MX2011005007A

MX2011005007A - Composiciones y metodos anti-cxcr1.

Info

Publication number: MX2011005007A
Application number: MX2011005007A
Authority: MX
Inventors: Max S Wicha; Christophe Ginestier
Original assignee: Univ Michigan
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2011-07-28
Also published as: JP2014037427A; AU2009314141A1; NZ625440A; HRP20170463T1; BRPI0921150B1; CA2743305A1; CN104634972B; AU2009314141B2; US20150160227A1; BRPI0921150A2; EP3153862A1; CN104623664B; WO2010056753A1; HK1161350A1; US9606124B2; CN102272599B; SG10201701954QA; CN104623664A; JP2016065082A; LT2356462T

Abstract

La presente invención proporciona métodos para tratar cáncer mediante la administración de un inhibidor de la senda IL8-CXCR1 (por ej., un anticuerpo anti-CXCR1 o Repertaxin) solo o en combinación con un agente de quimioterapéutico adicional de manera tal que se matan las células de cáncer no tumorigénicas y tumorigénicas en un sujeto. La presente invención también proporciona composiciones y métodos para detectar la presencia de y aislar células madre de tumores sólidos en un paciente (por ej., basados en la presencia de CXCR1 o FBXO21).

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS ANTI-CXCR1 Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reivindica prioridad de la Solicitud de Patente Provisional estadounidense N° 61/113,458, presentada el 11 de noviembre de 2008, que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia.

Declaración con Respecto a la Investigación o el Desarrollo Subvencionados por el Gobierno Federal Esta invención fue realizada con apoyo del gobierno con los números de concesión CA66233, CA101860 y 5 P 30 CA46592 otorgados por el NIH [Instituto Nacional de la Salud]. El gobierno tiene algunos derechos sobre la invención.

Campo de la Invención La presente invención proporciona métodos para tratar cáncer mediante la administración de un inhibidor de la senda IL8-CXCR1 (por ej., un anticuerpo anti-CXCR1 o Repertaxin) solo o en combinación con un agente quimioterapéutico adicional de manera tal que se maten las células de cáncer no tumorigénicas y tumorigénicas en un sujeto. La presente invención también proporciona composiciones y métodos para detectar la presencia de y aislar células madre de tumores sólidos en un paciente (por ej., basados en la presencia de CXCR1 o FBX021).

Antecedentes de la Invención El cáncer sigue siendo la segunda causa de mortalidad en este país, dando como resultado más de 500,000 muertes por año. A pesar de las ventajas en la detección y el tratamiento, la mortalidad por cáncer continúa siendo alta. A pesar del notable progreso en el entendi miento de la base molecular del cáncer, este conoci miento no ha sido aú n traducido en estrategias terapéuticas efectivas.

En particular, el cáncer de mama es el cáncer más comú n en mujeres estadounidenses; aproxi madamente una de cada nueve mujeres desarrollan cáncer de mama en su vida . Desafortunadamente , el cáncer de mama metastásico es todavía un cáncer incurable. La mayoría de las mujeres con cáncer de mama metastásico sucu mben a la enfermedad .

Los modos de terapia tradicionales (terapia por radiación , qui mioterapia y terapia hormonal) si es que fueran útiles, han estado limitados por la emergencia de células cancerígenas resistentes al tratamiento. Claramente, se necesitan nuevos enfoques para identificar dianas para tratar cáncer de mama metastásico o cáncer en general .

Breve Descripción de la I nvención La presente invención proporciona métodos para tratar cáncer mediante la ad ministración de un inhibidor de la senda IL8-CXCR1 (por ej . , un anticuerpo anti-CXCR1 o Repertaxin) solo o en combinación con un agente quimioterapéutico adicional de manera tal que se maten las cél ulas de cáncer no tumorigénicas y tumorigénicas en un sujeto. La presente invención también proporciona composiciones y métodos para tratar y diag nosticar la presencia de células madre de tu mores sóli dos en un paciente (por ej. , basados en la presencia de CXCR 1 o FBX021 ).

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para tratar el cáncer que comprenden: administrar un antagonista de la senda IL8-CXCR1 y un agente quimioterapéutico adicional a un sujeto. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o eliminar células madre cancerosas y células cancerosas no tumorigénicas en un sujeto que comprenden: administrar Repertaxin o derivados del mismo a un sujeto en condiciones tales que se maten al menos una porción de las células madre cancerosas y al menos una porción de las células cancerosas no tumorigénicas. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir o eliminar células madre cancerosas y células cancerosas no tumorigénicas en un sujeto que comprenden: administrar un antagonista de la senda IL8-CXCR1 y un agente quimioterapéutico adicional a un sujeto en condiciones tales que se maten al menos una porción de las células madre cancerosas y al menos una porción de las células cancerosas no tumorigénicas. En modalidades particulares, la presente invención proporciona composiciones o kits que comprenden un antagonista de la senda IL8-CXCR1 y un agente quimioterapéutico adicional.

En algunas modalidades, el antagonista de la senda IL8- CXCR1 comprende un agente que bloquea específicamente la unión de IL8 a CXCR1. En algunas modalidades, el agente se une a (es específico para) CXCR1 pero no se une a CXCR2. En otras modalidades, al agente se une a CXCR1. En modalidades particulares, el agente comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CXCR1. En modalidades adicionales, el agente comprende Repertaxin o un derivado del mismo. En modalidades adicionales, el agente qui mioterapéutico adicional comprende un compuesto antimitótico. En algunas modalidades, el compuesto antimitótico se selecciona del grupo que consiste en: docetaxel , doxorubicina, paclitaxel, fluorouracilo, vincristina, vinblastina, nocodazol , colchicina, podofilotoxina, esteganacina y combretastatina. En otras modalidades, el compuesto antimitótico es un alcaloide de la vinca (por ej., vincristina y vinblastina); o un carbamato de bencimidazol tal como nocodazol; o colchicina o compuestos relacionados tales como podofilotoxina, esteganaci na o combretastatina; o un taxano tal como paclitaxel y docetaxel. En algunas modalidades, el agente qui mioterapéutico adicional comprende docetaxel.

En modalidades particulares, el sujeto tiene un tipo de cáncer que al ser tratado con un agente qui mioterapéutico posee niveles aumentados de producción de IL-8 (por ej. , que causan un au mento en la movilidad de la cantidad de células madre cancerosas). En algunas modalidades, el sujeto tiene un tipo de cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata , cáncer de ovario, cáncer de mama, melanoma, cáncer de pul món no microcítico, cáncer de pul món microcítico y adenocarcinoma esofágico.

En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para detectar células madre de tu mores sólidos que comprenden ; a) proporcionar: i) una muestra tomada de un tumor en un sujeto y ii) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo (u otra molécula de unión) , específicos para la proteína CXCR1 o la proteína FBX021 (u otra proteína de la Tabla 1 ) y b) poner en contacto la muestra tlsular con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo en condiciones tales que se detecte la presencia o ausencia de células madre de tumores sólidos CXCR 1 + o FBX021 +.

En modalidades particulares, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se conjuga con una molécula de señal. En modalidades adicionales, la molécula de señal comprende una molécula fluorescente. En otras modalidades, la molécula de señal comprende una enzima capaz de catalizar una reacción que produce color en presencia de un sustrato colorimétrico. En algunas modalidades, el método comprende adicionalmente poner en contacto la muestra con un anticuerpo secundario o fragmento de anticuerpo secundario, específico para el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En otras modalidades, el anticuerpo secu ndario o el frag mento de anticuerpo secundario comprende una molécula de señal. En modalidades particulares, no se ensaya ning una otra proteína o ácido nucleico para determi nar la presencia o ausencia de células madre de tu mores sólidos CXCR1 + o FBX021 +. En modalidades adicionales, el tu mor se selecciona del grupo q ue consiste en: un tumor de cáncer de próstata, un tumor de cáncer de ovario, un tu mor de cáncer de mama, un melanoma, un tumor de cáncer de pulmón no microcítico, un tumor de cáncer de pulmón microcítico y un tumor de adenocarcinoma esofágico.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para enriquecer una población de células madre de tumores sólidos que comprenden: a) disociar un tumor sólido para generar células disociadas; b) poner en contacto las células disociadas con un reactivo que une CXCR 1 o FBX021 (u otra proteína de la Tabla 1 ) ; y c) seleccionar células que se unen al reactivo en condiciones de forma tal que se genere una población enriquecida para cél ulas madre de tumores de sólidos.

En algunas modalidades, no se emplean reactivos adicionales para generar la población enriquecida para células madre de tu mores de sólidos. En alg unas modalidades, el tu mor se selecci ona del grupo que consiste en: un tumor de cáncer de próstata, un tu mor de cáncer de ovario, un tumor de cáncer de mama, un melanoma, un tumor de cáncer de pul món no microcítico , un tumor de cáncer de pul món microcítico y un tu mor de adenocarci noma esofágico. En modalidades adicionales, el reactivo es un anticuerpo o un frag mento de anticuerpo (por ej. , un frag mento Fab) . En modalidades adicionales, el reactivo se conjuga con un fluorocromo o partículas magnéticas. En otras modalidades, la selección de cél ulas se realiza por citometría de flujo, separación cel ular activada por fluorescencia, adsorción , separación en columna por afinidad o selección magnética.

En modalidades particulares, la presente invención proporciona una población enriquecida de cél ulas madre de tumores sólidos aislados mediante los métodos descritos en la presente.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona poblaciones aisladas de células madre cancerosas que son: a) tumorigénicas y b) CXCR 1 + o FBX021 +. En algunas modalidades, las cél ulas madre cancerosas son células madre cancerosas seleccionadas del grupo que consiste en: células madre de cáncer de próstata, células madre de cáncer de ovario, cél ul as madre de cáncer de mama, células madre de cáncer de piel, células madre de cáncer de pulmón no microcítico, células madre de cáncer de pulmón microcítico y células madre de adenocarcinoma esofágico. En otras modalidades, la población comprende al menos 60% de células madre cancerosas y menos de 40% de células tumorales no tumorigénicas. En modalidades adicionales, las células madre cancerosas están enriquecidas al menos dos veces en comparación con las células tumorales no tumorigénicas sin fraccionar (por ej., 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces 10 veces,... 100 veces, ... 1000 veces).

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para obtener a partir de un tumor una composición celular que comprende células madre cancerosas y células tumorales no tumorigénicas, donde al menos el 60% son células madre tumorigénicas y el 40% o menos son células tumorales no tumorigénicas; el método comprende: a) obtener una mezcla disociada de células tumorales a partir de un tumor; b) separar la mezcla de células tumorales en una primera fracción que comprende al menos 60% de células madre cancerosas y 40% o menos de células tumorales no tumorigénicas y una segunda fracción de células tumorales reducida de células madre cancerosas donde la separación se da mediante el contacto de la mezcla con un reactivo contra CXCR1 o FBX021 y c) demostrar que la primera fracción es tumorigénica mediante: i) inyección en serie en un primer animal hospedador y la segunda fracción que no es tumorigénica mediante inyección en serie en un segundo animal hospedador. En algunas modalidades, la separación se realiza por citometría de flujo, separación celular activada por fluorescencia (FACS), adsorción, separación en columna por afinidad o selección magnética. En algunas modalidades, la separación se realiza por análisis de separadores celulares activados por fluorescencia (FACS).

En modalidades particulares, la presente invención proporciona métodos para seleccionar un tratamiento para un paciente que posee un tumor sólido, que comprenden: (a) obtener una muestra del paciente; (b) identificar la presencia de células madre de tumores sólidos CXCR1+ o FBX021+ en la muestra y (c) seleccionar un tratamiento para el paciente que se dirija a células madre de tumores sólidos CXCR1+ o FBX021+ (por ej., seleccionar el uso de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-CXCR1). En algunas modalidades, las células madre de tumores sólidos CXCR1+ o FBX021+ son células madre cancerosas seleccionadas del grupo que consiste en: células madre de cáncer de próstata, células madre de cáncer de ovario, células madre de cáncer de mama, células madre de cáncer de piel, células madre de cáncer de pulmón no microcítico, células madre de cáncer de pulmón microcítico y células madre de adenocarcinoma esofágico.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para analizar un compuesto, que comprenden: a) presentar una muestra que comprende una célula madre cancerosa CXCR1+ o FBX021+ a un compuesto antineoplásico candidato, donde el compuesto antineoplásico candidato comprende un antagonista de CXCR1 o FBX021 o un antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1 y b) detectar un cambio en la célula como respuesta al compuesto.

En algunas modalidades, la muestra comprende una mamoesfera no adherente. En modalidades adicionales, el antagonista de CXCR1 o FBX021 o el antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1 comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunas modalidades, el antagonista de CXCR1 es un derivado de Repertaxin. En otras modalidades, la detección comprende detectar la muerte celular de células de mama tumorigénicas. En modalidades adicionales, los métodos comprenden adicionalmente identificar el agente antineoplásico candidato como apto para matar células tumorigénicas así como células cancerosas no tumorigénicas.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para determinar la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la tumorigénesis de células madre de tumores sólidos que comprenden: a) obtener células madre de tumores sólidos enriquecidas, donde las células madre de tumores sólidos: i) están enriquecidas al menos dos veces en comparación con células tumorales sin fraccionar y ii) expresan CXCR1 o FBX021; b) exponer un primer set, pero no un segundo set, de células madre de tumores sólidos a un compuesto de prueba; c) inyectar el primer set de las células madre de tumores sólidos en un primer animal hospedador e inyectar el segundo set de células madre de tumores sólidos en un segundo animal hospedador y d) comparar un tumor, si estuviera presente, en el primer animal con un tumor formado en el segundo animal para determinar si el compuesto de prueba inhibe la formación tumoral. En modalidades particulares, el compuesto de prueba es un inhibidor de CXCR1 o FBX021 o un inhibidor de la senda IL8-CXCR1.

En modalidades adicionales, la presente invención proporciona métodos para determinar la capacidad de un compuesto de prueba para inhibir la tumorigénesis de células madre de tumores sólidos que comprenden: a) obtener una muestra que comprende al menos 60% de células madre de tumores sólidos, donde las células madre de tumores sólidos expresan CXCR1 o FBX021; b) inyectar las células madre de tumores sólidos en el primer y segundo animal hospedador; c) tratar el primer animal hospedador con un compuesto de prueba y no tratar el segundo animal hospedador con el compuesto de prueba y d) comparar un tumor, si existiera, en el primer animal con un tumor formado en el segundo animal para determinar si el compuesto de prueba inhibe la formación de tumores. En otras modalidades, el compuesto de prueba es un inhibidor de CXCR1 o FBX021 o un inhibidor de la senda IL8-CXCR1.

Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra que las poblaciones celulares ALDEFLUOR positiva de líneas celulares de cáncer de mama (MDA- MB-453, SUM159) poseen propiedades de células madre cancerosas. A-B, G-H. Análisis representativo por citometría de flujo de la actividad enzimática de ALDH en células MDA-MB-453 (A-B) y SUM159 (G-H). El ensayo ALDEFLUOR se realizó tal como se describe en el Ejemplo 1 a continuación. (C, I) La población ALDEFLUOR positiva fue capaz de generar tumores en ratones NOD/SCID que resumieron la heterogeneidad fenotípica del tumor i nicial . (F , L) Las curvas del crecimiento tumoral se grafican para disti ntas cantidades de células i nyectadas (para M DA-M B-453: 50 , 000 células, 5 ,000 células y 500 células y para SUM 1 59: 100, 000 células, 1 0, 000 cél ulas y 1 ,000 células) y para cada pobl ación (ALDEFLUOR positiva, ALDEFLUOR negativa, sin separar) . La ci nética del creci miento tumoral se correlaciona con la latencia y el tamaño de la formación del tumor y la cantidad de cél ulas de ALDEFLUOR positiva (F, L) . (D, J) Tinción H&E del sitio de inyección de células con ALDEFLUOR positiva, que revela la presencia de células tumorales (D: sitio de inyección de células con M DA- M B-453 ALDEFLUOR positiva y J : sitio de inyección de células con SUM59 ALDEFLUOR positiva) . (E, K) El sitio de inyección de células con ALDEFLUOR negativa contenía solo Matrigel residual, células apoptóticas y tejido de ratón (E: sitio de inyección de células con MDA-M B-453 ALDEFLUOR negativa y K: sitio de inyección de células con SUM59 ALDEFLUOR negativa). Los datos describen ± SD promedio.

La Figura 2 muestra la clasificación de poblaciones de ALD EFLUOR positiva o negativa aisladas de líneas cel ulares de mama basadas en la "firma de células madre cancerosas" . Figura 2A. La aglomeración jerárquica de 16 muestras basadas en una firma de expresión de 413 genes. Cada fila de la matriz de datos representa un gen y cada colu mna representa una muestra. Nótese la separación entre las muestras de ALDEFLUOR positiva (nombres subrayados) o negativa (nombre sin subrayar) con los 41 3 genes para 15 de las 16 muestras. Algunos genes incluidos en la firma se denomina por su abreviatura HUGO tal como se usa en 'Entrez Gene' (Genes regulados por disminución en las poblaciones de ALDEFLUOR positiva, se marcan con verde y los genes regulados por incremento en las poblaciones de ALDEFLUOR negativa se marcan con rojo). Fig. 2B-C. Para confirmar los resultados de la expresión génica, en un set de cinco líneas celulares de cáncer de mama separadas para el fenotipo ALDEFLUOR, la expresión de cinco genes discriminadores sobreexpresados en las poblaciones de ALDEFLUOR positiva (CXCR1/IL8RA, FBX021, NFYA, NOTCH2 y RAD51L1) se midieron mediante RT-PCR cuantitativo. En esta figura se presentan los niveles de expresión de RT-PCR cuantitativo de CXCR1 y FBX021. Los niveles de expresión génica medidos por RT-PCR cuantitativo confirman los resultados obtenidos usando micromatrices de ADN con un aumento de los niveles de ARNm de CXCR1 y FBX021 en la población ALDEFLUOR positiva comparado con la población ALDEFLUOR negativa (p<0.05).

La Figura 3 muestra el rol del eje IL8/CXCR1 en la regulación de células madre de cáncer de mama. A. Las células que expresan CXCR1 están contenidas en la población ALDEFLUOR positiva. Las poblaciones de ALDEFLUOR positiva y negativa de cuatro líneas celulares de mama diferentes (HCC1954, SUM159, MDA-MB-453, BrCa-MZ-01) se aislaron por FACS, fijaron y analizaron para la expresión de la proteína CXCR1 mediante inmunotinción y análisis de FACS. Las células de ALDEFLUOR positiva se vieron altamente enriquecidas en células de CXCR1 positiva en comparación con la población ALDEFLUOR negativa. B. Efecto del tratamiento con IL8 sobre la formación de una tumoresfera de tres líneas celulares diferentes (HCC1954, SUM159, MDA-MB-453). El tratamiento con IL8 aumentó la formación de tumoresferas primarias y secundarias en una modalidad dependiente de la dosis. C. Efecto del tratamiento con IL8 sobre la población ALDEFLUOR positiva de cuatro líneas celulares diferentes cultivadas en condiciones adherentes. IL8 aumentó la población ALDEFLUOR positiva en una modalidad dependiente de la dosis en cada una de las cuatro líneas celulares analizadas (* p<0.05/ ** p<0.01, diferencias estadísticamente importantes con respecto al grupo de referencia).

La Figura 4 muestra que las células de ALDEFLUOR positiva exponen un potencial metastásico aumentado. A. El eje IL8/CXCR1 está involucrado en la invasión de células madre cancerosas. El rol del eje IL8/CXCR1 fue evaluado en la invasión mediante un ensayo de invasión Matrigel usando suero o IL8 como atrayente para tres líneas celulares diferentes (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159). Las células de ALDEFLUOR positiva fueron 6 a 20 veces más invasivas que las células de ALDEFLUOR negativa (p<0.01). Al usar IL8 (100 ng/ml) como atrayente, se observó que un aumento importante de las células de ALDEFLUOR positiva estaban invadiendo a través de Matrigel en comparación con el suero como atrayente (p<0.05). En cambio, IL8 no tuvo efectos sobre la capacidad invasiva de la población ALDEFLUOR negativa. B-M. La población ALDEFLUOR positiva presentó un potencial metastásico aumentado. B-D. La cuantificación del flujo de fotones normalizado medido en intervalos semanales siguiendo la inoculación de 100,000 células infectadas con luciferasa de cada grupo (ALDEFLUOR positiva, ALDEFLUOR negativa, sin separar). E-J. Detección de metástasis utilizando el software de imágenes por biolumiscencia (E, G, I: Ratones boca abajo; F, H, J: Ratones boca arriba). Los ratones inoculados con células de ALDEFLUOR positiva desarrollaron varias metástasis localizadas en distintos sitios (hueso, músculo, pulmón, tejido blando) y mostraron una elevada emisión de flujo de fotones en comparación con los ratones inoculados con células sin separar, que no desarrollaron más que una metástasis por ratón. En cambio, los ratones inoculados con células de ALDEFLUOR negativa desarrollaron solo una pequeña metástasis ocasional que se vio limitada por los nodulos linfáticos. K-M. La confirmación histológica mediante tinción H&E de la metástasis en hueso (K), tejido blando (L) y músculo (M) que resulta de la inyección de células de ALDEFLUOR positiva.

La Figura 5 muestra el efecto de la inhibición de CXCR1 sobre la viabilidad de células tumorales (Fig. 5A) así como sobre la viabilidad de células madre cancerosas (Fig. 5B).

La Figura 6 muestra que el tratamiento con Repertaxin induce un efecto inespecífico mediado por la señalización del ligando FAS/FAS y muestra específicamente que la inhibición del crecimiento celular inducida por el tratamiento con Repertaxin se salvó parcialmente mediante la adición de un antagonista FAS y que las células tratadas con un agonista FAS mostraron una inhibición del crecimiento celular similar a las células tratadas con Repertaxin.

La Figura 7 muestra la activación de FAK, AKT y la activación de F0X0A3 sin tratamiento con Repertaxin (7A) y en presencia de Repertaxin (7B).

La Figura 8 muestra el efecto del Repertaxin, docetaxel o la combinación de los mismos en una línea celular de cáncer de mama (8A, SUM159) y tres xenoinjertos de cáncer de mama humano generados a partir de distintos pacientes (8B, MC1; 8C, UM2; y 8D, UM3).

La Figura 9 muestra el efecto del Repertaxin, docetaxel o el tratamiento de combinación en la población de células madre cancerosas tal como se evalúan en el ensayo de ALDEFLUOR en diversas líneas celulares que incluyen SUM159 (9A), MC1 (9B), UM2 (9C), UM3 (9D).

La Figura 10 muestra el efecto del Repertaxin, docetaxel o la combinación en diluciones en serie de tumores primarios (10A.

SUM159, 10B. MC1, 10C. UM2, 10D. UM3) implantados en el panículo adiposo mamario de ratones NOD-SCID secundarios.

La Figura 11 muestra que el tratamiento con Repertaxin reduce el potencial metastásico de la línea celular SUM159. La figura 11A muestra una cuantificación del flujo de fotones normalizado en intervalos semanales seguidos de la inoculación con células intracardíacas SUM159 administradas. La formación de metástasis se controló usando imágenes por bioluminiscencia (11B: Ratones tratados con solución salina; 11 C: Ratones tratados con Repertaxin).

La Figura 12 muestra representaciones de la superposición entre la subpoblación ALDEFLUOR positiva y la subpoblación CXCR1 positiva (superior) o subpoblación CXCR2 positiva (inferior) de células SU 159. B-C. Se cultivaron células SUM159 en condiciones adherentes y se trataron con repertaxin (100nM) o dos anticuerpos bloqueadores específicos para CXCR1 (10 g/ml) o CXCR2 (10pg/ml). Luego de tres días, el efecto sobre la población de células madre cancerosas se analizó usando el ensayo de ALDEFLUOR (B) y se accedió a la viabilidad celular luego de cinco días de tratamiento usando el ensayo MTT (C). Se observó una reducción importante de la población ALDEFLUOR positiva y viabilidad celular luego del tratamiento con repertaxin o anticuerpo anti-CXCR1. En cambio, no se observó un efecto importante con el anticuerpo anti-CXCR2. D. Luego de 4 días de tratamiento, la cantidad de células apoptóticas se evaluó utilizando un ensayo TUNEL. Se detectó el 36% de células apoptóticas (teñidas de verde) en células tratadas con repertaxin en comparación con las de referencia donde estaban presentes las células mayormente viables (teñidas de azul). E-F. Para determinar si la muerte celular se medió a través de un efecto inespecífico. Las poblaciones de CXCR1 positiva y de CXCR1 negativa se separaron en flujo y cada población se trató con diversas concentraciones de repertaxin (D). Se detectó una reducción en la viabilidad celular en poblaciones de CXCR1 positiva y no clasificadas mientras que no se observó ningún efecto en la población CXCR1 negativa (E). Se usó un medio condicionado dializado (dCM) de células de CXCR1 positiva tratadas durante tres días con repertaxin para tratar poblaciones de CXCR1 positiva separadas, de CXCR1 negativa o no clasificadas. Se usaron diluciones en serie del medio acondicionado dializado (Referencia, dCM 1/4, dCM 1/2, dCM 3/4, dCM). Luego de dos días de tratamiento, se evaluó la viabilidad celular usando el ensayo MTT. Se observó una enorme reducción en la viabilidad celular en ambas poblaciones de CXCR1 negativa y sin separar mientras que no se observó ningún efecto en la población CXCR1 positiva (F).

La Figura 13 muestra la tumorigenicidad de las poblaciones celulares de ALDEFLUOR positiva/CXCR1 positiva y ALDEFLUOR positiva/CXCR1 negativa de la línea celular SUM159. A. Se graficaron curvas de crecimiento tumoral para distintas cantidades de células inyectadas (50,000 células, 5,000 células, 1,000 células y 500 células) y para cada población de (ALDEFLUOR positiva/CXCR1 positiva, ALDEFLUOR positiva/CXCR1 negativa). Ambas poblaciones celulares generaron tumores. La cinética del crecimiento tumoral se correlaciona con la latencia y el tamaño de la formación del tumor y la cantidad de células inyectadas. B-C. Tumores generados por la población ALDEFLUOR positiva/CXCR1 positiva reconstituyó la heterogeneidad fenotípica del tumor inicial luego de pasajes seriados mientras que la población ALDEFLUOR positiva/CXCR1 negativa produjo tumores que contienen solamente células de ALDEFLUOR positiva/CXCR1 negativa. Transplantamos ambas poblaciones celulares para tres pasajes.

La Figura 14 muestra el efecto de bloqueo de CXCR1 sobre la formación de tumoresferas. Las células SUM159 y HCC1954 se cultivaron en condiciones adherentes y se trataron durante tres días con repertaxin (100nM), un anticuerpo bloqueador anti-CXCR1 (10pg/ml) o un anticuerpo bloqueador anti-CXCR2 (10pg/ml). Luego de tres días de tratamiento, las células se desprendieron y cultivaron en suspensión. Se evaluó la cantidad de tumoresferas formados luego de 5 días de cultivo. Se observaron resultados similares para ambas líneas celulares con una reducción importante en ia formación de tumoresferas primarias y secundarias en condiciones tratadas con repertaxin y anti CXCR1 en comparación con las de referencia. En cambio, el anticuerpo bloqueador anti-CXCR2 no tuvo efectos sobre la formación de tumoresferas.

La Figura 15 muestra el efecto de tratamiento con repertaxin sobre la viabilidad celular de las líneas celulares SUM159, HCC1954 y MDA-MB-453. La tres líneas celulares diferentes (SU 159, HCC1954, MDA- B-453) se cultivaron en condiciones adherentes y se trataron con repertaxin (100nM). La viabilidad celular se evaluó luego de uno, tres y cinco días de tratamiento usando el ensayo MTT. Se observó una reducción en la viabilidad celular luego de 3 días de tratamiento para la línea celular SUM159 y HCC1954. Sin embargo, el repertaxin no tuvo efecto sobre la viabilidad de las células MDA-MB 453.

La Figura 16 muestra el efecto de bloqueo de CXCR1 sobre la población ALDEFLUOR positiva in vitro. A-B. Se cultivaron células HCC1954 (A) y MDA-MB-453 (B) en condiciones adherentes y se trataron con repertaxin (100nM) o dos anticuerpos bloqueadores específicos para CXCR1 (10Mg/ml) o CXCR2 (10Mg/ml). Luego de tres días, el efecto sobre la población de células madre cancerosas se analizó usando el ensayo ALDEFLUOR. Para HCC1954, se observó una reducción importante de la población ALDEFLUOR positiva y la viabilidad celular luego del tratamiento con repertaxin o anticuerpo anti-CXCR1. En cambio, no se observó un efecto importante con el anticuerpo anti-CXCR2 (A). Para MDA-MB-453, no se observó ningún efecto sobre la población ALDEFLUOR positiva (B).

La Figura 17 muestra que el tratamiento con repertaxin induce un efecto inespecífico mediado por la señalización de ligando FAS/FAS. A. Para determinar si el efecto inespecífico de muerte inducido por el tratamiento con repertaxin estuvo mediado por el ligando FAS, se midió el nivel del ligando FAS soluble en el medio usando un ensayo ELISA. Luego de 4 días de tratamiento, se detectó un aumento mayor a cuatro veces del ligando FAS soluble en el medio de células tratadas con repertaxin en comparación con las de referencia no tratadas. B. Se midió el nivel de ARNm del ligando FAS mediante RT-PCR y confirmó el aumento de la producción de ligando FAS luego del tratamiento con repertaxin. Se observaron resultados similares luego de 4 días de tratamiento con el agonista FAS que activa la señalización de FAS con un aumento de cinco veces de ARNm del ligando FAS en comparación con la referencia. C. Las células SUM159 se cultivaron en condiciones adherentes y se trataron con repertaxin solo o en combinación con un ligando anti FAS. La inhibición del crecimiento celular inducido por el tratamiento con repertaxin se recuperó parcialmente por la adición del ligando anti FAS. Las células tratadas con un agonista FAS mostraron una inhibición de crecimiento celular similar a células tratadas únicamente con repertaxin. D-E. El efecto del tratamiento con repertaxin solo o en combinación con un ligando anti FAS y se analizó el tratamiento de un agonista FAS sobre la población CXCR1 positiva y ALDEFLUOR positiva. No se pudo recuperar la enorme reducción en la población CXCR1 positiva y ALDEFLUOR positiva inducido por tratamiento con repertaxin, mediante el ligando anti FAS y el tratamiento con agonista FAS produjo un aumento de diez veces y tres veces en el porcentaje de la población CXCR1 positiva y ALDEFLUOR positiva, respectivamente.

La Figura 18 muestra el efecto del agonista FAS sobre las células de CXCR1 positiva y CXCR1 negativa. Las poblaciones de CXCR1 positiva y de CXCR1 negativa se separaron en flujo y cada población se trató con diversas concentraciones del agonista FAS. Se detectó una reducción en la viabilidad celular en poblaciones de CXCR1 negativa y no clasificadas mientras que no se observó ningún efecto en la población CXCR1 positiva.

La Figura 19 muestra el análisis de la expresión de la proteína CXCR1 en la población normal madre/progenitor de mama y el efecto del tratamiento con IL-8 en la formación mamoesferas. Las poblaciones de ALDEFLUOR positiva y negativa de células aisladas epiteliales de mama normales de mamoplastias reductivas se aislaron mediante FACS, fijaron y analizaron para la expresión de la proteína CXCR1 mediante inmunotinción y análisis de FACS. Las células de ALDEFLUOR positiva se vieron altamente enriquecidas en células de CXCR1 positiva en comparación con la población ALDEFLUOR negativa. B-C. Efecto del tratamiento con IL8 sobre la formación de mamoesferas. El tratamiento con IL8 aumentó la formación de mamoesferas primarias (B) y secundarias (C) en una modalidad dependiente de la dosis.

La Figura 20 muestra el efecto del tratamiento con repertaxin sobre las células epiteliales mamarias normales. A. Las células epiteliales mamarias normales aisladas de mamoplastias reductivas se cultivaron en condiciones adherentes y se trataron con repertaxin (100nM o 500nM) o agonista FAS (500ng/ml). Luego de cinco días de tratamiento, se evaluó la viabilidad celular usando el ensayo MTT. El tratamiento con repertaxin del agonista FAS no tuvo efecto sobre la viabilidad de las células epiteliales mamarias normales cultivadas en condiciones adherentes, aun cuando se usaron altas concentraciones de repertaxin (500nM). B. El nivel del ligando FAS soluble se evaluó mediante el ensayo ELISA en un medio de células epiteliales mamarias normales tratadas con repertaxin. Luego de 4 días dé tratamiento se detectó un aumento del ligando FAS soluble en dicho medio a partir de las células tratadas. C. Análisis de la expresión de FAS/CD95 en células epiteliales mamarias normales mediante análisis FACS. No se detectó ninguna expresión de FAS/CD95 en las células epiteliales mamarias normales cultivadas en condición adherente. D. Efecto del tratamiento con repertaxin sobre la formación de mamoesferas. Las células epiteliales mamarias normales se cultivaron en condición adherente y se trataron durante cuatro, ocho, once y quince días con repertaxin (100n ). Luego del tratamiento con repertaxin, las células se desprendieron y cultivaron en suspensión. Se observó una reducción importante de células que inician mamoesferas en la condición tratada con repertaxin.

