TWI732760B - 抗ｏｘ４０抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供結合至OX40之抗體或其抗原結合部分。亦提供該等蛋白質於治療應用，如：於癌症之治療中之用途。進一步提供產生該等抗體之細胞、編碼該等抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之聚核苷酸及包含編碼該等抗體之重鏈及/或輕鏈可變區之該等聚核苷酸的載體。

Description

抗OX40抗體及其用途
OX40(TNFRSF4)(亦稱作ACT35、IMD16、TXGP1L及CD134)係在活化CD4+ T細胞上表現之共刺激受體之TNFSFR家族中之50-kD I型跨膜醣蛋白。在癌症情形下，在腫瘤浸潤淋巴球中發現表現OX40之活化T細胞。OX40及其配體OX40-L在誘導及維持T細胞反應中起關鍵作用。最近研究已展示，採用增強抗腫瘤T細胞功能以抵抗癌症，其中有效反應之關鍵組份包括CD4+ T細胞之活化及經由記憶體及效應物T細胞促進存活信號。鑒於持續需要經由(例如)增強免疫反應(例如T細胞反應)治療疾病(例如癌症)之改良策略，調節T細胞反應之新穎藥劑(例如靶向OX40之彼等)以及使用該等藥劑之療法(例如，組合療法)可為治療有益的。
本文提供特異性結合OX40且具有合意功能性質之抗體，例如人類單株抗體。該等性質包括結合至人類OX40及食蟹猴OX40之高親和力及(例如)在帶有腫瘤之個體中刺激抗原特異性T細胞反應。本文亦提供檢測試樣中之OX40之方法。
在一個態樣中，本文提供抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至OX40且展現以下性質中之至少一者：(1)如(例如)藉由Biacore所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類OX40； (2)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類OX40；(3)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴OX40，例如結合至膜結合之食蟹猴OX40；(4)誘導或增強T細胞活化，如藉由以下所證明：(i)表現OX40之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖；(5)(例如)在利用hOX40-293細胞之分析中如藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小之EC50抑制OX40配體與OX40結合；(6)結合至成熟人類OX40之細胞外部分上之表位(SEQ ID NO：2)，例如，在區DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)內之表位；(7)與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1競爭結合至人類OX40；(8)與6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2競爭結合至人類OX40。
在某些實施例中，本文所述抗OX40抗體或其抗原結合部分刺激抗腫瘤免疫反應，例如抗原特異性T細胞反應。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部分增加表現OX40之T細胞中之細胞介素產生(例如，IL-2及/或IFN-γ)及/或增加T細胞增殖。在某些實施例中，抗體結合至人類補體之C1q組份。在某些實施例中，抗體誘導NK細胞介導之活化CD4+ T細胞溶解。在某些實施例中，抗體促進巨噬細胞介導之表現OX40之細胞之吞噬作用。在某些實施例中，抗體抑制調控性T細胞介導之CD4+ T細胞增殖之抑制。
在某些實施例中，抗OX40抗體或其抗原結合部分結合至Fc受體，例如一或多種活化FcγR。在某些實施例中，抗體或其抗原結合部 分經由多價交聯誘導或增強T細胞活化。
本文提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至OX40且包含呈選自以下之可變重鏈及可變輕鏈對之三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR：SEQ ID NO：318及94；SEQ ID NO：17及18；28及29；28及30；37及38；48及49；48及50；57及58；65及66；73及74；84及85；84及86；93及94。
本文亦提供單株抗體或其抗原結合部分，其結合至OX40且包含：(a)分別包含SEQ ID NO：87、317及89之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：90-92之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別包含SEQ ID NO：11-13之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：14-16之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(c)分別包含SEQ ID NO：19-21之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：22-24之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(d)分別包含SEQ ID NO：19-21之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：25-27之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(e)分別包含SEQ ID NO：31-33之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：34-36之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(f)分別包含SEQ ID NO：39-41之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：42-44之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列； (g)分別包含SEQ ID NO：39-41之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：45-47之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(h)分別包含SEQ ID NO：51-53之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：54-56之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(i)分別包含SEQ ID NO：59-61之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：62-64之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(j)分別包含SEQ ID NO：67-69之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：70-72之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(k)分別包含SEQ ID NO：75-77之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：78-80之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(l)分別包含SEQ ID NO：75-77之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：81-83之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；或(m)分別包含SEQ ID NO：87-89之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及分別包含SEQ ID NO：90-92之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
本文提供結合至OX40且包含重鏈及輕鏈可變區之單株抗體或其抗原結合部分，其中該重鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：318、17、28、37、48、57、65、73、84及93。
本文提供結合至OX40且包含重鏈及輕鏈可變區之經分離單株抗 體或其抗原結合部分，其中該輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：94、18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94。
本文提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至OX40且包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少85%一致、例如90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈及輕鏈可變區序列：SEQ ID NO：318及94；17及18；28及29；28及30；37及38；48及49；48及50；57及58；65及66；73及74；84及85；84及86；93及94。
本文提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至OX40且包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%99%或100%一致的重鏈及輕鏈序列：SEQ ID NO：124及116；95及96；97及98；99及100；101及102；103及104；105及106；107及108；109及110；111及112；113及114；115及116；117及118；119及120；121及122；123及116；124及116；及125及116。
在某些實施例中，經分離單株抗體或其抗原結合部分(a)結合至OX40上與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3或20C1相同之表位，或結合至OX40上與6E1-1、6E1-2、14A2-1或14A2-2相同之表位，及(b)將3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1與OX40在活化T細胞上之結合抑制至少50%、60%、70%、80%或90%，如(例如)藉由FACS所量測。
在某些實施例中，抗OX40抗體或其抗原結合部分在人類OX40之成熟細胞外部分(SEQ ID NO：2)之區域DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)或 DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)內結合。在一些實施例中，本文所述抗OX40抗體或其抗原結合部分結合至人類及食蟹猴OX40二者。在一些實施例中，本文所述抗OX40抗體或其抗原結合部分不結合至小鼠及/或大鼠OX40。
在某些實施例中，抗OX40抗體或其抗原結合部分係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體或其變體。在某些實施例中，抗OX40抗體或其抗原結合部分之CDR區中之甲硫胺酸殘基取代不會經歷氧化之胺基酸殘基。在某些實施例中，抗OX40抗體或其抗原結合部分係人類或人類化抗體。在某些實施例中，抗OX40抗體包含具有與增強之活化FcγR之結合之Fc。
本文提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至OX40且包括包含IgG2鉸鏈及不屬IgG2同型之CH1、CH2及CH3中之至少一者之經修飾重鏈恆定區。
在某些實施例中，重鏈包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125，或與SEQ ID NO：95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125之胺基酸序列至多10個胺基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈。
在某些實施例中，輕鏈包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122，或與SEQ ID NO：96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122之胺基酸序列至多10個胺基酸不同或至少95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈。
在某些實施例中，抗OX40抗體或其抗原結合部分係非免疫原 性。
在某些實施例中，抗OX40抗體或其抗原結合部分無經歷異構化之胺基酸序列。例如，若抗體之重鏈及/或輕鏈CDR序列中存在胺基酸序列Asp-Gly，則該序列經不會經歷異構化之胺基酸序列取代。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：76中所述之重鏈可變區CDR2序列，但其中Asp-Gly序列(LISY DG SRKHYADSVKG；SEQ ID NO：76)中之Asp或Gly經不會經歷異構化之胺基酸序列置換，例如Asp-Ser或Ser-Gly序列。在另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO：88中所述之重鏈可變區CDR2序列，但其中Asp-Gly序列(AIDT DG GTFYADSVRG；SEQ ID NO：88)中之Asp或Gly經不會經歷異構化之胺基酸序列置換，例如Ser-Gly、Asp-Ala或Ser-Thr序列。
本文提供結合至OX40且包含選自由SEQ ID NO：282-296組成之群之胺基酸的抗體。在一個實施例中，抗體包含由選自由SEQ ID NO：282-296組成之群之胺基酸序列組成的重鏈。
本文提供包含連接至具有第二結合特異性之分子之抗OX40抗體的雙特異性分子。
本文提供編碼抗OX40抗體或其抗原結合部分之重鏈及/或輕鏈可變區之核酸、包含核酸分子之表現載體及經表現載體轉化之細胞。
本文提供包含連接至藥劑之本文所述抗OX40抗體的免疫偶聯物。
本文提供包含抗OX40抗體或其抗原結合部分及載劑之組合物。
本文提供包含抗OX40抗體或其抗原結合部分及使用說明書之套組。在某些實施例中，套組進一步包含抗CTLA4抗體、抗PD-1或抗PD-L1抗體。
本文提供製備抗OX40抗體之方法，其包含使抗OX40抗體在細胞中表現並自細胞分離該抗體。
本文提供刺激抗原特異性T細胞反應之方法，其包含使T細胞與抗OX40抗體或其抗原結合部分接觸，使得刺激抗原特異性T細胞反應。
本文提供活化或共刺激T細胞(例如效應物T細胞)之方法，其包含使細胞(例如效應物T細胞)與抗OX40抗體或其抗原結合部分及CD3接觸，其中活化或共刺激效應物T細胞。
本文提供增加T細胞中之IL-2及/或IFN-γ產生及/或T細胞之增殖的方法，其包含使T細胞與有效量之抗OX40抗體或其抗原結合部分接觸。
本文提供增加個體中T細胞中之IL-2及/或IFN-γ產生之方法，其包含投與有效量之抗OX40抗體或其抗原結合部分、包含抗OX40抗體之雙特異性分子或偶聯物或包含抗OX40抗體之組合物，以增加自T細胞之IL-2及/或IFN-γ產生。
本文提供減少或耗盡有需要之個體之腫瘤中T調控性細胞之數目的方法，其包含投與有效量之抗OX40抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或偶聯物以減少腫瘤中T調控性細胞之數目，其中抗體或其抗原結合部分具有效應物或增強效應物功能。
本文提供刺激個體中免疫反應之方法，其包含向個體投與有效量之抗OX40抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或偶聯物，使得刺激個體中之免疫反應。在某些實施例中，個體具有腫瘤且刺激抵抗腫瘤之免疫反應。
本文提供抑制個體中腫瘤細胞生長之方法，其包含向個體投與抗OX40抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或偶聯物，使得抑制個體中腫瘤之生長。
本文提供藉由(例如)免疫療法治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之抗OX40抗體或其抗原結合部分、包含抗 OX40抗體之雙特異性分子或偶聯物或包含抗OX40抗體之組合物以治療癌症。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、子宮/子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食管癌、胃腸癌、胰臟癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經系統之贅瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相關癌症。在某些實施例中，癌症係轉移性癌症、難治性癌症或復發性癌症。
在某些實施例中，本文所述方法進一步包含投與一或多種其他治療劑與抗OX40抗體(例如抗PD1抗體、LAG-3抗體、CTLA-4抗體及/或PD-L1抗體)。
本文提供檢測試樣中OX40之存在之方法，其包含在容許在抗體或其抗原結合部分與OX40之間形成複合物之條件下使試樣與抗OX40抗體或其抗原結合部分接觸及檢測複合物之形成。
本文提供本文所述抗OX40抗體之用途，其用於治療癌症、刺激個體中之免疫反應、刺激抗原特異性T細胞反應、活化或共刺激T細胞、增加T細胞中之細胞介素(例如IL-2及/或IFN-γ)產生及/或T細胞之增殖、減少或耗盡腫瘤中T調控性細胞之數目及/或抑制腫瘤細胞生長。本文亦提供本文所述抗OX40抗體之用途，其用於製備用於刺激個體中之免疫反應、刺激抗原特異性T細胞反應、活化或共刺激T細胞、增加T細胞中之IL-2及/或IFN-γ產生及/或T細胞之增殖、減少或耗盡腫瘤中T調控性細胞之數目及/或抑制腫瘤細胞生長的藥劑。
本文提供治療人類個體之實體腫瘤之方法，該方法包含向個體投與有效量之抗OX40抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO：318中所述之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有SEQ ID NO：94中所述之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，其中該方法包含至少一個投藥週期，其中該週期係2週之時段，其中 對於至少一個週期中之每一者，抗OX40抗體之一個劑量係以1mg/kg體重之劑量、20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量、約1mg/kg體重之劑量或約20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量投與。
在一個實施例中，該方法進一步包含投與抗PD-1抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO：301中所述之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有SEQ ID NO：302中所述之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，其中該方法包含至少一個投藥週期，其中該週期係2、3或4週之時段，其中對於至少一個週期中之每一者，抗OX40抗體之一個劑量係以1mg/kg體重之劑量、20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量、約1mg/kg體重之劑量、或約20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量投與，且抗PD-1抗體之一個劑量係以240mg、360mg或480mg之劑量或約240mg、360mg或480mg之劑量投與。
在另一實施例中，該方法進一步包含投與抗CTLA-4抗體，該抗體包含具有SEQ ID NO：309中所述之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有SEQ ID NO：310中所述之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，其中該方法包含至少一個投藥週期，其中該週期係3週之時段，其中對於至少一個週期中之每一者，抗OX40抗體之一個劑量係以1mg/kg體重之劑量、20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量、約1mg/kg體重之劑量、或約20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量投與，且抗CTLA-4抗體之一個劑量係以1mg/kg之劑量或約1mg/kg之劑量投與。
其中抗OX40抗體係與抗CTLA-4抗體一起投與至少一個週期，之後投與抗OX40抗體單一療法至少一個週期。在一些實施例中，治療由8個週期組成。在一個實施例中，抗OX40抗體係與抗CTLA-4抗體 一起投與前4個週期，之後投與抗OX40抗體單一療法後4個週期。
在一些實施例中，抗OX40抗體包含分別SEQ ID NO：124及116中所述之重鏈及輕鏈序列。
在某些實施例中，抗OX40抗體或抗OX40抗體及抗PD-1或抗CTLA-4抗體經調配用於靜脈內投與。在一些實施例中，抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗體調配在一起。在其他實施例中，單獨調配抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗體。
在一些實施例中，治療由8個週期組成。在一個實施例中，在每一週期之第1天投與抗OX40抗體或抗OX40抗體及抗PD-1或抗CTLA-4抗體。
在某些實施例中，在投與抗PD-1或抗CTLA-4抗體之前投與抗OX40抗體。在一個實施例中，在投與抗PD-1或抗CTLA-4抗體之前之約30分鐘內投與抗OX40抗體。在其他實施例中，在投與抗PD-1或抗CTLA-4抗體之後投與抗OX40抗體。在其他實施例中，抗OX40抗體與抗PD-1或抗CTLA-4抗體並行投與。
在某些實施例中，治療產生至少一個選自以下之治療效應：腫瘤大小減小、轉移性病灶之數目隨時間減少、完全反應、部分反應及穩定疾病。在一些實施例中，腫瘤與選自由以下組成之群之癌症相關：子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌及卵巢癌。
自以下詳細說明及實例(其不應理解為具有限制性)將明瞭本發明之其他特徵及優點。
圖1A顯示3F4人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：126)及胺基酸序列(SEQ ID NO：17)。描繪CDR1(SEQ ID NO：11)、CDR2(SEQ ID NO：12)及CDR3(SEQ ID NO：13)區且指示V、D及J種系來源。
圖1B顯示3F4人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：127)及胺基酸序列(SEQ ID NO：18)。描繪CDR1(SEQ ID NO：14)、CDR2(SEQ ID NO：15)及CDR3(SEQ ID NO：16)區且指示V及J種系來源。
圖2A顯示14B6(14B6-1及14B6-2)人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：128)及胺基酸序列(SEQ ID NO：28)。描繪CDR1(SEQ ID NO：19)、CDR2(SEQ ID NO：20)及CDR3(SEQ ID NO：21)區且指示V、D及J種系來源。
圖2B顯示14B6-1人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：129)及胺基酸序列(SEQ ID NO：29)。描繪CDR1(SEQ ID NO：22)、CDR2(SEQ ID NO：23)及CDR3(SEQ ID NO：24)區且指示V及J種系來源。
圖2C顯示14B6-2人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：130)及胺基酸序列(SEQ ID NO：30)。描繪CDR1(SEQ ID NO：26)、CDR2(SEQ ID NO：27)及CDR3(SEQ ID NO：28)區且指示V及J種系來源。
圖3A顯示23H3人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：131)及胺基酸序列(SEQ ID NO：37)。描繪CDR1(SEQ ID NO：31)、CDR2(SEQ ID NO：32)及CDR3(SEQ ID NO：33)區且指示V、D及J種系來源。
圖3B顯示23H3人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：132)及胺基酸序列(SEQ ID NO：38)。描繪CDR1(SEQ ID NO：34)、CDR2(SEQ ID NO：35)及CDR3(SEQ ID NO：36)區且指示V及J種系來源。
圖4A顯示6E1(6E1-1及6E1-2)人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：133)及胺基酸序列(SEQ ID NO：48)。描繪CDR1 (SEQ ID NO：39)、CDR2(SEQ ID NO：40)及CDR3(SEQ ID NO：41)區且指示V、D及J種系來源。
圖4B顯示6E1-1人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：134)及胺基酸序列(SEQ ID NO：49)。描繪CDR1(SEQ ID NO：42)、CDR2(SEQ ID NO：43)及CDR3(SEQ ID NO：44)區且指示V及J種系來源。
圖4C顯示6E1-2人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：135)及胺基酸序列(SEQ ID NO：50)。描繪CDR1(SEQ ID NO：45)、CDR2(SEQ ID NO：46)及CDR3(SEQ ID NO：47)區且指示V及J種系來源。
圖5A顯示18E9人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：136)及胺基酸序列(SEQ ID NO：57)。描繪CDR1(SEQ ID NO：51)、CDR2(SEQ ID NO：52)及CDR3(SEQ ID NO：53)區且指示V、D及J種系來源。
圖5B顯示18E9人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：137)及胺基酸序列(SEQ ID NO：58)。描繪CDR1(SEQ ID NO：54)、CDR2(SEQ ID NO：55)及CDR3(SEQ ID NO：56)區且指示V及J種系來源。
圖6A顯示8B11人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：138)及胺基酸序列(SEQ ID NO：65)。描繪CDR1(SEQ ID NO：59)、CDR2(SEQ ID NO：60)及CDR3(SEQ ID NO：61)區且指示V、D及J種系來源。
圖6B顯示8B11人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：139)及胺基酸序列(SEQ ID NO：66)。描繪CDR1(SEQ ID NO：62)、CDR2(SEQ ID NO：63)及CDR3(SEQ ID NO：64)區且指示V及J種系來源。
圖7A顯示20B3人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：140)及胺基酸序列(SEQ ID NO：73)。描繪CDR1(SEQ ID NO：67)、CDR2(SEQ ID NO：68)及CDR3(SEQ ID NO：69)區且指示V、D及J種系來源。
圖7B顯示20B3人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：141)及胺基酸序列(SEQ ID NO：74)。描繪CDR1(SEQ ID NO：70)、CDR2(SEQ ID NO：71)及CDR3(SEQ ID NO：72)區且指示V及J種系來源。
圖8A顯示14A2(14A2-1及14A2-2)人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：142)及胺基酸序列(SEQ ID NO：84)。描繪CDR1(SEQ ID NO：75)、CDR2(SEQ ID NO：76)及CDR3(SEQ ID NO：77)區且指示V、D及J種系來源。
圖8B顯示14A2-1人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：143)及胺基酸序列(SEQ ID NO：85)。描繪CDR1(SEQ ID NO：78)、CDR2(SEQ ID NO：79)及CDR3(SEQ ID NO：80)區且指示V及J種系來源。
圖8C顯示14A2-2人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：144)及胺基酸序列(SEQ ID NO：86)。描繪CDR1(SEQ ID NO：81)、CDR2(SEQ ID NO：82)及CDR3(SEQ ID NO：83)區且指示V及J種系來源。
圖9A顯示20C1人類單株抗體之重鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：145)及胺基酸序列(SEQ ID NO：93)。描繪CDR1(SEQ ID NO：87)、CDR2(SEQ ID NO：88)及CDR3(SEQ ID NO：89)區且指示V、D及J種系來源。
圖9B顯示20C1人類單株抗體之κ輕鏈可變區之核苷酸序列(SEQ ID NO：146)及胺基酸序列(SEQ ID NO：94)。描繪CDR1(SEQ ID NO： 90)、CDR2(SEQ ID NO：91)及CDR3(SEQ ID NO：92)區且指示V及J種系來源。
圖10A顯示OX40.21人類單株抗體之重鏈之核苷酸序列(SEQ ID NO：176)及胺基酸序列(SEQ ID NO：124)。輕鏈之核苷酸序列(SEQ ID NO：168)及胺基酸序列(SEQ ID NO：116)示於圖10B中。
圖11A-11D顯示各種抗OX40抗體對於活化人類T細胞之結合曲線及EC50(nM)，其中hIgG1及二級抗體用作對照，如藉由FACS所評估。
圖12A-12C顯示各種抗OX40抗體對於活化食蟹猴T細胞之結合曲線及EC50(nM)，其中hIgG1及二級抗體用作對照，如藉由FACS所評估。
圖13A-13C顯示抗OX40抗體OX40.21對於活化人類T細胞、過表現人類OX40之HEK293細胞及過表現食蟹猴OX40之CHO細胞之結合曲線及KD，如藉由Scatchard分析所評估。
圖14A顯示各種丙酮固定之冷凍人類組織切片利用抗OX40抗體OX40.8、OX40.6及OX40.16之免疫組織學染色。影像顯示對於增生性扁桃腺於1μg/ml之抗體濃度下及對於其他組織於5μg/ml之抗體濃度下的代表性染色，只是心內膜及瓣膜中10μg/ml下之OX40.16除外。儘管所有三種抗體對於扁桃腺中之淋巴球之小亞組染色呈陽性，但OX40.8亦染色心臟中之肌絲樣結構且OX40.6染色扁桃腺及心臟中之心內膜及瓣膜中之小動脈中之心肌、內皮/內皮下膜基質。GC，生髮中心；MZ，外套層。
圖14B顯示各種丙酮固定之冷凍人類組織切片利用抗OX40抗體OX40.21(OX40.16之變體)之免疫染色。影像顯示5μg/ml之抗體濃度下之代表性染色。抗體對於扁桃腺及胸腺中之淋巴球之小亞組染色呈陽性。扁桃腺中之陽性細胞分佈在生髮中心、外套層及濾泡間細胞區 中，而胸腺中之陽性細胞主要定位於髓質中。在心臟、肝、腎及肺中未觀察到特異性染色。GC，生髮中心；Me，髓質；MZ，外套層。
圖15A顯示肝細胞癌(HCC)、結腸直腸癌(CRC)、頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)及黑色素瘤(Mel)中之OX40+腫瘤浸潤淋巴球之分佈。藉由在顯微鏡之20倍物鏡下估計陽性細胞之數目對於每一腫瘤類型之12至20個病例實施人工評分。最小值，<1個細胞/20倍物鏡視場；輕度，1至<10個細胞/20倍物鏡視場；中等，10至<50個細胞/20倍物鏡視場；顯著，50至<200個細胞/20倍物鏡；強烈，>200個細胞/20倍物鏡視場。
圖15B及15C顯示結腸直腸癌(CRC)及頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)試樣之毗鄰FFPE切片上之CD3、FoxP3及OX40的免疫組織學染色。圖15B係低功率視圖，其顯示OX40+及FoxP3+ TIL係CD3+ TIL之小部分且主要分佈於腫瘤間質中。圖15C係較高功率視圖，其顯示OX40+及FoxP3+(Treg)TIL於CRC中之潛在部分共定位。
圖16顯示各種抗OX40抗體抑制OX40配體(OX40-L)與人類OX40轉染之293細胞(「hOX40-293細胞」)結合之能力，其中hIgG1作為對照。
圖17概述各種抗OX40抗體之間之OX40-L阻斷關係。
圖18顯示各種抗OX40抗體抑制抗OX40抗體純系L106與hOX40-293細胞結合之能力，如藉由FACS所評估，其中僅PE標記之L106、PE標記之mIgG1及未染色之細胞作為對照。
圖19A-19C顯示各種抗OX40抗體抑制別藻藍蛋白(APC)偶聯之OX40.1抗體與hOX40-293(圖19A及19B)或hOX40-HT1080細胞(圖19C)結合之能力，如藉由FACS所評估。使用hIgG1及/或hIgG4作為對照。
圖19D-19G顯示各種抗OX40抗體抑制生物素偶聯之OX40.4或 OX40.5抗體與hOX40-293細胞結合之能力。使用hIgG1及鏈黴抗生物素蛋白-APC作為對照。
圖19H基於圖19A-19C中所示之結果概述關於OX40.1之表位框。
圖19I基於圖19D-19G中所示之結果概述關於OX40.5或OX40.4之表位框。
圖20A顯示OX40.21僅結合至非還原人類OX40，而與N-連接糖之存在無關。
圖20B及20C顯示在去糖基化後藉由肽定位鑑別之兩種N-醣肽：對於AspN118(圖20B)及AspN12(圖20C)二者皆為60%佔據率。
圖20D繪示由OX40.16、OX40.21及OX40.8結合之OX40中之區。
圖20E顯示藉由LC-MS之由OX40.16、OX40.21及OX40.8識別之肽的鑑別。
圖21A-21D顯示在與CHO-CD3-CD32A細胞共培養時各種抗OX40抗體對人類初代CD4+ T細胞增殖之效應。使用僅CHO細胞、僅T細胞、僅與T細胞共培養之CHO細胞及hIgG1作為對照。
圖22A-22D顯示各種抗OX40抗體對自與CHO-CD3-CD32A細胞共培養之人類初代CD4+ T細胞之干擾素γ(IFN-γ)分泌的效應。使用僅CHO細胞、僅T細胞、僅與T細胞共培養之CHO細胞及hIgG1作為對照。
圖23A-23F顯示各種抗OX40抗體對從自不同供體分離之葡萄球菌腸毒素B(SEB)活化之人類末梢血單核細胞(PBMC)之培養物中初代T細胞之IL-2分泌之刺激的效應。
圖24顯示各種抗OX40抗體對NK92細胞誘導之活化CD4+細胞之溶解的效應。
圖25A及25B顯示藉由NK：靶細胞比率之各種抗OX40抗體對初代NK細胞介導之自兩種供體分離之活化CD4+ T細胞之溶解的效應。
圖26顯示各種抗OX40抗體對hOX40-293細胞由初代人類巨噬細胞之吞噬作用的效應。
圖27顯示人類補體C1q組份與OX40.21之結合程度，使用IgG1及IgG1.1(無效應物)作為對照。
圖28A-28C顯示OX40在腫瘤浸潤淋巴球中表現，且型式通常限於CD4+細胞，且在CD8+細胞上表現最低。
圖28D顯示OX40由小鼠Sa1N腫瘤中之CD4+ T細胞及調控性T細胞表現。
圖28E顯示OX40由小鼠MC38腫瘤中之CD4+ T細胞、CD8+ T細胞及調控性T細胞表現。
圖29顯示各種抗OX40抗體逆轉調控性T(Treg)細胞介導之人類CD4+ T細胞之抑制的能力。在Treg細胞存在及不存在二者下，與IgG1同型對照相比，抗OX40抗體增加T反應(Tresp)細胞之增殖。
圖30A及30B顯示靜脈內投與之來自猴之OX40.6抗體的清除率。兩隻猴顯示加速清除率，其與抗藥物抗體之形成相關。
圖31係繪示各種抗OX40抗體、以及品質對照試樣QC-1、QC-2及QC-3之抗原性百分比的T細胞增殖結果。
圖32A-32C顯示MC38結腸腺癌模型中嵌合OX86抗體(具有OX86之大鼠可變區及小鼠恆定區且不阻斷OX40與OX40-L之間之相互作用之抗體，即非阻斷抗體)之不同同型對抗腫瘤活性的效應，該抗腫瘤活性藉由經該等同型(mIgG1及mIgG2同型)治療之個別小鼠中之腫瘤體積變化量測：(圖32A)對照小鼠IgG1抗體(「對照」)、(圖32B)OX86 mIgG1抗體(「OX-40 mIgG1」)、(圖32C)OX86 mIgG2抗體(「OX-40 mIgG2a」)。
圖33A-33C顯示OX86抗體之不同同型(mIgG1及mIgG2a)對腫瘤及末梢中CD4+調控性T細胞之數目及脾中之細胞數目的效應。
圖34A-34C顯示MC38結腸腺癌模型中具有人類IgG1之嵌合OX86抗體對抗腫瘤活性的效應，該抗腫瘤活性藉由經指示抗體治療之個別小鼠中之腫瘤體積變化量測：(圖34A)人類IgG1同型對照(「同型」)、(圖34B)OX86-hIgG1嵌合抗體(「OX86-hG1」)、(圖34C)OX86-hIgG1-S267E抗體(「OX86-hG1-S267E」)。hIgG1中之S267E取代藉由增加與FcR(CD32A及CD32B)之結合增加其效應物功能。OX86-hIgG1展現有效力抗腫瘤活性。
圖35A-35D顯示嵌合OX86 hIgG1抗體對調控性T細胞耗盡之效應。
圖36A-36E顯示皮下小鼠CT-26腫瘤模型中於不同劑量下阻斷(即，阻斷OX40與OX40配體之間之相互作用)倉鼠抗小鼠OX40抗體(8E5)對抗腫瘤活性的效應，該抗腫瘤活性藉由經指示抗體治療之個別小鼠中之腫瘤體積變化來量測。(圖36A)倉鼠Ig對照、(圖36B)8E5於10mg/kg下、(圖36C)8E5於3mg/kg下、(圖36D)8E5於1mg/kg下、(圖36E)8E5於0.3mg/kg下。
圖37A-37D顯示MC38結腸腺癌模型中具有OX86-rG1抗體及抗PD1抗體之組合療法對抗腫瘤活性的效應，該抗腫瘤活性藉由經指示抗體及組合治療之個別小鼠中之腫瘤體積變化來量測：(圖37A)同型對照、(圖37B)抗PD1抗體、(圖37C)OX86-rG1(「抗OX40」)、(圖36D)OX86-rG1+抗PD1抗體(「抗OX40+抗PD1」)。
圖38A及38B分別顯示在第22及41天時對KLH、CD69+表現CD4+CD8- T細胞之離體回憶反應。在研究第1天時利用KLH對動物進行免疫。數據點代表作為CD4+CD8- T細胞之百分比之個別動物(雄性及雌性)結果。水平條代表組平均值。
圖39顯示結合至抗his Fab捕獲之FcγR-his蛋白質之抗體。假定1：1 mAb：FcγR結合化學計量，將結合反應繪製為理論Rmax之百分比。每 一抗體之條係以載玻片底部處彩色代號提供之順序顯示。
圖40顯示結合至抗his Fab捕獲之FcgR-his蛋白質之抗體。假定1：1 mAb：FcγR結合化學計量，將結合反應繪製為理論Rmax之百分比。每一抗體之條係以載玻片底部處彩色代號提供之順序顯示。
圖41A-41D顯示CT26結腸腺癌模型中與激動性抗OX40抗體(OX86-rG1)及抗CTLA-4抗體(9D9-mG2b)對抗腫瘤活性之組合療法，該抗腫瘤活性藉由經指示抗體及組合治療之個別小鼠中之腫瘤體積變化來量測：(圖41A)同型對照、(圖41B)抗CTLA-4抗體、(圖41C)OX86-rG1、(圖41D)OX86-rG1+抗CTLA-4抗體。
圖42係1/2a期臨床試驗方案之示意圖。
圖43係1/2a期臨床試驗之研究拜訪排程表的示意圖。
本文闡述特異性結合至OX40且藉此活化下游OX40信號傳導之經分離抗體，具體而言單株抗體，例如人類單株抗體(「激動劑抗OX40抗體」)。在某些實施例中，本文所述抗體之特徵在於特定功能特徵及/或包含特定結構特徵，例如包含具體胺基酸序列之CDR區。本文提供經分離抗體、製備該等抗OX40抗體之方法、包含該等抗體之免疫偶聯物及雙特異性分子及經調配以含有該等抗體之醫藥組合物。本文亦提供單獨或與其他免疫刺激劑(例如，抗體)及/或癌症療法組合使用該等抗體用於免疫反應增強之方法。因此，本文所述抗OX40抗體可用於多種治療應用中之治療，包括(例如)抑制腫瘤生長及治療病毒感染。
定義
為了更容易瞭解本說明，首先定義某些術語。其他定義在整個詳細說明中進行闡釋。
如本文所用術語「OX40」係指作為TNF-受體超家族之成員之受 體，其結合至OX40配體(OX40-L)。OX40亦稱作腫瘤壞死因子受體超家族成員4(TNFRSF4)、ACT35、IMD16、TXGP1L及CD 134。術語「OX40」包括OX40之任何變體或同種型，其由細胞天然表現。因此，本文所述抗體可與來自除人類外之物種之OX40(例如，食蟹猴OX40)交叉反應。或者，抗體可對人類OX40具有特異性且可不展現與其他物種之任何交叉反應性。OX40或其任何變體及同種型可自天然表現其或使用業內熟知之技術及/或本文所述彼等以重組方式產生之細胞或組織分離。
人類OX40前體(登錄號NP_003318.1)之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：1中。成熟人類OX40之細胞外結構域之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：2中。食蟹猴OX40之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：3中。人類OX40-L之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：4中。
如本文所用術語「程式化死亡1」、「程式化細胞死亡1」、「蛋白質PD-1」、「PD-1」、「PD1」、「PDCD1」、「hPD-1」及「hPD-I」可互換使用，且包括人類PD-1之變體、同種型、物種同系物及與PD-1具有至少一個共用表位之類似物。完全PD-1序列可在基因庫登錄號U64863下發現。
術語「細胞毒性T淋巴球相關之抗原-4」、「CTLA-4」、「CTLA4」、「CTLA-4抗原」及「CD152」(參見例如Murata(1999)Am.J.Pathol.155：453-460)可互換使用，且包括人類CTLA-4之變體、同種型、物種同系物及與CTLA-4具有至少一個共用表位之類似物。(參見例如Balzano(1992)Int.J.Cancer Suppl.7：28-32)。人類CTLA-4之完全序列闡述於基因庫登錄號L1 5006中。
如本文所用術語「抗體」可包括全抗體及其任何抗原結合片段(即「抗原結合部分」)或單鏈。在一個實施例中，「抗體」係指包含由二硫鍵互連之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白或其抗原結 合部分。每一重鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。在某些天然IgG、IgD及IgA抗體中，重鏈恆定區包括三個結構域：CH1、CH2及CH3。在某些天然抗體中，每一輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個結構域CL。可將VH及VL區進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及更保守之區(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。每一VH及VL由三個CDR及四個FR構成，其自胺基-末端至羧基-末端按下列順序佈置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統之各種細胞(例如效應物細胞)及經典補體系統之第一組份(C1q))的結合。
抗體通常以高親和力(由10-7M至10-11M或更小之解離常數(KD)反映)特異性結合至其同源抗原。通常將大於約10-6M之任何KD視為指示非特異性結合。如本文所用，「特異性結合」至抗原之抗體係指以高親和力(此意味著KD為10-7M或更小、較佳10-8M或更小、甚至更佳5×10-9M或更小、且最佳介於10-8M與10-10M之間或更小)結合至抗原及實質上一致抗原、但不以高親和力結合至無關抗原的抗體。若抗原展現與給定抗原之高程度序列一致性，例如，若其展現與給定抗原之序列至少80%、至少90%、較佳至少95%、更佳至少97%或甚至更佳至少99%序列一致性，則該抗原與給定抗原「實質上一致」。舉例而言，特異性結合至人類OX40之抗體亦可與來自某些非人類靈長類動物物種(例如，食蟹猴)之OX40交叉反應，但可不與來自其他物種之OX40(例如，鼠類OX40)或除OX40外之抗原交叉反應。
免疫球蛋白可來自普遍已知同型中之任一者，包括但不限於IgA、分泌IgA、IgG及IgM。IgG同型在某些物種中分成亞類：在人類中為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，且在小鼠中為IgG1、IgG2a、IgG2b 及IgG3。在某些實施例中，本文所述抗OX40抗體屬IgG1或IgG2亞型。免疫球蛋白(例如IgG1)係以若干異型存在，該等異型在至多多個胺基酸中彼此不同。「抗體」可包括(例如)天然及非天然抗體；單株及多株抗體；嵌合及人類化抗體；人類及非人類抗體；全合成抗體；及單鏈抗體。
如本文所用術語抗體之「抗原結合部分」係指保留特異性結合至抗原(例如，人類OX40)之能力的抗體之一或多個片段。已顯示，抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來實施。術語抗體(例如本文所述抗OX40抗體)之「抗原結合部分」內所涵蓋結合片段之實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，即包含兩個在鉸鏈區由二硫橋鍵連接之Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)，其由VH結構域組成；及(vi)經分離互補決定區(CDR)或(vii)兩個或更多個可視情況由合成連接體接合之經分離CDR的組合。此外，儘管Fv片段之兩個結構域(VL及VH)係由單獨基因編碼，但其可使用重組方法藉由合成連接體接合在一起，該合成連接體使其能夠成為其中VL及VH區配對形成單價分子之單一蛋白鏈(稱作單鏈Fv(scFv))；例如，參見Bird等人，(1988)Science 242：423-426；及Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。該等及其他潛在構築體係於Chan及Carter(2010)Nat.Rev.Immunol.10：301處闡述。該等抗體片段係使用彼等熟習此項技術者已知之習用技術獲得，且以與完整抗體相同之方式針對效用篩選片段。抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由酶或化學裂解完整免疫球蛋白來產生。
「雙特異性」或「雙功能性抗體」係具有兩個不同重鏈/輕鏈對 及兩個不同結合位點之人工雜合抗體。雙特異性抗體可藉由多種方法(包括雜交瘤融合或連接Fab'片段)產生。參見例如Songsivilai及Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.148,1547-1553(1992)。
如本文所用術語「單株抗體」係指對抗體之特定表位或組合物展示單一結合特異性及親和力之抗體，其中所有抗體皆對特定表位展示單一結合特異性及親和力。通常，該等單株抗體將源自單一細胞或編碼該抗體之核酸，且將在不有意引入任何序列變化下繁殖。因此，術語「人類單株抗體」係指具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變及可選恆定區的單株抗體。在一個實施例中，人類單株抗體係由雜交瘤產生，該雜交瘤藉由(例如)將自轉基因或轉染色體非人動物(例如具有包含人類重鏈轉基因及人類輕鏈之基因組之轉基因小鼠)獲得之B細胞融合至永生化細胞來獲得。
如本文所用術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，例如(a)自對人類免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體之動物(例如小鼠)或自其製備之雜交瘤分離之抗體；(b)自經轉化以表現抗體之宿主細胞、例如自轉染瘤分離之抗體；(c)自重組、組合人類抗體文庫分離之抗體；及(d)藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。該等重組人類抗體包含可變及恆定區，其利用由種系基因編碼之特定人類種系免疫球蛋白序列，但包括在(例如)抗體成熟期間發生之後續重排及突變。如業內所知(例如參見Lonberg(2005)Nature Biotech.23(9)：1117-1125)，可變區含有抗原結合結構域，其係由重排以形成對外來抗原具有特異性之各種基因編碼。除重排外，可變區可藉由多個單一胺基酸變化(稱作體細胞突變或超突變)進一步經修飾以增加抗體對外來抗原之親和力。恆定區將進一步因應 於抗原發生變化(即，同型切換)。因此，因應抗原編碼輕鏈及重鏈免疫球蛋白多肽之重排且體細胞突變之核酸序列可與初始種系序列一致，而是將實質上一致或類似(即，具有至少80%一致性)。
「人類」抗體(HuMAb)係指具有可變區之抗體，其中框架及CDR區二者皆係源自人類種系免疫球蛋白序列。此外，若抗體含有恆定區，則恆定區亦係源自人類種系免疫球蛋白序列。本文所述抗體可包括不由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機誘變或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文所用術語「人類抗體」並不意欲包括源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)種系之CDR序列已移植至人類框架序列上之抗體。術語「人類」抗體及「完全人類」抗體同義使用。
「人類化」抗體係指非人類抗體之CDR結構域外之一些、大部分或所有胺基酸經源自人類免疫球蛋白之相應胺基酸置換的抗體。在抗體之人類化形式之一個實施例中，CDR結構域外之一些、大部分或所有胺基酸經人類免疫球蛋白之胺基酸置換，而一或多個CDR區內之一些、大部分或所有胺基酸未改變。可允許存在胺基酸之小的添加、缺失、插入、取代或修飾，只要其不消除抗體結合特定抗原之能力即可。「人類化」抗體保留類似於初始抗體之抗原特異性之抗原特異性。
「嵌合抗體」係指可變區係源自一個物種且恆定區係源自另一物種之抗體，例如可變區係源自小鼠抗體且恆定區係源自人類抗體之抗體。
如本文所用，「同型」係指由重鏈恆定區基因編碼之抗體類別(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE抗體)。
「異型」係指特異性同型組內之天然變體，該等變體之多個胺 基酸不同(例如，參見Jefferis等人(2009)mAbs 1：1)。本文所述抗體可屬任何異型。如本文所用，稱作「IgG1f」或「IgG1.1f」同型之抗體分別係異型「f」之IgG1及無效應物IgG1.1抗體，即根據如Kabat中之EU索引具有214R、356E及358M，如(例如)SEQ ID NO：5中所示(參見表23之SEQ ID NO：5中之加下劃線之殘基)。
片語「識別抗原之抗體」及「對抗原具有特異性之抗體」在本文中可與術語「特異性結合至抗原之抗體」互換使用。
如本文所用之「經分離抗體」欲指實質上不含具有不同抗原特異性之其他抗體的抗體(例如，特異性結合至OX40之經分離抗體實質上不含特異性結合除OX40以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合至OX40之表位之經分離抗體可與來自不同物種之其他OX40蛋白具有交叉反應性。
如本文所用，「抑制OX40-L與OX40結合」之抗體欲指在業內公認之方法(例如本文所述基於FACS之結合分析)中(例如)在使用hOX40-293細胞之結合分析中以如下EC50抑制OX40-L與OX40結合的抗體：約1μg/mL或更小，例如約0.9μg/mL或更小、約0.85μg/mL或更小、約0.8μg/mL或更小、約0.75μg/mL或更小、約0.7μg/mL或更小、約0.65μg/mL或更小、約0.6μg/mL或更小、約0.55μg/mL或更小、約0.5μg/mL或更小、約0.45μg/mL或更小、約0.4μg/mL或更小、約0.35μg/mL或更小、約0.3μg/mL或更小、約0.25μg/mL或更小、約0.2μg/mL或更小、約0.15μg/mL或更小或約0.1μg/mL或更小。
「效應物功能」係指抗體Fc區與Fc受體或配體之相互作用或自其產生之生物化學事件。實例性「效應物功能」包括C1q結合、補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、FcγR介導之效應物功能(例如ADCC及抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP))及細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)之下調。該等效應物功能通常需要Fc區與結合 結構域(例如，抗體可變結構域)組合。
「Fc受體」或「FcR」係結合至免疫球蛋白之Fc區之受體。結合至IgG抗體之FcR包含FcγR家族之受體，包括該等受體之等位基因變體及選擇性剪接形式。FcγR家族由三種活化受體(小鼠中為FcγRI、FcγRIII及FcγRIV；人類中為FcγRIA、FcγRIIA及FcγRIIIA)及一種抑制受體(FcγRIIB)組成。人類FcγR之各種性質概述於表1中。大多數先天效應細胞類型共表現一或多種活化FcγR及抑制FcγRIIB，而天然殺傷(NK)細胞選擇性表現一種活化Fc受體(小鼠中為FcγRIII且人類中為FcγRIIIA)而不表現小鼠及人類中之抑制FcγRIIB。人類IgG1結合至大部分人類Fc受體且關於其結合之活化Fc受體之類型認為其等效於鼠類IgG2a。
Figure 105116545-A0202-12-0027-1
Figure 105116545-A0202-12-0028-2
「Fc區」(片段可結晶區)或「Fc結構域」或「Fc」係指介導免疫球蛋白與宿主組織或因子之結合(包括結合至位於免疫系統之各種細胞(例如，效應細胞)上之Fc受體或經典補體系統之第一組份(C1q))之抗體之重鏈的C-末端區。因此，Fc區包含排除第一恆定區免疫球蛋白結構域(例如，CH1或CL)之抗體之恆定區。在IgG、IgA及IgD抗體同型中，Fc區在抗體之兩條重鏈之每一者中包含CH2及CH3恆定結構域；IgM及IgE Fc區在每一多肽鏈中包含三個重鏈恆定結構域(CH結構域2-4)。對於IgG，Fc區包含免疫球蛋白結構域Cγ2及Cγ3及Cγ1與Cγ2之間之鉸鏈。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可變，但通常將人類IgG重鏈Fc區定義為自位置C226或P230處之胺基酸殘基(或該兩個胺基酸之間之胺基酸)延伸至重鏈之羧基-末端，其中編號係根據如Kabat中之EU索引。Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,MD；亦參見美國專利申請公開案第2008/0248028號之圖3C-3F。人類IgG Fc區之CH2結構域自約胺基酸231延伸至約胺基酸340，而CH3結構域位於Fc區中之CH2結構域之C-末端側上，即其自IgG之約胺基酸341延伸至約胺基酸447。如本文所用，Fc區可為天然序列Fc(包括任何異型變體)或變體Fc(例如，非天然Fc)。Fc亦可指與包含Fc之蛋白多肽(例如「包含Fc區之結合蛋白」(亦稱作「Fc融合蛋白」(例如，抗體或免疫黏附素)))分離或在其背景下之此區。
「鉸鏈」、「鉸鏈結構域」或「鉸鏈區」或「抗體鉸鏈區」係指重鏈恆定區中將CH1結構域接合至CH2結構域之結構域且包括鉸鏈之上、中間及下部分(Roux等人，J.Immunol.1998 161：4083)。鉸鏈在抗體之結合區與效應物區之間提供不同程度之撓性且亦提供用於兩個 重鏈恆定區之間之分子間二硫鍵結之位點。如本文所用，對於所有IgG同型而言，鉸鏈始於Glu216且結束於Gly237(Roux等人，1998 J Immunol 161：4083)。野生型IgG1、IgG2、IgG3及IgG4鉸鏈之序列示於表2及23中。
Figure 105116545-A0202-12-0029-3
Figure 105116545-A0202-12-0030-785
術語「鉸鏈」包括野生型鉸鏈(例如闡述於表23中之彼等)以及其變體(例如，非天然鉸鏈或經修飾鉸鏈)。舉例而言，術語「IgG2鉸鏈」包括如表23中所示之野生型IgG2鉸鏈及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1個突變(例如取代、缺失或添加)之變體。實例性IgG2鉸鏈變體包括1、2、3或全部4個半胱胺酸(C219、C220、C226及C229)變為另一胺基酸之IgG2鉸鏈。在具體實施例中，IgG2包含C219S取代。在某些實施例中，鉸鏈係包含來自至少兩個同型之序列之雜合鉸鏈。舉例而言，鉸鏈可包含來自一個同型之上、中間或下鉸鏈且鉸鏈之其餘部分來自一或多個其他同型。舉例而言，鉸鏈可為IgG2/IgG1鉸鏈，且可包含(例如)IgG2之上及中間鉸鏈及IgG1之下鉸鏈。鉸鏈可具有效應物功能或喪失效應物功能。舉例而言，野生型IgG1之下鉸鏈提供效應物功能。
術語「CH1結構域」係指重鏈恆定結構域中將可變結構域連接至鉸鏈之重鏈恆定區。如本文所用，CH1結構域始於A118且結束於V215。術語「CH1結構域」包括野生型CH1結構域(例如對於IgG1具有SEQ ID NO：202且對於IgG2具有SEQ ID NO：203；表23)以及其變體(例如，非天然CH1結構域或經修飾CH1結構域)。舉例而言，術語「CH1結構域」包括野生型CH1結構域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1個突變(例如取代、缺失或添加)之變體。實例性CH1結構域包括具有改良抗體之生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)之突變之CH1結構域。本文提供影響抗體之生物活性之CH1結構域之修飾形式。
術語「CH2結構域」係指重鏈恆定結構域中將鉸鏈連接至CH3結構域之重鏈恆定區。如本文所用，CH2結構域始於P238且結束於K340。術語「CH2結構域」包括野生型CH2結構域(例如對於IgG1具有SEQ ID NO：204且對於IgG2具有SEQ ID NO：205；表23)以及其變體(例如，非天然CH2結構域或經修飾CH2結構域)。舉例而言，術語「CH2結構域」包括野生型CH2結構域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1個突變(例如取代、缺失或添加)之變體。實例性CH2結構域包括具有改良抗體之生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)之突變之CH2結構域。在某些實施例中，CH2結構域包含降低效應物功能之取代A330S/P331S。本文提供影響抗體之生物活性之CH2結構域之其他修飾形式。
術語「CH3結構域」係指重鏈恆定結構域中將C-末端連接至CH2結構域之重鏈恆定區。如本文所用，CH3結構域始於G341且結束於K447。術語「CH3結構域」包括野生型CH3結構域(例如對於IgG1具有SEQ ID NO：206且對於IgG2具有SEQ ID NO：207；表23)以及其變體(例如，非天然CH3結構域或經修飾CH3結構域)。舉例而言，術語「CH3結構域」包括野生型CH3結構域及具有1、2、3、4、5、1-3、1-5、3-5及/或至多5、4、3、2或1個突變(例如取代、缺失或添加)之變體。實例性CH3結構域包括具有改良抗體之生物活性(例如ADCC、CDC或半衰期)之突變之CH3結構域。本文提供影響抗體之生物活性之CH3結構域之修飾形式。
「天然序列Fc區」或「天然序列Fc」包含與自然界中發現之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。天然序列人類Fc區包括天然序列人類IgG1 Fc區；天然序列人類IgG2 Fc區；天然序列人類IgG3 Fc區；及天然序列人類IgG4 Fc區以及其天然變體。天然序列Fc包括Fc之各種異型(例如，參見Jefferis等人(2009)mAbs 1：1)。
術語「表位」或「抗原決定子」係指免疫球蛋白或抗體特異性結合抗原(例如，OX40)上之位點。蛋白質抗原內之表位可自藉由蛋白質之三級摺疊(通常構象表位)並置之鄰接胺基酸(通常線性表位)或非鄰接胺基酸形成。在暴露於變性溶劑時，通常但不總是保留自鄰接胺基酸形成之表位，而在用變性溶劑處理時通常損失藉由三級摺疊形成之表位。在獨特空間構象中，表位通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。確定由給定抗體結合表位之方法(即表位定位)已為業內熟知且包括(例如)免疫印跡及免疫沈澱分析，其中測試(例如來自OX40)之重疊或鄰接肽與給定抗體(例如抗OX40抗體)之反應性。確定表位之空間構象之方法包括業內之技術及本文所述彼等，例如，x射線結晶學及2維核磁共振及HDX-MS(例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris編輯，(1996))。
術語「表位定位」係指參與抗體-抗原識別之抗原上之分子決定子的鑑別方法。
術語「結合至相同表位」在提及兩種或更多種抗體時意指抗體結合至胺基酸殘基之相同群組，如藉由給定方法所測定。確定抗體與本文所述抗體是否結合至「OX40上之相同表位」之技術包括業內公認之表位定位方法，例如抗原：抗體複合物之晶體之x射線分析，其提供表位之原子拆分及氫/氘交換質譜(HDX-MS)。其他方法監測抗體與抗原片段(例如蛋白水解片段)或抗原之突變變化形式的結合，其中由於抗原序列內胺基酸殘基之修飾所致之結合損失經常被視為可指示表位組份(例如，丙胺酸掃描誘變-Cunningham及Wells(1985)Science 244：1081)。另外，亦可使用表位定位之計算組合方法。該等方法取決於目標抗體自組合噬菌體展示肽文庫親和分離特異性短肽的能力。預計具有相同或密切相關VH及VL或相同CDR1、2及3序列之抗體結 合至相同表位。
「與另一抗體競爭結合至靶標」之抗體係指抑制(部分或完全)另一抗體與靶標結合之抗體。可使用已知競爭實驗確定兩個抗體是否彼此競爭結合至靶標，即一個抗體是否抑制另一抗體與靶標結合及其抑制程度。在某些實施例中，抗體抗體與另一抗體競爭結合至靶標且將該結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。端視抗體係「阻斷抗體」(即，首先與靶標一起培育之冷抗體)而定，抑制或競爭之程度可不同。競爭分析可如以下中所述執行：例如，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harb Protoc；2006；doi：10.1101/pdb.prot4277，或「Using Antibodies」之第11章，Ed Harlow及David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA 1999。競爭抗體結合至相同表位、重疊表位或毗鄰表位(例如，如由立體阻礙所證明)。
其他業內公認之競爭性結合分析包括：固相直接或間接放射免疫分析(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析(EIA)、夾心式競爭分析(參見Stahli等人，Methods in Enzymology 9：242(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見Kirkland等人，J.Immunol.137：3614(1986))；固相直接標記之分析、固相直接標記之夾心式分析(參見Harlow及Lane,Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988))；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見Morel等人，Mol.Immunol.25(1)：7(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人，Virology 176：546(1990))；及直接標記之RIA。(Moldenhauer等人，Scand.J.Immunol.32：77(1990))。
如本文所用術語「特異性結合」(「specific binding」)、「選擇性結合」(「selective binding」)、「選擇性結合」(「selectively binds」)及「特異性結合」(「specifically binds」)係指結合至預定抗 原而非其他抗原上之表位之抗體。通常，抗體(i)在藉由(例如)在BIACORE 2000表面電漿共振(SPR)儀器中使用預定抗原(例如重組人類OX40)作為分析物及抗體作為配體之表面電漿共振(SPR)技術測定時，以約小於10-7M、例如約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之平衡解離常數(KD)結合，及(ii)較其與除預定抗原或密切相關抗原以外之非特異性抗原(例如，BSA、酪蛋白)之結合親和力大至少兩倍之親和力結合至預定抗原。因此，「特異性結合至人類OX40」之抗體係指以10-7M或更小、例如約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之KD結合至可溶性或細胞結合之人類OX40的抗體。「與食蟹猴OX40交叉反應」之抗體係指以10-7M或更小、例如約小於10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低之KD結合至食蟹猴OX40的抗體。在某些實施例中，在標準結合分析中，不與非人類物種之OX40(例如鼠類OX40)交叉反應之抗體展現針對該等蛋白質之基本上不可檢測之結合。
如本文所用術語「k締合」或「ka」欲指特定抗體-抗原相互作用之締合速率常數，而如本文所用術語「k解離」或「kd」欲指特定抗體-抗原相互作用之解離速率常數。本文所用術語「KD」欲指平衡解離常數，其係自kd對ka之比率(亦即kd/ka)獲得且以莫耳濃度(M)表示。可使用業內充分確立之方法測定抗體之KD值。測定抗體之KD之較佳方法係藉由使用表面電漿共振、較佳使用生物感測器系統(例如Biacore® SPR系統)或流式細胞術及Scatchard分析。
如本文所用術語對IgG抗體之「高親和力」係指抗體對於靶抗原具有10-8M或更小、更佳10-9M或更小且甚至更佳10-10M或更小之KD。然而，對於其他抗體同型，「高親和力」結合可變。舉例而言，對於IgM同型之「高親和力」結合係指抗體具有10-7M或更小、更佳10-8M或更小之KD。
術語「EC50」在使用抗體或其抗原結合片段之活體外或活體內分析之上下文中係指誘導係最大反應之50%之反應、即介於最大反應與基線之間之一半的抗體或其抗原結合部分之濃度。
術語「結合至固定OX40」係指本文所述抗體結合至(例如)細胞表面上表現或附接至固體載體之OX40的能力。
如本文所用術語「交叉反應」係指本文所述抗體結合至不同物種之OX40之能力。舉例而言，結合人類OX40之本文所述抗體亦可結合另一物種之OX40(例如，食蟹猴OX40)。如本文所用，交叉反應性可藉由在結合分析(例如，SPR、ELISA)中檢測與純化抗原之特定反應性或結合至或以其他方式與生理上表現OX40之細胞在功能上相互作用上來量測。用於測定交叉反應性之方法包括(例如)藉由BIACORE®表面電漿共振(SPR)分析使用BIACORE® 2000 SPR儀器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)或流式細胞技術的如本文所述之標準結合分析。
如適於物體之如本文所用術語「天然」係指自然界中可發現之物體的事實。舉例而言，可自自然界中之來源分離且尚未在實驗室中由人有意修飾之生物體(包括病毒)中存在之多肽或聚核苷酸序列係天然的。
「多肽」係指包含至少兩個連續連接之胺基酸殘基之鏈，其中鏈之長度無上限。蛋白質中之一或多個胺基酸殘基可含有例如但不限於糖基化、磷酸化或二硫鍵等修飾。「蛋白質」可包含一或多種多肽。
如本文所用術語「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單鏈或雙鏈，且可為cDNA。
亦提供本文中(例如)表23中所述之序列之「保守序列修飾」，即，不消除由核苷酸序列編碼或含有胺基酸序列之抗體與抗原之結合 之核苷酸及胺基酸序列修飾。該等保守序列修飾包括保守核苷酸及胺基酸取代、以及核苷酸及胺基酸添加及缺失。舉例而言，可藉由業內已知之標準技術(例如定點誘變及PCR介導之誘變)向表23中之序列中引入修飾。保守序列修飾包括保守胺基酸取代，其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基置換者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分支側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，抗OX40抗體中之預測非必需胺基酸殘基較佳係經來自同一側鏈家族之另一胺基酸殘基置換。不消除抗原結合之鑑別核苷酸及胺基酸保守取代之方法為業內所熟知(例如，參見Brummell等人，Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人Protein Eng.12(10)：879-884(1999)；及Burks等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：412-417(1997))。或者，在另一實施例中，可藉由(例如)飽和誘變沿抗OX40抗體編碼序列之全部或一部分隨機引入突變，且可針對改良之結合活性篩選所得經修飾之抗抗OX40抗體。
對於核酸而言，術語「實質同源性」指示，兩個核酸或其指定序列在最佳比對及比較(其中適當插入或缺失核苷酸)時有至少約80%之核苷酸、通常至少約90%至95%且更佳至少約98%至99.5%之核苷酸一致。或者，當區段將在選擇性雜交條件下與鏈之補體雜交時存在實質同源性。
對於多肽而言，術語「實質同源性」指示，兩個多肽或其指定 序列在最佳比對及比較(其中適當插入或缺失胺基酸)時有至少約80%之胺基酸、通常至少約90%至95%且更佳至少約98%至99.5%之胺基酸一致。
兩個序列之間之一致性百分比在最佳比對序列時隨該等序列共有之一致位置數而變化(即同源性%=一致位置數/總位置數乘以100)，其中所測定最佳比對考慮為達成兩個序列最佳比對而需要引入之缺口數及各缺口長度。兩個序列之間之序列比較及一致性百分比測定可使用數學算法來完成，如下文非限制性實例中所述。
兩個核苷酸序列之間之一致性百分比可使用GCG軟體包裝(可於http：//www.gcg.com獲得)中之GAP程式使用NWSgapdna.CMP矩陣及40、50、60、70或80之空位權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來測定。兩個核苷酸或胺基酸序列之間之一致性百分比亦可使用E.Meyers及W.Miller之算法(CABIOS,4：11-17(1989))使用PAM120權重殘基表來測定，該算法已納入ALIGN程式(2.0版)中，空位長度罰分為12且空位罰分為4。另外，兩個胺基酸序列之間之一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣來測定，該算法已納入GCG軟體包裝(可於http：//www.gcg.com獲得)中之GAP程式中，且空位權重為16、14、12、10、8、6或4且長度權重為1、2、3、4、5或6。
本文所述核酸及蛋白序列可進一步用作「查詢序列」以針對公開資料庫實施搜索以(例如)鑑別相關序列。該等搜索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之NBLAST及XBLAST程式(2.0版)實施。BLAST核苷酸搜索可利用NBLAST程式實施(評分=100，字長=12)以獲得與本文所述核酸分子同源之核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可利用XBLAST程式實施(評分=50，字長=3)以獲得與本文所述蛋白質分子同源之胺基酸序列。出於比較目的，為獲得加空位比對， 可如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述來利用加空位BLAST。在利用BLAST及加空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如，XBLAST及NBLAST)之缺省參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。
該等核酸可存在於全細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純之形式存在。當藉由標準技術實施純化以清除其他細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸(例如染色體之其他部分)或蛋白質)時，核酸係「經分離」或「使得實質上純的」，該等標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內熟知之其他方法。參見F.Ausubel等人編輯，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
可根據標準技術使核酸(例如cDNA)突變以提供基因序列。對於編碼序列而言，若合意，該等突變可影響胺基酸序列。具體而言，涵蓋與本文所述天然V、D、J、恆定、切換及其他該等序列實質上同源或源自其之DNA序列。
如本文所用術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸之核酸分子。一類載體為「質粒」，其係指額外DNA區段可連接至其中之環形雙鏈DNA環。另一類載體為病毒載體，其中額外DNA區段可連接至病毒基因組中。某些載體能夠在已將其引入其中之宿主細胞中進行自主複製(例如，具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中時整合至該宿主細胞之基因組中，並藉此隨宿主基因組一同複製。此外，某些載體能夠引導與其可操作連接之基因的表現。該等載體在本文中稱作「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體經常呈質體形式。在本說明書 中，「質粒」與「載體」可互換使用，此乃因質粒係載體之最常用形式。然而，亦包括可起等效功能之其他形式之表現載體，例如病毒載體(例如，複製缺陷型逆轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
