CN116744913A - 包含苯衍生物作为免疫抑制剂的免疫抑制药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了苯衍生物作为免疫抑制剂的用途。作为免疫抑制剂的苯衍生物由式1表示：其中R是直链烷基、支链烷基或者包含一个或更多个碳‑碳双键的烷基，X是酰胺或酯基，并且Y是卤素、甲氧基、乙氧基、羟基或硝基。该苯衍生物用于制备免疫抑制药物。所述苯衍生物由于其抑制T淋巴细胞增殖的能力而有效用于治疗T细胞介导的免疫性疾病，例如，用于预防和治疗器官和骨髓移植之后的排斥，以及治疗T细胞介导的自身免疫病、银屑病、多发性硬化、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、特异性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、胃肌无力、肾小球肾炎、格林‑巴利综合征以及变应性疾病例如变应性哮喘和特应症。

Description

包含苯衍生物作为免疫抑制剂的免疫抑制药物组合物
技术领域
本发明涉及苯衍生物作为免疫抑制剂的用途，并且更特别地，涉及这样的苯衍生物作为免疫抑制剂的用途：所述苯衍生物由于其抑制T淋巴细胞增殖的能力而有效用于治疗T细胞介导的免疫性疾病，例如，用于预防和治疗器官和骨髓移植之后的排斥，以及治疗T细胞介导的自身免疫病、银屑病、多发性硬化、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、特异性溶血性贫血(specific hemolytic anemia)、溃疡性结肠炎、胃肌无力(myastheniagastrica)、肾小球肾炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)以及变应性疾病例如变应性哮喘和特应症。
背景技术
免疫是保护身体免受抗原(例如病原体)侵害所必需的重要现象。
免疫应答由早期固有免疫应答和后期适应性免疫应答介导。
固有免疫又称天赋免疫(native immunity)、非特异性免疫、初级防御作用或天然免疫，是指不识别特定病原体并对特定病原体立即有响应的免疫系统。
与固有免疫不同，适应性免疫对不同大分子具有高度特异性，并且可在重复暴露于相同抗原后引起非常强的免疫应答。
适应性免疫应答的两种类型是细胞介导的免疫和体液免疫。细胞介导的免疫是由T淋巴细胞介导的。
T淋巴细胞分为功能不同的群体：辅助CD4(辅助)T细胞，包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg细胞；以及CD8细胞毒性T淋巴细胞。
T细胞识别在组织或器官移植之后具有不同遗传背景的移植物中的I类和II类MHC分子，并引起称为排斥反应的特异性免疫应答，其破坏移植物。为了成功的器官或组织移植，需要调节T细胞介导的免疫应答。
对于变应性疾病，一些CD4+辅助T细胞释放IL-4和IL-13，其刺激B细胞抗体向免疫球蛋白E(IgE)的同种型转化。这些T细胞在产生在特应症的发病机制中非常重要的特定类型抗体IgE中发挥关键作用。因此，调节T细胞的免疫应答是非常重要的。
自身免疫病是指其中针对外来抗原例如病原体的免疫系统将其自身器官或组织识别为外来来源的抗原而引起免疫应答的疾病。已知T细胞参与自身免疫病的发病机制。这样的自身免疫病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病和银屑病，已知其机制是由T细胞细胞因子介导的炎症。
对于这些疾病的治疗，调节T细胞的免疫应答也是非常重要的。因此，抑制T细胞增殖对于调节T细胞的免疫应答非常重要。
现有技术文件
专利文件
(专利文件0001)韩国专利公开No.10-2008-0013886(于2008年2月13日公开)
发明内容
技术问题
因此，本发明的一个目的是提供苯衍生物作为免疫抑制剂的用途，所述苯衍生物由于其抑制T淋巴细胞增殖的能力而有效用于治疗T细胞介导的免疫性疾病，例如，用于预防和治疗器官和骨髓移植之后的排斥，以及治疗T细胞介导的自身免疫病、银屑病、多发性硬化、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、特异性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、胃肌无力、肾小球肾炎、格林-巴利综合征以及变应性疾病例如变应性哮喘和特应症。
问题的解决方案
本发明的一个方面提供了由式1表示的化合物在制备免疫抑制药物中的用途：
其中R是直链烷基、支链烷基或者包含一个或更多个碳-碳双键的烷基，X是酰胺或酯基，并且Y是卤素、甲氧基、乙氧基、羟基或硝基。
根据本发明的一个实施方案，式1中的X和Y可位于邻位。
根据本发明的另一个实施方案，式1中的R可具有6至14个碳原子。
根据本发明的另一个实施方案，所述药物可用于抑制细胞介导的免疫。
根据本发明的另一个实施方案，所述药物可用于治疗同种异体移植排斥。
