶液を除去し、当該プレートを、ウェルあたり0.4mLの洗浄緩衝液で3回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgGであるF(ab’)2特異的F(ab’)2抗体(Jackson Immunoresearch #109-036-097)を、PBSで1:2000に希釈し、各ウェルに0.1mLを加えた。当該プレートを室温で1時間インキュベートし、ウェルあたり0.4mLの洗浄緩衝液で洗浄した。0.1mLのTMB試薬(Invitrogen)を加え、室温で1~5分間インキュベートした。0.05mLの1NのHClを加えることによって反応を止め、Bio-Tek Spectraにおいて、450nmで吸光度を読み取った。PD-L1に対する抗PD-L1抗体リードの計算されたEC50は、ほとんどのリードが、直接的ELISAにより、MPDL3280A(Ref Ab)と同様に、良好な結合活性を有することを示した(図6)。対照的に、ほとんどの抗OX40抗体リードは、基準抗体(Ref Ab、GSK3174998)と比較して、著しく低い結合活性を示した(図7)。
(FACSによるPD-L1およびOX40特異的IgGリードに対する結合活性の特定)
PD-L1またはOX40を発現したHEK293細胞を用いて結合活性を特定して結合活性を比較するために、フローサイトメトリに対しても、精製された抗体リード(抗PD-L1抗体リードまたは抗OX40抗体リード)を適用した。図8および9は、安定発現されたPD-L1またはOX40のHEK293細胞を用いたFACSによって示されるように、対応する抗体リードの結合活性を示している。
PD-L1またはOX40を発現したHEK293細胞を用いて結合活性を特定して結合活性を比較するために、フローサイトメトリに対しても、精製された抗体リード(抗PD-L1抗体リードまたは抗OX40抗体リード)を適用した。図8および9は、安定発現されたPD-L1またはOX40のHEK293細胞を用いたFACSによって示されるように、対応する抗体リードの結合活性を示している。
PD-L1結合活性を調べるために抗PD-L1抗体リードで染色したPD-L1安定発現293細胞のFACS分析のために、安定発現細胞を、1μg/mLの精製した抗PD-L1抗体リード、基準抗体(Ref Ab MPDL3280A)と共に、またはネガティブコントロールとしてのアイソタイプ抗体と共に、氷上で1時間インキュベートした。当該細胞を1×PBSで3回洗浄し、次いで、Alexa-488標識ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Invitrogen Inc.)と共に、氷上でさらに1時間インキュベートした。染色後、当該細胞を1×PBSで3回洗浄し、1×PBS/2%FBSに再懸濁させ、その後、FACS Calibur(BD Biosciences,Inc.)およびFlowJo(TreeStar,LLC)によって分析した。同じシナリオにおいて、図9において安定発現したOX40のHEK293細胞に対する抗OX40抗体リードの結合活性も、同じ戦略で実行し、上記において説明したように分析した。図8に示されるように、ほとんどの抗PD-L1抗体リードは、基準抗体と同様に、良好な結合活性を有する。このことは、OmniMabライブラリから選択されたファージクローンが、実際に、当該細胞におけるネガティブPD-L1を認識することを示した。
この現象は、図9に示されるように、抗OX40抗体リードに対しても観察される。OX40結合活性を調べるために、精製された抗OX40抗体リードで染色したOX40安定発現293細胞クローン2D5のFACS分析のために、安定発現細胞を、コントロール抗体として2μg/mLの抗OX40基準Ab(OX40 ref.)または抗CD137基準Ab(CD137 ref.)と共に、氷上で1時間インキュベートした。当該細胞を1×PBSで3回洗浄し、次いで、Alexa-488標識ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Invitrogen Inc.)と共に、氷上でさらに1時間インキュベートした。染色後、当該細胞を1×PBSで3回洗浄し、1×PBS/2%FBSに再懸濁させ、その後、FACS Calibur(BD Biosciences、Inc.)およびFlowJo(TreeStar、LLC)によって分析した。
(リガンド競合結合(ELISAアッセイ))
抗体リードは、PD-1へのPD-L1の結合を遮断する能力について本発明の抗PD-L1抗体リードを評価するために使用される結合選択性および親和性アッセイを示した。
抗体リードは、PD-1へのPD-L1の結合を遮断する能力について本発明の抗PD-L1抗体リードを評価するために使用される結合選択性および親和性アッセイを示した。
組換えヒトPD-1/His(hPD-1/His)へのヒトPD-L1-Fcキメラ(PD-L1-Fc)の結合を遮断する能力について、ELISAによって抗体を試験した。精製された組換えhPD-1/His(APBio)を、PBS中における1mg/mlへと透析し、次いで、ビオチン(Abcam)とコンジュゲートさせた。Nunc Maxisorp 96ウェルプレートを、ウェルあたりPBS中における250ngのhPD-1/Hisで一晩かけてコーティングした。当該hPD-1/His溶液を除去し、当該プレートを0.4mLの洗浄緩衝液(PBS中における0.1%のTween-20)で3回洗浄した。0.4mLブロッキング緩衝液(PBS中における5%の低脂肪ミルク粉末)を全てのウェルに加え、撹拌しながら室温で1時間インキュベートした。ブロッキングステップの際、当該抗体ストックを、2倍の段階希釈によって、PBS中における200nMから0nMの範囲で希釈した。精製した組換えビオチン化PD-L1-Fcキメラを、PBS中における4μg/mLに希釈した。PD-1/Hisでコーティングしたプレートを、0.2mLの洗浄緩衝液(PBS中における0.1%のTween-20)で3回洗浄した。60μLの抗体希釈物(抗PD-L1抗体リードまたはRef Ab MPDL3280A)を60μLのビオチン化PD-L1-Fcキメラと一緒に加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを、前に説明したように洗浄した。ストレプトアビジン-HRPを、PBS中において1:2000に希釈し、結果として得られる溶液の100μLを、洗浄したプレートのウェルに加え、室温で1時間インキュベートした。プレートを、前に説明したように洗浄し、100μLのTMB基質溶液を各ウェルに加え、10分間インキュベートした。50μLの1NのHClによって反応を止め、Bio-Tek読み取り機を使用して450nmの吸光度を読み取り、図10に示した。部分抗体リードは、競合ELISAによって、PD-PD-L1の間の相互作用を阻害することが示された。ほとんどの抗体リードは、基準抗体(Ref Ab MPDL3280A)と比較した場合、同様のブロッキング活性を示した。
(抗PD-L1抗体に対するPD-1:PD-L1リガンド相互作用の阻害によるT細胞活性化の刺激増強)
当該PD-1シグナル伝達経路は、中程度のTCR/CD28共刺激シグナルを阻害し、その場合、最初に、T細胞増殖を減少することなく、サイトカイン産生が減少する。当該TCR/CD28共刺激シグナルが弱まると、当該PD-1経路が支配的となり、サイトカイン産生の著しい減少は、増殖の減少を伴う。したがって、本発明のヒト抗体のPD-L1との相互作用の阻害を介した当該PD-1の阻害がT細胞活性化を高めることを検証するために、混合リンパ球反応(MLR)を実施する。
当該PD-1シグナル伝達経路は、中程度のTCR/CD28共刺激シグナルを阻害し、その場合、最初に、T細胞増殖を減少することなく、サイトカイン産生が減少する。当該TCR/CD28共刺激シグナルが弱まると、当該PD-1経路が支配的となり、サイトカイン産生の著しい減少は、増殖の減少を伴う。したがって、本発明のヒト抗体のPD-L1との相互作用の阻害を介した当該PD-1の阻害がT細胞活性化を高めることを検証するために、混合リンパ球反応(MLR)を実施する。
ヒト全血液由来の単球を、RosetteSep(商標)Human Monocyte Enrichment Cocktail(Cat.No.15068)によって濃縮し、10%のFBS、100ng/mL(1000U/mL)のGM-CSF、100ng/mL(500U/mL)を伴う分化培地RPMI 1640において6日間培養した。分化を検証するために、単球由来の当該分化樹状細胞(DC)を、DC-SIGN-PE、FITC Abとコンジュゲートした抗CD14、PE Abとコンジュゲートした抗CD83、またはFITC Abとコンジュゲートした抗CD80によって点検し、MLRにおいてAPCとして使用した。
ヒト全血由来の同種異系CD4+T細胞を、RosetteSep(商標)Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail(Cat.NO. 15062)によって単離した。純度が95%超であることを確実にするために、CD4+T細胞の純度を抗CD4コンジュゲート化APC Abによって確認し、T細胞増殖アッセイのために、1uMのCFSE(CellTrace(商標)CFSE細胞増殖キット、Life technologies、Cat.NO. C34554)によって標識した。当該抗体リードが、PD-1とPD-L1との間の相互作用を遮断することによってT細胞活性化を回復できるかどうかを見るため、3日間および5日間において、示されるような異なる抗体リードを伴う未成熟DCと共に共培養するために、標識したCD4+T細胞を使用した。3日間および5日間のインキュベート後、ELISAによるIL-2およびIFN-γ定量化など、サイトカインのために上清を収集した。未成熟樹状細胞と同種異系T細胞とによる培養物への抗PD-L1抗体リード(クローン6、32、28、51、64、27、および37)の添加は、結果として、アイソタイプIgG(イソ#1、#2)で処理された培養物と比較して、T細胞増殖およびサイトカイン産生における増加を生じることが予想され、図11Aおよび11Bに示した。当該IL-2およびIFN-γ産生は、特に抗PD-L1抗体クローン6の場合、抗体処理の3日(図11A)または5日(図11B)後において、アイソタイプの抗体処理と比較して、MLRにおいて著しく増加する。サイトカインの増分は、抗体処理の5日後においても、依然として明らかであり、基準抗体(ref)であるMPDL3280Aと同様である。このことは、当該抗PD-L1抗体クローン6が、二重特異性抗体複合物のための潜在的リードの1つであることを示した。
