TW202334203A - 新穎的ox40及pd-l1特異性融合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文揭示提供對OX40及PD-L1兩者具有特異性的融合蛋白，該等融合蛋白可用於以PD-L1標靶依存方式共同刺激淋巴細胞活化。此類融合蛋白可用於許多醫藥用途，例如作為抗癌劑及/或免疫調控劑。本文揭示也涉及製備本文所述的融合蛋白的方法以及包含此類融合蛋白的組合物。本文揭示進一步涉及編碼此類融合蛋白的核酸分子。另外，本案申請揭示此類融合蛋白的治療及/或診斷用途。

Description

新穎的OX40及PD-L1特異性融合蛋白
本發明係關於一種新穎的OX40及PD-L1特異性融合蛋白。
計畫性死亡-配體1或PD-L1(也稱作分化簇274或CD274以及B7同源物1或B7-H1)為單通道I型膜蛋白，其屬於抗原呈現的共同刺激/共同抑制分子的B7家族。PD-L1的細胞外部分含有兩個結構域：N-末端IgV型結構域及IgC型結構域。PD-L1具有短的細胞質結構域而不具有任何明顯的訊號轉導模體，這導致最初認為PD-L1作為受體不存在內在訊號傳遞。然而，最近的數據顯示，PD-L1的細胞質結構域含有能夠抑制干擾素(IFN)轉導並保護癌細胞免受IFN細胞毒性的非典型保守訊號轉導模體(Gato-Canas等人， Cell Rep，2017)。
PD-L1在懷孕、慢性感染、組織同種異體移植、自體免疫性疾病及癌症期間對免疫系統的抑制中扮演重要角色。PD-L1在各種細胞類型上表現，包括B細胞、T細胞、巨噬細胞、骨髓樹突細胞、肥大細胞、上皮及血管內皮細胞。其也在若干癌症類型中表現，包括但不限於黑色素瘤、肺癌、膀胱癌、結腸癌及乳癌。藉由媒介腫瘤浸潤T細胞的耗竭及缺失、分泌免疫抑制細胞介素、以及保護免受細胞毒性T細胞的裂解，高PD-L1表現程度與增加的腫瘤侵犯相關。
PD-L1為計畫性細胞死亡蛋白1(PD-1)的配體，其為關鍵免疫檢查點抑制受體，主要在活化的T細胞上表現，但也在免疫系統的其他細胞(包括B細胞及單核細胞)上表現。PD-1為免疫球蛋白家族的一員，其含有IgV樣細胞外結構域、跨膜結構域、以及具有ITIM(免疫受體酪胺酸的抑制模體)與ITSM(免疫受體酪胺酸的轉換模體)的細胞質尾。PD-L1與PD-1的接合導致含有src同源性2結構域的酪胺酸磷酸酶1及2(SHP1及2)召集到PD-1的細胞內轉換模體並表現CBL家族的E3泛素連接酶。這些泛素連接酶隨後泛素化並使關鍵TCR訊號轉導介質去活化，導致從細胞表面除去TCR(Karwacz等人， EMBO Mol Med，2011)。SHP 1及SHP 2磷酸酶藉由終止ZAP70及PI3K磷酸化而直接抑制TCR訊號傳遞。另外，接合PD-1的PD-L1可藉由影響CK2及週期蛋白依存激酶(CDK)的表現及活性而引起TCR訊號傳遞路徑的抑制(Arasanz等人， Oncotarget，2017)。也顯示PD-1接合導致重新編制T細胞代謝，從製造效應物功能所需增加的糖解到與長壽細胞相關的脂肪酸β-氧化。這也可解釋高PD-1表現細胞在慢性感染及癌症患者中的存活及持續性(Patsoukis 等人， Nat Commun，2015)。
藉由抗PD-1或抗PD-L1標靶劑阻斷PD-1/PD-L1相互作用可逆轉免疫檢查點功能並釋放對T細胞反應的煞車(brake)。目前阿特珠單抗(atezolizumab)(TECENTRIQ、MPDL3280A、RG7466)、阿維魯單抗(avelumab)(BAVENCIO、MSB0010718C)、及度伐魯單抗(durvalumab)(IMFINZI、MEDI4736)這三種PD-L1抗體經批准用於治療癌症。若干使用這些抗體的成功臨床試驗已顯示，膀胱癌、皮膚癌及肺癌的客觀緩解率高、反應持久或存活率提高(Xu-Monette等人， Front Immunol，2017)。
OX40，也稱作CD134或腫瘤壞死因子受體超家族成員4(TNFRSF4)，其為影響許多免疫功能方面的TNF受體，且為一種控制T細胞的最重要的共同刺激受體(Croft等人， Immunol Rev，2009)。OX40主要在活化的T細胞上表現，較佳在CD4 +T細胞上表現，同時也在CD8 +細胞上以較低程度表現(Croft， Annu Rev Immunol，2010)，但不在初始細胞上表現。也在活化的調控性T細胞(Treg)(So等人， Cytokine Growth Factor Rev，2008)、自然殺手T(NKT)細胞(Zaini等人， J Clin Invest，2007)、自然殺手(NK)細胞(Melero等人， Clin Cancer Res，2013)、以及嗜中性白血球(Baumann等人， Eur J Immunol，2004)上觀察到較低程度的OX40表現。唯一已知的OX40配體(OX40配體、OX40L、CD252或TNFSF4)並非持續表現。其主要在活化的抗原呈現細胞(例如樹突細胞、B細胞、巨噬細胞及內皮細胞)以及活化的T細胞上被發現(Flynn等人， J Exp Med，1998；Ohshima等人， J Immunol，1997；Stuber等人， Immunity，1995；Chen等人， Immunity，1999)。
OX40及OX40L兩者的表現藉由抗原呈現給T細胞受體而增加。雖然單獨的T細胞受體連接可驅動CD4 +T細胞上的OX40表現，但藉由CD28的共同刺激連接及OX40-OX40L連接可增強及維持這種表現(Rogers等人， Immunity，2001；Walker等人， J Exp Med，1999)。在初始刺激後24小時至4到5天，先前未經刺激的CD4 +T細胞上的OX40表現達到峰值。
藉由OX40L或抗OX40促效劑抗體接合OX40產生的共同刺激訊號會提高T細胞的增殖、效應物功能及存活(Weinberg等人， Immunol Rev，2011；Croft等人， Immunol Rev，2009)。OX40訊號傳遞也影響Treg功能，導致Treg抑制能力降低或Treg擴增，這取決於微環境(Aspeslagh等人， Eur J Cancer，2016)。另外，OX40及OX40L調控來自T細胞的細胞介素製造，導致記憶CD4 +細胞及記憶CD8 +細胞的產生與維持。
T細胞調控的能力使得OX40成為腫瘤治療的有希望的候選物。OX40在不同腫瘤環境中的腫瘤浸潤T細胞上表現，該等腫瘤環境包括乳癌、黑色素瘤、B細胞淋巴瘤及頭頸癌(Marabelle等人， J Clin Invest，2013；Morris等人， Nat Med，2009；Vetto等人， Am J Surg，1997；Xie等人， Pathol Res Pract，2010；Sarff等人， Am J Surg，2008)。研究顯示，OX40促效劑，包括OX40L、OX40融合蛋白、OX40抗體及RNA適體的使用導致若干臨床前模型中的腫瘤消退(Ali等人， Vaccine，2004；Kjaergaard等人， Cancer Res，2000；Morris等人， Breast Cancer Res Treat，2001；Piconese等人， J Exp Med，2008；Gough等人， J Immunother，2010；Redmond等人， Crit Rev Immunol，2009)。因此，一些抗OX40促效劑單株抗體(例如 MedImmune LLC的MEDI0562)目前正進行早期癌症臨床試驗。大多數已報導的OX40促效劑的所有作用涉及直接調控CD8 +T細胞存活(Vetto等人， Am J Surg，1997)、促進CD4 +T細胞對CD8 +T細胞的幫助(Lee等人， J Immunol，2004)、及/或抑制Treg的作用(Aspeslagh等人， Eur J Cancer，2016)。值得注意的是，OX40促效劑的效用可受到許多因素影響，包括腫瘤微環境及腫瘤負荷量。
另一方面，在自體免疫中，OX40及OX40L通常在發炎或自體免疫部位正調控。OX40及/或OX40L的阻斷已在大多數主要動物模型進行檢測，並顯示出疾病的症狀顯著減弱，該等疾病包括過敏性氣喘(Arestides等人， Eur J Immunol，2002；Jember等人， J Exp Med，2001)、實驗過敏性腦脊髓炎(EAE)(Weinberg等人， J Immunol，1999)、多發性硬化症(MS)(Weinberg等人， Nat Med，1996)、結腸炎(Higgins等人， J Immunol，1999)、糖尿病(Pakala等人， Eur J Immunol，2004)、關節炎(Yoshioka等人， Eur J Immunol，2000)、動脈粥狀硬化(van Wanrooij等人， Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007)、移植物抗宿主疾病(Tsukada等人， Blood，2000)、以及同種異體移植排斥(Curry等人， Transplantation，2004)。在大多數情況下，減少的疾病與抑制T細胞(弱CD4 +或CD8 +T細胞反應)或T細胞衍生細胞介素有關，儘管較有可能是其他細胞類型，包括NK細胞、NKT細胞、肥大細胞、及嗜中性白血球(其都可表現OX40L及/或OX40)的活性降低可能部分地導致臨床症狀減少(Croft等人， Immunol Rev，2009)。
由於OX40在調控免疫反應中的角色，因此一直以來對結合人類OX40並增加OX40媒介的反應的化合物的需求尚未得到滿足，從而為包括癌症的各種疾病提供潛在治療。
本文揭示尤其提供經由一或多個融合蛋白同時接合OX40及PD-L1的新穎方法，該等融合蛋白具有對OX40的結合特異性及對PD-L1的結合特異性的性質。
無本文揭示尤其提供經由一或多個融合蛋白同時接合OX40及PD-L1的新穎方法，該等融合蛋白具有對OX40的結合特異性及對PD-L1的結合特異性。所提供的融合蛋白旨在使OX40陽性T細胞與在腫瘤微環境中表現的PD-L1橋接。此類雙特異性分子可使OX40誘導的T細胞活化及擴增與抗PD-L1媒介的免疫檢查點阻斷組合，且因此可克服單一藥劑治療的某些限制，並為抗藥或無反應的患者提供益處。融合蛋白也旨在於一個分子中提供組合治療的潛力，並同時能使得在腫瘤微環境中局部誘導抗原特異性T細胞，從而潛在地降低周圍毒性。
在一些方面，本文揭示提供結合OX40及PD-L1的融合蛋白，及其方法與有用應用。本文揭示內容也提供製備本文所述的OX40及PD-L1結合融合蛋白的方法以及包含此類蛋白的組合物。本文揭示的OX40及PD-L1結合融合蛋白及其組合物可用於檢測樣品中OX40及/或PD-L1的方法、用於結合個體中OX40及/或PD-L1的方法、或用於調控個體中免疫反應的方法。先前並無描述過具有這些伴隨本文揭示提供的用途的特徵的此類融合蛋白。
定義
以下列表定義本案說明書中使用的術語、用語及縮寫。本文列出及定義的所有術語旨在涵蓋所有文法形式。
如本文所用，除非另有說明，否則「OX40」意指人類OX40(huOX40)。人類OX40意指由UniProt P43489(2021年4月7日，第177版)定義的全長蛋白、其片段或其變異。人類OX40由基因TNFRSF4編碼。OX40也稱作分化簇134(CD134)或腫瘤壞死因子受體超家族成員4(TNFRSF4)，兩者可互換使用。食蟹獼猴OX40(cyOX40)涉及食蟹獼猴的OX40。在一些具體實施例中，使用非人類物種的OX40，例如食蟹獼猴OX40及小鼠OX40。
如本文所用，除非另有說明，否則「計畫性細胞死亡1配體1」或「PD-L1」意指人類PD-L1(huPD-L1)。人類PD-L1意指由UniProt Q9NZQ7(2021年6月2日，第184版)定義的全長蛋白、其片段或其變異。人類PD-L1由CD274基因編碼。PD-L1也稱作分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)。在一些具體實施例中，使用非人類物種的PD-L1，例如食蟹獼猴PD-L1及小鼠PD-L1。
如本文所用，「結合親和力」描述本文揭示的生物分子(例如多肽或蛋白)(例如脂質運載蛋白突變蛋白、抗體、融合蛋白、或任何其他肽或蛋白)結合選定標靶(並形成複合物)的能力。結合親和力藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的許多方法測量，包括但不限於螢光滴定、基於酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)的分析，包括直接型及競爭型ELISA、量熱法，諸如等溫滴定量熱法(ITC)及表面電漿共振(SPR)。這些方法在本領域中是公認的且在本文中進一步描述這些方法的一些實例。結合親和力因此報導為使用這些方法測量的解離常數(K D)、半最大效應濃度(EC 50)、或半最大抑制濃度(IC 50)的值。較低的K D、EC 50或IC 50值反映較好(較高)的結合能力(親和力)。因此，可測量及比較兩種生物分子對選定標靶的結合親和力。當比較兩個生物分子對選定標靶的結合親和力時，「相當於」、「大致相同」、「基本上相同」或「基本上相似」等詞意指在結合親和力測量的實驗變異性內，具有以K D、EC 50或IC 50值報導的結合親和力一種生物分子與另一種分子的結合親和力相同或相似。較佳地，「相當於」、「大致相同」、「基本上相同」或「基本上相似」涉及與給定參考值偏差在50%以內，更佳偏差在20%以內，最佳偏差在10%以內的值。結合親和力測量的實驗變異性取決於所使用的特定方法且為本發明所屬技術領域中具有通常知識者所已知。
如本文所用，「基本上」乙詞也可涉及表現出感興趣的特徵或性質的全部或接近全部範圍或程度的定性條件。本生物領域中具有通常知識者將理解到，生物及化學現象即便有也很少達到完整及/或進行到完整或達到或避免絕對結果。因此，本文所用的「基本上」乙詞用來捕捉許多生物及化學現象中固有潛在的不完整性。
如本文所用，「檢測(detect)」、「檢測(detection)」、「可檢測的(detectable)」或「檢測(detecting)」等詞應理解為定量及定性兩者程度及其組合。因此，其包括對本文揭示的生物分子進行的定量、半定量及定性測量。
如本文所用，「可檢測的親和力」通常意指生物分子與其標靶之間的結合能力，由K D、EC 50或IC 50值報導，最多為約10 -5M或更低。根據K D、EC 50或IC 50值報導，高於10 -5M的結合親和力通常無法再以常見方法(諸如ELISA及SPR)測量，且因此為次要的。因此，「可檢測的親和力」可涉及藉由ELISA或SPR，較佳SPR測定的約10 -5M或更低的K D值。
值得注意的是，本文揭示的生物分子與其標靶之間的複合物形成受到許多不同因素的影響，諸如各自標靶的濃度、競爭劑的存在、pH及所用緩衝系統的離子強度、用於測定結合親和力的實驗方法(例如螢光滴定、競爭型ELISA(也稱作競爭性ELISA)及表面電漿共振)、以及甚至用於評估實驗數據的數學算法。因此，本發明所屬技術領域中具有通常知識者清楚的是，取決於方法及實驗設置，K D、EC 50或IC 50值所報導的結合親和力可在一定實驗範圍內變化。這意味著所測量的K D、EC 50或IC 50值或公差範圍可能存在輕微偏差，這取決於例如這些值是否為藉由ELISA(包括直接型或競爭性ELISA)、SPR或藉由其他方法所測定。
如本文所用，「特異性(specific for)」、「特異性結合(specific binding)」、「特異性結合(specific binding)」或「結合特異性(binding specificity)」涉及生物分子區分期望標靶(例如OX40及PD-L1)與一或多個參考標靶(例如嗜中性白血球明膠酶相關性脂質運載蛋白的細胞受體)的能力。應當理解到，這種特異性並非絕對而是相對的性質，且例如可藉由SPR、西方墨點法、ELISA、螢光流式細胞分選(FACS)、放射免疫測定(RIA)、電化學發光(ECL)、免疫放射分析(IRMA)、免疫組織化學(IHC)、以及肽掃描來測定。
當在本文結合OX40及PD-L1的本文揭示的融合蛋白的上下文中使用時，「特異性」、「特異性結合」、「特異性結合」或「結合特異性」等詞意指融合蛋白與本文所述的OX40及PD-L1結合、反應或針對他們，但基本上不結合另一種蛋白。「另一種蛋白」乙詞包括不是OX40或PD-L1的任何蛋白或與OX40或PD-L1密切相關或同源的蛋白。然而，「另一種蛋白」乙詞不排除來自人類之外的物種的OX40或PD-L1以及OX40或PD-L1的片段及/或變異。「基本上不結合」乙詞意指本文揭示的融合蛋白以較OX40及/或PD-L1低的結合親和力結合另一種蛋白，即顯示小於30%、較佳20%、更佳10%、具體較佳小於9、8、7、6或5%的交叉反應。融合蛋白是否如上文定義進行特異性反應可容易地測試，尤其是藉由比較本文揭示的融合蛋白與OX40及/或PD-L1的反應以及該融合蛋白與其他蛋白的反應。
如本文所用，「脂質運載蛋白」乙詞涉及重量約為18–20 kDa的單體蛋白，其具有圓柱形β褶板超二級結構區，該結構區包含藉由複數個(較佳四個)環在一端成對連接的複數個β股(較佳八個指定為A到H的β股)，從而包含配體結合口袋並定義配體結合口袋的入口。較佳地，本文揭示所用的包含配體結合口袋的環為連接β股A及B、C及D、E及F以及G及H的開放端的環，且指定為環AB、CD、EF及GH。已充分確定的是，在剛性脂質運載蛋白支架中，該等環的多樣性在脂質運載蛋白家族成員中產生多種不同的結合模式，每種結合模式能夠適應不同大小、形狀和化學特性的標靶(請例如回顧：Skerra， Biochim Biophys Acta，2000；Flower等人， Biochim Biophys Acta，2000；Flower， Biochem J，1996)。應當理解到，脂質運載蛋白家族已天然演化為結合廣泛的配體，具有異常低程度的整體序列保守性(通常序列一致性低於20%)，但仍保留高度保守的整體折疊模式。各種脂質運載蛋白中位置之間的對應性也是本發明所屬技術領域中具有通常知識者眾所周知的(請參見例如美國專利號7,250,297)。本文所用的「脂質運載蛋白」定義中的蛋白包括但不限於人類脂質運載蛋白，包括淚液脂質運載蛋白(Tlc，Lcn1)、脂質運載蛋白-2(Lcn2)或嗜中性白血球明膠酶相關性脂質運載蛋白(NGAL)、脂蛋白元D(ApoD)、脂蛋白元M、α 1-酸性糖蛋白1、α 1-酸性糖蛋白2、α 1-微球蛋白、補體成分8γ、視網醇結合蛋白(RBP)、附睪視網酸結合蛋白、糖蛋白、氣味結合蛋白IIa、氣味結合蛋白IIb、脂質運載蛋白15(Lcn15)、以及前列腺素D合成酶。
如本文所用，「脂質運載蛋白-2」或「嗜中性白血球明膠酶相關性脂質運載蛋白」涉及人類脂質運載蛋白-2(hLcn2)或人類嗜中性白血球明膠酶相關性脂質運載蛋白(hNGAL)，且進一步涉及成熟的人類脂質運載蛋白-2或成熟的人類嗜中性白血球明膠酶相關性脂質運載蛋白。「成熟」乙詞當用於描述蛋白的特性時，意指基本上不含訊號肽的蛋白。本文揭示的「成熟hNGAL」涉及人類嗜中性白血球明膠酶相關性脂質運載蛋白的成熟形式，其不含訊號肽。成熟的hNGAL由SWISS-PROT數據庫中寄存的序列的21–198位殘基描述，寄存編號為P80188，且其胺基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
如本文所用，「天然序列」涉及具有天然存在的序列或具有野生型序列的蛋白或多肽，無論其製備模式為何。這種天然序列蛋白或多肽可從自然界分離或可藉由其他方式製造，諸如藉由重組或合成方法。
「天然序列脂質運載蛋白」涉及與天然衍生的對應多肽具有相同胺基酸序列的脂質運載蛋白。因此，天然序列脂質運載蛋白可具有來自任何生物體，具體而言為哺乳動物的對應天然存在(野生型)脂質運載蛋白的胺基酸序列。「天然序列」乙詞當用於脂質運載蛋白的上下文時，特定涵蓋天然存在的截短或分泌形式的脂質運載蛋白、天然存在的變異形式，諸如脂質運載蛋白的可變剪接形式及天然存在的等位基因變異。「天然序列脂質運載蛋白」及「野生型脂質運載蛋白」等詞在本文中可互換使用。
如本文所用，「突變蛋白」、「突變的」實體(無論為蛋白或核酸)或「突變體」涉及與天然存在的(野生型)蛋白或核酸相比，一或多個胺基酸或核苷酸的交換、缺失或插入。該術語也包括本文所述突變蛋白的片段。本文揭示明確涵蓋如本文所述的脂質運載蛋白突變蛋白，其具有圓柱形β褶板超二級結構區，該結構區包含8個β股，該β股藉由在一端的四個環成對連接，從而包含配體結合口袋並定義配體結合口袋的入口，其中與天然序列脂質運載蛋白相比，位於該等四個環內的至少一個胺基酸發生突變。本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白較佳具有如本文所述結合OX40的功能。
如本文所用，與本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白相關的「片段」乙詞涉及衍生自全長成熟hNGAL或脂質運載蛋白突變蛋白的蛋白或多肽，其N末端及/或C末端截短，即缺少至少一個N末端及/或C末端胺基酸。此類片段可包括至少10個或更多個，諸如20個或30個或更多個成熟hNGAL或其來源的脂質運載蛋白突變蛋白的一級序列的連續胺基酸，且通常可在成熟hNGAL的免疫分析中檢測到。此類片段可能缺少最多2個、最多3個、最多4個、最多5個、最多10個、最多15個、最多20個、最多25個或最多30個(包括其間的所有數字)N末端及/或C末端胺基酸。應當理解到，該片段較佳為成熟hNGAL或其來源的脂質運載蛋白突變蛋白的功能片段，這意味著其較佳保留成熟hNGAL或其來源的脂質運載蛋白突變蛋白的結合特異性，較佳與OX40結合。作為說明性實例，此類功能片段可包含至少在對應於成熟hNGAL的線性多肽序列的位置13–157、15–150、18–141、20–134、25–134或28–134處的胺基酸。
關於本文揭示的融合蛋白的對應標靶OX40或PD-L1的「片段」，其涉及N末端及/或C末端截短的OX40或PD-L1，或OX40或PD-L1的蛋白結構域。本文所述OX40的片段或PD-L1的片段保留全長OX40或PD-L1被本文揭示的融合蛋白識別及/或結合的能力。作為說明性實例，該片段可為OX40或PD-L1的細胞外結構域。作為說明性實例，人類OX40的此類細胞外結構域可包含UniProt P43489的殘基29–214或SEQ ID NO: 4的殘基1–186。這樣的細胞外結構域可包含OX40的細胞外次結構域的胺基酸、基本上由其組成、或由其組成，該細胞外次結構域諸如為結構域1(UniProt P43489的殘基30–65)、結構域2(UniProt P43489的殘基66–107)、結構域3(UniProt P43489的殘基108–126)、以及結構域4(UniProt P43489的殘基127–167)的單獨或組合的胺基酸序列。食蟹獼猴OX40的細胞外結構域可包含SEQ ID NO: 6的殘基1–192。作為另一說明性實例，人類PD-L1的此類細胞外結構域可包含UniProt Q9NZQ7的胺基酸殘基19–238、基本上由其組成、或由其組成。
如本文所用，「變異」乙詞涉及蛋白或多肽的衍生物，其包括突變，例如藉由胺基酸序列或核苷酸序列的取代、缺失、插入及/或化學修飾。在一些具體實施例中，此類突變及/或化學修飾不降低蛋白或肽的功能性。此類取代可為保守的，即胺基酸殘基被化學上相似的胺基酸殘基所取代。保守取代的實例為以下組的成員之間的取代：1)丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸及纈胺酸；2)天門冬胺酸、麩胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺及組胺酸；3)精胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺及組胺酸；4)異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸、丙胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸及脯胺酸；以及5)異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸。此類變異包括蛋白或多肽，其中一或多個胺基酸已被其各自的D-立體異構物或被天然存在的20個胺基酸之外的胺基酸所取代，諸如例如鳥胺酸、羥脯胺酸、瓜胺酸、高絲胺酸、羥離胺酸、正纈胺酸。此類變異也包括例如其中在N-及/或C-末端加入一或多個胺基酸殘基或使一或多個胺基酸殘基缺失的蛋白或多肽。一般而言，變異與天然序列蛋白或多肽具有至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%或至少約98%的胺基酸序列一致性。變異較佳地保留其來源的蛋白或多肽的生物活性，例如結合相同的標靶。
本文所用的「變異」乙詞相對於本文揭示的融合蛋白的對應蛋白配體OX40或PD-L1，分別涉及OX40或PD-L1或其片段，其與OX40或PD-L1(野生型OX40或PD-L1)的天然序列，諸如本文所述UniProt P43489寄存的OX40或UniProt Q9NZQ7寄存的PD-L1相比，具有一個或多個，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80或更多個胺基酸取代、缺失及/或插入。OX40變異或PD-L1變異分別較佳與野生型OX40或PD-L1具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%的胺基酸一致性。本文所述的OX40變異或PD-L1變異保留結合本文揭示的OX40及PD-L1特異性融合蛋白的能力。
如本文關於脂質運載蛋白突變蛋白所用的「變異」乙詞涉及本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白或其片段，其中序列具有突變，包括取代、缺失及插入、及/或化學修飾。如本文所述的脂質運載蛋白突變蛋白的變異保留其來源的脂質運載蛋白突變蛋白的生物活性，例如與OX40結合。一般而言，脂質運載蛋白突變蛋白變異與其來源的脂質運載蛋白突變蛋白具有至少約50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、98%的胺基酸序列一致性。
如本文所用，「誘變」乙詞涉及使突變引入多核苷酸或胺基酸序列。較佳在實驗條件下引入突變，使得在蛋白或多肽序列的給定位置處天然存在的胺基酸可被改變，例如被至少一個胺基酸取代。「誘變」乙詞也包括藉由刪除或插入一或多個胺基酸而對序列片段的長度進行(額外)修飾。因此，在本文揭示的範圍內，例如，在選定序列位置處的一個胺基酸被一段三個胺基酸取代，導致與天然蛋白或多肽胺基酸序列的對應區段的長度相比增加兩個胺基酸殘基。這種插入或缺失可彼此獨立地引入在本文揭示中可進行誘變的任何序列區段中。在本文揭示的一個示例性具體實施例中，插入可引入對應於天然序列脂質運載蛋白的環AB的胺基酸序列區段(請參見國際專利公開號WO 2005/019256，其藉由引用整體併入本文)。
如本文所用，「隨機誘變」乙詞意指在某一序列位置不存在預定的突變(胺基酸的改變)，但在誘變期間至少兩個胺基酸可用一定的機率併入預定的序列位置。
如本文所用，「序列一致性」或「一致性」等詞表示測量其相似性或關係的序列的性質。如本文揭示中使用的「序列一致性」或「一致性」等詞意指本文揭示的蛋白或多肽的序列與所討論的序列(同源)比對後，相對於這兩個序列中較長序列中的殘基數目，成對相同殘基的百分比。藉由使相同胺基酸殘基的數目除以殘基的總數，並使乘積乘以100來測量序列一致性。
如本文所用，「序列同源性」或「同源性」等詞具有其通常含義，且同源胺基酸包括相同胺基酸以及被認為是本文揭示的蛋白或多肽(例如本文揭示的任何融合蛋白或脂質運載蛋白突變蛋白)的線性胺基酸序列中等同位置處的保守取代的胺基酸。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者將認識到使用標準參數測定序列同源性或序列一致性的可用電腦程式，例如BLAST(Altschul等人， Nucleic Acids Res，1997)、BLAST2(Altschul等人， J Mol Biol，1990)及Smith-Waterman(Smith及Waterman， J Mol Biol，1981)。序列同源性或序列一致性的百分比在本文中例如可使用第2.2.5版的BLASTP(2002年11月16日；(Altschul等人， Nucleic Acids Res，1997))來測定。在一些具體實施例中，同源性百分比基於包括原肽序列的整個蛋白或多肽序列(矩陣：BLOSUM 62；間隙扣分：11.1；截止值設定為10 -3)的比對，較佳使用野生型蛋白支架作為成對比較中的參考。其計算方法為在BLASTP程式輸出中顯示為結果的「陽性」(同源胺基酸)數目除以程式選擇用於比對的胺基酸總數的百分比。
特定而言，為了測定脂質運載蛋白(突變蛋白)的胺基酸序列與參考(野生型)脂質運載蛋白的胺基酸序列中的某個位置處的胺基酸序列是否不同，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可使用本領域眾所周知的手段及方法，例如手動或藉由使用電腦程式，諸如BLAST 2.0(其代表基本局部比對搜索工具)或ClustalW、或任何其他合適於產生序列比對的合適程式來進行比對。因此，參考(野生型)脂質運載蛋白的胺基酸序列可作為「主題序列(subject sequence)」或「參考序列」，而脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列可作為「查詢序列」。「野生型序列」、「參考序列」及「主題序列」等詞在本文中可互換使用。脂質運載蛋白的較佳野生型序列為如SEQ ID NO: 1所示的成熟hNGAL的序列。
「間隙」為比對中由於胺基酸的加入或缺失而產生的空間。因此，完全相同序列的兩個拷貝具有100%一致性，但並非高度保守且具有缺失、加入或取代的序列可能具有較低程度的序列一致性。
如本文所用，「位置」乙詞意指本文揭示的胺基酸序列內的胺基酸的位置或本文揭示的核酸序列內的核苷酸的位置。應當理解到，當「對應(correspond)」或「對應(corresponding)」等詞在本文中用於一或多個脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列位置的上下文中時，對應位置並非僅由前面的核苷酸或胺基酸的數量所決定。因此，由於(突變或野生型)脂質運載蛋白中別處胺基酸的缺失或加入，因此根據本文揭示的給定胺基酸的絕對位置可與對應位置不同。類似地，由於突變蛋白或野生型脂質運載蛋白5’-非轉譯區(UTR)中其他地方的缺失或額外核苷酸，包括啟動子及/或任何其他調控序列或基因區(包括外顯子和內含子)，因此根據本文揭示的給定核苷酸的絕對位置可與對應位置不同。
根據本文揭示的「對應位置」可為在根據本文揭示的成對或多序列比對中與其對應的序列位置比對的序列位置。較佳地，應當理解到，對於根據本文揭示的「對應位置」，核苷酸或胺基酸的絕對位置可與相鄰的核苷酸或胺基酸不同，但是已交換、缺失、或加入的該等相鄰的核苷酸或胺基酸可包含在相同的一或多個「對應位置」中。
另外，對於基於根據本文揭示的參考序列的脂質運載蛋白突變蛋白中的對應位置，較佳地，應當理解到，脂質運載蛋白突變蛋白的核苷酸或胺基酸的位置可在結構上對應於參考脂質運載蛋白(野生型脂質運載蛋白)或另一種脂質運載蛋白突變蛋白中其他地方的位置，即使他們的絕對位置數目可能不同，如本發明所屬技術領域中具有通常知識者鑒於脂質運載蛋白之間高度保守的整體折疊模式所理解般。
如本文可互換使用的，「共軛(conjugate)」、「共軛(conjugation)」、「融合(fusion)」、「融合(fusion)」或「連接(linked)」等詞涉及藉由所有形式的共價或非共價連接，藉由包括但不限於基因融合、化學共軛、經由連接子或交聯劑耦合以及非共價締合的方式使兩個或多個次單元連接在一起。
如本文所用的「融合多肽」或「融合蛋白」等詞涉及包含兩個或更多個次單元的多肽或蛋白。在一些具體實施例中，本文所述的融合蛋白包含兩個或更多個次單元，這些次單元中的至少一者能夠特異性結合OX40，且另一次單元能夠特異性結合PD-L1。在一個具體實施例中，本文所述的融合蛋白不包含能夠特異性結合4-1BB(CD137)的次單元。在融合蛋白內，可藉由共價或非共價鍵聯而連接次單元。較佳地，融合蛋白為兩個或更多個次單元之間的轉譯融合。可藉由使閱讀框中一個次單元的編碼序列與另一次單元的編碼序列進行基因工程改造而產生轉譯融合。可由編碼連接子的核苷酸序列散布兩個次單元。然而，也可藉由化學共軛連接本文揭示的融合蛋白的次單元。形成融合蛋白的次單元通常如下彼此連接：一個次單元的C末端與另一次單元的N末端連接、或一個次單元的C末端與另一次單元的C末端連接、或一個次單元的N末端與另一次單元的N末端連接、或一個次單元的N末端與另一次單元的C末端連接。融合蛋白的次單元可用任何順序連接，且可包括一個以上的任何組成次單元。若一或多個次單元為由一個以上多肽鏈組成的蛋白(複合物)的一部分，則「融合蛋白」乙詞也可涉及包含融合序列及蛋白(複合物)的所有其他多肽鏈的蛋白。作為說明性實例，當抗體經由抗體的重鏈或輕鏈與脂質運載蛋白突變蛋白融合時，「融合蛋白」乙詞可涉及包含脂質運載蛋白突變蛋白及抗體的重鏈或輕鏈的單一多肽鏈。「融合蛋白」乙詞也可涉及完整抗體(輕鏈及重鏈)及與其重鏈及/或輕鏈中的一或兩者融合的脂質運載蛋白突變蛋白。