如本文所用術語「重組宿主細胞」(或簡稱為「宿主細胞」)欲指包含細胞中並不天然存在之核酸之細胞，且可為向其中引入重組表現載體之細胞。應瞭解，此等術語不僅欲指特定個體細胞而且亦指此細胞之子代。由於突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，因此，此子代實際上可能與母細胞不同但仍包括於本文所用術語「宿主細胞」之範疇內。
如本文所用術語「抗原」係指任何天然或合成免疫原性物質，例如蛋白質、肽或半抗原。抗原可為OX40或其片段。抗原亦可為腫瘤抗原，針對其期望保護或治療性免疫反應，例如由腫瘤細胞表現之抗原，例如，與抗OX40抗體組合用作欲投與之腫瘤疫苗。抗原包括用於預防或治療癌症之腫瘤相關之抗原。腫瘤相關之抗原之實例包括(但不限於)包含以下之序列之全部或一部分之序列：βhCG、gp100或Pme117、HER2/neu、WT1、間皮素、CEA、gp100、MART1、TRP-2、黑色素-A、NY-ESO-1、NY-BR-1、NY-CO-58、MN(gp250)、獨特型(idiotype)、MAGE-1、MAGE-3、MAGE-A3、酪胺酸酶、端粒酶、SSX2及MUC-1抗原及生殖細胞源腫瘤抗原。腫瘤相關之抗原亦包括血型抗原，例如Lea、Leb、LeX、LeY、H-2、B-1、B-2抗原。或者，構築體中可包括一種以上抗原。舉例而言，可將MAGE抗原與其他抗原(例如黑色素A、酪胺酸酶及gp100)以及佐劑(例如GM-CSF或IL-12)組合，並連接至抗APC抗體。
上述抗原之序列為業內熟知。舉例而言，MAGE-3 cDNA序列之實例提供於US 6,235,525(Ludwig Institute for Cancer Research)中；NY-ESO-1核酸及蛋白序列之實例提供於US 5,804,381及US 6,069,233 (Ludwig Institute for Cancer Research)中；黑色素-A核酸及蛋白序列之實例提供於US 5,620,886及US 5,854,203(Ludwig Institute for Cancer Research)中；NY-BR-1核酸及蛋白序列之實例提供於US 6,774,226及US 6,911,529(Ludwig Institute for Cancer Research)中且NY-CO-58核酸及蛋白序列之實例提供於WO 02/90986(Ludwig Institute for Cancer Research)中；HER-2/neu蛋白之胺基酸序列之實例可以GENBANK®登錄號AAA58637獲得；且人類癌胚抗原-樣1(CEA-1)之核苷酸序列(mRNA)可以GENBANK®登錄號NM020219獲得。
「免疫反應」係指脊椎動物內針對外來試劑之生物反應，該反應保護生物體抵抗該等試劑及由其引起之疾病。免疫反應係由免疫系統之細胞(例如，T淋巴球、B淋巴球、天然殺傷(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥胖細胞、樹突細胞或嗜中性球)及由該等細胞中之任一者或肝產生之可溶性大分子(包括抗體、細胞介素及補體)之作用介導，其導致選擇性靶向、結合至、損害、破壞及/或自脊椎動物身體消除侵入病原體、經病原體感染之細胞或組織、癌性或其他異常細胞或在自體免疫或病理發炎之情形下正常人類細胞或組織。免疫反應包括(例如)T細胞(例如效應物T細胞)或Th細胞(例如CD4+或CD8+ T細胞)之活化或抑制或Treg細胞之抑制。
「免疫調節劑」或「免疫調控劑」係指可參與調節、調控或改良免疫反應之試劑，例如信號傳導路徑之組份。「調節」、「調控」或「改良」免疫反應係指免疫系統之細胞或該等細胞(例如，效應物T細胞)之活性之任何改變。該調節包括免疫系統之刺激或抑制，其可表現為各種細胞類型之數目之增加或減少、該等細胞之活性之增加或減少或可在免疫系統內發生之任何其他變化。已鑑別抑制性及刺激性免疫調節劑，其中之一些在腫瘤微環境中可具有增強之功能。在較佳實施例中，免疫調節劑位於T細胞表面上。「免疫調節性靶標」或 「免疫調控性靶標」係藉由物質、試劑、部分、化合物或分子靶向結合且其活性藉由物質、試劑、部分、化合物或分子之結合得以改變之免疫調節劑。免疫調節性靶標包括(例如)細胞表面上之受體(「免疫調節性受體」)及受體配體(「免疫調節性配體」)。
「免疫療法」係指藉由包含誘導、增強、抑制或以其他方式改良免疫反應之方法治療受疾病折磨或處於感染疾病或具有疾病之復發之風險的個體。
「免疫刺激療法」或「免疫刺激性療法」係指引起增加(誘導或增強)個體中之免疫反應用於(例如)治療癌症的療法。
「增強內源免疫反應」意指增加個體中之現存免疫反應之有效性或功效。有效性及功效之此增加可藉由(例如)克服抑制內源宿主免疫反應之機制或藉由刺激增強內源宿主免疫反應之機制來達成。
「T效應物」(「Teff」)細胞係指具有細胞溶解活性之T細胞(例如，CD4+及CD8+ T細胞)以及T輔助(Th)細胞，其分泌細胞介素且活化並引導其他免疫細胞，但不包括調控性T細胞(Treg細胞)。本文所述抗OX40抗體活化Teff細胞，例如CD4+及CD8+ Teff細胞。
增加之刺激免疫反應或免疫系統之能力可自T細胞共刺激受體之增強之激動劑活性及/或抑制受體之增強之拮抗劑活性產生。增加之刺激免疫反應或免疫系統之能力可在量測免疫反應之分析、例如量測細胞介素或趨化介素釋放、細胞溶解活性(在靶細胞上直接測定或經由檢測CD 107a或粒酶間接測定)及增殖變化之分析中由EC50或最大活性值之倍數增加反映。刺激免疫反應或免疫系統活性之能力可增強至少10%、30%、50%、75%、2倍、3倍、5倍或更多。
如本文所用術語「連接」係指兩個或更多個分子之締合。鏈接可為共價或非共價鏈接。鏈接亦可為遺傳的(即，重組融合)。該等鏈接可使用多種業內公認之技術(例如化學偶聯及重組蛋白產生)來達 成。
如本文所用，「投與」係指使用熟習此項技術者已知之各種方法及遞送系統中之任一者向個體物理引入包含治療劑之組合物。本文所述抗體之較佳投與途徑包括靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、脊柱或其他非經腸投與途徑(例如藉由注射或輸注)。如本文所用片語「非經腸投與」意指除經腸及局部投與以外之投與模式，通常藉由注射，且包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病灶內、囊內、眶內、心內、皮內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、經囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注、以及活體內電穿孔。或者，本文所述抗體可經由非經腸途徑投與，例如局部、表皮或黏膜投與途徑，例如經鼻內、經口、經陰道、經直腸、經舌下或經局部。投與亦可(例如)實施一次、複數次及/或在一或多個延長時段內實施。
如本文所用術語「T細胞介導之反應」係指由T細胞(包括效應物T細胞(例如，CD8+細胞)及輔助T細胞(例如，CD4+細胞))介導之反應。T細胞介導之反應包括(例如)T細胞細胞毒性及增殖。
如本文所用術語「細胞毒性T淋巴球(CTL)反應」係指由細胞毒性T細胞誘導之免疫反應。CTL反應主要係由CD8+ T細胞介導。
如本文所用術語「抑制」或「阻斷」(例如，在提及細胞上OX40-L與OX40之結合之抑制/阻斷時)可互換使用且涵蓋部分及完全抑制/阻斷。在某些實施例中，抗OX40抗體將OX40-L與OX40之結合抑制至少約50%、例如約60%、70%、80%、90%、95%、99%或100%，如(例如)本文中進一步所述所測定。在某些實施例中，抗OX40抗體將OX40-L與OX40之結合抑制不超過50%、例如約40%、30%、20%、10%、5%或1%，如(例如)本文中進一步所述所測定。
如本文所用術語「抑制腫瘤之生長」包括腫瘤生長之任何可量 測減少，例如腫瘤生長抑制至少約10%、例如至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約99%或100%。
如本文所用「癌症」係指特徵在於體內異常細胞不受控生長之寬泛組之疾病。失調之細胞分裂可形成侵襲相鄰組織且可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠部分的惡性腫瘤或細胞。
如本文所用術語「治療」(「treat」、「treating」及「treatment」)係指對個體實施之任何類型之介入或方法或向其投與活性劑，其中目的係逆轉、緩和、改善、抑制或緩解或預防症狀、併發症、病況或與疾病相關之生物化學標記的進展、發展、嚴重程度或復發。預防係指投與不患疾病之個體，以防止疾病發生或使其效應(若存在)最小化。
「血液惡性病」包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤或淋巴惡性病以及脾及淋巴結之癌症。實例性淋巴瘤包括B細胞淋巴瘤(B細胞血液癌)及T細胞淋巴瘤。B細胞淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphomas)及大部分非霍奇金氏淋巴瘤。B細胞淋巴瘤之非限制性實例包括彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、黏膜下相關之淋巴組織淋巴瘤、小細胞淋巴球性淋巴瘤(與慢性淋巴球性白血病重疊)、外套細胞淋巴瘤(MCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、縱膈大B細胞淋巴瘤、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、結節邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病。T細胞淋巴瘤之非限制性實例包括結節外T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、退行性大細胞淋巴瘤及血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤。血液惡性病亦包括白血病，例如但不限於繼發性白血病、慢性淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病及急性淋巴母細胞性白血病。血液惡性病進一 步包括骨髓瘤，例如但不限於多發性骨髓瘤及燜燃型多發性骨髓瘤。術語血液惡性病涵蓋其他血液及/或B細胞-或T細胞相關之癌症。
術語「有效劑量」(「effective dose」或「effective dosage」)定義為足以達成或至少部分達成期望效應之量。藥物或治療劑之「治療有效量」或「治療有效劑量」係在單獨使用或與另一治療劑組合使用時促進疾病消退之藥物之任何量，該疾病消退係由疾病症狀之嚴重程度降低、無疾病症狀之時段之頻率及持續時間增加或防止因感病性之損害或失能來證明。
在提及實體腫瘤時，有效量包含足以引起腫瘤收縮及/或減小腫瘤生長速率(例如抑制腫瘤生長)或預防或延遲其他不期望細胞增殖的量。在某些實施例中，有效量係足以延遲腫瘤發生之量。在一些實施例中，有效量係足以預防或延遲腫瘤復發之量。有效量可以一或多次投與來投與。藥物或組合物之有效量可：(i)減少癌細胞數目；(ii)減小腫瘤大小；(iii)抑制、延緩、減緩至一定程度且可停止癌細胞浸潤至周邊器官中；(iv)抑制、即減緩至一定程度且停止腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤發生及/或復發；及/或(vii)將與癌症相關之症狀中之一或多種減輕至一定程度。在一個實例中，「有效量」係在臨床上證明影響癌症顯著減少或減緩癌症(例如晚期實體腫瘤)進展之抗OX40抗體之量及抗PD-1抗體(例如，尼沃魯單抗(nivolumab))或抗CTLA-4抗體(例如，伊匹單抗(ipilimumab))組合之量。如本文所用術語「固定劑量」、「平坦劑量」及「平坦-固定劑量」可互換使用且係指投與患者而與患者之重量或體表面積(BSA)無關的劑量。因此，固定或平坦劑量不提供為mg/kg劑量，而是提供為試劑之絕對量。
如本文所用「基於體表面積(BSA)之劑量」係指根據個體患者之體表面積(BSA)調節之劑量。基於BSA之劑量可提供為mg/kg體重。已 公開各種計算以在不直接量測下獲得BSA，最廣泛使用之計算係Du Bois公式(參見Du Bois D,Du Bois EF(Jun 1916)Archives of Internal Medicine 17(6)：863-71；及Verbraecken,J.等人(2006年4月).Metabolism-Clinical and Experimental 55(4)：515-24)。其他實例性BSA公式包括Mosteller公式(Mosteller RD. N Engl J Med .,1987；317：1098)、Haycock公式(Haycock GB等人，J Pediatr 1978,93：62-66)、Gehan及George公式(Gehan EA,George SL,Cancer Chemother Rep 1970,54：225-235)、Boyd公式(Current,JD(1998),The Internet Journal of Anesthesiology 2(2)；及Boyd,Edith(1935),University of Minnesota.The Institute of Child Welfare,Monograph Series,No.x.London：Oxford University Press)、Fujimoto公式(Fujimoto S等人，Nippon Eiseigaku Zasshi 1968；5：443-50)、Takahira公式(Fujimoto S等人，Nippon Eiseigaku Zasshi 1968；5：443-50)及Schlich公式(Schlich E等人，Ernährungs Umschau 2010；57：178-183)。
藥物之「預防有效量」或「預防有效劑量」係在向處於發生疾病或患有疾病之復發之風險之個體單獨投與或與另一治療劑組合投與時抑制疾病發展或復發的藥物之量。可使用多種熟練從業者已知之方法、例如在臨床試驗期間在人類個體中、在預測於人類中之效能之動物模型系統中或藉由在活體外分析中分析試劑之活性評估治療或預防劑促進疾病消退或抑制疾病發展或復發之能力。
舉例而言，抗癌劑係在個體中減緩癌症進展或促進癌症消退之藥物。在較佳實施例中，藥物之治療有效量促進癌症消退至消除癌症之程度。「促進癌症消退」意指單獨或與抗贅瘤劑組合投與有效量之藥物可減少腫瘤生長或大小、使腫瘤壞死、減少至少一種疾病症狀之嚴重程度、增加無疾病症狀之時段之頻率及持續時間、防止因感病性之損害或失能或以其他方式改善患者之疾病症狀。藥理學有效性係指 藥物促進患者中癌症消退之能力。生理安全性係指因藥物投與引起之細胞、器官及/或生物體水平(不利效應)之毒性或其他不利生理效應的可接受之低程度。
舉例而言，對於腫瘤之治療，藥物之治療有效量或劑量較佳相對於未治療個體將細胞生長或腫瘤生長抑制至少約20%、更佳至少約40%、甚至更佳至少約60%且仍更佳至少約80%。在最佳實施例中，藥物之治療有效量或劑量完全抑制細胞生長或腫瘤生長，即較佳將細胞生長或腫瘤生長抑制100%。可使用下文所述之分析評估化合物抑制腫瘤生長之能力。或者，可藉由檢驗化合物抑制細胞生長之能力評估組合物之此性質，該抑制可藉由熟練從業人員已知之分析在活體外量測。在本文所述之其他較佳實施例中，可觀察到腫瘤消退且其可持續至少約20天、更佳至少約40天或甚至更佳至少約60天之時段。
術語「患者」及「個體」係指接受預防性或治療性治療之任何人類或非人類動物。舉例而言，本文所述方法及組合物可用於治療患有癌症(例如晚期實體腫瘤)之個體或患者。術語「非人類動物」包括所有脊椎動物，例如哺乳動物及非哺乳動物，例如非人類靈長類動物、羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬蟲類等。
在以下子部分中進一步詳細闡述本文所述各個態樣。
I.抗OX40抗體
本文闡述特徵在於特定功能特徵或性質之抗體，例如完全人類抗體。舉例而言，抗體特異性結合人類OX40。另外，抗體可與來自一或多種非人類靈長類動物之OX40(例如食蟹猴OX40)交叉反應。在用作單一療法時或在與免疫-腫瘤藥劑(例如抗PD-1抗體(例如，尼沃魯單抗)或抗CTLA-4抗體(例如，伊匹單抗))組合使用時，該等抗體可用於治療癌症。
本文所述抗OX40抗體展現以下功能性質中之一或多者或全部： (1)如(例如)藉由BIACORE® SPR分析所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類OX40；(2)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類OX40；(3)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴OX40，例如結合至膜結合之食蟹猴OX40；(4)誘導或增強T細胞活化，如藉由以下所證明：(i)表現OX40之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖；(5)(例如)在利用hOX40-293細胞之分析中如藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小之EC50抑制OX40配體與OX40結合；(6)結合至成熟人類OX40之細胞外部分上之表位(SEQ ID NO：2)，例如，在區DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)內之表位；(7)與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1競爭結合至人類OX40；(8)與6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2競爭結合至人類OX40。
較佳地，抗體以高親和力、例如以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M或更小、10-10M或更小、10-11M或更小、10-12M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M或10-9M至10-7M之KD結合至OX40。在某些實施例中，抗OX40抗體以(例如)如藉由BIACORE® SPR分析測定之10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M至10-7M之KD結合至可溶性人類OX40。在某些實施例中，抗OX40抗體以(例如)如藉由流 式細胞術測定之10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M之KD結合至(例如)活化人類T細胞上之結合(例如，細胞膜結合)之人類OX40。在某些實施例中，抗OX40抗體以(例如)如藉由FACS測定之10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M之EC50結合至(例如)活化人類T細胞上之結合(例如，細胞膜結合)人類OX40。在某些實施例中，抗OX40抗體以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-7M、10-10M至10-7M、10-9M至10-7M或10-8M至10-7M之KD結合至可溶性人類OX40，且以10-7M或更小、10-8M或更小、10-9M(1nM)或更小、10-10M或更小、10-12M至10-7M、10-11M至10-8M、10-10M至10-8M、10-9M至10-8M、10-11M至10-9M或10-10M至10-9M之KD或EC50結合至細胞膜結合之人類OX40。
本文所述抗OX40抗體可如(例如)藉由FACS所量測(例如，如實例中所述)以(例如)100nM或更小、10nM或更小、100nM至0.01nM、100nM至0.1nM、100nM至1nM或10nM至1nM之EC50結合至食蟹猴OX40，例如結合至膜結合之食蟹猴OX40。
本文所述抗OX40抗體可藉由(例如)活化Teff細胞、限制T效應細胞由Treg細胞抑制、耗盡及/或抑制腫瘤Treg細胞及/或活化(例如)腫瘤中之NK細胞刺激或增強免疫反應。舉例而言，抗OX40抗體可活化或共刺激Teff細胞，如藉由(例如)增強之細胞介素(例如，IL-2及IFN-γ)分泌及/或增強之增殖所證明。在某些實施例中，亦提供CD3刺激。在某些實施例中，OX40抗體將IL-2分泌增加50%、100%(即，2倍)、 3倍、4倍、5倍或更大之因數，視情況最大值為至多10倍、30倍、100倍，如(例如)初代人類T細胞或表現人類OX40之T細胞上所量測(例如，如實例中進一步闡述)。在某些實施例中，OX40抗體將IFN-γ分泌增加50%、100%(即，2倍)、3倍、4倍、5倍或更大之因數，視情況最大值為至多10倍、30倍、100倍，如(例如)初代人類T細胞或表現人類OX40之T細胞上所量測(例如，如實例中進一步闡述)。
本文所述抗OX40抗體可以(例如)10nM或更小、1nM或更小、0.01nM至10nM、0.1nM至10nM或0.1nM至1nM之EC50抑制細胞(例如表現人類OX40之293細胞(即，hOX40-293細胞))上人類OX40L與人類OX40之結合(參見實例6)。
本文所述抗OX40抗體結合至OX40上之表位，如(例如)藉由結合至人類OX40之片段所測定。舉例而言，在某些實施例中，抗體結合至人類OX40(SEQ ID NO：2)之序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)之全部或一部分，如(例如)藉由HDX或藉由抗體與人類OX40之片段之結合、之後酶裂解所測定(參見實例11)。在其他實施例中，抗體結合至人類OX40(SEQ ID NO：2)之序列DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)之全部或一部分。
在某些實施例中，本文所述抗OX40抗體結合至序列SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：182)之全部或一部分。
在其他實施例中，本文所述抗OX40抗體結合至序列PCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：183)之全部或一部分。
在其他實施例中，結合至序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)之全部或一部分之抗OX40抗體進一步結合至序列QLCTATQDTVCR(SEQ ID NO：184)之全部或一部分。
在其他實施例中，本文所述抗OX40抗體結合至序列SQNTVCRPCGPGFYN(SEQ ID NO：185)之全部或一部分。
本文所述抗OX40抗體與包含本文所述CDR或可變區之抗OX40抗體(例如3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1)競爭結合至OX40(或抑制該等抗OX40抗體之結合)。在某些實施例中，抗OX40抗體將3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1與人類OX40之結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。在某些實施例中，3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1將抗OX40抗體與人類OX40之結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
在某些實施例中，抗體經由(例如)FcR結合利用多價交聯誘導或增強T細胞活化。在某些實施例中，抗體係多價，例如二價。在某些實施例中，抗體並非單價。
在某些實施例中，抗體具有1、2、3、4、5或6個以下特徵：(1)如(例如)藉由BIACORE® SPR分析所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類OX40；(2)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類OX40；(3)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴OX40，例如結合至膜結合之食蟹猴OX40；(4)誘導或增強T細胞活化，如藉由以下所證明：(i)表現OX40之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖；(5)(例如)在利用hOX40-293細胞之分析中如藉由FACS所量測以 (例如)1nM或更小之EC50抑制OX40配體與OX40結合；(6)結合至成熟人類OX40之細胞外部分上之表位(SEQ ID NO：2)，例如，在區DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)內之表位；(7)與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1競爭結合至人類OX40；(8)與6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2競爭結合至人類OX40。
因此，應理解，如根據業內已知之方法測定並在本文中闡述之展現該等功能性質中之一或多者(例如，生物化學、免疫化學、細胞、生理學或其他生物活性或諸如此類)之抗體與特定活性相對於在抗體不存在下(或在存在不相關特異性之對照抗體時)觀察到的活性在統計學上顯著之差異有關。較佳地，抗OX40抗體將所量測參數(例如，T細胞增殖、細胞介素產生)增加所量測參數之至少10%、更佳至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%(即2倍)、3倍、5倍或10倍。相反，抗體可將所量測參數(例如，腫瘤體積、OX40-L與OX40之結合、腫瘤中調控性T細胞之量)減少所量測參數之至少10%、更佳至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%、95%或99%。
業內已知用於評估抗體對不同物種之OX40之結合親和力的標準分析，包括(例如)ELISA、西方印跡及RIA。適宜分析詳細闡述於實例中。亦可藉由業內已知之標準分析(例如藉由BIACORE® SPR分析)評估抗體之結合動力學(例如，結合親和力)。用於評估抗體對OX40之功能性質(例如，配體結合、T細胞增殖、細胞介素產生)之效應之分析更詳細闡述於下文及實例中。
在某些實施例中，抗OX40抗體並非天然抗體或係非天然抗體， 例如，抗OX40抗體具有不同於彼等天然抗體之翻譯後修飾，其不同之處在於(例如)具有更多、更少或不同類型之翻譯後修飾。
II.實例性抗OX40抗體
本文所述特定抗體係具有抗體3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之CDR及/或可變區序列之如實例1中所述經分離並在結構上表徵之抗體(例如單株抗體)，以及與抗體3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之可變區或CDR序列具有至少80%一致性(例如，至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致性)之抗體。3F4、14B6(14B6-1及14B6-2)、23H3、6E1(6E1-1及6E1-2)、18E9、8B11、20B3、14A2(14A2-1及14A2-2)及20C1之VH胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：17、28、37、48、57、65、73、84及93中。3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之VL胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94中。
因此，本文提供包含重鏈及輕鏈可變區之抗體或其抗原結合部分，其中重鏈可變區包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：17、28、37、48、57、65、73、84及93。
亦提供包含重鏈及輕鏈可變區之抗體或其抗原結合部分，其中輕鏈可變區包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94。
本文提供包含以下之抗體或其抗原結合部分：包含SEQ ID NO：17及18；28及29；28及30；37及38；48及49；48及50；57及58；65及66；73及74；84及85；84及86；93及94之重鏈及輕鏈可變區序列。
本文所述抗OX40抗體可包含3F4、14B6-1、14B6-2、23H3.、 6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1或其組合之重鏈及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。3F4、14B6(14B6-1及14B6-2)、23H3、6E1(6E1-1及6E1-2)、18E9、8B11、20B3、14A2(14A2-1及14A2-2)及20C1之VH CDR1之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：11、19、31、39、51、59、67、75及87中。3F4、14B6(14B6-1及14B6-2)、23H3、6E1(6E1-1及6E1-2)、18E9、8B11、20B3、14A2(14A2-1及14A2-2)及20C1之VH CDR2之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：12、20、32、40、52、60、68、76及88中。3F4、14B6(14B6-1及14B6-2)、23H3、6E1(6E1-1及6E1-2)、18E9、8B11、20B3、14A2(14A2-1及14A2-2)及20C1之VH CDR3之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：13、21、33、41、53、61、69、77及89中。3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之VL CDR1之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90中。3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之VL CDR2之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91中。3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之VL CDR3之胺基酸序列分別闡述於SEQ ID NO：16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92中。CDR區係使用Kabat系統描繪(Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及公共服務部，NIH公開案第91-3242號)。
假定該等抗體中之每一者皆結合至OX40且抗原結合特異性主要係由CDR1區、2區及3區提供，可「混合並匹配」VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列(即可混合並匹配來自不同抗體之CDR，但 每一抗體必須含有VH CDR1、2及3及VL CDR1、2及3)以產生其他抗OX40結合抗體。可使用上文及實例中所闡述之結合分析(例如ELISA)來測試該等「混合並匹配」抗體之OX40結合。較佳地，在混合並匹配VH CDR序列時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列經結構上類似之CDR序列置換。同樣，在混合並匹配VL CDR序列時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列經結構上類似之CDR序列置換。熟習此項技術者將容易地明瞭，可藉由用來自針對單株抗體3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之本文揭示之CDR序列之結構上類似之序列取代一或多個VH及/或VL CDR區序列來產生新穎VH及VL序列。具有等效於或優於本文所揭示特異性抗體之結合親和性、生物活性及/或其他性質的「混合並匹配」之抗體可經選擇用於本發明方法中。
本文提供經分離抗體或其抗原結合部分，其包含：(a)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區CDR1：SEQ ID NO：11、19、31、39、51、59、67、75及87；(b)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區CDR2：SEQ ID NO：12、20、32、40、52、60、68、76及88；(c)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之重鏈可變區CDR3：SEQ ID NO：13、21、33、41、53、61、69、77及89；(d)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區CDR1：SEQ ID NO：14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90；(e)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區CDR2：SEQ ID NO：15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91；及(f)包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之輕鏈可變區 CDR3：SEQ ID NO：16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92；其中抗體特異性結合至人類OX40。
在一個實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈可變區，其中重鏈可變區CDR1,CDR2及CDR3區分別包含：SEQ ID NO：11-13；19-21；31-33；39-41；51-53；59-61；67-69；74-77；87-89；及87、317及89；其中抗體特異性結合至人類OX40。
在另一實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈可變區，其中輕鏈可變區CDR1,CDR2及CDR3區分別包含：SEQ ID NO：14-16；22-24；25-27；34-36；42-44；45-47；54-56；62-64；70-72；78-80；81-83；及90-92；其中抗體特異性結合至人類OX40。
在具體實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈可變區，其中抗體包含：(a)分別包含SEQ ID NO：87、317及89之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：90-92之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別包含SEQ ID NO：11-13之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：14-16之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(c)分別包含SEQ ID NO：19-21之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：22-24之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(d)分別包含SEQ ID NO：19-21之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：25-27之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列； (e)分別包含SEQ ID NO：31-33之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：34-36之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(f)分別包含SEQ ID NO：39-41之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：42-44之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(g)分別包含SEQ ID NO：39-41之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：45-47之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(h)分別包含SEQ ID NO：51-53之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：54-56之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(i)分別包含SEQ ID NO：59-61之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：62-64之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(j)分別包含SEQ ID NO：67-69之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：70-72之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(k)分別包含SEQ ID NO：75-77之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：78-80之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(l)分別包含SEQ ID NO：75-77之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：81-83之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；或(m)分別包含SEQ ID NO：87-89之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：90-92之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序 列；其中抗體特異性結合至人類OX40。
在另一實施例中，抗體包含重鏈及輕鏈可變區，其中抗體包含：(a)分別由SEQ ID NO：87、317及89組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：90-92組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別由SEQ ID NO：11-13組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：14-16組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(c)分別由SEQ ID NO：19-21組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：22-24組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(d)分別由SEQ ID NO：19-21組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：25-27組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(e)分別由SEQ ID NO：31-33組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：34-36組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(f)分別由SEQ ID NO：39-41組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：42-44組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(g)分別由SEQ ID NO：39-41組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：45-47組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(h)分別由SEQ ID NO：51-53組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3 序列、及/或分別由SEQ ID NO：54-56組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(i)分別由SEQ ID NO：59-61組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：62-64組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(j)分別由SEQ ID NO：67-69組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：70-72組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(k)分別由SEQ ID NO：75-77組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：78-80組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(l)分別由SEQ ID NO：75-77組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：81-83組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；或(m)分別由SEQ ID NO：87-89組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：90-92組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
本文所述之VH結構域或其一或多個CDR可連接至恆定結構域用於形成重鏈，例如全長重鏈。類似地，本文所述之VL結構域或其一或多個CDR可連接至恆定結構域用於形成輕鏈，例如全長輕鏈。全長重鏈(C-末端離胺酸(K)除外或C-末端甘胺酸及離胺酸(GK)除外，其可不存在)及全長輕鏈組合以形成全長抗體。N-末端麩醯胺酸及麩胺酸鹽殘基亦可在輕鏈及重鏈上轉化成焦麩胺酸鹽殘基。
本文所述VH結構域可稠合至人類IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，其係天然的或經修飾)之恆定結構域，例如，如本文進一步闡述。舉例而言，重鏈可包含稠合至闡述於SEQ ID NO：5中之人類IgG1 胺基酸序列之本文所述任何VH結構域的胺基酸序列。
人類IgG1恆定結構域亦可為異型變體之恆定結構域。舉例而言，IgG1之異型變體包含R107K、E189D及M191L(在上文中加下劃線且編號係根據SEQ ID NO：6中之編號)。在全長重區內，該等胺基酸取代編號為R214K、E356D及M358L。
本文所述VL結構域可稠合至人類κ或λ輕鏈之恆定結構域。舉例而言，輕鏈可包含稠合至闡述於SEQ ID NO：7中之人類IgG1 κ輕鏈胺基酸序列之本文所述任何VL結構域的胺基酸序列。
在某些實施例中，重鏈恆定區在C-末端處包含離胺酸或另一胺基酸，例如，其包含以下最後胺基酸：對於重鏈為LSPGK(SEQ ID NO：8)。在某些實施例中，重鏈恆定區在C-末端處缺乏一或多個胺基酸，且具有(例如)C-末端序列LSPG(SEQ ID NO：9)或LSP。
實例性重鏈及輕鏈之胺基酸序列闡述於表23中且對於重鏈對應於SEQ ID NO：95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125且對於輕鏈對應於SEQ ID NO：96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122。
包含與闡述於表23中之重鏈或輕鏈中之任一者(或其可變區)至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%或70%一致之胺基酸序列(例如SEQ ID NO：95及96；97及98；99及100；101及102；103及104；105及106；107及108；109及110；111及112；113及114；115及116；117及118；119及120；121及122；123及116；124及116；及125及116)的重鏈及輕鏈可用於形成具有期望特徵(例如本文中進一步闡述之彼等)之抗人類OX40抗體。實例性變體係包含(例如)恆定結構域之異型變化及/或可變區或恆定區之突變(例如本文揭示之突變)之彼等。包含與表23中闡述之重鏈或輕鏈中之任一者(或其可變 區)至多1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2或1個胺基酸不同(藉由取代、添加或缺失)之胺基酸序列的重鏈及輕鏈可用於形成具有期望特徵(例如本文進一步闡述之彼等)之抗人類OX40抗體。
在各個實施例中，上述抗體展現以下功能性質中之一或多者、兩者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者或更多者或全部：(1)如(例如)藉由Biacore所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類OX40；(2)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類OX40；(3)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴OX40，例如結合至膜結合之食蟹猴OX40；(4)誘導或增強T細胞活化，如藉由以下所證明：(i)表現OX40之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖；(5)(例如)在利用hOX40-293細胞之分析中如藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小之EC50抑制OX40配體與OX40結合；(6)結合至成熟人類OX40之細胞外部分上之表位(SEQ ID NO：2)，例如，在區DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)內之表位；(7)與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1競爭結合至人類OX40；(8)與6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2競爭結合至人類OX40。
該等抗體包括(例如)人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
在某些實施例中，本文所述抗OX40抗體結合至成熟人類OX40 (SEQ ID NO：2)之以下區內之胺基酸殘基：DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)，對應於成熟人類OX40(SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基46-62。
在某些實施例中，本文所述抗OX40抗體結合至成熟人類OX40(SEQ ID NO：2)之以下區內之胺基酸殘基：DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)，對應於成熟人類OX40(SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基89-124。
在某些實施例中，結合至序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)之全部或一部分之本文所述抗OX40抗體結合至序列SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：182)之全部或一部分。
在其他實施例中，結合至序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)之全部或一部分之本文所述抗OX40抗體結合至序列PCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：183)之全部或一部分。
在其他實施例中，結合至序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)之全部或一部分之抗OX40抗體進一步結合至序列QLCTATQDTVCR(SEQ ID NO：184)之全部或一部分。
在其他實施例中，結合至序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)之全部或一部分之本文所述抗OX40抗體進一步結合至序列SQNTVCRPCGPGFYN(SEQ ID NO：185)之全部或一部分。
經修飾重鏈恆定結構域
本文所述抗OX40抗體之重鏈恆定區可屬任一同型，例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4或其組合及/或其修飾形式。在某些實施例中，抗OX40抗體包含改變抗體之性質之經修飾重鏈恆定區。
如本文及實例中進一步論述，抗OX40抗體與未經修飾之hIgG1恆 定區(hIgG1同型抗體)之交聯誘導OX40信號傳導並促進T細胞活化，並尤其促進T細胞增殖、IFN-γ分泌及IL-2分泌。交聯可在利用CHO-CD3-CD32A細胞及人類初代CD4 T細胞之共培養物之分析中藉由(例如)結合至在經轉染CHO細胞之表面上表現之人類CD32A Fcγ受體(FcγR)來發生。交聯亦可(例如)藉由在葡萄球菌腸毒素B(SEB)活化之人類末梢血單核細胞(PBMC)之培養物中添加可溶性多株抗人類Fcγ抗體來發生。
具有經修飾重鏈恆定區(例如，IgG1恆定區，其中CH1/鉸鏈區經hIgG2 CH1/鉸鏈區置換)之抗OX40抗體可具有相對於具有完全IgG1重鏈恆定區之抗體改變抗體之活性的能力。可改變之實例性活性包括(但不限於)(1)在交聯存在或不存在下之T細胞活化，(2)在交聯存在或不存在下之T細胞增殖，及/或(3)在交聯存在或不存在下之細胞介素分泌(例如，IFN-γ、IL-2)。實例中所述之方法可用於確定具有經修飾重鏈恆定區之抗OX40抗體是否展現該等改變活性(例如，參見實例27)。在較佳實施例中，該等改變活性不顯著影響抗體之抗原結合性質，其可使用(例如)FACS、SPR評估。
因此，本文提供改變抗OX40抗體之活性之方法，其包含提供具有非IgG2鉸鏈之抗OX40抗體及用IgG2鉸鏈置換非IgG2鉸鏈。在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含IgG2同型之鉸鏈(「IgG2鉸鏈」)及CH1、CH2及CH3結構域。在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含IgG2鉸鏈及CH1、CH2及CH3結構域，其中CH1、CH2及CH3結構域中之至少一者不屬IgG2同型。IgG2鉸鏈可為野生型IgG2鉸鏈，例如野生型人類IgG2鉸鏈(例如，ERKCCVECPPCPAPPVAG；SEQ ID NO：208)或其變體，限制條件係IgG2鉸鏈保留賦予抗體相對於包含非IgG2鉸鏈之相同抗體改變之活性之能力。在某些實施例中，IgG2鉸鏈變體保留與野生型IgG2鉸鏈類似之剛性或勁度。鉸鏈之剛性可藉由(例如) 電腦建模、電子顯微術、光譜(例如核磁共振(NMR))、X射線結晶照相術(B-因子)或沉降速度分析超離心(AUC)測定以量測或比較包含鉸鏈之抗體之回轉半徑。若包含鉸鏈之抗體具有與具有不同鉸鏈(例如IgG1鉸鏈)之相同抗體之值相差小於5%、10%、25%、50%、75%或100%之自前一句子中所述之測試中之一者獲得之值，則鉸鏈相對於另一鉸鏈可具有類似或較高剛性。熟習此項技術者藉由闡釋該等測試之結果應能夠自測試確定鉸鏈是否具有與另一鉸鏈至少類似之剛性。實例性人類IgG2鉸鏈變體係包含四個半胱胺酸殘基(即，C219、C220、C226及C229)中之一或多者之取代之IgG2鉸鏈。半胱胺酸可由絲胺酸置換。實例性IgG2鉸鏈係包含C219S突變之人類IgG2鉸鏈(例如，ERKSCVECPPCPAPPVAG；SEQ ID NO：209)。可使用之其他IgG2鉸鏈變體包括包含C220、C226及/或C229取代(例如C220S、C226S或C229S突變(其可與C219S突變組合))之人類IgG2鉸鏈。IgG2鉸鏈亦可為鉸鏈之一部分係另一同型之鉸鏈(即，其係嵌合鉸鏈)的IgG2鉸鏈，限制條件係嵌合鉸鏈之剛性至少類似於野生型IgG2鉸鏈之剛性。舉例而言，IgG2鉸鏈可為下鉸鏈(如表2中所定義)屬IgG1同型且係(例如)野生型IgG1下鉸鏈的IgG2鉸鏈。可用於IgG2鉸鏈中之其他IgG2鉸鏈突變包括SE(S267E)、SELF(S267E/L328F)、SDIE(S239D/I332E)、SEF及GASDALIE(G236A/S239D/A330L/I332E)突變。
若鉸鏈之連續胺基酸之一半以上來自同型，則「雜合」或「嵌合」鉸鏈稱作屬特異性同型。舉例而言，將具有IgG2之上鉸鏈及中鉸鏈及IgG1之下鉸鏈的鉸鏈視為IgG2鉸鏈。
在某些實施例中，抗OX40抗體包含包括IgG2鉸鏈之經修飾重鏈恆定區，該IgG2鉸鏈包含以下序列中之一者：ERKCCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO：208)； ERKSCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO：209)；ERKCSVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO：210)；ERKXCVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO：211)；ERKCXVECPPCPAPPVAG(SEQ ID NO：212)；ERKCCVECPPCPAPPVAGX(SEQ ID NO：213)；ERKSCVECPPCPAPPVAGX(SEQ ID NO：214)；ERKCSVECPPCPAPPVAGX(SEQ ID NO：215)；ERKXCVECPPCPAPPVAGX(SEQ ID NO：216)；ERKCXVECPPCPAPPVAGX(SEQ ID NO：217)；ERKCCVECPPCPAPELLGG(SEQ ID NO：218)；ERKSCVECPPCPAPELLGG(SEQ ID NO：219)；ERKCCSVECPPCPAPELLGG(SEQ ID NO：220)；ERKXCVECPPCPAPELLGG(SEQ ID NO：221)；ERKCXVECPPCPAPELLGG(SEQ ID NO：222)；ERKCCVECPPCPAPELLG(SEQ ID NO：223)；ERKSCVECPPCPAPELLG(SEQ ID NO：224)；ERKCCSVECPPCPAPELLG(SEQ ID NO：225)；ERKXCVECPPCPAPELLG(SEQ ID NO：226)；ERKCXVECPPCPAPELLG(SEQ ID NO：227)；ERKCCVECPPCPAP(SEQ ID NO：228)；ERKSCVECPPCPAP(SEQ ID NO：229)；ERKCSVECPPCPAP(SEQ ID NO：230)；ERKXCVECPPCPAP(SEQ ID NO：231)；或ERKCXVECPPCPAP(SEQ ID NO：232)，其中X係除半胱胺酸外之任何胺基酸，或上述序列中之任一者，其中1-5、1-3、1-2或1個胺基酸插在胺 基酸殘基CVE與CPP之間。在某些實施例中，插入THT或GGG。在某些實施例中，1、1-2或1-3個胺基酸插在鉸鏈與CH2結構域之間。舉例而言，甘胺酸可插在鉸鏈與CH2結構域之間。
在某些實施例中，鉸鏈包含SEQ ID NO：208、209、210、211或212，其中1、2、3或所有4個胺基酸P233、V234、A235及G237(對應於C-末端4個胺基酸「PVAG」(SEQ ID NO：233)缺失或經另一胺基酸(例如，IgG1鉸鏈(ELLG(SEQ ID NO：234)或ELLGG(SEQ ID NO：235)之C-末端之胺基酸)取代。在某些實施例中，鉸鏈包含SEQ ID NO：208、209、210、211或212，其中V234、A235及G237缺失或經另一胺基酸取代。在某些實施例中，鉸鏈包含SEQ ID NO：208、209、210、211或212，其中A235及G237缺失或經另一胺基酸取代。在某些實施例中，鉸鏈包含SEQ ID NO：208,209,210,211或212，其中G237缺失或經另一胺基酸取代。在某些實施例中，鉸鏈包含SEQ ID NO：447、448、449、450或451，其中V234及A235缺失或經另一胺基酸取代。IgG2中之PVAG(SEQ ID NO：233)經IgG1鉸鏈之相應胺基酸(即ELLG(SEQ ID NO：234)或ELLGG(SEQ ID NO：235))取代以獲得上文所示雜合鉸鏈，其提供具有IgG2鉸鏈之優點及IgG1鉸鏈之效應物功能之鉸鏈。
在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含由上文所示序列中之一者(例如SEQ ID NO：208-232中之任一者)組成或基本上由其組成之鉸鏈，且在某些實施例中，不包含其他鉸鏈胺基酸殘基。
在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含CH1結構域，其係IgG1或IgG2同型之野生型CH1結構域(分別「IgG1 CH1結構域」或「IgG2 CH1結構域」)。亦可使用同型IgG3及IgG4之CH1結構域(分別「IgG3 CH1結構域」及「IgG2 CH1結構域」)。CH1結構域亦可為野生型CH1結構域之變體，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH1結構域之 變體。CH1結構域之實例性變體包括A114C及T173C及/或C131，例如C131S。
在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含CH2結構域，其係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型之野生型CH2結構域(分別「IgG1 CH2結構域」、「IgG2 CH2結構域」、「IgG3 CH2結構域」或「IgG4 CH2結構域」)。CH2結構域亦可為野生型CH2結構域之變體，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH2結構域之變體。CH2結構域之實例性變體包括調節抗體之Fc區之生物活性(例如ADCC或CDC)或調節抗體之半衰期或其穩定性的變體。在一個實施例中，CH2結構域係具有A330S及P331S突變之人類IgG1 CH2結構域，其中CH2結構域具有相對於無突變之相同CH2結構域降低之效應物功能。本文別處進一步闡述其他突變。
在某些實施例中，經修飾重鏈恆定區包含CH3結構域，其係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型之野生型CH3結構域(分別「IgG1 CH3結構域」、「IgG2 CH3結構域」、「IgG3 CH3結構域」或「IgG4 CH3結構域」)。CH3結構域亦可為野生型CH3結構域之變體，例如野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 CH3結構域之變體。CH3結構域之實例性變體包括調節抗體之Fc區之生物活性(例如ADCC或CDC)或調節抗體之半衰期或其穩定性的變體。
通常，CH1、鉸鏈、CH2或CH3結構域之變體可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個突變、及/或至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個突變、或1-10或1-5個突變，或包含與相應野生型結構域(分別CH1、鉸鏈、CH2或CH3結構域)之胺基酸序列至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列，限制條件係包含特異性變體之重鏈恆定區保留必需生物活性。
表3闡述包含人類CH1、鉸鏈、CH2及/或CH3結構域之實例性人類重鏈恆定區，其中每一結構域係為重鏈恆定區提供期望生物活性之野生型結構域或其變體。表3中之未填充單元指示結構域存在或不存在，且若存在則可屬任一同型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。舉例而言，包含表3中之重鏈恆定區1之抗體係包含至少包含IgG2鉸鏈之重鏈恆定區的抗體，且其亦可包含CH1、CH2及/或CH3結構域，且若存在，則該CH1、CH2及/或CH3結構域屬IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。作為用於理解表3之另一實例，包含重鏈恆定區8之抗體係包括包含IgG1 CH1結構域、及IgG2鉸鏈、IgG1 CH2結構域之重鏈恆定區的抗體，且其亦可包含或不包含CH3結構域，若存在其可屬IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同型。
Figure 105116545-A0202-12-0067-5
Figure 105116545-A0202-12-0068-786
在某些實施例中，抗OX40抗體包含表3中所示之重鏈恆定區且可相對於包含不包含該特定重鏈恆定區之重鏈恆定區的相同抗體具有改變之活性。在某些實施例中，包含表3或4中所示之重鏈恆定區之抗體可相對於包含不包含IgG2鉸鏈或相同IgG2鉸鏈之重鏈恆定區的相同抗體具有改變之活性。在某些實施例中，包含表3或4中所示之重鏈恆定區之抗體可相對於包括包含非IgG2鉸鏈且包含(例如)IgG1、IgG3或IgG4鉸鏈之重鏈恆定區的相同抗體具有改變之活性。在某些實施例中，包含表3或4中所示之重鏈恆定區之抗體可相對於包含不包含相同CH1、鉸鏈、CH2或CH3結構域中之一或多者之重鏈恆定區的相同抗體具有改變之活性。舉例而言，在某些實施例中，包含表3或4中所示之重鏈恆定區之抗體可相對於包含不包含IgG2鉸鏈及特定同型之CH1、CH2及/或CH3結構域之重鏈恆定區的相同抗體具有改變之活性。舉例而言，包含表3中所示重鏈恆定區22之抗體可相對於以下抗 體具有改變之活性：(i)包含不包含IgG2鉸鏈且包含(例如)非IgG2鉸鏈(例如，IgG1,IgG3或IgG4鉸鏈)之重鏈恆定區的相同抗體；(ii)包含不包含IgG2鉸鏈及IgG1 CH1且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG1 CH1之重鏈恆定區的相同抗體；(iii)包含不包含IgG2鉸鏈及IgG2 CH2且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG2 CH2之重鏈恆定區的相同抗體；(iv)包含不包含IgG2鉸鏈及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG1 CH3之重鏈恆定區的相同抗體；(v)包含不包含IgG2鉸鏈、IgG1 CH1及IgG2 CH2且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG1 CH1及/或非IgG2 CH2之重鏈恆定區的相同抗體；(vi)包含不包含IgG2鉸鏈、IgG1 CH1及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG1 CH1及/或非IgG1 CH3之重鏈恆定區的相同抗體；(vii)包含不包含IgG2鉸鏈、IgG2 CH2及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG2 CH及/或非IgG1 CH3之重鏈恆定區的相同抗體；(viii)或包含不包含IgG2鉸鏈、IgG1 CH1、IgG2 CH2及IgG1 CH3且包含(例如)非IgG2鉸鏈及/或非IgG1 CH1及/或非IgG2 CH2及/或非IgG1 CH3之重鏈恆定區的相同抗體。
可連接至抗OX40可變區(例如本文所述之可變區)之實例性經修飾重鏈恆定區提供於表4中，其闡述結構域中之每一者之身份。
Figure 105116545-A0202-12-0069-8
Figure 105116545-A0202-12-0070-9
Figure 105116545-A0202-12-0071-10
其他實例性經修飾重鏈恆定區提供於表5中。
Figure 105116545-A0202-12-0071-11
在某些實施例中，抗OX40抗體包含經修飾重鏈恆定區，其包括包含SEQ ID NO：238、239、240、241及208-232中之任一者之IgG2鉸 鏈或其變體，例如包含如下胺基酸序列之IgG2鉸鏈：(i)與SEQ ID NO：238、239、240、241及208-232中之任一者有1、2、3、4或5個胺基酸取代、添加或缺失不同；(ii)與238、239、240、241及208-232中之任一者有至多5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加或缺失不同；(iii)與SEQ ID NO：238、239、240、241及208-232中之任一者有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5個胺基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含與SEQ ID NO：238、239、240、241及208-232中之任一者至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中在(i)-(iv)中之任一者中，胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代；且其中經修飾重鏈恆定區為抗OX40抗體提供相對於另一重鏈恆定區(例如包含非IgG2鉸鏈之重鏈恆定區)或相對於包含非IgG2鉸鏈之相同經修飾重鏈恆定區改變之活性。
在某些實施例中，抗OX40抗體包含經修飾重鏈恆定區，其包括包含SEQ ID NO：202之IgG1 CH1結構域或包含SEQ ID NO：203或者SEQ ID NO：202或203之變體之IgG2 CH1結構域，該變體(i)與SEQ ID NO：202或203有1、2、3、4或5個胺基酸取代、添加或缺失不同；(ii)與SEQ ID NO：202或203有至多5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加或缺失不同；(iii)與SEQ ID NO：202或203有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5個胺基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含與SEQ ID NO：202或203至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中在(i)-(iv)中之任一者中，胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代；且其中包含經修飾重鏈恆定區之抗OX40抗體可具有相對於具有另一重鏈恆定區(例如包含非IgG2鉸鏈之重鏈恆定區)之抗OX40抗體或相對於包含非IgG2鉸鏈之相同經修飾重鏈恆定區改變之活性。
在某些實施例中，抗OX40抗體包含經修飾重鏈恆定區，其包括 包含SEQ ID NO：204或298或者SEQ ID NO：204或298之變體之IgG1 CH2結構域，該變體(i)與SEQ ID NO：204或298有1、2、3、4或5個胺基酸取代、添加或缺失不同；(ii)與SEQ ID NO：204或298有至多5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加或缺失不同；(iii)與SEQ ID NO：204或298有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5個胺基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含與SEQ ID NO：204或298至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中在(i)-(iv)中之任一者中，胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代；且其中經修飾重鏈恆定區可為抗OX40抗體提供相對於另一重鏈恆定區(例如包含非IgG2鉸鏈之重鏈恆定區)或相對於包含非IgG2鉸鏈之相同經修飾重鏈恆定區改變之活性。
在某些實施例中，抗OX40抗體包含經修飾重鏈恆定區，其包括包含SEQ ID NO：206或SEQ ID NO：206之變體之IgG1 CH3結構域，該變體(i)與SEQ ID NO：206有1、2、3、4或5個胺基酸取代、添加或缺失不同；(ii)與SEQ ID NO：206有至多5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加或缺失不同；(iii)與SEQ ID NO：206有1-5、1-3、1-2、2-5或3-5個胺基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含與SEQ ID NO：206至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中在(i)-(iv)中之任一者中，胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代；且其中經修飾重鏈恆定區可提供相對於另一重鏈恆定區(例如包含非IgG2鉸鏈之重鏈恆定區)或相對於包含非IgG2鉸鏈之經修飾重鏈恆定區改變之活性。
經修飾重鏈恆定區亦可包含上述CH1、鉸鏈、CH2及CH3結構域之組合。
在某些實施例中，抗OX40抗體包含經修飾重鏈恆定區，其包含SEQ ID NO：244-281中之任一者或SEQ ID NO：244-281中之任一者之 變體，該變體(i)與SEQ ID NO：244-281中之任一者有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸取代、添加或缺失不同；(ii)與SEQ ID NO：244-281中之任一者有至多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加或缺失不同；(iii)與SEQ ID NO：244-281有1-5、1-3、1-2、2-5、3-5、1-10或5-10個胺基酸取代、添加或缺失不同及/或(iv)包含與SEQ ID NO：244-281中之任一者至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列，其中在(i)-(iv)中之任一者中，胺基酸取代可為保守胺基酸取代或非保守胺基酸取代；且其中經修飾重鏈恆定區可提供相對於另一重鏈恆定區(例如包含非IgG2鉸鏈之重鏈恆定區)或相對於包含非IgG2鉸鏈之相同經修飾重鏈恆定區改變之活性。
經修飾重鏈恆定區可具有(i)相對於野生型重鏈恆定區類似、降低或增加之效應物功能(例如，結合至FcγR)及或(ii)相對於野生型重鏈恆定區類似、降低或增加之半衰期(或結合至FcRn受體)。
III.具有特定種系序列之抗體
在某些實施例中，本文所述抗OX40抗體包含來自特定種系重鏈免疫球蛋白基因之重鏈可變區及/或來自特定種系輕鏈免疫球蛋白基因之輕鏈可變區。
如本發明之實例中所論述，製備對OX40具有特異性之人類抗體，其包含係人類種系VH 1-08基因、VH 6-6基因、VH 5-51基因、VH 3-9基因、VH DP44基因、VH 3-30.3基因、VH 3-10基因及/或VH 3-13基因之產物或源自其之重鏈可變區。因此，本文提供對人類OX40具有特異性之經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含係選自由以下組成之群之人類VH種系基因之產物或源自其之重鏈可變區：VH 1-08基因、VH 6-6基因、VH 5-51基因、VH 3-9基因、VH DP44基因、VH 3-30.3基因、VH 3-10基因及VH 3-13基因。
製備對OX40具有特異性之人類抗體，其包含係人類種系VK L5基因、VK L6基因、VK LI5基因、VK A27基因及/或VK O14/O4基因之產物或源自其之輕鏈可變區。因此，本文提供經分離單株抗體或其抗原結合部分，其包含係選自由以下組成之群之人類VK種系基因之產物或源自其之輕鏈可變區：VK L5基因、VK L6基因、VK LI5基因、VK A27基因及VK O14/O4基因。
本文所述較佳抗體係包含係上文所列舉人類種系VH基因中之一者之產物或源自其之重鏈可變區且亦包含係上文所列舉人類種系VK基因中之一者之產物或源自其之輕鏈可變區之彼等。
如本文所用，若抗體之可變區係自使用人類種系免疫球蛋白基因之系統獲得，則人類抗體包含係特定種系序列之「產物」或「源自」其之重鏈或輕鏈可變區。該等系統包括利用所關注抗原對攜帶人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠實施免疫或利用所關注抗原篩選展示於噬菌體上之人類免疫球蛋白基因文庫。為人類種系免疫球蛋白序列之「產物」或「源自」其之人類抗體可藉由以下方式來鑑別：比較人類抗體之胺基酸序列與人類種系免疫球蛋白之胺基酸序列，並選擇序列最接近人類抗體序列(即最大一致性%)之人類種系免疫球蛋白序列。為特定人類種系免疫球蛋白序列之「產物」或「源自」其之人類抗體與種系序列相比可含有胺基酸差異，此乃因存在(例如)天然體細胞突變或有意引入定點突變。然而，所選人類抗體之胺基酸序列通常與由人類種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有當與其他物種之種系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類種系序列)相比時將人類抗體鑑別為人類之胺基酸殘基。在某些情形下，人類抗體之胺基酸序列可與由種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少95%、或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。通常，源自特定人類種系序列之人類抗體將展示與由人類種系免疫球蛋白基因編碼之胺基 酸序列不超過10個的胺基酸差異。在某些情形下，人類抗體可展示與由種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過5個或甚至不超過4個、3個、2個或1個的胺基酸差異。