(抗OX40抗体のアゴニスト活性アッセイ)
T細胞増殖およびサイトカイン産生のOX40共刺激を活性化するために、精製された抗体リードを、サイトカイン産生、増殖を高めるそれらの能力、およびヒトCD3+T細胞における増殖を誘起する能力について、機能的にスクリーニングした。当該抗CD3抗体(OKT3、BioLegend Cat.No.317304)および抗OX40抗体リード(クローンB6、B70、B120、A4、B17、B19、およびB30)、基準抗体(GSK3174998)またはアイソタイプの抗体(アイソ#1、#2)を、Maxisorp 96ウェルプレートにコーティングした。その一方で、ナイーブヒトCD3+T細胞を、製造元の説明に従って市販のRosetteSep(商標)Human T Cell Enrichment Cocktail(STEMCELL Cat.No.15061)を使用して、健康な成人のボランティア由来のヒト血液から単離した。次いで、当該単離されたCD3+T細胞を、CFSE(CellTrace(商標)CFSE細胞増殖キット、Life technologies、Cat.NO. C34554)によって標識し、細胞増殖およびサイトカイン産生を特定するために、RPMI1640培地、10%のウシ胎仔血清、および2.5mMのL-グルタミンの入った、抗体で予めコーティングしたウェルに、1×106細胞/mLにおいて播種した。3日間の培養後、フローサイトメトリによる増幅アッセイのために当該細胞を収集し、次いで、定量ELISAによってIL-2およびIFN-γ産生について培地を分析した。
T細胞増殖およびサイトカイン産生のOX40共刺激を活性化するために、精製された抗体リードを、サイトカイン産生、増殖を高めるそれらの能力、およびヒトCD3+T細胞における増殖を誘起する能力について、機能的にスクリーニングした。当該抗CD3抗体(OKT3、BioLegend Cat.No.317304)および抗OX40抗体リード(クローンB6、B70、B120、A4、B17、B19、およびB30)、基準抗体(GSK3174998)またはアイソタイプの抗体(アイソ#1、#2)を、Maxisorp 96ウェルプレートにコーティングした。その一方で、ナイーブヒトCD3+T細胞を、製造元の説明に従って市販のRosetteSep(商標)Human T Cell Enrichment Cocktail(STEMCELL Cat.No.15061)を使用して、健康な成人のボランティア由来のヒト血液から単離した。次いで、当該単離されたCD3+T細胞を、CFSE(CellTrace(商標)CFSE細胞増殖キット、Life technologies、Cat.NO. C34554)によって標識し、細胞増殖およびサイトカイン産生を特定するために、RPMI1640培地、10%のウシ胎仔血清、および2.5mMのL-グルタミンの入った、抗体で予めコーティングしたウェルに、1×106細胞/mLにおいて播種した。3日間の培養後、フローサイトメトリによる増幅アッセイのために当該細胞を収集し、次いで、定量ELISAによってIL-2およびIFN-γ産生について培地を分析した。
T細胞活性においてアンタゴニスト活性を有する抗OX40抗体リードのスクリーニングを、図12Aに示した。全ての抗OX40抗体リードは、基準抗体と同様の用量応答において当該CD3+T細胞活性化を高める能力を示した。より高い用量の抗体処理は、明確により高いT細胞活性化活性を示した。その一方で、IL-2およびIFN-γなど、サイトカイン産生(図12B)も、とりわけ、抗OX40抗体リードクローンB17の場合、同様のT細胞活性化反応が明らかとなった。サイトカインは、抗OX40抗体リードB17による3日間の処理後、非常に誘起される。増進は、基準抗体処理よりもはるかに高く、このことは、クローンB17が、二重特異性抗体構築のための候補の1つであることを意味した。
図13Aおよび図13Bに示されたデータのように、抗OX40抗体リードであるクローンB17およびB19の両方は、抗OX40抗体リード(B17またはB19)による3日間の処理の後のアッセイにおいて、より良好なアゴニスト活性を示した。IL-2産生またはIFN-γ産生のいずれかは、抗体処理において明確な増進を示し、用量依存性相関関係を示した。より高い用量での抗体処理において、より高いサイトカイン産生が記録された。
OX40抗体リードB17およびB19のアゴニスト活性を評価するために、アゴニスト活性アッセイと同様に、EC50も特定し、比較のためにサイトカイン産生を記録した。
(抗PD-L1-OX40 scFv抗体の構築、発現、および精製)
二重特異性が、scFv形式と融合されたIgGベースとして設計されるため、抗免疫チェックポイント抗体の構造に、OX40 scFvをFc末端において融合させた。抗体は、阻害性抗免疫チェックポイント抗体(例えば、抗PD-L1、抗PD-1、抗CTLA4、抗LAG3など)、または刺激性抗体(例えば、抗CD28、抗CD137、抗CD27、抗ICOSなど)であり得る。図14に表されるように、二重特異性抗体を生成するために、リンカーが、抗体FcとOX40 scFvとの間に位置される。
二重特異性が、scFv形式と融合されたIgGベースとして設計されるため、抗免疫チェックポイント抗体の構造に、OX40 scFvをFc末端において融合させた。抗体は、阻害性抗免疫チェックポイント抗体(例えば、抗PD-L1、抗PD-1、抗CTLA4、抗LAG3など)、または刺激性抗体(例えば、抗CD28、抗CD137、抗CD27、抗ICOSなど)であり得る。図14に表されるように、二重特異性抗体を生成するために、リンカーが、抗体FcとOX40 scFvとの間に位置される。
いくつかの実施形態において、当該抗PD-L1抗体リードクローン6が、IgG形式であるように割り当てられ、その一方で、当該抗OX40抗体リードは、抗PD-L1抗体リードクローン6におけるFc領域のC末端において融合させるために、scFv形式として転換されるであろう。抗体からscFv形式への転換は、結果として、結合活性または特異性の減少を生じることができ、したがって、いくつかの抗OX40抗体リードを、scFv転換に使用した。二官能性抗PD-L1抗体Fcの構築物を、完全長OX40 scFv(クローンA4としての配列番号10、クローンB17としての配列番号11、クローンB19としての配列番号12、またはクローンB120としての配列番号13)と融合させた。正確な折り畳みを確実にし、立体障害を最小にするために、短いフレキシブルなペプチドリンカー(GGGGS)2(配列番号14)を、例えば、Fc領域の抗PD-L1抗体重鎖C末端と、OX40 scFvのN末端モジュールとの間に位置した。抗PD-L1-OX40 scFv抗体のコード配列を、配列番号16(抗PD-L1-クローン6重鎖-OX40クローンB17scFv)および配列番号17(抗PD-L1-クローン6重鎖-OX40クローンB19scFv)に示した。構築された抗体Fc融合タンパク質を、シグナルペプチド(配列番号15)によってリードし、哺乳動物細胞によって発現させ、ならびにトランスフェクトされた細胞培養上清から一段階タンパク質Gクロマトグラフィによって精製した。図15に示されるように、一段階精製プロセスにおいて90%を超える純度を得ることができ、それは、精製された融合タンパク質が正しい分子量(Mw=220kD)を有することを示す。
(MLRにおける抗PD-L1-OX40 scFv二重特異性抗体リードに対するT細胞活性化の刺激の増強)
PD-1とPD-L1との間の相互作用およびOX40シグナル伝達のアゴニスト活性化の阻害によってT細胞活性化を高めることにおける二重特異性抗体の相乗的協力を特定するために、二重特異性抗体リードの抗PD-L1-OX40 scFvを、上記において説明したようにMLRに適用した。次いで、抗体処理の3日後または5日後に、IL-2およびIFN-γ産生を記録した。T細胞活性化増進における相乗効果を比較するために、単一、併用、または二重特異性抗体を等しい量または等しいモルにおいて適用し、アイソタイプIgGをネガティブコントロールとして使用した。図16Aおよび16Bに示されたデータのように、当該抗PD-L1抗体リード単独は、基準抗体MPDL3280Aと同様に、処理の3日後に著しいIL-2誘導を示したが、対照的に、当該抗OX40抗体リードは、抗体処理の3日後または5日後のいずれかにおいて、サイトカイン産生の明確な上方調節を増加することができない。このことは、基準抗体GSK3174998と一致している。しかしながら、当該抗OX40抗体と抗PD-L1抗体との併用は、抗体処理の3日後および5日後におけるサイトカイン産生の著しい上方調節を示した。当該相乗効果は、二重特異性抗体リード処理においても観察され、サイトカイン産生の増分は、併用処理と同様である。このことは、抗PD-L1-OX40 scFv二重特異性抗体リードも、当該scFv転換において結合活性の損失なしに、抗体併用処理と同様に機能することを示した。
PD-1とPD-L1との間の相互作用およびOX40シグナル伝達のアゴニスト活性化の阻害によってT細胞活性化を高めることにおける二重特異性抗体の相乗的協力を特定するために、二重特異性抗体リードの抗PD-L1-OX40 scFvを、上記において説明したようにMLRに適用した。次いで、抗体処理の3日後または5日後に、IL-2およびIFN-γ産生を記録した。T細胞活性化増進における相乗効果を比較するために、単一、併用、または二重特異性抗体を等しい量または等しいモルにおいて適用し、アイソタイプIgGをネガティブコントロールとして使用した。図16Aおよび16Bに示されたデータのように、当該抗PD-L1抗体リード単独は、基準抗体MPDL3280Aと同様に、処理の3日後に著しいIL-2誘導を示したが、対照的に、当該抗OX40抗体リードは、抗体処理の3日後または5日後のいずれかにおいて、サイトカイン産生の明確な上方調節を増加することができない。このことは、基準抗体GSK3174998と一致している。しかしながら、当該抗OX40抗体と抗PD-L1抗体との併用は、抗体処理の3日後および5日後におけるサイトカイン産生の著しい上方調節を示した。当該相乗効果は、二重特異性抗体リード処理においても観察され、サイトカイン産生の増分は、併用処理と同様である。このことは、抗PD-L1-OX40 scFv二重特異性抗体リードも、当該scFv転換において結合活性の損失なしに、抗体併用処理と同様に機能することを示した。