根据本发明的另一个实施方案，所述药物可用于治疗自身免疫病。
根据本发明的另一个实施方案，所述药物可用于治疗癌症疾病。
根据本发明的另一个实施方案，所述药物可用于治疗银屑病。
根据本发明的另一个实施方案，所述药物可用于治疗特应症。
根据本发明的另一个实施方案，所述药物可用于治疗胰岛素依赖性糖尿病。
根据本发明的另一个实施方案，所述药物可用于治疗多发性硬化。
根据本发明的另一个实施方案，所述药物可用于治疗类风湿性关节炎。
发明的有益效果
根据本发明，式1的苯衍生物可抑制T淋巴细胞增殖，因此作为免疫抑制剂是有效的。由于这种能力，苯衍生物可用于治疗T细胞介导的免疫性疾病。例如，苯衍生物可用于预防和治疗器官和骨髓移植之后的排斥，以及治疗T细胞介导的自身免疫病、银屑病、多发性硬化、类风湿性关节炎、胰岛素依赖性糖尿病、特异性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、胃肌无力、肾小球肾炎、格林-巴利综合征以及变应性疾病例如变应性哮喘和特应症。
附图说明
图1示出了不同浓度的实施例1的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图2示出了不同浓度的实施例2的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图3示出了不同浓度的实施例3的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图4示出了不同浓度的实施例4的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图5示出了不同浓度的实施例5的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图6示出了不同浓度的实施例6的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图7示出了不同浓度的实施例7的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图8示出了不同浓度的实施例8的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图9示出了不同浓度的实施例9的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图10示出了不同浓度的实施例10的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图11示出了不同浓度的实施例11的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图12示出了不同浓度的实施例12的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图13示出了不同浓度的实施例13的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图14示出了不同浓度的实施例14的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图15示出了不同浓度的实施例15的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图16示出了不同浓度的实施例16的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图17示出了不同浓度的实施例17的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图18示出了不同浓度的实施例18的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图19示出了不同浓度的实施例19的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图20示出了不同浓度的比较例1的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图21示出了不同浓度的比较例2的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图22示出了不同浓度的比较例3的化合物对T细胞分裂的抑制程度。
图23示出了由实施例2的化合物引起的IL-2、IL-4、IL-13和TNF基因表达的水平，其使用在1小时和4小时之后的片段数目/千碱基转录物/百万片段表示。
图24示出了由实施例2的化合物引起的IL-3、NFATC1、REL和MYC基因表达的水平，其使用在1小时和4小时之后的片段数目/千碱基转录物/百万片段表示。