如本文所用，本文所揭示的融合蛋白的「次單元」乙詞涉及單個蛋白或單獨的多肽鏈，其自身可形成穩定的折疊結構且可定義向標靶提供結合模體的獨特功能。在一些具體實施例中，本文揭示的較佳次單元為脂質運載蛋白突變蛋白。在一些其他具體實施例中，本文揭示的較佳次單元為抗體或其抗原結合結構域/片段。
本文揭示的融合蛋白可包含的「連接子」使如本文所述的融合蛋白的兩個或更多個次單元連接在一起。該連接可為共價或非共價的。較佳的共價連接為經由肽鍵，諸如胺基酸之間的肽鍵。較佳的連接子為肽連接子。因此，在較佳的具體實施例中，該連接子包含一或多個胺基酸，諸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個胺基酸。本文描述較佳的肽連接子包括甘胺酸-絲胺酸(GS)連接子、醣基化GS連接子、及脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸聚合物(PAS)連接子。在一些較佳的具體實施例中，使用GS連接子，諸如SEQ ID NO: 10中所述的(G 4S) 3連接子，使融合蛋白的次單元連接在一起。其他較佳的連接子包括化學連接子。
如本文所用，「白蛋白」乙詞包括所有哺乳動物白蛋白，諸如人類血清白蛋白或牛血清白蛋白或大鼠血清白蛋白。
如本文所用，「有機分子」或「有機小分子」等詞表示包含至少兩個碳原子但較佳不超過7或12個可旋轉碳鍵的有機分子，其分子量範圍在100與2,000道耳吞之間，較佳在100與1,000道耳吞之間，且任選地包括一或兩個金屬原子。
「樣本」定義為取自任何個體的生物樣本。生物樣品包括但不限於血液、血清、尿液、糞便、精液或組織，包括腫瘤組織。
「個體」為脊椎動物，較佳為哺乳動物，更佳為人類。本文所用的「哺乳動物」乙詞涉及歸類為哺乳動物的任何動物，包括但不限於人類、家畜及農場動物，以及動物園、運動或寵物動物，諸如綿羊、狗、馬、貓、牛、大鼠、豬、猿(諸如食蟹獼猴)，僅列舉若干說明性實例。較佳地，本文所用的「哺乳動物」為人類。
「有效量」為足以產生有益或期望結果的量。有效量可用一或多次單獨施用或劑量施用。
如本文所用，「抗體」包括完整抗體或任何抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或其單鏈。「抗體」及「免疫球蛋白」等詞在本文中可互換使用。全長抗體涉及包含藉由雙硫鍵相互連接的至少兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC)的糖蛋白。每個重鏈由重鏈可變結構域(V H或HCVR)及重鏈恆定區(C H)組成。重鏈恆定區由三個結構域C H1、C H2及C H3組成。每個輕鏈由輕鏈可變結構域(V L或LCVR)及輕鏈恆定區(C L)組成。輕鏈恆定區由一個結構域C L組成。V H及V L區可進一步細分為高變異性，稱作互補決定區(CDR)，其間散布著更保守的區域，稱作框架區(FR)。每個V H及V L由三個CDR及四個FR構成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈的可變區含有與抗原(例如PD-L1)相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可任選地媒介抗體與宿主組織或因子的結合，包括免疫系統的各種細胞(例如效應物細胞)及典型補體系統的第一成分(C1q)。
如本文所用，抗體的「抗原結合片段」(本文也稱作「抗原結合結構域」)涉及保留特異性結合抗原(例如PD-L1)的能力的抗體的一或多個片段。已顯示抗體的抗原結合功能可藉由全長抗體的片段來執行。涵蓋在抗體的「抗原結合片段」乙詞內的結合片段的實例包括以下：(i)Fab片段，其由V H、V L、C L及C H1結構域組成；(ii)F(ab’)2片段，其包含在鉸鏈區由雙硫鍵連接的兩個Fab片段；(iii)Fab’片段，其由V H、V L、C L及C H1結構域以及C H1及C H2結構域之間的區域組成；(iv)Fd片段，其由V H及C H1結構域組成；(v)單鏈Fv片段，其由抗體單臂的V H及V L結構域組成；(vi)dAb片段(Ward等人， Nature，1989)，其由V H結構域組成；(vii)分離的互補決定區(CDR)或兩個或多個分離的CDR的組合，其可任選地藉由合成連接子連接；(viii)「雙抗體(diabody)」，其包含使用短連接子連接在同一多肽鏈中的V H及V L(請例如參見專利文獻EP 404,097；WO 93/11161；以及Holliger等人， Proc Natl Acad Sci U S A，1993)；以及(ix)「結構域抗體片段」，其僅含有V H或V L，其中在一些情況下，兩個或更多個V H區共價連接。
抗體可為多株抗體或單株抗體；異種異體的、同種異體的或同基因的；或其修飾形式(例如人源化的、嵌合的或多特異性的)。抗體也可為全人類的。
如本文所用，「框架」或「FR」涉及除了高度變異區(CDR)殘基之外的可變結構域殘基。
「片段可結晶區」或「Fc區」涉及抗體重鏈的C末端區，包括天然序列Fc區及變異Fc區。儘管抗體重鏈Fc區的邊界可能不同，但人類IgG重鏈Fc區通常定義為從位置Cys226或Pro230的胺基酸殘基延伸到其羧基末端，根據Kabat的EU索引進行編號(Johnson及Wu， Nucleic Acids Res，2000)。Fc區的C末端離胺酸(根據Kabat的EU索引的殘基447)例如可在抗體的製造或純化期間，或藉由重組工程改造編碼抗體重鏈的核酸而被除去。因此，完整抗體的組合物可包含全部K447殘基被除去的抗體群、沒有K447殘基被除去的抗體群、以及具有含或不含K447殘基的抗體混合物的抗體群。用於本文揭示抗體的合適天然序列Fc區包括人類IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3及IgG4。
「Fc受體」或「FcR」涉及與抗體的Fc區結合的受體。
如本文所用，「分離的抗體」涉及基本上不含其天然環境的抗體。例如，分離的抗體基本上不含細胞物質及來自其來源的細胞或組織來源的其他蛋白。「分離的抗體」進一步涉及基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體的抗體。在本案中，特異性結合PD-L1的分離抗體基本上不含特異性結合除了PD-L1之外的抗原的抗體。然而，特異性結合PD-L1的分離的抗體可具有與其他抗原，諸如來自其他物種的PD-L1分子的交叉反應。
如本文所用，「單株抗體」涉及具有單一分子組成的抗體分子的製劑。單株抗體組合物對具體表位表現出單一結合特異性及親和力。
如本文所用，「人源化抗體」涉及由源自除了人類之外的哺乳動物的抗體的CDR、以及人類抗體或源自人類抗體的FR區及恆定區組成的抗體。人源化抗體可包含具有可變區胺基酸序列的可變結構域，如使用如Ehrenmann等人，(2010)所述的免疫基因學訊息系統(IMGT)DomainGapAlign工具所評估，該可變區胺基酸序列作為整體分析時更接近人類而非其他物種。由於抗原性降低，因此人源化抗體可用作治療劑中的有效成分。如本文所用，「治療劑」或「治療活性劑」等詞涉及治療上有用的試劑。治療劑可為用於預防、改善或治療疾病、生理狀況、症狀或用於其評估或診斷的任何藥劑。
如本文所用，「人類抗體」包括具有可變區的抗體，其中框架區及CDR區都衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列。另外，若抗體含有恆定區，則恆定區也源自人類生殖系免疫球蛋白序列。本文揭示的人類抗體可包括不由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如藉由體外隨機或定點特異性誘變或藉由體內體細胞突變引入的突變)。然而，本文所用的「人類抗體」乙詞並非旨在包括其中衍生自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)的生殖系的CDR序列已移植到人類框架序列上的抗體。 A. 對本文揭示的 OX40 及 PD-L1 具有特異性的示例性融合蛋白。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白含有至少兩個以任何順序排列的次單元：(1)第一次單元，其包含對PD-L1具有特異性的全長抗體或其抗原結合結構域，及(2)第二次單元，其包含對OX40具有特異性的脂質運載蛋白突變蛋白。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白也可含有至少一個額外的次單元，例如第三次單元。例如，融合蛋白可含有對OX40具有特異性的第三次單元。在一些具體實施例中，第三次單元可為或包含對OX40具有特異性的脂質運載蛋白突變蛋白。例如，兩個脂質運載蛋白突變蛋白可融合到第一抗體次單元，一個在抗體的C-末端，且一個在抗體的N-末端。在一些具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白可融合到抗體的重鏈或輕鏈。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可包含一或多個額外的次單元(例如第四、第五或第六次單元)。
在一些具體實施例中，至少一個次單元可在其N-末端及/或其C-末端融合到另一次單元。
在一些具體實施例中，至少一個次單元可經由連接子連接到另一次單元。在一些進一步的具體實施例中，連接子為肽連接子，例如非結構化甘胺酸-絲胺酸(GS)連接子、醣基化GS連接子、或脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸聚合物(PAS)連接子。在一些具體實施例中，GS連接子為如SEQ ID NO: 10所示的(Gly 4Ser) 3連接子((G 4S) 3)。其他示例性連接子示於SEQ ID NO: 11–20。在一些具體實施例中，肽連接子可具有1到50個胺基酸，例如1、2、3、4、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸。例如，當第一次單元包含抗體，諸如全長抗體時，第二次單元可經由肽連接子在第二次單元的N-末端與該抗體的重鏈恆定區(CH)的C-末端之間連接。在一些進一步的具體實施例中，第三次單元可經由肽連接子在第三次單元的N-末端與該抗體的輕鏈恆定區(CL)的C-末端之間連接。
在一些具體實施例中，一個次單元可連接到另一次單元，基本上如 圖 1所述。一般而言，一個次單元可在其N-末端及/或其C-末端融合到另一次單元。例如，在一些具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白次單元可在其N-末端及/或其C-末端融合到抗體次單元。又例如，一個脂質運載蛋白突變蛋白可較佳經由肽連接子連接到抗體重鏈結構域(HC)的C-末端、HC的N-末端、抗體輕鏈的C-末端(LC)、及/或LC的N末端( 圖 1A 到 1D)。
在一些具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白次單元可在其N-末端及/或其C-末端融合到抗體片段。例如，在一些具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白可較佳經由肽連接子連接在抗體的重鏈恆定區(CH)的C末端或輕鏈恆定區(CL)的C末端。
在一些具體實施例中，當一個次單元包含抗體，諸如全長抗體時，第二次單元可連接在第二次單元的N末端與該抗體的重鏈恆定區(CH)的C末端之間。
在一些具體實施例中，第三次單元可連接在第三次單元的N-末端與該抗體的及輕鏈恆定區(CL)的C-末端之間。
在一些具體實施例中，對於本文揭示的融合蛋白，其中至少一個次單元可為或包含抗體，諸如全長抗體，抗體的Fc區的Fc功能可在融合蛋白同時接合OX40及PD-L1時同時保留。例如，抗體的Fc區仍然能夠在融合蛋白同時接合OX40及PD-L1時同時結合Fc受體陽性細胞。
在一些具體實施例中，其中所提供的融合蛋白的至少一個次單元可為或包含抗體，諸如全長抗體，抗體的Fc區的Fc功能可藉由蛋白工程改造降低或完全抑制，而融合蛋白能夠同時接合OX40及PD-L1。例如，抗體的Fc區結合Fc受體陽性細胞的能力可藉由蛋白工程改造降低或完全抑制，而融合蛋白能夠同時接合OX40及PD-L1。在一些具體實施例中，這例如可藉由從IgGl骨架轉換為IgG4來實現，這是因為與IgGl相比，已知IgG4顯示出減少的Fc-γ受體相互作用。在一些具體實施例中，為了進一步減少與Fc-γ受體的殘餘結合，可使突變引入IgG4骨架，諸如F234A及L235A。在一些具體實施例中，也可使S228P突變引入IgG4骨架以最小化IgG4半抗體的交換(Silva等人， J Biol Chem，2015)。在一些具體實施例中，可引入F234A及L235A突變以降低ADCC及ADCP(Glaesner等人， Diabetes Metab Res Rev，2010)及/或引入M428L及N434S突變或引入M252Y、S254T及T256E突變以延長血清半衰期(Dall'Acqua等人， J Biol Chem，2006；Zalevsky等人， Nat Biotechnol，2010)。在一些具體實施例中，融合蛋白的抗體重鏈中可存在額外的N297A突變於以除去天然醣基化模體。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白中包括的抗體的Fc部分可有助於維持融合蛋白的血清濃度。例如，當Fc部分結合內皮細胞及吞噬細胞上的Fc受體時，融合蛋白可被內化並再循環回到血流，從而增加其在體內的半衰期。
在一方面，本文揭示的融合蛋白以高親和力結合OX40。在另一方面，所提供的融合蛋白以高親和力結合PD-L1。在一些較佳的具體實施例中，所提供的融合蛋白同時結合OX40及PD-L1。在一些具體實施例中，同時結合OX40及PD-L1能讓所提供的融合蛋白表現出持久的抗腫瘤或抗感染反應。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠以最多約2 nM或甚至更低的K D值結合PD-L1，諸如約1.5 nM或更低、約1 nM或更低、約0.6 nM或更低、或約0.4 nM或更低。在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠以與包括在此類融合蛋白中的對PD-L1具有特異性的抗體的K D值相當或更低的K D值結合PD-L1，諸如具有SEQ ID NO: 78及79所提供的重鏈及輕鏈的該抗體。所提供的融合蛋白的K D值例如可在表面電漿共振(SPR)分析，諸如基本上如 實例 3中所述的SPR分析中測量。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠以最多約10 nM或甚至更低的K D值結合OX40，諸如約7 nM、約6 nM、或約5 nM、約4 nM、約3 nM、約2 nM、或甚至更低。在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠以與對具體的融合蛋白，例如SEQ ID NO: 33、34、35、36、95、96或97中包括的對OX40具有特異性的脂質運載蛋白突變蛋白，或與抗體的Fc區，例如SEQ ID NO: 39、40、41、42、98、99或100融合的脂質運載蛋白突變蛋白的K D值相當或更低的K D值結合OX40。所提供的融合蛋白的K D值例如可在SPR分析，諸如基本上如 實例 3中所述的SPR分析中測量。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠以最多約0.5 nM或甚至更低的EC 50值結合PD-L1，諸如約0.3 nM或更低、約0.2 nM或更低、約0.15 nM或更低、或約0.1 nM或更低。在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠以與包括在具體融合蛋白中的對PD-L1具有特異性的抗體的EC 50值相當或更低的EC 50值結合PD-L1，諸如具有SEQ ID NO: 78及79所提供的重鏈及輕鏈的該抗體。所提供的融合蛋白的EC 50值例如可在酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)中，諸如基本上如 實例 4中所述的ELISA分析測量。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠以最多約0.6 nM或甚至更低的EC 50值結合OX40，諸如約0.5 nM或更低、約0.2 nM或更低、約0.15 nM或更低、或約0.1 nM或更低。在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠以與對具體的融合蛋白，例如SEQ ID NO: 33、34、35、36、95、96或97中包括的對OX40具有特異性的脂質運載蛋白突變蛋白，或與抗體的Fc區，例如SEQ ID NO: 39、40、41、42、98、99或100融合的脂質運載蛋白突變蛋白的EC 50值相當或更低的EC 50值結合OX40。所提供的融合蛋白的EC 50值例如可在ELISA分析，諸如基本上如 實例 4中所述的ELISA分析中測量。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白與食蟹獼猴PD-L1具有交叉反應。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠以最多約0.5 nM或甚至更低的EC 50值結合食蟹獼猴PD-L1，諸如約0.2 nM或更低、約0.1 nM或更低、或約0.05 nM或更低。所提供的融合蛋白的EC 50值例如可在ELISA分析，諸如基本上如 實例 4中所述的ELISA分析中測量。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白與食蟹獼猴OX40具有交叉反應。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠以最多約15 nM或甚至更低的EC 50值結合食蟹獼猴OX40，諸如約10 nM或更低、約8 nM或更低、約6 nM或更低、約3 nM或更低、約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約3 nM或更低、或約0.1 nM或更低。所提供的融合蛋白的EC 50值例如可在ELISA分析，諸如基本上如 實例 4中所述的ELISA分析中測量。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠同時結合OX40及PD-L1。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠同時結合OX40及PD-L1，EC 50值最多約為1 nM或甚至更低，諸如0.8 nM或更低、0.6 nM或更低、或0.4 nM或更低。在一些其他具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠同時結合OX40及PD-L1，EC 50值最多約10 nM或甚至更低，諸如8 nM或更低、6 nM或更低、3 nM或更低、或2 nM或更低。可例如在ELISA分析，諸如基本上如 實例 5中所述的ELISA分析中測定同時結合。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白能夠結合細胞上表現的OX40。所提供的融合蛋白結合細胞上表現的OX40的能力例如可在基本上如 實例 6中所述的流式細胞術分析中測量。表現OX40的細胞例如可為以人類OX40或食蟹獼猴OX40轉染的CHO細胞。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白能夠結合細胞上表現的PD-L1。所提供的融合蛋白結合細胞上表現的PD-L1的能力例如可在基本上如 實例 6中所述的流式細胞術分析中測量。表現PD-L1的細胞例如可為以人類PD-L1或食蟹獼猴PD-L1轉染的CHO細胞。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠抑制OX40與OX40L的結合。在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠以與具有SEQ ID NO: 25及26提供的重鏈及輕鏈的抗OX40抗體及/或SEQ ID NO: 43及44的基準融合蛋白相似的模式結合OX40。可例如藉由ELISA分析，諸如基本上如 實例 9中所述的ELISA分析來測定OX40與融合蛋白的OX40L結合的抑制。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠與PD-1競爭結合PD-L1。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠與PD-1競爭結合PD-L1，IC 50值最多為約5 nM或甚至更低，諸如約3 nM或更低、約2 nM或更低、或約1 nM甚至更低。可例如藉由ELISA分析，諸如基本上如 實例 10中所述的ELISA分析來測定抑制作用模式。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠與SEQ ID NO: 25及26中所示的抗OX40抗體競爭結合OX40。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可具有與SEQ ID NO: 25及26中所示的抗OX40抗體重疊的表位。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠共同刺激T細胞反應。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白導致與PD-L1抗體，諸如SEQ ID NO: 78及79的構築單元PD-L1抗體或SEQ ID NO: 80及81的參考PD-L1抗體、或OX40抗體，諸如SEQ ID NO: 25及26的參考抗體相當或更強的T細胞活化。在一些具體實施例中，與抗PD-L1抗體及OX40靶向分子，諸如抗OX40抗體或OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的組合相比，所提供的融合蛋白以相當或更好的效率導致T細胞活化。可例如在如 實例 11所述的PD-1/PD-L1阻斷生物分析中、或在基本上如 實例 12、 實例 13、 實例 14、 實例 15及/或 實例 16中所述的功能T細胞活化分析中測量經刺激的T細胞反應或T細胞活化。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠誘導增加的IL-2分泌。在一些較佳的具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠誘導濃度依存IL-2分泌及/或證明在較高濃度下誘導IL-2分泌增強的趨勢。在一些具體實施例中，與抗PD-L1抗體及OX40靶向分子，諸如抗OX40抗體或OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的組合相比，所提供的融合蛋白可能以相當或更好的效率導致增加的IL-2分泌。可例如在基本上如 實例 12、 實例 13及/或 實例 14中所述的功能性T細胞活化分析中測量IL-2分泌。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠誘導CD4 T細胞的IFN-γ(或IFNg)分泌增加。在一些較佳的具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠誘導濃度依存IFN-γ分泌及/或證明在較高濃度下誘導IFN-γ分泌增強的趨勢。在一些具體實施例中，與抗PD-L1抗體及OX40靶向分子，諸如抗OX40抗體或OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的組合相比，所提供的融合蛋白可能以相當或更好的效率導致增加的IFN-γ分泌。可例如在基本上如 實例 15中所述的混合淋巴細胞反應評估分析中測量CD4 T細胞的IFN-γ分泌。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠誘導CD4 T細胞的IL-13分泌增加。在一些較佳的具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠誘導濃度依存IL-13分泌及/或證明在較高濃度下誘導IL-13分泌增強的趨勢。在一些具體實施例中，與抗PD-L1抗體及OX40靶向分子，諸如抗OX40抗體或OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的組合相比，所提供的融合蛋白可能以相當或更好的效率導致增加的IL-13分泌。在一些具體實施例中，與SEQ ID NO: 43及44的參考雙特異性融合蛋白相比，所提供的融合蛋白可導致IL-13分泌增加，具有更高EC50。可例如在基本上如 實例 15中所述的混合淋巴細胞反應評估分析中測量CD4 T細胞的IL-13分泌。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠誘導CD3 T細胞的IL-2/IL-13分泌增加。在一些具體實施例中，與SEQ ID NO: 78及79的構築單元PD-L1抗體相比，所提供的融合蛋白可導致IL-2及/或IL-13的更高分泌。可例如在基本上如 實例 16中所述的混合淋巴細胞反應評估分析中測量CD3 T細胞的IL-2及/或IL-13分泌。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠誘導CD3 T細胞的IL-2/IL-13分泌增加。在一些具體實施例中，與SEQ ID NO: 78及79的構築單元PD-L1抗體相比，所提供的融合蛋白可導致IL-2及/或IL-13的分泌更高。可例如在基本上如 實例 16中所述的混合淋巴細胞反應評估分析中測量CD3 T細胞的IL-2及/或IL-13分泌。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白能夠誘導CD3 T細胞的顆粒酶A、顆粒酶B及/或可溶性Fas配體分泌增加。在一些具體實施例中，與SEQ ID NO: 78及79的構築單元PD-L1抗體相比，所提供的融合蛋白可導致顆粒酶A、顆粒酶B及/或可溶性Fas配體的分泌更高。可例如在基本上如 實例 16中所述的混合淋巴細胞反應評估分析中測量CD3 T細胞的顆粒酶A、顆粒酶B及/或可溶性Fas配體分泌。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠以PD-L1依存方式共同刺激T細胞反應。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可導致在PD-L1陽性細胞，諸如PD-L1轉染的細胞或PD-L1陽性腫瘤細胞附近的T細胞局部誘導IL-2製造。當在本文中使用時，「在PD-L1陽性細胞附近」涉及藉由所提供的融合蛋白(其同時結合OX40及PD-L1)使T細胞及PD-L1陽性細胞彼此靠近。可例如在如實例11所述的PD-1/PD-L1阻斷生物分析中、或在基本上如 實例 12、 實例 13、 實例 14、 實例 15及/或 實例 16中所述的功能T細胞活化分析中測定所提供的融合蛋白對T細胞的PD-L1依存活化。
