JPH10504284A

JPH10504284A - 抗原パルス化樹状細胞によるｉｎｖｉｖｏＴ細胞活性化法

Info

Publication number: JPH10504284A
Application number: JP8502392A
Authority: JP
Inventors: ジー．エングルマン，エドガー; レヴィー，ロナルド; スー，フランク; ベニケ，クローディア
Original assignee: ザボードオブトラスティーズオブレランドスタンフォードジュニアユニバーシティー
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1995-06-13
Publication date: 1998-04-28
Also published as: AU710783B2; ES2530769T3; EP0765386A1; CA2192655A1; AU2772595A; PT765386E; EP0765386A4; WO1995034638A1; EP0765386B1; DK0765386T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、in vivo で免疫応答を誘導するために外因性抗原を提示するための単離したヒト樹状細胞の使用方法に関する。特に、本発明は、ヒト血液から樹状細胞を単離し、該細胞を抗原としてのリンパ腫由来免疫グロブリンに露出し、そして自己由来抗原パルス化樹状細胞をリンパ腫患者に再注入して腫瘍反応性免疫応答を誘起および／または増強することに関する。ここに記載した本発明の方法は、ワクチンとしてのおよび／またはがんや感染性病原体（ウイルスなど）に対する免疫療法としての抗原パルス化樹状細胞の臨床的使用を含むがこれらに限らない広範囲の用途を有する。

Description

【発明の詳細な説明】抗原パルス化樹状細胞によるin vivo Ｔ細胞活性化法１．序論本発明は、in vivo で免疫応答を誘導するために外因性抗原を提示するための単離したヒト樹状細胞の使用方法に関する。特に、本発明は、ヒト血液から樹状細胞を単離し、該細胞を抗原としてのリンパ腫由来免疫グロブリンに露出し、そして自己由来抗原パルス化樹状細胞をリンパ腫患者に再注入して腫瘍反応性免疫応答を誘起および／または増強することに関する。ここに記載した本発明の方法は、ワクチンとしてのおよび／またはがんや感染性病原体（ウイルスなど）に対する免疫療法としての抗原パルス化樹状細胞の臨床的使用を含むがこれらに限らない広範囲の用途を有する。２．発明の背景 2.1. 免疫応答の生起生体に外来抗原が侵入すると、生体はＴ細胞およびＢ細胞として知られる２つの機能的に区別されるリンパ球集団により仲介される細胞性免疫応答と体液性免疫応答の２つの主要な成分からなる免疫応答を誘起する。Ｔ細胞は機能と表現型により２つのサブセットにさらに分割できる。１つのＴ細胞サブセットは、免疫系において各種の他の細胞型を「助ける」または活性化するリンホカインを産生することによって抗原刺激に応答する。もう１つのＴ細胞サブセットは、抗原陽性標的細胞を直接破壊する能力がある抗原特異的な細胞障害性エフェクター細胞へと発達することができる。一方、Ｂ細胞応答は主として分泌タンパク質の抗体によって行われる。抗体は抗原を中和することにより、あるいは抗体依存性細胞毒性を仲介する際に免疫系の他のエフェクター細胞と共同して働く。ヘルパーＴ細胞（ＴH）は、ＣＤ４と呼ばれる糖タンパク質マーカーをそれらの細胞表面に発現することにより、古典的な細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＢ細胞とは区別できる。ＣＤ４⁺ＴH が機能するメカニズムは十分には解明されていないが、ＣＤ４⁺Ｔ細胞画分内に機能的に異なるサブセットが存在することが報告されている(Mosmann and Coffman，1989，Ann．Rev．Immunol．7:145 -173)。マウスでは、１型ヘルパーＴ細胞（ＴH1）が活性化後にインターロイキン-2（IL-2）とγ−インターフェロン（γ-IFN）を産生するのに対し、２型ヘルパーＴ細胞（ＴH2）はIL-4とIL-5を産生する。リンホカイン産生の様相に基づくと、ＴH1はＣＴＬを含めた他のＴ細胞サブセットの活性化と増殖を促進することに関与しているようだが、ＴH2はＢ細胞の増殖と分化、抗体の合成、抗体のクラススイッチを特異的に調節している。一部のＣＤ４⁺Ｔ細胞は、ＣＤ８⁺ＣＴＬと同様に、細胞障害性エフェクター機能ももつようである。第２のＴ細胞サブ集団はＣＤ８表面マーカーを発現する古典的なＣＴＬである。大部分のＴH と違って、これらの細胞は標的細胞との直接接触の際に細胞溶解活性を示すが、それらはある種のリンホカインを産生する能力も持ち合わせている。in vivo において、抗体応答のみでは不十分な場合にＣＴＬ機能が特に重要となる。ウイルス感染やがんに対する防御においては、Ｂ細胞とそれらの抗体産物よりもむしろＣＴＬが主要な役割を果たしているとする実験的証拠が優勢を占めている。Ｔ細胞とＢ細胞の両応答の著しい特色は免疫抗原に対するそれらの完ぺきなまでの特異性である。しかし、抗原認識のメカニズムはこれら２つの細胞型間で異なっている。Ｂ細胞は、細胞表面受容体として作用するか、または固体表面上のもしくは溶液中の抗原に直接結合する分泌タンパク質として作用する抗体により抗原を認識する。一方、Ｔ細胞は、小さい断片に処理または分解されて、抗原提示細胞の表面などの固相上に提示された抗原を認識するにとどまる。さらに、抗原断片は主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるクラスＩまたはクラスII分子とともにＴ細胞に提示されねばならない。ＭＨＣはさまざまな免疫学的機能を有するタンパク質をコードしている遺伝子類のクラスターを指す。ヒトでは、ＭＨＣはＨＬＡとして知られている。クラスＩ遺伝子産物はあらゆる体細胞に存在しており、もともとは主な移植拒絶反応の標的として発見されたものである。クラスII遺伝子産物は大部分が種々の造血系統の細胞で発現されており、免疫系における細胞−細胞相互作用に関与している。最も重要な点は、ＭＨＣコード化タンパク質がＡＰＣの表面上で処理された抗原断片の受容体として機能していることがわかったことである(Bjorkmanら，1987，Nature 329: 506-512 )。 2.2. 抗原提示細胞Ｔ細胞への抗原の提示は抗原提示細胞（antigen presenting cell: APC）と呼ばれる特殊な細胞集団により行われる。一般的に、ＡＰＣにはマクロファージ／単球、Ｂ細胞、および骨髄由来の樹状細胞（dendritic cell: DC）が含まれる。ＤＣは「プロフェッショナル」ＡＰＣと呼ばれることもある。ＡＰＣは外因性抗原を内在化して、それらを酵素に富む小胞内でより小さい断片に切断し、そして細胞表面上での発現のためにＭＨＣコード化クラスＩまたはクラスII産物にそれらの断片を結合させることができる（Goldberg and Rock，1992，Nature 357: 3 75-379）。