La Figura 21 muestra el efecto del tratamiento con repertaxin sobre la activación de FAK, AKT y FOX03a. Para evaluar el efecto del tratamiento con repertaxin sobre la señalización corriente abajo de CXCR1, se utilizaron dos construcciones diferentes, una que inactiva la expresión de PTEN a través de ARNsi de PTEN y la otra conduce a la sobreexpresión de FAK (Ad-FAK). A. Células del referencia SUM159, SUM159 ARNsi de PTEN y SUM159 Ad-FAK se cultivaron en condiciones adherentes durante dos días en ausencia o presencia de 100nM de repertaxin y se accedió a la activación de la senda de FAK/AKT por análisis de transferencia western. El tratamiento con Repertaxin llevó a una reducción en la fosforilación de FAK Tyr397 y AKT Ser473 mientras que la eliminación de PTEN y la sobreexpresión de FAK bloquearon el efecto del tratamiento con repertaxin sobre la actividad de FAK y AKT. B. Mediante el uso de tinción por inmunofluorescencia sobre células de CXCR1 positiva, confirmamos que el tratamiento con Repertaxin da como resultado una desaparición de la expresión fosfo-FAK (tinción membranosa en rojo) y fosfo-AKT (tinción citoplásmica en rojo). La tinción por inmunofluorescencia con un anti-FOX03A reveló una ubicación citoplásmica de FOX03a (en rojo) en las células sin tratar mientras que el tratamiento con repertaxin indujo una reubicación de FOX03A al núcleo. En cambio, las células con eliminación de PTEN o sobreexpresión de FAK muestran un alto nivel de expresión de fosfo-FAK, fosfo-AKT y de FOX03A citoplásmica tanto en células tratadas con repertaxin o sin tratar. En todas las muestras, los núcleos se sometieron a tinción de contraste con DAPI (en azul). C-D. El efecto del Repertaxin sobre la viabilidad celular de ARNsi de PTEN de SUM159 y Ad-FAK de SUM159 y sobre la población de células madre cancerosas se evaluó utilizando ensayos MTT y ALDEFLUOR, respectivamente. Luego de 3 días de tratamiento, las células con eliminación de PTEN o sobreexpresión de FAK desarrollaron resistencia al repertaxin (C). El tratamiento con Repertaxin no altera la proporción de células de inactivación de ALDEFLUOR positiva y SUM159 PTEN. (D).

La Figura 22 muestra el efecto del tratamiento con repertaxin sobre la viabilidad celular de las líneas celulares SU 159, HCC1954 y MDA-MB-453. Para evaluar el efecto del tratamiento con repertaxin sobre la señalización corriente abajo de CXCR1 utilizamos una construcción de lentivirus inactivando la expresión de PTEN a través de un ARNsi de PTEN. A. HCC1954 de referencia y las células HCC1954 ARNsi de PTEN se cultivaron en condiciones adherentes durante dos días en ausencia o presencia de 100nM de repertaxin y la activación de la senda de FAK/AKT se accedió mediante análisis de transferencia western. El tratamiento con Repertaxin llevó a una reducción en la fosforilación de FAK Tyr397 y AKT Ser473 mientras que la eliminación de PTEN bloqueó el efecto del tratamiento con repertaxin sobre la actividad de FAK y AKT. B. El tratamiento con repertaxin no tuvo efectos sobre la viabilidad celular de la línea celular MDA-MB-453 que albergan la mutación de PTEN. Usando el análisis de transferencia western confirmamos que la senda FAK/AKT no perturbó el tratamiento con repertaxin.

La Figura 23 muestra el efecto del repertaxin sobre la viabilidad celular de HCC1954 ARNsi de PTEN evaluado usando el ensayo MTT. Luego de 3 días de tratamiento, las células con eliminación de PTEN desarrollaron resistencia al repertaxin. 5 La Figura 24 muestra la expresión del ligando FAS y ARNm IL-8 luego del tratamiento con docetaxel y repertaxin medido por RT-PCR cuantitativo. A-B. Las células cultivadas SU 159 en condiciones adherentes se trataron con repertaxin (100nM), agonista FAS (500ng/ml) o docetaxel (10n ). Luego de tres días de tratamiento, las células se recogieron y se extrajo ARN. El docetaxel indujo tanto el ligando FAS (A) e IL-8 (B) ARNm en células SU 159. A. Un aumento de 4 veces del nivel de II-8 ARNm se detectó luego del tratamiento con agonista FAS o docetaxel (B).

La Figura 25 muestra la evaluación de la activación de PTEN/FAK/AKT en los tres xenoinjertos diferentes de cáncer de L5 mama. El análisis de transferencia western reveló que ambos xenoinjertos presentaron una expresión de PTEN y una activación de la senda FAK/AKT tal como se muestra en la fosforilación de FAK Tyr397 y AKT Ser473.

La Figura 26 muestra el efecto del tratamiento con repertaxin 20 sobre la población de células madre de cáncer de mama in vivo. A- C. Para evaluar el efecto del tratamiento con repertaxin en el crecimiento tumoral y la población de células madre cancerosas in vivo se usó una línea celular (SUM159) y los tres xenoinjertos de cáncer de mama humano generados a partir de diferentes pacientes 25 (MC1, U 2, U 3). A. Para cada muestra se inyectaron 50,000 células en un panículo adiposo mamario humanizado de ratones NOD/SCID y se controló el tamaño del tumor. Cuando los tumores fueron de alrededor de 4 mm, se Inició la inyección s.c. de repertaxin (15mg/Kg) dos veces al día durante 28 días o inyección I.P. de docetaxel una vez por semana (10mg/Kg) o la combinación (repertaxin/docetaxel). La gráfica muestra el tamaño del tumor antes y durante el transcurso de cada tratamiento indicado (flecha, comienzo del tratamiento). Se observaron resultados similares para cada muestra con una reducción estadísticamente importante del tamaño del tumor en grupos tratados solamente con docetaxel o la combinación de repertaxin/docetaxel comparados con los de referencia, mientras no se observó una diferencia entre el crecimiento de los tumores de referencia y los tumores tratados únicamente con repertaxin. B-C. Evaluación del tratamiento con repertaxin, docetaxel o el tratamiento combinado sobre la población de células madre cancerosas tal como se evalúa en el ensayo ALDEFLUOR (B) y por reimplantación en ratones secundarios (C). Los xenolnjertos de tumor tratados con docetaxel mostraron porcentajes similares o aumentados de células con ALDEFLUOR positiva comparado con las de referencia, mientras que el tratamiento únicamente con repertaxin o en combinación con docetaxel produjo una reducción estadísticamente importante en células con ALDEFLUOR positiva con una reducción de 65% a 85% en células madre cancerosas comparados las de referencia (p<0.01) (B). Diluciones seriadas de células obtenidas de tumores primarios, se implantaron en ratones sin tratar (referencia) y ratones tratados en un panículo adiposo mamario de ratones NOD/SCID secundarlos que no recibieron más tratamiento. Los tumores primarios de referencia y tratados con docetaxel formaron tumores secundarios en todas las diluciones mientras que solo cantidades de células mayores obtenidas de tu mores primarios tratados con repertaxi n o en combinación con docetaxel fueron capaces de formar tu mores. Además, se demoró considerablemente el creci miento tumoral y los tumores resultantes fueron considerablemente más pequeños que los tumores de referencia o tratados con docetaxel (C) . D. Los xenotransplantes de cada gru po se recogieron y se realizó una ti nción de inmunohistoquí mica para detectar la expresión de fosfo-FAK, fosfo-AKT, FOX03A y ALDH 1 . La expresión de fosfo-FAK membranoso y la expresión de fosfo-AKT citoplásmico (flecha) se detectó en los tumores de referenci a y en los tratados con docetaxel mientras que no se observó ni nguna expresión en los tumores tratados únicamente con repertaxin o en combinación con docetaxel . Se detectó la expresión de FOX03A nuclear (en color pardo) en las células tratadas únicamente con docetaxel o repertaxin o en com binación. Se detectó una reducción en la expresión de ALDH 1 (flecha) en tumores tratados con repertaxi n solo o en combi nación en comparación con los de referencia y tu mores tratados con docetaxel .

La Figura 27 muestra el efecto del tratamiento con repertaxin sobre la población de células madre de cáncer de mama in vivo. A-C. Para evaluar el efecto del tratamiento con repertaxin sobre el creci miento tumoral y la población de células madre cancerosas in vivo se usó una línea cel ular de cáncer de mama (SU M 1 59, A) y tres xenoinjertos de cáncer de mama humano generados a partir de diferentes pacientes.

Por ejemplo, se Inyectaron 50,000 células en un panículo adiposo mamario humanizado de ratones NOD/SCID y se controló el tamaño del tumor. Cuando los tumores fueron de alrededor de 4mm, se Inició la inyección s.c. de repertaxin (15mg/Kg) dos veces al día durante 28 días o inyección I.P. de docetaxel una vez por semana (10mg/Kg) o la combinación (repertaxin/docetaxel). La gráfica muestra el tamaño del tumor antes y durante el transcurso de cada tratamiento indicado (flecha, comienzo del tratamiento). Se observaron resultados similares para cada muestra con una reducción estadísticamente importante del tamaño de tumor en grupos tratados únicamente con docetaxel o la combinación de repertaxin/docetaxel en comparación con los de referencia, mientras no se observó una diferencia entre el crecimiento de los tumores de referencia y los tumores tratados únicamente con repertaxin. Se calculó la evaluación del tratamiento con repertaxin, docetaxel o el tratamiento combinado sobre la población de células madre cancerosas por medio del ensayo ALDEFLUOR y por reimplantación en ratones secundarios. Los xenoinjertos de tumor tratados con docetaxel mostraron porcentajes similares o aumentados de células con ALDEFLUOR positiva comparado con las de referencia, mientras que el tratamiento con repertaxin solo o en combinación con docetaxel produjo una reducción estadísticamente importante en células con ALDEFLUOR positiva con una reducción de 65% a 85% en células madre cancerosas en comparación con las de referencia (p<0.01) (B). Diluciones seriadas de células obtenidas de tumores primarios, ratones sin tratar (referencia) y ratones tratados se implantaron en un panículo adiposo mamario de ratones NOD/SCID secundarios que no recibieron más tratamiento. Los tumores primarios de referencia y tratados con docetaxel formaron tumores secundarios en todas las diluciones mientras que solo cantidades de células mayores obtenidas de tumores primarios tratados con repertaxin solo o en combinación con docetaxel fueron capaces de formar tumores. Se demoró considerablemente el crecimiento tumoral y los tumores resultantes fueron considerablemente más pequeños que los tumores de referencia o tratados con docetaxel.

La Figura 28 muestra el efecto del tratamiento con repertaxin sobre la población de células madre de cáncer de mama tal como se evaluó por el fenotipo CD44+/CD24. A-B. Se calculó la evaluación del tratamiento con repertaxin, docetaxel o el tratamiento combinado sobre la población de células madre cancerosas por medio de la presencia de células CD44+/CD24. En tumores residuales tratados únicamente con docetaxel, observamos sistemáticamente ya sea un porcentaje sin cambiar o aumentado de células CD44+/CD24 mientras que el tratamiento con repertaxin solo o en combinación con docetaxel dio como resultado una reducción de la población celular CD44+/CD24. A. Se presenta un análisis del gráfico de flujo para el xenoinjerto U 3. B. Se observaron resultados similares para MC1, U 2 y UM3. La mayoría de la células SUM159 son CD44+/CD24 en cualquier condición de tratamiento.

La Figura 29 muestra que el tratamiento con repertaxin reduce el desarrollo de metástasis sistémicas. Para evaluar el efecto del tratamiento con repertaxin sobre la formación de metástasis se infectaron líneas celulares de cáncer de mama HCC1954 (A), SU 159 (B), MDA-MB-453 (C) con un lentivirus que expresa luciferasa y se inocularon 250,000 células infectadas con luciferasa en ratones NOD/SCID a través de inyección intracardíaca. Los ratones se trataron 12 horas luego de la inyección intracardíaca ya sea con inyección s.c. de solución salina o inyección s.c. de repertaxin (15mg/kg), dos veces al día durante 28 días. La formación de metástasis se controló usando imágenes por bioluminiscencia. La cuantificación del flujo de fotones normalizado medido en intervalos semanales luego de la inoculación reveló una reducción estadísticamente importante en la formación de metástasis en repertaxin en comparación con referencias de salina para ratones inoculados con células HCC1954 o SUM159 (A-B). En cambio, el tratamiento con repertaxin no tuvo efectos sobre la formación de metástasis para ratones inyectados con células MDA-MB-453. (C). Confirmación histológica, mediante tinción H&E, de metástasis en huesos y tejido blando de ratones que no fueron tratados con repertaxin (D).

La Figura 30 muestra la señalización de IL-8/CXCR1 en células madre cancerosas tratadas con quimioterapia solo o en combinación con repertaxin. A. Representación de una potencial señalización de células IL-8/CXCR1 en células madre cancerosas. La activación de CXCR1 luego de la unión a IL-8 induce la fosforilación de la Cinasa de Adhesión Focal (FA ). La FAK activa fosforila AKT y activa la senda de WNT que regula la autorrenovación de células madre y FOX03A que regula la supervivencia celular. La activación de FAK protege las células madre cancerosas de un efecto inespecífico mediado por FAS/ligando FAS mediante la inhibición de FADD, un efector corriente abajo de la señalización de FAS. En presencia de quimioterapia, solo las células tumorales aparentes son sensibles al tratamiento y liberan un alto nivel de proteínas de IL-8 y ligando FAS durante procesos apoptóticos. Se estimulan las células madre cancerosas a través de un efecto inespecífico mediado por IL-8 y son resistentes al efecto inespecífico de matanza mediado a través del ligando FAS. B. El tratamiento con repertaxin bloquea la señalización de IL-8/CXCR1 e inhibe la autorrenovación y supervivencia de células madre de cáncer de mama. Cuando el tratamiento con repertaxin se combina con quimioterapia se sensibilizan las células madre cancerosas con el efecto inespecífico de muerte mediado por el ligando FAS.

Definiciones Para que sea más fácil entender la presente invención, se definen a continuación algunos términos y frases.

Tal como se usa en la presente, los términos "agente anticanceroso", "agente anticanceroso convencional" o "fármaco terapéutico para el cáncer" se refieren a todo agente terapéutico (por ej., compuestos quimioterapéuticos y/o compuestos terapéuticos moleculares), terapias de radiación o intervenciones quirúrgicas, usado en el tratamiento de cáncer (por ej., en mamíferos).

Tal como se usa en la presente, los términos "fármaco" y "agente quimioterapéutico" se refieren a moléculas activas farmacológicas que se usan para diagnosticar, tratar o prevenir enfermedades o estados patológicos en un sistema fisiológico (por ej., un sujeto o células, tejidos y órganos in vivo, in vitro o ex vivo). Los fármacos actúan alterando la fisiología de un organismo, tejido, célula o sistema in vitro viviente al que la droga se ha administrado. Con los términos "fármaco" y "agente quimioterapéutico" se pretende comprender compuestos antihiperproliferativos y antineoplásicos así como otros compuestos terapéuticos biológicos.

Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad efectiva puede administrarse en una o dos administraciones.

Tal como se usa en la presente, el término "administración" se refiere a la acción de proporcionar un fármaco, profármaco, anticuerpo u otro agente o tratamiento terapéutico a un sistema fisiológico (por ej., un sujeto o células, tejidos y órganos in vivo, in vitro o ex vivo). Ejemplos de rutas de administración al cuerpo humano pueden ser los ojos (oftálmica), boca (oral), piel (transdérmico), nariz (nasal), pulmones (inhalación), mucosa oral (bucal), oído, por inyección (por ej., de forma intravenosa, subcutánea, intratumoral, intraperitoneal, etc.) y similares.

"Administración conjunta" se refiere a la administración de más de un agente terapéutico (por ej., terapia de radiación) a un sistema fisiológico (por ej., un sujeto o células, tejidos y órganos in vivo, in vitro o ex vivo). "Administración conjunta" de los agentes químicos correspondientes (por ej., antagonista de la senda IL8-CXCR1 y agentes quimioterapéuticos adicionales) puede ser concomitante o en orden temporal o en combinación física.

Tal como se usa en la presente, el término "regresión" se refiere a regresar un sujeto, célula, tejido u órgano enfermo a un estado no patológico o menos patológico en comparación con un sujeto, célula, tejido u órgano de ejemplo no patogénico. Por ejemplo, la regresión de un tumor incluye una reducción de la masa tumoral así como una completa desaparición de un tumor o tumores.

Tal como se usa en la presente, "in vitro" se refiere a un ambiente artificial y a procesos o reacciones que ocurren dentro del ambiente artificial. Los ambientes in vitro pueden consistir en, pero sin limitación, tubos de ensayo y cultivos celulares. El término "in vivo" se refiere al ambiente natural (por ej., un animal o una célula) y a procesos o reacciones que ocurren dentro de un ambiente natural.

Tal como se usa en la presente, el término "cultivo celular" se refiere a cualquier cultivo celular in vitro. Incluido dentro de este término se encuentran líneas celulares continuas (por ej., con un fenotipo inmortal), cultivos celulares primarios, líneas celulares limitadas (por ej., células no transformadas) y toda otra población celular mantenida in vitro, incluidos ovocitos y embriones.

Tal como se usa en la presente, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a organismos a ser tratados con métodos de la presente invención. Tales organismos incluyen, pero no se limitan a, animales humanos y veterinarios (perros, gatos, caballos, cerdos, ganado, ovejas, cabras y similares). En el contexto de la invención, el término "sujeto" o "paciente" se refiere en general a un individuo que recibirá o que ha recibido tratamiento.

El término "diagnosticado", tal como se usa en la presente, se refiere al reconocimiento de una enfermedad por sus signos y síntomas o análisis genéticos, análisis patológicos, análisis histológicos y similares.

Tal como se usa en la presente, el término "antisentido" se usa con referencia a secuencias de ácido nucleico (por ej., ARN, ADN fosforotioato) que son complementarias con una secuencia de ARN específica (por ej., ARNm). Incluidas dentro de esta definición están las moléculas de ARN antisentido naturales o sintéticas, incluidas moléculas que regulan la expresión génica tal como ARN pequeño de interferencia o micro ARN. Un tipo de secuencia antisentido que puede usarse en la presente invención es el tipo específico para CXCR1 ARNm.

El término "compuesto de prueba" o "compuesto candidato" se refiere a una entidad química, farmacéutica, un fármaco o similar, que puede usarse para tratar o prevenir una enfermedad, un mal, una dolencia o un trastorno de la función corporal o de otra manera alterar el estado fisiológico o celular de una muestra. Los compuestos de prueba comprenden tanto compuestos terapéuticos conocidos como potenciales. Puede determinarse que un compuesto de prueba sea terapéutico mediante el uso de métodos de análisis de la presente invención. Un "compuesto terapéutico conocido" se refiere a un compuesto terapéutico que ha demostrado (por ej., a través de pruebas con animales o previas experiencias con administración a humanos) ser efectivo en dicho tratamiento o prevención. En modalidades preferidas, los "compuestos de prueba" son agentes anticancerosos. En modalidades particularmente preferidas, los "compuestos de prueba" son agentes anticancerosos que inducen apoptosis en las células.

Tal como se usa en la presente, el término "proteína de unión al antígeno" se refiere a proteínas que se unen a un antígeno específico. Las "proteínas de unión al antígeno" incluyen pero no se limitan a, inmunoglobulinas, incluidos anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena simple y humanizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 y bibliotecas de expresión de Fab. Varios procedimientos conocidos en la técnica son usados para la producción de anticuerpos policlonales. Para la producción de anticuerpos, se inmunizan varios animales hospedadores mediante inyección del péptido correspondiente al epítopo deseado incluyendo pero sin limitación, conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, etc. En una modalidad preferida, el péptido se conjuga con un portador inmunogénico (por ej., toxoide de difteria, albúmina de suero bovino (BSA) o lapa californiana (KLH). Se usan varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmune dependiendo de las especies hospedadoras, incluyendo pero sin limitación, Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, tensoactivos, sustancias tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (Bacillus de Calmette y Guerin) y Corynebacterium parvum.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivos (ver por ej., Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Estas incluyen pero no se limitan a, la técnica de hibridoma desarrollada originalmente por Kóhler y ilstein (Kóhler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (ver, por ej., Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72 (1983)), y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., in Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 (1985)).

De acuerdo con la invención, los métodos descritos para la producción de anticuerpos de cadena simple (U.S. 4,946,778, que se incorpora a la presente a modo de referencia) pueden adaptarse para producir anticuerpos específicos de cadena simple según se desea. Una modalidad adicional de la invención utiliza los métodos conocidos en la técnica para la construcción de bibliotecas de expresión de Fab (Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989)) para permitir una rápida y fácil identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que contienen el idiotipo (región de unión al antígeno) de la molécula de anticuerpo mediante métodos conocidos. Por ejemplo, estos fragmentos incluyen pero no se limitan a: el fragmento F(ab')2 que puede producirse mediante la digestión de pepsina de una molécula de anticuerpo; el fragmento Fab' que puede generarse mediante la reducción de puentes de disulfuro de un fragmento F(ab')2 y los fragmentos Fab que pueden generarse tratando una molécula de anticuerpo con papaína y un agente reductor.

Los genes que codifican proteínas de unión al antígeno pueden aislarse mediante métodos conocidos en la técnica. En la producción de anticuerpos, el análisis del anticuerpo deseado puede lograrse mediante métodos conocidos en la técnica (por ej., radioinmunoensayo, ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), inmunoensayos "intercalados", ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipltina en geles de difusión, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos ¡n situ (usando oro coloidal, marcadores de enzima o radioisótopo, por ejemplo), transferencias western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ej., ensayos de aglutinación de gel, ensayos de hemoaglutinación, etc.) ensayos de fijación complementaria, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.), etc.

Tal como se usa en la presente, el término "modular" se refiere a la actividad de un compuesto para afectar (por ej., promover o retardar) un aspecto de la fusión celular incluyendo pero sin limitación a crecimiento, proliferación, invasión, angiogénesis, apoptosis celular y similares.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona métodos para tratar cáncer mediante la administración de un inhibidor de la senda IL8-CXCR1 (por ej., un anticuerpo anti-CXCR1 o Repertaxin) solo o en combinación con un agente quimioterapeutico adicional de manera tal que se maten las células de cáncer no tumorigénicas y tumorigénicas en un sujeto. La presente invención también proporciona composiciones y métodos para tratar y diagnosticar la presencia de células madre de tumores sólidos en un paciente (por ej., con base en la presencia de CXCR1 o FBX021).

I. Células cancerosas tumorigénicas, inhibición de ALDH, CXCR1 y CXCR1 La evolución de una célula normal en una totalmente transformada requiere la desregulación de procesos celulares múltiples (1, 2). De acuerdo con los modelos clásicos de carcinogénesis, estos eventos pueden ocurrir en cualquier célula. En cambio, la "hipótesis de células madre cancerosas" sostiene que las dianas preferenciales de transformación oncogénica son células madre de tejido o células progenitoras precoces que han adquirido un potencial de autorrenovación (3-6). Estas "células que inician tumores" o "células madre cancerosas" (CSC), a su vez, se caracterizan por su capacidad para experimentar autorrenovación, un proceso que dirige la tumorigénesis y la diferenciación que contribuye a la heterogeneidad celular del tumor. Se han generado pruebas recientes que apoyan la hipótesis de células madre cancerosas utilizando xenoinjertos de tumores humanos primarios. Estos estudios han sugerido que los tumores están compuestos de una jerarquía celular conducida por el componente de células madre cancerosas. Además, datos recientes sugieren que las líneas celulares inmortalizadas derivadas de tejidos tanto humanos como murinos también pueden contener una población celular que exhibe propiedades de células madre. La mayoría de estos estudios se han basado en propiedades in vitro incluyendo potencial clonogénico, formación de esferas y potenciales de diferenciación multilinaje (7-10) . Estudios más limitados que utilizan un transplante funcional de líneas celulares inmortalizadas en xenoinjertos también han sugerido la existencia de tal jerarquía. Estos estudios han usado generalmente exclusión de tinte de Hoechst para identificar la llamada "población lateral" (SP) (7 , 9, 1 1 ) . Además, los marcadores de superficie celular definidos usando los xenoinjertos de tumores pri marios tales como CD44 y CD 1 33, también se han utilizado para identificar las poblaciones similares en líneas celulares establecidas (7-8) .

Tal como se descri be en los Ejemplos a continuación , la expresión del marcador de células madre de aldehido deshidrogenasa (ALDH) se estudió en series de 23 líneas celulares derivadas de cánceres de mama humanos y cél ulas de mama no transformadas. El ALDH es una enzi ma detoxificante responsable de la oxidación de aldehidos intracelulares y se cree que juega un papel en la diferenciación de células madre a través del metabolismo de ácido retiniano a retinoico (12, 1 3) . La actividad de ALDH seg ún se evalúa por el ensayo ALDEFLUOR fluorescente se ha utilizado exitosamente para aislar células madre cancerosas en mieloma múltiple y leucemia mieloide aguda (AML) así como de tumores cerebrales (14- 16) . Se ha demostrado recientemente q ue la actividad de ALDH puede utilizarse para aislar una subpoblación de células que exhiben propiedades de células madre de tejido mamario humano normal y carcinomas de mama ( 17) . La población ALDEFLUOR positiva aislada del tejido de mamoplastia red uctiva es capaz de reconstituir estructuras alveolares ductales en panículos adiposos mamarios de ratones NOD/SC I D humanizados.

Además, las células con ALDEFLUOR positiva aisladas de carcinomas mamarios humanos poseen propiedades de células madre según lo demuestra su capacidad para reconstituir tumores en pasajes seriados en ratones NOD/SCID así como para generar la heterogeneidad fenotípica de los tumores iniciales (17). En los Ejemplos a continuación, se demuestra que la mayoría de las líneas celulares de células madre cancerosas contienen una población ALDEFLUOR positiva con un perfil molecular definido que exhibe propiedades de células madre cancerosas.

Tal como se describe en los Ejemplos a continuación, el trabajo conducido durante el desarrollo de las modalidades de la presente invención identificó la CXCR1 (un receptor de la quimiocina inflamatoria IL-8) como un marcador de células madre cancerosas. Solo las células dentro de la población ALDEFLUOR positiva expresaron CXCR1. Además, se ha demostrado que este receptor juega un papel funcional en lo referente a que IL8 recombinante es capaz de aumentar la proporción de células madre en líneas celulares según lo determinado por los ensayos de Aldefluor y de formación de esferas. Aunque se ha informado que IL8 está asociado con cánceres de mama agresivos y es mayor en el suero de mujeres con enfermedades metastásicas, se cree que la presente invención es la primera en mostrar una conexión funcional entre IL8 y su receptor de CXCR1 en células madre.

Tal como se describe adicionalmente en los Ejemplos a continuación, se ha demostrado que puede dirigirse selectivamente a células madre cancerosas bloqueando el receptor de CXCR1 en estas células. En un enfoque descrito en los Ejemplos, las líneas celulares de cáncer de mama se trataron con anticuerpos monoclonales para CXCR1, pero no para el otro receptor IL8 de CXCR2. Dicho tratamiento se dirige selectivamente a células madre cancerosas como se demuestra en las poblaciones ALDEFLUOR positiva reducidas. Increíblemente, se encontró que aunque CXCR1 solo se expresa en un muy pequeño porcentaje de células (por ej., menos del 1%) en comparación con el bloqueo del receptor de CXCR1 indujo la muerte celular en la mayoría de otras células cancerosas a pesar del hecho de que carecen del receptor de CXCR1. Se ha elucidado la senda molecular que media los efectos de IL sobre las células madre cancerosas y supone el llamado "efecto inespecífico" de matar otras células. IL8 estimula la autorrenovación de células madre mediante la unión a CXCR1 que a su vez activa la adhesión focal de la senda de la cinasa Fak. Esto da como resultado la activación de Akt la cual dirige la autorrenovación de células madre. Cuando la senda está bloqueada en células madre cancerosas, la reducción en la señalización de Akt causa el secuestro citoplásmico de los factores de transcripción Foxo dando como resultado una síntesis aumentada del ligando Fas. El ligando Fas se secreta a partir de células madre cancerosas e induce la muerte celular en células circundantes que contienen el receptor de Fas.

Mientras que la presente invención no está limitada a ningún mecanismo particular y no es necesario un entendimiento del mecanismo para ensayar la presente invención, se cree que CXCR1 media la autorrenovación de células madre cancerosas a través de una senda que involucra Fak y Akt y que el bloqueo de esta senda induce la muerte celular en células madre cancerosas así como en células tumorales circundantes. Así, en algunas modalidades, la presente invención proporciona compuestos y métodos para alterar la senda de IL8-CXCR1 (por ej., con anticuerpos anti-CXCR1, anticuerpos anti-FAK u otros agentes) para tratar cáncer.

Ya que IL8 es una quimiocina involucrada en la inflamación tisular, se ha mostrado interés en el desarrollo de inhibidores de la señalización de IL8. Se ha desarrollado un inhibidor de molécula pequeña, Repertaxin, como un agente antiinflamatorio para reducir potencialmente complicaciones como infarto de miocardio y apoplejía. El Repertaxin se ha introducido en pruebas clínicas de fase I y fase II y ha mostrado poca toxicidad. Tal como se muestra en los Ejemplos a continuación, el Repertaxin (como anticuerpos anti-CXCR1) es capaz de dirigirse a células madre cancerosas así como de inducir apoptosis mediada por el ligando Fas mediante el efecto inespecífico en células circundantes. De manera importante, en xenoinjertos de tumores, el Repertaxin potencia el efecto de la quimioterapia. Además, a diferencia de la quimioterapia que preferentemente destruye las células diferenciadas en tumores reduciendo las células madre cancerosas, el Repertaxin es capaz de dirigirse a células madre cancerosas. Tal como se muestra en los ejemplos, esto se demostró mediante una reducción en la población Aldefluor en tumores tratados con Repertaxin y mediante la reducción de la capacidad de esas células tumorales tratadas para formar tumores secundarios en ratones. También se probaron los efectos del Repertaxin sobre la capacidad de bloquear metástasis. Las células tumorales se marcaron con luciferasa y se inyectaron de forma intracardíaca en un modelo de metástasis experimental. Un día después de introducirse las células tumorales, un grupo de animales se colocó sobre repertaxin solo y el otro no se sometió a tratamiento. El Repertaxin redujo significativamente el desarrollo de metástasis.

La presente invención identificó el receptor IL8 de CXCR1 como diana al tratar las células madre cancerosas. El inhibidor de molécula pequeña Repertaxin inhibe tanto CXCR1 y CXCR2. Los Ejemplos demostraron que CXCR1 es el receptor más importante en las células madre cancerosas. Además, los Ejemplos indican que la falla de la quimioterapia citotóxica en tratar afectivamente cánceres establecidos no se tienen por qué deber a la incapacidad de esta terapia para dirigir células madre cancerosas pero además del aumento documentado de secreción de IL8 tras un tratamiento quimioterapéutico citotóxico tumoral. Los presentes Ejemplos indican que el uso de inhibidores de CXCR1 tienen efectos beneficiosos en su capacidad de dirigir específicamente células madre cancerosas así como bloquear la estimulación de IL8 de estas células inducidas por quimioterapia citotóxica.

El direccionamiento de la senda IL8-CXCR1 no se encuentra limitado al cáncer de mama sino que puede emplearse en cualquier tipo de cáncer. Preferentemente, el tipo de cáncer tratado es uno donde existen pruebas de una producción de IL8 aumentada (por ej., junto con quimioterapia). Los agentes quimioterapéuticos han demostrado regular directamente la transcripción de IL8 en células cancerosas. El paclitaxel aumenta la transcripción de IL8 y la secreción en líneas celulares de ovario, mama y pulmón (Uslu et al., 2005, Int. J. Gynecol. Cáncer, 15:240-245 y Collins et al., 2000, Can. Imm. Immuno., 49:78-84, ambos incorporados a la presente a modo de referencia). También, la administración de adriamicina y 5-fluoro-2'-desoxiuridina para células de cáncer de mama (DeLarco et al., 2001, Can. Res. 61:2857-2861, incorporados a la presente a modo de referencia), la adición de 5-FU a células de cáncer oral (Tamatani et al., 2004, Int., J. Can., 108:912:921, incorporados a la presente a modo de referencia), adición de doxorubicina a células de cáncer de pulmón microcítico (Shibakura et al., 2003, Int. J. Can., 103:380-386, incorporados a la presente a modo de referencia) y administración de dacarbazina a células de melanoma (Lev et al., 2003, Mol., Can. Ther., 2:753-763, incorporados a la presente a modo de referencia) todos dieron como resultado una expresión aumentada de CXCL8. Como tal, en algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes para dirigir IL-CXCR1 en combinación con agentes quimioterapéuticos (por ej., tales como aquellos mencionados en las referencias anteriores) para tratar a un sujeto con un tipo de cáncer que incluye pero no se limita a cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer de mama, melanoma, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico y adenocarcinoma esofágica.

La presente invención no se limita al tipo de cáncer tratado y en cambio incluye pero no se limita a, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de células básales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarclnomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncógeno, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma de vejiga carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemagioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.

II. Detección de Marcadores Cancerígenos de Células madre de tumores sólidos En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para detectar la expresión de marcadores cancerígenos de células madre (por ej., CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP y otras proteínas de la Tabla 1). En algunas modalidades, la expresión se mide directamente (por ej., en el nivel de ARN o proteína). En algunas modalidades, la expresión se detecta en muestras de tejido (por ej., tejido de biopsia). En algunas modalidades, la expresión se detecta en fluidos corporales (por ej., incluidos pero sin limitación, plasma, suero, sangre, mucosa y orina).

