ES2924709T3 - Métodos de aislamiento de receptores de células T que tienen especificidad antigénica para una mutación específica de cáncer - Google Patents

Métodos de aislamiento de receptores de células T que tienen especificidad antigénica para una mutación específica de cáncer

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ES2924709T3 ES14796317T ES14796317T ES2924709T3 ES 2924709 T3 ES2924709 T3 ES 2924709T3 ES 14796317 T ES14796317 T ES 14796317T ES 14796317 T ES14796317 T ES 14796317T ES 2924709 T3 ES2924709 T3 ES 2924709T3
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Yong-Chen Lu
Paul E Robbins
Steven A Rosenberg
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Abstract

Se describen métodos para aislar un TCR que tiene especificidad antigénica para una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer, comprendiendo el método: identificar uno o más genes en el ácido nucleico de una célula cancerosa de un paciente, conteniendo cada gen un cáncer -mutación específica que codifica una secuencia de aminoácidos mutada; inducir APC autólogas del paciente para que presenten la secuencia de aminoácidos mutada; cocultivar células T autólogas del paciente con las APC autólogas que presentan la secuencia de aminoácidos mutada; seleccionar las células T autólogas; y aislar una secuencia de nucleótidos que codifica el TCR de las células T autólogas seleccionadas, donde el TCR tiene especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica del cáncer. También se describen métodos relacionados para preparar una población de células, poblaciones de células, TCR, composiciones farmacéuticas y métodos para tratar o prevenir el cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

D E S C R IP C IÓ N
M é to d o s de a is la m ie n to de re ce p to re s de cé lu la s T que tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para una m u ta c ión e sp e c ífica de c á n ce r
En el p re se n te d o cu m e n to se in co rp o ra p o r re fe re n c ia en su to ta lid a d un lis ta do de se cu e n c ia s de n u c le ó tid o s /a m in o á c id o s le g ib le s p o r o rd e n a d o r p re se n ta d o s im u ltá n e a m e n te con el p re se n te d o cu m e n to e id e n tif ica d o de la s ig u ie n te m a nera : un a rch ivo A S C II (T e x to ) de 29577 b ytes lla m a d o “718291 S T 25.T X T ” con fe ch a del 15 de se p tie m b re de 2014.
A n te c e d e n te s d e la in ve n c ió n
La te ra p ia a d o p tiva de cé lu las (A C T ) q ue usa cé lu la s que se han m o d ifica d o g e n é tic a m e n te para e xp re sa r un re ce p to r de cé lu la s T de a n tíg e n o a n tica n ce ríg e n o (T C R ) p uede p ro d u c ir re sp u e s ta s c lín ica s p o s itiva s en a lg u n o s p ac ie n te s con cáncer.
T ran et al., S c ie n ce 344 (2014 ), 641 -645 d e sc rib e in m u n o te ra p ia con tra el c á n c e r b asad a en cé lu la s T C D 4+ e sp e c ífica s de m u ta c ió n en un p ac ie n te con c á n ce r ep ite lia l.
No o bs ta n te , q ue da n o b s tá cu lo s para el uso e x ito so de cé lu la s m o d ifica d a s en cu a n to a T C R p ara el tra ta m ie n to g e n e ra liz a d o del c á n c e r y o tra s e n fe rm e d a d e s . P o r e je m p lo , los T C R q ue re con oce n e sp e c ífica m e n te a n tíge no s de c á n ce r p ueden s e r d ifíc ile s de id e n tif ic a r y /o a is la r de un p ac ien te . P o r co n s ig u ie n te , e x is te la n e ce s id a d de m é to d o s m e jo ra d o s p ara o b te n e r T C R re a c tivo s a cáncer, en d on de el c á n c e r se s e le cc io n a de un c á n c e r de co lon y un c á n c e r recta l.