ＡＰＣはＭＨＣによりコードされるクラスＩとクラスIIの両方の糖タンパク質を発現しているので、それらは免疫応答の開始のためにＣＤ４⁺Ｔ細胞とＣＤ８⁺Ｔ細胞の両方に抗原断片を提示することができる。定義によると、ＡＰＣは抗原特異的受容体をもつＴ細胞に抗原を提示できるのみならず、Ｔ細胞の活性化に必要なあらゆるシグナルを提供することができる。こうしたシグナルは十分には定義されていないが、おそらくサイトカインや成長因子だけでなく種々の細胞表面分子を含む。さらに、ナイーブつまり非感作Ｔ細胞の活性化に必要な因子は、すでに感作された記憶Ｔ細胞の再活性化に必要とされる因子と異なっているかもしれない。ＡＰＣが抗原を提示しかつＴ細胞活性化のためのシグナルを送る能力は、一般にアクセサリー細胞機能と言われている。単球とＢ細胞はコンピテントＡＰＣであることがわかっているが、in vitroでのそれらの抗原提示能はすでに感作されたＴ細胞の再活性化に限られるようである。それゆえ、それらは機能的にナイーブな、つまり感作されていないＴ細胞集団を直接活性化することはできない。ＡＰＣが抗原を処理してＴ細胞に提示できることは久しく知られているものの、小さな抗原ペプチドがＭＨＣコード化分子に直接結合できることは、比較的最近まで知られていなかった（Babbitら，1985，Nature 317: 359; Townsend ら， 1986，Cell 44: 959）。しかしながら、通常、複雑な抗原はＡＰＣの内部で加水分解的に断片へと処理されて、細胞内でＭＨＣコード化タンパク質と物理的に会合してから、複合体として細胞表面に移行すると考えられる。抗原提示のための２つの異なる経路が提案されている（Bracialeら，1987，Immunol．Rev．98:95- 114）。外因性抗原はＡＰＣによって取り込まれ、処理されて外因的経路でクラスII制限ＣＤ４⁺Ｔ細胞に提示されるが、一方、内因的経路は、ＭＨＣクラスＩタンパク質との会合とＣＤ８⁺ＣＴＬへの提示のために、ウイルス感染細胞内のウイルス遺伝子産物などの合成タンパク質を細胞内で処理すると考えられた。抗原処理および提示における２つの経路はいくつかの点で今もなお正しいかもしれないが、外因的に加えられた抗原もクラスＩ制限ＣＴＬに提示され得るという最近の知見を考慮すると、その区別はぼやけてくる（Moore ら，1988，Cell 54:77 7）。「樹状細胞」という用語は、さまざまなリンパ系または非リンパ系の組織に存在する形態学的に類似した細胞型の多様集団を指す（Steinman，1991，Ann．Rev ．Immunol．9:271-296）。これらの細胞には、脾臓のリンパ系ＤＣ、表皮のランゲルハンス細胞、および血液循環系のベール細胞が含まれる。それらは形態、高レベルの表面ＭＨＣクラスII発現、そしてＴ細胞、Ｂ細胞、単球およびナチュラルキラー細胞上に発現されるその他の表面マーカーの不在に基づいて一群として集合的に分類されているが、それらが共通の前駆細胞に由来するのか、すべてが同じやり方でＡＰＣとして機能し得るのか、については現在のところ不明である。さらに、大多数の研究報告はマウス脾臓から単離したＤＣを利用しているので、こうした研究結果は他の組織型から得られたＤＣの機能と必ずしも相関しないかもしれない（Inaba ら，1987，J．Exp．Med．166:182-194; Hengelら，1987， J．Immunol.，139:4196-4202; Kastら，1988，J．Immunol.，140:3186-3193; Ro maniら，1989，J．Exp．Med．169:1169-1178; Macatonia ら，1989，J．Exp．Me d．169:1255-1264; Inaba ら，1990，J．Exp．Med．172:6631-6640）。例えば、高レベルのＭＨＣクラスII発現にもかかわらず、マウス表皮ランゲルハンス細胞は、脾臓ＤＣと違って、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）とともに培養しないかぎり、混合リンパ球反応(MLR)において活性ＡＰＣとはならない（Witmer-Pock ら，1987，J．Exp．Med．166:1484-1498; Heufler ら，1988 ，J．Exp．Med．167:700-705）。ほとんどのヒトランゲルハンス細胞はＣＤ１およびＣＤ４マーカーを発現するが、新たに単離した血液ＤＣはＣＤ４を弱く発現するもののＣＤ１は発現しない。一方、培養した末梢血ＤＣはＣＤ１ｃを発現するがＣＤ４を発現しない。さらに、マウスＤＣにおいて観察された機能的特徴がどの程度ヒトＤＣ（特に、非脾臓組織から得られたＤＣ）に適用可能であるのか、まだ確定されていない。それは一部にはヒト免疫系とマウス免疫系の生来の相違によるものである。その上、in vivo におけるヒトＤＣの働きは本発明以前には研究されたことがなかった。マウスリンパ腫細胞のイディオタイプタンパク質に露出したマウス樹状細胞は、in vivo で腫瘍免疫性を引き出すことが報告されているが、こうした成功がヒト患者において実証されたことはない（Bohlenら，1991，Internationa l Publication No．WO91/13632）。このような方策が臨床的使用に適しているとする証拠は当分野にはない。実際、当分野では、がんは複雑な病気であって、モデル動物で行った治療からヒトにおけるその成功の可能性を十分に予測できないことは周知である。ヒトがんの治療法の有効性および毒性は、すべての変動要因が存在する臨床的背景においてのみ適切に試験され得るのである。３．発明の概要本発明は、抗原特異的免疫応答を誘導および／または増強するための、単離して抗原でパルスしたヒトＤＣのＡＰＣとしてのin vivo 使用に関する。本発明はまた、かかる細胞を含む医薬組成物に関する。本発明は、一部には、逐次密度勾配遠心によりヒト血液から部分精製されたヒトＤＣがＢ細胞リンパ腫患者の生体内で強力なＡＰＣとして機能するという出願人の発見に基づくものである。以下の実施例６に示すように、単離した自己由来のＤＣを、患者のリンパ腫細胞から「常法により調製した(custom made)」免疫グロブリンでパルスして患者に再注入すると、イディオタイプ特異的Ｔ細胞の増殖応答が検出される。最も重要な点は、このような治療期間にわたり患者の腫瘍が実質的に退縮することである。ここに記載する本発明には、一次免疫応答を開始させるためのワクチンとしてのおよび／または二次免疫応答を増強するための免疫療法としての抗原パルス化ＤＣのin vivo 投与を含むがこれらに限らない、さまざまな用途が考えられる。こうした応答は腫瘍抗原（例えば、リンパ腫イディオタイプ、ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質、メラノーマ抗原MAGE、オンコジーン産物）から感染性病原体（例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)）に及ぶ、対象のいかなる抗原に対しても引き出すことができる。４．図面の簡単な説明図１治療中の示した時点で採取した患者の血液の“FICOLL/HYPAQUE”勾配遠心により末梢血リンパ球を単離した。