在一些較佳的具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠在表現PD-L1的腫瘤細胞的存在下及/或在腫瘤微環境中共同刺激T細胞反應。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠在PD-L1陽性腫瘤細胞的存在下共同刺激T細胞反應，EC 50為約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約0.3 nM或更低、約0.1 nM或更低、或約0.05 nM或更低。在表現PD-L1的腫瘤細胞的存在下及/或在腫瘤微環境中，例如可在基本上描述於 實例 13中的功能性T細胞活化分中析評估藉由所提供的融合蛋白對T細胞活化。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白在無PD-L1的存在下不能共同刺激T細胞反應。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白在無表現PD-L1的細胞的存在下不能共同刺激T細胞反應。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠辨別PD-L1的存在並導致較SEQ ID NO: 25及26中所示的OX40抗體更好的對應的T細胞活化。可例如在如實例11所述的PD-1/PD-L1阻斷生物分析中、或在基本上如 實例 12、 實例 13、 實例 14、 實例 15及/或 實例 16中所述的功能T細胞活化分析中測定融合蛋白的PD-L1依存作用。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠阻斷由PD-1與PD-L1結合所媒介的抑制訊號。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠藉由阻斷PD-1/PD-L1相互作用來釋放T細胞活化的煞車或導致成功的T細胞活化。可例如在基本上如 實例 11中所述的PD-1/PD-L1阻斷生物分析測量PD-1抑制訊號的阻斷。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠刺激T細胞增殖及/或活化。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠刺激CD4 +T細胞增殖及/或活化。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠誘導IL-13及/或IFN-γ分泌，較佳劑量依存IL-13及/或IFN-γ分泌。在一些具體實施例中，與抗PD-L1抗體及OX40靶向分子，諸如抗OX40抗體或OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的組合相比，所提供的融合蛋白可能能夠誘導更高的IL-13及/或IFN-γ分泌。本文所用的IL-13及/或IFN-γ分泌可為T細胞活化的量度。可例如藉由基本上如 實例 15中所述的混合淋巴細胞反應(MLR)分析中評估由所提供的融合蛋白刺激的CD4 +T細胞增殖及/或活化。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可能能夠刺激CD3 +T細胞增殖及/或活化。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白可能能夠誘導IL-2及效應物分子，諸如顆粒酶A、顆粒酶B及/或可溶性Fas配體的製造。在一些具體實施例中，與SEQ ID NO: 78及79的構築單元PD-L1抗體及OX40靶向分子，諸如抗OX40抗體或OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白相比，所提供的融合蛋白可能能夠誘導IL-2及細胞毒性因子，諸如顆粒酶A、顆粒酶B及/或可溶性Fas配體的製造增加。可例如藉由基本上如 實例 16中所述的MLR分析中評估由所提供的融合蛋白刺激的CD3 +T細胞增殖及/或活化。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白具有有利的穩定性及藥物動力學特徵。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白具有與SEQ ID NO: 78及79的構築單元抗體相當的藥物動力學特徵。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白具有類抗體藥物動力學。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白具有約200小時或更長、約250小時或更長、約300小時或更長、約350小時或更長、約400小時或更長、或甚至更長的終端半衰期。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白具有較SEQ ID NO: 43及44中所示的基準融合蛋白更有利的藥物動力學特徵。可基本上如 實例 17及 實例 18中所述分析所提供的融合蛋白的藥物動力學特徵。在一些具體實施例中，若c max的%在336小時之後高於10%，則可認為實現有利的藥物動力學特徵或類抗體藥物動力學特徵。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠以最多約1 nM的K D值結合PD-L1。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠以最多約100 nM的K D值結合OX40。較佳藉由表面電漿共振(SPR)分析來測定K D值。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠以最多約1 nM的EC 50值結合PD-L1。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠以最多約2 nM的EC 50值結合OX40。較佳藉由酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)來測定EC 50值。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白與食蟹獼猴PD-L1具有交叉反應。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白與食蟹獼猴OX40具有交叉反應。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠以最多約10 nM的EC 50值(較佳在ELISA分析中測量)同時結合OX40及PD-L1。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠結合表現PD-L1的腫瘤細胞。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠抑制OX40與OX40配體的結合。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠與PD-1競爭結合PD-L1。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠與SEQ ID NO: 25及26中所示的抗體競爭結合OX40。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白結合OX40上與SEQ ID NO: 25及26中所示抗體的表位重疊的表位。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠刺激T細胞增殖及/或反應。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠刺激CD4+及/或CD8+ T細胞增殖。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠誘導IL-2及/或干擾素γ(IFNg或IFN-γ)分泌增加。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠誘導細胞毒性因子分泌增加。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白能夠以PD-L1依存方式共同刺激T細胞反應。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白在不存在PD-L1的情況下不會共同刺激T細胞反應。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白具有與抗體相當的藥物動力學特徵。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白具有與抗體相當的血清半衰期。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含SEQ ID NO: 82–91中任一者所示的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含與SEQ ID NO: 82–91中任一者所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、或甚至更高序列一致性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79、SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 93及90、或SEQ ID NO: 91及94中所示的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含與SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79、SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 93及90、或SEQ ID NO: 91及94中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含與SEQ ID NO: 78及87中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的胺基酸序列。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含SEQ ID NO: 78及87中所示的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含與SEQ ID NO: 88及79中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的胺基酸序列。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含SEQ ID NO: 88及79中所示的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含與SEQ ID NO: 89及79中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的胺基酸序列。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含SEQ ID NO: 89及79中所示的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含與SEQ ID NO: 82及79中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的胺基酸序列。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含SEQ ID NO: 82及79中所示的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含與SEQ ID NO: 93及90中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的胺基酸序列。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含SEQ ID NO: 93及90中所示的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含與SEQ ID NO: 91及94中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的胺基酸序列。在一些具體實施例中，所提供的融合蛋白包含SEQ ID NO: 91及94中所示的胺基酸序列。 B. 融合蛋白中包括的示例性抗體。
在一些具體實施例中，對於所提供的融合蛋白，第一次單元可為或包含抗體，諸如全長抗體，或其對PD-L1具有特異性的抗原結合結構域。在一些具體實施例中，抗體例如可為IgG1、IgG2或IgG4。在一些具體實施例中，抗體為或包含IgG4。在一些具體實施例中，抗體為抗PD-L1的單株抗體。
本文揭示的PD-L1結合抗體的說明性實例可包含抗原結合區，其交叉阻斷或結合與包含已知抗體的重鏈可變結構域(V H)及輕鏈可變結構域(V L)區的PD-L1結合抗體相同的表位，該已知抗體諸如阿特珠單抗(也稱作MPDL3280A或RG7446，商品名Tecentriq ®)、阿維魯單抗(也稱作MSB0010718C，商品名Bavencio®)、度伐魯單抗(先前稱作MEDI4736，商品名Imfinzi ®)、及BMS-936559(也稱作MDX-1105)、5C10(包括人源化5C10)、5F10(包括人源化5F10)、及9F6(包括人源化9F6)。在一些具體實施例中，本文揭示的PD-L1結合抗體可包含抗原結合區，諸如來自抗體的三個重鏈互補決定區(CDR)(HCDR1、HCDR2及HCDR3)及三個輕鏈CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)中的任一者，該抗體選自由阿特珠單抗、阿維魯單抗、度伐魯單抗、BMS-936559、5C10、5F10及9F6所組成之群。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有選自由SEQ ID NO: 65–70組成之群的重鏈可變區(HCVR)及/或選自由SEQ ID NO: 71–76組成之群的輕鏈可變區(LCVR)。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有SEQ ID NO: 66–67中任一者的重鏈及/或SEQ ID NO: 73的輕鏈。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域的重鏈及輕鏈對分別為或包含如下的HCVR及LCVR：SEQ ID NO: 65及71、SEQ ID NO: 66及72、SEQ ID NO: 67及73、SEQ ID NO: 68及74、SEQ ID NO: 69及75、或SEQ ID NO: 70及76。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體的重鏈及輕鏈對為或包含如SEQ ID NO: 77及79、SEQ ID NO: 78及79、SEQ ID NO: 80及81、或SEQ ID NO: 93及94中所示的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有與選自由SEQ ID NO: 65–70所組成之群的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的HCVR，及/或與選自由SEQ ID NO: 71–76所組成之群的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的LCVR。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有與選自由SEQ ID NO: 77–78、80及93所組成之群的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的重鏈，及/或與選自由SEQ ID NO: 79、81及94所組成之群的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的輕鏈。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有與SEQ ID NO: 77及SEQ ID NO: 79中的每一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的重鏈及輕鏈。在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有與SEQ ID NO: 78及SEQ ID NO: 79中的每一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的重鏈及輕鏈。在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有與SEQ ID NO: 80及SEQ ID NO: 81中的每一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的重鏈及輕鏈。在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域可具有與SEQ ID NO: 93及SEQ ID NO: 94中的每一者具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或甚至更高序列一致性的重鏈及輕鏈。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域的重鏈可變區可具有三個具有以下序列的CDR：GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 45)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 46)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 47)。 在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域的重鏈可變區可具有三個具有以下序列的CDR：GFDIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 50)、IDPADGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 51)、ARGLGAWFAS (HCDR3；SEQ ID NO: 52)。在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域的重鏈可變區可具有三個具有以下序列的CDR：GFNIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 55)、IDPANGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 56)、SRGPPGGIGEYIYAMDY (HCDR3；SEQ ID NO: 57)。 在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域的重鏈可變區可具有三個具有以下序列的CDR：GFTFSDSW (HCDR1，SEQ ID NO: 60)、ISPYGGST (HCDR2，SEQ ID NO: 61)、ARRHWPGGFDY (HCDR3；SEQ ID NO: 62)。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域的輕鏈可變區可具有三個具有以下序列的CDR：QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 48)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 49)。在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域的輕鏈可變區可具有三個具有以下序列的CDR：QDITNS (LCDR1，SEQ ID NO: 53)、YTS (LCDR2)、QQGHTLPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 54)。在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域的輕鏈可變區可具有三個具有以下序列的CDR：SSVSSSY (LCDR1，SEQ ID NO: 58)、STS (LCDR2)、HQYHRSPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 59)。在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域的輕鏈可變區可具有三個具有以下序列的CDR：QDVSTA (LCDR1，SEQ ID NO: 63)、SAS (LCDR2)、QQYLYHPAT (LCDR3；SEQ ID NO: 64)。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含具有三個具有以下序列的CDR的重鏈可變區：GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 45)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 46)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 47)，以及具有三個具有以下序列的CDR的輕鏈可變區：QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 48)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 49)。在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含具有三個具有以下序列的CDR的重鏈可變區：GFDIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 50)、IDPADGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 51)、ARGLGAWFAS (HCDR3；SEQ ID NO: 52)，以及具有三個具有以下序列的CDR的輕鏈可變區：QDITNS (LCDR1，SEQ ID NO: 53)、YTS (LCDR2)、QQGHTLPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 54)。在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含具有三個具有以下序列的CDR的重鏈可變區：GFNIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 55)、IDPANGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 56)、SRGPPGGIGEYIYAMDY (HCDR3；SEQ ID NO: 57)，以及具有三個具有以下序列的CDR的輕鏈可變區：SSVSSSY (LCDR1，SEQ ID NO: 58)、STS (LCDR2)、HQYHRSPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 59)。在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含具有三個具有以下序列的CDR的重鏈可變區：GFTFSDSW (HCDR1，SEQ ID NO: 60)、ISPYGGST (HCDR2，SEQ ID NO: 61)、ARRHWPGGFDY (HCDR3；SEQ ID NO: 62)，以及具有三個具有以下序列的CDR的輕鏈可變區：QDVSTA (LCDR1，SEQ ID NO: 63)、SAS (LCDR2)、QQYLYHPAT (LCDR3；SEQ ID NO: 64)。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含具有三個具有以下序列的CDR的重鏈可變區：GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 45)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 46)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 47)，以及具有三個具有以下序列的CDR的輕鏈可變區：QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 48)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 49)。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 65及71中所示的序列具有至少70%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 65及71中所示的序列具有至少75%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 65及71中所示的序列具有至少80%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 65及71中所示的序列具有至少85%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 65及71中所示的序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 65及71中所示的序列具有至少92%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 65及71中所示的序列具有至少95%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 65及71中所示的序列具有至少97%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 65及71中所示的序列具有至少98%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 65及71中所示的序列具有至少99%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 65及71中所示的序列。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含具有三個具有以下序列的CDR的重鏈可變區：GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 45)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 46)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 47)，以及具有三個具有以下序列的CDR的輕鏈可變區：QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 48)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 49)。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 66及72中所示的序列具有至少70%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 66及72中所示的序列具有至少75%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 66及72中所示的序列具有至少80%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 66及72中所示的序列具有至少85%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 66及72中所示的序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 66及72中所示的序列具有至少92%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 66及72中所示的序列具有至少95%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 66及72中所示的序列具有至少97%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 66及72中所示的序列具有至少98%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 66及72中所示的序列具有至少99%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 66及72中所示的序列。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含具有三個具有以下序列的CDR的重鏈可變區：GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 45)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 46)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 47)，以及具有三個具有以下序列的CDR的輕鏈可變區：QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 48)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 49)。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 67及73中所示的序列具有至少70%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 67及73中所示的序列具有至少75%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 67及73中所示的序列具有至少80%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 67及73中所示的序列具有至少85%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 67及73中所示的序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 67及73中所示的序列具有至少92%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 67及73中所示的序列具有至少95%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 67及73中所示的序列具有至少97%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 67及73中所示的序列具有至少98%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 67及73中所示的序列具有至少99%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 67及73中所示的序列。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含具有三個具有以下序列的CDR的重鏈可變區：GFDIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 50)、IDPADGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 51)、ARGLGAWFAS (HCDR3；SEQ ID NO: 52)，以及具有三個具有以下序列的CDR的輕鏈可變區：QDITNS (LCDR1，SEQ ID NO: 53)、YTS (LCDR2)、QQGHTLPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 54)。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 68及74中所示的序列具有至少70%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 68及74中所示的序列具有至少75%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 68及74中所示的序列具有至少80%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 68及74中所示的序列具有至少85%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 68及74中所示的序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 68及74中所示的序列具有至少92%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 68及74中所示的序列具有至少95%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 68及74中所示的序列具有至少97%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 68及74中所示的序列具有至少98%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 68及74中所示的序列具有至少99%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 68及74中所示的序列。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含具有三個具有以下序列的CDR的重鏈可變區：GFNIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 55)、IDPANGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 56)、SRGPPGGIGEYIYAMDY (HCDR3；SEQ ID NO: 57)，以及具有三個具有以下序列的CDR的輕鏈可變區：SSVSSSY (LCDR1，SEQ ID NO: 58)、STS (LCDR2)、HQYHRSPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 59)。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 69及75中所示的序列具有至少70%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 69及75中所示的序列具有至少75%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 69及75中所示的序列具有至少80%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 69及75中所示的序列具有至少85%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 69及75中所示的序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 69及75中所示的序列具有至少92%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 69及75中所示的序列具有至少95%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 69及75中所示的序列具有至少97%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 69及75中所示的序列具有至少98%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 69及75中所示的序列具有至少99%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 69及75中所示的序列。