IV.同源抗體
本文提供具有重鏈及輕鏈可變區之抗體，該等重鏈及輕鏈可變區包含與本文所述較佳抗體之胺基酸序列同源之胺基酸序列，且其中抗體保留本文所述抗OX40抗體之期望功能性質。
舉例而言，經分離抗OX40抗體或其抗原結合部分可包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中：(a)重鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：318、17、28、37、48、57、65、73、84及93，或相對於選自由以下組成之群之胺基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50個胺基酸變化(即，胺基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO：318、17、28、37、48、57、65、73、84及93；(b)輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94，或相對於選自由以下組成之群之胺基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50個胺基酸變化(即，胺基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO：18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94；(c)抗體特異性結合至OX40，且(d)抗體展現以下功能性質中之1、2、3、4、5、6種或全部：(1)如(例如)藉由Biacore所量測以(例如)10nM或更小(例如， 0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類OX40；(2)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類OX40；(3)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴OX40，例如結合至膜結合之食蟹猴OX40；(4)誘導或增強T細胞活化，如藉由以下所證明：(i)表現OX40之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖；(5)(例如)在利用hOX40-293細胞之分析中如藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小之EC50抑制OX40配體與OX40結合；(6)結合至成熟人類OX40之細胞外部分上之表位(SEQ ID NO：2)，例如，在區DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)內之表位；(7)與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1競爭結合至人類OX40；(8)與6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2競爭結合至人類OX40。
該抗體可係(例如)人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
在某些實施例中，抗OX40抗體或其抗原結合部分可包含重鏈及輕鏈，其中：(a)重鏈包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125，或相對於選自由以下組成之群之胺基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50個胺基酸變化(即，胺基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO：95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、124及125；(b)輕鏈包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列：SEQ ID NO：96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122，或相對於選自由以下組成之群之胺基酸序列包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50個胺基酸變化(即，胺基酸取代、添加或缺失)：SEQ ID NO：96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122；(c)抗體特異性結合至OX40，且(d)抗體展現以下功能性質中之1、2、3、4、5、6種或全部：(1)如(例如)藉由Biacore所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類OX40；(2)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類OX40；(3)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴OX40，例如結合至膜結合之食蟹猴OX40；(4)誘導或增強T細胞活化，如藉由以下所證明：(i)表現OX40之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖；(5)(例如)在利用hOX40-293細胞之分析中如藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小之EC50抑制OX40配體與OX40結合；(6)結合至成熟人類OX40之細胞外部分上之表位(SEQ ID NO：2)，例如，在區DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)內之表位； (7)與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1競爭結合至人類OX40；(8)與6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2競爭結合至人類OX40。
亦提供包含與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1之相應CDR有1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個胺基酸變化(即，胺基酸取代、添加或缺失)差異之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及/或VLCDR3的抗OX40抗體。在某些實施例中，相對於3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1中之相應序列，抗體包含1、2、3、4、5或6個CDR中之每一者之1-5個胺基酸變化。在某些實施例中，相對於3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及/或20C1中之CDR，抗體在所有CDR中包含總共1-5個胺基酸變化。
具有與3F4、14B6(14B6-1及14B6-2)、23H3、6E1(6E1-1及6E1-2)、18E9、8B11、20B3、14A2(14A2-1及14A2-2)及20C1之彼等序列同源之序列(例如分別SEQ ID NO：17及18；28及29；28及30；37及38；48及49；48及50；57及58；65及66；73及74；84及85；84及86；93及94之VH及VL區、或分別SEQ ID NO：95及96；97及98；99及100；101及102；103及104；105及106；107及108；109及110；111及112；113及114；115及116；117及118；119及120；121及122；123及116；124及116；及125及116之重鏈及輕鏈、或CDR)的抗體可藉由以下方式獲得：誘變(例如，定點或PCR介導之誘變)編碼SEQ ID NO：17、28、37、48、57、65、73、84及93及/或SEQ ID NO：18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94或SEQ ID NO：95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、 123、124及125及/或SEQ ID NO：96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120及122之核酸分子，之後使用本文所述功能分析測試經編碼改變之抗體之保留功能(即，上文(1)至(7)中所述之功能)。
V.具有保守修飾之抗體
本文提供之抗OX40抗體可包括包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中該等CDR序列中之一或多者包含基於本文所述抗體(例如，3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1)的指定胺基酸序列或其保守修飾形式，且其中抗體保留本文所述抗OX40抗體之期望功能性質。因此，抗OX40抗體或其抗原結合部分可包括包含CDR1、CDR2及CDR3序列之重鏈可變區及包含CDR1、CDR2及CDR3序列之輕鏈可變區，其中：(a)重鏈可變區CDR3序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：13、21、33、41、53、61、69、77及89之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代；(b)輕鏈可變區CDR3序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代；(c)抗體特異性結合至OX40，且(d)抗體展現以下功能性質中之1、2、3、4、5、6種或全部：(1)如(例如)藉由Biacore所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類OX40；(2)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小(例如，0.01 nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類OX40；(3)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴OX40，例如結合至膜結合之食蟹猴OX40；(4)誘導或增強T細胞活化，如藉由以下所證明：(i)表現OX40之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖；(5)(例如)在利用hOX40-293細胞之分析中如藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小之EC50抑制OX40配體與OX40結合；(6)結合至成熟人類OX40之細胞外部分上之表位(SEQ ID NO：2)，例如，在區DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)內之表位；(7)與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1競爭結合至人類OX40；(8)與6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2競爭結合至人類OX40。
在較佳實施例中，重鏈可變區CDR2序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：12、20、32、40、52、60、68、76、88及317之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代；且輕鏈可變區CDR2序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代。在另一較佳實施例中，重鏈可變區CDR1序列包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：11、19、31、39、51、59、67、75及87之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代；且輕鏈可變區CDR1序列包含選自由以下組成 之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90之胺基酸序列及其保守修飾形式，例如1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4或1-5個保守胺基酸取代。
在各個實施例中，抗體可係(例如)人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
亦可在除CDR外或以及CDR的抗體部分中進行保守胺基酸取代。舉例而言，可在框架區或Fc區中進行保守胺基酸修飾。相對於本文提供之抗OX40抗體序列，可變區或重鏈或輕鏈可包含1、2、3、4、5、1-2、1-3、1-4、1-5、1-10、1-15、1-20、1-25或1-50個保守胺基酸取代、在某些實施例中，抗OX40抗體包含保守及非保守胺基酸修飾之組合。
VI.競爭抗體及相同表位結合抗體
本文亦提供與本文所述抗OX40抗體(例如，抗體3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1)競爭結合至OX40之抗體。該等競爭抗體可在標準OX40結合分析中基於其競爭性抑制單株抗體3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1中之一或多者結合至OX40的能力來鑑別。舉例而言，可使用標準ELISA分析或競爭性ELISA分析，其中將重組人類OX40蛋白固定於板上，添加不同濃度之未標記之第一抗體，洗滌板，添加經標記之第二抗體，洗滌，且量測結合之標記之量。若增加濃度之未經標記(第一)抗體(亦稱作「封阻抗體」)抑制經標記(第二)抗體之結合，則據稱第一抗體抑制第二抗體與板上之靶標之結合，或據稱與第二抗體競爭結合。另外或或者，可使用BIACORE® SPR分析以評估抗體競爭之能力。測試抗體抑制本文所述抗OX40抗體與OX40之結合之能力展示測試抗體可與抗體競爭結合至OX40。
因此，本文提供藉由使用(例如)如實例中所述FACS將本文所述抗OX40抗體與OX40在細胞(例如活化T細胞)上之結合抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的抗OX40抗體。
在其他實施例中，本文提供與本文所述抗OX40抗體(例如，抗體3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1)中之一或多者結合至相同表位的抗OX40抗體，如使用業內公認之表位定位技術(例如下文所述彼等)所測定。
業內公認之表位定位技術包括(例如)結構方法(例如X射線晶體結構測定(例如，WO2005/044853))、分子建模及核磁共振(NMR)譜(包括在游離時及在與所關注抗體之以複合物結合時OX40中不穩定醯胺氫之H-D交換速率之NMR測定)(Zinn-Justin等人Biochemistry 1992；31：11335-47；Zinn-Justin等人Biochemistry 1993；32,6884-91)。
對於X射線結晶學，結晶可使用業內任何已知方法來完成(例如Giege等人Acta Crystallogr 1994；D50：339-50；McPherson,Eur J Biochem 1990；189：1-23)，包括微配液(microbatch)(例如Chayen,Structure 19976；5：1269-74)、懸滴氣相擴散(例如McPherson,J Biol Chem 1976；251：6300-3)、接種及透析。期望使用具有至少約1mg/mL且較佳約10mg/mL至約20mg/mL之濃度之蛋白製劑。可在含有聚乙二醇1000-20,000(PEG；平均分子量介於約1000Da至約20,000Da之範圍內，較佳約5000Da至約7000Da，更佳約6000Da)之沈澱溶液中最大達成結晶，其中濃度介於約10%至約30%(w/v)之範圍內。亦可期望包括蛋白穩定劑，例如甘油，濃度介於約0.5%至約20%範圍內。適宜鹽(例如氯化鈉、氯化鋰或檸檬酸鈉)亦可在沈澱溶液中係合意的，濃度較佳介於約1mM至約1000mM範圍內。沈澱較佳緩衝至 約3.0至約5.0、較佳約4.0之pH。可用於沈澱溶液中之具體緩衝液可變且為業內所熟知(Scopes,Protein Purification：Principles and Practice，第三版，(1994)Springer-Verlag,New York)。該等緩衝液之實例包括(但不限於)HEPES、Tris、MES及乙酸鹽。晶體可在寬範圍之溫度(包括2℃、4℃、8℃及26℃)下生長。可使用熟知X射線繞射技術研究抗體：抗原晶體且可使用電腦軟體(例如X-PLOR(Yale University,1992，由Molecular Simulations,Inc.分發；參見例如Blundell及Johnson,Meth.Enzymol 1985；114及115,H.W.Wyckoff等人編輯，Academic Press；美國專利申請公開案第2004/0014194號)、及BUSTER(Bricogne,Acta Cryst 1993；D49：37-60；Bricogne,Meth Enzymol 1997；276A：361-423；Carter及Sweet編輯；Roversi等人，Acta Cryst.2000；D56：1313-23)對其進行精製。
其他表位定位方法監測抗體與抗原片段或抗原之突變變化形式的結合，其中由於抗原序列內胺基酸殘基之修飾所致之結合損失經常被視為可指示表位組份。一種此方法係丙胺酸掃描誘變，如(例如)Cunningham及Wells,Science 1989；244：1081：5所述。另一適宜方法係深突變掃描(參見例如Araya等人，Trends in Biotechnology 2011；29：435-42；Forsyth等人，mAbs 2013；5：523-32)。
另外或或者，可使用表位定位(包括構象中斷表位之定位)之計算組合方法。
另外或或者，表位定位可藉由測試抗體與包含OX40之片段(例如非變性或變性片段)之肽之結合來達成。可合成一系列涵蓋OX40(例如，人類OX40)之序列之重疊肽且在(例如)直接ELISA、競爭性ELISA(其中評估肽防止抗體與結合至微量滴定板之孔之OX40之結合之能力)中或在晶片上針對結合進行篩選。其他方法依賴於所關注抗體自組合噬菌體展示肽文庫親和分離特異性短肽(呈天然三維形式或呈變性形 式)的能力。隨後該等肽被視為界定由用於篩選肽文庫之抗體識別之表位的引導者。
亦可藉由基於MS之蛋白質足跡法(例如氫/氘交換質譜(HDX-MS)及蛋白質之快速光化學氧化(FPOP))鑑別表位。HDX-MS可如本文實例及以下中所述來執行：Wei等人，Drug Discovery Today 2014；19：95。FPOP可如(例如)Hambley等人(J American Soc Mass Spectrometry 2005；16：2057)中所述來執行。
可使用業內已知之方法產生並鑑別與本文所述抗OX40抗體競爭結合之抗體。舉例而言，可利用如本文所述人類OX40對小鼠實施免疫，產生雜交瘤，且使用上述方法針對與本文所述抗體競爭結合至OX40之能力篩選所得單株抗體。
結合至與本文所述抗OX40抗體相同之表位之抗體可藉由用含有與抗體結合之表位之OX40之較小片段對小鼠實施免疫來產生。可使用上述方法鑑別表位或包含表位之區。或者，可使用Jespers等人(Biotechnology 1994；12：899)之方法以引導與本文所述抗OX40抗體識別相同表位且因此展現類似性質之抗體的選擇。舉例而言，使用噬菌體展示，首先使抗OX40抗體之重鏈與(較佳人類)輕鏈譜配對以選擇OX40結合抗體，且隨後使新輕鏈與(較佳人類)重鏈譜配對以選擇識別OX40上與本文所述抗OX40抗體相同之表位或表位區的(較佳人類)OX40結合抗體。或者，可藉由誘變編碼抗體之重鏈及輕鏈之cDNA獲得本文所述抗體之變體。
在一些實施例中，本文提供結合至對應於成熟人類OX40(SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基46-62之序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)之全部或一部分的抗體，如實例中之方法所測定。
在某些實施例中，本文所述抗OX40抗體結合至序列SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：182)之 全部或一部分，如藉由實例中之方法所測定。
在其他實施例中，本文所述抗OX40抗體結合至序列PCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：183)之全部或一部分，如藉由實例中之方法所測定。
在其他實施例中，結合至序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)之全部或一部分之抗OX40抗體進一步結合至序列QLCTATQDTVCR(SEQ ID NO：184)之全部或一部分，如藉由實例中之方法所測定。
在其他實施例中，本文所述抗OX40抗體結合至序列SQNTVCRPCGPGFYN(SEQ ID NO：185)之全部或一部分，如藉由實例中之方法所測定。
在其他實施例中，抗OX40抗體在對應於成熟人類OX40(SEQ ID NO：2)之胺基酸殘基89-124之區DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)內結合，如藉由實例中之方法所測定。
VII.經改造及經修飾抗體 VH及VL區
本文亦提供經改造及經修飾之抗體，其可使用具有本文揭示之VH及/或VL序列中之一或多者之抗體作為起始材料以改造經修飾抗體來製備，該經修飾抗體可具有自起始抗體改變之性質。抗體可藉由修飾一個或兩個可變區(即VH及/或VL)內、例如一或多個CDR區內及/或一或多個框架區內之一或多個殘基來改造。另外或或者，抗體可藉由修飾恆定區內之殘基以例如改變抗體之效應物功能來改造。
可實施之一種可變區改造類型係CDR移植。抗體與靶抗原主要經由位於六個重鏈及輕鏈互補決定區(CDR)中之胺基酸殘基相互作用。出於此原因，在個別抗體之間CDR內之胺基酸序列較CDR外之序列更 不同。由於CDR序列負責大部分抗體-抗原相互作用，故可藉由構築包括來自移植至具有不同性質之不同抗體之框架序列之特異性參照抗體之CDR序列的表現載體表現模擬特異性參照抗體之性質的重組抗體(例如參見Riechmann,L.等人(1998)Nature 332：323-327；Jones,P.等人(1986)Nature 321：522-525；Queen,C.等人(1989)Proc.Natl.Acad。參見U.S.A. 86：10029-10033；頒予Winter之美國專利第5,225,539號、及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號；第5,585,089號；第5,693,762號及第6,180,370號)
因此，另一實施例係關於單株抗體或其抗原結合部分，其包括包含分別包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3序列的重鏈可變區：SEQ ID SEQ ID NO：11-13；19-21；31-33；39-41；51-53；59-61；67-69；74-77；及87-89，及包含分別包含選自由以下組成之群之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO：14-16；22-24；25-27；34-36；42-44；45-47；54-56；62-64；70-72；78-80；81-83；及90-92。因此，該等抗體含有單株抗體3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之VH及VL CDR序列，但可含有不同框架序列。
該等框架序列可自包括種系抗體基因序列之公開DNA資料庫或公開參考文獻來獲得。舉例而言，人類重鏈及輕鏈可變區基因之種系DNA序列可參見「VBase」人類種系序列資料庫(可在網際網路www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上獲得)以及Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及公共服務部，NIH公開案第91-3242號；Tomlinson,I.M.等人(1992)「The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops」J,Mol. Biol. 227：776-798；及Cox,J.P.L.等人(1994)「A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage」Eur.J.Immunol.24：827-836；每一者之內容皆以引用方式明確併入本文中。
用於本文所述抗體中之較佳框架序列係在結構域類似於本文所述抗體所使用之框架序列之彼等。可將VH CDR1、2及3序列及VL CDR1、2及3序列移植至具有與發現於衍生出框架序列之種系免疫球蛋白基因中之序列一致之序列的框架區上，或可將CDR序列移植至與種系序列相比含有至多20個、較佳保守胺基酸取代之框架區上。舉例而言，已發現，在某些情況下，有益地突變框架區內之殘基以維持或增強抗體之抗原結合能力(例如，參見頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
本文所述經改造抗體包括已對VH及/或VL內之框架殘基進行修飾以(例如)改良抗體之性質之彼等。通常，進行該等框架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方式係將一或多個框架殘基「回復突變」成相應種系序列。更特定而言，已經受體細胞突變之抗體可含有與衍生出該抗體之種系序列不同之框架殘基。該等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生出該抗體之種系序列來鑑別。為使框架區序列返回至其種系構形，可藉由(例如)定點誘變或PCR介導之誘變將體細胞突變「回復突變」成種系序列。亦意欲涵蓋該等「回復突變」抗體。另一類型之框架修飾涉及突變框架區或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基，以去除T細胞表位，藉此降低抗體之潛在免疫原性。此方法亦稱作「去免疫化」且進一步詳細闡述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
另一類型之可變區修飾係突變CDR區內之胺基酸殘基以改良所關注抗體之一或多種結合性質(例如親和力)。可實施定點誘變或PCR介導之誘變以引入突變，且可在如本文所闡述且於實例中提供之活體外 或活體內分析中評估對所關注抗體結合或其他功能性質之效應。較佳引入保守修飾(如上文所論述)。突變可為胺基酸添加、缺失或較佳取代。此外，通常改變CDR區內不超過一個、兩個、三個、四個或五個殘基。
因此，本文亦提供包含重鏈可變區之抗OX40單株抗體或其抗原結合部分，該重鏈可變區包含：(a)VH CDR1區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：11、19、31、39、51、59、67、75及87，或與SEQ ID NO：11、19、31、39、51、59、67、75及87相比具有1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；(b)VH CDR2區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：12、20、32、40、52、60、68、76、88及317，或與SEQ ID NO：12、20、32、40、52、60、68、76及88相比具有1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；(c)VH CDR3區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：13、21、33、41、53、61、69、77及89，或與SEQ ID NO：13、21、33、41、53、61、69、77及89相比具有1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；(d)VL CDR1區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90，或與SEQ ID NO：14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90相比具有1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；(e)VL CDR2區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91，或與SEQ ID NO：15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91相比具有1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列；及(f)VL CDR3區，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：16、24、27、 36、44、47、56、64、72、80、83及92，或與SEQ ID NO：16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92相比具有1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失或添加之胺基酸序列。
抗體之CDR中之甲硫胺酸殘基會被氧化，引起抗體之潛在化學降解及因此降低功效。因此，本文所述抗OX40抗體之重鏈及/或輕鏈CDR中之一或多個甲硫胺酸殘基可經不會經歷氧化降解之胺基酸殘基置換。
類似地，可自抗OX40抗體、具體而言於CDR中去除去醯胺位點。
較佳消除抗原結合結構域內之潛在糖基化位點以防止可干擾抗原結合之糖基化。參見(例如)美國專利第5,714,350號。
靶向抗原結合
在各個實施例中，本文所述抗體經修飾以選擇性阻斷抗原結合可有害之組織及環境中之抗原結合，但容許可有益之抗原結合。在一個實施例中，生成特異性結合至抗體之抗原結合表面並干擾抗原結合之阻斷肽「掩膜」，該掩膜藉由肽酶可裂解連接體連接至抗體之結合臂之每一者。參見(例如)頒予CytomX之美國專利第8,518,404號。該等構築體可用於治療癌症，其中與非腫瘤組織相比，在腫瘤微環境中蛋白酶含量大大增加。腫瘤微環境中可裂解連接體之選擇性裂解容許解離掩蔽/阻斷肽，從而使得在腫瘤中而非在抗原結合可能引起不期望副作用之周邊組織中選擇性抗原結合。
或者，在相關實施例中，研發包含兩個抗原結合結構域之二價結合化合物(「掩蔽配體」)，其結合至(二價)抗體之抗原結合表面且干擾抗原結合，其中兩個結合結構域掩膜藉由可裂解連接體(例如可藉由肽酶裂解)彼此連接(但非抗體)。參見(例如)頒予Tegopharm Corp.之國際專利申請公開案第WO 2010/077643號。掩蔽配體可包含或源 自抗體意欲結合之抗原，或可獨立地生成。該等掩蔽配體可用於治療癌症，其中與非腫瘤組織相比，在腫瘤微環境中蛋白酶含量大大增加。腫瘤微環境中可裂解連接體之選擇性裂解容許兩個結合結構域彼此解離，從而降低對抗體之抗原結合表面之親合力。掩蔽配體自抗體之所得解離使得在腫瘤中而非在抗原結合可能引起不期望副作用之周邊組織中選擇性抗原結合。
Fc及經修飾之Fc
除自抗原結合結構域與抗原之結合產生之治療抗體之活性(例如在拮抗劑抗體之情形下阻斷同源配體或受體蛋白質，或在激動劑抗體之情形下誘導之信號傳導)外，抗體之Fc蛋白質與免疫系統通常以複雜方式相互作用以引發任何數量之生物效應。效應物功能(例如免疫球蛋白之Fc區)負責許多重要抗體功能，例如抗原依賴性細胞細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導之吞噬作用(ADCP)，從而引起殺死靶細胞，但藉由不同機制。存在重鏈恆定區之五種主要類別或同型(IgA、IgG、IgD、IgE、IgM)，各自具有特徵性效應物功能。該等同型可進一步細分成亞類，例如，IgG分成四個亞類，稱作IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgG分子與三類對抗體之IgG類別具有特異性之Fcγ受體(FcγR)(即FcγRI、FcγRII及FcγRIII)相互作用。已報導對於IgG與FcγR受體之結合重要的序列位於CH2及CH3結構域中。抗體之血清半衰期受該抗體結合至新生Fc受體(FcRn)之能力影響。
本文所述抗OX40抗體可包含與包含不同Fc區之恆定結構域組合之本發明之可變結構域，該等Fc區基於抗體預期用途之生物活性(若存在)選擇。Salfeld(2007)Nat.Biotechnol.25：1369。舉例而言，人類IgG可分類成四個亞類，IgG1、IgG2、IgG3及IgG4，且該等中之每一者包含對於結合至一或多個Fcγ受體(活化受體FcγRI(CD64)、 FcγRIIA、FcγRIIC(CD32)；FcγRIIIA及FcγRIIIB(CD16)及抑制受體FcγRIIB)及對於補體之第一組份(C1q)具有獨特特性的Fc區。人類IgG1及IgG3結合至所有Fcγ受體；IgG2結合至FcγRIIAH131，且以較低親和力結合至FcγRIIAR131 FcγRIIIAV158；IgG4結合至FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC及FcγRIIIAV158；且抑制性受體FcγRIIB對IgG1、IgG2及IgG3較所有其他Fcγ受體具有較低親和力。Bruhns等人(2009)Blood 113：3716。研究已顯示，FcγRI不結合至IgG2，且FcγRIIIB不結合至IgG2或IgG4。同前。一般而言，關於ADCC活性，人類IgG1≧IgG3>>IgG4≧IgG2。因此，例如，可選擇IgG1恆定結構域而非IgG2或IgG4用於期望ADCC之藥物中；若活化表現FcγRIIIA之NK細胞、單核球或巨噬細胞，則可選擇IgG3；且若抗體欲用於使過敏患者脫敏，則可選擇IgG4。若期望抗體無所有效應物功能，則亦可選擇IgG4。
因此，本文所述抗OX40可變區可連接(例如，共價連接或稠合)至Fc，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc，其可屬任何異型或同種異型，例如對於IgG1：G1m、G1m1(a)、G1m2(x)、G1m3(f)、G1m17(z)；對於IgG2：G2m、G2m23(n)；對於IgG3：G3m、G3m21(g1)、G3m28(g5)、G3m11(b0)、G3m5(b1)、G3m13(b3)、G3m14(b4)、G3m10(b5)、G3m15(s)、G3m16(t)、G3m6(c3)、G3m24(c5)、G3m26(u)、G3m27(v)。參見(例如)Jefferis等人(2009)mAbs 1：1)。異型之選擇可受潛在免疫原性問題影響，以(例如)最小化抗藥物抗體之形成。
在某些實施例中，本文所述抗OX40可變區連接至結合至一或多種活化Fc受體(FcγI/CD64、FcγIIa/CD32或FcγIIIa/CD16)之Fc，且藉此刺激ADCC且可引起T細胞耗盡。在特定實施例中，本文所述抗OX40可變區連接至Fc，從而引起耗盡。在其他實施例中，本文所述抗 OX40可變區連接至人類IgG1或IgG3 Fc，即抗體屬IgG1或IgG3同型。在其他實施例中，抗OX40抗體係耗盡抗體。舉例而言，其可耗盡處於腫瘤微環境中之Treg細胞(且藉此增強抗腫瘤活性)，但不顯著耗盡處於腫瘤微環境中之Teff細胞並介導抗腫瘤效應，及/或不顯著耗盡在腫瘤外(例如在末梢中)之Treg及Teff細胞。在其他實施例中，抗OX40抗體屬刺激腫瘤位點處Treg細胞耗盡或消除及Teff細胞之伴隨活化的同型(天然或非天然(例如，包括突變)同型)。在其他實施例中，抗OX40抗體在腫瘤位點處產生升高之Teff對Treg比率，其指示有效力之抗腫瘤活性，且較佳不顯著耗盡在腫瘤外(例如在末梢中)之Treg及Teff細胞。
在某些實施例中，抗OX40抗體阻斷Treg之免疫抑制性活性。在其他實施例中，抗OX40抗體具有降低或消除之FcR結合(例如降低之與活化FcR之結合)的Fc受體。在某些實施例中，抗OX40抗體具有結合至FcRIIb或具有增強之與FcRIIb之結合的Fc，此可提供增強之激動作用。參見(例如)WO 2012/087928；Li及Ravetch(2011)Science 333：1030；Wilson等人(2011)Cancer Cell 19：101；White等人(2011)J.Immunol.187：1754。
本文所述抗OX40可變區可連接至非天然Fc區(例如較差效應物或大部分較差效應物Fc(例如人類IgG2或IgG4)或具有增強之與一或多種活化Fc受體(FcγI、FcγIIa或FcγIIIa)之結合的Fc)，例如以增強腫瘤環境中Treg耗盡。
本文所述可變區可連接至包含一或多個修飾以通常改變抗體之一或多種功能性質(例如血清半衰期、補體結合、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞細胞毒性)的Fc。此外，本文所述抗體可經化學修飾(例如可將一或多個化學部分附接至該抗體)或其可經修飾以改變其糖基化，以改變抗體之一或多種功能性質。該等實施例中之每一者進一步詳細闡述於下文中。Fc區中殘基之編號係Kabat之EU索引之編號。參 照殘基編號提供本文中揭示之序列變體，之後代替天然胺基酸經取代之胺基酸，視情況之前有該位置處之天然殘基。在給定位置處存在多個胺基酸之情況下，例如若序列在天然同型之間不同或若可在該位置處取代多個突變，則其由斜杠分開(例如「X/Y/Z」)。
舉例而言，可在Fc區中進行修飾以生成具有如下性質之Fc變體：(a)增加或降低之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，(b)增加或降低之補體介導之細胞毒性(CDC)，(c)增加或降低之對C1q之親和力及/或(d)相對於母體Fc增加或降低之對Fc受體之親和力。該等Fc區變體通常將包含Fc區中之至少一個胺基酸修飾。據信組合胺基酸修飾尤其合意。舉例而言，變體Fc區可包括其中、(例如)本文中鑑別之具體Fc區位置之兩個、三個、四個、五個等取代。實例性Fc序列變體揭示於本文中，且亦提供於美國專利第5,624,821號、第6,277,375號、第6,737,056號、第6,194,551號、第7,317,091號、第8,101,720號、PCT專利公開案WO 00/42072、WO 01/58957、WO 04/016750、WO 04/029207、WO 04/035752、WO 04/074455、WO 04/099249、WO 04/063351、WO 05/070963、WO 05/040217、WO 05/092925及WO 06/020114處。
降低效應物功能
ADCC活性可藉由修飾Fc區而降低。在某些實施例中，可去除影響與Fc受體之結合之位點，較佳除補救受體結合位點外之位點。在其他實施例中，Fc區可經修飾以去除ADCC位點。ADCC位點為業內已知；關於IgG1中之ADCC位點，參見(例如)Sarmay等人(1992)Molec.Immunol.29(5)：633-9。在一個實施例中，人類IgG1之G236R及L328R變體有效地消除Fc γ R結合。Horton等人(2011)J.Immunol.186：4223及Chu等人(2008)Mol.Immunol.45：3926。在其他實施例中，具有降低之與FcγR之結合之Fc包含胺基酸取代L234A、L235E及 G237A。Gross等人(2001)Immunity 15：289。
CDC活性亦可藉由修飾Fc區而降低。IgG1位置D270、K322、P329及P331處之突變、尤其丙胺酸突變D270A、K322A、P329A及P331A顯著降低相應抗體結合C1q及活化補體之能力。Idusogie等人(2000)J.Immunol 164：4178；WO 99/51642。已顯示IgG1之位置331之修飾(例如P331S)可降低補體結合。Tao等人(1993；J.Exp.Med.178：661及Canfield及Morrison(1991)J.Exp.Med.173：1483。在另一實例中，改變胺基酸位置231至239內之一或多個胺基酸殘基以藉此降低抗體結合補體之能力。WO 94/29351。
在一些實施例中，補體結合降低之Fc具有胺基酸取代A330S及P331S。Gross等人(2001)Immunity 15：289。
對於欲完全避免效應物功能之用途，例如在僅抗原結合即足以生成期望治療益處且效應物功能僅導致不期望副作用(或增加其風險)時，可使用IgG4抗體，或可設計無Fc區或其大部分之抗體或片段，或可使Fc突變以完全消除糖基化(例如N297A)。或者，已生成人類IgG2(CH1結構域及鉸鏈區)及人類IgG4(CH2及CH3結構域)之雜合構築體，其無效應物功能，缺乏結合FcγR之能力(如IgG2)且不能活化補體(如IgG4)。Rother等人(2007)Nat.Biotechnol.25：1256。亦參見Mueller等人(1997)Mol.Immunol.34：441；Labrijn等人(2008)Curr.Op.Immunol.20：479(通常論述Fc修飾以降低效應物功能)。
在其他實施例中，藉由用不同胺基酸殘基置換至少一個胺基酸殘基來改變Fc區以改變抗體之效應物功能。舉例而言，一或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320及322之胺基酸可經不同胺基酸殘基置換，使得抗體具有降低之對效應物配體之親和力，但保留親代抗體之抗原結合能力。改變親和力之效應物配體可為(例如)Fc受體(殘基234、235、236、237、297)或補體之C1組份(殘基 297、318、320、322)。美國專利第5,624,821號及第5,648,260號，二者皆由Winter等人提供。
一個早期專利申請案提出IgG Fc區之修飾以減少結合至FcγRI以減少ADCC(234A；235E；236A；G237A)或阻斷結合至補體組份C1q以消除CDC(E318A或V/K320A及K322A/Q)。WO 88/007089。亦參見Duncan及Winter(1988)Nature 332：563；Chappel等人(1991)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)88：9036；及Sondermann等人(2000)Nature 406：267(論述該等突變對FcγRIII結合之效應)。
降低效應物功能之Fc修飾亦包括在位置234、235、236、237、267、269、325及328處取代、插入及缺失，例如234G、235G、236R、237K、267R、269R、325L及328R。Fc變體可包含236R/328R。用於降低FcγR及補體相互作用之其他修飾包括取代297A、234A、235A、237A、318A、228P、236E、268Q、309L、330S、331S、220S、226S、229S、238S、233P及234V。該等及其他修飾參閱Strohl(2009)Current Opinion in Biotechnology 20：685-691。可藉由使位置233-236及327-331中之一或多處之IgG殘基突變降低效應物功能(ADCC及補體活化二者)，同時維持新生FcR結合(維持半衰期)，例如IgG1中之E233P、L234V、L235A、視情況G236A、A327G、A330S及P331S；IgG4中之E233P、F234V、L235A、視情況G236A；及IgG2中之A330S及P331S。參見Armour等人(1999)Eur.J.Immunol 29：2613；WO 99/58572。降低效應物功能之其他突變包括IgG1中之L234A及L235A(Alegre等人(1994)Transplantation 57：1537)；IgG2中之V234A及G237A(Cole等人(1997)J.Immunol 159：3613；亦參見美國專利第5,834,597號)；及對於IgG4之S228P及L235E(Reddy等人(2000)J.Immunol.164：1925)。人類IgG1中用於降低效應物功能之突變之另一組合包括L234F、L235E及P331S。 Oganesyan等人(2008)Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.64：700。通常參見Labrijn等人(2008)Curr.Op.Immunol.20：479。發現在Fc(IgG1)融合蛋白(阿巴西普(abatacept))背景下降低效應物功能之其他突變係C226S、C229S及P238S(EU殘基編號)。Davis等人(2007)J.Immunol.34：2204。
具有降低之ADCC及/或CDC之其他Fc變體揭示於Glaesner等人(2010)Diabetes Metab.Res.Rev.26：287(IgG4中之F234A及L235A以降低ADCC及ADCP)；Hutchins等人(1995)Proc.Nat'l Acad.Sci.(USA)92：11980(IgG4中之F234A、G237A及E318A)；An等人(2009)MAbs 1：572及美國專利申請公開案2007/0148167(IgG2中之H268Q、V309L、A330S及P331S)；McEarchern等人(2007)Blood 109：1185(IgG1中之C226S、C229S、E233P、L234V、L235A)；Vafa等人(2014)Methods 65：114(IgG2中之V234V、G237A、P238S、H268A、V309L、A330S、P331S)。
在某些實施例中，選擇基本上較差效應物功能之Fc，即，其具有降低之與FcγR之結合及降低之補體結合。較差效應物之實例性Fc(例如IgG1 Fc)包含以下五個突變：L234A、L235E、G237A、A330S及P331S。Gross等人(2001)Immunity 15：289。包含該等突變之實例性重鏈闡述於序列表中，如表23處所詳述(例如SEQ ID NO：11)。該五個取代亦可與N297A組合以消除糖基化。
增強效應物功能
或者，ADCC活性可藉由修飾Fc區來增加。關於ADCC活性，人類IgG1≧IgG3>>IgG4≧IgG2，因此，可選擇IgG1恆定結構域而非IgG2或IgG4用於期望ADCC之藥物中。或者，Fc區可藉由修飾以下位置處之一或多個胺基酸經修飾以增加抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)及/或增加對Fcγ受體之親和力：234、235、236、238、239、 240、241、243、244、245、247、248、249、252、254、255、256、258、262、263、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、299、301、303、305、307、309、312、313、315、320、322、324、325、326、327、329、330、331、332、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、433、434、435、436、437、438或439。參見WO 2012/142515；亦參見WO 00/42072。實例性取代包括236A、239D、239E、268D、267E、268E、268F、324T、332D及332E。實例性變體包括239D/332E、236A/332E、236A/239D/332E、268F/324T、267E/268F、267E/324T及267E/268F/324T。舉例而言，已顯示包含可視情況與I332E組合之G236A變體之人類IgG1 Fc將FcγIIA/FcγIIB結合親和性比率增加約15倍。Richards等人(2008)Mol.Cancer Therap.7：2517；Moore等人(2010)mAbs 2：181。用於增強FcγR及補體相互作用之其他修飾包括但不限於取代298A、333A、334A、326A、2471、339D、339Q、280H、290S、298D、298V、243L、292P、300L、396L、3051及396L。該等及其他修飾參閱Strohl(2009)Current Opinion in Biotechnology 20：685-691。特定而言，可藉由IgG1之位置E333處之變化(例如E333A)增強ADCC及CDC二者。Shields等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591。在IgG1中使用P247I及A339D/Q突變以增強效應物功能揭示於WO2006/020114中，且D280H、K290S±S298D/V揭示於WO2004/074455中。已顯示K326A/W及E333A/S變體增加人類IgG1中之效應物功能，且E333S增加IgG2中之效應物功能。Idusogie學人(2001)J.Immunol.166：2571。
特定而言，已定位人類IgG1對於FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點，且已闡述具有改良結合之變體。Shields等人(2001)J. Biol Chem. 276：6591-6604。顯示位置256、290、298、333、334及339處之具體突變可改良與FcγRIII之結合，包括組合突變體T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A及S298A/E333A/K334A(具有增強之FcγRIIIa結合及ADCC活性)。已鑑別具有強烈增強之與FcγRIIIa之結合的其他IgG1變體，包括具有S239D/I332E及S239D/I332E/A330L突變之變體，其在食蟹猴中顯示對FcγRIIIa之親和力最大增加、FcγRIIb結合減少及強的細胞毒性活性。Lazar等人(2006)Proc.Nat'l Acad Sci.(USA)103：4005；Awan等人(2010)Blood 115：1204；Desjarlais及Lazar(2011)Exp.Cell Res.317：1278。向抗體(例如阿倫單抗(alemtuzumab)(CD52特異性)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HER2/neu特異性)、利妥昔單抗(rituximab)(CD20特異性)及西妥昔單抗(cetuximab)(EGFR特異性))中引入三重突變翻譯成大大增強之活體外ADCC活性，且S239D/I332E變體顯示在猴中增強之耗盡B細胞之能力。Lazar等人(2006)Proc.Nat'l Acad Sci.(USA)103：4005。另外，已鑑別含有L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I及P396L突變之IgG1突變體，其在B細胞惡性病及乳癌之模型中在表現人類FcγRIIIa之轉基因小鼠中展現增強之與FcγRIIIa之結合及同時增強之ADCC活性。Stavenhagen等人(2007)Cancer Res.67：8882；美國專利第8,652,466號；Nordstrom等人(2011)Breast Cancer Res.13：R123。
不同IgG同型亦展現差異CDC活性(IgG3>IgG1>>IgG2
Figure 105116545-A0202-12-0099-764
IgG4)。Dangl等人(1988)EMBO J.7：1989。對於期望增強之CDC之用途，亦可引入增加與C1q之結合之突變。可藉由IgG2中之K326及/或E333處之突變(例如K326W(其降低ADCC活性)及E333S)增強招募補體(CDC)之能力，以增加與C1q、即補體級聯之第一組份之結合。Idusogie等人(2001)J.Immunol.166：2571。向人類IgG1中引入S267E/H268F/ S324T(單獨或以任一組合)可增強C1q結合。Moore等人(2010)mAbs 2：181。Natsume等人(2008)Cancer Res.68：3863(其中之圖1)之IgG1/IgG3雜合同型抗體「113F」之Fc區亦賦予增強之CDC。亦參見Michaelsen等人(2009)Scand.J.Immunol.70：553及Redpath等人(1998)Immunology 93：595。
可增加或減少效應物功能之其他突變揭示於Dall' Acqua等人(2006)J.Immunol.177：1129處。亦參見Carter(2006)Nat.Rev.Immunol.6：343；Presta(2008)Curr.Op.Immunol.20：460。
亦可使用增強對抑制性受體FcγRIIb之親和力的Fc變體，以例如增強細胞凋亡誘導或佐劑活性。Li及Ravetch(2011)Science 333：1030；Li及Ravetch(2012)Proc.Nat'l Acad.Sci(USA)109：10966；美國專利申請公開案2014/0010812。該等變體可提供具有與FcγRIIb+細胞(包括例如B細胞及單核球)相關之免疫調節活性的抗體。在一個實施例中，Fc變體相對於一或多種活化受體提供選擇性增強之對FcγRIIb之親和力。根據EU索引，用於改變與FcγRIIb之結合之修飾包括選自由以下組成之群之位置處之一或多個修飾：234、235、236、237、239、266、267、268、325、326、327、328及332。用於增強FcγRIIb親和力之實例性取代包括但不限於234D、234E、234F、234W、235D、235F、235R、235 Y、236D、236N、237D、237N、239D、239E、266M、267D、267E、268D、268E、327D、327E、328F、328W、328Y及332E。實例性取代包括235Y、236D、239D、266M、267E、268D、268E、328F、328W及328Y。用於增強與FcγRIIb之結合之其他Fc變體包括235Y/267E、236D/267E、239D/268D、239D/267E、267E/268D、267E/268E及267E/328F。特定而言，人類IgG1之S267E、G236D、S239D、L328F及I332E變體(包括S267E+L328F雙重變體)尤其在增強對抑制性FcγRIIb受體之親和力中 具有特定價值。Chu等人(2008)Mol.Immunol 45：3926；美國專利申請公開案2006/024298；WO 2012/087928。對FcγRIIb之增強特異性(如不同於FcγRIIaR131)可藉由添加P238D取代來獲得。Mimoto等人(2013)Protein.Eng.Des.& Selection 26：589；WO 2012/115241。
在某些實施例中，抗體經修飾以延長其生物半衰期。各種方式係可行的。舉例而言，此可藉由增加Fc區對FcRn之結合親和力來進行。在一個實施例中，在CH1或CL區內改變抗體以含有取自IgG之Fc區之CH2結構域之兩個環的補救受體結合表位，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所述。增加與FcRn之結合及/或改良藥物動力學性質之其他實例性Fc變體包括位置259、308及434處之取代，包括(例如)259I、308F、428L、428M、434S、434H、434F、434Y及434M。增加與FcRn之Fc結合之其他變體包括：250E、250Q、428L、428F、250Q/428L(Hinton等人，2004,J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216,Hinton等人2006 Journal of Immunology 176：346-356)、256A、272A、305A、307A、311A、312A、378Q、380A、382A、434A(Shields等人，Journal of Biological Chemistry,2001,276(9)：6591-6604)、252F、252Y、252W、254T、256Q、256E、256D、433R、434F、434Y、252Y/254T/256E、433K/434F/436H(Dall Acqua等人Journal of Immunology,2002,169：5171-5180,Dall'Acqua等人，2006,Journal of Biological Chemistry 281：23514-23524)。參見美國專利第8,367,805號。
已提出IgG Fc中之某些保守殘基之修飾形式(I253/H310/Q311/H433/N434)(例如N434A變體(Yeung等人(2009)J.Immunol 182：7663)作為增加FcRn親和力之方式，由此延長循環中抗體之半衰期。WO 98/023289。已顯示包含M428L及N434S之組合Fc變體可增加FcRn結合並將血清半衰期延長至多5倍。Zalevsky等人(2010) Nat.Biotechnol.28：157。包含T307A、E380A及N434A修飾之組合Fc變體亦延長IgG1抗體之半衰期。Petkova等人(2006)Int.Immunol.18：1759。另外，亦已顯示包含M252Y/M428L、M428L/N434H、M428L/N434F、M428L/N434Y、M428L/N434A、M428L/N434M及M428L/N434S變體之組合Fc變體可延長半衰期。WO 2009/086320。
此外，包含M252Y、S254T及T256E之組合Fc變體將半衰期延長幾乎4倍。Dall'Acqua等人(2006)J.Biol.Chem.281：23514。使用提供增加FcRn親和力但降低之pH依賴性之相關IgG1修飾(M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F)以生成IgG1構築體(「MST-HN Abdeg」)用作競爭者以防止其他抗體與FcRn結合，從而產生該另一抗體、即內源性IgG(例如在自體免疫設定中)或另一外源性(治療)mAb之增加清除率。Vaccaro等人(2005)Nat.Biotechnol.23：1283；WO 2006/130834。
用於增加FcRn結合之其他修飾闡述於Yeung等人(2010)J.Immunol.182：7663-7671；6,277,375；6,821,505；WO 97/34631；WO 2002/060919中。
在某些實施例中，可使用雜合IgG同型以增加FcRn結合，且潛在地延長半衰期。舉例而言，可藉由用兩種同型不同之位置處之IgG3的胺基酸取代CH2及/或CH3區中之IgG1位置構築IgG1/IgG3雜合變體。因此，可構築雜合變體IgG抗體，其包含一或多個取代，例如274Q、276K、300F、339T、356E、358M、384S、392N、397M、422I、435R及436F。在本文所述其他實施例中，可藉由用兩種同型不同之位置處之IgG1的胺基酸取代CH2及/或CH3區中之IgG2位置構築IgG1/IgG2雜合變體。因此，可構築雜合變體IgG抗體，其包含一或多個取代，例如以下胺基酸取代中之一或多者：233E、234L、235L、-236G(稱作在位置236處插入甘胺酸)及327A。參見美國專利第8,629,113號。生成IgG1/IgG2/IgG4序列之雜合體，其據稱延長血清半 衰期並改良表現。美國專利第7,867,491號(其中之序列編號18)。
亦可藉由聚乙二醇化延長本發明抗體之血清半衰期。抗體可經聚乙二醇化以(例如)延長抗體之生物(例如血清)半衰期。為聚乙二醇化抗體，通常在一或多個PEG基團附接至抗體或抗體片段之條件下使抗體或其片段與聚乙二醇(PEG)試劑(例如PEG之反應性酯或醛衍生物)反應。較佳地，聚乙二醇化係經由與反應性PEG分子(或類似反應性水溶性聚合物)之醯化反應或烷基化反應來實施。如本文所用術語「聚乙二醇」意欲涵蓋PEG之用於衍生其他蛋白質之任一形式，例如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來醯亞胺。在某些實施例中，欲聚乙二醇化之抗體係無糖基化抗體。聚乙二醇化蛋白質之方法為業內已知且可適用於本文所述抗體。參見(例如)Nishimura等人之EP 0154316及Ishikawa等人之EP 0401384。
或者，在一些情況下，可期望縮短抗體之半衰期，而非延長抗體之半衰期。人類IgG1之Fc中之修飾(例如1253A(Hornick等人(2000)J.Nucl.Med.41：355)及H435A/RI253A或H310A(Kim等人(2000)Eur.J.Immunol.29：2819))降低FcRn結合，由此縮短半衰期(增加清除率)用於快速清除較佳之情況中，例如醫學成像。亦參見Kenanova等人(2005)Cancer Res.65：622。增強清除率之其他方式包括將本發明之抗原結合結構域格式化為無結合FcRn之能力之抗體片段(例如Fab片段)。該修飾可將抗體之循環半衰期自幾週減少至幾小時。若需要，隨後可使用抗體片段之選擇性聚乙二醇化以微調(延長)抗體片段之半衰期。Chapman等人(1999)Nat.Biotechnol.17：780。亦可在(例如)融合蛋白構築體中將抗體片段稠合至人類血清白蛋白以延長半衰期。Yeh等人(1992)Proc.Nat'l Acad.Sci.89：1904。或者，可利用本發明之第一抗原結合結構域及結合至人類血清白蛋白(HSA)之第二抗原結合結構域構築雙特異性抗體。參見國際專利申請公開案WO 2009/127691及其中引用之專利參考文獻。或者，可向抗體片段添加專門多肽序列以延長半衰期，例如「XTEN」多肽序列。Schellenberger等人(2009)Nat.Biotechnol.27：1186；國際專利申請公開案WO 2010/091122。
其他Fc變體
在使用IgG4恆定結構域使，較佳包括取代S228P，其模擬IgG1中之鉸鏈序列且藉此穩定IgG4分子，例如減少所治療患者中治療抗體與內源性IgG4之間之Fab-臂交換。Labrijn等人(2009)Nat.Biotechnol.27：767；Reddy等人(2000)J.Immunol.164：1925。
可藉由D221G及K222S修飾消除IgG1構築體之鉸鏈中之潛在蛋白酶裂解位點，從而增加抗體之穩定性。WO 2014/043344。
Fc變體對其配體(Fc受體)之親和力及結合性質可藉由業內已知之多種活體外分析方法(基於生物化學或免疫學之分析)來測定，該等方法包括(但不限於)平衡方法(例如，酶聯免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA))或動力學(例如，BIACORE® SPR分析)及其他方法，例如間接結合分析、競爭抑制分析、螢光共振能量轉移(FRET)、凝膠電泳及層析(例如，凝膠過濾)。該等及其他方法可在所檢查組份之一或多者上利用標記及/或採用多種檢測方法，其包括(但不限於)發色、螢光、發光或同位素標記。結合親和力及動力學之詳細說明可參見Paul,W.E.編輯，Fundamental Immunology，第4版，Lippincott-Raven,Philadelphia(1999)，其關注抗體-免疫原相互作用。
在其他實施例中，抗體之糖基化經修飾以增加或減少效應物功能。舉例而言，可藉由使位置297處之保守天冬醯胺殘基(例如N297A)突變、由此取消補體及FcγRI結合來製得無所有效應物功能之無糖基化抗體。Bolt等人(1993)Eur.J.Immunol.23：403。亦參見Tao及Morrison(1989)J.Immunol.143：2595(使用IgG1中之N297Q以消除位 置297處之糖基化)。
儘管無糖基化抗體通常無效應物功能，但可引入突變以恢復該功能。可使無糖基化抗體(例如自N297A/C/D/或H突變產生或在未糖基化蛋白質之系統(例如大腸桿菌)中產生之彼等)進一步突變以恢復FcγR結合，例如S298G及/或T299A/G/或H(WO 2009/079242)、或E382V及M428I(Jung等人(2010)Proc.Nat'l Acad.Sci(USA)107：604)。
另外，可藉由改變糖基化製備具有增強ADCC之抗體。舉例而言，基於與FcγRIIIa之改良結合，已顯示自重鏈Asn297連接之寡糖去除岩藻糖可增加ADCC。Shields等人(2002)JBC 277：26733；Niwa等人(2005)J.Immunol.Methods 306：151；Cardarelli等人(2009)Clin.Cancer Res.15：3376(MDX-1401)；Cardarelli等人(2010)Cancer Immunol.Immunotherap.59：257(MDX-1342)。該等低岩藻糖抗體可在(例如)無岩藻糖基轉移酶(FUT8)之基因剔除中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中產生(Yamane-Ohnuki等人(2004)Biotechnol.Bioeng.87：614)，或在生成岩藻糖基化抗體之其他細胞中產生。參見(例如)Zhang等人(2011)mAbs 3：289及Li等人(2006)Nat.Biotechnol 24：210(二者皆闡述經糖改造之甲醇酵母(Pichia pastoris.)中之抗體產生)；Mossner等人(2010)Blood 115：4393；Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733；Shinkawa等人(2003)J.Biol.Chem.278：3466；EP 1176195B1。ADCC亦可如PCT公開案WO 03/035835中所述增強，該公開案揭示使用變體CHO細胞系Lec13，其將岩藻糖附接至Asn(297)連接之碳水化合物之能力降低，亦導致在該宿主細胞中表現之抗體的低岩藻糖基化(亦參見Shields,R.L.等人，(2002)J.Biol.Chem. 277：26733-26740)。或者，可在抗體產生期間向培養基中添加岩藻糖類似物以抑制將岩藻糖納入抗體上之碳水化合物中(參見(例如)WO 2009/135181)。
增加抗體鏈接之寡糖中之平分型GlcNac結構亦增強ADCC。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342闡述經改造以表現修飾醣蛋白之糖基轉移酶(例如，β(1,4)-N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))的細胞系，使得在經改造細胞系中表現之抗體展現增加之平分型GlcNac結構，從而增加抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人，(1999)Nat.Biotech. 17：176-180)。
已研發不含半乳糖、唾液酸、岩藻糖及木糖殘基(所謂GNGN糖型)且展現增強之ADCC及ADCP但減少之CDC之其他糖基化變體，以及不含唾液酸、岩藻糖及木糖(所謂G1/G2糖型)且展現增強之ADCC、ADCP及CDC之其他糖基化變體。美國專利申請公開案第2013/0149300號。視情況在經遺傳修飾之圓葉菸草(N.benthamiana)植物中產生具有該等糖基化型式之抗體，其中敲除內源性木糖基及岩藻糖基轉移酶基因。
糖改造亦可用於藉由改變Fc區之Asn297處附接之碳水化合物鏈之α2,6唾液酸基含量來修飾IgG構築體之抗發炎性質，其中增加比例之α2,6唾液酸化形式產生增強之抗發炎效應。參見Nimmerjahn等人(2008)Ann.Rev.Immunol.26：513。相反，在不期望抗發炎性質之情形下，具有α2,6唾液酸化碳水化合物之抗體之比例減少可有用。於美國專利申請公開案第2008/0206246號處提供(例如)藉由選擇性純化α2,6唾液酸化形式或藉由酶修飾修飾抗體之α2,6唾液酸化含量的方法。在其他實施例中，Fc區之胺基酸序列可藉由(例如)納入F241A修飾經修飾以模擬α2,6唾液酸化之效應(參見(例如)WO 2013/095966)。
VIII.抗體物理性質
本文所述抗體可在輕鏈或重鏈可變區中含有一或多個糖基化位點。該等糖基化位點由於改變之抗原結合可增加抗體之免疫原性或改變抗體之pK(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala 及Morrison(2004)J.Immunol 172：5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med 168：1099-109；Spiro(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316：452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列之基序處發生。在一些實施例中，抗OX40抗體不含可變區糖基化。此可藉由選擇可變區中不含糖基化基序之抗體或藉由使糖基化區內之殘基突變來完成。
在某些實施例中，本文所述抗體不含天冬醯胺異構現象位點。天冬醯胺之去醯胺化可在N-G或D-G序列上發生且引起產生向多肽鏈中引入扭結且降低其穩定性(異天冬胺酸效應)的異天冬胺酸殘基。例如，若抗體之重鏈及/或輕鏈CDR序列中存在胺基酸序列Asp-Gly，則該序列經不會經歷異構化之胺基酸序列取代。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：76中所述之重鏈可變區CDR2序列，但其中Asp-Gly序列(LISY DG SRKHYADSVKG；SEQ ID NO：76)中之Asp或Gly經不會經歷異構化之胺基酸序列置換，例如Asp-Ser或Ser-Gly序列。在另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO：88中所述之重鏈可變區CDR2序列，但其中Asp-Gly序列(AIDT DG GTFYADSVRG；SEQ ID NO：88)中之Asp或Gly經不會經歷異構化之胺基酸序列置換，例如Ser-Gly、Asp-Ala或Ser-Thr序列。
每一抗體將具有獨特等電點(pI)，其通常在介於6與9.5之間之pH範圍內。IgG1抗體之pI通常在7-9.5之pH範圍內且IgG4抗體之pI通常在6-8之pH範圍內。推測認為pI在正常範圍外之抗體可能在活體內條件下有一些展開及不穩定。因此，較佳係具有含有在正常範圍內之pI值之抗OX40抗體。此可藉由選擇pI在正常範圍內之抗體或使帶電表面殘基突變來達成。
每一抗體將具有特徵性熔融溫度，其中熔融溫度越高表示活體內總體穩定性越大(Krishnamurthy R及Manning M C(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。通常，較佳地，TM1(初始展開之溫度)大於60℃、較佳大於65℃、甚至更佳大於70℃。抗體之熔點可使用差示掃描量熱法(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)Immunol Lett 68：47-52)或圓二色性(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)來量測。在較佳實施例中，選擇不會快速降解之抗體。抗體之降解可使用毛細管電泳(CE)及MALDI-MS(Alexander A J及Hughes D E(1995)Anal Chem 67：3626-32)來量測。在某些實施例中，本文揭示之抗OX40抗體(例如，OX40.21抗體)具有增加之穩定性。
因此，在其他實施例中，選擇具有最小聚集效應之抗體，聚集效應可導致觸發不期望免疫反應及/或改變或不利之藥物動力學性質。通常，抗體可接受25%或更小、較佳20%或更小、甚至更佳15%或更小、甚至更佳10%或更小且甚至更佳5%或更小之聚集度。聚集度可藉由若干技術(包括尺寸排除管柱(SEC)、高效液相層析(HPLC)及光散射)來量測。
IX.改造抗體之方法
如本文所論述，可藉由修飾VH及/或VL序列或抗體之恆定區使用具有本文揭示之VH及VL序列之抗OX40抗體以產生新抗OX40抗體。因此，在另一實施例中，使用本文所述抗OX40抗體(例如3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1)之結構特徵以產生結構上有關之抗OX40抗體，其保留本文所述抗體之至少一種功能性質，例如與人類OX40及食蟹猴OX40之結合。舉例而言，可將3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1或其突變之一或多個CDR區與已知框架區及/或其他CDR以重組方式組合以產生其他經重組改造之本文所述抗OX40抗體，如上文所論述。其他類型之修 飾包括先前部分中所闡述之彼等。用於改造方法之起始材料係本文所提供VH及/或VL序列中之一或多者或其一或多個CDR區。為產生經改造抗體，實際上無需製備(即表現為蛋白質)具有本文所提供VH及/或VL序列中之一或多者或其一或多個CDR區之抗體。相反，使用序列中所含有之資訊作為起始材料以產生源自初始序列之「第二代」序列，且然後製備「第二代」序列並表現為蛋白質。
因此，本文提供生成抗OX40抗體之方法，其包含：(a)提供：(i)重鏈可變區抗體序列，其包含選自由以下組成之群之CDR1序列：SEQ ID NO：11、19、31、39、51、59、67、75及87、選自由以下組成之群之CDR2序列：SEQ ID NO：12、20、32、40、52、60、68、76、88及317及/或選自由以下組成之群之CDR3序列：SEQ ID NO：13、21、33、41、53、61、69、77及89；及(ii)輕鏈可變區抗體序列，其包含選自由以下組成之群之CDR1序列：SEQ ID NO：14、22、25、34、42、45、54、62、70、78、81及90、選自由以下組成之群之CDR2序列：SEQ ID NO：15、23、26、35、43、46、55、63、71、79、82及91及/或選自由以下組成之群之CDR3序列：SEQ ID NO：16、24、27、36、44、47、56、64、72、80、83及92；(b)改變重鏈可變區抗體序列及/或輕鏈可變區抗體序列內之至少一個胺基酸殘基以產生至少一個經改變之抗體序列；及(c)使經改變之抗體序列表現為蛋白質。
可使用標準分子生物學技術來製備並表現經改變之抗體序列。