B re v e s u m a rio d e la in ve n c ió n
La inve n c ió n p ro p o rc io n a un m é to do p ara p re p a ra r una p ob la c ió n de cé lu la s q ue e xp re sa n un TC R , o una p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, q ue tie n e e sp e c ific id a d a n tig é n ica para una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s c o d ifica d a p or una m u ta c ió n e sp e c ífica de cán ce r, c o m p re n d ie n d o el m é todo : id e n tif ic a r uno o m ás g en es en el á c id o n uc le ico de una cé lu la c a n ce ro sa de un p ac ien te , en el q ue el c á n ce r se s e le cc io n a de cá n ce r de co lon y c á n c e r recta l, co n te n ie n d o cada gen una m u ta c ión e sp e c ífica de c á n ce r que co d ifica una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados ; in d u c ir A P C a u tó lo g a s del p ac ien te para que p rese n te n la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s ; cu ltiv a r de m a n e ra co n ju n ta cé lu la s T a u tó lo g a s del p ac ie n te con las A P C a u tó lo g a s q ue p rese n ta n la se c u e n c ia de a m in o á c id o s m u tados ; s e le cc io n a r las cé lu la s T a u tó lo g a s q ue (a) se cu ltiva ro n de m a ne ra con ju n ta con las A P C a u tó lo g a s q ue p rese n ta n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s y (b ) tie n e n e sp e c ific id a d a n tigé n ica p o r la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s p re se n ta d a en el co n te x to de una m o lé cu la de M H C e xp re sa d a p o r el p ac ien te ; a is la r una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica el TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, de las cé lu la s T a u tó lo g a s se le cc io n a d a s , en el que el TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, tien e e sp e c ific id a d a n tig é n ica p ara la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a p or la m u ta c ió n e sp e c ífica de cán ce r; e in tro d u c ir la s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica el T C R a is lado , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en cé lu la s m o n o n u c le a re s de sa n g re p e rifé rica (P B M C ) p ara o b te n e r cé lu la s q ue e xp re sa n el TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o.
B rev e d e s c rip c ió n d e las d iv e rs a s v is ta s d e l/d e los d ib u jo (s )
La fig u ra 1A es un g rá fico que m u e s tra el n ú m e ro de p u n to s p o r 1 x 103 (1 e3 ) cé lu la s m e d id a s por e n sa yo de p un to s de in m u n o a b so rc ió n liga d a a e n z im a s (E L IS P O T ) de in te rfe ró n (IFN )-y d e sp u é s de un cu ltivo co n ju n to de 20 hora s de 3737 -T IL con O K T 3 o cé lu la s d e n d rítica s (D C ) tra n s fe c ta d a s con A R N de p ro te ín a ve rd e f lu o re sce n te (G FP ), o la co n s tru cc ió n de m in igé n en tá n d e m (T M G ) ind icad a . “> ” in d ica m ás de 500 p u n to s p o r 1 x 103 cé lu las . Las cé lu la s tra n s fe c ta d a s de fo rm a s im u la d a se tra ta ro n con re ac tivo de tra n s fe c c ió n so lo s in a d ic ión de á c ido nuc le ico .
La fig u ra 1B es un g rá fico que m u es tra el p o rce n ta je de C D 4 3737 -T IL que fu e ro n O X 40 d e sp u é s del cu ltivo c o n ju n to con O K T 3 o DC tra n s fe c ta d a s con A R N de G FP, T M G -1, o el gen de tip o s ilve s tre (w t) in d ica d o ALK, CD93, ERBB2IP, FCERIA, GRXCRl, KIF9, NAGS, NLRP2, o RAC3. Las cé lu la s tra n s fe c ta d a s de fo rm a s im u la d a se tra ta ro n con re ac tivo de tra n s fe cc ió n so lo s in a d ic ión de á c id o nuc le ico .
Las fig u ra s 2 A -2 C son g rá fico s q ue m u e s tra n el n ú m e ro de p un tos p o r 1 x 103 (1 e3 ) cé lu la s m e d id o s p o r el e nsayo E L IS P O T de IFN -y a las 20 hora s para 3737 -T IL (A), cé lu la s T D M F 5 (B), o cé lu la s T T 4 (C ) q ue se cu ltiva ro n de m a n e ra co n ju n ta con DC tra n s fe c ta d a s con cé lu la s TM G -1 (A ) o 624 -C IIT A (B ) y (C ) que se cu ltiva ro n de m anera c o n ju n ta p re v ia m e n te s in nada, o los a n ticu e rp o s de b lo q ue o de H L A in d ica d o s (co n tra M H C -I, M H C -II, H LA -D P , H LA -D Q , o H LA -D R ) (A -C ).
