CN114836389A - 分泌抗hcg单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗hcg单克隆抗体及应用 - Google Patents

分泌抗hcg单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗hcg单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及分泌抗HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗HCG单克隆抗体及应用，包括分泌抗HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株C1和杂交瘤细胞株C2，且分别保藏于中国典型培养物保藏中心；杂交瘤细胞株C1的保藏编号为CCTCC NO：C2021219，杂交瘤细胞株C2的保藏编码为CCTCC NO：C2021220。将上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经过饱和硫酸铵盐和protein‑A层析柱处理后，可以有效除去杂质，得到纯度高，效价高，特异性强，稳定性好的单克隆抗体；纯化后得到的单克隆抗体用于检测试剂的生产，大大提高了试剂灵敏度。

Description

分泌抗HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗HCG单克隆抗体及 应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及分泌抗HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株、抗HCG单克隆抗体及应用。
背景技术
HCG即人绒毛膜促性腺激素，是人类受孕后胎盘合体滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素，由结构单位α亚基和功能单位β亚基组成。在妊娠早期HCG的浓度迅速增高,检测尿中的HCG即可证实妊娠。有许多研究表明，肿瘤病人的血和尿中有游离的HCG的β亚基存在，研制高纯度的HCG单克隆抗体对早孕、癌症的检测有重要的意义。
HCG的α亚基与LH（促黄体生成素）、FSH（促卵泡激素）、TSH（促甲状腺激素）的结构相似，氨基酸排列顺序基本相同，仅β亚基有部分不同，在羧基末端约30个氨基酸的片段，代表了HCG的特异性。当用HCG分子作为免疫原制备单克隆抗体，或多或少地都会和LH、FSH、TSH发生交叉反应，抗α-HCG的抗体无法识别α-HCG和甾体糖蛋白之间的差异，抗β-HCG的抗体灵敏性和特异性较好，在HCG的诊断与治疗等检测中可以有效的降低交叉反应。目前，单克隆抗体的制备主要有小鼠体内诱生腹水、杂交瘤细胞体外培养及基因工程等方法。其中由于腹水制备的成本低，产量大，且操作简单，而被广泛应用。但此方法所得到的抗体中含有多种杂蛋白及其他杂质，为了获得高效价、高纯度、高特异性的抗体，必须选择合适的纯化方法对其进行分离纯化，以满足在工业、科学研究或医疗诊断等方面的应用。
发明内容
本发明的第一个目的在于：针对现有技术存在的不足，提供分泌抗HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：
分泌抗HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株C1和杂交瘤细胞株C2，且分别保藏于中国典型培养物保藏中心；杂交瘤细胞株C1的保藏编号为CCTCC NO：C2021219，杂交瘤细胞株C2的保藏编码为CCTCC NO：C2021220。
作为一种改进的技术方案，所述杂交瘤细胞株C1和所述杂交瘤细胞株C2分别通过免疫小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合得到。
本发明的第二个目的在于：针对现有技术存在的不足，提供抗HCG单克隆抗体。
为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：