图25示出了不同浓度的实施例1的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图26示出了不同浓度的实施例2的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图27示出了不同浓度的实施例3的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图28示出了不同浓度的实施例4的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图29示出了不同浓度的实施例5的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图30示出了不同浓度的实施例6的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图31示出了不同浓度的实施例7的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图32示出了不同浓度的实施例8的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图33示出了不同浓度的实施例9的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图34示出了不同浓度的实施例10的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图35示出了不同浓度的实施例11的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图36示出了不同浓度的实施例12的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图37示出了不同浓度的实施例13的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图38示出了不同浓度的实施例14的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图39示出了不同浓度的实施例15的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图40示出了不同浓度的实施例16的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图41示出了不同浓度的实施例17的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图42示出了不同浓度的实施例18的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图43示出了不同浓度的实施例19的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图44示出了不同浓度的比较例1的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图45示出了不同浓度的比较例2的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图46示出了不同浓度的比较例3的化合物对IL-2产生的抑制程度。
图47和48是示出实施例2、3和6的化合物对预防移植之后排斥的作用的图像。
图49以照片示出了实施例14和17的化合物对银屑病的治疗作用。
图50、51和52图示性地示出了实施例14和17的化合物对银屑病的治疗作用，其通过视觉观察进行评价。
图53、54和55是示出实施例14和17的化合物对银屑病的治疗作用的组织病理学图像(H&E)。
图56和57示出了在银屑病诱导小鼠中由实施例14和17的化合物引起的T细胞的变化。
图58以照片示出了实施例2的化合物对特应性皮炎的治疗作用。
图59示出了显示实施例2的化合物对特应性皮炎的治疗作用的组织病理学图像(H&E)。
图60示出了显示实施例2的化合物对特应性皮炎的治疗作用的组织病理学图像(甲苯胺蓝染色)。
图61示出了基于IgE水平降低的实施例2化合物对特应性皮炎的治疗作用。
具体实施方式
现在将更详细地描述本发明。
本发明人已发现，能够抑制T细胞增殖的药物发挥免疫抑制活性并且已成功地通过动物实验显示出免疫抑制活性，所述动物实验使用皮肤移植模型作为移植模型、特应性皮炎模型作为超敏免疫应答模型以及银屑病模型作为自身免疫病模型。基于该发现完成了本发明。
将参考以下实施例更具体地说明本发明。这些实施例仅是举例说明性的，以帮助理解本发明，并且不旨在限制本发明的范围。
提供这些示例性实施方案是为了向本领域技术人员更全面地说明本发明。
尽管本文中详细描述了本发明的细节，但是对于本领域技术人员而言明显的是，这样的细节仅仅是优选的实施方案，并且不旨在限制本发明的范围。
因此，本发明的真实范围由所附权利要求书及其等同方案来限定。
本发明提供了由式1表示的化合物在制备免疫抑制药物中的用途：