La fig u ra 2D es un g rá fico q ue m u e s tra el n ú m e ro de p un tos p o r 1 x 103 (1 e3 ) cé lu la s m e d id o s p o r el e nsayo E L IS P O T DE IFN -y a las 20 hora s para 3737 -T IL cu ltiva d a s de m a n e ra c o n ju n ta con cé lu la s B D Q -0301 /-0601 a u tó lo g a s (b a rra s g rises ) o cé lu la s B E B V a lo g é n ica s p a rc ia lm e n te e m p a re ja d a s en el locus H LA -D Q 05/0601 (b a rra s n eg ra s) o el locus H LA -D Q -0201 /0301 (b a rra s s in so m b re a r) a los que se ha a d m in is tra d o m e d ia n te p u lsos d u ra n te la n oche D M S O , A L K m u ta d o (m ut) o p é p tid o s la rgo s E r B b 2 IP 25 -A A m u tados . E T G H L E N G N K Y P N L E (S E Q ID NO: 53);
la fig u ra 2E es un g rá fico que m u e s tra el n úm e ro de p un tos p or 1 x 103 (1 e 3 ) cé lu la s m e d id o s p o r el e nsayo E L IS P O T DE IFN -y a las 20 hora s para 3737 -T IL cu ltiva d a s de m a n e ra co n ju n ta con cé lu la s B a u tó lo g a s a las que se han a d m in is tra d o m e d ia n te p u lsos d u ra n te la n oche el p é p tid o E R B B 2 IP 25 -A A m u ta do T S F L S IN S K E E T G H L E N G N K Y P N L E (S E Q ID NO: 73), o los p é p tid o s de E R B B 2 IP m u ta d o s tru n c a d o s in d ica d o s F L S IN S K E E T G H L E N G N K Y P N L E (S E Q ID NO: 30), S IN S K E E T G H L E N G N K Y P N L E (S E Q ID NO: 31), N S K E E T G H L E N G N K Y P N L E (S E Q ID NO: 32), K E E T G H L E N G N K Y P N L E (S E Q ID NO: 33), E T G H L E N G N K Y P N L E (S E Q ID NO: 53), T S F L S IN S K E E T G H L (S E Q ID NO: 34), T S F L S IN S K E E T G H L E N (S E Q ID NO: 35), T S F L S IN S K E E T G H L E N G N (S E Q ID NO: 36), T S F L S IN S K E E T G H L E N G N K Y (S E Q ID NO: 37), o T S F L S IN S K E E T G H L E N G N K Y P N (S E Q ID NO: 38).
La fig u ra 3A es un g rá fico que m u e s tra el p o rce n ta je de v a r io s c lo n o tip o s de T C R V p en 3737 -T IL , m e d id o por c ito m e tría de flu jo se le cc io n a d a en cé lu la s T C D 4 v iva s (so m b re a d a s ) o C D 8 (no so m b re a d a s ).
La fig u ra 3B es un g rá fico q ue m u e s tra los n ive les de IFN -y (p g /m l) d e te c ta d o s en m u e s tra s de su e ro del pac ien te 3737 m e d id a s en el n úm e ro in d ica d o de d ía s a n tes y d e sp u é s de la tra n s fe re n c ia a d o p tiva de cé lu la s de 3737 -T IL el d ía 0 (in d ica d o p o r la f le ch a ). Las ba rras de e rro r son el e rro r e s tá n d a r de la m e d ia (S E M ).
La fig u ra 3C es un g rá fico q ue m u es tra la m a sa tu m o ra l to ta l (c írcu lo s ) (m e d id a com o % del v a lo r de re fe ren c ia a n tes del tra ta m ie n to ) o la m asa tu m o ra l en el p u lm ón (tr iá n g u lo s ) o el h íg ad o (cu a d ra d o s ) en el n úm e ro in d ica d o de m e se s en re lac ió n con la tra n s fe re n c ia ce lu la r el d ía 0 ( in d ica d o p or la f lech a ).
La fig u ra 3D es un g rá fico q ue m u e s tra el p o rce n ta je de va r io s c lo n o tip o s de T C R V p en C D 4 V p 22 - O X 40 3737-T IL , seg ún lo m e d id o p o r c ito m e tría de flu jo .
Las fig u ra s 4 A y 4B son g rá fico s q ue m u es tra n la fre cu e n c ia de los d os c lo n o tip o s de T C R P -C D R 3 e sp e c ífico s de m u ta c ió n E R B B 2 IP V p22 (A ) y V p 5.2 (B ) en la sa n g re (c írcu lo s ) del p ac ie n te 3737 en d ive rso s tie m p o s a n tes y d e sp u é s de la tra n s fe re n c ia a d o p tiva de cé lu la s con 3737 -T IL , un tu m o r a n tes de la tra n s fe re n c ia c e lu la r (rom b o s), y d ive rso s tu m o re s d e sp u é s de la tra n s fe re n c ia ce lu la r (T u -1 -P o s t (cu a d ra d o s), T u -2 -P o s t ( ^ ) , y T u -3 -P o s t (▼)). Las b a rras so m b re a d a s ind ican la fre cu e n c ia de los d os c lo n o tip o s de T C R P -C D R 3 e sp e c ífico s de m u tac ión E R B B 2 IP V p 22 (A ) y V p5.2+ (B ) en las cé lu la s tra n s fe r id a s (3737 -T IL ). “X ” in d ica “ No d e te c ta d o ” .