較佳地，由經改變之抗體序列編碼之抗體係保留本文所述抗OX40抗體之功能性質中之一者、一些或全部者，該等功能性質包括：(1)如(例如)藉由Biacore所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之KD結合至可溶性人類OX40； (2)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小(例如，0.01nM至1nM)之EC50結合至膜結合之人類OX40；(3)如(例如)藉由FACS所量測以(例如)10nM或更小(例如，0.01nM至10nM)之EC50結合至食蟹猴OX40，例如結合至膜結合之食蟹猴OX40；(4)誘導或增強T細胞活化，如藉由以下所證明：(i)表現OX40之T細胞中增加之IL-2及/或IFN-γ產生及/或(ii)增強之T細胞增殖；(5)(例如)在利用hOX40-293細胞之分析中如藉由FACS所量測以(例如)1nM或更小之EC50抑制OX40配體與OX40結合；(6)結合至成熟人類OX40之細胞外部分上之表位(SEQ ID NO：2)，例如，在區DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)或DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)內之表位；(7)與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、18E9、8B11、20B3及20C1競爭結合至人類OX40；(8)與6E1-1、6E1-2、14A2-1及14A2-2競爭結合至人類OX40。
經改變之抗體可展現如上文(1)至(7)所述之功能性質中之一或多者、兩者或更多者、三者或更多者、四者或更多者、五者或更多者、六者或全部。經改變之抗體之功能特性可使用業內可獲得及/或本文所闡述之標準分析(例如實例中所闡釋之彼等(例如ELISA、FACS))來評估。
在改造本文所述抗體之方法之某些實施例中，可沿抗OX40抗體編碼序列之全部或部分隨機或選擇性引入突變且可針對如本文所述結合活性及/或其他功能性質篩選所得經修飾抗OX40抗體。突變方法已於業內有所闡述。舉例而言，Short之PCT公開案WO 02/092780闡述使用飽和誘變、合成性接合裝配或其組合產生及篩選抗體突變之方 法。或者，Lazar等人之PCT公開案WO 03/074679闡述使用計算篩選方法以最佳化抗體之生理化學性質的方法。
X.核酸分子
本文亦提供編碼本文所述抗體之核酸分子。該等核酸可存在於全細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純之形式存在。當藉由標準技術實施純化以清除其他細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸(例如其他染色體DNA，例如連接至自然界中經分離DNA之染色體DNA)或蛋白質)時，核酸係「經分離」或「使得實質上純的」，該等標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶、管柱層析、限制酶、瓊脂糖凝膠電泳及業內熟知之其他方法。參見F.Ausubel等人編輯，(1987)Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。核酸可為(例如)DNA或RNA且可含有或不含有內含子序列。在某些實施例中，核酸係cDNA分子。
本文提供之核酸可使用標準分子生物學技術來獲得。對於由雜交瘤(例如自攜帶人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠製備之雜交瘤，如下文進一步闡述)表現之抗體，編碼藉由雜交瘤製備之抗體之輕鏈及重鏈的cDNA可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術來獲得。對於自免疫球蛋白基因文庫獲得(例如使用噬菌體展示技術)之抗體，可自文庫回收編碼抗體之核酸。
較佳核酸分子係編碼3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之VH及VL序列之彼等。編碼3F4、14B6、23H3、6E1、18E9、8B11、20B3、14A2及20C1之VH序列之實例性DNA序列分別闡述於SEQ ID NO：126、128、131、133、136、138、140、142及145中。編碼3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之VL序列之實例性DNA序列分別闡述於SEQ ID NO：127、129、 130、132、134、135、137、139、141、143、144及146中。編碼重鏈序列之實例性DNA序列闡述於SEQ ID NO：147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、176及177中。編碼輕鏈序列之實例性DNA序列闡述於SEQ ID NO：148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172及174中。
編碼抗OX40抗體之成熟VH及VL結構域之實例性核苷酸序列分別闡述於SEQ ID NO：145及146中。編碼抗OX40抗體之重鏈之實例性核苷酸序列闡述於SEQ ID NO：177中。編碼OX40抗體之輕鏈之實例性核苷酸序列闡述於SEQ ID NO：168中。
製備本文提供之抗OX40抗體之方法可包括使重鏈及輕鏈在包含編碼具有信號肽之重鏈及輕鏈之核苷酸序列的細胞系中表現。本文中亦提供包含該等核苷酸序列之宿主細胞。
一旦獲得編碼VH及VL區段之DNA片段，即可藉由標準重組DNA技術進一步操縱該等DNA片段，以(例如)將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段(例如抗體恆定區或撓性連接體)。如本上下文中使用之術語「可操作地連接」係指兩個DNA片段接合，使得其編碼之胺基酸序列保持在框架內。
可藉由將編碼VH之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區(鉸鏈、CH1、CH2及/或CH3)之另一DNA分子，將編碼VH區之經分離DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如，參見Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及公共服務部，NIH公開案第91-3242號)且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，例如 IgG1區。對於Fab片段重鏈基因，編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子將編碼VL區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如，參見Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美國衛生及公共服務部，NIH公開案第91-3242號)且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
為產生scFv基因，將編碼VH及VL之DNA片段可操作地連接至編碼撓性連接體(例如編碼胺基酸序列(Gly4-Ser)3)之另一片段，使得VH及VL序列可表現為鄰接單鏈蛋白，其中VL及VH區藉由撓性連接體接合(例如，參見Bird等人(1988)Science 242：423-426；Huston等人(1988)Proc.Natl Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，(1990)Nature 348：552-554)。
本文亦提供編碼與3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1單株抗體之序列同源之VH及VL序列的核酸分子。實例性核酸分子編碼與編碼3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1單株抗體之VH及VL序列之核酸分子至少70%一致、例如至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%一致之VH及VL序列。本文亦提供具有保守取代(即，在核酸分子翻譯時不改變所得胺基酸序列之取代)之核酸分子，例如用於密碼子最佳化。
XI.抗體生成
本文所述抗OX40抗體可使用多種已知技術(例如由Kohler及 Milstein,Nature 256：495(1975)闡述之標準體細胞雜交技術)來產生。儘管體細胞雜交程序較佳，但原則上亦可採用產生單株抗體之其他技術，例如B淋巴球之病毒或致癌轉化、使用人類抗體基因文庫之噬菌體展示技術。
製備雜交瘤之較佳動物系統係鼠類系統。小鼠中之雜交瘤產生係已充分建立之程序。業內已知分離融合用免疫脾細胞之免疫方案及技術。亦已知融合配偶體(例如，鼠類骨髓瘤細胞)及融合程序。
本文所述嵌合或人類化抗體可基於如上文所述製備之鼠類單株抗體之序列製備。編碼重鏈及輕鏈免疫球蛋白之DNA可自所關注鼠類雜交瘤獲得並使用標準分子生物學技術加以改造以含有非鼠類(例如，人類)免疫球蛋白序列。舉例而言，為產生嵌合抗體，可使用業內已知方法將鼠類可變區連接至人類恆定區(例如，參見頒予Cabilly等人之美國專利第4,816,567號)。為產生人類化抗體，可使用業內已知方法將鼠類CDR區插入人類框架中(例如，參見頒予Winter之美國專利第5,225,539號及頒予Queen等人之美國專利第5,530,101號、第5,585,089號、第5,693,762號及第6,180,370號)。
在一個實施例中，本文所述抗體係人類單株抗體。可使用攜帶人類免疫系統而非小鼠系統之部分的轉基因或轉染色體小鼠來產生針對OX40之該等人類單株抗體。該等轉基因及轉染色體小鼠包括在本文中分別稱為HuMAb小鼠及KM小鼠之小鼠，且在本文中統稱為「人類Ig小鼠」。
HuMAb mouse®(Medarex,Inc.)含有編碼非重排人類重鏈(μ及γ)及κ輕鏈免疫球蛋白序列以及使內源性μ及κ鏈基因座不活化之靶突變的人類免疫球蛋白基因微小基因座(例如，參見Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠展現降低之小鼠IgM或κ表現，且因應免疫，所引入人類重鏈及輕鏈轉基因經歷類別切換及體細 胞突變以生成高親和力人類IgGκ單株(Lonberg,N.等人(1994)，上文文獻；參閱Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg,N.及Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol. 13：65-93，及Harding,F.及Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci. 764：536-546)。HuMab小鼠之製備及使用及由該等小鼠攜帶之基因體修飾進一步闡述於以下中：Taylor,L.等人(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen,J.等人(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3720-3724；Choi等人(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen,J.等人(1993)EMBO J. 12：821-830；Tuaillon等人(1994)J.Immunol. 152：2912-2920：Taylor,L.等人(1994)International Immunology 6：579-591；及Fishwild,D.等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，所有參考文獻之內容係全文以引用方式明確併入本文中。進一步參見所有皆頒予Lonberg及Kay之美國專利第5,545,806號、第5,569,825號、第5,625,126號、第5,633,425號、第5,789,650號、第5,877,397號、第5,661,016號、第5,814,318號、第5,874,299號及第5,770,429號；頒予Surani等人之美國專利第5,545,807號；所有皆頒予Lonberg及Kay之PCT公開案第WO 92/03918號、第WO 93/12227號、第WO 94/25585號、第WO 97/13852號、第WO 98/24884號及第WO 99/45962號；及頒予Korman等人之PCT公開案第WO 01/14424號。
在某些實施例中，本文所述抗體係使用在轉基因及轉染色體上攜帶人類免疫球蛋白序列之小鼠(例如攜帶人類重鏈轉基因及人類輕鏈轉染色體之小鼠)產生。該等小鼠(在本文中稱作「KM小鼠」)詳細闡述於頒予Ishida等人之PCT公開案WO 02/43478中。
此外，業內可獲得表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉基因動物系統且可使用其來產生本文所述抗OX40抗體。
舉例而言，可使用稱作Xenomouse(Abgenix,Inc.)之替代性轉基因系統；該等小鼠闡述於(例如)頒予Kucherlapati等人之美國專利第5,939,598號、第6,075,181號、第6,114,598號、第6,150,584號及第6,162,963號中。
此外，業內可獲得表現人類免疫球蛋白基因之替代性轉染色體動物系統且可使用其來產生本文所述抗OX40抗體。舉例而言，可使用攜帶人類重鏈轉染色體及人類輕鏈轉染色體之小鼠，稱作「TC小鼠」；該等小鼠闡述於Tomizuka等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中。此外，攜帶人類重鏈及輕鏈轉染色體之牛已在業內加以闡述(Kuroiwa等人(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)且可使用其來產生本文所述抗OX40抗體。
業內闡述之用於產生人類抗體(例如人類抗OX40抗體)之其他小鼠系統包括(i)Veloclmmune®小鼠(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)，其中內源性小鼠重鏈及輕鏈可變區經由同源重組經人類重鏈及輕鏈可變區置換，可操作地連接至內源小鼠恆定區，使得在小鼠中產生嵌合抗體(人類V/小鼠C)，且隨後使用標準重組DNA技術轉化成完全人類抗體；及(ii)MeMo®小鼠(Merus Biopharmaceuticals,Inc.)，其中小鼠含有非重排人類重鏈可變區而非單一重排人類常見輕鏈可變區。該等小鼠及其產生抗體之用途闡述於(例如)WO 2009/15777、US 2010/0069614、WO 2011/072204、WO 2011/097603、WO 2011/163311、WO 2011/163314、WO 2012/148873、US 2012/0070861及US 2012/0073004中。
本文所述人類單株抗體亦可使用用於篩選人類免疫球蛋白基因文庫之噬菌體展示方法來製備。用於分離人類抗體之該等噬菌體展示方法已於業內確立。參見(例如)：頒予Ladner等人之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號及第5,571,698號；頒予Dower等人之美國 專利第5,427,908號及第5,580,717號；頒予McCafferty等人之美國專利第5,969,108號及第6,172,197號；及頒予Griffiths等人之美國專利第5,885,793號、第6,521,404號、第6,544,731號、第6,555,313號、第6,582,915號及第6,593,081號。
本文所述人類單株抗體亦可使用SCID小鼠來製備，其中人類免疫細胞已經重構以使得可在實施免疫後生成人類抗體反應。此等小鼠闡述於(例如)頒予Wilson等人之美國專利第5,476,996號及第5,698,767號中。
免疫
為生成OX40之完全人類抗體，可利用OX40抗原之純化或富集製劑及/或表現OX40或其片段之細胞對含有人類免疫球蛋白基因之轉基因或轉染色體小鼠(例如，HCo12、HCo7或KM小鼠)實施免疫，如針對其他抗原由(例如)Lonberg等人(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild等人(1996)Nature Biotechnology 14：845-851及WO 98/24884所述。或者，可利用編碼人類OX40或其片段之DNA對小鼠實施免疫。較佳地，小鼠在首次輸注時為6-16週齡。舉例而言，可使用重組OX40抗原之純化或富集製劑(5-50μg)對HuMAb小鼠實施腹膜內免疫。倘若使用OX40抗原之純化或富集製劑之免疫不產生抗體，亦可利用表現OX40之細胞(例如細胞系)對小鼠實施免疫以促進免疫反應。實例性細胞系包括過表現OX40之穩定CHO及Raji細胞系。
利用各種抗原之累積經驗已顯示，在最初用Ribi佐劑中之抗原經腹膜內(IP)或皮下(SC)實施免疫、之後用Ribi佐劑中之抗原每隔一週IP/SC免疫(至多總共10次)時，HuMAb轉基因小鼠反應最佳。可在免疫方案過程中利用血漿試樣監測免疫反應，該等血漿試樣係藉由眶後取血獲得。藉由ELISA及FACS(如下文所述)篩選血漿，且可使用具有抗OX40人類免疫球蛋白之足夠效價之小鼠進行融合。可在處死及 去除脾及淋巴結之前3天將小鼠用抗原靜脈內加強免疫。預計每次免疫可能需要實施2-3次融合。通常對於每一抗原對介於6隻與24隻之間之小鼠實施免疫。通常，使用HCo7、HCo12及KM菌株。另外，可將HCo7及HCo12轉基因一起配種成具有兩種不同人類重鏈轉基因(HCo7/HCo12)之單一小鼠。
產生OX40之單株抗體之雜交瘤的生成
為生成產生本文所述抗體之雜交瘤，可自免疫小鼠分離脾細胞及/或淋巴結細胞並融合至適當永生細胞系，例如小鼠骨髓瘤細胞系。所得雜交瘤可經篩選用於產生抗原特異性抗體。舉例而言，可使用50% PEG將來自經免疫小鼠之脾淋巴球之單細胞懸浮液融合至Sp2/0非分泌小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1581)。將細胞以約2×105平鋪於平底微量滴定板中，之後在含有10%胎兒純系血清、18%「653」條件化培養基、5%奧瑞金(origen，IGEN)、4mM L-麩醯胺酸、1mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、0.055mM 2-巰基乙醇、50單位/ml青黴素(penicillin)、50mg/ml鏈黴素(streptomycin)、50mg/ml慶大黴素(gentamycin)及1×HAT(Sigma)之選擇性培養基中培育兩週。約兩週後，可在HAT更換為HT之培養基中培養細胞。然後可藉由ELISA針對人類單株IgM及IgG抗體篩選個別孔。一旦出現雜交瘤過度生長，通常即可在10-14天後觀察培養基。可將分泌抗體之雜交瘤再平鋪，再次篩選，且若對人類IgG仍呈陽性，則可藉由限制性稀釋將單株抗體亞選殖至少兩次。然後可在活體外培養穩定的亞純系以在組織培養基中產生少量抗體用於表徵。
為純化抗體，可使所選雜交瘤在兩升旋轉燒瓶中生長用於單株抗體純化。可將上清液過濾並濃縮，然後使用蛋白質A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,N.J.)進行親和層析。可藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查所溶析之IgG以確保純度。可將緩衝溶液更換為PBS， 且可使用1.43消光係數藉由OD280來測定濃度。隨後可將單株抗體等分並儲存於-80℃下。
產生OX40之單株抗體之轉染瘤之生成
抗體可在宿主細胞轉染瘤中使用(例如)如業內所熟知之重組DNA技術及基因轉染方法之組合產生(Morrison,S.(1985)Science 229：1202)。
舉例而言，為表現抗體或其抗體片段，可藉由標準分子生物學技術(例如使用表現所關注抗體之雜交瘤之PCR擴增或cDNA選殖)獲得編碼部分或全長輕鏈及重鏈之DNA，且可將DNA插入表現載體中，使得該等基因可操作地連接至轉錄及翻譯控制序列。在此背景下，術語「可操作地連接」欲指使抗體基因接合至載體中，使得該載體內之轉錄及翻譯控制序列發揮其調控抗體基因之轉錄及翻譯之預期功能。表現載體及表現控制序列經選擇與所用表現宿主細胞相容。可將抗體輕鏈基因及抗體重鏈基因插入單獨載體中，或將兩種基因插入同一表現載體中。藉由標準方法(例如將抗體基因片段上之互補限制位點與載體接合，或若不存在限制位點，則利用鈍端接合)將抗體基因插入表現載體中。可使用本文所述抗體之輕鏈及重鏈可變區藉由將其插入已編碼期望同型之重鏈恆定區及輕鏈恆定區之表現載體中來產生任何抗體同型之全長抗體基因，使得VH區段可操作地連接至載體內之CH區段，且使VL區段可操作地連接至載體內之CL區段。
另外或或者，重組表現載體可編碼有利於自宿主細胞分泌抗體鏈之信號肽。可將抗體鏈基因選殖至載體中，使得信號肽在框架內連接至抗體鏈基因之胺基末端。信號肽可係免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，來自非免疫球蛋白之信號肽)。用於抗體重鏈及輕鏈中之實例性信號序列包括最初於本文所述抗OX40抗體中發現之信號序列。
除抗體鏈基因外，重組表現載體可攜帶控制抗體鏈基因在宿主 細胞中之表現之調控序列。術語「調控序列」意欲包括控制抗體鏈基因轉錄或翻譯之啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如，聚腺苷酸化信號)。該等調控序列闡述於(例如)Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990))中。彼等熟習此項技術者應瞭解，表現載體之設計(包括調控序列之選擇)可端視諸如欲轉化之宿主細胞之選擇、期望蛋白質之表現程度等因素而定。用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調控序列包括在哺乳動物細胞中引導較高蛋白質表現程度之病毒元件，例如源自以下各項之啟動子及/或增強子：巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒。或者，可使用非病毒調控序列，例如泛素啟動子或β-球蛋白啟動子。此外，調控元件係由來自不同來源(例如SRα啟動子系統)之序列構成，該SRα啟動子系統含有來自SV40早期啟動子之序列及人類T細胞1型白血病病毒之長末端重複(Takebe,Y.等人(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。
除抗體鏈基因及調控序列外，重組表現載體亦可攜帶其他序列，例如調控載體在宿主細胞中複製之序列(例如複製起點)及可選標記物基因。可選標記物基因有利於選擇其中已引入載體之宿主細胞(例如，參見所有皆由Axel等人之美國專利第4,399,216號、第4,634,665號及第5,179,017號)。舉例而言，可選標記物基因通常賦予在已引入載體之宿主細胞上對藥物(例如G418、潮黴素(hygromycin)或胺甲喋呤(methotrexate))之抗性。較佳可選標記物基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(針對dhfr-宿主細胞用於胺甲喋呤選擇/擴增)及neo基因(針對G418選擇)。
對於輕鏈及重鏈之表現，藉由標準技術將編碼重鏈及輕鏈之表現載體轉染至宿主細胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋常用於 將外源性DNA引入原核或真核宿主細胞中之多種技術，例如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-葡聚糖轉染及諸如此類。儘管理論上可在原核或真核宿主細胞中表現本文所述抗體，但在真核細胞(且最佳哺乳動物宿主細胞)中表現抗體最佳，此乃因此等真核細胞且具體而言哺乳動物細胞較原核細胞更有可能裝配並分泌經適當摺疊且具有免疫活性之抗體。已報導抗體基因之原核表現對高產率從之活性抗體之產生無效(Boss,M.A.及Wood,C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。本文揭示之抗體亦可在經糖改造之酵母巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)菌株中產生。Li等人(2006)Nat.Biotechnol 24：210。
用於表現本文所述重組抗體之較佳哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(包括dhfr-CHO細胞，闡述於Urlaub及Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中，與DHFR可選標記物一起使用，例如如R.J.Kaufman及P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.759：601-621中所述)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞及SP2細胞。具體而言，對於與NSO骨髓瘤細胞之使用，另一較佳表現系統係WO 87/04462、WO 89/01036及EP 338,841中揭示之GS基因表現系統。在將編碼抗體基因之重組表現載體引入哺乳動物宿主細胞中時，抗體係藉由將宿主細胞培養足以容許抗體在宿主細胞中表現或更佳使抗體分泌至宿主細胞生長之培養基中的時間段來產生。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體。
由於通常觀察之翻譯後修飾，本發明之抗體多肽之N-及C-末端可不同於預計序列。舉例而言，經常自抗體重鏈失去C-末端離胺酸殘基。Dick等人(2008)Biotechnol.Bioeng.100：1132。N-末端麩醯胺酸殘基且在較小程度上麩胺酸鹽殘基通常在治療抗體之輕鏈及重鏈上轉化成焦麩胺酸鹽殘基。Dick等人(2007)Biotechnol.Bioeng.97：544；Liu等人(2011)JBC 28611211；Liu等人(2011)J.Biol.Chem. 286：11211。
XII.分析
可藉由(例如)標準ELISA針對與OX40之結合測試本文所述抗OX40抗體。簡言之，將微量滴定板用PBS中之1-2μg/ml之純化OX40塗佈，且隨後用PBS中之5%牛血清白蛋白封阻。將抗體之稀釋物(例如，來自OX40免疫之小鼠之血漿之稀釋物)添加至每一孔中並於37℃下培育1-2小時。將板用PBS/Tween洗滌且隨後於37℃下與偶聯至辣根過氧化酶(HRP)之二級試劑(例如，對於人類抗體，山羊-抗人類IgG Fc特異性多株試劑)一起培育1小時。在洗滌後，將板用ABTS受質(Moss Inc，產品：ABTS-1000)顯影並藉由分光光度計於OD 415-495下進行分析。隨後藉由流式細胞術針對與表現人類OX40之細胞系、而非不表現OX40之對照細胞系之結合進一步篩選來自經免疫小鼠之血清。簡言之，藉由將表現OX40之CHO細胞與抗OX40抗體以1：20稀釋一起培育來評估抗OX40抗體之結合。洗滌細胞並利用PE標記之抗人類IgG Ab檢測結合。使用FACScan流式細胞術(Becton Dickinson,San Jose,CA)實施流式細胞分析。較佳地，產生最高效價之小鼠將用於融合。
如上文所述ELISA分析可用於篩選抗體且因此雜交瘤，該等雜交瘤產生顯示與OX40免疫原之陽性反應性之抗體。隨後可亞選殖並進一步表徵產生較佳以高親和力結合至OX40之抗體的雜交瘤。隨後可選擇來自每一雜交瘤之一個純系(其保留母體細胞之反應性(藉由ELISA))用於製備細胞庫並用於抗體純化。
為純化抗OX40抗體，可使所選雜交瘤在兩升旋轉燒瓶中生長用於單株抗體純化。可將上清液過濾並濃縮，之後使用蛋白質A-sepharose(Pharmacia,Piscataway,NJ)進行親和層析。可藉由凝膠電泳及高效液相層析檢查所溶析之IgG以確保純度。可將緩衝溶液更換為 PBS，且可使用1.43消光係數藉由OD280來測定濃度。可將單株抗體等分並儲存於-80℃下。
為確定所選抗OX40抗體是否結合至獨特表位，可使用市售試劑(Pierce,Rockford,IL)生物素化每一抗體。可利用鏈黴抗生物素蛋白標記之探針檢測生物素化MAb結合。可使用如上文所述OX40塗佈之ELISA板實施使用未經標記之單株抗體及生物素化單株抗體之競爭研究。
為測定純化抗體之同型，可使用對特定同型之抗體具有特異性之試劑實施同型ELISA。舉例而言，為測定人類單株抗體之同型，可於4℃下將微量滴定板之孔用1μg/ml抗人類免疫球蛋白塗佈過夜。在用1% BSA封阻後，於環境溫度下使板與1μg/ml或更少測試單株抗體或純化同型對照反應1至2小時。隨後可使孔與人類IgG1或人類IgM特異性鹼性磷酸酶偶聯之探針反應。如上文所述使板顯影並加以分析。
為測試單株抗體與表現OX40之活細胞之結合，可使用流式細胞術，如實例中所述。簡言之，將表現膜結合之OX40之細胞系(在標準生長條件下生長)與含有0.1% BSA之PBS中之不同濃度之單株抗體於4℃下混合1小時。在洗滌後，在與一級抗體染色相同之條件下使細胞與螢光黃標記之抗IgG抗體反應。可藉由FACScan儀器使用光及側向散射性質分析試樣以導通單一細胞且測定經標記抗體之結合。可使用使用螢光顯微術之替代分析(除流式細胞術分析外或代替流式細胞術分析)。可如上文所述精確染色細胞並藉由螢光顯微術檢查。此方法容許可視化個別細胞，但端視抗原之密度而定可具有減低之靈敏性。
可藉由西方墨點法針對與OX40抗原之反應性進一步測試抗OX40抗體。簡言之，可自表現OX40之細胞製備細胞萃取物且使其經受十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。在電泳後，將分離抗原轉移至硝基纖維素膜，用20%小鼠血清封阻，並用欲測試之單株抗體探測。可 使用抗IgG鹼性磷酸酶檢測IgG結合並用BCIP/NBT受質片(Sigma Chem.Co.,St.Louis,MO)使其顯影。
用於分析結合親和力、交叉反應性及結合動力學之方法包括業內已知之標準分析，例如使用BIACORE® 2000 SPR儀器(Biacore AB,Uppsala,Sweden)之BIACORE® SPR分析。
在某些實施例中，抗OX40抗體特異性結合至人類OX40之細胞外區。舉例而言，抗體可特異性結合至OX40之細胞外結構域內之特定結構域(例如，功能結構域)。在特定實施例中，抗體特異性結合至OX40-L結合之OX40上之位點。在其他實施例中，抗體特異性結合至人類OX40之細胞外區及食蟹猴OX40之細胞外區。
XIII.免疫偶聯物、抗體衍生物及診斷
本文所述抗OX40抗體可用於診斷目的，包括試樣測試及活體內成像，且出於此目的，抗體(或其結合片段)可偶聯至適當可檢測之試劑，以形成免疫偶聯物。出於診斷目的，適當試劑係可檢測之標記，其包括用於全身成像之放射性同位素、及用於試樣測試之放射性同位素、酶、螢光標記及其他適宜抗體標記。
可檢測標記可為活體外診斷領域中當前所用之各種類型中之任一者，包括包含金屬溶膠(例如膠狀金)之顆粒標記、提供有(例如)N2S2、N3S或N4類型之肽螯合劑之同位素(例如I125或Tc99)、發色團(包括螢光標記物、生物素、發光標記物、磷光標記物及諸如此類)、以及將給定受質轉化成可檢測標記物之酶標記及在藉由(例如)聚合酶鏈式反應擴增後顯示之聚核苷酸標記。隨後生物素化抗體可藉由抗生物素蛋白或鏈黴抗生物素蛋白結合來檢測。適宜酶標記包括辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及諸如此類。舉例而言，標記可為酶鹼性磷酸酶，其係在1,2二氧雜環丁烷受質(例如金剛烷基甲氧基磷醯基氧基苯基二氧雜環丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧雜環丁烷-3,2'-(5'-氯)三 環{3.3.1.1 3,7}癸}-4-基)苯基磷酸二鈉(CSPD)、以及CDP及CDP-star®或彼等熟習此項技術者熟知之其他發光受質(例如適宜鑭系元素(例如鋱(III)及銪(III))之螯合物)轉化後藉由量測化學發光之存在或形成來檢測。藉由所選標記測定檢測方式。標記或其反應產物之外觀在標記係顆粒且以適當程度累積之情形下可使用裸眼看到，或使用儀器(例如分光光度計、發光儀、螢光計及諸如此類)看到，所有皆係根據標準實踐。
較佳地，偶聯方法產生鏈接，其實質上(或幾乎)係非免疫原性，例如肽-(即醯胺-)、硫化物-(立體阻礙)、二硫化物-、腙-及醚鏈接。該等鏈接幾乎係非免疫原性且在血清內顯示合理穩定性(例如，參見Senter,P.D.,Curr.Opin.Chem.Biol.13(2009)235-244；WO 2009/059278；WO 95/17886)。
端視部分及抗體之生物化學性質而定，可利用不同偶聯策略。倘若部分係50至500個胺基酸之天然或重組多肽，則在闡述蛋白偶聯物之合成之化學法之教科書中存在標準程序，其可由熟習此項技術者容易地遵守(例如，參見Hackenberger,C.P.R.及Schwarzer,D.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.47(2008)10030-10074)。在一個實施例中，使用抗體或部分內之馬來醯亞胺基部分與半胱胺酸殘基的反應。倘若(例如)使用抗體之Fab或Fab'-片段，則此係尤其適宜之偶合化學。或者，在一個實施例中，偶合至抗體或部分之C-末端。蛋白質(例如Fab-片段)之C-末端修飾可如(例如)所述實施(Sunbul,M.及Yin,J.,Org.Biomol Chem.7(2009)3361-3371)。
一般而言，位點特異性反應及共價偶合係基於將天然胺基酸轉變成具有與存在之其他官能基之反應性正交之反應性的胺基酸。舉例而言，稀有序列上下文內之具體半胱胺酸可在醛中經酶轉化(參見Frese,M.A.及Dierks,T.,ChemBioChem.10(2009)425-427)。亦可藉 由在給定序列上下文中利用某些酶與天然胺基酸之特異性酶反應性來獲得期望胺基酸修飾(例如，參見Taki,M.等人，Prot.Eng.Des.Sel.17(2004)119-126；Gautier,A.等人，Chem.Biol.15(2008)128-136；且蛋白酶催化之C-N鍵之形成闡述於Bordusa,F.,Highlights in Bioorganic Chemistry(2004)389-403中)。
亦可藉由末端胺基酸與適當修飾試劑之選擇性反應達成位點特異性反應及共價偶合。
N-末端半胱胺酸與苄腈之反應性(參見Ren,H.等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.48(2009)9658-9662)可用於達成位點特異性共價偶合。
天然化學接合亦可依賴於C-末端半胱胺酸殘基(Taylor,E.Vogel；Imperiali,B,Nucleic Acids and Molecular Biology(2009),22(Protein Engineering),65-96)。
EP 1 074 563闡述偶聯方法，其係基於一段帶負電荷胺基酸內之半胱胺酸的反應較位於一段帶正電胺基酸中之半胱胺酸快。
部分亦可為合成肽或肽模擬物。倘若多肽係經化學合成，則在該合成期間可納入具有正交化學反應性之胺基酸(例如，參見de Graaf,A.J.等人，Bioconjug.Chem.20(2009)1281-1295)。由於許多正交官能基處於危險中且可引入合成肽中，故該肽與連接體之偶聯係標準化學法。
為獲得單標記之多肽，可藉由層析分離具有1：1化學計量之偶聯物與其他偶聯副產物。可藉由使用染料標記之結合對成員及帶電連接體促進此程序。藉由使用此類經標記且帶高負電荷之結合對成員，容易分離單偶聯之多肽與未經標記之多肽及攜帶一個以上連接體之多肽，此乃因可使用電荷及分子量之差異進行分離。螢光染料可用於純化複合物與未結合之組份，如經標記之單價黏合劑。
在一個實施例中，附接至抗OX40抗體之部分係選自由以下組成之群：結合部分、標記部分及生物活性部分。
本文所述抗OX40抗體亦可偶聯至治療劑以形成免疫偶聯物，例如抗體-藥物偶聯物(ADC)。適宜治療劑包括抗代謝物、烷基化劑、DNA小溝黏合劑、DNA嵌入劑、DNA交聯劑、組織蛋白去乙醯酶抑制劑、出核轉運抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓撲異構酶I或II抑制劑、熱休克蛋白抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、抗生素及抗有絲分裂劑。在ADC中，抗體及治療劑較佳經由可裂解連接體(例如肽基、二硫化物或腙連接體)偶聯。更佳地，連接體係肽基連接體，例如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO：180)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser或Glu。ADC可如以下中所述製備：美國專利第7,087,600號、第6,989,452號及第7,129,261號；PCT公開案WO 02/096910、WO 07/038658、WO 07/051081、WO 07/059404、WO 08/083312及WO 08/103693；美國專利公開案20060024317、20060004081及20060247295；其揭示內容以引用方式併入本文中。
更特定而言，在ADC中，抗體偶聯至藥物，其中抗體起靶向試劑之作用用於將ADC引導至表現其抗原之靶細胞(例如癌細胞)。較佳地，抗原係腫瘤相關之抗原，即由癌細胞獨特表現或過表現者。在此處後，藥物在靶細胞內部或在其附近釋放以用作治療劑。關於ADC在癌症療法中之作用機制及用途的綜述，參見Schrama等人，Nature Rev.Drug Disc.2006,5,147。
對於癌症治療，藥物較佳係引起靶向癌細胞死亡之細胞毒性藥物。可用於ADC中之細胞毒性藥物包括以下類型之化合物及其類似物及衍生物：(a)烯二炔(例如卡奇黴素(calicheamicin)(參見(例如)Lee等 人，J.Am.Chem.Soc.1987,109,3464及3466)及安西黴素(uncialamycin)(參見(例如)Davies等人，WO 2007/038868 A2(2007)及Chowdari等人，US 8,709,431 B2(2012))；(b)微管溶素(參見(例如)Domling等人，US 7,778,814 B2(2010)；Cheng等人，US 8,394,922 B2(2013)；及Cong等人，於2014年2月11日提出申請之美國第14/177376號))；(c)CC-1065及多卡米星(duocarmycin)(參見(例如)Boger,US 6,5458,530 B1(2003)；Sufi等人，US 8,461,117 B2(2013)；及Zhang等人，US 2012/0301490 A1(2012))；(d)埃博黴素(epothilone)(參見(例如)Vite等人，US 2007/0275904 A1(2007)及US RE42930 E(2011))；(e)奧裡斯他汀(auristatin)(參見(例如)Senter等人，US 6,844,869 B2(2005)及Doronina等人，US 7,498,298 B2(2009))；(f)吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體(參見(例如)Howard等人，US 2013/0059800 A1(2013)；US 2013/0028919 A1(2013)；及WO 2013/041606 A1(2013))；及(g)類美登素(maytansinoid)(例如DM1及DM4)(參見(例如)Chari等人，US 5,208,020(1993)及Amphlett等人，US 7,374,762 B2(2008))。
在ADC中，連接體共價連接抗體及藥物。通常，存在一個附接至每一連接體之藥物分子，但連接體可具支鏈，從而容許附接複數個藥物分子以增加每ADC遞送之藥物酬載。此外，每一抗體可附接一個以上連接體。ADC上攜帶之藥物分子之數目稱作藥物-抗體比率(DAR)。舉例而言，若抗體之每一重鏈附接有一個連接體，該連接體又附接有一個藥物分子，則DAR係2。較佳地，DAR介於1與5之間，更佳介於2與4之間。熟習此項技術者亦應瞭解，儘管在每一個別ADC 中抗體偶聯至整數數目之藥物分子，就整體而言，ADC之製備可分析非整數DAR，此反映統計平均數。概言之，ADC之架構可由下式代表：[抗體]-[連接體-(Drug)n]m
其中通常m係1、2、3、4、5或6(較佳2、3或4)且n係1、2或3。
在一些實施例中，連接體含有在靶細胞內部或在其附近裂解以釋放藥物之可裂解基團。在其他實施例中，連接體不含可裂解基團，而是ADC依賴於抗體之分解代謝以釋放藥物。
一類可裂解基團係pH敏感性基團。血漿中之pH稍微高於中性，而溶酶體內之pH-其中大部分ADC在靶細胞內內化後終止-係酸性，為約5。因此，酸催化裂解之可裂解基團將以在溶酶體內較血漿內快若干數量級之速率裂解。酸敏感性基團之實例包括順式-烏頭基醯胺及腙，如以下中所述：Shen等人，US 4,631,190(1986)；Shen等人，US 5,144,011(1992)；Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1981,102,1048；及Yang等人，Proc.Nat'l Acad.Sci(USA),1988,85,1189；其揭示內容以引用方式併入本文中。
在另一實施例中，可裂解基團係二硫化物。二硫化物可藉由硫醇-二硫化物交換機制以取決於環境硫醇濃度之速率裂解。由於麩胱甘肽及其他硫醇之細胞內濃度高於其血清濃度，故二硫化物之裂解速率將在細胞內較高，即在ADC內化後。此外，可藉由調節二硫化物之立體及電子特徵(例如，烷基-芳基二硫化物對烷基-烷基二硫化物；芳基環上之取代等)、從而使得可設計具有增強之血清穩定性或特定裂解速率之二硫化物鏈接來調節硫醇-二硫化物交換之速率。對於與偶聯物中之二硫化物可裂解基團有關之其他揭示內容，參見(例如)Thorpe等人，Cancer Res.1988,48,6396；Santi等人，US 7,541,530 B2(2009)；Ng等人，US 6,989,452 B2(2006)；Ng等人，WO 2002/096910 A1(2002)；Boyd等人，US 7,691,962 B2(2010)；及Sufi等人，US 2010/0145036 A1(2010)；其揭示內容以引用方式併入本文中。
較佳可裂解基團係與由血清內之蛋白酶相對由靶細胞內部之蛋白酶選擇性裂解之肽。通常，可裂解肽基團包含1至20個胺基酸、較佳1至6個胺基酸、更佳1至3個胺基酸。胺基酸可為天然及/或非天然α-胺基酸。天然胺基酸係由遺傳密碼編碼之彼等，以及自其衍生之胺基酸，例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽、瓜胺酸及O-磷酸絲胺酸。在此上下文中，術語「胺基酸」亦包括胺基酸類似物及模擬物。類似物係具有天然胺基酸之相同一般H2N(R)CHCO2H結構的化合物，只是R基團並非在天然胺基酸中發現者。類似物之實例包括高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸-亞碸及甲硫胺酸甲基鋶。胺基酸模擬物係具有不同於α-胺基酸之一般化學結構之結構但以與其類似之方式起作用的化合物。胺基酸可具有遺傳編碼之胺基酸之「L」立體化學、以及鏡像異構「D」立體化學。
較佳地，可裂解肽基團含有作為蛋白酶之可裂解識別序列之胺基酸序列。許多可裂解識別序列為業內已知。參見(例如)Matayoshi等人，Science 247：954(1990)；Dunn等人，Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah等人，Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry,Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber等人，Meth.Enzymol.244：595(1994)；Smith等人，Meth.Enzymol.244：412(1994)；及Bouvier等人，Meth.Enzymol.248：614(1995)；其揭示內容以引用方式併入本文中。
更佳地，可裂解肽基團包含選擇用於由內體或溶酶體蛋白酶、尤其後者裂解之胺基酸序列。該等蛋白酶之實例包括細胞自溶酶B、C、D、H、L及S，尤其細胞自溶酶B。細胞自溶酶B優先裂解在N-至- C方向上書寫之序列-AA2-AA1-處之肽，其中AA1係鹼性或強烈氫鍵結胺基酸(例如離胺酸、精胺酸或瓜胺酸)且AA2係疏水胺基酸(例如苯丙胺酸、纈胺酸、丙胺酸、白胺酸或異白胺酸)，例如Val-Cit(其中Cit表示瓜胺酸)或Val-Lys。對於關於細胞自溶酶-可裂解基團之其他資訊，參見Dubowchik等人，Biorg.Med.Chem.Lett.1998,8,3341；Dubowchik等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,3347；及Dubowchik等人，Bioconjugate Chem.2002,13,855；其揭示內容以引用方式併入。可用於裂解肽基連接體之另一酶係天冬胺酸內肽酶(legumain，一種優先在Ala-Ala-Asn處裂解之溶酶體半胱胺酸蛋白酶)。
在較佳實施例中，ADC中之連接體包含由位於靶細胞內部之蛋白酶優先裂解之二肽或三肽。較佳地，二肽或三肽可由細胞自溶酶B裂解，更佳為Val-Cit或Val-Lys二肽。
亦可使用單一胺基酸可裂解肽基團，如Chen等人，US 2010/0113476 A1(2010)中所揭示，其揭示內容以引用方式併入本文中。
對於並不意欲由細胞內化之偶聯物，可選擇可裂解基團，使得其由在靶細胞附近之細胞外基質內存在之蛋白酶、例如由接近死亡之細胞釋放之蛋白酶或腫瘤相關之蛋白酶裂解。實例性細胞外腫瘤相關之蛋白酶係基質金屬蛋白酶(MMP)、胞漿素、甲拌磷寡肽酶(TOP)及CD10。參見(例如)Trouet等人，US 5,962,216(1999)及US 7,402,556 B2(2008)；Dubois等人，US 7,425,541 B2(2008)；及Bebbington等人，US 6,897,034 B2(2005)；其揭示內容以引用方式併入本文中。
除共價連接抗體及藥物外，連接體可實施其他功能。舉例而言，連接體可含有聚(乙二醇)(PEG)基團，其增強在實施偶聯化學期間或在最終ADC產物中之溶解性。
連接體可進一步包括毗鄰可裂解肽基團定位之自分解部分。自分解基團用作防止抗體及/或藥物部分以立體方式干擾肽基團由蛋白酶裂解、但其後自身自發釋放(即，自分解)以便不干擾藥物之作用的間隔體。參見Carl等人，J.Med.Chem.1981,24(3),479；Carl等人，WO 81/01145(1981)；Dubowchik等人，Pharmacology & Therapeutics 1999,83,67；Firestone等人，US 6,214,345 B1(2001)；Toki等人，J.Org.Chem.2002,67,1866；Doronina等人，Nature Biotechnology 2003,21(7),778(誤符，第941頁)；de Groot等人，Org.Chem.2001,66,8815；Boyd等人，US 7,691,962 B2(2010)；Boyd等人，US 2008/0279868 A1(2008)；Sufi等人，WO 2008/083312 A2(2008)；Feng,US 7,375,078 B2(2008)；Jeffrey,US 8,039,273 B2(2011)；及Senter等人，US 2003/0096743 A1(2003)；其揭示內容以引用方式併入。
較佳自分解基團係對-胺基苄基氧基羰基(PABC)，下文繪示其結構及作用機制：
Figure 105116545-A0202-12-0132-12
因此，在較佳實施例中，ADC具有包含由定位於靶細胞內部之蛋白酶優先裂解之二肽或三肽及毗鄰二肽或三肽之自分解基團的連接體。較佳地，二肽或三肽可由細胞自溶酶B裂解。較佳地，自分解基團係PABC基團。
多種技術可用於偶聯抗體及藥物。在較佳者中，使抗體中之離胺酸殘基之側鏈中的ε-胺基與2-亞胺基四氫噻吩反應以引入游離硫醇(-SH)基團。硫醇基團可與馬來醯亞胺或其他親核劑受體基團反應以實現偶聯，如下文所闡釋：
Figure 105116545-A0202-12-0133-13
通常，獲得每個抗體兩個或三個硫醇之硫醇化程度。對於代表性程序，參見Chowdari等人，US 8,709,431 B2(2014)，其揭示內容以引用方式併入本文中。因此，在一個實施例中，本發明抗體具有一或多個(較佳兩個或三個)藉由與亞胺基四氫噻吩反應修飾之離胺酸殘基。
替代偶聯技術採用無銅之「點擊化學(click chemistry)」，其中橫跨環辛炔之應變炔烴鍵添加疊氮化物基團以形成1,2,3-三唑環。參見(例如)Agard等人，J.Amer.Chem.Soc.2004,126,15046；Best,Biochemistry 2009,48,6571，其揭示內容以引用方式併入本文中。疊氮化物可位於抗體上且環辛炔可位於藥物部分上，或反之亦然。較佳環辛炔基團係二苯并環辛炔(DIBO)。具有DIBO基團之各種試劑可自Invitrogen/Molecular Probes、Eugene、Oregon獲得。下文反應闡釋DIBO基團附接至抗體之情況之點擊化學偶聯：
Figure 105116545-A0202-12-0134-14
在藉由此技術製得之ADC中，連接體包含1,2,3-三唑環。
又一偶聯技術涉及向抗體中引入非天然胺基酸，其中非天然胺基酸提供官能基用於與藥物部分中之反應性官能基偶聯。舉例而言，可將非天然胺基酸對-乙醯基苯丙胺酸納入抗體或其他多肽中，如Tian等人，WO 2008/030612 A2(2008)中所教示。對-乙醯基苯丙胺酸中之酮基團可為藉由與羥基胺基在連接體-藥物部分上形成肟之偶聯位點。或者，可經由點擊化學將非天然胺基酸對-疊氮基苯丙胺酸納入抗體中以為偶聯提供疊氮化物官能基，如上文所論述。亦可使用無細胞之方法將非天然胺基酸納入抗體或其他多肽中，如Goerke等人，US 2010/0093024 A1(2010)及Goerke等人，Biotechnol.Bioeng.2009,102(2),400-416中所教示。上述揭示內容以引用方式併入本文中。因此，在一個實施例中，抗體具有一或多個由非天然胺基酸置換之胺基酸，其較佳係對-乙醯基苯丙胺酸或對-疊氮基苯丙胺酸，更佳係對-乙醯基苯丙胺酸。
再一偶聯技術使用酶轉麩胺醯胺酶(較佳細菌轉麩胺醯胺酶或BTG)，如Jeger等人，Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9995中所教示。BTG在麩醯胺酸之側鏈甲醯胺與伸烷基胺基(其可為例如離胺酸之ε-胺基或5-胺基-正戊基)之間形成醯胺鍵。在典型偶聯反應中，麩醯胺酸殘基位於抗體上，而伸烷基胺基位於連接體-藥物部分上，如下文所示：
Figure 105116545-A0202-12-0135-15
麩醯胺酸殘基於多肽鏈上之定位對其對BTG介導之轉醯胺化之易感性具有大的效應。抗體上之麩醯胺酸殘基通常皆不為BTG受質。然而，若抗體去糖基化(糖基化位點係天冬醯胺297(N297))，則使得附近麩醯胺酸295(Q295)具有BTG易感性。或者，可藉由在恆定區中引入N297A突變以消除N297糖基化位點來無醣苷地合成抗體。此外，已顯示抗體中之N297Q取代不僅消除糖基化，且亦引入亦易於BTG介導之轉醯胺化之第二麩醯胺酸殘基(於位置297處)。因此，在一個實施例中，抗OX40抗體經去糖基化。在另一實施例中，抗OX40抗體具有N297Q取代。熟習此項技術者應瞭解，藉由合成後修飾或藉由引入N297A突變之去糖基化生成兩個BTG反應性麩醯胺酸殘基/抗體(一個/重鏈，於位置295處)，而具有N297Q取代之抗體將具有四個BTG反應性麩醯胺酸殘基(兩個/重鏈，於位置295及297處)。
此外，另一偶聯技術使用酶轉肽酶A，如Levary等人，PLoS One 2011,6(4),e18342；Proft,Biotechnol.Lett.2010,32,1-10；Ploegh等人，WO 2010/087994 A2(2010)；及Mao等人，WO 2005/051976 A2(2005)中所教示，其揭示內容以引用方式併入本文中。轉肽酶A識別基序(通常LPXTG(SEQ ID NO：181)，其中X係任何天然胺基酸)可附接至抗體，且親核受體基序(通常GGG)可位於藥物部分上，或反之亦然。
本文所述抗OX40抗體亦可用於檢測OX40，例如人類OX40，例如組織或組織試樣中之人類OX40。該等抗體可用於(例如)ELISA分 析或流式細胞術中。在某些實施例中，使抗OX40抗體與細胞(例如組織中之細胞)接觸適於發生特異性結合之時間，且隨後添加試劑(例如檢測抗OX40抗體之抗體)。實例性分析提供於實例中。抗OX40抗體可為完全人類抗體，或其可為嵌合抗體，例如具有人類可變區及鼠類恆定區或其部分之抗體。用於檢測試樣(細胞或組織試樣)中之OX40(例如人類OX40)之實例性方法包含(1)使試樣與抗OX40抗體接觸足以容許抗OX40抗體與試樣中之OX40特異性結合的時間，及(2)使試樣與特異性結合至抗OX40抗體(例如結合至抗OX40抗體之Fc區)之檢測試劑(例如抗體)接觸，藉此檢測由抗OX40抗體結合之OX40。在與抗體及/或檢測試劑一起培育後，可包括洗滌步驟。用於該等方法中之抗OX40抗體不必連接至標記或檢測試劑，此乃因可使用單獨檢測試劑。
XIV.雙特異性分子
本文所述抗OX40抗體可用於形成雙特異性分子。舉例而言，抗體或其抗原結合部分可衍生或連接至另一功能分子，例如另一肽或蛋白質(例如受體之另一抗體或配體)，以生成結合至至少兩個不同結合位點或靶分子之雙特異性分子。在一個實施例中，抗OX40抗體可連接至特異性結合至可用作組合治療之潛在靶標之任何蛋白質(例如本文所述蛋白質)之抗體或scFv(例如，PD-1、PD-L1或LAG-3之抗體)。或者，抗體可衍生或連接至一個以上之其他功能分子，以生成結合至兩個以上不同結合位點及/或靶分子之多特異性分子。該等多特異性分子亦欲涵蓋於如本文所用之術語「雙特異性分子」中。為產生本文所述雙特異性分子，抗OX40抗體可在功能上連接(例如藉由化學偶合、遺傳融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他結合分子，例如另一抗體、抗體片段、肽或結合模擬物，使得產生雙特異性分子。
因此，本文提供包含至少一種對OX40之第一結合特異性及對第二靶表位之第二結合特異性的雙特異性分子。在一個實施例中，雙特異性分子係多特異性，例如分子進一步包括第三結合特異性。
在某些實施例中，雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv(scFv))作為結合特異性。抗體亦可係輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，例如Fv或單鏈構築體，如Ladner等人，美國專利第4,946,778號中所述，其內容以引用方式明確併入。
儘管人類單株抗體較佳，但本文所述雙特異性分子中可採用其他抗體，包括(例如)鼠類嵌合及人類化單株抗體。
本文提供之雙特異性分子可使用業內已知之方法藉由偶聯成份結合特異性來製備。舉例而言，可單獨生成雙特異性分子之每一結合特異性且隨後彼此偶聯。當結合特異性係蛋白質或肽時，可使用多種偶合劑或交聯劑進行共價偶聯。交聯劑之實例包括蛋白質A、碳化二亞胺、N-琥珀醯亞胺基-S-乙醯基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰伸苯基二馬來醯亞胺(oPDM)、丙酸N-琥珀醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)酯(SPDP)及4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基琥珀醯亞胺基酯(磺基-SMCC)(例如，參見Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu,MA等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括闡述於以下中之彼等：Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.第78號，118-132；Brennan等人(1985)Science 229：81-83)及Glennie等人(1987)J.Immunol 139：2367-2375)。較佳偶聯劑係SATA及磺基-SMCC，二者皆購自Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)。
當結合特異性係抗體時，其可經由兩條重鏈之C-末端鉸鏈區之巰基鍵結來偶聯。在尤佳實施例中，鉸鏈區在偶聯之前經修飾以含有 奇數個(較佳一個)巰基殘基。
或者，兩種結合特異性可在同一載體中經編碼且在同一宿主細胞中表現並裝配。此方法在雙特異性分子係mAb×mAb、mAb×Fab、mAb×(scFv)2、Fab×F(ab')2或配體×Fab融合蛋白時尤其有用。雙特異性抗體可包含在每一重鏈之C-末端處包含scFv之抗體。本文所述雙特異性分子可係包含一種單鏈抗體及結合決定子之單鏈分子或包含兩種結合決定子之單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩種單鏈分子。用於製備雙特異性分子之方法闡述於以下中：例如美國專利第5,260,203號、美國專利第5,455,030號、美國專利第4,881,175號、美國專利第5,132,405號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,476,786號、美國專利第5,013,653號、美國專利第5,258,498號及美國專利第5,482,858號。
雙特異性分子與其特異性靶標之結合可使用業內公認之方法(例如酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、FACS分析、生物分析(例如生長抑制)或西方墨點分析)來確認。該等分析中之每一者通常藉由採用對所關注複合物具有特異性之經標記試劑(例如抗體)來檢測尤其受關注之蛋白質-抗體複合物之存在。
XV.組合物
進一步提供含有與醫藥上可接受之載劑調配在一起之單獨或與其他靶標之抗體組合之一或多種抗OX40抗體的組合物(例如醫藥組合物)。該等組合物可包括本文所述抗體或免疫偶聯物或雙特異性分子中之一者或組合(例如兩種或更多種不同者)。舉例而言，組合物可包含結合至OX40上之不同表位或具有補體活性之抗體(或免疫偶聯物或雙特異性物)之組合。
在某些實施例中，組合物包含至少1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、1-300mg/ml 或100-300mg/ml之濃度之抗OX40抗體。
本文所述醫藥組合物亦可以組合療法、即與其他藥劑組合投與。舉例而言，組合療法可包括與至少一種其他抗癌劑及/或T細胞刺激(例如，活化)劑組合之本文所述抗OX40抗體的投與。可用於組合療法中之治療劑之實例更詳細闡述於下文關於本文所述抗體之用途之部分中。
在某些實施例中，本文揭示之治療組合物包括用於治療癌症之其他化合物、藥物及/或藥劑。該等化合物、藥物及/或藥劑可包括(例如)刺激針對給定癌症之免疫反應之化學療法藥物、小分子藥物或抗體。在一些情況下，治療組合物可包括(例如)以下中之一或多者：抗CTLA-4抗體、抗PD-1抗體、抗PDL-1抗體、抗GITR抗體、抗CD 137抗體或抗LAG-3抗體。
如本文所使用，「醫藥上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑及生理上相容之類似試劑。較佳地，載劑適於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投與(例如，藉由注射或輸注)。端視投與途徑而定，可於材料中對活性化合物(即抗體、免疫偶聯物或雙特異性分子)進行包衣以保護化合物免受酸及可使化合物不活化之其他天然條件的作用。
本文所述醫藥組合物可包括一或多種醫藥上可接受之鹽。「醫藥上可接受之鹽」係指保留母體化合物之期望生物活性且不賦予任何不期望毒理學效應之鹽(例如，參見Berge,S.M.等人(1977)J.Pharm.Sci. 66：1-19)。該等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括源自無毒無機酸(例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸及諸如此類)以及源自無毒有機酸(例如脂肪族單-及二羧酸、經苯基取代之鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香族酸、脂肪族及芳香族 磺酸及諸如此類)之彼等。鹼加成鹽包括源自鹼土金屬(例如鈉、鉀、鎂、鈣及諸如此類)以及源自無毒有機胺(例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及諸如此類)之彼等。
本文所述醫藥組合物亦可包括醫藥上可接受之抗氧化劑。醫藥上可接受之抗氧化劑的實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱胺酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及諸如此類；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及諸如此類；及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及諸如此類。
可用於本文所述醫藥組合物中之適宜水性及非水性載劑的實例包括水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物、植物油(例如橄欖油)及可注射有機酯(例如油酸乙酯)。可(例如)藉由使用諸如卵磷脂等包衣材料、藉由維持所需粒徑(在分散液之情形下)及藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。
該等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。藉由上述滅菌程序並藉由納入各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸如此類)二者可確保防止微生物之存在。該等組合物中亦可期望包括等滲劑，例如糖、氯化鈉及諸如此類。另外，可藉由引入吸收延遲劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來實現可注射醫藥形式之長期吸收。
醫藥上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。業內已知用於醫藥活性物質之該等介質及藥劑之使用。除任何與活性化合物不相容之習用介質或藥劑外，亦涵蓋其於本文所述醫藥組合物中之使用。醫藥組合物可包含 防腐劑或可不含防腐劑。該等組合物中亦可納入附加活性化合物。
通常，治療組合物在製造及儲存條件下必須無菌且穩定。可將組合物調配成溶液、微乳液、脂質體或其他適於高藥物濃度之有序結構。載劑可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)及其適宜混合物。可(例如)藉由使用包衣(例如卵磷脂)、藉由維持所需粒徑(在分散液情形下)且藉由使用表面活性劑來維持適當流動性。在許多情形下，較佳可將等滲劑(例如糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)或氯化鈉)納入組合物中。可藉由向組合物中納入延遲吸收劑(例如，單硬脂酸鹽及明膠)實現可注射組合物之長期吸收。
無菌可注射溶液可藉由以下方式來製備：將所需量之活性化合物納入具有上文所列舉成份中之一者或組合之適宜溶劑中，視需要之後進行無菌微濾。通常，可藉由將活性化合物納入含有基本分散介質及來自上文所列舉彼等之所需其他成份的無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉劑之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍-乾燥(凍乾)，其可自其預先經無菌過濾之溶液產生活性成份加上任一所期望額外成份之粉劑。
可與載劑材料組合產生單一劑型之活性成份之量將端視所治療個體及特定投與模式而變化。可與載劑材料組合產生單一劑型之活性成份之量通常可為產生治療效應之組合物之量。通常，在100%中，此量將在與醫藥上可接受之載劑組合之約0.01%至約99%之活性成份、較佳約0.1%至約70%、最佳約1%至約30%活性成份範圍內。
可對劑量方案進行調節以提供最佳期望反應(例如治療反應)。舉例而言，可投與單次濃注，可隨時間投與若干個分次劑量或可根據治療狀況緊急程度所指示按比例減少或增加劑量。尤其有利地將非經腸組合物調配成劑量單位形式以便於劑量之投與及均勻性。如本文所使 用之劑量單位形式係指適於作為單位劑量供欲治療個體使用之物理離散單元；各單元含有預定量之活性化合物，此預定量經計算與所需醫藥載劑結合產生期望治療效應。本文所述劑量單位形式之規格取決於且直接依賴於下列因素：(a)活性化合物之獨特特性及欲達成之特定治療效應，及(b)複合此活性化合物以治療個體敏感性之技術中的固有限制條件。
對於抗OX40抗體之投與，劑量在約0.0001至100mg/kg、約0.01至5mg/kg、約0.01至10mg/kg、約0.1至1mg/kg、約0.1至0.5mg/kg或約0.5至0.8mg/kg宿主體重之範圍內。舉例而言，劑量可為0.2mg/kg體重、0.3mg/kg體重、0.5mg/kg體重、1mg/kg體重、3mg/kg體重、5mg/kg體重或10mg/kg體重或在1-10mg/kg範圍內。在某些實施例中，劑量係0.2mg/kg。在一些實施例中，劑量係0.25mg/kg。在其他實施例中，劑量係0.5mg/kg。實例性治療方案需要每週投與一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每3個月一次或每3至6個月一次。本文所述抗體之實例性劑量方案包括經由靜脈內投與1mg/kg體重或3mg/kg體重，其中抗體係使用以下投藥排程表中之一者給予：(i)每四週共六個劑量，隨後每三個月；(ii)每三週；(iii)3mg/kg體重一次，之後每三週1mg/kg體重。
在某些實施例中，對於利用抗OX40抗體及抗PD-1或抗CTLA-4抗體之組合治療，抗體係以固定劑量投與。因此，在一些實施例中，抗OX40抗體係以約25至約320mg、例如約25至約160mg、約25至約80mg、約25至約40mg、約40至約320mg、約40至約160mg、約40至約80mg、約80至約320mg、約30至約160mg或約160至約320mg之固定劑量投與。在一個實施例中，抗OX40抗體係以20mg或約20mg之劑量投與。在另一實施例中，抗OX40抗體係以40mg或約40mg之劑量投與。在另一實施例中，抗OX40抗體係以80mg或約80mg之劑量投 與。在另一實施例中，抗OX40抗體係以160mg或約160mg之劑量投與。在另一實施例中，抗OX40抗體係以320mg或約320mg之劑量投與。
在一些實施例中，抗PD-1抗體係以約100至300mg之固定劑量投與。舉例而言，免疫-腫瘤藥劑之劑量可為240mg或約240mg、360mg或約360mg或480mg或約480mg。在某些實施例中，抗PD1抗體之劑量在約0.0001mg/kg至100mg/kg範圍內，且更通常0.01mg/kg至5mg/kg宿主體重範圍內。舉例而言，劑量可為0.3mg/kg體重或約0.3mg/kg體重、1mg/kg體重或約1mg/kg體重、3mg/kg體重或約3mg/kg體重、5mg/kg體重或約5mg/kg體重或10mg/kg體重或約10mg/kg體重，或在1-10mg/kg範圍內。在一些實施例中，抗PD-1抗體之劑量係240mg或約240mg，每2週投與一次(Q2W)。此劑量可按比例調節(120mg/週)達較長或較短時段，例如360mg每3週投與一次(Q3W)或480mg每4週投與一次(Q4W)。
在一些實施例中，抗CTLA-4抗體係以約0.1mg/kg至約10mg/kg之劑量投與。舉例而言，劑量可為1mg/kg或約1mg/kg或3mg/kg或約3mg/kg宿主體重。
利用抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗體之組合治療之實例性劑量方案在下文提供於標題為「使用及方法」之部分下。
在某些實施例中，抗OX40抗體係以約15分鐘至約60分鐘、例如約30分鐘之輸注持續時間投與患者。
在某些實施例中，在以3mg/kg(0.1mg/kg/min)之劑量投與時，抗PD-1抗體(例如，尼沃魯單抗)係以約15分鐘至約60分鐘、例如約30分鐘之輸注持續時間投與患者。在某些實施例中，在以10mg/kg之劑量投與時，抗PD-1抗體係以約45分鐘至75分鐘、例如約60分鐘之輸注持續時間投與患者。
在某些實施例中，在以3mg/kg之劑量投與時，抗CTLA-4抗體(例如，伊匹單抗)係以約15分鐘至120分鐘、例如約30分鐘之輸注持續時間投與患者。在某些實施例中，在以10mg/kg之劑量投與時，抗CTLA-4抗體係以約15分鐘至120分鐘、例如90分鐘之輸注持續時間投與患者。
在某些實施例中，在同一天投與時，抗OX40抗體在抗PD-1或抗CTLA-4抗體之前投與。在某些實施例中，在同一天投與時，抗OX40抗體在抗PD-1或抗CTLA-4抗體之後投與。在某些實施例中，在同一天投與時，抗OX40抗體與抗PD-1或抗CTLA-4抗體同時投與。
在某些實施例中，在同一天投與時，抗OX40抗體在抗PD-1或抗CTLA-4抗體之前約15至45分鐘(例如，約30分鐘)投與。在某些實施例中，在同一天投與時，抗OX40抗體在抗PD-1或抗CTLA-4抗體之後約15至45分鐘(例如，約30分鐘)投與。
或者，本文提供抗OX40抗體可以平坦劑量(平坦劑量方案)投與。
在一些情形下，同時投與兩種或更多種具有不同結合特異性之單株抗體，使得所投與每一抗體之劑量在上述範圍內。另外，抗體通常係在多個時機下投與。單一劑量之間之間隔可係(例如)每週、每月、每三個月或每年。間隔亦可如藉由量測患者之針對靶抗原之抗體血液含量所指示而不規則。在一些方法中，對劑量進行調節以達成約1-1000μg/ml且在一些方法中約25-300μg/ml之血漿抗體濃度。
本文所述抗OX40抗體可以另一抗體之劑量方案與另一抗體一起投與。舉例而言，抗OX40抗體可每兩週在60分鐘內以靜脈內輸注形式與抗PD-1抗體(例如尼沃魯單抗(OPDIVO))一起投與直至疾病進展或不可接受之毒性發生為止。或者，抗OX40抗體可每3週在30分鐘內以靜脈內輸注形式與派姆單抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA)一起投 與直至疾病進展或不可接受之毒性發生為止。
抗體可以持續釋放調配物形式投與，在該情形下需要較不頻繁投與。劑量及頻率端視抗體在患者中之半衰期而變化。通常，人類抗體顯示最長半衰期，其次為人類化抗體、嵌合抗體及非人類抗體。投與劑量及頻率可端視治療為預防性抑或或治療性而變化。在預防性應用中，以相對較不頻繁之間隔經較長時間段投與相對較低之劑量。一些患者在其餘生中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對較短間隔之相對較高之劑量直至減輕或終止疾病進展且較佳直至患者顯示疾病症狀之部分或完全改善為止。此後，可向患者投與預防性方案。
本文所述醫藥組合物中活性成份之實際劑量可有所變化，以便獲得對於特定患者、組合物及投與模式有效達到期望治療反應而對患者不具毒性之活性成份量。所選劑量值將端視多種藥物代謝動力學因素而定，該等因素包括所用本文所述特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所用特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、一般健康情況及先前醫療史及已為醫學技術中所熟知之類似因素。
本文所述抗體之「治療有效劑量」較佳可降低疾病症狀之嚴重程度，增加無疾病症狀時段之頻率及持續時間或預防因感病性所致之損害或失能。在癌症之上下文中，治療有效劑量較佳可增加存活、及/或預防與癌症相關之身體症狀之進一步劣化。癌症之症狀為業內所熟知且包括(例如)不常見的痣特徵(unusual mole feature)、痣外觀(包括不對稱、邊界、顏色及/或直徑)變化、新近著色皮膚區域、異常痣、指甲下變深區域、乳房腫塊、乳頭變化、乳腺囊腫、乳房疼痛、死亡、體重減輕、虛弱、過度疲勞、進食困難、喪失食欲、慢性咳 嗽、惡化氣絕、咳血、尿液帶血、糞便帶血、噁心、嘔吐、肝轉移、肺轉移、骨轉移、腹痛下墮、氣脹病、腹腔中流體、陰道出血、便秘、腹脹、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、發熱、疼痛)、疼痛、吐血、嚴重出汗、發熱、高血壓、貧血、腹瀉、黃疸、頭暈、發冷、肌肉痙攣、結腸轉移、肺轉移、膀胱轉移、肝轉移、骨轉移、腎轉移及胰臟轉移、吞嚥困難及諸如此類。
治療有效劑量可防止或延遲癌症發作，例如在存在疾病之早期或初步體徵時可為合意的。用於診斷癌症之實驗室測試包括化學(包括OX40含量之量測)、血液學、血清學及放射學。因此，監測上述中之任一者之任何臨床或生物化學分析可用於確定特定治療是否係用於治療癌症之治療有效劑量。熟習此項技術者應能夠基於諸如個體之大小、個體症狀之嚴重程度及特定組合物或所選投與途徑等因素來測定該等量。
本文所述抗體及組合物可使用此項技術中已知之多種方法中之一或多者經由一或多個投與途徑投與。如熟習此項技術者應瞭解，投與途徑及/或模式應視所期望結果而變化。本文所述抗體之較佳投與途徑包括靜脈內、肌內、皮內、腹膜腔內、皮下、脊柱或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。本文所用片語「非經腸投與」意指除經腸及局部投與以外之投與模式，通常藉由注射，且包括(但不限於)靜脈內、肌內、動脈內、鞘內、囊內、眼窩內、心內、皮內、腹膜腔內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、經囊下、蛛網膜下、脊柱內、硬膜外及胸骨內注射及輸注。
或者，抗體可經由非經腸途徑投與，例如局部、表皮或黏膜投與途徑，例如經鼻內、經口、經陰道、經直腸、經舌下或經局部。
活性化合物可利用保護化合物免於快速釋放之載劑製備，例如控制釋放調配物，包括植入體、經皮貼劑及微囊封遞送系統。可使用 生物可降解、生物相容之聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此等調配物之許多方法已獲得專利權或通常已為彼等熟習此項技術者所知。參見(例如)Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson編輯，Marcel Dekker公司，New York,1978。
抗體組合物可利用業內已知之醫學器件投與。舉例而言，在一個實施例中，組合物可利用無針皮下注射器件(例如揭示於美國專利第5,399,163號、第5,383,851號、第5,312,335號、第5,064,413號、第4,941,880號、第4,790,824號或第4,596,556號中之器件)來投與。用於投與抗體之熟知植入體及模組的實例包括：美國專利第4,487,603號，其揭示用於以控制速率分配用藥之可植入微輸注幫浦；美國專利第4,486,194號，其揭示用於經由皮膚投與藥物之治療器件；美國專利第4,447,233號，其揭示用於以精確輸注速率遞送用藥之用藥輸注幫浦；美國專利第4,447,224號，其揭示用於連續藥物遞送之可變流量可植入輸注裝置；美國專利第4,439,196號，其揭示具有多室隔間之滲透藥物遞送系統；及美國專利第4,475,196號，其揭示滲透藥物遞送系統。此等專利皆以引用方式併入本文中。許多其他植入體、遞送系統及模組為熟習此項技術者已知。