(二重特異性抗体の凝集および純度の特定)
精製された抗PD-L1-クローン6-OX40クローンB17scFvAbは、単一カラムタンパク質Aクロマトグラフィ精製の後のSEC-HPLC分析によって、低い純度(74.07%)であることが明らかとなり、したがって、純度を向上させるため、および本発明の二重特異性抗体の凝集を低減するために、いくつかの抗体バリアントを作製した。二重特異性抗体抗PD-L1-OX40 Ab(配列番号16)において、OX40B17scFvにおけるリンカーの代わりに、上記において説明したリンカーを使用し、CHO細胞において抗PD-L1-OX40 Ab-V1からV4(配列番号18から配列番号21)として作製した。これらのバリアントを精製し、XBridge Protein BEH SEC-HPLCカラム(Waters、Cat.No.186007640)によって分析した。当該データを下記の表1にまとめ、二重特異性抗体バリアントの1つである抗PD-L1-OX40 Ab-V4は、抗体純度を著しく向上させることが明らかとなった。純度は、74.07%から92.27%に高められる。したがって、当該抗PD-L1-OX40 Ab-V4を、当該抗体純度を向上させるために、さらなる遺伝子改変に使用した。
精製された抗PD-L1-クローン6-OX40クローンB17scFvAbは、単一カラムタンパク質Aクロマトグラフィ精製の後のSEC-HPLC分析によって、低い純度(74.07%)であることが明らかとなり、したがって、純度を向上させるため、および本発明の二重特異性抗体の凝集を低減するために、いくつかの抗体バリアントを作製した。二重特異性抗体抗PD-L1-OX40 Ab(配列番号16)において、OX40B17scFvにおけるリンカーの代わりに、上記において説明したリンカーを使用し、CHO細胞において抗PD-L1-OX40 Ab-V1からV4(配列番号18から配列番号21)として作製した。これらのバリアントを精製し、XBridge Protein BEH SEC-HPLCカラム(Waters、Cat.No.186007640)によって分析した。当該データを下記の表1にまとめ、二重特異性抗体バリアントの1つである抗PD-L1-OX40 Ab-V4は、抗体純度を著しく向上させることが明らかとなった。純度は、74.07%から92.27%に高められる。したがって、当該抗PD-L1-OX40 Ab-V4を、当該抗体純度を向上させるために、さらなる遺伝子改変に使用した。
二重特異性抗体のサイズ分布のキャラクタリゼーションのために、試料をWaters Alliance 2695 Separations Moduleを使用してXBridge Protein BEH SEC-HPLCカラム(Waters、Cat.No.186007640)にロードした。Water 2996 PDA Detectorを使用して、280nmにおいてタンパク質ピークを検出した。移動相は、0.4mL/分の流量の、200mMのNaCl(AMRESCO、Cat.No.0241)を含む均一濃度の25mMのリン酸ナトリウム(Sigma、Cat.No.04272およびCat.No.04269)、pH6.8であった。図17Aから17Eに示されるように、ピークエリアの一部分によってピークのパーセンテージを特定した。
抗PD-L1-OX40 Ab-V4は、著しい純度向上が明らかとなった(図17E)。純度を向上させるために、再び、当該二重特異性抗体をさらに、OX40B17scFv断片において遺伝子改変した。いくつかの二重特異性抗体バリアント、抗PD-L1-OX40 Ab-V5からV12(配列番号22から配列番号29)を作製するために、図18に示したOX40B17scFvにおけるいくつかの残基を異なるアミノ酸で置換し、重鎖バリアントを抗PD-L1クローン6軽鎖と対合させ、発現させ、上記において言及したように精製した。二重特異性抗体バリアントの純度を下記の表2にまとめ、当該抗PD-L1-OX40 scFv-V5は、これらの抗体バリアントの中で最も純度が高いことが明らかとなった。純度は、最高で96.46%まで高まった。これは、遺伝子改変二重特異性抗体において優れた純度を示し、将来におけるこれらの二重特異性抗体の良好な開発能力も明らかとなった。図19に示されるように、抗PD-L1-OX40 Ab-V5の完全性についてもSDS-PAGEによって分析し、還元条件下および非還元条件下において良好な完全性を示した。
その一方で、遺伝子改変二重特異性抗体バリアントも、図20に示されるように直接的ELISAによるヒトPD-L1およびOX40の結合活性評価のために適用した。示される全ての二重特異性抗体バリアントは、ヒトPD-L1に対する同じ結合活性を示し(図21)、この結合活性は、抗PD-L16抗体と同様である。この現象は、ヒトOX40結合アッセイにおいても観察された(図22)。抗PD-L1-OX40 Ab-V10のみが、ヒトOX40に対して、他のバリアントと比較して弱い結合活性を示した。それは、OX40 scFvの遺伝子改変が、OX40結合活性に影響を及ぼさないことを示した。当該結合活性は、PD-L1またはOX40のいずれかに対して保持される。抗PD-L1-OX40 Ab-V5は、優れた抗体純度ならびにPD-L1およびOX40に対する結合活性が明らかとなったため、血清安定性に対して、当該抗PD-L1-OX40 Ab-V5を選択した。
(エクスビボ血清安定性)
当該安定性は、ヒト血清(BioreclamationIVT、Cat.No.HMSRM)ならびに関連前臨床種:赤毛ザル(BioreclamationIVT、Cat.No.RHSSRM)およびCD1マウス(BioreclamationIVT、Cat.No.MSESRM)由来の血清において評価した。15μg/mLの最終濃度となるように、試料を異なる種の血清に加え、37℃の水浴においてインキュベートした。0日間、1日間、2日間、3日間、7日間、10日間、および14日間のインキュベート時間の後で、血清試料を収集し、分析まで-80℃において冷凍して貯蔵した。
当該安定性は、ヒト血清(BioreclamationIVT、Cat.No.HMSRM)ならびに関連前臨床種:赤毛ザル(BioreclamationIVT、Cat.No.RHSSRM)およびCD1マウス(BioreclamationIVT、Cat.No.MSESRM)由来の血清において評価した。15μg/mLの最終濃度となるように、試料を異なる種の血清に加え、37℃の水浴においてインキュベートした。0日間、1日間、2日間、3日間、7日間、10日間、および14日間のインキュベート時間の後で、血清試料を収集し、分析まで-80℃において冷凍して貯蔵した。
(定量サンドイッチELISA)
PBS中における1μg/mLのOX40-Fcの100μLでELISAプレート(NUNC、Cat.No.442404)をコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。0.1%のTween-20(Sigma、Cat.No.P2287-500mL)を含むPBSとして洗浄緩衝液を調製し、洗浄緩衝液中における1%のBSA(UniRegion、Cat.No.UR-BSA001-100G)として、ブロッキング緩衝液を調製した。ブロッキング緩衝液における3×段階希釈による10倍希釈によって血清試料を調製し、ブロッキング緩衝液における3×段階希釈によって標準物を10nMにおいて調製した。ビオチン化PD-L1-Fcを、標準的プロトコルを使用してBiotin Fastコンジュゲート化キット(abcam,Cat.No.ab201796)によって標識し、ブロッキング緩衝液における30nMにおいて調製した。ストレプトアビジン-HRP(abcam、Cat.No.ab7403)を、ブロッキング緩衝液における1μg/mLにて調製した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した後に、全ての試料を100μLにおいて各ウェルに加え、周囲温度において1時間インキュベートした。100μLのTMB溶液(Invitrogen、Cat.No.00-2023)による2分間のTMB現像を、100μLの1NのHCl溶液(Merck、Cat.No.1.00317.1000)によって止めた。450nm吸収を、ELISA読み取り機(Biotek、Powerwave XS)によって読み取った。
PBS中における1μg/mLのOX40-Fcの100μLでELISAプレート(NUNC、Cat.No.442404)をコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。0.1%のTween-20(Sigma、Cat.No.P2287-500mL)を含むPBSとして洗浄緩衝液を調製し、洗浄緩衝液中における1%のBSA(UniRegion、Cat.No.UR-BSA001-100G)として、ブロッキング緩衝液を調製した。ブロッキング緩衝液における3×段階希釈による10倍希釈によって血清試料を調製し、ブロッキング緩衝液における3×段階希釈によって標準物を10nMにおいて調製した。ビオチン化PD-L1-Fcを、標準的プロトコルを使用してBiotin Fastコンジュゲート化キット(abcam,Cat.No.ab201796)によって標識し、ブロッキング緩衝液における30nMにおいて調製した。ストレプトアビジン-HRP(abcam、Cat.No.ab7403)を、ブロッキング緩衝液における1μg/mLにて調製した。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄した後に、全ての試料を100μLにおいて各ウェルに加え、周囲温度において1時間インキュベートした。100μLのTMB溶液(Invitrogen、Cat.No.00-2023)による2分間のTMB現像を、100μLの1NのHCl溶液(Merck、Cat.No.1.00317.1000)によって止めた。450nm吸収を、ELISA読み取り機(Biotek、Powerwave XS)によって読み取った。
その優れた純度およびPD-L1およびOX40に対する結合活性により、エクスビボ血清安定性のために抗PD-L1-OX40 Ab-V5を選択した。精製された二重特異性抗体を、異なる種(例えば、ヒト、マウス、またはサルなど)に由来する血清と混合した。数日間の培養後、当該試料を取り出し、抗体量を特定するためにサンドイッチELISAによって分析した。図23に示されるように、当該抗PD-L1-OX40 Ab-V5は、37℃での14日間の培養後において、依然として、良好な血清安定性を示した。抗体の濃度は、依然として、ヒト、マウス、またはサルのいずれかにおいて、70%超である。そのことは、当該抗体が良好な血清安定性も有することを示した。