La fig u ra 4C es un g rá fico que m u es tra la e xp re s ió n de ERBB2IP en re lac ión con ACTB en 3737 -T IL (cé lu la s T ) y d ive rso s tu m o re s a n tes (T u -P re ) y d e sp u é s (T u -1 -p os t, T u -2 -p o s t y T u -3 -p o s t) de tra n s fe re n c ia a d o p tiva de cé lu las .
La fig u ra 4D es un g rá fico q ue m u es tra la m a sa tu m o ra l to ta l (c írcu lo s ) (m e d id a com o % del v a lo r de re fe ren c ia p rev io al tra ta m ie n to ) o la m a sa tu m o ra l en el p u lm ón (tr iá n g u lo s ) o el h íg ad o (cu a d ra d o s) en el n úm ero in d ica d o de m e se s en re lac ió n con la tra n s fe re n c ia ce lu la r (in d ica d a por flech as).
La fig u ra 5 A es un e sq u e m a de un e je m p lo de co n s tru cc ió n de m in igé n en tá n d e m (T M G ), los cu a le s de p o lip é p tid o s c o d ifica d o s q ue co n tie n e n 6 re s id u o s de a m in o á c id o s m u ta d o s id e n tif ica d o s fla n q u e a d o s en sus e x tre m o s te rm in a le s N y C, 12 a m in o á c id o s en a m bo s lados. La se c u e n c ia K IF 2C m u ta d a es D S S L Q A R L F P G L T IK IQ R S N G L IH S (S E Q ID NO: 57).
La fig u ra 5B es un g rá fico que m u e s tra el n ive l de IFN -y (p g /m l) se c re ta d o p or cé lu la s T T IL 2359 cu ltiva d a s de m a n e ra co n ju n ta d u ra n te la n oche con m e la n o c ito s a u tó lo g o s o cé lu la s C O S -7 tra n s fe c ta d a s de m a ne ra con jun ta con H L A -A *0205 y la co n s tru cc ió n de T M G RJ-1 (e s tru c tu ra m o s tra d a en la fig u ra 9A), R J-2, R J-3, R J-4, R J-5, R J-6, R J-7, R J-8, R J-9, R J-10 , R J -11, R J-12 , o un v e c to r vac ío .
La fig u ra 5C es un g rá fico q ue m u es tra el n ivel de IF N -y (p g /m l) se c re ta d o p o r T IL 2359 cu ltiva d a s de m a nera c o n ju n ta con cé lu la s C O S -7 tra n s fe c ta d a s con H L A -A *0205 y una v a r ia n te RJ-1 en la q ue el gen in d ica d o “w t” en la ta b la se co n v irtió n u e va m e n te en la se cu e n c ia W T. La se cu e n c ia KIF2C W T es D S S L Q A R L F P G L A IK IQ R S N G L IH S (S E Q ID NO: 65).
La fig u ra 5D es un g rá fico q ue m u es tra el n ivel de IF N -y (p g /m l) se c re ta d o p o r T IL 2359 cu ltiva d a s de m a nera c o n ju n ta con cé lu la s C O S -7 tra n s fe c ta d a s con un v e c to r vac ío , KIF2C W T , o co n s tru cc ió n de A D N c de KIF2C m u ta do , ju n to con la co n s tru cc ió n de A D N c de H L A (que id e n tif ica cada b arra so m b re a d a de izq u ie rd a a derecha ): H LA -A *0101 (b a rra s s in so m b re a r), H LA -A *0201 (b a rra s g rises), o H L A -A *0205 (b a rra s negras).
La fig u ra 5E es un g rá fico q ue m u e s tra el n ive l de IF N -y (p g /m l) se c re ta d o p o r cé lu la s T T IL 2359 cu ltiva d a s de m a n e ra co n ju n ta d u ra n te la n oche con cé lu la s H E K 293 que e xp re sa n de m a ne ra e s ta b le H L A -A *0205 a las que se a d m in is tra ro n m e d ia n te p u lsos d ive rsa s c o n c e n tra c io n e s (| iM ) de K IF 2 C 10-19 W T (R L F P G L A IK I; S E Q ID NO: 58) (lín ea in fe rio r en el g rá fico ) o K IF 2 C 10-19 m u ta do (R L F P G L T IK I; S E Q ID NO: 59) (lín ea s u p e r io r en el g rá fico ).
