HUE032623T2 - Anti-CXCR1 kompozíciók és módszerek - Google Patents

Anti-CXCR1 kompozíciók és módszerek Download PDF

Info

Publication number
HUE032623T2
HUE032623T2 HUE09826676A HUE09826676A HUE032623T2 HU E032623 T2 HUE032623 T2 HU E032623T2 HU E09826676 A HUE09826676 A HU E09826676A HU E09826676 A HUE09826676 A HU E09826676A HU E032623 T2 HUE032623 T2 HU E032623T2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
cancer
cell
tumor
cxcr1
Prior art date
Application number
HUE09826676A
Other languages
English (en)
Inventor
Max S Wicha
Christophe Ginestier
Original Assignee
Univ Michigan Regents
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Michigan Regents filed Critical Univ Michigan Regents
Publication of HUE032623T2 publication Critical patent/HUE032623T2/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/18—Sulfonamides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/715—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • G01N2333/7158—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for chemokines

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Description

ÄNTM2XM KOMPOZÍCIÓK ÉS MÓDSZEREK
Leírás MLATKÖZÄ ÁLLAMILAG TÁMOGATOTT KÜÎAïÀSRÛt VAGY FEdLRSZïês,
m&L
Ez a találmány a NIH Ilii rtt^Qltéi|:;-OA00ZP» GAiö'ltiÓ és 5 P 30 itémofati* si' §i!mú ^omiánymi $totoge3taf keretében készült, A kormány bizonyos jogokkal rendelkezik a talélmlnybah,
A TALÁlWÁif TERÜLETE A: jéien tiiiteioy tárgyai eljárások rák kezelésére ÍL8-CXCR1 etvöhel inhibitornak (pl. egy anti-CXCRI antitest vagy Repertaxin) egy további kemoterápiás szarral való kombinált headisávai úgy, hagy agy alanyban nam-daganatképzö és daganafképző rákos sejtek pusztülának el. A jelen találmány olyan készitményaket és eprásökat is Ismertet, amelyek szolid tumor őssejtek betegben való jelenlétének kimutatására és Izolálására szolgálnák (például a GXCR1 vagy FB.XÚ21 jelenléte alapján).
HÁTTÉR A rak továbbra is a második szlniú halálozási ok ebben az országban, ami több, mint 500 OÖÖ ember halálát okozza éventa. A kimutatásban és kezelésben elért félidés ellenére a rák okozta halálozás magas marad, A rák molekuláris alapjai megértésének figyelemre méltó fejlődése ellenére ezt a tudást még nem konvertálták hatásos kezelési stratégiákká. A mellrák a leggyakoribb fák az amerikai nőknél, körülbelül kilenc nő közül egynél az élete során kialakul mellrák. Sajnos a metasztatikus emlőrák még gyógyíthatatlan betegség. A legtöbb áttétes emlőrákban szenvedő nő áldozatul esik a betegségnek, A hagyományos kezelési módokat (sugárterápia* kemoterápia, és hormonális terápia) bár hasznosak, korlátozza a kezelésre reziztens rákos sejtek kialakulása. Nyilvánvaló, hogy újmegközelítésekre van szükség: m Iftétes mellrák és általában a rák kezelési oélpontjainák felismerésére,
Ginestler et al. {83th AACR Annual Meeting, April 2008, Absiract#5ÖÖ4) vizsgálja az 1LB/CXCR1 tengely szerepét: az emlőrák őssejtek működésének szabályozásában. Á WO 1005/103711 tárgyé: egy humán ÖXERt nokleinssv^szekvenciai és amino-
A sav*szskvsnóii! isannak szabályozása s» es érrendszeri rendellenességek, gyomor-bél és májbetegségsk, anyágcsere-betégségok, gyulladásos betegségek, hematológiai rendellenességek, légzőszerv! betegségek, neurológiái rendellenességek, urológiai rendellenességek, tákos bMegségek isemlősökben szapomdib! renbeüenssségek kezelésiben,
Az US 2007/208074 egy tymersejt növekedése vagy invazív jellege csökkentésére szolgáló módszeré valamint az iù#yaf y 11-8 receptor szintiét vagy aklyftasáí esökkon-tö szereket közöl. á ll 2ÖÖ0/Ö38419 tárgya a rák ás az ÂLDB1 őssejt ráknmrker jellemzésére és diagnosztizálására szolgáló készítmények és módszerek. M wáLÁtmÁHr ossmmGimäm À jêlén találmány tárgya eljárások rak kezelésére ib8*tSX£R1 útvonal Inhibitornak (pl. egy anti-CXCRI antitest vagy Repertaxin} egy további kemoterápiás szerre! való kombinált beadásával úgy, hogy egy alanyban nem-daganatképzö is daganatképző rákes séjtak puszto|ahak ek A jelen taiáimány olyan készítményeket és eljárásokat is Ismertét, ámelpk szöli tumor Őssejtek betegben való jelenlétének diagnosztizálására szolgálnák (például a CXCR1 vagy FBX021 jelenléte alapjánj.
Bizonyos megvalósítás! módokban a jelen találmány tárgyát rák kezelésére szolgáló eljárásók :képéiÉk* amelyek tartalmazzák egy alanynak IL8-CXCR1 útvonal ántagonlsta és egy további kemoterápiis szer adását. A jelen találmány egyes megvalósítási módjai olyan eljárásokat Ismertet, amelyek a rák őssejteket és a nem-daganatképző rákos sejteket csökkenik vagy kiküszöbölik egy alanyban, amelyek tartalmazzák: Repertaxin vagy származékának beadását egy alanynak olyaní körülmények között, hogy legalább a rák őssejtek egy része és a nem-da§anatképzÖ rákos sejtek legalább egy része éipusztuljon. A jelen találmány más megvaíósftási módjaiban olyan i|árásokaf ismertet, amelyek a rák őssejteket is a nem-daganatképzö rákos sejteket csökkentik vagy kiküszöbölik egy alanyban, amelyek tartalmazzák egy IU-CXCR1 reakcióét iotagohtsta és egy tovább! kemoterápiás szer beadását egy alanynak olyan körülmények közit. begy legalább a rák isseitek egy részé és a nem-daganatképzö rákos sejtek legalább egy részi elpusztuljon, A találmány tárgya az ILB-CXCRI reakcióét antagonistát és egy további kemoterápiis szert tartalmazó kestílminyek vagy készletek Is.
Bizonyos meivsíősiiásl módokban, az ItB-CXCRl reakeiőúí ahtegonlsta olyan * s^rt tartalmaz, a mely specifikusan gátolja az IL8 kötődését CXCR ! “bez<: iízony os kivh tél alakokban a szer kötődik a #$ :ff>ecifiku$ de nem Éitődik: a CXGB2-böz. Más megvzíisitásí miöökban a szer kötődik a GXORI-hez. A táiáfmáhy előnyös megvalósítási módjaiban a szer egy anii~CXCR1 antitestet vagy antitest-fmgmenst tartalmaz. A fevlsöi megvaíősftlil midökto, a szer Repertaxlm vagy annak egy származékit tsrtaimazzabfeyábbi megvalósítási módokban a további kemoterápiás szert tartalmaz egy antímltotíkus vsgyüieíet Bizonyos megvalósítási módokban az snílmíietikus vegptíei a docetaxel, doxorubicin, paklitaxel, iuoruraesl, vinkrtsziin, vinbíasztín, nokodazol, kolchicin: podofiotoxin, szteganaoih, és kombretaszfaíín csoportból választott. Más magvalósítási mődökban az antimlWkys vegyulel oatbaralíhus alkaloidok íph vinknsztín és yioblssztin}; vagy benzimídazol-kartjamátofe: mint a nokodazol; vagy kolchicin vagy rokon vegyületek, mint például a podofillotoxln, szteganadn vagy combretastatín; vagy egy taxán, például pakíitaxeí és docetaxel. További megvalósítási módokban, a további kemÄripiis szer doœtaxeft tartalmaz, A találmány előnyös megvalósítási módjaiban, az alany egy olyan tâkîipushan szenved, amelyet ha egy kemoterápiás szsrtit kezelik, akkor megnövekedik az IL-B termelés (pl. a mozgikony rák őssejtek számának növekedését okozzak Néhány megvalósítási mód szerint, az alany az alábbiakból állá: csoportból kiválasztott ráktípusban szenved: prosztatarák, pateteszekrák, emlőrák, melanoma, nem-kissejtes tüdőrák, kissejtes tüdőrák és nyelőcső adenokarcinoma. A jelen szabadalmi bejelentés leír további iPrlsokát szöljd tumor őssejtek kimutatására, amelyek tartalmazzak aj i alany tumorából vert minta és ii) CXCR1 fehérjére vagy FBX021 féhedéra tvagy az 1. táblázat egy másik fehértejéről specifikus antitest vagy an!itesí4fa|méhS rendelkezésre bocsátása; és b) a szövetminta érintkezietése az antitesttel, vagy az antitest fragmenssel, olyan körülmények között, hogy a CXCR1 z vagy FBXÖ21+ szolid tumor Őssejtek jelenlétét vagy hiányát kimutatjuk
Az antitest vagy antitest fragmens konjugáíva lehet egy szígnálmolekulához. A szignálmoiekula tartalmazhat fluorescens molekulát. A szlgnálmolekuia tartalmazhat olyan enzimet, amely szintermell reekoiőf képes katalizálni kolodmetdkus szuhsztrit jelenlétében. Az eljárás tartalmazhatja továbbá a minta érsntkeztetéséí antitestre vagy antltest-fragmensrá specifikus másodlagos antitesttel, vagy másodlagos arrtítest-fragmensseí, A másodlagos antitest vagy mlsodlagos antítest-fragmens tartalmazhat szlgnálmoiekulát Előnyösen egyetlen más fehérjét vagy nukléinsavát: Sim mérünk a CXCR1 vagy F8Ä21S- szolid tumor őssejtek: jelenlétének vagy Hiányának kim utalásé hoz:A tömör a prosztatarák daganat, petefészekrák daganat, mellrák tumor, melanoma, rmm Alssajtes tüdőrák tumor, kissejtes tüdőrák tumor és nyelőcső adenocarcinoma tumor ösöporgáből lehet kiválasztva, A jiten bfjtleniés leír továbbá eprásokif szolid tumor őssejtek popüláolőjátiék feldúsitására, amely tartalmazza: a) szolid tumor szlfvátisitisát szétválasztott sejtek létrehozására: bf a szétválasztott sejtek érlntkeztetisét CKCill'-et vagy F8XÖ21-éf |vagy az 1, táblázatból más fehérjét) mégkötő reagenssel; is ej a reagenshez kötődő sejtek kiválasztását olyan körülmények között, hogy egy szolid tumor őssejtekre feldusl-tóit populáció keletkezik,
Bizonyos esetekben további reagenst nem alkalmazunk a szolid tumor őssejtekre feldúsított populáció létrehozásához. A tumor a fresziatarák daganat, petefészekrák daganat, mellrák tumor, melanoma, nenykíSSéjief tüdőrák tumor, kissejtes tüdőrák tumor és nyelőcső adenocarcinoma tumor osopodjábil lobét kiválasztva, A reagens lehet egy antitest vagy antitesfdragmens (pl, Fáhfragmens), A. reagens lehet kenjugálí fluorokrénl vágy mágneses részecskékhez, A sejtek kiválasztását néha áramlás!; clfomofhivál, tlüoreszoenoiá''aktivilf sejt-osZtályozássil, panning módszerrel, affinitást oszlopon való elválasztással, vagy mágneses kivátasztisSát bájtjuk vegre. A jelen bejelentés továbbá leírja az itt leírt eljárásokkal Izolált szolid tumor őssejtek dúsított popuIá-dóját.
Itt a rák őssejtek olyan Izolált populációi vannak leírva, amelyek a) tumorkelfők; és b) C'XCHif· vagy FBX021 %
Bizonyos esetekben a rák őssejtek a prosztatarak őssejtek, petefészekrák Őssejtek,. mellrák őssijtek, bőrrák őssejtek, nem-kissejtes tüdőrák őssejtek, kis-sejteetűd őrák őssejtek, és m nyelőcső adenocarcinoma őssejtek csoportjából kiválasztott rák őssejtek, kiás esetekben a populáció legalább 60% rák őssejtet és kevesebb, mint 40% nem-tumorképző tumorsejtet tartalmaz, A rák őssejtek legalább kétszeresre dúsíthatok a nem frakciónál! nmm-daganatképző tymorsejtekhez képest (pl. 2-szeresre, 3~szorosra: 4-szeresreiső-szörösré; 10~szeresre, 100-szorosra,.1000-szeresre). igyes esetekben a jelen találmány leír egirasckat rák őssejteket és nem tumorképző sejteket tartalmazd seifkészhmény tumorbil való előállításira, amelyben: legalább 80% daganatképző őssejt és légfeljehb 4i% nem íumorképző sejt van, az eljárás tartalmazza; a) tumorból szétválasztott tumorsaitok keverékének kinyerését; b) a tumorsejtek keverékének szétválasztását legalább 60% rák őssejteket és legfégebfe 40% nem-daganatkipző tumorsejteket, tartalmazó első frakcióra és tumorsejtek csők- * kent méhhyisigü rák őssejtet tartalmazd második frakciójára,^anplynéí az elválasztás a mágenst íáftálmaző kaváriknek CXCRlpplveg^ FBXÚIIi-gyei vélo inntkezietésével történik; és χή az első frakció dagsnatkápző voltának kiutalását!)· sorozatos befecskendezéssel egy első gazdsáiíatba, és a eem^áganatkapzőnek szint második frakció sorezates befecskendezésével egy második gazdaiijatba. Egyse megvalósítási módok-bán a szétválasztást áramlási oltömétnávak fiuoreszciacia-ákti^áit sejt-osztályozássai fFAÜS), panning módszerrel, affinitást oszlopon való elválasztással vagy mágneses kiválasztással hajiak végre. Bizonysa kiviteli alakokban a szétválasztást fluoreszcencia-aktivált sejtváíogatisr fFACij anallztssof végezzük.
Szollá tumoros beteg kezelésének kiválasztási eljiräsa különösen tartalmazhatja: faj minta kinyerésit a betegbÓlxW «HP vagy FBX021* szolid tumor őssejt jelenlétének a kimutatásit i mintában; és (ej CXCR1 + vagy F8XÖ21 + szolid tumor őssejteket célzó kezelés kiválasztását a beteg számára (pl, anti-CXCRI antitest vagy antitest-tagmens alkalmazásának kiválasztását), A CXCR'H vagy FBX021+ szolid tumor őssejtek lehetnek a prosztatarák issejtek, petefészekrák őssejtek, mellrák őssejtek, bőrrák őssejtek, nem-kissejtes tüdőrák őssejtek, kissejtes tüdőrák őssejtek, is nyelőcső adenekarcinema őssejtek csoportjából kiválasztott rák őssejtek. A jelen bejelentés továbbá eljárásokat Ismertet vegyülő! szűrésére,, amelyek tartalmazzák: aj CXCR1+ vagy F1X021* rák őssejieí tartalmazó minta jelölt antlneoplasztikus vegyületnek veié expozícióját, ahol $ jiUfó .ipfhheopjaszökus agyőiét: tartalmaz CXCR1 vagy FBX021 antagenistát vagy IL8-CXCR1 jeltovábbítási-útvonal antagonlstit; és b) a: sejtben a vegyuíetre adott válaszként kialakult változás kimutatását: A minta tártalmazhif nem-tapadó mammoszférát A CXCR1 vagy F8X021 antagonista, vagy az IL8-CXCR1 jelátviteli útvonal antagonista tartalmazhat antitestet vagy antitest-fragmenst, A GXOR1 antagonista lehet Repartaxin származék, A kimutatás tartalmazhatja a daganatképző emíősejt sejtpusztulásának kimutatását. Az eljárások továbbá tartalmazhatják a jelölt antíneoplasztíkos szer daganatképző sejtek makim* mint nem daianatképző rákes sejtek elpusztítása kepessiiének kimutatását.
Egyes esetekben, a jelen taíálminy szeld tumor őssejtek tumorképzésének gátlására szolgáié vizsgált vegyüSei képességének meghatározására irányuló módszereket Ismertet, amelyek tartalmazzák a) dúsított szolid tumor őssejtik kinyerését, ahol a szolid tumor Őssejtek t) legallbb kétszeresre va^ a nemfrakcionáli tumorsejtekhez képest; és ii) GMGRI-e! vagy FSXÖ2t~et expresszáinak;; bj szolid tumorsejtek első, de < nem egy második készlete tesztvegyulat hatásának wfô alávetés#"' c) # áioíid tumor őssejtek első késztetenek egy első gazdaállstha való injektálását, és a szolid turner őssejtek másödtk. iátztetériéi' égy másodé gázdsáiiatha való injektálásét és dj az első állatban esetleg jelenlévő tnmor összehasonlítását a második álláthan klilakult tumorral, hogy meghatározzuk, vajon a vizsgálandó vegyulet gátolja-e A tumor kepződéséL A vizsgált vegyülei különösön egy CXCH1 vagy FBX021 Inhibitor», vagy ILi-GXöRi inhibitorúivonaí inhibitor. A jelen bejelentés továbbá egy vizsgált vegyülei szottö tumor óssojtok tumofképzesét ||tló képességlnek me|határozására szolgáló eljárásokat Ismertet, amelyek tartalmazzák a) legalább 60% szolid tumor Őssejtet tartalmazó minta előállítását ahol: a szóid tamer őssejtek CXCRl~et vagy FBXÖ21-eí ezpresszálnak; b) szolid tumor issejtek első és második gazdaailatba való injektálás#; c) az első gazdaálíat tesztvagy u lettel való kezelését» és a második gazdaátlatnak a teszí-vegyüleltel való nem Kezelését: és ti) az első állatban esetleg jelenlévő tumor összehasonlítását a második állatban kialakult tumorral, hogy meghatározzuk, vajon a vizsgálandó vagyaiét gátolja-e a tumor képződését, A vizsgált vegyálet lehet GXGRTvagy FBXDSI Inhibitor; vagy ILS-CXCR1 útvonal jnhibíton
Ai ßmm LiiikÄiA
Az 1. ábra mutatja, hogy a (yDA-b1B~453, SUM159) mellrik sejtyonaigkhai származó AtPlFLUPfl-pozltív ssitpopuláeieknak rák őssejt tulajdonságai vannak. .&amp;#, G-H. Az ÁLON enzimstlkus sktivitás reprezentatív áramlási oltometriás elemzése ΜΟΑ~»4§3 (A*B) és SUM1S9 sejtekben (CAN), Az ALDEFLUOR mérést az síéből 1, példa szerint végeztük, p, J| Az ALDEFLUÖR-pozitív populaoid képes voit olyan tumorok'^ látrehozáeira AXőOfiílD egerekben, ami megismételte a kezdeti tumor fenoüpikus heteregenitásáb fF, bj A daganatnövekedési görbék a különböző számú befecskendezni s#í itggvényében (MDA-MB-4S3-m: S0 ÖÖO sejt, 6000 sejt, és az 600 sejt és SUk1159-re: 100 000 sejt, 10 000 sejt, és 1000 sejt), és minden egyes populációra (ALDEFLUOR-pozitív, ALDEFLUÖR-negatív, nem elválasztott). A tumornövekedési kinetika korrelált a látenciával és az ALDEFLUOR-pozitív sejtek tumorképződése méretével és számával (F, L). (D, J) Az ALDEFLUOR-pozitív sejtek injekciójának helyen a RiE testés felfedi a tumorsejtek jelenlétét (D: MDA-MB-4S3 ALDEFkUOR-pozlfv sejtek Injelolójánák helye, és J: SUMS9 ALÓEFLÜÖR- pozi t ív sejtek injekciójának helye). (E, K) Az ALDEFLUOR-neiatív sejtek Injékoiojánák he- ~f A »'X A :»'X X /"> íyén csak maradik. Matrikel#, apepíotlkys sejtek és egér szimat van |p* iyCÄ^B-4S3: ÄLPif lUdR-negativf eejtejc Ihjttóllh#: fsalye, és R: ÍUM59 ALDEFLUCtR-negatív sejtik injekciójának helye),: Az idifok középérték é szórás értékek,: A 2, ábra mutatja az emlő lajtvinaiakbó! izolált ALDEFLUOR-pozHiv la az ALDEFttitÚR-negatlv fopoláciék osztátpzását a „rák őssejt aláírás" alapján, 2A Φ? ra. tf minta hierarchikus csoportosítása egy 413 gênes expresszién aláírás alapján, Ä; idÄÄix: r$!nd»s&amp;r$ égy gint Is pináén oszlop egy mintát képvisel, Figyeljük még a 413 gènes ALÍÍFL:yOR"poz|Ív (aláhúzott nevek) és negativ minták (nem aláhúzott nevek) elválását á 13 minta közöl liméí, Az áíátráiban egyes gineket a HUSO rövidítéssel jelöljük, ahogy azokat „Entrez ien# mndazérhén hasznlfak (az ALDEFLUOR~ pozitív pöpulásiék által lefelé szabályozott gének zölddel Is ez AbDiFtUOR-pozitiv populációk által felfelé szabályozol gének pirossal jelölve), 28-0 ábra, A génexpresszi! emdPényelhek tgezetásáhnz egy ALDEFLltöR fenoipus szenht rendezett öt tagú eplőfákos sejtvonal halmazban az ALDEFtUOR-pozlíív populációkban (CXCR1/IL8RA, FBX021: MFYA, NOÏCH.2 és RAD51 LI V iúiexpresszált öt dlszkrimmátor gint mértük kvantitatív RT-PCR~reL A CXCR1 és FBXO.21 kvantitatív RT-PCR-expressziós szintjeit putetja he ez az ábra, A kvantitatív RT-FCR-re! Piri génsxpressziés szintek megerősítik a ÖRS mikroarray-k alkalmazásával kapott eredményeket a CXCR1 és FBXÖ21 mRNS színt emelkedésével az ALÖEFLUOR-pozitiv populációban az ALDEFLUOR-negativ populációhoz képest (p«0,ö5). A 3. ábra mutatja az ILB/CXCR1 tengely szerepét a mellrák őssejtek szabályozásában. A. A CXOR1-et exprssszáié sajtek az ALDEFLUOR-pozltiv populációban vannak, A négy kiíinbőző emiDSe|tvonalboi (HÖO1054, SUM159, MDÂ-MB-453, BRCA-IV1Z~Ö1 ) FACS alkalmazásával izolált ALDEFLUOR-pozítiv és -negatív populációkat rögzítettük és elemeztük CXCR1 fehérje expressziójára irnmunfestéssel és FACS elemzéssel. Az ALPBELUOR-pözitiv sejtekben nagyon feldúsultak CXCR1-pozitív sejtek, összehasonlítva az ALOEFtyORmegai? popyiieievot i. Az U kezelés hatása három különböző sejtvonal (HOC1954, SUM 159, MDA-MB-453} tumorszféra képzésére. Az ILS kezelés dözisfüggő módon megnövelte az elsődleges és Pásodfagos tumorszférik kíaiakuíasit, C. Az ILS kezelés hatása adherens körülmények között tenyésztett négy különböző asjtvonai ALBEFLUtS-pozítiv populációjára. Az ILS az AL D EFL UG R-pozitív populációt dózis-függő módon növelte mini a négy vizsgálat sejfvonalban (*p<9,ö5A*p<0:Ö1t statisztikailag szignifikáns küiönbsé- < gets a kontroll csoporthoz képest), A 4. ábra avm^ni^kad^isiiÂs^î^ikMSi.p^t^biiiù.AtPfcFLyOR-po^tfV· sej-leket mutat Á, Az ItJ/RXöRl tengelynek szerepe van a rák Issejt; invázióban, Az fi$/OXf3Rt tengely invázióé vizsgálat segítségével mértük M három; különböző seit4onalboz |NC€;iÍ64, yyA-MB-453, SUM159$ÍMÜ* rumot vagy IL8-at atiraktánaként alkalmazva. Az AtBEFEltÚR-pozítíy sejtek 8-20-szer invazivabbak, mini az ALDEFLUOR-neiafív sejtek :0<é,Qf}> Ha ÍL8-at (100 ng/ml) alkalmazunk atlraktánsként akkor a megfigyelhető volt a M atr ige le n ke resztül jelentősen megnövekedett az ALDEFLUOR-pozitív sejtek Inváziója az aftraktánsként alkalmazott szérumhoz képest (p<Ö,0S), Ezzel szemben az íL3~naknem volt hatása az: ÁLDEFLUÖR-negatív populáció invazív képességére, B~M> Az ALDEFLUÖR·· pozitív populáció megnövekedőt! metaszfatikus potenciált mutatott, B*D. A mindeh egyes csoportból (AIDE FLUOR- pozitív, AL D E F t U O R-negaí ív, nem el választóit) ludiferáiza! fertőzött sejtek beoltása után hetente mért normálisán fotonfluxus számszerűsítése. E- J Áttét kimutatása a biolumineszcencia képalkotó szoftver felhasználásával (E, G: I: Egerek ií^fsd^ítwafeí·;!Hÿ. -=»1ίΐ.. ii^j^eireïk felfelé fordítva). Az ÂLDEFLÜOR-pozitív sejtekkel beoltott egerekben több áttét fejlődött ki különböző heíyeken (osont, izom, tüdő, tégy szövetekj, Is magasabb fotónluxust mutattak, mint a nem elválasztott sejtekkel beoltott egerek, ameíyeknil egerenként legfeljebb egy áttét fejlődött ki. Ezzel szemben, az ALDEFLyöR-negaiv sejtekkel beoltott egerekben csak néha fejlődött ki kis áttét, amely á nyirokcsomókra korlátozódott K-M. Az AiöEFLUÖR-pozitív sejtek injektálásából származó osont- (K), lágy szöveti (t) és izom fivtj áttétek bisztölőglal megerősítése R A Etestisséi.
Az δ. ábra mutatja a CXCR1 gátlás hatását a tumor-sejtek életképességére pÁ ábra), valamint a rák őssejt életképességére (SB ábra). A í, ábra azt mutatja, hogy Repertaxin kezelés indukálja a FAS/FAS-iigandum jelátvitel által közvetített bystander hatást, és különösen azt mutatja, hogy a Repertixm keziles által indukált sejtnivikedés-gátlás FÄS antagoniste hozzáadá-sávaí részben megmaradt, és hogy a FÁS agonistával kezelt sejtek hasonló sejtnövekedés-gátlást mutatnak, mint a Repertaxinnal kezelt sejtek, A 7. ábra mutatja a FÁK, AKT aktiválását és FOXOA3 aktiválását Reporta» kezeiés (7A) nélkül, és Repertaxin jelenlétiben (?B). A 3, ábra a mutatja a iépertaxín, docetaxel, vagy ezek kombinációjának hatása! egy emlőrák sejivenáiía |8A; SUM 159} ÉS: iküiönfeőzi Elegekből generált: Mrortt humán: mellrák xenograflra (8B, MCI : 8C, UM2 és SD, UM3).
Miß. ábra mutatja a Reperíaxin,. docetaxel, v|gf,ij|#mb:it5ált Ne2@tii bitliát i rák őssejt populációra az ALDEFLUOR assay áltál kpliabőző sejtvonalakon, bélé-értve a SUM1Í9 (9A). MCI (9B), UM2 (8C), UM3 (ÍR): mérve, A tó, Átoueutátjá: sRapertaxm, a docetaxel vagy a kemblnáelé batási! azob: elsődleges tumorok sorczathigitásaka (IDA, SUMlii, TOR, MCI, IOC. UM2, 10D UM3), amelyeket másodlagos NOD-SCID egerek «îttilülîpâmélâlM ültettek, A 11, ábra azt mutatja, hogy a Reperíaxm kezelés csökkenti a SUM 159 sejtve-na! áttétpotenciálját, A 11A ábra mutatja az intrakardiálísan beadott SUM 159 sejtekkel való beoltást követően heti intervallumokban mért normalízált fotonfluxus számszerűsítését. Az áttétképződést bíoiumlneszoencia képalkotás alkalmazásával követtük nyomon (118; Séoldattal kezeit egerekéiIC: Repertaxinna! kezelt egerek). A 12, ábra mutatja a SUM 159 sejtek ALDEFLUOR-pozltlv szubpopuíációja és a CXOR1 -pozitív szyhpepuiációja (fent) vagy CXCR2-pozitív szubpopuíációja (lent) átfedésének ábrázolását. IMA SUM159 sejtekéi adherens körülmények között tenyésztettünk, és reperíaxinnal ;(1iö nM) vagy két specifikus blokkoló antitesttel kezeltünk ÇXÇRIére (10 pg/mi) vagy CXCR2~re (10 pg/mi), Három nap elteltével a rák őssejt populációra gyakorolt hatást elemeztük az AIDE FLUOR assay használatával (i), a sejtek életképességét őt napes kezelés «Μα kaptok m MTI assay használatával (C), Az ALDEFLUÖR-pozttív populáció és a sejtek életképességének jelentős üsikkenésé vélt megfigyelheti a repertaxin vagy az anti-CXCRl antitest kezelést követőem Ezzel szemben nem volt szígniikins hatás megfigyelhető az anti-CXCR.2 antitesttel. D, 4 napos kezelés után az apoptotíkus sejtek számát TŰNÉL assay alkalmazásával értékeltük. 36% apoptotíkus sejtet (zöld festés) mutattunk kl a répertaxinnai kézéit sejtekben a kontrollal ősszébásonlítva, áhol többnyire életképes sejtek (kék festés) voltak jelen. E~F. Annak: meghatározása, hogy a sejthalált bystander hátié közvéflbt. A CXCR1 -pozitív és CXCR1-negatlv populációkat áramlással válogattuk és mindegyik populációt különböző konænfrâciojü fepértaxinnat: kezeltük (D). A sejt éSeíképasségmsőkkenést a CXCR1-pozitív és szeleiiiiailan populációkban detektáltuk, míg nem llgyeiink meg hatást a CXÇR1-negatív populációban (E). Repertaxínnai bárom napig kezeit CXCR1-pozitív sejtekből kapott cliallzáit iondíolanált táptalajt (dCivt) használtunk válogatott CXCR1 -pozitív, CXCR1 megafiv, vagy válogatás nélküli populációkra. A dsalizái! kondicionált tápközeg sörozaffigftáx ' s. salt:>at&amp;&amp;lmaztyk.1/4» dCM 1/2, βϋΐ dCM). Két napos kezelés ytisl i sejtek életképességéi MIT assay használatává] értékeltük. A sejt életképesség jelentős c&amp;mkmém·. «It. .mágfliyeíhétő mini a GXCRI megatív, mind a nem szeparált populációkban, míg nem figyeltünk meg hatást a CXCR1-pozitív populáci-öbanfF), A 13. ábra mutatja a SUÜIIi séjtvonal ALDEFLUOR~poaitív/OXCRl“pozitm Is az ÄüDEFLUOR-poätiv/CXORI'-nagaiv eejipopuláeióinak tymofképző jéliéiéi Ä, A tumornövekedési görbéket a különböző számi: (50 CK)Ö sejt, 6000 sejt, 1 ööö sejt, Is 600 sejt) befecskendezett sejtre és minien egyes populációra (ALDEFIUOR-pozltív/'GXCR1 "pozitív, AIJ)EFLüOR-'rK3zitiv1CXGR1-negativ} ábrázoltuk, tinikét seipppulápiö létrehozott tumorokat A tumornövekedési kinetika: korrelált a tumorképzidis látenciájával és mértékével és a éeteoskendazeft sejtek száménak Í-ö, AI AhöEFLUOE-pozitiv/CXCRI-pozitív populáció által generált iágsnatök sorozatos passzálással rekönstitpáiták a kezdeti tumor fenotípusos heterogenitását, míg az Ak0EFLyöR^pozltiv/GXGRl-negatív populációban csak AtDEFLUOR-pozlt IviiXGRI-negatív sejteket iárMmaző tumorok jöttek létre. Mindkét sejtpopulációt háromszoros passzálással ültettük át. A 14. ábra műfaja a CXCR1 blokád hatásét a tumcrszféra ilelakulására, lyyiSé és HÍGC1 ö54 sejteket tenyésztettünk adherens: teltételek mellett, is kezel-tönk három napig repertaxinnai (100 nM), anti-CXGRI btekköiÖ antitesttel (löpg/mlk vagy anti-CXCR2 blokkoló antitesttel (10pg/ml). Három napos kéieies után a sédeket leváiasztöiük, és azuszpenziöban tenyésztettük:. A képződött tumorszférák számát S napos tenyésztést követöeá: értékeltük. Hasonló eredményeket figyeltünk meg mindkét sejtvonalra az elsődleges és másodlagos tumorszféra képződés jelentős csökkenésével a repertaxinnai és az anikCXCRI -gyei kezelt körülmények kpzott a kpntrpilhez klpesl Ízzel szemben m anti-CXCR2 blokkoló antitestnek nem vei ha-tása a lumerszíiP képzésre, A 15 ábra mutatja a repertaxln kezelés hatását a 8UM1 59, HCC1Ô54, és MDA-MB-453 sejtvonalak sejtjeinek êletképesságére. Marom különböző sejtvonalat (SUlVli 58, HCC1954, MOA-MB-4Í8) tenyésztettünk adherens körülmények között, és kezeltünk repertaxinnai (100 nM.)< A sejtek életképességét egy, három és öt napos a kezelés után az MIT assay használatával irtokoltük, A sejtek életképessÉgé-nek csökkenése volt megfigyelhető 3 napos kezells után a SUM 168 és HCC1954 sejtvöhaiak esteiben. Azonban a repertaxln nem hetet az MDA-MB 453-sejtek élet- * A 1:6:. ábra mutatja a CXCR1 blokád hatását az ALDEFLUOR-pozltív populáció-ra ín vitro, 8~C. BOCWM (A) és MDA~MB-453 (B) sejteket adherens körülmények között: tenyésztenünk, és repertaxínnaí :(100 oM| vagy két specifikus blokkoló ante tésttit kezeltúnk CXCRí-re (10 pg/ml) vagy C.XCR2ee (10 gg/ml). Három nap áltál' tévéi a rák őssejt populációra kifejtett hatást anakzakuk az ALDEFLUOR assay használatává!. Ä HCC1954<-re nézve az AIDE FLUOR-pozitív populáció és a sejtek iletkipességinek pléntős ósikkenésé voit megfigyelhető a repertaxin vagy az antí~ 0XCR1 antitest kezelést követően. Ezzel szemben nem volt szignifikáns hatás ?ie§~ figyelhető m antitestté! (A). Az MDA-b1B'453~ra nézve np semmilyen hatás nem veit megflgpáheíi az ALDEFÜÜQR-pezitiv populációra (8). A 17. ábra matatja* hogy a repertaxih keziíls inttekáí egy bystander hatás által közvetített RAS/FASdígancjurn jelátvitelt» Á> Annak meghatározására, hogy a repertaxin kezelés által kiváltott bystander ölő hatást FAS-ligandum kőzvetlteie-e, az oldható FASdígahöym szintjét mertük a tápkizeghen BUSA teszt használatival. 4 nap kezelés után az oldható FAS-ligandum több. mint négyszeres növekedésit mutattuk ki a fepertaxinnai kezelt sejtek közegében a nem kezelt kontroílokhoz képest. B. A FAS-ligandum mPHS szintjét RT-RSFRref mertük, és Igazoltuk a FÁS-iigahdyrn termelődés növekaóéslt a repertaxin kezelés után.. Hasonló eredményeket figyeltünk tied A napos FÁS agonistáva! való kezelés után, amely aktiviia: a FÁS jelátvitelt, a FAS-ligandum mRNS ötszörös növekedésével a kontrolihoz képest, C. SUMIll sejtekét tenyésztettünk adherens körülmények között, és kezeltünk reportaxsnna! önmagában vagy kombinációban egy anti FASdígandummal, A Repertaxin kezelés által indukált sejtnövekedés gátlását részben megőrizte az ante FASdÍpndum hozzáadása. A FAI ágonlstával kezelt sejtek ha so nló sejtnöve kod és-gátlást mutattak a csak repertaxinna! kezeit sejtekhez képest. p-Έ. A repertaxin kezelés hatását önmagában vagy anti-FAS-liyandummal kombinálva» és a FÁS-agonista kezelés hatását a CXCR1 "pozitív és ALDEFLUÛR-ροζΙίίν populiosóra ana-liziltuk. A CXQRIrpÖZltlv és ALDEFLUOR-pozitív populáció repertaxin kezelés által kiváltott masszív csökkenését nem mentette meg az anti-FAl-'llgandum és a FÁS-aspöisíúvaí történő kezelés, amely rendre tízszeres és háromszoros növekedést Idézel elő a exCRt-poziíív és ALDEFLUOR-pozltív popüílőiö százalékos irlhyá-ban. A 18, ibri mutatja égy FÁS agonista hatását a CXCR1-pozitív és CXCR1- negativ séffekre, &amp; GXORt-poziiív és CXCR1 -negatív populációkat áramlással ron* deztufg I# mindegyik populációt különböző koncentrációjú FÁS agonlstával kezei» tűnk, A sejt áletkipassé^cáökkanéaÉt aGXGRlmegsüv és szélekíllailan populáei» ókban detektáltuk, mig mm figyeltünk meg látást a £X0R1»pozitîv populációban. A 1i. ábra mufatjá: a CXGR1 pratein expressziójának elemzésit a normális meílszövei ős-lpregeniter populációjában és az IL»8~kezelés hatását a mámmósztirák iaíakuíasiim. A. Eniíoredukcíós műtétből származó normái emlő epitefiális sejtek AL13EFby|)R»pözitív és »negativ populációját Izoláltunk FACS ai» kalmazásival, röpiíeiikés elemeztük CXGR1 fehitje axpressxiójára immunfestés» sei és FAóS elemzéssel, .Az ALDEFLUÖR-pozitlv sejtekben nagyon feldúsultak GXCR1 -»pozitív sejtek, összehasonlítva az ALDEFLUOR-negativ populációval. B-C, Az ILS kezelés hatása a mammoszférák kialakulására. Az Ili kezelés dózisfüggö módon megnövelte az elsődleges (8) és másodlagos (0) mammoszférák kialakulását. A 20, ábra mulattá a repertaxin kezelés hatása! a normál emlő epiteliális sejtekre, A. Emlőredukdós műtétből Izolált normái omló epiteliális sejteket tenyésztettünk adherens körülmények között és kezeltünk reperiaxinnaí (106 nM vagy 500 nMjvagy a FAS-agonistávai (500 ng/ml). Öt napos kezelés után a sejtek életképességét MTI assay használatával: értékeltük, iem a repertaxin kezelés, sem a FÁS agonisfa nem volt hatással az adherens tenyésztésű normál emlő epiteliális sejtek életképességére még maisé koncentrációjú (S0Ö nM) mpertaxlnhasználat mellett sem. B. Az oldható FAS-iigancium szlnpt ELIS A teszttel Értékeltük a reperiaxinnaí kezeit normális erre lős epiteliális sejtek közegében. A napos kezelés után az oldható FAS-Sígandum növekedését a kezelt sejtek közegében mutattuk ki. C« A FAS/CDiő expresszíojának elemzése a normál epiteljáiil emlősejtekben FACS analízissel. Alom mutattunk ki FAS/CD9S expressziét az adherens körülmények között tenyésztett normál emlős epiteliális sejtekben. D. A repertaxin kezeiis hatása a mammoszférák kialakulására. Normál emlő epiteíliils sejteket tenyésztettünk adherens körülmények között, és ka» zeltünk négy, nyolc, tizenegy és tizenöt napig repedaxinnal (100 nM). Három napos repertaxin kezelés után a sítekét leválasztoiuk, és szuszpenzióban tenyésztettük, A mammoszíérákat kifejlesztő sejtek jelentős osökkenésit figyeltük még a repertaxin-kezelt körülmények között, A 21, ábra mutatja a repertaxin kézéiis hatását e FÁK, AKT és FOXOSa aktiválásra. A repertaxin kezelésnek a CXCR1 jelátvitel további szakaszára való hatás |r- ièkelêsèhez két kddhhoxd vfrÄ tosirukciôt alkalmaztunk, az egyik a, PTEN exprésazlonak: egy PTEN-slRNS épn ;yalé csehdesjfépx a másik iped'iff A IÁK túlzóit expreaszléjáhcz kezeld: (Ad-FAKX A., A BUMIüÖ kentrell, a SlitS PlBW siRNS. és a SUMIFŰ Ad-FAK sejteket tenyésztettük adherens körülmények közöli kit napon ái 100 nM æperlaxin téyaiÉÂeA is a FAK/AKf útvo nal aktiválásit Westem-bloftai követtük. A repedaxín kezelés a FÁK Tyr397 és az AKT Ser473 &amp;}szfönl|ció csökkenéséhez vezetet, mivel a PTEN deiécié és FÁK lyiexpressziéja blokkolta a repeftaxih kezeiéi hatását é FÁK és az AKT aklyttáslra, B. A CXCR1 -pozitív sejtek immunfíuoreszcens festésével igazoltuk, hogy Repertaxin kezelés a foszföÄK (membrán fesiidés piros}1 és a foszfo-AKT expresszié ;|eiio-plazma festödés piros) eltűnését eredményezi. Egy antí-FÖX03A-vaí történi Immunfluoreszcens féltedét fellelte ÍZ F0X03a elhelyezkedését a kezeletlen sejtek eiiepíazmájában pressai), amíg e repertaxin kezelés a FÖXÖ3A sejlraagbaivalA reiokallzaoiéjáf Indukálta, Ezzel szemben, a PTEN delécióval vagy FÁK fülexpresszióval érintett sejtek magas szintű foszfo-FAK, foszfo-AKT és dtopiszmis FÖXÖ3A expressziét mutattak mind a repertaxin kezeit, mind a kezeletlen sejtekben. Az összes mintában a sejtmagokat DAPFvai (kék) kontrasztfestettik. C~D, A Repertaxin haféeét a SUM ISO PTEN-slRNS és SUM159 Ad-FAK-sejtek életképességére és a rák őssejt pepuládéra rendre MIT és ALDEFLUOR tesztekkel mértük fel. 3 napos kezelés után a PTEN delécióval vagy iFAK félixpMsszlévai érintett a# iekben rezisztencia alakult ki rapertaxinna! szemben (C). A Repertaxin kezelés mm-változtatta meg az A EDE FLUÖR-pozit Iv SUM159 PTEN csendesített sejtek arányát CD). A 22. ábra mutatja a repertaxin kezelés hatását a FAK/AKT aktiválásra ;a: RPC1ÍS4 és a MDA-MB-453 sejtvonaiakban. A repertaxin kezelés CXCR1 downstream jelátvitelre vili hatésának feIméréséhez lentivíráiis konstrukciót használtunk a PTEN expressziéjá PTPN-síRNS ipn való csendesltéséveí A. HCC1954 kantrotl ês a HCC1954 PTEN siRNS sejteket adherens körülmények kezdi tenyésztettünk két napon át 100 nM: repertaxin távollétiben vagy jefëpfêiéhen, és a FAKflKT útvonal; aktiválását western btoitaí kivettük, A repertaxin kezelés a FÁK Tyr397 és az AKT Ser473 feszforiiàciô csökkenéséhez vezetett, míg a PTEN deiécié és FÁK túlexpressziója blokkolta a repertaxin kezelés hatását a FÁK és az AKT aktivitására. B, A repertaxin kezelés nem volt hatással a PTEN mutációt hordozó MDA-MB-4Ó3 sejtvonai sejtjeinek életképességére. Western biot analízis haszniiatával igazoMc hogy a FAKfAKT útvonalat nem zavarta meg a repertaxin; kezelés, * A 23, ábra mutatja a rspsttáxló hatását a HCC1954 PTENattRNS sajt eietke-pességére, MTT assay használativá! felmérve, 3 napos kezelés: után a PTEN delécioval érintett sejtekben rezisztencia alakult: szemben, A 24. ábra mutatja a FAS-ligandyrn is az \14 mRNS oxpressziójái docetaxel vagy repertaxin kezelést kővetően kvantiafiv ^T-PGR-reí a>érva, A~B. Adherens körülmények közit tenyésztett SUM1Ü leistet kezeltünk repertaxlnnaf (100 nl% FA$ agiilstévái P0teg/mí) vagy do^te^ÉÉ f 1Ö ®M)> idamm napes kezelés útin a sejteket kinyertük, és szuszpenzióban tenyésztettük; A docetaxel indukálta mind m FAS~|}|iadumöí (A), mind az iL«8 (B) mRNS-t a SUM158 sejtekben, A i-szeres növekedést mutattunk ki az fl-6 mRNS-szintben a FÁS agonista vagy docetaxei kezelés után (B). A 25, ábra mutatja a PJRPiFAMfkT akiiváció értékelését a «rem különböző mettra! xenograítban. Western-blot-analízis mutatta ki, hogy mindkét xenograft mutatott PfIN expressziét és a FAK/AKT útvonal akivilását, amint azt a FÁK Tyr397 is az AtCT Cér473 foszforiiacio mutatja. A 25. ábramutatja a Repertaxin kezelés hatását a mellrák őssejt populációra In vivo, A-C. A repertaxin kezelés tumor novekedésm és a rák őssejt populáeíára való in vivo hatása* értékeléséhez egy emlőrák sejtvonaiat pM lily is három különböző betegtől szármázó humán mellrák xénőpaftöt {PICI, Ubf2, ÜMá) használtunk, A. Minden egyes minta esetében IÜ »5 sejtet injektáltunk NOD/SCID egerek humanizált emíőzsirpárnájába, és figyelemmel kísértük a tumor méretét. Amikor a tumorok körülbelül 4 mm-esek voltak, s,c> mpértazih (15 mg/kg) Injekcié naponta kétszer 28 napig, vagy hetente egyszer i,p. docetaxel (10 mg/kg) injikőii, vagy a (repertaxin/docetaxei} kombináció adagolását kezdtük meg A paiken muti|a a tumor méretét az egyes jelzett kezelések előtt és során (a nyíl a kezelés kezdete). A tumorméret statisztikailag szignifikáns csökkenésével hasonló eredményeket Jgyek tünk meg minden egyes mintára az. önmagában adott docetaxeílel, vagy a repertaxin/docetaxei kombinációval k©2#j|: í^páibkliam #; Éöntroilhoz képesé míg nem figyeltünk meg különbséget a kontroll tumorok növekedésében a csak repertaxinnal kezelt tumorokhoz képest. B-C. A repertaxin, docetaxel, vagy a kombinált kezelésnek a rák isseit populáción való értékelése ALDEFLÜÖR teszttel (B), és másodlagos egerekbe való visszaültetéssel (C). A docetaxel-kezeh tumor xenograftok esetében az ALDEFLUOR-poxitsv sejtek a kontrolihoz képest hasonló, vagy megnövelt arányt ; Míatiák, míg ai^poitta^in'kazéíéai'éhmagéban.