T細胞反応性を調節する当該抗PD-L1-OX40 Ab-V5の能力を測定するために、精製されたT細胞が、数日間かけてGM-CSFおよびIL-4において単球を培養することによって調製した同種異系樹状細胞と共に培養されるであろう。市販のELISAキットを使用して、それぞれ、IL-2およびIFN-γを測定するために、3日目および5日目での上清の収集を可能にするように、平行プレートを準備した。図24Aおよび24Bに示されるデータのように、IL-2およびIFN-γ産生は、抗体処理の3日後および5日後に、二重特異性抗体処理(V5)ならびに併用処理において非常に上方調節される。さらに、増進は、単独での当該抗PD-L1Abまたは抗OX40 Ab処理よりも、明らかに優れている。このことは、遺伝子改変二重特異性抗体V5が、依然として、機能性損失なしに、併用処理と同様にアゴニスト活性を有すること、ならびに、将来において、様々な固形腫瘍または癌のための治療抗体として開発され得ることを意味した。
(二重特異性抗体の抗腫瘍活性(インビボモデル))
二重特異性抗体における当該PD-L1およびOX40の齧歯動物交差反応性の欠如は、当該抗体の抗ヒト腫瘍有効性の評価に対する標準的なマウス同系またはヒト異種移植腫瘍モデルの使用を妨げた。したがって、ベージュ(Bg)変異欠如マウスのTおよびBリンパ球および機能性NK細胞を有するSCID-Bgマウス(CB.17/Icr.Cg PkrdcscidLystbg/CrI)を使用して、新規のhuPBL-SCID-Bg異種腫瘍マウスモデルを作製した。当該二重特異性抗体の抗ヒト腫瘍有効性を、下記において説明するようにこのモデルを使用して評価した。
二重特異性抗体における当該PD-L1およびOX40の齧歯動物交差反応性の欠如は、当該抗体の抗ヒト腫瘍有効性の評価に対する標準的なマウス同系またはヒト異種移植腫瘍モデルの使用を妨げた。したがって、ベージュ(Bg)変異欠如マウスのTおよびBリンパ球および機能性NK細胞を有するSCID-Bgマウス(CB.17/Icr.Cg PkrdcscidLystbg/CrI)を使用して、新規のhuPBL-SCID-Bg異種腫瘍マウスモデルを作製した。当該二重特異性抗体の抗ヒト腫瘍有効性を、下記において説明するようにこのモデルを使用して評価した。
PC-3ヒト前立腺をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得て、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン、および10%の熱不活性化ウシ胎仔血清(FBS、Gibco Cat.NO. 10437)を含むRPMI-1640(Invitrogen)において培養した。細胞を、T-150ファルコンフラスコにおいて培養密度に増殖させた。続いて、細胞を、トリプシン処理し(トリプシン 0.25%-EDTA;Invitrogen)、インキュベートにとって十分な細胞数に増殖をスケールアップした。製造元のプロトコル(STEMCELL Technologies Inc.)に従って、Lymphoprep(商標)を使用して、末梢血液リンパ球(PBMC)をヘパリン処理した血液から単離した。各マウスが、PBS中における0.1mLの単一ボーラス注入において0.75×106のPBMCおよび3×106腫瘍細胞の注入を受けるように、カウントした細胞懸濁液を組み合わせた。当該マウスにおける腫瘍細胞の増殖を促進するために、別の0.1mLのマトリゲルを、当該組み合わせた細胞懸濁液と混合し、すぐに調製マウスに注入した。
各マウスに対して、0.2mL量の当該組み合わせた細胞懸濁液を、当該動物の右脇腹の皮下に注入した。14日のインキュベーション後、固形腫瘍が形成され、約250mm3から300mm3に達し、当該二重特異性抗体(3mg/kgの抗PD-L1-OX40 Ab-V5)、PD-L1基準抗体(Ref Ab、MPDL3280A)、またはコントロール抗体(アイソタイプ)を、腹腔内注射(i.p.)によって3週間にわたり毎週2回与えた。毎週2回、Pressierキャリパによる腫瘍測定ならびに実験期間における試験試料投与を行い、ならびに体重も記録した。以下の計算:長さ×幅2×0.44=体積(mm3)を用いて腫瘍体積を計算し、図25にプロットした。腫瘍体積が2000mm3に達するか、実験の終了前に体重が20%減少したマウスを研究から除去した。インキュベーションの7日後に腫瘍を測定したところ、同様の結果が観察され、腫瘍体積に従って動物を無作為化した。動物研究のため、各グループは、6匹のマウスを含んでいた。図25に示されたデータのように、当該二重特異性抗体は、PC-3異種移植マウスモデルにおいて、著しい抗腫瘍有効性を示した。PD-L1基準抗体と同様に、腫瘍サイズは、腫瘍インキュベーションの18日後に減少に転じ、100mm3未満に減少し続けた。当該PC-3異種移植マウスモデルは、二重特異性抗体の抗腫瘍について事前実証され、将来における治療薬リードである可能性が明らかとなる。
一括して、これらの結果は、二重特異性抗体が、PD-1/PD-L1シグナル伝達におけるその免疫チェックポイント遮断性およびOX40シグナル伝達のためのアゴニスト活性を維持することを示した。適切な動物モデル(例えば、ヒト化NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmIwjI/SzJ(NSG)モデルにおけるPC-3腫瘍など)を使用してこれらのタンパク質の生物学的活性をさらに調査するために、研究を進める。
本発明におけるFc領域は、任意の免疫グロブリンのアイソタイプ、サブクラス、アロタイプ、遺伝子改変変異体(例えば、ノブおよびホール(knob and hole)Fc断片など)に由来し得る。
(実施例)
下記の実施例は、ヒトPD-L1およびOX40を標的とする治療目的にとって好適なモノクローナル抗体の作製について説明している。複合体、ヒト抗ヒトPD-L1および抗OX40抗体は、それぞれ、抗PD-L1抗体クローン6および抗OX40抗体クローンB17から作製した。ヒトV領域配列のセグメントは、無関係のヒト抗体(生殖系列および非生殖系列)配列データベースを供給源とした。
下記の実施例は、ヒトPD-L1およびOX40を標的とする治療目的にとって好適なモノクローナル抗体の作製について説明している。複合体、ヒト抗ヒトPD-L1および抗OX40抗体は、それぞれ、抗PD-L1抗体クローン6および抗OX40抗体クローンB17から作製した。ヒトV領域配列のセグメントは、無関係のヒト抗体(生殖系列および非生殖系列)配列データベースを供給源とした。
実施例1 PD-L1およびOX40に結合するIgG抗体の作製
本発明によって提供されるある特定の抗体を、ヒトPD-L1またはOX40に結合するFabから独自に作製した。当該Fabは、対応するFc融合タンパク質(PD-L1-FcまたはOX40-Fc)および対応するヒトタンパク質(PD-L1またはOX40)を発現する細胞における交互パンニング(alternating panning)に従って、ファージディスプレイライブラリであるOmniMabファージミドライブラリから選択した。直接的ELISAまたは細胞ベースのELISAスクリーニング後、当該ポジティブクローンを、重鎖および軽鎖に対して配列決定した。これらのFabは、PD-L1に対して「OM-PD-L1-6」および「OM-PDL1-32」など、OX40に対して「OM-OX40-A4」、「OM-OX40-B17」、および「OM-OX40-B19」など、として指定されたものを含む。本出願において開示されるPD-L1抗体PD-L1-クローン3、PD-L1-クローン6、およびPD-L1-クローン32を、「OM-PD-L1-6」および「OM-PDL1-32」から作製した。その一方で、本出願において開示されるOX40抗体OX40-A4、OX40-B17、およびOX40-B19は、HEK293細胞またはCHO-S細胞において「OM-OX40-A4」、「OM-OX40-B17」、および「OM-OX40-B19」から作製した。ならびに、PD-L1およびOX40を同時に標的化する二重特異性抗体を、抗PD-L1 6-OX40 scFvB17抗体および抗PD-L1 6-OX40 scFvB19抗体として設計した。所定のFabの軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、当該軽鎖可変領域および重鎖可変領域の当該アミノ酸配列と同一である。
本発明によって提供されるある特定の抗体を、ヒトPD-L1またはOX40に結合するFabから独自に作製した。当該Fabは、対応するFc融合タンパク質(PD-L1-FcまたはOX40-Fc)および対応するヒトタンパク質(PD-L1またはOX40)を発現する細胞における交互パンニング(alternating panning)に従って、ファージディスプレイライブラリであるOmniMabファージミドライブラリから選択した。直接的ELISAまたは細胞ベースのELISAスクリーニング後、当該ポジティブクローンを、重鎖および軽鎖に対して配列決定した。これらのFabは、PD-L1に対して「OM-PD-L1-6」および「OM-PDL1-32」など、OX40に対して「OM-OX40-A4」、「OM-OX40-B17」、および「OM-OX40-B19」など、として指定されたものを含む。本出願において開示されるPD-L1抗体PD-L1-クローン3、PD-L1-クローン6、およびPD-L1-クローン32を、「OM-PD-L1-6」および「OM-PDL1-32」から作製した。その一方で、本出願において開示されるOX40抗体OX40-A4、OX40-B17、およびOX40-B19は、HEK293細胞またはCHO-S細胞において「OM-OX40-A4」、「OM-OX40-B17」、および「OM-OX40-B19」から作製した。ならびに、PD-L1およびOX40を同時に標的化する二重特異性抗体を、抗PD-L1 6-OX40 scFvB17抗体および抗PD-L1 6-OX40 scFvB19抗体として設計した。所定のFabの軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、当該軽鎖可変領域および重鎖可変領域の当該アミノ酸配列と同一である。
実施例2 抗PD-L1-OX40 scFvのその対応する標的へのインビトロ結合