抗HCG单克隆抗体，所述抗HCG单克隆抗体包括单克隆抗体α-HCG和单克隆抗体β-HCG，所述单克隆抗体α-HCG由保藏编号CCTCC NO：C2021219的细胞株分泌产生，所述单克隆抗体β-HCG由保藏编码为CCTCC NO：C2021220的细胞株分泌产生。
作为一种改进的技术方案，抗HCG单克隆抗体的纯化方法，将采集的腹水经过冷冻保存，取出融化后经过离心、过滤，将收集的腹水经过饱和硫酸铵盐预处理，再经过protein-A层析柱处理后得到纯化后的抗HCG单克隆抗体。
作为一种改进的技术方案，饱和硫酸铵盐预处理是指将过滤后收集的腹水和饱和硫酸铵盐溶液按照0.8-1：1-1.2的体积比混合，经过搅拌混匀后再离心，收集的沉淀中加入PBS缓冲液进行透析处理，透析处理结束后再经过离心、过滤得到粗单克隆抗体。
作为一种改进的技术方案，protein-A层析柱处理是指将饱和硫酸铵盐预处理得到的粗单克隆抗体按照2.5-3.5ml/min上柱，加入柱体积9-11倍量的第一洗脱液，经过洗脱处理后再加入柱体积9-11倍量的第二洗脱液，收集的流出液调至中性，再经过浓缩、透析、离心、过滤处理得到纯化的单克隆抗体。
作为一种改进的技术方案，所述第一洗脱液的pH为7.2-7.6，所述第一洗脱液中含有0.12-0.18M的Nacl和18-22mM 的Na2HPO4。
作为一种改进的技术方案，所述第二洗脱液的pH2.8-3.2，所述第二洗脱液含有0.08-0.12M的甘氨酸和0.2M-0.4M的精氨酸。
本发明的第三个目的在于：针对现有技术存在的不足，提供抗HCG单克隆抗体在体外诊断试剂盒中的应用。
为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案是：
抗HCG单克隆抗体在体外诊断试剂盒中的应用，化学发光免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、胶体金免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒中均采用配对的单克隆抗体α-HCG和β-HCG，单克隆抗体α-HCG作为包被抗体，单克隆抗体β-HCG作为标记抗体。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有以下优点：
本发明的杂交瘤细胞株C1和C2及其传代细胞株分别能够稳定的分泌单克隆抗体α-HCG和单克隆抗体β-HCG；将上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体经过饱和硫酸铵盐和protein-A层析柱处理后，可以有效除去杂质，得到纯度高，效价高，特异性强，稳定性好的单克隆抗体；纯化后得到的单克隆抗体用于检测试剂的生产，大大提高了试剂灵敏度。
附图说明
图1为α-HCG+β-HCG单克隆抗体效价与特异性的检测结果；
图2为α-HCG、β-HCG单克隆抗体效价的检测结果；
图3为α-HCG、β-HCG单克隆抗体特异性的检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
杂交瘤细胞株的制备（杂交瘤细胞株C1或C2的制备均采用以下方法）
（1）动物免疫
用α/β-HCG蛋白（外购）作为免疫原，免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠。初次免疫，抗原与小鼠快速佐剂（3周，外购）等体积混合，经后腿小腿肌肉免疫小鼠，免疫剂量为20μg/只。第14天后同样方式加强免疫1针。第21天，采微量（100微升）尾血测效价。血清效价达到10万以上即可进行融合。融合前3天，对小鼠进行腹腔冲击免疫20μg免疫原。
（2）细胞融合
将小鼠处死，浸泡于体积浓度为75%酒精中5min，在无菌环境下摘取免疫小鼠的脾脏，研磨分散细胞，洗涤离心后获得B淋巴细胞。将小鼠B淋巴细胞和处于对数生长期，生长状态良好的骨髓瘤细胞SP2/0按照细胞数量比5:1的是比例进行混合，离心，用无血清DMEM培养基清洗细胞，确保混合细胞中无血清，离心后弃上清，在37℃水浴中，缓慢加入质量浓度50%PEG溶液1ml，在60s内匀速加入，边滴加边混合；待其反应90s后，将40ml在37℃预温的无血清DMEM培养基缓慢加入终止融合（加入时速度应先慢后快，保证PEG彻底稀释而终止融合作用），将细胞1000rpm/min离心10min，弃去上清，用37℃预温的HAT培养基重悬细胞沉淀，充分混匀，将其置于96孔细胞培养板中，放入二氧化碳培养箱进行培养。