^gy· kombi- néophama; dőoetaxeííeí az ALDEFLUOR*pozitív sejtek s^ii|Äfjj|g éigóífikáhs elő a rák őssejtek 66-85%~ös csökkenésével a kontrolihoz képest (p <0,01 ) (8}> Az elsődleges tumorokból a nem kezelt (kontroli) és a kezelt egerekből nyert sejtek serozathígításarí további kezelést nem kapó másodlagos NÖD/ÍC1D egerek emlőzslrpárnájába ültettük, A kontroll és a öocefaxellei kezeli elsődleges tumorok minden hígításban generáltak másodlagos tumorokat, bár nagyobb síimben csak a tepertaxtnnai vagy doceíaxelíeí kombinálva kezelt elsődleges tumorokból nyert sejtek voltak képesek tumorokat létrehozok Ezenkívül a tumornövekedés jelentősen késett, és a kapott tumorok szignifikánsan kisebb méretűek voltak, mint a kontroll vagy a doeetaxehkezelt tumorok (<% ©. Mindegyik eső-portból gyűjtöttünk xenoíranszpíantáiumoi és immUnhísziokérniai festést végeztünk fószfo-PAK, foszfo-AKT, FOKOSA, és ALOH1 expresszió kimutatásira, Membranózus foszfo-FAK expressziót és citopiazmatikus foszfo-AKT expressziét (nyíl) mutattunk ki a kontmii és a dooetaxel-kezeít tumorokban, míg nem mutattunk ki expressziét a repertaxinnal önmagában vagy óocetaxeílei kombinálva kezelt tumorokban, Nukleáris FOKOSA expressziét Çbarnivil| mutattunk kl a doceíaxeiiel vagy repertaxinnal önmagában vagy kombinációban kezelt: sejtekben. Az ALDH1 expresszié (nyíl) csökkenésit mutattuk ki a repertaxinnal inmagában vagy kombinációban kezelt tumorokban a kontroli és a cfoceiaxebkezeü: tumorokhoz képest. A 27, ábra mutatja a Repertaxín kezelés hatását a mellrák őssejt populációra in vivő. A~C. A repertaxín kezelés tumor növekedésre és a rák őssejt populációra való In vívó hatása értékeléséhez egy emlőrák sejtvonalát ÍÉUM 159, A) és három különböző betegtől származó humán mellrák xenograftot használtunk. Minden minta esetében 50 ÍOt seftit injektáltunk NOO/SCID egerek humanizált emíoxsir-párnájába, és tigyilemmel kijártuk a tumor méretéi Amikor á tumorok, körülbelül 4mm-esek voltak, sm, repertaxín (15 mg/kg) Injekció naponta kétszer 28 napig, vagy betonte egyszer í.p. docetaxel (10 mg/kg) injekció, vagy a (repertaxln/docetaxel) kombináció adagolását kezdtük meg, A g ralikon mutatja a tumor méretét az egyes jelzet kezelések előtt él során (a nyíl a kezelés kezdete), A tümermérét statisztikailag szignifikáns csökkenésével hasonló eredményeket figyeltünk meg mindén egyes: mintára az önmagában adott doceiaxellel, vagy a répertaxln/dócétáxéll kombinációval kezelt csoportokban a kontrolihoz képest, míg nem figyeltünk meg különbséget a kontroll tumorok növekedésében a csak repertaxinnal kezelt tumorokhoz képest. A repertaxín, docetaxelj vagy a kombinált kezelésnek a rák őssejt postádé?! való felkérését ALDEFLUQR teszttel és-másodlagos. agarakba való visszaüíietéssel végeztük, A docetaxel-kezelí tumor xenografiok esetében az AtöEFtUOR-poxitív sejtek a kontrolihoz képest hasonló, vagy megnövelt arányt mutattak, míg a repertaxin kezelés önmagShan vagy k#m-hinácloban a doeetaxeiléi az ALDEFbUOR-poxitiv sejtek siaiszikailag szignifikáns csökkenését Idézték all a rák őssejtek |5~8ő%~os csökkenésével a kcntreSIboz képeit (p<O.Ö1}. Az elsődleges tumorokból, a nem kezeit (kontroll^ és a kezelt egerekből nyert sejtek sorozatkigitásait további kezelést nem kapó másodlagos MD/BCID egerek emiőzsirpimajéba ültettük A kontroli és a docetaxel lét kezeit elsődleges tumorok minden hígításban generáltak másodlaps tumorokat, bár nagyobb számban csak a yepertaxlnnal vagy docetaxellel kombinálva kezelt eísödle' ges tumorokból nyert sejtek voltak képesek tumorokat létrehozni. A tumornövekedés jelentősen ikissfl. és a kapott tumorok szlgnífikánsan kisebb méretűek voltak, mint a konMíf'fip a docetaxel kezelt tumorok. A 2S,oábra mutatja a repsrtaxio kezelés hatását a mellrák őssejt populációra: in vsvce a CP44-UCD24- fenotipussaí felmérne. A~B. A repertaxin; docetaxel, vagy a kombinált kezelésnek a rák őssejt populáción való felmérését CÖ44+/CD24- sej-tek jelenlétével végeztük, A docetaxellel önmagában kezelt maradék tumorokban következetesen tapasztaltok, hogy a 0Ö44+/U024* sejteknek az aranya vagy változatlan volt vagy megnőtt, míg a repertaxin kezelés önmagában vagy kombinációban docetaxellel a 0044+/0024- sejtpopuláció csökkenését eredményezte. A. Folyamatáhra elemzis bemutáíisé az UM3 xenograftra. B. Hasonló eredményeket figyeltek meg az. MCI« UM2 és UM3 esetében. Szinte minden SUM 159 sejt CD44+/C024- minden kezelési körülmény között. A 29. Ábra mutatja, hogy a repehaxin kezelés csökkenti a szisztémás áttétet. A repertaxin kezelésnek az áitétképzödésre gyakorolt hatása értékelésére HCC1954 (A). SU Ml 59 (B), MDA-MB-453 (€} emlőrák sejtvonalakat fertőztünk lucifécizt expresszáió lenti vírussal, és oltottunk 250 009 lutíferázzal fertőzött sejtet NOO/^úlö egerekbe infrakardiális Injekcióval. Az. égereket 12 órával az intrakardiális injekció után vagy s.c. sóoldat injekcióval vagy s.c. repertaxin injéikci-óval (15 rng/kcj} kezeltük naponta kétszer, 28 napon keresztül Az áttetképzödlst blöiumjneszöenoia képalkotás eikalmazásival kivettük nyomon. A beoltást kővetőin a heti intervallumokban mért normalizált fotonfiuxus kvantiflkàlâsa a mefasztlzis képződés statisztikailag szignifikáns csökkenését mutatta a HCC1954 * vagy SUM 159 Sá|t«#N beoltott repertaxíonaí Közeli oíiorekberx iSiziÓasoblltvá a fiziológiai sóoldaítal altot kontroll egerekhez képest (Avi)5 ÉmMÈmmmbm·: a ropartaxlo kaiolès aom gyakorolt semmilyen hatost·® metasztázis kialakulására az ÄA“Ä*Ä sejtekkel írpköíözöt égerekben, (0); A- repertaxsnnal nem közei: apróiból szármáéi csonK és lágyszoveti áttétek hiszfolcgiai igazolása MM fes-tassai (D). A 30. ábra íL~8/CXCR1 jelátvitelt mutat a csak kemoterápiával vagy kombinációban repertaxínnaí kezelt rák őssejtekben, A. A potenciális ÍL-8/ÜXCR.1 sajplátviteil rák: jasejtek ábrázolása. Az 11-8 kötődés követő CXCR1 aktiválás a Fokáüs Adhéziós Kinéz (FÁK) foszforílációjái indukálja. Az aktiv FÁK foszfodlezí az •AKT-ot, és áktivlp a WNT-útvonalat, amely szabályozza az őssejt önmegtpisél és a FÛXC3A-I ámely szabályozza a sejtek túlélésit, A FÁK aktiválása megvédi a rák Őssejiaket egy a FASdigandum/FAS által közvetített bystander hatástél a FÁS jelátvitel downstream effektorának, a FADD~nak a gátlásával; A kemoterápia jelenlétében esak az ömlesztett tumor sejtek érzékenyek a kezelésre, és bocsátanak ki: nagy mennyiségiiÍ..~Ö és FAS-iigandum fehérjéket az apoptotikus folyamat sörén. Az emlőrák éssejtek az ÍL-8 által közvetített bystander hatás útján stimulálodnak, és mzíszteosek a FAS-ligandum által közvetíteti bystander ölő hatásra, i, A RepeKaxIn kezelés blokkolja az lt.~8/CXCR1 jelátviteli Is gátolta az émiirii őssejt önmegújítást és a túlélést. Amikor repertaxín kezeiéit5ifcöfÄÄIjuk, akkor a rák őssejtek érzékennyé válnak a FAS-lígandum által közvetített bystander ölö hatásra.
DEFINÍCIÓK A jelén találmány megértésit: elősegítendő néhány szót és küjezést az alábbiakban definiálunk:
Arntní Itt használjuk, a „rákellenes azeK>: „hagyományos rákellenes szed1 vagy Mrákte~ ripias gyógyszer kifejezések a rak kezelésében (pl emlősöknél) használt bármely terápiás szerre vonatkoznak (pl. kemoterápiás vegyüíetek és/vagy molekuláris terápiás vegyüíetek), sugárterápiák, vagy:sebészeti beavatkozások (pl. emlősökben).
Amint itt haszni|pk, a „gyógyszer1 és a „kemoterápiás szer’ kifejezés alatt olyan íarmakológiaíiag aktív molekulákat értünk, amelyeket egy fiziológiai rendszerben betegségek vagy kőrös állapotok diagnosztizálására. kezelésére vagy megelőzésére aikaí- * maznak |pl egy alanyban, vagy in vivo, in vitro, vagy ex vivo sejfekhem szövetekben és szervekben), A .gyógyszerek egy élő szervezek szövet, sejt vagy in v/iro rendszer fiziológiáját változtatják meg, amelybe azt bejuttatták, A „gyógyszer’ Is i „kemoterápiás széf fogaiméba beleértjük az antkhiperpmiiferativ és daganatellenes vegyi leteket, valamint egyéb biológiai terápiás vegyiíefeket A „hatásos mennyiség” olyan mennyiség, amely elegendő előnyős, vagy kívánt eredmények létrehozásához, A hatásos mennyiség beadható ágy vagy több részlétben adagolva.
Amint itt használjuk, a „beadás” kifejezés alatt gyógyszer, elogyogyszer. antitest, vagy más szer vagy terápiás kezelés adását érijük egy fiziológiai rendszerbe (pt egy alanyba, vagy mvim, m^vfe, vagy ex vfvo sejtekbe, szövetekbe és szervekbe). Az embert testbe váló beadási módok példái lehetnék a szemen (szemészeti), szájon (orlÍls| a bőrőn Itranszdermáils), orron (nazális), tüdőn (Inhaláló), sz^nyálkabártyán (bukk||s|, fülön keresztüli, és injekcióval (pl. intravénásán, szubkután, intralumorálisan, Infrapentoneálisan sföd és hasonló módon Váló headss, ,,igyüttes beadás” kifejezés: egynél több kémiai anyag vagy terápiás kezelés (pl éugirieripiá) beadását jelenti egy fiziológiai rendszerbe (pl., egy alanyba, vágy in vimr in vitro m szövetekbe és szervekből. Az adob vegyi anyag (pl. az
IbS-CXCRI jelátviteli útvonal antagoniste és további kemoterápiás szer) „együttes be-adásaMehéi egyidejű, vagy történhet bármilyen időbeli sorrendben vagy fizikai kombinációban.
Ahogy Itt használjuk, a „regresszió” kifejezés egy megbetegedett aiany, sejt, szövet, vagy szerv egy vlsszatárisit jelenti egy nem patologikus, vagy kevésbé patológiás állapotba, egy példaként szolgáló alap nem patogén sejt, szövet, vagy szerv állapotához képest. Például egy tumor regressziójába tádozik egy tömör sejttömagének csökkenése, valamint. egy vagy több tumor teljes eltűnése.
Ahogy Itt hasznápk, az Jn vitro" alatt mesterséges környezetet és mes terséges környezetben előforduló folyamatokat vagy reakciókat értünk. Az in vitro környezet többek között kémcsövekből és sejttenyészetekM! áll: Az flm vára” kifejezés természetes környezetei (pl egy állat vagy egy sejt), és természetes környezetben előlem dúló folyamatokat vagy reakciókat értünk.
Ahogy itt használjuk,: a „ssjienyészef kifejezés bármely in vitro sejitenyészeteí jelent. A kifejezés magában foglal in vitro fenntartott folyamatos sejtvonalakat (pl. halhatatlan fénotlpusáái), elsődleges sejttenyészeteket, véges séjtvonalakát (pl. nem- -és más sejtpopulációt, beleértve à.#MpsejtéÂ>.él- mWl· okit.
AmintMAasználjyk.: m a Jete falllminy iszerintl ml· járásokkal kezelendő organizmust jelent. Ilyen organizmusok közé tartoznak többek kozott az emberek és az állatgyógyászat körébe eső állatok (kutyák, macskák, lovak, sertések. szarvasmarhák, juhok, kecskék, és hasonlók), A találmány összefüggésében az „alany" vagy ,jbeteg” kifejezés általában kezelést majd kapó vagy azt kapott egyebet jelent, A „diagnosztizált”, ahogy Itt használjuk, egy betegség mmk-páMámÄeÄ^agft genetikai anetfzi% patológiai analízis, patológiái elemzés, és haseaiik alapján való fel· ismeréslt plel.
Amint if ilisznipk, az „anfiszensr kifejezési olyan nukíeinsay-szekyeneíákra (pl. RNS, alkalmazzuk, amelyek egy konkrét RMS~szekvencla (pl, mRNS) kompiemeniarei. Ez a definíciója magába foglalja a természetes vagy szintetikus aniíszenez RNS-molekulákat, beleértve a génezp^eszilf szabályozó molekulákat, például a ksi zavari RNS-eket, vagy a mikro-RNS-eket, A jelen találmány szerint alkalmazható egyik Ippeó antiszensz szekvencia a CXCR1 mRNS-re specifikus típusúi A Jesztvegyölef , vagy geleit vegyüiet" kifejezés jelentése bármilyen Wmm egy* ség, gyógyszerhatóanyag, gyé&amp;ymw éettaiÂk, .amehrÄ»i^Äat0 kór, betegség, állapot vagy testi funkció riniellenessége kezelésére vágy megelőzésére, vagy égy minta fiziológiás vágy eeiiülárls státusának más módon való megváltoztatására. Teszt-vegyöietek lehetnék ismeri, vagy potenciálisan terápiás hatású vegyiletek. A feszivá -gyű let terápiás hatását a jelen találmány szerinti a szűrési eljárások segítségévei lehet meghatározni, A „ismert terápiás vegyüíef kifejezés jelentése olyan terápiás vegyület, amelyről (pl, állatkísérletekben, vagy embereknek való beadás korábbi tagasáiáiaiai alapján) kimutatták, hogy hatékony az ilyen kezelésben vagy megelőzésben. Az előnyös kiviteli alakoknál a „fesztvégyüiefek” rákellenes szerek. Különösen előnyös megvalósításokban a „ieszivegyüietek” sejtekben apaptlztsí indukáló rákellenes szerek.
Amint itt ttaszniipk, az „antigén kötő fehérje“ kifejezés konkrét antigénhez kotöÓÖ fehérjéket jelent „Antigén-kötő fehérjik” közé tartoznak főbbek között jmmunglobuíinbk, beleértve pollftnllis. mpppyonilis,: klméra, egylánci és humanizált antitestek. Fii fragmensek, FCabltt-fragmensek, és fab expressziós könyvtárak. Poíiklonáíis antitestek előállításához a szakterületen ismert különböző eprásokat használnak, Az antitestek termeléséhez különböző gazdaáliátok Inimunizálhafik a kívánt epifőpnak, többek között Ä nyulaknak, égeréknek*. paíkányoiilÉ* Juhotek, kecskéknek sib. megfeleli pepid be-fseskendezésévél ßgf #Äyös jnéd szerint, a pepiidet kon|uii|ek egy immunoién hordozóval :{p|. fffKcM, szawasmarha szérum albumin |iM, eagy kuleslyukesíga hemocianin (&amp;LH}). A gazdaszervezet iájától függően ikötidbdző adjuvánsokat alkalmaznak az Immunológiai válasz fokozására, többek között a Freund-féle (komplett és Inkomplett) adjuvánsokat, ásványi géleket, például alumínium-hidroxidöt, felöietaktív anyagokit. mint például lizolecítlnt, pluronio peiiolokál pöiranlenokat, peptideket, olajos ernulZiókál, kuleslyukosiga hemocianinokat öjoitux· fenolt is potenciálisan hasznos bumán adjuvánsokat, mint például a SC04 (Bacillus Caímette-Guerin) és a Corynéhacterium parvumot. Üonoklonális antitestek előállítására bármely olyan technika alkalmazható, amely biztosítja az antitest molekulák termelését tenyészetben folyamatos sejtvonalakkal (Id, pl. Harlow és Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Frail, Cold Spring Harbor, NY). Ezek közé tartoznak többek között, az eredetileg Kohler és Milstein (Kohler és Mifstein, Nature, 258:495-497 (1975)) által kidolgozott hihbdőma technika, valamint a trióma technika, a humán B-sejt hibridóma technika (lel pl Kozbor et al, Immunoi. Today, 4:72 (1983)), és a humán monollonális antitestek előállítására alkalmazható EBV-hibridóma technika (Cöfi «IllU Pihöókmái Anllpdies and CanoerTberapy, Alan R, üss, Inc., pp, 774)8 (1985)). A találmány szerint az egyláncú antitestek előállítására leírt technikák (US 4.946,778) kívánság szerint adaptálhatók konkrét egyláncú anltesíék termelésére, A taíáímáoy\i|f::i3YÍ:í!|;bi kiviteli alakja a szakterületen ismert módszert alkalmazza Fab expressziós könyvtárak felépítésére |Huse et al., Science, 248:1275-1281 (1989)), hogy lehetővé tegye a monokionálls fáb fragmensek gyors és könnyű azonosítását a kívánt specifldtással
Az antitest möliküla Idioüpusát (antlgénkotö régióját) tartalmazó antitest fragmensek ismert módszerekkel generálhatók. Például ilyen fragmentumok közé tartóznák, tóbbik: között: a F{aH)24ragrnens; amely egy antitest-molekula pepszlnes emisztèsévei illilhéfi élipa Fab: fragmentumok, amelyek egy F(ah)2~ítagmeos díszük fid hídjainak rédukáíisávaí álíihaték élő, és a Fáb fragmensek, amelyek egy antitest molekula papainnai is redukálószenel történő kezelésével generálhatók.
Az aotigénkőtö fehérjéket kódoló gének a szakterületen ismert módszerekkel izolálhatok. Az antitestek termelésénél a kívánt antitest szűrése a szakterületen ismert módszerekkel- valósítható meg például radioimmunoassay, ELliA (enzímkáposöl λ
ImmonoszorbeAf teszt), „szendvics“ ímmuntesztek, ih8menMdj«©tiiás tesztéig gél élé fázIli precipitin: makaiók,, immendiffúziős vizsgálatok, m sde Immyntélziel (például kolloid áfis arany, ipáira vagy tfádíöizöíóp· jelölisek alkalmazisávall Weaterrebiotgk, pfeeipitáoíis reakciók, sggiuiínáeiős tmzMs. (pl gélaggiutináeiós tmú, hemagglotináelős teáit stb,], komplement fixáofős tesztek, immunfiyoreszcens tesztek, protein A tettel és ipMynelektroferiils tesztek Ä# sík
Ahogy itt használjak a »modulál" kifejezés egy vegyüietnak a sejimükődés, bele-idya, de nem kizárólag, a sejtnövekedés, pföliferáoio, invázió, anghgenezís, az apoptózis, és hasonlók egy aspektusét befolyásoló (pl. elősegítő vagy késleltető) aktivitását jelenté
A TAtÁL»ÁRT RÉSZLETES LEÍRÁSA A jelen kezelésére I IS-CXGR 1 útvonal inhibitornak (pl. egy anti-CXCRI antitest vagy Repertaxln) egy további kemoterápiás szerrel való kombinált beadásával úgy, hogy egy alanyban nem-daganaikepzo isi daganatképző rákos sejtek pusztuljanak el. Á jelen talllminy olyan készitménpkit Iá eljárásokat iá ismertet, amelyek szolid tumor őssejtek betegben való jelenlétének diagnosztizálására szolgálnak (piidáui a CXCR1 vagy FBXC21 jelenléte alapján). I, Daganatképző ráksejtek, ALDH, CXCR1, és CXCR1 gátlás
Egy normális sejt evelisiőjs egy telesen átalakult sejtté több sejtfolyamaf deregulációját követeli meg (1,2). A ksmínegarsezls klasszikus modellje szenet ezek az események bármely sejtben iÄrdulbatnal. Ezzel szemben, a „rák őssejt hipotézis" szerint az onkcjgén transzformioíö prefereneiáüs céljai a szöveti őssejtek vagy a korai progenitor sejtek, amelyeknek van szerzett önmegújitó potenciálja (3-6), Ezeket a »turnon-kezdeményező sepskef vagy „rák őssejteket" (CSC) viszont az jellemzi, hogy képesek önmagukat megujiant egy Olyan folyamatban, amely a daganat oelluláris heterogenitásához hozzájáruló daganatképzödést és differenciálódást ösztönzi. A rák őssejt hipotézist alátámasztó újabb bizonyíték jött létre elsődleges humán daganatok xenograftjainak alkalmazásával. Ezek a vizsgálatok árrá: utaltak, hogy a daganatok a rak őssejt komponens által ösztönzött sejthierarohiáhől állnak. Ezenkívül ujehb adatok utalnak arra, hogy mind egér, mind humán szövetekből származó immortalize!! sejtvonálák iá tartalmazhatnak őssejt tulajdonságokat megjelenítő sejtpopulációt. A legtöbb Ilyen vizsgálat in vitro.tulajdonságékor! aiapuft, beleértve a klonogén potenciáit, á szlirálipzést és a több sejtvonalas differénolSiődM potansiálí {7-10). îwibbl* hsibatatiannl vili mfrwmhk xenograftban való funkdleriiiís átültetését alkalmazd korlâtezottabb vizsgálatok is arra utaltak, ífeen hierarchia tetőzik. Ezek a vizsgalatok általában Moenhst felék kizárást alkalmazták az úgynevezett poelték populáció” azonosítására (SP) (7, 9: 11} Ízen túlmenően elsődleges tumor xénografíok, például a 0044 és a CD 133 használatával definiált sejtfelszíni markereket alkaimaztak háienlö populációk felismerésére kialakult sejtvonalakban (7, 8),
Amint azt: az alábbi Példákban leírtuk:, az aldehid-dehídrogenáz (At DH) őssejt marker axpressziöpt humán mellrák és a nem-transzformáli emlőseitekből származé 83 tagö sejtvonahsorozatban vizsgálták. M ALUHI Intraaellulérls aldehidek exldáelőpéh felelő méregtelenítő enzim, és úgy gondolják, hagy szerepet játszik a reinaíhak Mlnsavvi való metaboíizációja útján tltféhl; őssejt differenciálódásban (12, 13). Az AI..DH aktivitását a fíiőreszeehs At DE FLUOR teszttel felmérve sikeresen alkalmazták rák őssejtek izolálására myeloma multiplexben és akut mlelold leukémiában (AML), valamint az agydaganafökből {14-1i| A közelmúltban kimutatták, hogy az ALDH aktivitás sá iiá^náfhali·· ·φ%® szubpppuiációjának Izolálására, amely a normális emberi emlőszöveti és emíö-karcínóma őssejt tulajdonságait mutatja (17), A redukciós emlőszővetpiasztikibóí izolált ALDEFLÜÖR*pozitív populáció képes rekonstruálni humanizált MOQ/SCID egerekben az emlő zsírpárnák duktáíis alveolaris szerkezetit. Ezenkívül a humán emlő karctoómákból izolált ÁLDELBUOR-pozítfv sejtek Őssejt hatását az igazolja, hogy képesek daganatokat helyreállítani sorozatos ÂWssâl'ttOl^OÎÏ egerekben, valamint létrehozni a kezdeti tumorok fenotipusos heterogenitását (17), Az alábbi Példákban igazoltuk, hogy a legtöbb emlőrák sejtvonal tartalmaz ALBEFLUOR-pozitív populációt egy a rák őssejt tufajdonsápit megjelenítő elkülönült molekuláris profillal.
Amint azt az alábbi piídákban leírtuk, a jelen találmány kivit# alakjai fejlesztése során végzett munka rák őssejt markerkénf azonositola a CXCRl-et (amely az 1L8 gyulladásos kemokin egy receptora), Kizárólag az Aidéfíeor-pozitív populációban lévő sejtek expresszáltik DXÇRI-éi Klmutáhuk továbbá, hogy ez a receptor játszik funkcionális szerepel: abban, hogy a rekombináns IL8 képes növelni az őssejtek arányát a sajt-vonalakban:. amint ezt az Aldefíuor Is a szfiraképzésl tesztekkel meghatároztuk. Bár az ItS-fOÍ léídák, hogy társítható agresszív emlőrákokkal, és magasabb a szintje az áttétes betegségben szenvedő nők szérumában, így vélik:, hogy a jelen találmány az első, ami kimutatja az ILS és az őssejtekben lévő GXCRi receptora közötti funkcionális kapcsola- £ töt •Amint fêitÂliii ismertetjük ai alábbi Réldâkham kimutattuk*. bogy a rákM*· sejtel szelektíven iàmuik&amp;iùk® CXCRÍ receptor blokkolásával izeikben ii iéffskhén, A Példákban leírt egyik megközelítés szerint az emlőrák sejivooaíakat a CXPRii mönpkiönális anlitestjeivei, de nem a másik ILS receptek a &amp;XCR2 ántitesfjeivef kezek ték, Az ilyen kezelés sí®lektíven célozta a rák: őszeiteket, amint ezt az Aldefiuoppozliiv püpaláoiők csökkenése igazolta. Figyelemre miítóan azt; derült ki, hogy bár a C3XCR1-et a sejteknek csak egy nagyon kis százaléka expresszibe (pl. kevesebb, mint 1%). a CXCRÍ receptor blokkolása a többi rákba st^t többségében sejthalált indukált, annak ellenére, hogy hiányzott belőlük a CXCRÍ: receptor !gy fény derült arra i molekuláris reakcióútra, amely az IL hatását közvetít! i rák őssejtekre^ is felélőé ezért a más sejté" kel megölő úgynevezett „bystander hatásért". Az ILS a CXCRÍ-hezkötődve Mtmuiátja ez őssejt önmegújulást, amely viszont aktiválja a fokálís adhéziós kinéz Fák útvonalat. Ennek az eredménye az Akt aktiválódás, amely ösztönzi az őssejt önmegújulást Ha ez az útvonal a rák őssejtekben blokköivs van, akkor az Akt jelátvitel csökkenése a Föxo »SZkripeiös faktorok ottopiazmaikys szekvesztrácipját okozza, ami a Fasdigandum fokozol szintéziséhez vezet, A Fasdtjpndum a rák össejtekbőí választódik el, és sejthalált Indukál a Fás receptort tartalmazé környező sejtekben. ivlig a jelén találmány nem korlátozódik semmilyen konkrét mechanizmushoz., és a rnechanizmus megértése nem szükséges a jelen találmány gyakorlati megvalósításához, úgy véljük, hogy á CXCRÍ közvetíti a rák őssejt önmegújulását egy 8::ÍgÉfc-éSkAi&amp;: bevonásával játszódó útvonalon kereéztÚjj és hogy énnek az útvonalnak a blokkolása sejthalál indukál a rák őssejtekben, valamint az azokat körülvevő daganátsejtekben. Mint ilyen, a taláiminy iízönyos megvalósítási módjaiban a találmány tárgyát képezik az ÍL8-CXCR1 útvonalat rák kezelése érdekében (pit anthCXCRI antitestekkel, antl-FAK antitestekkel, vagy más szerekkel) megszakító készítmények és módszerek,
Mivel az ILS kemokin részt vesz a szöveti gyuladáShan, korábban is érdeklődés mutatkozott az 118 jelátadas g^iiornaht Egy kis molekulájú Inhibitor, a
Repartaxin került kifejlesztésre gyulladáscsökkentő szerként arra. hogy potenciálisan csökkentse a miokardlálls Infarktus és a sztrók következményeit, A Repartaxin hakerüÉ L és II. fázisú klinikai vizsgálatokba, és kevéssé bizonyult toxikusnak, Am Int ézi az alib* bi Példákban bemutatjuk, a Reparla» (mint az anti-CXCRI antitestek) képes megcélozni a rik őssejteket, valamint indukálni a Pas-isgandum fás-közvefíietle apoptozíslt a környező sejtekben kiváltott bystander hatással. Fontos megjegyezni, hogy tumor xsnograffekban a ftepartaxln fokezza a kemoterápia hatását További, ellentétben i kemoterápiávaL amely a tumor őssejteket megkímélve pmfamm\à9®âm® differenciát sejteket pusztítja e|a Réparíaxiji képes a tumor őssejteket megcélozni. Amint azt a példákban bemutatjuk, ezt hizonyi|a a Repaftaxinnai kezelt tumorokban az Aídefluor populáció ssŐlkenéM, és sión kezet tumorsejíek képességének csökkenése másodlagos tumorok egerekben való létrehozására. Ugyancsak vizsgáltuk a Repartaxln képességét melaszfázis bfokkolislrs, á::ÍMmo^iték#|;tp^eráZ2ál jelöltük, és Intrakardlállsan fecskendeztük be egy klsédetl metásztizís modeiben. A tumorsejtek bevitele útin egy nappal, az egyik állatcsoportot csak repartaxínnaí kezeltük, a másik nem kapott kezelést. A Repartaxin szignifikánsan csökkentette a metssztázisok kialakulását. Ä jelen laiitmány szerint felismerés az, begy a CXCR111.8 receptor a cél a rák őssejtek közeliiében. A kis molekulájú Repartaxin inhibitor gátolja mind a CXCR1-eC mind a GXCR2-t A Példák igazolták; bogy a CXOR1 a rák Őssejtekben a legfontosabb receptor, Továbbá, a Példák azt muitpk, hogy a ciiotoxikus kemoterápia sikertelensége abban, begy erélyesen kezelje a kialakult rákos megbetegedéseket, nemcsak amiatt iebeíéeges, meri: ez a kezelés aeiTi képes az őssejteket megcélozni, fianem az Ih8 elválasztásnak a tumor citotoxikus kemoterápiás kezelés miatti dokumentált növekedése miatt is. A jelén Példák azt mutapk, hogy a CXC.R1 inhibitorok a használata jótékony hatást fejt ki abban, hogy képesek specifikusan megcélozni a Ä valamint, hogy blokkolják ezen sejteknek a citotoxikus kemöteripiá
Az U..8-CXCR1 útvonal célzása nem korlátoződik a metirakra, hanem bármilyen ti-· pusú rákra alkalmazható. Előnyősén kezeit rikipus egy olyan rák, amelynél bizonyíték van a megnövekedőt IL8 tomfelésre (pl. kemoterápiával összefüggésben ). -A kemoterápiás szerekről kimutatták, hogy közvetlenül szábilpzzik az IÜ transzkripciót rákos sejtekben, Â paklítaxel növeli az IL8 transzkripciót és a petefészek-, mell- és tüdőrák ssjtvonalakban való elválasztást (Uslu ef ak} 20®, int, J, Gynecol Cancer, 18:240-248; és Ooins et aLy 2000, Can. Irnm. Immuno., 49:78-84}, Ezenkívül adriamicin és δ-fluor-S’-dezoxi-uíldín beadása emlőrák-sejtekbe (DeLarco et al., 2001, Can. Res. 81:2867-2.861 X 8-FU beadása szájüregi rák sejtekbe (Tamatani et al., 2004, Int., J. Can., 188:912:821), doxomblin baablsa kissejtes tüdőrák-sejtekbe (Shlbakura et al,, 2008. Int. J. Can., 103:380-388) és dákathazin beadása melanoma sejtekbe (Lev et al., 2003, Mol, Can, Then, 2:783-763) Is mélhővékedett CXCL8 expressziét eredményez, Mint ilyen, a folilminy bizonyos megvalósítási módjaiban a találmány tárgya az IL-CXCRI-ei ciizé szerek, kombinálva egy kemoterápiás szerrel (pl, a fenti hivatkozásokban említet-* ilgusu râkbéb·, Âfêôk kiaöti pmsztalarákban, p eiefészektBkhan:f emlő- rêkbsâii, :iß#la^|mäfesn«. nem-kisseltés fidéfálíláh, iklssijtes tüdőrákban, iS nyelőcső egyén kezelésére, A jeter* láiáimátey mm Máfozödlfc :átesft rákhpusra, hanem kiteged többek között a következőkre: Ifemszarkoma, míkeszaÉŐma, ílposzarkóma, kondroszarkoom oszteogin szarkéma, kordéme, angiöszarkórna, endotelloszarkóma, limíangioszarkóma, tlmfangtöandstalioszarkőma, synovioma, mexczeliöma, Ewing-tumör, ielomioszarkoma, raPdomiüszarkórna, vastagbét-karcinőma, hasnyálmirigy-rák, mellrák, petefészekrák, prosztatarák, pikkelyes sejt karcinóma, nazális sejt kareinóma, adenokareinóma, verej-tékreihgy-Xamlnőma, faggyumirigy-kaminörna, szsmiícsös ksminéma, szemölcsös adenokamininm, elsztsdenokardnóma. medulla kaminorna, hörgő kareinőmgt, vasesejf-karclndma, hepatoma, epevezeiék kareinéma, konokarelnima. szeminonm embrionális karcinoma, Wiíms-tumor, méhnyakrak, heredaganat, túdökarcinépM* kissejtes tüöőkarcinóma, hólyagkarcinéma, aplteliális karcinőmá* glioma;, asztmeitoma, meduílobíasztőma,. kmniofaangióma, epeodimöma, pinealéma, hemangiobiásztérna, akusztikus neurfnőmaj oligodendroglioma, maníngeoma, melanoma, neorohlaazfóma ee retínobiasztoma, II Szolid tomor éese|tmarkera| limdtaÄa
Egyes eseteikben a jelen találmány leír eljárásokat őssejt rákmarkerek {pl, a dX^fil. FBX021, NFYÄ, NOTCH2, RAD51L1, TBP. és az 1. táblázat más fehérjéi) kifejeződésének kimutatására. A kifejeződést közvetlenül lehet mérni {pl, az Bll vagy a fähige szintjen). Az expresszié kimutatható szövetmintákban (pl. biopszia szövet). Az expressziét kt lőhet kimutatni testfolyadékokban (pl. többek között plazmában, szérumban, teljes vérben, váladékban és a vizétethin|, A jelen bejelentés leír további paneleket és készleteket markerek kimutatására. Így őssejt rikmarker jelenlétét fel lehet használni arra, hogy egy alanyra nézve prognózist állítsunk fel. A kapott információ felhasználható a kezelés menetének irányítására is. Például, ha egy alanynál szolid tumor őssejtet jelző markért (pl. CXCRt. F 8X021, NFYA. NOTCH2, RAD51 Li, T8P, és az 1. táblázat más fehérjéi) találnak, akkor további kezelések (pl, sugárterápia) egy olyan korábbi időpontban kezderninyezhefpfe amikor az nagyobb valószínűséggel lesz hatékony (pl, metasztázls előtt). Ezen felül, ha az alanynál olyan tumort találtak, amely nem reagál egy bizonyos kezelésre, akkoraz ilyen terápiákkal kaposolatos költségeket és kei lem ellenségekéi el Hebet kérőink A jelen bajeterrfés teír egy tiib marker (pi a CXORI vagy F BX021 is tegatibh a CD44, €0¾ is azlBA egyjket(tptalm«si: kombiniçlôj elemzésére szolgáló; papal, A panai lehetővé teszi a karoinogenezissel ls/vagy mefasziázissaí korreláló tibh marker egyidejű elemzéséi At alanytól Éiggôan a panalakat Ipéííííp vagy kgmbteidibaa |a>> hét elemezni annak érdekében, hogy a iihsfô legjobb diagnózist és prognózist szolgáltassák,: Egy paneibe yalo felvételhez: á markerekef azok pridlkiiv értékére lefolytatott szűréssel végezzük, bármely alkalmas módszerrel, többek közit! az alább; szemléltető példákban leírtakkal. 1. RNS kimutatása
Szolid tumor Őssejt rákmarketéké! i megfoieiö mRNS expressziójának mérésével lebet kimutatni egy szövetmintában. Az m R N S -exp ressziéí mérhetjük bármilyen alkalmas módszerrel, többek iőzii az alábbiakban közűitekkel. A humán CXCR1 nukleinsav hozzáforésí száma Nif. 690334 (e leírás részeként tekíhpkj, és a human FBX021 hozzáférési száma NMJ533624 Ezek a szekvenciák felhasználhatók primerek és próbák (valamint sSRNS-szekvenciák} tervezéséhez.