細胞を1%ヒトAB血清を含むIscove's改良Du lbecco's培地(IMDM)にKLH または自己由来の免疫グロブリンイディオタイプとともに４×10⁵個／マイクロタイターウェルでまいた。３日間の培養後、細胞を分割して、5% FCSと30単位/ml のIL-2を含むIMDMを供給した。5% CO₂の雰囲気下37 ℃で合計５日間培養した後、細胞を１μci/ ウェルの³H-チミジンで16時間パルスした。データは４通りの培養物の１分あたりの平均カウント数として表してある。図2A-2D 免疫グロブリンパルス化ＤＣで治療する前および４回目の免疫感作（任意のブースター）の２ヵ月後に、胸部の連続コンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）を行った。図2Aおよび2Bは大動脈傍(paraaortic)アデノパシーの退縮を示す。図2Cおよび2Dは心臓傍塊(paracardiac mass)および大動脈傍アデノパシーの退縮を示す。治療に先立って、これらの結節塊はゆっくりと進行していることが証明された。５．発明の詳細な説明免疫グロブリンまたは抗体分子はＨ鎖とＬ鎖からなるポリペプチドで、そのアミノ末端に高度に特異的な可変部を有する。Ｈ鎖およびＬ鎖の可変部は集合して免疫グロブリンタンパク質の特異な抗原認識部位を形成している。これらの可変部はそれら自体が免疫系によって抗原として認識され得る抗原決定基を含み、それらをイディオタイプと言う。Ｂ細胞の悪性疾患（Ｂ細胞リンパ腫、白血病および骨髄腫）は、Ｈ鎖およびＬ鎖に特異な可変部を有する単一の免疫グロブリン分子（またはモノクローナル抗体）を合成する腫瘍細胞のクローン増殖の産物である。このような腫瘍は起源が単クローン性であるので、患者の所定の腫瘍の全細胞により発現される免疫グロブリンは同一であり、その特異なイディオタイプによって正常なＢ細胞と区別することができる。Ｂ細胞リンパ腫は成熟リンパ球の腫瘍であり、一般にはその細胞表面に免疫グロブリンを発現する。したがって、Ｂ細胞リンパ腫の表面免疫グロブリンのイディオタイプ抗原決定基は、身体の他のどのような組織によっても発現されないので、悪性クローンの腫瘍特異的マーカーとして利用できる。動物およびヒトでの研究により、免疫グロブリンのイディオタイプは腫瘍特異的抗原として、また、in vivo 受動免疫療法の標的として有用であることが示された（Campbellら，1990，J．Immunol．145:1029; Campbellら，1988，J．Immun ol．141:3227）。悪性Ｂ細胞上のイディオタイプ抗原決定基に対する能動免疫は同系腫瘍のいくつかのモデル動物で腫瘍増殖に対して抵抗性を、そして株化腫瘍に対して特異的な抗腫瘍治療をもたらした（Campbellら，1988，J．Immunol．14 1:3227; Georgeら，1988，J．Immunol．141:2168）。さらに、ヒト以外の霊長類での前臨床研究から、ヒトリンパ腫由来の免疫グロブリンによる最適な免疫感作には、このタンパク質と免疫原性の強い担体タンパク質（例えばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)）との複合体化およびアジュバント中での乳化が必要であることが実証された。最近の研究では、病気の活動度が最も小さい数人のリンパ腫患者に、KLH に結合させたイディオタイプタンパク質を実験的アジュバント製剤中に乳化したものを繰り返し注入した(Kwakら，1992，New Eng．J．Med．327:1209)。最適な免疫感作状態はKLH のような免疫原性タンパク質とアジュバントの両方の使用を必要とした。アジュバントの不在下では、ないに等しいイディオタイプ特異的免疫応答しか観察されなかった。しかし、KLH-イディオタイプとアジュバントの組合せで治療した数人の患者はin vitroで抗イディオタイプ免疫応答を示し、重大な病気を抱える二人の患者は客観的な腫瘍退縮を経験した。ところが、免疫学的アジュバントの使用は毒性を伴った。さらに、容認されているヒトのアジュバントであるミョウバンは抗イディオタイプ応答を引き出すのに効果的でない。本発明は、骨髄移植をするのに適格でない非ホジキンＢ細胞リンパ腫患者が、かれら自身のＤＣと自己由来の腫瘍細胞から単離・精製した免疫グロブリンイディオタイプとのin vitroインキュベーション後のこれら細胞を注入することに耐えられることを実証する。患者は腫瘍関連イディオタイプに対する免疫応答および腫瘍量の退縮を生じることを知らされる。免疫グロブリンのような単離抗原の免疫原性は弱いことがあり、免疫をうまく誘起させるには免疫原性担体への抗原の結合と免疫原性アジュバントの使用が必要であるので、抗原パルス化ＤＣはin vivo での抗原提示においてこれら２つの要件に取って代わることができる。ここに記載する特定の手順および方法は、ヒト血液から単離したＤＣおよび抗原としてのリンパ腫由来の免疫グロブリンを用いて例示されるが、それらは本発明を実施するための単なる例示にすぎない。類似の手順および技術は同様に適用可能である。かくして、ここに記載する方法の変法を用いて、ＤＣが存在する任意の供給源からＤＣを単離し、任意の抗原またはその断片でパルスし、そして該抗原を発現する細胞または組織を含む患者に、このような細胞および組織の免疫学的破壊のために再注入することができる。 5.1. ヒト樹状細胞の単離本発明は、in vivo でのＴ細胞の活性化のためにＤＣを用いる抗原提示系に関する。ＤＣはほとんどの組織中に少数しか存在しないため、まずＤＣを単離して富化する必要がある。ＤＣはリンパ系と非リンパ系の両方の組織に見られるが、天然の容易に入手できるヒトＤＣの供給源は末梢血であり、末梢血は白血球100 個につき１個より少ないＤＣを含むと推定される。抗原提示におけるＤＣのアクセサリー細胞機能の効力により、富化した場合には比較的少数でのこれら細胞の使用が可能であり、in vivo でのＴ細胞応答の生起にとって絶対的な純度は必要でない。しかしながら、in vivo 投与には高度に精製したＤＣ集団（＞90％）を用いることが最も好ましい。ＤＣは正常なヒトから、または病気にかかっている患者から単離することができる。さらに、単離に先立ってＤＣの数を増やすためにこれらの個体をコロニー刺激因子で処理してもよい。例えば、ＤＣ精製用の末梢血単核白血球を得る前に、GM-CSF(“LEUKINE”，Immunex Corporation，Seattle，WA)を250 mcg/m²/ 日で数日ないし３週間個体に注入する。この方法は抗原パルスとその後の注入のためのＤＣの収量を高めるだろう。ヒトＤＣは、各種の分離法を使って、それらが存在するあらゆる組織から単離し得る。以下の実施例６に、ヒト末梢血からＤＣを単離するためのこのような方法の変法を例示する。この方法は特に、末梢血白血球の分離に用いられるウシ胎児血清、ヒツジ赤血球、マウスモノクローナル抗体などの抗原へのＤＣの露出を避けるように設計される。ＤＣは、他の外因的に加えられた抗原の不在下でさえも、このようなタンパク質をＴ細胞に提示する能力があるので、従来のＤＣ単離法は対象抗原に特異的でなく、それゆえ求める応答をマスクする可能性のあるＴ細胞活性化に結びつく。