（3）杂交瘤细胞筛选和亚克隆
融合后的第三天以及第八天，分别用HAT培养基更换融合体系中1/2的培养液，第十天吸取细胞上清，用间接ELISA的方法进行检测。
具体检测方法如下：
包被：用包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液，其配方为碳酸钠0.85g，碳酸氢钠1.4g，定容至500ml）将α-HCG或β-HCG抗原稀释成1μg/ml，100μl/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，除去未结合的抗原及杂质，拍干酶标板。
封闭：每孔加入含1w/v%BSA的PBST缓冲液进行封闭，150μl/孔，37℃孵育2h，用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
检测：将待检测的细胞上清加入到酶标板中，100μl/孔，同时用小鼠免疫血清做阳性对照，用HAT培养基做空白对照，37℃水浴30min。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
加酶标二抗：用PBS缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体1000倍稀释，加入到酶标板中，50μl/孔，37℃水浴30min。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
显色：加入TMB显色液显色，100μl/孔，37℃孵育10min；用2mol/L硫酸进行终止，50μl/孔，于450nm波长下检测。
第一次筛选后，用HAT培养基全部换液，隔天进行间接ELISA筛选，反复筛选三次。挑选三次结果均为强阳性（OD450强于阳性对照）的细胞进行亚克隆。将筛选到的阳性孔，转移到新的96孔细胞培养板，采用倍比稀释法，进行亚克隆。七天后，将培养基换成含20v/v%FBS的DMEM完全培养基，继续培养。8-12天后，用间接ELISA的方法检测培养上清，连续进行两次筛选及克隆化，选取细胞团单一的阳性孔，继续亚克隆，同时将每次克隆化的剩余细胞扩大培养冻存。一般经过2-3次亚克隆，直至96孔板的阳性率达到100%。继续重复，阳性率均在100%，结束亚克隆，即筛选到稳定的杂交瘤细胞株。
（4）杂交瘤细胞株保存
选取筛选的杂交瘤细胞株，进行扩大培养。当细胞生长状态好，细胞密度达到80%时，收集细胞，用现配的细胞冻存液（由10v/v%DMSO和90v/v%FBS的组成）冻存细胞，保存于本公司的细胞库中。
杂交瘤细胞株C1和杂交瘤细胞株C2分别在2022年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉，武汉大学；邮编:430072）；杂交瘤细胞株C1的保藏编号为CCTCC NO：C2021219，杂交瘤细胞株C2的保藏编码为CCTCC NO：C2021220。杂交瘤细胞株C1可分泌单克隆抗体α-HCG，杂交瘤细胞株C2可分泌单克隆抗体β-HCG。
实施例2
抗HCG单克隆抗体的纯化（β-HCG的纯化或α-HCG的纯化均采用以下方法）
（1）腹水的制备：
选取12周龄左右的balb/c雄鼠，每只小鼠腹腔注射0.5ml的液体石蜡，七天后腹腔注射筛选的阳性杂交瘤细胞，数量为106个/只。接种后，密切观察小鼠状态，待其腹部膨胀明显后收集腹水，8000rpm/min离心10min，去除杂质，收集上清，ELISA的方法检测腹水中抗体效价，合格后置于-20℃冰箱保存备用。
（2）抗体纯化
从-20℃冰箱取出腹水，待完全融化后离心，用0.45um滤膜过滤，通过饱和硫酸铵盐析法将腹水进行预处理，再经过protein-A柱进行纯化。收集纯化的抗体，用0.01M PBS进行透析，48h后收集抗体，0.22um滤器过滤后分装，置于-20℃冰箱中保存备用，用于后续检测和验证。
硫酸铵盐析法处理的具体操作：
a、取腹水2体积份，加入饱和硫酸铵溶液2体积份，边加边搅拌，充分混匀，搅拌30min后10000r/min离心20min，弃上清，收集沉淀。