La fig u ra 6 A es un g rá fico q ue m u e s tra el n ive l de IF N -y (p g /m l) se c re ta d o p o r cé lu la s T T IL 2591 cu ltiva d a s de m a n e ra co n ju n ta con m e la n o c ito s a u tó lo g o s o cé lu la s H E K 293 q ue e xp re sa n de m a ne ra e s ta b le H LA -C *0701 tra n s fe c ta d a s con un v e c to r v a c ío o una co n s tru cc ió n de T M G se le cc io n a d a del g rup o que co n s is te en DW -1 a D W -37.
La fig u ra 6 B es un e sq u e m a que m u e s tra la e s tru c tu ra de la co n s tru cc ió n de T M G D W -6. La se cu e n c ia de P O LA 2 m u ta d a es T IIE G T R S S G S H F V F V P S L R D V H H E (S E Q ID NO: 64).
La fig u ra 6C es un g rá fico q ue m u es tra el n ivel de IF N -y (p g /m l) se c re ta d o p o r T IL 2591 cu ltiva d a s de m a nera c o n ju n ta con cé lu la s C O S -7 tra n s fe c ta d a s con H LA -C *0701 y una v a r ia n te D W -6 en la que el gen in d ica d o “w t” en la ta b la se co n v irtió n u e va m e n te en la s e cu e n c ia W T . La s e cu e n c ia de POLA2 W T es T IIE G T R S S G S H L V F V P S L R D V H H E (S E Q ID NO: 66).
La fig u ra 6D es un g rá fico q ue m u es tra el n ivel de IF N - y (p g /m l) se c re ta d o p o r T IL 2591 cu ltiva d a s de m a ne ra co n ju n ta con cé lu la s C O S -7 tra n s fe c ta d a s con un v e c to r vac ío , POLA2 W T , o co n s tru cc ió n de A D N c de POLA2 m utado , ju n to con la co n s tru cc ió n de A D N c de H L A (q ue id e n tifica cada barra de izq u ie rd a a d e re ch a ): H LA -C *0401 (b a rra s s in so m b re a r), H LA -C *0701 (b a rra s g rises), o H L A -C *0702 (b a rra s negras).
La fig u ra 6 E es un g rá fico q ue m u e s tra el n ive l de IFN - y (p g /m l) se c re ta d o p o r cé lu la s T T IL 2591 cu ltiva d a s de m a ne ra co n ju n ta d u ra n te la n oche con cé lu la s H E K 293 q ue e xp re sa n de m a n e ra e s ta b le H LA -C *0701 a las que se a d m in is tra ro n m e d ia n te p u lsos d ive rsa s c o n c e n tra c io n e s (| iM ) de P O L A 2413-422 W T (T R S S G S H L V F ; S E Q ID NO: 67 ) (lín ea in fe rio r en el g rá fico ) o P O L A 2413-422 m u ta d o (t R s S G S H F V F ; S E Q ID NO: 68 ) (lín ea s u p e r io r en el g rá fico ).
Las fig u ra s 7 A -7 F son e xp lo ra c io n e s de to m o g ra fía c o m p u ta riza d a (T C ) de los p u lm o n e s del p ac ie n te 3737 to m a d a s a n tes (A -C ) de y se is m e se s d e sp u é s (D -F ) de la se g u n d a a d m in is tra c ió n de cé lu la s re a c tiva s a m u tac ión . Las fle c h a s se ñ a la n le s io n e s can ce ro sas .
