KR102256337B1 - 조직이식을 위한 세포배양액을 포함하는 면역억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암세포의 세포배양액을 유효성분으로 하며 면역항진증에 대해 면역을 억제하는 약학 조성물 및 이식용 공여자의 조직의 면역원성을 억제하는 이식조직 처리용 조성물 및 이를 이용한 처리방법 에 관한 것이다.

Description

조직이식을 위한 세포배양액을 포함하는 면역억제제 {Immunosuppressant comprising celll culture media for tissue transplantation}

본 발명은 암세포의 생리학적 특성을 이용해 만든 복합물을 통해 이종이식시 문제가 되는 면역 반응을 억제하는 것으로서, 구체적으로는 피부 세포 또는 피부 조직부터 추후 신체의 중요한 내장 장기까지 동종 뿐만 아니라 이종이식이 가능할 수 있는 면역 억제제에 관한 것이다.

현재 동종이식 또는 이종이식과 관련되어 많은 연구가 진행되고 있으나, 면역 거부 반응으로 인한 부작용이 큰 문제를 야기하고 있다. 그러한 면역 거부 반응을 억제하기 위한 다양한 방법 및 억제제 들이 임상 연구에 도입되고 있으나 아직 괄목할 만한 결과를 못 보여 주는 실정이다.

피부, 각막 및 뼈 등의 조직 또는 간장, 심장, 신장, 폐, 췌장 등 장기의 이식에는 자가이식, 동계이식, 동종이식 및 이종이식이 있다. 자가이식(자기이식; autotransplantation)은 한 개체의 일부를 동일한 개체의 다른 부분에 이식하는 것으로, 예를 들면 화상치료를 위해 자신의 정상피부를 손상부위에 이식하는 경우가 그에 해당한다. 동계이식(isotransplantation)은 동일한 균일계 동물 사이에서 행해지는 이 식으로, 인간에 있어서는 일란성 쌍생아 사이에서 행해지는 이식(예를 들면, 신장의 한쪽이나 간장조직 등의 이식)이다. 동종이식(allotransplantation)은 유전원 조성이 다른 두 개체 사이에서 행해지는 이식으로, 인간에 있어서는 이란성 쌍생아 사이에서의 이식이나 혈연관계가 전혀 없는 개체 사이에서의 이식이 이에 해당한다. 이종이식(xenotransplantation)은 서로 다른 동물종인 개체 사이에서의 이식으로, 예를 들면 침팬지나 돼지의 조직이나 장기를 인간에게 이식하는 경우가 이에 해당한다.

이식 기술의 발달과 더불어 동종이식 및 이종이식에 의한 질환, 즉 공여자로부터의 이식조직이나 장기를 수여자에게 이식한 후에 일어나는 심각한 면역 거절반응이 심삭한 문제로 대두되고 있다.

이식 조직 거절반응은 이식되는 생체의 일부 세포, 조직 또는 장기의 공여자와 수여자의 유전적 배경이 다른 경우(즉, 동종이식 또는 이종이식), 이식 조직이 수여자에 의해 이물질로 인식됨으로써 수여자의 면역계가 그 이식조직을 거절하여 배제하려고 하는 여러 가지 면역반응이다. 이 이식에 수반되는 이 면역반응은 이식 직후에 일어나는 강한 거부반응으로 초급성, 이식 후 수개월 이내에 보이는 급성, 이식 후 수개월 이후에 보이는 만성으로 나누어진다.

또한, T 세포로 대표되는 면역담당 세포에 의한 세포성 면역과 항체에 의한 액성 면역이 복잡하게 제휴된 형태로 일어나지만, 주로 세포성 면역이다.

이러한 이식에 수반되는 면역 거부반응을 억제하기 위해서는 면역관련 세포의 기능을 억제하는 한정된 몇 개의 면역억제제를 사용하고 있고, 일부 T 세포의 활성화에 필요한 메카니즘을 이용한 새로운 접근으로 면역억제제를 개발하고 있는 실정이다. 그러나 현재까지 안전하고 효과적인 이식 방법 또는 면역억제제가 없다는 문제점이 존자한다.