La presente invención proporciona adicional mente paneles y kits para la detección de marcadores. En alg unas modalidades, la presencia de un marcador de cáncer de células madres se usa para proporcionar el pronóstico a un sujeto. La información provista también se usa para dirigir el curso del tratamiento. Por ejemplo, si se encuentra que un sujeto tiene un marcador indicativo de una célula madre de tumor sólido (por ej. , CXCR1 , FBX021 , NFYA, NOTCH2, RAD51 L1 , TBP y otras proteínas de ia Tabla 1 ) , pueden iniciarse terapias adicionales (por ej. , terapias de radiación) en un momento anterior cuando es más probable que sean efectivos (por ej . , antes de las metástasis) . Además, si se encuentra que un sujeto tiene un tumor que no responde a cierta terapia, pueden evitarse gastos e inconvenientes de tales terapias.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona un panel para el análisis de una pluralidad de marcadores (por ej . , la combinación de CXCR1 o FBX021 y al menos uno de CD44, CD24 y ESA) . El panel permite el análisis simultáneo de múltiples marcadores correlativos con carcinogénesis y/o metástasis. Dependiendo del sujeto, los paneles pueden analizarse solos o en combinación para proporcionar el mejor diagnóstico y el mejor pronóstico posibles. Los marcadores para inclusión en un panel se seleccionan mediante análisis para su valor predictivo usando un método adecuado incluidos pero sin li mitación , aquellos descritos en los ejemplos ilustrativos a continuación . 1 . Detección de ARN En algunas modalidades, ia detección de marcadores cancerígenos de células madre de tumores sólidos se detectan midiendo la expresión del ARNm correspondiente en una muestra de tejido. La expresión de ARNm puede medirse por cualquier método adecuado, incluyendo pero sin limitarse a aquellos descritos a continuación. El No. de acceso para ácido nucleico CXCR1 humano es NM_000634 (incorporado a la presente a modo de referencia) y el No. de acceso para FOX021 humano es NM_033624 (incorporado a la presente a modo de referencia). Estas secuencias pueden usarse para designar cebadores y sondas (así como secuencias de ARNsi).

En algunas modalidades, el ARN se detecta por análisis de transferencia Northern. El análisis de transferencia Northern involucra la separación de ARN y la hibridación de una sonda marcada complementaria.

En aun modalidades adicionales, el ARN (o el ADNc correspondiente) se detecta por hibridación a una sonda de oligonucleótidos. Se encuentra disponible una variedad de ensayos de hibridación usando una variedad de tecnologías para la hibridación y detección. Por ejemplo, en algunas modalidades, se utiliza el ensayo Taq an (PE Biosystems, Foster City, CA; ver por ej., Patentes estadounidenses N° 5,962,233 y 5,538,848, cada uno incorporado a la presente a modo de referencia). El ensayo se realiza durante una reacción de PCR. El ensayo TaqMan explota la actividad de exonucleasa 5'-3' de la polimerasa AMPLITAQ GOLD DNA. Se incluye una sonda que consiste en un oligonucleótido con un colorante informante 5' (por ej., un colorante fluorescente) y un colorante inhibidor de la fluorescencia 3', en la reacción de PCR. Durante el PCR, si la sonda está unida a su diana, la actividad nucleolítica de 5'-3" de la polimerasa AMPLITAQ GOLD escinde la sonda entre el colorante informante y el colorante inhibidor de la fluorescencia. La separación entre el colorante informante y el colorante inhibidor de la fluorescencia da como resultado un aumento en la fluorescencia. La señal se acumula con cada ciclo de PCR y puede controlarse con un fluorímetro.

En aun otras modalidades, la PCR transcriptasa inversa (RT-PCR) se usa para detectar la expresión de ARN. En la RT-PCR, el ARN se convierte enzimáticamente en ADN complementario o "ADNc" usando una enzima transcriptasa inversa, El ADNc luego se usa como plantilla para una reacción de PCR. Los productos de PCR pueden detectarse mediante cualquier método adecuado, incluido pero sin limitación, electroforesis en gel y tinción con un colorante de ADN específico o hibridación a una sonda marcada. En algunas modalidades, el método de PCR transcriptasa inversa cuantitativa con mezclas estandarizadas de plantillas competitivas se describen en las patentes estadounidenses 5,639,606, 5,643,765 y 5,876,978 (cada una incorporada a la presente a modo de referencia). 2. Detección de proteínas En otras modalidades, la expresión génica de marcadores de cáncer de células madre se detecta mediante la expresión de la proteína o el polipéptido correspondiente (por ej., CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP y otras proteínas de la Tabla 1). La expresión de proteínas puede detectarse mediante cualquier método adecuado. En algunas modalidades, las proteínas pueden detectarse mediante inmunohistoquímica. En otras modalidades, las proteínas pueden detectarse mediante su unión a un anticuerpo desarrollado contra la proteína. El No. de acceso para la proteína CXCR1 humana es NM_000625 (incorporado a la presente a modo de referencia) y el No. de acceso para FOX021 humano es NP_296373 (incorporado a la presente a modo de referencia). La generación de anticuerpos se describe a continuación.

La unión al anticuerpo se detecta mediante métodos conocidos en la técnica (por ej., radioinmunoensayo, ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas), inmunoensayos "intercalados", ensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitina en geles de difusión, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos in situ (por ej., usando oro coloidal, marcadores de enzima o radioisótopo, por ejemplo), análisis de transferencia western, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ej., ensayos de aglutinación de gel, ensayos de hemoaglutinación, etc.) ensayos de fijación complementaria, ensayos de inmunofluorescencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.), etc.

En una modalidad, la unión al anticuerpo se detecta mediante la detección de un marcador en el anticuerpo primario. En otra modalidad, el anticuerpo primario se detecta mediante la detección de la unión de un anticuerpo secundario o un reactivo al anticuerpo primario. En una modalidad adicional, se marca el anticuerpo secundario. Muchos métodos se conocen en la técnica para la detección de la unión en un inmunoensayo y se encuentran dentro del ámbito de la presente invención.

En algunas modalidades, se usa un ensayo de detección automatizado. Métodos para la automatización de inmunoensayos incluyen aquellos descritos en las patentes estadounidense N° 5,885,530, 4,981,785, 6,159,750 y 5,358,691, cada uno incorporado a la presente a modo de referencia. En algunas modalidades , el análisis y la presentación de los resultados también están automatizados. Por ejemplo, en algunas modalidades, se utiliza un software que genera un pronóstico basado en la presencia o ausencia de una serie de proteínas que corresponde a un marcador cancerígeno.

En otras modalidades , el inmunoensayo descrito en las patentes estadounidenses N° 5,599,677 y 5 ,672,480; cada uno incorporado a la presente a modo de referencia. 3. Tecnología de micromatrices de ADNc Las micromatrices de ADNc están compuestas de múltiples (normalmente miles) de diferentes ADNc detectados (normalmente usando un dispositivo de detección robótico) en ubicaciones en un soporte sólido, tal como un portaobjetos de vidrio. Los ADNc se obtienen típicamente mediante amplificación por PCR de insertos de biblioteca de plásmidos usando cebadores complementarios a la porción principal de vector del plásmido o al gen en sí mismo donde se conoce la secuencia. Los productos de PCR adecuados para la producción de micromatrices tienen típicamente entre 0.5 y 2.5 kB de longitud. Puede elegirse ADNc de longitud total , marcador de secuencia expresada (EST) o ADNc elegidos al azar de cualquier biblioteca de interés. Los EST son ADNc secuenciados parcialmente tal como se describe, por ejemplo en Hillier, et al ., 1 996, 6: 807-828. Aunque algunos EST corresponden a genes conocidos, normal mente existe muy poca o nada de información en cuanto a un EST particular salvo por una peq ueña cantidad de secuencia 3' y/o 5' y posiblemente, el tejido de origen del ARNm del que se derivó el EST.

Tal como será apreciado por un experto en la técnica, en general los ADNc contienen suficiente información de secuencia para identificar exclusivamente un gen dentro del genoma humano. Además, en general los ADNc tienen la longitud suficiente para hibridizar, selectivamente, específicamente o exclusivamente, a ADNc obtenido de un ARNm derivado de un gen único en condiciones de hibridación del experimento.

En un experimento típico de micromatriz, la micromatriz se hibridizó con poblaciones de ARN, ADN o ADNc marcados diferencialmente derivadas de dos muestras distintas. Los ARN más comunes (ya sea ARN total o poliA+ARN) se aislan a partir de células o tejidos de interés y se transcriben de forma inversa para proporcionar ADNc. El marcado se realiza normalmente durante la transcripción inversa mediante la incorporación de un nucleótido marcado en la mezcla de reacción. Aunque pueden usarse varios marcadores, el nucleótido más comúnmente se conjuga con los tintes fluorescentes Cy3 o Cy5. Por ejemplo, pueden usarse Cy5-dUTP y Cy3-dUTP. El ADNc derivado de una muestra (que representa, por ejemplo, un tipo celular, tipo dé tejido o condición de crecimiento particular) se marca con un fluoróforo mientras que el ADNc derivado de una segunda muestra (que representa, por ejemplo, un tipo celular, tipo de tejido o condición de crecimiento diferente) se marca con el segundo fluoróforo. Se cohibridizan cantidades similares de material marcado de las dos muestras a la micromatriz. En el caso del experimento de micromatriz donde las muestras se marcan con Cy5 (que fluoresce rojo) y Cy3 (que fluoresce verde), los datos primarios (obtenidos por el análisis de la micromatriz usando un detector capaz de detectar cuantitativamente la i ntensidad de fluorescencia) son proporciones de fluorescencia-intensidad (rojo/verde/R/V) . Estas proporciones representan concentraciones relativas de moléculas de ADNc que hibridan el ADNc representado en la micromatriz y por tanto reflejan los niveles de expresión relativa de ARNm que corresponde a cada ADNc/gen representado en la micromatriz. * Cada experi mento de micromatriz puede proporcionar decenas de miles de funciones de datos, cada uno representando la expresión relativa de un gen particular en las dos muestras. La organización y el análi sis apropiados de los datos son de mucha importancia y varios programas informáticos que incorporan herramientas estadísticas estándar han sido desarrollados para facilitar el análisis de datos. Una base para organizar los datos de expresión génica es agrupar los genes con patrones de expresión similar en aglomerados. Se describe un método para realizar un análisis de aglomerados jerárquicas y exhibir los datos derivados de experimentos de micromatrices, en Eisen et al ., 1998, PNAS 95: 14863- 14868. Tal como se describe allí, la aglomeración puede combinarse con una representación gráfica de los datos primarios en donde cada función de datos se representa con un color que representa cuantitativa y cualitativamente la función de datos. Mediante la conversión de datos a partir de una gran tabla de números en un formato visual , este proceso facilita un análisis intuitivo de los datos. Puede encontrarse información y detalles adicionales en cuanto a las herramientas matemáticas y/o el enfoque de aglomeración en sí misma, por ejemplo, en Sokal & Sneath, Principies of numerical taxonomy, xvi, 359, W. H. Freeman, San Francisco, 1963; Hartigan, Clustering algorithms, xiii, 351, Wiley, New York, 1975; Paull et al., 1989, J. Nati. Cáncer Inst. 81:1088-92; Weinstein et al. 1992, Science 258:447-51; van Osdol et al., 1994, J. Nati. Cáncer Inst. 86:1853-9; and Weinstein et al., 1997, Science, 275:343-9.

Detalles adicionales de los métodos experimentales usados en la presente invención pueden encontrarse en los Ejemplos a continuación. Puede encontrarse información adicional que describe métodos para la fabricación y uso de micromatrices en la Patentes estadounidense N° 5,807,522, que se incorpora a la presente a modo de referencia. Instrucciones para la construcción de equipos de micromatriz (por ej., equipo de matrices y dispositivo explorador) usando partes disponibles comercialmente. Se encuentran discusiones adicionales de tecnología de micromatriz y protocolos para la preparación de muestras y realización de experimentos de micromatriz, por ejemplo, en matrices de ADN para el análisis de expresión génica, Methods Enzymol, 303:179-205, 1999; control de expresión basada en fluorescencia usando micromatrices, Methods Enzymol, 306: 3-18, 1999; and M. Schena (ed.), DNA Microarrays: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, UK, 1999. 4. Análisis de datos En algunas modalidades, se usa un programa de análisis computarizado para traducir los datos sin procesar generados por el ensayo de detección (por ej., presencia, ausencia o cantidad de un marcador o unos marcadores dados) en datos de valor predictivo para un médico. El médico puede acceder a los datos predictivos usando cualquier medio adecuado. Por tanto, en algunas modalidades, la presente invención proporciona el beneficio adicional de que el médico que podría no estar capacitado en genética o biología molecular, no necesita entender los datos sin procesar. Los datos se presentan directamente al médico en la forma más útil. El médico entonces es capaz de utilizar inmediatamente la información para optimizar el cuidado del sujeto.

La presente invención contempla todo método capaz de recibir, procesar y transmitir la información a y de los laboratorios que dirigen los ensayos, proveedores de información, personal médico y sujetos. Por ejemplo, en algunas modalidades de la presente invención se obtiene una muestra (por ej., una biopsia o muestra de suero u orina) de un sujeto y se presenta a un servicio de establecimiento de perfiles (por ej., laboratorio clínico en un centro médico, negocio de establecimiento de perfiles genómicos, etc.) ubicado en cualquier parte del mundo (por ej., en una país diferente del país donde vive el sujeto o donde la información se usa finalmente) para generar datos sin procesar. Cuando la muestra comprende un tejido u otra muestra biológica, el sujeto puede visitar un centro médico para tener la muestra obtenida y enviarle al centro de establecimiento de datos o los sujetos pueden recoger la muestra por sí mismos y enviarla directamente a un centro de establecimiento de perfiles. Cuando la muestra comprende información biológica previamente determinada, la información la puede enviar directamente el sujeto al servicio de establecimiento de perfiles (por ej., una tarjeta de información que contiene la información puede explorarse por medio de una computadora y los datos transmitidos a una computadora del centro de establecimiento de perfiles usando un sistema de comunicación electrónica). Una vez que lo recibe el servicio de establecimiento de perfiles, la muestra se procesa y se produce un perfil (por ej., datos de expresión) específico para la información de diagnóstico o pronóstico deseada para el sujeto.

Los datos del perfil luego se preparan en un formato adecuado para su interpretación por un médico tratante. Por ejemplo, en vez de proporcionar datos de expresión sin procesar (por ej., examinar una cantidad de marcadores), el formato preparado puede representar un diagnóstico o evaluación del riesgo para el sujeto, junto con recomendaciones para opciones de tratamiento particulares. Los datos pueden exhibirse al médico mediante un método adecuado. Por ejemplo, en algunas modalidades, el servicio de establecimiento de perfiles genera un informe que puede imprimirse para el médico (por ej., en el análisis de diagnóstico inmediato) o exhibirse al médico en un monitor de computadora.

En algunas modalidades, la información primero se analiza en el análisis de diagnóstico inmediato o en un centro regional. Los datos sin procesar luego se envían a un centro de procesamiento central para análisis adicional y/o para convertir los datos sin procesar en información útil para un médico o paciente. El centro de procesamiento central proporciona la ventaja de privacidad (todos los datos se almacenan en un centro con protocolos de seguridad uniforme), celeridad y uniformidad de análisis de datos. El centro de procesamiento central puede luego controlar el destino de los datos que siguen al tratamiento del sujeto. Por ejemplo, usando un sistema de comunicación electrónica, el centro puede proporcionar datos al médico, al sujeto o a investigadores.

En algunas modalidades, el sujeto es capaz de acceder a los datos directamente usando el sistema de comunicación electrónica. El sujeto puede elegir además una intervención o asesoramiento basado en los resultados. En algunas modalidades, los datos se usan para usos de investigación. Por ejemplo, los datos pueden usarse para optimizar adicionalmente la inclusión o eliminación de marcadores como indicadores útiles de una condición o estado particular de la enfermedad. 5. Kits En aun otras modalidades, la presente invención proporciona kits para la detección y la caracterización del cáncer (por ej., para detectar uno o más marcadores o para modular la actividad de un péptido expresado por uno o más marcadores). En algunas modalidades, los kits contienen anticuerpos específicos para un marcador de cáncer, además de reactivos de detección y lampones. En otras modalidades, los kits contienen reactivos específicos para la detección de ARNm o ADNc (por ej., sondas o cebadores de oligonucleótido). En algunas modalidades, los kits contienen todos los componentes necesarios y/o suficientes para realizar un ensayo de detección incluyendo todos los controles, instrucciones para realizar ensayos y todo software necesario para el análisis y la presentación de los resultados.

Otra modalidad de la presente invención comprende un kit para probar la presencia de polínucleótidos o proteínas. El kit puede comprender, por ejemplo, un anticuerpo para la detección de un polipéptido o una sonda para la detección de un polinucleótido. Además, el kit puede comprender una muestra de referencia; instrucciones para el procesamiento de muestras, realizando el análisis e interpretando los resultados; y tampones y otros reactivos necesarios para realizar el análisis. En otras modalidades, el kit comprende pares de cebadores para detectar la expresión de u no o más genes de firmas génicas de células madre de tumores sólidos. En otras modalidades, el kit comprende una matriz de ADNc u oligonucleótido para detectar la expresión de uno o más genes de firmas génicas de células madre de tumores sólidos. 6. I magenología in vivo En algunas modalidades, los métodos de imagenología se usan para visualizar la expresión de marcadores de cáncer en un animal ( por ej . , un mamífero humano o no humano). Por ejemplo, en algunas modalidades, el ARNm del marcador de cáncer (por ej. , ARNm de CXCR1 o FBX021 ) o proteína (por ej. , proteína CXCR1 o FBX021 ) se marcan usando un anticuerpo marcado específico para el marcador de cáncer. Puede detectarse un anticuerpo específicamente unido y marcado en u n individ uo usando un método de imagenología in vivo, que incl uye pero no se limita a, i magenología de radionucleido, tomografía de emisión de positrones, tomografía axial computarizada, método de imagenología de rayos X o resonancia magnética, detección por fluorescencia y detección quimioluminiscente. Los métodos para generar anticuerpos a los marcadores de cáncer de la presente i nvención se describen a continuación .

Los métodos de imagenología de la presente invención son útiles en el diagnóstico de cánceres que expresan los marcadores de cáncer de células madre de tumores sólidos de la presente invención. La imagenología in vivo se usa para visualizar la presencia de un marcador indicativo de cáncer. Dichos métodos permiten el diagnóstico sin el uso de una biopsia poco agradable. Los métodos de imagenología in vivo de la presente invención son también útiles para proporcionar el pronóstico a pacientes con cáncer. Por ejemplo, puede detectarse la presencia de un marcador indicativo de células madre cancerosas. Los métodos de imagenología in vivo de la presente invención pueden usarse adicionalmente para detectar cánceres metastásicos en otras partes del cuerpo.

En algunas modalidades, los reactivos (por ej., anticuerpos) específicos para CXCR1 o FBX021 se marcan de forma fluorescente. Los anticuerpos marcados se introducen en un sujeto (por ej., de forma oral o parenteral). Los anticuerpos marcados de forma fluorescente se detectan usando cualquier método adecuado (por ej., usando un aparato descrito en la patente estadounidense 6,198,107, que se incorpora a la presente a modo de referencia).

En otras modalidades, los anticuerpos están marcados de radiactivamente. El uso de anticuerpos para el diagnóstico in vivo es bien conocido en la técnica. Sumerdon et al., (Nucí. Med. Biol 17:247-254

[1990] han descrito un anticuerpo-quelante optimizado para la imagenología de radioinmunocentellografía de tumores usando lndio-111 como el marcador. Griffin et al., (J Clin Onc 9:631-640

[1991]) han descrito el uso de este agente en la detección de tumores en pacientes que se sospecha tienen cáncer de páncreas. El uso de agentes similares con iones paramagnéticos como marcadores de imagenología de resonancia magnética es conocido en la técnica (Lauffer, Magnetic Resonance in Medicine 22:339-342

[1991]). El marcador usado dependerá de la modalidad de imagenología elegida. Los marcadores radiactivos tales como Indio-111, Tecnecio-99m o Yodo-131 pueden usarse para exploraciones planas o tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT). Los marcadores de emisión de positrones tales como Fluoro-19 también pueden usarse para tomografías de emisión de positrones (PET). Para MRI, pueden usarse iones paramagnéticos tales como Gadolinio (III) o Manganeso (II).

Se encuentran disponibles metales radioactivos con semividas en el rango de entre 1 hora y 3.5 días para conjugarse con anticuerpos, tales como escandio-47 (3.5 días), galio-67 (2.8 días), galio-68 (68 minutos), tecnecio-99m (6 horas) e indio-111 (3.2 días), de los cuales galio-67, tecnecio-99m e indio-111 son preferibles para la imagenología de cámara gamma, galio-68 es preferible para la tomografía de emisión de positrones.

Un método útil para marcar anticuerpos con dichos radiometales es mediante un agente quelante bifuncional, tal como ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) tal como se describe, por ejemplo en Khaw et al. (Science 209:295

[1980]) para ln-111 y Tc-99m, y por Scheinberg et al. (Science 215:1511

[1982]). Otros agentes quelantes también pueden usarse, pero el 1-(p-carboximetoxibencil)EDTA y el anhídrido carboxicarbónico de DTPA son ventajosos porque su uso permite la conjugación sin afectar sustancialmente la inmunoreactividad del anticuerpo.

Otro método para el acoplamiento de DTPA con proteínas es mediante el uso del anhídrido cíclico de DTPA tal como se describe en Hnatowich et al. (Int. J. Appl. Radiat. Isot. 33:327

[1982]) para el marcado de albúmina con ln-111, pero que puede adaptarse mediante el marcado de anticuerpos. Un método adecuado de marcado de anticuerpos con Tc-99m que no usa la quelación con DPTA es un método de preestañado de Crockford et al., (patente estadounidense N° 4,323,546, que se incorpora a la presente a modo de referencia).

Un método para marcar inmunoglobulinas con Tc-99, es el descrito en Wong et al. (Int. J. Appl. Radiat. Isot., 29:251

[1978]) para la proteína plasmática y aplicado recientemente de forma exitosa por Wong et al. (J. Nucí. Med., 23:229

[1981]) para marcar anticuerpos.

En el caso de los radiometales conjugados con el anticuerpo específico, es asimismo deseable introducir una proporción tan elevada del radiomarcador como sea posible en una molécula de anticuerpo sin destruir su inmunoespecificidad. Puede lograrse una mejora adicional efectuando el radiomarcado en presencia de un marcador específico de cáncer de células madre de la presente invención para asegurar que el sitio de unión al antígeno en el anticuerpo estará protegido.

En aun otras modalidades, se utiliza la imagenología de biofotones (Xenogen, Almeda, CA) para la imagenología in vivo. Esta imagenología in vivo en tiempo real utiliza luclferasa. El gen de luciferasa se incorpora a las células, microorganismos y animales (por ej., como una proteína de fusión con un marcador de cáncer de la presente invención). Cuando es activo, lleva a una reacción que emite luz. Se usan software y una cámara de CCD para capturar la imagen y analizarla.

III. Anticuerpos y fragmentos de anticuerpo La presente invención proporciona anticuerpos aislados o fragmentos de anticuerpos contra CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP y otras proteínas de la Tabla 1. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede ser cualquier anticuerpo monoclonai o policlonal que reconoce específicamente estas proteínas. En algunas modalidades, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP y otras proteínas de la Tabla 1. En algunas modalidades, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, son anticuerpos quiméricos o humanizados que se unen específicamente a estas proteínas. En otras modalidades, los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, son anticuerpos humanos que se unen específicamente a estas proteínas.

Los anticuerpos contra CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP y otras proteínas de la Tabla 1 se usan en los métodos experimentales, diagnósticos y terapéuticos descritos en la presente. En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención se usan para detectar la expresión de una proteína del marcador de células madre cancerosas en muestras biológicas tales como, por ejemplo, una biopsia de tejido del paciente, efusión pleural o muestra de sangre. Las biopsias de tejido pueden seccionarse y las proteínas pueden detectarse usando, por ejemplo, i n mu nofl uorescencia o in munohistoquímica. De manera alternativa, se aislan las células individuales de una muestra y se detecta la expresión proteica en células fijas o vivas mediante análisis FACS. Además, los anticuerpos pueden usarse en matrices de proteínas para detectar la expresión de un marcador de células madre cancerosas, por ejemplo , en células tu morales, en Usados celulares o en otras muestras proteicas. En otras modalidades, los anticuerpos de la presente invención se usan para inhibi r el creci miento de células tu morales poniendo en contacto los anticuerpos con células tu morales ya sea en ensayos basados en células in vitro o modelos de ani males in vivo. En aun otras modalidades, los anticuerpos se usan para tratar el cáncer en un paciente humano mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo contra el marcador de células madre cancerosas (por ej., de la Tabla 1 ) .

Los anticuerpos policlonales pueden prepararse mediante cualquier método conocido. Los anticuerpos policlonales pueden surgi r in munizando un ani mal (por ej. , un conejo, rata, ratón , bu rro, etc.) mediante inyecciones múltiples subcutáneas o intraperitoneates del antígeno correspondiente ( un fragmento de péptido purificado, proteína recombinante de longitud completa, proteína de fusión, etc.) opcionalmente conjugados con lapa californiana (KLH) , albúmina sérica , etc. , diluidos en solución salina estéril y combi nados con un adyuvante (por ej. , adyuvante de Freund incompleto o compl eto) para formar una emulsión estable. El anticuerpo policlonal l uego se recupera de la sangre, ascitis y similar de un ani mal así inmunizado. La sangre obtenida se coagula y el suero se trasvasa, se aclara por centrifugación y se ensaya para titulación del anticuerpo. Los anticuerpos policlonales pueden purificarse a partir de suero o ascitis de acuerdo con métodos estándar en la técnica que incluyen cromatografía de afinidad , cromatografía de i ntercambio de iones, electroforesis en gel , diálisis, etc.

Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse usando métodos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler and Milstei n ( 1975) Nature 256:495. Usando un método de hibridoma, se inmuniza un ratón, un hámster u otro animal hospedador apropiado, tal como se describe anteriormente para provocar la producción por linfocitos de anticuerpos que se unen específicamente a un antígeno inmunizador. De manera alternativa, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. Luego de la inmunización, los linfocitos se aislan y fusionan con un mieloma adecuado usando una línea celular, por ejemplo, polietílenglicol, para formar células de hibridoma que pueden seleccionarse entonces a partir de células de linfocitos y de mieloma no fusionados. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales dirigidos específicamente contra un antígeno elegido tal como se determi na por inmu noprecipitación , i nmunotransferencia o por un ensayo de unión in vitro tal como radioin muensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELI SA) pueden propagarse luego ya sea en cultivos i n vitro usando métodos estándar (Godi ng, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, 1 986) o in vivo en tu mores de ascitis en un ani mal. Los anticuerpos monoclonales pueden l uego purificarse a partir del medio de cultivo o el fluido de ascitis tal como se describe para anticuerpos policlonales anteriormente.

Anticuerpos monoclonales alternativos también pueden realizarse usando métodos de ADN tal como se describe en la patente estadounidense N° 4,816,567. Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal se aislan, tales como de linfocitos B maduro o células de hibridoma, tal como mediante RT-PCR usando cebadores de oligonucleótido que amplifican específicamente los genes que codifican cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo y su secuencia se determina usando procedimientos convencionales. Los polinucleótidos aislados que codifican las cadenas ligeras y pesadas luego se clonan en vectores de expresión adecuados que al transfectarse en células hospedadoras tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovarios de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no produce proteína de inmunoglobulina, se generan anticuerpos monoclonales mediante células hospedadoras. También, pueden aislarse anticuerpos o fragmentos de anticuerpo recombinantes monoclonales de las especies deseadas a partir de las bibliotecas de exhibición del fago tal como describe (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).

Los polinucleótidos que codifican un anticuerpo monoclonal pueden modificarse adicionalmente en una cantidad de maneras distintas usando tecnología de ADN recombinante para generar anticuerpos alternativos. En una modalidad, los dominios contantes de las cadenas ligeras y pesadas de, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de ratón puede sustituirse 1 ) por aquellas regiones de, por ejemplo, un anticuerpo humano para generar un anticuerpo qui mérico o 2) por un polipéptido no inmunoglobulina para generar un antígeno de fusión. En otras modalidades, las regiones constantes se truncan o eli mi nan para generar el fragmento de anticuerpo deseado de un anticuerpo monoclonal. +Además, la mutagénesis dirigida al sitio o de alta densidad de la región variable puede usarse para opti mizar la especificidad , afinidad, etc. , de un anticuerpo monoclonal.

En alg unas modalidades de la presente invención , el anticuerpo monoclonal contra el marcador de células madre cancerosas es un anticuerpo humanizado. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos que contienen secuencias mínimas de anticuerpos no humanos (por ej. , murinos) dentro de las regiones variables. Dichos anticuerpos se usan terapéuticamente para red ucir las respuestas a la antigenicidad y HAMA (anticuerpo anti-ratón humano) al ad mi nistrarse a un sujeto hu mano. En la práctica , los anticuerpos hu manizados son típicamente humanos que tienen un mínimo o ninguna secuencia no humana. Un anticuerpo humano es un anticuerpo producido por un hu mano o un anticuerpo que posee una secuencia de ami noácido que corresponde a un anticuerpo producido por un hu mano.

Los anticuerpos humanizados pueden producirse usando varios métodos conocidos en la técnica. Puede humanizarse un anticuerpo sustituyendo C DR de un anticuerpo hu mano por el de un anticuerpo no humano (por ej. , ratón , rata, conejo, hámster, etc.) que posee la especificidad, afinidad y capacidad deseadas (Jones et al . , 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534- 536). El anticuerpo humanizado puede modificarse adicionalmente mediante la sustitución de un residuo adicional ya sea en la región flanqueante Fv y/o dentro de los residuos no humanos reemplazados para retinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanos pueden prepararse directamente usando varios métodos conocidos en ia técnica. Pueden generarse linfocitos B humanos inmortalizados inmunizados in vitro o aislados a partir de un individuo inmunizado que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (ver, por ejemplo, Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; y patente estadounidense N° 5,750,373). También, el anticuerpo humano puede seleccionarse de una biblioteca de fago, donde la biblioteca de fago expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol . , 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Los anticuerpos humanizados también pueden realizarse en ratones transgénicos que contienen los loci de ¡nmunoglobulina humana que son capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de ¡nmunoglobulina. Este enfoque se describe en las patentes estadounidenses N° 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425 y 5,661,016.

Esta invención también comprende anticuerpos biespecíficos que reconocen específicamente marcadores de células madre cancerosas. Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos capaces de reconocer y unir específicamente al menos dos epítopos diferentes.

Los anticuerpos biespecíficos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpos intactos. Los métodos para la creación de anticuerpos biespecíficos son comunes en la técnica (Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science 229:81; Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368 y patente estadounidense N° 5,731,168).

En algunas modalidades de la invención, puede desearse el uso de un fragmento de anticuerpo y no un anticuerpo intacto para, por ejemplo, aumentar la penetración de tumor. Se conocen varios métodos para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron por medio de digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 y Brennan et al., 1985, Science, 229:81). Sin embargo, estos fragmentos ahora se producen típicamente directamente por células hospedadoras recombinantes tal como se describe anteriormente. Por tanto, los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv pueden expresarse en y secretarse de E. coli u otras células hospedadoras, permitiendo así la producción de grandes cantidades de estos fragmentos. De manera alternativa, dichos fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas de fago de anticuerpo descritas anteriormente. El fragmento de anticuerpo también puede ser un anticuerpo lineal tal como se descri be en la patente estadounidense N° 5,641 ,870 , por ejemplo, y puede ser monoespecifico o bispecífico. Otros métodos para la producción de frag mentos de anticuerpos serán aparentes para el practicante capacitado.

También puede desearse, en especial en el caso de fragmentos de anticuerpo, modificar un anticuerpo para aumentar su semivida sérica. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de unión al receptor de rescate en el frag mento de anticuerpo por mutación de la región apropiada del fragmento de anticuerpo o por incorporación del epítopo en un marcador de péptido que luego se fusiona con el fragmento de anticuerpo ya sea al final o en el medio (por ej. , por síntesis de ADN o péptido).

La presente invención abarca adicionalmente variantes y equivalentes que son sustancialmente homólogos a los anticuerpos o frag mentos de anticuerpos qui méricos, humanizados y humanos, establecidos en la presente. Estos pueden contener, por ejemplo, mutaciones de sustitución conservadora, es decir, la sustitución de uno o más aminoácidos por medio de aminoácidos similares. Por ejemplo, la sustitución conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido por otro dentro de la misma clase general , tal como , por ejemplo, un aminoácido ácido por otro ami noácido ácido, un aminoácido básico por otro aminoácido básico o un ami noácido neutro por otro ami noácido neutro. Lo que se pretende por medio de una sustitución conservadora de aminoácidos se conoce bien en la técnica.

La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico. Los agentes citotóxicos incluyen agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ej., una toxina activa enzimáticamente de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal o fragmentos de las mismas), isótopos radioactivos (esto es, un radioconjugado), etc. Los agentes quimioterapéuticos útiles en la creación de tales inmunoconjugados incluyen, por ejemplo, metotrexato, adriamicina, doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes mtercalables. Las toxinas enzimáticamente activas y los fragmentos de las mismas que pueden utilizarse incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no de unión de toxina de difteria, cadena A de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidores de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Se encuentra disponible una variedad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radioconjugados que incluye 212Bi, 1311, 1311 n , 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y agente citotóxico se realizan utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionatc (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolieno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Pueden usarse conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como calicheamicina, maitansinoides, un tricoteno y CC1065 y derivados de estas toxinas que poseen actividad de toxina.