在一些具體實施例中，所提供的PD-L1抗體或其抗原結合結構域包含具有三個具有以下序列的CDR的重鏈可變區：GFTFSDSW (HCDR1，SEQ ID NO: 60)、ISPYGGST (HCDR2，SEQ ID NO: 61)、ARRHWPGGFDY (HCDR3；SEQ ID NO: 62)，以及具有三個具有以下序列的CDR的輕鏈可變區：QDVSTA (LCDR1，SEQ ID NO: 63)、SAS (LCDR2)、QQYLYHPAT (LCDR3；SEQ ID NO: 64)。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少70%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少75%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少80%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少85%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少92%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少95%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少97%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少98%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含與SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少99%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。在一些具體實施例中，該所提供的抗體包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 70及76中所示的序列。
除非另有說明，否則本文揭示的所有CDR序列為根據Lefranc, M.-P.，The Immunologist，7，132–136 (1999)中所述的IMGT方法進行定義。CDR1由位置27到38所組成，CDR2由位置56到65所組成，生殖系V基因的CDR3由位置105到116所組成，重排的V-J基因或V-D-J基因的CDR3由位置105到117(J-PHE或J-TRP118之前的位置)所組成，其中對於具有少於13個胺基酸的重排的CDR3-IMGT，在環頂部具有缺口，或對於具有多於13個胺基酸的重排的CDR3-IMGT，具有額外的位置112.1、111.1、112.2、111.2等等。在本段落中給出的位置為根據Lefranc, M.-P.，The Immunologist，7，132–136 (1999)中所述進行IMGT編號。
如在本文揭示的融合蛋白中所包括的特異性結合PD-L1的抗體可包含Fc部分，其使得能延長本文揭示的雙特異性結合分子的體內半衰期。在一些具體實施例中，這樣的Fc部分較佳來自人源，更佳IgG1或IgG4抗體的人類Fc部分、甚至更佳IgG1或IgG4的經工程改造人類Fc部分(其具有活化或靜默效應物功能)。在一些具體實施例中，靜默效應物功能可能優先於活化效應物功能。在一些具體實施例中，這樣的Fc部分經工程改造以靜默效應物功能，其在位置234及/或235處具有突變，根據Kabat的EU索引進行編號 (Johnson及Wu， Nucleic Acids Res，2000)。在一些具體實施例中，可引入所提供的抗PD-L1抗體的位置F234及L235中的突變以靜默效應物功能。在其他具體實施例中，可引入所提供的抗PD-L1抗體的位置D265及P329的突變以靜默效應物功能。根據Kabat的EU索引對這兩個集合的潛在突變進行編號(Shields等人， J Biol Chem，2001)。
用於製造抗體及其片段的各種技術為本領域眾所周知，且例如描述在Altshuler等人(2010)中。因此，例如，可在以抗原與添加劑和佐劑的混合物免疫之後從動物的血液中獲得多株抗體，且可藉由提供由連續細胞株培養物製造的抗體的任何技術來製造單株抗體。這些技術的實例例如描述在Harlow及Lane(1999)、(1988)中，且包括Köhler與Milstein在1975年最初描述的融合瘤技術、三源融合瘤(trioma)技術、人類B細胞融合瘤技術(請例如參見：Li等人， Proc Natl Acad Sci U S A，2006；Kozbor及Roder， Immunol Today，1983)、以及用於製造人類單株抗體的EBV融合瘤技術(Cole等人， Cancer Res，1984)。另外，重組抗體可從單株抗體獲得，或可使用各種展示方法，諸如噬菌體、核糖體、mRNA、或細胞展示從頭製備。在一些具體實施例中，用於表現重組(人源化)抗體或其片段的合適系統例如可選自細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物細胞株、或基因轉殖動物或植物(請例如參見：美國專利號6,080,560；Holliger及Hudson， Nat Biotechnol，2005)。另外，描述用於製造單鏈抗體的技術(請尤其參見美國專利號4,946,778)可適用於製造對本發明的標靶具有特異性的單鏈抗體。BIAcore系統中所用的表面電漿共振可用於提高噬菌體抗體的效率。 C. 本文揭示的示例性脂質運載蛋白突變蛋白。
脂質運載蛋白為天然進化為結合配體的蛋白結合分子。脂質運載蛋白存在於許多生物體中，包括脊椎動物、昆蟲、植物及細菌。脂質運載蛋白家族的成員(Pervaiz及Brew， FASEB J，1987)通常為小型分泌蛋白，並具有單一多肽鏈。其特點在於一系列不同的分子識別性質：其與各種主要為疏水性的小分子(諸如類視色素、脂肪酸、膽固醇、前列腺素、膽綠素、費洛蒙、激味分子及氣味劑)結合、及其與特異性細胞表面受體結合、及其形成巨分子複合物。儘管其在過去主要被歸類為運輸蛋白，但如今清楚知道脂質運載蛋白實現多種生理功能。這些包括在視網醇運輸、嗅覺、費洛蒙訊號傳遞及前列腺素合成中的作用。脂質運載蛋白也參與免疫反應的調控及細胞穩態的媒介(請例如回顧：Flower等人， Biochim Biophys Acta，2000；Flower， Biochem J，1996)。
脂質運載蛋白具有異常低程度的整體序列保守性，通常具有小於20%的序列一致性。強烈相比之下，其整體折疊模式為高度保守的。脂質運載蛋白結構的中心部分由單個八股反平行的β褶板所組成，其自身閉合形成連續氫鍵結的β桶狀結構。此β桶狀結構形成中央空腔。桶狀結構的一端被穿過其底部的N末端肽區段以及連接β股的三個肽環空間所阻斷。β桶狀結構的另一端對溶劑開放並涵蓋標靶結合位點，該位點由四個柔性肽環(AB、CD、EF及GH)所形成。正是剛性脂質運載蛋白支架中環的多樣性，產生多種不同的結合模式，每種結合模式能夠適應不同大小、形狀和化學特性的標靶(請例如回顧：Skerra， Biochim Biophys Acta，2000；Flower等人， Biochim Biophys Acta，2000；Flower， Biochem J，1996)。
根據本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白可為任何脂質運載蛋白的突變蛋白。可使用突變蛋白的合適脂質運載蛋白(有時也稱作「參考脂質運載蛋白」、「野生型脂質運載蛋白」、「參考蛋白支架」、或簡稱作「支架」)的實例包括但不限於淚液脂質運載蛋白(脂質運載蛋白-1、Tlc或von Ebner腺蛋白)、視網醇結合蛋白、嗜中性白血球脂質運載蛋白型前列腺素D合成酶、β-乳球蛋白、膽色素結合蛋白(BBP)、脂蛋白元D(APOD)、嗜中性白血球明膠酶相關性脂質運載蛋白(NGAL)、α2-微球蛋白相關性蛋白(A2m)、24p3/子宮運載蛋白(24p3)、von Ebner腺蛋白1(VEGP 1)、von Ebner腺蛋白2(VEGP 2)、以及主要過敏原Can f 1(ALL-1)。在具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白來自脂質運載蛋白組，脂質運載蛋白組由人類淚液脂質運載蛋白(hTlc)、人類嗜中性白血球明膠酶相關性脂質運載蛋白(hNGAL)、人類脂蛋白元D(hAPOD)、以及大菜粉蝶(Pieris brassicae)的膽色素結合蛋白所組成。
當與另一脂質運載蛋白的序列一致性相比時，根據本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列可能與其來源的參考(或野生型)脂質運載蛋白(例如hNGAL)具有高序列一致性(也請參見上文)。在這種一般情況下，根據本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列至少基本上類似於對應參考(野生型)脂質運載蛋白的胺基酸序列，條件是在比對中可能存在由於胺基酸添加或缺失而產生的缺口(如本文所定義)。在一些具體實施例中，與對應參考(野生型)脂質運載蛋白的序列基本上類似的本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白的對應序列，與對應脂質運載蛋白的序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少82%、至少85%、至少87%、或至少90%的一致性，包括至少95%的一致性。在這方面，與野生型脂質運載蛋白相比，本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白當然可能包含本文所述的取代，其使得脂質運載蛋白突變蛋白能夠結合OX40。
一般而言，相對於野生型或參考脂質運載蛋白的胺基酸序列，例如hNGAL，本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白在開放端的四個環中含有一或多個突變的胺基酸殘基，該四個環包含配體結合口袋並定義配體結合口袋的入口(請參見上文)。如上所述，這些區域在測定脂質運載蛋白突變蛋白對所需標靶的結合特異性中是必要的。在一些具體實施例中，本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白也可在四個環之外的區域中含有突變的胺基酸殘基。本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白可在連接脂質運載蛋白的封閉端的β股的三個肽環(指定為BC、DE及FG)中的一或多者中含有一或多個突變的胺基酸殘基。在一些具體實施例中，來自淚液脂質運載蛋白、NGAL或其同源物的突變蛋白可在N-末端區及/或排列在β桶狀結構末端的三個肽環BC、DE及FG中的任何序列位置處具有1、2、3、4或更多個突變胺基酸殘基，該β桶狀結構位於天然脂質運載蛋白結合口袋的對面。
設想任何類型及數量的突變，包括取代、缺失及插入，只要脂質運載蛋白突變蛋白保留其結合OX40的能力，及/或其與參考(野生型)脂質運載蛋白(例如成熟hNGAL)的胺基酸序列具有至少60%，諸如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、或更高一致性的序列一致性即可。
在一些具體實施例中，取代為保守取代。在一些具體實施例中，取代為非保守取代或來自以下示例性取代的一或多者。
保守取代一般為根據待突變的胺基酸所列出的以下取代，每個取代後跟隨一或多個可認為是保守的取代：Ala → Ser、Thr、或Val；Arg → Lys、Gln、Asn、或His；Asn → Gln、Glu、Asp、或His；Asp → Glu、Gln、Asn、或His；Gln → Asn、Asp、Glu、或His；Glu → Asp、Asn、Gln、或His；His → Arg、Lys、Asn、Gln、Asp、或Glu；Ile → Thr、Leu、Met、Phe、Val、Trp、Tyr、Ala、或Pro；Leu → Thr、Ile,Val、Met、Ala、Phe、Pro、Tyr、或Trp；Lys → Arg、His、Gln、或Asn；Met → Thr、Leu、Tyr、Ile、Phe、Val、Ala、Pro、或Trp；Phe → Thr、Met、Leu、Tyr、Ile、Pro、Trp、Val、或Ala；Ser → Thr、Ala、或Val；Thr → Ser、Ala、Val、Ile、Met、Val、Phe、Pro、或Leu；Trp → Tyr、Phe、Met、Ile、或Leu；Tyr → Trp、Phe、Ile、Leu、或Met；Val → Thr、Ile、Leu、Met、Phe、Ala、Ser、或Pro。其他取代也是可被允許的，且可根據經驗或根據其他已知的保守或非保守取代來決定。作為進一步的方向，以下組各自含有通常可用於定義彼此保守取代的胺基酸： a.     丙胺酸(Ala)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、纈胺酸(Val)； b.     天門冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、麩醯胺酸(Gln)、天門冬醯胺(Asn)、組胺酸(His)； c.     精胺酸(Arg)、離胺酸(Lys)、麩醯胺酸(Gln)、天門冬醯胺(Asn)、組胺酸(His)； d.     異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、纈胺酸(Val)、丙胺酸(Ala)、苯丙胺酸(Phe)、蘇胺酸(Thr)、脯胺酸(Pro)； e.     異白胺酸(Ile)、白胺酸(Leu)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、酪胺酸(Tyr)、色胺酸(Trp)。
若這種保守取代導致生物活性發生變化，則可引入更實質的變化，諸如以下所述的，或如下面關於胺基酸類別進一步描述的，且篩選具有所需特徵的產物。這種更實質的變化的實例為：Ala →Leu或Phe；Arg → Glu；Asn → Ile、Val、或Trp；Asp → Met；Cys → Pro；Gln → Phe；Glu → Arg；His → Gly；Ile → Lys、Glu、或Gln；Leu → Lys或Ser；Lys → Tyr；Met → Glu；Phe → Glu、Gln、或Asp；Trp → Cys；Tyr → Glu或Asp；Val → Lys、Arg、His。
在一些具體實施例中，藉由選擇取代來實現脂質運載蛋白(突變蛋白)的物理及生物性質的實質修飾，該等取代在其對維持(a)取代區域中多肽骨架的結構，例如，作為褶板或螺旋構形，(b)標靶位點分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積的作用方面顯著不同。
天然存在的殘基根據共同的側鏈性質被分成以下組：(1)疏水性：甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸；(2)中性親水性：半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸；(3)酸性：天門冬胺酸、麩胺酸；(4)鹼性：組胺酸、離胺酸、精胺酸；(5)影響鏈取向的殘基：甘胺酸、脯胺酸；(6)芳香族：色胺酸、酪胺酸、苯丙胺酸。在一些具體實施例中，取代可能需要使這些類別之一的成員與另一類別的成員交換。
任何不參與維持對應脂質運載蛋白的正確構形的半胱胺酸殘基也可被取代(通常以絲胺酸取代)，以改善分子的氧化穩定性並防止異常交聯。相反地，可使半胱胺酸鍵加入脂質運載蛋白以改善其穩定性。 D. 本文揭示的示例性 OX40 特異性脂質運載蛋白突變蛋白。
如上所述，脂質運載蛋白是由其超二級結構所定義的多肽，即包含八個β股的圓柱形β褶板超二級結構區，該β股藉由在一端的四個環成對連接從而定義結合口袋。本文揭示不限於本文特定揭示的脂質運載蛋白突變蛋白。在這方面，本文揭示涉及具有圓柱形β褶板超二級結構區的脂質運載蛋白突變蛋白，該結構區包含八個β股，該β股藉由在一端的四個環成對連接從而定義結合口袋，其中該四個環中至少三個其每一者的至少一個胺基酸的已突變，且其中該脂質運載蛋白以可檢測的親和力有效結合OX40。
在一些其他具體實施例中，本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白為成熟人類嗜中性白血球明膠酶相關性脂質運載蛋白(hNGAL)的突變蛋白。成熟hNGAL的突變蛋白在本文中可稱作「hNGAL突變蛋白」。
在一方面，本文揭示包括源自參考(野生型)脂質運載蛋白，較佳源自成熟hNGAL的任何數量的脂質運載蛋白突變蛋白，其以可檢測的親和力結合OX40。在一相關方面，本文揭示包括能夠藉由結合OX40來活化OX40下游訊號傳遞路徑的各種脂質運載蛋白突變蛋白。就此意義而言，OX40可被認為是參考(野生型)脂質運載蛋白，較佳hNGAL的非天然標靶，其中「非天然標靶」涉及在生理條件下不結合參考(野生型)脂質運載蛋白的物質。藉由在某些序列位置處具有一或多個突變的參考(野生型)脂質運載蛋白進行工程改造，本案發明人已證明對非天然標靶OX40的高親和力及高特異性是可能的。
在一些具體實施例中，與對應參考(野生型)脂質運載蛋白相比，本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白可在其N末端缺少1、2、3、4或更多個胺基酸及/或在其C末端缺少1、2、3、4或更多個胺基酸。另外，本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白可在突變胺基酸序列位置之外包括參考(野生型)脂質運載蛋白，較佳hNGAL的野生型(天然)胺基酸序列。
在一些具體實施例中，併入本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白中的一或多個突變胺基酸殘基至少基本上不妨礙或不干擾與指定標靶的結合活性及突變蛋白的折疊。這些突變，包括取代、刪除及插入，可使用已建立的標準方法在DNA程度上完成(Sambrook及Russell，2001，Molecular cloning：a laboratory manual)。在一些具體實施例中，(a)藉由以核苷酸三聯體的子集取代編碼參考脂質運載蛋白的對應序列位置的核苷酸三聯體，利用隨機誘變引入對應於參考(野生型)脂質運載蛋白，較佳hNGAL的線性多肽序列的一或多個序列位置處的突變胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，以可檢測的親和力結合OX40的脂質運載蛋白突變蛋白可包括天然半胱胺酸殘基被另一胺基酸，例如絲胺酸殘基所取代的至少一個胺基酸取代。在一些具體實施例中，以可檢測的親和力結合OX40的脂質運載蛋白突變蛋白可包括一或多個非天然半胱胺酸殘基，其取代參考(野生型)脂質運載蛋白，較佳hNGAL的一或多個胺基酸。在一些具體實施例中，根據本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白包括天然胺基酸被半胱胺酸殘基所取代的至少兩個胺基酸取代，由此形成一或多個半胱胺酸橋。在一些具體實施例中，該半胱胺酸橋可連接到至少兩個環區域。這些區域的定義在本文中根據以下使用：Skerra， Biochim Biophys Acta(2000)；Flower (1996)；及Breustedt等人(2005)。
一般而言，本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白可與成熟hNGAL(SEQ ID NO: 1)的胺基酸序列具有至少約70%，包括至少約80%，諸如至少約85%的胺基酸序列一致性。
在一些方面，本文揭示提供結合OX40的hNGAL突變蛋白。在這方面，本文揭示提供一或多個hNGAL突變蛋白，其能夠以可檢測的親和力，較佳以藉由K D測量為約10 -5M或更低的親和力結合OX40。較佳的hNGAL突變蛋白能夠以藉由K D測量的親和力結合OX40，該K D為約400 nM或更低、約135 nM或更低、約50 nM或更低、約30 nM或更低、約20 nM或更低、約10 nM或更低、約5 nM或更低、約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約0.3 nM或更低、約0.2 nM或更低、約0.1 nM或更低、或約0.05 nM或甚至更低。可例如在SPR分析中測量K D值。
在一些具體實施例中，結合OX40的hNGAL突變蛋白可與食蟹獼猴OX40(cyOX40)具有交叉反應，且在一些具體實施例中，能夠以藉由K D測量的親和力結合cyOX40，該K D為約290 nM或更低、約115 nM或更低、約55 nM或更低、約10 nM或更低、約5 nM或更低、約4 nM或更低、約2 nM或更低、約1 nM或更低、約0.5 nM或更低、約0.4 nM或更低、約0.3 nM或更低、約0.2 nM甚至更低。
在一些具體實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白可干擾或競爭OX40L與OX40的結合。在一些其他實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白在OX40L及/或結合OX40/OX40L複合物的存在下可能能夠結合OX40。
在一些具體實施例中，根據本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白可包含天然半胱胺酸殘基被例如絲胺酸殘基所取代的至少一個胺基酸所取代。在一些具體實施例中，根據本文揭示的hNGAL突變蛋白可包含在對應於成熟hNGAL(SEQ ID NO: 1)的線性多肽序列的位置76及/或175的位置處的天然半胱胺酸殘基被另一胺基酸，例如絲胺酸殘基所取代的胺基酸所取代。在此情況下，值得注意的是，已發現除去由半胱胺酸殘基76及175形成的野生型hNGAL的結構雙硫鍵(在對應初始核酸基因庫的程度上)(請參見Breustedt等人， J Biol Chem，2005)可提供不僅穩定折疊且能夠以高親和力結合給定非天然標靶的hNGAL突變蛋白。在一些具體實施例中，結構雙硫鍵的消除可提供能夠產生或刻意引入非天然雙硫鍵到本文揭示的突變蛋白中的進一步優點，從而增加突變蛋白的穩定性。然而，結合OX40並具有在Cys 76及Cys 175之間形成的雙硫鍵的hNGAL突變蛋白也為本文揭示的一部分。
在一些具體實施例中，所提供的結合OX40的hNGAL突變蛋白可在對應於成熟hNGAL(SEQ ID NO: 1)的線性多肽序列的位置25、28、36、40、41、44、49、50、52、59、62、63、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、82、83、87、93、96、100、103、106、114、118、125、127、129、132、134、143、及164的一或多個位置處包含一或多個以下突變胺基酸殘基：Asn 25 → Ser；Gln 28 → His；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Trp或Arg；Glu 44 → Gly；Gln 49 → Gly；Lys 50 → Glu或Thr；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Lys 62 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Arg或Pro；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Lys 75 → Glu；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Ile 80 → Thr；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Phe 83 → Leu；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp；Asn 114 → Asp；His 118 → Tyr；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Asn 129 → Asp；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；Glu 143 → Ala；以及Asn 164 → Asp。在一些具體實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白在成熟hNGAL(SEQ ID NO: 1)的這些序列位置處包含2個或更多個、例如3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個、15個或更多個、16個或更多個、17個或更多個、18個或更多個、19個或更多個、20個或更多個、21個或更多個、22個或更多個、23個或更多個、24個或更多個、25個或更多個、26個或更多個、27個或更多個、28個或更多個、29個或更多個、30個或更多個、或31個或更多個前述突變的胺基酸殘基。在一較佳的具體實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白包含10個或更多個前述突變的胺基酸殘基。在一較佳的具體實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白包含15個或更多個前述突變的胺基酸殘基。在一較佳的具體實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白包含20個或更多個前述突變的胺基酸殘基。在一較佳的具體實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白包含25個或更多個前述突變的胺基酸殘基。在一較佳的具體實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白包含29個或更多個前述突變的胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，所提供的結合OX40的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL(SEQ ID NO: 1)的線性多肽序列相比，可包含以下突變胺基酸殘基集合之一： (a)      Gln 28 → His；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Trp；Glu 44 → Gly；Gln 49 → Gly；Lys 50 → Thr；Tyr 52 → Gln；Tyr 62 → Arg；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Lys 75 → Glu；Asp 77 → His；Trp 79 → Asp；Ile 80 → Thr；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Phe 83 → Leu；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp；Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Tyr； (b)     Gln 28 → His；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Trp；Gln 49 → Gly；Lys 50 → Glu；Tyr 52 → Gln；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Arg；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Lys 75 → Glu；Asp 77 → His；Trp 79 → Asp；Ile 80 → Thr；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp；Asn 114 → Asp；His 118 → Tyr；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Asn 129 → Asp；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Tyr； (c)      Asn 25 → Ser；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Gly；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Pro；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp；Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；Glu 143 → Ala；以及Gln 164 → Asp； (d)     Asn 25 → Ser；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Gly；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp； Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；Glu 143 → Ala；以及Gln 164 → Asp； (e)      Asn 25 → Ser；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Gly；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp； Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；以及Gln 164 → Asp； (f)      Asn 25 → Ser；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Gly；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Ile 80 → Thr；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp； Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；以及Gln 164 → Asp；或 (g)      Asn 25 → Ser；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Gly；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Pro；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Ile 80 → Thr；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp； Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；以及Gln 164 → Asp。