따라서 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 세포에 미치는 독성은 없으며, 공여자의 세포에 처리한 제제가 면역 억제 효력을 발휘해 수령자의 면역 체계의 기본이 되는 비장세포(splenocyte)의 면역 관련 인자를 자극하지 않는 다양한 동종이식(homograft) 장기뿐만 아니라 이종이식(xenograft)에 이용될 수 있는 면역억제제를 개발하였다.

KR 1020140133399 A KR 1019977002068 A KR 100185226 B1

본 발명의 목적은 피부 및 기타 장기 이식 등 동종 또는 이종 조직 이식에서 필연적으로 발생하는 면역 거부 반응을 억제하는 면역억제제 및 면역을 억제하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 이식할 조직과 동일한 조직 기원의 암세포를 배양한 세포배양액을 유효성분으로 포함하는 조직 이식을 위한 면역억제용 조성물을 제공한다. 여기서 조직 이식은 이종이식 또는 동종 이식을 모두 포함하며, 상기 암세포는 조직 이식하고자 하는 조직의 암세포인 것이 바람직하다. 보다 구체적으로는, 피부 흑색종 세포(B16F10), 골육종 세포(SAOS2), 림프종, 육종, 용종, 유암종, 카포시 육종, 소세포암종, 대세포암종, 선암종, 편평상피세포암종, 간세포암종, 담관상피암종, 간모세포종, 혈관육종, 선극세포종, 유암종, 과립세포종, 형질세포골수종, B세포림프종, 여포성림프종, 육아종, T-세포림프종 등의 암세포를 배양한 세포배양액을 유효성분으로 할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 상기 세포배양액에는 사이토카인(cytokine), 당질, 미네랄 성분, 성장 인자(growth factor) 및 엑소좀(exosome) 등이 포함되어 있다.

상기 조성물은 수여자에게 이식할 조직에 투입 또는 침지, 침습 등의 방법으로 전처리하는 것이 바람직하며, 상기 조직은 피부, 각막, 뼈, 간장, 심장, 신장, 폐, 위장, 대장, 췌장 등의 조직일 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 상기 조성물은 면역 사이토카인인 IL-6, IL-10, IL-12 또는 TNF-α의 조절능을 갖고 있다.

따라서, 본 발명은 또 다른 예로 암세포를 배양한 세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 면역항진증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 암세포는 피부 흑색종 세포(B16F10), 골육종 세포(SAOS2) 등을 포함하며 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 면역항진증은 일반적으로 자가면역의 이상에서 오는 것으로 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 1형 당뇨병, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트 증후군, 루푸스(전신성 홍반성 루푸증), 쇼그렌증후군, 경피증, 결절성 다발동맥염, 기쿠치병, 건선, 백반증, 갑상선 기능 항진증, 섬유근육통, 탈모, 기립성 빈맥증후군, 아토피염 등을 포함하며, 원인을 알 수 없는 신체 내 자극으로 인해서 자가 면역 세포들이 염증을 일으키는 것을 의미하는데 이러한 특히 과다한 면역반응으로 유도된 염증은 신체 조직 및 기관을 파괴할 수 있어 그 문제점가 되고 있다. 이러한 질병에는 상기 IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α 등이 관여하고 있고, 암세포 배양물을 통해 각각의 사이토카인 인자들이 감소되는 것을 확인하였다. 결국 조직 이식이나 과다 자극 면역 완화든 면역 반응을 유도하는 사이토카인을 감소시켰을 때 개선된 결과가 나온다고 볼 수 있다.

본 발명은 조직이식용 시술 및 이식용 조직의 보관, 관리, 면역 억제 처리를 통한 편리를 도모할 수 있으며, 조직이식용 면역억제제를 개발할 수 있다. 이를 통해 조직이식을 받아야 하는 수령자들의 면역 체계 보호 및 조직이식의 성공률 상승, 부가적인 경제 효과 등이 예상된다.