在某些實施例中，抗OX40抗體經調配以確保在活體內適當分佈。舉例而言，血腦障壁(BBB)排除許多高度親水性化合物。為確保抗體跨越BBB(若期望，例如，針對腦癌)，則其可(例如)在脂質體中經調配。對於製造脂質體之方法，參見(例如)美國專利4,522,811；5,374,548；及5,399,331。脂質體可包含一或多個選擇性運輸至特定細胞或器官中、由此增強靶向藥物遞送的部分(例如，參見V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。實例性靶向部分包括葉酸或生物素(例如，參見頒予Low等人之美國專利5,416,016)；甘露糖苷 (Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗體(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性劑蛋白質A受體(Briscoe等人(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
XVI.使用及方法
本文所述抗OX40抗體及組合物具有多種活體外及活體內應用，其涉及(例如)藉由活化OX40信號傳導增強免疫反應或檢測OX40。在較佳實施例中，抗體係人類抗體。舉例而言，本文所述抗OX40抗體可在活體外或離體與培養物中之細胞接觸或(例如)在活體內投與人類個體以增強多種疾病中之免疫性。因此，本文提供改良個體中之免疫反應的方法，其包含向個體投與本文所述抗體或其抗原結合部分，使得個體中之免疫反應經改良。較佳地，增強、刺激或上調反應。
較佳個體包括免疫反應之增強可為合意的之人類患者。該等方法尤其適於治療患有可藉由加強免疫反應(例如，T細胞介導之免疫反應，例如抗原特異性T細胞反應)治療之病症之人類患者。在特定實施例中，該等方法尤其適於活體內治療癌症。為達成免疫性之抗原特異性增強，本文所述抗OX40抗體可與所關注抗原一起投與或抗原可已經存於欲治療之個體(例如，帶有腫瘤或帶有病毒之個體)中。在抗OX40抗體與另一藥劑一起投與時，兩者可單獨或同時投與。
亦涵蓋用於檢測試樣中人類OX40抗原之存在或量測人類OX40抗原之量的方法，其包含在容許在抗體與人類OX40之間形成複合物之條件下使試樣及對照試樣與本文所述抗OX40抗體(或其抗原結合部分)接觸。隨後檢測複合物之形成，其中試樣與對照試樣相比之間之複合 物形成差異指示試樣中人類OX40抗原之存在。本文所述抗OX40抗體亦可用於經由免疫親和力純化純化人類OX40。
假定本文所述抗OX40抗體刺激或共刺激T細胞反應(例如抗原特異性T細胞反應)之能力，本文亦提供使用抗體以刺激、增強或上調抗原特異性T細胞反應(例如抗腫瘤T細胞反應)之活體外及活體內方法。在某些實施例中，亦包括CD3刺激(例如，藉由與表現膜CD3之細胞共培育)，該刺激可與用抗OX40抗體刺激同時、之前或之後提供。在一個實施例中，方法包含使T細胞與本文所述抗OX40抗體、及視情況抗CD3抗體接觸，使得刺激抗原特異性T細胞反應。可使用抗原特異性T細胞反應之任何適宜指示因子以量測抗原特異性T細胞反應。該等適宜指示因子之非限制性實例包括在抗體存在下增加之T細胞增殖及/或在抗體存在下增加細胞介素產生。在較佳實施例中，刺激由抗原特異性T細胞之介白素-2及/或干擾素-γ產生。
可利用抗OX40抗體增強或共刺激之T細胞包括CD4+ T細胞及CD8+ T細胞。T細胞可為Teff細胞，例如CD4+ Teff細胞、CD8+ Teff細胞、輔助(Th)細胞及T細胞毒性(Tc)細胞。
亦提供刺激個體中免疫反應(例如，抗原特異性T細胞反應)之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所述抗OX40抗體，使得刺激個體中之免疫反應(例如，抗原特異性T細胞反應)。在較佳實施例中，個體係帶有腫瘤之個體且刺激針對腫瘤之免疫反應。腫瘤可為實體腫瘤或液體腫瘤(例如血液惡性病)。在某些實施例中，腫瘤係免疫原性腫瘤。在某些實施例中，腫瘤係非免疫原性。在某些實施例中，腫瘤係PD-L1陽性。在某些實施例中，腫瘤係PD-L1陰性。個體亦可為帶有病毒之個體且刺激針對病毒之免疫反應。
進一步提供抑制個體中腫瘤細胞生長之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所述抗OX40抗體，使得抑制個體中之腫瘤生 長。亦提供治療個體中病毒感染之方法，其包含向個體投與本文所述抗OX40抗體，使得治療個體中之病毒感染。
本文亦涵蓋自患有腫瘤(例如癌性腫瘤)之個體之腫瘤微環境耗盡Treg細胞的方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所述抗OX40抗體，該抗OX40抗體包含刺激腫瘤微環境中Treg細胞之耗盡的Fc。Fc可為(例如)具有效應物功能或增強之效應物功能(例如結合至一或多種活化Fc受體或具有增強之與一或多種活化Fc受體之結合)的Fc。在較佳實施例中，Treg耗盡發生而不顯著耗盡或抑制腫瘤微環境中之Teff，且不顯著耗盡或抑制腫瘤微環境外、例如末梢中之Teff細胞及Treg細胞。在某些實施例中，個體在Treg細胞上較在Teff細胞上、例如在腫瘤微環境中具有較高含量之OX40。
在某些實施例中，用具有增強激動作用(例如結合至抑制性FcRIIb或具有增強之與抑制性FcRIIb之結合)之Fc的抗OX40抗體治療個體。抗OX40抗體可耗盡腫瘤中之Treg及/或腫瘤浸潤性淋巴球(TIL)中之Treg。
在某些實施例中，給予個體抗OX40抗體作為附加療法。利用抗OX40抗體治療患有癌症之個體可延長存活，例如相對於當前護理標準長期耐久反應；至少3個月、6個月、9個月、1年、2年、3年、4年、5年、10年或更多年之長期存活，或至少3個月、6個月、9個月、1年、2年、3年、4年、5年或10年或更多年之無復發存活。在某些實施例中，用抗OX40抗體治療患有癌症之個體可防止癌症復發或延遲癌症復發(例如)3個月、6個月、9個月、1年、2年、3年、4年、5年或10年或更多年。抗OX40抗體治療可用作一線、二線或三線治療。
在較佳實施例中，抗OX40抗體並無顯著毒性。舉例而言，抗體對人類器官(例如肝、腎、腦、肺及心臟中之一或多者)並無顯著毒性，如(例如)臨床試驗中所測定。在某些實施例中，抗體並不顯著觸 發不合意之免疫反應，例如自體免疫性或發炎。
在某些實施例中，用抗OX40抗體治療個體不會引起免疫系統過刺激至個體之免疫系統隨後攻擊個體自身(例如，自體免疫反應)或引起(例如)過敏反應之程度。因此，抗體較佳不引起過敏反應。
在某些實施例中，用抗OX40抗體治療個體不會引起顯著發炎反應，例如免疫介導之肺炎、免疫介導之結腸炎、免疫介導之肝炎、免疫介導之腎炎或腎功能障礙、免疫介導之垂體炎、免疫介導之甲狀腺功能減退及甲狀腺功能亢進或其他免疫介導之不良反應。
在某些實施例中，抗OX40抗體與另一癌症療法(例如刺激免疫系統之化合物(例如，免疫-腫瘤藥劑)，例如本文所述化合物或調節本文所述靶標之化合物)組合提供協同抗腫瘤效應。
下文進一步詳細論述本文所述該等及其他方法。
癌症
由抗OX40抗體活化OX40可增強對患者中癌細胞之免疫反應。因此，本文提供治療患有癌症之個體之方法，其包含向個體投與本文所述抗OX40抗體，使得治療個體，例如使得抑制或減少癌性腫瘤之生長及/或腫瘤退化及/或達成延長存活。抗OX40抗體可單獨使用以抑制癌性腫瘤之生長。或者，抗OX40抗體可與另一藥劑(例如另一免疫原性藥劑)、標準癌症治療或另一抗體組合使用，如下文所述。
因此，本文提供(例如)藉由抑制個體中腫瘤細胞生長來治療癌症之方法，其包含向個體投與治療有效量之本文所述抗OX40抗體。抗體可為人類抗體。另外或或者，抗體可為嵌合或人類化抗體。
本文亦提供組合療法，其包含投與抗OX40抗體及抗PD-1或抗CTLA-4抗體以治療患有腫瘤(例如，晚期實體腫瘤)之個體。
在某些實施例中，本文提供治療癌症之方法，其中根據所定義臨床劑量方案向患有腫瘤(例如，晚期實體腫瘤)之患者投與抗OX40抗 體及抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體。在某些實施例中，抗OX40抗體係OX40.21。在某些實施例中，抗PD-1抗體係BMS-936558(尼沃魯單抗)。在某些實施例中，抗CTLA-4抗體係伊匹單抗(Yervoy®)。在某些實施例中，可對劑量方案進行調節以提供最佳期望反應(例如有效反應)。
如本文所用，附加或組合投與(共投與)包括以相同或不同劑型同時投與化合物或分開投與化合物(例如，依序投與)。因此，抗OX40及抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體可在單一調配物中同時投與。或者，抗OX40及抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體可經調配用於分開投與且並行或依序投與(例如，一種抗體在投與第二抗體之前之約30分鐘內投與)。
舉例而言，可首先投與抗PD1抗體或抗CTLA-4抗體，且之後(例如，之後立刻)投與抗OX40抗體，或反之亦然。在某些實施例中，在投與抗OX40抗體之前投與抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體。在另一實施例中，在投與抗OX40抗體之後投與抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體。在另一實施例中，並行投與抗OX40抗體及抗PD-1抗體或抗CTLA-4抗體。該並行或依序投與較佳引起在所治療患者中同時存在兩種抗體。
可利用抗OX40抗體或與抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗體之組合療法抑制生長之癌症包括通常對免疫療法有反應之癌症及通常對免疫療法無反應之彼等。癌症可為具有實體腫瘤或血液惡性病(液體腫瘤)之癌症。用於治療之癌症之非限制性實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、鱗狀非小細胞肺癌(NSCLC)、非鱗狀NSCLC、神經膠質瘤、胃腸癌、腎癌(例如透明細胞癌)、卵巢癌、肝癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、腎癌(例如，腎細胞癌(RCC))、前列腺癌(例如激素難治性前列腺腺癌)、甲狀腺癌、神經胚細胞瘤、胰臟癌、神經膠母細胞瘤(多形性神經膠母細胞瘤)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌、結腸癌及頭頸癌(或癌瘤)、胃癌、生殖細胞腫 瘤、兒科肉瘤、鼻竇天然殺傷、黑色素瘤(例如，轉移性惡性黑色素瘤，例如皮膚或眼內惡性黑色素瘤)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛區癌、睪丸癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、兒童期實體腫瘤、輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經系統之贅瘤(CNS)、原發性CNS淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊軸腫瘤、腦癌、腦幹膠質瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、表皮樣癌、鱗狀細胞癌、T細胞淋巴瘤、環境誘導之癌症(包括由石棉誘導之彼等)、病毒相關癌症或病毒起源之癌症(例如，人類乳頭瘤病毒(HPV相關或起源之腫瘤))、及源自兩種主要血球譜系(即骨髓細胞系(其產生顆粒球、紅血球、血栓細胞、巨噬細胞及肥胖細胞)或淋巴細胞系(其產生B、T、NK及漿細胞))中之任一者之血液學惡性病，例如所有類型之白血病、淋巴瘤及骨髓瘤，例如急性、慢性、淋巴球性及/或骨髓性白血病，例如急性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)及慢性骨髓性白血病(CML)、未分化之AML(M0)、骨髓母細胞性白血病(M1)、骨髓母細胞性白血病(M2；細胞成熟)、前髓球性白血病(M3或M3變體[M3V])、骨髓單核球性白血病(具有嗜酸性球增多症之M4或M4變體[M4E])、單核球性白血病(M5)、紅白血病(M6)、巨核母球性白血病(M7)、分離之顆粒球性肉瘤及綠色瘤；淋巴瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、B細胞血液學惡性病(例如B細胞淋巴瘤)、T細胞淋巴瘤、淋巴漿細胞樣淋巴瘤、單核球樣B細胞淋巴瘤、黏膜相關之淋巴組織(MALT)淋巴瘤、退行性(例如，Ki 1+)大細胞淋巴瘤、成人T細胞淋巴瘤/白血病、外套細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、血管中心淋巴瘤、腸T細胞淋巴瘤、原發性縱膈B細胞淋巴瘤、前體T-淋巴母細胞性淋巴瘤、T-淋 巴母細胞性淋巴瘤；及淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、末梢T細胞淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤、移植後淋巴增殖病症、真實組織細胞性淋巴瘤、原發性中樞神經系統淋巴瘤、原發性積液淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤(LBL)、淋巴譜系之造血性腫瘤、急性淋巴母細胞性白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、濾泡性淋巴瘤、彌漫性組織細胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母細胞大細胞淋巴瘤、前體B-淋巴母細胞性淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤(CTLC)(亦稱作蕈樣真菌病或塞紮裡症候群(Sezary syndrome))及具有華氏巨球蛋白血症之淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)；骨髓瘤，例如IgG骨髓瘤、輕鏈骨髓瘤、非分泌骨髓瘤、燜燃型骨髓瘤(亦稱作無痛骨髓瘤)、孤立性漿細胞瘤及多發性骨髓瘤、慢性淋巴球性白血病(CLL)、多毛細胞淋巴瘤；類骨髓譜系之造血性腫瘤、間質起源之腫瘤(包括纖維肉瘤及橫紋肌肉瘤)；精細胞瘤、畸形癌、中樞及周圍神經腫瘤，包括星細胞瘤、神經鞘瘤；間質起源之腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及骨肉瘤；及其他腫瘤，包括黑色素瘤、著色性乾皮病、角質棘皮瘤、精細胞瘤、甲狀腺濾泡性癌及畸形癌、淋巴譜系之造血性腫瘤，例如T細胞及B細胞腫瘤，包括(但不限於)T細胞病症，例如T前淋巴球性白血病(T-PLL)，包括小細胞及腦回狀細胞類型；較佳T細胞類型之大的顆粒性淋巴球白血病(LGL)；a/d T-NHL肝脾淋巴瘤；末梢/胸腺後T細胞淋巴瘤(多型及免疫母細胞亞型)；血管中心(鼻)T細胞淋巴瘤；頭或頸癌、腎癌、直腸癌、甲狀腺癌；急性類骨髓性淋巴瘤以及該等癌症之任何組合。本文所述方法亦可用於治療轉移性癌症、不可切除及/或難治性癌症(例如，利用(例如)阻斷CTLA-4或PD-1抗體之先前免疫療法難治之癌症)及復發性癌症。
在某些實施例中，利用抗OX40抗體或抗OX40抗體與抗PD-1或抗CTLA-4抗體之組合治療之患者患有晚期實體腫瘤。舉例而言，在一 個實施例中，欲治療之患者患有子宮頸癌。在另一實施例中，欲治療之患者患有結腸直腸(CRC)癌。在另一實施例中，欲治療之患者患有膀胱癌(例如，不可切除之局部晚期或轉移膀胱癌)。在另一實施例中，欲治療之患者患有卵巢癌(例如，不可切除欲治療之患者患有或轉移卵巢癌)。
在一個實施例中，利用抗OX40抗體或抗OX40抗體與抗PD-1或抗CTLA-4抗體之組合治療之患者患有非小細胞肺癌(NSCLC)。在另一實施例中，欲治療之患者患有頭頸鱗狀細胞癌(SCCHN)。在另一實施例中，欲治療之患者患有B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)。在另一實施例中，欲治療之患者患有骨髓瘤。在另一實施例中，患者患有黑色素瘤。在另一實施例中，欲治療之患者患有彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
在某些實施例中，向對先前治療(例如利用免疫-腫瘤藥物之先前治療)展現反應不足之患有癌症之患者或患有難治或抗性、固有難治或抗性(例如，利用PD-1路徑拮抗劑難治)或其中抗性或難治性狀態係獲得性之癌症之患者投與抗OX40抗體。舉例而言，可藉由單獨投與抗OX40抗體或與另一療法(例如，抗PD-1療法)之組合治療對第一療法無反應或反應不足或在治療(例如抗PD-1治療)後觀察到疾病進展之個體。
在某些實施例中，向先前未接受免疫-腫瘤藥劑(例如PD-1路徑拮抗劑)(即，經其治療)之患者投與抗OX40抗體。
在某些實施例中，可利用護理治療之標準(例如，手術、輻射及化學療法)投與抗OX40抗體。在其他實施例中，抗OX40抗體可作為維持療法(例如意欲防止腫瘤發生或復發之療法)投與。
在某些實施例中，抗OX40抗體可與另一治療(例如輻射、手術或化學療法)一起投與。舉例而言，在存在可存在微轉移之風險時及/或 為了降低復發之風險，可投與抗OX40抗體附加療法。
在某些實施例中，抗OX40抗體可作為單一療法、或作為唯一免疫刺激療法投與。在其他實施例中，抗OX40抗體亦可免疫原試劑(例如癌細胞、純化腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽及碳水化合物分子)、細胞及經編碼免疫刺激細胞介素之基因轉染之細胞)組合(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可使用之腫瘤疫苗之非限制性實例包括黑色素瘤抗原之肽(例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽)、或經轉染以表現細胞介素GM-CSF之腫瘤細胞(下文進一步論述)。
在人類中，已顯示一些腫瘤具有免疫原性，例如黑色素瘤。藉由經由OX40活化降低T細胞活化之臨限值，可活化宿主中之腫瘤反應，從而容許治療非免疫原性腫瘤或具有限制免疫原性之彼等。
在一些實施例中，抗OX40抗體可結合疫苗接種方案使用。已設計出針對腫瘤之疫苗接種之許多實驗策略(參見Rosenberg,S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCO Educational Book Spring：60-62；Logothetis,C.,2000,ASCO Educational Book Spring：300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring：414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational Book Spring：730-738；亦參見Restifo,N.及Sznol,M.,Cancer Vaccines，第61章，第3023-3043頁，DeVita等人(編輯)，1997,Cancer：Principles and Practice of Oncology，第五版)。在該等策略之一個此策略中，使用自體或同種腫瘤細胞製備疫苗。已顯示該等細胞疫苗在腫瘤細胞經轉導以表現GM-CSF時最有效。已顯示GM-CSF係用於腫瘤疫苗接種之抗原呈遞之有效力之活化劑(Dranoff等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.90：3539-43)。
各種腫瘤中基因表現及大規模基因表現模式之研究已產生所謂腫瘤特異性抗原之定義(Rosenberg,S A(1999)Immunity 10：281-7)。 在許多情形下，該等腫瘤特異性抗原係在腫瘤及產生腫瘤之細胞中表現之分化抗原，例如黑色素細胞抗原gp100、MAGE抗原及Trp-2。更重要的是，可顯示許多該等抗原為宿主中發現之腫瘤特異性T細胞之靶標。OX40活化可與在腫瘤中表現之重組蛋白及/或肽之集合結合使用以生成對該等蛋白之免疫反應。該等蛋白通常由免疫系統視為自身抗原且因此對其具有耐受性。腫瘤抗原可包括蛋白端粒酶，其係染色體之端粒之合成所需的且在85%以上人類癌症及僅有限數目之體細胞組織中表現(Kim等人(1994)Science 266：2011-2013)。腫瘤抗原亦可為由於改變蛋白序列或在兩個無關序列(即，費城染色體(Philadelphia chromosome)中之bcr-abl)之間產生融合蛋白之體細胞突變而在癌細胞中表現之「新-抗原」或來自B細胞腫瘤之獨特型。
其他腫瘤疫苗可包括來自參與人類癌症之病毒(例如人類乳頭瘤病毒(HPV)、肝炎病毒(HBV及HCV)及卡波西氏疱疹肉瘤病毒(KHSV))的蛋白質。可與OX40活化結合使用之另一形式之腫瘤特異性抗原係自腫瘤組織自身分離之純化熱休克蛋白(HSP)。該等熱休克蛋白含有來自腫瘤細胞之蛋白之片段且該等HSP高度有效地遞送至抗原呈遞細胞用於引發腫瘤免疫性(Suot及Srivastava(1995)Science 269：1585-1588；Tamura等人(1997)Science 278：117-120)。
樹突細胞(DC)係可用於引發抗原特異性反應之有效力之抗原呈遞細胞。DC可離體產生且裝載有各種蛋白質及肽抗原以及腫瘤細胞萃取物(Nestle等人(1998)Nature Medicine 4：328-332)。DC亦可藉由遺傳方式轉導以亦表現該等腫瘤抗原。出於免疫目的，DC亦已直接融合至腫瘤細胞(Kugler等人(2000)Nature Medicine 6：332-336)。作為疫苗接種之方法，DC免疫可有效地與OX40活化組合以活化更有效力之抗腫瘤反應。
本文所述抗OX40抗體亦可與化學治療方案組合。在該等情況 下，可減少所投與化學治療試劑之劑量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。舉例而言，抗OX40抗體可與氨烯咪胺(decarbazine)組合用於治療黑色素瘤。在另一實例中，抗OX40抗體可與介白素-2(IL-2)組合用於治療黑色素瘤。支持抗OX40抗體及化學療法之組合使用之科學原理係細胞死亡，即大部分化學治療化合物之細胞毒性作用的結果，應在抗原呈遞路徑中產生增加之腫瘤抗原含量。可經由細胞死亡與抗OX40抗體產生協同作用之其他組合療法係輻射、手術及激素剝奪。該等方案中之每一者皆在宿主中產生腫瘤抗原之來源。血管生成抑制劑亦可與抗OX40抗體組合使用。血管生成之抑制導致腫瘤細胞死亡，此可將腫瘤抗原餵入宿主抗原呈遞路徑中。
本文所述抗OX40抗體亦可與將表現Fcα或Fcγ受體之效應物細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性抗體組合使用(例如，參見美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性抗體可用於靶向兩種單獨抗原。舉例而言，抗Fc受體/抗腫瘤抗原(例如，Her-2/neu)雙特異性抗體已用於將巨噬細胞靶向腫瘤之位點。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性反應。可藉由OX40之活化加強該等反應之T細胞臂。或者，可藉由使用結合至腫瘤抗原及樹突細胞特異性細胞表面標記物之雙特異性抗體將抗原直接遞送至DC。
腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監督。許多該等機制可藉由由腫瘤表現且具有免疫抑制性之蛋白質之不活化來克服。該等機制尤其包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163：1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13：198-200)及Fas配體(Hahne等人(1996)Science 274：1363-1365)。針對該等實體中之每一者之抗體可與抗OX40抗體組合使用以消除免疫抑制劑之效應並幫助由宿主之腫瘤免疫反應。
活化宿主免疫反應之其他抗體可與本文所述抗OX40抗體組合使 用。該等抗體包括樹突細胞表面上之分子，其活化DC功能及抗原呈遞。抗CD40抗體能夠有效地取代T細胞輔助活性(Ridge等人(1998)Nature 393：474-478)且可與抗OX40抗體結合使用。活化針對T細胞共刺激分子之抗體(例如CTLA-4(例如，美國專利第5,811,097號)、OX-40(Weinberg等人(2000)Immunol 164：2160-2169)、4-1BB(Melero等人(1997)Nature Medicine 3：682-685(1997)及ICOS(Hutloff等人(1999)Nature 397：262-266)亦可提供增加之T細胞活化程度。PD1或PD-L1之抑制劑亦可與抗OX40抗體結合使用。
目前使用骨髓移植以治療多種造血性起源之腫瘤。儘管移植物抗宿主病係由此治療所致，但可自移植物抗腫瘤反應獲得治療益處。抗OX40抗體可用於增加移入腫瘤特異性T細胞之供體之有效性。
亦存在若干實驗治療方案，其涉及抗原特異性T細胞之離體活化及擴增及該等細胞授受性轉移至接受者中以刺激對抗腫瘤之抗原特異性T細胞(Greenberg及Riddell(1999)Science 285：546-51)。該等方法亦可用於活化T細胞對感染物(例如CMV)之反應。在抗OX40抗體存在下之離體活化可增加授受性轉移之T細胞之頻率及活性。
傳染病
本文亦提供治療已暴露於特定毒素或病原體之患者的方法。因此，本文提供治療個體之傳染病之方法，其包含向個體投與本文所述抗OX40抗體，使得治療個體之傳染病。在某些實施例中，抗OX40抗體係嵌合或人類化抗體。
類似於如上文所論述抗OX40抗體對於腫瘤之應用，該等抗體可單獨使用或作為佐劑與疫苗組合使用，以刺激對病原體、毒素及自身抗原之免疫反應。此治療方法可尤其有用之病原體之實例包括目前無有效疫苗之病原體或習用疫苗並非完全有效之病原體。該等病原體包括(但不限於)HIV、肝炎(A、B及C型)、流行性感冒、疱疹、賈第蟲 (Giardia)、瘧疾、利什曼蟲(Leishmania)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)。抗OX40抗體可用於抵抗由在感染過程中呈遞改變抗原之試劑(例如HIV)之確立感染。在抗OX40抗體投與時，該等新穎表位被識別為外來物，由此引起強的T細胞反應。
引起可藉由本文所述方法治療之感染之病原體病毒的一些實例包括HIV、肝炎(A、B或C型)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II及CMV、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流行性感冒病毒、蟲媒病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯薩奇病毒(coxsackie virus)、冠狀病毒、呼吸道融合病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風疹病毒、小病毒、痘瘡病毒、HTLV病毒、登革熱病毒(dengue virus)、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰白質炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒及蟲媒病毒腦炎病毒。
引起可藉由本文所述方法治療之感染之病原體細菌的一些實例包括披衣菌(chlamydia)、立克次體細菌(rickettsial bacteria)、分枝桿菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumonococci)、腦膜炎球菌(meningococci)及淋球菌(gonococci)、克留氏菌屬(klebsiella)、變形桿菌屬(proteus)、沙雷菌屬(serratia)、假單胞菌屬(pseudomonas)、軍團病桿菌屬(legionella)、白喉(diphtheria)、沙門桿菌屬(salmonella)、桿菌、霍亂(cholera)、破傷風(tetanus)、肉毒中毒、炭疽(anthrax)、瘟疫、鉤端螺旋體病(leptospirosis)及萊姆病細菌(Lymes disease bacteria)。
引起可藉由本文所述方法治療之感染之病原體真菌的一些實例包括念珠菌屬(Candida)(白色念珠菌(albicans)、克魯斯氏念珠菌(krusei)、光滑念珠菌(glabrata)、熱帶念珠菌(tropicalis)等)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、曲黴菌屬(Aspergillus)(煙曲黴菌 (fumigatus)、黑曲黴菌(niger)等)、毛黴菌屬(Genus Mucorales)(毛黴(mucor)、犁頭黴(absidia)、根黴菌(rhizopus))、申克孢子絲菌(Sporothrix schenkii)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)及莢膜組織漿菌(Histoplasma capsulatum)。
引起可藉由本文所述方法治療之感染之病原體寄生蟲的一些實例包括溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)、大腸纖毛蟲(Balantidium coli)、福氏耐格裡原蟲(Naegleriafowleri)、棘狀變形蟲屬(Acanthamoeba sp.)、藍氏賈第蟲(Giardia lambia)、隱孢子蟲屬(Cryptosporidium sp.)、肺泡囊蟲(Pneumocystis carinii)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、焦蟲(Babesia microti)、布魯氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、克魯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、黑熱病利什曼原蟲(Leishmania donovani)、弓蟲(Toxoplasma gondii)、巴西鼠鉤蟲(Nippostrongylus brasiliensis)。
在所有上述方法中，抗OX40抗體可與其他形式之免疫療法(例如細胞介素治療(例如，干擾素、GM-CSF、G-CSF、IL-2)或雙特異性抗體療法(其提供增強之腫瘤抗原呈遞(例如，參見Holliger(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak(1994)Structure 2：1121-1123)))組合。
自體免疫反應
抗OX40抗體可引起並增強自體免疫反應。實際上，使用腫瘤細胞及肽疫苗之抗腫瘤反應之誘導揭示，許多抗腫瘤反應涉及抗自身反應性(van Elsas等人(2001)J.Exp.Med.194：481-489；Overwijk等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：2982-2987；Hurwitz,(2000)，上文文獻；Rosenberg及White(1996)J.Immunother Emphasis Tumor Immunol 19(1)：81-4)。因此，抗OX40抗體可結合各種自身蛋白使用 以設計疫苗接種方案以有效地生成針對該等自身蛋白之免疫反應用於疾病治療。舉例而言，阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)涉及Aβ肽在腦中類澱粉沈積物中之不適當累積；針對類澱粉之抗體反應能夠清除該等類澱粉沈積物(Schenk等人，(1999)Nature 400：173-177)。
其他自身蛋白亦可用作用於治療過敏及哮喘之靶標(例如IgE)及用於類風濕性關節炎之TNFc。最後，可藉由使用抗OX40抗體誘導對於各種激素之抗體反應。中和對生殖激素之抗體反應可用於避孕。亦可將中和對激素及特定腫瘤之生長所需之其他可溶性因子之抗體反應視為可能之疫苗接種靶標。
如上文針對抗OX40抗體之使用所述之類似方法可用於誘導治療性自體免疫反應以治療具有其他自身抗原(例如類澱粉沈積物，包括阿茲海默氏病中之Aβ)、細胞介素(例如TNFα)及IgE之不適當累積的患者。
疫苗
本文所述抗OX40抗體可藉由共投與該等抗體與所關注抗原(例如，疫苗)用於刺激抗原特異性免疫反應。因此，本文提供增強對個體中之抗原之免疫反應的方法，其包含向個體投與：(i)抗原；及(ii)抗OX40抗體，使得增強對個體中之抗原之免疫反應。該抗體可為人類抗OX40抗體(例如本文所述人類抗OX40抗體中之任一者)。在其他實施例中，抗體可為嵌合或人類化抗體。抗原可為(例如)腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原或來自病原體之抗原。該等抗原之非限制性實例包括論述於上文部分中之彼等，例如上文論述之腫瘤抗原(或腫瘤疫苗)、或來自上述病毒、細菌或其他病原體之抗原。
在某些實施例中，使用包含抗OX40抗體結合之表位之肽或融合蛋白作為疫苗代替抗OX40抗體，或除抗OX40抗體外亦使用該肽或融合蛋白。
在活體內及活體外投與本文所述抗體組合物(例如，人類單株抗體、多特異性及雙特異性分子及免疫偶聯物)的適宜途徑為業內所熟知且可由彼等熟習此項技術者選擇。舉例而言，抗體組合物可藉由注射(例如，靜脈內或皮下)投與。所用分子之適宜劑量將端視個體之年齡及體重及抗體組合物之濃度及/或調配物而定。
如前文所述，本文所述抗OX40抗體可與一或多種其他治療劑(例如細胞毒性劑、放射性毒性劑或免疫抑制劑)共投與。抗體可連接至試劑(呈免疫-複合物形式)或可與試劑分開投與。在後一情形(單獨投與)中，抗體可在試劑之前、之後或並行投與或可與其他已知療法(例如抗癌療法，例如輻射)共投與。該等治療劑尤其包括抗贅瘤劑，例如多柔比星(doxorubicin)(阿德力黴素(adriamycin))、順鉑、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate)、卡莫司汀(carmustine)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、達卡巴嗪(dacarbazine)及環磷醯胺羥基脲，其自身僅在對患者具有毒性或亞毒性之量下有效。順鉑係以100mg/ml劑量每四週一次靜脈內投與且阿德力黴素係以60-75mg/ml劑量每21天一次靜脈內投與。本文所述抗OX40抗體或其抗原結合片段與化學治療劑之共投與提供兩種抗癌劑，其經由對人類腫瘤細胞產生細胞毒性效應之不同機制起作用。該共投與可解決與發生對藥物之抗性或可使得腫瘤細胞與抗體不反應之腫瘤細胞之抗原性變化有關的問題。
亦提供包含本文所述抗OX40抗體組合物(例如，人類抗體、雙特異性或多特異性分子或免疫偶聯物)及使用說明書之套組。該套組可進一步含有至少一種額外試劑或一或多種額外本文所述人類抗體(例如，具有補體活性且結合至不同於第一人類抗體之OX40中之表位的人類抗體)。套組通常包括指示套組之內容物之預期用途之標記。術語標記包括套組上供應或與套組一起供應或以其他方式伴隨套組之任何書面或記錄材料。
治療方案
適於治療人類患者之實體腫瘤(例如，晚期實體腫瘤)之方案包括(例如)向患者投與有效量之抗OX40抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：318中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：94中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，其中該方法包含至少一個投藥週期，其中該週期係兩週之時段(Q2W)，其中對於至少一個週期中之每一者，抗OX40抗體之至少一個劑量係以1mg/kg體重之劑量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量；約1mg/kg體重之劑量；或約20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量投與。
用於治療人類患者之實體腫瘤之另一適宜方案包括(例如)向患者投與有效量之以下中之每一者：(a)抗OX40抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：318中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：94中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，及(b)抗PD-1抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：301中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：302中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，其中該方法包含至少一個投藥週期，其中該週期係兩週之時段，其中對於至少一個週期中之每一者，抗OX40抗體之至少一個劑量係以1mg/kg體重之劑量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量；約1mg/kg體重之劑量；或約20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量投與，且抗PD-1抗體之至少一個劑量係以240mg之平坦劑量或約240mg之平坦劑量投與。在一些實施例中，抗PD-1抗體係以360mg之固定劑量每三週投與一次(q3w)或以480mg之劑量每四週投與一次(q4w)。
用於治療人類患者之實體腫瘤之另一適宜方案包括(例如)向患者投與有效量之以下中之每一者：(a)抗OX40抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：318中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：94中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，及(b)抗CTLA-4抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：309中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：310中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，其中該方法包含至少一個投藥週期，其中該週期係三週之時段(q3w)，其中對於至少一個週期中之每一者，抗OX40抗體之至少一個劑量係以1mg/kg體重之劑量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量；約1mg/kg體重之劑量；或約20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量投與，且抗CTLA-4抗體之至少一個劑量係以1mg/kg體重之平坦劑量或約1mg/kg體重之平坦劑量投與。在一個實施例中，抗OX40抗體係與抗CTLA-4抗體一起投與至少一個週期，之後投與抗OX40抗體單一療法至少一個週期。在某些實施例中，抗OX40抗體係與伊匹單抗一起投與最初四個週期，之後投與抗OX40抗體單一療法後續週期。
在一些實施例中，抗OX40抗體及抗PD-1抗體係以下列劑量投與：(a)1mg/kg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體；(b)20mg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體；(c)40mg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體； (d)80mg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體；(e)160mg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體；或(f)320mg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體。
在一些實施例中，抗OX40抗體及抗CTLA-4抗體係以下列劑量投與：(a)1mg/kg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體；(b)20mg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體；(c)40mg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體；(d)80mg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體；(e)160mg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體；或(f)320mg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體。
在一個實施例中，計算每體重之抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗體之劑量，例如mg/kg體重。在另一實施例中，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗體之劑量係平坦-固定劑量。在另一實施例中，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗體之劑量隨時間變化。舉例而言，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗體最初可以高劑量投與且可隨時間降低。在另一實施例中，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗體最初以低劑量投與且可隨時間增加。
在另一實施例中，所投與抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗體之量對於每一劑量恆定。在另一實施例中，所投與抗體之量隨每一劑量變化。舉例而言，抗體之維持(或跟隨)劑量可高於首先投與之負荷劑量或與其相同。在另一實施例中，抗體之維持劑量可低於負荷劑量或與其相同。
在一些實施例中，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗體經調配用於靜脈內投與。在一些實施例中，在每一週期之第1天投與抗OX40抗體或抗OX40抗體及抗PD-1或CTLA-4抗體。
在一些實施例中，抗OX40及/或抗PD-1或抗CTLA-4抗體每週一次、每兩週一次、每三週一次或每四週一次投與，或只要觀察到臨床益處或直至存在完全反應、確認進展性疾病或不可管控之毒性。
在一個實施例中，投藥週期係兩週，若需要，其可重複。在另一實施例中，週期係三週。在一些實施例中，治療由至多8個週期組成。在其他實施例中，治療由至多12個週期組成。
在一個實施例中，每兩週週期投與每一抗OX40抗體及抗PD-1抗體之一個劑量。在另一實施例中，每三週週期投與每一抗PD-1抗體及抗OX40抗體之一個劑量。在另一實施例中，每四週週期投與每一抗PD-1抗體及抗OX40抗體之一個劑量。
在一個實施例中，每三週週期投與每一抗OX40抗體及抗CTLA-4抗體之一個劑量。在一些實施例中，前四個週期每三週投與每一抗OX40抗體及抗CTLA-4抗體之一個劑量，之後第五至第八週期投與抗OX40抗體單一療法。
在另一實施例中，投與抗OX40抗體及抗PD-1或抗CTLA-4抗體作為一線治療(例如，初始或首次治療)。在另一實施例中，投與抗OX40抗體及抗PD-1或抗CTLA-4抗體作為二線治療(例如，在初始或首次治療之後，包括在復發之後及/或在首次治療失敗時)。
在另一態樣中，本發明之特徵在於上文所提及之實施例中之任一者，其中抗PD-1抗體經抗PD-L1或抗PD-L2抗體置換或與其組合。
在一些實施例中，人類患者患有選自由以下組成之群之癌症：子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌及卵巢癌。
在某些實施例中，抗OX40抗體包括包含闡述於SEQ ID NO：87中 之序列之重鏈可變區CDR1、包含闡述於SEQ ID NO：317中之序列之重鏈可變區CDR2、包含闡述於SEQ ID NO：89中之序列之重鏈可變區CDR3、包含闡述於SEQ ID NO：90中之序列之輕鏈可變區CDR1、包含闡述於SEQ ID NO：91中之序列之輕鏈可變區CDR2及包含闡述於SEQ ID NO：92中之序列之輕鏈可變區CDR3。在某些實施例中，抗OX40抗體包括分別包含闡述於SEQ ID NO：318及94中之序列之重鏈及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗OX40抗體包含分別包含闡述於SEQ ID NO：124及116中之序列之重鏈及輕鏈序列。
在某些實施例中，抗PD-1抗體包括分別包含闡述於SEQ ID NO：303-305中之序列之重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3及分別包含闡述於SEQ ID NO：306-308中之序列之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，抗PD-1抗體包含分別闡述於SEQ ID NO：301及302中之序列之重鏈及輕鏈可變區。在某些實施例中，抗PD-1抗體包含分別闡述於SEQ ID NO：299及300中之重鏈及輕鏈序列。
在某些實施例中，抗CTLA-4抗體包括分別包含闡述於SEQ ID NO：311-313中之序列之重鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3及分別包含闡述於SEQ ID NO：314-316中之序列之輕鏈可變區CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，抗CTLA-4抗體包含分別闡述於SEQ ID NO：309及310中之序列之重鏈及輕鏈可變區。
結果
關於靶病灶，對療法之反應可包括：
Figure 105116545-A0202-12-0168-17
Figure 105116545-A0202-12-0169-18
關於非靶病灶，對療法之反應可包括：
Figure 105116545-A0202-12-0170-19
根據本文揭示之方法治療之患者較佳經歷癌症之至少一個體徵之改良。在一個實施例中，改良係藉由可量測之腫瘤病灶之量及/或大小之減小來量測。在另一實施例中，病灶可利用胸部x射線或CT或MRI膜來量測。在另一實施例中，可使用細胞學或組織學以評估對療法之反應。
在一個實施例中，所治療患者展現完全反應(CR)、部分反應(PR)、穩定疾病(SD)、免疫有關之完全反應(irCR)、免疫有關之部分反應(irPR)或免疫有關之穩定疾病(irSD)。在另一實施例中，所治療患者經歷腫瘤收縮及/或生長速率減小，即抑制腫瘤生長。在另一實施例中，減少或抑制不期望細胞增殖。在另一實施例中，可發生以下中之一或多者：可減少癌細胞之數目；可減小腫瘤大小；可抑制、延緩、減緩或停止癌細胞浸潤至周圍器官中；可減緩或抑制腫瘤轉移；可抑制腫瘤生長；可預防或延遲腫瘤復發；可將一或多個與癌症相關之症狀減輕至一定程度。
在其他實施例中，根據本文提供之方法中之任一者投與有效量之抗OX40抗體及抗PD-1或抗CTLA-4抗體產生至少一個選自由以下組 成之群之治療效應：腫瘤大小減小、隨時間出現之轉移性病灶之數目減少、完全消退、部分消退或穩定疾病。在其他實施例中，治療方法產生較僅藉由抗OX40抗體或抗PD-1或抗CTLA-4抗體達成者更好之相當臨床受益率(CBR=CR+PR+SD
Figure 105116545-A0202-12-0171-765
6個月)。在其他實施例中，與單獨抗OX40抗體或抗PD-1或抗CTLA-4抗體相比，臨床受益率之改良係約20%20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或更大。
組合療法
除上文提供之組合療法外，本文所述抗OX40抗體可用於如下文所述組合療法中。
組合療法之方法包括抗OX40抗體或抗OX40抗體與抗PD-1或抗CTLA-4抗體之組合與一或多種其他試劑(例如小分子藥物、抗體或其抗原結合部分)共投與且有效刺激免疫反應以藉此進一步增強、刺激或上調個體之免疫反應的彼等。舉例而言，如實例中所示，向小鼠投與抗OX40抗體及拮抗劑抗PD-1抗體可在抑制腫瘤生長中具有協同效應。
抗OX40抗體可與以下物質組合：(i)刺激性(例如，共刺激)分子(例如，受體或配體)之激動劑及/或(ii)免疫細胞(例如T細胞)上之抑制性信號或分子(例如，受體或配體)之拮抗劑，二者皆可增強免疫反應(例如抗原特異性T細胞反應)。在某些態樣中，免疫-腫瘤藥劑係(i)刺激性(包括共刺激)分子(例如，受體或配體)之激動劑或(ii)參與先天免疫性之細胞(例如NK細胞)上之抑制性(包括共抑制性)分子(例如，受體或配體)的拮抗劑，且其中免疫-腫瘤藥劑增強先天免疫性。該等免疫-腫瘤藥劑通常稱作免疫檢查點調節劑，例如免疫檢查點抑制劑或免疫檢查點刺激劑。
在某些實施例中，抗OX40抗體與靶向作為免疫球蛋白超家族(IgSF)之成員之刺激性或抑制性分子的試劑一起投與。舉例而言，抗 OX40抗體可與靶向IgSF家族之成員之試劑一起投與個體以增加免疫反應。在其他實施例中，抗OX40抗體可與靶向(或特異性結合至)膜結合之配體之B7家族之成員(其包括B7-1、B7-2、B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H2(ICOS-L)、B7-H3、B7-H4、B7-H5(VISTA)及B7-H6)或特異性結合至B7家族成員之共刺激性或共抑制性受體的試劑一起投與。
抗OX40抗體亦可與靶向分子(配體或受體)之TNF及TNFR家族之成員之試劑一起投與，該等試劑係例如CD40及CD40L、GITR、GITR-L、CD70、CD27L、CD30、CD30L、4-1BBL、CD137、TRAIL/Apo2-L、TRAILR1/DR4、TRAILR2/DR5、TRAILR3、TRAILR4、OPG、RANK、RANKL、TWEAKR/Fn14、TWEAK、BAFFR、EDAR、XEDAR、TACI、APRIL、BCMA、LTβR、LIGHT、DcR3、HVEM、VEGI/TL1A、TRAMP/DR3、EDA1、EDA2、TNFR1、淋巴毒素α/TNFβ、TNFR2、TNFα、LTβR、淋巴毒素α 1β2、FAS、FASL、RELT、DR6、TROY及NGFR(參見(例如)Tansey(2009)Drug Discovery Today 00：1)。
可藉由抗OX40抗體與以下試劑中之一或多者之組合刺激T細胞反應：(1)抑制T細胞活化之蛋白質之拮抗劑(抑制劑或阻斷劑)(例如，免疫檢查點抑制劑)，例如如上文所述CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2及LAG-3及以下蛋白質中之任一者：TIM-3、半乳凝素9、CEACAM-1、BTLA、CD69、半乳凝素-1、TIGIT、CD113、GPR56、VISTA、B7-H3、B7-H4、2B4、CD48、GARP、PD1H、LAIR1、TIM-1及TIM-4；及/或(2)刺激T細胞活化之蛋白質之激動劑，例如B7-1、B7-2、CD28、4-1BB(CD137)、4-1BBL、ICOS、ICOS-L、GITR、GITR-L、 CD70、CD27、CD40、DR3及CD28H。
調節上述蛋白質中之一者且可與抗OX40抗體組合用於治療癌症之實例性藥劑包括：YervoyTM(伊匹單抗)或曲美目單抗(Tremelimumab)(針對CTLA-4)、加利昔單抗(galiximab)(針對B7.1)、BMS-936558(針對PD-1)、MK-3475(針對PD-1)、AMP224(針對B7DC)、BMS-936559(針對B7-H1)、MPDL3280A(針對B7-H1)、MEDI-570(針對ICOS)、AMG557(針對B7H2)、MGA271(針對B7H3)、IMP321(針對LAG-3)、BMS-663513(針對CD137)、PF-05082566(針對CD137)、CDX-1127(針對CD27)、阿塞西普(Atacicept)(針對TACI)、CP-870893(針對CD40)、魯卡木單抗(Lucatumumab)(針對CD40)、達西珠單抗(Dacetuzumab)(針對CD40)、莫羅單抗-CD3(Muromonab-CD3)(針對CD3)、伊匹單抗(針對CTLA-4)。
抗OX40抗體亦可與匹利珠單抗(pidilizumab)(CT-011)一起投與。
可與抗OX40抗體組合用於治療癌症之其他分子包括NK細胞上之抑制性受體之拮抗劑或NK細胞上之活化受體之激動劑。舉例而言，抗OX40抗體可與KIR之拮抗劑(例如，利利單抗(lirilumab))組合。
T細胞活化亦由可溶性細胞介素調控，且抗OX40抗體可與抑制T細胞活化之細胞介素之拮抗劑或刺激T細胞活化之細胞介素之激動劑一起投與(例如)患有癌症之個體。
在某些實施例中，抗OX40抗體可與以下物質組合使用：(i)抑制T細胞活化之IgSF家族或B7家族或TNF家族之蛋白質之拮抗劑(或抑制劑或阻斷劑)或抑制T細胞活化之細胞介素之拮抗劑(例如，IL-6、IL-10、TGF-ß、VEGF；「免疫抑制性細胞介素」)及/或(ii)刺激T細胞活化之IgSF家族、B7家族或TNF家族之刺激性受體或細胞介素的激動 劑，其用於刺激免疫反應、例如用於治療增殖疾病(例如癌症)。
用於組合療法之再一些藥劑包括抑制或耗盡巨噬細胞或單核球之藥劑，包括(但不限於)CSF-1R拮抗劑，例如CSF-1R拮抗劑抗體，包括RG7155(WO11/70024、WO11/107553、WO11/131407、W013/87699、W013/119716、WO13/132044)或FPA-008(WO11/140249；W013169264；WO14/036357)。
抗OX40抗體亦可與抑制TGF-β信號傳導之藥劑一起投與。
可與本文所述抗OX40抗體組合之其他藥劑包括增強腫瘤抗原呈遞之藥劑，例如樹突細胞疫苗、GM-CSF分泌細胞疫苗、CpG寡核苷酸及咪喹莫特(imiquimod)，或增強腫瘤細胞之免疫原性之療法(例如，蒽環)。
可與抗OX40抗體組合之再一些療法包括耗盡或阻斷Treg細胞之療法，例如特異性結合至CD25之藥劑。
可與抗OX40抗體組合之另一療法係抑制抑制代謝酶(例如吲哚胺加雙氧酶(IDO)、加雙氧酶、精胺酸酶或一氧化氮合成酶)之療法。
可與抗OX40抗體一起使用之另一類藥劑包括抑制腺苷形成或抑制腺苷A2A受體之藥劑。
可與抗OX40抗體組合用於治療癌症之其他療法包括逆轉/防止T細胞無反應或耗竭之療法及在腫瘤位點處觸發先天免疫活化及/或發炎的療法。
抗OX40抗體可與一種以上免疫-腫瘤藥劑組合，且可(例如)與靶向免疫路徑之多個要素之組合方法組合，例如以下中之一或多者：增強腫瘤抗原呈遞之療法(例如，樹突細胞疫苗、GM-CSF分泌細胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特)；藉由(例如)抑制CTLA-4及/或PD1/PD-L1/PD-L2路徑及/或耗盡或阻斷Treg或其他免疫抑制細胞抑制陰性免疫調控之療法；利用(例如)刺激CD-137及/或GITR路徑及/或刺 激T細胞效應物功能之激動劑刺激陽性免疫調控的療法；全身性增加抗腫瘤T細胞之頻率的療法；使用(例如)CD25之拮抗劑(例如，達克珠單抗(daclizumab))或藉由離體抗CD25珠粒耗盡來耗盡或抑制Treg(例如腫瘤中之Treg)的療法；影響腫瘤中之抑制劑骨髓細胞之功能的療法；增強腫瘤細胞之免疫原性之療法(例如，蒽環)；包括經遺傳修飾之細胞(例如由嵌合抗原受體修飾之細胞)的授受性T細胞或NK細胞轉移(CAR-T療法)；抑制代謝酶(例如吲哚胺加雙氧酶(IDO)、加雙氧酶、精胺酸酶或一氧化氮合成酶)之療法；逆轉/防止T細胞無反應或耗竭之療法；在腫瘤位點處觸發先天免疫活化及/或發炎之療法；投與免疫刺激性細胞介素；或阻斷免疫抑制性細胞介素。
抗OX40抗體可與以下試劑中之一或多者一起使用：接合陽性共刺激性受體之激動試劑、經由抑制性受體減弱信號傳導之阻斷劑、拮抗劑及一或多種全身性增加抗腫瘤T細胞之頻率之藥劑、克服腫瘤微環境內之不同免疫抑制性路徑(例如，阻斷抑制性受體接合(例如，PD-L1/PD-1相互作用)、耗盡或抑制Treg(例如，使用抗CD25單株抗體(例如，達克珠單抗)或藉由離體抗CD25珠粒耗盡)、抑制代謝酶(例如IDO)或逆轉/防止T細胞無反應或耗竭)的藥劑及在腫瘤位點處觸發先天免疫活化及/或發炎之藥劑。
在某些實施例中，若個體係BRAF V600突變陽性，則將抗OX40抗體與BRAF抑制劑一起投與個體。
在某些實施例中，抗OX40抗體與另一免疫刺激抗體一起投與。
本文提供刺激個體之免疫反應之方法，其包含向個體投與抗OX40抗體及一或多種其他免疫刺激性抗體，例如抗PD-1拮抗劑(例如拮抗劑抗體)、抗PD-L1拮抗劑(例如拮抗劑抗體)、拮抗劑抗CTLA-4拮抗劑(例如拮抗劑抗體)及/或抗LAG3拮抗劑(例如拮抗劑抗體)，使得在個體中刺激免疫反應，以(例如)抑制腫瘤生長或刺激抗病毒反 應。在一個實施例中，向個體投與抗OX40抗體及拮抗劑抗PD-1抗體。在一個實施例中，向個體投與抗OX40抗體及拮抗劑抗PD-L1抗體。在一個實施例中，向個體投與抗OX40抗體及拮抗劑抗CTLA-4抗體。在一個實施例中，抗OX40抗體係人類抗體。或者，抗OX40抗體可為(例如)嵌合或人類化抗體。在一個實施例中，至少一種其他免疫刺激性抗體(例如，拮抗劑抗PD-1、拮抗劑抗PD-L1、拮抗劑抗CTLA-4及/或拮抗劑抗LAG3抗體)係人類抗體。或者，至少一種其他免疫刺激性抗體可為(例如)嵌合或人類化抗體(例如，自小鼠抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4及/或抗LAG3抗體製備)。
本文提供治療過度增殖疾病(例如，癌症)之方法，其包含向個體投與抗OX40抗體與拮抗劑PD-1抗體、拮抗劑PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體或抗LAG3抗體。在某些實施例中，以亞治療劑量投與一種或兩種抗體。本文亦提供改變與用免疫刺激劑治療過度增殖疾病相關之不良事件的方法，其包含向個體投與抗抗OX40抗體及亞治療劑量之抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4或抗LAG3抗體。在某些實施例中，抗OX40抗體包含3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1之CDR或可變區，或係本文所述另一激動劑抗OX40抗體。
適用於本文所述方法中之PD-1拮抗劑包括(但不限於)配體、抗體(例如，單株抗體及雙特異性抗體)及多價試劑。在一個實施例中，PD-1拮抗劑係融合蛋白，例如Fc融合蛋白，例如AMP-244。在一個實施例中，PD-1拮抗劑係抗PD-1或抗PD-L1抗體。
實例性抗PD-1抗體係尼沃魯單抗(BMS-936558)或包含闡述於WO 2006/121168中之抗體17D8、2D3、4H1、5C4、7D3、5F4及4A11中之一者之CDR或可變區的抗體。在某些實施例中，抗PD1抗體係闡述於WO2012/145493中之MK-3475(蘭布魯珠單抗(Lambrolizumab))；及闡 述於WO 2012/145493中之AMP-514，其他已知PD-1抗體及其他PD-1抑制劑包括闡述於以下中之彼等：WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2011/066389、WO 2011/161699、WO 2012/145493、美國專利第7,635,757號及第8,217,149號及美國專利公開案第2009/0317368號。亦可使用WO2013/173223中揭示之抗PD-1抗體中之任一者。與該等抗體中之一者競爭結合及/或結合至與該等抗體中之一者相同之PD-1上之表位的抗PD-1抗體亦可用於組合治療。靶向PD-1受體之另一方法係由稠合至IgG1之Fc部分之PD-L2(B7-DC)的細胞外結構域構成的重組蛋白，稱作AMP-224。在某些實施例中，抗體與上文所提及抗體具有至少約90%可變區胺基酸序列一致性。
在某些實施例中，抗OX40抗體與尼沃魯單抗組合使用，該尼沃魯單抗包括包含分別於SEQ ID NO：299及300中所示序列之重鏈及輕鏈、或其抗原結合片段及變體。在某些實施例中，抗體具有尼沃魯單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區。因此，在一個實施例中，抗體包含具有闡述於SEQ ID NO：301中之序列之尼沃魯單抗之VH之CDR1、CDR2及CDR3結構域、及具有闡述於SEQ ID NO：302中之序列之尼沃魯單抗之VL之CDR1、CDR2及CDR3結構域。在某些實施例中，抗體包括分別包含闡述於SEQ ID NO：303-305中之序列之CDR1、CDR2及CDR3結構域、及分別包含闡述於SEQ ID NO：306-308中之序列之CDR1、CDR2及CDR3結構域。在某些實施例中，抗體包括分別包含闡述於SEQ ID NO：301及/或SEQ ID NO：302中之胺基酸序列之VH及/或VL區。在某些實施例中，抗體與SEQ ID NO：301或SEQ ID NO：302具有至少約90%、例如至少約90%、95%或99%可變區一致性。
實例性抗PD-L1抗體包括BMS-936559(在WO 2007/005874及美國專利第美國專利第7,943,743號中稱作12A4)、或包含3G10、12A4、 10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7及13G4之CDR或可變區之抗體，其闡述於PCT公開案WO 07/005874及美國專利第7,943,743號中。在某些實施例中，抗PD-L1抗體係MEDI 4736(亦稱作抗B7-H1)、MPDL3280A(亦稱作RG7446)、MSB0010718C(WO2013/79174)或rHigM12B7。亦可使用WO2013/173223、WO2011/066389、WO2012/145493、美國專利第7,635,757號及第8,217,149號及美國公開案第2009/145493號中揭示之抗PD-L1抗體中之任一者。
實例性抗CTLA-4抗體包括Yervoy TM(伊匹單抗或抗體10D1，闡述於PCT公開案WO 01/14424中)、曲美目單抗(先前稱作替西莫單抗(ticilimumab)，CP-675,206)、或闡述於以下公開案中之任一者中之抗CTLA-4抗體：WO 98/42752；WO 00/37504；美國專利第6,207,156號；Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(17)：10067-10071；Camacho等人(2004)J.Clin.Oncology 22(145)：摘要號2505(抗體CP-675206)；及Mokyr等人(1998)Cancer Res.58：5301-5304。亦可使用WO2013/173223中揭示之抗CTLA-4抗體中之任一者。
實例性抗LAG3抗體包括包含抗體25F7、26H10、25E3、8B7、11F2或17E5之CDR或可變區之抗體，其闡述於美國專利公開案第US2011/0150892號、第WO10/19570號及第WO2014/008218號中。在一個實施例中，抗LAG-3抗體係BMS-986016。可使用之其他業內公認之抗LAG-3抗體包括IMP731及IMP-321，其闡述於US 2011/007023、WO08/132601及WO09/44273中。
在某些實施例中，抗OX40抗體與伊匹單抗組合使用。在某些實施例中，抗體具有伊匹單抗之重鏈及輕鏈CDR或可變區。因此，在一個實施例中，抗體包含具有闡述於SEQ ID NO：309中之序列之伊匹單抗之VH之CDR1、CDR2及CDR3結構域、及具有闡述於SEQ ID NO：310中之序列之伊匹單抗之VL之CDR1、CDR2及CDR3結構域。在某 些實施例中，抗體包括分別包含闡述於SEQ ID NO：311-313中之序列之CDR1、CDR2及CDR3結構域、及分別包含闡述於SEQ ID NO：314-316中之序列之CDR1、CDR2及CDR3結構域。在某些實施例中，抗體包括分別包含闡述於SEQ ID NO：309及/或SEQ ID NO：310中之胺基酸序列之VH及/或VL區。在某些實施例中，抗體與SEQ ID NO：309或SEQ ID NO：310具有至少約90%、例如至少約90%、95%或99%可變區一致性。
向一或多種第二靶抗原(例如LAG-3及/或CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1)投與抗OX40抗體及拮抗劑(例如拮抗劑抗體)可增強對患者中癌細胞之免疫反應。可使用抗OX40抗體抑制生長之癌症包括通常對免疫療法有反應之癌症及通常對免疫療法無反應之彼等。利用本發明之組合療法治療之癌症之代表性實例包括本文所列舉之彼等癌症。
在某些實施例中，本文論述之治療抗體之組合可以單一組合物形式在醫藥上可接受之載劑中並行投與，或以單獨組合物形式與每一抗體在醫藥上可接受之載劑中同時投與。在另一實施例中，治療抗體之組合可依序投與。此外，若依序投與組合療法之一個以上劑量，則依序投與之次序可在投與之每一時間點逆轉或保持相同次序，且依序投與可與並行投與組合，或其任一組合。舉例而言，抗OX40抗體與抗PD1抗體(及/或抗CTLA-4抗體及/或抗PD-L1抗體及/或抗LAG-3抗體)之組合之首次投與可並行，第二投與可與第一抗PD1抗體及第二抗OX40抗體依序，且第三投與可與第一抗OX40抗體及第二抗PD1抗體依序等。另一代表性投藥方案涉及與第一抗OX40及第二抗PD1抗體(及/或抗CTLA-4抗體及/或抗PD-L1抗體及/或抗LAG-3抗體)依序之第一投與，且後續投與可並行。
在某些實施例中，藉由向患有可受益於免疫系統之刺激之疾病(例如癌症或傳染病)之個體投與抗OX40抗體及免疫-腫瘤藥劑治療該 個體。實例性免疫-腫瘤藥劑包括CD 137(4-1BB)激動劑(例如，激動性CD 137抗體，例如烏瑞魯單抗(urelumab)或PF-05082566(W012/32433))；GITR激動劑(例如，激動性抗GITR抗體)、CD40激動劑(例如，激動性CD40抗體)；CD40拮抗劑(例如，拮抗性CD40抗體，例如魯卡木單抗(HCD122)、達西珠單抗(SGN-40)、CP-870、893或Chi Lob 7/4)；CD27激動劑(例如，激動性CD27抗體，例如瓦利路單抗(varlilumab)(CDX-1127))、MGA271(針對B7H3)(WO11/109400))；KIR拮抗劑(例如，利利單抗)；IDO拮抗劑(例如，INCB-024360(WO2006/122150、WO07/75598、WO08/36653、WO08/36642)、吲哚西莫(indoximod)、NLG-919(WO09/73620、WO09/1156652、WO1 1/56652、W012/142237)或F001287)；類鐸(Toll-like)受體激動劑(例如，TLR2/4激動劑(例如，卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin))；TLR7激動劑(例如，海特諾(Hiltonol)或咪喹莫特)；TLR7/8激動劑(例如，雷西莫特(Resiquimod))；或TLR9激動劑(例如，CpG7909))；及TGF-β抑制劑(例如，GC1008、LY2157299、TEW7197或IMC-TR1)。
在一個實施例中，抗OX40抗體係在投與第二藥劑(例如免疫-腫瘤藥劑)之前投與。在另一實施例中，抗OX40抗體係與第二藥劑(例如免疫-腫瘤藥劑)並行投與。在另一實施例中，抗OX40抗體係在投與第二藥劑之後投與。兩種藥劑之投與可於以下時間開始：例如間隔30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、3小時、6小時、12小時、24小時、36小時、48小時、3天、5天、7天或一或多週，或第二藥劑之投與可在投與第一藥劑之後(例如)30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、3小時、6小時、12小時、24小時、36小時、48小時、3天、5天、7天或一或多週開始。
在某些實施例中，抗OX40抗體及第二藥劑(例如免疫-腫瘤藥劑) 係同時投與，例如在(例如)30分鐘或60分鐘之時段內向患者同時輸注。抗OX40抗體可與第二藥劑(例如免疫-腫瘤藥劑)共調配。
視情況，作為單獨免疫治療劑之抗OX40抗體或抗OX40抗體與一或多種其他免疫治療抗體(例如，抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3阻斷)之組合可進一步與免疫原試劑(例如癌細胞、純化腫瘤抗原(包括重組蛋白、肽及碳水化合物分子)、細胞及經編碼免疫刺激細胞介素之基因轉染之細胞)組合(He等人(2004)J.Immunol.173：4919-28)。可使用之腫瘤疫苗之非限制性實例包括黑色素瘤抗原之肽(例如gp100、MAGE抗原、Trp-2、MART1及/或酪胺酸酶之肽)、或經轉染以表現細胞介素GM-CSF之腫瘤細胞(下文進一步論述)。抗OX40抗體及一或多種其他抗體(例如，CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷)之組合亦可進一步與標準癌症治療組合。舉例而言，抗OX40抗體及一或多種其他抗體(例如，CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷)之組合可與化學治療方案有效地組合。在該等情況下，可減少與該組合一起投與之化學治療試劑之劑量(Mokyr等人(1998)Cancer Research 58：5301-5304)。舉例而言，該組合可包括具有或不具有其他抗體(例如抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或LAG-3抗體)之抗OX40抗體，其進一步與氨烯咪胺或介白素-2(IL-2)組合用於治療黑色素瘤。支持組合激動性抗OX40抗體與CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷與化學療法之科學原理係細胞死亡，其係大部分化學治療化合物之細胞毒性作用的結果，應在抗原呈遞路徑中產生增加之腫瘤抗原含量。可經由細胞死亡與具有或不具有CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷之抗OX40抗體之組合產生協同作用之其他組合療法包括輻射、手術或激素剝奪。該等方案中之每一者皆在宿主中產生腫瘤抗原之來源。血管生成抑制劑亦可與抗OX40抗體及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG- 3阻斷之組合來組合。血管生成之抑制導致腫瘤細胞死亡，其可為餵入宿主抗原呈遞路徑中之腫瘤抗原之來源。
在某些實施例中，抗OX40抗體可用作單獨免疫治療劑，或抗OX40抗體及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3封阻抗體之組合亦可與將表現Fcα或Fcγ受體之效應細胞靶向腫瘤細胞之雙特異性抗體組合使用(例如，參見美國專利第5,922,845號及第5,837,243號)。雙特異性抗體可用於靶向兩種單獨抗原。可藉由使用抗OX40抗體及CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷之組合加強該等反應之T細胞臂。
在另一實例中，抗OX40抗體可用作單獨免疫治療劑，或抗OX40抗體與其他免疫刺激劑(例如抗CTLA-4抗體及/或抗PD-1抗體及/或抗PD-L1抗體及/或LAG-3試劑，例如抗體)之組合可結合抗贅瘤抗體(例如Rituxan®(利妥昔單抗)、Herceptin®(曲妥珠單抗)、Bexxar®(托西莫單抗(tositumomab))、Zevalin®(替伊莫單抗(ibritumomab))、Campath®(阿倫單抗)、Lymphocide®(依帕珠單抗(eprtuzumab))、Avastin®(貝伐珠單抗(bevacizumab))及Tarceva®(厄洛替尼(erlotinib))及諸如此類)使用。舉例而言且不希望受限於理論，用抗癌抗體或偶聯至毒素之抗癌抗體之治療可導致癌細胞死亡(例如，腫瘤細胞)，其可增強由免疫刺激劑(例如OX40、CTLA-4、PD-1、PD-L1或LAG-3試劑，例如抗體)介導之免疫反應。在實例性實施例中，過度增殖疾病(例如，癌症腫瘤)之治療可包括抗癌劑(例如抗體)與抗OX40抗體及視情況其他免疫刺激劑(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3試劑，例如抗體)之組合，其並行或依序或其任一組合，其可增強由宿主之抗腫瘤免疫反應。
腫瘤藉由多種機制逃避宿主免疫監督。許多該等機制可藉由由腫瘤表現且具有免疫抑制性之蛋白質之不活化來克服。該等機制尤其 包括TGF-β(Kehrl等人(1986)J.Exp.Med.163：1037-1050)、IL-10(Howard及O'Garra(1992)Immunology Today 13：198-200)及Fas配體(Hahne等人(1996)Science 274：1363-1365)。針對該等實體中之每一者之抗體可進一步與具有或不具有其他免疫刺激劑(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3試劑，例如抗體)之抗OX40抗體組合，以消除免疫抑制劑之效應並幫助由宿主之抗腫瘤免疫反應。
可用於活化宿主免疫反應之其他試劑(例如抗體)可進一步與具有或不具有其他免疫刺激劑(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗體)之抗OX40抗體組合使用。該等抗體包括樹突細胞表面上之分子，其活化DC功能及抗原呈遞。抗CD40抗體(Ridge等人，上文文獻)可結合抗OX40抗體及視情況其他免疫刺激劑(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3試劑，例如抗體)使用。針對T細胞共刺激性分子之其他活化抗體(Weinberg等人，上文文獻；Melero等人，上文文獻；Hutloff等人，上文文獻)亦可提供增加之T細胞活化程度。
如上文所論述，目前正使用骨髓移植以治療多種造血性起源之腫瘤。單獨或與CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷組合之抗OX40免疫療法可用於增加移入腫瘤特異性T細胞中之供體之有效性。
若干實驗治療方案涉及抗原特異性T細胞之離體活化及擴增及該等細胞授受性轉移至接受者中以刺激對抗腫瘤之抗原特異性T細胞(Greenberg及Riddell，上文文獻)。該等方法亦可用於活化T細胞對感染物(例如CMV)之反應。預計在具有或不具有其他免疫刺激療法(例如抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗體)之抗OX40抗體存在下之離體活化可增加授受性轉移之T細胞之頻率及活性。