在一些具體實施例中，與成熟hNGAL(SEQ ID NO: 1)的線性多肽序列相比，結合OX40的hNGAL突變蛋白包括上述突變胺基酸殘基組之一的除了三個、除了兩個或除了一個以外的所有突變胺基酸殘基。
在一些具體實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白與成熟hNGAL(SEQ ID NO: 1)的序列具有至少70%的序列一致性或至少70%的序列同源性。
在一些具體實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白包含如SEQ ID NO: 33–36及95–97的任一者中所示的胺基酸序列或其片段或變異。
在一些具體實施例中，本文揭示的hNGAL突變蛋白與選自由SEQ ID NO: 33–36及95–97所組成之群的胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或更高的序列一致性。
本文揭示也包括hNGAL突變蛋白的結構同源物，該hNGAL突變蛋白具有選自由SEQ ID NO: 33–36及95–97所組成之群的胺基酸序列，該等結構同源物具有相對於該hNGAL突變蛋白大於約60%，較佳大於65%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%、大於92%，且最佳大於95%的胺基酸序列同源性或序列一致性。
在一些具體實施例中，本文揭示提供以藉由K D測量為約5 nM或更低的親和力結合OX40的脂質運載蛋白突變蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白與SEQ ID NO: 33的胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或更高的序列一致性。在一些具體實施例中，本文揭示提供以藉由K D測量為約5 nM或更低的親和力結合OX40的脂質運載蛋白突變蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白與SEQ ID NO: 34的胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或更高的序列一致性。在一些具體實施例中，本文揭示提供以藉由K D測量為約5 nM或更低的親和力結合OX40的脂質運載蛋白突變蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白與SEQ ID NO: 35的胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或更高的序列一致性。在一些具體實施例中，本文揭示提供以藉由K D測量為約5 nM或更低的親和力結合OX40的脂質運載蛋白突變蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白與SEQ ID NO: 36的胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或更高的序列一致性。在一些具體實施例中，本文揭示提供以藉由K D測量為約5 nM或更低的親和力結合OX40的脂質運載蛋白突變蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白與SEQ ID NO: 95的胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或更高的序列一致性。在一些具體實施例中，本文揭示提供以藉由K D測量為約5 nM或更低的親和力結合OX40的脂質運載蛋白突變蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白與SEQ ID NO: 96的胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或更高的序列一致性。在一些具體實施例中，本文揭示提供以藉由K D測量為約5 nM或更低的親和力結合OX40的脂質運載蛋白突變蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白與SEQ ID NO: 97的胺基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或更高的序列一致性。
在一些具體實施例中，本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白可在其N-或C-末端，較佳C-末端處包含異源胺基酸序列，例如Strep II標籤(SEQ ID NO: 9)或某些限制酶切割位點序列，而不影響脂質運載蛋白突變蛋白的生物活性(與其標靶，例如OX40的結合)。
在一些具體實施例中，可引入脂質運載蛋白突變蛋白的進一步修飾，以調控突變蛋白的某些特徵，諸如提高折疊穩定性、血清穩定性、蛋白抗性或水溶性或降低聚集趨勢、或向突變蛋白引入新的特徵。在一些具體實施例中，修飾可導致所提供的突變蛋白的兩個或更多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個)特徵被調控。
例如，可使脂質運載蛋白突變蛋白的一或多個胺基酸序列位置突變以引入新的反應性基團，例如用於與其他化合物，諸如聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、生物素、肽或蛋白共軛，或用於形成非天然存在的雙硫鍵。經共軛的化合物，例如PEG及HES，可在某些情況下增加對應脂質運載蛋白突變蛋白的血清半衰期。
在一些具體實施例中，脂質運載蛋白突變蛋白的反應性基團可天然存在於其胺基酸序列中，諸如天然存在於該胺基酸序列中的半胱胺酸殘基。在一些其他具體實施例中，可經由誘變引入這樣的反應性基團。在經由誘變引入反應性基團的情況下，一種可能性為藉由半胱胺酸殘基在合適位置使胺基酸突變。使半胱胺酸殘基引入hNGAL突變蛋白的胺基酸序列的這種突變的示例性可能性包括在對應於成熟hNGAL(SEQ ID NO: 1)的野生型序列的序列位置14、21、60、84、88、116、141、145、143、146或158的一或多個序列位置處引入半胱胺酸殘基。所產生的硫醇部分可用於使突變蛋白聚乙二醇化或羥乙基化，例如，以增加對應脂質運載蛋白突變蛋白的血清半衰期。
在一些具體實施例中，為了提供合適的胺基酸側鏈作為上述化合物之一共軛到脂質運載蛋白突變蛋白的新的反應性基團，可使人工胺基酸引入脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列。一般而言，會使這些人工胺基酸設計成更具反應性，從而促進與所需化合物的共軛。可藉由誘變引入這些人工胺基酸，例如使用人工tRNA，諸如對乙醯基苯丙胺酸。 E. 對 OX40 及 PD-L1 具有特異性的融合蛋白的示例性用途及應用。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可藉由OX40及PD-L1的雙靶向製造增效作用。在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可藉由OX40共同刺激及PD-1/PD-L1路徑阻斷製造增效作用。在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可藉由OX40及PD-L1的雙靶向製造局部抗腫瘤作用。因此，本文揭示的融合蛋白在醫學中存在許多可能的應用。
在一些具體實施例中，本文揭示涵蓋本文揭示的一或多個融合蛋白或包含此類融合蛋白的一或多個組合物用於同時結合OX40及PD-L1的用途。
本文揭示也涉及一或多個如所述的融合蛋白用於與OX40及/或PD-L1形成複合物的用途。
因此，在本文揭示的一方面，所提供的融合蛋白可用於OX40及PD-L1的檢測。這樣的用途可包括以下步驟：在合適的條件下使一或多個該融合蛋白與懷疑含有OX40及/或PD-L1的樣品接觸，從而能使得在融合蛋白與OX40及/或PD-L1之間形成複合物，並藉由合適的訊號檢測複合物。如上所述，可檢測訊號可由標記引起，或由結合發生的物理性質變化，即複合物形成本身引起。一個實例為表面電漿共振，其數值在結合配偶體的結合期間改變，其中一個結合配偶體被固定在諸如金箔的表面上。
本文揭示的融合蛋白也可用於分離OX40及/或PD-L1。這樣的用途可包括以下步驟：在合適的條件下使一或多個該融合蛋白與假定含有OX40及/或PD-L1的樣品接觸，從而能使得在融合蛋白與OX40及/或PD之間形成複合物-L1，並從樣品中分離複合物。
在一些方面，本文揭示提供包含根據本文揭示的一或多個融合蛋白的診斷及/或分析試劑盒。
除了其在診斷學中的用途之外，在又一方面，本文揭示考慮包含一或多個本文揭示的融合蛋白及醫藥上可接受的賦形劑的醫藥組合物。
另外，在一些具體實施例中，本文揭示提供同時結合OX40及/或PD-L1的融合蛋白，其用作抗腫瘤劑及/或抗感染劑、以及免疫調控劑。在一些具體實施例中，設想本文揭示的融合蛋白用於治療人類疾病的方法中，該等疾病諸如為多種癌症，包括PD-L1陽性癌症。PD-L1陽性癌症為其中表現PD-L1的癌症。可藉由本領域熟知的方法，諸如免疫組織化學或流式細胞術來測量PD-L1的表現。因此，也提供在有需要的個體中治療人類疾病，諸如包括PD-L1陽性癌症的多種癌症的方法，其包含向該個體施用治療有效量的一或多個本文揭示的融合蛋白。如本文所用的「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」等詞涵蓋疾病狀態的任何治療，並包括預防疾病狀態或病況在個體中發生、抑制疾病狀態或病況，即阻止其發展；以及/或緩解疾病狀態或病況，即使其消退及/或改善疾病狀態或病況或其任何症狀。
可使用本文揭示的融合蛋白治療的癌症的實例包括PD-L1陽性的各種類型的癌症，諸如PD-L1陽性癌。PD-L1陽性癌症例如可包含乳癌(例如乳腺癌)。「癌症」及「腫瘤」等詞在本文中可互換使用。在一個具體實施例中，腫瘤為固態腫瘤。
在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可同時靶向表現PD-L1的腫瘤細胞並活化與這些腫瘤細胞相鄰的宿主免疫系統的淋巴細胞。在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可增加靶向抗腫瘤T細胞活性、增強抗腫瘤免疫、及/或對腫瘤生長具有直接抑制作用，從而製造增效抗腫瘤結果。在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可活化腫瘤微環境中的免疫反應。在一些具體實施例中，本文揭示的融合蛋白可減少效應淋巴細胞對健康細胞的副作用，即脫靶毒性，例如經由局部抑制癌基因活性及誘導淋巴細胞活化。
在一些具體實施例中，本文揭示涵蓋本文揭示的融合蛋白或包含所提供的融合蛋白的組合物用於在PD-L1陽性腫瘤細胞附近誘導局部淋巴細胞反應的用途。因此，在一些具體實施例中，本文揭示提供在PD-L1陽性腫瘤細胞附近誘導局部淋巴細胞反應的方法，其包含應用本文揭示的一或多個融合蛋白或包含此類融合蛋白的一或多個組合物。「局部的」意指在同時經由OX40結合T細胞並與接合PD-L1陽性腫瘤細胞後，T細胞會在PD-L1陽性細胞附近製造細胞介素，具體而言為IL-2及/或干擾素γ。這些細胞介素反映T細胞的活化，接著T細胞可能直接或間接藉由吸引其他殺手細胞(諸如T細胞或NK細胞)來殺死PD-L1陽性細胞。
在一些具體實施例中，本文揭示涵蓋本文揭示的融合蛋白或包含此類融合蛋白的組合物用於共同刺激T細胞及/或活化OX40的下游訊號傳遞路徑的用途。較佳地，當接合表現PD-L1的腫瘤細胞時，所提供的融合蛋白會共同刺激T細胞及/或活化OX40的下游訊號傳遞路徑。因此，本文揭示提供較佳在接合表現PD-L1的腫瘤細胞時誘導T淋巴細胞增殖及/或活化OX40的下游訊號傳遞路徑的方法，該方法包含應用本文揭示的一或多個融合蛋白及/或包含此類融合蛋白的一或多個組合物。
在一些具體實施例中，本文揭示涵蓋本文揭示的融合蛋白或包含此類融合蛋白的組合物用於誘導T細胞上的OX40聚集及活化，並使此類T細胞導向到表現PD-L1的腫瘤細胞的用途。
本文揭示也涵蓋本文揭示的融合蛋白或包含此類融合蛋白的組合物用於同時活化OX40的下游訊號傳遞路徑及接合PD-L1陽性腫瘤細胞的用途。
本文揭示也涵蓋同時活化OX40的下游訊號傳遞路徑並接合PD-L1陽性腫瘤細胞的方法，該方法包含使本文揭示的一或多個融合蛋白或包含此類融合蛋白的一或多個組合物應用在包含腫瘤的組織。
本文揭示也涵蓋同時共同刺激T細胞並接合PD-L1陽性腫瘤細胞的方法，該方法包含使本文揭示的一或多個融合蛋白或包含此類融合蛋白的一或多個組合物應用在包含腫瘤的組織。
本文揭示也涵蓋同時誘導淋巴細胞活性及接合PD-L1陽性腫瘤細胞的方法，該方法包含使本文揭示的一或多個融合蛋白或包含此類融合蛋白的一或多個組合物應用在包含腫瘤的組織。
本文揭示也涵蓋誘導T細胞上的OX40聚集及活化並使該等T細胞導向到PD-L1陽性腫瘤細胞的方法，該方法包含使本文揭示的一或多個融合蛋白或包含此類融合蛋白的一或多個組合物應用在包含腫瘤的組織。
本文揭示也涵蓋在PD-L1陽性腫瘤細胞附近誘導局部淋巴細胞反應的方法，該方法包含使本文揭示的一或多個融合蛋白或包含此類融合蛋白的一或多個組合物應用在包含腫瘤的組織。
本文揭示也涵蓋誘導PD-L1陽性腫瘤細胞附近的T細胞增加分泌IL-2、IL-13、TGF-γ、及/或一或多個細胞毒性因子的方法，該方法包含使本文揭示的一或多個融合蛋白或包含此類融合蛋白的一或多個組合物應用在包含腫瘤的組織。一或多個細胞毒性因子可選自由顆粒酶A、顆粒酶B及可溶性Fas配體所組成之群。
本文揭示也涵蓋誘導PD-L1陽性腫瘤細胞附近的T細胞增加分泌一或多個細胞毒性因子的方法，該方法包含使本文揭示的一或多個融合蛋白或包含此類融合蛋白的一或多個組合物應用在包含腫瘤的組織。一或多個細胞毒性因子可選自由顆粒酶A、顆粒酶B及可溶性Fas配體所組成之群。 F. 對 OX40 及 PD-L1 具有特異性的示例性融合蛋白的製造。
在一些具體實施例中，本文揭示提供核酸分子(DNA及RNA)，其包括編碼所提供的融合蛋白的核苷酸序列。在一些具體實施例中，本文揭示涵蓋含有所提供的核酸分子的宿主細胞。由於基因密碼的簡併性能讓某些密碼子被其他指定相同胺基酸的密碼子所取代，因此本文揭示不限於編碼如本文所述的融合蛋白的具體核酸分子，而是涵蓋包括編碼功能性融合蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。在這方面，本文揭示也涉及編碼提供的融合蛋白的核苷酸序列。
若核酸分子(諸如DNA)包括含有關於轉錄及/或轉譯調控的訊息的序列元件，且該等序列「可操作地連接」到編碼蛋白的核苷酸序列，則其被稱為「能夠表現核酸分子」或「能夠使得核苷酸序列表現」。可操作的連接為其中調控序列元件及待表現的序列以能夠使基因表現的方式連接的連接。基因表現所必需的調控區的精確性質可能因物種而異，但通常這些區域包括啟動子，該啟動子在原核生物中含有啟動子本身，即引導轉錄起始的DNA元件，以及當轉錄成RNA時將發出轉譯起始訊號DNA元件。這種啟動子區域通常包括參與轉錄和轉譯起始的5’非編碼序列，諸如原核生物中的-35/-10框及Shine-Dalgarno元件，或真核生物中TATA框、CAAT序列、及5’-端帽元件。這些區域也可包括增強子或阻遏物元件以及轉譯的訊號及前導序列，用於使天然蛋白靶向宿主細胞的具體區室。
另外，3’非編碼序列可能含有參與轉錄終止、多腺核苷酸化等的調控元件。然而，若這些終止序列在具體宿主細胞中的功能不令人滿意，則其可被在該細胞中具有功能的訊號所取代。
因此，本文揭示的核酸分子可能「可操作地連接」到調控序列(或多個調控序列)，諸如啟動子序列，以使得該核酸分子表現。在一些具體實施例中，本文揭示的核酸分子包括啟動子序列及轉錄終止序列。合適的原核啟動子例如為tet啟動子、lacUV5啟動子或T7啟動子。用於在真核細胞中表現的啟動子的實例為SV40啟動子或CMV啟動子。
在一些具體實施例中，編碼本申請中揭示的脂質運載蛋白突變蛋白的核酸分子可與本文揭示的抗體或抗體鏈的另一核酸分子「可操作地連接」，以使得能表現本文揭示的融合蛋白。
另外，對於包括在融合蛋白中的本文揭示的hNGAL突變蛋白，在一些具體實施例中，可分別除去Cys 76與Cys 175之間的天然存在的雙硫鍵。因此，可在具有還原性氧化還原環境的細胞區室中，例如在革蘭氏陰性菌的細胞質中製造此類突變蛋白。
進一步關於本文揭示提供的hNGAL突變蛋白，如包含在融合蛋白中，本文揭示也包括編碼包含此類突變蛋白的融合蛋白的核酸分子，在一些具體實施例中，其可包括在實驗誘變的指定序列位置之外的一或多個額外突變。例如，若此類突變有助於脂質運載蛋白突變蛋白及/或融合蛋白的改善的折疊效率、血清穩定性、熱穩定性、或配體結合親和力，則此類突變通常是可容忍的，或甚至可證明是有利的。
在一些具體實施例中，所提供的核酸分子也可為載體或任何其他種類的選殖載體的一部分，諸如質體、噬菌體質體(phagemid)、噬菌體、桿狀病毒、黏質體、或人工染色體。
在一些具體實施例中，噬菌體質體中包括核酸分子。噬菌體質體載體表示編碼溫和噬菌體，諸如M13或f1基因間區域的載體，或其與感興趣的cDNA融合的功能部分。在以這種噬菌體質體載體及合適的輔助噬菌體(例如M13K07、VCS-M13或R408)重複感染細菌宿主細胞之後，會製造出完整的噬菌體顆粒，從而能夠使經編碼的異源cDNA物理耦合到其展示在噬菌體表面上的對應多肽(Lowman， Annu Rev Biophys Biomol Struct，1997；Rodi及Makowski， Curr Opin Biotechnol，1999)。
除了上述調控序列及編碼本文所述融合蛋白的核酸序列之外，這種選殖載體也可包括源自與用於表現的宿主細胞相容的物種的複製及控制序列，以及賦予經轉化或經轉染細胞以可選擇表現型的選擇標記。大量合適的選殖載體為本領域已知的，且可商購獲得。
在一些具體實施例中，本文揭示也涉及使用基因工程改造方法從編碼融合蛋白或其中任何次單元的核酸開始製造本文揭示的融合蛋白的方法。在一些具體實施例中，所提供的方法可在體內進行，其中所提供的融合蛋白例如可在細菌或真核宿主生物體中製造，接著從該宿主生物體或其培養物中分離。也可以在體外製造本文揭示的融合蛋白，例如使用體外轉譯系統。
當在體內製造融合蛋白時，可使用本領域熟知的重組DNA技術使編碼這種融合蛋白的核酸引入合適的細菌或真核宿主生物體中。編碼本文所述融合蛋白的DNA分子，且具體為含有這種融合蛋白編碼序列的選殖載體，可轉化到能夠表現該基因的宿主細胞中。可使用標準技術進行轉化。因此，本文揭示也涉及含有如本文所揭示的核酸分子的宿主細胞。
可在適於表現編碼本文揭示的融合蛋白的核苷酸序列的條件下培養經轉化的宿主細胞。合適的宿主細胞可為原核細胞，諸如大腸桿菌(E. coli)或枯草桿菌，或真核細胞，諸如釀酒酵母、巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)、SF9或High5昆蟲細胞、永生哺乳動物細胞株(例如HeLa細胞或CHO細胞)、或原代哺乳動物細胞。
當本文揭示的脂質運載蛋白突變蛋白(包括包含在本文揭示的融合蛋白中的脂質運載蛋白突變蛋白)包括分子內雙硫鍵時，可較佳使用合適的訊號序列使新生蛋白引導到具有氧化還原環境的細胞區室。這種氧化環境可由革蘭氏陰性菌，諸如腸桿菌的周質、革蘭氏陽性菌的細胞外環境、或真核細胞內質網腔所提供，且通常有利於結構雙硫鍵的形成。
也可在宿主細胞，較佳大腸桿菌的細胞質液中製造本文揭示的融合蛋白。在這種情況下，所提供的融合蛋白可直接以可溶及折疊狀態獲得，或以包涵體的形式回收，接著在體外復性。另一選擇為使用具有氧化性細胞內環境的具體宿主菌株，其因此可使得在細胞質液中形成雙硫鍵(Venturi等人， J Mol Biol，2002)。
然而，本文所述的融合蛋白不一定僅能藉由使用基因工程改造來產生或製造。更準確地說，這種蛋白也可藉由許多常規及眾所周知的技術中的任一者，諸如普通有機合成策略、化學合成(諸如Merrifield固相合成)、商購自動合成儀、或藉由體外轉錄及轉譯來獲得。例如，這種融合蛋白中包括的有前景的融合蛋白或脂質運載蛋白突變蛋白有可能使用分子模型來鑑定、在體外合成，並研究其與感興趣的標靶的結合活性。用於蛋白的固相及/或液相合成的方法為本領域眾所周知(請例如參見Bruckdorfer等人， Curr Pharm Biotechnol，2004)。
可使用本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的公認方法藉由體外轉錄/轉譯來製造本文揭示的融合蛋白。
也可藉由常規重組技術單獨來製備或與常規合成技術組合來製備本文所述的融合蛋白。
另外，可藉由使單獨的次單元，例如包括在融合蛋白中的抗體及突變蛋白共軛在一起而獲得根據本文揭示的融合蛋白。可例如使用常規方法藉由所有形式的共價或非共價連接來實現這種共軛。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解可用於製備本文揭示所考慮的融合蛋白的方法，但該融合蛋白的蛋白或核酸序列未在本文中明確揭示。總的來說，胺基酸序列的這種修飾例如包括單個胺基酸位置的定向誘變，以藉由併入某些限制酶的切割位點來簡化蛋白基因或其部分的次選殖。另外，可併入這些突變以進一步提高融合蛋白對其標靶(例如OX40及PD-L1)的親和力。另外，若有需要，則可引入突變以調控蛋白的一或多個特徵，諸如提高折疊穩定性、血清穩定性、蛋白抗性或水溶性、或降低聚集趨勢。
在研究以下實例及其附圖(其不旨在造成限制)之後，本文揭示的其他目的、優點及特徵對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者將變得顯而易見。因此，應當理解到，雖然本文揭示是藉由示例性具體實施例及任選特徵來特定揭示，但本發明所屬技術領域中具有通常知識者可使用本文揭示中所體現的修改及變化，且這些修改及變化被認為是在本文揭示的範圍內。 實例
實例 1 ：代表性融合蛋白的表現與分析
在此實例中，藉由使具有SEQ ID NO: 77或78提供的重鏈，或包含SEQ ID NO: 67的重鏈可變結構域，或包含GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 45)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 46)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 47)的CDR，並具有SEQ ID NO: 79提供的輕鏈，或包含SEQ ID NO: 73的輕鏈可變結構域，或包含QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 48)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 49)的CDR的PD-L1特異性抗體與本文揭示的OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白如SEQ ID NO: 33–36中任一者，經由連接子，諸如SEQ ID NO: 10的(G 4S) 3連接子融合在一起，以同時接合L-40和OX40，來產生代表性抗體-脂質運載蛋白突變蛋白融合蛋白。 圖 1中描述所產生的不同形式。例如，經由使SEQ ID NO: 33–36中任一者的一或多個脂質運載蛋白突變蛋白與包含SEQ ID NO: 77或78提供的重鏈，或包含SEQ ID NO: 67的重鏈可變結構域，或包含GFSLYD (HCDR1，SEQ ID NO: 45)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 46)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；47)的CDR，並具有SEQ ID NO: 79提供的輕鏈，或包含SEQ ID NO: 73的輕鏈可變結構域，或包含IGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 48)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 49)的CDR的抗體的四個末端中的一或多個融合，來產生這樣的融合蛋白，例如SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79、SEQ ID NO: 91及79、以及SEQ ID NO: 78及87的融合蛋白。產生的融合蛋白對OX40可為二價的(例如如 圖 1A 到 1D所示)、或對OX40為四價的(例如如 圖 1E 到 1H所示)、或對OX40具有更高的配價(例如如 圖 1I所示)。
在此實施例中描述的PD-L1特異性抗體以及所有抗體脂質運載蛋白突變蛋白融合蛋白具有經工程改造的IgG1骨架或經工程改造的IgG4骨架，其含有S228P突變以使體外及體內IgG4半抗體交換最小化(Silva等人， J Biol Chem，2015)。經工程改造的IgG1骨架含有L234A及L235A突變。IgG4骨架中的其他突變也可存在於本文描述的所有抗體及融合蛋白中，包括突變F234A、L235A、M428L、N434S、M252Y、S254T及T256E中的任一個或多個。可引入F234A及L235A突變以減少ADCC及ADCP (Glaesner 等人， Diabetes Metab Res Rev，2010)。可引入M428L及N434S突變或M252Y、S254T及T256E突變以延長血清半衰期(Dall'Acqua等人， J Biol Chem，2006；Zalevsky等人， Nat Biotechnol，2010)。所有抗體都在無羧基末端離胺酸的情況下表現以避免異質性。
另外，如 圖 1J 到 1K所示，藉由使SEQ ID NO: 33–36中任一者的OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白中的一或多個經由連接子(例如SEQ ID NO: 10的(G4S)3連接子)融合到SEQ ID NO: 29中提供的抗體的Fc區的C-末端，來產生單特異性脂質運載蛋白突變蛋白Fc融合。所得構築體在SEQ ID NO: 39–42中提供。
本發明也包括不對稱抗體-脂質運載蛋白突變蛋白融合形式，其中例如抗體的一個輕鏈可與脂質運載蛋白突變蛋白融合，而另一個則不融合。
藉由基因合成產生融合蛋白的構築體，並使其選殖到哺乳動物表現載體中。接著其在Expi293FTM細胞(Life Technologies)中暫時表現。藉由HPLC(Agilent Technologies)使用蛋白A親和管柱(Applied Biosystems)測量細胞培養基中融合蛋白的濃度。融合蛋白的效價總結在 表 1中。
使用蛋白A層析純化融合蛋白，接著在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中進行粒徑篩析層析(SEC)。在SEC純化之後，使含有單體蛋白的級分匯集，並使用分析型SEC再次分析。
表 1 ：暫時表現效價
SEQ ID NO 表現效價 [mg/mL]
78及87 0.05
88及79 0.05
89及79 0.05
82及79 0.12
實例 2 ：融合蛋白的穩定表現
藉由基因合成，包括密碼子最佳化，來產生示例性融合蛋白的構築體，並使其選殖到哺乳動物表現載體中。接著其在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中穩定表現。使用具有蛋白A感測器的Octet(ForteBio，Pall Corp.)測量細胞培養基中融合蛋白的濃度，並使用人類IgG1標準品定量。融合蛋白的效價總結在 表 2中。
表 2 ：穩定的表現效價
SEQ ID NO 表現效價 [mg/mL]
78及87 2.8
88及79 2
89及79 1.75
82及79 1.7
93及90 0.95
91及94 0.22
實例 3 ：藉由表面電漿共振 (SPR) 測定融合蛋白與 PD-L1 或 OX40 的結合
分別使用Biacore 8K及T200儀器(GE Healthcare)藉由表面電漿共振(SPR)來測定示例性融合蛋白與人類PD-L1(huPD-L1)、食蟹獼猴PD-L1(cyPD-L1)、人類OX40(huOX40)、及食蟹獼猴OX40(cyOX40)的結合動力學及親和力。
使用標準胺化學使抗人類IgG Fc抗體(GE Healthcare)固定在CM5感測器晶片上：使用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化晶片上的羧基。隨後，以5 µL/min的流速使用在10 mM乙酸鈉(pH 5.0)中濃度為25 µg/mL的抗人類IgG Fc抗體溶液(GE Healthcare)，直到達到4000–10000共振單位(RU)固定程度為止。藉由使1 M乙醇胺溶液通過表面來封閉殘留未反應的NHS-酯。以類似的方式處理參考通道。隨後，以10 μL/min的流速，藉由晶片表面上的抗人類IgG-Fc抗體捕獲在HBS-EP+緩衝液中的0.5 μg/mL的測試融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、88及79、89及79、82及79、93及90與91及94)，持續180秒。在每個捕獲步驟之後清洗針頭。也測試抗PD-L1抗體作為對照組，包括參考抗體(SEQ ID NO: 80及81)與包含在融合蛋白中的抗體(SEQ ID NO: 78及79)以及參考抗OX40抗體(SEQ ID NO: 25及26)。
為了進行親和力測定，在HBS-EP+緩衝液中製備以下稀釋液：huPD-L1-His (具有C-末端聚組胺酸標籤的huPD-L1，R&D Systems)、huOX40-His (具有C-末端聚組胺酸標籤的huOX-40，Sino Biologicals)、cyOX40-His(具有C-末端聚組胺酸標籤的cyOX-40，Sino Biologicals)的稀釋液，所有上述的範圍為150 nM到1.9 nM，以及cyPD-L1-His(具有C-末端聚組胺酸標籤的cyPD-L1，Sino Biologicals)，其範圍為25 nM到1.56 nM；並使上述稀釋液施加到製備的晶片表面。以180秒的接觸時間、900秒的解離時間、及30 µL/min的流速進行結合分析。所有測量都在25°C下進行。藉由注入3 M MgCl 2120秒來實現晶片表面的再生。在蛋白測量之前，為了調控目的而進行三個啟動循環。以Biacore Inside Evaluation軟體(V1.0.5)評估數據。使用雙重參考，並使用1:1結合模型擬合原始數據。
表 3 及表 4總結代表性融合蛋白的k on、k off及所得平衡解離常數(K D)的測定值。測試的雙特異性融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、88及79、89及79、82及79、93及90與91及94)以次奈莫耳(subnanomolar)到低奈莫耳親和力結合PD-L1及OX40。雙特異性融合蛋白對PD-L1的親和力與用於構築雙特異性融合蛋白的抗PD-L1抗體的親和力相當。
表 3 ：藉由SPR測定的融合蛋白對PD-L1的動力學常數及親和力
SEQ ID NO huPD-L1 cyPD-L1
k on[M -1x s -1] k off[s -1] K D[nM] k on[M -1x s -1] k off[s -1] K D[nM]
78及87 2.32E+06 1.16E-03 0.50 5.39E+05 7.84E-04 1.45
88及79 2.17E+06 1.13E-03 0.52 1.08E+06 1.32E-03 1.22
89及79 2.24E+06 1.15E-03 0.51 1.26E+06 1.36E-03 1.08
82及79 2.19E+06 1.16E-03 0.53 9.09E+05 1.24E-03 1.36
93及90 2.46E+06 1.10E-03 0.45 n.d. n.d. n.d.
91及94 2.33E+06 1.10E-03 0.47 n.d. n.d. n.d.