Bizonyos esetekben az RNS-t Northern-blot eiemzissel mutapk ki. A Northern-blet elemzés magában foglalj« az RNS szétválaszfÉsát és egy komplementer jelzett próba hibridizációját. Még további esetekben az RNS-t (vagy a megfelelő cDNS4) egy oügonukteotki próbához való hibbdlzÉeéval mutatjuk ki). Változatos btbrsdtziülés és a kimutatási technológiákat alkalmazó különböző hibridizációs tesztek állnak rendelkezésre. Midiül bizonyos esetekben a Tagbían tesztet (PE Biosystems, Foster City, CA; id. például az US 5,962,233 és 5,538,848 sz< szabadalmi iratok* atnély^é· #SeÄ részét ké pezi) használjuk, A tesztet egy PCR-reako?o alatt végezzük, A TaqRlan teszt az AMPLITAÖ GOLD DNBöpolímeráz Ik^exonÂeâz aktivitásit használja ki, A POR re-akoliban szerepel egy S’mportar festékkel (pi, egy fluoreszcens festék) és egy 3-kiolté festékkel rendelkezi olígonukleottdbei álló próba. A POR folyamán, ha a próba a saját oéipeniihoz kötődik,akkor az AMPLITAQ GÖLD polimeráz 8’~3’ nukfeolitfkus aktivitása féthasiia a riporter és a kioltó festék között a próbát. A riporter festék elválasztása a kioltó festéktől a fluoreszcencia növekedését eredményezi. A jel a POR minden egyes ciklusával halmozódik, és kövsliiii egy ffUörímeterrel Még további esetekben reverz-tmnszkhptiz POR (RT-PGR) módszert aIkaImazunk az RNÜ expressziójának kimutatásÉra, Az RT--PCR során az RNS-t revorz transzkríptáz alkalmazásával enzim alkalmazásival eozimáílkusso Átalakítjuk komplsmsnter ÖNB-sé vagy „ePNSss"Sé. A cDNS-t ezután terápiáiként használjuk egy PCR-reakCióban. A POR-tenmikeket bármilyen alkalmas mpdsianll ki tehet mutatni főbbek között gáP efókiroforézisséf és ÄB specifikus feetikke!: valu festéssel vagy jelzett próbává való hibridizációval Bizonyos esőtökben kvantitatív revorz tronszknptáz P C R-t a lkaim azn a k át m 5#«,78δ és 5.876,978 sz, szabadalmi iratokban teirt kompetitiv tompiát módszer standard keverékeivel 2. Fehérje kimutatása
Az Őssejt rákmarkerek génexpressziója a megfelelő fehérje vagy poiipeptid (pl a CXOR1, FBXÖ21, NFYÂ, NÖTCH2, RÂBS1L1, IBP, és az 1. táblázat más fehérjéi) expresszíójának mérésével mutathatók ki. A fehérjeexpressztö bármely alkalmas módszerrel kimutatható. Egyes esetekben a fehérjéket Immunhisztokémlal módszerrel mutatják ki Más esetekben a tahitikét a fehérjével szemben keletkeze antitesthez való kötődésük alapján mutatják ki. A humán CXCR1 hozzáférési száma NPj8Í0|25, és a humán FBX021 hezzáférési száma NP 298373. Az antitestek képződését az alábbiakban ismertetjük..
Az antitest kötődése a szakterületen Ismert módszerekkol valósítható meg (páiőlui tediOimmunassiyíj ILISA {enzimkapcsolí immunoszófbihs teszt), „szeadvlöif1 immun-tesztek, immunradiometriás tesztek, géldiffúziós precipftácios reakciók, immundiffuzíós vizsgiiaiők, in siu Immuntesztek (például kolloidáiis arany, enzim vagy radíelzotőp jele-lések alkalmazásával), Western-biotok, preeípiiáeiős reakciók, agglutinációs tesztek (pl gélaggluiínádős teszt, Hemaggíytlnáeiós teszt stb.), komplement fixációs tesztek, protein A tesztek és immuneiektroforézis teszlek stb.
Az antitest IkOtödést az elsődleges antitesten lévő jelzés kimutatásával lehet kimutatni. A elsőd leges antitestet egy másodlagos antiiésinak vagy égy reagensnek az elsődleges antitesthez való kötődésével lehet kimutatni. A másodlagos antitest lehet jelzett. Számos módszer ismert a szakirodalembih egy Immunoassay során létrejött kötődés kimutatására, és ezek á jelen bejelentés körén belül vannak.
Bizonyos esetekben automatizált kimutatási tesztet alkalmazunk. Az immuntesztek automatizálási módszerei közé tartoznak ai IJB 8t855,538S: ##81,788^,159,758, ter 1,358,091 sz. szabadalmi Iratokban leírtak. Az eredmények elemzését lés bemutatását Is lehet automatizálni. Például rákos markeréknek megfelelő febégesorozatok jelenléte, vagy hiánya alapján prognózist generáló szoftver használható. Más szempontok szerint az imrrsunteszí leírása az US 5,599 077 és az 5,672,480 az. szábáda:l?^í: iratokban szerepei.
&amp;..A cDNS mtkrmmy· imhmtúgiB A cDNS mikraarray több (általábantöbb ezer) különböző cONS-b lartaímaz (áílaíá-ban egy robot pecsitafö eszközzel felyíée) egy szilárd; hordozó,...mint például egy üveg mikroszkóp tárgylemez Ismert helyeire. A eOhfB-eket plezmld könyvtár Ihszertek; PCIT-ampiífitóeléjávai kamuk é 0mmlé vektbr^erjnÄi magává! a ginnel kőmpfe’-mmúM pirneÄ:· álkaímiiiillyal! azoknál a gineknél, ahol a szekvencia Ismert Af*G$k termékek előállítására alláímas míkroarray-k jellemzően 0,5 és 2 J ki közötti hosszü-saguak. teles hosszúságé dDN8~ek, expresszált szekvencia Jelek (EST), vagy viiett tensxerüen kiválasztott cDNS~ek bármely Jelentős könyvtárból választhatok. Az EST% részlegesen székvenált cDRS-ek, amint ez például itt szerepel: t-iier, el ab, 1996, 6:807-828. Bár néhány EST Ismert géneknek felél meg* gyakran nagyon kevés vagy semmilyen Ipfermáélö nem áll rendelkezésre egy adóit EST-ről, kivéve egy kis mennyiségű 3! és/vagyS1 szekvenciát, és esetleg az mRNS eredeti szövetik ahonnan az EST származott, Amint azt egy a szakterületen jártas szakember nyilvánvalónak tartja, általában á cDNS ek elegendő szekvencia Információt tartalmaznak ahhoz, hogy a gént egyedileg azonosítsák az emberi genomban. Ezenkívül általában a oQNS~ek elegendő hosszúságiak ahhoz, hogy szelektíven:, specifikusan vagy egyédilég: hthridszaijahak egy egyetlen génből szármázd mRNS~bő! kapott cDNS-hez a kísérlet hibridizációs körűimé* nyel kőzitts
Egy tipikus mikroarray kísérteiben egy mlkroarrayte hibrídízájnak két különböző mintáhéi származó eltérően Jelzett RNÍ, DNS vagy cOhIS populációkkal A íéggyakrah-ban a vizsgált sejtekből vagy szövetekből: :RNS4 (vagy a teljes RNS-t, vagy polí-A-r RNS4) Izolálnak, és mverz transzkripcióval kapnak eDbtS-t. A jelölést általiban a revem transzkripció során végzik egy jelzett nukleoiidnak a reakeíoeíegybe való bevezetésével Máiét a küíenhöz# jeiiisel aikaimazhaték, leggyakrabban a nukleotid a Cy3 vagy Cy5 fluoreszcens festékekkel van konjugálva. Például CyMUTP és OyS-dUTF használható. Egy (például; egy adod sejttípust, szövettípust vágy növekedési álápot képviselő) minti-bél származó cDhiS-f az egyik Tlyorofdrraj jeiöpk meg, lilfcözjbe« |tiM&amp; (például egy másik sejttípust, szövettípust, vagy á: növekedési; körülményt képviselő): mintából; származó cDNSte a második fiuoroforrai Jeiöpk meg. Hasonló mennyiségű jelzett anyagot A két; mintából származó hasohíé mennyiségű Jelzett anyagot együtt hihridízáijuk a :m:ikroarfay*ra.. Olyan rmkroarray kísérletben, amelyben: a mintákat CyS-tel (vörösen duo imszkâlô} is Cy&amp;rflfll (zölden duomszkáío) Jeíiítytg a {míkroarray-nak egy a flubreaz* oeneia intenzitás mennyiségi kimutatására képéé détektar alkalmazaslysl való letapogatása y|in nyelt) elsődleges adatok a fluoreszcencia-intenzitások arányai (piros/zőid , WB). Sasi az aranyok képvíSélfe azoknak: a aO^i-raolékaiáknak a mlatív koncentráció-1, amelyek htbödlzálódtak a míkroarraymn jelen lévő oMfl-ekhez, és így tükrözik a mikroarray-n plan lévő minden egyes cDNSaiek/génnek megfelelő mRNS relais expresszlös: színijét.
Minden mlkroarray kísérlet több tízezer adatpontot: adhel, Is ezek mindegyike egy adott gén relatív expresszijét képviseli a kél. mintádén. Az adaték megfelelő szervezése és elemzése kulcsfontosságú, és a különböző, a standard statisztikai eszközöket magukba foglaló számítógépes programokat fejlesztettek ki az adatok elemzésének meg ko π n y késéhez. A génsxpresszlôs adatok rendezésének egyik alapja a hasonló expresszibe mintázaté gének klaszterekhe való csoportosítása. A mlkroarray kísérletekből származó aditoi blérarohlkui klaszteranalízise és megjelenítése végrehajtásának egy módszere Itt van leírva: Eisen et aí.: 1998, PNAS 95:14863-14888. Az ott leírtak szerint a kleszterképzis kombinálhat# az elsődleges adatok graikas ábrázolasáváí, amelyben minden adatpont egy olyan szín képvisel amely mennyiségileg és minőség 6 ieg jellemzi azt az adatpontot. A számokat tádátmazó nagy táblázatokból származó adatok vizuális fórmába való átalakításával m m epres eiósegifr az adatok intuitiv elemzését. A matematikai eszközökkel és/vagy magával a csoporiositásl módszerrel kapcsa-latban további Ihförröációk és részletek találhatók például Itt: Sokai &amp; Sneaíh, Principles of numerical taxonomy, xvl, 359, W. Η. Freeman, San Francisco, 1963; Hurtigen, Clustering algorithms, xílL 351, Wiley, New York, 1975; Pauli et al, 1989. d. Natl. Cancer Inst. 81:1088192: Weinstein et al, 1992, Science 258:.447-61 ; van Osdol el al., 1994, J. Natl, Cancer Inst. 88:1853-8; is Weinstein et ai., 1997, Science, 270:348-9, A jelen találmány szerint alkalmazott kísérlett módszerek további részletet ez alite hl példában faiálhatóteÁíA haszná latit: leíró tovább) informiciók megtalálható az US 5,807,522 sz, szabadalmi leírásban. Útmutató mlkroarray hardver (pb nyomtatók és szkennerek) építésére kereskedelemben kapható alkatrészek feihasz-naif iával. A mikrearray technológiával és a mintaeiőálüíési protokollokkal, valamint a mlkrorarray kísérletek végrehajtisával ka p cső la los tóvá bbl értekezések találhatok például Itt: DNA arrays for analysis of gene expression, Methods Enzymob 303:179-208, 1999; Fiuoreseenoe-hased expression monitoring using rplemarrays, Methode inzymob 306: 3--18, 1999; és M, Sehens (ed.), DNA Microarrays: Â Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, UK, 1999;
Egy számítógép-alapú analízis program használható a detektálási feszt álfa! generált nyers áriátok (pl, egy adott, marker vagy markerek jelenléte, hiánya vagy mennyisége) átfordítására egy klinikus számára ér|ÍReí|óíö prediküv adatokká A kkmkus a pre-diktfv adatokhoz bármilyen alkalmas eszközzel hozzáférhet. Ily módon a jelen hejeíéh-tés további előnye, hogy az orvosnak, aki valószínűleg nem képzett genetikus vagy molekuláris biológus, nem kell érteni a nyers adatokat M adatokat a klinikusnak a leghasznosabb tormáhan közvetlenül mutatják be. A klinikus ezután azonnal fél tudja haszhlihí az információkat annak érdekében, hogy optimalizálja egy aíany gondozását A jelen hajiiahtés bármely olyan módszert: figyelembe vesz, amely képes az információknak a tésztákat végzi laboratóriumok, információ szolgáltat, orvosi személyzet és alanyok részére és ezektől való fogadására, ^Âlgo^ira.ésIlôyâb^iâsâmFêldâK ui egy alanytól levett minta (például egy hiopszia, szérum- vagy vizeiefmínfa) elküldhető egy prifiíáikeiő szolgáltatáshoz (pl. klinikai laboratórium egy egészségügyi intézményien;, egy iénomprofil-aikotási vállalkozás sib,} a világ; bármely részem (pl., egy az alany tartózkodási helyétől vagy az információ felhasználási helyétől elférő országba) a nyers adatok generálására. Ha a minta szövetet vagy egyéb biológiai mintát tartalmaz,: ekkor az alany a minta levételéhez felkereshet egy orvosi központot, és az elküldheti a profil alkotó központba* vagy az alanyok maguk is íeveheíík a mintát, és közvetlenül elküldhetik azt a profiialkető központba, Ha a minta előzőleg meghatározóit biológiai információt tarfalmáz, akkor az információt az alany közvetlenül eljuttathatja a profiialkotő szolgáltatáshoz (például az információt tartalmazó információs kártya egy számítógéppel beolvasható, és az adatokat továbbítani lehet a profiíaíkotó központ számítógépére egy elektronikus kömmunikáelós rendszerőégítségévei),
Miután megkapta a profiiaikotö szofgiiafás, a mintát féfdofgezzik és létrehozzák a pmfílt (pl expressziós adatok), amely az alany számára kívánt diagnoszflRi! vagy prognosztikai információra specifikus.
Jk prof Ilidatokat ezután egy kezelöorvosí értelmezés számára alkalmas formában liiffják elő. Például, ahelyett, hogy a nyers expressziós adatokat bocsátanának rendelkezésre (pl. szimöSrmarker vizsgálata), az előkészített formátum diagnózist vagy kockázatelemzést tartalmazhat az alanyra, valamint ajánlásokat konkrét kezelési lehetősé- gekre. Az adatok a klinikus száraira bármely alkalmas módszerről megjeleníthet^·, Például agyas kiviteli alakokban a profiialkoté szolgáltatás generál agy jelentési, amelyet ki lehet nyomtatni a klinikus számára (pi az ellitiskponton)! vagy meg lehet jetení-leni a klinikus száii1ítdgépéh:^|.:k|p|nyŐjén, Néhány esetben az adatokat először őlemzik az őílitiái ponton: vagy egy régióié-· lis létesítményben, A. nyom adatokat azután egy kü^ni::feldölgö^dj|#teeitminyb# köb dik további elemzésre edvagy a nyers adatok átalakításira egy klinikusnak vagy beteg-nék hasznos információvá, A llzpmtl feldolgozó iitesömény a személyes adatok 'védelmét (Összes adatot egy központi létesítményben tárolják egységes biztonsági proto-lilikkai} és az adatok elemzésének sebességét egységességét nyújtja, A központi fok dolgozó létesítmény az alany kezelését követően ellenőrizni tudja az adatok sorsát Például egy elektronikus kommunikáeiés rendszer használatával, a központi létesítmény képes adatokat szolgáltatni a kíinikosnafe az alanynak, vagy a kutatóknak, Éiiönyos esetekben az alany k%^Änratle^lilleÄÄaz adatokhoz az eleki-ronikus kommunikációs rendszer használatával. Az alany további beavatkozást vagy tanáesadist választhat az eredmények alapján, Bfenps kiviteli módokban az adatokat kutatási óéira haszná|ák, Például az adatokat fel lehet használni ama, begy tovább optimalizálják az egyes markerek figyelembevételéi vagy kizárását, mint egy adott betegség vagy arjoak stádiuma hasznos jelzőjét 5, KészMmk A jelen bejelentés egy még további aspektusa leírja rák kimutatására és jellemzésére ipl. egy vagy több marker kimutatásira, vagy egy több marker által expresszáit pepid aktivitásának modulálására! szolgáié készleteket, A készletek tartalmazhatnak rakmarkerm specifikus antitesteket a kimutatási reagensek és pufferek mellett, Ä készletek tartalmazhatnak az mRNS vagy oDNS kimutatására specifikus reagenseket (pl, oligonukieotíd próbák vagy primerek}, A készletek tartalmazhatják az egy kimutatási teszthez szükséges és/vagy elegendő összes elemet, beleértve minden ellenőrzést, a vizsgalat elvégzéséhez az utasításokat és m elemzéshez és az eredmények bemutatásihoz a szükséges bármely szoftvert. Így Mszletei lehet poiinukíeotidok vagy fehérjék jelenlétének vizsgálatára használni, A készlet tartalmazhat például egy antitestet poiipeptid kimutatásihoz, vágy próbát polinukíeotid kimutatásához. Ízen túimenően a kit tartalmazhat referenda vagy kontroll mintát; utasításokat a minták feldolgozásához, a teszt és az eredmények értei- y mhéQZ^êhmr il puffereket és más, a vizsgálat végrehajtásához szükséges reigipstlil Pis esetekben a készlet tartalmaz a szolid tumor osse.it génsíirtls: egy vagy töbfe:|é^-@xpresMi'ó|áraakJtmiáatá$ám iántin(|l^ párokat, Más esetekben a készlet tartalmaz a szolid tumor ορβφ ginaíifrás egy vagy több génje expresszlójának kimutatására cDNS-í vagy oligonukleotld array-i diJn vívo Mépezás
In vivő leképezési technikák alkalmazhatok arra, hogy láthatóvá tegyük a rákmar-kerek expressziojit egy illatban (például egy humán vagy nennhumán emlősben), Például rákmarker rhftNSé{pl a CXCR1 vagy FBX021 lehet mttíXB) iggy .(pl. CXCR1 vagy FBXÖ21 fehérje} jelölhető a rákmarkerre specifikus jelzett antitest feihasz^ hálásával. Egy specifikusan kötődő és jelzett antitestei egy egyénben ki lehet mutatni egy In vivő képaíkótömódszerrel, többek között radionukiid képalkotási, pozitron emisz-sziós tomográfiáé, számítógépes axiáíis tomográfiáé, röntgen vagy mágneses rez,onan· cia képalkotási:, fluoreszcens detektálási és kemiiumíneszcens detektálási módszerrel. A rékmifkemk áPtíféstjéjnek generálására szolgáló módszereket az alábbiakban isméiét“ jük.
Az in vivo képalkotó eljárások hasznosak olyan rákok diagnózisára, amelyek szolid tumor őssejt rákniárkereket fejeznek ki. In vivő képalkotást használna a rákot jelző marker Jelenlétének szemléltetésére. izek a technikák lehetővé teszik a diagnózist egy kellémotlen éiopszia alkalmazása nélkül. Az In vivo képalkotó eljárások hasznosakm-kos beteiék számára prognozia szolgáíMisára Is, Például rák őssejteket jelző marker jeíenllflt 1 lebet mutatni, A jelen találmány szerinti In vivo képalkotó eljárások hasznak hatok meg áttetés rákok kimutatására is a szervezet mis részeiben. Néhány esetben a £XCR1-fe vagy a FSX021 -re specifikus reagensek (pl. antitestek) iuoreszoenclisen jelzettek. A jelzett antitestekét {pildiu! orálisan vagy parentersHsan} bejuttatjuk egy alanyba. A fluoreszcensen jelzett antitesteket bármilyen aíkaímes mniszerrel (pl. Az US 6,198,107 sz. szabadalmi iratban leírt berendezés hasznilatávall mutatjuk ki
iái éséfekbén az antitestéi radioaktiven jelzettek. Az antitestek in vívó diagnosztizálása jói ismert a szakterületen. Sumerdon et al., (Nucl, Med. Bioi 17:247-254 [1990] leírtak egy optimalizált antífest-kaiátorí tumorok radioinimunsclntigráfíás képalkotására, jelzésre lhdium^111>mt hasznaivá, Οβη et al, (J. Clin One 9:631-640 [1991]) e szer használatát írták le ha snyá lm írig y rák-gya n ús betegekben daganatok kimutatására, A
Sv hasonló, &amp; mágneses nzoniÄ képalkotáshoz piramágneses ionokkal jelzett szerek alkalmazása ismert a szakterrtteíen ÏLay&amp;p Magnetic Resonance In yedíclná. 11:339-:34i (19911), Az alkalmazott jeiöiis függ a választott képalketÉsi módszertől Radioaktív jelölök, mint például m indiurtulii, a teohnéeium-iSm vagy a jid~131 használhatók piiháim felvételekhez vagy égyföton-kiboesltásos számítógépes tomográfiához (SPÉCI). Ä pozftmnf Mbpdsátó jelölök, mint például a fluor-19 alkalmazhatók pozitron emissziós tomográfiához is (PET). A fvIRÍ-hez paramágneses Ionok, mint a gadoííni·· um(HI) vagy mangán{íl) használhatók. 1 óra és körulfoelö! 3S|> nap közötti felezési idejű radioaktív fémek állnak rendelkezésre antitestekhez való konjugálásra, mint például a szkandium-47 (3,5 nap) gaílium-67 (2,8 nap), gaíííum-88 (88 perd), teolmécjem-99m (6 óra) és az indium-111 (3,2 nap), amelyek közti # gaillum-87, teohnéeiun>99m, és az indium-tfl előnyös gamma" kamerás leképezéshez, a :gallíum-88 előnyös gozitan emissziós tomográfiához.
Antitestek ilyen radioaktív fémekkel való jelölésének hasznos módszere egy hi-funkciös kelátképző szer segítségével, mint például díetilén-peníaecetsavvaj (DIRA) történik, például Khaw el al (Science 209:295 (198Ö'j) által ln-111-re és Tc~llm-res és Bebeínberg et al (Science 215:1511 (1982j) által leírt módon. Egyéb keiáiképző szerek is használhatók, de az 1-(p~karboximeíoxibenzlf)EDTA4 is a DTPA ka rbox i lka rbo nsa va n li id ridje azért előnyösek, mert használatuk lehetővé konjugációt anélkül, hogy az jelentősen befolyásolná az antitest immunreaktivitását.
Egy másik módszer a ΟΡΙΑ 7ehér]ékhez veti kapcsolásához a PIPA ciklikus srv hídridjlnek használatával történik Hnatowich et ai. (int. J, Appl Radial, ísot 33:327 (19821 által albumin ln-111-gyel való jelölésre leírt módon, de amely adaptálható antitestek jelölésére, Egy alWmas mldszér az áfiitislik lG-99m-mel vei való jelölésire DPIA-vaí való kelátképzés nélkül a Crockford et. al., (OS 4,323,548 sz, szabadalmi irat) pretinning módszere, immunglobuiínok Te-§9nvnneí történő jelölésének egy módszerét Wong et al (Int. J. Appl Radial, Isot., 29:251, [1978]) írták le plazmafehérjére, és a közelmúltban ezt sikeresen alkalmaztak Wong et ál |3, NuoIzPedv, 23:229 [1131]) antitestek jelölésére.
Abban az esetben, ha radioaktiv fémeket tepjygálnak egy konkrét antitesthez, akkor hasonlóképpen kívánatos a lehető legmagasabb arányban bejuttatni a radioaktív jelzést az antitest molekulábi inltköi, hogy annak immunspedíitása ieromlana. További javulás érhető el a találmány szerinti specifikus őssejt rákmark er jelenlétében végzett radioaktiv jelzés megválősííÉsanát ha biztosilök az antitesten az anlginkőtő hely vé~ eleimet, ln vivo biófötőnos képalkotást (Xeho§eh, Aipeeia, CA) lehet használni az in vivo képalkotáshoz. Ez st valós idejű in vívó képalkotás iuciferázt használ. A iueiferáz gén sejtekbe, mikmorgarsiimdtokbi' éMökfeá van beépítve (p:L mint a taiilminf szerinti ta km árkor egy fúziós fehérjéje), l ia az aktív, akkor fényt kibocsátó reakcióhoz vezet, A kép elkészítéséhez la elemzéséhez CCO kamera és szoftver használható. fik Aríifealti lé antitestfragmensek A jeiea találmány izolál antitesteket és antitesifragmenseket ismertet a CXCR1, FBXÖ21, NFXA, NOÏCH2, RAD51U, IBP, és az 1. táblázat más fehérjéi ellen. Az anti-test, vagy antitestfragment lehet bármely monoklonálls vagy pollklonáiis antítesl amely specifikusan felismeri ezekét a fehérjéket. A CXCR1 , FBXÖ2Í, NEVA, NÖTCH2, R.AD51 L1, IBP és más fehérjékhez specif kosán kötődő monokionáiis antitestek, vagy ezek fragmensei szerepelnek az l> tihílzafban, A rnonokienälis antitestek, vagy ezek fragmensei lehetnek kimére vagy Nemin izé 11 antitestek, amelyek specifikusan kötődnek ezekhez a féhérjikhez, A monokionáiis antitestek vagy ezek fragmensei lehetnek humán antitestek:, amelyek spediikusan iköiődnek ezekhez a fehérjékhez. A CXCM1, FBX021, NFYÄ, N0TCH2, RASitLI, IBP elleni antitestek és az 1. táblázat rnás fehérjéi használhatók az itt leírt kísérleti, diagnosztikai és terápiás eljárásokban Az antitesteket tél lehet használni rak őssejt marker fehérje expresszlojänik kimutatására biológiai mintákban, mint például egy betegből vett szövetbíopsxiában: vagy venÄfehen, A szövetbiopsziik szekclonálhalék és: fe-bégéi detektálhatok például ímmunfluoreszcenclás vagy immunhisztokémiai módszerekkel. Alis módszer szerint egy mintából egyes sejteket izolálunk, és a fehérje expresszíóf rögzített vagy élő sejteken FACS-anallzissei mutatjuk ki. Az antitestek használhatók továbbá fehérje array-ken rak őssejt marker expressxíójának kimutatására, például tumorsejteken. sejtlizátuoiokban, vagy más fehérjemintákban. Az antitesteket fel lelet használni, hogy gltöíjik a turnorsejtek növekedését égy, hogy éhntkeztetjük az antitesteket tumor sejtekkel akár ln vitro spjtalapű vizsgálati eljárásokban, vagy in vivo állati modellekben. Az antitesteket fei lehet használni a rák kezelésire egy humin be-tigben egy rák őssejt marker (pl. az 1. táblázatból) eileni antitest terápiásán hatásos mennyiségének beadásával. A CXCRt antitestet vagy antltest-fragmenst a találmány szerinti összefüggésben használjuk.
Políklonális antitestek eiöáitítbaük bármilyen ismert eljárással. Políklonálís aníiíes- tek eioidizhetók állat (például ff öl patkány, egér, szamár etb.) Immunizálásával adott esetben afen! soofdatfal hfgldi ;kuics!|fykusigU: éemoeianinte (Kiét};, szérum aiPuráin-ta sth. konjugált, és stabil èmuiÆ képzésőbez adjuvánssal (pl komplett m$f Inkomplett Freund-féle adjuváns} kOhlbinlif releváns antigénnel (tisztított peptíd-fragmens, telles hosszúságú rékombináhs feHérje, fúziós fehérje stb.) történő többszön szufekután vagy intraperitoneálls injekciókkal A poliklonális antitestet ezt Kővetően kinyerjük m így immunizált állat véréből hasún föfyadekéből és hasönlékfedli A levet vért megatvaszfjuk, és a szérumot dékaníiijuk, eentrifUglfeali tisztítjuk,; és meghatározzuk az a ntltesf Altért Polikionális antitesteket tisztíthatunk a szérumböi!: vágy hasit! folyadékból szskterüiei standard eprasi! szerint,, beleértve az affinitás kromatográfiai: lem cseréld krömafog ráfiét géleíektroforézish dialízist stb.:
Monekíonális antitestek készíthetők hibrklőma módszerekkel mint péídáuí a Kohler és Misiéin által leírtakkal (1675) Natura 265:455. A hibrídoma eprás hasznáia-tavai egy egeret, hörcsögöt vagy más megfeleli gazdaállatot, Immunizálunk a feni leírtak szerint egy immunizáló antigénhez specifikusan kötődő antitest termelésének llmtociták általi kiváltására. Alternatív módon a íimfoókák immunizálhatok In vitro. Az immunizálás elán a iímíocíiákat Izoláltuk is egy alkalmas fezénél- juk, .például a poiletilemglikoi alkalmazásával a híbhdoma sejtek MaíakiÉsárs, amelyekéi ezután el lehet választani a nem fuzionál ImfecMltói és rnieiÓma-sejtektöi Az immunpreoipiiáeiővai, immunoblot vagy egy in vitro kötődési tesziei például radioimmunologie! (RIA) vagy enzimmel kapóséit immunszorbens teszttel (ELISA) meghatározva kiválasztott antigén elleni specifikus monofelonáls antitesteket termelő hibridőrnákat azután szaporíthatjuk akár in vitro tenyésztéssel standard módszerek ah kalmazàsâval (Goding, Monoclonal Antibodies: Pnheipiss and Practice, Academie Press, 1966), vagy in vivo hasííri tumorok formájában egy állatban. A monoklonáils antitestek ezutin teiMi a tenyésztőközegböl vagy a hasőh; folyadékból a polikionáiis antitesteknél fentebb leírtak szerint.
Alternatívaként a monollonáíis antitestek előállíthatok rekombináns DNS módszerekkel is, mint az az Ili 4,016,567 sz. szabadalmi iratban szerepel A monokionális mtöl· testet kódoló pPlnykleotidókaí például érett i-sejtékbő! vagy hibridóma-sejtből; ízoláluk, például RT-PCFMáncindité olígonukleotidok alkalmazásával, amelyek ipeelfikusan smpliflkápk az antitest néhél és könnyű láncait kódoló-génjeit, és szekvenciájukat szokásos eprásokkai határozzuk meg. A nehéz és könnyű láncokat kódoló izolált poinukíeotidokat ezután megfeleli expressziős vektorokba klónozzuk, amelyeket, ha «y gildás^tekbe, pÄiüi Í> obi sejtekbe, OÖS Msjtekte, kínéi hörcsög petefészek (mO) sejtekbe m$f ;tayrt|föWIMéhé|Ít egyébként nem #rmelö miélóma sejtekbe transzféktáijuk, akkor a gazdasejtek által generált monoklohátís antitestek állíthatók elő. 4 kívánt fajok retemhlnins moooklonálfs antítestjei vagy azok íragmensel Izolálhatok publikált fágkönyvfárskbó! az alábbi leírások szerint. (McCafferty et el., 1990, Nature, B4i:6§2*554; Oaokson et al, 1991, Nature, 352:624-826; valamin! Marks el ai„ 1991, i*.
Monoktonáiis antitestet kódoló polnukieotíci|ok|: rekembináns DNS technológia alkalmazásával számos különböző módon tovább módositható(k) alternativ antitestek generálásához. Például égy égér monoklonáíís antitest könnyű és nehéz láncainak konstans doménjei kícserélhetők 1} ezeknél a régióknál, például egy humán antitestre egy kimére antitest : létrehozására, vágy 2) egy nem i m m u n g lo bu ! í repo! I peptid re fúziós antitest létrehozásira, A konstans régiók csonkíthatok vágy eltávolithatók egy rnonoklonális antitest kívánt antltesí-f ragmen sének generálásához. Ezenkívül a varlibh lie régió helyspecifikus vagy nagy sűrűségű mutagenezíse használható egy monokióoilis antitest specificitásának, affinitásának stb, ophmalizilasara.
Egy rák őssejt marker elleni monoklanáíis antitest lehet humanizált antitest A humanizált antitestek olyan antitestek, amelyek a vadáhlls tartominpikon beiül minimális szekvenciákat tartalmaznak nem humán (pl egér) antitestekből Ilyen antitesteket használnak terápiásán az aniigenlatás és a HAMA (humán anti-egér antitest) válaszok csökkentésére, amikor beadják egy humán alanynak. A gyakorlatban a humanizált antitestek jellemzően olyan humán antitestek, amelyekben a minimálistól nulláig terjedő mennyiségű nem -humán szekvencia van. Egy humán antitest egy olyan antitest, amelyet éné béri szervezet termeit, vagy egy olyan antitest, amelynek aminosavszekvenciàjs megíe-lei egy olyan antitestnek, amelyet emberi szervezet termeit.
Humanizált antitestek éíóáiilthatők különböző, a szakterületen lemért módszerek alkalmazásává!;. Egy antitest humanizálható egy humán antitest CDR-jének egy olyan nem humán (pl.egér. patkány, nyúl, hörcsög stb.) antitestével való helyettesítésével, amely i kívánt specificitássai, ailnitással, és képességgel rendelkezik (Jones et a!., t|IÍ, Nature, 321:522-525; Ríechmann el al, 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et ál, 1188, Science, 239:1534-1536), A humanizált antitestet tovább lehet módosítani egy további maradvány helyettes kési vel akár az Fv vázrégióban és/vagy a helyettesített nom-humán maradványokon beiül az antitest specififásánalc affinitásának és/vagy képességének finomítására és opiimálizálÉsára,
Hunién antitestek kteetíenüL alöiiiithaiók különböző:, a szakterületen Ismeri módszerek alkstmazásávat fa vitrolíaiiuiaí^áfl vagy agy: oeizeti ahti#n. éiíent tantestet tér*-mÄ egyénből lipsÄ: ImmóftaMt humán B-fimíoeiták állíthatók al# |1d:. például Colé el tUl^neclöfial ÄntjbodlttÄJOpncer Therapy, Alan R. üss, p. 77. (1985);..Boamer et lL 1991, J. immumL· 14f £1):88-95: és az US 5,750,373 sz> szabadalmi irat). Ezenkívül a humán anÄÄlijpifkönptärMttohiit fâsilasztânl «Mj * fágkönptár humán anth testeket expresses! psaghan et aL 1996, Nature Biotechnology, 14:399-314: Lemezek et al.., 1998, PN.AS, S'il 57-6162; Hoogenhoom és Winter, 1991, J, Mol. Biol., 227:381 : Marka et aL, 1991, J. Moi. Biol., 222:581). HumanixáIt antitestek humán Imniungiebuiln fókuszokat tartalmazó iranszgeníkus egerekben is előállíthatok, amelyek képesek immunizálás hâtasap á hnmin antitestei teljes választékának termelésére endogén immunglobulin-termelés náikuL Ezt a módszert leírják m US 5,54S;i07; 5,545,806; 5,569,836; 5,625,13176,633,425: 00 5,561,016 sz, szabadalmi iratokban. A találmány tárgyát képezik továbbá blspooifikua antiteetek, amelyek specifikusan felismerik a rák őssejt markerekei A blspeoiTíkus amiisfik olyan antitestek, amelyek képesek speeiikusan felismerni és megkötni legalább kit eltérő epiiépot A bispeolfikus ahiiasiek lehetnek Intakt antitestek «agy aniÉtesi4ragmensek. A bispecifikus antitestek eliéllfiásl módszerei közismertek a szakterületen fMiiisiein et aí., 1983, Nature 395:633-539: irenhah et aL, 1985, Science 2Ä81; Süresh et al, 1986, Methods ln Enzym» 121:120; liraoneoker et a)„ 199! EMBÜ J. 10:3655-3659; ihalaby et a! 1592; J. Exp. Med: 175:217-235; Kosteiny et a! 1992, J. Immunol. 148:1647-1553; feuber ei ai., 1994, J. Immun» 152:5368; és az US 5,731,163 sz. szabadalmi irat). A találmány szerinti bizonyos megvalósítási módokban kívánatos lehet inkább egy antitesí-fragmenst használni a tumorpenetráció növelésem, mini például egy intakt antitestet. Kölönbező módszerek ismeretesek az antitest fragmensek előállítására. Hagyományosan ezek a fragmentumok Intakt antitestek profeolítlkus emésztéséből származnak (például fcnmeto et et, 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117, és Brennan et al,, 1985, Science, 229:81), Azonban ezeket a fragmenseket mir most íellémzően közvetlenül előállíthatjuk rekomhlnáns gazdasejtekkel a fentebb leírták szedet: így a Fab, Fv, és scFv antitestfragmensek mind expressziihatók és szekrefálhafók az E, coli vagy más gazdasejtekben, fgy ez lehetővé feszi ezeknek a fragmentumoknak a nagy mennyiségű termelésit, Alternatív módon, az ilyen anltesifagmensek izolálhatok fent tárgyalt antitest: fágkönyvtárakból. Az afifesb •ί fragméneek ligetnek Ittéátls aífitesfek 'm, amsnt a2l i%: US 5,641,870 sz. szabadalmi kát fefrja például:, ás lehetnek mmmpmlfümmk vagy bispeeífkusak, Az anfiiisfiragménsek élöáiíífására szolgáló egyéb módszerek nyilvánvalóak lesznek a gyakorlott szakember számára. Kívánatos lehet további, különösére antltest-íragmensek esetében egy antitest módosítása a szénámban lévő fétezisí idé|inek növelése érdekében; Ezt például el lehet érni egy rnanti reoeptorkőti apltopnak m aníitestfragmensbe az antítestfmgmens rbegféíéíi régióinak mutációjával való beépítésével, vagy az apitöpnak agy peptld szakaszba való belpllalbé, amilyet az aniiiest-fragmensliez fuzionálunk annak bármely végén vagy a közepén (pl, DNS vagy peptid-sziníézís). A Jelen találmány továbbá magában foglal olyan variánsokat és ekvivalenseket, amelyek lényegében a Iáméra, humanizált és humán antitesteknek, vagy azok Itt meghatározott antítesí-fragmenseinek homológjai, Ezek tartalmazhatnak, például, konzervatív szubsztitúcióé mutációkat azaz egy vagy több aminosav helyettesítését hasonló amínosavakkaí. Például egy konzervatív szubsztitúció azt jelenti, hogy egy aminosavat egy azonos általános osztályba tartozóval helyettesítünk, például egy savas aminosavat egy másik savas aminosayvaL egy bázikus aminosavat egy másik bázlkus amlnosavval, vagy egy semleges aminosavat egy másik semleges aminosawal. Egy konzervatív aminosav helyettesítés célja jól ismert a szakterületen, A találmány tárgya továbbá citotoxíkus szerhez konjugált antitestet tartalmazó immunkonjugátumok, A citotoxíkus szerek közé tartoznak kemoterápiás szerek, növekedést gátió szerek, toxinok (pl. bakteriális, gomba-, növényi vagy állati eredetű enzimafikusan aktiv toxin, vagy ezek fragmensel), radioaktiv Izotópok (azaz egy radiokonjugátum) stb. Az ilyen immunkor|ugátumek iétrebo^sában hasznos kemoterápiás szerek közi tartoznak például a meíofrexáf, adharnlcin, doxorubicin, rnelfaián, míiomioín 0, klorambuol, daunorubícin vagy más interkaiáiö szerek. Az alkalmazható enzímalkusan aktív toxinok és ffagmenseik közé tartoznak a dlftéria A lánc, a diftéha toxin nem kötő aktív fragmensel, exotoxin A lino, ricin A lánc, ebrín A lánc, módónéin A lánc, alfa-szarcln, Aleurites fordli fehérjék, diantln fehérjék, Pbytoíacá ámehcana fehérjék (PAPi, PAPít és PAP-S), Momordtea charantla Inhibitohjkurotn, krotín, sapaenaha officinalis inhibitor, geionin, rnitogellln, restriktoein, íénomíoirt enomioln és a tricothecének. Számos radíonukld hozzáférhető radíokoppgalt antitestek, többek között a 212BI, 1311, 131 ín, iöf , és az 188Re előállítására. Az antitest és citotoxíkus szer konjugátumai különféle bffunkoiós fehérje-kaposbiószerel atkaímazásivai kiszüínal, például ;i-szekeinlmkilb3-##^^ (SPÖP), imíno-iíoíán (ií), imldoésztetek bifunkelős származékai, (például dimetil-adipimklát HCL), aktív észterek (így példáit! dtokemlmldlNzufeerét), aldehidek (például glyfámidehld}, hisz-azldo-¥®gyöietek (mint pilöiul: a blszCpmzIduPenzöíp-he^áadíaminl, bisz-diszöníum-származékok (így például fefez-Çp“diazdPiemp8n^il}-eti!éndiamlnp diizoclanátok (így például tpiip~2J“dilzocäanit}j: és btiz-alÉV íiuorvegyületek (így például 1 ,S~dii!uor-2,4~ dinltro-benzol). Egy antitest és egy vagy több kis molekulájú toxin konjugátumaf, így például egy calicheamlcln, majtanzinoidok. irichothén és CCI 085, és e toxinok toxln-hatású származékai Is felhasználhatok, Néhány megvalósítási mód szerint, a találmány keretében alkalmazói antitest humán Fc rigíikat tartalmaz, amelyek úgy vannak módosítva, hogy fokozzák az eífektor funkciót, például az antigén-függő, seji-kőzvetitei citotoxieitást (ADCC) és/vagy a komp-iement-dependens olíötoxícitást (GDC). Ezt úgy loheieiérnl, hogy egy vagy több amino-sav-szuhmttítűeiét végzünk az antitest az ÉemÉgiőpbsn, Például, ütszíain-maradék(oka}t lehet hevinni az Fc régióba, hogy lehetővé tegye a íanook közötti dlszulfídhíd kialakulását: ebben á régióban a komptement-kozvetífett sejípusztylás és az aníitesPdependens ceilulárís citotoxiclfás (ADCG) javítására (Cáron ét ak, 1992, J, Exp Med. 178:11 Síéi 95; Shapes, 1992, Immunöl. 14812918-21)22), Homodlmer antitestek fokozott tumorellenes aktivitással Is előálíithafők heíerohifenkeíonális térhilésítő-línkerek aikah mazásával, amint léífíák IÉ: Wolíf ef ai, 1993, Cancer Research 53:2580-2565, Alternativ módon kettős Fc-régióval rendelkező antitest is szerkeszthető (Stevenson et al., 1989, Änfl-CanoerOrui Design 3:219-239), A jelen találmány gyógyszer-hatóanyag szűrő teszteket (pl. rákellenes gyógyszerek klszüréséré) ismertet. A szűrési eljárások a jelen bejelentés módszereivel azonosított őssejt rákmarkerekeí hasznipk (pl, üXCRI, FBXD21, NFYA, NOTCH2, RÁD51L1,: TiP és az 1, l áhiázat más fehérjéi) Például, a jelen találmány eljárásokat Ismertet olyan vegyítetek szitáséra, amelyek megváteztatják (pl, neveik vagy csökkentik) a ÇXCR1 vagy a F8X021 éxpressziójál, vagy aktivitását, jelölt vegyületek lehetnek a rlkmarker ellenes anliszensz szerek, vagy siRNS szerek (pl, öfi|0hukieotidök). Jelölt vegyületek lehetnek olyan antitestek, amelyek speolfíküsan kötődnek egy a jelen tejé Iminy szeríni őssejt rákmatkerhez, Kis molekulájú vegyületek könyvtárait lehet szűrni a leírásban Ismertetett eljárások használatával.