D e s c rip c ió n d e ta lla d a d e la in ve n c ió n
La inve n c ió n p ro p o rc io n a un m é to do para p re p a ra r una p ob la c ió n a is la d a de cé lu la s T que e xp re sa n un re cep to r de cé lu la s T (T C R ), o una parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, q ue tie n e e sp e c ific id a d a n tig é n ica para una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a p o r una m u ta c ión e sp e c ífica de cá n ce r com o se d e fine en las re iv in d ica c io n e s . La inve n c ió n p ro p o rc io n a m u ch as v e n ta ja s . P o r e je m p lo , los m é to d o s de la in ve n c ió n pueden e va lu a r rá p id a m e n te un g ran n ú m e ro de m u ta c io n e s re s tr in g id a s p o r to d a s las m o lé cu la s de M H C del p ac ie n te al m ism o tie m p o , que p uede id e n tif ic a r el re p e rto rio co m p le to de las cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ió n del pac ien te . A d ic io n a lm e n te , d is tin g u ie n d o m u ta c io n e s de c á n ce r in m u n o g é n ica s de (a) m u ta c io n e s e sp e c ífica s de cá n ce r im p e rce p tib le s (q ue no co d ifica n una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s ) y (b ) m u ta c io n e s e sp e c ífica s de cán ce r q ue cod ifica n una se cu e n c ia de a m in o á c id o s no in m u n o g é n ica , los m é to d o s de la in ve n c ió n p ueden id e n tif ic a r una o m ás se cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta d o s e sp e c ífico s de c á n ce r q ue p ueden se le cc io n a rs e co m o d ia n a m e d ia n te un TC R , o una parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o. Los m é to do s de la inve n c ió n ta m b ié n p ueden e v ita r los se sg o s té c n ico s in h e re n te s a m é to do s tra d ic io n a le s de id e n tifica c ió n de a n tíg e n o s de c á n ce r ta le s com o, p o r e jem p lo , a q u e llo s que usan b ib lio te ca s de A D N c , y ta m b ié n pueden lle va r m e no s tie m p o y s e r m e no s la b o rio so s que eso s m é to do s . P or e je m p lo , los m é to d o s de la inve n c ió n p ueden s e le cc io n a r cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ió n s in cu ltiva r de m a ne ra co n ju n ta las cé lu la s T con lín e a s ce lu la re s tu m o ra le s , q ue p ue de n s e r d ifíc il de g en era r, p a rticu la rm e n te para , p o r e je m p lo , cá n ce re s e p ite lia le s . S in lim ita rse a una te o ría o m e ca n ism o p articu la r, se c ree que los m é to do s de la inve n c ió n p ueden id e n tif ic a r y a is la r TC R , o p artes de un ión a a n tíg e n o del m ism o, q ue se le cc io n a n com o o b je tivo la d e s tru cc ió n de cé lu la s ca n ce ro sa s m ie n tra s m in im iza n o e lim in a n la d e s tru cc ió n de cé lu la s no c a n ce ro sa s n o rm a le s , re d u c ie n d o o e lim in a n d o de e ste m o do la tox ic id a d .
El m é to d o co m p re n d e id e n tif ic a r uno o m ás g en es en el á c id o n u c le ico de una cé lu la ca n ce ro sa de un pac ien te , co n te n ie n d o cada gen una m u ta c ió n e sp e c ífica de c á n ce r q ue co d ifica una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados. La cé lu la ca n ce ro sa p uede o b te n e rse de cu a lq u ie r m u e s tra co rpo ra l d e riva d a de un pac ien te q ue co n tie n e o se e sp e ra q ue co n te n g a cé lu la s tu m o ra le s o ca n ce ro sa s . La m u e s tra co rpo ra l p ue de se r cu a lq u ie r m u e s tra de te jid o ta l com o san g re , una m u es tra de te jid o o b te n id a del tu m o r p rim a rio o de m e tá s ta s is tu m o ra le s , o cu a lq u ie r o tra m u e s tra q ue co n te n g a cé lu la s tu m o ra le s o ca n ce ro sa s . El á c id o n u c le ico de la cé lu la c a n ce ro sa p uede s e r A D N o A R N .
C on el fin de id e n tif ic a r m u ta c io n e s e sp e c ífica s de cán cer, el m é to d o p ue de c o m p re n d e r a d e m á s s e c u e n c ia r á c ido n u c le ico ta l com o A D N o A R N de cé lu la s no ca n ce ro sa s n o rm a le s y co m p a ra r la s e cu e n c ia de la cé lu la ca n ce ro sa con la se cu e n c ia de las cé lu la s no ca n ce ro sa s n o rm a le s . P ue d e o b te n e rse una cé lu la no ca n ce ro sa norm a l del p a c ie n te o de un in d iv id u o d ife ren te .