抗PD-L1-OX40二重特異性抗体を、図14に示されるように構築し、HEK293細胞またはCHO-S細胞において発現させた。二重特異性抗体を含む培地を、タンパク質Gクロマトグラフィによって、培養上清から親和性により精製した。精製された抗体を濃縮し、その後、PBS緩衝液において透析し、図15に示されるようにSDS-PAGEによって分析した。PD-L1またはOX40への精製された融合タンパク質の直接結合をELISAにおいて試験するために、100ng/ウェルの組換えPD-L1またはOX40で、96ウェルELISAプレートをコーティングした。様々な濃度の精製された抗PD-L1-OX40 scFvを各ウェルに加え、1時間インキュベートした。洗浄後、抗FabHRPコンジュゲート(Jackson Immunochemicals)の1:5000希釈を各ウェルに加え、さらに1時間インキュベートした。最終洗浄後、TMB基質(Invitrogen Inc.)を加え、450nmにおけるOD吸光度を測定した。当該データを、GraphPad Prism 5を使用してS字形曲線近似によって解析し、EC50を計算した。
抗PD-L1-OX40二重特異性抗体を、図14に示されるように構築し、HEK293細胞またはCHO-S細胞において発現させた。二重特異性抗体を含む培地を、タンパク質Gクロマトグラフィによって、培養上清から親和性により精製した。精製された抗体を濃縮し、その後、PBS緩衝液において透析し、図15に示されるようにSDS-PAGEによって分析した。PD-L1またはOX40への精製された融合タンパク質の直接結合をELISAにおいて試験するために、100ng/ウェルの組換えPD-L1またはOX40で、96ウェルELISAプレートをコーティングした。様々な濃度の精製された抗PD-L1-OX40 scFvを各ウェルに加え、1時間インキュベートした。洗浄後、抗FabHRPコンジュゲート(Jackson Immunochemicals)の1:5000希釈を各ウェルに加え、さらに1時間インキュベートした。最終洗浄後、TMB基質(Invitrogen Inc.)を加え、450nmにおけるOD吸光度を測定した。当該データを、GraphPad Prism 5を使用してS字形曲線近似によって解析し、EC50を計算した。
実施例3 FACS分析による抗PD-L1-OX40 scFvの抗原結合特異性
抗PD-L1-OX40 scFv抗体結合特異性を試験するために、安定PD-L1発現293細胞であるIFN-γ刺激A549またはWiDrを、氷上で1時間かけて1μg/mLの抗PD-L1-OX40 scFv抗体で染色し、その後、1×PBSで3回洗浄した。結合した抗体融合タンパク質を、Alexa-488標識ヤギ抗ヒトIgG(H+L)で検出し、その後、FACS分析を行った。当該試験のネガティブコントロールとして、アイソタイプ抗体を使用した。結果は、抗PD-L1-OX40 scFvが、抗PD-L1単独と比較して、その抗原結合特性を維持していることを示した。抗PD-L1-OX40 scFv抗体の結合特異性も、安定OX40発現293細胞を使用して試験した。
抗PD-L1-OX40 scFv抗体結合特異性を試験するために、安定PD-L1発現293細胞であるIFN-γ刺激A549またはWiDrを、氷上で1時間かけて1μg/mLの抗PD-L1-OX40 scFv抗体で染色し、その後、1×PBSで3回洗浄した。結合した抗体融合タンパク質を、Alexa-488標識ヤギ抗ヒトIgG(H+L)で検出し、その後、FACS分析を行った。当該試験のネガティブコントロールとして、アイソタイプ抗体を使用した。結果は、抗PD-L1-OX40 scFvが、抗PD-L1単独と比較して、その抗原結合特性を維持していることを示した。抗PD-L1-OX40 scFv抗体の結合特異性も、安定OX40発現293細胞を使用して試験した。
実施例4 二官能性タンパク質のインビトロ免疫調節効果
T細胞反応性を調節する当該抗PD-L1-OX40 scFv抗体の能力を測定するため、精製したT細胞を、数日かけてGM-CSFおよびIL-4において単球を培養することによって調製した同種異系樹状細胞と共に培養する。市販のELISAキットを使用してそれぞれIL-2およびIFN-γを測定するために3日目および5日目での上清の収集を可能にするために、平行プレートを準備した。Genentech/Rocheのヒト化抗PD-L1であるMPDL3280Aを、自前で作製し、ポジティブコントロールとして使用した。図16Aおよび16Bに示される当該データのように、当該IL-2およびIFN-γ産生は、抗体処理の3日または5日後に、二重特異性抗体処理ならびに併用処理において非常に上方調節される。とりわけ、抗PD-L1抗体クローン6および抗OX40抗体クローンB17(抗PD-L1-OX40 scFvB17Ab)によって複合化された当該二重特異性抗体、または組み合わせ物(抗PD-L1クローン6Ab+抗OX40クローンB17Ab)は、PD-L1およびOX40基準抗体の組み合わせ物(PD-L1 RefAb+OX40 RefAb)よりも高いT細胞活性化の増進を示した。このことは、当該抗OX40B17抗体が、基準OX40抗体GSK3174998と比較してより良好なアゴニスト活性を結果として生じる特殊なエピトープ結合性を有し得ることを示していた。
T細胞反応性を調節する当該抗PD-L1-OX40 scFv抗体の能力を測定するため、精製したT細胞を、数日かけてGM-CSFおよびIL-4において単球を培養することによって調製した同種異系樹状細胞と共に培養する。市販のELISAキットを使用してそれぞれIL-2およびIFN-γを測定するために3日目および5日目での上清の収集を可能にするために、平行プレートを準備した。Genentech/Rocheのヒト化抗PD-L1であるMPDL3280Aを、自前で作製し、ポジティブコントロールとして使用した。図16Aおよび16Bに示される当該データのように、当該IL-2およびIFN-γ産生は、抗体処理の3日または5日後に、二重特異性抗体処理ならびに併用処理において非常に上方調節される。とりわけ、抗PD-L1抗体クローン6および抗OX40抗体クローンB17(抗PD-L1-OX40 scFvB17Ab)によって複合化された当該二重特異性抗体、または組み合わせ物(抗PD-L1クローン6Ab+抗OX40クローンB17Ab)は、PD-L1およびOX40基準抗体の組み合わせ物(PD-L1 RefAb+OX40 RefAb)よりも高いT細胞活性化の増進を示した。このことは、当該抗OX40B17抗体が、基準OX40抗体GSK3174998と比較してより良好なアゴニスト活性を結果として生じる特殊なエピトープ結合性を有し得ることを示していた。
実施例5 インビボでの二重特異性抗体によって誘起されるヒト白血球増殖
マウスPD-L1またはOX40とのPD-L1またはOX40抗体における検出可能な交差反応の欠如ならびにヒト免疫細胞の存在に対する要件は、当該二重特異性抗体のインビボ機能性評価のためのモデルの開発を必要とした。重症複合免疫不全(SCID)変異およびIL-2受容体共通ガンマ鎖(一般的に、NSGと呼ばれる)における欠損を有するNOD遺伝的背景のマウスは、多くのヒト末梢血白血球(huPBL)の移植を支援することができ、少なくとも30日間、移植を維持することができる(King et al.,2008)。huPBL-NSGモデルとしても知られるこのマウスモデルを、ヒト免疫細胞に対する当該抗体のインビボ全身性投与の機能効果を評価するために使用した。
マウスPD-L1またはOX40とのPD-L1またはOX40抗体における検出可能な交差反応の欠如ならびにヒト免疫細胞の存在に対する要件は、当該二重特異性抗体のインビボ機能性評価のためのモデルの開発を必要とした。重症複合免疫不全(SCID)変異およびIL-2受容体共通ガンマ鎖(一般的に、NSGと呼ばれる)における欠損を有するNOD遺伝的背景のマウスは、多くのヒト末梢血白血球(huPBL)の移植を支援することができ、少なくとも30日間、移植を維持することができる(King et al.,2008)。huPBL-NSGモデルとしても知られるこのマウスモデルを、ヒト免疫細胞に対する当該抗体のインビボ全身性投与の機能効果を評価するために使用した。
詳細には、新たに単離した600万のヒトPBMCを、静脈内注入によってhuPBL-NSGマウスへと養子移入した。PBMC注入の9日間後、当該動物に、腹腔内注入によって、単回1mg/kg用量の単一抗体、二重特異性抗体、またはIgG4アイソタイプコントロール抗体を投与した。PBMC移植の24日から28日後に、フローサイトメトリによって評価したヒトおよびマウスCD45に対する抗体でPBMCを染色した。リンパ球ゲートを特定するために、前方および側方散乱プロファイルを使用した。移植されたマウスの末梢血におけるヒトCD45+細胞の割合の増加によって証明されるように、二重特異性抗体は、ヒト白血球の増殖を高めることができた。各群に対して、n≧6匹のマウス。
実施例6 抗PD-L1-OX40 scFv抗体によるhuPBL-NSGにおけるPC-3またはA498腫瘍細胞増殖の阻害
huPBL-NSGマウスにおいて異種移植モデルを確立するために、PD-L1ポジティブヒト前立腺癌細胞株PC-3(ATCC#CRL-1435)または腎癌細胞A498(ATCC(登録商標)HTB-44(商標))を使用することができる。腫瘍形成のために、3×106PC-3細胞(またはA498細胞)/マウスが、上記において説明したhuPBL-NSGマウスに、皮下において注入されるであろう。腫瘍成長に対する阻害効果を評価するために、腫瘍細胞移植の14日後に、0.1~3mg/kgの異なる濃度の抗PD-L1-OX40 scFv抗体、基準抗体、またはアイソタイプの抗体が、毎週2回、4週間にわたってマウスに静脈内投与されるであろう。腫瘍成長は、FoxChaseSCID(登録商標)Beigeマウスモデルにおいて説明したように、最長5週間にわたって毎週2回測定されるであろう。
huPBL-NSGマウスにおいて異種移植モデルを確立するために、PD-L1ポジティブヒト前立腺癌細胞株PC-3(ATCC#CRL-1435)または腎癌細胞A498(ATCC(登録商標)HTB-44(商標))を使用することができる。腫瘍形成のために、3×106PC-3細胞(またはA498細胞)/マウスが、上記において説明したhuPBL-NSGマウスに、皮下において注入されるであろう。腫瘍成長に対する阻害効果を評価するために、腫瘍細胞移植の14日後に、0.1~3mg/kgの異なる濃度の抗PD-L1-OX40 scFv抗体、基準抗体、またはアイソタイプの抗体が、毎週2回、4週間にわたってマウスに静脈内投与されるであろう。腫瘍成長は、FoxChaseSCID(登録商標)Beigeマウスモデルにおいて説明したように、最長5週間にわたって毎週2回測定されるであろう。