Algunas modalidades de la invención contienen regiones Fe humanas que se modifican para mejorar la función efectora, por ejemplo, citotoxicidad mediada por célula dependiente del antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Esto puede lograrse por medio de la introducción de una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fe del anticuerpo. Por ejemplo, los residuos de cisteína pueden introducirse en la región Fe para permitir la formación de la unión de disulfuro intercadena en esta región para mejorar la muerte de las células mediadas por complemento y la citotoxicidad mediada por célula dependiente del antígeno (ADCC) (Carón et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; Shopes, 1992, Immunol. 148:2918-2922). Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral mejorada también pueden prepararse utilizando reticuladores heterobifuncionales tal como se describe en Wolff et al., 1993, Cáncer Research 53:2560-2565. De manera alternativa, puede genomanipularse un anticuerpo que tiene regiones Fe dobles (Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230).

IV. Análisis del fármaco En algunas modalidades, la presente invención proporciona ensayos de análisis de fármaco (por ej., para analizar fármacos anticancerosos). Los métodos de análisis de la presente invención utilizan marcadores de cáncer de células madre (por ej., CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1, TBP y otras proteínas de la Tabla 1) identificados usando los métodos de la presente invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos de análisis para compuestos que alteran (por ej., aumento o reducción) la expresión o actividad de CXCR1 o FBX021. En algunas modalidades, los compuestos candidatos son agentes antisentido o agentes ARNsi (por ej., oligonucleótidos) dirigidos contra marcadores de cáncer. En otras modalidades, los compuestos candidatos son anticuerpos que se unen específicamente a un marcador de cáncer de células madre de la presente invención. En algunas modalidades, las bibliotecas de compuestos de moléculas pequeñas se analizan usando los métodos descritos en la presente.

En un método de análisis, ios compuestos candidato se evalúan para su capacidad de alterar la expresión del marcador de cáncer de células madre poniendo en contacto un compuesto con una célula que expresa un marcador de cáncer de células madre y luego realizando un ensayo para el efecto de los compuestos candidato sobre la expresión. En algunas modalidades, el efecto de los compuestos candidato sobre la expresión del gen marcador de cáncer se ensaya detectando el nivel del ARNm marcador de cáncer expresado por la célula. La expresión de ARN m puede detectarse mediante cualq uier método adecuado. En otras modalidades, el efecto de los compuestos candidato sobre la expresión de los genes marcadores de cáncer se ensaya midiendo el nivel del polipéptido codificado por los marcadores del cáncer. El nivel del polipéptido expresado puede medirse usando cualquier método adecuado, incluyendo pero sin limitarse a aquellos descritos en la presente. En algunas modalidades, se detectan otros cambios en la biología cel ular (por ej. , apoptosis) .

En concreto, la presente invención proporciona métodos de análisis para identificar moduladores, esto es, compuestos o agentes candidato o de prueba (por ej. , proteínas, péptidos, peptidomiméticos, peptoides, pequeñas moléculas u otros fármacos) que se unen a o alteran la señalización o la función asociadas con los marcadores de cáncer de la presente i nvención, tienen un efecto inhibitorio (o estimulador) sobre, por ejemplo, la expresión del marcador de cáncer de células madre o la actividad de marcadores de cáncer o tienen un efecto esti mulador o inhibitorio sobre, por ejemplo, la expresión o la actividad de un sustrato del marcador de cáncer. Los compuestos así identificados pueden usarse para modular la actividad de productos de gen diana (por ej. , genes marcadores de cáncer de células madre, tales como CXCR1 o FBX021 ) ya sea directa o indirectamente en un protocolo terapéutico, para elaborar la función biológica del producto del gen diana o para identificar los compuestos que alteran las i nteracciones de los genes diana normales. Los compuestos que inhiben la actividad o la expresión de marcadores de cáncer son útiles en el tratamiento de trastornos proliferativos, por ejemplo, cáncer, cáncer particularmente metastásico o eliminación o control de células madre tumorales para prevenir o reducir el riesgo de cáncer.

En una modalidad, la invención proporciona ensayos para analizar compuestos candidato o de prueba que son sustratos de una proteína o un polipéptido marcador de cáncer o una porción biológicamente activa de los mismos. En otra modalidad, la invención proporciona ensayos para analizar compuestos candidato o de prueba que se unen con o modulan la actividad de una proteína o un polipéptido marcador de cáncer o una porción biológicamente activa de los mismos.

Los compuestos de prueba de la presente invención pueden obtenerse usando cualquiera de los varios enfoques en métodos de biblioteca combinatorios conocidos en la técnica, que incluyen bibliotecas biológicas; bibliotecas de peptoides (bibliotecas de moléculas que poseen funcionalidades de los péptidos pero con una cadena principal novedosa no peptídica, resistente a degradación enzimática pero que sin embargo se mantiene bioactiva; ver por ejemplo, Zuckennann et al., J. Med. Chem. 37: 2678-85

[1994]); bibliotecas de fase de solución o fase sólida paralelas direccionables longitudinalmente; métodos de biblioteca sintéticos que requieren deconvulación; el método de biblioteca del "compuesto por unidad de resina" ("one bead one"); y métodos sintéticos de biblioteca usando selección de cromatografía por afinidad. Los enfoques de las bibliotecas biológicas y de peptoide se prefieren para su uso con bibliotecas peptidicas mientras que los otros cuatro enfoques se aplican a bibliotecas de compuestos peptídicos, de oligómeros no peptídicos o de moléculas pequeñas (Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares pueden encontrarse en la técnica, por ejemplo en: DeWitt et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 90:69091993; Weinstein et al. Nad. Acad. Sci. USA 91:11422

[1994]; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678

[1994]; Cho et al., Science 261:1303

[1993]; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059

[1994]; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061

[1994]; y Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233

[1994].

Pueden presentarse bibliotecas de compuestos en solución (por ej., Houghten, Biotechniques 13:412-421

[1992]), o en cuentas (Lam, Nature 354:82-84

[1991]), genochips (Fodor, Nature 364:555-556

[1993]), bacterias o esporas (patente estadounidense N° 5,223,409; que se incorpora a la presente a modo de referencia), plásmidos (Culi et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:18651869

[1992]) o en fago (Scott and Smith, Science 249:386-390

[1990]; Devlin Science 249:404-406

[1990]; Cwirla et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 87:6378-6382

[1990]; Felici, J. Mol. Biol. 222:301

[1991]).

En una modalidad, un ensayo es un ensayo basado en células donde una célula que expresa una proteína marcadoras de cáncer de células madre o una porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad del marcador de cáncer. Puede lograrse la determinación de la capacidad del compuesto de prueba de modular la actividad del marcador de cáncer de células madre mediante el control, por ejemplo, de cambios en la actividad enzimática. La células, por ejemplo, puede ser de origen mamífero.

Puede evaluarse también la capacidad del compuesto de prueba de modular la unión del marcador de cáncer a un compuesto, por ej., un sustrato de marcador de cáncer de células madre. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante el acoplamiento del compuesto, por ej., el sustrato, con un marcador radioisótopo o enzimático de manera tal que pueda determinarse la unión del compuesto, por ej., el sustrato, a un marcador de cáncer detectando el compuesto marcado, por ej., un sustrato, en un complejo.

De manera alternativa, el marcador de cáncer de células madre se acopla con un marcador radioisótopo o enzimático para monitorear la capacidad de un compuesto de prueba para modular la unión de un marcador de cáncer a un sustrato de marcador de cáncer en un complejo. Por ejemplo, los compuestos (por ej., sustratos) pueden marcarse con 1251, 35S 14C o 3H, ya sea directa o indirectamente y puede detectarse el radioisótopo por el conteo directo de radioemisión o conteo por centelleo. De manera alternativa, los compuestos pueden marcarse enzimáticamente, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfato alcalino o luciferasa y el marcador enzimático se detecta determinando la conversión de un sustrato producto en un producto.

La capacidad de un compuesto (por ej., sustrato de marcador de cáncer de células madre) puede evaluarse para interactuar con un marcador de cáncer de células madre o sin el marcado de cualquiera de los reactantes. Por ejemplo, puede usarse un microfisiómetro para detectar la interacción de un compuesto con un marcador de cáncer sin marcar ninguno de los compuestos ni el marcador de cáncer (McConnell et al. Science 257:1906-1912

[1992]). Tal como se usa en la presente, un "microfisiómetro" (por ej., citocensor) es un instrumento analítico que mide la velocidad en la que la célula acidifica su ambiente usando un sensor potenciométrico de luz direccionada (LAPS). Pueden usarse los cambios en la velocidad de acidificación como un indicador de la interacción entre un marcador de compuesto y de cáncer.

En aun otra modalidad, se proporciona un ensayo libre de células donde una proteína marcadora de cáncer o una porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se evalúa la capacidad del compuesto de prueba de unirse a la proteína marcadora de cáncer o una porción biológicamente activa de la misma. Las porciones biológicamente activas de las proteínas de marcadores celulares a ser usadas en ensayos de la presente invención incluyen fragmentos que participan en las interacciones con sustratos u otras proteínas, por ej., fragmentos con un alto nivel de puntuaciones de probabilidad.

Los ensayos libres de células implican una mezcla de reacción de la proteína de gen diana y el compuesto de prueba en condiciones y por un período de tiempo suficiente para permitir que los dos componentes interactúen y se unan, formando así un complejo que luego puede eliminarse y/o detectarse.

La interacción entre dos moléculas puede detectarse también, por ej, usando una transferencia de energía por fluorescencia (FRET) (ver, por ejemplo, Lakowicz et al., patente estadounidense N° 5,631,169; Stavrianopoulos et al., patente estadounidense N° 4,968,103; que se incorporan a la presente a modo de referencia). Se selecciona un marcador fluoróforo de forma tal que la energía fluorescente emitida de las moléculas del primer donante sea absorbida por un marcador fluorescente en una segunda molécula "aceptora" que a su vez es capaz de fluorescer debido a la energía absorbida.

De manera alternativa, la molécula de proteína "donante" puede simplemente utilizar la energía fluorescente natural de los residuos de triptofano. Los marcadores se eligen para emitir distintas longitudes de onda, de manera tal que el marcador de molécula "aceptora" pueda diferenciarse de la "donante". Dado que la eficiencia de la transferencia de energía entre los marcadores se relaciona con la distancia que separa las moléculas, puede evaluarse la relación espacial entre las moléculas. En una situación donde ocurre la unión entre las moléculas, la emisión fluorescente del marcador de la molécula "aceptora" en 1 5, el ensayo debe ser el máximo. Un evento de unión por FRET puede medirse convenientemente a través de medios de detección fluorométrica estándar conocidos en la técnica (por ej., usando un fluorímetro).

En otra modalidad, puede lograrse la determinación de la capacidad de la proteína del marcadores de cáncer de células madre de unirse a una molécula diana, usando análisis de interacción biomolecular en tiempo real (ver, por ej., Sjolander and Urbaniczky, Anal. Chem. 63:2338-2345

[1991] y Szabo et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705

[1995]). "Resonancia por plasmón de superficie" o "BIA" detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real sin marcar ningún reactante (por ej., BIAcore). Los cambios en la masa en la superficie de unión (que indica un evento de unión) da como resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cercana a la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia por plasmón de superficie (SPR)), da como resultado una señal detectable que puede usarse como indicación de reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas.

En una modalidad, el producto del gen diana o la sustancia de prueba se anclan en una fase sólida. Los complejos de producto del gen diana/compuesto de prueba anclados en fase sólida pueden detectarse al final de la reacción. El producto del gen diana puede anclarse en una superficie sólida y el compuesto de prueba (no anclado) puede marcarse ya sea directa o indirectamente con marcadores detectables descritos en la presente.

Puede desearse inmovilizar los marcadores de cáncer de células madre, un anticuerpo marcador anticanceroso o su molécula diana para facilitar la separación de formas complejas de las no complejas de una o ambas proteínas así como para adaptar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de prueba a una proteína marcadora de cáncer de células madre o la interacción de una proteína marcadora de cáncer con una molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, puede lograrse en un recipiente adecuado para contener reactivos. Ejemplos de dichos recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una modalidad, puede proporcionarse una proteína de fusión que agrega un dominio que permite que una o ambas proteínas de unan a la matriz. Por ejemplo, pueden adsoberse las proteínas de fusión del marcador de cáncer-glutatión-S- transferasa o proteínas de fusión diana/glutatión-S-transferasa en cuentas de glutatión Sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación que derivan de glutatión que se combinan luego con el compuesto de prueba o el compuesto de prueba y ya sea la proteína diana no adsorbida o la proteína marcadora de cáncer, y la mezcla incubada en condiciones que contribuyen a la formación de complejos (por ej., en condiciones fisiológicas de sal y pH). Luego de la incubación, las cuentas o las placas de microtitulación se lavan para eliminar los componentes sin unir, la matriz se inmoviliza en el caso de las cuentas, los complejos se determinan ya sea directa o indirectamente, por ejemplo, tal como se describe anteriormente.

De manera alternativa, los complejos pueden disociarse de la matriz y el nivel de unión o actividad de los marcadores de cáncer se determina usando métodos estándar. Otros métodos para inmovilizar ya sea proteínas marcadoras de cáncer o una molécula diana en matrices incluyen el uso de la conjugación de biotina y estreptavidina. La proteína marcadora de cáncer biotinilada o las moléculas diana pueden prepararse a partir de biotin-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando métodos conocidos en la técnica (por ej., kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL) e inmovilizarse en los pocilios de las placas de 96 pocilios revestidos con estreptavidina (Pierce Chemical).

Para poder llevar a cabo el ensayo, se agrega el componente no inmovilizado a la superficie revestida que contiene el componente anclado. Luego de que la reacción se completó, se eliminaron los compuestos no reactivos sin reaccionar (por ej., mediante lavado) en condiciones tales que se forman complejos que permanecerán inmovilizados en la superficie sólida. La detección de complejos anclados en la superficie sólida puede lograrse en una variedad de formas. Cuando el componente no inmovilizado previamente está pre marcado, la detección del marcador inmovilizado en la superficie indica que se formaron complejos. Cuando el componente no inmovilizado previamente no está pre marcado, puede usarse un marcador indirecto para detectar complejos anclados en la superficie , por ej. , usando un anticuerpo marcado específico para el componente in movilizado (el anticuerpo, a su vez, puede estar directa o indirectamente marcado con por ej., anticuerpo anti-lgG marcado) .

Este ensayo se lleva a cabo usando anticuerpos reactivos con una proteína marcadora de cáncer de células madre o moléculas diana pero que no interfieren con la unión de la proteína marcadora de cáncer de células madre a su molécula diana . Dichos anticuerpos pueden derivarse a los pocilios de la placa y proteína marcadora de cáncer o diana sin uni r retenida en los pocilios mediante conjugación de anticuerpo. Los métodos para la detección de dichos complejos, además de los descritos anteriormente para complejos inmovilizados GST incluyen inmunodetección de complejos usando reactivos con la proteína marcadora de cáncer o la molécula diana así como ensayos ligados a la enzima que se apoyan en la detección de actividad enzi mática asociado con la proteína marcadora de cáncer o la molécula diana.

De manera alternativa, los ensayos libres de células pueden conducirse en una fase líquida. En dicho ensayo, los productos de reacción se separan de componentes sin reaccionar mediante una cantidad de métodos estándar que incluyen pero no se limitan a centrifugación diferencial (ver, por ejemplo, Rivas and Minton, Trends Biochem Sci 18:284-7

[1993]); cromatografía (cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio de iones); electroforesis (ver, por ej., Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nueva York.) e inmunoprecipitación (ver, por ejemplo, Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology 1999, J. Wiley: Nueva York). Dichas resinas y métodos de cromatografía son conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ej., Heegaard J. Mol. Recognit 11:141-8

[1998]; Hageand T eed J. Chromatogr. Biomed. Sci. App1 699:499-525

[1997]). Además, la transferencia de energía por fluorescencia puede utilizarse convenientemente, tal como se describe en la presente, para detectar la unión sin purificación adicional del complejo a partir de la solución.

El ensayo puede incluir poner en contacto la proteína marcadora de cáncer de células madre o la porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une al marcador de cáncer para formar una mezcla de ensayo poniendo en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba y determinando la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con una proteína marcadora de cáncer, donde la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para interactuar con una proteína marcadora de cáncer incluye determinar la capacidad del compuesto de prueba de unirse preferencialmente a marcadores de cáncer o porciones biológicamente activas de los mismos o modular la actividad de una molécula diana, en comparación con el compuesto conocido.

En la medida en que los marcadores de cáncer de células madre puedan interactuar ¡n vivo con una o más macromoléculas celulares o extracelulares, tales como proteínas, son útiles los inhibidores de dicha interacción. Puede usarse un ensayo homogéneo para identificar inhibidores.

Por ejemplo, se prepara un complejo preformado del producto del gen diana y el producto del ligando celular o extracelular interactivo, de forma tal que se marquen ya sea los productos del gen diana o sus ligandos pero la señal generada por el marcador se inactive durante la formación de complejos (ver, por ej., patente estadounidense N° 4,109,496, que se incorpora a la presente a modo de referencia, que utiliza este enfoque para inmunoensayos). La adición de una sustancia de prueba que compite con y reemplaza una de las especies del complejo preformado dará como resultado la generación de una señal por encima de los registros. De esta manera, pueden identificarse las sustancias de prueba que alteran la interacción entre el ligando y el producto del gen diana. De manera alternativa, la proteína del marcador de cáncer puede usarse como "proteína carnada" en un ensayo de dos o tres híbridos (ver, por ej., patente estadounidense N° 5,283,317; Zervos et al., Cell 72:223-232

[1993]; Madura et al., J. Biol. Chem. 268.12046- 2054

[1993]; Bartel et al., Biotechniques 14:920-924

[1993]; Iwabuchi et al., Oncogene 8:1693-1696

[1993] y Brent W0 94/10300; que se incorporan a la presente a modo de referencia), para identificar otras proteínas que se unen o interactúan con marcadores de cáncer ("proteínas de unión al marcador de cáncer" o "marcador de cáncer bp") y se ven implicados en la actividad marcadora de cáncer. Dichos marcadores de cáncer bps pueden ser activadores o inhibidores de señales mediante proteínas o dianas marcadoras de cáncer, como por ejemplo, elementos corriente abajo de una senda de señalización mediada por marcadores de cáncer.

Tam bién pueden identificarse moduladores de la expresión de marcadores de cáncer. Por ejemplo, se pone en contacto una célula o una mezcla libre de células con un compuesto candidato y se eval úa la expresión de la proteína o ARNm del marcador de cáncer al nivel de expresión de la proteína o ARNm del marcador de cáncer de células madre en ausencia del compuesto candidato. Cuando la expresión de la proteína o ARN m del marcador de cáncer es mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica al compuesto candidato como estimulador de la expresión de la proteína o ARNm del marcador de cáncer. De manera alternativa, cuando la expresión de la proteína o ARNm del marcador de cáncer (esto es, una cantidad estadística y significativamente menor) es mayor en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, se identifica el compuesto candidato como esti mulador de la expresión de la proteína o ARN m del marcador de cáncer. El nivel de expresión de la proteína o ARNm del marcadores de cáncer pueden determi narse mediante métodos descritos en la presente para detectar la proteína o ARNm del marcadores de cáncer.

Esta invención se refiere adicionalmente a agentes novedosos identificados en los ensayos de análisis antes mencionados (ver, por ej., la descripción a continuación de terapias contra el cáncer). De la misma manera, se encuentra dentro del ámbito de la presente invención usar adicionalmente un agente identificado tal como se describe en la presente (por ej., un agente modulador del marcador de cáncer, una molécula de ARNsi, un anticuerpo específico del marcador de cáncer o un ligando del marcador de cáncer) en un modelo animal apropiado (tal como los descritos en la presente) para determinar la eficacia, toxicidad, efectos secundarios o mecanismos de acción del tratamiento con tal agente. Además, los agentes novedosos identificados por los ensayos de análisis antes mencionados pueden, por ej., usarse para tratamiento tal como se describe en la presente (por ej., para tratar un paciente humano que tiene cáncer).

En algunas modalidades, la presente invención emplea mamoesferas no adherentes para varios procedimientos de análisis que incluyen métodos para analizar antagonistas de la senda de señalización de CXCR1 o FBX021. Las mamoesferas no adherentes son un sistema de cultivo in vitro que permiten la propagación de células madre y progenitores epiteliales mamarias humanas primarias en estado no diferenciado basándose en su capacidad de proliferarse en suspensión como estructuras esféricas. Las mamoesferas no adherentes se describieron previamente en Dontu et al Genes Dev. 2003 May 15;17(10):1253-70 y Dontu et al., Breast Cáncer Res. 2004;6(6):R605-15, que se incorporan a la presente a modo de referencia. Estas referencias se incorporan a modo de referencia en sus totalidades y en especial para la enseñanza de la construcción y uso de mamoesferas no adherentes. Tal como se describe en Dontu et al., las mamoesferas se caracterizaron como compuestas por células madre y progenitoras capaz de ser autorenovables y de diferenciación de multilinaje. Dontu et al. también describen que las mamoesferas contienen células capaces de generar por clonación estructuras de complejo ductal-alveolar funcional en sistemas de cultivo reconstituidos de 3-D en atrigel.

En algunas modalidades, se usan los siguientes ejemplos de métodos de análisis. Para estudios in vitro, se podría tratar células con construcciones adenovirales que expresan ARNsi candidato de referencia o de CXCR1 o FBX021 (m.o.i. 10 a 100) durante 3 días o una pequeña molécula candidato (por ej., derivado de PHA665752) (0.1-0.5 uM) durante 3 días y comparar la capacidad de las células de CXCR1+ o FBX021+ de formar esferas tumorales en comparación con células sin tratar contra las tratadas. Para estudios in vivo, se podrían infectar células de cáncer de mama con un lentivirus que expresa luciferasa para controlar el crecimiento tumoral. Las células cancerosas que expresan luciferasa pueden inyectarse en un tejido de mama y pueden establecerse tumores de aproximadamente 0.5- 0.7 cm de tamaño con 5 animales por grupo. Los animales con tumores establecidos pueden luego tratarse ya sea con inhibidor de CXCR1 o FBX021 candidato (diariamente i.v. 30mg/kg/día durante 7 días) o vehículo de referencia. Se han realizado estudios paralelos usando una infección con adenovirus que expresa el ARNsi de referencia o de CXCR1 o FBX021 candidato (m.o.i. 100 o 500 durante 7 días). Pueden visualizarse animales en los días 7, 14, 21 y 28 para evaluar el tamaño del tumor y luego se sacrifican . El tamaño del tumor puede ser evaluado adicionalmente con una autopsia y puede teñirse una porción del tumor para evaluar la histología del tumor. El resto del tu mor puede cultivarse y clasificarse para eval uar el porcentaje de células CXCR1 o FBX021 positiva y CXCR1 o FBX021 negativa. Para verificar que la administración del i nhibidor de CXCR1 o FBX021 candidato y la infección por adenovirus de ARNsi de CXCR1 o F BX021 candidato inhiben la función de señalización de CXCR 1 o FBX021 , puede examinarse la fosforilación de mediadores corriente abajo tales como Gab- 1 y ERK (ver, Chistensen et al . , Cáncer Res., 2003; 63:7345-7355, que se i ncorpora a la presente a modo de referencia).

V. Terapias contra el cáncer En alg unas modalidades, la presente invención proporciona terapias contra el cáncer. En algunas modalidades, las terapias se dirigen a marcadores de cáncer (por ej. , incl uyen pero no se li mitan a CXCR1 o FBX021 y proteínas en la senda de señalización de CXCR 1 o FBX021 ) . En algunas modalidades, pueden usarse terapias conocidas o terapias de células madre cancerosas desarrolladas posteriormente. Por ejemplo, los agentes terapéuticos de cél ulas madre cancerosas se describen en las patentes estadouni denses N° 6,984,522 y 7, 1 1 5,360 y solicitudes WO03/050502, WO05/074633 y WO05/005601 , que se incorporan a la presente a modo de referencia en sus totalidades.

Terapia con anticuerpos En algunas modalidades, la presente invención proporciona anticuerpos que se dirigen a tumores que expresan un marcador de cáncer de células madre de ia presente invención. Cualquier anticuerpo adecuado (por ej., monoclonal, policlonal o sintético) puede utilizarse en los métodos terapéuticos descritos en la presente. En algunas modalidades, los anticuerpos usados para la terapia contra el cáncer son anticuerpos humanizados. Los métodos para anticuerpos humanizados son conocidos en la técnica (ver, por ej., patentes estadounidenses N° 6,180,370, 5,585,089, 6,054,297 y 5,565,332; que se incorporan a la presente a modo de referencia).

En algunas modalidades, los anticuerpos terapéuticos comprenden un anticuerpo generado con un marcador de cáncer de células madre de la presente invención donde el anticuerpo se conjuga con un agente citotóxico. En dichas modalidades, se genera un agente terapéutico específico para el tumor que no se dirige a células normales, reduciendo así varios de ios efectos secundarios perjudiciales de la quimioterapia tradicional. Para ciertas aplicaciones se prevé que los agentes terapéuticos serán agentes farmacológicos que serán útiles como agentes para adjuntar a antibióticos, en particular agentes citotóxicos o de otra manera anticelulares que tienen la capacidad de matar o suprimir el crecimiento o la división celular de las células endoteiiales. La presente invención contempla el uso de cualquier agente farmacológico que pueda conjugarse con un anticuerpo y ser administrado en forma activa. Ejemplos de agentes anticelulares incluyen agentes quimioterapéuticos, radioisótopos y citotoxinas. Los anticuerpos terapéuticos de la presente invención pueden incluir una variedad de restos citotóxicos, que incluyen pero no se limitan a, isótopos radioactivos (por ej., yodo-131, yodo-123, tecnecio-99m, indio-111, renio-188, renio-186, galio-67, cobre-67, itrio-90, yodo-125 o astatina-211), hormonas tales como esteroide, antimetabolitos tales como citosinas (por ej., arabinosida, fluorouracilo, metotrexato o aminopterina; una antraciclina; mitomicina C), alcaloides de la vinca (por ej., demecolcina; etoposida; mitramicina) y un agente alquilante tal como clorambucilo o melfalán. Otras modalidades pueden incluir agentes tales como un coagulante, una citosina, factor de crecimiento, endotoxina bacteriana o el resto de lípido A de la endotoxina bacteriana. Por ejemplo, en algunas modalidades, los agentes terapéuticos pueden incluir toxinas derivadas de planta, hongo o bacteria, tales como toxinas de cadena A, una proteína inactivadora de ribosoma, a-sarcina, aspergilina, restrictocina, una ribonucleasa, toxina de difteria o pseudomonas exotoxina, para mencionar solo algunos ejemplos. En algunas modalidades, se usa una cadena A de ricina desglicosilada.

En todo caso, se propone que los agentes como estos, si se desea, pueden conjugarse exitosamente con un anticuerpo de manera tal que permitirán su direccionamiento, internalización, liberación o presentación de componentes sanguíneos en el sitio de las células tumorales diana según se requiere usando tecnología de conjugación conocida (See, e.g., Ghose et al., Methods Enzymol., 93:280

[1983]).

Por ejemplo, en algunas modalidades, la presente invención proporciona inmunotoxinas dirigidas al marcador de cáncer de células madre de la presente invención. Las inmunotoxinas son conjugados de un agente de direccionamiento específico típicamente un anticuerpo dirigido ai tumor o un fragmento con un agente citotóxico tal como un resto de toxina. El agente de direccionamiento dirige la toxina a, y por tanto mata selectivamente, las células que contienen el antígeno dirigido. En algunas modalidades, los anticuerpos terapéuticos emplean agentes reticulantes que proporcionan una elevada estabilidad in vivo (Thorpe et al., Cáncer Res., 48:6396

[1988]).

En otras modalidades, particularmente aquellas que implican el tratamiento de tumores sólidos, se diseñan anticuerpos para tener un efecto citotóxico o de otra manera anticelular contra la vasculatura tumoral mediante la supresión del crecimiento o la división celular de las células endoteliales vasculares. Se pretende que este ataque lleve a un colapso vascular localizado en el tumor, privando las células tumorales, en particular aquellas células tumorales distales de la vasculatura de oxígeno y nutrientes, finalmente llevando a la muerte celular y la necrosis tumoral.

En algunas modalidades, los agentes terapéuticos basados en el anticuerpo se formulan como composiciones farmacéuticas tal como se describe a continuación. En algunas modalidades, la administración de una composición de anticuerpo de la presente invención da como resultado una reducción medible en el cáncer (por ej., reducción o eliminación del tumor).

VI. Administración y composiciones terapéuticas Puede administrarse una composición farmacéutica que contiene un regulador de tumorigénesis de acuerdo con la presente invención mediante cualquier método efectivo. Por ejemplo, un antagonista de la senda IL8-CXCR1 o puede administrarse otro agente terapéutico que actúa como un antagonista de proteínas en la senda de transducción/respuesta de señales de IL8-CXCR1 mediante cualquier método efectivo. En algunas modalidades de la presente invención el agente terapéutico comprende Repertaxin o un derivado del mismo.

En ciertas modalidades, puede administrarse una solución fisiológicamente apropiada que contiene una concentración efectiva de un antagonista de la senda IL8-CXCR1, de manera tópica, intraocular, parenteral, oral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea o mediante cualquier otro medio efectivo. En particular, el antagonista de la senda IL8-CXCR1 puede inyectarse directamente en un cáncer o tumor diana (por ej., en tejido mamario) mediante una aguja en cantidades efectivas para tratar las células tumorales del tejido diana. De manera alternativa, un cáncer o tumor presente en una cavidad corporal tal como un ojo, tracto gastrointestinal, tracto genitourinario (por ej., la vejiga urinaria), el sistema pulmonar y bronquial y similares, pueden recibir una composición fisiológicamente apropiada (por ej., una solución tal como salina o tampón de fosfato, una suspensión o una emulsión, que es estéril) que contiene una concentración efectiva de un antagonista de la senda IL8-CXCR1 a través de la inyección directa con una aguja o a través de un catéter u otro tubo de administración colocado en el órgano hueco que sufre el cáncer o tumor. Cualquier dispositivo de imagenología efectivo tales como rayos X, sonograma o sistema de visualización por fibra óptica, puede usarse para ubicar el tejido diana y guiar la aguja o el tubo de catéter. En otra modalidad alternativa, puede administrarse sistemáticamente una solución fisiológicamente apropiada que contiene una concentración efectiva de un antagonista de la senda IL8-CXCR1 , en la circulación sanguínea para tratar un cáncer o tumor que no puede accederse directamente o aislado anatómicamente.

Tales manipulaciones tienen en común el objetivo de colocar el antagonista de la senda IL8-CXCR1 en contacto suficiente con el tumor diana para permitir que el antagonista ponga en contacto, transduzca o transfecte las células tumorales (dependiendo de la naturaleza del agente). En una modalidad, los tumores sólidos presentes en los revestimientos epiteliales de órganos huecos pueden tratarse mediante infusión de la suspensión en un órgano hueco lleno de fluido o rociando o humidificando el órgano hueco lleno de aire. Por tanto, las células tumorales (tales como células madre de tumores sólidos) pueden estar presentes en o entre el tejido epitelial en el revestimiento del árbol broncopulmonar, el revestimiento del tracto gastrointestinal, el revestimiento del tracto reproductivo femenino, tracto genitourinario, vejiga, la vesícula biliar y cualquier otro tejido de órgano al que puede accederse para poner en contacto con el antagonista de la senda IL8-CXCR1. En otra modalidad, el tumor sólido puede ubicarse en o sobre el revestimiento del sistema nervioso central, tal como, por ejemplo, la médula espinal, raíz espinal o cerebro, de manera tal que se ponga en contacto el antagonista de la senda IL8-CXCR1 infundido en el fluido cerebroespinal y transduzca las células del tumor sólido en ese espacio. Un experto en la técnica de la oncología puede apreciar que el antagonista puede administrarse al tumor sólido mediante inyección directa en el tumor de manera que el antagonista se ponga en contacto y afecte las células tumorales dentro del tumor.

Las células tumorigénicas identificadas por la presente invención también pueden usarse para hacer surgir anticuerpos de células anticancerosas. En una modalidad, el método implica obtener una población enriquecida de células tumorigénicas; tratar la población de para prevenir la replicación celular (por ejemplo, por irradiación) y administrar la célula tratada a un sujeto humano o animal en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune a las células madre de tumores sólidos. Para orientación en cuanto a la dosis efectiva de células a ser inyectadas o administradas oralmente, ver, patentes estadounidenses N° 6,218,166, 6,207,147 y 6,156,305, que se incorporan a la presente a modo de referencia. En otras modalidades, el método implica obtener una población enriquecida de células madre de tumores sólidos o células madre de tumores sólidos aislados; mezclar las células madre tumorales en un cultivo in vitro con células efectoras inmunológicas (de acuerdo con los métodos inmunológicos conocidos en la técnica) de un sujeto humano o animal hospedador donde surge el anticuerpo; eliminar las células efectoras inmunológicas del cultivo; y transplantar las células efectoras inmunológicas en un animal hospedador en una dosis que es efectiva para estimular una respuesta inmune en el animal.