La m u ta c ión e sp e c ífica de c á n ce r p ue de s e r cu a lq u ie r m u ta c ión en cu a lq u ie r gen q ue co d ifica una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s (ta m b ié n d e n o m in a d a “ m u ta c ión no im p e rce p tib le ” ) y q ue se e xp re sa en una cé lu la ca n ce ro sa pero no en una cé lu la no ca n ce ro sa norm a l. E je m p lo s no lim ita n te s de m u ta c io n e s e sp e c ífica s de cá n ce r q ue p ueden id e n tif ica rse en los m é to d o s de la inve n c ió n in c lu ye n de se n tid o e rró ne o , s in sen tido , inse rc ión , d e le c ió n , d u p lica c ió n , d e sp la za m ie n to del m arco de lec tu ra , y m u ta c io n e s de e xp a n s ió n de re pe tic ió n . En una re a liza c ió n de la inve n c ió n , el m é to do co m p re n d e id e n tif ic a r al m e no s un gen q ue co n tie n e una m u ta c ió n e sp e c ífica de c á n c e r que co d ifica una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados . S in e m ba rg o , el n úm e ro de g en es que con tien en una m u ta c ión e sp e c ífica de c á n ce r de e ste tip o q ue p ue de id e n tif ica rse u sa nd o los m é to d o s de la inve n c ió n no se lim ita y p uede in c lu ir m ás de un gen (p o r e je m p lo , a p ro x im a d a m e n te 2, a p ro x im a d a m e n te 3, a p ro x im a d a m e n te 4, a p ro x im a d a m e n te 5, a p ro x im a d a m e n te 10, a p ro x im a d a m e n te 11, a p ro x im a d a m e n te 12, a p ro x im a d a m e n te 13, a p ro x im a d a m e n te 14, a p ro x im a d a m e n te 15, a p ro x im a d a m e n te 20, a p ro x im a d a m e n te 25, a p ro x im a d a m e n te 30, a p ro x im a d a m e n te 40, a p ro x im a d a m e n te 50, a p ro x im a d a m e n te 60, a p ro x im a d a m e n te 70, a p ro x im a d a m e n te 80, a p ro x im a d a m e n te 90, a p ro x im a d a m e n te 100, a p ro x im a d a m e n te 150, a p ro x im a d a m e n te 200 , a p ro x im a d a m e n te 400 , a p ro x im a d a m e n te 600, a p ro x im a d a m e n te 800, a p ro x im a d a m e n te 1000, a p ro x im a d a m e n te 1500, a p ro x im a d a m e n te 2000 o m ás, o un in te rva lo d e fin id o p or d os c u a lq u ie ra de los va lo re s a n te rio re s ). Del m ism o m odo, en una re a liza c ió n de la inve nc ión , el m é to do co m p re n d e id e n tif ic a r al m e no s una m u ta c ión e sp e c ífica de c á n c e r q ue co d ifica una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s . S in e m b a rg o , el n úm e ro de ta le s m u ta c io n e s e sp e c ífica s de c á n ce r q ue p ueden id e n tif ica rse u sa nd o los m é to d o s de la inve n c ió n no se lim ita y p ue de inc lu ir m á s de una m u ta c ió n e sp e c ífica de c á n ce r (p o r e je m p lo , a p ro x im a d a m e n te 2, a p ro x im a d a m e n te 3, a p ro x im a d a m e n te 4, a p ro x im a d a m e n te 5, a p ro x im a d a m e n te 10, a p ro x im a d a m e n te 11, a p ro x im a d a m e n te 12, a p ro x im a d a m e n te 13, a p ro x im a d a m e n te 14, a p ro x im a d a m e n te 15, a p ro x im a d a m e n te 20, a p ro x im a d a m e n te 25, a p ro x im a d a m e n te 30, a p ro x im a d a m e n te 40, a p ro x im a d a m e n te 50, a p ro x im a d a m e n te 60, a p ro x im a d a m e n te 70, a p ro x im a d a m e n te 80, a p ro x im a d a m e n te 90, a p ro x im a d a m e n te 100, a p ro x im a d a m e n te 150, a p ro x im a d a m e n te 200 , a p ro x im a d a m e n te 400, a p ro x im a d a m e n te 600 , a p ro x im a d a m e n te 800, a p ro x im a d a m e n te 1000, a p ro x im a d a m e n te 1500, a p ro x im a d a m e n te 2000 o m ás, o un in te rva lo d e fin id o p or d os c u a lq u ie ra de los va lo re s a n te rio re s ). En una re a liza c ió n en la que se id e n tifica m ás de una m u ta c ió n e sp e c ífica de cán cer, las m u ta c ion es e sp e c ífica s de c á n ce r p ue de n e s ta r u b ica d a s en el m ism o gen o en g en es d ife re n te s .