其中R是直链烷基、支链烷基或者包含一个或更多个碳-碳双键的烷基，X是酰胺或酯基，并且Y是卤素、甲氧基、乙氧基、羟基或硝基。
在式1中R的定义中，直链烷基具有6至14个碳原子，并且可由CH3(CH2)n-(其中n是6至14)表示。
在式1中R的定义中，支链烷基可具有C6主链和C2支链，其由结构式1表示：
主链中的碳原子数没有限制并且可在6至14的范围内。
在式1中R的定义中，包含一个或更多个碳-碳双键的烷基可具有C8主链和两个C1支链，其由结构式2表示：
在此，直链烷基、支链烷基或者包含一个或更多个碳-碳双键的烷基中的碳原子数优选为6至14，如针对支链和主链所述。如果碳原子数少于6，则难以预期化合物的期望免疫抑制作用。同时，如果碳原子数超过14，则化合物可在体内被吸收。
式1中X是由结构式3表示的酰胺基：
或由结构式4表示的酯基：
式1中Y是卤素、甲氧基(MeO-)、羟基(OH-)或硝基(NO2-)基团。卤素基团是氟(F-)、氯(Cl-)、溴(Br-)或碘(I-)。
当式1中的X和Y位于邻位时，化合物的免疫抑制作用可进一步增强。
免疫是保护身体免受抗原(例如病原体)侵害所必需的重要现象。免疫应答由早期固有免疫应答和后期适应性免疫应答介导。固有免疫又称天赋免疫、非特异性免疫、初级防御作用或天然免疫，是指不识别特定病原体并对特定病原体立即有响应的免疫系统。与固有免疫不同，适应性免疫对不同大分子具有高度特异性，并且可在重复暴露于相同抗原后引起非常强的免疫应答。适应性免疫应答的两种类型是细胞介导的免疫和体液免疫。细胞介导的免疫是由T淋巴细胞介导的。
T淋巴细胞分为功能不同的群体：辅助CD4(辅助)T细胞，包括Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg细胞；以及CD8细胞毒性T淋巴细胞。
T细胞识别在组织或器官移植之后具有不同遗传背景的移植物中的I类和II类MHC分子，并引起称为排斥反应的特异性免疫应答，其破坏移植物。为了成功的器官或组织移植，需要调节T细胞介导的免疫应答。
对于变应性疾病，一些CD4+辅助T细胞释放IL-4和IL-13，其刺激B细胞抗体向免疫球蛋白E(IgE)的同种型转化。这些T细胞在产生在特应症的发病机制中非常重要的特定类型抗体IgE中发挥关键作用。因此，调节T细胞的免疫应答是非常重要的。
自身免疫病是指其中针对外来抗原例如病原体的免疫系统将其自身器官或组织识别为外来来源的抗原而引起免疫应答的疾病。已知T细胞参与自身免疫病的发病机制。这样的自身免疫病包括类风湿性关节炎、多发性硬化、炎性肠病和银屑病，已知其机制是由T细胞细胞因子介导的炎症。对于这些疾病的治疗，调节T细胞的免疫应答也是非常重要的。因此，抑制T细胞增殖对于调节T细胞的免疫应答非常重要。本发明人已发现，能够抑制T细胞增殖的药物发挥免疫抑制活性并且已成功地通过动物实验显示出免疫抑制活性，所述动物实验使用皮肤移植模型作为移植模型、特应性皮炎模型作为超敏免疫应答模型以及银屑病模型作为自身免疫病模型。基于该发现完成了本发明。
使用式1化合物制备的药物适合于抑制细胞介导的免疫。
所述药物适合于治疗同种异体移植排斥。
所述药物适合于治疗自身免疫病。
所述药物适合于治疗银屑病。
所述药物适合于治疗特应症。
所述药物适合于治疗胰岛素依赖性糖尿病。
所述药物适合于治疗多发性硬化。
所述药物适合于治疗类风湿性关节炎。
式1化合物的免疫抑制活性可通过T细胞增殖抑制、IL-2基因表达水平测量和IL-2蛋白表达水平测量测试来表明。
具有免疫抑制活性的式1化合物可用于制备抑制细胞介导的免疫的免疫抑制药物，并用于治疗与改变的免疫适应性应答相关的疾病，例如自身免疫病、变应性反应和“移植物抗宿主”病，具有最小的副作用。因此，使用式1化合物将有助于减轻或治愈患有相关疾病的患者的病症。特别地，式1化合物也可用于接受或将要接受同种异体组织或器官移植的患者的预防性治疗，以用于防止不期望的免疫反应。
本发明可应用于患有疾病例如自身免疫病或“移植物抗宿主”病或者处于排斥所移植同种异体组织或器官的风险中的哺乳动物，包括人。这样的哺乳动物的一些实例包括家养宠物、小鼠和大鼠。
式1化合物的有效免疫抑制量是有效提供免疫抑制作用的量。免疫抑制作用是指减缓、中断、抑制或阻止免疫应答或细胞介导的免疫应答的进一步表达。
如本领域技术人员所知，式I化合物的有效量可由主治诊断医师通过使用已知技术并通过观察在类似情况下获得的结果而容易地确定。在确定有效量或剂量方面，主治诊断医师要考虑许多因素，包括但不限于：哺乳动物的种类；它的大小、年龄和一般健康状况；涉及的特定疾病；疾病的程度或涉及或严重程度；个体患者的响应；施用的特定化合物；施用方式；所施用制剂的生物利用度特征；以及其他相关情况。
包含式1化合物的药物可以以使得所述化合物以有效量生物利用的任何形式或方式施用，包括经口和肠胃外途径。例如，其可经口、皮下、肌内、静脉内、经皮、鼻内或经直肠施用。经口施用是优选的。
药物还可与一种或更多种其他免疫抑制剂组合使用，以使其他药物的副作用最小化或增强其他药物的作用。