En algunas modalidades de la presente invención, los agentes terapéuticos antitumorigénicos (por ej. antagonistas de la senda IL8-CXCR1) de la presente invención se coadministran con otras terapias antineoplásicas. Se usa un amplio rango de agentes terapéuticos en la presente invención. Cualquier agente terapéutico que puede coadministrarse con los agentes de la presente invención o asociarse con los agentes de la presente invención es adecuado para su uso en los métodos de la presente invención.

Se contemplan varias clases de agentes antineoplásicos (por ej., anticancerosos) para su uso en algunas modalidades de la presente invención. Los agentes anticancerosos adecuados para su uso con la presente invención incluyen pero no se limitan a, agentes que inducen apoptosis, agentes que inhiben la función de adenosina deaminasa, inhiben la biosíntesis de pirimidina, inhiben la biosíntesis del anillo de purina, inhiben las interconversiones de nucleótido, inhiben el ribonucleótido reductasa, inhiben el monofosfato de timidina (TMP), inhiben la reducción de dihidrofolato, inhiben la síntesis de ADN, forman aductos con ADN, dañan el ADN, inhiben la reparación de ADN, se intercalan con ADN, deaminata asparaginas, inhiben la síntesis de ARN, inhiben la síntesis o la estabilidad de proteína, inhiben la síntesis o función microtubular y similares.

En algunas modalidades, ejemplos de agentes anticancerosos adecuados para su uso en composiciones y método de la presente invención, incluyen pero no se limitan a: 1) alcaloides, que incluyen inhibidores microtubulares (por ej., vincristina, vinblastina y víndesina, etc.), estabilizantes microtubulares (por ej., paclitaxel (TAXOL) y docetaxel, etc.), e inhibidores de la función de cromatina, que incluyen inhibidores de topoisomerasa, tales como epipodofilotoxinas (por ej., etoposida (VP-16) y teniposida (VM-26), etc.) y agentes que se dirigen a la topoisomerasa I (por ej., camptotecina e isirinotecano (CPT-11), etc.); 2) agentes covalentes de unión a ADN (agentes alquilantes), que incluyen mostazas de nitrógeno (por ej, mecloretamina, clorambucil, ciclofosfamida, ifosfamida y busulfán (MYLERAN), etc.), nitrosoureas (por ej, carmustina, lomustina y semustina, etc.) y otros agentes alquilantes (por ej., dacarbazina, hidroximetilmelamina, tiotepa y mitomicina, etc.); 3) agentes de unión a ADN no covalentes (antibióticos antitumorales), que incluyen inhibidores de ácido nucleico (por ej, dactinomicina (actinomicina D), etc.), antraciclinas (por ej., daunorubicina (daunomicina y cerubidina), doxorubicina (adriamicina) e idarubicina (idamicina), etc.), antracenedionas (por ej., análogos de antraciclina, tales como mitoxantrona, etc.), bleomicinas (BLENOXANE), etc. y plicamicina (mitramicina), etc.; 4) antimetabolitos, que incluyen antifolatos (por ej., metotrexato, FOLEX y MEXATE, etc.), antimetabolitos de purina (por ej., 6-mercaptopurina (6-MP, PURINETHOL), 6-tioguanina (6-TG), azatíoprina, aciclovir, ganciclovir, clorodesoxiadenosina, 2-clorodesoxiadenosina (CdA) y 2'-desoxicoformicina (pentostatina), etc.), antagonistas de pirimidina (por ej, fluoropirimidinas (por ej., 5-fluorouracilo (ADRUCIL), 5-fluorodesoxiuridina (FdUrd) (floxuridina) etc.) y citosina arabinosidas (por ej., CYTOSAR (ara-C) y fludarabina, etc.); 5) enzimas, que incluyen L-asparaginasa e hidroxiurea, etc.; 6) hormonas, que incluyen glucocorticoides, antiestrógenos (por ej., tamoxifeno, etc.), antiandrógenos no esferoides (por ej., flutamida, etc.) e inhibidores de aromatasa (por ej., anastrozol (ARIMIDEX), etc.); 7) compuestos de platino (por ej., cisplatina y carboplatina, etc.); 8) anticuerpos monoclonales conjugados con fármacos anticancerosos, toxinas y/o radionucleidos, etc.; 9) modificadores de la respuesta biológica (por ej., interferones (por ej. IFN-a, etc.) y interleucinas (por ej., IL-2, etc.), etc.); 10) inmunoterapia adoptiva; 11) factores de crecimiento hematopoyético; 12) agentes que inducen la diferenciación celular tumoral (por ej., ácido retinoico todo trans, etc.); 13) técnicas de terapia génica; 14) técnicas de terapia antisentido; 15) vacunas para tumores; 16) terapias dirigidas contra metástasis tumorales (por ej., batimastat, etc.); 17) inhibidores de angiogénesis; 18) inhibidores de proteosoma (por ej., VELCADE); 19) inhibidores de acetilación y/o metilación (por ej., inhibidores de HDAC ); 20) moduladores de NF kappa B; 21) inhibidores de la regulación de ciclo celular (por ej.., inhibidores de CDK); 22) moduladores de la función de proteína p53 y 23) radiación.

Cualquier agente oncolítico que es rutinariamente usado en el contexto de la terapia contra el cáncer se usa en las composiciones y métodos de la presente invención. Por ejemplo, la Administración de Drogas y Alimentos mantiene un formulario de agentes oncolíticos aprobados para su uso en Estados Unidos. Las agencias equivalentes internacionales a la U.S.F.D.A. mantiene formularios similares. La Tabla 3 proporciona una lista de ejemplos de agentes antineoplásicos aprobados para su uso en Estados Unidos. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los "ficha técnica del producto" requeridos en todos los agentes quimioterapéuticos aprobados describen las indicaciones aprobadas, información de dosificación, datos de la toxicidad y similares, para ejemplos de agentes.

TABLA 3 clorhidrato) Clorhidrato de daunorubicina, Cerubidi Wyeth Ayerst, daunomicina ne adison, NJ (¡1 S ,3 S )-3-Acetil-l,2,3,4,6,ll-hexahidro-3, 5, 12-trihidroxi-10-metoxi-6, 11-dioxo-l-naftacenil 3-amino-2, , 6-tridesoxi- (alfa) -L- lixo hexopiranosida clorhidrato) Denileucina diftitox Ontak Seragen, (péptido recombinante) Inc . , Hopkinton, MA Dexrazoxana Zinecard Pharmacia & ( (S) -4, 4 ' - (1-metil-l, 2-etanediil) bis- Upj ohn 2, ß-piperazina diona) Company Docetaxel Taxotere Aventis ( (2R, 3S) -N-carboxi-3-fenilisoserina, Pharmaceutica N-terc-butil éster, 13-éster con 5b- ls, Inc., 20-epoxi-12a, 4, 7b, 10b, 13a- Bridgewater , hexahidroxitax- ll-en-9-ona 4-acetato NJ 2-benzoato, trihidrato) Clorhidrato de doxorubicina Adriamyc Pharmacia & (8S, IOS) -10- [ (3-amino-2,3, 6-tridesoxi- in, Upjohn a-L-lixo-hexopiranosil ) oxi ] -8- Rubex Company glicolil-7, 8, , 10-tetrahidro-6, 8, 11- I ( (8S-cis) -10- [ (3-amino-2, 3, 6- Upj ohn tridesoxi-a-L-arabino- Company hexopiranosil) oxi] -7,8,9, 10-tetrahidro-6, 8, ll-trihidroxi-8-(hidroxiacetil) -l-metoxi-5 , 12-naftacenediona clorhidrato) Epoetin alfa Epogen Amgen, Inc (péptido recombinante) Estramustina Emcyt Pharmacia & (estra-1, 3, 5 (10) -trien-3, 17- Upjohn diol (17 (beta) )-, 3- [bis (2- Company cloroetil ) carbamato] 17- (fosfato de dihidrógeno) , sal de disodio, monohidrato o estradiol 3- [bis (2-cloroetil ) carbamato] 17- (fosfato de dihidrógeno) , sal de disodio, monohidrato) Fosfató de Etoposida Etopopho Bristol-Myers ( ' -Demetilepipodofilotoxina 9- [4 , 6-0- s Squibb (R) -etiliden- (beta) -D-glucopiranosida] , 4' -(fosfato de dihidrógeno) ) etoposida, VP-16 Vepesid Bristol-Myers (4 ' -demetilepipodofilotoxina 9- [ , 6-0- Squibb (R) -etiliden- (beta) -D-glucopiranosida] ) Exemestano Aromasin Pharmacia & ( 6-metilenandrosta-l, 4-dien-3, 17- Up ohn diona) Company Filgrastim Neupogen Amgen, Inc (r-metHuG-CSF) floxuridina (intraarterial) FUDR Roche (2 ' -desoxi-5-fluorouridina) Talco Scleros Bryan, Corp., (Mg3Si4Oio (OH) 2) ol Woburn, MA Tamoxifeno Nolvade AstraZeneca ( (Z) 2- [4- (1,2-difenil-l-butenil) X Pharmaceutica fenoxi] -N, N-dimetiletanamina 2- ls hidroxi-1, 2, 3- propantricarboxilato (1:1) ) Temozolomida Temodar Schering (3, 4-dihidro-3-metil-4-oxoimidazo [5, 1-d] -as-tetrazina-8-carboxamida ) teniposida, VM-26 Vumon Bristol-Myers ( 4 ' -demetilepipodofilotoxina 9— [ 4 , 6-0- Squibb (R)-2- teniliden- (beta) -D-glucopiranosida] ) Testolactona Teslac Bristol-Myers (ácido 13-hidroxi-3-oxo-13, 17- Squibb secoandrosta-1, 4-dien-17-oico tdgr ]-lactona) Tioguanina, 6-TG Thiogua GlaxoSmithKli (2-amino-l, 7-dihidro-6 H - purina-6- nine ne tiona) Tiotepa Thiople Immunex (Aziridina, ?,?',?"- X Corporation fosfinotiolidinetris-, o Tris (1- aziridinil) sulfuro de fosfina) Clorhidrato de topotecano Hycamti GlaxoSmithKli ( (S) -10- [ (dimetilamino) metil] -4-etil- n ne 4, 9-dihidroxi-lH-pirano [3 ' , 4': 6,7] indolizino [1,2-b] quinolina-3, 14-(4H, 12H) -diona monoclorhidrato) Toremifeno Faresto Roberts (2- (p-[ (Z) -4-cloro-l, 2-difenil-l- n Pharmaceutica butenil ] -fenoxi ) -N, N-dimetiletilamina 1 Corp., citrato (1:1)) Eatontown, NJ Tositumomab, I 131 Tositumomab Bexxar Corixa Corp., (anticuerpo anti-CD20 lambda IgG2a Seattle, WA monoclonal inmunoterapéutico murino recombinante (I 131 es un anticuerpo radioinmunoterapéutico) ) Trastuzumab Hercept Genentech, (anticuerpo anti-HER2 kappa IgGi in Inc monoclonal recombinante) Tretinoina, ATRA Vesanoi Roche (ácido retinoico todo-trans) d Mostaza de uracilo Uracil Roberts Labs Mustard Capsule También se pueden usar agentes terapéuticos antimicrobianos como agentes terapéuticos en la presente invención. Se puede usar cualquier agente que puede destruir, inhibir o atenuar de otra forma la función de organismos microbianos, así como cualquier agente que se considera tiene tales actividades. Los agentes antimicrobianos incluyen, pero no se limitan a, antibióticos naturales y sintéticos, anticuerpos, proteínas inhibidoras (por ej., defensinas), ácidos nucleicos antisentido, agentes alteradores de membrana y similares, usados solos o en combinación. De hecho, se puede usar cualquier tipo de antibiótico que incluye, pero no se limita a, agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes antifúngicos y similares.

En otras modalidades adicionales, la presente invención proporciona compuestos de la presente invención (y cualquier otro agente terapéutico) asociados con agentes de direccionamiento que son capaces de dirigirse específicamente a tipos celulares particulares (por ej., células tumorales). Generalmente, el compuesto terapéutico que está asociado con un agente de direccionamiento se dirige a células neoplásicas a través de la interacción del agente de direccionamiento con un resto de superficie celular que es tomado en la célula a través de endocitosis mediada por receptor.

Cualquier resto que se sabe que se ubique en la superficie de células diana (por ej., células tumorales) es útil en la presente invención. Por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra tal resto se dirige a las composiciones de la presente invención a superficies celulares que contienen el resto. De manera alternativa, el resto de direccionamiento puede ser un ligando dirigido a un receptor presente en la superficie celular o al revés. De manera similar, las vitaminas también se pueden usar para dirigir los tratamientos de la presente invención a una célula particular.

Tal como se usa en la presente, el término "moléculas de direccionamiento" se refieren a restos químicos y porciones de los mismos útiles para dirigir compuestos terapéuticos a células, tejidos y órganos de interés. Se contemplan diversos tipos de moléculas de direccionamiento para su uso con la presente invención incluyendo, pero sin limitación a, péptidos de señalización, anticuerpos, ácidos nucleicos, toxinas y similares. Los restos de direccionamiento pueden promover adicionalmente la unión de los compuestos químicos asociados (por ej., moléculas pequeñas) o el ingreso de los compuestos en las células, tejidos y órganos dirigidos. Preferentemente, los restos de direccionamiento se seleccionan conforme a su especificidad, afinidad y eficacia para suminitrar selectivamente los compuestos unidos a los sitios dirigidos dentro de un sujeto, tejido o una célula, intuyendo ubicaciones subcelulares u organelos específicos.

Diversos problemas de eficacia afectan la administración de todos los fármacos y de fármacos altamente citotóxicos (por ej., fármacos anticáncer) en particular. Un problema de importancia particular es asegurar que los agentes administrados afecten solo las células (por ej., células cancerosas), tejidos u órganos dirigidos. La administración no específica o no intencionada de agentes altamente citotóxicos a células no dirigidas puede causar importantes problemas de toxicidad.

Se han realizado numerosos intentos por concebir esquemas de direccionamiento a fármacos para abordar los problemas asociados con la administración no específica de fármacos. {Véase por ej., K.N. Syrigos and A. A. Epenetos Anticancer Res., 19:606-614 (1999); Y.J. Park et al., J. Controlled Reléase, 78:67-79 (2002); R.V.J. Chari, Adv. Drug Deliv. Rev., 31:89-104 (1998); y D. Putnam y J. Kopecek, Adv. Polymer Sci., 122:55-123 (1995)). La conjugación de restos de direccionamiento de conjugación como péptidos de ligandos y anticuerpos (por ej., RDG para células del endotelio) a moléculas de fármaco se ha usado para aliviar algunos problemas de toxicidad colateral asociados con fármacos particulares.

Los compuestos y agentes anticáncer se pueden administrar en cualquier portador farmacéutico estéril, biocompatible, incluyendo, pero sin limitación a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa y agua. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden contener un agente (por ej., un anticuerpo). En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas contienen una mezcla de al menos dos agentes (por ej., un anticuerpo y uno o más agentes anticáncer convencionales). En aun otras modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención contienen al menos dos agentes que se administran a un paciente en una o más de las siguientes condiciones: en diferentes periodicidades, en diferentes duraciones, en diferentes concentraciones, por diferentes vías de administración, etc. En algunas modalidades, el antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1 se administra antes del segundo agente anticáncer, por ej., 0.5, 1, 2 3, 4, 5, 10, 12 o 18 horas, 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días, 1, 2, 3 o 4 semanas antes de la administración del agente anticáncer. En algunas modalidades, el antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1 se administra luego del segundo agente anticáncer, por ej., 0.5, 1, 23, 4, 5, 10, 12 o 18 horas, 1, 2, 3, 4, 5, o 6 días, 1, 2, 3 o 4 semanas luego de la administración del agente anticáncer. En algunas modalidades, el antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1 y el segundo agente anticáncer se administran simultáneamente pero en diferentes cronogramas, por ej., el compuesto antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1 se administra diariamente mientras que el segundo agente anticáncer se administra una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas. En otras modalidades, el antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1 se administra una vez por semana mientras que el segundo agente anticáncer se administra diariamente, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas o una vez cada cuatro semanas.

Dependiendo de la afección que se esté tratando, las modalidades preferidas de las presentes composiciones farmacéuticas se formulan y administran sistémica o localmente. Se pueden encontrar técnicas para la formulación y administración en la última edición de "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Pa.). Las vías adecuadas pueden, por ejemplo, incluir administración oral o transmucosa así como administración parenteral (por ej., administración intramuscular, subcutánea, ¡ntramedularmente, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal o intranasal).

La presente invención contempla administrar compuestos terapéuticos y, en algunas modalidades , uno o más agentes anticáncer convencionales, de acuerdo con métodos de admi nistración farmacéutica y técnicas de preparación aceptables. Por ejemplo, los compuestos terapéuticos y agentes anticáncer adecuados se pueden administrar a un sujeto intravenosamente en un portador farmacéuticamente aceptable como solución salina fisiológica. Se contemplan métodos estándar para administración i ntracelular de agentes farmacéuticos (por ej. , ad mi nistración por medio de liposomas). Tales métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, las formulaciones de la presente invención son útiles para la administración parenteral (por ej. , i ntravenosa, subcutánea, intramuscular, intramedular e intraperitoneal) . La coad ministración terapéutica de algunos agentes anticáncer contemplados (por ej. , polipéptidos terapéuticos) tam bién se puede lograr usando reactivos y técnicas de terapia genética.

En algu nas modalidades de la presente invención, los compuestos terapéuticos se administran a un sujeto solos o en combinación con uno o más agentes anticáncer convencionales (por ej. , secuencias de nucleótido, fármacos, hormonas, etc. ) o en composiciones farmacéuticas donde los componentes se mezclan opcionalmente con excipiente(s) u otros portadores farmacéuticamente aceptables. En modalidades preferidas de la presente invención , los portadores farmacéuticamente aceptables son biológicamente inertes. En modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas de la presente i nvención se formulan usando portadores farmacéuticamente aceptable bien conocidos en la técnica en dosis adecuadas para la administración oral. Tales portadores permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, pastillas, cápsulas, grageas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, soluciones, suspensiones y similares, para la ingestión oral o nasal respectiva de un sujeto.

Las preparaciones farmacéuticas para uso oral pueden obtenerse por medio de la combinación de los compuestos activos con excipientes sólidos, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla en granulos, luego de agregar auxiliares adecuados, en caso de ser necesario, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son cargas de carbohidrato o proteína como azúcar, incluyendo lactosa, sucrosa, manitol o sorbitol; almidón de maíz, trigo, arroz, papa, etc., celulosa como metil celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa o carboximetilcelulosa de sodio, gomas incluyendo arábiga y tragacanto y proteínas como gelatina y colágeno. En caso de que se desee, se pueden agregar agentes desintegrantes o solubilizantes, tales como poliviníl pirrolidona reticulada, ágar, ácido algínico o una sal de los mismos tal como alginato de sodio.

En modalidades preferidas, los regímenes de dosificación y administración son adaptados por el médico u otros expertos en la técnica farmacológica, con base en consideraciones farmacológicas y terapéuticas bien conocidas incluyendo, pero sin limitación a, el nivel deseado de efecto terapéutico y el nivel práctico del efecto terapéutico que se puede obtener. Generalmente, se aconseja seguir los principios farmacológicos bien conocidos para administrar agentes quimioterapéuticos (por ej., es generalmente aconsejable no cambiar las dosificaciones en más de un 50% por vez y no más de cada 3-4 semividas del agente). Para las composiciones que tienen consideraciones de toxicidad relacionada con la dosis relativamente bajas o inexistentes y en los casos en que se desea la máxima eficacia (por ej., destrucción de las células cancerosas) las dosis en exceso de la dosis requerida promedio son bastante comunes. Este enfoque a la dosificación es comúnmente llamado estrategia de la "dosis máxima". En algunas modalidades, el antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1 se administra a un sujeto a una dosis de 1-40 mg por día (por ej., durante 4-6 semanas). En algunas modalidades, al sujeto se le administra una dosis de carga de entre 15-70 mg del antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1. En algunas modalidades, al sujeto se le administra una dosis de carga de aproximadamente 35-45 mg del antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1 (por ej., de forma subcutánea) y luego dosis diarias de alrededor de 10 mg (por ej., de forma subcutánea) durante alrededor de 4-6 semanas.

Consideraciones adicionales de dosificación se refieren al cálculo de los niveles diana adecuados para el agente que se está administrando, la acumulación del agente y la posible toxicidad, la estimulación de resistencia, la falta de eficacia y la descripción del rango del índice terapéutico del agente.

En algunas modalidades, la presente invención contempla el uso de métodos de rutina para titular la administración del agente. Una estrategia común para la administración es establecer un nivel diana razonable para el agente en el sujeto. En algunas modalidades preferidas, los niveles del agente se miden en el plasma del sujeto. Los niveles y las frecuencias de dosis adecuados luego se diseñan para lograr el nivel diana de estado estacionario deseado para el agente. Se controlan los niveles reales o promedio del agente en el sujeto (por ej., por hora, día, semana, etc.) de forma tal que los niveles o las frecuencias de dosificación se puedan ajustar para mantener los niveles diana. Ciertamente, las farmacocinéticas y farmacodinámicas (por ej., biodisponibllidad, depuración o bioacumulación, biodistribución, interacciones de fármacos, etc.) del agente o agentes particulares que se están administrando pueden potencialmente afectar lo que se consideran niveles diana razonables y por lo tanto afectar los niveles o frecuencias de dosificación.

Los métodos de dosificación de nivel diana típicamente dependen de establecer un objetivo terapéutico razonable definido en términos de un rango deseado (o rango terapéutico) para el agente en el sujeto. En general, el límite inferior del inttervalo terapéutico es más o menos igual a la concentración del agente que proporciona aproximadamente 50% del efecto terapéutico máximo posible. El límite superior del rango terapéutico es generalmente establecido por la toxicidad del agente y no por su eficacia. La presente invención contempla que el límite superior del rango terapéutico para un agente particular será la concentración en la cual menos del 5 o 10% de los sujetos muestran efectos secundarios tóxicos. En algunas modalidades, el límite superior del rango terapéutico es aproximadamente dos veces, o menos, que el límite inferior. Los expertos en la técnica comprenderán que estas consideraciones de dosificación son altamente variables y en alguna medida individualistas (por ej., con base en las predisposiciones genéticas, consideraciones inmunológicas, tolerancas, resistencias y similares). Por lo tanto, en algunas modalidades, los niveles de dosificación diana eficaces para un agente en un sujeto particular puede ser 1, ... 5,. . . 10, . . . 15, . . . 20, . . . 50, . . . 75, . . . 100, . . . 200, . . . X% mayores que lo óptimo en otro sujeto. A la inversa, algunos sujetos pueden sufrir efectos secundarios significativos y problemas de salud relacionados con la toxicidad a niveles de dosificación o frecuencias mucho menores (1, ...5, . . . 10, . . . 15, . . . 20, . . . 50, . . . 75, . . . 100, . . . 200, . . . X%) que aquellos que típicamente producen niveles terapéuticos óptimos en algunos o la mayoría de los sujetos. En ausencia de información más específica, los niveles de administración diana se fijan frecuentemente en el medio del rango terapéutico.

En modalidades preferidas, el médico diseña racionalmente un régimen de dosificación individualizado basado en principios y ecuaciones farmacológicos conocidos. En general, el médico diseña un régimen de dosificación individualizado basado en el conocimiento de diversas propiedades farmacológicas y farmacocinéticas del agente, incluyendo, pero sin limitarse a, F (biodísponibildad fraccionaria de la dosis), Cp (concentración en plasma), CL (depuración/velocidad de depuración), Vss (volumen de la distribución de fármaco en estado estacionario), Css (concentración en estado estacionario) y t1/2 (semivida del fármaco) así como información sobre la velocidad de absorción y distribución del fármaco. Se remite a los expertos en la técnica a uno cualquiera de diversos textos farmacológicos bien conocidos (por ej., Goodman and Gilman's, Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 10th ed., Hardman et al., eds., 2001) para una explicación adicional de estas variables y para ecuaciones completas que describen el cálculo de regímenes de dosificación individualizados. Los expertos en la técnica también serán capaces de anticipar posibles fluctuaciones en estas variables en sujetos individuales. Por ejemplo, la desviación estándar en los valores observados para F, CL y Vss es típicamente alrededor de 20%, 50% y 30% respectivamente. El efecto práctico de parámetros que potencialmente varían en gran medida en sujetos individuales es que 95% de las veces el Css logrado en un sujeto es entre 35 y 270% del nivel diana. Para los fármacos con índices terapéuticos bajos, este es un rango indeseablemente amplio. Los expertos en la técnica comprenderán, sin embargo, que una vez que se mide el Cp (concentración en plasma) del agente, es posible calcular los valores de F, CL y Vss directamente. Esto le permite al médico ajustar eficazmente un régimen de dosificación de un sujeto particular.

En aun otras modalidades, la presente invención contempla que se usen las técnicas continuadas de control de fármaco terapéutico para ajustar adicionalmente los métodos y regímenes de dosificación de un individuo. Por ejemplo, en una modalidad, los datos de Css se utilizan para refinar adicionalmente los cálculos de CL/F y luego ajustar la dosificación de mantenimiento del individuo para lograr niveles diana de agente deseados usando principios y ecuaciones farmacológicos conocidos. El control de fármaco terapéutico se puede llevar a cabo prácticamente en cualquier momento durante el cronograma de dosificación. En modalidades preferidas, el control se lleva a cabo en múltiples puntos de tiempo durante la dosificación y especialmente cuando se administran dosis intermitentes. Por ejemplo, el control del fármaco se puede llevar a cabo concomitantemente, dentro de fracciones de un segundo, segundos, minutos, horas, días, semanas, meses, etc., de la administración del agente sin importar la metodología de dosificación utilizada (por ej., dosificación intermitente, dosis de carga, dosifación de mantenimiento, dosificación aleatoria o cualquier otro método de dosificación). Sin embargo, los expertos en la técnica comprenderán que cuando el muestreo sea inmediatamente posterior a la administración del agente, los cambios en los efectos del agente y la dinámica pueden no visualizarse rápidamente debido a que los cambios en la concentración en plasma del agente se pueden retrasar (por ej., debido a una velocidad de distribución lenta u otros factores farmacodinámícos). Por consiguiente, las muestras objeto obtenidas poco después de la administración del agente pueden tener valor limitado o reducido.

El objetivo principal de recoger muestras biológicas del sujeto durante el nivel de administración diana en estado estacionario predicho es modificar el régimen de dosificación del individuo basándose en el cálculo posterior de estimaciones revisadas de la proporción CL/F del agente. Sin embargo, los expertos en la técnica comprenderán que las concentraciones de fármaco pos-absorción tempranas no reflejan típicamente la depuración del agente. Las concentraciones de fármaco pos-absorción tempranas están estipuladas principalmente por la velocidad de absorción del agente, el estado central más que el estacionario, el volumen de la distribución del agente y la velocidad de distribución. Cada una de estas características farmacocinéticas tiene valor limitado al momento de caluclar regímenes de dosificación terapéuticas de mantenimiento a largo plazo.

Por consiguiente, en algunas modalidades, cuando el objetivo es una dosis terapéutica de mantenimiento a largo plazo, se obtienen muestras biológicas del sujeto, células o los tejidos de interés, mucho después de que se haya administrado la dosis anterior y aun más preferentemente poco antes de que se administre la siguiente dosis planeada.

En aun otras modalidades, en los casos en que el agente terapéutico esté casi completamente depurado por el sujeto en el rango entre dosis, entonces la presente invención contempla recoger muestras biológicas del sujeto en diversos momentos luego de la administración anterior y más preferentemente poco después de que se administre la dosis.

VII. Repertaxin y otros inhibidores de CXCR1 de molécula pequeña En algunas modalidades, los métodos, kits y composiciones de la presente invención utilizan inhibidores de molécula pequeña de CXCR1. Un ejemplo de agente es repartaxin. En algunas modalidades, la dosis ¡n vivo de repartaxin se encuentra entre 3 y 60 mg por kilogramo (por ejemplo, 3... 30... 50... 60 mg/kg). En modalidades particulares, la dosis de repartaxin es de alrededor de 30 mg por kilogramo. A continuación se muestra la fórmula química para repartaxin: En otra modalidad, se utilizan derivados del repertaxin. Otros antagonistas de CXCR1 de molécula pequeña incluyen SB265610 (Glaxo SmithKIine Beecham; Benson et al., 2000, 151:196-197), así como SCH 527123 (2-hidroxi-N,N-dimetil-3-(2-[[(R)-1-(5-metilfuran-2-il)propil]amino]-3,4-dioxiciclobut-1-enilamino)benzamida (SCH 527123), un antagonista del receptor de CXCR2/CXCR1 oralmente biodisponible (Schering Plough)). Se pueden identificar otros inhibidores de molécula pequeña mediante los métodos de análisis descritos anteriormente.

Ejemplos El siguiente ejemplo se proporciona a los efectos de demostrar e ilustrar adicionalmente algunas modalidades y aspectos preferidos de la presente invención y no debe interpretar como una limitación del alcance la misma.

Ejemplo 1 CXCR1 identifica las células madre cancerosas El presente ejemplo describe la identificación de CXCR1, así como otras proteínas (por ej., FBX021), como marcadores de células madre cancerosas.

Cultivo celular Se obtuvieron líneas celulares mamarias (BCL) de la ATCC ("http://www" seguido por "Igcpromochem- atcc.com/common/catalog/cellBiology/ celIBiologylndex.cfm") o de colecciones creadas en los laboratorios de los Dres. S. Ethier (ahora disponible en "http://www." seguido por "asterand.com/asterand /BIOREPOSITORY 5 /hbreastcancercelllines.aspx, SUM44, SUM52, SUM149, SUM159, SUM185, SUM190, SUM225, SU 229"), V.J. Mobus (BrCa- Z-01) y V. Catros (S68). Todas las BCL analizadas se derivaron de carcinomas, excepto por MCF10A, que se derivó de enfermedad fibroquística y el 184A1 derivado de HMEC, que se derivó de tejido mamario normal. Las líneas celulares se cultivaron utilizando las o condiciones de cultivo recomendadas. Todos los experimentos se realizaron con células subconfluentes en la fase exponencial de crecimiento.

Ensayo de ALDEFLUOR y separación de la población ALDH- positiva mediante FACS Se evaluó la actividad de ALDH en 33 BCL 5 que representaban los principales subtipos moleculares de cáncer de mama humano. El kit de ALDEFLUOR (StemCell technologies, Durham, NC, EUA) se utilizó para aislar la población con actividad enzimática de ALDH alta (17). Las células obtenidas de líneas celulares subconfluentes luego de la tripsinización o de xenoinjertos o recientemente disociados se suspendieron en tampón de ensayo de ALDEFLUOR con sustrato de ALDH (BAAA, 1 pmol/l por 1x106 células) y se incubaron durante 40 minutos a 37"C. En cada experimento, se tiñó una muestra de células en condiciones idénticas con 50mmol/L de detilaminobenzaldehído (DEAB), un inhibidor de 5 ALDH específico, como referencia negativa. La separación por citometría de flujo se realizó utilizando un FACStarPLUS (Becton Dicklnson). Se excitó la fluorescencia con ALDEFLUOR a 488 nm y se detectó utilizando un filtro pasa banda con isotiocianato de fluoresceína estándar (FITC) 530/30. Para los tumores xenotransplantados, se utilizó incubación con un anticuerpo anti-H2Hd (BD biosciences, 1/200, 20 min en hielo) seguida por un anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (Jackson labs, 1/250, 20 min en hielo) para eliminar las células provenientes de ratón. Las compuertas de separación se establecieron utilizando células teñidas con Pl para determinar la viabilidad, células teñidas con ALDEFLUOR tratadas con DEAB y aquellas teñidas solamente con anticuerpo secundario. Antes de establecer los perfiles con ARN o inyectar a los ratones con NOD/SCID, se revisó la pureza de las poblaciones separadas utilizando una doble separación de 10,000 células ALDEFLUOR-positivas y -negativas para en líneas celulares BrCa-MZ-01 y SUM159. En ambas líneas celulares, las poblaciones ALDEFLUOR-positivas contenían más de 98% de células ALDEFLUOR-positivas y no se detectaron células ALDEFLUOR-positivas en la población ALDEFLUOR-negativa.

Tumorigenicldad en ratones NOD/SCID Se evaluó la tumorigenicidad de células SUM159, MDA-MB-453 y BrCa-MZ-01 sin separar ALDEFLUOR-positivas y negativas en ratones NOD/SCID. A los panículos adiposos se les removió el epitelio a las 3 semanas de edad antes de la pubertad y se los humanizó mediante inyección de fibroblastos humanos (1:1 irradiados:no irradiados, 50,000 células/100µ? Matrigel/panículo adiposo) según se describió (17). Los animales se sometieron a eutanasia cuando los tumores alcanzaron 1.2 cm en el diámetro de mayor longitud, de acuerdo con las reglamentaciones para el uso de animales vertebrados en investigaciones. Una porción de cada panículo adiposo se fijó en formalina y se empapó en parafina para el análisis histológico. Otra porción se evaluó mediante el ensayo ALDEFLUOR, seguido por separación y transplante en serie.

