CN105078998B - 抑制移植物抗宿主病的PKCθ的小分子抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PKCθ小分子抑制剂，所述的PKCθ小分子抑制剂为FL‑1507，其分子式为：
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域的一种抑制移植物抗宿主病（GVHD）的新型PKCθ的小分子抑制剂，尤其涉及一种对体细胞抗原受体（TCR）的信号传递具有强烈抑制作用的小分子化合物，用于预防同种异体CAR-T治疗过程中所产生的可能致命的GVHD。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞免疫疗法 （CAR-T疗法）代表当今肿瘤免疫细胞治疗技术的最前沿，在急性淋巴细胞白血病的临床试验中获得极大的成功。它的基本原理就是利用病人自身的T细胞，嵌合抗原受体修饰后，可以特异性地识别肿瘤相关抗原，使效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境并打破宿主免疫耐受状态。CAR-T治疗分以下五步：1）从癌症病人身上分离免疫T细胞。2）利用基因工程技术给T细胞加入一个能识别肿瘤细胞，并且同时激活T细胞杀死肿瘤细胞的嵌合抗体（CAR），使T细胞变成CAR-T细胞。它不再是一个普通的T细胞，它是一个带着GPS导航，随时准备找到癌细胞，并发动自杀性袭击。3）体外培养，大量扩增CAR-T细。4）把扩增好的CAR-T细胞输回病人体内。5）严密监护病人，尤其是控制前几天身体的剧烈反应。
目前的CAR-T疗法是一种“个性化”的疗法，细胞制品来自于患者自身，无法“现货供应”，只能“现做现用”，不仅操作复杂，不可控因素多，关键问题在于90%的患者由于自身T细胞缺陷，尤其是在CAR-T治疗前往往接受过化疗和免疫抑制剂治疗，T细胞数量和质量达不到CAR-T制备的要求，因而无法接受CAR-T治疗。鉴于这一问题，多个中心尝试开发通用型CAR-T，即采用正常异体来源的T细胞制备CAR-T，用于肿瘤患者的治疗。同种异体CAR-T治疗的主要风险是移植物抗宿主病（GVHD）。鉴于T细胞受体（TCR）及其介导的信号通路是产生GVHD的关键因素，目前普遍采用的技术是通过敲除内源性TCR基因以排除同种异体TCR导致的GVHD。这种策略显著拓宽了CAR-T的细胞来源，避免因患者自体T细胞因数量低、功能不足、扩增能力差等限制应用。第三方细胞来源的CAR-T还具备易于操作、重复性好等优势，更有利于大批量临床应用。但是，通过敲除TCR制备同种异体CAR-T目前遇到敲除效率低等技术瓶颈，预计在若干年内都不能用于临床。
TCR的信号传递需要关键的蛋白激酶。PKCθ是TCR信号的关键调节分子，在免疫学领域被认为是T细胞激活的“突触”，与CARMA和Bcl-10一起，通过诱导NF-kB、NF-AT、AP-1等转录因子而介导T细胞活化。研究表明，PKCθ缺失的T细胞不产生GVHD，但保留肿瘤杀伤功能。因此，PKCθ抑制剂具有抑制同种异体CAR-T所引起的GVHD而不影响其抗肿瘤的功能，具有良好的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种抑制移植物抗宿主病的新型PKCθ的小分子抑制剂，旨在开发PKCθ的小分子抑制剂，抑制TCR的信号传递而不影响T细胞的抗肿瘤功能，从而克服同源异体CAR-T治疗过程中所引起的致命的GVHD。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种新型PKCθ小分子抑制剂，所述的PKCθ小分子抑制剂为FL-1507，其分子式为：
。
进一步的，所述的PKCθ的特异性小分子抑制剂为FL-1507的衍生物。
进一步的，所述的PKCθ的特异性小分子抑制剂抑制TCR信号及T细胞活化，用于制备同种异体CAR-T，避免其产生GVHD。
进一步的，所述的PKCθ的特异性小分子抑制剂抑制TCR信号及T细胞活化，用于预防同种异体骨髓抑制所产生的GVHD。
本发明的有益效果是:
本发明的PKCθ的特异性小分子抑制剂通过抑制PKCθ使T细胞上的TCR受体信号转导抑制，进而抑制TCR介导的GBHD的产生。所发明的PKCθ的特异性小分子抑制剂可抑制同源异体CAR-T治疗所引起的GVHD，促进同源异体CAR-T的推广和产业化。同时，这类化合物也可用于预防同种异体骨髓抑制所引起的GVHD。
本发明用高通量筛选法从化合物库中筛选到对TCR信号具有高强度选择性抑制作用的小分子化合物，包括其药学上可接受的盐和前体药。该化合物是蛋白激酶C q亚型（PKCθ）的选择性抑制剂，在体外试验中能抑制CAR-T细胞内TCR的信号传递，但不影响CAR-T的增殖和肿瘤杀伤功能。此类化合物可以有效地抑制同种异体CAR-T治疗过程中所产生的GVHD，促进同种异体CAR-T的临床应用。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。本发明的具体实施方式由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为基于PKCθ荧光极化的高通量筛选流程图。
图2为本发明的FL-1507浓度依赖性地抑制PKCθ的活性。PKCθ的活性采用放射性检测法，所得的IC50值来自于三次实验的结果（平均值±标准差）。
图3是本发明的FL-1507对T细胞PKCθ的抑制作用。元代培养的T细胞与不同浓度的FL-1507反应45分钟后再与PMA（100 nM）反应20分钟。Western blot 检测p-S916 - PKCθ和p-S742 - PKCθ的强度。
图4A是PKCθ酶活性放射分析法显示FL-1507对PKCθ无显著抑制作用示意图。
图4B是PKCθ酶活性放射分析法显示FL-1507对PKCθ无显著抑制作用示意图。
图4C是PKCθ酶活性放射分析法显示FL-1507对PKCθ无显著抑制作用示意图。