Az egyik szűrési módszer szerint, a jelölt vegyűieteknek az issejt rákmarker expressziéja megváltoztatási kèpessêgM éftékeHuk egy vegyüiétnek e|y össeíl rákman kert kiféjéző se)®!: való énníkaztétéséuei majd a jelölt vegyöléféknék az expressziorá: gyakorol hatás# mérésével. A jelöli vegyieteknek egy rákmarker gén expfesszlőjirá való hatását # sejt által kifejezett. mRNS-expresszió szintje detektálásával: yízsgálha1|Uk^ Az mRbltl expresszié bármely alkalmas módszerrel kimutatható. A jelölt vegyűieteknek fákmarker gének expressziójára való hatását a rákmsrkerek által kidőli pöíipepíid szint« ja mérésével vizsgálhatjuk. Az expressxáll polipeptld szintiéi: bármilyen alkalmas móré szerzi! mérhetjük, többek között az itt leírtakkal:. Bizonyos esetekben más sejtbiológiái változásokat (pl apoptözis} detektálunk. fontosabban, a jelen találmány olyan modulátorok, azaz jelölt vagy vizsgálati ve~ gyüíetek vagy szerek (pl, fehérjék, peptldek. peptídomimatikumok, psptekfek, Is molekulák vagy egyéb gyógyszerek;) azonositásáfa sze!||ió szSrisí módszereket Ismertet, amelyek kötődnek a találmány szénái rikmarkerekhez vagy megváitozíapk az azokhoz kapcsolódó jeláiadás? vagy működést, gátló jjvagy stimuláló) hatásuk van például az őssejt rákmarker exprassziojára vagy a rákmarkerekek aktivitására, vagy stimuláló vagy gátló hatásuk van például egy rákmarker s®bs^Ä expressziójára vagy aktivitásira. Az így azonosított vegyületek aikálmazhaíök a eélgin termékek fpl. az őssejt rákmarker gének, mini: például a CXCR1 vagy FBX021) aktivitásának közvetlen vagy közvetett modulálására egy terápiás protokollban, a megcélzói géntérmékite^íéíriuhkdlölának kidolgozására, vagy azéknak a vegyüleíeknek az azonosítására, amelyek megszakítják a normál oélgén kölcsönhatásokat. A rákmarkerek aktivitását vagy expmssziójáí gátló vegyületek, haszhölák á proliferativ rendellenességek, például rák, küiönósen: a metasztatizáló rák kezelésére vagy tumor őssejtek megszüntetésére vagy szabályozik Sára a rak kockázatinak megelőzéséhez vagy csökkentéséhez. A bejelentés tesztekét ismertet rákmarker fehérje vagy polipeptld vagy annak bio lógiailag aktiv része szubszírápt képező jelölt vagy tesztvegyüíetek szűrésére. A bejelentés teszteket Ismertet rákmarker !éhér|éhez vagy pelipeptldhez vagy annak biológiai-lag aktiv részéhez kötödö vagy annak aktivitásit moduláló jelölt vagy tesitvegyűletek szűrésére is, A y|H|jÉ!iI yegyöieÄ tiőállihatök a szakterületen Ismert, kombinatorikus: könyvtárakra Ideértve a biológiai könyvtárakat; peptoid könyvtárakat (nenvpeptkt gerincű, enzimaikus lebontással szemben rezisztens, de mégis bioaktiv, peptld funkcionalitással rendelkező molekulák könyvtárai; ki. például Zuckennann et ab, J. Med. Chem. 37:2878- 85 [1984]); térheüieg címezhető párhuzamos tzflârd tégM vagy ÄitfisMi WnyMm* kát - épülő számos hagyományos módszerrel; a dekonvoiùaôt Igénylő szintetikus könyvtár módszerekkel -mz jőpy^^öhQy^egy^vegyütef könyvtár módszerrel';, ás affinités! kromatográlás szeieNoíot alkalmazó szintetikus könyvtár módszerekké A. thlolágjai könyvtár és pepíokf ikanyviár módszerek használata elönyősehh aypaptídkőnyvtárákkál szemben, míg a másik négy módszer peplldek, nenvpeplid oligomerek vagy kis moleko-lájú vegyúletek könyvtaraihoz alkalmazható (Lám (1997), Änticaneer Drug Des, 12:145). A molekuláris könyvtárak szintézisének módszerei megtalálhatok a szakirodalom-ban, például: DekVitt el aLáProo. iNatLAoad. Sói. UtSvA, 98:6989 f1993| irhát ál, , Erőd, Mád. Aoad. BöL USA 91:11422 ;|1894| luckermann el ak, J. Med-, Chem. 37:2678: [1994]; Cho el a!- Science :211:1393 [1993]; Carrai; et al., Angem Chem, lót. EdtíEngL 33.2059 [1994]; Carell et al., Angew, Chem, Int. Ec. Engl, 33*2081 [1994]; is Cailop et al., J. Med, Chem. 37:1233 [1994],
Vegyüleikönyvtárakaf be tehet mutatni oldatban (pi. Houghten, Biotechnigues 13:412-421 [198¾]¾ vagy gyöngyökön (Lam, Saturn 354:82-54 [19911¾ csípőkén (Feder, Nature 364:555-165 [1893]), baktériumokon vagy spórákon (US 6,223,489 szzszaba-dalmi írat), píazmidokon (Cull et al,, Rróc, Átid, Acad- Sói. iiA 89:15651569 (1992]¾ vagy fágckón (Beolt és Smith: Science 249:385-398 (1ÜÖ]; Devlin: Sőlepee 249:404-405119981 Cwírla eí aL, Proc. Nath Acad. Sec 87:8378-6382 [1999]; Fellel, J. Moi. Bioi. 222:161; [1991]).
Az egyik aspektusban egy teszt egy sejtalapú teszt, amelyben egy őssejt rákmar* ier íehipt vagy annak biológiailag aktiv részletét expresszálő sejtet érintkezésbe hozzuk egy tesztvegyOlettei- és a tesztvegyÖlelnek a rákmarker aktivitásának modulálására vonatkozó képességét meghatározzuk, Ä vizsgálandó vegyületnek az őssejt rákmarker aktivitás modulálása képesslglnék mégiátimzásit végezhetjük például az enzimaikus aktivitás változásának nyomon követésével A sejt például lehet emlős eredetit A tesztvegyüiét kipességa e|y rákmarkernek egy vegyülethez, pl. egy őssejt rákmarker szubsztráthoz való kötődésének modulálására is értékelhető. Ez megvalósítható, például úgy, hogy a, vegyiletet, például a szubsztrátoi, egy radioaktiv Izotóppal vagy enzimes jelzéssel kapcsoljuk össze úgy, hogy a vegyület pl. a szubsztrát kötődését egy rákmarkerhez a jelzett vegyület, például szubsztrát egy komplexben vall kimutatásával határozzuk meg.
Alternatív módon az őssejt rikmarker radioaktív izotóphoz vagy ehzimes jelölés- λ í'> s-c ve iïTir'x V·· leg kapcsolódik a fesztvegyület agy rakmarkernek egy komplexben lévő rákmarker szuösztrifhoz való kötődése rnadyláíására való képessége nyomon követésére, Például a vegyiietek (pl, szubszírátck) jelölhetők 1251 358, 14C vagy 3H segítségévek közveb lenül vagy közvetve, és a radioaktív Izotópéi a radioemisszlo közvetlen számlálásával: vagy sxdntiliúciös számlálással detektáljuk, Alternatív modo rí a vegyütefek lehetnek enaámatikufifi jelzettek, például |p?m^ppipxi<lfea:h aikaíikus fószfatázzai vagy ludferázzai. és az enEiioattkúi: jtlölM egy megfelelő sxubsxíráí termékké való konverziójának melbátáralásaval detektáljuk.
Egy vagyaiét (pl. egy őssejt rákmarker szubsztrát) képességét arra, hogy kölcsön-hatásba lépjen egy őssejt rákmarkermt, bármely kőíesöpbatásia lépő anyag jelölésével vagy jelölése nilköl tehet értékelni. Hildául egy mlkrofizsométer háeznéitsil ve®!** leinek égy fökfhaÄnöiváló ielcsöohatása kimutatására anélkül, hogy a vegyiét vagy a rákmaíker jelzett lenne (McConnell et ai Science 257:1906-1912 (1992)). Ahogy Itt használjuk, a „rnlkrofizlornéter" (pl. Cytosensor) egy olyan analitikai eszköz, amely egy fénnyel címezhető potenciometnás érzékelővel (LAPS) méri azt; f sebességat, amellyel egy sejt eísavasítja környezetét. Az ebben a savanyítás! sebességben fellépő változásokat agy vegyület és egy rákmirkehközöbl kölcsönhafis indikitorekint léhaf használni Így másik mód szerint a találmány tárgya egy sejfmentes vizsgálati eljárás Is, amelyben a mkmarker fehérjit vagy annak biológiailag aktív részletét érintkezésbe hozunk egy tesztvegyütettei is a tesxtvegyületnek az őssejt rákmarker fehérjéhez vagy blologíaílag aktív részihez való kötődési képességét ifiikepk. A rákmarker fehérjéknek a jelen találmány szerinti tesztekben használandó híeiőgíiifag aktív részéi közé fáé tpznák azok a iragmeniek, amelyek kölcsönhatásba l^efe.«fe^áfókki|i:?ágy::!fás fehérjékkel, például nagy felületi valószínűségi pontszámú: ftaimensekkel. A sejtmentes vizsgálati eljárások mag tikban fogiapk egy reakelőelegy eilgén-fehérje és a vizsgálandó vegyület reakciáelegyét olyan körülmlnyék között és annyi ideig, hogy lehetővé tegye a két komponensnek, hogy kölcsönhatásba lépjenek és kötődjenek, így kialakítva egy komplexet, amely eltávötlhatő és/vagy detektálható, A kölcsönhatás két molekula közei Is kimutatható, pi fluoreszcencia energia transzferrel PRIT) fid, például iatevaez et ai, US 5,631,189 szabadalmi Irat; itavnanöpoulös Őt si, US 4,988,103 szabadalmi írat). Egy fluorofor jelzést ügy választunk meg, hogy égy első donor molekula által kibocsátott fluoreszcens energiát egy második, „akceptor* molekula fluoresoénsz jelölésé abszorbeálja, amely viszont képes fiuo- következtében.
Alternatív módon egy „donor’ fehérje-molekula egyszerűen a triptofán maradványok természetes fluoreszcens energiáját használja fej, A jelzéseket úgy választjuk meg, hogy kölönhözó hyjiitnhosszásáiu fényt bocsássanak ki ügy, hogy a jikóéptór* molekula jelölése megkülönböztethető legyen a Jonöf-étól, Mivel az energiaátaeiás hatékonysága a Jelzések kozott kapcsolatban van a möíékuiikáf ptválaöii a molekulák térbeli kapcsolata felmérhető. Égy olyan helyzetben, amelyben a kötés végbemegy a molekulák között, az „akeeptor* molekula 1 5 helyzeti Jelzése fluoreszcens emissziójának i feszíhen mailmiíisnak kell fennie. Egy FRET kötődési esemény kényelmesen mérhető a szakterületen jól ismert szokásos fiyohmetriái iifektilásl esz^ közökkei (pi. fluonmiter segítségévei).
Egy másik módesetén m őssejtrikmarkerek fehérjéjének egy megcélzott molékte Iához való kötődési képességet valós idejű hiomolekuláris kölcsönhatási elemzés (8IA) alkalmazásával lehet meghatározni (Id. pl. Sjoiander and Urhaniozky» Anah Chem. 63:2338-2345 [19911 és Szabó et al. Gurr. Opin. Struct Bioi. 8:899-765 [1995]}. „Felületi plazmonrezonanoia” vagy „BIA” valós időben észleli a jöiospecifikus kölcsőnhatásokit anélkül, hogy bármelyik kölcsönható anyagot megelőlnenk (pl.ÍiAeore). A kötődési feíe-leten létrejövő (a kötődési eseményt jelző) tőmegyálfozások a Miiét közelében megváltoztatják a fény törésmutatóját (ez az optikai jelenség a felületi plazmon rezonancia (SER)}, ami biológiai molekulák közötti valós idejű reakciók jelzésére Mhaszniiható. A óéi géntermék, vagy a vizsgált anyag lehet szilárd fázisra rögzítve, A szilárd: lázi-son rögzüli cél géníerrnék/vízsgáSatt yegyüíef komplexeket ki lehet kimutatni a reakció végén. A cél géntennék lehet szilárd felületre rögzítve, és m vizsgálati vegyiét (ami nincs : rögzítve) közvetlenül vagy közvetve megjelölhető az il tárgyalt kimutatható jelölésekkel Kívánatos lehel az őssejt rákmarkerekei rákmafker ellenes antitestet vagy annak célmolekuláját rögzíteni, hogy megkönnyítsük a komplexbe vitt formájú egyik vagy mindkét fehérje elválasztását nem kompfexáifaktöl, valatnint a fészt áutómatizálását megoldani. Egy tesztvegyüietnek egy őssejt rákmarker fehérjéhez való kötődése, vagy egy rákmarkor fehérje kölcsönhatása egy célmolekulával egy jelölt vegyidet jelenlétében és távoilétében elérhető a reagenseket tartalmazó bármilyen alkalmas eszközben. Ilyen eszközök közé tartoznak mlhrotltráíö lemezek, kémcsövek, és a mikmoentrífuga csövek. Az egyik megvalósítási mód szerint egy fúziós fehérje alkalmazható, amely egy mátrixhoz kötendő egyik, vagy mindkét fehegSbez egy domaint ad hozzá. Például gfuiaileneS- traoszfefez-rákmarker tóóe fehégiket,: sragy glytatten-S^fBn^Äräx^ari#' fúziós fehérjéket fehet gitrtafiérr Sephafőse gyöngyökre (Sigma Cffemiöál· StJkoufS;,, liöf vagy liutafien-derivatizijt feikréltüí1«ekr# adszerbailol· amikét azutin; kombinálunk a; vizsgálati vegyüledel vagy a fesefeegyuleie! is vagy a nemiedszőrűéit cálfehiipveí vagy rákmarker fehérjével· és az elegye! komplexet képezve inkufeiluk alkalmas körülmények közölt (pl· fiziológiás só és pH feltételek között}. Az inkulálásfi követően a gyöngyökről vagy mikrotitráló leviez lyukakból mosással eltávolítjuk a nem kötött komponenseket, a mátrix i:,gj|ôii|yÔkpï!t#g:zlivi|::lans és a ipmpléxal közvellenfl vagy köz-Vétve, például a fent leírt módon határozzuk még.
Alternativ módén a kamplexeket te lehet disszeolalPl a mithxfeí , és a rákmarkerek kötődésének vagy aktivitásának a szintjét standard módszerek alkalmazásával határoz-hátjók meg. Akar egy rákmarker fertige, akár egy megcélzott molekula mátrixokhoz való rögzítésinek egyéb módszerei közé tartozik a bíotln és sztreptavídín alkalmazása. A híotlniíezett rákmarker fehérje vagy megcélzott molekulák előállíthatok biofin-NNS-bő! {N-hitíroxl·szűkeinImid} a szakterületen ismert módszerek alkalmazásával (például blotlnllezésl készlet. Pierce Chemicals, Rockford, IL), és ímmobilizálhafok sztreptavfolnnit bevohi 9Í lyukú lemezek lyukaiban (Piarcé Chemical). A vizsgálat végfehajtáaa érdekében, a nem-immobííizált komponenst hozzáadjuk lehorgonyzóit komponenst tartalmazó bevont felülethez. Miután a reakció befejeződött, az el mm reagált komponenseket eltávolítjuk (például mosással) olpn körülmények kőzett, hogy a kialakult komplexek rögzítve maradjanak a szilárd felületre, A szilárd felü-leihez rögzített komplexek kimutatása elvégezhető számos módon. Amikor a korábban nem immoblllzálf komponens előre jelzett, ekkor a felületen rögzült jelzés detektálása jelzi, hogy komplexek jöttek létre. Amikor a kofilban nem Immobilizáit komponens nem előre jelzett, akkor közvetett jelzést lehet a felületen rögzfteä komplexek kimutatásira alkalmazni; pl, egy az Immobilizáit komponensre specifikus jelzett antstesí használaíávaí (az antitest viezont közvetlenül v^gy közvetve lehet jelzett, pl. egy jelzett antl-IgG ante testtelji
Ezt a vizsgáiétól: őssejt rákmarker fehéfjéveí vagy céimolekulákkal reagáló antitestek felhasználásával végezzük, de amelyek nem zavarják meg az őssejt rikmarkemk fehérjéjének kötődését a céímolekulához, Az ilyen antitestek származékként hezzÉköL· hetök a iernez lyukaihoz, és :a nem kötődött óéi- vagy a rákmarker fehérjék antitest kon-Idgállssáj; fogzölnek avipkákhan, e$T"lmmÄfeält: fcempfexéHre leírt eprisok mellei az Ilyen komplexek detektáíieára szolgáié eljárások elemplexek Immundetektálását a rákmarker fehérjével vagy a celmotekulaval reaktiv antitestek aíkalmazáa^fil;y'Vá!aíiftltii| enzim-kapcsait teszteket tartalmaznak* amely -testek a .rákmarker fehérjéhez. zagy va céjmetekytihoz társult enzimallkus;aktivitás kimutatásán alaisulaak,: váltirnátN módon sejimantes vizsgálatokat végezhetünk folyékony fázisban. Egy ilyen tesztben a reakció termékeket az el nem reagál! komponensektől i számos szokásos módszerek egyikével választjuk el, többek között: differenciális oentrífugálássaí (id. példipi. lûtes and Minton, Trends Blochern Sei 18:284-7 [1993]}; kromatográfiával (géiszüréses kromatográfia, Ioncserélő kromatográfiai; eiekirofofezissel (ki például AüsubelíSt al,( szerk. Current Protocols ín Molecular Biology 1999, J, Wiley: New York.); és immunpredpítácíóval (Id, például Ausubel et al, szóé, Current Protocols In Molecular Biology 1999, J. Wiley: New York). A szakember számára ilyen gyanták is kromatográfiás módszerek lemértek (Id> pl. Heegaard J. Moi. Recognit 11:141-8 [1988]; Hageand Tweed J. Chromatdgr. Biomed. Sei, Appi 899:499-323 [1997]}. Ezenkívül fluoreszcencia energia transzfer ísükénplmesen alkalmazható az Itt ismertetett módon a kötődés kimutatására a komplex oldatból való további tisztítása nélkül. A teszi magában foglalhatja az őssejt rákmarkerek fehérjéinek vágy azok bloioglah lag aktiv részének egy a rákmarkefhez kötődő ismert vegyüiettel való érintkeztetését egy tesztkeverék kipzésireva teszfkeverék érintkeztetését egy vizsgálandó vegyüiettel, és a vizsgált vegyuiitoek égy rákmarker fehérjével való kölcsönhatási képességének meghatározását* ahol a vizsgáit vegyüíetnek egy rákmarker fehégéveí való kölcsönhatási képessegének meghatirozisa tartalmazza a vizsgált vegyüleínek rákmarkerekhez vagy azok biológiailag áktiv részéhez való preferencsális kötődési képességének, vagy egy célvegyüiet aktiyffeslÉ moduláló képességének meghatározását az ismert vegyidet-tel őssiébisóniffeá, kiá oss^tjékmarkerek, in vivo, kölcsönhatásba képesek lépni egy vagy több cellu-iáris vagy eztraoelluláns makromolekulával* például fehérjékkel, akkor az ilyen kölcsön-hatás inhibitorai hasznosak, inhibitorok azonosítására homogén tesztet lehet alkalmazni, Például, a cél géníermék és az interaktiv celluláris vagy extraceíiúláffs kötődő partnerterrnék előre kialakított komplexét úgy állítjuk elő, hogy vagy a célgén termékek vagy ezek kötődő partnerei jelzettek, de a jelzés által generált jel a komplexképződés kövétkáztébéh kioltódik (Id. például US 4,109s4@i sz. szabadaiml Irat, amely hasznosifa ezt a módszert immunfesztekre}. Az egyik, vagy mindkét rnolekulatlpussal versengő és azt a preformált komplexből ildszoriö vizsgálati: anyag hozzáadása a: hittérszlnt feletti JÄi *|©rwií'. Ezen a módón felismerhetők mok a vl|S|ÉÍatÍ anyagók, melyek megszakítják á: aél gÉPterméi, és a kötődő partner közötti kifeAhafte Alternatív módon, a iákmarkerek feíferjéjt; ''csali fehéijekénf lehet alkaimaznl két-lllíte vagy hámm-hjhnd tesztben 0dL piMÄBl tíS 0,283,31? sz. szabadalmi Irat; lervos ai ab, Cali, 72:223-212 [1993]; Madura et al.: J, Biol, Chem. 208,1204^19004 [1993]; Bartal at al., iíoteehnígues 14:129-924 [1993]; íwabuchí ©t al., Onoegene 8,:1093-1899 [1993]; és Iránt WO 94/103901 hegy azonosítsunk más felyán fehérjéket, amelyek kötődnek vagy löíesőnhatáspa lépnek a rákmafkerekkel („rákmarker köti fehérjék* vagy „felmarker-bp~r), és szerepet latsainak a rákmarker aktivitásban, ilpo rákmarkeöhp-k lehetnek a rákmarker fehérjék vagy célok, például agy fákmarttereÉi, Illái. közvetítői J#pvÉbbttiÉ útvonalban következő elemek jelelnek skiivátorai vagy gátiéi Λ rákmarkerek expressziójának modulátorai is azonosíthatók. Piídáui egy sejtes vagy sejimentas keveréket érintkeztünk egy jelölt vegyüléiét, és a rákmarkar mMHS-vagy fehérje expressziöját értékeljük az őssejt rákmarker mRNS-nek vagy fehifjioOk a jelölt vegyület távöljiféhen létrejövő expresszlója szintjéhez képest. Amikor a rákmarkér mRNS vagy fehéqe expresszloja nagyobb a |elölt vegyület Jelenlétében, mint annak hiányában, akkor a jelölt vegyületet rákmarker mRNll vagy fehérje expresszié sefeenfeként azonosítjuk. Amikor a rákmarker miNS vagy fehérje expressziöja kisebb (azaz statiszta katlag szignifikánsan alacsonyabb) a jelölt vegyűlet jelenlétében, mint; annak hiányában, akkor a jelölt vegyületet rákmarkef mRNS vagy fehérje expresszié Inhibitoraként axone-sítjyfe A rákmarkerek mRNS vagy felérje expressziojának szintjét a rikrnarkemk mRNS vagy fehérje defektiiására itt leírt ejjáfásökkai lehet meghatározni.
Ez a bejelentés kiterjed tovább! azonosított áj szerek a fent leírt szürövlzsgálátok-ban (Id, pl. a rákterápiák alább leírása) íeirt áj szerekre Is. Ennek megfelelően, a beja-tentés tárgyához tartozik egy itt leírt módon azonosítei szer (pl egy rákmarker modtifáió szén egy antiszensz rákmarker nukléinsavmolekyia, egy siRNS-moíekula, a rákmarkér specifikus antitest, vagy egy rákmarker-kötö partner) felhasználása agy megfelelő állati modellbih (mint például az itt leírtakban), az ilyen szerrel való kezelés a hatékonyságának, toxicltásának, mellékhatáséinak, vagy hatásmechanizmusának a meghatározására. A fentiekben leírt szűrőtesztekkel azonosított új szerek ezenkívül alkalmazhatók pl. itt leírt kezelésekben [pl rákos herein beteg kezelésiben). Ä jelen bejelentés nem-tapadó mammoszférákat alkalmaz különböző szűrési eljárásokhoz, beleértve a CXCR1 vagy FÍX021 jeltovábbítási útvonal antagonisták szűrésére szolgáló módszereket, A nem tapadó mammoszíérák egy olyan ín vitro tenyésztési rendszer, lehetövi-tezt dlfferenolilætlin állapotban levé elsődleges humán emlő egiieíiills Dssijlek iSHPloiepfor lejték iEapQÉását pzpn az alapon, hegy szuszpenzió-ban msnt gömb alakú struktúrák Képesek osztódni: A nem tapadó mammoszfirákat korábban Jetiik;: Pontú et al Genes Oev, 2003 May 15; 17(10): 1:233¾¾ és Donit! el al, Breast Cancer Res. 2ÜÜ4;6(6):R605~15, Ezek a hivatkozások Kt^ezeiten jók a nem-tapadó marnmoszférák felépítésének ès alkalmëzàèàiék 'kltanításérá.. Amint alt Dóriin ot ab közleményükben Írjak, a mammoszférákaí az jellemzi, hogy önmegújításra és tibbsajtvanalas ditférenaiiíédásra képes és- és progenitor sejtekből állnak. Dontu et ai. leírják további, hogy a mammeszfiekat tartalmazó sejtek képesek a kíonáíisah gene* rálni komplex: Émkbionálls duktáíis-aiveoláris struÉÉrákai Üatrigélben reköoaiíipálf 3-D tenyésztőrendszerekben. M alábbi példaszerű szűrési módszerek alkalmazhatók, In viiro vizsgálatokban sejteket lehet kezeim 3 napig kontrol vagy CXCR1 vagy FBX021 jelöli síRMS# (Ιβ 16-10Ö) expresszálé adenovirusskonsirukelokkah vagy egy kis molekulájú jelöltet |pi. egy PHA665752 származékot) (0,1-0,5. uM) 3 napig, és ésszehasonilanl a CXCÜÉ * vagy FBX021+ sejtek képességét tumor szférák képzésére a kézeieiien vs. kezet sej-lekben, M wim vizsgálatokban meg lehet fertőzni humán mellrák sejteket egy luciforázt expresszálö lentiviaissal a tamer növekedésinek szabályozásához; lucfferázt expresszálé ráksejteket be lehet fecskendezni; melíszövethe, és körülbelül 0,5-0,7 cm méretű tumorokat megállapítani csoportonként 6 állatiam Adaganatos állatokat azután kezelni lehet vagy egy jelölt CXGR1 vagy F8XÖ21 inhibitorral (naponta iv, 30 rog/kg/nap, 7 napon át), illetve a hordozóanyag kontrollal, Párhuzamos vizsgalatokat lehet végezni kantról vagy jelit PXOR1 vagy FBMD21 siRNS-i(MOI 100 vagy 500, 7 napig) expresszáló ádenoyjmssat való fertőzéssel. A daganatméret felmérésére az állatokról felvételeket lehet készítem a 7„ 14., 21, és 2,3. napokon, majd az állatokat íeölnb A dapnatméret tovább vizsgálható a boncolás során, és a daganat egy részét mag lehet festeni a daganat szövettani felméréséhez, A fennmaradó daganatot ki lehet emelni és szétválogatni a GXQR1 vagy FBX021 pozitív és CXCR1 vagy FBX021 negatív sejtek százalékantnyának felméréséhez. Annak igazolására,: hogy egy CXCR1: vagy FBX021 inhibitor jelölt adagolása és egy CXCR1 vagy FBÄtl jelöli siRNS adenovirus tertpzés gátoija-e a CXCR1 vágy FÍX02T jetátoM itihkciil 'vfesgtthi' íehét az útvona-íon sorban kővetkező mediátorok, például a Gab~1 Is ERK foszfofijációját (ki Chlstéhsen et ab, Cancer Res., 2003:63:7345-7356):, ¥, Daganatellenes terápiák
Bizonyosmegvalósítási módokban a jelen találmány tárgyai rákteráptek. A terápiák megcélozhatnak rákmarkereket (piláa CXCRi vagy FBX021 és a CXCR1 vagtf FBX021 jeítovÉbbíflsi útvonal fehérjéit,) Bármely ismert vagy később kifejlesztett rák őssejt terápia is: használhatói Péídádk a rák őssejt terápiás szerekét Ismertetnek US 1^14,522:: és 1,1::11,260 szabadalmi iratok, valamint a WÖO3/050502, W005/074633 és W005/005601 m* bejeteotisote
AniíWsMáripm CXCRl antagonlsta antitesteket használunk a jelen találmánnyal összefüggésben. Bármely alkalmas antitest (pl, monoklonálís, polikíonális vagy szintetikus) használható az itt ismertetett a terápiás eljárásokban. Néhány megvalósítási mid szerint a rak térti-piára használt antitestek humanizált antitestek. Antitestek humanizilisate szoigaii ep-fások jól ismertek a szakterületen (id. például, US 6,180,370, 5,585,089, 6,054,297, és az 5,568,132 az szabadalmi iratok).
Bizonyos megvalösitásí módokban a terápiás antitestek egy a jelen találmány szerinti őssejt rákmarker ellen generált antitestet tartalmaznak, ahol az antitest citotoxikus szerhez van konpgálva. Az Ilyen megvalósítási módokban, egy olyan daganatspecifikus terápiás szer keletkezik, amely nem a normál sejteket célozza, így csökkentve a hagyományos kemoterápia sok káros mellékhatását Bizonyos alkalmasoknál, igy képzeljük, hogy a terápiás szerek olyan farmakológia! szerek lesznek, amelyek hasznos szerek lesznek antitestekhez való kötődésre, különösen citotoxikus vagy más módon sejtellénéS szerekj amelyek képesek az endofelíálls sejteket elpusztítani, vagy növekedésüket vagy sejtosztódásukat elnyomni. A jelén találmány tárgykörébe tartozik minden olyan farmakológia! szer alkalmazása, amely antitesthez van konjugálva, és aktív formában adják be. Sejiellenes szerek közé tartoznak például kemoterápiás szerek, radio-izotópok, és eitotoxinok. A jelen találmány szerinti terápiás antitestek közé tartoznak különböző citotoxikus molekuláié szék, beleértve többek között radioaktiv izotópok (pl. jód-131, a jőd-123, teohniöium-Üim, mdium-1 11, réniüm-188, rénlum-188, galÍlum-87, réz-87, ittdumÄ, jódoz-llb vagy asztelín-211 ), hormonok, mint például egy sztéléid, antimeiaböktök, igy például a cltozinok (pl. arahinozíd, fluorouraoll, mefotrexái vagy aminopferin; egy: anfradkfin, mttomiclmCÍi, vinka alkaloidok (pk demekoloin; etopozld; mitramíein}, és tumoreilenes alkilezö szerek, Igy például a klorarnbucil, vagy melfalán.
Mis megvalósítási módok magukba olyan szörekéö mint például koagulànst, eltekint, növekedést faktort, bakleuills endotoxfoi vagy bakteriális endotoxin lipid A egységét. Néhány megvalósítást méd szerint például terápiás ágensek kézé tartoznak növényi, gomba- vagy bakledóm-afadsiű toxin, mint például A-iáno toxi» nők, dboszóma inaktlváló fehérje, a-szareíh. aspergülin, restriktocin, ribonukieáz, diftéria toxin vagy Pseudomonas exotoxln, begy csak néhány példát említsünk, Bizonyos kiviteli alakokban degfikozíiljf tjein A láncot alkalmazunk.
Mindenesetre ajánlatos az ilyen szereket kívánság: szerint sikeresen konjugálni é|y antitesthez oly módon, ami lehetővé teszi szükség szerinti célzásukat, ihternaiixáciéjukát, felszabadulásukat vagy vérkomponenseknek való prezentációjukat a megcélzott tumorsejteknél (id, pildiujdlhose et al, Methods ËhxymoL,, Ä£8ö (1Û83f:. Például néhány megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya a találmány szerinti: őssejt rákmarkereket célzó immunoioxinok. Az immunoioxinok specifikus célzéáhyagoknak, általában tumorra irányuló antitesteknek vagy ezek ftagmenseinek és egy citotoxikus szernek, Így például egy toxin moiekularèsznek a konjugátumai. A célba juttató szer Irányítja a tekint a megcélzott antigént hordozó sejtekhez, Is ezáltal a toxin szelektíven pusztftjá el a sejtekét. Néhány megvalósítási mód szerint terápiás entitás-teknél magas to Vívó stabilitást nyújtó térhálósáé szereket alkalmaznak (Thorpe et al., CanceriÄ,, 48:6396 j1988j). Más megvalósítási módok szerint, elsősorban a szolid tumorok kezelésire szolgáló antitesteknek van a daganat érrendszerére gyakorolt citotoxikus vagy más módon áépeffenes hatása sejtek növekedésének vagy sejtosztódásá nak elnyomásával. Ennek a támadásnak a célja, hogy egy daganatnál lokalizált vaszkuíáns összeomláshoz vezessen, megfosztva a iumorsejteket különösen az érrendszerre nézve disztálís iumorsejteket az oxigéntől is a tápanyagoktól ami végső soron a sejt pusztulásához is a tumor neurózishoz vezet. Néhány rnegvalóslisi mód szerint az antitest-alapú terápiás szerek az alábbiakban ismertetett gyógyászati készítményokM'lg^állillferllióhydSfliájpálÓsyláti módoknál a jelen találmány szerinti antitest késiimény adagolása a fik mérheti csökkenését (pl. daganaíosokkenést vagy eí!minátás|i eredményezi. VL Terápiás készítmények és adagolás A jelen találmány szerinti, daganatképzést száhityozöt tartalmazó gyógyászat! készítmény bármely hatékony eljárással adagolhatjuk. Például egy SLS-CXCR1 jelátviteli
•;V útvonal antagonists, vagy il ILS-CXCR1 jeláiviteliVváíasz-reakcióút 'fehérjéire anfagooimakéntiham más terápiás szer bármely hatékony eljárással beadható. A jelen találmány egyes: megvaloslÉsí ímidjálbama terápiás szer Reperíaxmt vagy annak egy származékát tartalmazza.
Bizonyos megyalôsiiâsi módokban egy ÍI8OXCR1 jelátviteli útvonal antagenlstif tartalmazó, fiziológiailag megfelelő oldat beadható helyileg, ínfraokuiánsam parantefálSsan, orálisan*, jíntranazalisán, iMrevénâsân, Intramuszkulärlsam siubkután, vagy bármilyen más hatékony módon. Az: ILS-CXORí jelátviteli útvonal anti|phi|fé; szer főleg közvetlenül fecskendezhető be egy megcélzott rákmsgbeté§edisbe vagy daganatba (pl, mellszövetbe} egy tű segítségévéi a oélszövet dafanatsejtjérnek kezelésihez hatékony mennyiségekben. Alternatív módon egy testüregben, például a szemben, a gasztröintesztínilis traMusbahvra húgys és ivarszervi traktusban (pl, a: húgyhólyagban), pylrnonáils és ibrondhiáliá rendszerben és hasonlókban lévő rák vagy daganat a ráktól vagy daganattól sejtett iregee azembéiközvétlenüí egy tűvel befecskendezve vagy katéteren vagy más szilié esivin keresztül befogadhat ÍL8-CXCR1 jelátviteli útvonal antagoniste hatékony koncentrációját tartalmazó élettaniig megfeleli készítményt {pl steril sooldatoi vagy loMfál^pafert, szuszpenziét vagy emulziót). Bármilyin hatásos képalkoté eszköz, mint például röntgen, szonogréfia vagy száloptikás vízualizációs rendszer használható a célszövet helyériek megtalálásához és mlÊ rv8§rïàtitercs§i nyitásihoz. Egy másik módszer szerint egy 1L8-CXCR1 jelátviteli útvonal antagonista hatásos koncentrációját tartalmazó éietfanikag megfelelő oldat beadható sziszllmásán a varkénngáibo olyan rák vagy tumor kezelésére, amelyet nem lehet közvetlenül elemi vágy anatómiailag izolált.
Az ilyen műveletek közös célja, hogy az ÍL8-CXCR1 jelátviteli útvonal aníagonísiát elegendő mértékben érinikeztessuk a eildagáhattai, hogy lehetővé tegyük az antagonistának a tumorsejtekkel való érintkezést iranszdukciőt vagy trahszfektálist (a szer jellegétől függően). Az egyik kiviteli módban üreges szervek hámbélésében levő szelíd tumorók kezelhetik Idiyadékkal töltött üreges szervbe fecskendezett vagy levegővel töltött üreges szervbe permetezett vagy párásított szuszpenzióval. Így a tumorsejtek (például; szolid furnér őssejtek) lehetnek i töd# m gyomor-bél traktus bélésében, a nil ivarszervek béliéiben vagy ezek környezetiben, a húgy- és Ivarszervi traktus, hólyag, epehólyag és bármely más szerv szövetében, amelyek hozzáférhetek az liJPBXCRi jelátviteli útvonal antagonista éhntkezteíéséhez, Így másik megvalósítási mód szerint a szolid tumor lohol a központi idegrendszer, például a gerincvelő, gerincvelői gyökerek vagy az. agy bélésében vagy azon úgy, hogy a cerebrospinalis folyadékba íníundÉlt (UKSHBItl Jelátviteli Iámnál antagoniste az adott a szolid tumnr sejtekkel és azokba bejut. Egy az. onkológiai szakterületen jártas szakember számárá te oyilvánvilbv bogy a szollá tumorba az antagonists beadható a daganatba közvetlen Injekcióval hogy az antagoniste elérje és hasson a da-ianat beiséjéhén lévő sejtekre. A felismert daganatképp sejtek alkalmazhatók rákellenes sejt elleni antitestek termelésére, Az. eljárás magában foglalhatja daganafképző sejtek vagy Izolált daganat-képző sejtek dúsított populációjának előállítását; a populáció kezelését a sejt replikádé megakadályozására (például besugárzássib; és a kezelt sejt beadását egy humán vagy állati alanynak szolid tumor őssejtekre adott immunválasz indukálásához hatásos meny-nyisigberv A befecskendezendő vagy orálisan adagolandó sejtek hatásos dózisához útmutatásért: Id. az US 6,218,110,8,207,1#? és 6,156,305 sz. szabadalmi iratokat. Az e|lrás magában foglalhatja szólid tumor őssejtek vagy izolált szolid tumor őssejtek dúsított ^oïpulàçi|^Â:^Mtl a tumor őssejtek összekeverését in vitro tenyészetben, az antitest termeiésro basznáiandó humán alanyból vagy gazdaáfiatból származó Immun efíektor sejtekkel p szakterületen ismert immunoiégiai módszerek szerinti az immun effektor sejtek eltávolítását a tenyészetből; és az immun effektor sejtek átülteté-séf egy gazdaállátba olyan dózisban, amely hatékonyan stimulálja az immunválaszt az állatban: A jelen találmány szerint a jelen találmány szerinti daganatképződés elleni terápiás szereket (pl ilB-GXÄI jelátviteli útvonal aniagonistákat) együtt adjuk más daganatellenes terápiákkal A terápiás szerek széles választéka alkalmazható a jelen találmány szerint. Bármely olyan terápiás szer, amely egyitf adagolható a találmány szerinti sze* rekkeí, vagy kapcsolatba hozható a jelen találmány szerinti szerekkel alkalmas a jeleh: találminy széunti eprásokban való alkalmazásra. Különböző osztályokba tartozó daganatellenes (pl. rákellenes) szerek alkalmazása jöhet szóba a jelén találmány bizonyos kiviteli módjaiban. A jelen találmánnyal való ah kaimazásra aikáimas daganatellenes szerek többek között apoptőzist indukáló szerek, adenozin-dezamináz funkciót gátló, pfrlmidin bioszintózist gátló, punn gyűrű biószlntézist gátló, nukíeofid inferkonverziót gátló, ribonukleotid redukfázi gátló, tímldfn-monofoszfát (IMP) szintézist gátló, díhldrofolát redukciót gátló, DNS-szintézisí gátló, DNS-seí adduktumot képező,JM8Akárosító, US javítást gátló, DNS-sel interkaíáió, aszparagin dezamínáló. RNS szintézist: gátló. fshé|eazintezist vagy stabilitást gátló, mlkrotubulus szintézist vágy funkciót gátló, és hasonló szerek.