制剂制备领域的技术人员可根据所选择化合物的特定特征、待治疗的疾病状态、疾病阶段和其他相关情况来容易地选择适当的施用形式和方式。
化合物可单独施用，或者以与可药用载体或赋形剂组合的药物组合物的形式施用，其比例和性质由所选择化合物的溶解性和化学特性以及标准药学实践来确定。
药物组合物以药学领域公知的方式制备。载体或赋形剂可以是固体、半固体或液体物质，其可用作活性成分的载剂或介质。合适的载体或赋形剂是本领域公知的。
药物可适于经口或肠胃外使用，并且可以以片剂、胶囊剂、栓剂、溶液剂、混悬剂等形式施用于患者。化合物可例如与惰性稀释剂或与可食用载体一起经口施用。化合物可封装在明胶胶囊中或压制成片剂。
出于经口治疗性施用的目的，化合物可与赋形剂一起并入，并以片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)、口香糖等形式使用。
药物中存在的化合物的量使得将获得合适的剂量。
片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等也可包含以下辅料中的一种或更多种：黏合剂，例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如藻酸、PrimogelTM、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁或SterotexTM；助流剂，例如胶体二氧化硅；并且可添加甜味剂例如蔗糖或糖精，或者可添加矫味剂例如薄荷、水杨酸甲酯或橙矫味剂。当剂量单位形式是胶囊剂时，除了上述类型的物质之外，它还可包含液体载体，例如聚乙二醇或脂肪油。
其他剂量单位形式可包含改变剂量单位物理形式的其他多种物质，例如如包衣。因此，片剂或丸剂可用糖、虫胶或其他肠溶包衣剂来包被。糖浆剂除了本发明化合物之外，还可包含作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂以及矫味剂。
出于肠胃外治疗性施用的目的，可将式1化合物并入到溶液剂或混悬剂中。化合物的量使得将获得合适的剂量。
溶液剂或混悬剂还可包含以下辅料中的一种或更多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
实施例1
将式2化合物与DMSO混合以制备10μM、20μM、30μM和40μM混合物。混合物被分配到孔中。
实施例2
除了使用式3化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例3
除了使用式4化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例4
除了使用式5化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例5
除了使用式6化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例6
除了使用式7化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例7
除了使用式8化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例8
除了使用式9化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例9
除了使用式10化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例10
除了使用式11化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例11
除了使用式12化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例12
除了使用式13化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例13
除了使用式14化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例14
除了使用式15化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例15
除了使用式16化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例16
除了使用式17化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例17
除了使用式18化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例18
除了使用式19化合物之外，重复实施例1的操作。
实施例19
除了使用式20化合物之外，重复实施例1的操作。
比较例1