78及79 2.06E+06 9.76E-04 0.48 2.52E+05 7.19E-04 2.86
80及81 1.61E+06 6.40E-04 0.40 2.66E+05 1.05E-02 39.55
表 4 ：藉由SPR測定的融合蛋白對OX40的動力學常數及親和力
SEQ ID NO huOX40 cyOX40
k on[M -1x s -1] k off[s -1] K D[nM] k on[M -1x s -1] k off[s -1] K D[nM]
78及87 5.86E+05 3.85E-04 0.66 8.47E+05 7.74E-04 0.91
88及79 2.72E+05 9.53E-03 35.04 3.55E+05 3.22E-02 90.74
89及79 1.05E+05 9.15E-03 87.43 1.48E+05 3.50E-02 236.23
82及79 4.35E+05 3.93E-04 0.90 5.50E+05 7.58E-04 1.38
93及90 5.98E+05 3.69E-04 0.62 8.42E+05 7.47E-04 0.886
91及94 4.16E+05 3.57E-04 0.86 5.19E+05 7.07E-04 1.363
25及26 5.22E+05 1.70E-03 3.25 8.67E+05 6.14E-03 7.08
實例 4 ：在酵素結合免疫吸附分析法 (ELISA) 中融合蛋白與 PD-L1 或 OX40 的結合
使用酵素結合免疫吸附分析法(ELISA)來測定示例性融合蛋白對人類PD-L1及人類OX40的結合效力。
使在PBS中濃度為1 μg/mL的重組huPD-L1-His或huOX40-His(具有C-末端聚組胺酸標籤的人類PD-L1或OX40，R&D Systems或Sino Biologics)，在4℃下在微量滴定盤上塗覆隔夜。在以PBS-0.05%T(補充有0.05% (v/v) Tween 20的PBS)清洗之後，以PBS-0.1%T(補充有0.1% (v/v) Tween 20的PBS)中的2% BSA (w/v)在室溫下封閉滴定盤1小時。以100 μL PBS-0.05%T清洗五次之後，使示例性融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、88及79、89及79與82及79)、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合(SEQ ID NO: 39–42)、抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79與80及81)、參考抗OX40抗體(SEQ ID NO: 27及28)與靶向PD-L1及OX40的參考雙特異性融合蛋白(SEQ ID NO: 43及44)以不同濃度，通常為100到0.001 nM，加入孔中並在室溫下培養1小時，接著進行另一清洗步驟。藉由以1:5000或1:25000經稀釋的抗人類IgG Fc-HRP(Jackson Laboratory)在PBS-0.1%T-2%BSA中培養來檢測所研究的結合分子。在額外的清洗步驟之後，使螢光HRP受質(QuantaBlu，Thermo)加入到每個孔中，並使用螢光微孔盤讀取器檢測螢光強度。
也使用相同的ELISA設置來測定融合蛋白與食蟹獼猴標靶的結合效力，其中使cyPD-L1-His(具有C-末端聚組胺酸標籤的食蟹猴PD-L1，Sino Biologicals)或cyOX40-Fc (C-末端融合到Fc的食蟹猴OX40，Evitria)塗覆在微量滴定盤上。類似地滴定測試的試劑，並檢測結合的試劑。或者，可經由抗NGAL-HRP或抗Fab-HRP檢測融合蛋白與cyOX40-Fc的結合。
示例性實驗的結果與1:1結合S形擬合得到的擬合曲線一同示於 圖 2A 到 2D中，其中EC 50值及最大訊號為自由參數，且斜率和底部固定為一。所得的EC 50值提供在 表 5中。
所觀察到的針對所提供的融合蛋白(SEQ ID NO: 78及79、88及79、89及79與82及79)的兩個人類靶標的EC 50值與所測試的PD-L1抗體(如包括在融合蛋白中的SEQ ID NO: 80及81的參考PD-L1抗體與SEQ ID NO: 78及79的PD-L1抗體)、及/或如包括在雙特異性融合蛋白中的OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合非常相似或相當。所有測試的融合蛋白都顯示出與食蟹獼猴PD-L1具有交叉反應，具有與參考PD-L1抗體(SEQ ID N: 80和81)或包括在融合蛋白中的PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78和79)相當的EC 50值。另外，所有測試的雙特異性脂質運載蛋白突變蛋白融合蛋白都顯示出與食蟹獼猴OX40具有交叉反應，與雙特異性融合蛋白中包括的OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合具有相當的EC 50值。
表 5 ：PD-L1或OX40結合的ELISA數據
SEQ ID NO EC 50[nM] 與huPD-L1 的結合 EC 50[nM] 與cyPD-L1 的結合 EC 50[nM] 與huOX40 的結合 EC 50[nM] 與cyOX40 的結合
78及87 0.36 0.3 0.6 0.74
88及79 0.57 0.43 0.79 0.5
89及79 0.45 0.36 0.94 0.72
82及79 0.3 0.25 0.53 0.44
41 -- -- 0.33 0.36
39 -- -- 0.39 0.31
40 -- -- 0.45 0.43
42 n.d. n.d. 0.44 n.d.
78及79 0.25 0.2 N/A N/A
43及44 0.35 0.27 0.45 1.4
80及81 0.17 0.18 N/A N/A
27及28 -- -- 0.02 0.7
實例 5 ：在 ELISA 中融合蛋白與 PD-L1 及 OX40 的同時結合
為了證明示例性融合蛋白與PD-L1及OX40的同時結合，使用雙結合ELISA形式。
使溶於PBS (1 μg/mL)的重組huPD-L1-His (R&D Systems)在4℃下在微量滴定盤上塗覆隔夜。在每個培養步驟後，以100 µL PBS-0.05%T清洗滴定盤五次。在室溫下以PBS-0.1%T中的2% BSA (w/v)封閉滴定盤1小時，隨後再次清洗。使不同濃度的測試融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、88及79、89及79、82及79、93及90與91及94)、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合(SEQ ID NO: 39–42)、抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79與80及81)、參考抗OX40抗體(SEQ ID NO: 27及28)、以及靶向PD-L1及OX40的參考雙特異性融合蛋白加入到孔中，並在室溫下培養1小時，接著進行清洗步驟。隨後，在以PBS-0.1%T-2%BSA中以1 µg/mL的恆定濃度加入生物素化的huOX40-His(huOX40-His-Bio，Sino Biological)，持續1小時。在清洗之後，使1:5000稀釋的ExtrAvidin-HRP(Sigma-Aldrich)的PBS-0.1%T-2%BSA加入到孔中並培養1小時。在額外的清洗步驟之後，使螢光HRP受質(QuantaBlu，Pierce)加入到每個孔中，並使用螢光微孔盤讀取器檢測螢光強度。
也使用反向設置測試示例性融合蛋白的雙重結合，其中使重組1 µg/mL huOX40-His(Sino Biologicals)塗覆在微量滴定盤上，並經由加入生物素化的huPD-L1-His(R&D Systems)檢測結合的融合蛋白。
融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、88及79、89及79與82及79)的雙重結合數據與1:1 S形結合擬合得到的擬合曲線一同示於 圖 3A 及 3B中，其中EC 50值及最大訊號為自由參數，且斜率固定為一。EC 50值總結在表6中。所有雙特異性融合蛋白都顯示出清楚的結合訊號，證明融合蛋白能夠同時接合PD-L1及OX40。如預期的，針對其中一個標靶的單特異性分子，諸如抗PD-L1或抗OX40抗體及OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合，在同時結合分析中未顯示出結合。
表 6 ：PD-L1及CD37兩者同時靶向結合的ELISA數據
SEQ ID NO EC 50[nM] PD-L1 捕獲_OX40 檢測 EC 50[nM] OX40 捕獲_PD-L1 檢測
78及87 0.89 3.28
88及79 1.34 2.96
89及79 1.28 4.63
82及79 0.68 2.03
93及90 0.52 2.10
91及94 0.75 1.90
43及44 0.76 2.73
實例 6 ：與表現人類及食蟹獼猴 OX40 及 PD-L1 的細胞結合的融合蛋白流式細胞術分析
藉由流式細胞術評估融合蛋白與表現人類及食蟹獼猴PD-L1的細胞以及與表現人類及食蟹獼猴的OX40細胞的標靶特異性結合。
根據製造商的操作說明，使用Flp-In系統(Life technologies)，以人類PD-L1、食蟹獼猴PD-L1、人類OX40、食蟹獼猴OX40或模擬對照組來穩定地轉染Flp-In CHO細胞。
經轉染的CHO細胞維持在具有10%胎牛血清(Biochrom)及500 µg/mL濕黴素B(Roth)的Ham’s F-12培養基(Life technologies)中。根據製造商的操作說明(37°C，5% CO 2氣氛)在細胞培養瓶中培養細胞。
對於流式細胞術分析，使各細胞株與融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、88及79、89及79與82及79)一同培養，並在FACS分析中使用螢光標記的抗人類IgG抗體進行檢測，如下所述：
使5 × 10 4個細胞/孔在含有5%胎牛血清(PBS-FCS)的冰冷PBS中培養1小時。使一系列稀釋的測試融合蛋白、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合(SEQ ID NO: 39–42)，抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79與80及81)、參考抗OX40抗體(SEQ ID NO: 25及26)與靶向PD-L1及OX40的參考雙特異性融合蛋白(SEQ ID NO: 43及44)加入到細胞中，並在冰上培養1小時。以PBS清洗細胞兩次，接著與山羊抗hIgG Alexa488標記的抗體在冰上培養30分鐘。隨後清洗細胞並使用iQue流式細胞儀(Intellicyte Screener)進行分析。繪製平均幾何螢光訊號，並以Graphpad軟體使用非線性回歸進行擬合(共用底部，斜率=1)。
融合蛋白結合人類及食蟹獼猴PD-L1及OX40的能力描述在 圖 4中。所有測試的雙特異性融合蛋白及抗PD-L1抗體都以特異性方式結合經轉染細胞表面上的人類及食蟹獼猴PD-L1。OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的所有雙特異性融合蛋白及Fc融合在細胞環境中特異性結合人類及食蟹獼猴OX40。無任何融合蛋白與經模擬轉染細胞結合。
實例 7 ：藉由 ELISA 分析融合蛋白的脫靶結合
使用基於ELISA的分析來評估融合蛋白與30種不同標靶的脫靶結合，該等標靶包括PD-L1、PD-L2及其他TNF受體家族蛋白(Frese等人， MAbs，2013)。在以PBS-0.05%T清洗後，在4℃下使在PBS中濃度為5 μg/mL的標靶塗覆在微量滴定盤上隔夜，以PBS-0.1%T-2%BSA在室溫下封閉滴定盤1小時。以100 μL PBS-0.05%T清洗五次後，使100 nM或10 nM的測試融合蛋白加入到孔中，並在室溫下培養1小時，接著進行另一清洗步驟。藉由以1:5000經稀釋的F(ab’)2片段山羊抗人類IgG F(ab’)2 HRP(Jackson Laboratory)在PBS-0.1%T-2%BSA中培養來檢測所研究的結合抗體。在額外的清洗步驟之後，使螢光HRP受質(QuantaBlu，Thermo)加入到每個孔中並培養50分鐘。使用螢光微孔盤讀取器檢測螢光強度，並使其標準化為對照組抗體(SEQ ID NO: 37及38)的訊號。使結合非特異性標靶的每個測試分子的標準化訊號加起來，得到在給定濃度，即100 nM或10 nM下抗體的累積結合比率。進一步使各個測試分子在100 nM和10 nM下的累積結合比率相加，得到累積結合比率的總和。例如，對照組抗體(SEQ ID NO: 37及38)在100 nM或10 nM下測試時具有32的累積結合比率，且累積結合比率的總和為64，其中由與每個非特異性標靶及空白孔的結合產生的螢光強度被標準化為該對照組抗體。結果示於 表 7。較高的累積結合比率與較強的脫靶結合相關。
所提供的SEQ ID NO: 78及87、88及79、89及79與82及79的融合蛋白顯示出無或可忽略不計的脫靶結合(累積結合比率的總和＜150)。
表 7 ：融合蛋白的累積結合分數
融合蛋白 累積結合比率 累積結合比率的總和
標準化的螢光強度 SEQ ID NO: 82及79 100 nM 32 68
10 nM 36
SEQ ID NO: 78及87 100 nM 30 57
10 nM 27
SEQ ID NO: 88及79 100 nM 43 73
10 nM 30
SEQ ID NO: 89及79 100 nM 47 80
10 nM 33
實例 8 ：藉由流式細胞術分析融合蛋白的脫靶結合
使用流式細胞術研究以評估融合蛋白與OX40陰性但PD-L1陽性的人類內皮細胞(HUVEC)的脫靶或非特異性結合。
為了進行實驗，按照供應商指南，使用胰蛋白酶溶液(Promocell)分離90%融合度的HUVEC並進行計數。使2.5 x10 4HUVEC/孔加入到384孔盤的每個孔中(用於FACS(V形底)。以PBS清洗細胞，並以1/1000的稀釋度向各孔中加入活死亡標記(Invitrogen)。在另一清洗步驟之後，使測試的融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、88及79、89及79、82及79與97及98)、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO: 39、40及42)、脂質運載蛋白支架(SEQ ID NO: 2)、或人類IgG4對照組抗體(SEQ ID NO: 21及22)以200 nM到3.125 nM的濃度的Fc融合加入細胞中，與2000 nM抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)預培養或不預培養30分鐘。在4°C下培養30分鐘，接著進行兩個清洗步驟。接著使抗人類IgG二級抗體(Life technologies)加入到每個孔中，接著在4°C下培養30分鐘。在兩個最後的清洗步驟之後，使滴定盤插入Intellicyt並進行測量。接著使用Forecyt軟體分析原始數據以得到螢光幾何平均值。
示例性數據示於 圖 5中。所測試的融合蛋白未顯示出非特異性結合或脫靶結合HUVEC。雙特異性融合與HUVEC的結合是由PD-L1所驅動，且藉由加入SEQ ID NO: 78及79的抗PD-L1抗體而終止。
實例 9 ：使用 ELISA 測定融合蛋白與 OX40 在結合 OX40L 中的競爭
為了證明融合蛋白抑制OX40與OX40L之間相互作用的能力，使用競爭型ELISA形式。
使PBS(2 µg/mL)中的重組huOX40L-His(BioLegend)在4°C下在微量滴定盤上塗覆隔夜。在每個培養步驟之後，以100 µL PBS-0.05%T清洗滴定盤五次。在室溫下以PBS-0.1%T中的2% BSA (w/v)封閉滴定盤1小時，隨後再次清洗。使不同濃度的融合蛋白與作為示踪劑的10 nM重組生物素化huOX40-Fc(R&D systems)混合，並在室溫下培養1小時。使融合蛋白與示踪劑的混合物加入到滴定盤中，並在室溫下培養20分鐘，接著以100 µL PBS-0.05%T進行五個清洗步驟。隨後，使1:5000稀釋的ExtrAvidin-HRP(Sigma-Aldrich)加入到孔中並培養1小時。在額外的清洗步驟之後，使螢光HRP受質(QuantaBlu，Pierce)加入到每個孔中，並使用螢光微孔盤讀取器檢測螢光強度。
示例性融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、88及79、89及79與82及79)的競爭數據顯示在 圖 6中。所有雙特異性融合蛋白都顯示出與OX40基準抗體(SEQ ID NO: 25及26)及基準融合蛋白(SEQ ID NO: 43及44)相當的OX40/OX40L相互作用的明顯抑制。
實例 10 ：使用 ELISA 測定融合蛋白與 PD-L1 在結合 PD-1 中的競爭
為了證明融合蛋白抑制PD-1與PD-L1之間相互作用的能力，使用競爭型ELISA形式。
使PBS(1 µg/mL)中的重組huPD-1-His(ACROBiosystems)在4°C下在微量滴定盤上塗覆隔夜。在每個培養步驟5次後，以100 μL PBS-0.05%T(補充有0.05% (v/v) Tween 20的PBS)清洗滴定盤五次。在室溫下以PBS-0.1%T(補充有0.1% (v/v) Tween 20的PBS)中的2% BSA (w/v)封閉滴定盤1小時，隨後再次清洗。使不同濃度的融合蛋白與作為示踪劑的15 nM重組huPD-L1-Fc(R&D systems)混合，並在室溫下培養1小時。使融合蛋白與示踪劑的混合物加入到滴定盤中，並在室溫下培養20分鐘，接著以100 µL PBS-0.05%T進行五個清洗步驟。隨後，使1:5000稀釋的山羊抗人類IgG-Fc HRP(Jackson Laboratory)加入到孔中並培養1小時。在額外的清洗步驟之後，使螢光HRP受質(QuantaBlu，Pierce)加入到每個孔中，並使用螢光微孔盤讀取器檢測螢光強度。
示例性融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、88及79、89及79與82及79)的競爭數據與1:1 S形結合擬合得到的擬合曲線一同示於 圖 7中，其中IC 50值及最大訊號為自由參數，且斜率固定為一。IC 50值總結在 表 8中。所有雙特異性融合蛋白都顯示出PD-1/PD-L1相互作用的明顯抑制，其中IC 50值與抗體構築單元及參考PD-L1抗體相當。
表 8 ：融合蛋白與PD-L1結合PD-1的競爭
SEQ ID NO IC 50[nM] PD-1 競爭
78及87 6.3
88及79 8.2
89及79 7.1
82及79 4.3
78及79 5
43及44 4.6
80及81 3
27及28 N/A
實例 11 ：使用 PD-1/PD-L1 阻斷生物分析來評估 T 細胞活化
使用PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞(經工程改造以表現PD-1及由NFAT反應元件(NFAT-RE)驅動的 luc基因(螢火蟲螢光素酶基因))與PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞(表現人類PD-L1的CHO-K1細胞及經設計以抗原非依存方式啟動同源TCR的經工程改造的細胞表面蛋白)共同培養，以評估所選融合蛋白阻斷PD-1/PD-L1媒介的抑制的潛力。在此生物分析中，當PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞及PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞共同培養時，PD-1/PD-L1相互作用會抑制TCR訊號傳遞及NFAT-RE媒介的發光。加入PD-1/PD-L1阻斷劑，諸如本文所述的OX40及PD-L1特異性融合蛋白，會釋放抑制訊號並導致TCR活化及NFAT-RE媒介的發光。
PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞在補充有10% FCS的Ham’s F12培養基中生長，接種8.00 x 10 3個細胞/孔，並在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中黏附隔夜。第二天，丟掉培養基。向每個孔中加入1.00 x 10 4PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞，接著加入不同濃度(通常為0.005 nM到20 nM)的測試融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79、78及87、88及79、89及79、93及90與91及94)、構築單元抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)、或靶向PD-L1及OX40的參考雙特異性融合蛋白(SEQ ID NO: 43及44)。以透氣密封件覆蓋滴定盤，並在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中培養。在6小時之後，使30 μL Bio-Glo™試劑加入每個孔中，並使用光度計定量生物發光訊號。以GraphPad Prism®進行四參數邏輯曲線分析，以計算 表 9中總結的EC 50值。以一式三份進行該分析。
代表性實驗的結果描述在 圖 8中。數據證明，所測試的雙特異性融合蛋白以劑量依存方式抑制PD-1/PD-L1阻斷並活化報導細胞株，具有與構築單元抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)相當的EC 50值。作為陰性對照組，同型對照組抗體(SEQ ID NO: 21及22與37及38)不會導致發光訊號的增加。
表 9 ：使用PD-1/PD-L1阻斷生物分析來評估T細胞活化
SEQ ID NO/ 構築體 EC 50[nM]
82及79 0.58
78及87 0.35
88及79 0.52
89及79 0.59
93及90 0.29
91及94 0.65
78及79 0.37
43及44 0.68
IgG1同型對照組 無活化
21及22 無活化
實例 12 ：使用人類周邊血液單核細胞 (PBMC) 評估 T 細胞活化
使用T細胞分析來評估所選融合蛋白共同刺激T細胞反應以及防止PD-L1結合PD-1媒介的共同抑制的能力。為此，使不同濃度的融合蛋白加入到金黃色葡萄球菌B型腸毒素(SEB)刺激的人類周邊血液單核細胞(PBMC)中，並在37°C下培養3天。在上清液中測量IL-2分泌程度。
按照Biochrom的方案，藉由聚蔗糖密度梯度(Biocoll，1.077g/mL，Biochrom)離心，從血沉棕黃層(buffy coat)分離來自健康志願供體的PBMC。使經純化的PBMC重新懸浮在由90% FCS及10% DMSO所組成的緩衝液中，立即冷凍並儲存在液態氮中直到進一步使用為止。對於該分析，使PBMC解凍並在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中在補充有10% FCS及1%青黴素-鏈黴素(Life Technologies)的培養基(RPMI 1640，Life Technologies)中靜置16小時。
對於每個實驗條件，使用一式三份進行以下流程：使2.50x10 4個PBMC在384孔平底組織培養盤的每個孔中在培養基中培養。使通常為10到0.002 nM的稀釋系列的測試融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79、78及87、88及79與89及79)、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合(SEQ ID NO: 39、40及42)、抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO: 42)及抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)的Fc融合的混合劑、參考抗OX40抗體(SEQ ID NO: 25及26)及參考抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)的混合劑、靶向PD-L1及OX40的參考雙特異性融合蛋白(SEQ ID NO: 43及44)、或hIgG4同型對照組抗體(SEQ ID NO: 21及22)、及0.1 ng/mL的SEB加入各孔中。以透氣密封件(4titude)覆蓋滴定盤，並在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中培養3天。隨後，使用人類IL-2 DuoSet試劑盒(R&D Systems)按照以下方法評估上清液中的IL-2濃度。
以PBS中的1 μg/ml「人類IL-2捕獲抗體」在室溫下塗覆384孔盤2小時。隨後，以80 µl補充有0.05% Tween(PBS-T)的PBS清洗孔5次。在含有1%酪蛋白(w/w)的PBS-0.05%T中封閉1小時之後，使分析上清液及稀釋在培養基中的一系列濃度的IL-2標準品轉移到各個孔中，並在4℃下培養隔夜。第二天，加入100 ng/mL山羊抗hIL-2-Bio檢測抗體(R&D Systems)及1 μg/mL Sulfotag標記的鏈親和素(Mesoscale Discovery)在含有0.5%酪蛋白的PBS-T中的混合物，並在室溫下培養1小時。在清洗之後，向各孔中加入25 μL讀取緩衝液(Mesoscale Discovery)，並藉由Mesoscale Discovery讀取器檢測所得的電化學發光(ECL)訊號。使用Mesoscale Discovery軟體進行分析及定量。
代表性實驗的結果描述在 圖 9中。SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79與SEQ ID NO: 43及44的雙特異性融合蛋白及抗-PD-L1抗體SEQ ID NO: 78及79能夠誘導T細胞活化，這藉由與同型對照組(hIgG4，Sigma)相比增加的IL-2分泌程度來證明( 圖 9A 及 9B)。與用於構築融合蛋白的抗PD-L1抗體相比，所有測試的融合蛋白都會誘導更強的T細胞活化。OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合不會誘導T細胞活化，其表明與PD-L1的結合為OX40簇集及OX40媒介的T細胞活化的必要條件。如藉由IL-2分泌所測量，以OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白構築的雙特異性融合蛋白誘導比參考雙特異性分子以及抗PD-L1與抗OX40抗體的混合劑更強的T細胞活化( 圖 9B)。由雙特異性融合蛋白SEQ ID NO: 82及79誘導的T細胞活化較由用於製備雙特異性融合蛋白的構築單元的組合誘導的T細胞活化更強( 圖 9B)。
實例 13 ：在表現 PD-L1 的腫瘤細胞的存在下評估 T 細胞活化
使用T細胞分析來評估融合蛋白在腫瘤細胞的存在下共同刺激T細胞活化的能力。在表現PD-L1的人類乳腺癌細胞MDA-MB-231的存在下，使不同濃度的融合蛋白應用在經抗CD3刺激的T細胞。在上清液中測量IL-2分泌程度。
如 實例 12所述，從血沉棕黃層分離來自健康志願供體的PBMC。按照製造商的操作說明，使用Pan T細胞純化試劑盒(Miltenyi Biotec GmbH)藉由磁性細胞分選從PBMC進一步純化T淋巴細胞。使經純化的Pan T細胞重新懸浮在由90% FCS及10% DMSO所組成的緩衝液中，立即冷凍並儲存在液態氮中直到進一步使用為止。
對於該分析，使T細胞解凍並在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中在補充有10% FCS及1%青黴素-鏈黴素(Life Technologies)的培養基(RPMI 1640，Life Technologies)中靜置16小時。
對於每個實驗條件，使用一式三份進行以下流程：在37℃下以0.25 μg/mL抗CD3抗體預塗覆平底組織培養盤1小時，接著以PBS清洗兩次。以30 µg/mL絲裂黴素C(Sigma Aldrich)處理MDA-MB-231腫瘤細胞30分鐘以阻斷增殖。接著以PBS清洗經絲裂黴素處理的腫瘤細胞兩次，並以8.3 x 10 3個細胞/孔接種在培養基中，以使得在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中黏附隔夜。標靶細胞之前已在標準條件下生長，使用Accutase(PAA Laboratories)分離，並重新懸浮在培養基中。
在接著幾天，以PBS清洗滴定盤兩次之後，使每孔2.50 x 10 4T細胞加入腫瘤細胞中。使稀釋系列的測試融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79)、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合(SEQ ID NO: 42)、抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO: 42)及抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)的Fc融合的混合劑、參考抗OX40抗體(SEQ ID NO: 25及26)及參考抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)的混合劑、靶向PD-L1及OX40的參考雙特異性融合蛋白(SEQ ID NO: 43及44)、或hIgG4同型對照組抗體(SEQ ID NO: 21及22)加入相應孔中，接著加入0.05 μg/mL抗CD28抗體。以透氣密封件覆蓋滴定盤，並在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中培養3天。
在共同培養3天之後，如 實例 12所述評估上清液中的IL-2濃度。
示例性數據示於 圖 10中。在融合蛋白的存在下，使Pan T細胞與MDA-MB-231細胞共同培養，導致與hIgG4同型對照組抗體相比IL-2分泌明顯增加，該融合蛋白具有與PD-L1特異性抗體的C-末端融合的脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79)。使用抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)並未觀察到IL-2分泌增加，表明該實驗設置中T細胞活化主要由OX40活化所驅動。 圖 10A顯示與以較低親和力脂質運載蛋白突變蛋白構築的雙特異性融合蛋白(兩位數奈莫耳範圍)相比，以對OX40具有高親和力的脂質運載蛋白突變蛋白構築的雙特異性融合蛋白(皮莫耳範圍)導致更高程度的IL-2分泌。 圖 10B顯示，如藉由IL-2的分泌所測量，雙特異性融合蛋白SEQ ID N: 82及79誘導強T細胞活化，而此雙特異性融合蛋白的構築單元的單獨或組合或抗PD-L1及抗OX40抗體的混合劑都不會誘導T細胞活化。數據顯示，在表現PD-L1的標靶細胞的存在下，靶向PD-L1及OX40的雙特異性形式優於靶向OX40及PD-L1的兩種單獨分子的混合劑。SEQ ID NO: 82及79的雙特異性融合蛋白較參考雙特異性融合蛋白(SEQ ID NO: 43及44)誘導更強的T細胞活化。