本発明のこの態様によると、ヒト末梢血単核白血球(PBM L)は、血液サンプルから、特に搬出(apheresis)により調製されたバフィーコートまたは白血球から、“FICOLL HYPAQUE”勾配遠心と、これに続く“PERCOLL” 不連続遠心(Markowicz and Engleman，1990，J．Clin．Invest．85:955)と、これに続く“METRIZAMIDE”（2-[3-アセトアミド-5-N- メチル- アセトアミド- 2, 4,6- トリヨードベンズアミド]-2-デオキシ-D- グルコース）または“NYCOPREP 1.068”NYCODENZ，N,N’-ビス(2,3- ジヒドロキシプロピル)-5-[N-(2,3-ジヒドロキシプロピル)アセトアミド]-2,4,6-トリヨード- イソフタルアミド不連続遠心により単離できる。高浮遊密度(HD)画分はγδおよびαβ- Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞を含み、一方、ＤＣは“METRIZAMIDE”または“NYCOPREP 1.068” の低浮遊密度(LD)画分中に存在する。その後ＬＤ画分を２回目の“METRIZAMIDE ”または“NYCOPREP 1.068”勾配にかけて、さらに富化されたＤＣ集団を得ることができる。ＤＣはまた、必要とされる純度に応じて、追加のプロトコールを使ってさらに富化させてもよい。単離したＤＣは直ちに対象の抗原でパルスされ得る。別法として、反復密度勾配遠心、正の選択(positive selection)、負の選択(n egative selection)、またはこれらの組合せを含む方法によりＤＣを単離することもできる。しかしながら、上記の密度勾配遠心法が好適である。なんとなれば、それらは対象の外因性抗原の添加前にＤＣが内在化して提示し得るマウス抗体やヒツジ赤血球の形の異種タンパク質を含まないからである。正の選択法はＤＣ表面マーカーに対する抗体によるアフィニティークロマトグラフィーを利用し得る。しかし、正の選択にはＤＣ特異的抗原決定基を認識する抗体を必ずしも使用する必要はない。例えば、まず初めにＤＣ含有画分から密度勾配遠心、プラスチック付着、およびＦｃ受容体パンニング後にＢ細胞と単球を除き、次に、ＤＣについて正の選択を行うべくＭＨＣクラスII抗原に対する抗体を使用できる。負の選択は先に記載したプロトコールの改変を含む。基本的には、ＤＣ含有細胞調製物を、非ＤＣの除去のためにＤＣが発現しない細胞表面抗原に対する抗体１種以上と反応させる。任意のＴ細胞、Ｂ細胞、単球および顆粒球マーカーに対する抗体を使用できる。こうした抗体の例として、Ｔ細胞に特異的な抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ５および抗ＣＤ８；Ｂ細胞に特異的な抗ＣＤ１２、抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０；単球に特異的な抗ＣＤ１４；およびナチュラルキラー細胞に特異的な抗ＣＤ１６および抗ＣＤ５６が挙げられる(B ecton Dickinson，San Jose，CA およびOrtho Diagnostics，NJ)。これらの抗体はＤＣの富化のために任意の組合せで繰り返しまたは逐次的方法で使用される。抗体への結合後、細胞は次のようにして分離することができる。細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体の大多数はマウス由来のものであるから、抗マウス抗体を被覆した固相表面に吸着させる；または、抗体がビオチンと結合しているのであれば、アビジンまたはストレプトアビジン被覆表面により抗体結合細胞を分離できる；または、抗体が磁気ビーズに結合しているのであれば、抗体により認識される抗原を発現している細胞は磁場におくことにより分離できる(Harlo w and Lane，1988，Antibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor La boratory Press)。 5.2. 抗原提示細胞としての樹状細胞の使用免疫応答の開始はＡＰＣにより仲介されるが、ＡＰＣは酵素的分解によって複雑な抗原をより小さな断片へと処理して、ＭＨＣコード化分子と会合したそれら断片をＴ細胞に提示する。マクロファージ／単球がＡＰＣとして最も広く研究されているが、マウスＤＣも強力なアクセサリー細胞機能をもつことが明らかにされている。本発明では、ヒト血液から単離したＤＣがin vivo で抗原特異的Ｔ細胞の活性化のために抗原を提示することを実証する。 5.2.1. 樹状細胞による提示のための抗原系ＤＣの強力なアクセサリー細胞機能は、Ｔ細胞とＢ細胞がそれらの特異的受容体を介して認識し得るほとんど全ての抗原エピトープのための抗原提示系を提供する。以下の実施例６には、ＤＣがin vivo で抗原としての免疫グロブリンイディオタイプをＴ細胞に提示できることを示す。Ｔ細胞の活性化は抗原に応答する際のＴ細胞の増殖により証明される。それゆえ、ＤＣはウイルス、微生物などの感染性病原体によりコードされる抗原ならびにがん細胞により発現される腫瘍抗原の提示においてin vivo で有用であり得る(Urban and Schreiber，1992，Ann ．Rev．Immunol．10: 617-644)。本発明に適用できる感染性病原体としては、細菌、寄生体、真菌およびウイルスがあるが、これらに限らない。ＤＣが処理して提示し得る、これら病原体によりコードされる抗原には外部表面タンパク質と、内部酵素を含めた構造タンパク質とが含まれるが、これらに限らない。例えば、env、gag、pol、nef、vif、rev およびtat 遺伝子を含むＨＩＶゲノムの遺伝子によりコードされる抗原は、全てがin vivo でＤＣにより提示され得る。さらに、肝炎Ｂ型ウイルス、肝炎Ｃ型ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘−帯状疱疹ウイルス、ブドウ球菌種、およびマイコバクテリウム種を含めて、種々の他の感染性病原体が本発明の範囲に包含される。腫瘍特異的抗原としての免疫グロブリンイディオタイプのほかにも、多くのヒト腫瘍関連抗原がモノクローナル抗体によって同定されている(Reisfeld and Ch eresh，1987，Adv．Immunol．40: 323-377)。これらの細胞性抗原はいくつかの腫瘍細胞によって比較的多量に選択的に発現されているものの、それらががん患者の体内で免疫応答を自然に誘起するのか、またはこのような応答を引き出すために効果的に使用し得るのか、いまだ確立されていない。腫瘍細胞または腫瘍抗原を用いる高度免疫処理によって腫瘍反応性のＴおよびＢ細胞を誘導できる動物腫瘍モデルと違って、承認された臨床プロトコールなしではヒトにおいてヒト腫瘍細胞そのものまたはオンコジーンのタンパク質を容易に試験することはできない。したがって、ほとんどのヒト研究では、がん患者から得られたリンパ球（おそらく体内で自己由来腫瘍細胞が発現した抗原に露出されたもの）を利用してきた。しかしながら、いくつかの系では、腫瘍の進行がサプレッサー細胞により仲介される腫瘍特異的免疫応答のダウンレギュレーションを伴うことが明らかにされた。