除了使用式21化合物之外，重复实施例1的操作。
比较例2
除了使用式22化合物之外，重复实施例1的操作。
比较例3
除了使用式23化合物之外，重复实施例1的操作。
测试例1：T细胞增殖抑制
为了研究实施例1至19和比较例1至3的化合物对T细胞增殖的抑制作用，使用与胞内分子共价键合的荧光染料羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(carboxyfluoresceindiacetate succinimidyl ester，CFSE)离体测量T细胞增殖。从7周龄C57BL/6小鼠收获脾并压碎。使用过滤器(40μm孔径)仅分离单细胞，用氯化铵-钾(ACK)裂解缓冲液去除红细胞，仅留下白细胞，并向其中添加CD 90.2微珠(miltenyi 130-121-278)。在4℃下孵育20分钟之后，使用MACS磁力架和LS柱仅分离脾T细胞。将脾T细胞悬浮于1ml游离培养基(RPMI1640+200U/mL青霉素+200μg/mL链霉素)中，向其中添加0.3μl CFSE(10mM)，随后在37℃下孵育5分钟。通过添加10ml游离培养基终止猝灭孵育，随后离心以获得细胞沉淀物。将补充有10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基添加至细胞沉淀物以悬浮细胞。将细胞悬液以2×105个细胞/孔的密度分配到96孔板的孔中，并用CD3和CD28抗体(各0.5μg/ml)处理以活化T细胞。测试结果使用FACS Canto获得，并在图1至22中示出。
参考这些图，浓度从底部图至顶部图提高：10μM、20μM和30μM。实施例1至19的化合物发挥了对T细胞增殖的优异抑制作用，而比较例1至3的化合物对T细胞增殖具有不显著的抑制作用。
在每个图中，y轴表示细胞的量(数目)，并且x轴表示细胞中CFSE的量。荧光随着向图的左侧移动而降低。这种降低表明细胞的增殖。
测试例2：细胞毒性
使用细胞计数试剂盒(CCK-8，Dojindo)测量实施例1至19和比较例1至3的化合物对由韩国细胞系库(Korea Cell Line Bank)提供的T淋巴细胞细胞系Jurkat E6-1的细胞毒性。在允许细胞系在补充有10％ FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中生长之后，将细胞以2×104个细胞/孔的密度平板接种在96孔板的每个孔中，并用实施例1至19和比较例1至3的化合物中的每种进行处理。在5％ CO2培养箱中在37℃下培养20小时之后，添加CCK-8溶液至浓度为10％，然后在5％CO2培养箱中在37℃下再培养一个半小时。吸光度在450nm(参考：650nm)处测量，并以相对于来自未经处理细胞(生存力100％)的值*？*的百分比表示。结果在表1中示出。
在表1中，数字100对应于100％的生存力。
[表1]
无(％) 10μM(％) 20μM(％) 30μM(％)
实施例1 100 97.3 94.3 96.6
实施例2 100 99 96 89.8
实施例3 100 98 94 90
实施例4 100 96 92 88
实施例5 100 88.7 87.2 85.7
实施例6 100 99.3 99.2 99.4
实施例7 100 82 79.3 66
实施例8 100 94.7 92.2 90.9
实施例9 100 95.3 95.1 92.0
实施例10 100 98.7 96.8 91.8
实施例11 100 89.8 91 93
实施例12 100 91 85.3 78.5
实施例13 100 98.8 97.9 90.3
实施例14 100 96.9 96.6 95.4
实施例15 100 88.8 91.2 93.5
实施例16 100 89.3 85.7 76.3
实施例17 100 73.6 72.1 72.7
实施例18 100 80.2 79.3 75.7
实施例19 100 88.4 90.5 94.2
如从表1中的结果可看出的，在用实施例1至19的化合物处理之后的生存力表明了所述化合物的非常低的细胞毒性。
测试例3：基因表达水平测量
测量由实施例2的化合物引起的基因表达水平，以研究本发明化合物如何对Jurkat T淋巴细胞中总基因表达产生作用。为此，将5×106个Jurkat细胞不处理或用本发明化合物处理30分钟，以分别制备未经处理的细胞培养样品和经处理的细胞培养样品。将佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)和离子霉素分别以25ng/mL和1μM/mL的浓度添加至各细胞培养样品，随后活化1小时或4小时。将培养溶液离心以获得细胞沉淀物。向细胞沉淀物中添加Trizol，并根据供应商建议的方法提取总RNA。通过RNA测序发现了由化合物引起的参与活化Jurkat T细胞的基因。IL-2基因对于用于诱导T细胞增殖的重要细胞因子IL-2蛋白的产生是必需的。