實例 14 ：融合蛋白誘導的 PD-L1 依存 T 細胞活化的評估
使用T細胞活化分析進一步分析融合蛋白對PD-L1標靶依存T細胞的共同刺激。使不同濃度的融合蛋白應用在經抗CD3刺激的T細胞，與經人類PD-L1轉染或模擬轉染的Flp-In-CHO細胞共同培養。在上清液中測量IL-2分泌程度。
如 實例 12所述，從血沉棕黃層分離來自健康志願供體的PBMC。如 實例 13所述進一步純化及儲存T淋巴細胞。
對於該分析，使T細胞解凍並在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中在補充有10% FCS及1%青黴素-鏈黴素(Life Technologies)的培養基(RPMI 1640，Life Technologies)中靜置隔夜。
對於每個實驗條件，使用一式三份進行以下流程：在37℃下以0.25 μg/mL抗CD3抗體預塗覆平底組織培養盤2小時，接著以PBS清洗兩次。以30 µg/mL絲裂黴素C(Sigma Aldrich)處理經人類PD-L1轉染或模擬轉染的CHO細胞30分鐘以阻斷增殖。接著以PBS清洗經絲裂黴素處理的細胞兩次，並以8.3 x 10 3個細胞/孔接種在培養基中，以使得在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中黏附隔夜。CHO細胞之前已在標準條件下生長，使用Accutase(PAA Laboratories)分離，並重新懸浮在培養基中。
在接著幾天，使每孔2.50 x 10 4T細胞加入CHO細胞中。使通常為0.004到40 nM的稀釋系列的測試融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79)、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合(SEQ ID NO: 39–42)、抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)、靶向PD-L1及OX40的參考雙特異性融合蛋白(SEQ ID NO: 43及44)、或hIgG4同型對照組抗體(SEQ ID NO: 21及22)加入相應孔中，接著加入0.05 μg/mL抗CD28抗體。以透氣密封件覆蓋滴定盤，並在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中培養3天。
在共同培養3天之後，如 實例 12所述評估上清液中的IL-2濃度。
示例性數據示於 圖 11中。在雙特異性融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: NO: 89及79)的存在下，Pan T細胞與以經人類PD-L1轉染的CHO細胞的共同培養導致與hIgG4同型相比強的劑量依存IL-2分泌。在與脂質運載蛋白突變蛋白雙特異性融合蛋白培養後分泌的IL-2程度，與在參考雙特異性分子的存在下分泌的IL-2程度相當。對於抗PD-L1抗體及OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合，並未觀察到IL-2分泌增加。這些結果顯示，需要兩個標靶的同時接合才能在此設置中誘導T細胞活化。
當與經模擬轉染的CHO細胞(PD-L1陰性)共同培養時，並未觀察到IL-2分泌的劑量依存增加，表明雙特異性融合蛋白對T細胞的活化主要為PD-L1依存的。
實例 15 ：以 CD4 +T 細胞進行混合淋巴細胞反應 (MLR) 評估
利用混合淋巴細胞反應(MLR)分析來評估示例性融合蛋白在天然表現PD-L1的人類抗原呈現細胞的存在下誘導CD4 +T細胞刺激的能力。在單核細胞衍生的樹突細胞(moDC)及CD4 +T細胞的存在下，以單向MLR測試不同濃度的融合蛋白及不同對照組(SEQ ID NO: 80及81、SEQ ID NO: 78及79、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 43及44、SEQ ID NO: 80及81+SEQ ID NO: 25及26、SEQ ID NO: 78及79+SEQ ID NO: 42)，該等樹突細胞來自錯誤配對的健康供體。在測試分子的存在下培養6天之後，在上清液中定量IL-2及干擾素-γ(IFNg)的分泌。
按照製造商的操作說明(StemCell)，使用Lymphoprep溶液從血小板分離血液包中純化PBMC。使用Miltenyi試劑盒從PBMC中純化總CD4 +T淋巴細胞，並冷凍在90% FBS 10% DMSO的溶液中。使用CD14 +珠粒試劑盒(Miltenyi)純化CD14 +單核細胞並新鮮使用。
在50 ng/mL IL-4及100 ng/mL GMCSF (Miltenyi)的存在下，在加有10% FBS及Pen/Strep(LifeTech)的RPMI1640中以2x10 6個細胞/mL培養CD14 +單核細胞6天，獲得MoDC。在第3天，加入10 mL含有細胞介素的新鮮培養基。在分化的第7天，藉由FACS評估表現型(CD14、CD1a、HLADR、PD-L1)。
在完全RPMI培養基中，在U形底96孔中存在50.000個CD4 +T細胞的情況下，在一式三份孔中的RPMI中存在測試分子的情況下，培養10.000個moDC，持續6天。在培養結束時，立即冷凍上清液並儲存以進行IL-2及IFNg定量。藉由使用Luminex技術測量上清液中的IL-2濃度，且示例性數據示於 圖 12中。 圖 12A顯示在若干組的MLR實驗中(N=8)，與相應的單獨構築單元(SEQ ID NO: 42與SEQ ID NO: 78及79)或參考OX40或PD-L1抗體(SEQ ID NO: 25及26或SEQ ID NO: 80及81)相比，融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)在IL-2誘導劑量反應(0.001到20.5 nM)中顯著更好。 圖 12B表明與同型抗體對照組相比，融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)會誘導IFNg的劑量依存分泌。與參考PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)及參考OX40抗體(SEQ ID NO: 25及26)的混合劑的等莫耳濃度相比，SEQ ID NO: 82及79的融合蛋白所誘導的IFNγ濃度更高，濃度範圍為0.001到20.5 nM。
實例 16 ：以 CD3 +T 細胞進行混合淋巴細胞反應 (MLR) 評估
利用混合淋巴細胞反應(MLR)分析來評估示例性融合蛋白在天然表現PD-L1的人類抗原呈現細胞的存在下誘導CD3 T細胞刺激的能力。分析CD4及CD8 T細胞兩者都存在的CD3 T細胞的誘導，為分析融合蛋白對兩種細胞群的影響的相關分析。在單核細胞衍生的樹突狀細胞(moDCs)及來自錯誤配對的健康供體的CD3 T細胞的存在下，以單向MLR測試不同濃度的融合蛋白及對照組(SEQ ID NO: 78及79、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 82及79)。在測試分子的存在下培養6天之後，定量上清液中IFNg、IL-13、IL-2、顆粒酶A、顆粒酶B、及FasL的分泌。
如 實例 15獲得MoDC。使用Miltenyi試劑盒從PBMC獲得總CD3+細胞並新鮮使用。在完全RPMI培養基中，在U形底96孔中存在50.000個CD4 +T細胞的情況下，在一式三份孔中的RPMI中存在測試分子的情況下，培養10.000個moDC，持續6天。在培養結束時，立即冷凍上清液並儲存以供IL-2、IFNg、IL-13、顆粒酶A、顆粒酶B、及FasL分泌。使用Muminex技術定量上清液中的分泌因子。
SEQ ID NO: 82及79的融合蛋白顯示干擾素γ(IFNg)分泌的刺激，與SEQ ID NO: 78及79的抗體相似( 圖 13A)。然而，SEQ ID No: 82及79的融合蛋白與SEQ ID NO: 78及79的抗體相比，顯示出更強T細胞效應細胞介素，諸如IL-13及IL-2的誘導( 圖 13B 到 13C)。
SEQ ID NO: 82及79的融合蛋白與SEQ ID NO: 78及79的抗體相比，也顯示出對顆粒酶A、顆粒酶B及可溶性Fas配體分泌的更強刺激( 圖 13D 到 13F)，表明所測試的構築體刺激來自人類原代T細胞的細胞毒性因子的分泌。
實例 17 ：融合蛋白在小鼠中的藥物動力學
在小鼠中進行代表性融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79、SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 93及90、SEQ ID NO: 91及94、SEQ ID NO: 43及44)的藥物動力學分析。使約6到9周齡的CD-1 NUDE小鼠(每個時間點3隻小鼠；Charles River Laboratories，Research Models and Services，Germany GmbH)以2 mg/kg的劑量使用融合蛋白注射到尾靜脈中。使用雄性CD-1小鼠作為參考。使用5 mL/kg的體積以單次快速注射施用給測試物品。在5分鐘、24小時、168小時及336小時的時間點獲得來自小鼠的血漿樣品。收集足量全血(在異氟醚麻醉下採集)以獲得每隻動物及每個時間至少30 μL鋰鹽-肝素血漿。使用三明治ECL分析檢測藥物濃度，經由標靶PD-L1及脂質運載蛋白突變蛋白支架或經由標靶OX40及人類IgG來檢測完整的雙特異性構築體。經由標靶PD-L1及抗人類IgG來檢測用作參考的抗PD-L1抗體。使用Phoenix WinNonlin軟體(Certara)使用二房室模型(two-compartmental model)來擬合數據。
圖 14顯示融合蛋白SEQ ID NO: 78及79、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79、SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 93及90、SEQ ID NO: 91及94的血漿濃度隨時間的圖，該等融合蛋白與作為構築單元的PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)獲得的值一同作圖。雙特異性融合蛋白的藥物動力學行為看起來與抗PD-L1抗體的藥物動力學行為相似。參考雙特異性(SEQ ID NO: 43及44)直到168小時為止顯示出與其他融合蛋白相似的特徵，隨後可能由於抗藥物抗體的形成而導致暴露減少。終端半衰期總結在 表 10中。
數據證明融合蛋白在小鼠體內具有長的、類抗體的終端半衰期。因為用於測定融合蛋白血漿濃度的分析需要結合到雙特異性分子的兩個臂，因此結果也證明雙特異性分子在14天的時程內保持完整。
表 10 ：使用非房室分析來測定小鼠的終端半衰期。參考雙特異性的終端半衰期可能受到抗藥物抗體的影響。
SEQ ID NO 終端半衰期 [h] 小鼠
78及87 291
88及79 239
89及79 449
82及79 222
93及90 230
91及94 137
78及79 273
43及44 (27)
實例 18 ：食蟹獼猴中融合蛋白的藥物動力學
在食蟹獼猴中進行代表性融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 78及87與SEQ ID NO: 88及79)的藥物動力學分析。食蟹獼猴(每個時間點1到2隻猴子，混合性別或僅雄性)接受7.6–10 mg/kg劑量的融合蛋白的靜脈注射。在30分鐘、2小時、4小時、8小時、24小時(D2)、D3、D4、D5、D8或D9、D11或D12、D15及D22的時間點獲得食蟹獼猴的血漿樣品。在Gyrolab xP系統中使用三明治格式檢測藥物濃度，經由標靶PD-L1及脂質運載蛋白突變蛋白支架檢測完整的雙特異性構築體。
藉由夾心ELISA測定抗藥物抗體的存在，使藥物本身(5 μg/mL)塗覆在微量滴定盤上，使其與在PBS-0.1%T-2%BSA中1:100經稀釋的猴血漿樣品一同培養，並使用抗食蟹獼猴IgG抗體經由HRP標記的結合經塗覆藥物的食蟹獼猴抗體(Jackson)檢測。高於背景(每隻動物的施用前血漿樣品)2倍的訊號被定義為抗藥物抗體陽性( 表 11)。
圖 15顯示融合蛋白SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 78及87與SEQ ID NO: 88及79以及PD-L1抗體SEQ ID NO: 78及79的食蟹獼猴血漿濃度隨時間的半對數圖。在施用後4到11天開始，檢測所有融合蛋白以及PD-L1抗體的抗藥物抗體反應(在 圖 15中以虛線表示)。使用Phoenix WinNonlin軟體(Certara)使用非房室分析(NCA)模型來擬合排除抗藥抗體陽性時間點的食蟹獼猴的藥物血漿濃度，且NCA參數示於( 表 11)中。對於大多數融合蛋白(除了SEQ ID NO: 78及87)及PD-L1抗體，總藥物暴露(AUCINFobs)、清除率(Cl obs)及分布體積(Vz obs)的測定取決於從最後一個ADA負時間點到無窮大外推(AUC_%Extrap_obs)的顯著百分比。NCA數據暗示，結合OX40的抗運載蛋白(anticalin)部分與PD-L1抗體SEQ ID NO: 78及79的融合僅適度影響SEQ ID NO: 82及79與SEQ ID NO: 78及79的半衰期(t 1/2)及清除率(Cl obs)(與構築單元抗體約70%的相似性)。
表 11 ：在除去ADA陽性測試時間點之後食蟹獼猴PK的非房室分析參數
SEQ ID NO 劑量 [mg/kg] 動物 t 1/2 [h] t max [h] c max [µg/mL] AUCINF obs [h•{µg/mL}] AUC_ %Extrap_obs [%] Cl obs [mL/h/kg] Vz obs [mL/kg] 經測試的 ADA 陽性 [h]
78及79 1 221 130 0.5 18.6 2323 27 0.43 81 264
271 106 0.5 22.4 2014 21 0.50 76 264
82及79 7.72 21 85 2 180.2 16389 55 0.47 58 96
7.6 71 72 0.5 231.6 17842 39 0.43 44 168
78及87 10 11 22 0.5 278.3 7148 5 1.40 45 168
61 18 0.5 266.5 7553 0 1.32 34 240
88及79 10 11 89 0.5 308.7 30130 48 0.33 43 192
t 1/2=半衰期，t max=最大濃度的時間，c max=最大濃度，AUCINF obs=從零預測直到從最後ADA陰性觀察時間點無窮大的藥物暴露，AUC_ %Extrap_obs=AUCINFobs的外推百分比，Cl obs=觀察到的清除率，Vz obs=觀察到的分布體積
實例 19 ：融合蛋白的熱穩定性評估
為了測定融合蛋白的熔化溫度(T ms)，其為構形穩定性的一般指標，使用毛細管nanoDSC儀器(CSC 6300，TA Instruments)以1°C/min的掃描速率從25到100℃掃描PBS(Gibco)中的1 mg/mL蛋白濃度的分子。使用整合的Nano分析軟體從顯示的熱分析圖計算T ms。
示例性融合蛋白的所得熔化溫度以及熔化開始溫度列於下方 表 12中。
表 12 ：藉由nanoDSC測定T m及起始熔化溫度。以粗體標記主要的熱轉變。
SEQ ID NO 熔化開始[°C] T m[°C]
78及87 60 69.3；74.1；78.6； 80.3
88及79 60 68.9；70.2；78.6； 80.3
89及79 60 68.9；70.3；79.0； 80.6
82及79 63 69.4；72.0；78.7； 80.4
78及79 60 70.5；78.7； 80.4
實例 20 ：融合蛋白的穩定性評估
為了評估在熱應力條件下的穩定性，使示例性融合蛋白(SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79與SEQ ID NO: 82及79)以2 mg/mL的濃度在PBS中在40℃下培養1或2周。隨後藉由使2 μg樣品以0.35 mL/min的流速及150 mM磷酸鈉pH 7.0作為流動緩衝液施加到Zenix C SEC-300，4.6x150 mm(Sepax)管柱(具有前管柱)上，使用分析粒徑篩析測定單體融合蛋白。所有測試的融合肽在40°C的PBS中培養2周後，藉由SEC檢測在純度方面是穩定的。示例性結果示於 圖 16中。利用 實例 5中所述的同時結合分析，在定量ELISA設置中測量功能性融合蛋白含量。在40°C下培養2周後，並未觀察到活性損失。
實例 21 ：融合蛋白的 pI 及電荷的評估
在2M尿素的存在下，使用pH 5到pH 8的兩性電解質混合物，在Protein Simple Maurice儀器上使用成像毛細管等電聚焦(icIEF)評估電荷分佈及pI。示例性融合蛋白的pI及帶電物質分布列於下方 表 13中。示例性電泳圖示於圖17中。
表 13 ：電荷分布及pI由icIEF所測定。報導酸性物質(AS)總和、主峰純度(main)及鹼性物質(BS)總和(無小數點的四捨五入值)。
SEQ ID NO pI[pH] 電荷分布
78及87 6.5 AS：39%；主峰：56%；BS：5%
88及79 6.4 AS：47%；主峰：22%；BS：31%
89及79 6.1 AS：47%；主峰：23%；BS：30%
82及79 6.4 AS：48%；主峰：47%；BS：6%
93及90 7.6 AS：40%；主峰：56%；BS：4%
91及94 7.6 AS：36%；主峰：34%；BS：31%
實例 22 ： Treg 細胞抑制分析中活性的評估
使用人類原代CD4 T細胞(本文定義為Treverter，Tresp)及原代體外誘導的Treg(iTreg)的Treg體外抑制測定用於評估融合蛋白釋放iTreg對Tresp施加的抑制的能力。使融合蛋白(不在溶液中，而是結合到塑膠板上以提供交聯)以固定濃度施加到iTreg與Tresp的共同培養物中。在共同培養的Tresp細胞上測量Tresp細胞的增殖及表面活化標記CD25的表現。
從血沉棕黃層分離來自健康志願供體的PBMC。藉由使用免疫磁珠進行陰性選擇，從來自血沉棕黃層的新鮮健康供體PBMC中分離出初始T細胞。一小部分初始T細胞被冷凍作為Tresp的來源。
在IL-2及TGF-β1的存在下，以抗CD3/抗CD28 Dynabeads刺激剩餘的初始T細胞，持續六天，以產生iTreg細胞。在第六天，使初始Tresp解凍並以CFSE標記。使經CellTrace TMViolet標記的iTreg及經抗CD3/抗CD28刺激的Tresp以不同的比例再共同培養四天。
細胞在96孔圓底盤中培養，分別以固定劑量(200 nM)的融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO: 42)的Fc融合、抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)、或hIgG4同型對照組抗體(SEQ ID NO: 21及22)預塗覆。以透氣密封件覆蓋滴定盤，並在37°C下在濕潤的5% CO 2氣氛中培養4天。
在培養結束時，使細胞的存活力、CD4及CD25染色，並藉由CFSE稀釋或CD25表現的流式細胞術分析分別測定細胞增殖及活化的變化。
圖 18A顯示使用N=6個獨立供體，以固定劑量的融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)處理導致iTreg對Tresp的抑制活性顯著降低，以與對照組(單獨刺激的Tresp)相比的抑制百分比測量。在iTreg與Tresp的比率為1:1、1:2、1:4、1:8及1:16時，檢測到融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)與hIgG4同型對照組之間的統計學顯著差異。使用重複測量的雙因子變異數分析與Dunnett多重比較測試， ****p＜0.0001。使用N =6個獨立PBMC供體，以固定劑量的與塑膠板交聯的OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO: 42)的Fc融合處理，導致iTreg對Tresp的抑制活性顯著降低，以與對照組(單獨刺激的Tresp)相比的抑制百分比測量。以Tresp細胞增殖測量，與陰性對照組hIgG4同型對照組相比，以固定劑量的抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)處理不會導致Treg抑制活性的任何顯著差異。
圖 18B顯示以融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)處理會導致Tresp上CD25表現增加，其為T細胞活化的標標記。在iTreg與Tresp的比率為1:4、1:8、1:16及1:32時，這種增加與hIgG4同型對照組處理相比在統計學上顯著不同。使用重複測量雙因子變異數分析及Dunnett多重比較測試，比較融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)與hIgG4同型，進行*p＜0.5、**p＜0.01、***p＜0.001、****p＜0.0001統計學分析。以Tresp細胞增殖測量，與陰性對照組hIgG4同型相比，以固定劑量的抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)處理不會導致Treg抑制活性的任何顯著差異。
與抗PD-L1抗體相比，融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)及OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合顯示出更強的克服Treg細胞抑制的能力( 圖 18A 及圖 18B)表明經測試的構築體減少Treg細胞對Tresp細胞的抑制。
實例 23 ：在 MC38h-OX40 敲入小鼠模型中評估抗腫瘤作用
使人類OX40敲入C57BL/6小鼠中以製造人源化敲入(KI)小鼠(Biocytogen)。使MC38腫瘤細胞(1x10 6)皮下接種到KI小鼠的右側腹部。當平均腫瘤尺寸達到60–160 mm 3時，根據腫瘤體積隨機選擇小鼠，每組15隻小鼠(PBS n=13除外)。隨機化當天藉由靜脈途徑進行CD20減除。使包含SEQ ID NO: 36的OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白與SEQ ID NO: 80及81 (SEQ ID NO: 101及102)的小鼠交叉反應抗PD-L1抗體、抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)或PBS的融合蛋白，以三周為基礎，腹膜注射到小鼠中，進行7次注射。使抗OX40抗體(SEQ ID NO: 25及26)靜脈注射到小鼠中，三周一次，進行7次注射。
在等莫耳劑量下，融合蛋白(SEQ ID NO: 101及102)較抗PD-L1抗體顯著更高程度地減緩腫瘤生長，如下方 表 14所示，顯示出第一次給藥後12天的腫瘤生長抑制率。如 圖 19所示，與抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)以及抗OX40抗體(SEQ ID NO: 25及26)相比，以融合蛋白(SEQ ID NO: 101及102)處理會導致腫瘤體積顯著減少。
表 14 ：第12天的腫瘤生長抑制(TGI)
TGI(%)
抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)與PBS的比較 +3.5
融合蛋白(SEQ ID NO: 101及102)與PBS的比較 +46.86
融合蛋白(SEQ ID NO: 101及102)與抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)的比較 +42.9
實例 24 ：在 KLH 模型中評估抗 KLH IgG 及 IgM 的製造
使人類OX40敲入C57BL/6小鼠中以製造人源化敲入小鼠(Biocytogen)。根據體重，隨機分配小鼠(每組15隻小鼠)。在第0天及第7天皮下注射在TiterMax金佐劑(Sigma-Aldrich)中乳化的KLH(ThermoFischer)。使包含50 mg/kg SEQ ID NO: 36的OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白與SEQ ID NO: 80及81 (SEQ ID NO: 101及102)的小鼠交叉反應抗PD-L1抗體、38.5 mg/kg(等莫耳劑量的融合蛋白)的抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)或PBS的融合蛋白，以三周為基礎，腹膜注射到小鼠中，共進行7次注射。在KLH注射前的第4天、KLH注射後的第7天及第14天進行血液取樣，並收集血漿。根據製造商的建議，使用來自Life Diagnostics的ELISA分析IgG及IgM試劑盒進行抗KLH IgG及IgM定量。
如 圖 20所示，與抗PD-L1抗體及經PBS處理的組相比，以融合蛋白處理會導致IgG及IgM製造增加。
本文示例性描述的具體實施例可在缺少未特定揭示於本文的任何一個或多個元件、一個或多個限制的情況下適當地實施。因此，例如，「包含」、「包括」、「含有」等詞應被廣義地理解而不受限制。另外，本文所用的術語及詞語已用作描述性而非限制性術語，且在使用這些術語及詞語時並無意排除所示及所述特徵或其部分的任何均等方案，但應認識到在所要求保護的本發明的範圍內可能作出各種修改。因此，應當理解到，雖然已藉由較佳具體實施例及任選特徵具體揭示本案具體實施例，但本發明所屬技術領域中具有通常知識者可對其進行修改及變化，且這些修改及變化被認為是在本發明的範圍內。本文所述的所有專利、專利申請案、教科書及同行審議的出版物都全文以引用方式併入本文。另外，當藉由引用併入本文的參考文獻中的術語的定義或使用與本文提供的該術語的定義不一致或相反時，適用本文提供的該術語的定義，而不適用參考文獻中該術語的定義。落入一般揭示內容的每個較窄的種類和亞屬分組也形成本發明的一部分。這包括本發明的一般性描述，其中從該屬中除去任何標的附帶條件或負面限制，而不論所刪除的資訊是否特定列述於本文。另外，在特徵是根據馬庫西群組描述的情況下，本發明所屬技術領域中具有通常知識者將認識到，本文揭示也因此根據馬庫西群組的任何單獨成員或成員的子群組來描述。進一步的具體實施例將從以下的申請專利範圍而變得顯而易見。
均等方案：本領域技術人員將認識到，或能夠使用不超過常規實驗確定本文所述的本發明的特定具體實施例的許多均等方案。這些均等方案旨在包含在以下的申請專利範圍中。本說明書中提及的所有出版物、專利及專利申請案在此藉由引用併入本說明書，其程度如同特定與單獨地表明每個單獨的出版物、專利或專利申請案藉由引用併入本說明書一般。 非專利參考文獻GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., ARASANZ, H., IBANEZ-VEA, M., LORENZO, L., FERNANDEZ-HINOJAL, G., VERA, R., SMERDOU, C., MARTISOVA, E., AROZARENA, I., WELLBROCK, C., LLOPIZ, D., RUIZ, M., SAROBE, P., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D. 2017. PDL1 Signals through Conserved Sequence Motifs to Overcome Interferon-Mediated Cytotoxicity. Cell Rep,20 ,1818-1829. KARWACZ, K., BRICOGNE, C., MACDONALD, D., ARCE, F., BENNETT, C. L., COLLINS, M. & ESCORS, D. 2011. PD-L1 co-stimulation contributes to ligand-induced T cell receptor down-modulation on CD8+ T cells. EMBO Mol Med,3 ,581-92. ARASANZ, H., GATO-CANAS, M., ZUAZO, M., IBANEZ-VEA, M., BRECKPOT, K., KOCHAN, G. & ESCORS, D. 2017. PD1 signal transduction pathways in T cells. Oncotarget,8 ,51936-51945. PATSOUKIS, N., BARDHAN, K., CHATTERJEE, P., SARI, D., LIU, B., BELL, L. N., KAROLY, E. 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無
圖 1 ：提供本申請中描述的代表性融合蛋白的設計概述，該等融合蛋白對標靶OX40及PD-L1具有雙特異性。代表性融合蛋白基於對PD-L1具有特異性的抗體(例如以下的抗體：重鏈由SEQ ID NO: 78提供，或包含SEQ ID NO: 67的重鏈可變結構域，或包含GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 45)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 46)及VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 47)的CDR序列，且輕鏈由SEQ ID NO: 79提供，或包含SEQ ID NO: 73的輕鏈可變結構域，或包含QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 48)、YAS (LCDR2)及QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 49)的CDR序列)及一或多個對OX40具有特異性的脂質運載蛋白突變蛋白(例如SEQ ID NO: 36的脂質運載蛋白突變蛋白)來製備。如 圖 1A 到 1I所示，使一或多個脂質運載蛋白突變蛋白基因融合到PD-L1特異性抗體的重鏈或輕鏈的C末端及/或N末端，產生例如SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 78及83、SEQ ID NO: 84及79、SEQ ID NO: 78及85、SEQ ID NO: 86及79、以及SEQ ID NO: 82及83的融合蛋白。產生的融合蛋白對OX40可為二價的(例如如 圖 1A 到 1D所示)，或對OX40為四價的(例如如 圖 1E 到 1H所示)、或對OX40具有更高的配價(例如如 圖 1I所示)。藉由使一或多個OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白(例如如 圖 1J 到 1K所示)經由肽連接子融合到如本文所述提供的抗體的Fc區的C末端，產生其他單特異性融合蛋白。所得的單特異性融合蛋白提供於例如SEQ ID NO: 92及SEQ ID NO: 42中。