もしそうであれば、がん患者から単離したＴ細胞は、腫瘍−免疫宿主から得られたＴ細胞と同様には機能しないようにin vivo でこのような抑制の影響下にすでに入っているかもしれない。さらに、ヒト腫瘍反応性Ｔ細胞を活性化するこれらの試みは一般にＡＰＣとして単球を使用してきたが、単球は、特にそのＴ細胞が腫瘍抗原に対してin vivo で十分に感作されていない場合、ＤＣよりも効果がかなり劣ることが判明した。ここに記載する抗原パルス化ＤＣはin vivo で腫瘍抗原を提示するための細胞性アジュバントとして用いることができる。ＤＣの強力なアクセサリー細胞機能は、その免疫応答がin vivo で腫瘍を消失させるには明らかに不十分ながん患者のＴ細胞に、in vivo で腫瘍抗原を提示することができる。生存能のあるまたは照射された全腫瘍細胞、腫瘍膜調製物、および天然の供給源から精製されたまたは組換え産物として発現された腫瘍抗原はどれもin vitroでＤＣをパルスするために使用し得る。最近、オンコジーンの産物がマウスＴ細胞活性を誘導し得ることがわかった。例えば、ラット遺伝子産物ｐ２１のオンコジーン形態、およびbcr-abl 遺伝子の融合産物ｐ２１０は、マウスを免疫するために用いたとき、Ｔ細胞増殖応答を引き出す（Peace ら，1991，J．Immunol．146: 2059-2065; Chenら，1992，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 89: 1468-1472）。したがって、アミノ酸置換の結果として正常細胞の対応物と異なっているオンコジーンのタンパク質は、Ｔ細胞によって認識され得る新しい免疫原決定基をもつかもしれない。こうしたタンパク質は細胞表面に発現される必要はない。細胞質および核のタンパク質は細胞内で処理を受け、ＭＨＣコード化産物に結合して、複合体の形で細胞表面に移動するからである(Gould ら，1989，J．Exp．Med．170: 1051-1056)。オンコジーン産物は結腸がん、白血病、リンパ腫などのさまざまな腫瘍型で発現されるので、抗原パルス化ＤＣはこうしたがんに対してin vivo でＴ細胞を活性化するために使用できる。いろいろなタイプのがんと関連している他の分子も本発明に包含され、それらには、制限するものではないが、HER-2/neu 遺伝子産物（米国特許第4,968, 603 号）、エストロゲン受容体、乳脂グロブリン、ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質（Levine，1993，Annu．Rev．Biochem．62:623）、ムチン(Taylor-Papadi mitriou，1990，国際公開 WO90/05142)、テロメラーゼ、核マトリックスタンパク質、MART-1、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3（van der Bruggen ら，1991，Science 254:1643; Celis ら，1994，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:2105）、GP100(Ba kker ら，1994，J．Exp．Med．179:1005)、がん胎児性抗原、チロシナーゼおよびパピローマウイルス抗原がある。細胞またはウイルスに由来する、細菌、寄生体、真菌、ウイルスおよび腫瘍の抗原は、ＤＣ培養物に添加した後のインキュベーションにより、飲作用による取込み後のピノソームの浸透圧溶解により（Moore ら，1988，Cell 54: 777-785）、または抗原含有リポソーム内の取込みにより、ＤＣに導入され得る。抗原は精製形態の天然に存在する完全ポリペプチド、精製形態の組換え完全ポリペプチド、生存または死滅形態の全生物または細胞、酵素的消化により得られたタンパク質断片、または固相化学合成により製造された合成ペプチドとして用いられる(C reighton，1983，Protein Structures and Molecular Principles，W.H．Freema n and Co.，N.Y．pp 50-60)。ＤＣをパルスするのに必要な抗原量はその分子の性質、大きさおよび純度に応じて変化する。一般には、ポリペプチドは１〜100 μg/mlで用いられ、小型のペプチドは１〜50μg/mlで用いられる。ピノソームの浸透圧溶解による導入には、200 〜500 μg/10⁶APC の範囲の、より多量のタンパク質が必要となる。また、対象の特定抗原をコードする外因性遺伝子または該遺伝子もしくはその部分を含む発現べクターを、トランスフェクション、組換えワクシニアウイルスおよびレトロウイルスを含む慣用法により、ＤＣに組み込むこともできる(Sambrookら，1989，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，C old Spring Harbor Laboratory Press)。このアプローチは組み込まれた遺伝子の連続発現を生じさせ、遺伝子産物によるＭＨＣ占拠をもたらす。外因性抗原をＤＣに導入するための上記方法並びに当業者が常用する他の方法を、以後、ひとまとめにしてＤＣの抗原パルス(antigen pulsing)と言う。 5.2.2. in vivo での一次および二次Ｔ細胞応答の誘導本発明は、抗原に対するヒト患者の免疫応答を活性化する方法に関する。この方法は、ヒトＤＣを、好ましくは末梢血から、単離すること、該細胞をin vitro で抗原によりパルスすること、その後細胞または組織が該抗原を発現している患者に抗原パルス化細胞を投与することを含む。抗原を処理して、抗原断片を数日間保持するＤＣの能力は、強力な免疫原としてのそれらのin vivo 使用を可能にする。上記第5.2.1 節に記載した各種の方法にしたがってＤＣを抗原でパルスし、洗浄した後、すでに存在するが弱いＴ細胞応答を誘起または増強するためにワクチンとしておよび／または免疫療法剤としてin vivo 投与する。抗原パルスとその後のin vivo 投与のために、単離したＤＣの数を増やそうとする場合は、抗原とのインキュベーションに先立って単離細胞の数を増加させる。GM-CSFと腫瘍壊死因子αはヒト造血前駆細胞のＤＣへの分化を誘導することがわかっている (Cauxら，1992，Nature 360: 258)。こうして、単離したＤＣは培養下にこのようなサイトカインで処理することにより増やすことができる。抗原パルス化ＤＣによる免疫感作は、応答の強さと特異性の両方を高めることができる。こうした免疫感作を数日間または数週間の間隔で繰り返すことが好ましいかもしれない。ＤＣのＡＰＣとしての効力は応答を増強するための慣用アジュバントの使用の必要性を少なくするが、免疫反応をさらに高めるためのアジュバントの使用を排除するものではない。さらに、抗原パルス化ＤＣは、in vivo でそれらの数および活性を長期間維持できるサイトカインとともに投与してもよい。この種のサイトカインにはGM-CSFなどのコロニー刺激因子およびIL-12 などのインターロイキンが含まれる。