IL-4基因是用于产生诱导B祖细胞转化成能够产生IgE和IgG4的B细胞(“类别转换”)的IL-4蛋白的必需基因。IL-2基因促进MHC II类的产生。TNF基因是被称为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)的细胞因子基因，其可引起急性炎症反应。TNF基因参与自身免疫病例如风湿病的机制。IL-13基因是由Th2细胞分泌并介导疾病例如变应性炎症或哮喘的基因。已知当用IL-3、特定冲动或抗原刺激时，IL-13基因由活化的T细胞产生。当IL-3(也称为有效的肥大细胞生长因子)的表达被抑制时，IL-13基因抑制肥大细胞并因此针对肥大细胞介导的疾病例如特应症是有效的。IL-13基因可用于骨髓增生性疾病和血癌，因为IL-3是造血祖细胞增殖所必需的造血因子。MYC位于许多配体-膜受体复合物下游的信号转导途径的交叉点(crossroad)，并立即响应以调节细胞增殖和生长。MYC初始充当允许干细胞例如胚胎细胞的分裂进行得更快的辅助子。MYC保持沉默，在不需要进一步生长或分裂的正常细胞中基本不表达。Myc基因位于8q24，并且其过表达存在于数种由于基因异常例如扩增和易位而引起的癌中。已知p53在正常干细胞中适当地控制Myc的功能，但癌基因Myc基因在其中Myc过表达超过控制水平或者p53失去其功能的癌细胞中维持其高活性。数个实验显示，当在癌细胞中过表达的Myc的功能被抑制时，癌细胞的生长被抑制，从而导致死亡，并且癌细胞对现有抗癌药物的抗性降低，从而产生协同作用。出于这些原因，控制Myc的过表达或活性作为针对新的抗癌药物的有前景的方法已引起了关注。Myc过表达存在于多种癌，包括大多数血癌中。NFATc1和Re1也被认为是用于细胞增殖的重要因子。图23和24的图确定了上述基因被抑制。
总之，实施例2的化合物可用作多种类型的癌的治疗剂。
测试例4：IL-2蛋白表达水平测量
从7周龄C57BL/6小鼠切下脾并压碎。使用过滤器(40μm孔径)仅分离单细胞，用氯化铵-钾(ACK)裂解缓冲液去除红细胞，仅留下白细胞，并向其中添加CD 90.2微珠(miltenyi 130-121-278)。在4℃下孵育20分钟之后，使用MACS磁力架和LS柱仅分离脾T细胞。通过离心去除MACS缓冲液以获得细胞沉淀物。将补充有10％ FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基添加至细胞沉淀物以悬浮细胞。将细胞悬液以2×105个细胞/孔的密度分配到96孔板的孔中，并用CD3和CD28抗体(各0.5μg/ml)处理以活化T细胞。用实施例1至19的化合物的10μM、20μM、30μM和40μM混合物中的每种处理三个孔。将细胞在5％CO2培养箱中在37℃下培养24小时。使用ELISA试剂盒对汤状物(soup)进行分析以用于定量测量IL-2。结果在图25至43中示出。
参考图24至46，发现本发明化合物的施用以剂量依赖性方式抑制IL-2产生。直方图中条的高度表示所产生的IL-2的量，表明本发明化合物抑制IL-2产生。相比之下，比较化合物不能抑制T细胞增殖，因为它们不能抑制IL-2产生。
测试例5：移植
对于动物的皮肤移植实验，作为供体的BALB/c小鼠(7周龄/20g/雌性)和作为接受体的C57/BL6小鼠(7周龄/20g/雌性)购自Hana Biotech Co.,Ltd.,Korea。使动物适应动物饲养所一周的时间。之后，向每只供体BALB/c小鼠腹膜内施用100mg/kg的alfaxan用于麻醉，使用剃刀剃除小鼠背部的毛发，用10％聚维酮对背部进行消毒，移出背部皮肤以制备移植物，并将移植物储存在冰陪替氏培养皿(Petri dish)中的湿纱布上。向每只接受体C57/BL6小鼠腹膜内施用100mg/kg的alfaxan用于麻醉，使用剃刀剃除小鼠背部的毛发，用10％聚维酮对背部进行消毒，用剪刀除去背部的皮肤(直径10mm)同时保留肉膜。移植储存在冰陪替氏培养皿中的供体皮肤，系上带，并施用庆大霉素。从移植之前两天开始以12小时间隔每天两次对接受体小鼠腹膜内施用免疫抑制剂。在施用期间，对皮肤移植之后是否发生排斥反应进行观察。观察来自手术之后未施用任何药物的小鼠和施用DMSO作为载剂的小鼠的移植物的状态，并与来自移植小鼠的移植物的状态进行比较。结果在图47和48中示出。参考图47和48，在原初小鼠和在手术之后第7天仅施用载剂的小鼠中出现排斥反应。相比之下，来自用实施例2、3和6的化合物处理的小鼠的移植物维持≥21天。
测试例6：自身免疫病
使用银屑病动物进行测试以评价银屑病皮肤病变的减轻。为此，首先，使购自HanaBiotech Co.,Ltd.,Korea的BALB/c小鼠(7周龄/20g/雌性)适应动物饲养所一周的时间。之后，将小鼠背部的毛发剃除并用脱毛膏(Niclean乳膏(巯基乙酸80％，IldongPharmaceutical Co.,Ltd.,Korea))完全去除。将动物饲养24小时。每天施加80mg的乳膏(4mg咪喹莫特)，持续1周(7天，总共7次)以诱导银屑病，如图49中所示。此后，将80mg的/>乳膏(4mg咪喹莫特)连续施加至每组，持续10天。根据表2中示出的方案施用每种本发明化合物。在施用期间，对银屑病是否减轻进行观察。作为结果，如图49中所示，与阴性对照组或DMSO施用组中的皮肤病变相比，施用本发明化合物的组中的皮肤病变得到减轻。