圖 2 ：顯示ELISA實驗的結果，其中代表性融合蛋白與PD-L1或OX40的結合如 實例 4所述測定。使PD-L1或OX40(具有C末端His或Fc標籤)塗覆在微量滴定盤上，並從100 nM的最高濃度開始滴定測試試劑。分別藉由抗人類IgG Fc-HRP或抗NGAL-HRP檢測所研究的結合劑。以1:1結合模型進行數據，EC 50值及最大訊號作為自由參數，且斜率固定為1。所得的EC 50值提供在 表 5中。
圖 3 ：說明ELISA實驗的結果，其中代表性融合蛋白同時結合兩個標靶PD-L1及OX40的能力如 實例 5所述測定。使重組huPD-L1-His或huOX40-His塗覆在微量滴定盤上，接著從最高濃度的100 nM開始滴定融合蛋白。隨後，分別加入恆定濃度的生物素化huOX40-His或生物素化huPD-L1-His，其經由ExtrAvidin-過氧化酶檢測。
圖 4 ：顯示如 實例 6所述使用人類或食蟹獼猴OX40( 圖 4A)以及人類或食蟹獼猴PD-L1( 圖 4B)表現Flp-In-CHO細胞藉由流式細胞術評估融合蛋白的標靶結合的結果。當使用經模擬轉染的Flp-In-CHO細胞時並未觀察到結合( 圖 4C)。
圖 5 ：描述如 實例 8所述螢光活化細胞分選(FACS)研究的結果，該研究評估融合蛋白與OX40陰性但PD-L1陽性的人類內皮細胞(HUVEC)的脫靶或非特異性結合。所測試的融合蛋白都未顯示非特異性或脫靶結合。
圖 6 ：顯示融合蛋白與OX40競爭結合OX40L，如 實例 9所述的競爭型ELISA研究中所述。使恆定濃度的huOX40L-His塗覆在微量滴定盤上，接著加入不同濃度的測試分子及固定濃度的示踪劑huOX40-Fc的混合物。使用HRP標記的抗IgG Fc抗體檢測結合的示踪劑。觀察到OX40及PD-L1雙特異性融合蛋白或OX40特異性抗體對huOX40-Fc與OX40L結合的劑量依存抑制。
圖 7 ：顯示融合蛋白與PD-L1競爭結合PD-1，如 實例 10所述的競爭型ELISA研究中所述。使恆定濃度的huPD-1-His塗覆在微量滴定盤上，接著加入不同濃度的測試分子及固定濃度的示踪劑huPD-L1-Fc的混合物。使用HRP標記的抗IgG Fc抗體檢測結合的示踪劑。觀察到OX40及PD-L1雙特異性融合蛋白或PD-L1特異性抗體對huPD-L1-Fc與PD-1結合的劑量依存抑制。
圖 8 ：顯示代表性融合蛋白阻斷由PD-1/PD-L1相互作用媒介的抑制訊號的潛力，如 實例 11所述使用PD-1/PD-L1阻斷生物分析進行評估。在各種濃度的測試分子的存在下，使PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞(在NFAT啟動子控制下表現PD-1及NFAT媒介的螢光素酶基因的Jurkat細胞株)與PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞共同培養。在6小時之後，加入螢光素酶分析試劑，並測量發光訊號。背景訊號是僅與PD-L1 aAPC/CHO-K1細胞共同培養的PD-1-NFAT-luc Jurkat T細胞。SEQ ID NO: 82及79、78及87、88及79、89及79、93及90、及91及94的融合蛋白阻斷PD-1/PD-L1路徑，與SEQ ID NO: 78及79所示構築單元(building block)PD-L1抗體及SEQ ID NO: 43及44所示的參考PD-L1/OX40雙特異性融合蛋白相當。
圖 9 ：顯示代表性實驗的結果，其中研究所選融合蛋白誘導T細胞活化的能力。在實驗中，在1 ng/mL金黃色葡萄球菌B型腸毒素(SEB)的存在下，使人類周邊血液單核細胞(PBMC)與融合蛋白、抗體、脂質運載蛋白突變蛋白Fc融合、混合劑(cocktail)、或對照組一同培養。如 實例 12所述，藉由基於電化學發光的分析，測定反映T細胞活化的分泌的介白素2(IL-2)濃度，作為T細胞活化的讀數，並標準化為對應IgG4對照組的濃度。 A顯示，藉由IL-2的分泌所測定，所選的融合蛋白能夠較用於構築融合蛋白的PD-L1抗體誘導更強的T細胞活化。OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合不會誘導T細胞活化，其表明與PD-L1的結合為OX40簇集及OX40媒介的T細胞活化的必要條件。 B顯示，圖中所示的雙特異性融合蛋白較參考雙特異性融合蛋白、抗PD-L1/抗OX40抗體混合劑、及用於構築雙特異性融合的構築單元誘導更強的T細胞活化。
圖 10 ：顯示代表性融合蛋白在腫瘤細胞的存在下共同刺激T細胞活化的能力。使表現PD-L1的人類乳癌細胞MDA-MB-231接種到抗人類CD3塗覆的滴定盤中。加入Pan T細胞及各種濃度的融合蛋白及單一構築單元，並培養3天。如 實例 13所述，藉由基於電化學發光的分析來測定分泌的IL-2的濃度。 A顯示，以脂質運載蛋白突變蛋白構築的雙特異性融合蛋白及參考雙特異性會誘導劑量依存T細胞活化。在此實驗設置中，抗體構築單元不會誘導T細胞活化。 B顯示，如藉由IL-2的分泌所測量的，代表性融合蛋白會誘導強T細胞活化，而此雙特異性融合蛋白的構築單元的單獨或組合或抗PD-L1及抗OX40抗體的混合劑都不會誘導T細胞活化。
圖 11 ：證明代表性融合蛋白在PD-L1的存在下共同刺激T細胞活化的能力。使PD-L1抗體構築單元、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白的Fc融合、及參考雙特異性抗體進行平行測試。經人類PD-L1轉染( A)或經模擬轉染(人類PD-L1陰性( B)的CHO細胞接種到抗人類抗CD3塗覆的滴定盤中。加入Pan T細胞以及各種濃度的測試分子，並培養3天。如 實例 14所述，藉由基於電化學發光的分析來測定上清液中分泌的IL-2的濃度。融合蛋白僅在PD-L1的存在下才會誘導IL-2分泌的強劑量依存增加。
圖 12 ：顯示代表性融合蛋白在人類原代免疫細胞表現的PD-L1的存在下刺激人類T細胞的能力。使PD-L1構築單元(SEQ ID NO: 78及79)，OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO: 42)的Fc融合、參考抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)、參考雙特異性(SEQ ID NO: 43及44)、及參考OX40促效劑抗體(SEQ ID NO: 25及26)進行平行測試。人類單核細胞衍生的樹突細胞與人類原代CD4 T細胞在單向混合淋巴細胞反應中共同培養。加入指定濃度的測試分子，並培養6天。如 實例 15所述，藉由基於發光的分析來測量分泌的IL-2( A)及干擾素γ(IFNg)( B)的濃度。融合蛋白誘導IFNg及IL-2兩者的劑量依存分泌。
圖 13 ：證明代表性融合蛋白在人類原代免疫細胞表現的PD-L1的存在下刺激人類CD3 T細胞的能力。使PD-L1構築單元(SEQ ID NO: 78及79)及串聯脂質運載蛋白-Fc融合(SEQ ID NO: 92)進行平行測試。人類單核細胞衍生的樹突細胞與人類原代CD3 T細胞在單向混合淋巴細胞反應中共同培養。加入測試分子並以10 μg/ml的固定濃度培養6天。藉由基於發光的分析來測量分泌的IL-2、IFNg、IL-13、顆粒酶A、顆粒酶B及Fas配體的濃度。數據證明融合蛋白誘導IL-2、IL-13、顆粒酶A及顆粒酶B的分泌濃度高於構築單元。
圖 14 ：提供SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79、SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 93及90與SEQ ID NO: 91及94的雙特異性融合蛋白、參考雙特異性抗體(SEQ ID NO: 43及44)及構築單元PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)在小鼠中的藥物動力學分析的結果，如 實例 17所述。以2 mg/kg的劑量向CD-1 NUDE小鼠或雄性CD-1小鼠(每個時間點3隻小鼠)靜脈注射融合蛋白。使用三明治法ECL(Sandwich ECL)分析藥物濃度，經由標靶PD-L1及OX40或脂質運載蛋白支架檢測來檢測完整分子。使用三明治法ECL分析，以標靶PD-L1及人類Fc來測定抗PD-L1抗體血漿濃度。數據證明融合蛋白在小鼠體內具有長的、類抗體的終端半衰期。
圖 15 ：提供雙特異性融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 78及87與SEQ ID NO: 88及79)及構築單元PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)在食蟹獼猴中的藥物動力學分析的結果，如 實例 18所述。以7.6–10 mg/kg的劑量向食蟹獼猴(每個時間點1–2隻猴子)靜脈注射測試分子。在指定的時間點，在Gyrolab xP系統中使用三明治格式檢測藥物濃度。數據繪製在時間相對濃度圖中。PK曲線受抗藥物抗體(ADA)形成的影響，根據融合蛋白的不同，ADA的形成會導致96小時到168小時後的暴露減少。在不受ADA影響的時間點，血漿濃度與抗PD-L1抗體相當。
圖 16 ：提供在熱應力之前(黑色跡線)、在40°C下1周之後(藍色跡線)、及在40°C下2周之後(粉紅色跡線)示例性融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)的SEC層析圖，如 實例 20所述。
圖 17 ：提供示例性融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)的icIEF電泳圖，如 實例 21所述。
圖 18:提供在分析中以融合蛋白(SEQ ID NO: 82及79)、OX40特異性脂質運載蛋白突變蛋白(SEQ ID NO: 42)的Fc融合、抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 78及79)、或hIgG4同型對照組抗體(SEQ ID NO: 21及22)獲得的結果，如 實例 22所述。 圖 18A提供關於逆轉Treg細胞對CD4 Tresp細胞的抑制的結果。人類Tresp CD4 T細胞以不同比率與誘導性Treg(iTreg)一同培養。使固定濃度為200 nM的測試分子預塗覆在塑膠上以確保交聯，並在iTreg及Tresp的混合物的存在下培養4天。在第4天使Tresp的增殖定量為CFSE陰性細胞百分比，並使數據表示為增殖抑制相對於單獨Tresp的對照組。 圖 18B提供在與測試項目培養4天之後，藉由流式細胞術對CD4 Tresp上的CD25表現定量的結果。
圖 19 ：描述在施用PBS溶液(白色圓圈)、20 mg/kg融合蛋白(SEQ ID NO: 101及102)(黑色圓圈)、15.4 mg/kg抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)(等莫耳劑量的融合蛋白)(灰色圓圈)、及7.7 mg/kg抗OX40抗體(SEQ ID NO: 25及26)(黑色三角形)之後每組小鼠在不同時間的中位數腫瘤體積。數據表示為中位數+/-IQR(四分位距)。當老鼠少於100%但超過50%的初始小隊時，會繪製虛線。
圖 20 ：顯示藉由ELISA在KLH模型的小鼠血漿上定量抗KLH IgG( 圖 20A)及抗KLH IgM( 圖 20B)的散點圖。以白色圓圈表示PBS組，以灰色圓圈表示抗PD-L1抗體(SEQ ID NO: 80及81)組，且以黑色圓圈表示融合蛋白(SEQ ID NO: 101及102)組。以幾何平均數+/-SD表示數據。** p＜0.01**** p＜0.0001。使用Dunnett調整法對對數轉換數據進行雙因子變異數分析。
無
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Claims (41)

  1. 一種能夠結合OX40及PD-L1兩者之融合蛋白，其中該融合蛋白包含任何順序的至少兩個次單元，其中第一次單元包含對PD-L1具有特異性的抗體或其抗原結合結構域，且其中第二次單元包含對OX40具有特異性的脂質運載蛋白突變蛋白。
  2. 如請求項1之融合蛋白，其進一步包含第三次單元，該第三次單元包含對OX40具有特異性的脂質運載蛋白突變蛋白。
  3. 如請求項1或2之融合蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列在對應於成熟hNGAL(SEQ ID NO: 1)的線性多肽序列的位置25、28、36、40、41、44、49、50、52、59、62、63、65、68、70、72、73、75、77、78、79、80、81、82、82、83、87、93、96、100、103、106、114、118、125、127、129、132、134、143及164的位置處包含十個或更多個以下突變胺基酸殘基：Asn 25 → Ser；Gln 28 → His；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Trp或Arg；Glu 44 → Gly；Gln 49 → Gly；Lys 50 → Glu或Thr；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Lys 62 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Arg或Pro；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Lys 75 → Glu；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Ile 80 → Thr；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Phe 83 → Leu；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp；Asn 114 → Asp；His 118 → Tyr；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Asn 129 → Asp；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；Glu 143 → Ala；以及Asn 164 → Asp。
  4. 如請求項1到3中任一項之融合蛋白，其中與成熟hNGAL(SEQ ID NO: 1)的線性多肽序列相比，該脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列包含以下突變胺基酸殘基集合的一者： (a)    Gln 28 → His；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Trp；Glu 44 → Gly；Gln 49 → Gly；Lys 50 → Thr；Tyr 52 → Gln；Tyr 62 → Arg；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Lys 75 → Glu；Asp 77 → His；Trp 79 → Asp；Ile 80 → Thr；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Phe 83 → Leu；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp；Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Tyr； (b)    Gln 28 → His；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Trp；Gln 49 → Gly；Lys 50 → Glu；Tyr 52 → Gln；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Arg；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Lys 75 → Glu；Asp 77 → His；Trp 79 → Asp；Ile 80 → Thr；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp；Asn 114 → Asp；His 118 → Tyr；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Asn 129 → Asp；Tyr 132 → Trp；以及Lys 134 → Tyr； (c)     Asn 25 → Ser；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Gly；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Pro；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp；Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；Glu 143 → Ala；以及Gln 164 → Asp； (d)    Asn 25 → Ser；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Gly；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp； Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；Glu 143 → Ala；以及Gln 164 → Asp； (e)     Asn 25 → Ser；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Gly；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp； Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；以及Gln 164 → Asp； (f)     Asn 25 → Ser；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Gly；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Ile 80 → Thr；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp； Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；以及Gln 164 → Asp；或 (g)    Asn 25 → Ser；Leu 36 → Phe；Ala 40 → Tyr；Ile 41 → Arg；Gln 49 → Gly；Tyr 52 → Gln；Lys 59 → Arg；Ser 63 → Ala；Asn 65 → Gln；Ser 68 → Gly；Leu 70 → Pro；Arg 72 → Pro；Lys 73 → His；Asp 77 → His；Tyr 78 → Asp；Trp 79 → Asp；Ile 80 → Thr；Arg 81 → Val；Thr 82 → Ile；Cys 87 → Ser；Thr 93 → Ile；Asn 96 → Trp；Tyr 100 → Asp；Leu 103 → Ile；Tyr 106 → Asp； Asn 114 → Asp；Lys 125 → Trp；Ser 127 → Phe；Tyr 132 → Trp；Lys 134 → Tyr；以及Gln 164 → Asp。
  5. 如請求項1到4中任一項之融合蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 33–36及95–97所組成之群的胺基酸序列具有至少85%的序列一致性。
  6. 如請求項1到5中任一項之融合蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 33–36及95–97所組成之群的胺基酸序列具有至少90%的序列一致性。
  7. 如請求項1到6中任一項之融合蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 33–36及95–97所組成之群的胺基酸序列具有至少95%的序列一致性。
  8. 如請求項1到7中任一項之融合蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 33–36及95–97所組成之群的胺基酸序列具有至少99%的序列一致性。
  9. 如請求項1到8中任一項之融合蛋白，其中該脂質運載蛋白突變蛋白的胺基酸序列包含選自由SEQ ID NO: 33–36及95–97所組成之群的胺基酸序列或其片段或變異。
  10. 如請求項1到9中任一項之融合蛋白，其中一個次單元經由連接子連接到另一次單元。
  11. 如請求項1到10中任一項之融合蛋白，其中該第二次單元在N-末端經由連接子連接到該第一次單元的每個重鏈恆定區(CH)的N-末端或C-末端或該第一次單元的每個輕鏈恆定區(CL)的N-末端或C-末端。
  12. 如請求項1到11中任一項之融合蛋白，其中該第三次單元在N-末端經由連接子連接到該第一次單元的每個重鏈恆定區(CH)的N-末端或C-末端、該第一次單元的每個輕鏈恆定區(CL)的N-末端或C-末端、或每個第二次單元的C-末端。
  13. 如請求項10到12中任一項之融合蛋白，其中該連接子為(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 3連接子(SEQ ID NO: 10)。
  14. 如請求項10到12中任一項之融合蛋白，其中該連接子為非結構化甘胺酸-絲胺酸連接子、聚脯胺酸連接子、脯胺酸-丙胺酸-絲胺酸聚合物、或選自由SEQ ID NO: 10–20組成之群的連接子。
  15. 如請求項1到14中任一項之融合蛋白，其中抗體包含以下CDR序列集合的一者： (a)    GFSLSNYD (HCDR1，SEQ ID NO: 45)、IWTGGAT (HCDR2，SEQ ID NO: 46)、VRDSNYRYDEPFTY (HCDR3；SEQ ID NO: 47)、QSIGTN (LCDR1，SEQ ID NO: 48)、YAS (LCDR2)、QQSNSWPYT (LCDR3；SEQ ID NO: 49)； (b)    GFDIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 50)、IDPADGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 51)、ARGLGAWFAS (HCDR3；SEQ ID NO: 52)、QDITNS (LCDR1，SEQ ID NO: 53)、YTS (LCDR2)、QQGHTLPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 54)；以及 (c)     GFNIKDTY (HCDR1，SEQ ID NO: 55)、IDPANGNT (HCDR2，SEQ ID NO: 56)、SRGPPGGIGEYIYAMDY (HCDR3；SEQ ID NO: 57)；SSVSSSY (LCDR1，SEQ ID NO: 58)、STS (LCDR2)、HQYHRSPPT (LCDR3；SEQ ID NO: 59)； (d)    GFTFSDSW (HCDR1，SEQ ID NO: 60)、ISPYGGST (HCDR2，SEQ ID NO: 61)、ARRHWPGGFDY (HCDR3；SEQ ID NO: 62)；QDVSTA (LCDR1，SEQ ID NO: 63)、SAS (LCDR2)、QQYLYHPAT (LCDR3；SEQ ID NO: 64)。
  16. 如請求項1到15中任一項之融合蛋白，其中該抗體的重鏈包含以下CDR序列集合：GFSLSNYD(HCDR1，SEQ ID NO: 45)、IWTGGAT(HCDR2，SEQ ID NO: 46)，及VRDSNYRYDEPFTY(HCDR3；SEQ ID NO: 47)，且該抗體的輕鏈包含以下CDR序列集合：QSIGTN(LCDR1，SEQ ID NO: 48)、YAS(LCDR2)，及QQSNSWPYT(LCDR3；SEQ ID NO: 49)。
  17. 如請求項1到16中任一項之融合蛋白，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 65及71、SEQ ID NO: 66及72、SEQ ID NO: 67及73、SEQ ID NO: 68及74、SEQ ID NO: 69及75或SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少90%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。
  18. 如請求項1到17中任一項之融合蛋白，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 65及71、SEQ ID NO: 66及72、SEQ ID NO: 67及73、SEQ ID NO: 68及74、SEQ ID NO: 69及75或SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少95%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。
  19. 如請求項1到18中任一項之融合蛋白，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 65及71、SEQ ID NO: 66及72、SEQ ID NO: 67及73、SEQ ID NO: 68及74、SEQ ID NO: 69及75或SEQ ID NO: 70及76中所示的序列具有至少99%序列一致性的重鏈可變區及輕鏈可變區。
  20. 如請求項1到19任一項之融合蛋白，其中該抗體分別包含如下的重鏈可變區及輕鏈可變區：SEQ ID NO: 65及71、SEQ ID NO: 66及72、SEQ ID NO: 67及73、SEQ ID NO: 68及74、SEQ ID NO: 69及75或SEQ ID NO: 70及76。
  21. 如請求項1到20中任一項之融合蛋白，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 77及79、SEQ ID NO: 78及79或SEQ ID NO: 80及81中所示的序列具有至少90%序列一致性的重鏈區及輕鏈區。
  22. 如請求項1到21中任一項之融合蛋白，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 77及79、SEQ ID NO: 78及79或SEQ ID NO: 80及81中所示的序列具有至少95%序列一致性的重鏈區及輕鏈區。
  23. 如請求項1到22中任一項之融合蛋白，其中該抗體包含與SEQ ID NO: 77及79、SEQ ID NO: 78及79或SEQ ID NO: 80及81中所示的序列具有至少99%序列一致性的重鏈區及輕鏈區。
  24. 如請求項1到23任一項之融合蛋白，其中該抗體分別包含如下的重鏈及輕鏈：SEQ ID NO: 77及79、SEQ ID NO: 78及79或SEQ ID NO: 80及81。
  25. 如請求項1到24中任一項之融合蛋白，其中該抗體具有IgG4骨架。
  26. 如請求項25之融合蛋白，其中該IgG4骨架具有一或多個以下突變：S228P、N297A、F234A、L235A、M428L、N434S、M252Y、S254T及T256E。
  27. 如請求項1到26中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 82–91中任一項所示的胺基酸序列，或其中該融合蛋白包含與SEQ ID NO: 82–91中任一項所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%或更高序列一致性的胺基酸序列。
  28. 如請求項1到27中任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含與SEQ ID NO: 78及87、SEQ ID NO: 88及79、SEQ ID NO: 89及79、SEQ ID NO: 82及79、SEQ ID NO: 93及90或SEQ ID NO: 91及94中所示的胺基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%或更高序列一致性的胺基酸序列。
  29. 如請求項1到28任一項之融合蛋白，其中該融合蛋白包含SEQ ID NO: 78及87中所示的胺基酸序列、SEQ ID NO: 88及79中所示的胺基酸序列、SEQ ID NO: 89及79中所示的胺基酸序列、SEQ ID NO: 82及79中所示的胺基酸序列、SEQ ID NO: 93及90中所示的胺基酸序列或SEQ ID NO: 91及94中所示的胺基酸序列。
  30. 一種核酸分子，其包含編碼如請求項1到29中任一項的融合蛋白的核苷酸序列。
  31. 如請求項30之核酸分子，其中該核酸分子可操作地連接到調控序列以使該核酸分子表現。
  32. 如請求項30或31之核酸分子，其中該核酸分子包含在載體或噬菌體質體(phagemid)載體中。
  33. 一種宿主細胞，其含有如請求項30到32中任一項的核酸分子。
  34. 一種製造如請求項1到29中任一項的融合蛋白之方法，其中該融合蛋白從編碼該融合蛋白的核酸開始製造。
  35. 如請求項34之方法，其中該融合蛋白在細菌或真核宿主生物體中製造，並從該宿主生物體或其培養物中分離。
  36. 一種醫藥組合物，其包含如一或多個如請求項1到29中任一項的融合蛋白。
  37. 一種治療癌症之方法，其包含向個體施用如請求項1到29中任一項的融合蛋白或一或多個包含此類融合蛋白的組合物。
  38. 一種如請求項1到29中任一項之融合蛋白，其用途為治療。
  39. 如請求項38之用於該用途之融合蛋白，其中該用途為治療癌症。
  40. 一種如請求項1到29中任一項之融合蛋白之用途，其係用於製造藥劑。
  41. 如請求項40之用途，其中該藥劑用於治療癌症。
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