b、收集的沉淀中加入PBS缓冲液1.6体积份，使其完全溶解后装入透析袋，再将透析袋放于PBS缓冲液中4℃条件下透析48小时，透析结束后，4000r/min离心20min，取上清用0.22um滤器过滤，即为粗抗体。
protein-A柱处理的具体操作：
a、取出Protein-A层析柱，平衡至室温，用5倍层析柱体积的结合缓冲液（含有0.15M Nacl和20mM 且pH7.4的Na2HPO4）冲洗平衡柱子，然后再用5倍层析柱体积的20v/v%乙醇溶液平衡柱子；
b、将粗抗体加入层析柱，收集流出液，重复上样2次（控制流速2.5-3.5ml/min），上样结束后层析柱中加入10倍柱体积且pH7.4的第一洗脱液（含有0.15M Nacl和20mM的Na2HPO4）进行洗杂，平衡柱子，收集流出液；
c、层析柱中继续加入柱体积10倍量的pH3.0的第二洗脱液（含有0.1M甘氨酸和0.3M精氨酸），收集的流出液（即为目的蛋白）立即用中和液（1M Tris-HCl，pH8.5）调成中性；
d、将调至中性的洗脱液装入透析袋（用PEG20000浓缩），将透析袋放入PBS缓冲液中透析48小时，透析结束后4000r/min离心20min，取上清用0.22um滤器过滤，即为纯的抗体。
实施例3
单克隆抗体鉴定
1、α-HCG、β-HCG单克隆抗体效价与特异性的检测
采用间接ELISA的方法，对纯化抗体的效价与特异性进行检测。具体检测方法如下：
（1）包被：用包被液（pH9.6碳酸盐缓冲液，其配方为：碳酸钠0.85g，碳酸氢钠1.4g，定容至500ml）将本发明制备纯化的α-HCG单克隆抗体和外购抗体，分别稀释成1μg/ml，按照100μl/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，除去未结合的抗原及杂质，拍干酶标板。
（2）封闭：每孔加入含1w/v%BSA的PBST缓冲液进行封闭，150μl/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
（3）检测：分别将三种强弱度的HCG，两种LH，两种FSH的质控品加入到酶标板中，100μl/孔，37℃水浴30min。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
（4）加酶标二抗：用PBS缓冲液将HRP标记自制的纯β-HCG和外购抗体，分别5000倍稀释，加入到酶标板中（自纯与外购分别配对），50μl/孔，37℃水浴30min。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
（5）显色：加入TMB显色液显色，100μl/孔，37℃孵育10min；用2M 硫酸终止液进行终止，50μl/孔，于450nm波长下检测。
校测结果见图1，通过图1可以发现本发明制备的纯抗体的HCG效价高于对照，交叉检测显示LH和FSH的值均低于对照，说明纯化抗体特异性好，经过多次重复实验，均证明，用此方法纯化的抗体效价高，特异性好。
2、抗体亚型检测
使用北京博奥龙免疫技术有限公司的单抗亚型检测试剂盒，按照说明书进行检测。具体检测方法如下：
（1）包被：用包被液分别将α-HCG、β-HCG抗原稀释成1μg/ml，100μl/孔分别包被到各自的酶标板中，4℃包被过夜，用PBST缓冲液洗板5次，除去未结合的抗原及杂质，拍干酶标板。
（2）封闭：每孔加入含1w/v%BSA的PBST缓冲液进行封闭，150μl/孔，37℃孵育2h，用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
（3）检测：将待检测的抗体加入到酶标板中（每个抗体做8个检测），100μl/孔，37℃水浴30min。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
（4）加酶标二抗：在酶标板中加入HRP标记的羊抗鼠抗体（包含IgG1-HRP、IgG2a-HRP、IgG2b-HRP、IgG3-HRP、IgM-HRP、IgA-HRP），50μl/孔，37℃水浴30min，用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