実施例7 マウスおよびサルにおける抗PD-L1-OX40 scFvの薬物動態評価
10~40mg/kgの二官能性タンパク質抗PD-L1-OX40 scFvが、皮下注入または静脈内注入によってマウスまたはサルに投与されるであろう。注入後、最長15日間まで、異なる時点において、血清試料が採取されるであろう。当該血清試料中のFc融合タンパク質の濃度が、サンドイッチELISAアッセイを使用して特定されるであろう。
10~40mg/kgの二官能性タンパク質抗PD-L1-OX40 scFvが、皮下注入または静脈内注入によってマウスまたはサルに投与されるであろう。注入後、最長15日間まで、異なる時点において、血清試料が採取されるであろう。当該血清試料中のFc融合タンパク質の濃度が、サンドイッチELISAアッセイを使用して特定されるであろう。
本発明について、そのある特定の実施形態を参照しながらかなり詳細に説明してきたが、他の実施形態も可能である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲は、本明細書に含まれる実施形態の説明に限定されるものではない。
本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく本発明の構造に様々な改変および変更を為すことができることは、当業者に明らかであろう。先述の観点から、本発明の改変および変更が以下の特許請求の範囲の範囲内である限り、本発明は、それらを網羅することが意図される。
Claims (27)
- OX40(CD134)に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、
重鎖可変領域、および軽鎖可変領域がそれぞれ、
配列番号6、および配列番号5のアミノ酸1~108、
配列番号8、および配列番号7のアミノ酸1~108、
配列番号10のアミノ酸128~246、および配列番号10のアミノ酸1~112、ならびに
配列番号13のアミノ酸124~241、および配列番号13のアミノ酸1~108
からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、および軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合性部分。 - 前記抗体またはその抗原結合性部分が、配列番号10、11、12、および13からなる群より選択される単鎖可変断片(scFv)配列を含む、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記抗体またはその抗原結合性部分が、二重特異性抗体である、請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記二重特異性抗体は、免疫チェックポイントタンパク質結合部位を含む、請求項3に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
- 前記免疫チェックポイントタンパク質結合部位は、プログラム細胞死タンパク質1リガンド(PD-L1)結合部位、PD-1結合部位、上皮増殖因子受容体(EGFR)結合部位、ヒト上皮増殖因子受容体2(HER2)結合部位、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA-4)結合部位、またはリンパ球活性化遺伝子3(LAG3)結合部位を含む、請求項4に記載の抗体またはその抗原結合性部分。
- PD-L1に結合する抗体またはその抗原結合性部分であって、
重鎖可変ドメイン、および軽鎖可変ドメインがそれぞれ、
配列番号2、および配列番号1のアミノ酸1~111、ならびに
配列番号4、および配列番号3のアミノ酸1~110
からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性のアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、および軽鎖可変ドメインを含む抗体またはその抗原結合性部分。 - 少なくとも1つのポリペプチド鎖を含む二重特異性抗体であって、前記ポリペプチド鎖は、
OX40結合部位であって、
重鎖可変領域、および軽鎖可変領域がそれぞれ、
配列番号6、および配列番号5のアミノ酸1~108、
配列番号8、および配列番号7のアミノ酸1~108、
配列番号10のアミノ酸128~246、および配列番号10のアミノ酸1~112、ならびに
配列番号13のアミノ酸124~241、および配列番号13のアミノ酸1~108
からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性のアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域、および軽鎖可変領域
を含むOX40結合部位と、
PD-L1結合部位であって、
重鎖可変ドメイン、および軽鎖可変ドメインがそれぞれ、
配列番号2、および配列番号1のアミノ酸1~111、ならびに
配列番号4、および配列番号3のアミノ酸1~110
からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性のアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン、および軽鎖可変ドメイン
を含む、PD-L1結合部位と、
を含む、二重特異性抗体。 - 前記ポリペプチド鎖は、さらに、
Fcドメインと、
当該FcドメインのN末端に接続されたFab断片であって、前記PD-L1結合部位を含むFab断片と、
当該FcドメインのC末端に接続されたscFvであって、前記OX40結合部位を含むscFvと、
を含む、請求項7に記載の二重特異性抗体。 - 前記ポリペプチド鎖は、さらに、前記Fcドメインと前記scFvとの間にリンカーを含む、請求項8に記載の二重特異性抗体。
- 前記scFvが、配列番号18のアミノ酸455~707,配列番号19のアミノ酸455~708,配列番号20のアミノ酸455~701,配列番号21のアミノ酸455~706,配列番号22のアミノ酸455~706,配列番号23のアミノ酸455~706,配列番号24のアミノ酸455~706,配列番号25のアミノ酸455~706,配列番号26のアミノ酸455~706,配列番号27のアミノ酸455~706,配列番号28のアミノ酸455~706,および配列番号29のアミノ酸455~706からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の二重特異性抗体。
- 前記二重特異性抗体が、一対のポリペプチド鎖を含む、請求項7に記載の二重特異性抗体。
- 前記二重特異性抗体が、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、またはIgY抗体である、請求項11に記載の二重特異性抗体。
- 前記二重特異性抗体が、IgG抗体である、請求項12に記載の二重特異性抗体。
- 前記IgG抗体は、IgG1,IgG2,IgG3,またはIgG4抗体である、請求項13に記載の二重特異性抗体。
- 治療薬と、
請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性部分、あるいは請求項7から14のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、
を含む抗体-薬物コンジュゲートであって、当該治療薬は、リンカーによって、当該抗体または当該抗原結合性部分、あるいは当該二重特異性抗体に共有結合的にコンジュゲートされている、抗体-薬物コンジュゲート。 - 請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合性断片と、少なくとも1種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 請求項6に記載の前記抗体または前記その抗原結合性部分と、少なくとも1種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 請求項7から14のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、少なくとも1種の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 請求項1に記載の抗体またはその抗原結合性部分を有効量含み、癌を治療するためのものである、医薬組成物。
- 前記癌は、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫(RCC)、および卵巣癌からなる群より選択される、請求項19に記載の医薬組成物。
- 請求項6に記載の抗体またはその抗原結合性部分を有効量含み、癌を治療するためのものである、医薬組成物。
- 前記癌は、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫(RCC)、および卵巣癌からなる群より選択される、請求項21に記載の医薬組成物。
- 請求項7から14のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を有効量含み、癌を治療するためのものである、医薬組成物。
- 前記癌は、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黒色腫、リンパ腫、乳癌、頭頚部癌、腎細胞腫(RCC)、および卵巣癌からなる群より選択される、請求項23に記載の医薬組成物。
- 請求項1から5のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合性部分をコードする核酸分子。
- 請求項6に記載の抗体または抗原結合性部分をコードする核酸分子。
- 請求項7から14のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする核酸分子。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762611543P | 2017-12-29 | 2017-12-29 | |