本文提供改變與用免疫刺激劑治療過度增殖疾病(例如癌症)相關 之不良事件的方法，其包含向個體投與具有或不具有抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3試劑(例如抗體)之抗OX40抗體。舉例而言，本文所述方法提供藉由向患者投與非吸收性類固醇來降低免疫刺激性治療抗體誘導之結腸炎或腹瀉之發病率的方法。如本文所用，「非吸收性類固醇」係展現廣泛首過代謝之糖皮質激素，使得在肝中代謝後，類固醇之生物利用度較低，即小於約20%。在一個實施例中，非吸收性類固醇係布地奈德(budesonide)。布地奈德係局部作用之糖皮質類固醇，在經口投與後，其主要由肝廣泛代謝。ENTOCORT EC®(Astra-Zeneca)係布地奈德之pH及時間依賴性口服調配物，其經研發以最佳化藥物遞送至迴腸及貫穿結腸遞送。ENTOCORT EC®在美國經批准用於治療涉及迴腸及/或升結腸之輕度至中度克羅恩氏病(Crohn's disease)。用於治療克羅恩氏病之ENTOCORT EC®之常見經口劑量係6mg/天至9mg/天。ENTOCORT EC®在腸中釋放，之後吸收並保留於腸黏膜中。一旦其穿過腸黏膜靶組織，ENTOCORT EC®即由細胞色素P450系統在肝中廣泛代謝成具有可忽略之糖皮質激素活性之代謝物。因此，生物利用度較低(約10%)。與具有較少廣泛首過代謝之其他糖皮質激素相比，布地奈德之低生物利用度產生改良之治療比率。布地奈德產生較全身作用之皮質類固醇少之不利效應，包括較少下丘腦-垂體抑制。然而，長期投與ENTOCORT EC®可引起全身性糖皮質激素效應，例如腎上腺功能亢進及腎上腺抑制。參見PDR，第58版，2004；608-610。
在再一些實施例中，具有或不具有CTLA-4及/或PD-1及/或PD-L1及/或LAG-3阻斷(即，抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗體)之抗OX40抗體以及非吸收性類固醇可進一步與柳酸鹽組合。柳酸鹽包括5-ASA試劑，例如：磺胺塞拉金(sulfasalazine)(AZULFIDINE®,Pharmacia & UpJohn)；奧沙拉秦(olsalazine) (DIPENTUM®,Pharmacia & UpJohn)；巴柳氮(balsalazide)(COLAZAL®,Salix Pharmaceuticals,Inc.)；及美沙拉秦(mesalamine)(ASACOL®,Procter & Gamble Pharmaceuticals；PENTASA®,Shire US；CANASA®,Axcan Scandipharm,Inc.；ROWASA®,Solvay)。
根據本文所述方法，出於降低由免疫刺激性抗體誘導之結腸炎之發病率的目的，與具有或不具有抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或LAG-3抗體之抗OX40抗體及非吸收性類固醇組合投與之柳酸鹽可包括柳酸鹽及非吸收性類固醇之任何重疊或依序投與。因此，例如，用於降低由本文所述免疫刺激性抗體誘導之結腸炎之發病率的方法涵蓋並行或依序投與柳酸鹽及非吸收性類固醇(例如，在非吸收性類固醇6小時後投與柳酸鹽)或其任一組合。此外，柳酸鹽及非吸收性類固醇可藉由相同途徑投與(例如，二者皆係經口投與)或藉由不同途徑投與(例如，柳酸鹽係經口投與且非吸收性類固醇係經直腸投與)，其可不同於用於投與抗OX40抗體及抗CTLA-4及/或抗PD-1及/或抗PD-L1及/或抗LAG-3抗體之途徑。
本文所述抗OX40抗體及組合抗體療法亦可結合其他熟知療法使用，該等熟知療法針對其針對所治療適應症(例如癌症)之特定有用性進行選擇。與抗OX40抗體之組合可與已知醫藥上可接受之藥劑依序使用。
舉例而言，本文所述抗OX40抗體及組合抗體療法可與其他治療(例如輻照、化學療法(例如，使用喜樹鹼(camptothecin)(CPT-11)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、順鉑、多柔比星、伊立替康(irinotecan)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑、太平洋紫杉醇、卡鉑-太平洋紫杉醇(紫杉醇)、多柔比星、5-fu或喜樹鹼+apo21/TRAIL(6X combo))、一或多種蛋白酶體抑制劑(例如，硼替佐米(bortezomib)或MG132)、一或多種Bcl-2抑制劑(例如， BH3I-2’(bcl-xl抑制劑)、吲哚胺加雙氧酶-1抑制劑(例如，INCB24360、吲哚西莫、NLG-919或F001287)、AT-101(R-(-)-棉酚衍生物)、ABT-263(小分子)、GX-15-070(奧巴克拉(obatoclax))或MCL-1(類骨髓性白血病細胞分化蛋白-1)拮抗劑)、iAP(細胞凋亡蛋白之抑制劑)拮抗劑(例如，smac7、smac4、小分子smac模擬物、合成smac肽(參見Fulda等人，Nat Med 2002；8：808-15)、ISIS23722(LY2181308)或AEG-35156(GEM-640))、HDAC(組織蛋白去乙醯酶)抑制劑、抗CD20抗體(例如，利妥昔單抗)、血管生成抑制劑(例如，貝伐珠單抗)、靶向VEGF及VEGFR之抗血管生成劑(例如，癌思停(Avastin))、合成三萜系化合物(參見Hyer等人，Cancer Research 2005；65：4799-808)、c-FLIP(細胞FLICE-抑制性蛋白)調節劑(例如，PPARγ(過氧化體增殖子-活化受體γ)之天然及合成配體、5809354或5569100)、激酶抑制劑(例如，索拉菲尼(Sorafenib))、曲妥珠單抗、西妥昔單抗、替西羅莫司(Temsirolimus)、mTOR抑制劑(例如雷帕黴素(rapamycin)及替西羅莫司、硼替佐米、JAK2抑制劑、HSP90抑制劑、PI3K-AKT抑制劑、來那度胺(Lenalildomide)、GSK3β抑制劑、IAP抑制劑及/或遺傳毒性藥物組合使用(例如同時或分開)。
本文所述抗OX40抗體及組合抗體療法可進一步與一或多種抗增殖細胞毒性劑組合使用。可用作抗增殖細胞毒性劑之化合物之類別包括(但不限於)以下：烷基化劑(包括但不限於氮芥(nitrogen mustard)、次乙亞胺衍生物、磺酸烷基酯、亞硝基脲及三氮烯)：尿嘧啶氮芥、甲川氯(Chlormethine)、環磷醯胺(CYTOXANTM)愛斯達(fosfamide)、美法侖(Melphalan)、氮芥苯丁酸(Chlorambucil)、哌泊溴烷(Pipobroman)、曲他胺(Triethylenemelamine)、三乙烯硫代磷醯胺、白消安(Busulfan)、卡莫司汀(Carmustine)、洛莫司汀(Lomustine)、鏈脲菌素 (Streptozocin)、達卡巴嗪及替莫唑胺(Temozolomide)。
抗代謝物(包括但不限於葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷去胺酶抑制劑)：胺甲喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿苷(Floxuridine)、阿糖胞苷(Cytarabine)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、磷酸氟達拉濱(Fludarabine phosphate)、噴司他汀(Pentostatine)及吉西他濱。
除業內已知之其他微管蛋白穩定劑外，適於與抗OX40抗體組合之抗增殖劑包括但不限於紫杉烷、太平洋紫杉醇(太平洋紫杉醇係以TAXOLTM購得)、歐洲紫杉醇(docetaxel)、盤皮海綿內酯(discodermolide)(DDM)、地特斯他汀(dictyostatin)(DCT)、培洛賽德A(Peloruside A)、埃博黴素、埃博黴素A、埃博黴素B、埃博黴素C、埃博黴素D、埃博黴素E、埃博黴素F、呋喃埃博黴素D(furanoepothilone D)、去氧埃博黴素B1、[17]-脫氫去氧埃博黴素B、[18]脫氫去氧埃博黴素B、C12,13-環丙基-埃博黴素A、C6-C8橋接埃博黴素A、反式-9,10-脫氫埃博黴素D、順式-9,10-脫氫埃博黴素D、16-去甲基埃博黴素B、埃博黴素B10、盤皮海綿內酯、帕土匹龍(patupilone)(EPO-906)、KOS-862、KOS-1584、ZK-EPO、ABJ-789、XAA296A(盤皮海綿內酯)、TZT-1027(索博列多汀(soblidotin))、ILX-651(鹽酸泰絲多汀(tasidotin hydrochloride))、軟海綿素B(Halichondrin B)、甲磺酸埃雷布林(Eribulin mesylate)(E-7389)、哈米特林(Hemiasterlin)(HTI-286)、E-7974、念珠藻素(Cyrptophycin)、LY-355703、類美登素(Maytansinoid)免疫偶聯物(DM-1)、MKC-1、ABT-751、T1-38067、T-900607、SB-715992(伊匹尼塞(ispinesib))、SB-743921、MK-0731、STA-5312、軟珊瑚醇(eleutherobin)、17β-乙醯氧基-2-乙氧基-6-側氧基-B-均-雌-1,3,5(10)-三烯-3-醇、環鏈黴菌素(cyclostreptin)、異勞力馬來(isolaulimalide)、勞力馬來(laulimalide)、 4-表-7-去羥基-14,16-二去甲基-(+)-盤皮海綿內酯及隱塞龍1(cryptothilone 1)。
在期望結合抗OX40抗體或在用抗OX40抗體治療之前使得異常增殖細胞休眠的情形下，亦可向患者投與激素及類固醇(包括合成類似物)，例如17a-乙炔基雌二醇、已烯雌酚(Diethylstilbestrol)、睪固酮、普賴松(Prednisone)、氟甲睪酮(Fluoxymesterone)、丙酸甲雄烷酮(Dromostanolone propionate)、睪內酯(Testolactone)、乙酸甲地孕酮(Megestrolacetate)、甲基普賴蘇濃(Methylprednisolone)、甲基-睪固酮、普賴蘇濃(Prednisolone)、曲安西龍(Triamcinolone)、氯烯雌醚(Chlorotrianisene)、羥助孕酮(Hydroxyprogesterone)、胺魯米特(Aminoglutethimide)、雌氮芥(Estramustine)、乙酸甲羥助孕酮(Medroxyprogesteroneacetate)、柳培林(Leuprolide)、氟他胺(Flutamide)、托瑞米芬(Toremifene)、ZOLADEXTM。在採用本文所述方法或組合物時，若期望，亦可投與在臨床設定中用於調節腫瘤生長或轉移之其他藥劑，例如抗模擬物。
在某些實施例中，抗OX40抗體係與尼沃魯單抗(並行或分開)投與以治療患有癌症(例如結腸直腸或膀胱癌)之患者。
在某些實施例中，抗OX40抗體係與伊匹單抗(並行或分開)投與以治療患有癌症(例如卵巢、膀胱或前列腺癌)之患者。
安全有效投與化學治療劑之方法已為熟習此項技術者所知。另外，其投與闡述於標準文獻中。舉例而言，許多化學治療劑之投與闡述於Physicians' Desk Reference(PDR)，例如1996版(Medical Economics Company，Montvale,N.J.07645-1742,USA)中；其揭示內容以引用方式併入本文中。化學治療劑及/或輻射療法可根據業內熟知之治療方案投與。熟習此項技術者應明瞭，化學治療劑及/或輻射療法之投與可端視所治療疾病及化學治療劑及/或輻射療法對該疾病 之已知效應而變。同樣，根據熟練臨床醫師之知識，治療方案(例如，投與之劑量值及時間)可鑒於所投與治療劑對患者之觀察效應並鑒於疾病對所投與治療劑之觀察反應而變。
藉由以下實例進一步闡釋本發明，但其不應視為進一步限制本發明。貫穿本申請案引用之所有圖及所有參考文獻、基因庫序列、專利及已公開專利申請案之內容皆係以引用方式明確併入本文中。
XVII.套組及單位劑型
本文亦提供套組，其包括含有適用於前述方法之治療有效量之抗OX40抗體(例如，OX40.21)及抗PD-1(例如，尼沃魯單抗)或抗CTLA-4(伊匹單抗)抗體及醫藥上可接受之載劑的醫藥組合物。套組亦可視情況包括說明書，例如包含投與排程表，以容許從業人員(例如，醫師、護士或患者)投與其中所含組合物以將組合物投與患有癌症(例如，實體腫瘤)之患者。套組亦可包括注射器。
視情況，套組包括單一劑量醫藥組合物之多個包裝，其各自含有有效量之抗OX40抗體或抗PD-1或抗CTLA-4抗體用於跟隨上文提供之方法單一投與。套組中亦可包括投與醫藥組合物所需之儀器或器件。舉例而言，套組可提供一或多個含有一定量之抗OX40抗體或抗PD-1或抗CTLA-4抗體之預填充注射器。
在一個實施例中，本發明提供用於治療人類患者之實體腫瘤之套組，該套組包含一定劑量之抗OX40抗體及用於本文所述方法中之說明書，該抗OX40抗體包含具有闡述於SEQ ID NO：318中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：94中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域。在某些實施例中，套組進一步包含(a)一定劑量之抗PD-1抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：301中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：302中之序列之輕鏈可變區之 CDR1、CDR2及CDR3結構域，或(b)一定劑量之抗CTLA-4抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：309中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：310中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域。
實施例
1.一種經分離抗體或其抗原結合部分，其結合至人類OX40且展現以下性質：(a)結合至膜結合之人類OX40；(b)結合至食蟹猴OX40；(c)結合至可溶性人類OX40；(d)誘導或增強T細胞活化；(e)抑制OX40配體與OX40結合；(f)與抗體3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3、14A2-1、14A2-2及20C1中之一或多者競爭結合至人類OX40。
2.如實施例1之抗體，其中該抗體不結合至小鼠及/或大鼠OX40。
3.如實施例1或2之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體刺激抗腫瘤免疫反應。
4.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體刺激抗原特異性T細胞反應。
5.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體增加表現OX40之T細胞中之IL-2及/或IFN-γ產生。
6.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體增加T細胞增殖。
7.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其 中該抗體結合至Fc受體。
8.如實施例7之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合至一或多種活化FcγR。
9.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體如藉由Biacore所量測以約1nM或更小、例如0.5nM或更小或0.1nM或更小之KD結合至可溶性人類OX40。
10.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體如藉由FACS所量測以50nM或更小、例如10nM或更小或1nM或更小之EC50結合至膜結合之人類OX40。
11.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體如藉由FACS所量測以50nM或更小、例如10nM或更小或1nM或更小之EC50結合至膜結合之食蟹猴OX40。
12.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體經由多價交聯誘導或增強T細胞活化。
13.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合人類補體之C1q組份。
14.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體誘導NK細胞介導之活化CD4+ T細胞之溶解。
15.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體促進巨噬細胞介導之表現OX40之細胞之吞噬作用。
16.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體抑制調控性T細胞介導之CD4+ T細胞增殖之抑制。
17.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合至人類OX40(SEQ ID NO：2)之序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)。
18.如實施例1至16中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其 中該抗體結合至人類OX40(SEQ ID NO：2)之序列DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)。
19.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其特異性結合至OX40且包含呈選自由以下組成之群之可變重鏈及可變輕鏈對之三個可變重鏈CDR及三個可變輕鏈CDR：(a)SEQ ID NO：318及94；(b)SEQ ID NO：17及18；(c)SEQ ID NO：28及29；(d)SEQ ID NO：28及30；(e)SEQ ID NO：37及38；(f)SEQ ID NO：48及49；(g)SEQ ID NO：48及50；(h)SEQ ID NO：57及58；(i)SEQ ID NO：65及66；(j)SEQ ID NO：73及74；(k)SEQ ID NO：84及85；(l)SEQ ID NO：84及86；及(m)SEQ ID NO：93及94。
20.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至OX40且包含：(a)分別包含SEQ ID NO：87、317及89之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：90-92之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別包含SEQ ID NO：11-13之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：14-16之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序 列；(c)分別包含SEQ ID NO：19-21之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：22-24之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(d)分別包含SEQ ID NO：19-21之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：25-27之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(e)分別包含SEQ ID NO：31-33之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：34-36之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(f)分別包含SEQ ID NO：39-41之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：42-44之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(g)分別包含SEQ ID NO：39-41之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：45-47之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(h)分別包含SEQ ID NO：51-53之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：54-56之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(i)分別包含SEQ ID NO：59-61之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：62-64之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(j)分別包含SEQ ID NO：67-69之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：70-72之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(k)分別包含SEQ ID NO：75-77之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序 列、及/或分別包含SEQ ID NO：78-80之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(l)分別包含SEQ ID NO：75-77之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：81-83之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；或(m)分別包含SEQ ID NO：87-89之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別包含SEQ ID NO：90-92之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
21.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至OX40且包含：(a)分別由SEQ ID NO：87、317及89組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：90-92組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(b)分別由SEQ ID NO：11-13組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：14-16組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(c)分別由SEQ ID NO：19-21組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：22-24組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(d)分別由SEQ ID NO：19-21組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：25-27組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(e)分別由SEQ ID NO：31-33組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：34-36組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(f)分別由SEQ ID NO：39-41組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序 列、及/或分別由SEQ ID NO：42-44組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(g)分別由SEQ ID NO：39-41組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：45-47組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(h)分別由SEQ ID NO：51-53組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：54-56組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(i)分別由SEQ ID NO：59-61組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：62-64組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(j)分別由SEQ ID NO：67-69組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：70-72組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(k)分別由SEQ ID NO：75-77組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：78-80組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；(l)分別由SEQ ID NO：75-77組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：81-83組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列；或(m)分別由SEQ ID NO：87-89組成之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列、及/或分別由SEQ ID NO：90-92組成之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
22.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至OX40且包含重鏈及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：17、28、 37、48、57、65、73、84及93。
23.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至OX40且包含重鏈及輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少90%一致之胺基酸序列：SEQ ID NO：18、29、30、38、49、50、58、66、74、85、86及94。
24.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至OX40且包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少85%一致之重鏈及輕鏈可變區序列：(a)SEQ ID NO：318及94；(b)SEQ ID NO：17及18；(c)SEQ ID NO：28及29；(d)SEQ ID NO：28及30；(e)SEQ ID NO：37及38；(f)SEQ ID NO：48及49；(g)SEQ ID NO：48及50；(h)SEQ ID NO：57及58；(i)SEQ ID NO：65及66；(j)SEQ ID NO：73及74；(k)SEQ ID NO：84及85；(l)SEQ ID NO：84及86；及(m)SEQ ID NO：93及94。
25.如實施例24之抗體或其抗原結合部分，其中該等重鏈及輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之重鏈及輕鏈可變區至少90%一致之胺基酸序列：實施例24之(a)至(l)。
26.如實施例25之抗體或其抗原結合部分，其中該等重鏈及輕鏈可變區包含與選自由以下組成之群之重鏈及輕鏈可變區至少95%一 致之胺基酸序列：實施例24之(a)至(l)。
27.如實施例26之抗體或其抗原結合部分，其中該重鏈及輕鏈可變區包含選自由以下組成之群之重鏈及輕鏈可變區：實施例24之(a)至(l)。
28.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其結合至OX40且包含與選自由以下組成之群之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈及輕鏈序列：(a)分別SEQ ID NO：124及116；(b)分別SEQ ID NO：95及96；(c)分別SEQ ID NO：97及98；(d)分別SEQ ID NO：99及100；(e)分別SEQ ID NO：101及102；(f)分別SEQ ID NO：103及104；(g)分別SEQ ID NO：105及106；(h)分別SEQ ID NO：107及108；(i)分別SEQ ID NO：109及110；(j)分別SEQ ID NO：111及112；(k)分別SEQ ID NO：113及114；(l)分別SEQ ID NO：115及116；(m)分別SEQ ID NO：117及118；(n)分別SEQ ID NO：119及120；(o)分別SEQ ID NO：121及122；(p)分別SEQ ID NO：123及116；及(q)分別SEQ ID NO：125及116。
29.如實施例28之抗體或其抗原結合部分，其中該等重鏈及輕鏈包含選自由以下組成之群之重鏈及輕鏈：實施例28之(a)至(r)。
30.一種經分離單株抗體或其抗原結合部分，其(a)與如實施例27之抗體結合至OX40上之相同表位，及/或(b)將如實施例27之抗體與活化T細胞上之OX40的結合抑制至少95%，如藉由FACS所量測。
31.如實施例19至30中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合至人類OX40(SEQ ID NO：2)之序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)。
32.如實施例19至30中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合至人類OX40(SEQ ID NO：2)之序列DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)。
33.如實施例19至31中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體結合至人類及食蟹猴OX40二者。
34.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
35.如實施例34之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體係IgG1抗體。
36.如實施例35之抗體，其中該抗體或其抗原結合部分包含具有增強之與活化FcγR之結合的Fc。
37.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該等CDR區中之一或多個甲硫胺酸殘基取代不會經歷氧化之胺基酸殘基。
38.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體或其抗原結合部分係人類或人類化抗體。
39.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其 中該抗體係非免疫原性，如根據實例21所評估。
40.如前述實施例中任一實施例之抗體或其抗原結合部分，其中重鏈及/或輕鏈CDR序列中之胺基酸序列Asp-Gly(若存在)經不會經歷異構化之胺基酸序列取代。
41.如實施例40之抗體或其抗原結合部分，其中該抗體包含闡述於SEQ ID NO：76中之重鏈可變區CDR2序列，但其中該Asp-Gly序列被不會經歷異構化之胺基酸序列置換。
42.如實施例41之抗體，其中該Asp-Gly序列中之該Asp或Gly被Ser置換。
43.一種雙特異性分子，其包含連接至具有第二結合特異性之分子之如前述實施例中任一實施例之抗體。
44.一種核酸，其編碼如實施例1至42中任一實施例之抗體或其抗原結合部分之重鏈及/或輕鏈可變區。
45.一種表現載體，其包含如實施例44之核酸分子。
46.一種細胞，其經如實施例45之表現載體轉化。
47.一種免疫偶聯物，其包含連接至試劑之如實施例1至42中任一實施例之抗體。
48.一種組合物，其包含如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物以及載劑。
49.一種套組，其包含如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、或雙特異性分子或免疫偶聯物以及使用說明書。
50.一種製備抗OX40抗體或其抗原結合部分之方法，其包含使該抗體或其抗原結合部分在如實施例46之細胞中表現及自該細胞分離該抗體或其抗原結合部分。
51.一種刺激抗原特異性T細胞反應之方法，其包含使該T細胞與如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特 異性分子或免疫偶聯物接觸，使得刺激抗原特異性T細胞反應。
52.一種活化或共刺激效應物T細胞之方法，其包含使效應物T細胞與如實施例1至43及47中任一實施例之抗OX40抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物與CD3接觸，其中活化或共刺激該效應物T細胞。
53.一種增加T細胞中IL-2及/或IFN-γ產生之方法，其包含使該T細胞與有效量之如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物接觸。
54.一種增加T細胞增殖之方法，其包含使該細胞與有效量之如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物接觸。
55.一種增加個體之T細胞中IL-2及/或IFN-γ產生之方法，其包含投與有效量之如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物，以增加自該等T細胞之IL-2及/或IFN-γ產生。
56.一種減少或耗盡有需要之個體之腫瘤中T調控性細胞之數目的方法，其包含投與有效量之如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物，以減少該腫瘤中T調控性細胞之數目，其中該抗體或其抗原結合部分具有效應物或增強之效應物功能。
57.一種刺激個體之免疫反應之方法，其包含向該個體投與如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物，使得刺激該個體之免疫反應。
58.如實施例57之方法，其中該個體患有腫瘤且刺激針對該腫瘤之免疫反應。
59.一種抑制個體中腫瘤細胞生長之方法，其包含向該個體投 與如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物，使得抑制該腫瘤之生長。
60.一種治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如實施例1至43及47中任一實施例之抗體或其抗原結合部分、雙特異性分子或免疫偶聯物，以治療該癌症。
61.如實施例60之方法，其中該癌症選自由以下組成之群：膀胱癌、乳癌、子宮/子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食管癌、胃腸癌、胰臟癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經系統之贅瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相關癌症。
62.如實施例60或61之方法，其中該癌症係轉移性癌症、難治性癌症或復發性癌症。
63.如實施例56至62中任一實施例之方法，其進一步包含投與一或多種其他治療劑。
64.如實施例63之方法，其中該一或多種其他治療劑係抗體或小分子。
65.如實施例64之方法，其中該其他療法係抗PD1抗體、LAG-3抗體、CTLA-4抗體、PD-L1抗體或抗TGFβ抗體。
66.一種治療人類個體之實體腫瘤之方法，該方法包含向該個體投與有效量之抗OX40抗體，該抗體包含具有闡述於SEQ ID NO：318中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：94中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，其中該方法包含至少一個投藥週期，其中該週期係兩週之時段，其中對於該至少一個週期中之每一者，該抗OX40抗體之一個劑量係以1mg/kg體重之劑量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量；約1mg/kg體重之劑量；或約20mg、40mg、80mg、160mg 或320mg之固定劑量投與。
67.一種治療人類個體之實體腫瘤之方法，該方法包含向該個體投與有效量之以下中之每一者：(a)抗OX40抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：318中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：94中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，(b)抗PD-1抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：301中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：302中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，其中該方法包含至少一個投藥週期，其中該週期係兩週、三週或四週之時段，其中對於該至少一個週期中之每一者，該抗OX40抗體之至少一個劑量係以1mg/kg體重之劑量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量；約1mg/kg體重之劑量；或約20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量投與，且該抗PD-1抗體之一個劑量係以240mg、360mg或480mg之劑量或約240mg、360mg或480mg之劑量投與。
68.如實施例67之方法，其中該等抗OX40抗體及抗PD-1抗體係以如下劑量投與：(a)1mg/kg體重之抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體；(b)20mg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體；(c)40mg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體；(d)80mg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體； (e)160mg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體；或(f)320mg抗OX40抗體及240mg、360mg或480mg抗PD-1抗體。
69.一種治療人類個體之實體腫瘤之方法，該方法包含向該個體投與有效量之以下中之每一者：(a)抗OX40抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：318中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：94中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，(b)抗CTLA-4抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：309中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：310中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，其中該方法包含至少一個投藥週期，其中該週期係三週之時段，其中對於該至少一個週期中之每一者，該抗OX40抗體之至少一個劑量係以1mg/kg體重之劑量；20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量；約1mg/kg體重之劑量；或約20mg、40mg、80mg、160mg或320mg之固定劑量投與，且該抗CTLA-4抗體之一個劑量係以1mg/kg之劑量或約1mg/kg之劑量投與，其中該抗OX40抗體係與該抗CTLA-4抗體一起投與至少一個週期，之後投與抗OX40抗體單一療法至少一個週期。
70.如實施例67之方法，其中該抗OX40抗體及抗CTLA-4抗體係以如下劑量投與：(a)1mg/kg體重之抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體；(b)20mg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體；(c)40mg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體；(d)80mg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體； (e)160mg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體；或(f)320mg抗OX40抗體及1mg/kg抗CTLA-4抗體。
71.如實施例66至70中任一實施例之方法，其中該等抗OX40抗體、或抗OX40抗體及抗PD-1或抗CTLA-4抗體經調配用於靜脈內投與。
72.如實施例67至71中任一實施例之方法，其中該等抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗體調配在一起。
73.如實施例67至71中任一實施例之方法，其中該等抗OX40及抗PD-1或抗CTLA-4抗體單獨經調配。
74.如實施例66至68及71至73中任一實施例之方法，其中該治療由至多12個週期組成。
75.如實施例69至73中任一實施例之方法，其中該治療由8個週期組成。
76.如實施例75之方法，其中該抗OX40抗體係與該抗CTLA-4抗體一起投與前4個週期，之後投與抗OX40抗體單一療法後4個週期。
77.如實施例66至76中任一實施例之方法，其中在每一週期之第1天投與該等抗OX40抗體、或抗OX40抗體及抗PD-1或抗CTLA-4抗體。
78.如實施例67至77中任一實施例之方法，其中在投與該抗PD-1或抗CTLA-4抗體之前投與該抗OX40抗體。
79.如實施例78之方法，其中在投與該抗PD-1或抗CTLA-4抗體之前之約30分鐘內投與該抗OX40抗體。
80.如實施例67至77中任一實施例之方法，其中在投與該抗PD-1或抗CTLA-4抗體之前投與該抗OX40抗體。
81.如實施例67至77中任一實施例之方法，其中該抗OX40抗體 與該抗PD-1或抗CTLA-4抗體並行投與。
82.如實施例66至81中任一實施例之方法，其中該治療產生至少一個選自以下之治療效應：腫瘤大小減小、轉移性病灶之數目隨時間減少、完全反應、部分反應及穩定疾病。
83.如實施例66至82中任一實施例之方法，其中該實體腫瘤與選自由以下組成之群之癌症相關：子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌及卵巢癌。
84.如實施例66至83中任一實施例之方法，其中該抗OX40抗體包括包含分別闡述於SEQ ID NO：87、317及89及90至92中之胺基酸序列之重鏈及輕鏈可變區CDR。
85.如實施例66至84中任一實施例之方法，其中該抗OX40抗體包含分別闡述於SEQ ID NO：318及94中之重鏈及輕鏈可變區序列。
86.如實施例66至85中任一實施例之方法，其中該抗OX40抗體包含分別闡述於SEQ ID NO：124及116中之重鏈及輕鏈序列。
87.如實施例67、68及71至86中任一實施例之方法，其中該抗PD-1抗體包括包含分別闡述於SEQ ID NO：303-305及306-308中之胺基酸序列之重鏈及輕鏈可變區CDR。
88.如實施例67、68及71至87中任一實施例之方法，其中該抗PD-1抗體包含分別闡述於SEQ ID NO：301及302中之重鏈及輕鏈可變區序列。
89.如實施例69至86中任一實施例之方法，其中該抗CTLA-4抗體包括包含分別闡述於SEQ ID NO：311-313及314-316中之胺基酸序列之重鏈及輕鏈可變區CDR。
90.如實施例69至86及89中任一實施例之方法，其中該抗CTLA-4抗體包含分別闡述於SEQ ID NO：309及310中之重鏈及輕鏈可變區序列。
91.一種用於治療人類個體之實體腫瘤之套組，該套組包含一定劑量之抗OX40抗體及使用說明書，該抗OX40抗體包含具有闡述於SEQ ID NO：318中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：94中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域。
92.如請求項91之套組，其進一步包含(a)一定劑量之抗PD-1抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：301中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：302中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域，或(b)一定劑量之抗CTLA-4抗體，其包含具有闡述於SEQ ID NO：309中之序列之重鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域及具有闡述於SEQ ID NO：310中之序列之輕鏈可變區之CDR1、CDR2及CDR3結構域。
93.一種檢測試樣中OX40之存在之方法，其包含使該試樣與如實施例1至38中任一實施例之抗體或其抗原結合部分在容許在該抗體或抗原結合之間形成複合物之條件下接觸。
94.一種結合至OX40之抗體，其包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：282至296。
95.如實施例94之抗體，其中該抗體包含由選自由以下組成之群之胺基酸序列組成之重鏈：SEQ ID NO：282至296。
96.一種經分離單株抗體，其結合至OX40且包含分別包含SEQ ID NO：87、317及89之重鏈CDR1、CDR2及CDR3序列及分別包含SEQ ID NO：90至92之輕鏈CDR1、CDR2及CDR3序列。
97.一種經分離單株抗體，其結合至OX40且包含分別包含SEQ ID NO：318及94之胺基酸序列之重鏈及輕鏈可變區。
98.一種經分離單株抗體，其結合至OX40且包含分別包含SEQ ID NO：124及116之胺基酸序列之重鏈及輕鏈。
99.一種經分離單株抗體，其結合至OX40，其中該抗體結合至人類OX40(SEQ ID NO：2)之序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)之全部或一部分。
100.一種組合物，其包含如實施例96至99中任一實施例之經分離單株抗體及載劑。
101.一種核酸，其編碼如實施例96或97之抗體之重鏈及/或輕鏈可變區、或如實施例98之重鏈及/或輕鏈。
102.一種套組，其包含如實施例96至99中任一實施例之抗體。
103.一種刺激抗原特異性T細胞反應之方法，其包含使該T細胞與如實施例96至99中任一實施例之抗體接觸。
104.一種治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如實施例96至99中任一實施例之抗體，以治療該癌症。
105.如實施例104之方法，其中該癌症或實體腫瘤選自由以下組成之群：子宮頸癌、膀胱癌、結腸直腸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌及頭頸之鱗狀細胞癌。
實例 實例1：抗OX40抗體之生成
使用重組六聚組胺酸-OX40抗原在HuMAb®轉基因小鼠(「HuMAb」係Medarex,Inc.,Princeton,New Jersey之商標)及KM小鼠(KM Mouse®品系含有如PCT公開案WO 02/43478中所述之SC20轉染色體)之Hco7、Hco12、Hco17及Hco38品系中生成人類抗OX40單株抗體。
用不同免疫策略對總共52隻小鼠(其包括轉基因小鼠之5種基因型(KM、Hco7、Hco12、Hco17及Hco38))進行免疫。免疫原係內部製備且以2.0mg/mL用於20μg/小鼠之總劑量之huOX40-6xhis。投與途徑包括：尾部基底注射、後踝免疫、腹膜內(ip)及皮下(sc)注射及佐劑 (Ribi，目錄號S6322，Sigma)。實施自30隻小鼠之27次融合並篩選。自該27種融合物鑑別541種ELISA抗原陽性抗體，且進一步表徵可分離特定關注之抗體，包括命名為3F4、14B6-1、14B6-2、23H3、6E1-1、6E1-2、18E9、8B11、20B3(亦稱作OX40.17)、14A2-1、14A2-2及20C1之抗體。其可變區胺基酸序列及同型闡述於圖1-9中。3F4之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：17及18組成。14B6-1之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：28及29組成。14B6-2之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：28及30組成。23H3之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：37及38組成。6E1-1之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：48及49組成。6E1-2之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：48及50組成。18E9之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：57及58組成。8B11之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：65及66組成。20B3之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：73及74組成。14A2-1之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：84及85組成。14A2-2之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：84及86組成。20C1之重鏈及輕鏈可變區由胺基酸序列SEQ ID NO：93及94組成。
cDNA測序鑑別抗體3F4、23H3、18E9、8B11、20B3(亦稱作OX40.17)及20C1中之每一者之一條重鏈及一條輕鏈及抗體14B6、14A2及6E1中之每一者之一條重鏈及兩條輕鏈(輕鏈1或「L1」及輕鏈2或「L2」)。藉由蛋白質分析，鑑別抗體14B6、6E1及14A2之單一輕鏈，且N-末端測序及分子量測定指示其係14B6及14A2之輕鏈L1及6E1之輕鏈L2。抗體14B6-1及14B6-2分別對應於具有輕鏈L1及L2之抗體14B6。抗體14A2-1及14A2-2分別對應於具有輕鏈L1及L2之抗體14A2。抗體6E1-1及6E1-2分別對應於具有輕鏈L1及L2之抗體6E1。3種抗體之輕鏈中之每一者之胺基酸及核苷酸序列提供於表23中。
對於一些上述抗體，在HCDR2中進行親代抗體中之取代以去除異構化位點(DG)之存在，且引入框架取代(由於衍生自DP44種系)以使得框架更像通常表現之抗體。對於基於20C1之抗體，將三個其他不常見框架殘基逆轉成種系(A2V、D24G及G82bS)。G82bS框架逆轉亦消除去醯胺位點(NG)。引入親代雜合純系序列中之各種取代之概述提供於表6中。
Figure 105116545-A0202-12-0209-20
Figure 105116545-A0202-12-0210-787
實例2：抗OX40抗體與活化初代人類T細胞之結合
測試實例1所生成之人類單株抗OX40抗體與活化初代人類T細胞之結合之能力。
在結合分析之前，將細胞活化若干天，以誘導OX40表現。簡言之，在重組人類IL-2存在下將PBMC與經抗人類CD3加上抗人類CD28塗佈之磁珠粒一起培養3天或4天。在分析當天，移除珠粒並使用各抗OX40抗體，依滴定方式為細胞染色。利用螢光偶聯之抗人類IgG多株二級抗體檢測結合之抗體，且針對CD4及CD25共染色細胞以檢測活化之CD4 T細胞。使用FACSCanto II流式細胞儀(Becton Dickinson)量測染色之螢光強度。針對CD4+CD25+群體計算抗OX40抗體染色之幾何平均螢光強度(GMFI)或中值螢光強度(MedFI)(FACSDiva軟體)。使用GraphPad Prism軟體計算抗體結合之EC50。
如圖11A中所示，抗OX40抗體以低於奈莫耳濃度之EC50結合至活化初代人類T細胞。值得注意的是，OX40.5顯示所測試抗OX40抗體之最低結合性。利用具有可變區取代之抗OX40抗體實施相同實驗。使用呈來自經重組抗體表現載體轉染之宿主細胞之培養物之上清液形式的抗體實施初始實驗。如圖11B中所示，某些取代引起顯著損失之結合性，亦即針對抗體OX40.7、OX40.9、OX40.14及OX40.15。進一步使用純化抗體材料分析一組具有可變區取代之抗體。
如圖11C及11D中所示，所有測試抗體皆以低於奈莫耳濃度之EC50結合至OX40，但OX40.18除外，其顯示比3F4雜交瘤親代純系更低之結合性。在圖11B中測試之抗體之組中，OX40.5顯示最低結合 性，而在圖11C中測試之抗體之組中，OX40.1顯示最低結合性。EC50值之概述提供於下表7中。
Figure 105116545-A0202-12-0211-22
實例3：抗OX-40抗體與活化初代食蟹猴T細胞之結合
對測試結合至實例1中之活化初代人類T細胞之人類單株抗OX-40抗體結合活化初代食蟹猴T細胞之能力進行測試。
簡言之，在結合分析之前，將細胞活化若干天，以誘導OX40表現。藉由使用氯化銨緩衝液溶解紅血球自食蟹猴末梢血分離總白血球。隨後在重組人類IL-2存在下將白血球在經與食蟹猴交叉反應之抗 人類CD3加上抗人類CD28抗體預塗佈之燒瓶中培養4至5天，以擴增並活化T細胞。在分析當天，收穫細胞並用遞增之每一抗OX40抗體染色。利用螢光偶聯之抗人類IgG多株二級抗體檢測結合之抗體，且針對CD4及CD25共染色細胞以檢測活化之CD4 T細胞。使用FACSCanto II流式細胞儀(Becton Dickinson)量測染色之螢光強度。針對CD4+CD25+群體計算抗OX40抗體染色之幾何平均螢光強度(GMFI)或中值螢光強度(MedFI)(FACSDiva軟體)。生成劑量-反應曲線且使用GraphPad Prism軟體計算抗體結合之EC50。
如圖12A及12B中所示，所測試抗OX40抗體以高功效結合至活化食蟹猴CD4 T細胞，其中EC50在0.068nM(20C1)至1.4nM(20B3)之範圍內。18E9及20B3以介於1nM與1.5nM之間之EC50結合，而其餘抗體以低於1nM之EC50結合。在圖12A中測試之抗OX40抗體中，OX40.1顯示最低結合，且在圖12B中測試之抗OX40抗體中，OX40.5顯示最低結合。利用具有可變區取代之抗OX40抗體實施相同實驗。如圖12C中所示，OX40.6、OX40.8及OX40.21抗體顯示最高結合功效，且EC50為0.12nM或更低。OX40.1顯示與食蟹猴CD4 T細胞之遠較低結合。在活化小鼠或大鼠CD4+ T細胞上未檢測到OX40.21抗體之結合。EC50值之概述提供於下表8中。
Figure 105116545-A0202-12-0212-23
Figure 105116545-A0202-12-0213-24
實例4：抗OX40抗體與活化初代T細胞及過表現人類及食蟹猴OX40之細胞之結合的Scatchard分析
進一步使用Scatchard分析評估OX40.21(IgG1同型)與活化人類T細胞之結合。簡言之，使用IODO-GEN®固相碘化試劑(1,3,4,6-四氯-3a-6a-二苯基甘脲；Pierce目錄號28601)利用125I-Na(1mCi；PerkinElmer目錄號NEZ033H001 MC)放射性碘化OX40.21。自購自Stanford Blood Bank之末梢血單核細胞(PBMC)(供體W-326470)分離活化人類CD4+ T細胞。藉由負向選擇(RosetteSepTM人類CD4+ T細胞富集混合劑，StemCell Technologies目錄號15062)分離CD4+ T細胞並將其冷凍。在結合分析之前，將經分離CD4+ T細胞活化4天以誘導OX40表現，如下。在200IU/mL重組人類IL-2(Peprotech目錄號200-02)存在下將解凍細胞與經抗人類CD3加上抗人類CD28塗佈之磁珠粒(人類T-Expander CD3/CD28 Dynabeads,Invitrogen目錄號111.41D)以1：1珠粒細胞比率一起培養4天。
放射性碘化之OX40.21 IgG1與活化人類T細胞之結合係藉由將活 化人類T細胞與遞增之125I-OX40.21 IgG1一起培育來展示。藉由在遞增之100倍莫耳濃度過量之未經標記之抗體存在下之結合測定非特異性結合且將其自總CPM減去以計算特異性結合。使用125I-OX40.21 IgG1濃度對CPM之線性標準曲線以外推特異性結合(即最大nM結合之125I-OX40.21IgG1)並藉此計算每細胞之受體數目。
如表9及圖13A中所示，在內源性表現OX40之活化人類T細胞上觀察OX40.21 IgG1之可飽和結合，且對於兩種T細胞供體之每一者之KD為0.05nM。
Figure 105116545-A0202-12-0214-25
使用過表現人類OX40之HEK293細胞(「hOX40-293」)實施相同分析。簡言之，放射性碘化OX40.21與過表現人類OX40之結合係藉由將hOX40-293細胞與遞增之125I-OX40.21一起培育來展示。藉由在遞增之100倍莫耳濃度過量之未經標記之抗體存在下之結合測定非特異性結合且將其自總CPM減去以計算特異性結合。使用125I-OX40.21濃度對CPM之線性標準曲線以外推最大nM結合之125I-OX40.21並藉此計 算每細胞之受體數目。如圖13B及表10中所示，針對與hOX40-293細胞上表現之OX40之結合觀察OX40.21 IgG1之可飽和之結合。來自使用不同數目之hOX40-293細胞/試樣之兩種測試條件之結合之平均KD係0.22nM。
Figure 105116545-A0202-12-0215-26
使用過表現食蟹猴OX40之CHO細胞(「cynoOX40-CHO」)實施相同分析。簡言之，放射性碘化OX40.21與食蟹猴OX40之結合係藉由將cynoOX40-CHO細胞與遞增之125I-OX40.21一起培育來展示。藉由在遞增之100倍莫耳濃度過量之未經標記之抗體存在下之結合測定非特異性結合且將其自總CPM減去以計算特異性結合。使用125I-OX40.21濃度對CPM之線性標準曲線以外推最大nM結合之125I-OX40.21並藉此計算每細胞之受體數目。如圖13C及表11中所示，針對與cynoOX40-CHO細胞上表現之食蟹猴OX40之結合觀察OX40.21 IgG1之可飽和之結合。來自使用不同數目之細胞/試樣之兩種測試條件之結合之平均KD係0.63nM。
Figure 105116545-A0202-12-0216-27
實例5：抗OX40抗體與淋巴球之特異性結合
在一組22種正常人類組織(包括脾、扁桃腺、胸腺、大腦、小腦、心臟、肝、肺、腎、胰臟、垂體、周圍神經、胃、結腸、小腸、甲狀腺、皮膚、骨骼肌、前列腺、子宮、睪丸及胎盤)上藉由免疫組織化學測試各種OX40抗體之特異性。
新鮮之冷凍及/或OCT包埋之人類組織係自多個商業組織網絡/供應商(Asterand Inc.Detroit,MI；Cooperative Human Tissue Network,Philadelphia,PA；ProteoGenex Inc,Culver City,CA)購得。為檢測組織結合，將一系列抗OX40抗體(OX40.6-FITC、OX40.8-FITC、6E1-FITC、OX40.16-FITC、OX40.17-FITC、OX40.20-FITC及OX40.21-FITC)螢光黃化並施加至丙酮固定之低溫恒溫器部分，之後抗FITC橋接抗體且藉由EnVision+系統可視化。使用非特異性螢光黃化人類IgG1作為同型對照抗體。使用穩定表現人類OX40之HT1080細胞 (HT1080/huOX40)及增生性人類扁桃腺組織切片作為陽性對照細胞及組織。為確定FITC偶聯是否對結合性質具有任何影響，在HT1080/huOX40細胞中使用抗huIgG作為橋接抗體比較FITC偶聯及未偶聯之抗OX40抗體。在光學顯微鏡下評估經染色之載玻片。
初始測試揭示，未偶聯及FITC偶聯之抗OX40抗體尤其染色人類OX40轉染之細胞而非親代HT1080細胞之細胞質及膜。未偶聯及FITC偶聯之抗OX40抗體之間不存在差異。該等結果表明，抗體適於免疫組織化學分析，且FITC偶聯對組織結合性質無影響。
所有所測試抗OX40抗體在淋巴組織(扁桃腺、脾及胸腺)及富含淋巴組織(結腸、胃及小腸)中之單核細胞(MNC)之小亞組(呈離散或小簇形式)、以及多個組織(肺、皮膚及甲狀腺)中之幾個離散MNC中皆展現陽性染色。基於形態，該等陽性細胞主要係淋巴球。
除染色淋巴球之亞組外，OX40.6抗體(一種配體阻斷劑)在更通常與小動脈及血管之外膜及其周圍結締組織相關之內皮/內皮下膜基質及間質元素之亞組中、在幾乎所有檢查組織(圖14A)、以及專門組織元素(例如圍繞睪丸中之生精小管之鞘狀間質)中展示強染色。OX40.8抗體(一種配體非阻斷劑)陽性標記心臟之心肌中之肌絲樣結構(圖14A)及腎之小腦小球中之腎小球系膜細胞。利用另一配體非阻斷劑(即6E1抗體)之染色亦揭示心肌細胞、以及神經元及大腦及小腦之神經纖維網及腎中之小管上皮細胞中的染色。一般而言，僅在抗體以相對高濃度(3μg/ml或5μg/ml)、而非以較低濃度(1μg/ml)使用時檢測到非淋巴球之染色，此表明低親和力結合或潛在脫靶結合。
其他配體阻斷抗體OX40.16(圖14A)及OX40.17之進一步測試揭示淋巴球之亞組之清潔染色，且對於所有檢查組織之其他組織元素無特異性染色。OX40.21抗體(即OX40.16抗體之變體)具有與OX40.16抗體(圖14B)類似之結合型式。正常食蟹猴組織之類似組中之免疫組織 化學揭示與人類極類似之染色型式，此展示食蟹猴可用作相關臨床前物種。
實例6：癌症中OX40之表現
FFPE(福馬林(formalin)固定石蠟包埋)腫瘤組織試樣係自商業組織供應商購得(對於每一腫瘤類型，n=12-20)。為檢測與組織之結合，使用Leica BondRX平臺研發利用商業抗人類OX40抗體之自動化IHC分析。簡言之，於95℃下將熱誘導之抗原修復(HIER)在pH9 ER2緩衝液(Leica)中實施20min。將小鼠抗人類OX40單株抗體純系ACT35(BD Pharmingen)以5μg/ml培育60分鐘，之後將Novolink Max聚合物(Leica)培育30分鐘。最後，使載玻片與DAB受質-色素原溶液反應6分鐘，利用Mayer蘇木素複染，去水，清潔並用Permount蓋上蓋玻片。使用Dako蛋白質阻斷作為一級抗體之稀釋劑。
為剖析TIL，使用市售抗CD3(T細胞標記物)及抗FoxP3(Treg標記物)單株抗體染色毗鄰切片。使用商業小鼠IgG1作為陰性對照且使用增生性人類扁桃腺組織作為陽性對照。在免疫染色後，人工評估載玻片且在光學顯微鏡下進行評分。
在所檢查之四種腫瘤類型中，CD3+ TIL存於所檢查之所有試樣中，且TIL之量在試樣間變化且同一組織內異質性分佈。在一些情形下，如所預計，TIL在腫瘤及宿主界面中分佈更大。大部分TIL位於絕大多數組織試樣中之腫瘤間質中。然而，在許多情形下，其易於在腫瘤內巢中發現。在小部分TIL中觀察到陽性OX40染色且其主要分佈於腫瘤間質中。一般而言，OX40+ TIL之豐度與CD3+ TIL之豐度成正比。在四種所檢查腫瘤類型中，OX40+ TI在HCC及CRC中更豐富(圖15A-15C)。
實例7：阻斷OX-40L與OX-40之結合之人類單株抗OX40抗體
測試若干抗OX40抗體阻斷重組可溶性OX40L與人類OX40轉染之 293細胞之結合的能力。簡言之，首先將經人類OX40穩定轉染之293細胞與不同濃度之抗OX40抗體一起預培育。隨後添加固定濃度(0.2μg/mL)之重組可溶性his標記之人類OX40L(OX40L-His,R&D Systems)並進一步培育試樣。在洗滌細胞後，使用內部APC標記之抗His tag抗體檢測結合之OX40L-His。使用FACSCanto II流式細胞儀(Becton Dickinson)量測染色之螢光強度。計算細胞群體之APC-抗His tag抗體/OX40L-His染色之幾何平均螢光強度(GMFI)(FACSDiva軟體)。生成劑量-反應曲線且使用GraphPad Prism軟體計算OX40L結合之抗體阻斷之EC50；EC50示於表12中。
Figure 105116545-A0202-12-0219-28
如圖16中所示，大部分所測試抗OX40抗體完全阻斷可溶性人類OX40L與轉染細胞表面上之人類OX40之結合，只是6E1、OX40.4及OX40.5除外。由OX40.5之不完全阻斷可能係由於與人類OX40較其他測試抗體之結合或與重疊但不同表位之結合低之功效。相比之下，6E1及OX40.4不阻斷人類OX-40L與OX40之結合。阻斷之此缺乏可能 係由於與其餘抗體不同之表位之結合。
實例8：抗體競爭/分揀
如下實施抗體分揀實驗。使用胺偶合化學法將一或多種抗OX40抗體直接塗佈至Biacore CM5晶片上。將自60μg/mL之起始濃度連續稀釋(1：3)之抗OX40抗體與20nM OX40-6X-His抗原一起培育至少1小時。使所培育複合物流經抗體偶合表面並觀察交叉阻斷。用若干抗體在表面上重複實踐以基於所有抗體之相互交叉阻斷生成表位地圖。亦在表面上塗佈OX40L以鑑別並分揀能夠阻斷OX40-OX40L相互作用之抗體。在Biacore T200或Biacore 3000 SPR儀器上實施實驗。
如圖17中所概述，抗體20C1、20B3、8B11、23H3、18E9、14B6、OX40.1及OX40.2係配體阻斷劑；抗體3F4係部分配體阻斷劑；且14A2、6E1及OX40.5係配體非阻斷劑。
實例9：OX40抗體之生物物理性質
藉由SPR分析測試若干OX40抗體對可溶性人類OX40之親和力。簡言之，藉由將1-10μg/mL各別抗體捕獲於經抗人類-CH1塗佈之CM5晶片上實施親和力量測。使用400nM之單一濃度或自400nM之1：2連續稀釋之人類-OX40-6XHIS抗原。在BIACORE® T200或BIACORE® 3000 SPR儀器上實施實驗。將數據擬合至1：1模型。
如表13中所示，所測試抗OX40抗體具有10-8M至10-9M範圍內之解離常數(KD)。
Figure 105116545-A0202-12-0220-29
Figure 105116545-A0202-12-0221-30
亦測試OX40.21抗體之熱穩定性，且結果概述於表14中。使用GE Healthcare CAP-DSC測定熱穩定性。試樣係以250μg/mL濃度在PBS中運行。掃描速率係60℃/hr。將數據擬合至非2態模型。在與其他屬性(例如，低脫靶效應、免疫原性等)一起考慮時，OX40.21抗體經測定為所測試更穩定抗體中之一者。
Figure 105116545-A0202-12-0221-31
亦測試在向食蟹猴單一靜脈內投藥後之OX40.21抗體之藥物動力學。OX40.21抗體展現在向食蟹猴單一靜脈內(IV)投藥後可接受之藥物動力學(PK)性質，其中線性PK(0.4至4mg/kg)及長的終末半衰期(6天)。
Figure 105116545-A0202-12-0221-32
Figure 105116545-A0202-12-0222-788
使用異速放大(allometric scaling)(假定冪指數=0.85(CLT)及1(Vss))自食蟹猴PK數據投射OX40.21之人類PK參數。所投射人類t1/2係10天(表16)。藉由兩區室方法計算PK參數。
Figure 105116545-A0202-12-0222-35
實例10：由一組未經標記之抗OX40抗體之PE標記之抗OX40抗體純系L106的FACS交叉阻斷
測試若干抗OX40抗體阻斷PE標記之抗OX40抗體純系L106與人類OX40轉染之293細胞之結合的能力。簡言之，首先將經人類OX40穩定轉染之293細胞與不同濃度之未經標記之抗OX40抗體一起培育。隨後將細胞洗滌並與2.5μg/mL之固定濃度之PE標記之L106抗體(BD Biosciences)一起培育。使用FACSCanto II流式細胞儀(Becton Dickinson)量測染色之螢光強度。計算細胞群體之PE-L106抗體染色之幾何平均螢光強度(GMFI)(FACSDiva軟體)。使用GraphPad Prism軟體生成L106結合之阻斷之劑量-反應曲線。
如圖18中所示，18E9及OX40.1抗體完全阻斷L106與人類OX40轉染之細胞之結合，而20B3顯示部分阻斷。其餘抗體顯示較小阻斷或不顯示阻斷，此指示18E9及OX40.1結合至與所測試其他抗體不同之 OX40上之表位。
實例11：抗OX40抗體之交叉阻斷分析
實施此實驗以測試各種抗OX40抗體之交叉阻斷性質以評估結合特異性。簡言之，將OX40抗體OX40.1偶聯至別藻藍蛋白(APC)，且將人類OX40抗體OX40.4及OX40.5生物素化。將一組未偶聯人類OX40抗體以一定劑量施加至在其表面上過表現人類OX40蛋白質之經改造293或HT1080細胞系並允許於4℃下結合30min。在未清除未偶聯之Ab情況下，將APC-OX40.1(1μg/mL)、生物素-OX40.4(0.4μg/mL)或生物素-OX40.5(0.4μg/mL)施加至分析孔並容許其於4℃下結合30min。將細胞洗滌且若需要在相同條件下在鏈黴抗生物素蛋白-APC偶聯物存在下進一步培育。在最終洗滌後，在FACSCanto流式細胞儀(BD Bioscience,San Jose,CA)上分析細胞。平均螢光強度(MFI)信號與結合之偶聯抗體成正比。
如圖19A-19C中所示，APC-OX40.1與過表現人類OX-40蛋白質之細胞之結合由OX40.2及OX40.5阻斷，但由OX40.4僅中等阻斷(若存在)。APC-OX40.1之結合由8B11.H9、3F4.G11、20B3.G2及14B6.C5阻斷，但不由6E1.A12及14A2.B9阻斷。圖19A-19C中評估之抗體之間之觀察結合關係的圖示於圖19H中。
圖19D-19E顯示生物素-OX40.4之結合由20B3.G2強烈阻斷，由20C 1.F2中等阻斷，由3F4.G11及23H3.C6弱阻斷(若存在)，且不由14A2.B9阻斷。生物素-OX40.5之結合由20B3.G2、23H3.C6及20C1.F2強烈阻斷，由3F4.G11中等阻斷，且由14A2.B9弱阻斷。
圖19F-19G顯示生物素-OX40.4之阻斷不由OX40.1或OX40.8阻斷，且由OX40.5或OX40.6僅弱阻斷(若存在)。生物素-OX40.5之結合由OX40.1阻斷，由OX40.6中等阻斷，且由OX40.4或OX40.6僅極弱阻斷(若存在)。
圖19D-19G中評估之抗體之間之觀察結合關係的圖示於圖19I中。
實例12：抗OX40抗體結合至構象表位/表位定位
此實例顯示OX40.21結合至非變性人類OX40，但不結合至變性人類OX40，且結合並非藉由N-糖基化實現。
如下測定OX40.21與具有或無N-連接糖基化之天然或變性OX40之結合。將天然(即，非變性)及變性人類OX40之試樣與酶N-聚糖酶PNGase F一起或不一起培育以去除N-糖基化。使具有或無N-連接糖基化之天然人類OX40之試樣經受SDS凝膠電泳，且使具有或無N-連接糖基化之變性人類OX40之試樣經受變性SDS凝膠電泳。
如圖20A中所示，OX40.21僅結合至天然OX40，且不結合至變性形式，且糖基化之存在或不存在不影響與OX40之結合。圖20B及20C顯示在去糖基化後藉由肽定位鑑別兩種N-醣肽(對於AspN118及AspN12二者為60%佔據率)。
該等數據表明，OX40.21結合至係構象且獨立於N-連接糖基化之表位。
亦使用質譜執行表位定位研究。藉由利用胞內蛋白酶之酶消解生成his標記之人類OX40(「hOX40」)之肽片段。使用AB Sciex 5600 Triple-TOF實施LC-MS。
如圖20D及20E中所示，藉由限制蛋白分解之天然hOX40之結合實驗揭示，OX40.16及OX40.21主要結合至肽DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)，其對應於成熟人類OX-40(SEQ ID NO：2)之細胞外部分之胺基酸46-62。OX40.8結合至肽DSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTNCTLAGK(SEQ ID NO：179)，其對應於成熟人類OX40(SEQ ID NO：2)之細胞外部分之胺基酸89-124。表位由OX40.21結合之位置與OX40配體之結合位點之部分 重疊，如藉由人類OX40/OX40L複合物(蛋白質資料庫(Protein Data Bank，PDB)ID代碼2HEV)之結晶結構所測定。針對OX40.21藉由質譜鑑別之其他肽示於圖20E之上圖中，且包括QLCTATQDTVCR(SEQ ID NO：184)、SQNTVCRPCGPGFYN(SEQ ID NO：185)、SQNTVCRPCGPGFYNDVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：182)及PCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：183)。
實例13：抗OX-40抗體促進T細胞增殖並誘導自T細胞之IFN-γ及IL-2分泌
藉由量測與抗OX-40抗體一起培育之T細胞之增殖及由該等T細胞分泌之IL-2及IFN-γ之量測試該等抗體誘導活體外T細胞活性的能力。
生成經轉染CHO細胞系以在初代T細胞活化分析中用作人工抗原呈遞細胞。CHO-CD3-CD32A細胞系在單鏈Fv格式中表現抗人類CD3抗體以及人類Fc受體CD32A，以將抗OX40抗體呈遞於CHO細胞表面上。簡言之，藉由負向選擇(RosetteSepTM,StemCell Technologies)分離人類初代CD4 T細胞並在分級劑量之抗OX40抗體或同型對照抗體存在下將其與經輻照CHO-CD3-CD32A細胞以8：1 T：CHO比率共培養。於37℃下在培養物中3至4天後，收穫上清液用於遵循製造商之建議藉助藉由ELISA(BD Biosciences)或HTRF分析(Cisbio)量測所分泌人類IFNγ來評估T細胞活化。其後，添加氚化胸苷持續培養之最後約18小時以藉由氚化胸苷納入量測T增殖，作為T細胞活化之額外評估。
如圖21A-21D及22A-22D中所示(且下表17中所概述)，大部分所測試抗OX40抗體以劑量依賴性方式強烈增強由CHO-CD3-CD32細胞刺激之人類CD4 T細胞活化，如藉由增殖及IFNγ分泌所量測。此分析中測試之抗體組與OX40.1、OX40.4及OX40.5相比至少一樣或更好地共刺激T細胞活化。
表17.