Bizonyos kiviteli módok szedni a litálrniny szerinti készíiményékhért ét éijárásbfe· ban való Mhasznijásra alkalmas rákellenes szerek géléit? többek között * kővetkezők: 1} alkaloidok, beleértve riirotubuius inhibitorokat (pl. vinkfíszin, vlnblaszlin, és vindézin A% mikmte8l8&amp; éfábiffitíálók (pl. paklltaxel (TAXOL), és docetaxel stb.), és krcmatin tekéi#·. inhibitorok, beleértve ióposzómeráz Inhibitorokat. mint például opipodofOlotoxinokat (pl. eiopozíd (VF*tÍf, és a tenlpozid (Vfvl~26) stb,), és a topoizomeráz bet célzó (pl. kamptotecín és izinnotekán (CPÎ-1 1) stb,) széfek: 2) kova-lens DNS-kötő szerek (aikliező szerek), beleértve nitrogén-mustárokat (pl, mekioreiamin, kiorahibuóil, cikíofoszfamid. ifoszfamkt és beszéltén (MYLÉRAN) tiki nítrozo-karhamidok (pí. karmusztin, lomuszíln, és szamuszttn sib.), ét mis alkllezöszerek (pl. dakarbaztn, bídrcklrnetllrnelamln, tiotepa, és rhltornicin stb.); 3) nem kovalens DNS-kötő szerek (tumoreílenes antibiotikumok), beleértve a nukielnsav·' inhibitörékat (pl, dakiinomicin (akíióomTin P) stb,), ahtraoiklinek (pl. daunorubioîn (daunomleln, is cerubidin}, doxorubicin fadhamtelo), m idarubiein (idamíein) sib,), antrécéndlonok (pl. aníraciklin analógok, mint például; mltoxintron stb,), biéomlcínek (ILiblOMANi! SÍ>, és piikamiein (mltramicln) stb,: 4} aníimeíaboíitok, köztük antifolátok (pl, metotrexát, FOLEX, és MEXATE stb.), purin antimetabolitok (pl. 6-merkapto-purin ;p*h!F, PURINETHOL), 6-iioguanin (6~ÍG), azatioprln, aoikiovir, ganciklovír, icrodezdxladenozln, 2-klór~dezoxíadenozln (CdA), ét 2 -dezéxlkofdrmlcín (paníosztatin) stb,), plflmldln-antagonlsták (pl, Suonptrimidlnek (például idluor·· uracil (ADRUCIL), S~ fíuor-dezoxiuridin (Fdürd) (floxuridsn)) stb,), és oltozin arabínozídok (pl, CYÏOSAR (ara-C) és fludarabin stb,,);, 5) enzimek, beleértve az L-asparaginází és hldroxpkarbamid stb,; B) hornionok, ideértve a glOkokorükoidokat, antiösztrogénekef (például tamoxifen stb.), nem-szteroid anfiandrogének (pl, flutamid stb,), és aromatáz Inhibitorok (pl, anasztrozot (Arlmldéx) stb,); T| platina vegyüSetek (pl, ciszplaiin és karboplatín stb,); 8) rákellenes hatlinyágokkai tixihókkaí és/vagy a radioaktív izotópokkal stb, ko n j ugáit m o nők ! ο n á i i s antitestek; 9) biológia? válasz módosítók (pl, interferonok (pl. IFN-a stb,} és az Inieríeuklnek (pl. IL-2 stb.) stb.); 10) adoptiv ímmunterápla; 11) hematopoiatíkus növekedési faktorok; 12) tumorsejbdífferencláíódast indukáló szerek (pl. all-transz-retinsav stb.); 13) génterápiás módszerek; 14) antiszensz terápiás módszerek; 15) tumor vakcinák; 18) tumor metasztázisok elten irányuló terápiák (pl. ball másztál stb.); 1?) angiogenezís Inhibitorok; 18) proteoszóma inhibitorok (pl, VELGADE); 19) áqeiilezés é#^gyilpilt£és|jjl$ék;|pk, NföAC inhibitorok); 20) NE kappa,;S modulátorai; 21) a sejt- ciklus í»taí : (pi. CDK inhibitorod £$ popsiéin funÄ modylétorat; és 23| besugárzás, Ä rákferápiávai összefüggésben rutinszerűen használt bármilyen onkoíitikus szer alkalmazható a találmány szerinti a készítményekben: és eljárásokban, Filiáuf az Egyesült Államok Élelmiszer·' és Gyogyszerielugyeleti Aaiéslga |Ü FÖA} nyilvántartja az Egyesült Államokban használatra ehpdélyezétt obkölifikes szerakat* Az ÁB FPÁ megfelelő nemzetközi fimügynökségeí Hasonló nyilvántartásokat tartana fenn, A I, iám lázat az Egyesült Államokban használatra engedélyezett daganatellenes szerek jelentős példái: sorolja fel, Ä szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy az Egyesült Államokban jóváhagyott minden keméterapoutikumra előirt pfkalmazásr előírás'* iga le a jóváhagyott Javallatokat, az adagolási Információkat, fozioltási adatokat és hasonlókat a példaként szereplő szerekre.
3,TÁBLÁZAT
Anfmtkrobiiiis terápiás szerek is alkalmazhatók terápiás szerként a jelen leírásban A mikroorganizmusok működéséi pusztító, gátló vagy más módén gyengítő bármely szer használható, valamint minden olyan szer, amelynél szóba jön ilyen aktivitás. Az ântimlkrobiàiis szerek közé tartoznak többek közli a természetes ésszintetikus antibiotikumok, antitestek, gátló fehérjék (pi, defenzinek), aníiszensz nukieinsavak, membrán bomlasztó szerek és hasonlók, önmagukban: vagy kombinációban, Valójában birmilpn típusú antibiotikum használható többek közei antihakíenálís szerek, vírusellenes szerek, gombaellenes szerek, és hasonlók. A vegyülefek (és bármely más kemoterápiás szer) ce» szerekkel társítva képesek lehetnek konkrétan bizonyos sejttípusokat jpk temorsejfeket) megcélozni. Általában egy óéiba juttató szerrel társított terápiás vegyulet a neoplasztikus sejteket a óéiba juttató szernek egy sejtfelszíni molekularéssze! való kölcsönhatása revén célozza meg, amely receptor által közvetített endoejtizíssal kerül be a sejtbe; iirrnely olyan molekuiarész alkalmazható a jelen találmánnyal, amelyről tudható, hogy a célsejtek (pi. tumorsejtek) felszínén megtalálhatók. Például egy ilyen molekula-rész ellen irányuló antitest a készítményt a molekularészt tartalmazó sejttéielethez írá* nyitja, Alternativ módon a célba juttató molekuiarész lábét egy a sejt felületén lévő receptorra Irányuló Sigandum, vagy fordítva. Hasonlóképpen vitaminokat Is lehet használni :Ä:' a feien szernek agy adott sejthez kaié: irényiiasára,
Ahogyltt hasznaink, à „ciizo moiskylakf kifejezet kémiai csoportokat, ; ésítzek ri-szeli jeleni, amelyek hasznosak terápiái yegyőíateknek e sejtekhez, szövetekhez, szeryekhéf és a fontos szervekhez való irányítására. Különböző típusa célzó molekulák használata jöhet azőba a feien találmány szerint, beleértve többek között a jeizőpeptiiek, antitestek, nuklelnMÄ:; tetek:: i&amp;, haibrilik, A céihajuttaté molekulare-szék járuiékoszn elősegítik a kapmeliÄ (pi. kis möléfcylák) kötődi«·· set, vagy a veipMetek belépését a megpelzei seftekbe, szövetekbe és szervekbe. A oltó molekülariszeket előnyösen azok specÜeítisaj affinitása, és a hatásossága alapján választjuk ki, ahogy szelektíven: futtatják el a csatéit vegyüieteket célzott helyekhez egy alanyban, szövetben, vagy sejtben, beleértve az egyedi szubceiiuiáhs helyeket és sejtszerveeskikei Különböző hatékonysági problémák érintik minden gyógyszer adagolását - és különösen az erősen citotoxikus gyógyszerek (pl rákellenes gyógyszerek) adagolását. Az egyik különösen fontos kérdés annak biztosítása, hogy a beadötf szerek csak célzott sejteket (pl. rákos sejteket), sziveteket vagy szerveket érintsék. Az erősen citotoxikus szerek nem specifikus vagy nem szándékos bejuttatása nem célzott sejtekbe súlyos mérgezési problémákat okozhat.
Számos kísérletet iétiék gyógyszerek: olyan célzott bejuttatására szolgáló sémák kidolgozásira, amelyek a nem specifikus győgyszerbejüttatással kapcsolatos problémákat kezeik, (id, pIlK.N. Syhgos and A,A. Epenetos Antieancer Rés., 19:600-01:4(1999}; Ÿ.J. Park et al„ J. Controlled Release, 78Ä» (2002); RMü. Chari, Adv, imp ieliv. Rev., 31:89-104 (1098); és ö, Futnám and JL Kopecek, Adv. Polymer Sei., 122:55-123 flOiő)}. Célbafüttatö molekulafészak, mint például antitestek és ligandum pepidek (pl hámsejtekhez PtDC) hafőanyag-molekolákhoz való konjugálását használták arra, hogy enyhítsék egy adott hatóanyaggal kapcsolatos járulékos toxícitási kérdéseket; A találmány szerinti vegyületek is rákellenes szerek beadhatók bármilyen steril, biológiailag beleértve többek között sóoldat, puferelf sooldat, clextróz és víz. A gyégyászaílkészítmények tartalmazhatnak egyetlen szert (pí. egy antitestet), A találmány szerint a gyógyászati készítmények tartalmazhatják legalább két szer (pl, egy antitest és egy vagy több hagyományos rákellenes szif) keverékét A jelen találmány szerinti gyógyászai készítmények továbbá legalább két szert tartalmaznak, amelyeket a kővetkező kitételek közül egy vagy több szerint adagolnak egy betegnek; különböző idöszakonkint, különböző időtartamokig, különböző koncentrációkban, különböző adagolási módokon sás Bizonyos kiviteli módokban az l:t8-ORR1 jelátviteli útvonal aniagonísfát a második rákellenes szer előtt adagolják, pl 0,5, 11 1 4, 5, 10, 12, vagy 18 órával, Í J;, 3, 4, 5 vágyó nappal, 1,2, 3, vagy 4 héttel a rákellenes szer beadása előtt, iizenyos kiviéi) módokban az itSASXöRl |aiátv!teii étvo-hál ántagonlstát a második rákellenes smr útin adagolják, pl. Ö J, 1,2 3, 4, 5, 18, 12, vagy 18 drivai, 1,2, 3, 4;, ő vágy é nappal, 1 j,: 8, vagy 4 héttel a rákellenes szer beadása: után, Bizonyos kiviteli módokban az IL8-CXCR1 jelátviteli útvonal antagoniste és á második rákellenes szer beadása egyidejűiig:,; de különbőzé adagolási menetrendek szerint történik, pl, az tES-CXCR1 jelátviteli útvonal antagonisfa vegyotitét naponta adar góljuk, míg a második rákellenes szert hetente egyszer, kéthetente egyszer, háromhe·' tente egyszer vagy négyhetente egyszer. Más megvalósítási módok szerint az ILS-CXCR1 jelátvitel! útvonaí antagonists! hetente egyszer adagoljuk, míg a második rákéi-lenes szert .papanía* hetpnt^e^ egyszer, háromhetenti egyszer vagy négyhetente egyszéf ddigólp!, A kezelendő állapottól függően a jelen gyógyászati készítmények előnyös megvalósítási módjait szisztémásán vagy lokálisan formázzák és adagolják, A formázásra és leadásra vonatkozó mödszerékét a következő kézikönyv legújabb kiadásában megtalálhatók: „Plemingtort Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co,, Easton Pa.}. Megfelelő beadási módok lehetnek például többek kozott az orális vagy íranszmukozáils adagolás, valamint a parenteráiís adagolás (például intramuszkuláns, szubkután, intramedulíárls, intratokális, intraventríkuláris, Intravénás, intrapehtoneálís, vagy intranazális beadás). A jelen találmány tárgykörében szóba jöhetnék terápiás vogyületek és bizonyos megvalósítási módokban egy vagy több hagyományos rákellenes szer adagolása, összhangban elfogadható gyógyszerészeti bejuttatást módszerekkel és előállítási efátáeok-kai.. Például terápiás hatású vegyületek és megfelelő rákellenes szerek alanynak beadhatók Intravénásán gyégyászatllag elfogadható hordozóval, például fiziológiás sőoldat-tal. Szóba jöhetnek gyógyászati szerek intraceiluláris bejuttatására szolgáló standard módszerek (pl. liposzómával való bejuttatás). Ezek a módszerek jól ismertek a szakterületén átlagos jártassággal rendelkező szakember számára,
Bizonyos: kiviteli módokban a jelen találmány szerinti készítmények hasznosak pafénterális (például Intravénás, szúbkután, iníramuszkuláris, intramedulíárls, és intraperitoneálie} beadásra. Egyes szóba jöhető rákellenes szerek (pl, terápiás polipeptidek) terápiás együttes beadása génterápiás reagensek és módszerek alkalma- * zásával m elvégezhető. A jelen találmány bizonyos kiüli máá|alMn ο terápiás vegyáletetet spy alanynak komliliiiölö^n adjuk he egy vagy több hagyományos rákellenes: széffel (pk nukléofidázekvenoiák, gyógyszerek,: honooook stö.) vagy elpri gyógyászai kéazífmé-nyákben, ahol: a komponensek adott esetben egy vagy több segédanyaggal, vagy mis gyógyászatijai elfogadható hordozóval vannak keverve. A jelén találmány szerinti előnybe kiviteli módokban a gyógyászatiján elfogadható hordozók biológiailag mertek. Előnyös kiviteli módokban a találmány szerinti gyógyászatíkésxítményekei győgyászailag elfogadható, a szakterületen jól ismert hordozok használatával orális beadásra alkalmas: dózisokban formázzuk. Az ilyen hordozók lehetővé teszik a gyógyászati készítmények kiszerelését tabletták, pirulák, kapszulák, drazsék, folyadékok, lélek, szirupok, zagyok, oldatok, szuszpenziók és hasonlók formájában egy alanynak való orális vagy nazális beadásra.
Orális alkalmazásra való gyógyszerészeti készítményeket úgy állíthatunk elő, hogy a hatóanyagokat szilárd segédanyagokkal kombináljuk, adott: esetben a kapói eíegyet megörüljük, és a keveréket granulátummá, alkalmas segédanyagok hozzáadása után, ha szükséges, tablettákká vagy drazsémagokká dolgozzuk fel. Megfelelő segédanyagok a szénhidrát vagy a fehérje töltőanyagok, mint például cukrok, beleértve a laktózt, szacharózt manóitól vagy szorhítot; kukoricakeményitőt, buzakeményitőí, nzskeményitőt, burgonyakeményítőt stö.; cellulóz, például metil-celluléz, hidmxlpmpíimetlltöellulóz, vagy nâtrium-karlsoximefll-cellulôz; gumik, például: gums arábikum és tragakanta; és fehérjék, mint zselatin és kollagén. Kívánt esetben szétesést elősegítő vagy oldódást elősegítő szereket la adhatunk hozzá, mint például térhálósított polivinil-plrroiidont:, agart:, alginsavat vagy sóját, például nátnum-algmátoi
Az eiónyós megvalósítási módokban az adagolási és beadási rendszereket a klinikus, vagy a farmakológiái szaktarüíéfen gyakorlott mások szakember szabja meg jól ismert farmakológia! és gyógyászati megfontolások alapján, beleértve többek között a kívánt szintű és a ténylegesen elérhető terápiás hatást. Általában célszerű követni a kemoterápiás szerek jól Ismert farmakológiai elvek szerinti adagolását (pl. általában j tanácsos, hogy egpzerre ne változzon a dózis több mint ÓÜ%-kal, és ne gyakrabban, mint a szer felezési ideiének 3-4 szerese):. Az Olyan készítmények esetiben, amelyeknél az adagfüggő toxícitási megfontolások csekélyek, vagy nincsenek, és ahol maximális hatékonyság szükséges (pi, â ráksejtek pusztítása}, ott nem ritkák az átlagosan szükséges adagot meghaladó dózisok. Ez az adagolási módszer közkeletű neve a „maximális dó- zls” ; stratégia, iízdnps: megvalósítás? médokl» ïSZ: íbtCXCill ptiivitets útvonal antagoniste! egy alanynak napi 1-40 mg (pl· 4-4$ .Μ%ί:?44ΐΙΙΙΙΡ0.: tligélunk* Bizonyos megvalósítási módokban az alanynak 15 és 70 rng közötti telítő adagban adagoljuk az IL8-CXCR1 Jelátviteli útvonal antagonist Bizonyos megvalósítási módokban az alanynak körülbelül 36-45 mg telítő adagban adagoljak az ÍL8-CXCR1 Jelátviteli útvonal antagonisiát (pl, szubkután), majd napi körülbelül 10 mg-os adagban (pl. szubkután) körülbelül 4-8 hétig.
További adagolási megfontolások vonatkoznak a szer megfelelő célszintjének, a szer felhalmozódásának és potenciális toktcltásának, rezlsztenöla serkentésének, a hatásosság hiányának kiszámításához, is a szer terápiás indextartományánsk leírásihoz.
Bizonyos kiviteli alakokban a jelen találmány szerint szóba jön a szer adagolásának rétin módszerekkel való módosítása. Gyakori stratégia a beadást ésszerű célszintre beáliftanl az alanyban, Bizonyos előnyös megvalósítási módoknál a szer szintjét mérjük az alany plazmájában. Ennek alapján megfelelő dózisszintekef és gyakoriságokat tervezünk a szernek az alanynál kívánt egyensúlyi oélszmtjének eiéréséhez, A szer tényleges vagy átlagos szintjét az alanyban npmon követjük (pl. óránként, naponta, hetente, stb.) úgy, hogy az adagolási szinteket vagy frekvenciákat ágy lehessenÉeálHtahf, hogy fenntartsuk a célszinteket. Természetesen az adagolt konkrét szer vagy szerek farmakokinétikáp és íármaködinimíája |pl. biológiai hozzáférhetőség, a kiürülés vagy biológiai felhalmozódás, biológiai eloszlás, gyégpzerkölosönhatások sibj potenciálisan hatással lehetnek arra, hogy mi tekinthető ésszérl oélszlhtnék, és Így hatással vannak az adagolási sziráekfi vagy gyakoriságokra. Ä céiszlntü adagoiási mödszerék jeliemzÄn egy megállapított ésszerű terápiás célkitűzésre támaszkodnak, amelyet a szernek az alanyban kívánatos tartományára (vagy terápiás tartománnyal) definiálnak Általában* a terápiás tartomány alsó határa nagyjából megegyezik a szemek azzal a koncentrációjával· amely körülbelül 50%-át adja a maximálisan lehetséges terápiás hatásnak. A terápiás táhomány teiső határé! ilfalában: a szer toxlcltása, és nem annak hatékonysága határozza meg, A jelen találmány szerint a terápiás tartomány szóba jövö félső határa egy adott szemek az a koncentrációja lesz, amelynél az alanyok kevesebb, mint 5 vagy 10%-ánal jelentkezik toxikus mellékhatás Bizonyos kiviteti módokban a terápiás tartomány felső határa körülbelül legfeljebb kétszeresé az alsó határnak. A szakterületen jártas szakember megéri; hogy ezek az adagolási mégföhloiáaok nagymértékben változók, és bizonyos mértékig egyéniék (pl, genetikai hajlamokon, immunológiai megfontolásokon, toleranciákon, re- * sdtóenciákoo és hesorÄon alapulnak). llytnéd«: bizonyos: megvalósítási; módok szénái: egy alanyban igy szar hatékony hitelt adagolási szintje Jíe hét 1-,- 1,-,, 1 Cl s ..,. 15, ™ - 50,... 76, ,,, 100,... 200,.v,,:)<.%^| Oi|j|pbb,;:^l^:iZ' opeiiUs egy másik alany ban, Ezzel szagba a néhány alanygelantös meliékhátesokaí és texieliáSiaí kapcsalátős :egèsza#ûgyl.problémákattepapÄt. jőve!|1.,... 1:.... 10 ....11,......2&amp;.... 10,.,./fi,...... 100, 200,,.,. K%~kal) kisebb adagolási szintek vagy gyakoriságok mellett, .mint. amelyek tipikus optimális terápiás szintét hoznak létre egyes alanyokban vagy az alanyok többségében. Konkrétabb Infoimiplî bíinyái^n az adagolási célszinteket gyakran a terápiás tartomány közepém áiíifpk bé.
Az előnyös kivkeii alakokban a klinikus racionálisán egyénre szabott adagolási rendet tervez az ismert farmakológiai elvek és egyenletek alapién, A klinikus áltálában egyénre szabott adagolási rendet tervez meg a szer különböző farmakolégiai és fármakokinelikai tulajdonságainak ismerete alapján, beleértve többek között az F (a dózis frakcíonális biológiai hozzáférhetősége), a Cp (koncentráció a plizmiban), a CL (elearoneeVklörülés sebessége), Vss (gyógyszer állandósult eloszlási térfogata) Css (egyensöÍyl ionoentráció); és a 11/2 (gyógyszer felezési ideje), valamint a szer felszívó-dásí és eloszlási sebessége értékeit. Szakemberek szamára számos Jól ismert farmakológia! szöveg áll rendelkezésre (pl. Goodman és Gilman, Pbarmaoeutieal Basis of Therapeutics, 10. kiadás., Hardman st ai,, Szerk,, 2001) ezen változók és az egyénied-tett adagolási rezslmek kiszámítását szemléltető telles egyenletek további magyarázatára. A témában jártas szakember képes lasz élőre is megsejteni ezeknek a változóknak az esetleges Ingadozásait az egyes álanyokbim Például a megfigyelt F, Cl, és Vss értekek szórása jellemzően rendre körülbelül 20%, 50% és 30%. A potenciálisan széles körben változó paraméterek gyakorlati hatása az egyes alanyokban az, hogy az idő 95%-ában a Css egy alanyban a eélszínt 55 és 270%-a közötti értéket éri el. Alacsony terápiás indexű gyógyszereknél ez egy nem kívánt módon szeles tartomány. A szakterületen jártas szakember számára érthető azonban, hogy ha egyszer a szer Cp {koncentráció a plazmában} értekét mérjük, akkor lehetőség van közvetlenül megbecsülni az F, Cl, és a Vss értékekei Ez lehetővé teszi, hogy az orvos hatékonyan finoman beállítsa egy adott alany adagolási rendjét. teég további megvaiositásí módok szerint a találmány tárgykörébe tartozik, hogy a folyamatos terápiás monitorozási módszereket kell használni az egyen adagolási módszereinek és sémáinak további kiigazításához. Pékiául az egyik megvalósítási módban: Css adatokat használunk a CL/F feecsíisiíPek további f némítására, és ezt követően m S.; egyén imÉÈMÊù· dózisának beai!itisiza;*: begy -zr ..hatóanyag llvânt: megoálzctt ülőiét isméit fermikolőglai elvek is egyenletek alkalmazásival eiérjik, Terápiás: gyogpzarmontarazist: végaziafink: gyakorlatilag: bármikor ai: adagolási: rend: alkilma-zása sarán, Az előnyös kiviteli alakoknál a monitorozást több: időpontban végezzük, az adagolás során, és. különösen akkor, amikor internattaió dózisokat adunk, Például gyógyszer monitorozás végezhető egyidejűleg, a szar beadásától: számítva: a másodé porc tört: részén, másodperoiri, porcán, órán, napon, biten, hónapon síd, bálik tüggeb lenül az alkalmazott: adagolási módszertől: (pl, ím#rmiti|íő' ádagöjáiptáltö· dó^llők* fenn* tartó kezelés, véletlenszert adagolás, vagy bármely más adagolási módszer). Azonban: a szakember számira nyilvánvaló lesz, hogy amikor a mintavétel gyorsan követi szar beadását, akkor a szer hatását és dinamikája esetleg nem: könnyen megfigyelheti, mb yel a: azir piázmáköncentráelőjának: változása: lehet késleltetett (például lassú: eloszlás vagy más fpmakÂtâmfàà HhyáSőfc miatt). Ennek megfelelően a röviddel szer beadása után kapott mintáknak korlátozott vagy alacsony lehet az értéke, A biológiai mintáknak az alanytól ® megjósolt egyensúlyi célzott beadási szint meb lei vilÓ levételének elsődleges eé|aaz ezt követően a szer kiszámított CUF arányára vonatkozó félüjvízsgll becslések alapján az egyén adagolási rendjének módosítása. Azonban a szakember számára nyilvánvaló lesz, hogy a felszívódást követő korit gyögyszer-koncföotfíoiök általában nem tükrözik szer cléarance értékét. A felszívódást követő korai gyóiyszeékoncerkráclőkat eleisorban a szer abszorpciós rátája, inkább a szer centrális* és nem az egyensúlyi megoszlási: térfogata, és az eloszlás sebessége Ingják meghatározni. E farmakokineiikai jellemzők mindegyike korlátozott értékű, amikor bosszú távú terápiás adagolási rendek kiszámításánál alkalmazzák.
Ennek megféíelően: néhány megvalósítás; módban, amikor a cél a terápiás hosszú távú fenntartó kezelés, biológiai mintát veszünk az alanytól, sejtből, vagy a vizsgált szövetekből jóval az első dózis beadása után és még előnyösebben röviddel a következő tervezett adag beadása előtt. Még további: megvalósitásí módokban, aböl a terápiás szer szinte teljesen kiürül az aianybÖI:: :a: dozisok közötti intervallumban, akkor a jelen találmány tárgykörébe tartozik az alanytól az előző adagolás után; különböző időpontokban biológiai minták levétele, legelőnyösebben röviddel a dózis beadása után:. VII, A repertaxin is más kis molekulájú CXCR1 inhibitorok A jelen találmány szerint a CXCR1 kis molekulájú Inhibiferai alkalmazhatók. Az: egyik példaként szar w mpartaxin;. iizónyos ü&amp;gveíésífásí? Imitaten*, à 'féf^$áKÍr* Jn. vte dőzlé® 3:&amp;: 8Ö m||)sr kilogramm (pl 3 ,,, :30 .... 50 ,., ÓD mg/kg). Â találmány előnyős megvalósítási: m a r^partoin dózis körülbelül 30; mö::kliöira?émön:ké:nt é mparfaxln kémiai képletét az alábbiakban mutatjuk be:
Más kivitel mődekhsn a mpértaxin származékait atkaimszzuk. Egyéb kis molekulájú CXCB1 antagomsfák közé tartozik az S8285810 (Cäla.xo SmlthKIine Beecham; Benson et al.< 2000,1 SI ; 1Ü-197¾ valamlot az BON 527123 (ΖόιΙΟΓΟχΙ-Ν,Ν-ΌΐΓΠθΙΙΟό-ΐΖ" [[(R}Ma5~metlkftir^n^il)p?zspií]amloo|-3,4-dtoxo^oiklobyé1-aail"at«o}beazamí£l (SON 527123), egy orálisan biológiailag hozzáférhető CXGR2/CXCR1 receptor antagoniste (Schering Plough)). Más kis molekulájú InhiblOrokata fent ismertetett szűrési eljárásokkal lehet azonosítani, mmm A következő példa arra szolgál, hogy demonstráljuk és tovább illusztráljuk a jelen találmány bizonyos előnyös megvalósítási módjait ésaspektusait, és nem szabad annak oltalmi kőre korlátozásaként értelmezni.
t> PILPA A CXGR1 telismer rák őssejteket
Ez a példa M|á a GXCR1, valamint más fehérjék (pl FBXÖ21) rák őssejt marker-ként való azonositását.
Sejttenyésztés* Emfösejtvonalakat (BOLj az ATCC-töi Lhtlp:/?wwv/." utána ceiiBioíogyindex.cfm") vagy ér. Si Eitler (már hezzáfifhető a ''hup~//wwwi!, utána; "astemnómorefesterani^ilGRERÖSiTÖRV /hbreasteaneereelMínes.aspx, SUM44, SUM62, SU Ml 40, SUM159. SUM 185, SUM190, SUM22S, SUM229'' elmen). VJ. Mobüs (BRCA-MZ-Ölh és V, Catros (S88) laboratóriumaiban kifejlesztett gyüjtemi» nyékből kaptunk. Minden vizsgák 8CL kamlnőmákbői mShsI kivéve az MCF1OA-L amely fibrocisziâs bÂ-pégÂ, is a HMEC-areöetü 184A1~et, amely normális emlő-SZÖvétbil származott. A sejtvonalakat az ajánlott tenyésztési körülmények között tenyésztettük. Minden kísérletet egybefolyó sejtekkel, a növekedés exponenciális fáziséban végeztünk.
Az ALDEFLUOR íeaM és m ALDM^mitfv populáció elválasztása FACS módszer-mi. Az ÁLON aktivitást: tiumén emlőrák imolekulárls altípusait képviselő 33 BCL-ben mér-tűk, A m<APs ÄDH eiizimstikys aktivitású populáció Izoilllslra az ALDEFUJÖB: készletei (StemCeiI technoigies, Durham. NC, USA) használok A szobkonfluens sejt-vonalakból irípszínezés után vagy frissen disszociált kénograflokbói kapott sejteket ALPN szubsztrátoi (ΒΑΆΑ, 1 pmol/1 per 1x108 sejt) tartalmazó ALDEFLUOR yizagllati pufferben szuszpendáijuk, ésdnkybáíjyk 40 percen ét 37 °C-on. Minden egyes kísérletben azonos körülmények között megfestettünk negatív kontrollként egy sejimintái 50 mmol/liter dfetílarmno-benzaldehkidel (DEAB), egy specifikus ALDH inhibitorral. Áramló-si citomeíriás válogatást végeztünk FACSíarPLUS {Beeten Dickinson) alkalmazásával. Az ALDEFLUOR fluoreszcenciáját 488 nm-es hullámhosszon gerjesztettük, és standard liupreszcein-izotlooianlf (FITC) 530/30 sávszűrő alkalmazásával detektáltuk. A :ptiOtran$izpfóntá|. Isij^gtcfcff #nti~H!Kd antitesttel (BD ilosoiences, 1/200, 20 percig jégen) való inkubálást követően tikoeritrlnnef (Jackson Labs. 1/ISöJO pere jégen) jelzett másodlagos antitestet alkalmaztunk, hogy elimínáíjük az egér eredetű sejteket. A válogatási kapukat: az életképességhez Pl-vei festett sejtek, a DEAB-bal kezelt ALDEFLUöR-ral festett sejtek, és a csak másodlagos antitestté! lestett sejtek használa-Iával alakítottuk ki. Az RNS profllozas vagy a NOP/SCID egerek injekciózása elök a szétválasztott populációk tisztaságát a BRCA-MZ-Ü1 és a SUM159 sejtvonalakban 10 000 ALDEFLUOR-pozítív és negativ sejt dupla szétválogatásával ellenőriztük. Mindkét sejivonai esetében a válogatott ALDEFLUOR-pozitiv populációk több, mint 98% ALDEFLUOR-pozítív sejteket labálmaztak, és nem mutattunk kl ALDEFLU0R-pozltiv Sejteket az ALDEFLUÖR-negativ populációban.
Tumorképző hatás NöO/SCiD egerekben. Az ÁLDELFUOR-pozitív, -negatív és a 159, MDA-MB-4S3 és BR.CA-MZ-01 sejtek daganatképzö haté-sátJNOD/SCID egerekben mértük. A pubertás előtti 3 hetes korban zsírpárnákat hámrétegtől megfosztottunk, is humán íibrehiasziok (1 ; 1 besugárzottnem besugárzott, 50 000 sejt/100 pl Miatrígeí/zsírpáma) befecskendezisivel humanizáltunk a leírlak szerint (17). Az itlitökif eutaalzlituk amikor a tumorok legnagyobb átmérője 1,2 cm volt, 4 batárivá azfgbnoas itl&amp;Ä vité használatának száfeáiyait Minden egyes zslfparoa egy úmM mmMltnhan fixáltuk, és paraffinba ágyaztuk ysztoiégiat anafíA» Híz, Így másik liizf az ábilFLÜÓR teszttel, maid; válogatással és somzatos transz-piaetáciDVál mértük,
Nem~iep®M tenyészet AtDEFLUOR-pcziíiv, -negatív, nem szeparált 184Ä1, §UM14i és. SÖM1M sejteket azálasztattönk egyetlen sajíkinf ultra-alacsony tapadási iémezékre (Cernini* Anion, MA) alacsony sűrűségben (iOöi életképes sejí/ml), A sejte-kei szérummentes emlő epiielíális bazllís iipfeözoiien pambrex Bio Science, Walkervier MD) tenyésztettük 3-7 napig, a leírtak szennt (IS), A sejtek szflmiépzésí képességei a táptalajhoz adott különböző dózisé IL8 (GenWay Siotec% San: Μόρο, DA) kezelés étin: kvanf ifikiltu k, RAtíl ®xtmketó> Teljes RNS-t extraháltunk fagyasztott ALDBFLyöR-gözilfv es ~ negativ sejtekből DNS/RNS All Prep Maxi készlet használatával a gyártó utasításai szerint plagen, Sample and Hollandia). Nyolc BCLd használtunk fel transzkripciós analízisre: 184.A1,BRCA-MZ-Öi, HCC19S4, MDA-MB-231;, MDA-MB-453. SK-BR-7,: SÜM14B ás SUMtSiL. Az RNS integritást denaturáló fermsidehid vagaróz géíelekirőforézísse! es mikroanailzissai szabályoztuk: (Agilent Bíoanalyzef, Pale Alte, CA). Gánexpresaz/ds prcáíéíkoüa ÜMB micmermyiel A génexpressxiós elemzések Asymetrix U133 Plus .2,# barnán: oligonukleotld míkreieszteket häMMmk« amelyek több, mint 47 000 trans^riptet Is vanánst, köztük 38 500 jól jellemzett Humán gént tartalmaztak. A cRNS előállítás, a Nhddizáeiók, a mosások is a detektálás a gyártó utasításai Qtítn./Nvwxy, utána „affymotrix.com/index.aflx*') szerint történtek. Az expresszié» adatokat RMA (Robusztus Multichip Átlag) eljárással R-ben elemeztük a Bíeóöhdyeíof és a kapesöíődé csomagok (19) alkalmazásival a leírtak szerint (.20,21 ). Az: RMA elvégezte a háttér beiílliásit, a: guantilis normalizálást és a génenként 11 oligonuklectíd összegzését,
Az elemzés előtt, egy szűrési eljárással eltávolítottuk az adatbázisból az alacsony és rosszul mért, 100 egység aSatii értékü expressziôjù géneket a 16 minta mindegyiké-bői, megtartva 2S 286 gini/EST-ek l|y a szórás (SD) erőssége alapján égy második szűrőt alkalmaztunk a felügyelet nélküli elemzésekhez azon gének kizárása céljából, amelyek alacsony expressziás változást mutattak az elemzések során. SD kiszámítása log2-fransztormáIt adatokra alapulva történt, ahol a legalacsonyabb értékeket először egy 100 egységes a HitlAr Intezitáshez, megtartva 0,5 feletti szótássaí 13 650 gént/EST-ét Egy felügyelet nélküli analízist végeztünk 16 sejteken, 13 §60 génre., A hiemrchikys kiászíerezast megelőzőén a Szőrt sdáfökát lőgi-fmnszfofmálfuk:, és betápláltuk a: Ouster programba P2| a gének medjánra normáit adÄfnäk felhasználásával, a hasonlósági mértikra: a Pmmm-fáiu korreláció és az átiagponios láncmódszer csoportosítás alkalmazásival Az eredményeket a Tree View programma! (22) jelenítettük mag. Az AIDE FLU OR-pazltfv és -negatm populációkat megkülönböztető gének azoacaltasim és rangsorolására egy Mann és Whítney-íéie ü tesztet alkalmaztunk a 16 |!I§épteM§T~ré, és hamis feiíedezési arányi (POR (23) alkalmaztunk a többszöri vizsgalati hipotézis javítására. A diszkrimlrsátöf aláírás osztályozási erejét a minták hierarchikus klaszterezésseí való besorolásával illusztráltuk. LOOCV4 alkalmaztuk az azonosított molekuláris aláírások előrejelzése pontossága a felügyelt elemzés érvényességének becslésére; minden egyes mintát egyenként zártunk ki és osztályoztunk a lineáris diszknminanda-anelízissel (EDA, (24|a nem kizárt mintákra definiált modell segítségével
Vetés ideß; 'M$<PCR; büután a különböző seiveoalakből az ALDiFLUOR-pezitiv és az A IDE Ft. U O R-nega ti v populációkat szétválogattuk, a teljes RNS~i izoláltuk RNeasy Mini készlettel (QIAGER) és alkalmaztuk valós idejű kvantitatív RT-PCR (QRT~ PCR) tesztre egy ABI ΡΡίΒΜΙ) 79ö0tff szefe^nolado^ktáló rendszerben, 384 lyukú blokk moduliéi és automatizálás) tartozékkal (Applied Blosyeteros). Lánctndiókaí és próbákat a Tagman rendszerhez az Applied Biosystems weboldaláról válaszrottunk, A CXCRAre. F8X021~re, NFYA-ra, NÖTCH2~re, RAD51L1~re és TBP-re használt PCR láncindító párok és íluprö|én próbák szekvenciái elérhetők az Applied Biosystems weboldalán (CXCRi vizsgálati azonosító: :Rsr_00l?4146_mi; F8XÖ21 vizsgálati azonosító: N$J)Q372141 jmi; NFYA vizsgálati azonosító: Hs^ÖÖ553639joi; NOTCH2 vizsgálati azonosító: Hs. 01050719_mi; RAD51L1 vizsgálati azonosító: HsOÖ172522_mí; TIP vizsgálati ázooosító; Hs,^0427820^1). A CXCR1 « FBX021, NFYA, HQTOm, RÄDS1L1 relatív éxpresáziós roRNS színiét a TBP gén belső standardra nézve számé toltuk ki, hogy az RNS minősége és a bejuttatott cDNA mennyisége ingadozására nom maiizáljunk a korábban leírtak szerint (25), ínvázsős teszt A teszteket három párhuzamossal végeztünk transwe.il kamrákban 12-lyukú lemezekre (Corning, NY) alkalmazott: 8 um pórust! polikarbonát szűrőbetétekből- A 30 u! jéghideg 1:6 bazálls membrán kivonattal (Matrigel, Bö-Bioseíence) DMEM/F12-ben bevont szűrőket ínkuMltuk 1 órán át 37 °C-on. A sejteket a felső kamrába adtuk be 200 ül szérummentes tápközegben. Az ihviziős teszthez 6000 sejtet: ol· tüÄÄ·« Äf szűrőkbe, és äz aisé kamrát megtöltöttük 600 yt táptözöi- |p|. amelyet 10% humán szérummal (Cambrez} egészítettünk ki vagy 600 u! szérum-mebteS tÉptézeggei, amelyet ILS^-eal (100 ng/m!) egészítettünk ki. 48 órás inkubálás után a Séítekót a szűrő alján fénymikroszkóp alkalmazásával megszámoltuk. A relatív ibvázüfbérmáltuk a szérurnos feltételek melletti nem elválasztott, megfelelő sejtvona-Mhoz,
LenMm^ftm&amp; A iuciferáz gén transzdukcióhoz HCC1'9S4~bőj, MPA~MB-4S3-bői, és SUM 159-ből származó 70%-os össszefolyó sejteket tenyésztóközegóen inkubáltuk egy éjszakán át Lenti-LUC-VSVG (Vector Corn, Ann Arbor, Ml) tentivíráíis feíüíúszék 1.3 arányú kicsapatott keverékévek A következő napoo o sejteket begyűjtöttük tbpszirVEDTA segítségével is 1 -'6 ambyfean âtefettek 1 hét Inkubálás után a sejteket ALDEFLUOR fenotipus szerint szétválogattuk, és a fuciérÉi exppssziőt ellenőriztük minien egyes szortírozott populációban (ALDEFLUOR-pozitív és ALDEFLUOR-negatív) 2 ml D'-lueiferln 0,0003% (Promega, Madison, Wf) hozzáadásával a tenyésxközegbe, és a fotorsfluxust egy kamera rendszerrel (Xenogen, Alameda, CA) számláltuk,
MmMmÉfélis beoltás, Hat hetes NOD/SCID egereket érzéstelenítettünk 2% ízofluorán/levegő keverékkel, és a szívük bal kamrájába 10G 000 sejtet fecskendeztünk be 100 pl steril, Ca2* és Mg2* nélküli, Duíbecoo-féie PBS-ben, A bárom sejivonal (HOC 1954, MDA-MB-453, BUM 159} mindegyikére és minden egyes popuiáoióra (ALDEFLUÖR-pozíiív, AbDEELUOR-negafív és szelekiáiatlan) három állatot injektál· tunk.