抗原パルス化ＤＣは、Ｔ細胞の増殖、Ｔ細胞の細胞障害性、抗体生産または抗原陽性細胞または組織の数の減少を測定するアッセイで検出したとき免疫応答を引き出すのに十分な濃度で、公知の生理食塩水中に浮遊させる。患者には通常、単離して抗原でパルスしたＤＣの総数を投与する。それぞれの単離法後のＤＣの収量に応じて、数百万から数億個のＤＣを患者に注入し得る。細胞はオートロガス(autologous)患者に、ＨＬＡ適合の同種患者に、またはＨＬＡ不適合の同種患者にさえも注入することができる。６．実施例：自己由来免疫グロブリンイディオタイプでパルスしたヒト樹状細胞により誘導されたＢ細胞リンパ腫の退縮 6.1. 材料および方法 6.1.1. 細胞の分離ヒトＤＣは白血球搬出後のリンパ腫患者のバフィーコートから得た。PBMLは“ FICOLL HYPAQUE”勾配遠心により単離した(Boyum，1968，J．Clin．Lab．Invest : 21:21-29)。簡単に述べると、バフィーコートをCa²⁺やMg²⁺などの２価イオンを含まないDulbecco's PBS（DPBSという）で10mlに希釈した。10mlの“FICOLL” を各チューブの底に穏やかに入れ、室温にて1000×g、35分遠心した。界面を集め、DPBSで３回洗った。残存する単核細胞画分から各種の細胞集団をさらに分離するため、調製物を４層不連続“PERCOLL”勾配（30%，40%，50.5% および 75%）(Pharmacia，Uppsala ，Sweden)でさらに分画化した(Markowicz and Engleman，1990，J．Clin．Inves t．85:955)。もとの“PERCOLL”密度は1.130g/ml DPBSで調製し、50.5%“PERCOL L”溶液15mlを調製し、円錐形のポリプロピレンチューブ中で揺すって“PERCOLL ”溶液の表面に泡を発生させた。このチューブの底に約6.5ml の75%“PERCOLL” を徐々に入れ、次にゆっくり回転させたチューブの壁面に沿って滴下して３〜3. 5ml の40%“PERCOLL”を重層し、次に同様にして2.5ml の30%“PERCOLL”を重層した。約４時間以内に使用するように勾配を氷上で保持した。 5%ヒト血清を補給したDPBS 5〜10ml中の2.5〜３×10⁸個のPBMLを４層不連続“ PERCOLL”勾配上に載せた。細胞を４℃で1000×g、20〜25分遠心した。“PERCOL L”50.5% 層上の界面からＬＤ細胞（単球）を集め、一方、リンパ球とＤＣは75% 層と50.5% 層の界面から集めた。集めた細胞画分を少なくとも３倍容量のDPBS で希釈し、４℃で1000×g、12分遠心した。5%ヒト血清を補給したDPBSを用いて２回、４℃で400 ×g、５〜６分の遠心により細胞を洗った。次に、ＨＤ細胞（10% のプールしたヒト血清を含むRPMI 50ml につき３〜７× 10⁸個）をテフロン容器内で37℃にて一夜培養した。その後、培養細胞を10mlの1 5.5%(wt/vol)“METRIZAMIDE”(Sigma Chemical Co.)の上に載せ、室温で650 ×g 、10分遠心することにより、“METRIZAMIDE”（15.5%）の勾配遠心にかけた。この画分から、ヒトIgG 被覆ペトリ皿上での約20分間の固相吸着法により、混入している単球をさらに除いた。IgG はヒトでの静脈内使用について試験して承認を受けた市販の製剤であった。次に、２回目の“METRIZAMIDE”勾配(14%)にかけてＤＣを富化させた。１回目の“METRIZAMIDE”勾配から得られたＨＤ細胞はαβ およびγδ−Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞の混合物からなるものだった。この方法を用いて得られたＤＣの純度は60〜90% であった。また、ＤＣは一夜培養後に“NYCOPREP 1.068”不連続勾配(Nycomed Pharma AS ，Oslo，Norway)による遠心にかけて富化させることもできる。約2.5 ×10⁸個の細胞を85% DPBS、10% ヒト血清および5% EDTA からなる溶液 15 〜20ml中に浮遊させた。この下に順次 50%ヒト血清、10% EDTAおよび10% DPBSの溶液４〜５ml、次に75%“NYCOPREP 1.068”、24% DPBSおよび1% ヒト血清の溶液４ml、続いて10 0%“NYCOPREP 1.068”８mlを入れた。細胞は室温で400 ×g、13分遠心した。界面とペレットを集め、10% ヒト血清を含むDPBS少なくとも３倍容量で希釈し、20 ℃で800 ×g、12分遠心した。細胞を室温にてRPMI中の10% ヒト血清で２回洗った。ＤＣは全細胞集団の30〜40% を占めていた。しかし、これらの細胞を“NYCO PREP”遠心にもう１回かけることによりさらに富化させることができ、80〜90% ＤＣのＬＤ画分を得ることができた。これとは別に、最初の“NYCOPREP”段階の後のＬＤ細胞を負の選択に付すため抗体被覆ペトリ皿とインキュベートすることにより、ＣＤ３⁺、ＣＤ１４⁺、ＣＤ１６⁺およびＣＤ２０⁺細胞を除くことができた。非付着細胞集団も80〜90% のＤＣを含んでいた。しかし、白血球マーカーに対する抗体の形の異種タンパク質の使用を避けるために、密度勾配遠心が好適であった。ここに記載した方法はどれも400 〜500ml の全血から１〜2.5 ×10⁶個の収量の細胞をもたらすことができた。それぞれのＤＣ富化段階後のＤＣの純度は、フルオレセインに結合させた抗 HLA-DR（抗 MHCクラスII）抗体(CA141)とフィコエリトリンに結合させた抗CD14 （抗単球）で染色することにより測定した。全細胞集団のフルオログラフィー分析は蛍光活性化セルソーターで評価した。HLA-DR⁺でCD14^-の細胞がＤＣ集団に相当した。 6.1.2. 腫瘍免疫グロブリンイディオタイプの生産全ての患者は組織病理学的に非ホジキンのリンパ腫であると診断された。腫瘍の免疫表現型研究から、それらはＢ細胞由来のものであり、単一タイプのパターンでＨ鎖とＬ鎖からなる免疫グロブリン分子を表面に発現していることがわかった。低グレードのＢ細胞リンパ腫を有し、しかも骨髄移植をするのに適格でない患者が選ばれた。全患者の臨床疾患を評価するために用いたベースライン研究は完全な理学的検査、胸部Ｘ線撮影、日常的な血球算定および化学試験、腹部および骨盤のＣＴスキャンを含み、二足性リンパ管造影は行っても行わなくてもよく、これらは全てリンパ腫患者のルーチンの臨床ケアの一部であった。ベースラインで用いられる客観的手法にしたがってこの研究の間に全てが再ステージング(r e-staging)を受けた。精製後に抗原として使用するための免疫グロブリンをＢ細胞リンパ腫に分泌させるために、腫瘍バイオプシー検体から得られた細胞浮遊液をリン酸緩衝溶液(P BS)で洗い、HAT 感受性ヘテロハイブリドーマB5/K6H6(B5)と１：４または１：５（融合相手：腫瘍細胞）の比率で混合した。Ｂ５はNS-1マウスミエローマ融合相手とヒトリンパ腫細胞との融合により作製されたヘテロハイブリドーマである。Ｂ５クローンは免疫グロブリンを自然分泌する能力を失っている。ヒトＢ細胞と融合したとき免疫グロブリン分泌能を保持しているサブクローンを同定した。