Cultivo independiente la fijación Las células sin separar ALDEFLUOR-positivas y -negativas de 184A1, SUM149 y SU 159 se colocaron en placas como células únicas en placas de unión ultra-baja (Corning, Acton, MA) a una densidad baja (5000 células viables/ml). Las células se cultivaron en medio basal epitelial mamario libre de suero (Cambrex Bio Science, Walkerville, MD) durante 3-7 días, según se descrcibió (18). Se cuantificó la capacidad de las células de formar esferas luego del tratamiento con diferentes dosis de IL8 (GenWay Biotech, San Diego, CA) agregado al medio.

Extracción de ARN Se extrajo el ARN total de células ALDEFLUOR-positivas y -negativas usando el maxi-kit de preparación total de ADN/ARN, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Sample and Assay technologies, Países Bajos). Se utilizaron ocho BCL para el análisis transcripcional: 184A1, BrCa-MZ-01, HCC1954, MDA- B-231, MDA-MB-453, SK-BR-7, SUM149 y SU 159. La integridad del ARN se controló mediante electroforesis en gel de agarosa con formaldehído desnaturalizante y micro-análisis (Agilent Bioanaiyzer, Palo Alto, CA).

Establecimiento de perfiles de la expresión génica con micromatrices de ADN Los análisis de expresión génica utilizaron micromatrices de oügonucleótidos humanos 2.0 U133 de Affymetrix con más de 47,000 transcripciones y variantes, incluyendo 38,500 genes humanos bien caracterizados. La preparación de ARNc, las hibridaciones, los lavados y la detección se realizaron según lo recomendó el proveedor ("http://www." seguido por "affymetrix.com/index.affx"). Los datos de expresión se analizaron mediante el método de RMA (promedio multichip robusto) en R usando Bioconductor y paquetes asociados (19), según se describió (20,21). El RMA realizó el ajuste del fondo, la normalización cuantil y el resumen de 11 oligonucleótidos por gen.

Antes del análisis, un proceso de filtración eliminó del set de datos los genes con una expresión baja y mal medida, según lo definió un valor de expresión inferior a 100 unidades en las 16 muestras y se retuvieron 25,285 genes/EST. Se aplicó un segundo filtro, basado en la intensidad de la desviación estándar (SD) en los análisis sin supervisar, para excluir los genes que presentaban una variación de expresión baja en los análisis. Se calculó la SD en los datos transformados con log2, donde los valores más bajos se llevaron a un valor mínimo de 100 unidades, es decir, la intensidad del fondo y se retuvieron 13,550 genes/EST con una SD superior a 0.5. Se realizó un análisis no supervisado en 16 células de ALDEFLUOR-positivas y -negativas en 13,550 genes. Antes del agrupamiento jerárquico, los datos filtrados se transformaron con log2 y se ingresaron al programa Cluster (22) usando datos centrados en la media en genes, la correlación de Pearson como medida de similitud y agrupamiento de unión centroide. Los resultados se mostraron usando el programa Tree View (22). Para identificar y clasificar los genes discriminandos las poblaciones de ALDEFLUOR-positivas y -negativas, se aplicó una prueba ann y Whitney U a los 25,285 genes/EST y se utilizó la tasa de descubrimiento falso (FDR, (23)) para corregir las múltiples hipótesis de prueba. El poder de clasificación de la firma discriminadora se ilustró mediante la clasificación de muestras por medio de agrupamiento jerárquico. Se aplicó un LOOCV para estimar la exactitud de predicción de las firmas moleculares identificadas y la validez del análisis supervisado; todas las muestras se excluyeron una por tina y se clasificaron con el análisis discriminante lineal (LDA, (24) usando un modelo definido las muestras no excluidas.

RT-PCR en tiempo real Luego de separar las poblaciones de ALDEFLUOR-positivas y ALDEFLUOR-negativas de diferentes líneas celulares, el ARN total se aisló usando el mini kit RNeasy (QIAGEN) y se utilizó para los ensayos de RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) en un sistema de deteción de secuencia ABI PRISM® 7900HT con un módulo de bloque de 384 pocilios y accesorio de automatización (Applied Biosystems). Los cebadores y las sondas para el sistema Taqman se seleccionaron del sitio web de Applied Biosystems. Las secuencias de los pares de cebadores y las sondas fluorogénicas de PCR utilizados para CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1 y TBP se encuentran disponibles en el sitio web de Applied Biosystems (ID del ensayo de CXCR1: Hs_00174146_mi; ID del ensayo de FBX021: Hs_00372141_mi, ID del ensayo de NFYA: Hs_00953589_m¡, ID del ensayo de NOTCH2: Hs_01050719_mi, ID del ensayo de RAD51L1: Hs00172522_mi, ID del ensayo de TBP: Hs_00427620_mi). Se computó el nivel relativo de ARNm de expresión de CXCR1, FBX021, NFYA, NOTCH2, RAD51L1 con relación al gen TBP estándar interno para normalizar las variaciones en la calidad del ARN y la cantidad de ADNc de entrada, como se describión previamente (25).

Ensayo de invasión Se realizaron ensayos en triplicado en cámaras transweil con inserciones de filtros de policarbonato con poros de 8 um en placas de 12 pocilios (Corning, NY). Los filtros se recubrieron con 30 ul de extracto de membrana basal 1:6 helada (Matrigel, BD-Bioscience) en DMEM/F 2 incubada 1 hora a 37°C. Las células se agregaron a la cámara superior en 200 ul de medio libre de suero. Para el ensayo de invasión, se sembraron 5000 células en los filtros recubiertos con Matrigel y la cámara inferior se cargó con 600 ul de medio complementado con 10% de. suero humano (Cambrex) o con 600 ul de medio libre de suero complementado con IL8 (100ng/mL). Luego de 48 horas de incubación, las células en el lado inferior del filtro se contaron usando microscopía óptica. La invasión relativa se normalizó a las líneas celulares correspondientes sin separar en condición sérica.

Infeción con Lentivirus Para la transducción génica con luciferasa, se incubaron células 70% confluentes de HCC1954, MDA-MB-453 y SUM159 durante la noche con una mezcla precipiatada 1:3 de sobrenadantes lentivirales Lenti-LUC-VSVG (Vector Core, Ann Arbor, MI) en medio de cultivo. Al día siguiente las células se extrajeron mediante tripsina/EDTA y se subcultivaron a una proporción de 1:6. Luego de 1 semana de incubación, las células se separaron de acuerdo con el fenotipo de ALDEFLUOR y la expresión de luciferasa se verificó en cada población separada (ALDEFLUOR-positiva y ALDEFLUOR-negativa) agregando 2 mi de D-luciferina 0.0003% (Promega, Madison, Wl) al medio de cultivo y contando el flujo de fotones con un sistema de cámara de dispositivo (Xenogen, Alameda, CA).

Inoculación intracardíaca Se sometieron a anestesia ratones NOD/SCID de seis semanas de edad con una mezcla de 2% de isofluorano/aire y se inyectaron en el ventrículo cardíaco izquierdo con 100,000 células en 100 µ?_ de PBS de Dulbecco estéril sin Ca2 + y Mg2+. Para cada una de las tres líneas celulares (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159) y para cada población (ALDEFLUOR-positiva, ALDEFLUOR-negativa y sin separar), se inyectaron tres animales.

Deteción de bioluminiscencia La bioluminiscencia base se evaluó antes de la inoculación y cada semana posterior a las inoculaciones. Los ratones se anestesiaron con una mezcla de 2% de isofluorano/aire y se les proporcionó una única dosis i.p. de 150 mg/kg de D-luciferina (Promega, Madison, Wl) en PBS. Los animales luego se volvieron a anestesiar 6 minutos después de la administración de D-luciferina. Para el conteo del flujo de protones, se utilizó un sistema de cámara dispositivo acoplado con carga (Xenogen, Alameda, CA) con un sistema de suministro de isofluorano con cabezal cónico y una etapa de calentamiento para mantener la temperatura corporal. Los resultados se analizaron luego de 2 a 12 minutos de exposición usando el software Living Image proporcionado con el sistema de imagenología de Xenogen. La intensidad de la señal se cuantificó como la suma de todos los conteos de flujo de fotones detectados dentro de una región uniforme de interés colocada manualmente durante el posprocesamiento de datos. El flujo de fotones normalizado representa la proporción de flujo de fotones detectados cada semana luego de las inoculaciones y el flujo de fotones detectado antes de la inoculación.

Análisis estadístico Los resultados se presentan como la SD ± media de al menos tres experimentos indivicuales repetidos en cada grupo. Los análisis estadísticos utilizaron el software SPSS (versión 10.0.5). Las correlaciones entre los grupos de muestras y los parámetros moleculares se calcularon con la prueba exacta de Fisher o el ANOVA unidireccional para muestras independientes. Un valor-p *0.05 se consideró significativo.

La mayoría de las líneas celulares mamarias contienen una población ALDEFLUOR-positiva El ensayo de ALDEFLUOR (17) se utilizó para aislar CSC de 33 BCL que representan los diferentes subtipos moleculares y las caracterísiticas del cáncer de mama (20). Se encontró que 23 de las 33 líneas celulares contenían una población celular ALDEFLUOR-positiva en el rango de 0.2 hasta casi 100%. Las 16 BCL basales/mesenquimaies contenían una población ALDEFLUOR-positiva, mientras que 7 de las 12 BCL luminales no contenían ninguna células ALDEFLUOR-positiva (p=0.0006, prueba exacta de Fischer).

Las células ALDEFLUOR-positivas tienen capacidad de formación de tumoresferas. Se ha indicado anteriormente que las células progenitoras y madre epiteliales mamarias pueden sobrevivir y proliferar en condiciones independientes de la fijación y formar colonias esféricas flotantes que se denominan mamoesferas (18). Los datos de los tumores de mama, así como las líneas celulares, demostraron que las células tipo madre cancerosas o las células que inician el cáncer también se pueden aislar y propagar como "tumoresferas" en ensayos similares (26). Todas las células que inician mamoesferas en la glándula mamaria humana normal están contenidas en la población ALDEFLUOR-positiva (17). Para caracterizar la población ALDEFLUOR-positiva de BCL, se comparó la capacidad de poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas de 184A1, SUM149 y SUM159 de formar tumoresferas. En cada línea celular, la población ALDEFLUOR-positiva mostró mayor capacidad de formación de tumoresferas en comparación con las células ALDEFLUOR-negati as.

Las células de BCL ALDEFLUOR-positivas tienen propiedades de células madre cancerosas in vivo. Para determinar la organización jerárquica de BCL, se analizaron las propiedades de células madre de las poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas de las líneas celulares MDA-MB-453, SUM159 y BrCa-MZ-01. Las poblaciones ALDEFLUOR-positivas de estas tres BCL constituyeron entre 3.54±1.73% y 5.49±3.36% de las poblaciones celulares totales (Fig. 1A-B, G-H; Fig. 2A-B). Como se muestra en la Fig. 1F, L el tamaño y la latencia de la formación de tumor tuvo correlación con la cantidad de células ALDEFLUOR-positivas inyectadas. Extraordinariamente, 500 células ALDEFLUOR-positivas de MDA-MB-453 y 1,000 células ALDEFLUOR-positivas de SUM159 pudieron formar tumores. La capacidad de generar tumores se mantuvo a través de pasajes en serie, lo que demostró la capacidad de autorrenovacion de estas células. Por el contrario, las células ALDEFLUOR-negativas no pudieron generar tumores, si bien se produjo un crecimiento limitado cuando se inyectaron 50,000 células MDA-MB-453 ALDEFLUOR-negativas. La tinción de los cortes de panículos adiposos con H&E confirmaron que los tumores formados por células ALDEFLUOR-positivas contenían células malignas, mientras que solamente se apreció Matrigel residual, células apoptóticas y tejido de ratón en los sitios de inyecciones de células ALDEFLUOR-negativas (Fig. 1E, K). De manera coherente con el hecho de que la población ALDEFLUOR-positiva tiene características de células madre cancerosas, los tumores generados mediante esta población recapitulan la heterogeneidad fenotípica del tumor inicial, con una proporción similar de células ALDEFLUOR-positivas y -negativas (Fig. 1C, I). Esto indica que las células ALDEFLUOR-positivas pudieron autorrenovarse y así generar células ALDEFLUOR-positivas y pudieron diferenciarse y generar células ALDEFLUOR-negativas.

Cuando se separaron las células BrCa-MZ-01 en componentes ALDEFLUOR-positivos y -negativos, ambas pudieron generar tumores. Los tumores generados por la población ALDEFLUOR-positiva consistían en células ALDEFLUOR-positivas y -negativas que recapitulaban la heterogeneidad fenotípica del tumor inicial. Por el contrario, los tumores generados por células ALDEFLUOR-negativas dieron lugar a tumores de crecimiento lento que contenían solamente células ALDEFLUOR-negativas. A diferencia de la capacidad de las células ALDEFLUOR-positivas de ser transplantadas en serie, los pasajes en serie de tumores ALDEFLUOR-negativos disminuyeron el crecimiento tumoral sin crecimiento luego de los tres pasajes. Esto sugiere que el componente ALDEFLUOR-positivo de las células BrCa-MZ-01 contiene células con propiedades de células madre, mientras que las células ALDEFLUOR-negativas contienen células progenitoras que pueden someterse a crecimiento limitado, pero no pueden autorrenovarse.

Establecimiento de perfiles de expresión génica de poblaciones celulares ALDEFLUOR-positivas y -negativas. Para determinar si las células ALDELUOR-positivas aisladas de diferentes BCL expresaban un conjunto común de genes de "células madre cancerosas", las poblaciones celulares ALDEFLUOR-positivas y -negativas aisladas de ocho BCL (184A1, BrCa-MZ-01, HCC1954, DA-MB-231 , DA-MB-453, SK-BR-7, SUM49 y SU 159) se analizaron usando micromatrices de oligonucleótidos de genoma Affymetrix. El agrupamiento jerárquico no supervisado aplicado a 16 muestras y los 13,550 genes/EST filtrados no separaron las poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas. En lugar de ello, las poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas se agruparon con la línea celular parental. Esto sugiere que las diferencias en transcripciones de ARNm entre las líneas celulares clónales suplantan las diferencias entre las células ALDEFLUOR-positivas y ALDEFLUOR-negativas. Esto sugiere adicionalmente que solamente una cantidad limitada de genes se expresa diferencialmente entre las células madre cancerosas putativas y su progenie.

Para determinar qué genes discriminaban las poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas, se aplicó la prueba de Mann y Whitney U a todos los genes salvo aquellos con una expresión baja y mal medida, es decir, 25,285 conjuntos de sondas. Esta prueba identifó y clasificó, luego de la correción de FDR, 413 genes/EST que discriminaban las poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas. Los 28 genes sobreexpresados correspondientes a genes únicos se muestran en la Tabla 1 y la mayoría de los genes frecuentemente infraexpresados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 1 - Genes regulados por au mento Categoría Símbolo Descripción Citobanda ID. conjunto Función de sondas Genes que se dijo previamente que repetición desairollo tenían incidencia TPRXL tetrapeptídica tipo ehr3p25.l 239061_at embrionario en la biología de horneo secuencia temprano células madre homólogo de Noten 2 programa de NOTCH2 chrlpl3-pl l 202443_x_at (Drosófila) autorrenovación determinación del proteína de motivo de RBM15 chrlpl3 1555760_a_at destino de células unión a ARN 15 hematopoyéticas mantenimiento de beta-galactosida alfa- los antigenos ST3GAL3 2,3-sialiltiansferasa 3 chrlp34.1 1555181_a_at embrionarios SSEA- ST3 3 y -4 factor de transcripción programa de NFYA chróp21.3 204107_at nuclear Y, alfa autorrenovación determinación del destino de células homólogo de pecanex PCNX chrl4q24.2 213.173_at neurales de embrión (Drosófila) de desarrollo temprano Señalización FBX021 * proteína con caja F chrl2q24.22 212231_at ubiquitinación degradación de dominio WW con proteína, W OX Chrl6q23.3-q24.1 210695_s_at oxidorreductasa transcripción y corte y empalme de RNA Cinasa de proteína señalización de CAM 2B chr22ql2 34846_at dependiente de calcio calcio/calmodulina (Ca cinasa) ? beta dominio de fosfolipasa hidrólisis de PNPLA2 tipo patatina que chrllpl5..5 39854_r_at triglicéridos contiene 2 canal intracelular de transporte de iones CLIC5 Chr6pl2.1-21.1 213317_at cloruro 5 de cloruro UDP-glucosa ceramida glucosüación de UGCGL1 tipo glucosiltransferasa Chr2ql4.3 222689_at proteínas 1 proteína de repetición FBXL18 rica en leucina y con chr7p22_2 220896_at ubiquiünación cajaF 18 fosforilación de cinasa del receptor beta ADRBKl chrllql3 38447_at receptores acoplados adrenérgico 1 a proteíne G familia portadora de transportador de SLC38A2 chrl2q 1559924_at soluto 38, miembro 2 aminoácidos neutros Pro teína de IL8RA* Receptor de respuesta chr2q35 207094_at membrana (CXC 1) interleucina 8, alfa inflamatoria receptor de gusto, tipo TAS2R14 chrl2pl3 241997_at percepción amarga 2, miembro 14 miembro b de la familia CD300LB Chrl7q25.1 1554173_at respuesta inmune tipo molécula CD300 familia que contiene el G1PC3 dominio GIPC PDZ, chrl9pl3.3 236730_at miembro 3 reparación de la Reparación de 1 tipo RAD51 (S.

RAD51L1 chrl4q23 -q24.2 1570166_a_at re combinación ADN cerevisiae) homóloga remodelación de Remodelación de dominio interactivo rico ARID1B chr6q25.1 225181_at cromatina (complejo la cromatina en AT lB (tipo SWll) SW1/SNF) mantenimieneto de Citoesqucleto EFPK.1 epiplakina 1 chr8q24.3 209156_x_at los filamentos intermedios de queratina Matriz colágeno, tipo ¾ alfa morfogénesis COL11A2 chr6p21.3 216993_s_at extra celular 2 esquelética calicreina 3, (antígeno LK3 especifico de la chrl9ql3.41 231029_x_at proteasa próstata) 5 süenciamiento factor de inicio de la Interferencia de génico mediado por EF2C2 traslación eucaríota 2C, Chr8q24 213310_at RNA RNA interferente 2 pequeño homólogo de la Desconocido ZFP41 proteina con dedos de chr8q24.3 227898_s_at desconocido zinc 41 (ratón) 10 familia con similitud de FA 49B secuencia 49, miembro chr8q24.21 243182_at Desconocido B candidato 2 de PSORS1C2 susceptibilidad a chr6p21.3 220635_at Desconocido psoriasis 1 TABLA 2 - Genes reg ulados por dismin ución Categoría Símbolo Descripción Citobanda ID conjunto Función de sondas Síntesis de MRPL42* proteina ribosomal Chrl2q22 217919_s_at Síntesis de proteínas mitocondrial L42 proteínas dentro de la mitocondria M PL54* proteína ribosomal chrl9pl3.3 225797_at Síntesis de 20 mitocondrial L54 proteínas dentro de la mitocondria MRPL 7* proteína ribosomal chr3q26.33 223 80_s_at Síntesis de mitocondrial L47 proteínas dentro de la mitocondria MRBS23* proteína ribosomal chrl7q22- 223156_at Síntesis de mitocondrial S23 q23 proteínas 25 dentro de la mitocondria EIF3S9* factor de inicio de Chr7p22.2 236274_at Inicio de traducción eucariótica 3, sintesis de subunidad 9 eta, 116M>a proteínas (complejo de multiproteínas EIF3) Señalización ALG5* glicosilación unida a chrl3ql3.3 218203_at Glucosilación asparagina 5 homóloga de proteínas 5 DNAJC19* DnaJ (Hsp40) homólogo, chr3q26.33 225359_at Importación de subfamilia C, miembro 19 proteínas mitocondriales HBLD2* dominio del tipo HESB que Chr9q21.33 221425_s_at biogénesis de contiene 2 aglomeración hierro-azufre GART* Fosforibosilglicinamida chr21q22.1 230097_at biosíntesis de formiltransferasa, novo de purinas fosforibosilglicinamida sintetasa, 10 fosforibosilaminoimidazol sintetasa NUP37* nucleoporina 37kDa chrl2q23.2 218622_at Transporte de proteína intracelular a lo largo de la membrana nuclear RNF7* proteina con dedos de chr3q22- 224439_x_at subunidad de 15 zinc ring 7 q24 ligasas ubicuitina de proteina de caja SKP1- culin/CDC53-F DC2* proteina DC2 chr4q25 223001_at glicosilación de proteínas USP15* peptidasa especifica de chrl2ql4 210681_s_at Degradación de ubicuitina 15 proteínas 20 COMMD6* dominio COMM que contiene 225312_at Inhibición de e señalización NF-KappaB UBL5* 5 del tipo ubicuitina chrl9pl3.3 218011_at Ubiquitinación Apoptosis MRPX41* proteína ribosomal chr9q3 .3 225425_s_at Estabilización mitocondrial L41 de proteína p53, paro del ciclo celular (p21 (WAF1/CIP1) y p27 (Kipl) 25 dependiente) PDCD10* muerte celular programada chr3q26.1 210907_s_at Inicio de 10 apoptosis PDCD5* Muerte celular programada chrl9ql2- 227751_at Inicio de 5 apoptosis Programa de NACA* polipéptido alfa del chrl2q23- 222018_at Diferenciación diferenciación complejo asociado con q24.1 eritroide polipéptido activo Cielo celular FAM82B* familia con similitud de Chr8q21.3 218549_s_at Regulación de secuencia 82, miembro B dinámica microtubular Corte y CCN11* ciclina Ll Chr3q25.32 155541_a_at Procesamiento empalme da ARN previo a ARNm PRPF39* factor de procesamiento chrl4q21.3 220553_s_at Procesamiento previo a ARNm PRP39 39 previo a ARNm homólogo (S. cerevisiae) LSM3* LSM3 homólogo, ARN chr3p25.1 10 202209_at Procesamiento nuclear pequeño U6 previo a ARNm asociado (S. cerevisiae) SFRS7* factor de corte y chr2p22.1 213649_at Regulación de empalme, rico en corte y empalme arginina/serina 7, 35kDa de ARN PRPF48* factor de procesamiento Chr6p25.2 202127_at Procesamiento previo a ARNm PRP 4 B previo a ARNm homólogo (levadura) ¾ forilación ATP5S* ATP sintasa, transporte chrl4q22.1 206992_s_at subunidad de oxidativa H+, complejo F0 sintasa ATP mitocondrial, subunidad s mitocondrial (factor B) NDUFA2* deshidrogenase NADH chr5q31 209224_s_at componentes de (ubicuinona) 1 la enzima del 3ubcomplejo alfa, 2 complejo I de subunidades múltiples ATP5J2* ATP sintasa, transporte Chr7q22.1 202961_s_at subunidad de 20 H+, complejo FO sintasa ATP mitocondrial, subunidad mitocondrial F2 IMMP1L* membrana mitocondrial chrllpl3 2305S6__at Proteólisis interna IKP1 del tipo peptidasa Desconocido ASTE1* homólogo asteroide 1 Chr3q22.1 221135_s_at Desconocido (Drosophila) MGC61571* proteina hipotética Chr3p24.1 228283_at Desconocido 25 MGC61571 WDR53* dominio repetido WD 53 chr3q29 227814_at Desconocido DKF2P686A10121* proteina hipotética chr7q21.13 234311_S_at Desconocido CHCHD8* Dominio superhélice- chrllql3.4 220647_s_at Desconocido hélice-superhélice-hélice que contiene 8 FLJ32745* proteina hipotética Chr2ql3 235644_at Desconocido FIJ32745 CHURC1* dominio churchill que chrl4q23.3 233268_S_at Desconocido contiene 1 XTP3TPA* proteina transactivadora chrl6pll.2 218069_at Desconoc do de XTP3 A FLJ37953* proteína hipotética Chr2q33.1 235181_at Desconocido FLJ37953 SNORD50A* ARN nucleolar pequeño, chr6ql4.3 244669_at Desconocido C/D con caja 50A LOC644053* proteina hipotética c rlq41 235466_s_at Desconocido LOC644053 TMEM141* proteína transmembrana chr9q34.3 225568_at Desconocido 141 C8orf59* marco de lectura abierto chr8q21.2 226165_at Desconocido 59 de cromosoma 8 El poder de clasificación de esta firma discriminadora se ilustra clasificando las 16 muestras ALDEFLUOR-positivas y -negativas con los 413 genes/EST diferencialmente expresados. El agrupamiento jerárquico clasificó 15 de las 16 muestras (Fig. 2A).

Se sobrerregularon una cantidad de genes que se sabe que tienen incidencia en la biología de células madre en las poblaciones ALDEFLUOR-positivas (Tabla 1), incluyendo NFYA, NOTCH2, PCNX, RBM15, ST3GAL3 y TPRXL. Otros genes codifican proteínas que tienen un papel putativo o sin caracterizar en la función de células madre, como ARID1B, RAD51L1 y el receptor de quimiocina CXCR1/IL8RA (27). Los genes infraexpresados en la población ALDEFLUOR-positiva se encuentran implicados en la diferenciación celular, la apoptosis, corte y empalme de ARN y metabolismo mitocondrial.

Para aumentar la rigurosidad del análisis, el umbral del análisis de Mann y Whitney se elevó hasta el riesgo de 0.5 y se obtuvo una lista de 49 genes/EST que discriminaban poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas (genes con asterisco en las Tablas 1-2). Con esta lista, todas las células ALDEFLUOR-positivas, salvo las SK-BR-7, se agruparon. Entre estos 49 genes/ESTS, 45 correspondían a genes únicos identificados, solamente 3 de estos 45 se sobreexpresaron en el grupo ALDEFLUOR-positivo, mientras que 42 se infraexpresados. Los genes sobreexpresados caracterizados codifican una proteína con caja F FBX021 y CXCR1/IL8RA. Los genes infraexpresados incluyen aquellos que codifican proteínas mitocondriales (MRPL41, MRPL42, MRPL47, MRPL54, MRPS23, IMMP1L) y los factores de diferenciación (NACA) y pre-corte y empalme de ARNm (LSM3, factor de pre-procesamiento de ARNm PRPF39 y PRPF4B). La validación cruzada dejando un objeto afuera (LOOCV) con un riesgo de 0.5% estimó la exactitud de la predicción de la firma molecular identificadora y 88% de las muestras se predijeron en la clase correcta, con la particularidad de que esta "firma de células madre cancerosas" confirma el análisis supervisado.

La evaluación de RT-PCR cuantitativa confirmó un aumento significativo de CXCR1 y FBX021 en células ALDEFLUOR-positivas. Se realizó un análisis de RT-PCR cuantitativa de cinco genes discriminadores sobreexpresados en poblaciones ALDEFLUOR-positivas (CXCR1/IL8RA, FBX021, NFYA, NOTCH2 y RAD51L1). Se separaron tres líneas celulares utilizadas en el análisis para establecimiento de perfiles (BrCa-MZ-01, MDA- B-453, SUM159) y dos lineas celulares luminales (MCF7, S68) mediante ensayo de ALDEFLUOR y las poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas se procesaron por separado para el análisis de RT-PCR cuantitativa. Los niveles de expresión de RT-PCR cuantitativa de CXCR1 y FBX021 se presentan en la Fig. 2 B y C. Los niveles de expresión génica medidos por RT-PCR confirman los resultados obtenidos usando micromatrices de ADN con un aumento del nivel de ARNm de CXCR1 y FBX021 en la población ALDEFLUOR-positiva en comparación con la población ALDEFLUOR-negativa (p<0.05).

IL8 promueve la autorrenovación de células madre cancerosas. Los estudios que establecen perfiles sugieren que el receptor de IL8 CXCR1/IL8RA se expresó de forma coherente en la población celular ALDEFLUOR-positiva. Para confirmar esta asociación, la expresión de proteína de CXCR1/IL8RA se midió con citometría de flujo en poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas. Las poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas de cuatro líneas celulares diferentes se aislaron mediante FACS, se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo monoclonal CXCR1 marcado con ficoeritrina. Como se muestra en la Fig. 3A, las células ALDEFLUOR-positivas se vieron altamente enriquecidas en células CXCR1-positivas en comparación con la población ALDEFLUOR-negativa.

Para determinar si la señalización de IL8 es importante en la función de las células madre, se trataron cuatro BCL con IL8 recombinante humano para determinar su efecto en la población de células madre cancerosas según lo midió la formación de tumoresferas y la actividad enzimática de ALDH. Como se muestra en la Fig. 3B, la adición de IL8 aumentó la formación de tumoresferas primarias y secundarias en una forma dependiente de la dosis. Además, IL8 aumentó la población ALDEFLUOR-positiva en una forma dependiente de la dosis en cada una de las cuatro BCL analizadas (Fig. 3C). Esto ilustra el poder de la "firma de CSC" de identificar sendas que pueden tener incidencia en la función de células madre.

El eje IL8/CXCR1 está involucrado en la invasión de células madre cancerosas Se ha informado que el eje IL8/CXCR1 tiene incidencia en la invasión de células madre cancerosas (28, 29). Se utilizó un ensayo de invasión Matrigel, usando suero como atrayente, para examinar la capacidad de invasión de las poblaciones ALDEFLUOR-positivas y -negativas de tres líneas celulares diferentes (HCC1954, MDA-MB-453, SUM159). Como se muestra en la Fig. 4A, las células ALDEFLUOR-positivas demostraron una invasión 6 a 20 veces mayor a través de Matrigel que la población ALDEFLUOR-negativa (p<0.01). Cuando se utilizó como quimio-atrayente, IL8 (100 ng/ml) aumentó la invasión de las células ALDEFLUOR-positivas (p<0.05) (Fig. 4A). A diferencia de sus efectos sobre las células ALDEFLUOR-positivas, IL8 no tuvo ningún efecto sobre la capacidad invasiva de las células ALDEFLUOR-negativas. Estos resultados indican que las células madre cancerosas presentaron un comportamiento invasivo y, además, que IL8 facilita este proceso.

Las células ALDEFLUOR-positivas tienen mayor potencial metastásico. Se ha sugerido que los CSC tiene un papel crucial en la metástasis cancerosa (30, 31 ) . Los experimentos antedichos demostraron que las células ALDEFLUOR-positivas tienen una mayor capacidad invasiva en comparación con las células ALDEFLUOR-negativas. Para determinar la relación entre la positividad a ALDEFLUOR y la capacidad metastásica, se infectaron HCC1 954, MDA- M B-453 y SUM 159 con un sistema informante de luciferasa del lentivirus. Las células infectadas con luciferasa se separaron usando el ensayo de ALDEFLUOR y se introdujeron en ratones NOD/SCID mediante inyección intracardíaca. Se inyectó una suspensión de 100 ,000 células de cada población y la metástasis se evaluó mediante imagenología bioluminiscente. Los ratones inoculados con células ALDEFLUOR-positivas desarrollaron metástasis en sitios diferentes y mostraron una mayor emisión de flujo de fotones que los ratones inoculados con células sin separar, que no desarrollaron más de una metástasis por ratón o los ratones inoculados con células ALDEFLUOR-negativas, que desarrollaron solamente metástasis ocasionales limitadas a nodos linfáticos (Fig. 4B-J) . Los cortes histológicos confirmaron la presencia de metástasis en estos sitios (Fig . 4K-M). Por lo tanto, la capacidad metastásica de BCL está mediada predominantemente por CSC con la población ALDEFLUOR-positiva.

La hipótesis de que los tumores están organizados en una jerarquía celular conducida por CSC tiene implicaciones fundamentales para la biología del cáncer, así como i mplicaciones clínicas para la detección temprana, la prevención y el tratamiento del cáncer. La evidencia de CSC se ha apoyado mayormente en modelos de xenoinjerto de pasaje temprano y primario (32-34). No obstante, el éxito del establecimiento de xenoinjertos de tumor de mama ha sido bajo, en particular, para algunos subtipos moleculares. A diferencia de los tumores primarios, las líneas celulares se encuentran disponibles en cantidades ilimitadas y proporcionan solamente poblaciones carcinomatosas para el análisis molecular sin estroma y tejido normales. En el cáncer de mama, se han producido una gran cantidad de líneas celulares inmortalizadas que representan los diferentes subtipos moleculares encontrados en cánceres de mama humanos primarios (2, 20). No obstante, sigue habiendo una duda fundamental en cuanto a qué tan similarmente pueden recapitular estas líneas celulares la biología del cáncer de mama humano.

Evidencia in vivo de células madre en líneas celulares. Estudios recientes han sugerido que, si bien las líneas celulares se pueden derivar por clonación, estas contienen una jerarquía celular que representa las diferentes estapas de la diferenciación celular. Diversos estudios han utilizados marcadores como CD44+/CD24-para identificar CSC en líneas celulares de cáncer de mama. No obstante, su utilidad está limitada por la observación de que, frecuentemente, una gran porcentaje de células en una linea celular expresa estos marcadores de células madre putativos. Por ejemplo, más del 90% de las células en líneas celulares básales de cáncer de mama presentan el fenotipo CD44+/CD24-. De hecho, el fenotipo CD44+/CD24- no aisló la población tumorigénica de estas líneas celulares (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Un enfoque alternativo ha sido utilizar las SP de líneas celulares. No obstante, los estudios funcionales que utilizan tinción Hoechst están limitados por la toxicidad de este agente (35). También hay evidencia de que la actividad funcional de las células madre no está contenida en SP (36).

La actividad de ALDH evaluada por el ensayo de ALDEFLUOR aisla células con propiedades de células madre de diversos cánceres (14, 37). En este Ejemplo, se demostró que 23 de 33 BCL (predominantemente líneas celulares básales) contienen una población ALDEFLUOR-positiva. La falta de una población ALDEFLUOR-positiva en algunas BCL luminales puede indicar que estas BCL luminales se derivan de células progenitoras ALDEFLUOR-negativas.

