BRPI0905536A2 - processo de maturação de células dendrìticas autólogas - Google Patents
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Abstract
<B>PROCESSO DE MATURAçãO DE CéLULAS DENDRìTICAS AUTOLOGAS.<D> A invenção relata um novo processo de maturação de células dendriticas autólogas, o qual pode ser utilizado em todos os tipos de tumores, isto é, com diferentes origens teciduais. Esta invenção é baseada na capacidade de ativação do sistema imune do próprio paciente para destruir células tumorais. O processo usa células autólogas obtidas do sangue periférico do paciente e diferenciadas in vitro em células dendríticas maduras para que sejam sensibilizadas com os antígenos tumorais, obtidos por biópsias, também do próprio paciente.
Description
"PROCESSO DE MATURAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS
AUTÓLOGAS"
A presente invenção refere-se a um novo processo de maturação decélulas dendríticas autólogas em combinação com antígenos tumorais obtidosdo próprio paciente.
É de conhecimento que o sistema imune é muito complexo e compostode vários mecanismos que incluem uma variedade de mediadores e célulasque atuam em sinergia, mutuamente coordenados e desencadeados porestímulos e células específicas, como por exemplo, as células dendríticas(DCs) que são as mais potentes células apresentadoras de antígenos econhecidas por ativar linfócitos T.
Dentro do processo orgânico que ocorre naturalmente, as célulasdendríticas se originam de células precursoras hematopoiéticas na medulaóssea e sob condições fisiológicas diferenciam em células dendríticas imaturasque circulam por via hematológica até os tecidos periféricos aonde continuam oseu processo de maturação. Após o encontro com os antígenos nos tecidos, asDCs finalizam seu processo de maturação e durante esta fase aumentam suacapacidade migratória para os Iinfonodos regionais para ativar e coordenar aresposta imune. O sistema imune possui a capacidade de controlar e destruir otumor, contudo, ele freqüentemente falha em conter a progressão tumoral.Vários trabalhos científicos têm demonstrado que o microambiente tumoral écapaz de manipular a resposta imune local por produção de mediadores quepossam inibir a função das células imunes sistemicamente ou no próprio sítiotumoral. Além destes mediadores, as células neoplásicas possuem váriosmecanismos de escape da resposta imune. Vários tipos de processos nessesentido têm sido desenvolvidos para o possível tratamento destas neoplasias,envolvendo aplicações com drogas imunoestimulantes, anticorpos, citocinas ouaté mesmo terapias celulares. Do ponto de vista de aplicação clínica, algunsnão passaram de ensaios in vitro, enquanto outros tem sido e ainda estão emfase experimental em animais. Somente poucos têm passado para a faseseguinte que consiste em ensaios clínicos em humanos.A cirurgia, quimioterapia e radioterapia são tratamentos já bemestabelecidos para neoplasias malignas, no entanto se um ou todos essestratamentos convencionais não apresentam resultado satisfatório, o processode maturação de células dendríticas autólogas, pode ser uma alternativa a serrecomendada.
Podemos citar no Estado da Técnica, a tecnologia US 2007/0020297 Á1,que apresenta a utilização de células dendríticas, contudo, o mesmo se aplicasomente a tumores do sistema nervoso central e em combinação com aquimioterapia.Outra tecnologia também encontrada é a WO 95/34638 queutiliza células dendríticas aplicada ao Iinfoma e é baseado principalmente nométodo em como obter células dendríticas e não no desenvolvimento de umprocesso que visa o combate às células cancerígenas.
As seguintes vantagens são obtidas a partir do processo de obtenção dematuração de células dendríticas in vitro:
- Pode ser utilizado em todos os tipos de tumores e utilizando células dopróprio paciente, para evitar a rejeição heteróloga das mesmas e também aradiação, pois sabemos que é de fundamental importância a migração dasmesmas para os Iinfonodos para que possam expressar moléculas afim deativar o sistema imune.
- Pacientes, por questões clínicas ou terapêuticas, que não possuemcondições de receberem os tratamentos convencionais que são ressecçãocirúrgica, quimioterapia ou radioterapia, poderão usufruir do processo dematuração das DCs.
Uma deficiência que os processos existentes no Estado da Técnicateriam que resolver, é o fato que, os pacientes com carcinoma de célulasescamosas de cabeça e pescoço, bem como os pacientes com tumoresmetastáticos de mama, pulmão, cérvice, instestino, endométrio e carcinomarenal, possuem o número de células dendríticas no sangue alterado. Damesma forma, em alguns tumores primários as DCs não são recrutadas para ofoco tumoral, impedindo a captação dos antígenos tumorais. Estes dados sãoclinicamente relevantes, pois estão associados com um pior prognóstico destespacientes. Vários estudos sugerem que a disfunção das DCs na realidade é umprocesso sistêmico, apoiado na noção que fatores solúveis derivados dostumores caem na corrente linfática e sangüínea e afetam este tipo celular.Estudos recentes demonstram que a liberação de IL-10, IL-6, M-CSF1 fator decrescimento endotelial vascular (VEGF)1 gangliosídeos e prostanóides pelotumor podem bloquear a diferenciação e função das DCs in vivo.