도 1은 B16F10 배양액을 농도별로 24시간 동안 마우스 피부 세포에 처리 후 세포 생존율을 평가한 그래프다.
도 2는 B16F10 배양액을 농도별로 48시간 동안 마우스 피부 세포에 처리 후 세포 생존율을 평가한 그래프다.
도 3은 B16F10 배양액을 농도별로 72시간 동안 마우스 피부 세포에 처리 후 세포 생존율을 평가한 그래프다.
도 4는 마우스 피부 세포에 B16F10 배양액을 농도별로 72시간 처리한 후 이종 세포인 랫드 비장 세포와 72시간 동시배양하여 염증성 사이토카인인 IL-6를 유전자 분석한 그래프다.
도 5는 마우스 피부 세포에 B16F10 배양액을 농도별로 72시간 처리한 후 이종 세포인 랫드 비장 세포와 72시간 동시배양하여 염증성 사이토카인인 IL-10을 유전자 분석한 그래프다.
도 6은 앞서 나온 결과에서 IL-6를 IL-10의 수치로 나눈 그래프다.
도 7은 마우스 피부 세포에 B16F10 배양액을 농도별로 72시간 처리한 후 이종 세포인 랫드 비장 세포와 72시간 동시배양하여 염증성 사이토카인인 IL-12를 유전자 분석한 그래프다.
도 8은 SAOS2 배양액을 농도별로 24시간 동안 랫드 연골 세포에 처리 후 세포 생존율을 평가한 그래프다.
도 9는 SAOS2 배양액을 농도별로 48시간 동안 랫드 연골 세포에 처리 후 세포 생존율을 평가한 그래프다.
도 10은 SAOS2 배양액을 농도별로 72시간 동안 랫드 연골 세포에 처리 후 세포 생존율을 평가한 그래프다.
도 11은 SAOS2 배양액과 배양액을 동결건조하여 얻은 파우더를 배양배지에 희석하여 연골 세포에 72시간 처리한 후 이종 세포인 마우스 비장 세포와 72시간 동안 동시배양하여 염증성 사이토카인인 IL-6를 유전자 분석한 그래프다.
도 12는 SAOS2 배양액과 배양액을 동결건조하여 얻은 파우더를 배양배지에 희석하여 연골 세포에 72시간 처리한 후 이종 세포인 마우스 비장 세포와 72시간 동안 동시배양하여 염증성 사이토카인인 IL-10을 유전자 분석한 그래프다.
도 13은 앞서 나온 결과에서 IL-6를 IL-10의 수치로 나눈 그래프다.
도 14는 SAOS2 배양액과 배양액을 동결건조하여 얻은 파우더를 배양배지에 희석하여 연골 세포에 72시간 처리한 후 이종 세포인 마우스 비장 세포와 72시간 동안 동시배양하여 염증성 사이토카인인 IL-12를 유전자 분석한 그래프다.
도 15는 SAOS2 배양액과 배양액을 동결건조하여 얻은 파우더를 배양배지에 희석하여 연골 세포에 72시간 처리한 후 이종 세포인 마우스 비장 세포와 72시간 동안 동시배양하여 염증성 사이토카인인 TNF-α를 유전자 분석한 그래프다.

본 발명은 마우스 피부 흑색종인 B16F10 세포, 사람 골육종인 SAOS2 세포의 배양액을 이용하여 마우스의 피부 세포 및 이종인 랫드의 비장세포에 면역 교란을 일으켜 조직 이식용 면역 억제제로 활용 가능성을 확인하였다.

조직이식은 결손된 피부나 신체 사지, 내강 장기 등을 대체하기 위한 의료 기술로서 같은 종의 조직이나 장기를 이식하는 동종이식과 다른 종의 조직이나 장기를 이식하는 이종이식으로 나뉘게 된다. 생체의 방어 기작인 면역 반응(immune response)은 외부의 세포나 조직을 거부하게 되며, 이것은 조직이식에 있어 치명적인 부작용이다. 따라서 조직이식에 있어 공여자의 조직이나 장기를 수령자의 면역체계가 거부하지 않도록 면역억제제(immunosuppressant)를 수령자에게 투여해 전체적인 면역력을 낮춘 후 시술하게 된다. 이 경우, 면역 반응 억제 실패로 인한 조직 거부반응의 가능성뿐만 아니라 심각하게 면역이 억제된 경우 외부 환경으로 인한 감염 및 내인성 질환의 심화 가능성이 있어 수령자의 생명에 치명적인 위협이 된다.