参考图49，在用实施例14或17的化合物处理的组中，皮肤病变得到减轻。
[表2]
参考图50、51和52，用实施例14和17的化合物处理的小鼠显示出皮肤脱屑、红斑和厚度的显著降低(P<0.05，P：P值)。
在根据上述方案对测试对象的皮肤组织进行H&E染色之后，观察炎性细胞浸润的程度。结果在图53、54和55中示出。在仅施加咪喹莫特的组(阴性对照)和施加咪喹莫特并腹膜内注射DMSO的组中观察到严重的角化过度、角化不全和不规则棘层肥厚。相比之下，在施用实施例14和17的化合物的小鼠中观察到较少的炎性细胞浸润。
图56和57示出了针对施用实施例14和17的化合物的组的流式细胞术的结果。研究了实施例14和17的化合物在测试对象中对T细胞的体内作用。为此，从施用每种化合物的小鼠收获脾，并从收获的脾中提取T细胞。流式细胞术(FACS)显示，在施用每种化合物的小鼠中CD4 T细胞和CD8 T细胞的数目降低，表明本发明化合物抑制T细胞的体内增殖。
测试例7：变应性疾病
作为特应性动物的7周龄雄性NC/Nga小鼠购自中央实验动物研究所(CentralInstitute for Experimental Animals)(SLC,Japan)。使动物适应动物饲养所一周的时间(室温21℃至23℃，湿度50％至60％)。将小鼠背部的毛发剃除(3×4cm)，用脱毛膏(Niclean乳膏(巯基乙酸80％))完全去除，并放置24小时。用棉签将100mg Biostir软膏施加至每只小鼠的背部以诱导特应症。随后，将150μl的4％ SDS溶液施加至施加部位并完全干燥约2至3小时。此后，将100mg诱导特应性皮炎的Biostir软膏均匀地涂抹在背部，每周两次，总共8次(4周)，以诱导特应症。如表3中所示，将实验动物分成4组用于效力测试。特别地，施加Biostir软膏总共8次以诱导特应症，并随后进一步每周两次施加，持续2周。
[表3]
/>
参考图58，通过施用实施例2的化合物减轻了病变。
切下动物的皮肤组织，随后进行H&E染色。参考图59，在仅诱导特应症的小鼠和仅用DMSO腹膜内施用的小鼠中观察到表面糜烂、纤维蛋白性化脓性渗出物和严重的炎性细胞浸润，但在施用化合物3的小鼠中它们得到减轻。
特应性皮炎严重的程度可通过皮肤中肥大细胞的量来评价。为了研究实施例2的化合物对特应性皮炎的治疗作用，将动物的皮肤组织用甲苯胺蓝染色以观察肥大细胞。结果在图60中示出。参考图60，与阴性对照和DMSO施用组的皮肤中肥大细胞数目相比，施用实施例2化合物的小鼠的皮肤中肥大细胞数目降低。
在施用实施例2的化合物之后两周，测量了从小鼠心脏抽取的血液中IgE的量。将结果与从其他组获得的结果进行比较。参考图61，施用实施例2的化合物的组中的IgE浓度比经DMSO处理的组中的IgE浓度低。

Claims (12)

1.由式1表示的化合物在制备免疫抑制药物中的用途：
其中R是直链烷基、支链烷基或者包含一个或更多个碳-碳双键的烷基，X是酰胺或酯基，并且Y是卤素、甲氧基、乙氧基、羟基或硝基。
2.根据权利要求1所述的用途，其中式1中的X和Y位于邻位。
3.根据权利要求1所述的用途，其中式1中的R具有6至14个碳原子。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物可用于抑制细胞介导的免疫。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物可用于治疗同种异体移植排斥。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物可用于治疗自身免疫病。
7.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物可用于治疗癌症疾病。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物可用于治疗银屑病。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物可用于治疗特应症。
10.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物可用于治疗胰岛素依赖性糖尿病。
11.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物可用于治疗多发性硬化。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物可用于治疗类风湿性关节炎。
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