Esta disfunção e inibição das DCs em pacientes com câncer resultamem uma deficiência na indução da resposta antitumoral, favorecendo destaforma a progressão. Assim sendo, o uso de DCs tem sido proposto comoimunoterapia para tumores. Estas células são maturadas ex vivo comoalternativa para evitar a supressão induzida pelo tumor in vivo.
Tendo em vista os inconvenientes supra citados e no propósito desuperá-los, a presente invenção foi desenvolvida a partir do seguinte fato:enquanto estas células dendríticas do pacientes são deficientes em apresentarantígeno para ativar o sistema imune, as que passam pelo processo dematuração in vitro são capazes de estimular e induzir uma resposta imuneantitumoral in vitro e in vivo.
De acordo com a invenção apresentada, o processo de maturaçãorealiza-se por meio das seguintes etapas:1. Isolamento e diferenciação de células autólogas obtidas do pacientes esensibilização com antígenos tumorais;
2. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são coletadas porpunção venosa com anticoagulante e obtidas por centrifugação em Ficoll-Hypaque Plus. As células obtidas desta forma são resuspensas e mantidas emcultura em meio de IMDM suplementado com 10% de soro bovino fetal. Estascélulas são incubadas em estufa a 37°C contendo 5% C02 por 4 h e as célulasnão aderentes são removidas. O meio IMDM é trocado e as células aderentestratadas com GM-CSF e IL-4. Após cinco dias em cultura é adicionado TNF-alpha para ativação das células dendríticas diferenciadas. Após mais dois dias,as células são coletadas e lavadas três vezes por centrifugação com soluçãosalina e as células dendríticas submetidas à eletroporação com os antígenostumorais obtidas do próprio paciente por biópsia tumoral.
3. As células dendríticas autólogas sensibilizadas com os antígenos tumoraisdo próprio paciente são resuspensas e injetadas subcutaneamente nopaciente.
Todos estes procedimentos são realizados em condições estéreis.
O sistema imune dos pacientes foi avaliado antes e durante todo otratamento por citometria de fluxo das células do sangue periférico. A invençãopassará a ser descrita a seguir com referência aos desenhos apensos.
A figura 1 apresenta, expressão de linfócitos totais (CD3+) e IL-2intracelular em células do sangue periférico de três pacientes submetidos aotratamento com células dendríticas antes e durante a terapia (antes, após 21 e45 dias).
A figura 2 apresenta Linfócitos T auxiliares (CD4+) e expressão decitocinas intracelulares (IFN-gama, IL-2, TNF-alpha, IL-12 e IL-10) em célulasdo sangue periférico de três pacientes submetidos ao tratamento com célulasdendríticas antes e durante a terapia (antes, após 21 e 45 dias).
A figura 3 apresenta Linfócitos T citotóxicos (CD8+) IL-2 intracelular ereceptor CD25 em células do sangue periférico de três pacientes submetidosao tratamento com células dendríticas antes e durante a terapia (antes, após21 e 45 dias).
A figura 4 apresenta Células Natural Killer (NK) e expressão decitocinas intracelulares (IL-2 and IL-12) e o receptor CD25 em células dosangue periférico de três pacientes submetidos ao tratamento com célulasdendríticas antes e durante a terapia (antes, após 21 e 45 dias).
A figura 5 apresenta expressão de macrófagos (CD19+) e citocinasintracelulares (IFN-gama, IL-2, TNF-alpha) em células do sangue periférico detrês pacientes submetidos ao tratamento com células dendríticas antes edurante a terapia (antes, após 21 e 45 dias).
Claims (1)
1. "PROCESSO DE MATURAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICASAUTÓLOGAS" compreende um processo de maturação in vitro capaz deestimular e induzir uma resposta imune antitumoral in vitro e in vivo,caracterizado por isolamento e diferenciação de células autólogas obtidas dospróprios pacientes e sensibilização com antígenos tumorais, cujas as célulasmononucleares do sangue periférico (PBMC) são coletadas por punção venosacom anticoagulante e obtidas por centrifugação em Ficoll-Hypaque Plus1ficando resuspensas e mantidas em cultura em meio de IMDM suplementadocom 10% de soro bovino fetal, em estufa a 37°C contendo 5% C02 por 4 h, deforma que as células não aderentes são removidas, o meio IMDM é trocado eas células aderentes tratadas com GM-CSF e IL-4, após cinco dias em culturaé adicionado TNF-alpha para ativação das células dendríticas diferenciadas, eapós mais dois dias, as células são coletadas e lavadas três vezes porcentrifugação com solução salina e as células dendríticas já madurassubmetidas à eletroporação com os antígenos tumorais obtidas do própriopaciente por biópsia tumoral.
Priority Applications (2)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| BRPI0905536-3A BRPI0905536A2 (pt) | 2009-12-16 | 2009-12-16 | processo de maturação de células dendrìticas autólogas |
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Family Applications (1)
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