한편, 암세포는 우리 생체에서 특정 기능을 하지 않으며 증식을 거듭하는 세포로서 양성 종양과 악성 종양으로 나뉘게 된다. 양성 종양의 경우 정상적인 생성으로서 생명에 영향을 주지 않지만 악성 종양의 경우 조직 및 장기의 기능을 억압하는 증식이 일어나 치명적인 위협이 된다. 이런 암세포는 생체의 자정 능력인 면역 세포 및 면역 체계에서 벗어나기 위해 면역 교란을 유발하며 암세포를 죽이는 세포나 체액성 면역 인자들을 무용화한다. 이런 기전을 통해 생체 내에서 무한 증식해 조직 및 장기의 기능을 무력화시키고 죽음에 이르게 한다.

이러한 암세포의 면역 교란 특성에 착안하여 암세포를 기른 배양액의 혼합물을 활용해 조직이식을 위한 면역억제제 가능성을 확인하였다. 이것은 기존에 수령자의 면역을 억제하는 제제로서가 아닌, 공여자의 조직이나 장기 자체의 항원성-면역력을 억제하여 수령자의 면역 체계에 영향을 주지 않는 데 주안점을 두었다. 즉, 암세포의 배양액으로 만든 혼합제제를 처리한 세포나 조직이 수령자의 면역 세포와 반응시 수령자의 면역 세포가 반응하지 않는 새로운 개념의 조직이식을 위한 면역억제제인 것이다. 기존에 등록된 유럽특허(선행 특허문헌 1 참조)는 조직이식을 위하여 공여자 조직의 HLA-E에 특정적으로 작용하는 중화 항체를 반응시켜 면역원성을 제거하였지만 본 발명에 의해서는 전방위적인 면역원성 제거 및 교란이 가능하다.

세포의 배양액에는 세포가 배양액과 주고받는 다양한 물질들이 혼합되어 있다. 세포의 생리적 활성 물질인 사이토카인(cytokine)과 당질, 미네랄 성분, 성장인자(growth factor), 엑소좀(exosome)등이 포함된 세포의 배양액을 본 발명에서 사용하였다.

엑소좀은 세포에서 분비되는 100㎚ 안팎 크기의 생체입자로, 분비세포의 단백질과 유전정보 등을 담고 있다. 특히 암세포의 증식, 전이 등에 관여해 암 진단물질로 주목받고 있다. 또한 다양한 엑소좀의 종류 중 면역억제성 엑소솜에 관한 연구 결과로 자가면역 질환 및 부적합한 면역계의 활성화와 관련된 질환 치료제의 특허가 존재한다. (선행 특허문헌 2 참조)

본 발명에서는 주로 조직이식이 이루어지는 피부와 연골을 타겟으로 하여 실험관 단계(in vitro)의 실험으로 세포배양액 면역억제제의 효능을 확인하였다.

본 발명에서 상기 세포배양액 면역억제제의 배양된 세포가 제한되지는 않지만 주로 같은 조직 기원의 암세포에서 배양한 것일 수 있다.

결국 본 발명은 조직이식용 면역억제제 제조에 관한 것으로, 조직이식용 재료를 가공하는 다양한 원천 기술에 근본적인 목적을 둔다.

본 발명에서 상기 약학 조성물은 제한되지는 않지만 강한 면역 억제 및, 항상성 유지 기능을 가질 수 있다.

본 발명에서 상기 조직이식용 면역억제제의 제형은 제한되지는 않지만 조직 침지용 액상제제, 및 링거 주사액으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 유효성분으로서 상기 세포배양액 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 첨가제로서 당업계에 알려진 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보전제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 조성물 전체 중량에 기초하여 약 0.1 중량 % 내지 약 20 중량 %로 포함될 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물은 생체 외부에서 외용으로 처리될 수 있으며, 이 분야의 일반적인 방법으로 제제화함에 따라서, 단위 용량 형태로 제제화될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 단백질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스, 락토스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이크 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용 액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 주사용 증류수에 체액과 유사한 염분 농도를 가지도록 혼합되어 링거액으로 제조될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. B16F10 배양액을 처리한 마우스 피부 세포의 면역 억제 실험

1) MTT : 2 X 10⁶ cells /plate로 B16F10 세포를 배양한 뒤, 3일 후 세포배양액을 회수하였다. 회수된 세포배양액을 1500 rpm에 10 분간 원심 분리 후, 상층액을 사용하였다. 회수된 상층액을 0.25 μM pore의 실린지 필터를 이용하여 여과하였다. 여과한 뒤, 세포배양액을 배양배지(DMEM)에 5 %, 10 %, 20 %, 50 %, 80 %, 100 %로 희석하여 마우스 피부 세포에 처리하였다. 처리 24 시간, 48 시간 그리고 72 시간 후 MTT assay를 통하여 세포 생존율에 세포배양액이 미치는 영향을 확인하였다.