Este Ejemplo utiliza ensayos ¡n vivo en ratones NOD/SCID para demostrar las propiedades de células madre de las poblaciones ALDEFLUOR-positivas. La autorrenovación de demostró mediante el pasaje en serie en ratones NOD/SCID y la diferenciación se demostró mediante la capacidad de células ALDEFLUOR-positivas y no ALDEFLUOR-negativas de regenerar la heterogeneidad celular del tumor inicial.

Una firma de célula madre de cáncer de mama. Usando ocho líneas celulares mamarias, este Ejemplo identificó 413 genes cuya expresión discrimina células ALDEFLUOR-positivas y -negativas. Esta firma contiene una cantidad de genes que se sabe que inciden en la biología de células madre. Los genes sobreexpresados en la población ALDEFLUOR-positiva incluyen el homólogo de Notch 2 (N0TCH2), que regula la autorrenovación y la diferenciación de células madre mamarias (18, 38), NFYA, que se sabe que regulan la autorrenovación y la diferenciación de células madre. (39, 40), el homólogo de pecanex PCNX, RBM15/OTT, que tiene una incidencia pleyotrópica en células madre hematopoyéticas (41) y afecta la diferenciación mieloide a través de la señalización de NOTCH (42), el factor tipo homeosecuencia TPRXL, implicado en el desarrollo embrionario, ST3GAL3, que codifica una sintasa de antfgeno específico del estado embrionario 4 embrionario, asociada con el desarrollo fetal y la carcinogénesis renal y gástrica (43). De manera notable, la proteína de antígeno específico del estado embrionario 4 (SSEA-4) se expresa en poblaciones de células madre como las células madre CXCR4+/CD133+/CD34+/lin- en sangre del cordón umbilical humano y células madre mamarias latentes (44).

Los genes infraexpresados en la población ALDEFLUOR-positiva se encuentran implicados en la diferenciación celular, la apoptosis y la oxidación mitocondrial. Incluyen genes que codifican la subunidad alfa del complejo asociado con polipéptidos activos NACA, las proteínas de muerte programada PDCD5 y PDCD10, la proteína ribosomal mitocondrial L41 (MRPL41), que induce la apoptosis de forma independiente y dependiente de P53 a través de BCL2 y caspasas y proteínas implicadas en los procesos mitocondriales como la fosforilación oxidativa (NDUFA2, ATP5J2, I MP1L) y la síntesis de proteínas en la mitocondria (MRPL42, MRPL47, MRPL54, MRPS23). La regulación por disminución de genes apoptóticos en CSC puede tener incidencia en la resistencia de estas células a la radiación y la quimioterapia (45, 46). No se identificó ALDH1A1 como un gen expresado diferencialmente en la firma ALDEFLUOR-positiva. No obstante, la examinación del perfil de expresión génica de BCL individuales reveló que si bien algunas mostraban expresión diferencial de ALDH1A1 en la población 5 ALDEFLUOR-positiva, otras mostraban expresión diferencial de ALDH1A3, una isoforma de ALDH diferente en esta población. Esto sugiere que la expresión de isoformas de ALDH diferentes podría contribuir con el fenotipo ALDEFLUOR-positivos.

De quimiocinas a "estemocinas". La expresión de CXCR1, un receptor de IL8, es mayor en una variedad de cánceres (47-50). Si o bien la expresión de IL8 está asociada con el cáncer de mama ER- negativo (51), no se ha expresado previamente que esta quimiocina tenga incidencia en la función de las células madre. Su implicaión en la regulación del crecimiento y la metástasis está bien establecida para el cáncer de próstata independiente del andrógeno (52).

L5 Además, el nivel de expresión de IL8 está asociado con la tumorigenicidad y la metástasis a través de la angiogénesis y la produción de VEGF (53, 54). Los datos de expresión génica se validaron en tres formas. Primero, el análisis de RT-PCR cuantitativa confirmó un aumento significativo de ARNm de CXCR1 en la 20 población ALDEFLUOR-positiva de líneas celulares incluidas y no incluidas en el análisis de establecimiento de perfiles. Segundo, usando citometría de flujo se demostró que las células que contenían-CXCR1 se encontraban exclusivamente en la población ALDEFLUOR-positiva. Tercero, la IL8 recombinante aumentó la 25 formación de mamoesferas y el porcentaje de céluals ALDEFLUOR- positivas en BCL. El eje IL8/CXCR1 por lo tanto parece regular la proliferación y la autorrenovación de células madre mamarias. Dado que las células endoteliales y estromales secretan IL8, esta quimiocina parece tener incidencia en la mediación de interacciones entre las células madre tumorales y el microambiente tumoral.

Estudios recientes han sugerido un papel para las interleucinas/quimiocinas en la regulación CSC (55, 56). Esto incluye un papel para IL6 en las CSC mamarias y para IL4 en la mediación de la quimioresistencia de CSC de colon (56-59). Estos factores pueden estar implicados en la asociación entre inflamación y cáncer. Esto también incluye un papel de CCL5 (RANTES), una quimiocina secretada por células madre mesenquimales, que actúa como un factor paracrino y potencia la motilidad, la invasión y la metástasis de células de cáncer de mama (55).

Las raíces de la metástasis. Las CSC pueden ser responsables de mediar la metástasis tumoral. Se sugirió en primer lugar un nexo entre las CSC y la metástasis con la identificación de genes de céluals madre en una firma de 11 genes generada usando un perfil comparativo de tumores metastásicos y primarios en un modelo de ratón transgénico de cáncer de próstata y pacientes con cáncer (60). Esta firma también era un predictor poderoso de la recurrencia de la enfermedad, la fuerte luego de la terapia y la metástasis distante en una variedad de tipos de cáncer. Este Ejemplo ha demostrado que las células ALDEFLUOR-positivas son más metastásicas que las células ALDEFLUOR-negativas y que IL8, que previamente se había indicado que incidía en la metástasis tumoral, promueve la invasión y la quimiotaxia de células madre cancerosas que expresan preferentemente el receptor de IL8 CXCR1. La capacidad de aislar células madre cancerosas metastásicas de líneas celulares debería facilitar los estudios de los mecanismos moleculares mediante los que las células madre cancerosas median la metástasis tumoral.

Ejemplo 2 Inhibición de CXCR1 y terapia de combinación Este ejemplo describe diversos métodos empleados para probar el efecto de la inhibición de CXCR1 en células tumorales, así como la combinación de la inhibición de CXCR1 con un agente anti-mitótico (docetaxel).

Efecto de la Inhibición de CXCR1 en el Crecimiento Celular y en 1 la Población ALDEFLUOR-positiva de la Línea Celular SUM159 La línea celular SUM159 se cultivó en condiciones adherentes y las células se trataron usando el inhibidor de CXCR1/CXCR2 Repertaxin o dos anticuerpos de bloqueo específicos para CXCR1 o CXCR2. Luego de 4 días de tratamiento, se analizó el efecto en el crecimiento celular usando el ensayo MTT (Figura 5A) y en la población de células madre cancerosas usando el ensayo de ALDEFLUOR (Figura 5B). Se observó más del 95% de inhibición del crecimiento celular en las células tratadas con Repertaxin o el anticuerpo bloqueante de CXCR1, mientras que no se observó efecto para las células tratadas con anticuerpo bloqueante de CXCR2 (Figura 5A). Se observó un efecto notablemente similar en la población ALDEFLUOR-positiva con una disminución del 80% y el 50% de la población ALDEFLUOR-positiva en las células tratadas con Repertaxin y anticuerpo bloqueante de CXCR1, respectivamente (Figura 5B).

El Tratamiento con Repertaxin Induce un Efecto Inespecífico Mediado por la Señalización del Ligando FAS/FAS Las células de la línea celular SUM159 se cultivaron en condiciones adherentes y luego se trataron con Repertaxin solo o en combinación con un antagonista FAS. De manera interesante, la inhibición del crecimiento celular mediante el tratamiento con Repertaxin se rescató parcialmente con la adición de un antagonista FAS (ligando anti/Fas de BD pharmingen (cat# 556371)). Adicionalmente, las células tratadas con agonista FAS mostraron una inhibición del crecimiento celular similar a las células tratadas con Repertaxin. Estos resultados sugieren que el tratamiento con Repertaxin induce un efecto inespecífico mediado por la señalización del ligando FAS/FAS.

Efecto del Tratamiento con Repertaxin en la Activación de FAK. AKT v FOXOA3 Para evaluar el efeto del tratamiento con Repertaxin en la señalización de CXCR1 corriente abajo, se cultivaron células SUM159 durante 2 días en condiciones adherentes en ausencia o presencia de 100 nM de Repertaxin y se tiñeron mediante inmunofluorescencia con anticuerpos contra p-FAK, p-AKT y FOXOA3. En las células sin tratar (Fig. 7A), se detectó que el 30% de las células que expresaban p-FAK y el 10% de las células que expresaban p-AKT mostraron inactivación, mientras que las células tratadas con Repertaxin mostraron una inactivación completa de p-FAK y p-AKT (Fig. 7B). Las células SUM159 sin tratar presentaron un 80% de células positivas en el citoplasma para FOXOA3. De manera interesante, las células SUM159 tratadas con Repertaxin presentaron un 80% de células positivas en el núcleo para FOXOA3. El cambio en la ubicación celular de FOXOA3 del citoplasma al núcleo indica una activación de la proteína FOXOA3.

Curvas de Crecimiento Tumoral Luego del Tratamiento con Repertaxin. Docetaxel o la Combinación Se evaluó el efecto del Repertaxin, docetaxel o la combinación de los mismos usando una línea celular de cáncer de mama (8A, SUM159) y tres xenoinjertos de cáncer de mama humano generados a partir de distintos pacientes (8B, MC1 ; 8C, UM2; y 8D, UM3). En cada muestra se inyectaron 50,000 células en el panículo adiposo mamario de ratones NOD/SCID y se controló el tamaño del tumor. Las inyecciones se comenzaron cuando el tamaño del tumor era de alrededor de 4 mm, se inyectó Repertaxin (15mg/Kg) dos veces al día durante 28 días o una vez por semana, se inyectó docetaxel I.P. (10mg/Kg) o se utilizó la combinación (Repertaxin/Docetaxel). La Figura 8 muestra los tamaños de tumor antes y durante el transcurso de cada tratamiento indicado (flecha, comienzo del tratamiento). Se observaron resultados similares para cada muestra (SUM159, C1, U 2, U 3) con una reducción estadísticamente importante del tamaño del tumor cuando se trata solamente con Docetaxel o la combinación de Repertaxin/Docetaxel, en comparación con la referencia (p<0.01), mientras no se observó una diferencia considerable entre el crecimiento de los tumores de referencia y los tumores tratados con Repertaxin.

Efecto del tratamiento con Repertaxin. docetaxel o la combinación sobre la población de células madre cancerosas según se evaluó por medio del ensayo de ALDEFLUOR Se evaluó la actividad de ALDH mediante el ensayo de ALDEFLUOR para analizar el tamaño de las poblaciones de células madre cancerosas en cada tumor (9A. SUM159, 9B. C1, 9C. UM2, 9D. UM3) tratadas con Repertaxin, docetaxel o la combinación. Se observaron resultados similares en cada muestra. Los xenoinjertos de tumor tratados con docetaxel mostraron porcentajes similares o mayores de células ALDEFLUOR-positivas en comparación con las de referencia, mientras que el tratamiento con Repertaxin solo o en combinación con docetaxel produjo una reducción estadísticamente importante en células ALDEFLUOR-positivas con un 65% a un 85% menos de células madre cancerosas en comparación con las de referencia (p<0.01).

Efecto del tratamiento con Repertaxin. docetaxel o la combinación sobre la población de células madre cancerosas según se evaluó por medio de Implante en ratones secundarios Se implantaron diluciones en serie de células obtenidas de tumores primarios (10A, SUM159, 10B. MC1, 10C. UM2, 10D. UM3) sin tratar (referencia) y tratadas con Repertaxin, docetaxel o la combinación en el panículo adiposo de ratones NOD-SCID secundarios. Los tumores primarios tratados con docetaxel y de referecia formaron tumores secundarios con todas las diluciones, mientras que solamente las concentraciones más elevadas de tumores primarios tratados con Repertaxin o en combinación con docetaxel pudieron formar tumores secundarios retardados que fueron significativamente más pequeños que los tumores tratados con docetaxel o de referencia (p<0.01). Adicionalmente, 1000 y 100 células primarias tratadas con la combinación no puedieron formar tumores secundarios en 3 de 4 muestras (SUM159, U 2, UM3). 5 El tratamiento con Repertaxin reduce el potencial metastásico de la línea celular SUM159 Se infectó una línea celular SUM159 con un lentivirus que expresaba luciferasa y se inocularon 250,000 células infectadas con luciferasa en el corazón de ratones NOD/SCID. Los ratones se organizaron en dos grupos. Los dos grupos de ratones se trataron 12 horas luego de la inyección intracardíaca con inyección s.c. de solución salina o inyección s.c. de Repertaxin (15mg/kg), dos veces al día durante 28 días. La formación de metástasis se controló usando imagenología por bioluminiscencia ( 11 B : Ratones tratados con solución salina; 11C: Ratones tratados con Repertaxin). La L5 cuantificación del fujo de fotones normalizado medido en rangos semanales luego de la inoculación reveló un aumento estadísticamente importante de formación de metástasis en el grupo de ratones tratados con solución salina en comparación con el grupo de ratones tratados con Repertaxin (11 A). 70 Ejemplo 3 Tratamiento de Células Madre Cancerosas Mediante el Bloqueo de CXCR1 Este ejemplo demuestra el efecto de la inhibición de CXCR1 en células tumorales, a través de ensayos in vitro y de modelos de 25 ratón.

Disociación de tejido mamario. Se cortaron 100-200 g de tejido mamario normal de mamoplastias reductivas con bisturí, se disociaron enzimáticamente y las células individuales se cultivaron en suspensión para generar mamoesferas o en un sustrato de colágeno en condiciones adherentes para inducir la diferenciación celular (Dontu et al. Genes Dev. 17:1253-1270., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia).

Cultivo celular. Las líneas celulares de cáncer de mama se cultivaron usando las condiciones de cultivo recomendadas (Charafe-Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Las líneas celulares de cáncer de mama se trataron en condiciones adherentes con repertaxin (Sigma-Aldrich), anticuerpo monoclonal de ratón CXCR1 anti-humano (Clone 42705, R&D systems), anticuerpo monoclonal de ratón CXCR2 anti-humano (clon 48311, R&D systems), anticuerpo monoclonal de ratón CD95 anti-humano (Clon DX2, BD Pharmingen) utilizado como un agonista de señalización de FAS, anticuerpo monoclonal de ratón Ligando-FAS anti-humano (Clon NOK-1, BD pharmingen) utilizado como un antagonista de señalización de FAS o con docetaxel (Taxotere, Sanofi-Aventis).

Viabilidad celular. Para los ensayos con MTT, las células se colocaron en placas en condiciones adherentes en placas de 96 pocilios a 5,000 células por pocilio. Luego de un día, se comenzó el tratamiento con repertaxin. Se estimó el efecto del tratamiento con repertaxin en la viabilidad celular en diferentes momentos mediante la adición de 20 pl de solución de MTT (5 mg/mL en PBS) en cada pocilio. Las células luego se incubaron durante 1 hora a 37 eC, seguido por la adición de 50 µ? de DMSO a cada pocilio. Se midió la absorbancia a 560 nm en un lector de placa de fluorescencia (Spectrafluor, Tecan). Para los ensayos TUNEL, las células se colocaron en placas en condiciones adherentes en placas de 6 pocilios a 50,000 células por pocilio. Luego de un día, se comenzó el tratamiento con repertaxin. La cantidad de células apoptóticas se estimó luego de cuatro días de tratamiento. Las células se fijaron en 3.7% de formaldehído y se tiñeron usando el kit de TdT TACS (R&D systems). Los núcleos se contratiñeron con DAPI/montante de fluorescencia (Invitrogen). Los cortes se examinaron con un microscopio de fluorescencia (Leica, Bannockborn, IL, EUA) con células apoptóticas detectadas en verde.

Ensayo de ALDEFLUOR. El kit de ALDEFLUOR (StemCell technologies) se utilizó para aislar la población con actividad enzimática de ALDH elevada usando un FACStarPLUS (Becton Dickinson) como se describió previamente (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Para eliminar las células de origen de ratón de los tumores xenotransplantados, se tiñó la población celular con un anticuerpo anti-H2Kd (BD biosciences, 1/200, 20 min en hielo) seguido por tinción con un anticuerpo secundario marcado con ficoeritrina (PE) (Jackson labs, 1/250, 20 min en hielo).

Ensayo de ELISA. Para medir el nivel de ligando-FAS soluble secretado en el medio de cultivo de células tratadas o no con repertaxin, se utilizó Elisa con ligando sFAS humano (Bender Medsystems). Las absorbancia se leyó en un espectro-fotómetro usando 450 nm como la longitud de onda principal.

Transferencia Western. Las células se Usaron en un tampón laemmli y se cargaron en geles de SDS-poliacrilamida. Las bandas se Incubaron con los anticuerpos primarios respectivos diluidos en TBST (con 0.1% de Tween20 y 2% de BSA) durante la noche a 40 o 2 horas a temperatura ambiente. Las bandas se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios adecuados (GE Healthcare, RU) y se detectaron usando el sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Pierce).

Inmunotinción. Para la tinción inmunofluorescente, las células CXCR1-positivas separadas se fijaron con 95% de metanol a -20°C durante 10 minutos. Las células de rehidrataron en PBS y se incubaron con anticuerpos respectivos a temperatura ambiente durante 1 hora. Los anticuerpos primarios utilizados fueron P-FAK (1:50, Cell Signaling Technology), P-AKT (1:300, Cell Signaling Technology) y FOX03A (1:250, Cell Signaling Technology). Los portaobjetos luego se lavaron y se incubaron durante 30 minutos con anticuerpos secundarios conjugados con PE (Jackson labs). Los núcleos se contratiñeron con DAPI/montante de fluorescencia (Invitrogen) y se cubrieron. Los cortes se examinaron con un microscopio de fluorescencia (Leica, Bannockborn, IL, EUA). La inmunohistoquímica de la detección de la expresión de ALDH1 (1:100, BD biosciences), P-FAK, P-AKT, FOX03a se realizó en corte de parafina (Ginestier et al. Am. J Pathol. 161:1223-1233., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). La tinción se realizó utilizando el kit Histostainplus (Zymed laboratories). Se utilizó diaminobenzidina (DAB) o 3-amino-9- etilcarbazol (AEC) como cromógeno y los cortes se contratiñeron con hematoxilina.

Modelo animal. Se evaluó la tomorigenicidad de células SU 159 ALDEFLUOR-positivas/CXCR1-positivas y ALDEFLUOR-positivas/CXCR1-negativas en ratones NOD/SCID (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Se utilizaron la línea celular SUM159 y tres xenoinjertos de cáncer de mama humano primario generados a partir de tres pacientes diferentes (MC1, UM2, UM3) para determinar la eficacia del tratamiento con repertaxin en el crecimiento tumoral (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Las células de estos tumores se transplantaron ortotópicamente en el panículo adiposo depurado humanizado de ratones NOD/SCID, sin cultivación in vitro. Los padículos adiposis se prepararon como se describió previamente (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Se inyectaron 50,000 células de cada xenotransplante en el padículo adiposo humanizado de ratones NOD/SCID y se controló el crecimiento tumoral. Cuando el tamaño del tumor alcanzaba aproximadamente 4mm, se inició el tratamiento con repertaxin solo (s.c, 15mg/Kg, dos veces al día durante 28 días), docetaxel solo (i.p., 10mg/Kg, una vez por semana durante 4 semanas), en combinación (repertaxin/docetaxel) o un grupo de referencia inyectado con solución salina (i.p., una vez por semana y s.c. dos veces al día durante 28 días). Los animales se sometieron a eutanasia cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 1.5 cm en el diámetro de mayor longitud, para evitar la necrosis tumoral y de acuerdo con las reglamentaciones para el uso de animales vertebrados en investigaciones. Se inyectó una porción de cada panículo adiposo se fijó en formalina y se empapó en parafina para el análisis histológico. El resto de las células tumorales se re-implantaron en ratones NOD/SCID secundarios. Se utilizaron diluciones en serie de células para el re-implante con inyección de 10,000, 1,000 y 100 células para cada tumor tratado.

Cultivo independiente de la fijación. Las BCL tratadas en condiciones adherentes con repertaxin (100nM), anticuerpo anti-CXCR1 (10pg/ml) o anti-CXCR2 (10pg/ml) se disociaron y se colocaron en placas como células únicas en placas de unión ultra-baja (Corning, Acton, MA) a una densidad baja (5,000 células viables/ml). Las células se cultivaron como se describió previamente (Charafe-Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Los cultivos posteriores luego de la disociación de tumoresferas principales se colocaron en placas de unión ultra-baja a una densidad de 5,000 células viables/ml. La capacidad de las células de formar tumoresferas se cuantificó luego del primer (tumoresferas principales) y el segundo (tumoresferas secundarias) pasaje.

Extracción de ARN y qRT-PCR. Luego de tratar las células SUM159, se aisló el ARN total usando un mini kit RNeasy (QIAGEN) y se utilizó para los ensayos de RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) en un sistema de detección de secuencia 7900HT ABI PRISM®. Los cebadores y las sondas para el sistema Taqman se seleccionaron del sitio web de Applied Biosystems (www punto appliedbiosystems punto com) (ID del ensayo Ligando-FAS: Hs_00899442_mi; ID del ensayo de IL8: Hs00174103_mi, ID del ensayo de TBP: Hs_00427620_mi). Se computó el nivel relativo de ARNm de expresión de Ligando-FAS e IL8 con relación al gen TBP estándar interno para normalizar las variaciones en la calidad del ARN y la cantidad de ADNc de entrada, como se describión previamente (Ginestier et al. Clin. Cáncer Res. 12:4533-4544., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia).

Análisis de citometría de flujo. Se realizó tinción con CD44/CD24/Lin (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Se relizaron tinciones con CD95/FAS usando un APC marcado anti-CD95 (1:20, BD biosciences). Para la tinción de CXCR1 y CXCR2, los anticuerpos primarios anti-CXCR1 (1:100, Clon 42705, R&D systems) y anti-CXCR2 (1:100, clon 48311, R&D systems) fueron seguidos por una tinción con un anticuerpo secundario anti-ratón marcado con PE (dilución 1:250, Jackson Labs). Las células frescas se tiñeron con pg/ml de Pl (Sigma) durante 5 min para observar la viabilidad.

Infección viral. Se produjeron dos construcciones lentivirales diferentes para la expresión del gen de Luciferasa (Lenti-LUC-VSVG) (Charafe-Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia) y para la expresión de PTEN de inhibición (Lenti-PTEN-SiR A-DsRed) (Korkaya et al. PLoS Biolog. 7:e1000121., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Todas las construciones lentivirales las preparó el University of Michigan Vector. También se utilizó una construción adenoviral para la sobreexpresión de FAK (Ad-FAK-GFP) (Luo et al. Cáncer Res. 69:466-474., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). La infeción celular con diferentes vectores se realizó como se describió anteriormente (Charafe- Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). La eficacia de la infección se verificó midiendo el porcentaje de céluals que expresan DsRed o GFP.

Inoculación intracardíaca. Se sometieron a anestesia ratones NOD/SCID de seis semanas de edad con una mezcla de 2% de isofluorano/aire y se inyectaron en el ventrículo cardíaco izquierdo con 250,000 células en 100 µ? de PBS de Dulbecco estéril sin Ca2 + y Mg2+. Para cada una de las tres líneas celulares (HCC1954, MDA-MB-453 y SUM159) y para cada tratamiento (solución salina o repertaxin), se inyectaron seis animales. Doce horas después de las inyecciones intracardíacas, los ratones comenzaron a recibir dos inyeciones por día de repertaxin o solución salida para los de referencia.

Deteción de bioluminiscencia. La bioluminiscencia base se evaluó antes de la inoculación y cada semana posterior a las inoculaciones. Los procedimientos de deteción de bioluminiscencia se realizó como se describió anteriormente (Charafe-Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). El flujo de fotones normalizado representa la proporción de flujo de fotones detectados cada semana luego de las inoculaciones y el flujo de fotones detectado antes de la inoculación.

La expresión de CXCR1 subdivide las poblaciones de células madre cancerosas. La identificaión de sendas de señalización celular que regulan las células madre cancerosas (CSC) proporciona dianas terapéuticas potenciales en una población celular. Se identificó una firma de CSC mamarias basada en el establecimiento de perfiles de expresión génica que contenía diversos genes potencialmente implicados en sendas reguladoras de CSC mamarias (Charafe-Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., herein incorporated by reference in its entirety). Entre los genes sobreexpresados en la población de CSC mamarias, CXCR1, un receptor que une la quimiocina proinflamatoria IL-8/CXCL8, apareció como un cantidato prometedor, dado que la IL-8 recombinante estimuló la autorrenovación de las CSC mamarias (Charafe-Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., herein incorporated by reference in its entirety). Usando citometría de flujo, se midió la expresión de proteína de CXCR1 en la población de CSC mamarias como se evaluó mediante el ensayo de ALDEFLUOR en las líneas celulares de cáncer de mama humano HCC1954, MDA-MB-453 y SUM159. Las células con propiedades de células madre funcionales en xenoinyertos de ratones NOD/SCID se mantuvieron dentro de la población celular ALDEFLUOR-positiva (Charafe-Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., herein incorporated by reference in its entirety). La población ALDEFLUOR-positiva, que representa menos del 2% de la población total, se mantuvo casi exclusivamente dentro de la población ALDEFLUOR-positiva (Véase la FIG.12A y la Tabla 4)· TABLA 4 ALDEFLUOR CXCR1 CXCR1/ALDEFLUOR (%) (%) (%) Superposición Lineas celulares de cáncer de menta HCC1954 3.42 1.72 0.94 MDA-MB-453 ¿.22 0.8 0.5 SUM159 5.24 0.52 048 Xenoinjertos de cáncer de mama humanó Ct 12.3 1.81 1.32 UM2 8.4 123 0.88 UM3 9.7 0.84 0.76 También se evaluó la expresión de CXCR2. CXCR2 es un , receptor que también puede unir IL-8/CXL8, aunque con una menor afinidad en comparación con CXCR1. A diferencia de las células CXCR1-positivas, las células CXCR2-positivas se distribuyeron igualmente entre las poblaciones ALDEFLUOR-positivas y ALDEFLUOR-negativas (Véase la FIG. 12A). Para determinar la organización jerárquica de la población de células madre cancerosas de acuerdo con la expresión de CXCR1, las poblaciones ALDEFLUOR-positivas/CXCR1-positivas y ALDEFLUOR- positivas/CXCR1-negativas se separaron y se inyectaron en ratones NOD/SCID (Véase la FIG 13). Ambas poblaciones generaron tumores. La cinética del crecimiento tumoral se correlaciona con la latencia y el tamaño de la formación del tumor y la cantidad de células inyectadas. Tumores generados por la población de ALDEFLUOR positivo/CXCR1 positivo reconstituyó la heterogeneidad fenotípica del tumor inicial luego de pasajes seriados mientras que la población de ALDEFLUOR positivo/CXCR1 negativo produjo tumores que contienen solamente células de ALDEFLUOR pos¡tivo/CXCR1 negativo. Estos resultados sugieren que la jerarquía celular de las CSC está organizada de acuerdo con la expresión de CXCR1, no obstante ambas poblaciones celulares mostraron una capacidad tumorigénica similar.

El bloqueo de CXCR1 disminuye la población de células madre de cáncer de mama in vitro. Se trataron tres líneas celulares diferentes con repertaxin (100 nM), un inhibidor de CXCR1/2, para evaluar el efecto del bloqueo de CXCR1 en la población de CSC mamarias (Bertini et al. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 101:11791-11796., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). En SUM159, luego de tres días de tratamiento, se observó una reducción cinco veces mayor en la proporción de células ALDEFLUOR-positivas (Véase la FIG 12B). Se observó un efecto similar luego del tratamiento de células SUM159 con un anticuerpo bloqueante anti-CXCR1. Por el contrario, no se observó ningún efecto luego del tratamiento con un anticuerpo bloqueante anti-CXCR2, lo que sugiere que los efectos de repertaxin en la población ALDEFLUOR-positiva fueron mediados por CXCR1.

Los datos de los tumores de mama, así como las líneas celulares, demuestran que las células tipo madre cancerosas o las células que inician el cáncer también se pueden aislar y propagar como "tumoresferas" en cultivos de suspensión (Ponti et al. Cáncer Res. 65:5506-5511., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Luego de tres días de tratamiento con repertaxin o con el anticuerpo bloqueante anti-CXCR1 , cuando las cél ulas de separaron y se cultivaron en suspensión, se observó una disminución ocho veces mayor en la formación de tumoresferas primarias y secundarias en comparación con las de referencia. En cambio, el anticuerpo bloqueante anti-CXCR2 no tuvo efectos sobre la formación de tumoresferas (Véase la FI G. 14) .

De manera sorprendente, luego de cinco días de tratamiento con repertaxin , se observó una dismi nución masiva en la viabilidad de toda la población celular según se evaluó medi ante el ensayo de MTT, con solamente un 3% de las células aún viables (Véase la FIG. 12C). Se observaron resultados similares con el anticuerpo bloq ueante anti-CXCR 1 , pero no con el anticuerpo bloqueante anti-CXCR2, lo que indica que este efecto dependía del bloqueo de CXCR1 . Este efecto de repertaxin se demoró con la pérdida de viabilidad celular, con un inicio tres días posterior al tratamiento (Véase la FIG. 1 5A). El tratamiento con repertaxin indujo un efecto similar en la línea celular de cáncer de mama HCC 1954, mientras que no se observó ningún efecto en las células M DA- MB-453 que albergan una mutación PTEN (Hollestelle et al . Cáncer Res. 5: 1 95-201 . , que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia) (Véase la FIG . 14, 15B-C y 16).

Utilizando un ensayo TUNEL, las células SUM 1 59 se tiñeron l uego de 4 días de tratamiento con repertaxin y se observó una disminución masiva en la viabilidad celular, debida a la inducción de apoptosis con 36% de células apoptóticas detectadas luego del tratamiento con repertaxi n (Véase la FI G. 1 2D). Los resultados sugieren que el bloqueo de CXCR1 da como resultado una disminución de la población de CSC mamarias seguida por la inducción de apoptosis masiva en la población tumoral aparente restante.

El bloqueo de CXCR1 induce la muerte celular en células CXCR1 -negativas mediante un efecto inespecífico. La observación de que repertaxin o el anticuerpo bloqueante anti-CXCR1 indujeron la muerte celular masiva a pesar de que la población CXCR1 -positiva representaba menos del 2% de la población celular total sugirió que el bloqueo de CXCR1 en células CXCR1-positivas indujo la muerte de células CXCR1-negativas mediante un efecto inespecífico. Las poblaciones CXCR1-positivas y CXCR1-negativas separadas se trataron con repertaxin (Véase la FIG. 12E). Repertaxin disminuyó la viabilidad celular en la población CXCR1-positiva dentro de los tres días, mientras que no se observó efecto alguno en la población CXCR1-negativa. Repertaxin indujo la muerte celular masiva en células sin separar. El efecto de repertaxin en la viabilidad celular de las poblaciones CXCR1-positivas y sin separar dependía de la dosis (Véase la FIG. 12E). Los resultados son coherentes con el tratamiento con repertaxin que se dirige a la población CXCR1-positiva que, a su vez, induce la muerte de células CXCR1-negat¡vas a través de un efecto inespecífico.

Para determinar si este efecto estaba mediado por un factor soluble inducido por repertaxin, se recogió medio condicionado de la población CXCR1-positiva luego de tres días de tratamiento con repertaxin y este medio se dializó utilizando una membrana con una exclusión de 3.5 KDa para eliminar el repertaxin del medio manteniendo las moléculas mayores a 3.5 KDa. El medio condicionado dializado indujo una disminución masiva en la viabilidad celular tanto en poblaciones CXCR1-negativas como sin separar, pero no en la población CXCR1-positiva (Véase la FIG. 12F). Estos resultados demustran que el bloqueo de CXCR1 en la población CXCR1-positiva induce la muerte celular en la población CXCR1-negativa a través de un factor no dializable soluble. Si bien la población CXCR1-positiva es sensible al repertaxin, es resistente al factor de muerte dializable.

El efecto inespecífico inducido por el bloqueo de CXCR1 está mediado por la señalización de Ligando-FAS/FAS. La interacción Ligando-FAS/FAS se activa en diferentes estados fisiológicos como la involución de la glándula mamaria o en condiciones de lesión tisular, incluyendo las inducidas por la quimioterapia (Chhipa et al. J Cell Biochem. 101:68-79., Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia).