このサブクローンは、HAT 培地で生き残れないようにドラッグマーク(drug-mark) された。Carroll らの研究(1986，J．Immunol．Methods 89:61)は、Ｂ５が非分泌性ヒトＢ細胞腫瘍からイディオタイプ分泌を救済するための有効な融合相手であることを示す。マウス免疫グロブリンがＢ５またはそれから誘導されたハイブリドーマによって生産されることはない。腫瘍細胞と融合相手細胞との混合物をハンクス平衡塩溶液(HBSS)中で２回洗った。上清を吸引し、細胞ペレットを40% ポリエチレングリコール(PEG)に２分間さらした。PEG にHBSSを加えて徐々に希釈し、細胞を遠心した。次に、細胞を完全培地（RPMI培地、10% ウシ胎児血清、グルタミン 4mM）中に再浮遊させて２× 10⁶個／mlの密度とし、その後0.1ml をマイクロタイタープレートのウェルに加えた。細胞をPEG 融合から回収した24時間後、培地をHAT 培地（ヒポキサンチン 10^-4M、チミジン 1.6×10^-3M およびアミノプテリン 4×10^-5M を添加した完全培地）に変えることにより救済融合体の選択を開始させた。細胞を含むマイクロタイタープレートを37℃の湿潤5% CO₂/空気インキュベーターに入れて10〜20日間インキュベートした。上清をウェルから除き、細胞にアミノプテリンを含まない上記の培地（HT培地）を供給した。 ELISA アッセイを用いて、マイクロタイタープレートのどのウェルが救済された腫瘍免疫グロブリンを分泌しているハイブリドーマを含んでいるのかを調べた。細胞融合に使用した腫瘍バイオプシー検体は、単−Ｌ鎖型（κまたはλ）を発現する悪性細胞を多量に含んでいた。その腫瘍検体の既知の免疫表現型に対応するＨおよびＬ鎖型を有する免疫グロブリンを分泌するウェルを選択し、増やした。ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＨ鎖特異的試薬を0.05M 重炭酸ナトリウム緩衝液(p H9.5)で希釈した。96ウェルのマイクロタイタープレートにこの抗体を50μl/ウェルの容量で被覆した。プレートを４℃で一夜インキュベートした。その後プレートを0.05% トリトンＸ含有生理食塩水（洗浄緩衝液）で５回洗った。このウェルを5%脱脂乳/PBSとともに１時間インキュベートし、次に洗浄緩衝液で５回洗って非特異的結合をブロックした。ハイブリドーマ上清を加え（50μl/ウェル）、室温で１時間インキュベートした。プレートを再度洗い、ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＬ鎖特異的試薬に結合させた西洋ワサビペルオキシダーゼを50μl/ウェルで加えて発色させた。プレートを室温で60分インキュベートした。抗体の反応性は添加したABTS基質により判定され、マイクロタイタープレートリーダーを用いて 405nm で光学濃度を読み取った。ハイブリドーマが生育したときは、上記のELISA を使って免疫グロブリン含量について上清を試験した。上清の希釈液を、患者の腫瘍上に発現されたものと同一のイソタイプの精製ヒト免疫グロブリンを用いて作成した標準曲線と比較した。クローニングおよびリンパ腫と救済融合体の両方からの可変部遺伝子のＤＮＡ配列の比較により、イディオタイプタンパク質が患者のリンパ腫から誘導されることを確認した。絶えず２μg/mlよりも多く産生するハイブリドーマを大容量(200 0 〜5000ml)へと増やした。培地が完全に消費されるまで細胞密度を増加させた後、上清を回収してプールした。救済された腫瘍イディオタイプタンパク質はアフィニティークロマトグラフィーを使って上清から精製した。IgM クラスの場合は、マウスモノクローナル抗ヒトIgM Ｈ鎖特異的抗体を臭化シアン活性化セファロースB4または同等の固相マトリックスに２〜６mg/ml の膨潤ビーズ（免疫吸着剤）の濃度で結合させた。IgA クラスの救済された腫瘍イディオタイプは固相マトリックスに同様に結合させたヤギまたはウサギ抗ヒトIgA 特異的抗体からなる免疫吸着カラムを使って精製した。IgG クラスのイディオタイプは固相に結合させたプロテインＡのカラムを使って精製した。イディオタイプ含有上清は免疫吸着カラムを重力流動させた。吸着後、カラムを200ml の生理食塩水で洗って未結合タンパク質を除いた。イディオタイプは0.1Mグリシン-HCl緩衝液(pH2.4)で溶出するので、280nm での吸収を用いてタンパク質溶出液をモニターした。タンパク質ピークを集め、ELISA 法または280nm での吸収により免疫グロブリンレベルを測定した。タンパク質の純度はSDS-PAGEで測定した。 6.1.3. 抗原の調製キーホールリンペットヘモシアニン Megathura crenulata(KLH)はCalbiochem ，San Diego，California(Cat．#374805)から入手した。BES 緩衝液および硫酸マグネシウム中にタンパク質を60% 以上含む形でKLH を供給した。販売者によって測定されたタンパク質の純度は90% を越えていた。使用に先立って、KLH を生理食塩水に対して十分に透析し、その後PBS pH7.4 でデトキシゲル(detoxigel)カラム（Pierce Chemical Company，Rockford，Illi nois，Cat．#20339）を通過させるか、または25mMトリス-HCl pH8.0を用いてQAE Zeta Prep 15ディスク（LKBm，Broma，Sweden，Cat．#224-202）を通過させた。塩化ナトリウムの勾配を用いてカラムに付着した内毒素を除いた。KLH をカラムに繰り返しかけたところ、内毒素が許容できるレベルに減少した。リムルス変形細胞分解産物（limulus amoebocyte lysate: LAL）アッセイを用いて内毒素レベルをモニターした。次に、精製したイディオタイプ特異的タンパク質とKLH を無菌の生理食塩水に対して十分に透析した。それぞれの生成物を濃縮または希釈して塩化ナトリウム中１mg/ml の最終濃度を得た。その後、0.45μm フィルターを通してタンパク質を滅菌濾過した。最終濃度は280nm での吸収を測定するか、最終生成物の少量の消費してよいアリコートでELISA を行うことにより測定した。最終生成物は層流フードのもとで無菌の容器に無菌充填した。バイアルを凍結し、必要になるまで -20 ℃で貯蔵した。最終生成物の無菌性は臨床実験室で行われる標準５日細菌培養により確認した。 6.1.4. 抗原による樹状細胞のパルス化富化したＤＣは約 100万個／mlの濃度でRPMI培地中に再浮遊させた。24ウェルプレートで500 万個ずつの２つの独立した培養物にＤＣを分割した。次に、各組のＤＣを、50μg/mlの濃度の無菌精製イディオタイプ免疫グロブリンタンパク質またはKLH のいずれかと、37℃の湿潤5% CO₂インキュベーター内で４〜５時間または一夜培養した。 6.1.5. 抗原パルス化樹状細胞の注入イディオタイプタンパク質かKLH のいずれかでパルスしたＤＣを、パイロジェンフリーの注射級生理食塩水で３回洗い、静脈注射投与バッグ中で100ml の容量に再懸濁した。