Figure 105116545-A0202-12-0226-36
亦在葡萄球菌腸毒素B(SEB)活化之人類末梢血單核細胞(PBMC)之培養物中測試抗人類OX40抗體對刺激初代T細胞的效應。人類全血係自AllCells,Inc.(Berkeley,CA)獲得或自Bristol-Myers Squibb,Redwood City,CA處之供體在內部靜脈切開術程式支持下獲得。藉由在Ficoll-Hypaque墊子上梯度純化分離PBMC並在分級劑量之OX40抗體或同型對照抗體以及2-5μg/mL可溶性交聯抗體F(ab')2山羊抗人類Fcγ存在下將其在補充有固定、次最佳(85ng/mL)之超抗原葡萄球菌腸毒素B(SEB；Toxin Technologies,Sarasota,FL)之培養基中培養3天。 於37℃下培養3天後，收穫上清液用於藉助所分泌人類IL-2之ELISA量測來評估T細胞活化。簡言之，將培養上清液在試樣稀釋劑中1：10稀釋且根據製造商推薦之方案藉由ELISA(BD Bioscience)測試人類IL-2之存在。在添加TMB受質後，使用Softmax操作軟體於650nm之波長下在Spectramax 340PC讀數器上對分析板進行讀數。生色受質之量測光學密度與結合之檢測抗體成正比。
來自分離自不同供體之PBMC之數據示於圖23A-23F中。一般而言，與可溶性交聯純系23H3.C6、8B11.H9、3F4.G11、18E9.G5、6E1.A12及20B3.G2相比，可溶性交聯純系20C1.F2引發更穩健細胞介素反應(EC50為1.3-2.0nM)(圖23A-23C)。關於具有可變區突變之抗體，與可溶性交聯抗體OX-40.17、OX40.18、OX40.6及OX40.8相比，OX-40.21通常引發更穩健細胞介素反應(圖23D-23F)。來自該等供體之數據以及來自8個其他供體(其中測試其他抗OX40抗體)之數據共同展示，與OX40.1、OX40.2、OX40.4、OX40.5、OX40.17及OX40.18相比，OX40.21平均展現增強T細胞反應之優異功效。該等結果進一步展示，OX40.21引發與由OX40.6及OX40.8引發之反應相當的反應(表18)。
Figure 105116545-A0202-12-0227-37
*每一組實驗係在不同天實施。
實例14：使用細胞系之NK92介導之細胞溶解之抗OX40抗體促進
使用鈣黃綠素釋放作為讀出值測試若干抗人類OX40抗體促進NK92細胞介導之活化CD4+ T細胞溶解的能力。簡言之，藉由使用磁珠粒負向選擇分離用作靶細胞之CD4+ T細胞並利用經抗CD3及抗CD28塗佈之珠粒活化72小時。3天後，將NK92細胞與鈣黃綠素AM標記之活化CD4+細胞以5對1之比率一起平鋪。添加遞增之每一抗OX40抗體並將培育2小時。藉由使用Envision讀板儀(Perkin Elmer)對介質之螢光強度進行讀數來量測鈣黃綠素釋放。基於平均螢光強度(MFI)利用下式計算抗體依賴性細胞溶解之百分比：[(測試MFI-平均背景)/(平均最大值-平均背景)]×100。
如圖24中所示，OX40.8及OX40.16誘導靶細胞之特定溶解之最高量(分別60%及30%)。OX40.8之EC50係16ng/mL且OX40.16之EC50係4ng/mL。所測試之所有其他抗體以對於精確定量過低之程度誘導ADCC。
實例15：NK介導之初代人類CD4+T細胞之細胞溶解之抗OX40抗體促進
測試若干抗人類OX40抗體促進初代NK細胞介導之活化CD4+ T細胞溶解的能力。簡言之，藉由磁性選擇自兩個供體之PBMC分離用作靶細胞之CD4+ T細胞並利用經抗CD3及抗CD28塗佈之珠粒活化72小時。藉由使用磁珠粒負向選擇自單獨供體分離用作效應物之NK細胞，並利用IL-2活化24hr。在活化時段後，在1μg/ml之抗體存在下將NK效應細胞與鈣黃綠素標記之靶T細胞以20：1、10：1或5：1比率混合2小時。藉由使用Envision讀板儀(Perkin Elmer)對介質之螢光強度進行讀數來量測由溶解靶細胞釋放之鈣黃綠素之量。基於平均螢光強度(MFI)利用下式計算抗體依賴性細胞溶解之百分比：[(測試MFI-平均 背景)/(平均最大值-平均背景)]×100。
如圖25A及25B中所示，來自兩個供體之活化CD4+ T細胞靶標由OX40.8最有效地溶解。利用OX40.21及OX40.1二者觀察到較低ADCC活性程度。
實例16：巨噬細胞介導之表現OX40之HEK293細胞之細胞吞噬作用的OX40抗體促進
為測定若干OX40抗體之抗體介導之吞噬性活性，將初代人類巨噬細胞與CellTrace Violet標記之HEK293/OX40細胞及遞增之抗OX40抗體一起培養4小時。4小時後，收穫細胞，用抗CD64-APC染色，並在流式細胞儀上運行。將經染色對CD64及CellTrace Violet雙陽性之細胞視為被吞噬。使用下式計算被吞噬靶細胞之百分比：100×(雙陽性細胞之數目/CellTrace Violet陽性細胞之總數)。
如圖26中所示，所有測試抗OX40抗體皆以劑量依賴性方式誘導表現OX40之靶細胞之吞噬作用。OX40.8具有吞噬作用之最高總體程度及6.2ng/mL之最低EC50濃度。此展示人類IgG1抗OX40抗體以劑量依賴性方式誘導FcR介導之吞噬作用。
實例17：抗OX40抗體結合人類補體之C1q組份
研發比色ELISA分析以評估人類血清補體之C1q組份是否結合至OX40.21抗體。將所有測試抗體以10μg/mL塗佈於高結合免疫分析板上。在阻斷未佔據蛋白結合位點後，向孔中添加分級劑量之人類C1q(3.125-200μM)，該等孔包括用作結合至分析板之非特異性背景C1q之對照的阻斷空白孔。使用生物素化小鼠抗C1q抗體與鏈黴抗生物素蛋白-聚-HRP之組合以及四甲基聯苯胺受質檢測C1q與固定抗體之結合。結果報告為450nm處之光學密度讀數減去630nm。
如圖27中所示，C1q以劑量依賴性方式結合至OX40.21(實心方形)及人類IgG1同型對照(開圓)。然而，C1q與OX40.21之結合程度低 於與人類IgG1同型對照抗體。如所預計，存在極少背景信號(灰色環)且C1q與IgG1.1同型對照物明顯結合(實心黑色環)。IgG1.1抗體在Fc區中含有五個經設計以消除C1q結合及FcR相互作用之突變。此結果展示人類血清補體之C1q組份可結合至OX40.21，且指示OX40.21可誘導補體介導之表現OX40之細胞在活體內溶解。
實例18：OX40在腫瘤浸潤淋巴球中表現
在結腸直腸癌、肺癌及卵巢癌中(圖28C)，OX-40在腫瘤浸潤淋巴球中表現，且型式通常限於CD4+細胞(圖28A)，且在CD8+ T細胞上表現最低(圖28B)。
類似地，OX40由小鼠Sa1N腫瘤(圖28D)及小鼠MC38腫瘤(圖28E)中之CD4+ T細胞及Treg表現。為測試腫瘤中小鼠OX-40之表現，分別向AJ或B6小鼠中皮下植入2×106個SA1N肉瘤細胞或2×106個MC38細胞。在植入後第15天，收穫腫瘤，解離成單一細胞懸浮液，並染色用於流式細胞術。T細胞群體係基於CD8、CD4及Foxp3之其表現來鑑別。對於Sa1N腫瘤，腫瘤之CD4+ Foxp3+細胞示於紅色直方圖中，CD4+ Foxp4-細胞示於藍色直方圖中且CD8+細胞示於橙色直方圖中(圖28D)。同型對照染色之細胞示於綠色直方圖中。對於MC38腫瘤，Treg示於藍色直方圖中，CD4+細胞示於綠色直方圖中且CD8+細胞示於紅色直方圖中(圖28E)。
實例19：Treg細胞介導之抑制之抗OX40抗體逆轉
測試若干抗人類OX40抗體逆轉調控性T(Treg)細胞介導之人類CD4+ T細胞增殖抑制的能力。簡言之，藉由磁珠粒分離針對CD4+細胞富集PBMC及隨後分選CD4+CD25hiCD127lo Treg及CD4+CD25loCD127hiCD45RO+ Tresp細胞分離Treg及T反應(Tresp)細胞。隨後用增殖染料標記Tresp細胞並與逐漸增加數目之Treg細胞以1：1比率開始平鋪。用3μg/mL板結合之抗CD3、1μg/mL可溶性抗 CD28及2μg/mL板結合之抗OX40或同型對照刺激培養物。96小時後，藉由使用流式細胞術評估染料稀釋來量測Tresp細胞增殖。
如圖29中所示，在Treg細胞存在及不存在二者下，與同型對照相比，抗OX40抗體增加Tresp細胞增殖。此表明，所測試抗OX40抗體逆轉Treg細胞對Tresp細胞增殖之抑制效應。
實例20：毒性研究
在第1天(圖30A)及第29天(圖30B)向猴靜脈內投與OX40.6(2mg/kg)以評估任何相關毒性。未觀察到耐受性問題或臨床病理異常之證據。OX40.6刺激對KLH之增強之免疫反應，如特徵在於在離體KLH回憶分析中朝向在CD4+ T細胞中增強之CD69表現的趨勢。4隻猴中之兩隻展現加速清除率，其與抗藥物抗體之形成相關。
藉由化學發光(CL)免疫分析來分析上述實驗之食蟹猴血清試樣中OX40.6之濃度。使用OX40.6抗體以製備校準劑及品質控制(QC)試樣。將生物素化-人類-OX40-his固定於鏈黴抗生物素蛋白塗佈之微量滴定板(Greiner Bio-one)上作為OX40.6之捕獲分子。在板上培育達到10%食蟹猴血清之最終基質之試樣、標準品及品質控制試樣。在含有2%小鼠血清之1% BSA/PBS/0.05% Tween 20(PTB)中以10%最小所需稀釋分析試樣。洗掉未結合之物質並使用HRP標記之小鼠單株抗人類IgG抗體作為檢測分子檢測所捕獲OX40.6抗體。在添加SuperSignal ELISA Pico化學發光受質(Thermo Scientific)後，使用自OX40.6抗體校準劑生成之4-參數對數(4-PL)校正曲線自發光強度計算食蟹猴血清試樣中OX40.6之濃度，如藉由M5讀板儀所量測。OX40.6抗體校正曲線之範圍係在食蟹猴血清中5ng/mL至5,000ng/mL。量化之上限及下限分別係5,000ng/mL及10ng/mL(即，ULOQ 5000ng/mL，LLOQ 10ng/mL)。在食蟹猴血清中製備3750ng/mL、400ng/mL及20ng/mL之品質控制試樣且在每一板上對其進行分析以確保可接受之分析性能。 將校準劑、QC及試樣在含有2%小鼠血清之PTB中稀釋5倍。使用四個鏈黴抗生物素蛋白板以分析試樣。分析性能在可接受範圍內：標準品之板間% CV低於25%，且QC回收率在±30%標稱值內。
藉由電致化學發光(ECL)橋接免疫分析確定上述實驗中食蟹猴血清中OX40.6之抗藥物抗體的存在。特定而言，使用小鼠單株抗人類IgG Fc抗體以製備陽性對照。生物素化-抗OX40：抗hOX40-his以25ng/mL用作捕獲分子且釕化抗OX40：抗hOX40-his以25ng/mL用作檢測分子。以含有捕獲及檢測分子之1% BSA/PBS/0.05% Tween 20(PTB)中之100倍稀釋分析試樣。在聚丙烯板中培育2小時後，將試樣混合物轉移至鏈黴抗生物素蛋白塗佈之MSD板。在1小時培育後，洗掉未結合物質，添加MSD讀取緩衝液，且利用MSD讀板儀SI6000量測ECL。在食蟹猴血清中製備1000ng/mL(HPC)、100ng/mL(MPC)及10ng/mL(LPC)之陽性對照(小鼠抗人類IgG Fc)。使用彙集食蟹猴血清作為陰性對照(NC)。HPC、MPC及LPC對NC之信號比分別係102、10及2。使用一個鏈黴抗生物素蛋白板以分析試樣。分析性能在可接受範圍內：PC之% CV低於10%，且陰性對照之原始信號(54RLU)與投藥前試樣之原始信號(48-55RLU)相當。
實例21：免疫原性風險評估研究
針對若干抗人類OX40抗體執行活體外T細胞增殖分析以評估其人類免疫原性潛能。簡言之，藉由Ficoll(GE Healthcare)及梯度離心分離健康志願者之末梢血單核細胞(PBMC)，且藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增及與寡核苷酸探針(Prolmmune)雜交表徵人類淋巴球抗原(HLA)類別II。
使用一組40個具有密切匹配世界人口頻率之HLA類別II型之PBMC供體進行分析運行。用CFSE(Invitrogen)標記PBMC以監測增殖並在含有10%人類AB(Bioreclamation)、非必需胺基酸(Gibco)及pen- strep(Gibco)之RPMI(Lonzo)中以200,000個細胞/孔以6個重複平鋪於96孔板上。將抗人類OX40抗體、對照蛋白質、參照抗體及ConA與PBMC以1μM一起培養7天，其後洗掉培養基並用抗人類CD4 APC(BD science)單株抗體標記細胞。在利用洗滌步驟去除未結合之抗CD4抗體後，將細胞用PBS中之3.7%福馬林(Sigma)固定，並藉由流式細胞術分析以測定增殖CD4+細胞之百分比。
對於不同抗人類OX40抗體顯示陽性反應(定義為增殖CD4+ T細胞相對於培養基培育之PBMC顯著增加)之40個供體之百分比示於圖31中。抗人類OX40抗體之所有變體在此分析中皆顯示活化CD4+細胞之低潛能，與低QC蛋白質相當，只是OX40.16及OX40.21除外，其在40個供體之任一者中皆不顯示陽性CD4增殖反應。該等結果表明，該等抗人類OX40抗體具有引發人類之抗藥物抗體反應的低潛能。
實例22：在結腸癌模型中，與活化Fc受體之結合增強抗mOX40活性
為測試小鼠腫瘤模型中FcR結合在抗小鼠OX40抗體之活性中的作用，測試不同同型之抗OX40抗體。向C57BL/6小鼠皮下注射200萬個MC38腫瘤細胞。7天後，測定腫瘤體積並將小鼠隨機分成治療組以便具有相當之平均腫瘤體積。在第7、10及14天以200μg/劑量以200μl之體積腹膜內投與調配於PBS中之抗體。
在同源小鼠腫瘤模型中，抗鼠類OX40抗體(例如，OX86、大鼠IgG1)展現抗腫瘤活性。由於改變對T細胞表面受體具有特異性(共刺激性及共抑制性二者)之許多抗體之同型可改變該等抗體之抗腫瘤活性，故生成OX86之小鼠Fc同型變體，一種不阻斷OX40/OX40L相互作用之抗體。如圖32A-32C中所示，與格式化為小鼠IgG1之OX86(圖32B)相比，格式化為小鼠IgG2a Fc之OX86(圖32C)產生優異抗腫瘤活性。此可能係由於腫瘤位點處Treg細胞之耗盡及自抗體介導之OX40之激動作用之T效應細胞擴增。
為確認不同抗體同型對腫瘤浸潤T細胞群體之效應，藉由流式細胞術評估經不同同型治療之MC38小鼠之腫瘤。將所選小鼠處死，並在腫瘤植入後第15天收穫腫瘤及脾用於分析。藉由利用注射器在24孔板中解離腫瘤及淋巴結製備單一細胞懸浮液。使細胞懸浮液通過70μm過濾器，製成丸粒，重新懸浮並計數。隨後將細胞以1×106個細胞/孔平鋪於96孔板中用於染色。隨後在FACS Canto流式細胞儀(BD)上分析試樣。經抗OX40抗體治療之帶有腫瘤之小鼠之脾及腫瘤的分析顯示IgG2a同型可耗盡腫瘤中之CD4+ Treg(圖33A)，且IgG1及IgG2a同型可活化末梢中之T細胞擴增(圖33B)且可增加脾中之細胞數目(圖33C)。該等結果表明，OX40之激動作用(但不必阻斷OX40/OX40L相互作用)及OX86抗體之Fc受體結合促進抗腫瘤活性。
使用小鼠測試人類Fc及FcR之作用，其中小鼠FcR已敲除且經人類FcR置換。使用骨髓嵌合體系統實施該等實驗，其中CD45.1同基因型宿主經輻照，隨後利用人類FcR轉基因骨髓細胞重構。隨後使該等小鼠重構8週，之後接種2×106個MC38腫瘤細胞。7天後，測定腫瘤體積並將小鼠隨機分成治療組以便具有相當之平均腫瘤體積。在第7、10及14天以200μg/劑量以200μl之體積腹膜內投與調配於PBS中之抗體。用對照人類IgG1(圖34A)、嵌合OX-86人類G1雜合Ab(圖34B)或具有S267E突變之OX-86人類G1雜合體(圖34C)治療小鼠。結果類似於利用小鼠同型所觀察者，即人類IgG1抗體具有顯著抗腫瘤效應，此乃因其可結合至活化FcR，而增加與CD32B及CD32A二者之結合之S267E突變具有較高活性(圖34A-34C)。活性之此較高程度可能係由於對效應物T細胞之增加激動作用以及腫瘤位點處Treg之增加耗盡。
如先前所述檢查帶有腫瘤之小鼠之腫瘤位點及脾處之T細胞群體。Treg在經G1或G1 S267E抗體治療之小鼠中較不普遍，其中利用S267E同型觀察到較大效應(圖35A)。腫瘤位點處CD8+ T細胞(圖35B) 及CD4+效應物(圖35C)之百分比之增加亦明顯，且利用G1 S267E抗體時該等增加更顯著。亦注意到經抗OX-40抗體治療之小鼠之脾中之細胞性增加(圖35D)。該等結果表明，OX86-hIgG1抗體展現有效力抗腫瘤活性(圖34A-34C)及可量測之Treg耗盡(圖35A-35D)。
實例23：阻斷抗OX40抗體在小鼠腫瘤模型中展現抗腫瘤活性
執行以下實驗以確定阻斷OX40/OX40L之間之相互作用之抗體是否展現有效力抗腫瘤活性。為此，生成阻斷OX40/OX40L相互作用之倉鼠抗小鼠OX40抗體(倉鼠IgG1 8E5抗體)並在皮下小鼠CT-26腫瘤模型中測試其抗腫瘤活性。CT-26係小鼠結腸腺癌腫瘤細胞系，在皮下移植細胞時可在BALB/c小鼠中監測其實體腫瘤生長。
在研究開始之前，使雌性BALB/c小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)適應最少三天。將小鼠以每個籠5隻動物圈養，且將籠放置於微隔離器通氣槽中。圈養係於18℃至26℃及50+20%相對濕度下且每小時至少12次室內空氣變化。維持12h光/暗循環。向動物隨意提供經衛生處理之實驗室齧齒類動物飲食及城市用水。
將CT-26細胞維持於補充有10%胎牛血清(FBS；Hyclone，目錄號SH30071.03)之RPMI-1640培養基(Hyclone，目錄號SH30096.01)中。約一週兩次將包含於單一T175燒瓶中之細胞以1：5稀釋分化並擴增至四個T175燒瓶，直至獲得足夠數目之細胞用於腫瘤植入。接近80%鋪滿收穫細胞，洗滌並重新懸浮於PBS中。
在第0天，使用1cc注射器(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)及27規5/8英吋針向小鼠中植入1×106個CT-26細胞。隨後每週兩次利用電子測徑器(Mitutoyo,Aurora,Illinois)以3維量測腫瘤並記錄。使用下式計算腫瘤體積(mm3)：寬度×長度×高度×0.5。在植入後第6天腫瘤體積量測後，根據腫瘤體積對小鼠進行分級。將具有26mm3之平均腫 瘤體積之小鼠隨機分組並如表19中所示治療。
倉鼠同型對照抗體係GST(純系PIP，目錄號BE0260；BioXcell,West Lebanon,NH)之惰性美國倉鼠IgG單株抗體(mAb)。其係在即將投與之前在PBS中製備以在第6、10及14天經由腹膜內(IP)注射提供10mg/kg/小鼠之劑量，如表19中所示。
單抗小鼠OX40(純系8E5)之單株抗體係在即將投與之前在PBS中製備以在第6、10及13天經由IP注射提供10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg/小鼠之劑量，如表19中所示。
Figure 105116545-A0202-12-0236-38
每日檢查動物之體位、整飾及呼吸變化以及嗜睡。每週兩次稱重動物，且若重量損失>20%，則將其安樂死。每週兩次檢查小鼠之腫瘤之存在及大小直至死亡或安樂死。利用電子測徑器(Mitutoyo,Aurora,Illinois)以3維量測腫瘤並記錄。量測隨腫瘤生長變化之對治療化合物之反應。若腫瘤達到
Figure 105116545-A0202-12-0236-766
1500mm3之體積或出現潰瘍，則將動物安樂死。
如圖36A-36E中所示，與倉鼠IgG同型對照組(圖36A)相比，倉鼠抗小鼠OX40 mAb(純系8E5；圖36B-36E顯示利用不同劑量之8E5之治療)在皮下CT-26模型中展示有效力抗腫瘤活性。8E5抗體係以介於0.3mg/kg至10mg/kg範圍內之劑量投與，且即使在評估之最低劑量(0.3mg/kg)下，在研究時段結束時(第72天)，12隻小鼠中之10隻無腫瘤(TF)。儘管無腫瘤之小鼠之數目在每一劑量組之間無顯著不同(其中 直至研究時段結束，每一組具有9或10隻無腫瘤小鼠)，但與經兩個最低劑量(0.3mg/kg或1mg/kg)治療之小鼠相比，經兩個最高劑量(3mg/kg或10mg/kg)中之任一者治療之小鼠顯示更大腫瘤生長延遲。同型對照治療組中存在無腫瘤之小鼠；該組中之所有小鼠直至第39天皆由於潰瘍或腫瘤負荷(>1500mm3)而處死。
該等數據指示，在投與患有已確立腫瘤之小鼠時，在皮下小鼠CT-26腫瘤模型中，阻斷OX40與OX40-L之間之相互作用之抗OX40抗體展示有效力抗腫瘤活性。
實例24：在鼠類MC38結腸癌模型中，OX40激動作用與PD-1阻斷協同作用
為測試抗OX-40抗體與抗PD-1抗體治療之間之協同作用，在MC38小鼠腫瘤模型中測試該等抗體之組合。向C57BL/6小鼠皮下注射200萬個MC38腫瘤細胞。7天後，測定腫瘤體積並將小鼠隨機分成治療組以便具有相當之平均腫瘤體積。在第7、10及14天以200μg/劑量以200μl之體積腹膜內投與調配於PBS中之抗體。
如圖37A-37D中所示，抗PD-1抗體(圖37B)及抗OX40抗體(圖37C)二者在單獨使用時皆顯示最小活性，但在組合時具有顯著抗腫瘤活性(圖37D)，其中使得8隻小鼠中之5隻無腫瘤。
實例25：OX40激動作用增強食蟹猴中對疫苗之反應
量測對疫苗之免疫反應之增強以評估OX40.6抗體刺激食蟹猴之免疫反應的能力。選擇此方法，此乃因不可在健康非人類靈長類動物中評估期望效應(即對腫瘤之免疫反應之增強)，此乃因其無腫瘤。
第1天用鑰孔帽貝血藍蛋白(KLH)(10mg，肌內)並用B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)(ENGERIX-B)(20μg，肌內，在第1及29天)對猴進行免疫。在投與疫苗後，在第1及29天向猴靜脈內投用0mg/kg或2mg/kg之OX40.6抗體。在第22及41天藉由對KLH之離體T細胞反應及 藉由對KLH及HBsAg之T細胞依賴性抗體反應量測免疫反應。如圖38A及38B中所示，在第22天(圖38A)及第41天(圖38B)時2mg/kg下之OX40.6相關發現包括對KLH之離體回憶反應增加，其特徵在於表現CD69+、IFN-γ+及TNF-α+之CD4+CD8- T細胞之平均百分比增加。
實例26：具有經改造恆定結構域之抗體之Fc受體結合
此實例展示，在具有包含IgG2之CH1及鉸鏈之經修飾重鏈恆定區的抗體含有IgG1之CH2及CH3結構域時，其結合至FcγR。
除由可變結構域抗原結合外，抗體亦可經由與恆定結構域之相互作用接合Fc-γ受體(FcgR)。該等相互作用介導效應物功能，例如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。IgG1同型之效應物功能活性較高，但IgG2及IgG4之效應物功能活性極低或不存在，此乃因該等同型對FcgR具有較低親和力。另外，IgG1之效應物功能可經由恆定區內之胺基酸殘基之突變來修飾以改變FcgR親和力及選擇性。
使用生物感測器技術(包括Biacore表面電漿共振(SPR)及Fortebio生物膜層干涉法(BLI))研究抗體與Fcγ受體(FcγR或FcgR)之結合。於25℃下在Biacore T100儀器(GE Healthcare)上實施SPR研究。使用EDC/NHS將鼠類抗6xHis抗體之Fab片段固定於CM5感測器晶片上至約3000RU之密度。經由C-末端his-標記使用30s之接觸時間以10ul/min捕獲各種his標記之FcgR(7μg/ml)，且在10mM NaPO4、130mM NaCl、0.05% p20(PBS-T)pH 7.1之運行緩衝液中評估1.0uM抗體之結合。用於該等實驗之FcgR包括CD64(FcgRI)、CD32a-H131(FcgRIIa-H131)、CD32a-R131(FcgRIIa-R131)、CD32b(FcgRIIb)、CD16a-V158(FcgRIIIa-V158)、CD16b-NA1(FcgRIIIb-NA1)及CD16B-NA2(FcgRIIIb-NA2)。於25℃下在10mM NaPO4、130mM NaCl、0.05% p20(PBS-T)pH 7.1中在Fortebio Octet RED儀器(Pall,Fortebio)上實施 BLI實驗。在蛋白質A塗佈之感測器上自未經稀釋之表現上清液捕獲抗體，之後結合1μM hCD32a-H131、hCD32a-R131、hCD32b、hCD16a-V158或0.1μM hCD64分析物。
首先，製得抗體含有包括取代S267E(SE)及S267E/L328F(SELF)、以及突變P238D、P271G、H268D、A330R、G237D、E233D之各種組合(稱作V4、V7、V8、V9及V12)的經修飾IgG1 Fc結構域。該等抗體之結合係藉由Biacore SPR與IgG1f、IgG2.3(IgG2-C219S)及IgG4.1(IgG4-S228P)抗體以及經改造以減少與所有FcgR之結合之IgG1.1f抗體比較來研究。圖70中所示之結果展示IgG1f、IgG2.3及IgG4.1及突變IgG1抗體之預計FcgR結合性質(包括SE及SELF之增加之CD32a-H131、CD32a-R131及CD32b結合)以及V4、V7、V8、V9及V12突變體對於CD32b相對於CD32a-H131及CD32a-R131增加之選擇性(圖39)。
使用下一組構築體以將效應物功能改造成原本效應物功能陰性IgG2同型。對於此研究，在IgG2.3恆定區或IgG2.3/IgG1f雜合體(稱作IgG2.3G1-AY(表20))之背景下引入上述突變。抗體係以小規模表現為上清液，且使用Fortebio Octet生物膜層干涉法生物感測器技術測試對FcgR之結合。由於抗體係以低濃度存於上清液中，故藉由使用蛋白質A塗佈之感測器自上清液捕獲抗體、之後結合溶液中之FcgR分析物來實施實驗。亦包括純化之上清液對照IgG1f(包括野生型IgG1、SE、P238D、V4及V12抗體)用於比較，且該等對照抗體中之每一者皆展示預計FcgR結合性質(圖40)。IgG2.3抗體亦展示預計結合性質，與僅CD32a-H131具有明顯結合。然而，用以向IgG2.3中引入S267E、L328F、P238D、P271G、H268D、A330R、G237D或E233D突變之所有突變皆不能重演相應經改造IgG1 mAb之FcgR親和力(圖40)。相比之下，IgG2.3G1-AY構築體能夠完全保存野生型IgG1之FcgR結合性 質，同時保留IgG2.3之CH1及鉸鏈區。另外，含有S267E、L328F、P238D、P271G、H268D、A330R、G237D及E233D之所有IgG2.3G1-AY突變體皆展示與含有相同突變之IgG1型式mAb相當的FcgR結合性質(圖40)。此展示具有IgG2之CH1及鉸鏈區之抗體之成功改造與野生型或突變體IgG1之效應物功能的組合。
Figure 105116545-A0202-12-0240-39
Figure 105116545-A0202-12-0241-40
藉由產生利用IgG2.3G1-AY、IgG2.3G1-AY-S267E(IgG2.3G1-AY-V27)格式化之其他抗體、以及IgG2-B-形式變體(IgG2.5G1-AY及IgG2.5G1-AY-V27)、及含有IgG1及IgG2恆定結構域之不同組合之其他雜合抗體並使用Biacore SPR技術測試該等抗體與抗his Fab捕獲之his標記之FcgR的結合來進一步探索此改造測試。與Octet上清液數據一致，SPR數據顯示，IgG2.3G1-AY及IgG2.3G1-AY-V27抗體分別與IgG1f及IgG1f-S267E具有相當之FcgR結合性質，儘管含有A-形式IgG2抗體(IgG2.3)之CH1及鉸鏈區(表21)。亦使用IgG2.5G1-AY及IgG2.5G1-AY-V27抗體獲得類似數據，此展示成功改造具有IgG1f或經修飾IgG1f樣效應物功能之B-形式IgG2抗體(含有C131S突變，稱作IgG2.5)。具有IgG2.3G1-AY、IgG2.3G1-AY-V27、IgG2.5G1-AY或IgG2.5G1-AY-V27恆定區但不同可變區之若干其他抗體之數據顯示，此改造策略廣泛適於獨立於可變結構域之其他抗體(表21)。
Figure 105116545-A0202-12-0241-41
Figure 105116545-A0202-12-0242-42
Figure 105116545-A0202-12-0243-43
實例27：在具有或無交聯情況下具有經修飾重鏈恆定區之抗OX40抗體對T細胞增殖及自T細胞之IFN-γ及IL-2分泌的效應.
具有經修飾IgG2 CH1/鉸鏈區之抗OX40抗體可具有在不存在交聯下促進T細胞活化的能力，且因此可能夠在不存在表現FcγR之細胞類型或低表現下促進活體內T細胞活化，且可能在較IgG1同型抗體寬範圍之腫瘤類型中促進抗腫瘤活性。
或者，經修飾CH1/鉸鏈區抗體可仍需要交聯以促進T細胞活化，但與IgG1同型抗體相比，在結合FcγR時可具有增加之激動劑活性，且因此在促進T細胞活化及抗腫瘤活性中更有效力。
生成具有包含表22中所示序列之經修飾重鏈恆定區的抗OX40抗體且使用上述分析測試在具有或無交聯情況下其對T細胞增殖及自T細胞之IFN-γ及IL-2分泌的效應。抗體OX40.6、40.8、40.16及40.21之輕鏈序列分別對應於SEQ ID NO：96、110及116(對於OX40.16及40.21二者)。
Figure 105116545-A0202-12-0243-44
Figure 105116545-A0202-12-0244-45
CHO-CD3 +/- CD32分析
藉由量測與具有表22中所示序列之抗OX-40抗體一起培育之T細胞之增殖及由該等T細胞分泌之IL-2及IFN-γ之量測試該等抗體誘導活體外T細胞活性的能力。
生成經轉染CHO細胞系以在初代T細胞活化分析中用作人工抗原呈遞細胞。CHO-CD3-CD32A細胞系在單鏈Fv格式中表現抗人類CD3抗體以及人類Fc受體(FcR)CD32A，以將抗OX40抗體呈遞於CHO細胞表面上。CHO-CD3細胞系在無FcR之單鏈Fv格式中表現抗人類CD3抗體。
簡言之，藉由負向選擇(RosetteSepTM,StemCell Technologies)分離人類初代CD4 T細胞並在分級劑量之抗OX40抗體或同型對照抗體存在下將其與經輻照CHO-CD3-CD32A細胞或經輻照CHO-CD3細胞以8：1 T：CHO比率共培養。於37℃下在培養物中3至4天後，收穫上清液用於遵循製造商之建議藉助藉由ELISA(BD Biosciences)或HTRF分析(Cisbio)量測所分泌人類IFNγ來評估T細胞活化。其後，添加氚化胸苷持續培養之最後約18小時以藉由氚化胸苷納入量測T增殖，作為T細胞活化之額外評估。
SEB PBMC分析
亦在葡萄球菌腸毒素B(SEB)活化之人類末梢血單核細胞(PBMC)之培養物中測試具有表22中所示序列之抗OX-40抗體對刺激初代T細 胞的效應。人類全血試樣係自AllCells,Inc.(Berkeley,CA)獲得或自Bristol-Myers Squibb,Redwood City,CA處之供體在內部靜脈切開術程式支持下獲得。藉由在Ficoll-Hypaque墊子上梯度純化分離PBMC並在分級劑量之OX40抗體或同型對照抗體存在下將其在補充有固定、次最佳(85ng/mL)之超抗原葡萄球菌腸毒素B(SEB；Toxin Technologies,Sarasota,FL)之培養基中培養3天。在一些情形下，亦向培養物中添加2-5μg/mL之可溶性交聯抗體F(ab')2山羊抗人類Fcγ。於37℃下培養3天後，收穫上清液用於藉助所分泌人類IL-2之ELISA量測來評估T細胞活化。簡言之，將培養上清液在試樣稀釋劑中1：10稀釋且根據製造商推薦之方案藉由ELISA(BD Bioscience)測試人類IL-2之存在。在添加TMB受質後，使用Softmax操作軟體於650nm之波長下在Spectramax 340PC讀數器上對分析板進行讀數。生色受質之量測光學密度與結合之檢測抗體成正比。
MLR分析
測試具有表22中所示序列之抗OX-40抗體增強T細胞：樹突細胞同種異體混合淋巴球反應(T：DC AlloMLR)中初代人類T細胞增殖及IFN-γ分泌的能力。藉由負向選擇(RosetteSep,Stemcell Technologies)自健康人類供體之末梢血分離總T細胞。使用CD 14微珠粒(Miltenyi)自健康人類供體之末梢血分離單核球，且在GM-CSF及IL-4存在下培養6天以衍生不成熟樹突細胞(DC)。在分級劑量之OX40抗體或同型對照抗體存在下共培養DC及T細胞。在一些情形下，亦向培養物中添加2-5μg/mL之可溶性交聯抗體，例如F(ab')2山羊抗人類Fcγ。在第4天與第7天之間收穫每一試樣之上清液用於遵循製造商之建議藉由ELISA(BD Biosciences)或HTRF分析(Cisbio)量測所分泌IFN-γ。在上清液收穫後，將細胞培養物用1μCi/孔之3[H]-胸苷脈衝培養之最後16-18小時。將細胞收穫於濾板上，並將每分鐘之納入細胞之3[H]-胸苷之 3[H]計數讀取為T細胞增殖之量度。
實例28：CT26模型中具有CTLA-4阻斷之OX40激動劑mAb之抗腫瘤活性
為測試抗OX-40抗體與抗CTLA-4抗體治療之間之協同作用，在CT26小鼠腫瘤模型中測試該等抗體之組合。向小鼠接種CT26腫瘤並在接種後第+3天開始mAb投用(在第3、7及10天投用)200μg/小鼠之抗體，如圖41A-41D中所指示。
如圖41A-41D中所示，抗CTLA-4抗體(圖41B)及抗OX40抗體(圖41C)二者在單獨使用時顯示最小活性(對於兩個治療，8隻小鼠中之1隻無腫瘤)，但在組合時具有顯著抗腫瘤活性(圖41D)，其中使得8隻小鼠中之4隻無腫瘤。
實例29：患有實體腫瘤之個體中之1/2a期試驗
在患有晚期實體腫瘤之個體中執行單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合投與之OX40.21之1/2a期研究，以展示單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合投與OX40.21之效能。
1.目的
研究之主要目的係評估患有晚期惡性腫瘤之個體中單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合投與之OX40.21之安全性、耐受性、劑量限制性毒性(DLT)及最大耐受劑量(MTD)/建議2期劑量(RP2D)。
次要目的包括研究患有晚期惡性腫瘤之個體中單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合投與之OX40.21的初步抗腫瘤活性；表徵單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合投與之OX40.21的PK；及表徵單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合投與之OX40.21的免疫原性及與OX40.21一起投與之尼沃魯單抗或伊匹單抗的免疫原性。其他探索性目的包括探索在治療之前及在單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合投與OX40.21之後腫瘤生檢樣品及末梢血中抗腫瘤活性與選擇生物標記量 度之間之潛在相關性；評估OX40.21單一療法及組合療法對QTc間隔之潛在效應；表徵接受尼沃魯單抗與OX40.21之組合之個體中之尼沃魯單抗PK；表徵接受伊匹單抗與OX40.21之組合之個體中之伊匹單抗PK；評估經OX40.21單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合治療之個體之整體存活(OS)；及探索經OX40.21單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合治療之個體中劑量/暴露與抗腫瘤活性、藥效學(PD)效應(末梢血及腫瘤生檢樣品中之選擇生物標記)及關鍵安全性量度之間的潛在關係。
2.研究設計及持續時間
此係患有晚期實體腫瘤之個體中OX40.21之1/2a期開放標記研究，其整合初始OX40.21單一療法與隨後尼沃魯單抗或伊匹單抗組合療法。
研究部分(劑量遞增及劑量及劑量擴展)係以基於研究突現之安全性、PK及PD數據之分期方法進行。研究之第一部分始於OX40.21單一療法劑量遞增隊列。前3個單一療法劑量隊列之臨床數據用作起始OX40.21與尼沃魯單抗之組合之劑量遞增的基礎。除OX40.21與尼沃魯單抗之組合之第一隊列之臨床數據外，前3個單一療法劑量隊列之臨床數據亦用作起始OX40.21與伊匹單抗之組合之劑量遞增的基礎。在確立劑量遞增部分中OX40.21之可耐受及藥理學活性RP2D後，特定腫瘤隊列中之起始劑量擴展。
3.劑量遞增
部分1A之研究設計之示意圖示於圖42中。
研究之劑量遞增期評估單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合之OX40.21在患有晚期實體腫瘤之個體中之安全性及耐受性。
OX40.21之初始劑量值係20mg。後續劑量之劑量遞增決定係基於使用BLRM模型(對於OX40.21單一療法)或BLRM(-Copula)模型(對 於OX40.21與尼沃魯單抗或伊匹單抗之組合)之DLT。對於單一療法及組合療法劑量遞增部分二者，DLT時段係28天。DLT比率係基於在DLT時段內出現且不可鑑別替代性原因之AE之發病率、嚴重程度及持續時間來測定。下一單一療法隊列之劑量選擇/劑量值慮及BLRM(-Copula)建議以及來自所有經治療個體之所有可用PK、PD及臨床及實驗室安全性數據。使用自部分1A獲得之數據(包括臨床及實驗室安全性評估、PK/PD數據)及在Bayesian階層式建模框架內藉由納入OX40.21(部分1A)及尼沃魯單抗(CA209-003)二者之單一試劑毒性性質對建議進行建模測定部分2A之OX40.21之開始劑量選擇。使用自部分1A及2A獲得之數據(包括臨床及實驗室安全性評估、PK/PD數據)及在Bayesian建模框架內藉由納入OX40.21(部分1A)及伊匹單抗(CA184-022)二者之單一試劑毒性性質對建議進行建模測定部分3A之OX40.21之開始劑量選擇。實際劑量可根據BLRM(-Copula)修飾，但不超過先前所測試劑量之兩倍。
在所有劑量隊列之劑量遞增期間，在用研究藥物治療該隊列中之其他個體之前，觀察初始個體(標記個體)5天。
約30個個體入選每一劑量遞增部分。每一劑量遞增隊列中個體之數目根據BLRM(-Copula)建議變化。最初，以開始劑量值之OX40.21或OX40.21與尼沃魯單抗或伊匹單抗之組合治療約3個個體。在劑量遞增期期間根據BLRM(-Copula)以推薦劑量治療約3個可評估個體之其他隊列。以MTD治療至少6個DLT可評估個體。
部分1A：入選在部分1A、OX40.21單一療法劑量遞增中開始。部分1A之OX40.21之初始劑量係20mg，預計後續劑量為40mg、80mg、160mg及320mg。實際劑量可根據BLRM修飾，但不超過先前所測試劑量之兩倍。
部分2A：部分2A係OX40.21與尼沃魯單抗之組合臂，其在發現 可耐受單一療法劑量遞增中之至少3個劑量值或在單一療法劑量遞增(部分1A)中測定MTD後起始。部分2A中之OX40.21之開始劑量係低於展示可在部分1A中耐受之劑量之至少1個劑量值，以確保組合之進一步安全性。部分2A中之OX40.21之劑量絕不超過部分1A中之最高耐受劑量。尼沃魯單抗係以240mg之平坦劑量投與。每一治療週期係2週長且在每一週期之第1天開始每2週投與研究藥物達至多12個週期。
部分3A：部分3A係OX40.21與伊匹單抗之組合臂，其僅在發現可耐受單一療法劑量遞增中之至少3個劑量值或在單一療法劑量遞增(部分1A)中測定MTD且發現OX40.21與尼沃魯單抗劑量遞增部分中可耐受至少1個劑量隊列後起始。部分3A中之OX40.21之開始劑量係低於展示可在部分1A中耐受之劑量之至少1個劑量值。部分3A中之OX40.21之劑量絕不超過部分1A中之最高耐受劑量，以進一步確保經治療個體中組合劑量之安全性。伊匹單抗係以1mg/kg之劑量投與。每一治療週期係3週長。OX40.21係在第1週期第1天開始每3週投與至多且包括8個週期，且伊匹單抗係在第1天開始每3週投與達4個週期。僅OX40.21係在後4個週期中投與。
劑量擴展：
在基於來自劑量遞增(部分1A、2A及3A)之可用臨床安全性(DLT、在DLT時段後出現之顯著AE)、PK、PD及建模數據之總數的評估來測定MTD/RP2D時，起始劑量擴展隊列中之治療。在所有劑量擴展隊列中治療約110個個體。
部分1B係在部分1A中測定之MTD/RP2D下之患有子宮頸癌之個體中之OX40.21單一療法劑量擴展隊列。OX40.21之投用在每一週期之第1天開始且每2週投與達至多12個週期。在此擴展隊列中治療約12個個體。
部分2B係在部分2A中測定之MTD/RP2D下之患有CRC之個體中 的組合療法(OX40.21與尼沃魯單抗)劑量擴展部分。尼沃魯單抗係以240mg之平坦劑量投與。每一治療週期係2週長且在每一週期之第1天開始每2週投與研究藥物達至多12個週期。在此擴展隊列中治療約35個個體。
部分2C係在部分2A中測定之MTD/RP2D下之患有BC之個體中的組合療法(OX40.21與尼沃魯單抗)劑量擴展部分。每一治療週期係2週長且在每一週期之第1天開始每2週投與研究藥物達至多12個週期。在此擴展隊列中治療約27個個體。
部分3B係在部分3A中測定之MTD/RP2D下之患有OC之個體中的組合療法(OX40.21與伊匹單抗)劑量擴展部分。每一治療週期係3週長。在初始4個週期中投與伊匹單抗與OX40.21之組合。隨後個體繼續OX40.21單一療法至多額外4個週期，總共至多24週(8個週期)治療。在此擴展隊列中治療約35個患有OC總共個體。
研究時段之概述：
在研究中個體完成至多5個時段：篩選(至多28天)、治療(至多24週)、安全性隨訪(最少100天)、反應隨訪及存活長期隨訪(自第一劑量至多約2年)，如下文所述。研究拜訪示意圖提供於圖43中。
篩選時段：
篩選時段持續至多28天。篩選時段以確立個體之初始合格性及簽署知情同意書開始。使用交互反應技術(IRT)入選個體。
治療時段：
治療時段由至多24週投藥組成。在每一治療週期後，基於風險/益處及腫瘤評估決定用至多24週治療之下一週期之研究療法治療個體。對於每2週(q2w)投藥方案每8週實施腫瘤評估且對於每3週(q3w)投藥方案每9週實施腫瘤評估。在初始評估後至少4週確認對部分反應(PR)及完全反應(CR)之評估。使用實體腫瘤中之反應評估準則 (RECIST)v1.1評估腫瘤進展或反應終點。
在給定週期結束時具有穩定疾病(SD)、PR或CR之反應之個體繼續下一治療週期。通常使個體繼續研究療法直至首先出現以下中之一者：1)完成最大數目之週期；2)進展性疾病；3)臨床劣化，表明不可自治療獲得進一步益處；4)對療法不耐受性；或5)滿足中斷研究療法之準則。
安全性隨訪：
在完成研究療法後，個體進入安全性隨訪期。在治療結束(EOT)拜訪時，在療法之最後劑量後，評估個體之任何新不良事件(AE)達至少100天。隨訪拜訪發生在最後劑量後第30、60及100天或中斷日期。個體(撤回同意研究參與之彼等除外)完成3次臨床安全性隨訪拜訪，而與其是否開始新抗癌症療法無關。
存活隨訪：
在完成安全性隨訪期後，個體進入存活隨訪期。約每3個月(12週)隨訪個體，直至死亡、失訪、撤回同意書或結束研究，以先達到者為準。此期之持續時間係在研究藥物之第一劑量後至多2年。
反應隨訪：
在完成安全性隨訪期後，在EOT拜訪時所有具有進行性SD、PR或CR之個體皆進入反應隨訪期，其與存活隨訪期同時發生。在反應隨訪期期間或直至疾病進展或撤回研究同意書，該等個體每3個月(12週)繼續進行放射學及臨床腫瘤評估。在個體完成研究之存活期後，繼續收集具有進行性臨床益處之個體之放射學腫瘤評估。不評估在研究療法之初始過程後具有疾病進展之個體之超出EOT拜訪之反應，且若需要，使其接受其他腫瘤引導之療法。
研究之持續時間：
任何個別個體之研究時間之總持續時間係約2年。在最後個體完 成其最後研究拜訪時(其係在研究開始後約4年)，研究結束。
個體之數目：
入選約225個個體，且研究中治療約200個個體。
研究群體：
個體至少18歲且具有惡性病之組織學或細胞學確認，根據RECIST v1.1，該惡性病係具有可量測疾病之晚期(轉移、復發、難治及/或不可切除)的。
劑量遞增及停止規則
在部分1A、2A及3A中，在DLT資訊可用於個體之每一隊列後，針對劑量遞增建議利用BLRM及BLRM(-Copula)模型。下一隊列之OX40.21劑量選擇/劑量值慮及BLRM(-Copula)建議以及臨床建議及來自所有經治療個體之所有可用PK、PD及臨床及實驗室安全性數據。
劑量限制性毒性
為引導劑量遞增，基於未鑑別明確替代性原因之AE之發病率、強度及持續時間定義DLT。DLT時段係研究藥物起始之28天。對於個體管控，滿足DLT準則之AE(與其所發生之週期無關)導致研究藥物中斷。在DLT評估間隔期間出於DLT除外之原因撤出研究之個體可經新個體以相同劑量值置換。DLT評估時段期間DLT之發生率用於劑量遞增決定中且用於定義MTD。若在DLT時段後出現之AE經測定無明確替代性原因且與疾病進展無關，則出於定義MTD之目的，考慮該等AE。經歷DLT之個體未經研究藥物再治療且進入研究之安全性隨訪期。根據國家癌症研究所(National Cancer Institute)(NCI)常見不良事件評估準則(Terminology Criteria for Adverse Events)(CTCAE)v4.03對AE進行分級。
非血液學DLT：
A.肝DLT
‧AST、ALT或總膽紅素升高任何
Figure 105116545-A0202-12-0253-767
3級
‧AST、ALT或總膽紅素，
‧具有症狀性肝發炎(例如，右上象限壓痛、黃疸、瘙癢)之2級AST或ALT
‧AST或ALT>3×ULN及並行總膽紅素>2×ULN，而無膽汁淤積(升高血清鹼性磷酸酶[ALP])之初始發現(例如，與潛在藥物誘導之肝損傷或pDILI之Hy定律或或FDA定義一致之發現)
B.非肝DLT
‧2或更大級眼色素層炎、上鞏膜炎或虹膜炎
‧任何其他2級眼疼痛或視力模糊，其對局部療法無反應且在2週內不改良至1級嚴重性或需要全身治療
‧3或更大級肺炎、支氣管痙攣、神經病學毒性、過敏性反應或輸注反應
‧考慮任何3或更大級非皮膚、非肝毒性之DLT，具有以下具體例外：
‧3級或4級電解質異常，其不因相關臨床不利經歷而變複雜，持續小於72小時，且自發消退或對習用醫學干預有反應
‧3級噁心、嘔吐或腹瀉，其持續小於72小時，且自發消退或對習用醫學干預有反應
‧與胰臟炎之臨床或放射照相證據無關之澱粉酶或脂肪酶之3或4級升高
‧與血液動力學受損(例如，低血壓、受損末端器官灌注之臨床或實驗室)無關之經分離3級發熱
‧3級內分泌病，其藉由激素補充得到良好控制
‧3級腫瘤加劇(定義為定位至已知或懷疑腫瘤之位點之疼痛、刺激或疹)
‧3級疲勞，持續小於7天
‧3級輸注反應，其在小於6小時內恢復至1級
皮膚DLT
‧4級疹
‧若在1至2週輸注延遲後無改良(即，消退至
Figure 105116545-A0202-12-0254-768
1級)，則3級疹在2級皮膚毒性存在下，尚未經歷3級皮膚AE之個體可重新開始治療。
血液學DLT
‧在持續時間內4級嗜中性球減少症
Figure 105116545-A0202-12-0254-769
5天
‧具有臨床顯著出血或血小板輸血之任何需求之4級血小板減 少症或3級血小板減少症
‧不由潛在疾病解釋之4級貧血
‧4級發熱性嗜中性球減少症
‧持續>48小時之3級發熱性嗜中性球減少症
‧
Figure 105116545-A0202-12-0254-770
3級溶血(即，需要輸血或醫學干預，例如類固醇)
超出24週利用額外週期之治療
將個體治療24週，除非更早滿足研究藥物中斷之準則。在風險/益處評估有利於繼續投與研究療法時，完成進行性疾病控制(CR、PR或SD)之約24週治療的個體對於超出初始24週之單一療法(部分1)及組合療法(部分2及3)中的額外24週研究療法合格。在完成額外24週研究療法後，個體進入安全性隨訪期。
進展後之治療
在確定風險/益處評估有利於繼續投與研究療法後，在具有初始RECIST v1.1之選擇個體中進行進展後之治療-定義進展性疾病(例如，個體繼續經歷臨床益處、耐受治療並滿足其他準則)。
再治療
若在反應隨訪期期間出現確認疾病進展，則進行再治療。完成約24週(若適當，或額外治療週期)療法且以進行性疾病控制(CR、PR或SD)而無任何顯著毒性進入反應隨訪期的個體對於再治療合格。在評估及確定風險/益處比是否支持其他研究療法之投與後，該等個體在個案基礎(case-by-case basis)上對於再治療合格，且個體繼續滿足研究療法治療之合格性準則。利用最初分配之單一療法或組合療法方案(例如，與前24週期間所投與相同之劑量及劑量排程表)治療滿足再治療之準則之個體，除非隨後發現該劑量及排程表超過MTD，在該情形下，以認為可耐受/安全之下一較低劑量治療個體。
納入準則
1)簽署書面知情同意書
a)在實施不被視為SOC之部分之任何研究相關程序之前，個體必須簽署知情同意書。
b)同意腫瘤生檢試樣(劑量擴展隊列及添加至先前完成劑量遞增隊列中之任一者及對於劑量遞增隊列可選之其他個體需要強制性治療前及治療時生檢).