El nivel de Ligando-FAS soluble en el medio de células SU 159 tratadas con repertaxin usando un ensayo ELISA para evaluar el papel de la interacción FAL-ligando/FAS en la mediación del efecto inespecífico apoptótico inducido por el bloqueo de CXCR1. Se observó un aumento más de cinco veces mayor de Ligando-FAS soluble en el medio de células tratadas durante cuatro días con repertaxin, en comparación con células sin tratar (Véase la FIG. 17A). La regulación transcripcional de Ligando-FAS mediante el tratamiento con repertaxin midiendo el nivel de ARNm de ligando FAS se confirmó mediante RT-PCR (Véase la FIG. 17B). Se observó un aumento cuatro veces mayor del nivel de ARNm de ligando FAS en células tratadas con repertaxin en comparación con células sin tratar. Se observaron resultados similares luego del tratamiento con un agonista FAS que activa la señalización de FAS, lo que indica que Ligando-FAS es una diana de la señalización de FAS y genera un asa de retroalimentación. 100% de las células SUM159 expresaron la proteína FAS según lo determinó la citometría de flujo. El tratamiento de células SUM159 con el agonista FAS reprodujo el efecto de muerte observado con el tratamiento con repertaxin con una reducción masiva en la viabilidad celular (Véase la FIG. 17C). El efecto del tratamiento con repertaxin en la viabilidad celular se vio parcialmente invertido por un anticuerpo bloqueante anti-Ligando-FAS, con un 44% de las células aún viables luego del tratamiento con repertaxin y un anticuerpo anti-Ligando-FAS, en comparación con solamente un 3% con solo repertaxin (Véase la FIG. 17C). Los resultados sugieren que la muerte celular masiva inducida por repertaxin se debe a un efecto inespecífico mediado por la senda Ligando-FAS/FAS.

El tratamiento de células SUM159 con el agonista FAS dio como resultado un aumento diez veces mayor y tres veces mayor en el porcentaje de células CXCR1-positivas y ALDEFLUOR-positivas, respectivamente (Véase la FIG. 17D/E y 18). Los efectos de repertaxin en ambas poblaciones no se rescató medante anti-Ligando-FAS (Véase la FIG. 17D/E), lo que sugiere que la población ALDEFLUOR-posítiva que contiene la población CXCR1-positiva, mientras que es directamente sensible al bloqueo de CXCR1 que a su vez induce la producción de Ligando-FAS mediante estas células, es resitente a la señalizaicón pro-apoptótica de Ligando-FAS/FAS. Por el contrario, la población celular aparente ALDEFLUOR-negativa no expresa CXCR1 pero es sensible a la muerte celular mediada por Ligando-FAS.

La señalización de Ligando-FAS/FAS tiene un papel importante durante la involución de la glándula mamaria (Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Se examinó el efecto del bloqueo de CXCR1 en células epiteliales mamarias normales humanas obtenidas de mamoplastias reductivas. Como se observó en líneas celulares de cáncer de mama, las células mamarias normales CXCR1-positivas se mantuvieron casi exclusivamente dentro de la población ALDEFLUOR-positiva (Véase la FIG. 19A). Para determinar si la señalización de IL-8 es importante en la función madre/progenitora mamaria normal, las células epiteliales mamarias normales cultivadas en suspensión se trataron con IL-8 recombinante humana y se determinó su efecto en la población de CSC según se midió a través de la formación de mamoesferas (Dontu et al. Genes Dev. 17:1253-1270., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). La adición de IL8 aumentó la formación de mamoesferas primarias y secundarias en una forma dependiente de la dosis (Véase la FIG. 19B), lo que sugiere que el eje IL-8/CXCR1 puede estar implicado en la regulación de la proliferación o autorrenovación de células madre/progenitoras mamarias normales. El tratamiento con repertaxin o el agonista FAS no tuvo efecto sobre la viabilidad de las células epiteliales mamarias normales cultivadas en condiciones adherentes, aun cuando se usaron altas concentraciones de repertaxin (500n ) (Véase la FIG. 16A). No obstante, como se observó para las líneas celulares de cáncer de mama, se detectó un aumento de Ligando-FAS soluble en el medio de células epiteliales mamarias normales tratadas con repertaxin (Véase la FIG. 20B). Esta observación se puede explicar por la ausencia de expresión de FAS en las células epiteliales normales cultivadas en estas condiciones (Véase la FIG. 20C). Esto condice con los estudios que demuestran que la expresión de FAS en la glándula mamaria ocurre solamente durante el proceso de involución que sigue a la lactancia (Song et al. J Clin. Invest 106:1209-1220., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). A diferencia de su falta de efecto sobre la población aparente de células epiteliales mamarias normales, repertaxin disminuyó de forma significativa la formación de mamoesferas mediante estas células (Véase la FIG. 20C).

Estos resultados sugieren que el eje IL-8/CXCR1 tiene una incidencia importante en la regulación y la supervivencia de poblaciones de células madre/progenitoras epiteliales mamarias malignas y normales. La capacidad de afectar poblaciones celulares aparentes a través de un efecto inespecífico mediado por Ligando-FAS se puede relacionar con el nivel de expresión de FAS en estas células.

Los efectos de bloqueo de CXCR1 en las células madre cancerosas está mediado por la senda FAK/AKT/FOX03A. CXCR1 actúa a través de una senda de transducción de señal que implica la fosforilación de la cinasa de adhesión focal (FAK), que da como resultado la activación de AKT (Waugh et al. Clin. Cáncer Res. 14:6735-6741., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Para evaluar el impacto del bloqueo de CXCR1 en la activación de FAK y AKT, se midió el nivel de proteínas fosforiladas FAK y AKT mediante transferencia western para las tres líneas celulares diferentes. Para SUM159 y HCC1954, se detectó una disminución en la fosforilación de FAK Tyr397 y AKT Ser473 en células tratadas con repertaxin en comparación con células sin tratar, lo que sugiere que los efectos de repertaxin se pueden mediar a través de la senda FAK/AKT (Véase las FIGS. 21A y 22). La observación de que MDA- B453 es resistente al tratamiento con repertaxin se puede explicar mediante la presencia de una mutación de PTEN (919G>A) que activa la senda PI3K/AKT (Hollestelle et al. Mol. Cáncer Res. 5:195-201., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). No se detectó modificación alguna en la fosforilación de FAK Tyr397 y AKT Ser473 luego del tratamiento con repertaxin en la línea celular MDAMB453 (Véase la FIG 22). Para confirmar un papel funcional de la senda FAK/AKT en la mediación de los efectos del bloqueo CXCR1, se utilizaron dos construcciones virales, donde una inactiva la expresión de PTEN a través de ARÑsh de PTEN y la otra conduce a la sobreexpresión de FAK. PTEN, a través de su fosfatasa lipídica, antagoniza la señalización de PI3-K/AKT (Vivanco et al. Nat. Rev. Cáncer 2:489-501., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). La inactivación de PTEN dio como resultado la activación de AKT según lo demostró un aumento de la fosforilación de AKT Ser473 (Véase las FIGS. 21A y 22). La inactivación de PTEN bloqueó el efecto del tratamiento con repertaxin sobre la actividad de FAK y AKT. La sobreexpresión de FAK también bloqueó los efectos de repertaxin e indujo una activación de FAK y AKT medida por la expresión aumentada de la fosforilación de FAK Tyr397 y AKT Ser473. Estos resultados indican que los efectos del bloqueo de CXCR 1 se median a través de la señalización de FAK/AKT.

Utilizando tinción por i nmunofluorescencia en células CXCR 1 -positivas se confirmó que el tratamiento con repertaxi n da como resultado una disminución dramática de la expresión de fosfo-FAK y fosfo-AKT en comparaci ón con células si n tratar (Véase la FIG. 21 B) . AKT regula la actividad del factor de transcri pción forkhead FOX03A a través de un evento de fosforilación que da como resultado el secuestro de FOX03A citoplásmico (Bru net et al . Mol . Cell Biol. 21 : 952-965. , que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia) . Por el contrario, la forma no fosforilada de FOX03A transita hasta el núcleo, donde actúa como un factor de transcripción q ue regula la síntesis de Ligando-FAS (Jonsson et a! . Nat. Med . 1 1 :666-671 ) , que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia. Repertaxin induce la muerte celular a través de un efecto inespecífico mediado por Ligando-FAS; los efectos de repertaxin en esta senda de transdución de señal se examinaron medainte tinción por inmunofluorescencia. FOX03A estaba presente en una localización citoplásmica en células sin tratar, pero se trasladó hasta el núcleo tras el tratamiento con repertaxin (Véase la FI G 21 B) . Esto indica que el bloqueo de CXCR1 i nduce la actividad de FOX03A a través de la inhibición de la senda FAK/AKT. Las células con eliminación de PTEN o sobreexpresión de FAK presentan un nivel alto de expresión de fosfo-FAK y fosfo-Akt, lo cual se detectó mediante i nmunofluorescencia, tanto en cél ulas tratadas con repertaxin como sin tratar. El tratamiento con repertaxin no indujo activación de F0X03A en células con eliminación de PTEN o sobreexpresión de FAK, según se muestra en la ubicación citoplásmica de FOX03A (Véase la FIG. 21B).

Como consecuencia de la activación constitutiva de la senda FAK/AKT, las céluals con eliminación de PTEN o sobreexpresión de FAK presentaron resistencia al tratamiento con repertaxin. Las células con eliminación de PTEN o sobreexpresión de FAK no presentaron disminución alguna en la viabilidad celular con el tratamiento con repertaxin. Se ha sugerido que la señalización de AKT tiene una incidencia crítica en la biología de CSC (Véanse las FIGS. 21B y 22) (Dubrovska et al. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 106:268-273., Korkaya et al. PLoS Blolog. 7:e1000121., Yilmaz et al. Nature 441:475-482., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). La activación de la senda FAK/AKT bloqueó los efectos de repertaxin en las poblaciones de CSC, como lo muestra el mantenimiento de las poblaciones ALDEFLUOR-positivas luego del tratamiento con el inhibidor (Véase la FIG. 21B). Todos los resultados indican que el bloqueo de CXCR1 afecta directamente la senda FAK/AKT/ FOX O 3A. El tratamiento con repertaxin inhibe ia señalización de AKT, que es crucial para la actividad de las CSC y, posteriormente, induce un efecto inespecífico en las células tumorales aparentes mediadas por el Ligando-FAS generado por las CSC.

El tratamiento con repertaxin disminuye la población de células madre de cáncer de mama in vivo. La evidencia reciente sugiere que las CSC mamarias son relativamente resistentes a la quimioterapia y a la radiación y pueden contribuir al nuevo crecimiento tumoral luego de la terapia (Phillips et al. J Nati. Cáncer Inst. 98:1777-1785., Yu et al. Cell 131:1109-1123., Li et al. J Nati. Cáncer Inst. 100:672-679., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). El concepto de CSC sugiere que las mejoras considerables en el resultado clínico requerirán un direccionamiento eficaz de la población de CSC (Reya et al. Nature 414:105-11 ., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Se sintetizan y secretan diversos factores durante el proceso apoptótico cuando la quimioterapia se dirige a las células tumorales aparentes. Entre estos factores, Ligando-FAS amplifica los efectos de la quimioterapia mediando un efecto de muerte inespecífico (Chhipa et al. J Cell Biochem. 101:68-79, .que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). La quimioterapia también puede inducir la producción de IL-8 en células lesionadas. El agente quimioterapéutico comúnmente utilizado, docetaxel, indujo tanto ARNm de IL-8 como de Ligando-FAS en células SUM159 (Véase la FIG. 10a/B). También se detectó un aumento cuatro veces mayor del nivel de ARNm de IL-8 después del tratamiento con agonista FAS (Véase ta FIG. 10B). Se ha mostrado que IL-8 puede regular la población de CSC. Esto indica que la adición de repertaxin a la quimioterapia citotóxica puede bloquear este efecto y fijar como diana la población de células madre cancerosas.

Se usaron la línea celular SUM159 y tres xenoinjertos de cáncer de mama humano primario generados a partir de tres pacientes diferentes (MC1, UM2, UM3) para explorar la eficacia del tratamiento con repertaxin en el crecimiento tumoral. Las células de estos tumores se transplantaron ortotópicamente en el panículo adiposo depurado humanizado de ratones NOD/SCID, sin cultivación in vitro. Para cada uno de estos xenotransplantes, la población de CSC se mantuvo exclusivamente en la población ALDEFLUOR-positiva (Ginestier et al. Cell Stem Cell 1:555-567., Charafe-Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). En cada uno de los tumores, la población CXCR1-positiva se encontraba casi exclusivamente dentro de esta población ALDEFLUOR-positiva (Véase la Tabla 5) y se activa la senda PTEN/FAK/AKT (Véase la FIG.25).

Tabla 5 ALOEFLUOR CXCR1 CXCR1/ALDEFLUOR (%) (%) {%) Superposición Lineas celulares de cáncer de manta HCCI954 3.42 1.72 0.94 DA- B-453 4.22 0.8 0.5 SUM159 5.24 0.52 0.48 Xenoinjertos de cáncer de mama humano MCI 12.3 1.81 1.32 U 2 8.4 1.23 0.88 U 3 9.7 0.84 0.76 Se inyectaron 50,000 células de cada xenotransplante en el padículo adiposo humanizado de ratones NOD/SCID y se controló el crecimiento tumoral. Cuando el tamaño del tumor alcanzó aproximadamente 4 mm, se inició el tratamiento solo con repertaxin (15 mg/Kg, dos veces al día durante 28 días), docetaxel solo (10 mg/Kg, una vez por semana durante 4 semanas) o una combinación de ambos fármacos. El crecimiento tumoral se comparó con las referencias inyectadas con solución salina. Para cada xenotransplante, se observó una inhibición significativa de crecimiento tumoral inducido por el tratamiento con docetaxel o la combinación de repertaxin/docetaxel (Véanse las FIGS. 26A y 27). El tratamiento con repertaxin solo tuvo un impacto moderado en el crecimiento tumoral. Luego de cuatro semanas de tratamiento, se sacrificaron los animales y los tumores residuales se analizaron utilizando el ensayo de ALDEFLUOR. Los tumores residuales tratados con docetaxel solo contenían un porcentaje mayor o inalterado de células ALDEFLUOR-positivas en comparación con referencias sin tratar (Véanse las FIGS. 26B y 27). Por el contrario, el tratamiento con repertaxin solo o en combinación con docetaxel redujo la población ALDEFLUOR-positiva en más del 75% (Véanse las FIGS. 26B y 27). Los resultados se confirmaron mediante inmunohistoquímica de la expresión de ALDH1 en los diferentes xenotransplantes. Se detectó una disminución en células ALDH1-positivas en los tumores tratados con repertaxin, en comparación con los tumores sin tratar, mientras que el porcentaje de células ALDH1-positivo se vio inalterado o aumentado en los tumores tratados con docetaxel solo (Véase la FIG 26D).

Se evaluó la presencia de células CD44+/CD24" en estos tumores. Se ha mostrado anteriormente que los marcadores se expresan en células madre cancerosas (Al Hajj et al. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 100:3983-3988., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia) . Se midió la superposición entre el fenoti po CD44+/CD24- y la expresión de CX CR1 . Las cél ulas CXCR1 -positivas se encontraron presentes en la población celular CD44+/CD24- y la población celular que expresa CD24 o CD44-negativa (Véase la Tabla 6).

Tabla 6 CD247CD44- CXC 1 CD24-/CD44-/CXCR1* (%) (%) ( ) Superposición Xenoinjertos de cáncer de mama humano MC1 6.8 1.8 0.5 UM2 3.7 1.2 0.3 UM3 4.8 0.8 0.2 En tumores residuales tratados solo con docetaxel , se observó un porcentaje inalterado o aumentado de células CD44+/CD24", mientras que el tratamiento con repertaxin solo o en combinación con docetaxel dio como resultado una disminución de la población celular CD44+/CD24- (Véase l a FIG. 28) .

Un ensayo funcional in vivo que consiste en el re-implante de células de tumores tratados en ratones NOD/SCI D secundarios proporcionó una prueba directa que evalúa la capacidad de iniciación tumoral y autorrenovación de las CSC que permanecen l uego del tratamiento. Las células tumorales derivadas de animales tratados con docetaxel o de referencia mostraron un nuevo crecimiento tu moral similar con todas las diluciones en ratones NOD/SCI D secundarios. Por el contrario, el tratamiento con repertaxin con o sin docetaxel redujo el crecimiento tumoral en sujetos receptores secundarios (Véase la FIG. 26C). Cuando se inyectaron cantidad iguales de células, aquellas de animales tratados con repertaxin mostraron una disminución 2-5 veces mayor en el crecimiento tumoral en comparación con las células de animales tratados con docetaxel o de referencia (Véase la FIG. 26C). Para cada modelo de xenotransplante, 1000 o 100 células tumorales obtenidas de animales tratados con una combinación de repertaxin y docetaxel no pudieron formar ningún tumor secundario en ratones NOD/SCID (Véase la FIG. 26C, 27 y la Tabla 7). Estos estudios demostraron que el tratamiento con repertaxin se dirige específicamente a la población de CSC y la disminuye.

Tabla 7 Tumores/Inacciones cantidad de células inyectadas 10,00 0 5.000 2.500 1.000 500 250 100 Referencia 6/6 2/2 ... 8/8 — — 6/8 Repertaxin 4/4 2/2 2/2 4/8 1/3 0/2 0/9 Docetaxel 2/2 4/4 2/2 6/6 3/4 2/3 8/9 Repertaxln/Docetaxel 2/2 3/4 2/2 1/6 1/4 0/4 0/¾ El tratamiento con repertaxin inhibe la señalización de FAK/AKT y activa FOX03A in vivo. Se examinó la expresión de fosfo-FAK y fosfo-AKT mediante inmunohistoquímica en cada uno de los xenotransplantes luego del tratamiento. La expresión de fosfo-FAK membranoso se detectó en 50% de las cél ulas de los tumores de referencia y los tratados con docetaxel mientras que se eli mi nó la expresión de fosfo-FAK en los tumores tratados solamente con repertaxin o en combinación con docetaxel (Véase la FI G. 26D). Se observaron resultados si milares con la expresión de fosfo-AKT , donde el 70% de las células expresaban fosfo-AKT en los tumores sin tratar, 20% de las células fosfo-AKT-positivas en tu mores tratados con docetaxel y una inhibición completa de expresión de fosfo-AKT en los tumores tratados con repertaxi n solo o en combinaci ón con docetaxel (Véase la FI G . 26D) . Se detectó FOX03A nuclear en las células de los tumores tratados con docetaxel solo, repertaxin solo y la combinación de repertaxin/docetaxel. Estos datos i n vivo son coherentes con los datos in vitro y confirman que el tratamiento con repertaxin inhibe la señalización de FAK/AKT y activa FOX03A.

El tratamiento con repertaxin disminuye el desarrollo de metástasis sistémicas. Para determi nar si el repertaxi n disminuye la metástasis sistemática se infectaron líneas celulares de cáncer de mama HCC 1 954, MDA- M B-453 y SUM 1 59 con un sistema i nformante de lentivirus de luciferasa y se introdujeron las células en ratones NOD/SCI D mediante inyección intracardíaca. Se inyectó una suspensión de 250 , 000 células de cada línea celular y la formación de metástasis se controló una vez por semana mediante i magenolog ía biolu miniscente. Doce horas después de la i nyección i ntracardíaca, los ratones se trataron dos veces por día mediante i nyecci ón de repertaxin o sol ución salina para los de referencia. El tratamiento con repertaxi n en ratones inyectados con células HCC1954 y SUM159 disminuyó significativamente ia formación de metástasis con una menor emisión de flujo de fotones en los ratones tratados en comparación con los no tratados (Véase la FIG. 29A/B). Los cortes histológicos confirmaron la presencia de metástasis en diversos sitios en animales sin tratar (Véase la FIG. 29D). El tratamiento con repertaxin no tuvo efecto alguno sobre la formación de metástasis en ratones inyectados con células MDA-MB-453 (Véase la FIG. 29C). La emisión del flujo de fotones y la cantidad de animales que desarrollaron metástasis fueron similares tanto en el grupo tratado con repertaxin como en el sin tratar. Este resultado es coherente con los datos que describieron MDA-MB-453 como una línea celular resistente a repertaxin, debido a la presencia de una mutación de PTEN. Estos resultados indican que el bloqueo de CXCR1 con agentes como repertaxin también puede disminuir la metástasis mediada por la población de CSC (Charafe-Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., herein incorporated by reference in its entirety).

Los experimentos llevados a cabo durante la realización de modalidades de la presente invención indican que los subcomponentes celulares con propiedades de células madre conducen el crecimiento tumoral y la metástasis Visvader et al. Nat. Rev. Cáncer 8:755-768., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). En virtud de su resistencia relativa a modalidades terapéuticas actuales, estas células pueden contribuir a la resistencia al tratamiento y las recidivas (Reya et al. Nature 414:105-111., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). La presente invención proporciona un enfoque basado en el bloqueo del receptor de citocina CXCR1, que se expresa en las células madre cancerosas mamarias, para dirigirse eficazmente a la población de células madre cancerosas y para mejorar el resultado terapéutico. Los experimentos llevados a cabo durante la realización de modalidades de la presente invención en una cantidad de sistemas han demostrado que las redes de citocinas tienen una incidencia importante en la tumorigénesis. Existe evidencia de que muchas de estas citocinas pueden regular el comportamiento de células madre. IL-4 puede regular la autorrenovación de células madre cancerosas pancreáticas e II-6 puede regular las células madre cancerosas en el cáncer de mama y de colon (Todaro et al. Cell Stem Cell 1:389-402., Sansone et al. J Clin. Invest 117:3988-4002., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Previamente se ha demostrado el papel de IL-8 en la mediación de la invasión y la metástasis tumoral (Waugh & Wilson. Cáncer Res. 14:6735-6741., Inoue et al. Clin. Cáncer Res. 6:2104-2119., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Adicionalmente, IL-8 aumenta la autorrenovación de células madre neurales durante el sanado de heridas en el cerebro (Beech et al. J Neuroimmunol. 184:198-208., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Se ha descrito que las células madre cancerosas pulmonares expresan el receptor de quimiocina CXCR1 (Levina et al. PLoS. ONE. 3;e3077., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Los experimentos llevados a cabo durante la realización de modalidades de la presente invención demostraron que la población CXCR1-positiva está casi exclusivamente contenida en la población ALDEFLUOR-positiva en las líneas celulares de cáncer de mama y los xenoinjertos primarios, así como en las células mamarias normales. El receptor de quimiocina se sobreexpresa en poblaciones celulares de cáncer de mama ALDEFLUOR-positivas (Charafe-Jauffret et al. Cáncer Res. 69:1302-1313., herein incorporated by reference in its entirety). En cánceres de mama, se produce IL-8 en el microambiente tumoral mediante una cantidad de tipos celulares, incluyendo, células inflamatorias, células endoteliales vasculares, fibroblastos asociados con tumor y células madre mesenquimales (Waugh et al. Clin. Cáncer Res. 14:6735-6741., que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Las redes de citocinas median la interacción entre estos tipos celulares, por lo tanto, se puede fijar como diana las células madre cancerosas a través del bloqueo del receptor de IL-8 CXCR1.

Usando ensayos in vitro, se demostró que el bloqueo de CXCR1 reducía la población de células madre de cáncer de mama, pero no así el bloqueo de CXCR2 (un receptor de IL-8 alternativo). Esto fue seguido por la inducción de apoptosis en toda la población celular restante, que carece de expresión de CXCR1. Además de los anticuerpos bloqueantes de CXCR1, los experimentos llevados a cabo durante la realización de modalidades demuestran que repertaxin, un inhibidor de CXCR1/2, indujo efectos similares fijando como diana la población CXCR1-positiva. A diferencia de sus efectos directos sobre la población de células madre cancerosas que expresan CXCR1, repertaxin no tuvo efecto directo alguno en la población de células tumorales aparentes que carecen de expresión de CXCR1. Esto indica que el bloqueo de CXCR1 en células CXCR1- positivas indujo la muerte celular en células CXCR1-negativas mediante un efecto inespecífico. Los experimentos descritos en la presente demuestran que la senda Ligando-FAS/FAS es la mediadora de este efecto de muerte inespecífico. Este fenómeno explica la eficacia del tratamiento con repertaxin en la inducción de apoptosis masiva en toda la población celular, a pesar de que la población CXCR1-positiva representa menos del 1% de la población celular. El papel de Ligando-FAS se demostró mediante el bloqueo eficaz de la muerte inespecífica del anticuerpo anti-Ligando-FAS.

Los experimentos llevados a cabo durante la realización de modalidades de la presente invención indican que pueden ocurrir interacciones de citocinas similares en tumores expuestos a quimioterapia citotóxica. La quimioterapia puede inducir directamente la apoptosis celular en células tumorales diferenciadas e inducir la producción de Ligando-FAS mediante estas células es proceso de muerte que, a su vez, induce la apoptosis en células tumorales circundantes a través de un efecto inespecífico mediado por FAS. De manera concomitante con la produción de Ligando-FAS, estas células lesionadas también secretan mayores niveles de IL-8 en un proceso que se asemeja a la involución mamaria o el sanado de heridas. Como sucede en la glándula mamaria en involución, este IL-8 puede estimular las células madre cancerosas mamarias, así como protegerlas de la apoptosis. Esto puede contribuir con el aumento relativo en las células madre cancerosas observado luego de la quimioterapia en modelos preclínicos (4) y ensayos clínicos neo-adyuvantes (5). Los efectos de la quimioterapia en las sendas de apoptosis y autorrenovación en tumores se muestran en la Figura 30.

Para determinar si el bloqueo de CXCR1 podría dirigirse a cél ulas madre cancerosas mamarias in vivo, los efectos del agente citotóxico docetaxel se compararon con repertaxin en el compartimiento de células madre cancerosas y en el crecimiento tumoral en ratones NOD/SCI D Docetaxel es uno de los agentes qui mioterapéuticos más eficaces que se utiliza actualmente para tratar mujeres con cáncer de mama. Las poblaciones de cél ulas madre cancerosas se evaluaron mediante el ensayo de ALDEFLUOR y mediante transplantes en serie en ratones NOD/SCI D. Usando estos ensayos, se determi nó que el tratamiento con qui mioterapia sola dio como resultado ausencia de cambio o un aumento relativo en las poblaciones de células madre cancerosas. Por el contrario, el tratamiento con repertaxin solo o con qui mioterapia redujo de manera considerable la población de células madre cancerosas. A pesar de la dismi nución significativa en las poblaciones que inician el tumor, el uso de repertaxin solo no dio como resultado una reducción del tumor significativa. La combinación de repertaxin más quimioterapia dio como resultado u na dismi nución considerable en el ta maño del tumor, así como en la población de células mad re cancerosas . La combinación de estos agentes para fijar como diana tanto las cél ulas madre cancerosas como las poblaciones de células tu morales aparentes maximiza la eficacia de estos tratamientos.

Para aclarar el mecanismo de acción de repertaxin , se analizaron las sendas corriente abajo de CXCR1 . Se confirmó la interacción entre CXC R 1 , FAK y AKT El bloqueo de CXC R1 actúa específicamente a través de la activación de FAK y AKT Los experi mentos llevados a cabo durante la realización de modalidades de la presente invención indican que la activación de AKT regula la autorrenovación de cél ulas mad re mamarias malignas y normal es a través de la fosforilación de GSK3P, lo que da como resultado la activación de la senda WNT (Korkaya et al PLoS Biolog . 7;e10001 21 , que se i ncorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia) . Estos resultados indican por qué las células con i nactivación de PTEN son resistentes a repertaxin. Una función adicional de AKT es la regulación de la supervivencia celular a través de la fosforilación del factor de transcripción forkhead FOX03A. La fosforilación de FOX03A por medio de AKT da como resultado su secuestro citoplásmico. Por el contrario, se demostró que el bloqueo de CXCR1 conduce a una activación de AKT disminuida, lo que da como resultado la traslocación de FOX03A en el núcleo por lo que induce una cantidad de genes que incl uyen Lígando-FAS (Jonsson et al Nat. Med. 1 1 :666-671 . , que se i ncorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia) . El Ligando-FAS inducido a través del bloq ueo de CXCR 1 es, a su vez, responsable de los efectos de muerte i nespecíficos observados (Véase la F IG 30) .

Además de su papel en la señalización de CXCR1 , FAK media las interaciones de células con componentes de matriz extracel ular a través de receptores de integri na (Waug h et al Clin. Cáncer Res. 14:6735-6741 . , que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia) . La señalización de FAK tienen incidencia en la regulación de la autorrenovaci ón de cél ulas madre mamarias de ratón normales y malignas en modelos transgénicos (Luo et al Cáncer Res. 69:466-474. , que se incorpora a la presente en su total idad a modo de referencia) . La activación de FAK también promueve la supervivencia celular mediante el bloqueo de la apoptosis mediada por FADD y RI P (Kurenova et al Mol . Cell Biol . 24:4361 -4371 . , Xu et al. J Biol . Chem . 275 :30597-30604. , que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia) . Esto proporciona una explicación para la resistencia de la población de cél ulas madre cancerosas a la apoptosis inducida por FAS/Ligando-FAS.

Se ha demostrado que las células madre cancerosas mamarias tienen incidencia en la invasión y la metástasis tumoral (Croker et al J Cell Mol . Med. 2008, Charafe- Jauffret et al . Cáncer Res. 69: 1 302-1 31 3. , que se incorpora a la presente en su totalidad a modo de referencia). Se muestra en la presente que IL-8 y CXCR1 también tienen incidencia relevante en estos procesos. Los efectos del bloqueo de CXCR1 se analizaron usando repertaxin en la formación de metástasis experimental . Se demostró que el bloqueo de CXCR 1 disminuye el desarrollo de metástasis cuando se administra luego de inyección intracardíaca de células de cáncer de mama.

Los estudios clínicos que utilizan repertaxin han demostrado una falta de toxicidad . Las estrategias dirigidas a interferir con las asas que regulan la citocina como IL-8 y CXCR 1 representan métodos para dirigirse a células madre cancerosas mamarias.

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Todas las publicaciones y las patentes mencionadas en la memoria descriptiva que antecede se incorporan a la presente a modo de referencia. Diversas modificaciones y variaciones del método y sistema de la invención descritos serán aparentes para los expertos en la técnica si n desviarse del alcance y el espíritu de la invención. Si bien la invención se ha descrito en relación con modalidades preferidas específicas, se debe entender que la invención seg ún se reivindica no se debería limitar indebidamente a tales modalidades específicas. En efecto, se pretende q ue diversas modificaciones de los modos descritos para realizar la invención , obvias para los expertos en la técnica relevante, se encuentren dentro del alca nce de la presente i nvención.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Un método para detectar cél ulas madre de tu mores sólidos que comprende: detectar cél ulas madre de tu mores sólidos CXCR1 + o FBX021 + de una muestra de tejido tomada a partir de un tumor de un sujeto.

2. El método de la reivindicación 1 , donde dicha detección comprende poner en contacto dicha muestra de tejido con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

3. El método de la reivindicación 2, donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende Repertaxin.

4. El método de la reivindicación 2, donde dicho anticuerpo o frag mento de anticuerpo comprende una molécula de señal.

5. El método de la reivindicación 4, donde dicha molécula de señal comprende una molécula fluorescente o una enzima capaz de catalizar una reacción que produce color en presencia de un sustrato colorí métrico.

6. El método de la reivindicación 1 , donde no se ensaya ninguna otra proteína o ácido nucleico para determinar la presencia o ausencia de dichas células madre de tumores sólidos CXCR 1 + o FBX021 + .

7. El método de la reivindicación 1 , donde dicho tumor se selecciona del grupo que consiste en : un tumor de cáncer de próstata, un tumor cáncer de ovario, un tu mor de cáncer de mama, un melanoma, un tu mor de cáncer de pulmón no microcítico, un tumor de cáncer de pul món microcítico y un tumor de adenocarcinoma esofágico.

8. Una población aislada de cél ulas madre cancerosas que son: a) tumorigénicas y b) CXCR1 + o FBX021 +.

9. La población aislada de células madre cancerosas de la reivindicación 8 , donde dichas células madre cancerosas son cél ulas madre cancerosas seleccionadas del grupo que consiste en : cél ulas madre de cáncer de próstata, células madre de cáncer de ovario, células madre de cáncer de mama, células madre de cáncer de piel, células madre de cáncer de pulmón no microcítico, células mad re de cáncer de pulmón microcítico y células madre de adenocarci noma esofágico.

1 0. La población aislada de células madre cancerosas de la reivindicación 8, donde la población comprende al menos el 60% de las células madre cancerosas y menos del 40% de cél ulas tumorales no tumorigénicas.

1 1. La población aislada de células madre cancerosas de la reivindicación 8, donde las células madre cancerosas se enriquecen al menos dos veces en comparación con las células tumorales no tumorigénicas si n fraccionar.

12. La población aislada de células madre cancerosas de la reivindicación 8, donde las células madre cancerosas se enriquecen al menos cuatro veces en comparación con las células tumorales no tumorigénicas sin fraccionar.

1 3. Un método para tratar un sujeto que tiene un tumor, que comprende: admi nistrar un compuesto a dicho sujeto, donde dicho compuesto es un antagonista de CXCR1 o FBX021 o un antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1.

14. El método de la reivindicación 13, donde dicho compuesto es Repertaxin o un derivado de Repertaxin.

15. El método de la reivindicación 13, donde dicho antagonista de CXCR1 o FBX021 o el antagonista de la senda de señalización IL8-CXCR1 comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

16. El método de la reivindicación 13, donde dicho tumor comprende células madre cancerosas seleccionadas de un grupo que consiste en: células madre de cáncer de próstata, células madre de cáncer de ovario, células madre de cáncer de mama, células madre de cáncer de piel, células madre de cáncer de pulmón no microcítico, células madre de cáncer de pulmón microcítico y células madre de adenocarcinoma esofágico.