（5）显色：用TMB显色液避光显色，100μl/孔，37℃孵育10min；用2M 硫酸终止液进行终止，50μl/孔，于450nm波长下检测。
检测结果如表1所示：
Figure 406077DEST_PATH_IMAGE001
通过表1数据可以鉴定和确定细胞性质。
3、杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测
将筛选杂交瘤细胞进行传代培养，分别在1、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、45、50代时收集培养上清，用ELISA的方法检测，分析细胞分泌抗体的稳定性。具体检测方法如下：
（1）包被：用包被液分别将α-HCG、β-HCG抗原稀释成1μg/ml，100μl/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用PBST缓冲液洗板5次，除去未结合的抗原及杂质，拍干酶标板。
（2）封闭：每孔加入含1%BSA的PBST缓冲液进行封闭，150μl/孔，37℃孵育2h。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
（3）检测：将待检测的细胞上清加入到酶标板中，100μl/孔，37℃水浴30min。用PBST缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
（4）加酶标二抗：用PBS缓冲液将HRP标记的羊抗鼠抗体1000倍稀释，加入到酶标板中，50μl/孔，37℃水浴30min。用PBST缓冲液（1000mlPBS和0.2ml吐温20配置而成）洗板5次，拍干酶标板。
（5）显色：加入TMB显色液显色，100μl/孔，37℃孵育10min；用2M 硫酸终止液进行终止，50μl/孔，于450nm波长下检测；检测结果见表2。
Figure 11502DEST_PATH_IMAGE002
通过表2可以发现：经过多次重复实验，证明细胞传代50次分泌抗体效价基本无变化，呈现较高的一致性。
实施例4
单克隆抗体的应用
1、α-HCG、β-HCG单克隆抗体效价的检测
采用胶体金层析法，对纯化抗体的效价进行检测。设置两组实验，1号包被自纯抗体α-HCG，标记自纯抗体β-HCG；2号为对照组，包被和标记均为外购抗体。具体检测方法如下：
（1）胶体金-抗β-HCG结合物的制备：超纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01wt%，煮沸后每100 ml加入1wt%柠檬酸三钠水溶液1.5 ml，继续煮沸15min，待冷却后用0.2 mol/LK2CO3调至pH 8.2，快速搅拌下加入纯化的抗β-HCG 2 mg，继续搅拌15min后加入牛血清白蛋白240 mg，再搅拌5分钟，最后加入10wt%Nacl水溶液使Nacl在体系中的终浓度为1wt%，混匀后以2000 r/min离心10min，弃沉淀，上清液以10000 r/min离心60min，吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的胶体金-抗β-HCG 结合物。溶于贮存液中(0.02 mol/L，pH 7.4 Tris-HCl，含40 mg/100 ml分子量20000的聚乙二醇，50v/v%甘油，0.02w/v% NaN3)，-20℃保存。
（2）免疫层析测试条的制备：测试条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成。吸水纤维部分点金-抗β-HCG 结合物；硝酸纤维素膜上用0.02 mol/L，pH7.4 PBS稀释成100μg/ml的α-HCG (检测线)和羊抗鼠IgG(对照线)包被成两条约1 mm宽的线条，晾干后用含10v/v%新生牛血清的PBS封闭。干燥后依次粘在白色塑料片(支持物)上，切成0.8 cm×8 cm的条，加干燥剂密封保存。
（3）β-HCG 检测：将测试条点有金标记抗体端（即MAX端）浸入尿液，尿液液面勿超过标志线。结果判定：以测试条纤维素膜上出现两条红色线为阳性，提示尿液中含HCG；仅出现一条红色线(靠近吸水滤纸端，对照线)为阴性。如果无红色线条出现则视为试剂失效。结果确定时间：约3秒后取出，平放，3-5分钟观察结果，10分钟后无效。