Biôiumimmcémië észlelése, A kiindulási biolumineszcenciát az oltás előtt és az oltásokat követően minden héten mértük. Az egereket érzéstelenítettük 2% íiofiuorin/levegő^keverékével, és egyetlen í.p. adag 150 mi#«S D4ucíferiní (Promega. Madison, Wí} adtunk PBS-ben, Az állatokat ezután 6 perccel a D-lucíferin beadása után újra érzéstelenltettik, A fotonfluxus számlálásához ioítesesátbít kamera rendszert (Xenogen, Alameda, CA) alkalmaztunk egy orrtölcséres :Muofifr ádágei» fenstaffét és fűtött táloávil a testhőmérséklet fenntartásához. Az eredményeket 2-42 perces expozíció után elemezi ük a Xenogen képalkotó rendszerre! szállított living Image szoftver segítségével. A jelinteozitást az összes észlelt fotonfluxus szám összegeként kvanibkiiuk egy az adatok utófeldolgozása során kézzel kiválasztott egységes vizsgált területen belül. A normaíizált fotonfluxus a beoltás után és a beoltás előtt észlelt fofohiüxusí arányát jelenti minden héten. BMísztiké éMmzék Az eredményeket középidők ISO formájában mutatjuk be ¢.: legalább három ismételt: egyedi kísérletben osopotÄ A:,ÂtMkal:#lém» zésekhez i ti öMM-im verziójl} SPSS: szoftvert használtuk, Jk mintacsoportok is molekuláris paraméterek közötti korrelációkat a Flsher-egzakt teszttel vagy független mentákra szolgáié egytttas ÂOVÂ-vei iszÉmftottuk- Egy ^CLÖS-os: p-értéket szignifikánsnak tekintettünk. M í&amp;gtobh emit mjtv&amp;paí tartalmaz ÄLDEFLUOR-pozitiv pmpiMciêt Az ALDEFLUOR tesztet (17'» alkalmaztuk CSC ízo!|Í|s|ra 33 BCL-bői, amelyek az emlőrák különböző molekuláris aitlpg^alfiéspílömz^liröpez^ptáíták (20). Azt találtuk, hogy a 33 sépvonaíhol 23 tartalmazott ALDEFLUOR-poziUv sejt populációt, amely 0,2%-tól közel 1GÖ%~íg terjedt blind a 13; hazáíis/mezenohímáíis BCL tartalmazott ALDEFLUOR-pozitív populációt, míg a 12 íumináíis BCL közül 7 nem tartalmazott kimutatható álOlFtUOR^pazitlv iijfeket Íp^O jOOBj Físber-egzakt teszt).
Az ALÚERLU€^$®zítM dagamtképző képmmgs van. Azt már koráb ban leírták, Hogy az emlő epiteiiiiis őssejtek és a progenitor sejtét képesek túléím, es szaporodnak nem tapadó feltételek közöt, és lebegő gömb alakú telepeket képeznek, amelyeket mammoszflráknak nevezőnk (18). Emlőtumorokból; valamint sejtvonaiakból nyert adatok áitlhütáiák, Hogy rak őssejt-szerű sejtek, vagy rák-kezdeményező sejtek Is izolálhatok és Ivartalanul szaporíthatok Jágánátszferák” formájábanhasopiő tesztekben (28). A normái humán tejmíngyben lévő minden mammoszférá-kezdeményezö sejt ALOEFLUOR-poziflv populációban van (17), A BCL ékből származó ALDEFLUÖR-pozitív populáció jellemzésére a 184A1, S1Â14Ï és iUMIlé ALDEFLUÖR-pozitív és *. negatív populációinak daganatszféra képzésre való képességét hasonlítottuk össze. Minden egyes sejtvonalban az ALDEFLUÖR-pozitív populáció nagyobb daganatszíéra-képző képességét mutatott az A t D EFtUO R~negatív sejtekhez képest.
Az ALDEFLUOR-pöziíiv 8CL sejtek in vivé rák őssejt túiajáonmgtmk A BGL hierarchikus szerveződésének meghatározásához az MDA-MB-453, SUM lilpvalarhlnt a ÍROA^M2FOí sejtvonalák A L D E F L U G R - pozit ív és -negativ populációinak az őssejt tulajdonságait analizáltuk. Ennek a három BCL-nek az ALDEFt.UOR-pozitiv populációI alkotják a ta|es sejLpopulációk 3,54±1,73%-ától az 5,4903,36%-áig terjedő mennyiségét (1A-B, G#t ihrapÄ# ábra). Amint az IF, L ábrán látható a fumorképzödés mérete és látenciája terretii a ieíeoskendezéi ALDEFLUOR-pozilv sejtek számával, Figyelemre méltó módod 500 MPA-MÍMÍ3 ALDEFLUORrpozitív sejt és 1008 SUívU 59 AID E F l, ü O R-pöziLv sejt képes volt daganatképzésre. A tumorképzö képességet sorozatos passzáiással tartottuk fenn, demonstrálva e séjfék öőmegújító képességét Ezzel * kimben, ALDEFLUORmegativsejfek nem generálnak tumoroka!, bár korlátozott növekedést ártok eL amikor iO 00Û AiRFFbUOR-negatiy MDA«ys*4S3 mf&amp;k fecskendez» tünk be- A zsírpárna szekciók NIE festése megerősítette, hogy az ALDBFLUÖR-pozjtív síitek áltál gehérâit tumorok rosszindulatú séjfekst Itrtilmrtak, amíg csak az ALDELFUÖR-négaiív sejt injekciók helyén csak maradék: Matngeíií, apopíotíkus sejtek ás egér szövet volt látható (1 Ef lé ábra). ÚmzMmbm mmf bogy az ALpEFLUÖFbpozltíV populációnak rak őssejt Jellemzi! vannak, az Ilyen populáció által generált daganatokban megismétlődött az eredeti daganat fénoipusos heterogenitása, az ALDEFLUQR-pozitív és -negatív sejtek hasonló arányával (ábra. IC, 1). Ez azt jelzi, hogy ALDEFLUOR-pozitiv sejtek képesek voltak önállóan megújulni, ALDEFLUOR-pozitly sejteket generálni, és képesek voltak differenciálódni ÄUDEFLUOR negatív sejteket képezve.
Amikor BfOavyz-01 sejteket szétválasztottunk ALDBFLUOR*poziÍv ás -negatív komponensekre, akkor mindkettő: képes volt tumorgenerálásra. Az AIDE F L U O R-pozit ! v populáció által generilt daganatok mind AlDEFLUOR-pozitiv, mind -negatív sejtekből álltak, megismételve a kezdeti tumor fenotipusos heterogenitását. Ezzel szemhén m ALPEFLUÖR-negativ sejtek által generált tumorok lassan növekvő tumorok voltak, amelyek csak ALDEFLUORmegalív sejteket tartalmaztak. Az ALOBFLUOR-pozítiv sejteknek a sorozatos transzplantációra való képességével szemben az ALDi.FLÜOR-negatív tumorok sorozatos passzálisa lecsökkentette a tumornövekedésit, és három passzáíás után nem is volt növekedés. Ez azt sugallja, hogy a BRCA-MZ-öl soítek ALDEFLUOR-pozitlv komponense őssejt tulajdonságú síteket tartalmaz, amíg az ALDEFLÜOR-negativ sejtek olyan progenitor sejteket tartalmaznak, amelyek képesek koríitözoian növekedni, de nem képesek önmegújításra.
Az AlDELFUC^pözítm és -negatív sajtpopuMdók géPkiMj&amp;zéáésének pmftlaBm-tám< Annak megállapítására, hogy vajon a különböző BCL-ekből izolált ALDEFLUOR-pozitlv sejtek közös „rák őssejf gint fejeznek-e ki, nyolc BCL-ből (184A1 BRGA-MZ-ÖI, H001ÍÖ4, MDA-IViB-231, MDA~MB-453, SK-BR-7, SUM49, és SUM1ÜÍ izolált ALDEFLUOR-pozitlv és -negatív sejtpopulációt analizáltunk Asymetrix teljes genom oíigonukleatid mlkmáítiydit Felügyelet nélküli hiemrchíkos klaszterezást alkalmaztunk a 16 mintára is a 11550 szirf génte/EST-fe* ami nem különítette el az ALDEFLUÖR-poziív is -negatív populációkat. Ehelyett az AlpEFlUOR-pozltív és -negativ popylicí-ók a szülői sejtvonallal kíasztenzálódtak. Ez azt sugallja, hogy a kionáis sejtvonilak |o-zött az mRNS Iranszkriptekhen lévő eltérések az AtDÉFLUOR-pozitív és ALDEFLUÖR» negativ sejtek közötti rn^étémk helyébe lépnek. iz mvabbá azt sugallja, begy a feltété lezeti: rák őssejtek és azok utódai kőzett csak korlátozói számú gén fejeződik ks eltérd- en,
Annák meglatározására* hogy mely ginek különböztetik meg az ALDEFLUOR-pzlfy és 'neptíy pepúlácidkaf, a Mann és Whltney-tiié Ü~íeszieí alkalmaztuk az alacsony mértéke és rosszul mái ózpUssziójú fének kivételévé! az összes genre, azaz 25 285 próba készletre. Ez a teszt FDR körrékció után azenesitett és rangsorolt 413 géni ÍST~et, amely rHagkä|inb§^etti M: ALDBFkUÖR-pbzftiv és -negativ sejtpopyla--oiőkát, Az egyedi géneknek megfelelő 23 ló lexp rosszéit gént az. 1. fáblizatban mutatjuk lé, és a leggyakrabban sloiexprésazált gének a % táblázatban szerepelnek. 1. TÁBLÁZAT ~ Feisxabályoxott gének
>>
Ennek a dlszkrimináíő aláírásnak az osztilyezásl ^gptüilluazIrâlj'Q. b 4W difié-rondákén expresszáiödó génnel/EST-iei fibdáfké&amp;ö 16 ALDEFLüOR-poätiv és -negatív Minta osztályozása. A 16 rmnla közi! IfN^hierarchíkus klaszierezés rangsorolt (2A ábra).
Az Isa# bíolégíéhin Ismerlsn szerepet látszó számos gén az ALDEFLUÖR-pozitív populációkban feiuiszabáiyozott volt (1, táblázat)* beleértve az NEVA, NÛÎCH2, PCNX, RBM15, ST3GAL3 és a TPÍKLpinokát igpb gének olyan fehérjéket kódolnak, amelyek feltételezett vagy pem jellemzett izarépef játszanak az os-sejt működésé bért például az ARIIMÉ, RAfpILt, és a kemokln receptor ÇXCR1/IL8RA fehérjék; i(27), ALDEFLUGR-pozíiív populációban alulexpresszáií gének részt vesznek a sejtdifferenciálódásban, az apoptózísban, az RNS splloingben, ás a mitokondriális metabolizmusban.
Az elemzés szigorúságának fókizására a Mann és Whitney elemzés küszöbértékét megemeltük a 0,5~os keokázai szintre, ét így kaptünk egy az AL DEL FLUOR-pozitív és »negatív populációkat megkülönböztető 49 gérFEST listáját (az 1-2, táblázatokban csillaggal jelölt gének). Ezzel a listával az IR-iR^ kivételével az összes ALDEFLUOR-pozítiv Söjf egy csoportba került. E 49 gén/ESf között 45 azonosított egyedi géneknek felelt meg; a 45 közül esak 3 volt fúlexpresszált az ALDEFLUOR-pozitiv csoportban, míg: 42 alüíéxpresszált volt. A jellemzett túlzottan kifejezett gének a FBX021 és CXCR1/IL8RA F-box fehérjét kódolják. Az aluiexpressziíf iánek iizé tartoznak a mltokondriiiís fehérjék (MRPL41, MRPL42, MRPL4A lRRLi4s RÍRPS23, jMtöFIL}, m fmCA) és a pre-mRNS splicing faktorok (LSM3. PRPF39 és PRFF4B premiRXS feldolgozási faktorok), Hagyj-kí-egyet-koreszt-valídálással (LOOCV), 0,5% kockázat mellett becsültük meg az azonosító moleküllfis alllrás előrejelzésének pontosságát, és a minták 88%-át jósoltuk az ezzel rendelkező helyes csoportba ; a felügyelt elemzést Igazol va. MÄtilÄt &amp;röstiii meg a CXCR1 és az FBX021 jelentős növekedését az ALŰEFLUöR-pözitív sejtekben. Az ALDEFLUÜR-pozitív populációkban túíezpresszlíidoít bt diszkriminátöf gén (CXCR1/IL8RA, FBXÖ21, NFYA, NOTCH2 és RAD51L1) kvantitatív RT-PCR analízisét végeztük el, A profiíafkofási analízisben használt három sejtvonalát: IBRCA-MZ-üt, E1DA-MB-463, SUM 159} és két további luminéiss sejtvonalat (MCF7, S68) válogattunk szét ALDEFLUOR-tesztfei áraz AtDEFtUOR-pozitív és negatív populációkat külöa-kOiőn dolgoztuk fai kvantb latié RfRPGRcanalízishen. Λ CXCR1 és FBX021 k^ântlMIv RT-ECR szetinf éxpresstiös szintjeit "mutatjuk be a 2B és; € ábrán, A kvantitatív RX-P€R-reí mért: genexpressziés szinték megerősítették a p:Ni: mlkroarray mérések alkalmazásival: kapott eredményeket a CXCR1 és F8X021 mRNS szírit emelkedésével az ::Ä:LDiFk:UÖR"pozitiv: pöpuláeiiban az ALißFLtiOR-nsgatlv pópiiSáciöboz képest tp<ÖXiÖ},
Az ÍL8 eíúmgM m fék ő$mji ênmegùpMsàL M profílalkotásl vizsgálatok azt sugallták, hogy m. ILS receptor CXCR1/IL8RA következetesen ekpreaszáíodlk: az ALPRFkUÖR-pozítiv sejtpopulációban, Ennek az összefüggésnek az igazolására a CXCR1 /IL8RA fehérje expresszióját áramlási ctometnavai mértük AL DE FLUOR-pozitív és -negatív populációkban. Négy különböze sej hónaiból származó ALDEFtiiOR-pozitIv és -negatív populációkat FACS-szal Izoláltuk, fixáltuk, és egy íikoetitnnnel jelzett: CXGR1 monokionális antitesttel: féltettük meg> Amint azt a 3A ábra mutatja* az ÁbRlFhyOR-negatív populációval Összehasonlítva az ALDEFLUOR-pozitiv sejtekben nagyon feldúsultak a CXCRI-goZífy sejtek.
Annak megállapítására, hogy vajon az IL8 jelátvitel fontos-e az őssejt működésében, négy 8CL4 kezeltük humán rekombínios: flJReal, hogy meghatámzzuk: annak hatását a rák őssejt populációra, a daganatszferák képződésének, és az ALDN eozimaíikys aktivitás mérésével. Amint azt a 38 ábra mutatja, az ILi hozzáadása dozisfOggö módón megnövelte az elsődleges is másodlagos fumorszAérák kialakulá-sii Az Ibi ezenkívül dozis-függö mádon növelte az ALÖEFELtöR-pozitív populációt mind a négy vizsgáit BOL esetében |ID ábra). Ez mutatja a ,,GSC aláírás" erejét m olyan útvonaiii izonoslfciban, amelyek szerepet játszhatnak az őssep működésben, M íLBáCXCR f tengelynek szerepe van a rák őssejt invázióban. Az IL8/CXCR1 tengelyről leírták, hogy szerepet játszik a rák őssejt invázióban (28, 28). üvlafngel invázióé tesztet alkalmaztunk, ait r a ktá ns ként szé ru m öt felhasználva három: különböző séjtvonal IHCG1954, MDA-MB-4S3; SUM159) ALDEFLUOR-pöXitiv ás -negatív sejt-populációi invázióé képességének vizsgálatára, Amint a 4Á ábrán látható:,: az ALDEFLUÖR-pozitiv sejtek 8 -20-szor magasabb inváziót mutattak a yatrigelen keresztül, mint az ALDEFLUOR-aégatlv populáció (p<0,01 ), Amikor kemo-attraktánsként: egy IL8~at (100 ng/ml) alkalmaztunk, akkor az megnövelte az ÂLPEFLUOR-pfôzil;i¥ :séit^k invàzfôpf: |p^i,;8i| (¾ ábra). Az fili, a! ALPiFUMR-pozitív sejtekre lyáteoll fatálával ebemben semmilyen hatással earn volt m. invazív képességére. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a rák őssejtek invazív viselkedést mutattak, továbbá azk hogy az IkS Ä|kitiy^ nyítl ezt a miyamatgí.
Az ÂL^BFLUB^oiitiv B^iBk rm§riövek^&amp;B^ :m&amp;im^Mus\:pQiim^^<mÊiF· nak. Azt feltételeztük, èogy a C8C~k döntő szerepet játszanak a daganatos áttéteknél (30, 31 ). A fenti kísértétek igazolták; hogy az AtDEFLUOR-pozitlv sejteknek megnövekedett m Invazív képessége az ALDEFLUOR-negatív sejtekéhez képest. Az ALDEFLUOR-pozitivHás és a metaszíatikus képesség kapcsolaténak meghatározáséra HCCi954-et( MDA-MB-463-at, és SUM 159~eí fertőztünk iuciferáz lentivlrus riporter rendszerrel, Luoííerázdertiz® sej^k^ vpógattunk ALDEPLUOR teszt ai» kalmazásávak és NOP/SCID egerekbe vittük be inirafeardialls injekcióval. Minden egyes populációból 108 000 sejtnyl szuszpenziót fecskendeztünk he, és az áttéteket ösolumíneszcens képalkotással mértük fok Az ALDEPLUOR-pozitív sejtekkel beoltott egerekben különböző helyeken alakultak ki áttétek, és magasabb fotonfluxus kibocsátási mutattak, min! a nem szeparált sejtekkel beoltott egerek, arrMtpknii: egerem áttét alakult ki, vagy m AkDEFLUÖRmegstiv sejtekkel oltott egerek, amefyékhéh csak alkalomszerűen alakult ki nyirokcsomókra korlátozódó áttét (4B-J ábra). A hisztölógíaí metszetek, megerősítették metasztázisok jelenlétét ezeken a helyeken (4K-M lhra}< így a BCL-ek áttétképzö képességét túlnyomórészt az ALDEFLUOR-pozitlv populációban lévő CSC-k közvetítik, A hipotézis, hogy a daganatok a CSC-k által kialakítói céllulárls hierarchiába vannak szervezve, alapvető hatással van a rák biológiájára, valamint a rák korai felismerésének. megelőzésének és kezelésének klinikai: következményeire. A CSC-kre vonatkozó bizonyíték nagyrészt elsődleges és korai ámított xenograft modellekre támaszkodott (32-34). Azonban az emíőtumor xenogmi létrehozásának sikere alacsony volt, különösen bizonyos molekuláris altípusokéit. Ellentétben az elsődleges tomorökkai iepvermlák Korlátlan mennyiségben állnak rendelkezésre, és csak a normái szövet és strórna niíkül rákos populációkat szolgáltatják a molekuláns analn zishez, A mellrákban, számos halhatatlanná tett sejtyonalt állítottak elő, amelyek képviselik elsődleges humán méílrákhan megtalálható különböző molekuláris altípusokat (1, 28), Azonban alapvető kérdés továbbra ís az, hogy ezek a sejtvonalik
•äC mennyire köze? képesek megismételd az emberi mellrák biológiáját. M wm êimiayitèkok őssejteké mjtmn&amp;MkèÈn. Újabb vizsgálatok alti utaltak, begy bár' a epjWogplakatttetiet kloniltSio ázármazfatnk azok egy olyan oelíuiáns: Na* rarcbtit: ta:rtáteazpakí: amely a ceílulárís differenciálódás különböző szakaszait képviseli. ^8^si:-vi3^gáJat.|||ka|iiTiÉKS0tÍi markereket, például 0044+/0024-- markerekeí a mellrák sejtvonaiakban CSC kimutatására;, Azonban, azok hasznosságát korlátozza az a megfigyelés, hogy egy sejtvonalen leiül a sejteknek gyakran nagy százaléka fejezi ki ezeket: a feltételezett őssejtmarkeraket. A hazális emlőrák sejtvonaiakban például a sejtek főbb, mind: 90%-ának a fenotípusa CD44+/CD24-. Lalájában a CD444-/©p24<v fenotipus nem Izolálta ezen sejtvonalak tumorképző populációját (Ginestier et aL Cell Stem Cell '1:556-567), Egy alternatív megközelítés az volt, hogy használjanak sejtvonalbői származó SF~t. Azonban a Hoechst festést alkalmazó fenkoionálís ylzsgálatőkat korlátozza ennek a szernek a toxicíiása (35). Arra is van bizonyíték, hogy a funkcíónálls őssejt tevékenységet nem tartalmazza az SP (36). Az ALDE FLUOR teszttel fáimért ALDH aktivitás őssejt tulajdonságú sejteket Izolál különböző rákokból (14, |?)> Ebben a példában kimutattuk, hogy 33 8CL közül 23 (túlnyomó részi hazális sejtvenaiak} tadalmaz ALDEFtyOR-pozitiy populációt Az: AtDEFLUOR-pozltiy populáció hiánya luminals BGL-ekben azt jelezheti, hogy ezek a luminális BCL-ek ÁLD F F L UOR-negat I v progenitor sejtekből származnak;
Ezt példát alkalmaztuk invivő vizsgálatokban HÖp/SCID egerekben arra, hogy bizonyítsuk az ALDEFLUOR--pózitlv populációk Őssejt tulajdonságait Az önmegújítást NÖD/SCID egerekbe való átoitássaí demonstmlek, és a differenciálódást az AIDE F LUOR -pozitív sejteknek meglévő, de az AtDEFLyQR--negaiíy sejteknek fik Éhpö, â tumor kezdeti celluláris heterogenitása regenerálásának képességével be zonyltoítuk.
Egy nmlíták őssejt aláírása. Ez a nyolc emlő sejivonalaí alkalmazó példa 413 olyan gént azonosított., amelyek expressziója megkülönbözteti az ALDEFLÍJOR-pozliy is -negatív sejteket. Ez az aláírás számos olyan gént tartalmazott:, amelyekről imert, hogy szerepet játszanak az őssejt biológiában. Az AIDE F L ti 0 R-pozíf iv po pu-lációban tóiexpresszált gének közé failozÉ a Notoh homolog f (NÛÎ0H2| amely szabályozza az emlő őssejtek önmegyÉlsát és díffereneiálédásáf (13, SS}", az NFYA-f, amelyről ismert, hogy szabályozza az őssejtek önmegújítását és differenciálódását (39,40), a PCNX pecunex homológ, az RBM15/C3TT, áméíy pieíotrőp szere- pet játszik a hematopoetlkus őssejtekben (41), és hatassaii van $ niféléll dllfirehdja-ft|p. | NOTCH jelátvitel útján (42}, * TPRXL hümeob@$«erÖ taktet, amely az embrionális fejlődésben szerepel, az ST3GAL3, amely égyiláriiur^pé^toambfc onlÜs a?iiígém4sSZintázt lédet és a magzati fejlődéshez, valamint a vese és a gyomor karejnogenezisehez kapcsolódik (43). Ä sfádiumspocífíkus embrionális antigén 4 íohége (SSEA-4) osse.t populációkban különösen expresszálódsk, így a CXCR4+/CD133+/CD34 +/ljn* őssejtekben humán köidökzsinórvérben és nyy|aimii állapotú emiő őssejtekben (44)
Az ALDEFLUOR-pozitív populációban éfulexpresszált ginek vesznek részt a sejbdifferénciáiödásban, apopfózíshan, RNS splioinghen, és a mltokondriáiís oxidációban. Ízek közé a gének közi tartoznak s NACA naszcens polipeptld-asszocláit komplex alfa-alegységei kódéin a PDCÖ5 és PDCOIO programozott haléi fehérjéket; kódoló, az L41 mítokondriális ríboszomijis fehérjéi (yRPt4i) kődolő gin, amely apoptcjzist Indukál pS34ól függő és független módon BCL2-n és kasxpazokon keresztül, valamint a mltokondriáiís folyamatokban, így például az oxidativ íoszfotilációban (NDUFA2, ATP5J2, IMMPU) és a milokondriumban lejátszódó lé-hiljélzíntézjében (MRPL42, MRPL47, NIRPLS4, fVtRPS23) részt vevő fehérjéket kódoló gének. Az apoptotíkus ginek lefelé szabályozása a CSGM<ben szerepet játszhat ezeknek a sejteknek a sugárzással is a kemoterápiával szembeni élíenállásáhan (45,46). Az ALOHi A1-“et nem azonosították differenciálisán expresszált génként az ALDEFLUöR-pozítiv aláírásban. Az egyes BCL-ek genexpreaszíős profiljának vizsgálatánál azonban kiderült, hogy bár mlhány eltérő ÁLON 1Ä1 expressziét mutatott az ALDEF'ÜJOR-pozitív populációban, misokban az ALDH egy másik ízofermpriak, az AbPH 1 A3 exprosszlója volt eltérő ebben a populációban. Ez árra utal, hogy a különböző ALDH izoformok expressziója hozzájárulhat az ALDEPLUQR-pozltív fenotipushoz,
 kemokinekfől a ,ßim^okm&amp;ki§,-$m ILS egyik reoeptemnak, a CXCRi-nek a ke fsjeződése kilönbözö rákokban megnő (47-50), Bár az ILS expressziója ER-negatív emlőrákkal van kapcsolatban (51), erről Aianiokínrőt korábban nem számoltak be, hogy szerepet játszana az őssejt riiködésbeh. Az androgén-független prosztatarák növekedésének és áttétképzésének szabályozásában levő szerepe megfelelően tisztázott; pl), Ezenkivüi az ILS expresszíoe szintje a VEGFRermeiés és az ánpogéniiíe révén kapcsolatban van tumorképzéssei és az áttétekkel (53, 54). A géoexpressziős adatokat Mrorn módon valiőáítuk.. ε$Μ$&amp;· kvantitatív RÎ-PCE-elemzés erösÉette meg a CXCR1 ir.RNS növekedését mind a proiiiozisha bevont. mM i Hédi bevont sejtvonaiakbol származó ALOEFLUOR-pozitív populációban. Másodszor, Ipmiási élemetélpal izpnyltoiuk, hogy CXCR1-tartalmú sejtet kizárólag az ALDEELUÖR-pozitiv ^üfàÂMïi^^iUïikéHamiaiis^ra®· rekom binons ILS megnövelte a m-ÉÉtmoszférák:képződését és az ALOERLUGR-pozliv apjtak arányit a BCL-ekben. Az IL8/CXCR1 tengely tehát az emlő őssejt prplifetiólót vagy az ön* megújulást látszik szabályozni. Minthogy az eodoteffllli és sztrórnális sejtek szekretáinak IL8-at, ez a kemokin szerepet látszik játszani a daganat őssejtek is a tumor míkrokörnyezete közötti kölcsönhatás környezetében. Újabb vizsgálatok az Interleukineknek/kemoklneknek a CSC szabályozásában; lévő szerepére utaltak (55: 56). Ez magában foglalja az IL-i szerepét az emlő CSC-kben és az l!~4 szerepét a vastagbél CSC-k kemorezisztenciájának közvetkésében pB-Sá). izék a tényezők szerepet játszhatnak a gyulladás és a rák közötti kapcsolatban. Ez maiiban foglalja a CCLS IRANTES) egy szerepét J|,: amely egy a mezenchlmális őssejtek által szekreíáít kemokin; amely ügy működik, mint egy párákon faktor, és fokozza a mellrák-sejtek motillását, invázióját és metaszíázísát (SS).
Az âitêMk gy®k&amp;m> Ά CSC-k lehetnek felelősek a tumormeiaszíázís közvetítéséért. A CSC és a metasztázls közötti kapcsolatra először az utalt, amikor őssejt géneket azonosítottak egy 11 génes aláírásban, amelyet a prosztatarák franszgéníkus egérmedeííje és rikhitegek áttétes és elsőd leges daganatai összehasonlító pmafítjá-nak felhasznilÉsivat generáltak (60). Ez az aláírás erős előrejelzője is a betegség kiújuiásának. a kezelés utáni halálnak is a távoli áttéteknek különböző ráktípusokban. Ez a példa azt bizonyítottá, hogy az ALDEFLUOR-pozitlv sejtek sokkal; metasztafikusabbak, mint az ALDEFLUOR-negatív sejtek, és hogy az 118, amelyről korábban jelentették, hogy szerepet játszik a daganat rnetasztizisban:, elősegíti a grefereneiiilsan ez Ibi receptor GXQRI-eí expressziíi rák őssejtek invázióját és kemotaxisát Az áttétes rák Őssejtek sejivonafakbőí való izolálás! képességnek segítenie kel azeknak a molekuláris mechanizmusoknak vizsgálatát, amelyekkel a rák őssejtek közvetítik tumor mitasztázísi 2> PÉim CXCR1 gátlás és kombinációs terápia
Ez a példa bemutatja a különböző alkalmazott módszerekéi a CXCR1 tomöfsejfekra kifejtett, valamint a CXOR1~nek egy antbmltoiikus szerrel (docetaxel) 'kombinációban kifejtett gátló hatása tesztelésére. ,4 ÛMQR1 gátlás hatása a sapek pômkedèsêm^ és a BUM 159 sejtvonal ALDEFLUOR-pozitiv populációjára, A SUM 159 sejtvonaiat tenyésztettünk adherens körülmények között, és a séb leket a CXCR1/CXOR2 inhibitor Repertaxinnai vagy két specifikus, CXCR1 -el vagy CXCR.24 blokkoló antitesttel kezeltük, 4 nap kezelés után a sejtnö ve kedésre gyakorolt hatást elemeztük az MIT teszt alkalmazásával (5A ábrái* és a rák őssejt populá-clora gyakorolt hatást: az ALDiFLUöR teszt felhasználásával (SB ábra). Több, mint 95%~os sejtnövekedés gátlást figyeltünk meg a Repertaxinna! vagy a CXCR1 blokkoló antitesttel kezelt sejtekben, míg nem figyeltünk meg hatást a CXC R2 blokkoló antitesttel kezelt sejtekben (5A ábra). Érdekes módon hasonló hatás volt megfigyelhető az ALPERLyOR-pOZitlv populáción a Repertaxinnai és a CXCR1 Ölekkelő antitesttel kezelt ALDEFLUOR-pozltlv populáció rendre 80%-os és 50%-os csökkenésével (§B ábra). Ά Rap&amp;rtmp FAS/FARAigandumpfáMíaíM kűzv&amp;UMt bystander tm~ fást indukál BUM 169 sejtvonal sejteket tenyésztettünk adherens körülmények között, majd kezeltünk Repertaxinna! önmagában vagy kombinációban egy FÁS anfagonistávah Érdékes, hogy a Repertaxin kezelés által indukált sejínőveketíés-gáflás részben elmaradt a FÁS antagoniste ja nti/Fas-iigandurn (Cat# 556371) a BD Pharmingentöi] hozzáadásával. Ezenkívül a FÁS agonistával kezelt sejtek a csak Repertaxínnal kezeit sejtekéhez hásóhfö iéjthövekédis^gátláat mutatlak, izek az eredmények azt sugallják, hogy a Repertaxin kezelés FAS/FA$-!lgandum jelátvitellel közvetített bystander hatást indukál. A Regertaxm kezelés hatása a PAK\ AKT és FQXQA3 aktiválásra.
SV A Réperíaxln kezelésnek a való Palási értÉNill" séhez 2 napig, adherens »Élmények: kőzett 1:öö nü Réperiaxin jelenlétében vagy íávoiléíébeo és Immuriiyo^szcíeneiiyíl megférve SUfvi1ö9 sejteket! tényészleltünk p-FAK, pmrm FO mm elleni antitestekkel A nem:: kezek sejtekben (7A ábra): azt észlelték, hegy a p-FAK-ot expresszije sijlek |Ö%-a és a p-AKT-ct exprésszáió sej-fefclÄ-» inakllválási»ytáiöft:»lg. a Repertaxínnal kezelt sejtek a p-FAR és a p-AKT teljes inaktiválását mutatták (?B ábra). A rtem-kezelkSüyi SQ sejtek Búéiban veit a oimpíazrniöan FQXOA3, Érdekes módon a Repertaxinna! kezeit Çlflii 169 sejtek 80%~a íartaímáZött a sejtmag FOXOAS-at Az FOXOA3 sejten beSéilíokalaeiéja a citopiazmábóí a sejtmagba jelzi a FOXOA3 fehérje aktiválását
Tummmv&amp;k&amp;dèM gêàik Reperiaxín, docetaxel vagy a kombinációs kezelést követően A Repertam docetaxel vagy ezek kombinációjának hatását értékeltük egy emlőrák eejtveoalra (8A, SUM1691 és kőlinböza betegekből generált három humán mellrák xenogratra (8B, MCI : 8C, UM2:iSrlD·, UM3)i ülődén egyes minta esetében 50 000 sejtet Injektáltunk NOD-SCfD egerek emlbzstrpárni|ábSj és figyelemmel kísértük a tumor méretét. Azilrpkeiólát ::ákkor: kezdtük, amikor a tumor mérete körülbelül 4 mm volt, A Repertaxint (15 mg/kg) naponta kétszerié napig, vagy hetente egyszer injektáltuk, a >dc>cetaxalt LP Injektáltuk (10 mg/kg) vagy a kombinációt IRepedaxin/dooetaxel) alkalmaztuk A i, ábra mutatja a tumorméreteket az egyes jelzett kezelések előtt és során (a nyíl a kezelés kezdete) A tumorméret statisztikailag szignifikáns csökkenésével hasonló eredményeket figyeltünk meg minden egyes mintára (SUM159. Ü01, UM2„ UM3) az önmagában adott oocetaxellel vagy a Repertaxin/Docetaxel kombinációval kezelt csoportokban a kontrolihoz képest fp<Ö,Ö1), míg nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget: a kontroll tumorok növekedésében, sem pedig a Reperataxinnal kezelt tumoroknál X Raperíaxm, doceiaxal, vagy a kömőmálf kemíésmkm f$k őss&amp;ji populáció mmB heBsa felméréséi az áWEFLUQR teszttel végeztük
Az AbPH aktivitást az ALDEFLUOR teszttel mértük fe! a rák őssejt populáció méretének elemzésére minden egyes Re pertax ínnal, docetaxellal vagy a kombinációval kezelt tumorban (9A SUM 158, 9B MCI, 9C UM2, 90 0M3), Hasonló eredmé nyékét figyeltek meg minden minta esetében, A docetáxékkezést temoi xeeggrastok ecetében m ÁtÖEFLUOR-pozltsv sejtek a ikontrellboz képes! veit arányt mutattak,őmlg a Reportaxin kezelés önmagában Yagy kombinációién a dneetaxeílel az ALDEFLUOR'pozitív sejtek statisztikailag szignifikáns csökkenését idézlek eio a rák Őssejtek §fMt8%>~os csökkenésével a kontrolihoz képest (p<öt01), A Rdpedaxm, zkmaiaml, mgy a Éwabméiikaz&amp;iémmka fák êmejip&amp;paÊéïén mié féímérését AWBFLiUÚR íamitaiéz méaoéiagm egerekbe mié yíZBzaőiíetéa-mi végezték.
Sorozathígitásokat készítettünk elsődleges tumorokból nyeri sejtekből (10A iUMISÍ, 1ÖS Wéé, 10C IJM2, 100 UM3), ameiyek nem voltak kezelve (kontroll), vagy Repertaxinnak dooetaxalíeí vagy a konminéeiévai voltak kezelve, és ezeket öl·· tettük be másodlagos NOÖ-SCIO egerek emIőzsIrpár nájá0a. A kontroli és a döéétaxel kezelt eisödieges tumorok minden hígításban képeztek másodlagos tumorokat, amíg csak a Reperatxinnal vagy doceíaxeiiel kombinálva kezeit magasabb koneetitréoíéjÉ elsődleges tumorok voltak képesek késleltetett másodlagos tumorokat képezni, ameiyek szignifikánsan kisebb méretűek voltak, mint a kontroll vagy a őpéétaxeíial kezelt tumorok ( p«0,01}. Sót, a kornblnáeíÉvai kezelt 1 000 és 100 elsődleges sejt nem képezett másodlagos tumort a 4-böl 3 minta esetében (SUM 159, UM2* UM3). A Reperfaxm kezelés csökkenti a SUM 1S9 sejtvonai maiaaziatíkim potenciálját
Egy SUM159 sejtvonalat fertőztünk luoiferazt expresszálő íentivirussal, és 250 00Ö lucHterázzal fertőzött sejtet oltottunk be NOD/SCID egerek szivébe. Az egereket két csoportba szerveztük. Az egerek 2 csoportját 12 órával az intrakardíális injekció után vagy s.c. sióidat injekcióval vagy s,c, iRépértaxió: injekcióval (15 mg/kg) kezeltük naponta kétszer, 28 napon keresztül. Az áttétképződést biolumineszcencia képalkotás alkiimazislváí követtük nyomon (11 B: Sóoidattai kezelt egerek; 11C: Rsperfaxional kezelt egerek). A heti intervallumokban a beoltást követően mért normáliséit fotonfluxus számszerűsítése a metasztázis kialakulásában statisztikailag szignifikáns növekedést mutatott a sooldattai kezelt egerek csoportjában, összehasonlítva a Repertaxínnai kezeit egerek csoportjával (11 A). % P§WÁ Rák őssejtek kezelése Ü.XCR1 blokáddal &amp; a pi($É;: iiüi^atráija: a GXCR1 gátlás hatását tumoreejtelm, -ftted Iá vite tesztekben, mind egér modellekben.
Smíőszövet disszodéiása. 10KH8Q&amp; g nádukdós amldmötétböl származó pór-mills emlöszövetet szikikkel feídarahöSfynk, enzimafikusan disszociáltak, éá az egyedi sejtekét szuszpenzióban tenyésztettünk, hogy ma mmo szférákat hozzunk litre vágy hogy agy kollagén szuhszf réten adherens körülmények között séjtdlterénelátö:-dást Indukáljunk (DöntuM ál. Genes Dev. 17:1253-1270).