图4D是PKCθ酶活性放射分析法显示FL-1507对PKCθ无显著抑制作用示意图。
图4E是PKCθ酶活性放射分析法显示FL-1507对PKCθ无显著抑制作用示意图。
图5是本发明的FL-1507对TCR信号转导的抑制作用。原代培养的T细胞经anti-CD3/28刺激TCR后引起的RelA 和IL-2表达，这一作用被FL-1507抑制。
图6是本发明的FL-1507对GVHD的抑制作用。(A-E) BALB/c小鼠经致死剂量的放射性同位素照射后接受来自于C57BL/6小鼠的经FL1507或助溶剂处理24小时后的T细胞（0.5x106)。分别在第4天和第14天检测脾脏细胞与移植T细胞的比值。TN，native T-cells, TE,effector T cells。 (F) 小鼠的生存曲线。
具体实施方式
下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。
参照图1至图3以及图4A至图4E所示，鉴于PKCθ在TCR的信号转导以及TCR介导的GVHD过程中的关键作用，我们建立了基于PKCθ荧光极化的高通量筛选平台。通过对PKCθ其它亚型的反向筛选，获得了PKCθ选择性抑制剂。将所得的化合物经TCR信号转导实验进一步筛选，所获得的PKCθ选择性抑制剂能显著抑制TCR介导的GVHD。
通过这一系列筛选，我们发现了一系列PKCθ的选择性抑制剂。其中包括FL-1507。
进一步的，所述的PKCθ抑制剂为FL-1507的衍生物。
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1508，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1509，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1510，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1511，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1512，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1513，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1514，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1515，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1516，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1517，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1518，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1519，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1520，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1521，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1522，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1523，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1524，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1525，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1526，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1527，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1528，其分子结构如下：
优选的，所述FL-1507的衍生物为FL-1529，其分子结构如下：
进一步的，所述的PKCθ选择性抑制剂用于制备预防或治疗GVHD的药物。
进一步的，所述的PKCθ选择性抑制剂用于预防同种异体CAR-T所引起的GVHD，也可用于同种异体骨髓移植所引起的GVHD。
实施例1： FL-1507对同种异体T细胞移植所引起的GVHD的抑制作用。 我们将C57BL/6小鼠的T细胞经FL1507或助溶剂处理24小时后（0.5 x106)，输注于经致死剂量的放射性同位素照射的BALB/c小鼠，并分别于第4天和14天观察检测脾脏细胞与移植T细胞的比值并测定小鼠的生存曲线。结果显示，经FL-1507处理的T细胞所引起的GVHD显著低于对照组。FL-1507组小鼠的生存率也显著高于对照组，参照图6所示。
同时，参照图5所示，FL-1507显著抑制CD3/28激活TCR所引起的转录因子RelA以及细胞因子IL-2表达。因此，通过抑制TCR的信号转导，FL-1507对异体T细胞移植所致的GVHD有优良的抑制作用，对于同种异体CAR-T治疗以及骨髓抑制具有潜在的应用价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种PKCθ小分子抑制剂，其特征在于：所述的PKCθ小分子抑制剂为FL-1507，其分子式为：
。
2.根据权利要求1所述的PKCθ小分子抑制剂，用于抑制同种异体CAR-T治疗过程中所引起的移植物抗宿主病。
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