2) Real time RT-PCR

마우스 피부 세포에 B16F10의 세포배양액과 세포배양액을 동결건조하여 얻은 파우더를 배양 배지(DMEM)에 희석한 후 처리하였다. 처리 72시간 후, 사용 중이던 배지를 well에서 제거한 뒤, 랫드 비장세포(splenocyte)를 5 X 10⁶ cells/ well로 준비하여 마우스 피부 세포와 동시배양을 3일간 하였다. 3일 후, 랫드 비장세포에서 발현되는 사이토카인의 유전자량을 Real time RT-PCR을 이용하여 확인하였다.

실험의 결과, 마우스 피부 세포의 세포 생존율의 경우 24시간 동안 처리시 80% 세포 배양액 미만 처리시 세포독성이 확인되지 않았다. (도 1 참조) 48시간 동안 처리시 20% 세포배양액 미만 처리시 세포독성이 확인되지 않았다. (도 2 참조) 72시간 동안 처리시 50% 세포배양액 미만 처리시 세포독성이 확인되지 않았다.(도 3 참조) 이러한 결과를 종합하여 유전자 분석 실험의 농도는 50% 세포배양액까지 세포에 처리하였고, 랫드 비장세포와의 동시배양을 하여 면역 반응을 확인한 결과 염증성 사이토카인인 IL-6가 10% 와 50% 세포배양액 처리시 정상대조군 (마우스 피부 세포 + 랫드 비장세포만 배양)에 비해 유의하게 감소하는 것이 확인되었다. (도 4 참조) IL-10의 경우 20% 세포배양액 처리시에만 IL-10의 발현이 유의하게 감소하였다. (도 5 참조) 이 결과를 면역원성 분석 그래프인 IL-6/IL-10의 비율 그래프로 변환한 결과 10%, 50% 세포배양액을 처리한 시험군이 유의하게 면역원성을 감소시킨 것을 확인할 수 있었다. (도 6 참조) IL-12의 경우 10% 세포배양액을 처리한 시험군에서 정상대조군 대비 유의한 감소가 확인되었고, (도 7 참조) 종합적으로 10% B16F10 세포배양액을 처리하였을 때 공여자의 세포라 할 수 있는 마우스 피부 세포의 면역원성이 저하한 것을 알 수 있다.

실시예 2. SAOS2 배양액을 처리한 랫드 연골 세포의 면역 억제 실험

1) MTT : 1.5 X 10⁶ cells /plate로 SAOS2 세포를 배양한 뒤, 3일 후 세포배양액을 회수하였다. 회수된 세포배양액을 1500 rpm에 10분간 원심 분리 후, 상층액을 사용하였다. 회수된 상층액을 0.25 uM pore의 실린지 필터를 이용하여 여과하였다. 여과한 뒤, 세포배양액을 배양배지(DMEM)에 5 %, 10 %, 20 %, 50 %, 80 %, 100 %로 희석하여 랫드 연골 세포에 처리하였다. 처리 24시간, 48시간 그리고 72시간 후 MTT assay를 통하여 세포 생존율에 세포배양액이 미치는 영향을 확인하였다.

2) Real time RT-PCR

랫드 연골 세포(Rat chondrocyte)에 SAOS2 세포배양액과 세포배양액을 동결건조하여 얻은 파우더를 배양 배지(DMEM)에 희석한 후 처리하였다. 처리 72 시간 후, 사용 중이던 배지를 well에서 제거한 뒤, 마우스 비장 세포를 5 X 10⁶ cells/ well로 준비하여 랫드 연골 세포와 3일간 동시 배양 하였다. 3 일 후, 마우스 비장 세포에서 발현되는 사이토카인의 유전자량을 Real time RT-PCR을 이용하여 확인하였다.