Sejttenyésztés. Emlőrák sejtvonalakat tenyésztettünk ajánlott tenyésztési kié rülmények között (Charafe-Jaufref at al. Cancer Rés, 60:1302--1313). Em j őrá ksej tvo n a lat kezeltük adherens körülmények között repertaxinnai (Sigma-Aldrich).. PAS jelátviteli agenístaklnt antí-humán CXCR1 egér monoklonális antitest (Clone 42705* R&amp;D systems), anfNhuman CXOR2 egér monoklonális antitest (clone 4B311 s R&amp;D systems), anti-human CD95 egér monoklonális antitest (Clone DX2, BD Plwrilngpsl alkalmazásával FÁS jelátviteli antagonistaként antí-humán FÁS-íigandum egér monoklonális antitest (Clone MOK-1, BÖ Phamiingen) alkalmazásával vagy doeetaxeiíeí (Taxotere, Sanoíl-Áveniis}., A mjMt èi&amp;tkép&amp;ssège. Az .Iff teszthez a sejteket adherens állapotban 98-mérehelyes lemezakra azilesztettük, lyukanként SÖ90 sejtet. Egy nap éltekével indult a kezelés repertaxinnat. A mpertaxin kezelésnél a sejtek életképességére gpkomlf hatását külinböző ídőpöntökhan becsültük meg 20 pl IV1TÍ oldat (5 mg/ml PBS-ben) hozzáadásivál minden Syüköá. A sejteket ezután 1 érán |t 3? ;,C-on inkuháituk, majd hozzáadtunk 50 pl DklSO-t minden egyes lyukhoz. Az abszorbandát 500 nm-en mértük fluoreszcencia ! e m ezí eo I va sóvá I ( S pectraf I uor, Tecan). A TŰNÉL testhez a sejteket adherens körülmények között 8-mérőhe!yes lemezekre széfesztettük, lyukanként 50 000 sejtet. Egy nap elteltével Indult a kezelés repertaxinnai. Az apopotikus sejtek számit négy nappa! a kezelés után becsültük. A sejteket 3,7%~os formaldehiddel rögzítettük, és TACS TdT készletté! (RAB Systems) festettük, A sejh magokat ellenfestettük DAPI/antlfade-dal (Inyirogen). A metszeteket fluoreszcens mikroszkóppal (Leica, Bannockborn, IL, USA) vizsgáltuk, az apoptotikus sejtek zöld színben voltak detektálhatok. Â'Æ'AWËPWfâR tb$zt Az ALUEFLUDR· készletet (SternCél technologies) a nagy ALDH enzímaPkus aktivitású: populáció totálásá# használtok FACStarPLUS llectOR ®KÉÍn$gr# ÄatesÄlvhl :a koribban: leírtak fzennt pteestler et al, Cell fern Gell 1 :5ö|-68I)< M egér eréíiotö sejteknek a xenoffioikpSantáli tumorokból való eliminálásához a sejtpopulációt megfestettük anii~H2Kd antitesttel (BD Bioselenoes, 10200, IP percig légen), majd megtesfiluk egy fikoentannel jelzett másodlagos antitesttel (BE) (Jackson Labs, 1/260, 20 percig jégen). Áz MLíSA íeszt A repertaxinnai kezelt vagy nem kezeit sejtek tápközegében kF választott oldható BAS-ligandum ; szinfjlnek mérésére Human sFAS ügand Eiisá-t (Bender jiidlystims) használtunk. Az abezorbanciât egy spektrofotométerrel elsődleges hullámhosszként 450 nm4 használva olvastuk le,
Westam biot A sejteket taam?nlPpufíerhen iszáltuk, is SDS-polpteilamld fille vittük fel, A biotokat a megfelelő elsődleges antitestekkel TBST-ben (amely 0,1% Tiveeo20fets és 2% BSA-t tartalmazott) hígítva inkubáltuk vagy egy éjszakán át hoff); Vigy 2 órán át szobahőmérsékleten. A biotokat mostuk és megfelelő másodlagos antitestekkel (GE Healthcare, ÜK) inkubáltuk és SuperSignai West Pico kenvlumin» esxceneíás szubsztrátummal (Pierce) detektáltuk, ímmmfmfés. imnmnfiuoreszoeis festéshez kiválogatott CMCBIepozIfiv sejteket fixáltunk 95% metanollal »20 X-on 10 percig, A sejteket rehidratáltuk PBS-ben, és megfelelő antitestekkel inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 órán át Primer anlifes» tekként ROFAiCöi (1:50, Cell Signaling Technology), P-AKT-ot (1:300, Cell Signaling Technology)* és FOX03a~t (1:250, Cell Signaling Technology) használtunk. A lemezeket ezután mostuk, és inkubáltuk 30 percig PE konjugli másodlagos anfítesfekkeí (Jackson Labs). A sejtmagokat ellenfeatetluk iDAPI/anÄde-dai (ínvitrogen) majd fe-dőlemezzel lefedtük, A metszeteket fluoreszcens mikroszkóppal (Leica, Sanoeckborn, Ife USA) vizsgáltuk. Az ALMI (1:100, BD Bioseíences), a P-FAK. ΡΑΚΙ, PQXöla expresszld kimutatására immuhhlsztokémlal vizsgálatot végeztünk pamffinba ágyazott metszeten (Glnestíer et ai. Am, J Pathol, 181:1223-1233., a ta»· Mimányuhkhirteies egészében referenciaként téiíntjük), A festési a Histosiainplus készlettel (Zymed :D*aii^ÎiÎ!^bônai3id1nt (DAB) vagy 3-arnino~9~ etll'kad^azoit (AEC) használtunk kromogénként, és a metszeteket elienféstéttûk hematoxilínneí. Állati mode//. Az ÂtDELFÜORmQxitiv/CXCRl-pozitív is ALDEFLUOR- 1 δS) se jf eket NDD/SCID egerekben mértük (Ginestler et ah Cell Stem Geil Íá5ifN5@?|u &amp; SCMISO sejtvonai és három különböző betegtől (MCI, GMt, :UM3) g«Â három elsődleges humán mellrák xeoograftot használ· tunk mm» hogy meghatározzuk a répertaxlh kezelés hatékonyságát a tumornövekedésre (Ginestler et el. Cell Stem Call i :555-567). E tumorokból szármá-zb selteket ődotoglkysbő átültettük a humanizltt NGD/SOIP egerek feltlsztttol asm párnájába, in vitro tenyésztés nélkül. A zsírpárnákat a korábban leírtak szerint készé tettük (Ginestler eí ah Cell Stem Cell 1:555-587). Minden egyes xenotranszpiantátumbó! 50 000 sejtét Injektálunk humanizált NOD/SCID egerek em-lőzsirpámajábé is Sgyelemmel kfsirtök a tumor növekedését. Amikor a tumor mérete körülbelül 4 mm-es volt, álkor lezdtük a kezelést repertaxinnái önmagában (s.c., 15 mg/kg, naponta kétszer. 28 napon if j, doceíaxeliéi Önmagában (i,p.; 1Ô mg/kg, hetente egyszer, 4 héten keresztül), kombinációban (repertaxin/dooetaxel), vagy egy kontroll csoportnál söoidattaí ; (ip„, hetente egyszer és s,e, naponta kétszer, 28 napon Ml- Az illatokat eutanlzaituk, amikor a tumorok legnagyobb átmérője körülbelül 1,5 cm volt, a tumomekrözis elkerülésére és betartva a gerinces állatok kutatásban való használatának szabályait. Minden é|ps iryehíilf zsirpima egy részét formaiinban fkiítuk, és paraffinba ágyaztok hlsztölogiai anaílzisliez. A többi tumor sejtet üjm he-ültettük másodlagos NöD/SCIO egerekbe. A reimplantációhoz a sejtekből sorozaihi-gitásokat basználtohk 10 000, 1000 ás 100 sejt befecskendezésével minden egyes kezelt tumorba.
Nem-tapadó tenyészet Tapadó körülmények között repeftaxlnnal (100 nM), az antí-CXCRI antitesttel fTöpg/ml), vagy anh~CXCR2-yel (TOpg/ml) kezeit BCL-eket szélesztettünk egyedi sejtekként uitraaiacsony tapadású lemezre (Corning, Acton, MA) alacsony sűrűségben (5008 életképes sejt/mi). A sejteket a korábban ieirtak szerint hlyesztetfyk :|Cbaraféyauffrei et ai. Cancer Res. 69:1302-1313). A rákövetkező tenyészeteket az elsődleges tumorszférák disszociációja után uitraaiacsony tapadásé lemezre szétoszlattuk 5000 életképes sejt/mi sűrűségben. A sejtek tumorszferák iképzésére való képességét az első (elsődleges tumorsztérák) él a mi“ :Sodlk Ibtásodlagos tumorszfirákj:: passzllis után kvantifikáltuk. RNS exímketó êa^RT-Rsejteket kezeltünk, az üssz-RNS-t RNeasy Mini készlettel (QIAGEN) izoláltuk és válás tdejü kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR) tesztre használtuk fel egy ABI PRISM® 7900HT szekvenciameghalàrozô rend- szerben, A Tagman rendsziifÄ a íiboftidtókaf éi ® próbákat mz, Applied Biosystems weboldaláról (www d#;Apptisd:dpf::eoro) választottuk ki (FASdigandífeszt azonosító: Haj)0S99442_mi; lói faszt: iáebbsitó; HsJ)Ö1?4103 jrJn; TBP teszt azonosító:: Hs. 0042?Í2:D;;jai}:, A FAS-ligandum és az !LB rnRNS-ének relativ expressziós szintjét a IBP gén belső standardra nézve számítottuk ki, hogy az RNS minősége és a bejuttatott cDNS mennyisége Ingadozásira nprmallzájpnk a korábban leírtak ilifjnt (Ginestiar et al. Clin. CancerIkes. 12:4638-4544}. Áramlási atomeiriàs eiemzéz. CD44/CD24/Lln festést végeztünk £§inestier m aí. Call atom Coli: 1:665-68?}. ÇDS5/FAS festést antpaPió jelzett ABC (1:20, BD Siosoleneesi félóisznllásával végeztünk, A CXCR1 és CXCR2 festéshez az. an|p CXCR1 (1:100, Clone 42705, BID Systems) és antFGMS2 (1:100. done 48311, R<SD systems), elsődleges antitesteket követtünk egy F1:>vei jelzett másodlagos anti~ egér antitesttel (hígítás 1:260, Jackson Labs) való festéssel, Friss sejteket 1 pg/ml Pí~vel (Sigma) festettük δ percig az életképességhez. Vírusfertőzés. Két különböző ientivlraiis koostrukoíőt készítettünk a luciferáx géb expresszíójáhex (LeotPLyC-VSVCs) (Charafo-Jaoffref et ai. Cancer Rés: 69:1302-1313), és RTÍN expresszié gátlásához (LentbFTEN^STOS^DáPíe# (KOÉaÿi et el. PLoS ilölog:,, ?(e1000121), Minden lentivírus konstrukciót az Unlver-sity of Michigan Vector készített. A FÁK túlexpresszlöjához (Äd-FAK-GfR) Is alkalmaztunk agy adenovirus konstrukciót (Luo et ak Cancer Res. 89:468-474). A sejtek különböző yektorokkai vató fertőzését a korábban leírtak szedni végeztük (Charafe-Jauffret et al. Cancer Ras, a PsRed vagy a GFP-f expresszáié sejtek arányával igezolök;
Intrak&amp;rőiálís beoltás. Hat hetes MOD/SCID egereket érzéstelen siettünk 2% izoSoorinAevege keverékkel, és a szívük bal kamrájába 260 000 sejtet fecskendezz tünk be 100 μ! steril, Ca2+ és Mg2* nélküli, Doibecoo^lile RÍÍ-ben. A három sejtve-nal (RÇC19S4* MPVMB'463, IrlUM 169) mindegyikéhez, és minden egyes kezeléshez (sóoldaf vagy fepertaxin} hat állatba fecskendeztünk. Tizenkét órával ái Intrakarcliálís injekció után kezdtük az egereket naponta kétszar repertaxinsiai vagy a korfeiloknii sooidattá! Injekciózni. Bíüiümmeszmneíá észlelése. A kiindulási blolumineszcenaiát az oltás előtt és m oltásokat kövatóen minden héten mértük, A biolumineszoencía kimufafásre|árá^ sokat a korábban ieirfek szerint végeztük, (Charafe-daufíref et al Cancer Um. 09:1302-1313). A rmrrïïplizâlt tetoniexus a beoltás után és a beoltás etilt észlelt fotonfluxus arányát jelenti minien héten. Λ CXCRI &amp;xpm$$zió csoportokra osztja a rák őssé# populációkat A rák ossej-tekét (CSC) szabályozó sejt jelátviteli útvonalak azonosítása potenciális terápiás cél" pontokat ad egy sejtpopulációban. Génexpfésziós proílioxás alapján egy emlő CSC szabályozási útvonalakban potenciálisan résztvevő több gént tartalmazó emlő CSC aláírást azonosítottak (Charaíe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302--1313,). Az emlő CSC populációban iúfaxpresszált ginek kőzett az IÍ."3íCMCL3 prolnflammatorlkus kemokint kötő CXCR1 receptor tűnt Ígéretes jelöltnek, mivel a rekombináns IL-β síi-puláfta az emlő CSC megújulását (Gharafe-iauffrei et al. Cancer Ros, 89:1302-1313,), Áramlási oltomotna használatával mértük a CXCR1 fehérje expresszlóját az ALDELPyOR tesziol vizsgált H CCI 954, ΜΟΑ~ΜΒ-453 és SUN 159 humán emlőrák sejtvonalak emlő CSC populációjában. NOD/SCIO egér xenografokban funkcionális őssejt tulajdonságú sejtek voltak az ALDEFLUOR^poziív sejtpopulációban (Charate-Jauffret et al. Cancer Res, 69:1302-1313.), A CXCR1-pozitív populáció, ami a teljes populáció kövesebb, mint 2%~a szinte kizárólag az AtDEFLUOR-poziti'y populációban volt megtalálhatófék 12A ábra és a 4. táblázat).
_ 4. TAB LAZAT *BiauOR;%) GXCR1 CXC^5Ü0R ”
Imlőrák-seirvoeaisk HCC1SSZ 3:42 1,72 0,94
MDA-MB-4S3 4,22 Qß QM BUM 159 5,24 0.52 0,48
Rumârnëplérlk xersograftok MCI 12.3 1,81 1,32 UM2 8,4 1,23 0,88 UM3 8,? 0,84 0..78
A CXCR.2 expressziPlàt is felmértük, A CXCR2 egy olpn receptor, amely szlm ten kötődik az iiÄCiii^boz bár a CXCRIáiez összehasonlítva csökkent affinitás* sai. Ellentétben a CXCR1-pozitív sejtekkel, a CXCR2'-pozltlv sejtek egyenlően osztanak meg az ALDEFtUOR-pozliV ás ALDEFLUÖR-negPív populációk kőzett (id, 12A ábra). A rák ia#sf pepatÉclónék a CiCRI ixpresazió szerinti hierarchikus szerveződésinek meghatemzisahez ALDEFLUOR-pozitív/CXCRt-pozitív és ALDEFUJOR-pozlliv/CXCRIaiegatly sejtpopulációkat válogattunk szét és injektáltunk NOD/SGÍD egerekbe (Iclî, 13:, ábra). Mindkét sejtpopuláció létrehozott tumorokat. A tumprnöyekedésí kinetika korrelált a tumorkepződés íéíonoiájáva! és mértékével frs ÉeÉmskendazetl sejtek számával. 8-C. Az ALDEFLUGR-pozítty/CXCRI -peziivvpo-iullolO' által generált daganatok sorozatos passzáiással rokonstltuálták a kezdőt! tumor fenotípusos heterogenitását, míg az ALDEFLUOR-pozitív/CXCRI "negativ populációban csak ALDEFLUOR#oziíWCXGIi^negatív sejtest tartalmazó tumorok ]<>!-> tok létre. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a GGO eeíiuláris hierarchia a CXCR1 expresszié aíapján szerveződik,. ugyanakkor mindkét sejtpopulációban ha-son ló daganatképzö képesség jelenik meg Ä CXCRi blokád csökkenti a mellrák őssejt populációt ín vitro. Három különböző sejívonaiat kezeltük reperiaxinnai (100 nM), egy OXCRI/2-lnhlbitoîTal, hogy értékeljük a CXCRI biokád hatását a meií CSC populációra (Berlini et al. Proc, Natl. Acad. Set U, S A 101:11791-11796.). A SUM 159 esetében három napos kezelés után az ALDEFLUÖR-pozitív sejtek ötszörös csökkenése volt megfigyelhető (Id, 1.2B ábra). Hasonló hatiivett sejteknek egy antl-CXCRl blok koló antitesttel való kezelése után, Ezzel ellentétben, nem figyeltünk meg hatást egy anlHOXCR2 blokkoló antitesttel való kezelés utirg ami arm utat, hogy a repertáxin hatását az AtDEFLUOR-pozitlv populációra a CXCR1 közvetftetíe.
Emlótumoíokból, valamint sejtvonaiakból nyert adatok azt mutatják, hogy rák őssejt-szerű sejtek, vagy rák- kezd emé nyező sejtek is izolálhatok és szaporíthatok ,.daganatszférák'! formájában szuszpenziós tenyészetben (Ponti et ak Canoéf Rés. 65:5506-5511,). Repertaxínnai vágy az anti-CXCf?1 blokkoló antitesttel folytatott három napos kezelés után, amikor sejteket leválasztottuk, is sxuszpenzioban tenyésztettük. az elsődleges és másodlagos tumorszférák képződésének S-szoros csökkenését figyeltük meg a kontroliokhez képest. Ezzel szemben az antl-CXCR2 blokkoló antitestnek nem volt hatása a tbmorszféra kialakulására (Id 14. ábra),
Meglepő módon, a reperiaxinnai való öt napos kezelés után a teljes sejtpopuláció éléfképesséiének jelentős csökkenését észleltük az MTf teszt által fel mérve: amlkprlé a sejteknek csak 3%*a maradt életképes (ti, 12C), Hasonló eredményeket figyeltünk meg az arteCXCRI blokkoló antitestei, de nem az antí-CXCR2 blokkoló antltesifet, am! izf jelzi, hogy ai a hifii a CXCRI blokádtól függ. A reperiaxinnak ezt a hatasÉt kisleitetíe a sejtek életképességéoék három nappal a kezelés utárv kezdődi csökkenésé (Id. ISA ábra), A Repertaxin kezelés hasonló hatást indukált a HCC1954 rnnBtêk^mpiQmhm^Mîg nem figyeltünk meg: hatást a ΡΟΑ-ΜΕ-453 mb tekéi, amelyek RTE.N mutációt hordoznak {Hoiíestéile at ai Cancer Bis. 5:195-201.} (Μ, 34* 168 ~C, és 16. ábrák). TŰNÉL tesztet használva SUNII55 sejteket festettünk 4 napos repertaxín kezelés után, és a sejtek életképességének jelentős csökkenését figyelik meg, amelynek oka az apoptózis kiváltása volt, a mpertaxin t»É után kimutatóit 355§myi agpptofikus sejttel (id . T2D ábrá). ál efedményék azt sugalpk, hogy a CXCR1 blokád emlő CSC populáció csökkenésit éíldíPényszi, amit masszív apoptózis kiváltása követ a megmaradó tumortömeg populációban, ;&amp; CX@&amp;1 blokád sejthalált indukál a CXCRf-negalu B&amp;jtokbäo b^rnid&amp;rbmä-sop immsâêl Az a megfigyelés, hogy a fepertaxln vagy ez anfi-CXCRI blokkoló antitest masa ztv sejthalált ladikéit annak ellenére, hogy a CXCR1-pozitív populáció kevesebb volt, mint a teljes sejtpopuláció 2%-a, arm utalt, hogy a CXCR1 bio kád a a CXCR1-negatív sejtek halálát bystander hatáson keresztül okozta A válogatott CXCRi-pozitív ès CXCRI -nogativ populációkat repertaxinnal teéltük (id. 12E ábra). A regetíakln három napon belül csökkentette a: sejtek;életképességét a CXCR1-pozitív popujipiöban, míg semmilyen hatása nem volt megfigyelhető a CXCRI-negatív populációban, A ppéhákih: masszív sejthalált indukált az el-válaszíatían sejtekben, A repertaxín hatása az el; nem választott sejtek életképességére, és a CXCRI -pozitív populációkra dózisfüggd volt (id. 12E ábra). Az eredmé-nyek összhangban vannak a CXCRI-pozitív populációt célzó repertaxín kezeléssel ami viszont indukálja a CXCRi-negatív sejthalált a bystander hatáson kérésziül,
Arinak meghaiÉrozására: hogy ez a hatás vajon egy a repertaxín által Indukálf oldható faktor által közvetített-e, egy kondicionált tápközeget vettünk ki a CXCRI -pozitív populációból három napos repertaxín kezelés után, majd ezt a közeget dlalizáltuk egy 3,5 kPa kizárásé membrán fe I h a szná lásá va í d la I ízá ltok repertaxinnak a közegből való eltávolítása érdekében, megtartva a 3,5 kDa-náí nagyobb molekulákat. A dializáif kondicionált közeg á: sejtéi éíétképessigének masszív csökkenését váltotta ki mind a CXCR1 -negativ, mind a nem szeparált populációkban, Ée nem a CXCRI-pozitív popUliÉ^I»SEtí(ídi^:Í^|.. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a CXOR1 blokád a CXCRI -pozitív populációban egy oldható, nem-dlalizálhátö; faktoron kérésziül sejthaláit indukál a CXCRI-negativ populációban. Bár a CXCRI-pozitív populáció érzékeny a repertaxlnra, mégis ellenáll a dialízálható haláltényezönek. À. ®®l ÄÄÄI kiváltott bysíand&amp;r hatást FASáiganőum/PAB piéivítei közvetítetté, FAS-ügsndüm/FAS kölcsönhatást különböző fiziológiás állapotok aktiválják, mint például az emlőm irigy invoiúciö vagy szöveti sérüléséé állapotokban, be-leértve a liil^itiiipával indukáltakat (Chhípa et ai. J Cell Blochern. 111:61-¾ Song Of ah i » Invest 166:1209-1220 ), A repertaxinnal kezelt SUM1S9 sejtek közegében az oldható FA$~lígandum szintje EUSÄ vizsgálat alkalmazásával i ®· ligandurrfAS kölcsönhatás szerepének i CXGR1 blokád által kiváltott apptölkus bystander hatás közvetítésében való éftékétéséhez. Az oldható FAS-lígandum több, mint ötszeiisre nivekedii a négy napig repertaxinnal kezeit sejtek közegében a nem-kezeit sejtekéhez képest (Id, 1 TA Éöra), A FAS-lígandum rapertaxin kezeléssel való transzkripciós szabályozását a FAS-iigandurn mRNS szint mérésével RT^PÜR?·· rei iiegerösltittük (lé, í?B ábra). A FAS-ligandum mRNS szintjének 4-szeres növekedését figyeli! meg a repertaxinnal kezeli sejtekben, a nem kezelt sejtekhez képest, Hasonló eredményeket fgyeltünN meg egy a FÁS jelátvitelt aktiváló FÁS agonístávaí történt kezelés után, amely jelzi» hogy a FAS-ligandum a FÁS jelátvitel egy célpontja, pozitív feed-back hurkot létrehozva. A SUM159 sejtek 100%~a, expresszált FASrtehérjét, amint azi áramlási citometriával meghatároztuk; A SUM159 sejtek a FAS-agonistával történő kezelése reprodukálta a repertaxln kezeléssel megfigyelt ölési hatást a sejtek életképességének erőteljes csökkenésével (Id. 17C ábra). A rapertaxin kezelés hatását a sejtek eletképességére rléziégesen vis egy anti-FAS-ligandum blokkoló antitesttel, amikor a sejtek 44%-a maradt életképes a rapertaxin is antl-FAS-ligandum antitest kezelés után, szemben a 3%-keí esak repertaxln esetén (Id. 170 ábra). Az eredmények azt sugallják, hogy a reperiaxín által indukált masszív sejthalál oka egy a FAS-iigandumfFAS élvonal áltál kőzveitett bystander hatls. •A SUM 159 sejtek FAS agonlstával való kezelési rendre tízszeres és háromszoros növekedést okozott a CXCR1 -pozitív és az ALDEFLUOR-pozítiv sejtek arányában (Id. 17D/E és 18. ábrák). A repertaxln hatását egyik populáción sem szüntette meg anti-Fas-íigandum (id, 170/R ábra), ami árrá óta! hogy a C.XCR1 -pozitív populációt tartalmazó ALDEFLUOR-pozltív populáció - bár közvetlenül IrzékÉny a CXCR1 blokádra, ami viszont indukálja e sejtek FAS-ligandum-termeiését -- rezisz-tens á FAS-llgandum/FAS pro-apoptotlkus jelátvitelére. Ezzel szemben, az ALUiFLUOR-negatív ömlesztett sejtpopuláció nem expresszáija a CXCR1-et, de érzékeny a FASdigandum ital 4 FASttlgandum/FAS jeiátyleJ imiQ$Mmfü^t'ßUMk m. mÊuàÊfgf fevolioiöja során pong et ai. J Clin, Invest 106:1209-1220,), A CXCR1 .blokád hálásét vizsgáltuk redukeibs erafőptsaztikábe! nyert dumán Míbáf «tÄ :$pitélâ^p#&amp;r#*: Âiiri -âz a mellrák szonátákban megfigyeltük, a CXORI-pozitiu normális emtösepek szinte ttást§Íá§éM; ÄLDEFlUO^pÄlf pjpyfáoiébsirwltafe r^taláfbatöi (Id 1ÖA ábra), Annik meghatározására, hegy vajon: az M jeiatylei fontos-e á normális amié is* /progenitor funkcióban, szuszpenzíóbán tenyésztett normál amíi epifélsajfekei kezeltünk humán rekombináns IL-B-cal, és meghatároztuk annak hátasat a CSC populációra a mámmoszférák képződésének mérésével (Doniu ét ai. Genes Dev 17:1253-1270.) Al iys hozzáadása dózisfüggő módon írheghövefto az elsődleges és másodlagos mammoszférák kiaiakuiásál Od. 19i ,ibrá|, amf arra: utal, hogy az IL-S/CXCR1 tengelynek szerepe lehet a normális emlő őssejtek/progenitor sejtek proííferációjának, vagy öhmegf$úi|sánák szat>á!yoz:ásában. Som a repertaxin sem a FÁS agenista kezelés nem volt hatássát az adherens körülmények között tenyésztett normál emlő apiíeíiáils sejtek életképességére, még a reporta ö n magas koncentrációjú (500 py) használata mellei lém (id. 16A ábra), Azonham amint azt a mellrák sojfvonalakban megíiipitüíé az oidható FAS-iigandum növekedéséi mutattuk ki: m repertaxinnal kezelt normál emlő epítélsejtek közegében (id. 20B ábra). Ez a megfigyelés magyarázható a FAS-expresszíónak a hiányivai az ilyen körülmények között tenyéfztelnor^ sejtekben (Id, 20£ ábra}. Ez összhangban van azokkal a vizsgálatokkal amelyek azt mutatják, hogy a FAS-exprasszió az emiömírigybeo csak a szoptatás utáni Involúcíós folyamatban fordul elő (Song et ai. J Clin. Invest 106:1209-1220,), Ellentétben azzal hogy nincs hatása a normális emiő epiteíiálls sejtek ömlesztett populációjára, a repertaxin jelentősen csökkentette az e sejtek által képzett mammoszíérákat (id, 20C ábra).
Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az IL-8/CXCR1 tengely fontos szerepet játszik a normális és rosszindulatú emlő epiteíiálls essejt/progenítor sejt populációk szabályozásában és túlélésében:- Az ömleiiteft Sélfpöpüfáölök FAS-ligandum által közvetített bystander hatáson keresztai befolyásolási képessége kapcsolatban lehet a FAS-expresszio szintiével ezekben a sejtekben, X CXCR1 blokád hatásait a rák őssBjtekie e FAK/AKT/FOX03A útvonal kozvo-hl A CXCR1 egy olyan jeíltvlell ütvonaion keresztül hat, amely magában foglalja a * lokális adhéziós kinéz (FAK) foszforilácíót, és ez az AKT aktiválásit erMményezi (Waugh et al. Clin, Cancer Res. 14:6735-6741.). A C.XCR1 ÖiÖklíiának a FAK és AKT aktívádéra való hatása: értékelésihez: a FAK ès AKT fosÄrlil !e|ir||k szlhtjit Western-blottal mértük a Mmm Rúlirifé&amp;ző sejivonai esetében, A Sllktllïl és HCC 1954 esetében: a f AK Tyr3Sf és AKT Ser1'3 foszfonládo csökltenését észleltük a reperiaxinnai kezelt sejtekben a kezeletlen sejtekhez képest ami arra utak begy repertaxin hatásait a FAK/AKT élvonal közvetítheti (Id. 21A és 22, ábrák). Az a meg* figyelés, begy az IV1ÖA~lv18453 rezisztens a repertaxin kezelésre, m eg m ag y a rá zható a PT EN mutáció (919G>A) jelenlétével, ami aktiválja a RjBK/AKT útvonalat fBollestelíe et ai, i®i. Ganopf Mes, 0:196-201,, a találmányunknál teljes égiszében referenolaként teklnpl). Nem észleltünk módosulást a FAK Iyr3§7 is AKT Ser*-foszforilációban repertaxin kezelés után a MBAMBASBsejtvonalban (Id. 22, ábra). A FAKfMKT útvonalnak a CXCR1 blokád hatásainak közvetítésében játszott funkcionális szerepének Igazolásához két viráiis konstrukciót használtunk, az egyik a PTBN expressziét csendesíti el egy PTEN-shRNS-sei, a másik pedig túlzott FAK expressziőhoz vezet, A PTINIipld íoszfatáza révén antagonizálja a ΡΙ3-Κ/ΆΚΤ jelátvitelt (Vivanco et ál. Mat, Rév. Cancer 2:4§i-®61.). A PflN esendesiis AKT-aktiválást eredményezett, amint iát az AKT Ser473 íoszfoHláció növekedése bizonyította (Id. 21A és 22, ábrák), A PTEbi csendeeltis blokkolta a repertaxin kezelés hatását a FAK és az AKT aktivitására, A FAK túlzott expressziója is blokkolta a repertaxin hatásait, él jniuMlt egy FAK és AKT aktiválást, amelyet a FAK Tyr30' és AKT Séd173 föszforíláció megnövekedett expressziójával mértünk. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a QXCE1 blokád hátasait a FAK/AKT jelátadás közvetíti. tmmuniuoreszoens festésnek a CXCRT-pozitiv sejtekre való alkalmazásával megerősítettük, bogy a repertaxin kezelés a foszfo-FAK és foszfb-AKT expresszié drámai csökkenését eredményezi a kezeletlen sejtekhez képest (Id, 21B ábra). Az AKT szabályozza a F0X03A forkhead transzkripciós faktor aktivitását egy foszforiíezési eseményen keresztül, ami atoplazmlkus PÖX03A szekvesztrádót eredményez (Brunet et al. Mol, J Ceil Bioi, 21:052-965.). Ezzel szemben a FOXQ3A fi«ája átmegy a spjteagba, ahol transzkripciós faktorként viselkedik, amely szabályozza a FAS-iigandum szinfizisit (Jonsson et ai Nat. Med. 11:666-671.). A repertaxin agy FASdigandum által közvetített bystander hatáson ko-resztül sejthalált indukál' a repertaxin hatásait mm Jelátviteli útvonalon vizsgátluk imrmsnftuoreszcens Festéssel. A F0X03A a kezeletlen sejtekben egy cítopiazmatikus, lokalizációban voll jelen, de a repertaxin kezelésnél âtmgâzott a sejtmagba (Ici. 21B mmy iz az* jelzi, hogy a CXCR1 blokád indukálja FÖXOIA aktiviàsât a FAX/AKT útvonal gátlásán keresztül. A PTEN delèoioval vagy FÁK fúlexpmsazióvaí érintett sejtek ammunfioureszoeneiávaí kimutatói magaa színli foszfo-FAK és foszfo-Akt uxpresszíoi mutattak mind a ropartaxin kezeli mlod a kezeíetíén sebekben. A reperfextn kezelés nem indukálta a F0X03A aktiválást a PTEN delecrot hordozó vagy FAK-ot tutexpmsszáió sejtekben, amint azt a FOXÖ3A citopiazmában való elhelyezkedése mutatta (ki 21B ábra). A FAK/AKT útvonat konstitutiv aktiválása következtébena PTEN delédét hon dozó vagy FÁK túlexpressziót mutató sejtek rezisztenciát mutattak a repertaxin kezelésre. A PTEN delédót hordozó vagy FÁK túlzott expressziót mutató sejtek nem mutatták a sejtek életképességének semmilyen csökkenését a repertaxin kezeléssel. Felvetették, hogy az AKT jelátvitel kritikus szerepet játszik a GÉC biológiájában (id 21B és 22, ábrák) {Dubrovska et al. Proc. Natl. Acad, Sei. U, S A 108-268-273., Korkaya et al. PLoS Biolog. 7^1000121., Vilmaz et al. Nature 441:478-482.}, A FAK/AKT útvonal aktiválása blokkolta a repertaxin hatását; a CSC populációkra, ariJntriiiaz ALDELFUOR-pozltív pöpuláelÖk fenntartása mutaia az inhibitornál való kezelés után (Id. 21B ábra), Minden az eredmény azt mutalja, hogy a CXCR1 blokád közvetlenül befolyásolja a FAK/AKT/F0X03A útvonalat. A repertaxin kezelés gátolja az AKT jelátvitelt, ami dóráé fontosságú a CSC aktivitás szempontjából, és ezt kővetően indukál egy CSC-generálf FAS-ligandum által közvetített bystander hatást. A rep&amp;rlaxin kezelés csökkenk a makrák őssejt populációt in vivo, Újabb bizonyítékok arra utalnak, hegy az omló CSC viszonylag ellenálló a kemoterápiával és a sugárzással szemben, és hozzájárulhat a tumorok újra no ve kod èsèhez a terápiát kővetően {Phillips et ai, J Natl. Cancer Inst, 96:1777-1786., Vu et a!. Ceil 131:1109- 1123., U et al, J Nett Cancer Inst 100:672-679.), A CSC Fogalom arra utal, hogy egy a klnikái eredriiáyben szükség lesz a CSC : populáció hatékony megoilzisára (Raya et al. Nature 414-105-111.). Számos faktor szlntetlzàlôdotl és válászfidoi ki az apoptofllús folyamat során, amikor az natJeszfetf fumorsejteket célozták kemoterápiával. Ezek közül a faktorok közül a FAS-llgandum felerősíti á kemoterápiás hatásokat egy bystander ölő hatás közvetítésével (Chhipa et al. J Cell Blochern:, 1:01:68-79,: referenoiákint teljes egészében a leírás részét képezi).A kéme- terápia a sáriit sejtekben is indukálhatja az IL-8 termalést. A szokásosan alkalmazott; kemoterápiás szer, a docetaxel mind az lt.-8-at, rmnd a FAS-iigandum mRNS~t indukálta 8UM1SS sejtekben (!d. lÖaB ábra). Kimutattuk az IL~8 mRNS színt 4-szeres növekedését agonists kezelés után (Id. 10B Ära), Kimutattuk, hogy az IL-β képéé szabályozni a CSC populációt. Ez azt jelzi, hogy a repertaxin hozzáadása oitotoxikus kerncteráfiához biokkolhetja ezt a hatást, és megcélozza a rák őssejt po pulációt. A SUM139 sejtvooal és három különböze betegtől (MC1, UM2, UM3) generált három elsődleges humán mellrák xenegraftöt használtunk arra, hogy felderítsük a repertaxin kezelés hatikönpágst a tumornövekedésre. E tumorokból származó sejteket ortotopíkusan átültettük a hemantziit NOD/SCID egerek féltisztilott zsírpárnájába; #r tenyésztés' nélkül, blinden ilyen xenoifsoszplantitum esetében a CSC populáció kizárólag az ALDRFLUOR-pozitiv populációban volt megtalálható (Gínestier et al. Cell Stem Cell 1:555-587., Cha rate-Jauff ret et al. Cancer Res. 69:1302-13133. Az egyes tumorokban a dCRI-poziiv populáció mafdnem kizárólag az ALDEFLUOR-pozitlv populációban volt megtalálható (Id. 5. táblázat), és á PTEN/FAK/AKT útvonal aktiválódott (Id. 26, ábra), 5, táblázat
iV πϊ“·Γ! i sop <-· \ CíXcfíf CX C R1 í ÁLD E F L UÖ R
Ai-DC LJOR {vé (%} átfedés {%} imiárák-sejtvönaiak HCCÎ9S4 3,42 1,72 0,84 MDA-M8-4S3 4,22 0,8 0,5 SUM 159 5,24 WM 0,48
Humán emlőrák xenegmitpk MCI 12,3 1.81 1,32 UM2 8,4 1,23 0,88 UM3 9,7 0.84 0,78
Minden egyes xenotranszpíantátuniből 50 800 sejtet injektáltunk humanizált NÖD/SCIO egerek emtozsirpámápha, és figyelemmel kísértük a turnornövekedést. Amikor a daganat mérete körülbelül 4 mm volt, akkor indítottuk: a kezelést repertaxínnal önmagában (15 mg/kg, naponta kétszer, 28 napon át), a docetaxellel önmagában (10 mg/kg, hetente egyszer, 4 héten keresztül), vagy a két gyógyszer t komiíniclDjámi, A twor odvüipclifêl: összehasonlítottuk a Oldattal inlpMëmM· kontroliak fcidbten egyes xenotmosxpíáotieíöoáí a tumor növekedés docetaxel által vagy a kombinációs repertaxlallöcitaxii keMléa által Indukált |alariös gátlását fa gyelték meg (id, 26À és 27.. ábrák). A repertaxin kezelés önmagában mérsékelt hatást fejtei ki a tumor növekedeséfé, Négyhetes kezelés után az állatokat leéltük, és a maradék tumorokat az ALDEFbOOE feszt segítségével elemeztük, A ducetaxellel önmagában maradék kezelt furnérok változatlanul maradt vagy megnövekedeü arányé AyDILFUOR-pezítlv séfeket tadalmaztak a kezeletlen kertatílökboz yiszonyltva fid, 2Ü és 27, ábrák). Ezzel szemben a repedaxin kezelés önmagában vagy kombi» nációban docetaxel több mint 75%-kai csökkentetté az ALDEFLUOR-pozitív popuíá-dót (Id. 268 és .27. ábrák). Az eredményeket Igazoltuk az ALDH1 expresszié ímmunhiszíokéml&amp;í vizsgálatával a különböző xenofranszplafitátumokban. Az ALDH1-pozitív sejtek csökkenését a mpertaxlonal kezeit fomomkban mutattuk kit ésszehasoniltva a kezeletlen tumorokkal, míg az AtDHI-pozitív sejtek aránya váltó» zatlan maradt vagy növekedett az egyedül döCeíaxele! kezelt tumorokban (kJ. 260 ábra). A c:0444/0024· sejtek jelenlétét irtileifyk ezekben a tumorokban. Korábban kimutatták, hogy emlrik őssejtekben markerek expresszálódnak (AI Halj et al. Proc. Natl. Acad. Sei, U. S A 100:3983-3988.). A CÖ444/CD24~fenoíípus és a GX0R1 expresszié átfedését mértük. A CXCE1-pozitív sejtek jelen voitak a CD44t/ÜD24-sejtpopulációban, és a CD24-ei vagy a OD44~nega£ív marked expresszáío sejtpopulációban (Id. a 6. táblázatot). 8, táblázat CD24-/C044·»· CXCRl CD24-/CD44·*-/ (%) (%f CXCR+ átfedés (%5
Humán smíőrák xenopraftok MCI 8,8 1,8 0,5 UM2 3.7 1,2 0.3 UM3 4,8 0,8 Oj A döoetaxelleí önmagában kezeit maradék tumorokban megfigyeltük, hogy y CD444/0D24“ sejteknek az aránya vagy változatlan volt vagy megnőtt, míg a repedakln kezelés önmáglöan vagy kombinációban dccetaxolleí a OÖ44*/OD24» SéfipOipüilCiÖ csökkenését eredményezte (Id. 28. ábra). <
Egy íunkeienÉlís m ¥im vizsgálat, amely a kezelt tumorok sejtjeinek: másodlagos NGD/SCIO egerekbe való újbóli beultetésébSt állt, egy közvetlen tesztet adói a kezelés után megmaradt €80 sejtek turoorképzö és önmegujulé képességékek mérésére. A kontrol vagy a dooetaxebkezelt állatokból származó sejtek bármilyen hígításban a tumorok hasonló ntranovekedését mutatták másodlagos NÖDtSCiD: égerekben, Ízzel szemben a dopefaxeílel vagy anélkül végzett reperiaxln kezelés esik-kénlette a tumomövekedist másodlagos befogadókban $&amp; 260 ábra), Amikor mo* fim számú sejtet injektáltunk:, akkor a repertaxlnnai kezelt állatok 2~5-szöros tumornóvekedés csökkenést mutalál; a kontroll vagy doceíaxei-kezelt állatokból származó sejtekhez viszonyítva: (ki 260 ábra). Mindem egyes xanotranszpiantáturn modell esetében 1000 vagy 100, a repertaxin és docetaxel kombinációjával kezeli állatokból: kivett tumorsejt egyáltalán nem képezett másodlagos tumorokat NOD/SCID egerekben (Id, 28(1 27 ábrák ás 7. táblázat). Izek a vizsgálatok azt mutatják, Hegy a repertaxin kezelés klfejezetteh: a OÍO populációt célozza és esöklenti, T, táblázat 10 00 0 5000 2500 1000 500 250 100
Kmmn m.............2/2.......................m...........-...........—..............m"...... rnpmtmn 4/4 m 2/2 m 1/3 m o/e
DocMaxei 2/2 m 2/2 m m m s/9 R*múwán~m&amp;c«m*i m m m m va m 0 ./§ A mp®rtmn kezelés gátőre PAK/MTjPlâîvimiî, m aMvàljm m WÚM03A4 in vé vo. A foszfo-FAK és íoszfo-AKT expresszióját immünhísztokérniávaí vizsgáltuk; minden igyes xenotranszpiántatum kezelés után. MembranOzus foszfo-FAK expressziét mutattunk ki a kontroll és a dooetaxei-kezelt tumorok sejtjeinek 50%-áhan, míg a foszfo-FAK expresszié megszűnt a repertaxlnnai önmagában vagy döáetaxellél kombinálva kezelt tumorokban (kl 26D ábra). Hasonló eredményeket figyeltünk meg a foszfó-AKT exprosszlónak a kezeletlen tumorokban a sejtek 70%-a; expresszált fesÄxAKT-oi, a doóetaxeFlszelt tumorokban 20;%~ös volt a foszte-AKI-pozítiv sejtek aránya, ás a fószfo-AKT exprosszió tops gátlása volt a: repertaxínnal önmagában vagy docetaxelíel kombinálva kezeit: daganatokban (Id, 260 ábra). Nukleáris FÖMÖ3A volt kimutatható a docetaxelíel ónmagiban, a csak repertaxínnal, és a repedaxin/doeetaxel kombinációval kezeit tumorok sejtjeiben. Ezek m in vívó adatok 'S:' összhangban vígnál? Μ Ψί¥ο· aÍit#Éá| il .mpprőiitíks hogy reperiaxin kezelés gátolja FAH2ÄKT jelátvitelt és aktiválja a FCX03A-1 é mpwiamri kméâ®. m8kk®rÉf® mfàM&amp;mïkm ûttêtkèpzëst. Annak meghatározására,: bogy a repertaxin νφη csökkentbe a szisztémás metasztàzlst, HOC19S4, MDA-MÍ--453 ét á SUM 15# émiőrlk seltvonalalat égy íuoiferáx ísntívíms riporter rendszerre! fertőztünk, és behelyeztük a sejteket NOD/SCÍD egerekbe intrakardiáíis injekcióval Mieden egps populációból 250 000 sejtnyí szuszpenziot ttcskénöi®ni be, és az áttéteket hetente egyszer biolumineszcens képalkotással mértük fék Tizenkét érával az intrakardiáíis injekció útin az egereket naponta kétszer kezeltük repertaxín vagy a kontroíloknál sóoldat Injekcióval. A HCC1954 és SUM fii sejtekkel injektált egerekben a reperfaxín kezelés jelentősen csökkentette a meiasztázis képződést, alacsonyabb foton fluxus kibocsátással a kezelt, mint a kezeletlen egerekben (id. 29AB ábra). A híszfoíógíaí metszetek megerősítették mitásztázísdl jélenlétét a kezeletlen állatokban (Id. 290 ábra). Â repertaxín kezelés nem gya koré It se m rn i lyen hatást meta.sztázls kialakulására az MOA~M!-4ii sejtekkel injekciózott egerékben fid, 29C ábrája A Mén fluxus emisszió és azoknak az állatoknak aszsma, amelyekben álét képződött, hasonló volt mind a repertaxlnhaí kezeli mirât cso portban. Ez az eredmény összhangban van azokkal az adatokkal, amelyek az MDA-M8~463~at, mint a ETEN mutáció rÉti repertaxín jelenlétére rezíszíens séjívonafat írják le. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a OXCRt blokád az olyan szerekkel, mint repertaxín. képes lehet csökkenteni a CSC populáció által közvetített metasztázíst fCharafe-dauffret et ai. Cancer Has, €9:1302-1313.). A jelen taiálminy megvalósítási módjainak kifejlesztésé során végzett kisédetek azt jelzik, hogy össép tyiajdonsáiokkai bíró celluíárls aikomponensek Ösztönzik a iumornovekedési és i metasztázist MIsvadér ét ai. Nat. ley. Cancer 8:755-768.). A jelenlegi terápiás módszerekkel szembeni relatív rezisztenciájuk alapján ezek a sejtek hozzájárulhatnak a kezeléssel szembeni eíienáíláshoz és a reiapszushoz (Reya et ai. Nature 414:105-111.) A jeien találmány egy a meiírák őssejtekben expresszált CXCR1 citokin receptor blokkolásán alapuló módszert ismertet, hogy hatékonyan célozza meg a rák őssejt populációt, és hogy javítsa terápiás émdminyt, A jelen tálilminy meivalósifisí mödplnak kifejlesztése során végzet kísérletek számos rendszerben bebizonyították, hogy a citokin hálózatok fontos szerepet játszanak a cl aga n a cképzod ésbo n, Bizonyított fény, hogy több ilyen citokin szabályoz hatja az wélkesáésf, Aztl-4 képei a h«tyálmí$gpáfe őssejtek ön?Ts^g;u|Ílási^ nak szabályozására, ás az iL-i &amp; rák őssejtjak ázahÉiyozésára vastagbél- él maik rlkhan (Todaro ét ai* Cell Sté?n Cejí 1.388-482., Sansóne et al, 4 Clin, tevéét 117:3888-4002.)- Áz 11-8 szerepet a turner invázió és raétsszíázis: közvaiitéséhett korábban klmtiallák (WayghtfcWílsön. Cancer Res. 14:6735-0741., Inoue et ai. Clin, Cancer Res. 6:2104-211$).}. Ezen túlmenően az IL~8 növeli neurális őssejt önmag új u-lééit sehgyögyuíis serén az agyién (Beech ét al. J Neu re immunoi. 184:108-206.), Tüdőrák őssejteket., miét a CXCR1 kemokin receptért írtak le (Levína et al. PLoS. ONE, 3:e3Ö?7.}. A jelen találmány megvalósítás; módjainak kifejlesztése során végzett kísérletek bizonyították: hogy a CXCRI-poxIiv populáció szinte kizárólag az ÂL0EFLU Ö R-pozliív populáción belül található rneg az emlőrák sejtvonalakban és elsődleges xenograftokban, valamint a normális emlőseitekben A kemokin receptor tyíexpresszálédlk az ALDEELUOR-pozitlv emlőrák sejtpopulációkban (Charate-Jauffret et ah Cancer Res. 88:1302-1313,). A mellrákokban az IL-8 a tumor mskrokor-nyezetéhen számos sejttípus, Ideértve a gyulladásos sejtek, vaszkúiérís ehdpíeliáíís sejtek, a tumor-asszociált fibroblasxtok és mezenehymáiis őssejtek által termelődik (Waugh et: at Clin, Cancer Ree. 14:1735-6741.). A citökír* hálőzatök közvetítik az ezen sejttípusok közötti kölcsönhatást. így á rák őssajteket meg lehet célozni a CXCR1 IL-8 receptor blokádján keresztül.