US62/611,543 | 2017-12-29 | ||
JP2020533119A JP7362614B2 (ja) | 2017-12-29 | 2018-12-28 | 癌治療のために免疫チェックポイントを調節する単一特異性および二重特異性タンパク質 |
PCT/US2018/067868 WO2019133817A1 (en) | 2017-12-29 | 2018-12-28 | Monospecific and bispecific proteins with immune checkpoint regulation for cancer therapy |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020533119A Division JP7362614B2 (ja) | 2017-12-29 | 2018-12-28 | 癌治療のために免疫チェックポイントを調節する単一特異性および二重特異性タンパク質 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022109934A true JP2022109934A (ja) | 2022-07-28 |
Family
ID=67068142
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020533119A Active JP7362614B2 (ja) | 2017-12-29 | 2018-12-28 | 癌治療のために免疫チェックポイントを調節する単一特異性および二重特異性タンパク質 |
JP2022067239A Pending JP2022109934A (ja) | 2017-12-29 | 2022-04-14 | 癌治療のために免疫チェックポイントを調節する単一特異性および二重特異性タンパク質 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020533119A Active JP7362614B2 (ja) | 2017-12-29 | 2018-12-28 | 癌治療のために免疫チェックポイントを調節する単一特異性および二重特異性タンパク質 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11643470B2 (ja) |
EP (2) | EP4268848A3 (ja) |
JP (2) | JP7362614B2 (ja) |
KR (1) | KR102452246B1 (ja) |
CN (2) | CN118047873A (ja) |
AU (1) | AU2018394939B2 (ja) |
BR (1) | BR112020013133A2 (ja) |
CA (1) | CA3082036A1 (ja) |
ES (1) | ES2966569T3 (ja) |
MY (1) | MY195411A (ja) |
SG (1) | SG11202003893UA (ja) |
TW (2) | TW202116811A (ja) |
WO (1) | WO2019133817A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TWI731310B (zh) * | 2018-02-28 | 2021-06-21 | 圓祥生命科技股份有限公司 | 結合檢查點阻礙物作為標的治療的雙功能性蛋白質、其藥物複合體、其醫藥組成物、其核酸、及其用途 |
US20240141070A1 (en) * | 2019-10-17 | 2024-05-02 | Jiangsu Alphamab Biopharmaceuticals Co., Ltd. | Ox40/pd-l1 bispecific antibody |
WO2021097800A1 (en) * | 2019-11-22 | 2021-05-27 | Abl Bio Inc. | Anti-pd-l1/anti-b7-h3 multispecific antibodies and uses thereof |
EP4067387A4 (en) * | 2019-11-25 | 2023-12-27 | Akeso Biopharma, Inc. | BISPECIFIC ANTI-PD-1 ANTI-VEGFA NTIBODY, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND USE THEREOF |
AR127728A1 (es) * | 2021-11-19 | 2024-02-21 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Nueva proteína de fusión específica para ox40 y pd-l1 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003106498A2 (en) * | 2002-06-13 | 2003-12-24 | Crucell Holland, B.V. | Agonistic binding molecules to the human ox40 receptor |
JP2008544755A (ja) * | 2005-07-01 | 2008-12-11 | メダレックス インコーポレーティッド | プログラム死リガンド1(pd−l1)に対するヒトモノクローナル抗体 |
JP2011505836A (ja) * | 2007-12-14 | 2011-03-03 | ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・カンパニー | ヒトox40受容体に対する結合分子 |
JP2013538057A (ja) * | 2010-08-23 | 2013-10-10 | ボード・オブ・リージエンツ,ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 抗ox40抗体およびそれを使用する方法 |
JP2014527814A (ja) * | 2011-09-16 | 2014-10-23 | バイオセルオーエックス プロダクツ ビー.ブイ. | 抗cd134(ox40)抗体およびその使用 |
JP2015519375A (ja) * | 2012-05-31 | 2015-07-09 | ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドSorrento Therapeutics, Inc. | Pd−l1に結合する抗原結合蛋白質 |
WO2017087547A1 (en) * | 2015-11-17 | 2017-05-26 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Pd-l1-binding agents and uses thereof |
JP2017514461A (ja) * | 2014-03-31 | 2017-06-08 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗ox40抗体及び使用方法 |
WO2017193032A2 (en) * | 2016-05-06 | 2017-11-09 | Medimmune, Llc | Bispecific binding proteins and uses thereof |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5541297A (en) | 1988-04-01 | 1996-07-30 | Immunomedics, Inc. | Therapeutic conjugates of toxins and drugs |
JP6448533B2 (ja) | 2012-05-15 | 2019-01-09 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーBristol−Myers Squibb Company | Pd−1/pd−l1シグナル伝達を破壊することによる癌免疫療法 |
MX2016012779A (es) * | 2014-03-31 | 2017-04-27 | Genentech Inc | Terapia de combinacion con agentes antiangiogénesis y agonistas de unión a ox40. |
TW201619200A (zh) * | 2014-10-10 | 2016-06-01 | 麥迪紐有限責任公司 | 人類化抗-ox40抗體及其用途 |
MX2017006320A (es) * | 2014-11-17 | 2017-08-10 | Genentech Inc | Terapia combinada que comprende agonistas de unión de ox40 y antagonistas de unión del eje de pd-1. |
SG11201704550XA (en) * | 2014-12-05 | 2017-07-28 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Chimeric antigen receptors targeting fc receptor-like 5 and uses thereof |
EP3298032A1 (en) * | 2015-05-18 | 2018-03-28 | Bluebird Bio, Inc. | Anti-ror1 chimeric antigen receptors |
EP3365362A1 (en) * | 2015-10-23 | 2018-08-29 | Apogenix AG | Single-chain ox40-receptor agonist proteins |
GB201519481D0 (en) * | 2015-11-04 | 2015-12-16 | Cancer Rec Tech Ltd | Immunomodulatory antibodies |
NZ743124A (en) * | 2015-12-04 | 2022-11-25 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Antibodies targeting fc receptor-like 5 and methods of use |