检测结果如图2所示，每两条试纸条对应同个检测样本，α-HCG、β-HCG单克隆抗体的试验组与对照组（试纸条的上端做有黑色标记）相比，效价稍高，符合要求。
2、α-HCG、β-HCG单克隆抗体特异性的检测
检测245例普通尿液样本，均为阴性，膜面干净。检测结果如图3所示，校测结果：检测245例普通尿液样本，膜面干净，符合要求。
具体检测方法如下：
（1）胶体金-抗β-HCG结合物的制备：超纯水溶解氯金酸使其终浓度为0.01wt%，煮沸后每100 ml加入1wt%柠檬酸三钠水溶液1.5 ml，继续煮沸15分钟，待冷却后用0.2 mol/LK2CO3调至pH 8.2，快速搅拌下加入纯化的抗β-HCG 2 mg，并继续搅拌15分钟，加入牛血清白蛋白240 mg，再搅拌5分钟，最后加入10wt%Nacl水溶液使体系中Nacl的终浓度为1wt%，混匀。以2000 r/min离心10分钟，弃沉淀，上清液以10000 r/min离心60分钟，吸去上清液，沉淀物即为初步纯化的胶体金-抗β-HCG 结合物。溶于贮存液中(0.02 mol/L，pH 7.4 Tris-HCl，含40 mg/100 ml分子量20000的聚乙二醇，50v/v%甘油，0.02wt% NaN3)，-20℃保存。
（2）免疫层析测试条的制备：测试条由吸水纤维、硝酸纤维素膜和吸水滤纸三部分组成。吸水纤维部分点金-抗β-HCG 结合物；硝酸纤维素膜上用0.02 mol/L，pH7.4 PBS稀释成100μg/ml的α-HCG (检测线)和羊抗鼠IgG(对照线)包被成两条约1 mm宽的线条，晾干后用含10%新生牛血清的PBS封闭。干燥后依次粘在白色塑料片(支持物)上，切成0.8 cm×8cm的条，加干燥剂密封保存。
（3）β-HCG 检测：将测试条点有金标记抗体端（即MAX端）浸入尿液，尿液液面勿超过标志线。结果判定：以测试条纤维素膜上出现两条红色线为阳性，提示尿液中含HCG；仅出现一条红色线(靠近吸水滤纸端，对照线)为阴性。如果无红色线条出现则视为试剂失效。结果确定时间：约3秒后取出，平放，3-5分钟观察结果，10分钟后无效。检测结果见图3，通过图3可以发现：检测171例普通尿液样本，膜面干净，无假阳性反应，无非特异性吸附，符合要求。
为了更好的证明抗体纯化时采用本发明的操作方法可以提高抗体的回收率，给出了以下4个对比例。
对比例1
与实施例2中抗体纯化操作不同的是，protein-A柱处理的具体操作时第一洗脱液为纯水，具体结果见表3。
Figure 945960DEST_PATH_IMAGE003
结果表明：pH7.4的第一洗脱液为（0.15M Nacl，20mM Na2HPO4）时，样品与亲和柱的结合效果最好，大大的提高了抗体的回收率。
对比例2
与实施例2中抗体纯化操作不同的是，protein-A柱处理的具体操作时第二洗脱液为pH3.0的0.1M甘氨酸，具体结果见表4。
Figure 345848DEST_PATH_IMAGE004
通过表4可以发现，采用pH3.0的0.1M甘氨酸和0.3M精氨酸作为洗脱液，可以提高抗体回收率。
对比例3
与实施例2中抗体纯化操作不同的是，protein-A柱处理的具体操作时第二洗脱液为pH5.0的0.1M甘氨酸和0.3M精氨酸，具体结果见表5。
Figure 631336DEST_PATH_IMAGE005
通过表5可以发现，采用pH3.0的0.1M甘氨酸和0.3M精氨酸作为洗脱液，可以提高抗体回收率。
对比例4
与实施例2中抗体纯化操作不同的是，protein-A柱处理的具体操作时第二洗脱液为pH2.0的0.1M甘氨酸和0.3M精氨酸，具体结果见表6。
Figure 273408DEST_PATH_IMAGE006
通过表6可以发现，采用pH3.0的0.1M甘氨酸和0.3M精氨酸作为洗脱液，可以提高抗体回收率。
为了更好的证明本发明实施例1中杂交瘤制备时动物免疫方法的优势，给出了对比例，具体对比结果见表7。
对比例