실험 결과, 랫드 연골 세포의 세포 생존율의 경우 24시간 동안 처리시 50% 세포배양액 미만에서 세포독성이 확인되지 않았다. (도 8 참조) 48시간 동안 처리시 20% 세포배양액 미만 처리시 세포독성이 확인되지 않았다. (도 9 참조) 72시간 동안 처리시 50% 세포배양액 미만 처리시 세포독성이 확인되지 않았다. (도 10 참조) 이러한 결과를 종합하여 유전자 분석 실험의 농도는 50% 세포배양액까지 세포에 처리하였고, 세포배양액을 동결건조하여 얻은 파우더를 농도별로 희석해 실험을 병행하였다. SAOS2 세포배양액과 파우더를 각각 배양배지에 희석하여 72시간 동안 처리한 뒤, 마우스 비장 세포와 동시배양을 하여 면역 반응을 확인한 결과 염증성 사이토카인인 IL-6가 파우더 방식으로 처리한 군에선 대조군에 비교해 유의하게 감소하였으나 세포 배양액 처리군에선 유의하게 증가한 것이 확인되었다. (도 11 참조) IL-10의 경우 5% 세포배양액 처리시에만 IL-10의 발현이 유의하게 증가하였다. 파우더를 처리한 군은 감소하였다. (도 12 참조) 이 결과를 면역원성 분석 그래프인 IL-6/IL-10의 비율 그래프로 변환한 결과 50% 세포배양액을 처리한 시험군이 유의하게 면역원성이 증가 된 것이 확인되었다. (도 13 참조) IL-12의 경우 100, 500, 1,000 ㎍/mL 농도의 파우더 처리군과 전체 세포배양액 처리군에서 대조군과 비교해 유의하게 감소하는 것을 확인하였다. (도 14 참조) 이어서 TNF-α의 경우 전체 파우더 처리군은 결과가 유의하지 않으나 세포배양액 처리군에선 전체 농도에서 대조군 대비 유의하게 감소하는 결과를 확인했다. (도 15 참조) 종합적으로 연골세포와 면역원성과 관련해서 IL-6와 IL-10의 유의한 결과가 아닌 IL-12 와 TNF-α의 유의한 결과를 확인하였고, 공여자 세포의 면역원성이 억제되어 수령자의 면역세포원인 비장세포의 IL-12와 TNFα가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

결과적으로, 상기 in vitro 세포실험 결과로부터 본 발명에서 만든 암세포의 세포배양액이 공여자 세포의 면역원성을 교란하여 수령자의 면역원성 세포인 비장 세포의 면역 반응을 억제했다는 것을 확인하였다.

이상의 설명은 본 발명을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로, 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 실시예들은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 사상과 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호범위는 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 기술은 본 발명의 권리범위에 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. 이식할 조직과 동일한 조직 기원의 골육종 세포(SAOS2)를 배양한 세포배양액을 유효성분으로 포함하는 조직 이식을 위한 면역억제용 조성물
   
2. 제1항에 있어서, 상기 이식은 동종이식 또는 이종이식인 것을 특징으로 하는 면역억제용 조성물
   
3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 수여자에게 이식할 조직에 전처리하여 면역을 억제하는 것을 특징으로 하는 면역억제용 조성물
   
4. 제1항에 있어서, 상기 조직은 피부, 각막, 뼈, 간장, 심장, 신장, 폐, 위장, 대장, 췌장으로 이루어진 군에서 어느 하나인 것을 특징으로 하는 면역억제용 조성물
   
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 면역 사이토카인인 IL-6, IL-10, IL-12 또는 TNF-α의 조절능을 갖는 것을 특징으로 하는 면역억제용 조성물
   
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7. 제1항에 있어서, 상기 세포배양액은 사이토카인(cytokine), 당질, 미네랄 성분, 성장 인자(growth factor) 및 엑소좀(exosome)으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역억제용 조성물
   
8. 골육종 세포(SAOS2)를 배양한 세포 배양액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 또는 강직성 척추염 예방 또는 치료용 약학 조성물
   
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