In értté tesztek használatával azt igazolták, hogy a CXCR1 gátlása csökkentette a melrák őssejt populációt, de a CXCR2 {alternativ ÍL-8 receptor) gátlása nem. Ezt követte az egész fennmaradó sejtpopulációban az apoptózis indukciója, amely CXCR1 expresszié néikui történik, A CXÇR1 blokkoló antitestek mellett a jelen találmány megvalósítási módjainak krfejleszíese során végzett kísérletek azt mutatják, hogy a CXCR Ill-inhibitor repertaxín hasonló hatásokat indokai a CXCRI-pozltiv populáció megcélzóéival; A OXCRI-expresszáío rák őssejt populációra való közvetlen hátááa ellenére a mpedaxsnnak nem volt közvetlen: hatása az ömlesztett tumereejt populációra, amelyben nines CXCR1 expresszié, Íz azt jelzi, hogy a CXCB1 biokád CXCR1-pozitív sejtekben sejthalált indukált CXCR1 -negatív sejtekben egy bystander hatáson keresztül. Itt leírt kísérletek bizonyítják, hogy a PAS-iigandurn/FAS útvonal a közvetítőé a bystander ölő hatásnak. íz a jelenség magyarázza a repertaxín kezeíes hatásosságát a tops sejtpopyliolehan a masszív apoptózis indukálásában, annak ellenére, hogy m CXCR1-pozitív populáció kova- <· sete, mint ffrlt ÜPÄIi Μ AÄB-iigandum szerepét a bystander pue^Â^âk agf seti^FASdigandym antitest iltetl betáses blektelása bizonyította:. A leien találmány megvalósítási rnéd|aínák :kité|leezt|se során vigzei kléidetek azt mutatják, hogy a hasonló ciiokín kölcsönhatások felléphetnek citotoxikus kemoterápiának kitett fpmórekten- A kemoterápia közvetlenül indukálhatja a sejtes apoptézíst a dlfletinolilt iumorsejtekbem valamint ezeken a haldokló síteken keresztül a FASdígandum termelődést induká|a, ami viszont apspfózist Inddká! a Mn nyezö daganatsejtekben egy FÁS közvetítet bystander hatáson keresztül A FÁS-llgandym termelődésével egyidejűleg ezek a sérült sejtek megnovekedett mennyiségű lb-8-af szekretáinak az emlő irwoluciohoz vagy sebgyógyuláshoz hasonló folyamatban, Ahogyen az emlömírígy Ínvoiyöíó|án#l ez az IL-8 -stimulálhatja mellrák össije tekeh valamint megvédi azokat az ipoptőzístől Ez hozzájárulhat a rák őssejteknek A kemoterápia után a prekliníkai modellekben (4) és a neo-adjuvans klinikai vizsgálatokban (SÍ megfigyelt relatív növekedéséhez, A kemoterápiának a tumorok apoptózlsára és önmegújítö útvonalaira gyakorolt hatásala 30.. ábrán láthatók.
Annak méghátározására, hogy vajon a CXCR1 blokád megcélozhatja-e mellrák őssejteket ià v/uo, a docetaxel cstotoxikus szer hatását összehasehlíteiuk a repertaxinéval a rák őssejt kempáftmeotré, és a tumor növekedésére NOD/SGID egerekhéró A docetaxel egyike a használt leghatékonyabb kemötérápiás szereknek mellrákos nők kezelésére jelenleg, A ?ák őssejt populációkat az ALDEFlUÖR filittel és sorozatos transzplantációval : vizsgáltuk ilGDfSGID egerekben. Ezekét a teszteket használva megállapítottuk, hogy a kemoterápia kezelés önmagában nern eredményezett változást, vágy Ippih a rák őssejt populációk viszonylagos növekedését okozta. Ezzel szem ben a reperlaxin kezelés önmagában vagy kemoterápiával együtt szignifikánsan csökkentette a rák őssejt pöpuiieiit. A tumor-kezdeményezö peputá-ciók jelentős csökkenése ellenére a reperlaxin önmagában való használata nem eredményez jelentős dapanatzsugörodist A repertaxin és a kemoterápia kombinációja szlgniikáns csökkenést eredményezett a tumor méretében:, valamint a rák őssejt populációban. Ezeknek a szereknek a kombinálása a rák őssejtek és az ömlesztett tumorsejt populációk meocélzásához maximalizálja ezeknek a kezeléseknek a hatásosságét A repertaxin hatásmechanizmusának tisztázására: a C.XCR1 utáni lépéseket: elemeztük. A CXCR1, a FÁK és AKT közötti kölcsönhatási igazoltuk, A CXCR1 bio- «ί kád kifejezetten a FÁK leÁKTteMiválás utján fejti ki a hatását. A Jeten találmány: megvalósítási módjainak :kífé|esztése során végzett kísértetek azt jelzik, hegy az AKT szaiilyozza a normális és rosszindulatú emlő őssejt önmegújítását a GSR3I feaxferííleiöja: útján, ami a WNT ivónál aktiválását eredményezi (Korkaya et all RLoS »log, immm 21 )· Ezek az iredmirtyek jelzik azt, hogy PTEN csendesített sejtek miért reziszfensek a repertaxinra. Az AKT egy további funkciója sejtek túléli«· séook szabályozása a FOXÖ3A forkhead transzkripciós faktor íoszfohiezésén ke-resztül. A F0X03A AKT szekveszírácíójál: ered ményezi. Ízzel szemben bemutattuk, hogy a CXCRI blokád csökkent AKT akti vádéhoz vezet, ami a FGXOiÁ tránszídkáeiéjlí aredménpzí a sejtmagban, ahonnan számos gént, beleértve a FAS-tigandumot indukál (Jonsson et al. NatxMed,: ITi'Ili-671.). A CXCR1 blokádon keresztül indukált FAS-ligandum viszont fa tetős a megfigyelt bystander pusztító hatásokért (id. 30. ábra).
Amellett, hogy a szerepe van a CXCRI jelátvitelében, a FÁK íntegrin receptorokon keresztül közvetít! a sejteknek: az exiraceltutáris mátrix komponensekkel vei kölcsönhatását (Waugb et ai Clin. Cancer Rés, 14:1733-6741,), Transzgenitei mo~ deliekben a FÁK jelátviteli szerepet játszik a normális és rosszindulatú egetemjö Ős-sejtek szabályozásában inmegujoliséhan (Lyo et ai. Cancer Res, 69:466-474.). A FÁK aktiválás ejisegítí a sejtek túlélését is a F ADD- és a RIP-kőzveiíteit apoptózls liklbisávaS (Kurénova et al. Mol, J Cell Biol. 24:4361-4371,, Xu ét al. J Biol. Chem. 275:30697-30604.}. Ez magyarázatot ad a rák őssejt populáció ellenállására a FAS/FASMigandym által indukált apoptózissal szemben lebízonyosedeij hogy a mellrák őssejtek fontos szerepet játszanak a tumor invázióban és a metáSztázlibao (Crokir et al . J Cell Mol. Med, 2008, Charaíe-Jauffret et al. Cancer Res. 69:1302-1313.). A leírásban megmutattuk, hogy az IL-8 és a CXCRI fontos szerepet játszanak ezekben a folyamatokban is. A CXCRI folokld befisei repertaxinnak a kísérleti metasztázis képzésre velő alkaímázásávál elemeztük. Kimutattuk, hogy a CXCRI blokád esokkenfi a meíasztizisok kialakulásét emlő ráksejtek intrakardiálís injekcióval való beadását követben.
Repertaxint alkalmad klinikai vizsgálatokkal kimutatták a toxicités hiányát. A eltolón szabályozási hurkok, irtNpéliiuitazJL^'êsa CXCR1 megzavarására irányuló stratégiák a mellrák Őssejtekre irányuló célzási módszereik képvisillí.
Hmmmmmm 1. Hanahan D and Weinberg R A> The halmarks of cancer, Get 20¾ 100: 57- 70.. 2. Nave R M. Odin K, Fndiyand J ei al. A collection of breast cancer ceil Lines for the study of functionally distinct cancer subtypes, Cancer Cell 2006; « 515-527, 3. Bonnet P and Pick J I Men» acute myeloid leukemia la organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic ceil. NaLMed, 1997; 5:730-737. 4. Glinsky G V. Stem ceil origin of deafh-from-cancer phenotypes of hu-man prostate and breast cancers. Stem Geii Rev. 2097; 3; 79-93, s. daiswal S. Traver D, IWyameto ?, Akasht #C hagasse E and Weiss man .) I- Ikpressson of BCR/ABL and BCL-2 In myeloid progenitors leads to myeloid leukemias. Proc,NatL Acad.Sei,U.S.À 2695; 150:19692-199(77, e. Krivtsov A V, Twomey 0S Feng 2 et ai. Transformation from: committed progenitor to leukaemia stern cell Initiated by IVfLteAFt. Nature 2905; 442: IÎÂ ?. Ohnetsen M, BaHmaier M, Rruehhardt i, von Wasieie^skl R. Kreipe H, and Lehmann II, Identification of a distinct side population of cancer cells In the Cai-51 human breast carcinoma cell fine. PoLGetl Blochern. 2007; 306: 291-215, s, Fillmore C M and Kuperwasser C, Human breast cancer cell fines contain stem-likè cells that selhrenew, give rise to phenotypicaly diverse progeny and survive chemotherapy. Breast Cancer Res. .2008; 10: R25. 3. Kondo T, Setoguchi T, and Taga I. Persistence of a small subpopulation of cancer stem-like cells in the C6 glioma ceil line. Proc:Nati,Acad:Sci.li.§,A 2004; 101: 781-786. m Setoguchi T: Tags 1\ and Kendo T. Cancer stem celis persist in many Pincer celt lines, Celi Cycle 2004; 3: 414-415. 11. Rifrawaia L, Calhoun f, Sehneider-Broussard R, Zhou J, ilaypopi % and Tang D G. Side population Is enriched in tdmongenim atem-lie cancer cells, whereas ABCG2* end A. Cancer Res. 2665; 65:6207« §. 12. Chute J P, Muramoto 6 G, Whitesides J ei al. inhibition of aldehyde dehydrogenase and retinoid signaling Induces ihn expansion *>f hwewn hematopoietic stem gels- Proe-Nati-A(^<i.Sgi^Ü.S-â 2ÖÖ8; %m:11707-11712. is, Duesfer G> Families of retinoid dehydrogenases regulating vitamin k. function: production of visual pigment and retinoic acid, Eur.J Biochem. 2000: 287:431 S«4, 14. Cheung A M, Wan T s, Leung J C et ai. Aldehyde dehydrogenase activity in leukemic blasts defines a subgroup of acute myeloid leukemia with adverse prognosis and superior NOD/SCID engrafting potential. Leukemia 2007; 21: 1423-1430. is. Corti S, Locateiii F, Papadimitriou D et al. identification of a primitive hrain-derlvecl neural stem cell population based on aldehyde dehydrogenase activity,. Stem Cells 2006; 24: 9754)86. m Pearce O d, f aassig Û, Simpson C of ai, Characterization of cells with a high aldehyde dehydrogenase activity from cord blood and acute myeloid leukemia samples. Stem Cells 2005; 23:. 752-760. 1? Ginestier C, Húr M H, Charafe-Jauffret E et ai. ALDH1 Is a Marker of Normal end Malignant Human Mammary Stem Cells and a Predictor of Poor Clinical Outcome. CeH Stem Cell 2007; 1: 555-667.
Donfu G, Abdallah W M, Foley J M et ai. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary ateimfpregenitpr eelis. Genes Dev. 2003; 17: 1263-1:270:. 19. Irizarry R A, Hobbs B. Collin F et ai. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biosiatisiics, 2003; 4: 240-264. au. Charafe-Jauffret Es Ginestier C, Monviile F et al, Gene expression profiling of breast cell lines identifies potential new basal markers. Oncogene 2006; 26: 2273-2284. 21. Finetli P\ Cervera M. Charafe-Jauffret E et ai. Sixteen-kinase gene expression identifies luminal breast cancers With poor prognosis. Cancer Res. 2608; 58: 767-776, :2i Eisen Μ B. Spellman P T;S· Brown P G; and Beistein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression: patterns. PfOG.Nat!.Aoad,ScLU.S.A 1998: 95: 14883-14868. 23. Reiner A, YekutMi D, and Benjamin! V'.. Identifying differentially expressed genes using false discovery rate controlling; pmeedyres, Bioinforniatlcs. 2003; 19: 868-375, 24. Hua J; Baiagumnathan ¥, Chen Ύ ei al. Normalization benefits mieroarray-baeed eiassifieatien. EURASIP.d 8iainform,Syst:Biot 2808; 430ÜL 2s. G inestier G. Cervera M. Finett! P et ai. Prognosis and gene; expression profiling of 20q 13*amplified breast pansera, CllnCaneer Res. 12: 4533-4141:, 26. Ponti D, Costa Â; Zaffaroni N et al, Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast; cancer ceils with stem/progenitor ceil properties. Cancer Res. 2006; 65: 5506-5511. 27. Ringe 9; itrassberg S. Neumann K el ai. Towards in situ tissue repair: human mesenebymai stem cells express chemokine receptors CXCR1, CXCR2 and CCR2. ahdúhi|ra;fe upon stlmuiltien with CXCL8 but not CCL2. J Ceil Bioehem. 2007; 101: 136-146, as. Hughes L Malone C, Churned S, Burger A M: and McDonnell S. Characterisation of breast cancer cell lines and; establishment of a novel; isogenic subclone to study migration, invasion and iurnoungenioity, Clin, Exp. Metastasis 2603, 29. iteh Y, Job T, Tanida S et at. IL-8 promotes cell proliferation and migration through metalioproteinase-cleavage proHB-EGF in human colon carcinoma ceils. Cytokine 2006; 29: 275-2.82. so. Gupta G P, Perk J, Acharyya S et ai. iD genes médiats tumor reinitiation during breast cancer lung metastasis, Froc.NatLAcad.SeLU.S.A 2007; 104:19588-1 iSII. si. U F. Tiede B: Massague J, and Kang Y. Beyond tumorigenesis: cancer stem ceils in metastasis. Ceil Res, 2007; 17: 3-14. 32. A{ Hajj M, Wioha M S, Benito-Hemandez A, Morrison S J, and Clarke M F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer ceils. Ffoe, Natl .Acad, Sol. Ü J,A 2001; 100: 3083-3988. 33. U G, Heidt D G, Daierba P et ai. Identification of pancreatic cancer stem ceils. Cancer Res. 2007; 67: 1030-1037. 34; Ricci-Vitianl ;L, Lombardi D G; Pilozz! E et al. Identification and £ expansion of human eoíen-eanesNnittatíni calls, Nature IP; 446: i 1 i~1 15, 3s. Montanem F, Liadaki K, Schienda J, Flint A, Gascons i, and Kunkel l Mi·. Pernystifyfng SP cel! purification: viability, yield, and phenotype are defined by isplafipn parameters, Exp.Cell Ree, 2004; lit:. 144-154. 3« Sflnpl 4 Elmw P, Rbketson I at al> Purification; and unique properties of mammary epithelial stem ceils. Nature 2006; 430:; 693*087. 37, MMsul W> Hut Û A, Wang O et ál, Cfeamcterbatíon of; eloopgiulc multiple myeloma cells. Blood 2004; 103: 2332-2331, as. Farnb <1 and Clarke 11. Mammary elem Pilla and breast esn;eer~~roie of Notch fignalllng. Stem Cell Rev, 2007; 3: 169-175, 33 Krstlc A. yojaln M, and Stevanovic M. Regulation of SOX3 gene expression Is driven by multiple NF-Y binding elements. Amh,ibchem,B|ophys, 2007; 467:163-173. 40. Zhu J, Zhang Y, Joe G J, Pom petti Ft and imerson S G. NF-Ya activates multiple hematopoietic stem cell (NSC) regulatory genes and promotes BSC self-renewal. Proe.Natl.Acad.Sei,U.S.A 2005; 102: 11728-11733, 4Ί. Raffel G D, Mefcber T, Shigematsu H et al. Ott 1 (Rbm1 5} has pieiotropic robs In hematopoioic development. Proö,Nati,Aoad.Soi.ü.S;.A 2007; 104: 6001-6006, 4.2. Ma X, Renda y Js Wang L et al. Rfom 15 modulates Notch-induced transcriptional activation and affects myeloid diffërenfiatbh, Mol. Cell Biol, 2007; 27:3056-3064, 43. Peiffer l? Eld Ft Barbet R et al. A sub-population of high proliferative potential-quiescent human mesenchymal; stem ceils is under the reversible control of interferon alpha/befa Leukemia .2007; 21: 714-724. 44. Viiiadsen R, Fbdnksdoti-r A J, Ronnov- dessen L ei al, Evidence for a stem cell bieraroby in the adult human breast, J Cell Biol. 2007; 177; 87-101. vs, Hambardldrnyan D, Becher O J, and Holland I C. Cancer stem cells and survival pathways. Cell Cycle 2008; 7. 46, Jagani Z end Khosravi-Far R. Cancer stem cells and impaired apoptosis. AdV.Exp,Med,Biol. 2008: 615; 331-344. 47. Maxwell P J, Gallagher R, Seaton A et al. HIF-1 and NF-kappaB- mediated: upregutation ét QXCR1 aad CXÇ1R2 expression promotes cell survivsl In hypoxic prostate cancer ceils- Onoogene MOT; 20; 7333-7345. 48. Murphy C* McSurk M> Pettigrew 4 at i!< Ndnapicai and cytoplasmic expression of Μο60οΜο-8< CXCRi, and CXCR2 correlates with ceil pmiiferaien and microveseel density in pmatate oaneer, Clln.Caneer Res, 2003; 11: 4117-4127. 48. Trentin L IVlionn tvl Facco M et al: Multiple myeloma plasma celle show different chemokine receptor profiles it silos Of disease activity, ibd Haematol, 2007; 138; 394-602. so, Varney M L, Johansson f t, and Singh R K, Distinct expression of C.XCL8 and its receptors CXCR1 and CXOR2 and their associatlonwith vessel density and aggressiveness in malignant melanoma. AmJ Clin. Pathol. 2006; 125: 209-218. si. Freond A, Chauveau C, 8reuiiiet J P et ai, iL-8 expression and its possible relationship with estrogen-receptomegative status of breast canner ceils. Oncogene 2003; 22; 235-253, m-i Indue K. Slaton Jf, Eve B ¥ et al, Interleukin 8 expression regulates tumorigenicity and metastasea in andfogen-independeht prostate canoer, Clin.Cancer Res. 2000; 6: 2104-2113. S3. Balbay M D, Pettaway C A, Kunlyasu H et ai. Highly metastatic human prostate cancer growing within the prostate of athymie- mice everexpresses vascular endothelial growth factor. Oiin.Caneer Res, 1999: 5: 783-789. 84. Kim S J, Uehara H, Karashima % Mccarty Ms Shih N, and Fidler I J. Expression of infedeukimi comelates with angiogenesis, tumedgenleliy, and metastasis of human prostate cancer ceils implanted orthotoplcally In nude mice. Neoplasia, 2001; 3: 33-42. 58, Karnouh A E( Dash A B, Vo A P at al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature 2007; 449: 557-583, 56. Schafer Z I and Brugge J S. IL-6 involvement in epithelial cancers. J Clin .Invest 2007:117: 3660-8683, s?, Tddaro M? Alee Μ Ψ, Di Stefano A B m al. Colon oanoer stem cells dictate tumor growth and resist ceil death by production of interleukin^. Ceil Stem Cell 200?; 1: 389-402, * ä "Uni!: S, iöilarl f% Oernignani F et ai, tnterieukirhA end inter|euklrn4 receptor polymotphlsms end colorectal cancer risk, EueJ Cancer 2007; 43: 762-768. lie. Sansone R, Steml if Tavoiari É at al. !L*6 triggers malignant features in Ifom -huma« :ÉMiÉ8l breast carcinoma and normal mammary gland, J ûlin Jnyasi 2007; 117: 3988-4002. g&amp; einsky Ç V. Berexovska O, and Glinskii A B. Microahay analysis identifies a dealh-frorn-cancer signature predicting therapy failure ín patienta will multiple types of cancer. J Clin.Invest 2005; 116; 1803-1521, ei Golub T R, Slonim D % Tamayo P et ai. Molecular classification of cancer: class discovery and eless pmdjcfjoo by gene »pression monitoring. Seiende 1999; 288: 531-537.

Claims (6)

SZABADALMI IGÉNIFÖDTÖK
1. CXCR.1 antagonists, egy tumorral rendelkezőalsny kezelésére szolgáié eljá-fásban való alkalmazásra, ahol az: eljárás továbbá magában foglalja egy kemoterápiás szernek a beadását Is.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazásra szolgáló OXCR1 antagoniste, áléi a CSXORI antagoniste repertaxln vagy egy repartaxin-származék,
3. Az 1* lgInypeni szorinl alkalmazásra szolgáló CXCR1 antagonlsta, ahol a 1XIPR1 antagonlsta magában foglal agy antitestet vagy egy antitest fragmentumot.
4. Az 1 ,:igénypont szerinti aikaimazi» antagonlsta, ahol a kemoterápiás szer agy mitözis ellenes szer.
5. A 4, igénypont szerinti alkalmazásra szolgáld GXCR1 antagonlsta, ahol a mitözis ellenes szert a docetaxel, doxorubicin, paclitaxel, fluorouraclí, vincrisíín, vinblastin, nocodazol, oolchlcin, podophyllotoxin, sieganacin és a combretastatin által alkotót csoportból választjuk ki.
6.. Az 5. Igénypont szerinti iikalmazásM szolgáló CXCR1 antagoniste, ahol a mltózis ellenes szer paclitaxsk ?» Az 1. igénypont szerinti alkalmazásra szolgáló CXCR1 antagonlsta, ahol a tumor a prosztate-fik; Őssijfeki á xpétefészek-rÉk őssejtek, a mellrák őssejtek, a bőrrák őssejtek, a nom kissejtes tüdőrák őssejtek, a kissejtes tüdőrák őssejtek és a nyelőcső adenokarcinóma őssejtekből álló csoportból kiválasztott rák őssejteket tartalmaz. S, Az 1. igénypont szeri ntialka Imázéera szolgáló CXCR1 antagonlsta, ahol a ÖXöRi aetageelsta az reperfazln, és ahol a kemoterápiás szer az paclitaxel. 9* .A 8. igénypont szerinti alkalmazásra szolgáló CXCR1 antagonists ahol a tumor egy mellrák tumor, 18. A 9. igénypont szerinti alkalmazásra szolgáló CXCR1 antagonlsta, ahol a mellrák tumor melMk Őssejteket tartalmaz.
HUE09826676A 2008-11-11 2009-11-11 Anti-CXCR1 kompozíciók és módszerek HUE032623T2 (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11345808P 2008-11-11 2008-11-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUE032623T2 true HUE032623T2 (hu) 2017-10-30

Family

ID=42170302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUE09826676A HUE032623T2 (hu) 2008-11-11 2009-11-11 Anti-CXCR1 kompozíciók és módszerek

Country Status (26)

Country Link
US (3) US8940301B2 (hu)
EP (2) EP3153862A1 (hu)
JP (3) JP5716180B2 (hu)
KR (3) KR20110093893A (hu)
CN (3) CN102272599B (hu)
AU (1) AU2009314141B2 (hu)
BR (1) BRPI0921150B1 (hu)
CA (1) CA2743305C (hu)
CY (1) CY1118933T1 (hu)
DK (1) DK2356462T3 (hu)
EA (1) EA023466B1 (hu)
ES (1) ES2623128T3 (hu)
HK (3) HK1161350A1 (hu)
HR (1) HRP20170463T1 (hu)
HU (1) HUE032623T2 (hu)
IL (1) IL212822A (hu)
LT (1) LT2356462T (hu)
MX (2) MX2011005007A (hu)
NZ (2) NZ625440A (hu)
PL (1) PL2356462T3 (hu)
PT (1) PT2356462T (hu)
RS (1) RS55784B1 (hu)
SG (1) SG10201701954QA (hu)
SI (1) SI2356462T1 (hu)
WO (1) WO2010056753A1 (hu)
ZA (1) ZA201103416B (hu)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102272599B (zh) 2008-11-11 2015-01-14 密执安大学评议会 抗cxcr1组合物和方法
GB201106870D0 (en) * 2011-04-26 2011-06-01 Univ Belfast Marker
WO2013067055A1 (en) * 2011-11-01 2013-05-10 Bionomics, Inc. Methods of blocking cancer stem cell growth
CN103159650B (zh) * 2011-12-19 2016-04-20 天津市国际生物医药联合研究院 芳香杂环磺酰胺类化合物的制备及其应用
CN103159649B (zh) * 2011-12-19 2016-03-09 天津市国际生物医药联合研究院 磺酰胺类化合物的制备及其应用
EP2831112A1 (en) * 2012-03-29 2015-02-04 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Inhibition of interleukin- 8 and/or its receptor cxcrl in the treatment her2/her3 -overexpressing breast cancer
ES2728305T3 (es) * 2013-04-29 2019-10-23 Ogd2 Pharma Uso como diana del gangliosido GD2 O-acetilado como una nueva estrategia terapéutica y de diagnóstico para cáncer de células madre cancerosas
JP6683986B2 (ja) * 2013-07-10 2020-04-22 国立大学法人 東京大学 がん幹細胞分子マーカー
EP3518898A4 (en) 2016-10-03 2020-06-17 The Children's Medical Center Corporation PREVENTION AND TREATMENT OF DIABETIC NEPHROPATHY
CN110168646B (zh) * 2016-11-17 2023-12-19 南特生物科学公司 预测抗癌途径的验证
US20180206726A1 (en) 2016-12-07 2018-07-26 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
US10980739B2 (en) 2016-12-14 2021-04-20 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
US10100275B2 (en) 2017-03-16 2018-10-16 King Faisal Specialist Hospital & Research Centre Method for generating human multipotent mammary stem cells from normal primary breast luminal cells
EP3476390A1 (en) 2017-10-24 2019-05-01 Dompé farmaceutici S.p.A. Il-8 inhibitors for use in the treatment of sarcomas
WO2020106704A2 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
RU2702910C2 (ru) * 2018-12-20 2019-10-14 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) Способ снижения количества стволовых клеток рака молочной железы
WO2020172233A1 (en) * 2019-02-22 2020-08-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Treatment of prostate cancer by androgen ablation and il-8 blockade
RU2700695C2 (ru) * 2019-02-27 2019-09-19 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр радиологии" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ радиологии" Минздрава России) Способ снижения клоногенной активности стволовых клеток рака молочной железы
WO2021119482A1 (en) 2019-12-13 2021-06-17 Progenity, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
EP3854411A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-28 Rise Biopharmaceuticals, Inc. (Beijing) Pharmaceutical compositions and use thereof for relieving resistance due to cancer chemotherapy and enhancing effect of cancer chemotherapy
CN114075286A (zh) * 2020-08-21 2022-02-22 张家港博泽利斯生物技术有限公司 一种抗人cxcr1蛋白单克隆抗体的制备方法
JPWO2023032957A1 (hu) * 2021-08-30 2023-03-09

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4109496A (en) 1977-12-20 1978-08-29 Norris Industries Trapped key mechanism
US4323546A (en) 1978-05-22 1982-04-06 Nuc Med Inc. Method and composition for cancer detection in humans
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4981785A (en) 1988-06-06 1991-01-01 Ventrex Laboratories, Inc. Apparatus and method for performing immunoassays
US4968103A (en) 1988-07-22 1990-11-06 Photofinish Cosmetics Inc. Method of making a brush
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
EP0552108B1 (en) 1992-01-17 1999-11-10 Lakowicz, Joseph R. Energy transfer phase-modulation fluoro-immunoassay
US5376313A (en) 1992-03-27 1994-12-27 Abbott Laboratories Injection molding a plastic assay cuvette having low birefringence
JP3537141B2 (ja) 1992-10-30 2004-06-14 ザ ゼネラル ホスピタル コーポレーション 新種蛋白質分離のための相互作用を用いる補捉システム
US5639606A (en) 1993-04-06 1997-06-17 The University Of Rochester Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5876978A (en) 1993-04-06 1999-03-02 Medical College Of Ohio Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5643765A (en) 1993-04-06 1997-07-01 University Of Rochester Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5599677A (en) 1993-12-29 1997-02-04 Abbott Laboratories Immunoassays for prostate specific antigen
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US6156305A (en) 1994-07-08 2000-12-05 Baxter International Inc. Implanted tumor cells for the prevention and treatment of cancer
US6218166B1 (en) 1994-12-09 2001-04-17 John Wayne Cancer Institute Adjuvant incorporation into antigen carrying cells: compositions and methods
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
JP2000512126A (ja) * 1995-11-16 2000-09-19 ダーム、ミヒャエル・ヴェー 体液中の腫瘍細胞を数量化するための方法およびかかる方法に適合した試験キット
JP2000502450A (ja) 1995-12-22 2000-02-29 アボツト・ラボラトリーズ 蛍光偏光免疫アッセイによる診断法
US5885529A (en) 1996-06-28 1999-03-23 Dpc Cirrus, Inc. Automated immunoassay analyzer
KR20000049096A (ko) 1996-10-11 2000-07-25 린다 에스. 스티븐슨 혼합 림프구와 조합된 종양세포를 사용하는 암 면역요법
ATE363652T1 (de) 1997-03-07 2007-06-15 Clare Chemical Res Inc Fluorometrischer nachweis mit sichtbarem light
US8044259B2 (en) 2000-08-03 2011-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells
US6984522B2 (en) 2000-08-03 2006-01-10 Regents Of The University Of Michigan Isolation and use of solid tumor stem cells
WO2003050502A2 (en) 2001-12-07 2003-06-19 Regents Of The University Of Michigan Prospective identification and characterization of breast cancer stem cells
US20020147312A1 (en) * 2001-02-02 2002-10-10 O'keefe Theresa Hybrid antibodies and uses thereof
AU2003291549A1 (en) * 2002-11-15 2004-06-15 Morehouse School Of Medicine Anti-chemokine and associated receptors antibodies for inhibition of growth of neoplasms
CN101090729B (zh) * 2003-05-30 2014-07-23 艾更斯司股份有限公司 前列腺干细胞抗原(psca)变体及其序列
EP2481814A3 (en) 2003-06-09 2012-10-10 The Regents of the University of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20050142136A1 (en) * 2003-10-23 2005-06-30 Lary Suva Anti-interleukin 8 therapy for tumor osteolysis
WO2005074633A2 (en) 2004-02-03 2005-08-18 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for characterizing, regulating, diagnosing, and treating cancer
WO2005103711A2 (en) 2004-04-20 2005-11-03 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with cxc chemokine receptor 1 (cxcr1)
MXPA06013118A (es) 2004-05-12 2007-02-28 Schering Corp Antagonistas de cxcr1 y cxcr2 de quimocina.
GB0417740D0 (en) 2004-08-10 2004-09-08 Uc3 Methods and kit for the prognosis of breast cancer
JP5129149B2 (ja) * 2005-10-31 2013-01-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 癌を処置および診断するための組成物および方法
US20070208074A1 (en) * 2006-01-24 2007-09-06 Bonni Azad M Methods and compositions for treating and preventing tumors
TWI414517B (zh) * 2006-04-21 2013-11-11 Smithkline Beecham Corp Ｉｌ-８受體拮抗劑
WO2008036419A2 (en) 2006-09-22 2008-03-27 The Regents Of The University Of Michigan Aldehyde dehydrogenase 1(aldh1) as a cancer stem cell marker
JP5311439B2 (ja) * 2006-12-27 2013-10-09 日本メナード化粧品株式会社 皮膚の状態を評価する方法及びその用途
CN101126758A (zh) * 2007-09-06 2008-02-20 江苏省肿瘤医院 流式细胞术同步检测肿瘤中多种细胞蛋白表达的方法
WO2010009121A2 (en) * 2008-07-15 2010-01-21 University Of Florida Research Foundation, Inc. Colon stem cells associated with colitis and colorectal cancer and methods of use
CN102272599B (zh) 2008-11-11 2015-01-14 密执安大学评议会 抗cxcr1组合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR101588547B1 (ko) 2016-01-28
LT2356462T (lt) 2017-03-10
HK1206256A1 (en) 2016-01-08
CN102272599A (zh) 2011-12-07
JP5909783B2 (ja) 2016-04-27
CN104634972B (zh) 2017-06-13
AU2009314141A1 (en) 2010-05-20
SG10201701954QA (en) 2017-05-30
CN104623664B (zh) 2018-08-07
NZ625440A (en) 2016-01-29
MX2011005007A (es) 2011-07-28
US9606124B2 (en) 2017-03-28
EA201100779A1 (ru) 2011-12-30
JP2016065082A (ja) 2016-04-28
CA2743305C (en) 2017-04-04
JP5716180B2 (ja) 2015-05-13
JP2014037427A (ja) 2014-02-27
DK2356462T3 (en) 2017-02-27
US20150160227A1 (en) 2015-06-11
US20150094362A1 (en) 2015-04-02
KR20150065930A (ko) 2015-06-15
NZ602369A (en) 2015-02-27
CA2743305A1 (en) 2010-05-20
US10557850B2 (en) 2020-02-11
AU2009314141B2 (en) 2013-11-07
EP3153862A1 (en) 2017-04-12
HRP20170463T1 (hr) 2017-05-19
CY1118933T1 (el) 2018-01-10
EP2356462A4 (en) 2012-09-19
MX351889B (es) 2017-11-01
US20100136031A1 (en) 2010-06-03
IL212822A (en) 2017-05-29
CN104634972A (zh) 2015-05-20
CN104623664A (zh) 2015-05-20
EA023466B1 (ru) 2016-06-30
SI2356462T1 (sl) 2017-05-31
WO2010056753A1 (en) 2010-05-20
PL2356462T3 (pl) 2017-07-31
ES2623128T3 (es) 2017-07-10
KR20140132412A (ko) 2014-11-17
HK1206421A1 (en) 2016-01-08
EP2356462B1 (en) 2017-01-04
CN102272599B (zh) 2015-01-14
RS55784B1 (sr) 2017-07-31
US8940301B2 (en) 2015-01-27
JP2012508384A (ja) 2012-04-05
BRPI0921150A2 (pt) 2020-11-17
HK1161350A1 (en) 2012-08-24
PT2356462T (pt) 2017-04-07
EP2356462A1 (en) 2011-08-17
BRPI0921150B1 (pt) 2022-05-10
KR20110093893A (ko) 2011-08-18
IL212822A0 (en) 2011-07-31
ZA201103416B (en) 2012-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUE032623T2 (hu) Anti-CXCR1 kompozíciók és módszerek
JP2021193150A (ja) 小細胞肺癌に対する標的療法
KR101875227B1 (ko) 항-ｃｅａｃａｍ1 항체들과 이를 이용하는 방법들
CN107810011A (zh) 使用抗ox40抗体治疗癌症的方法
CN107532217A (zh) 用于癌症的治疗和诊断方法
CN107530402A (zh) 抗lilrb抗体及其在检测和治疗癌症中的用途
CN101336300A (zh) 神经胶质瘤的诊断、预后和治疗方法
CN106470705A (zh) 在体内和在体外的靶标的光控移除
CN103755809B (zh) 治疗和诊断表达slc34a2(tat211=seqid2)的肿瘤的抗体
CN101133167A (zh) 用于诊断nsclc的gitr抗体
US8093010B2 (en) Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment of cancer
US20220289840A1 (en) Antibodies To Cell Adhesion Molecule-Related/Down-Regulated By Oncogenes (CDON) And Uses Thereof
CN107614531A (zh) 在造血和淋巴恶性肿瘤中靶向cd99的组合物和方法
CN107604064B (zh) Ccl20在肿瘤化疗疗效评估和肿瘤治疗中的应用
JP2022513082A (ja) 免疫応答を調節するためのＩＲＥ１α－ＸＢＰ１シグナル伝達経路バイオマーカーの使用
AU2014200650B2 (en) Anti-CXCR1 compositions and methods
Wang Synthesis and evaluation of parthenolide analogues: chemical probes and therapeutic agents
WO2007037555A1 (ja) Ｄｕｓｐ１５遺伝子の治療的又は診断的用途
TW200526682A (en) Laminin-5γ2-binding peptides, related compositions, and use thereof