2)靶群體
個體必須至少18歲且具有惡性病之組織學或細胞學確認，根據RECIST v1.1，該惡性病係具有可量測疾病之晚期(轉移、復發、難治及/或不可切除)的。
A.劑量遞增：
在晚期或轉移設定中，個體必須已接受至少1個標準治療方案，且隨後進展，或對於該至少1個標準治療方案難治或不耐受(若該療法存在)。容許對於任何標準療法不合格之個體入選，限制條件係醫學記錄中記載其不合格性。允許以下腫瘤組織學，只是患有原發性中樞神經系統(CNS)腫瘤或具有CNS轉移作為唯一活躍疾病位點之個體除 外。
(i)黑色素瘤：若已知，必須記載BRAF突變狀態。
(ii)NSCLC：若已知，必須記載EGFR、ALK、KRAS及ROS1突變狀態
(iii)頭頸癌限於鱗狀細胞癌。若已知，必須記載HPV狀態
(iv)泌尿生殖道之移行細胞癌
(v)腎細胞癌
(vi)胰臟腺癌
(vii)CRC：若已知，必須記載MSI、KRAS及BRAF狀態。
(viii)子宮頸癌：若已知，必須記載HPV狀態。
(ix)必須記載三陰性乳癌HER2、ER及PR狀態
(x)子宮內膜之腺癌
(xi)卵巢癌
(xii)前列腺腺癌
(xiii)肝細胞癌-僅Child Pugh A
(xiv)小細胞肺癌
(xv)胃及胃食管結合部癌：若已知，必須記載HER2狀態。
B.劑量擴展：部分1B、2B、2C及3B
將允許以下腫瘤類型：
(a)子宮頸癌-部分1B
(i)不可切除、伴隨記載疾病進展轉移或復發之組織學確認之子宮頸癌
(ii)若已知，記載腫瘤HPV狀態。若未知，個別必須同意測試其提交存檔腫瘤組織試樣(塊或未染色載玻片)。
(iii)先前療法要求：1.對於轉移及/或不可切除疾病，必須已接受至少1個標準全身 性療法(例如，太平洋紫杉醇/順鉑、太平洋紫杉醇/順鉑/貝伐珠單抗)且隨後進展或對該至少1個標準全身性療法不耐受或難治。在完成輻射療法後給予且與主要輻射及輔助化學療法一起投與之並行化學療法不當作全身性化學療法方案。
(b)結腸直腸癌-部分2B
(i)伴隨記載疾病進展轉移或復發之組織學確認之CRC
(ii)若已知，記載MSI、MMR、KRAS及BRAF狀態。若未知，個別必須同意測試其提交存檔腫瘤組織試樣(塊或未染色載玻片)。
(iii)先前療法要求：對於轉移及/或不可切除疾病(或在輔助療法之6個月內進展)，個體必須已接受至少1個標準全身性療法且隨後進展或對該至少1個標準全身性療法不耐受或難治。
(c)膀胱癌-部分2C
(i)具有進展或難治性疾病之腎骨盆、輸尿管、膀胱或尿道之組織學或細胞學確認之泌尿道上皮癌(包括具有其他亞型之元素之泌尿道上皮癌之混合組織學)
(ii)先前療法要求：對於轉移(IV期)或局部晚期不可切除疾病之治療，個體必須已接受至少1個標準全身性療法(例如，基於鉑之化學療法)方案且隨後進展或對於該方案不耐受或難治。
(d)卵巢-部分3B
(i)具有記載疾病進展之組織學或細胞學確認之卵巢癌(包括上皮OC、原發性腹膜或輸卵管癌)
(ii)若已知，記載種系BRCA突變狀態。若未知，個別必須同意測試其提交存檔腫瘤組織試樣(塊或未染色載玻片)。
(iii)先前療法要求： 對於轉移及/或不可切除疾病，個體必須已接受至少1個標準全身性療法(例如，基於鉑之化學療法)且隨後進展或對該至少1個標準全身性療法不耐受或難治。
3)美國東岸癌症臨床研究合作組織(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體能狀態
Figure 105116545-A0202-12-0258-771
1。
4)存在至少1個病灶與可量測疾病，如藉由RECIST v 1.1所定義用於反應評估。允許作為可量測疾病之唯一位點之先前經輻照領域中具有病灶之個體入選，限制條件係病灶已展示明確進展且可精確量測。
5)對於需要新鮮腫瘤生檢之個體，除反應評估所需之最少一個RECIST v 1.1可量測病灶外，個體必須具有至少一個病灶可用於治療前及治療時生檢。此病灶需要不同於所評估指數病灶用於放射學反應。
6)在自最終治療大於4週之任何時間之洗滌時段後，允許先前暴露於利用任何尤其靶向檢查點路徑抑制之試劑(例如抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2、抗LAG-3及抗CTLA-4抗體)之療法的個體
注意：(i)經歷先前1至2級檢查點療法相關之免疫介導之AE的個體必須確認在研究進入時自該等時間恢復，經補充物治療之內分泌病除外，如藉由所有相關臨床症狀、在體檢時之異常發現及/或相關實驗室異常消退所記載。若適用，截止在開始研究療法治療前最少14天，該等個體必須亦完成類固醇漸減用於治療該等AE。(ii)在與醫療監測者討論後，將在個案基礎上考慮具有先前
Figure 105116545-A0202-12-0258-772
3級檢查點療法相關免疫AE之個體之合格性(例如，允許無胰臟炎之臨床或放射學特徵之症狀性分離3級脂肪酶升高入選)。
7)在自最終治療大於4週之任何時間之洗滌時段後，允許利用任何尤其靶向T細胞共刺激路徑之試劑(抗OX40抗體、抗CD 137、抗 GITR抗體及抗CD27除外)之先前療法的個體。
8)必須在研究藥物之第一劑量之前之至少2週完成先前姑息性放射療法。強烈鼓勵在基線處具有症狀性腫瘤病灶且在研究藥物之第一劑量之4週內可能需要姑息性放射療法之個體在入選之前接受姑息性放射療法。
9)入選劑量遞增及擴展隊列之個體必須同意獲取現存福馬林固定、石蠟包埋(FFPE)之腫瘤組織，塊或最少15個未染色載玻片(較佳25個載玻片)，用於實施相關研究。若存檔試樣不可用，則個體必須同意治療前腫瘤生檢。不能提供存檔腫瘤樣品且不同意治療前腫瘤生檢或不具有可及病灶之個體不合格。(然而，治療前生檢所產生組織之量或品質不足之個體不會僅基於此而不合格)。對於添加至先前完成之劑量遞增隊列之任何其他個體，需要強制性治療前及治療時生檢。
10)需要入選劑量擴展或添加至任何先前完成之劑量遞增隊列之個體在可接受之臨床風險下經歷強制性治療前及治療時生檢。(a)實體腫瘤組織樣品必須為粗針可切除或切開之生檢。認為細針生檢(利用細胞離心塗片器引流胸膜滲出液)或衝壓生檢對於生物標記綜述不足。不具有軟組織組份或脫鈣骨腫瘤樣品之骨病灶之生檢亦不可接受，(b)生檢病灶應不同於所評估指數病灶用於放射學反應
11)對於個體不足之器官功能，如藉由以下所定義：
(a)嗜中性球
Figure 105116545-A0202-12-0259-773
1500/μL(在首次研究藥物投與之4週內穩定，關閉任何生長因子)
(b)血小板
Figure 105116545-A0202-12-0259-774
80×103/μL(在首次研究藥物投與之2週內不允許輸血以達成此程度)
(c)血紅素
Figure 105116545-A0202-12-0259-775
8g/dL(在首次研究藥物投與之2週內不允許輸血以達成此程度)
(d)ALT及AST
Figure 105116545-A0202-12-0260-776
3×正常值上限(ULN)
(e)總膽紅素
Figure 105116545-A0202-12-0260-777
1.5×ULN(具有吉伯特氏症候群(Gilbert's Syndrome)且必須具有正常直接膽紅素之個體除外)
(f)根據研究者評估，正常甲狀腺功能或在激素補充時穩定
(g)白蛋白
Figure 105116545-A0202-12-0260-778
2mg/dl
(h)血清肌酸酐
Figure 105116545-A0202-12-0260-779
1.5×ULN或肌酸酐清除率(CrCl)
Figure 105116545-A0202-12-0260-780
40ml/min(使用以下Cockcroft-Gault式量測)：雌性CrCl=(140-年齡(歲))×重量(kg)×0.85
72×血清肌酸酐(mg/dL)
雄性CrCl=(140-年齡(歲))×重量(kg)×1.00
72×血清肌酸酐(mg/dL)
12)能夠遵守治療、PK及PD試樣收集及需要研究隨訪
年齡及生殖狀態
a)男性及女性，在知情同意書時年齡
Figure 105116545-A0202-12-0260-781
18歲。
b)在開始研究藥物之前之24小時內，育齡女性(WOCBP)必須具有陰性血清或尿液懷孕測試(最小靈敏性25IU/L或等效單位之人類絨促性素[hCG])。
c)女性必須未哺乳。
d)WOCBP必須同意遵循避孕方法之說明達研究藥物OX40.21治療之持續時間加上研究藥物之5個半衰期加上30天。此持續時間對於部分1及3個體應為12週(50天加上30天)或對於部分2個體為23週(130天加上30天[排卵週期之持續時間])，完成治療後總共高達160天。
e)與WOCBP有性行為之男性必須同意遵循避孕方法之說明達研究藥物OX40.21治療之持續時間加上研究藥物之5個半衰期加上90天。持續時間應為20週(對於部分1及3個體，50天加上90天)或31週(對於部分2個體，130天完成)。另外，雄性個體必須願意在此時間期間 避免捐精。
f)無精子雄性免除避孕需求。連續無異性性交之WOCBP亦免除避孕需求，但仍經歷懷孕測試。
排除準則
1)靶疾病例外
a)排除具有已知或懷疑CNS轉移或未經治療CNS轉移、或CNS作為疾病之唯一位點之個體。然而，容許腦轉移得到控制之個體入選。受控腦轉移定義為在輻射及/或手術治療後至少4週(或若臨床上指示無干預，則觀察4週)無放射照相進展，且脫離類固醇至少2週，且無新的或進行性神經病學體徵及症狀。
b)患有癌性腦膜炎之個體
c)對於卵巢癌：
i)排除在前6個月內具有腸梗塞史或利用Tenckhoff導管之卵巢癌個體。
ii)允許高達4個先前抗癌治療(即，化學療法、放射療法、激素或免疫療法)。在藥物假期後重新開始相同方案可視為一個方案；然而，若之間使用任何其他方案，則其應當作兩個方案。
2)病歷及並行疾病
a)排除在研究進入之前小於2年內經診斷患有先前惡性病(不同於用於入選此研究中者)之個體(非黑色素瘤皮膚癌及原位癌(例如膀胱、結腸、子宮頸/發育不良、黑色素瘤或乳房)除外)。另外，在超過2年以前診斷有其他第二惡性病且以治癒性目的接受療法而在間隔期間無疾病之證據且被視為出現低復發風險之個體係合格的。
b)需要並行干預之其他活動性惡性病
c)先前器官同種異體移植
d)先前治療：
i)允許先前抗癌治療(即化學療法、放射療法、激素或免疫療法)
ii)與先前抗癌症療法及/或手術相關之毒性(脫髪除非)必須已消退、恢復至基線或1級或認為不可逆
iii)對於細胞毒性劑，先前抗癌症療法之最後劑量與起始研究療法之間必須已過去至少4週
iv)對於非細胞毒性劑，自先前抗癌症療法之最後劑量與起始研究療法必須已過去至少4週或5個半衰期(以較短者為準)。
e)利用抗OX40抗體之先前療法
f)排除具有活動性、已知或懷疑自體免疫疾病之個體。允許患有白斑病、1型糖尿病、由於自體免疫病況所致且僅需要激素補充之殘餘甲狀腺功能減退之個體、具有葛雷夫斯氏病(Grave's disease)(在研究藥物之第一劑量之前，患有懷疑自體免疫甲狀腺病症之個體必須對甲狀腺球蛋白及甲狀腺過氧化酶抗體及甲狀腺刺激免疫球蛋白呈陰性)、無需全身治療之牛皮癬、或預計在不存在外部觸發下不復發之病況之歷史之甲狀腺機能正常之個體入選。氣喘及/或輕度過敏性鼻炎(季節性過敏)得到充分控制之個體係合格的。
g)具有與先前免疫療法(例如，抗CTLA-4或抗PD-1/PD-L1治療或尤其靶向T細胞共刺激或免疫檢查點路徑之任何其他抗體或藥物)相關之威脅生命之毒性之歷史的個體，不可能隨標準對抗措施(例如，腎上腺危象後補充激素)復發者除外。
h)患有症狀性或可干擾懷疑藥物相關肺毒性之檢測或管控的間質肺病之個體
i)需要大於10mg/天之普賴松或等效物之劑量之複現類固醇加強或長期類固醇的慢性阻塞性肺病
j)患有在研究藥物投與之14天內需要利用皮質類固醇(>10mg每日普賴松等效物)或其他免疫抑制醫藥全身治療之病況的個體，在不 存在活動性自體免疫疾病下腎上腺補充類固醇劑量>10mg每日普賴松等效物除外。注意：允許之起始研究藥物之前至多7天之短過程之類固醇治療(<5天)。
k)不受控或顯著心血管疾病，包括(但不限於)以下中之任一者：
i)在過去6個月內心肌梗塞或中風/暫時性腦缺血發作
ii)在過去3個月內不受控心絞痛
iii)臨床上顯著之心律不整(例如室性心動過速、心室震顫或尖端扭轉型室性心動過速)之任何歷史
iv)其他臨床上顯著之心臟病(例如，心肌病、紐約心臟學會(New York Heart Association)功能分類III-IV之鬱血性心臟衰竭、心包炎、顯著心包滲出液)之歷史
v)每日補充氧療法之心血管疾病相關之需求
vi)使用Fridericia式(QTcF)延長>480msec針對心率校正QT間隔
1)任何慢性肝炎之歷史，如藉由以下所證明：
i)對於B型肝炎表明抗原陽性測試
ii)對於定性C型肝炎病毒負荷陽性測定(藉由PCR)
注意：藉由PCR具有陽性C型肝炎抗體及陰性定量C型肝炎之個體係合格的。消退A型肝炎病毒感染之歷史並非排除準則。允許根據機構指南以排除感染之其他測試或取代測試。
m)需要在起始研究藥物療法之前
Figure 105116545-A0202-12-0263-782
7天全身抗細菌、抗病毒或抗真菌劑療法之活動性感染之證據(不適於經推測與研究進入所需之潛在腫瘤類型相關的病毒感染)
n)對HIV或已知獲得性免疫缺失症候群測試呈陽性之已知歷史
o)活動性或潛在結核病感染(包括最近轉化成陽性之PPD)之證據或歷史；具有感染性浸潤之證據之胸部x射線；最近無法解釋之發熱/ 寒冷型式之變化。
p)在研究藥物投與之4週內任何大手術。在研究藥物之第一劑量之前至少14天，個體必須已自大手術或嚴重創傷性損傷之效應恢復。
q)在研究藥物之前4週內使用含有活病毒之非腫瘤疫苗用於預防傳染病。允許使用不活化季節性流行性感冒疫苗，例如Fluzone®。
r)在研究藥物之第一劑量之前之2週內使用pRBC或血小板輸血
s)可使得研究藥物之投與對個體有危險或可不利地影響個體遵守或耐受研究之能力的已知或潛在醫學或精神病學病況及/或社會原因。
3)過敏及不利藥物反應
a)對尼沃魯單抗或伊匹單抗(分別僅部分2及3)過敏之歷史
b)對先前抗癌免疫調節療法(例如，檢查點抑制劑、T細胞共刺激抗體)任何顯著藥物過敏(例如過敏反應或肝毒性)的歷史
研究評估：
貫穿投藥間隔在所選時間實施體檢、生命徵象量測、12導線心電圖(ECG)及臨床實驗室評估。貫穿研究密切監測個體之AE。
‧安全性評估：在研究期間並在最後治療後持續100天評估AE。根據NCI CTCAE v4.03評估AE。隨訪個體直至所有治療相關之AE恢復至基線或認為不可逆。
‧效能評估：在基線及對於q2w投藥方案每8週(±1週)及對於q3w投藥方案每9週(±1週)、隨後在治療及反應隨訪期期間直至中斷治療或退出研究每12週實施利用CT及/或MRI(若適當)之疾病評估。若存在關於腫瘤進展之問題，則實施其他時間點時之腫瘤評估。對於患有惡性腫瘤之個體，根據RECIST v1.1評估腫瘤反應。
‧藥物動力學及免疫原性評估：對於接受單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合之OX40.21之個體，收集用於PK及免疫原性評估之 試樣。藉由非分室分析(NCA)方法表徵OX40.21之PK。藉由驗證免疫分析針對抗OX40.21抗體及/或抗尼沃魯單抗抗體及/或抗伊匹單抗抗體分析免疫原性試樣。
‧探索性生物標記評估：為探索與劑量及PK相關之對OX40.21之臨床反應之潛在預測標記物，自所有個體獲得3種類型之樣品用於生物標記測試：(i)全血、(ii)血清/血漿及(iii)腫瘤組織。
統計考慮 樣本大小測試 劑量遞增：
作為1期劑量遞增試驗，每一劑量遞增隊列之樣本大小取決於觀察毒性及後驗推斷。在每一劑量遞增部分(OX40.21單一療法[部分1A]、OX40.21與尼沃魯單抗組合[部分2A]及OX40.21與伊匹單抗組合[部分3A])期間治療約30個個體，在部分1A、2A及3A中組合總共約90個個體。最初，以OX40.21或OX40.21與尼沃魯單抗或伊匹單抗之組合之開始劑量值治療約3個個體。在劑量遞增期期間根據BLRM(-Copula)建議以推薦劑量值治療約3個可評估個體之其他隊列。以MTD治療至少6個DLT可評估個體。
劑量擴展：
在一般意義上，擴展期長度估計係基於靶反應比率(靶整體反應比率)及鑑別高於護理標準之該臨床反應之信號的能力(歷史整體反應比率)。
在部分1B劑量擴展隊列中治療約12個個體。在部分2B劑量擴展隊列中治療約35個個體。在部分2C劑量擴展隊列中治療約27個個體。在部分3B劑量擴展隊列中治療約35個個體。
終點 主要終點
安全性之評估係基於AE、嚴重AE、導致中斷之AE及死亡之發病率。另外，檢查臨床實驗室測試異常。
次要終點
效能：藉由基於RECIST v1.1之24週時之ORR、反應之持續時間及無進展存活率(PFSR)量測單獨OX40.21及OX40.21與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合之抗腫瘤活性。上述係基於以下時出現之腫瘤量測來測定：基線、在治療時段期間對於q2w投藥方案每8週(±1週)及對於q3w投藥方案每9週(±1週)及在存活隨訪期期間每3個月(12週)。
‧根據RECIST 1.1準則評估最佳整體反應(BOR)。
‧ORR係BOR係CR或PR之所有經治療個體之比例。
‧針對具有CR或PR之BOR之所有經治療個體計算之反應之持續時間係第一反應之日期與疾病進展或死亡之日期(以先達到者為準)之間之時間。
‧24週時之PFSR定義為在24週時保持無進展且存活之經治療個體的比例。藉由Kaplan-Meier估計(其慮及被檢查過之數據)計算該比例。
藥物動力學
對於單一療法或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合，端視排程表在2個週期中評估選擇參數(例如Cmax、Tmax、AUC(0-t)及AUC(TAU))。在收集廣泛PK時，在第二週期中評估參數(例如Ctau、CLT、Css-avg、累積指數(AI)及有效消除半衰期(T-HALFeff)。
免疫原性
藉由對OX40.21或尼沃魯單抗或伊匹單抗陽性ADA之頻率評估免疫原性之次要目的。
探索性終點
藉由特定時間點(例如，2年)時之OS比率評估與OS相關之探索性 目的。OS比率係在該時間點時存活個體之比例。個體之OS定義為自研究醫藥之第一劑量之日期至因任何原因死亡之日期的時間。藉由自末梢血(例如，可溶性因子，包括但不限於細胞介素及趨化介素)或腫瘤組織(例如，腫瘤浸潤淋巴球)中之基線或基線水準生物標記量測的變化評估與生物標記相關之探索性目的。
對於進行多次ECG量測之個體，視情況評估以下參數：自基線之ECG間隔QT、QTc、QRS及P-R間隔變化。
分析
安全性分析：依據系統器官分類、優先項及治療列舉所記錄之所有AE並將其製表。藉由治療列表並概述生命徵象及臨床實驗室測試結果。亦注意任何顯著體檢發現及臨床實驗室結果。評估ECG讀數，且注意異常(若存在)。
效能分析：由每一臂及劑量值中之個體及研究天提供腫瘤量測之清單。基於RECIST 1.1列舉個別個體之BOR。為闡述單獨或與尼沃魯單抗或伊匹單抗組合之OX40.21之抗腫瘤活性，計算ORR。藉由治療及/或劑量值及腫瘤類型提供藉由Clopper-Pearson方法之ORR及相應2側95% CI。藉由治療及/或劑量值及腫瘤類型提供反應之中值持續時間及相應2側95% CI。使用Kaplan-Meier方法分析反應之持續時間。另外，藉由Kaplan-Meier方法藉由治療、腫瘤類型及劑量值估計PFSR(即個體保持無進展或存活至24週之機率)。相應95% CI係基於Greenwood式衍生。使用Kaplan-Meier方法繪示OS之曲線。報告中值OS及相應2側95% CI。
藥物動力學分析：針對每一分析物列舉所有個別PK參數，包括任何排除及自概述排除之原因。藉由治療針對每一PK參數將概述統計學製表。針對Cmax、AUC(0-t)、AUC(TAU)、Ctau、CLT、Cssavg及AI提供幾何平均值及變異係數。針對Tmax提供中值及範圍。針對 所有其他PK參數(例如，T-HALFeff)提供平均值及標準偏差。
在劑量遞增單一療法中評估OX40.21劑量依賴性。為闡述對OX40.21之劑量之依賴性，針對量測之每一天提供Cmax、AUC(0-t)及AUC(TAU)對劑量之散佈圖。基於功率模型及功率係數周圍之CI探索性評估劑量比例。使用概述統計學藉由治療及研究天將尼沃魯單抗及伊匹單抗輸注結束及波谷(C波谷)濃度及OX40.21波谷濃度製表。亦可將該等數據與其他數據集彙集在一起用於群體PK分析。
免疫原性分析：藉由治療、劑量及免疫原性狀態提供所有可用免疫原性數據。測定具有OX40.21、尼沃魯單抗及伊匹單抗之陽性ADA評估之個體的頻率。
探索性生物標記分析：藉由每一臂中之計劃研究天及劑量將生物標記之概述統計學及其自基線之相應變化(或變化%)製表。以圖表方式表示生物標記量度之時程。若存在隨時間有意義之型式之指示，則實施進一步分析(例如，藉由線性混合模型)以表徵關係。使用諸如但不限於邏輯式回歸等方法以探索來自末梢血或腫瘤生檢之生物標記量度與臨床結果之間的可能相關性。
Figure 105116545-A0202-12-0268-47
Figure 105116545-A0202-12-0269-48
Figure 105116545-A0202-12-0270-49
Figure 105116545-A0202-12-0271-50
Figure 105116545-A0202-12-0272-51
Figure 105116545-A0202-12-0273-52
Figure 105116545-A0202-12-0274-53
Figure 105116545-A0202-12-0275-54
Figure 105116545-A0202-12-0276-55
Figure 105116545-A0202-12-0277-56
Figure 105116545-A0202-12-0278-57
Figure 105116545-A0202-12-0279-58
Figure 105116545-A0202-12-0280-59
Figure 105116545-A0202-12-0281-60
Figure 105116545-A0202-12-0282-61
Figure 105116545-A0202-12-0283-62
Figure 105116545-A0202-12-0284-63
Figure 105116545-A0202-12-0285-64
Figure 105116545-A0202-12-0286-65
Figure 105116545-A0202-12-0287-66
Figure 105116545-A0202-12-0288-67
Figure 105116545-A0202-12-0289-68
Figure 105116545-A0202-12-0290-69
Figure 105116545-A0202-12-0291-70
Figure 105116545-A0202-12-0292-71
Figure 105116545-A0202-12-0293-72
Figure 105116545-A0202-12-0294-73
Figure 105116545-A0202-12-0295-74
Figure 105116545-A0202-12-0296-75
Figure 105116545-A0202-12-0297-76
Figure 105116545-A0202-12-0298-77
Figure 105116545-A0202-12-0299-78
Figure 105116545-A0202-12-0300-79
Figure 105116545-A0202-12-0301-80
Figure 105116545-A0202-12-0302-81
Figure 105116545-A0202-12-0303-82
Figure 105116545-A0202-12-0304-83
Figure 105116545-A0202-12-0305-84
Figure 105116545-A0202-12-0306-85
Figure 105116545-A0202-12-0307-86
Figure 105116545-A0202-12-0308-87
Figure 105116545-A0202-12-0309-88
Figure 105116545-A0202-12-0310-89
Figure 105116545-A0202-12-0311-90
Figure 105116545-A0202-12-0312-91
Figure 105116545-A0202-12-0313-92
Figure 105116545-A0202-12-0314-93
Figure 105116545-A0202-12-0315-94
Figure 105116545-A0202-12-0316-95
Figure 105116545-A0202-12-0317-96
Figure 105116545-A0202-12-0318-97
Figure 105116545-A0202-12-0319-98
Figure 105116545-A0202-12-0320-99
Figure 105116545-A0202-12-0321-100
Figure 105116545-A0202-12-0322-101
Figure 105116545-A0202-12-0323-102
Figure 105116545-A0202-12-0324-103
Figure 105116545-A0202-12-0325-104
Figure 105116545-A0202-12-0326-105
Figure 105116545-A0202-12-0327-106
Figure 105116545-A0202-12-0328-107
Figure 105116545-A0202-12-0329-108
Figure 105116545-A0202-12-0330-109
Figure 105116545-A0202-12-0331-110
Figure 105116545-A0202-12-0332-111
Figure 105116545-A0202-12-0333-112
Figure 105116545-A0202-12-0334-113
Figure 105116545-A0202-12-0335-114
Figure 105116545-A0202-12-0336-115
Figure 105116545-A0202-12-0337-116
Figure 105116545-A0202-12-0338-117
表23提供成熟可變區及重鏈及輕鏈之序列及(若指示)具有信號肽之序列。
等效內容：
彼等熟習此項技術者僅使用常規實驗即可認識或能夠確定本文所揭示具體實施例之許多等效內容。此等等效內容皆意欲涵蓋在下文申請專利範圍內。
<110> 美商必治妥美雅史谷比公司(BRISTOL-MYERS SQUIBB COMPANY)
<120> 抗OX40抗體及其用途
<140> 105116545
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<150> US 62/264,691
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<150> US 62/327,140
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<151> 2016-05-09
<160> 318
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(277)
<223> 人類OX40前體
<400> 1
Figure 105116545-A0305-02-0341-1
Figure 105116545-A0202-12-0340-122
<210> 2
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(189)
<223> 成熟人類OX40之細胞外結構域
<400> 2
Figure 105116545-A0202-12-0340-123
Figure 105116545-A0202-12-0341-125
<210> 3
<211> 277
<212> PRT
<213> 長尾獼猴
<220>
<221> misc__feature
<222> (1)..(277)
<223> 食蟹猴OX40
<400> 3
Figure 105116545-A0202-12-0341-126
Figure 105116545-A0202-12-0342-127
<210> 4
<211> 183
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(183)
<223> 人類OX40-L
<400> 4
Figure 105116545-A0202-12-0343-130
<210> 5
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(329)
<223> 人類IgG1恆定結構域
<400> 5
Figure 105116545-A0202-12-0343-129
Figure 105116545-A0202-12-0344-131
Figure 105116545-A0202-12-0345-132
<210> 6
<211> 329
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(329)
<223> 人類IgG1恆定結構域(異型變體)
<400> 6
Figure 105116545-A0202-12-0345-133
Figure 105116545-A0202-12-0346-136
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(107)
<223> 人類IgG1 κ輕鏈
<400> 7
Figure 105116545-A0202-12-0346-135
Figure 105116545-A0202-12-0347-137
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：重鏈恆定區替代C-末端
<400> 8
Figure 105116545-A0202-12-0347-140
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：重鏈恆定區替代C-末端
<400> 9
Figure 105116545-A0202-12-0347-141
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(107)
<223> 人類IgG1 κ輕鏈恆定區(CL)
<400> 10
Figure 105116545-A0202-12-0347-139
Figure 105116545-A0202-12-0348-142
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3F4 VH CDR1
<400> 11
Figure 105116545-A0202-12-0348-143
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3F4 VH CDR2
<400> 12
Figure 105116545-A0202-12-0348-144
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3F4 VH CDR3
<400> 13
Figure 105116545-A0202-12-0348-145
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3F4 VL CDR1
<400> 14
Figure 105116545-A0202-12-0349-146
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3F4 VL CDR2
<400> 15
Figure 105116545-A0202-12-0349-149
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3F4 VL CDR3
<400> 16
Figure 105116545-A0202-12-0349-150
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3F4 VH
<400> 17
Figure 105116545-A0202-12-0349-151
Figure 105116545-A0202-12-0350-152
<210> 18
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3F4 VL
<400> 18
Figure 105116545-A0202-12-0350-153
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VH CDR1
<400> 19
Figure 105116545-A0202-12-0350-154
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VH CDR2
<400> 20
Figure 105116545-A0202-12-0351-155
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VH CDR3
<400> 21
Figure 105116545-A0202-12-0351-156
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VL1 CDR1
<400> 22
Figure 105116545-A0202-12-0351-157
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VL1 CDR2
<400> 23
Figure 105116545-A0202-12-0351-158
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VL1 CDR3
<400> 24
Figure 105116545-A0202-12-0352-159
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VL2 CDR1
<400> 25
Figure 105116545-A0202-12-0352-160
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VL2 CDR2
<400> 26
Figure 105116545-A0202-12-0352-161
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VL2 CDR3
<400> 27
Figure 105116545-A0202-12-0352-162
<210> 28
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VH
<400> 28
Figure 105116545-A0202-12-0352-163
Figure 105116545-A0202-12-0353-164
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VL1
<400> 29
Figure 105116545-A0202-12-0353-165
<210> 30
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VL2
<400> 30
Figure 105116545-A0202-12-0354-168
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：23H3 VH CDR1
<400> 31
Figure 105116545-A0202-12-0354-170
<210> 32
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：23H3 VH CDR2
<400> 32
Figure 105116545-A0202-12-0354-169
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：23H3 VH CDR3
<400> 33
Figure 105116545-A0202-12-0355-171
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：23H3 VL CDR1
<400> 34
Figure 105116545-A0202-12-0355-172
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：23H3 VL CDR2
<400> 35
Figure 105116545-A0202-12-0355-173
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：23H3 VL CDR3
<400> 36
Figure 105116545-A0202-12-0355-175
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：23H3 VH
<400> 37
Figure 105116545-A0202-12-0355-176
Figure 105116545-A0202-12-0356-177
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：23H3 VL
<400> 38
Figure 105116545-A0202-12-0356-178
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VH CDR1
<400> 39
Figure 105116545-A0202-12-0357-179
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VH CDR2
<400> 40
Figure 105116545-A0202-12-0357-180
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VH CDR3
<400> 41
Figure 105116545-A0202-12-0357-181
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VL1 CDR1
<400> 42
Figure 105116545-A0202-12-0357-182
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VL1 CDR2
<400> 43
Figure 105116545-A0202-12-0358-183
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VL1 CDR3
<400> 44
Figure 105116545-A0202-12-0358-184
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VL2 CDR1
<400> 45
Figure 105116545-A0202-12-0358-185
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VL2 CDR2
<400> 46
Figure 105116545-A0202-12-0358-186
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VL2 CDR3
<400> 47
Figure 105116545-A0202-12-0358-187
<210> 48
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VH
<400> 48
Figure 105116545-A0202-12-0359-188
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VL1
<400> 49
Figure 105116545-A0202-12-0359-189
Figure 105116545-A0202-12-0360-190
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VL2
<400> 50
Figure 105116545-A0202-12-0360-191
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：18E9 VH CDR1
<400> 51
Figure 105116545-A0202-12-0360-192
<210> 52
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：18E9 VH CDR2
<400> 52
Figure 105116545-A0202-12-0361-193
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：18E9 VH CDR3
<400> 53
Figure 105116545-A0202-12-0361-194
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：18E9 VL CDR1
<400> 54
Figure 105116545-A0202-12-0361-195
<210> 55
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：18E9 VL CDR2
<400> 55
Figure 105116545-A0202-12-0361-196
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：18E9 VL CDR3
<400> 56
Figure 105116545-A0202-12-0361-197
<210> 57
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：18E9 VH
<400> 57
Figure 105116545-A0202-12-0362-198
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：18E9 VL
<400> 58
Figure 105116545-A0202-12-0362-199
Figure 105116545-A0202-12-0363-200
<210> 59
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：8B11 VH CDR1
<400> 59
Figure 105116545-A0202-12-0363-201
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：8B11 VH CDR2
<400> 60
Figure 105116545-A0202-12-0363-203
<210> 61
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：8B11 VH CDR3
<400> 61
Figure 105116545-A0202-12-0363-204
<210> 62
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：8B11 VL CDR1
<400> 62
Figure 105116545-A0202-12-0363-205
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：8B11 VL CDR2
<400> 63
Figure 105116545-A0202-12-0364-206
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：8B11 VL CDR3
<400> 64
Figure 105116545-A0202-12-0364-207
<210> 65
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：8B11 VH
<400> 65
Figure 105116545-A0202-12-0364-209
Figure 105116545-A0202-12-0365-210
<210> 66
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：8B11 VL
<400> 66
Figure 105116545-A0202-12-0365-211
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20B3 VH CDR1
<400> 67
Figure 105116545-A0202-12-0365-316
<210> 68
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20B3 VH CDR2
<400> 68
Figure 105116545-A0202-12-0365-212
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20B3 VH CDR3
<400> 69
Figure 105116545-A0202-12-0366-213
<210> 70
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20B3 VL CDR1
<400> 70
Figure 105116545-A0202-12-0366-214
<210> 71
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20B3 VL CDR2
<400> 71
Figure 105116545-A0202-12-0366-215
<210> 72
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20B3 VL CDR3
<400> 72
Figure 105116545-A0202-12-0366-217
<210> 73
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20B3 VH
<400> 73
Figure 105116545-A0202-12-0367-218
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20B3 VL
<400> 74
Figure 105116545-A0202-12-0367-219
Figure 105116545-A0202-12-0368-220
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VH CDR1
<400> 75
Figure 105116545-A0202-12-0368-222
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VH CDR2
<400> 76
Figure 105116545-A0202-12-0368-221
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VH CDR3
<400> 77
Figure 105116545-A0202-12-0368-225
<210> 78
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VL1 CDR1
<400> 78
Figure 105116545-A0202-12-0368-223
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VL1 CDR2
<400> 79
Figure 105116545-A0202-12-0369-226
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VL1 CDR3
<400> 80
Figure 105116545-A0202-12-0369-227
<210> 81
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VL2 CDR1
<400> 81
Figure 105116545-A0202-12-0369-228
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VL2 CDR2
<400> 82
Figure 105116545-A0202-12-0369-229
<210> 83
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VL2 CDR3
<400> 83
Figure 105116545-A0202-12-0369-230
<210> 84
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VH
<400> 84
Figure 105116545-A0202-12-0370-231
<210> 85
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VL1
<400> 85
Figure 105116545-A0202-12-0370-232
Figure 105116545-A0202-12-0371-233
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VL2
<400> 86
Figure 105116545-A0202-12-0371-234
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20C1 VH CDR1
<400> 87
Figure 105116545-A0202-12-0371-235
<210> 88
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20C1 VH CDR2
<400> 88
Figure 105116545-A0202-12-0372-236
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20C1 VH CDR3
<400> 89
Figure 105116545-A0202-12-0372-237
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20C1 VL CDR1
<400> 90
Figure 105116545-A0202-12-0372-238
<210> 91
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20C1 VL CDR2
<400> 91
Figure 105116545-A0202-12-0372-240
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20C1 VL CDR3
<400> 92
Figure 105116545-A0202-12-0372-241
<210> 93
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20C1 VH
<400> 93
Figure 105116545-A0202-12-0373-243
<210> 94
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20C1 VL
<400> 94
Figure 105116545-A0202-12-0373-244
Figure 105116545-A0202-12-0374-245
<210> 95
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.6重鏈
<400> 95
Figure 105116545-A0202-12-0374-246
Figure 105116545-A0202-12-0375-247
<210> 96
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.6輕鏈
<400> 96
Figure 105116545-A0202-12-0376-248
<210> 97
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.7重鏈
<400> 97
Figure 105116545-A0202-12-0377-249
Figure 105116545-A0202-12-0378-250
<210> 98
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.7輕鏈
<400> 98
Figure 105116545-A0202-12-0378-251
Figure 105116545-A0202-12-0379-252
<210> 99
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.8重鏈
<400> 99
Figure 105116545-A0202-12-0379-253
Figure 105116545-A0202-12-0380-254
Figure 105116545-A0202-12-0381-255
<210> 100
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.8輕鏈
<400> 100
Figure 105116545-A0202-12-0381-256
Figure 105116545-A0202-12-0382-257
<210> 101
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.9重鏈
<400> 101
Figure 105116545-A0202-12-0382-258
Figure 105116545-A0202-12-0383-259
Figure 105116545-A0202-12-0384-260
<210> 102
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.9輕鏈
<400> 102
Figure 105116545-A0202-12-0384-261
Figure 105116545-A0202-12-0385-262
<210> 103
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.10重鏈
<400> 103
Figure 105116545-A0202-12-0385-263
Figure 105116545-A0202-12-0386-264
Figure 105116545-A0202-12-0387-265
<210> 104
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.10輕鏈
<400> 104
Figure 105116545-A0202-12-0387-266
Figure 105116545-A0202-12-0388-267
<210> 105
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.11重鏈
<400> 105
Figure 105116545-A0202-12-0388-268
Figure 105116545-A0202-12-0389-269
Figure 105116545-A0202-12-0390-270
<210> 106
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.11輕鏈
<400> 106
Figure 105116545-A0202-12-0390-271
Figure 105116545-A0202-12-0391-272
<210> 107
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.12重鏈
<400> 107
Figure 105116545-A0202-12-0391-273
Figure 105116545-A0202-12-0392-274
<210> 108
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.12輕鏈
<400> 108
Figure 105116545-A0202-12-0393-275
<210> 109
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.13重鏈
<400> 109
Figure 105116545-A0202-12-0394-276
Figure 105116545-A0202-12-0395-277
<210> 110
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.13輕鏈
<400> 110
Figure 105116545-A0202-12-0395-278
Figure 105116545-A0202-12-0396-279
<210> 111
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.14重鏈
<400> 111
Figure 105116545-A0202-12-0396-280
Figure 105116545-A0202-12-0397-281
Figure 105116545-A0202-12-0398-282
<210> 112
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.14輕鏈
<400> 112
Figure 105116545-A0202-12-0398-283
Figure 105116545-A0202-12-0399-284
<210> 113
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.15重鏈
<400> 113
Figure 105116545-A0202-12-0399-285
Figure 105116545-A0202-12-0400-286
Figure 105116545-A0202-12-0401-287
<210> 114
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.15輕鏈
<400> 114
Figure 105116545-A0202-12-0401-288
Figure 105116545-A0202-12-0402-289
<210> 115
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.16重鏈
<400> 115
Figure 105116545-A0202-12-0402-290
Figure 105116545-A0202-12-0403-291
Figure 105116545-A0202-12-0404-292
<210> 116
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.16輕鏈(由OX40.20、OX40.21、OX40.22共有)
<400> 116
Figure 105116545-A0202-12-0404-293
Figure 105116545-A0202-12-0405-294
<210> 117
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.17重鏈
<400> 117
Figure 105116545-A0202-12-0405-295
Figure 105116545-A0202-12-0406-296
<210> 118
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.17輕鏈
<400> 118
Figure 105116545-A0202-12-0407-297
<210> 119
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.18重鏈
<400> 119
Figure 105116545-A0202-12-0408-298
Figure 105116545-A0202-12-0409-299
<210> 120
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.18輕鏈
<400> 120
Figure 105116545-A0202-12-0409-300
Figure 105116545-A0202-12-0410-301
<210> 121
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.19重鏈
<400> 121
Figure 105116545-A0202-12-0410-302
Figure 105116545-A0202-12-0411-303
Figure 105116545-A0202-12-0412-304
<210> 122
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.19輕鏈
<400> 122
Figure 105116545-A0202-12-0412-305
Figure 105116545-A0202-12-0413-306
<210> 123
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.20重鏈
<400> 123
Figure 105116545-A0202-12-0413-307
Figure 105116545-A0202-12-0414-308
Figure 105116545-A0202-12-0415-309
<210> 124
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.21重鏈
<400> 124
Figure 105116545-A0202-12-0415-310
Figure 105116545-A0202-12-0416-311
Figure 105116545-A0202-12-0417-312
<210> 125
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.22重鏈
<400> 125
Figure 105116545-A0202-12-0417-313
Figure 105116545-A0202-12-0418-314
<210> 126
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3F4 VH(核苷酸序列)
<400> 126
Figure 105116545-A0202-12-0419-321
<210> 127
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：3F4 VL
<400> 127
Figure 105116545-A0202-12-0419-322
<210> 128
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VH
<400> 128
Figure 105116545-A0202-12-0419-319
<210> 129
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VL1
<400> 129
Figure 105116545-A0202-12-0420-784
<210> 130
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14B6 VL2
<400> 130
Figure 105116545-A0202-12-0420-325
<210> 131
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：23H3 VH
<400> 131
Figure 105116545-A0202-12-0420-324
<210> 132
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：23H3 VL
<400> 132
Figure 105116545-A0202-12-0421-327
<210> 133
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VH
<400> 133
Figure 105116545-A0202-12-0421-328
<210> 134
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VL1
<400> 134
Figure 105116545-A0202-12-0421-329
<210> 135
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：6E1 VL2
<400> 135
Figure 105116545-A0202-12-0422-332
<210> 136
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：18E9 VH
<400> 136
Figure 105116545-A0202-12-0422-331
<210> 137
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：18E9 VL
<400> 137
Figure 105116545-A0202-12-0422-330
<210> 138
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：8B11 VH
<400> 138
Figure 105116545-A0202-12-0423-333
<210> 139
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：8B11 VL
<400> 139
Figure 105116545-A0202-12-0423-335
<210> 140
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20B3 VH
<400> 140
Figure 105116545-A0202-12-0423-336
<210> 141
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20B3 VL
<400> 141
Figure 105116545-A0202-12-0424-340
<210> 142
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VH
<400> 142
Figure 105116545-A0202-12-0424-339
<210> 143
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VL1
<400> 143
Figure 105116545-A0202-12-0424-338
<210> 144
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：14A2 VL2
<400> 144
Figure 105116545-A0202-12-0425-341
<210> 145
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20C1 VH
<400> 145
Figure 105116545-A0202-12-0425-342
<210> 146
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：20C1 VL
<400> 146
Figure 105116545-A0202-12-0425-345
<210> 147
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.6重鏈
<400> 147
Figure 105116545-A0202-12-0426-346
<210> 148
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.6輕鏈
<400> 148
Figure 105116545-A0202-12-0426-348
Figure 105116545-A0202-12-0427-350
<210> 149
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.7重鏈
<400> 149
Figure 105116545-A0202-12-0427-349
Figure 105116545-A0202-12-0428-351
<210> 150
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.7輕鏈
<400> 150
Figure 105116545-A0202-12-0428-352
<210> 151
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.8重鏈
<400> 151
Figure 105116545-A0202-12-0428-353
Figure 105116545-A0202-12-0429-354
<210> 152
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.8輕鏈
<400> 152
Figure 105116545-A0202-12-0429-355
<210> 153
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.9重鏈
<400> 153
Figure 105116545-A0202-12-0430-358
<210> 154
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.9輕鏈
<400> 154
Figure 105116545-A0202-12-0430-357
Figure 105116545-A0202-12-0431-359
<210> 155
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.10重鏈
<400> 155
Figure 105116545-A0202-12-0431-360
Figure 105116545-A0202-12-0432-361
<210> 156
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.10輕鏈
<400> 156
Figure 105116545-A0202-12-0432-362
<210> 157
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.11重鏈
<400> 157
Figure 105116545-A0202-12-0432-364
Figure 105116545-A0202-12-0433-365
<210> 158
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.11輕鏈
<400> 158
Figure 105116545-A0202-12-0433-366
<210> 159
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.12重鏈
<400> 159
Figure 105116545-A0202-12-0434-367
<210> 160
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.12輕鏈
<400> 160
Figure 105116545-A0202-12-0434-368
Figure 105116545-A0202-12-0435-369
<210> 161
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.13重鏈
<400> 161
Figure 105116545-A0202-12-0435-370
<210> 162
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.13輕鏈
<400> 162
Figure 105116545-A0202-12-0436-374
<210> 163
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.14重鏈
<400> 163
Figure 105116545-A0202-12-0436-375
Figure 105116545-A0202-12-0437-379
<210> 164
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.14輕鏈
<400> 164
Figure 105116545-A0202-12-0437-380
<210> 165
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.15重鏈
<400> 165
Figure 105116545-A0202-12-0437-377
Figure 105116545-A0202-12-0438-381
<210> 166
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.15輕鏈
<400> 166
Figure 105116545-A0202-12-0438-382
Figure 105116545-A0202-12-0439-383
<210> 167
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.16重鏈
<400> 167
Figure 105116545-A0202-12-0439-384
<210> 168
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.16輕鏈(由OX40.20、OX40.21、OX40.22共有)
<400> 168
Figure 105116545-A0202-12-0440-386
<210> 169
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.17重鏈
<400> 169
Figure 105116545-A0202-12-0440-385
Figure 105116545-A0202-12-0441-387
<210> 170
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.17輕鏈
<400> 170
Figure 105116545-A0202-12-0441-388
<210> 171
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.18重鏈
<400> 171
Figure 105116545-A0202-12-0441-390
Figure 105116545-A0202-12-0442-391
<210> 172
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.18輕鏈
<400> 172
Figure 105116545-A0202-12-0442-392
Figure 105116545-A0202-12-0443-393
<210> 173
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.19重鏈
<400> 173
Figure 105116545-A0202-12-0443-394
<210> 174
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.19輕鏈
<400> 174
Figure 105116545-A0202-12-0444-396
<210> 175
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.20重鏈
<400> 175
Figure 105116545-A0202-12-0444-397
Figure 105116545-A0202-12-0445-398
<210> 176
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.21重鏈
<400> 176
Figure 105116545-A0202-12-0445-399
Figure 105116545-A0202-12-0446-401
<210> 177
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.22重鏈
<400> 177
Figure 105116545-A0202-12-0446-404
<210> 178
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hOX40表位
<400> 178
Figure 105116545-A0202-12-0447-410
<210> 179
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hOX40表位
<400> 179
Figure 105116545-A0202-12-0447-409
<210> 180
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：肽連接體
<400> 180
Figure 105116545-A0202-12-0447-408
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：轉肽酶A識別基序
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 181
Figure 105116545-A0202-12-0447-405
<210> 182
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hOX40表位
<400> 182
Figure 105116545-A0202-12-0448-411
<210> 183
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hOX40表位
<400> 183
Figure 105116545-A0202-12-0448-789
<210> 184
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hOX40表位
<400> 184
Figure 105116545-A0202-12-0448-413
<210> 185
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：hOX40表位
<400> 185
Figure 105116545-A0202-12-0448-414
<210> 186
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1 C-末端CH1(對於IgG3(17-15-15-15)、igG3(17-15-15)、IgG3(17-15)、IgG3(15-15-15)、IgG3(15)及IgG4相同)
<400> 186
Figure 105116545-A0202-12-0449-415
<210> 187
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2 C-末端CH1
<400> 187
Figure 105116545-A0202-12-0449-416
<210> 188
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1上鉸鏈
<400> 188
Figure 105116545-A0202-12-0449-417
<210> 189
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG3(17-15-15-15)上鉸鏈(對於IgG3(17-15-15)及IgG3(17-15)相同)
<400> 189
Figure 105116545-A0202-12-0449-418
<210> 190
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG3(15-15-15)上鉸鏈(對於IgG3(15)相同)
<400> 190
Figure 105116545-A0202-12-0449-419
<210> 191
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG4上鉸鏈
<400> 191
Figure 105116545-A0202-12-0450-420
<210> 192
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1中間鉸鏈
<400> 192
Figure 105116545-A0202-12-0450-421
<210> 193
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2中間鉸鏈
<400> 193
Figure 105116545-A0202-12-0450-422
<210> 194
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG3(17-15-15-15)中間鉸鏈
<400> 194
Figure 105116545-A0202-12-0450-423
<210> 195
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG3(17-15-15)中間鉸鏈
<400> 195
Figure 105116545-A0202-12-0451-425
<210> 196
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG3(17-15)中間鉸鏈
<400> 196
Figure 105116545-A0202-12-0451-426
<210> 197
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG3(15-15-15)中間鉸鏈
<400> 197
Figure 105116545-A0202-12-0451-424
<210> 198
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG3(15)中間鉸鏈
<400> 198
Figure 105116545-A0202-12-0452-428
<210> 199
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG4中間鉸鏈
<400> 199
Figure 105116545-A0202-12-0452-429
<210> 200
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1下鉸鏈(對於IgG3(17-15-15-15)、IgG3(17-15-15)、IgG3(17-15)、IgG3(15-15-15)、IgG3(15)及IgG4相同)
<400> 200
Figure 105116545-A0202-12-0452-430
<210> 201
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2下鉸鏈
<400> 201
Figure 105116545-A0202-12-0452-432
<210> 202
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(98)
<223> 野生型人類IgG1 CH1
<400> 202
Figure 105116545-A0202-12-0452-431
Figure 105116545-A0202-12-0453-433
<210> 203
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(98)
<223> 野生型人類IgG2 CH1
<400> 203
Figure 105116545-A0202-12-0453-434
<210> 204
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(103)
<223> 野生型人類IgG1 CH2
<400> 204
Figure 105116545-A0202-12-0454-435
<210> 205
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(103)
<223> 野生型人類IgG2 CH2
<400> 205
Figure 105116545-A0202-12-0454-436
Figure 105116545-A0202-12-0455-437
<210> 206
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(106)
<223> 野生型人類IgG1 CH3
<400> 206
Figure 105116545-A0202-12-0455-438
<210> 207
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(107)
<223> 野生型人類IgG2 CH3
<400> 207
Figure 105116545-A0202-12-0456-439
<210> 208
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 208
Figure 105116545-A0202-12-0456-440
<210> 209
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 209
Figure 105116545-A0202-12-0456-441
<210> 210
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 210
Figure 105116545-A0202-12-0457-444
<210> 211
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 211
Figure 105116545-A0202-12-0457-443
<210> 212
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 212
Figure 105116545-A0202-12-0457-442
<210> 213
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 213
Figure 105116545-A0202-12-0458-445
<210> 214
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 214
Figure 105116545-A0202-12-0458-447
<210> 215
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 215
Figure 105116545-A0202-12-0458-448
<210> 216
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 216
Figure 105116545-A0202-12-0459-450
<210> 217
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(19)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 217
Figure 105116545-A0202-12-0459-449
<210> 218
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 218
Figure 105116545-A0202-12-0460-451
<210> 219
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 219
Figure 105116545-A0202-12-0460-452
<210> 220
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 220
Figure 105116545-A0202-12-0460-453
<210> 221
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 221
Figure 105116545-A0202-12-0460-454
Figure 105116545-A0202-12-0461-458
<210> 222
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 222
Figure 105116545-A0202-12-0461-457
<210> 223
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 223
Figure 105116545-A0202-12-0461-456
<210> 224
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 224
Figure 105116545-A0202-12-0461-455
<210> 225
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 225
Figure 105116545-A0202-12-0462-459
<210> 226
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 226
Figure 105116545-A0202-12-0462-460
<210> 227
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 227
Figure 105116545-A0202-12-0462-461
<210> 228
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 228
Figure 105116545-A0202-12-0463-462
<210> 229
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 229
Figure 105116545-A0202-12-0463-463
<210> 230
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<400> 230
Figure 105116545-A0202-12-0463-465
<210> 231
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 231
Figure 105116545-A0202-12-0463-466
<210> 232
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：替代鉸鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為任何天然胺基酸
<400> 232
Figure 105116545-A0202-12-0464-467
<210> 233
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：鉸鏈之部分
<400> 233
Figure 105116545-A0202-12-0464-468
<210> 234
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：鉸鏈之部分
<400> 234
Figure 105116545-A0202-12-0464-469
<210> 235
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：鉸鏈之部分
<400> 235
Figure 105116545-A0202-12-0464-470
<210> 236
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：鉸鏈之部分
<400> 236
Figure 105116545-A0202-12-0464-473
<210> 237
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：鉸鏈之部分
<400> 237
Figure 105116545-A0202-12-0465-474
<210> 238
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> WT人類IgG2鉸鏈
<400> 238
Figure 105116545-A0202-12-0465-475
<210> 239
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 具有C219S之人類IgG2鉸鏈
<400> 239
Figure 105116545-A0202-12-0465-476
<210> 240
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2/IgG1鉸鏈
<400> 240
Figure 105116545-A0202-12-0465-478
Figure 105116545-A0202-12-0466-480
<210> 241
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2(C219S)/IgG1鉸鏈
<400> 241
Figure 105116545-A0202-12-0466-482
<210> 242
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 野生型人類IgG1鉸鏈
<400> 242
Figure 105116545-A0202-12-0466-483
<210> 243
<211> 103
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(103)
<223> 具有A330S/P331S之人類IgG1 CH2
<400> 243
Figure 105116545-A0202-12-0466-484
Figure 105116545-A0202-12-0467-485
<210> 244
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1-IgG2-IgG1f
<400> 244
Figure 105116545-A0202-12-0467-486
Figure 105116545-A0202-12-0468-487
<210> 245
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成IgG1-IgG2-1gG1f2
<400> 245
Figure 105116545-A0202-12-0468-489
Figure 105116545-A0202-12-0469-490
Figure 105116545-A0202-12-0470-491
<210> 246
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1-IgG2CS-IgG1f
<400> 246
Figure 105116545-A0202-12-0470-492
Figure 105116545-A0202-12-0471-493
<210> 247
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1-IgG2CS-IgG1f2
<400> 247
Figure 105116545-A0202-12-0471-494
Figure 105116545-A0202-12-0472-495
<210> 248
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2-IgG1f
<400> 248
Figure 105116545-A0202-12-0473-496
Figure 105116545-A0202-12-0474-497
<210> 249
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2-IgG1f2
<400> 249
Figure 105116545-A0202-12-0474-498
Figure 105116545-A0202-12-0475-499
<210> 250
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2CS-IgG1f
<400> 250
Figure 105116545-A0202-12-0475-501
Figure 105116545-A0202-12-0476-502
Figure 105116545-A0202-12-0477-503
<210> 251
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2CS-IgG1f2
<400> 251
Figure 105116545-A0202-12-0477-504
Figure 105116545-A0202-12-0478-505
<210> 252
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1-IgG2-IgG1.1f
<400> 252
Figure 105116545-A0202-12-0478-506
Figure 105116545-A0202-12-0479-507
<210> 253
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1-IgG2CS-IgG1.1f
<400> 253
Figure 105116545-A0202-12-0480-508
Figure 105116545-A0202-12-0481-509
<210> 254
<211> 325
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2-IgG1.1f
<400> 254
Figure 105116545-A0202-12-0481-510
Figure 105116545-A0202-12-0482-511
<210> 255
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2CS-IgG1.1f
<400> 255
Figure 105116545-A0202-12-0482-512
Figure 105116545-A0202-12-0483-513
Figure 105116545-A0202-12-0484-514
<210> 256
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1f
<400> 256
Figure 105116545-A0202-12-0484-515
Figure 105116545-A0202-12-0485-516
<210> 257
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG1.1f
<400> 257
Figure 105116545-A0202-12-0485-517
Figure 105116545-A0202-12-0486-518
<210> 258
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3
<400> 258
Figure 105116545-A0202-12-0487-519
Figure 105116545-A0202-12-0488-522
<210> 259
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.5
<400> 259
Figure 105116545-A0202-12-0488-523
Figure 105116545-A0202-12-0489-524
<210> 260
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-KH
<400> 260
Figure 105116545-A0202-12-0489-525
Figure 105116545-A0202-12-0490-526
Figure 105116545-A0202-12-0491-527
<210> 261
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.5G1-KH
<400> 261
Figure 105116545-A0202-12-0491-528
Figure 105116545-A0202-12-0492-529
<210> 262
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-AY
<400> 262
Figure 105116545-A0202-12-0492-531
Figure 105116545-A0202-12-0493-532
<210> 263
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.5G1-AY
<400> 263
Figure 105116545-A0202-12-0494-533
Figure 105116545-A0202-12-0495-534
<210> 264
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1.1f-KH
<400> 264
Figure 105116545-A0202-12-0495-535
Figure 105116545-A0202-12-0496-536
<210> 265
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.5G1.1f-KH
<400> 265
Figure 105116545-A0202-12-0496-537
Figure 105116545-A0202-12-0497-538
Figure 105116545-A0202-12-0498-539
<210> 266
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.5G1-V27
<400> 266
Figure 105116545-A0202-12-0498-540
Figure 105116545-A0202-12-0499-541
<210> 267
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3-V13
<400> 267
Figure 105116545-A0202-12-0499-542
Figure 105116545-A0202-12-0500-543
<210> 268
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3-V14
<400> 268
Figure 105116545-A0202-12-0501-544
Figure 105116545-A0202-12-0502-545
<210> 269
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3-V15
<400> 269
Figure 105116545-A0202-12-0502-546
Figure 105116545-A0202-12-0503-547
<210> 270
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3-V16
<400> 270
Figure 105116545-A0202-12-0503-548
Figure 105116545-A0202-12-0504-549
Figure 105116545-A0202-12-0505-550
<210> 271
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3-V17
<400> 271
Figure 105116545-A0202-12-0505-551
Figure 105116545-A0202-12-0506-552
<210> 272
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3-V18
<400> 272
Figure 105116545-A0202-12-0506-553
Figure 105116545-A0202-12-0507-554
<210> 273
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3-V19
<400> 273
Figure 105116545-A0202-12-0508-555
Figure 105116545-A0202-12-0509-556
<210> 274
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-AY-V20
<400> 274
Figure 105116545-A0202-12-0509-557
Figure 105116545-A0202-12-0510-558
<210> 275
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-AY-V21
<400> 275
Figure 105116545-A0202-12-0510-559
Figure 105116545-A0202-12-0511-560
Figure 105116545-A0202-12-0512-561
<210> 276
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-AY-V22
<400> 276
Figure 105116545-A0202-12-0512-562
Figure 105116545-A0202-12-0513-563
<210> 277
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-AY-V23
<400> 277
Figure 105116545-A0202-12-0513-564
Figure 105116545-A0202-12-0514-565
<210> 278
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-AY-V24
<400> 278
Figure 105116545-A0202-12-0515-566
Figure 105116545-A0202-12-0516-567
<210> 279
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-AY-V25
<400> 279
Figure 105116545-A0202-12-0516-568
Figure 105116545-A0202-12-0517-569
<210> 280
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-AY-V26
<400> 280
Figure 105116545-A0202-12-0517-570
Figure 105116545-A0202-12-0518-571
Figure 105116545-A0202-12-0519-572
<210> 281
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-AY-V28
<400> 281
Figure 105116545-A0202-12-0519-573
Figure 105116545-A0202-12-0520-574
<210> 282
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.6-Vh-hHC-IgG2.3
<400> 282
Figure 105116545-A0202-12-0520-575
Figure 105116545-A0202-12-0521-576
Figure 105116545-A0202-12-0522-577
<210> 283
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.8-Vh-hHC-IgG2.3
<400> 283
Figure 105116545-A0202-12-0522-578
Figure 105116545-A0202-12-0523-579
Figure 105116545-A0202-12-0524-580
<210> 284
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.16-Vh-hHC.IgG2.3
<400> 284
Figure 105116545-A0202-12-0524-581
Figure 105116545-A0202-12-0525-582
Figure 105116545-A0202-12-0526-583
<210> 285
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.6-Vh-hHC-IgG2.3G1
<400> 285
Figure 105116545-A0202-12-0526-584
Figure 105116545-A0202-12-0527-585
<210> 286
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.8-Vh-hHC.IgG2.3G1
<400> 286
Figure 105116545-A0202-12-0528-586
Figure 105116545-A0202-12-0529-587
<210> 287
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.16-Vh-hHC-IgG2.3G1
<400> 287
Figure 105116545-A0202-12-0529-588
Figure 105116545-A0202-12-0530-589
Figure 105116545-A0202-12-0531-590
<210> 288
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.6-Vh-hHC-IgG2.3G1-V27
<400> 288
Figure 105116545-A0202-12-0531-591
Figure 105116545-A0202-12-0532-592
Figure 105116545-A0202-12-0533-593
<210> 289
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.8-Vh-hHC-IgG2.3G1-V27
<400> 289
Figure 105116545-A0202-12-0533-594
Figure 105116545-A0202-12-0534-595
Figure 105116545-A0202-12-0535-596
<210> 290
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.16-Vh-hHC-IgG2.3G1-V27
<400> 290
Figure 105116545-A0202-12-0535-597
Figure 105116545-A0202-12-0536-598
<210> 291
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.6-Vh-hHC-IgG2.5
<400> 291
Figure 105116545-A0202-12-0537-599
Figure 105116545-A0202-12-0538-600
<210> 292
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.8-Vh-hHC-IgG2.5
<400> 292
Figure 105116545-A0202-12-0538-601
Figure 105116545-A0202-12-0539-602
Figure 105116545-A0202-12-0540-603
<210> 293
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.16-Vh-hHC-IgG2.5
<400> 293
Figure 105116545-A0202-12-0540-605
Figure 105116545-A0202-12-0541-606
Figure 105116545-A0202-12-0542-607
<210> 294
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.21-Vh-hHC-IgG2.5
<400> 294
Figure 105116545-A0202-12-0542-608
Figure 105116545-A0202-12-0543-609
Figure 105116545-A0202-12-0544-610
<210> 295
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.21-Vh-hHC-IgG2.5G1
<400> 295
Figure 105116545-A0202-12-0544-611
Figure 105116545-A0202-12-0545-612
Figure 105116545-A0202-12-0546-613
<210> 296
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.21-Vh-hHC-IgG2.5G1-V27
<400> 296
Figure 105116545-A0202-12-0546-614
Figure 105116545-A0202-12-0547-615
<210> 297
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：IgG2.3G1-V27
<400> 297
Figure 105116545-A0202-12-0548-616
Figure 105116545-A0202-12-0549-618
<210> 298
<211> 103
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：具有A330S/P331S之人類IgG1 CH2
<400> 298
Figure 105116545-A0202-12-0549-619
<210> 299
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：重鏈尼沃魯單抗
<400> 299
Figure 105116545-A0202-12-0550-620
Figure 105116545-A0202-12-0551-621
<210> 300
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：輕鏈尼沃魯單抗
<400> 300
Figure 105116545-A0202-12-0551-622
Figure 105116545-A0202-12-0552-623
<210> 301
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：重鏈可變區尼沃魯單抗
<400> 301
Figure 105116545-A0202-12-0552-624
Figure 105116545-A0202-12-0553-625
<210> 302
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：輕鏈可變區尼沃魯單抗
<400> 302
Figure 105116545-A0202-12-0553-626
<210> 303
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：HCDR1尼沃魯單抗
<400> 303
Figure 105116545-A0202-12-0554-632
<210> 304
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：HCDR2尼沃魯單抗
<400> 304
Figure 105116545-A0202-12-0554-631
<210> 305
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：HCDR3尼沃魯單抗
<400> 305
Figure 105116545-A0202-12-0554-630
<210> 306
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：LCDR1尼沃魯單抗
<400> 306
Figure 105116545-A0202-12-0554-629
<210> 307
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：LCDR2尼沃魯單抗
<400> 307
Figure 105116545-A0202-12-0554-628
<210> 308
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：LCDR3尼沃魯單抗
<400> 308
Figure 105116545-A0202-12-0555-633
<210> 309
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：重鏈可變區伊匹單抗(來自WO01/014424)
<400> 309
Figure 105116545-A0202-12-0555-634
<210> 310
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：輕鏈可變區伊匹單抗(來自WO01/014424)
<400> 310
Figure 105116545-A0202-12-0556-637
<210> 311
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：HCDR1伊匹單抗(來自WO01/014424)
<400> 311
Figure 105116545-A0202-12-0556-636
<210> 312
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：HCDR2伊匹單抗(來自WO01/014424)
<400> 312
Figure 105116545-A0202-12-0556-635
<210> 313
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：HCDR3伊匹單抗(來自WO01/014424)
<400> 313
Figure 105116545-A0202-12-0557-639
<210> 314
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：LCDR1伊匹單抗(來自WO01/014424)
<400> 314
Figure 105116545-A0202-12-0557-640
<210> 315
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：LCDR2伊匹單抗(來自WO01/014424)
<400> 315
Figure 105116545-A0202-12-0557-643
<210> 316
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：LCDR3伊匹單抗(來自WO01/014424)
<400> 316
Figure 105116545-A0202-12-0557-641
<210> 317
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.21之HCDR2
<400> 317
Figure 105116545-A0202-12-0557-642
<210> 318
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：OX40.21之VH
<400> 318
Figure 105116545-A0202-12-0558-644

Claims (23)

  1. 一種結合至人類OX40之經分離抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：87之序列的重鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：317之序列的重鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：89之序列的重鏈可變區CDR3，及包含SEQ ID NO：90之序列的輕鏈可變區CDR1、包含SEQ ID NO：91之序列的輕鏈可變區CDR2及包含SEQ ID NO：92之序列的輕鏈可變區CDR3。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：318之序列的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：94之序列的輕鏈可變區。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：124之序列的重鏈及包含SEQ ID NO：116之序列的輕鏈。
  4. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈恆定區。
  5. 如請求項4之抗體，其中該重鏈恆定區缺乏C-末端離胺酸，或該重鏈恆定區之C-末端包含除離胺酸外之胺基酸。
  6. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體可刺激抗原特異性T細胞反應。
  7. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體藉由Biacore所量測，以1nM或更小之KD結合至可溶性人類OX40。
  8. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體結合至人類OX40(SEQ ID NO：2)之序列DVVSSKPCKPCTWCNLR(SEQ ID NO：178)之全部或一部分。
  9. 如請求項1或2之抗體，其係IgG1同型。
  10. 如請求項1或2之抗體，其係人類抗體。
  11. 一種核酸，其編碼如請求項2至10中任一項之抗體之重鏈及輕鏈可變區。
  12. 一種表現載體，其包含如請求項11之核酸。
  13. 一種細胞，其經下列轉化：(i)如請求項12之表現載體；或(ii)包含編碼如請求項2至10中任一項之抗體之重鏈可變區的核酸之表現載體，及包含編碼如請求項2至10中任一項之抗體之輕鏈可變區的核酸之單獨表現載體。
  14. 一種組合物，其包含如請求項1至10中任一項之抗體及載劑。
  15. 如請求項14之組合物，其進一步包含一或多種其他治療劑。
  16. 如請求項15之組合物，其中該一或多種其他治療劑係選自由以下組成之群：抗PD1抗體、抗PD-L1抗體、抗CTLA-4抗體及其組合。
  17. 一種如請求項1至10中任一項之抗體之用途，其用於製造用於治療癌症之藥劑。
  18. 一種如請求項14至16中任一項之組合物之用途，其用於製造用於治療癌症之藥劑。
  19. 如請求項17或18之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：子宮頸癌、結腸直腸癌、膀胱癌及卵巢癌。
  20. 一種如請求項1-10中任一項之抗體之用途，其用於製造用於治療癌症之藥劑，其中該藥劑進一步包含PD-1抗體尼沃魯單抗(nivolumab)或係用於與PD-1抗體尼沃魯單抗併用。
  21. 一種如請求項1-10中任一項之抗體之用途，其用於製造用於治療癌症之藥劑，其中該藥劑進一步包含抗CTLA-4抗體伊匹單抗(ipilimumab)或係用於與抗CTLA-4抗體伊匹單抗併用。
  22. 一種如請求項1-10中任一項之抗體之用途，其用於製造用於治療癌症之藥劑，其中該藥劑進一步包含抗PD-1抗體尼沃魯單抗及 抗CTLA-4抗體伊匹單抗或係用於與抗PD-1抗體尼沃魯單抗及抗CTLA-4抗體伊匹單抗併用。
  23. 一種製造與人類OX40結合之抗體之方法，其包含在適當條件下培育如請求項13之細胞及分離該抗體。
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