それぞれの注入につき、患者は自分自身の血液から単離されたＤＣを全部受け取った。単離ごとに異なる数のＤＣが得られたので、各細胞注入液は５×10⁶から100 ×I0⁶個の抗原パルス化ＤＣを含んでいた。患者にアセトアミノフェンとジフェンヒドラミンを前投薬し、末梢静脈内ラインまたは（入手可能であれば）中心カテーテルから30〜60分かけてＤＣを注入した。注入前と注入中に生命徴候を連続的にモニターした。すべての治療は医師によりモニターされ、念入りに管理された。患者は同様に調製した抗原パルス化ＤＣを４回まで受け取った。この処置に対する全身反応を注意深く観察した。全身反応として体温、血圧、および気管支痙攣、脈管炎および／または免疫複合体の形成の徴候を調べた。自己由来の細胞を使用する場合はアナフィラキシーの危険がきわめて低かった。 6.1.6. イディオタイプ特異的増殖応答のアッセイ増殖反応アッセイは Chainらの技法（1987，J．Immunol．Methods 99:221）を改良したものであった。“FICOLL-HYPAQUE”勾配遠心で調製した新鮮なPBMLを洗い、1%ヒトAB血清を加えたIscove's改良Dulbecco's培地(IMDM)(IMDM-1% AB)にウェルにつき４×10⁵個の濃度でまいた。IMDM-1% AB調製物中の０から100 μg/ml の濃度のKLH または自己由来免疫グロブリンイディオタイプを４反復実験で加えた。３日後、細胞を分割し、5% FCSと30単位/ml のIL-2を含むIMDMを与えた。5% CO₂を含む雰囲気中37℃で合計５日間インキュベートした後、細胞を³H標識チミジン(１μCi／ウェル)で16〜20時間パルスした。データは[³H]チミジン取込みの毎分カウント数からバックグラウンドを差し引いた値の平均として表される。 6.1.7. 抗イディオタイプ抗体のアッセイマイクロタイタープレートにイディオタイプタンパク質か同じイソタイプの他の免疫グロブリンのパネルを被覆した。患者の血清を段階的に希釈した。陰性対照として予備処理サンプルを用いた。患者血清中の抗体の、患者のイディオタイプを含む免疫グロブリンの試験パネルへの結合は、患者のイディオタイプと反対のＬ鎖に特異的なヤギ抗ヒトＬ鎖-HRP抗体により、または患者のイディオタイプと反応しなかった抗ヒトＨ鎖イソタイプ特異的-HRP抗体の混合物により検出した。 6.2. 実施例臨床研究に登録された３人の患者のうち、１人は免疫グロブリンパルス化ＤＣの４回の注入を完了した。この患者は胸部と腹部のＸ線断層撮影で容易に認められる腫瘍塊により活動性の疾患が明らかになったため、この研究に参加した。インフォームド・コンセント（説明と同意）のあとで、患者はスタンフォード大学血液センターで４週おきに３回、白血球搬出(leukapheresis)を受けた。各白血球搬出後にＤＣを単離し、等分のアリコート（５×10⁷個の細胞）をKLH または患者自身の腫瘍から単離した免疫グロブリンイディオタイプとともに一夜培養した。抗原パルス化ＤＣを十分に洗って遊離の免疫グロブリンを除き、等張食塩水中に懸濁し、静脈内注入した。それぞれの注入の２週間後、患者にブーストとして無菌生理食塩水中の可溶性イディオタイプタンパク質 0.5mgを皮下投与し、別の皮下部位に無菌KLH の別個の 0.5mgブーストを投与した。細胞注入とブーストは十分に耐えられるものであり、それぞれの注入の２週間後に、末梢血から単離した新鮮なリンパ球を段階的用量のKLH またはイディオタイプでin vitroでチャレンジし、それらの増殖反応活性をアッセイした。ＤＣ注入以前には、患者はKLH にも免疫グロブリンイディオタイプにも応答しなかった。しかし、ＤＣ注入後は患者のリンパ球がKLH とイディオタイプの両方に応答して増殖した。図１に示すとおり、抗原パルス化ＤＣの注入前にはこれらの抗原に対する応答はほとんどまたは全くなかったが、初回の注入後には有意な増殖応答が見られ、３回目の注入後にはその応答が増強された。さらに、患者は患者自身の腫瘍に由来するイディオタイプタンパク質と反応する抗イディオタイプ抗体を血清中に産生していた。最も重要なことは、ＤＣ注入前には１年以上もの間増え続けていた患者の腫瘍量が、抗原パルス化ＤＣの３回目の注入後に測定したとき50% 以上消失し、４回目の処置後にはほぼ100%消失したことである（図 2A〜2D）。これらの結果は、ＤＣを単離し、それらを腫瘍抗原でパルスし、該細胞をオートロガス患者に間隔をおいて繰り返し注入することの実施可能性と安全性を示すものである。それらはさらに、このような注入が臨床的に重要な免疫応答を引き出すことと関連していることを示唆している。本発明は、本発明の個々の面を例示する特定の実施態様によってその範囲を制限されるものではない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明のさまざまな改変が前記の説明および添付図面から当業者には明らかになるだろう。このような改変も請求の範囲に含まれるものとする。本明細書に引用した刊行物はすべてその全体を参考としてここに組み入れる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者レヴィー，ロナルドアメリカ合衆国 94305 カリフォルニア州スタンフォード，メアーズコート 966番地 (72)発明者スー，フランクアメリカ合衆国 94303 カリフォルニア州パロアルト，ロマヴェルデアベニュー 761エイ番地 (72)発明者ベニケ，クローディアアメリカ合衆国 94536 カリフォルニア州フレモント，ローレンドライブ 4388番地

Claims

【特許請求の範囲】１．（a）ヒト樹状細胞を単離し、（b）該細胞を抗原でパルスし、そして（c）抗原でパルスした細胞をヒト患者に投与する、ことを含んでなる、抗原に対するヒト患者の免疫応答を活性化する方法。２．樹状細胞をヒト末梢血から単離する、請求項１に記載の方法。３．免疫応答がＴ細胞により仲介される、請求項１に記載の方法。４．免疫応答がＢ細胞またはそれらの分泌抗体により仲介される、請求項１に記載の方法。５．抗原が腫瘍細胞により産生される、請求項１に記載の方法。６．抗原がＢ細胞の腫瘍細胞により産生される、請求項５に記載の方法。７．抗原が免疫グロブリンである、請求項６に記載の方法。８．抗原が全微生物である、請求項１に記載の方法。９．抗原がウイルスである、請求項１に記載の方法。 10．抗原がポリペプチドである、請求項１に記載の方法。 11．抗原がペプチドである、請求項１に記載の方法。 12．in vitroで抗原によりパルスされた単離ヒト樹状細胞を含んでなる医薬組成物。 13．樹状細胞がヒト末梢血から単離されたものである、請求項12に記載の医薬組成物。 14．抗原が腫瘍細胞により産生される、請求項12に記載の医薬組成物。 15．抗原がＢ細胞の腫瘍細胞により産生される、請求項14に記載の医薬組成物。 16．抗原が免疫グロブリンである、請求項15に記載の医薬組成物。 17．抗原が微生物である、請求項12に記載の医薬組成物。 18．抗原がウイルスである、請求項12に記載の医薬組成物。 19．抗原がポリペプチドである、請求項12に記載の医薬組成物。 20．抗原がペプチドである、請求項12に記載の医薬組成物。