与实施例1中杂交瘤制备时动物免疫方法不同的免疫方法是：取8周龄的雄性BALB/c小鼠，用α/β-HCG蛋白作为免疫原进行免疫。第一次免疫剂量为100μg/只（与等体积的弗氏完全佐剂混合，充分乳化，背部皮下多点免疫）；两周后进行第二次免疫，免疫剂量为50μg/只（与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，背部皮下多点免疫）；两周后进行第三次免疫，免疫剂量为50μg/只（与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，背部皮下多点免疫）；四天后进行第四次免疫，免疫剂量为50μg/只（与等体积的弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，腹腔注射免疫）；一周后，对小鼠进行断尾采血，检测血清效价，血清效价达到10万以上，准备融合。融合前3天，直接对小鼠腹腔注射100μg/只的抗原（α/β-HCG蛋白）加强免疫。
Figure 55DEST_PATH_IMAGE008
通过表7数据可以得知，采用实施例1中的动物免疫方法与对比例的免疫方法相比，缩短了免疫周期，降低了免疫原用量，节约了成本。
本专利不局限于上述具体的实施方式，本领域的普通技术人员从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本专利的保护范围之内。

Claims (9)

1.分泌抗HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：包括杂交瘤细胞株C1和杂交瘤细胞株C2，且分别保藏于中国典型培养物保藏中心；杂交瘤细胞株C1的保藏编号为CCTCCNO：C2021219，杂交瘤细胞株C2的保藏编码为CCTCC NO：C2021220。
2.根据权利要求1所述的分泌抗HCG单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述杂交瘤细胞株C1和所述杂交瘤细胞株C2分别通过免疫小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合得到。
3.抗HCG单克隆抗体，其特征在于：所述抗HCG单克隆抗体包括单克隆抗体α-HCG和单克隆抗体β-HCG，所述单克隆抗体α-HCG由保藏编号CCTCC NO：C2021219的细胞株分泌产生，所述单克隆抗体β-HCG由保藏编码为CCTCC NO：C2021220的细胞株分泌产生。
4.根据权利要求3所述的抗HCG单克隆抗体，其特征在于：抗HCG单克隆抗体的纯化是将采集的腹水经过冷冻保存，取出融化后经过离心、过滤，将收集的腹水经过饱和硫酸铵盐预处理，再经过protein-A层析柱处理后得到纯化后的抗HCG单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的抗HCG单克隆抗体，其特征在于：饱和硫酸铵盐预处理是指将过滤后收集的腹水和饱和硫酸铵盐溶液按照0.8-1:1-1.2的体积比混合，经过搅拌混匀后再离心，将收集的沉淀中加入PBS缓冲液进行透析处理，透析处理结束后再经过离心、过滤得到粗单克隆抗体。
6.根据权利要求4所述的抗HCG单克隆抗体，其特征在于：protein-A层析柱处理是指将饱和硫酸铵盐预处理得到的粗单克隆抗体按照2.5-3.5ml/min上柱，加入柱体积9-11倍量的第一洗脱液，经过洗脱处理后再加入柱体积9-11倍量的第二洗脱液，收集的流出液调至中性，再经过浓缩、透析、离心、过滤处理得到纯化的单克隆抗体。
7.根据权利要求6所述的抗HCG单克隆抗体，其特征在于：所述第一洗脱液的pH为7.2-7.6，所述第一洗脱液中含有0.12-0.18M的Nacl和18-22mM 的Na2HPO4。
8.根据权利要求6所述的抗HCG单克隆抗体，其特征在于：所述第二洗脱液的pH2.8-3.2，所述第二洗脱液含有0.08-0.12M的甘氨酸和0.2M-0.4M的精氨酸。
9.根据权利要求3所述的抗HCG单克隆抗体在体外诊断试剂盒中的应用，其特征在于：化学发光免疫试剂盒、酶联免疫试剂盒、胶体金免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒中均采用配对的单克隆抗体α-HCG和β-HCG，单克隆抗体α-HCG作为包被抗体，单克隆抗体β-HCG作为标记抗体。
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