EP3402507A4 (en) * | 2016-01-11 | 2019-08-07 | Inhibrx, Inc. | MULTIVALENT AND MULTISPECIFIC OX40-BINDING FUSION PROTEINS |
US20190112380A1 (en) | 2016-03-29 | 2019-04-18 | University Of Southern California | Chimeric antigen receptors targeting cancer |
TWI731310B (zh) * | 2018-02-28 | 2021-06-21 | 圓祥生命科技股份有限公司 | 結合檢查點阻礙物作為標的治療的雙功能性蛋白質、其藥物複合體、其醫藥組成物、其核酸、及其用途 |
WO2019184909A1 (zh) * | 2018-03-27 | 2019-10-03 | 信达生物制药(苏州)有限公司 | 新型抗体分子、其制备方法及其用途 |
-
2018
- 2018-12-28 CA CA3082036A patent/CA3082036A1/en active Pending
- 2018-12-28 AU AU2018394939A patent/AU2018394939B2/en active Active
- 2018-12-28 TW TW109134512A patent/TW202116811A/zh unknown
- 2018-12-28 SG SG11202003893UA patent/SG11202003893UA/en unknown
- 2018-12-28 MY MYPI2020003383A patent/MY195411A/en unknown
- 2018-12-28 ES ES18897074T patent/ES2966569T3/es active Active
- 2018-12-28 JP JP2020533119A patent/JP7362614B2/ja active Active
- 2018-12-28 EP EP23187547.7A patent/EP4268848A3/en active Pending
- 2018-12-28 TW TW107147877A patent/TWI742336B/zh active
- 2018-12-28 KR KR1020207012822A patent/KR102452246B1/ko active IP Right Grant
- 2018-12-28 EP EP18897074.3A patent/EP3731875B1/en active Active
- 2018-12-28 CN CN202410242154.5A patent/CN118047873A/zh active Pending
- 2018-12-28 BR BR112020013133-4A patent/BR112020013133A2/pt unknown
- 2018-12-28 WO PCT/US2018/067868 patent/WO2019133817A1/en unknown
- 2018-12-28 CN CN201880072318.7A patent/CN111344019B/zh active Active
-
2020
- 2020-05-11 US US16/871,799 patent/US11643470B2/en active Active
-
2022
- 2022-04-14 JP JP2022067239A patent/JP2022109934A/ja active Pending
-
2023
- 2023-03-09 US US18/181,339 patent/US20230322939A1/en active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003106498A2 (en) * | 2002-06-13 | 2003-12-24 | Crucell Holland, B.V. | Agonistic binding molecules to the human ox40 receptor |
JP2008544755A (ja) * | 2005-07-01 | 2008-12-11 | メダレックス インコーポレーティッド | プログラム死リガンド1(pd−l1)に対するヒトモノクローナル抗体 |
JP2011505836A (ja) * | 2007-12-14 | 2011-03-03 | ブリストル−マイヤーズ・スクイブ・カンパニー | ヒトox40受容体に対する結合分子 |
JP2013538057A (ja) * | 2010-08-23 | 2013-10-10 | ボード・オブ・リージエンツ,ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム | 抗ox40抗体およびそれを使用する方法 |
JP2014527814A (ja) * | 2011-09-16 | 2014-10-23 | バイオセルオーエックス プロダクツ ビー.ブイ. | 抗cd134(ox40)抗体およびその使用 |
JP2015519375A (ja) * | 2012-05-31 | 2015-07-09 | ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドSorrento Therapeutics, Inc. | Pd−l1に結合する抗原結合蛋白質 |
JP2017514461A (ja) * | 2014-03-31 | 2017-06-08 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗ox40抗体及び使用方法 |
WO2017087547A1 (en) * | 2015-11-17 | 2017-05-26 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Pd-l1-binding agents and uses thereof |
WO2017193032A2 (en) * | 2016-05-06 | 2017-11-09 | Medimmune, Llc | Bispecific binding proteins and uses thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20200061397A (ko) | 2020-06-02 |
US11643470B2 (en) | 2023-05-09 |
CN111344019A (zh) | 2020-06-26 |
EP3731875A1 (en) | 2020-11-04 |
KR102452246B1 (ko) | 2022-10-12 |
EP4268848A3 (en) | 2024-01-10 |
EP4268848A2 (en) | 2023-11-01 |
MY195411A (en) | 2023-01-19 |
SG11202003893UA (en) | 2020-05-28 |
RU2020120518A (ru) | 2022-01-31 |
TW201932486A (zh) | 2019-08-16 |
AU2018394939B2 (en) | 2022-02-24 |
AU2018394939A1 (en) | 2020-05-14 |
TWI742336B (zh) | 2021-10-11 |
RU2020120518A3 (ja) | 2022-01-31 |
BR112020013133A2 (pt) | 2020-12-08 |
US20230322939A1 (en) | 2023-10-12 |
CN111344019B (zh) | 2024-03-15 |
EP3731875A4 (en) | 2021-12-08 |
EP3731875B1 (en) | 2023-10-04 |
CA3082036A1 (en) | 2019-07-04 |
CN118047873A (zh) | 2024-05-17 |
NZ763957A (en) | 2023-10-27 |
TW202116811A (zh) | 2021-05-01 |
JP7362614B2 (ja) | 2023-10-17 |
WO2019133817A1 (en) | 2019-07-04 |
ES2966569T3 (es) | 2024-04-23 |
US20200270357A1 (en) | 2020-08-27 |
JP2021509258A (ja) | 2021-03-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7362614B2 (ja) | 癌治療のために免疫チェックポイントを調節する単一特異性および二重特異性タンパク質 | |
JP7464525B2 (ja) | 標的療法のためのチェックポイント遮断を組み合わせる二官能性タンパク質 | |
US20240026018A1 (en) | Antibodies for t-cell activation | |
RU2793167C2 (ru) | Моноспецифические и биспецифические белки с регулированием иммунной контрольной точки для лечения рака | |
NZ763957B2 (en) | Monospecific and bispecific proteins with immune checkpoint regulation for cancer therapy | |
WO2023042202A1 (en) | Multispecific antibodies for use in treating diseases |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220513 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230418 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230703 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20231212 |