En una re a liza c ió n , id e n tif ic a r uno o m ás g e n e s en el á c id o n uc le ico de una cé lu la c a n ce ro sa co m p re n d e s e c u e n c ia r el e xo m a com p le to , el g e n o m a com p le to , o el tra n s c rip to m a co m p le to de la cé lu la can ce ro sa . La se cu e n c ia c ió n p uede lle va rse a cab o de cu a lq u ie r m a ne ra a d e cu a d a co n o c id a en la técn ica . E je m p lo s de té cn ica s de se cu e n c ia c ió n q ue p ueden s e r ú tiles en los m é to do s de la inve n c ió n in c lu ye n la se cu e n c ia c ió n de p róx im a g e n e ra c ió n (N G S ) (ta m b ié n d e n o m in a d a “te c n o lo g ía de se cu e n c ia c ió n m a s iva en p a ra le lo ” ) o la se cu e n c ia c ió n de te rce ra g e n e ra c ió n . La N G S se re fie re a te c n o lo g ía s de se cu e n c ia c ió n de A D N de a lto re n d im ie n to no b a sa d a s en S an g er. C on N G S, m illo n e s o m iles de m illo n e s de ca d e n a s de A D N p ue de n s e c u e n c ia rs e en p ara le lo , p ro d u c ie n d o s u s ta n c ia lm e n te m ás re n d im ie n to y m in im iza n d o la n eces id ad de los m é to d o s de c lo n a c ió n de fra g m e n to s que a m e n u d o se usan en la se cu e n c ia c ió n de S a n g e r de g en om a s. En N G S, m o lde s de á c id o n uc le ico p ueden lee rse a le a to ria m e n te en p a ra le lo a lo la rg o del g e n o m a co m p le to ro m p ie n d o el g e n o m a co m p le to en p artes pequeñas. La N G S puede , ve n ta jo sa m e n te , p ro p o rc io n a r in fo rm a c ió n de s e cu e n c ia de á c id o s n uc le ico s de un genom a, e xo m a, o tra n s c rip to m a co m p le to en p e río d o s de tie m p o m uy cortos , p o r e je m p lo , d en tro de a p ro x im a d a m e n te 1 a a p ro x im a d a m e n te 2 sem a n a s , p re fe rib le m e n te d e n tro de a p ro x im a d a m e n te 1 a a p ro x im a d a m e n te 7 d ías, o lo m á s p re fe rib le m e n te , en m e no s de a p ro x im a d a m e n te 24 horas. M ú ltip le s p la ta fo rm a s de N G S q ue están d isp o n ib le s co m e rc ia lm e n te o q ue se d e sc rib e n en la b ib lio g ra fía p ue de n usa rse en el co n te x to de los m é to do s de la inve nc ión , p o r e je m p lo , los d e sc rito s en Z h a n g et al., J. G enet. G e n om ics , 38(3 ): 95 -109 (2011 ) y V o e lke rd in g et al., C lin ica l C he m is try , 55: 641 -658 (2009 ).
E je m p lo s no lim ita n te s de te c n o lo g ía s y p la ta fo rm a s de N G S in c lu ye n se cu e n c ia c ió n p o r s ín te s is (ta m b ié n con oc id a com o “ p iro s e cu e n c ia c ió n ”) (co m o se im p le m e n ta , por e je m p lo , u sa n d o el s e c u e n c ia d o r g e n ó m ico G S -F L X 454, 454 de L ife S c ie n ce s (B ra n fo rd , C T), a n a liza d o r g e n ó m ico IL L U M IN A S O L E X A (Illu m in a Inc., S an D iego, CA), o el a n a liza d o r g e n ó m ico IL L U M IN A H IS E Q 2000 (Illu m in a ), o co m o se d e sc rib e en, p o r e je m p lo , el d o cu m e n to de R on ag h i et al., S c ien ce , 281 (5375 ): 363 -365 (1998 )), s e cu e n c ia c ió n p o r liga c ión (co m o se im p le m e n ta , por e jem p lo , u sa n d o la p la ta fo rm a S O L i D (L ife T e ch n o lo g ie s C orpo ra tio n , C a rlsb ad , C A ) o la p la ta fo rm a P O L O N A T O R G .007 (D o ve r S ystem s, S a lem , NH)), se cu e n c ia c ió n de m o lé cu la ú n ica (co m o se im p le m e n ta , p o r e je m p lo , u sa n d o el s is te m a Pa C B IO RS (P a c ific B io sc ie n ce s (M e n lo Park, C A ) o la p la ta fo rm a H e L IS C O P E (H e lico s B io sc ie n ce s (C a m b rid g e , M A)), n a n o te cn o lo g ía para la se cu e n c ia c ió n de m o lé cu la ún ica (co m o se im p le m e n ta , p o r e jem p lo , u sa n d o la p la ta fo rm a G R ID O N de O x fo rd N a n o p o re T e ch n o lo g ie s (O x fo rd , R e in o U n ido), las p la ta fo rm a s de se cu e n c ia c ió n de n a n o p o ro s a s is tid a por h ib rid ac ió n (H A N S ) d e sa rro lla d a s p or N a b sys (P ro v id e n ce , RI), y la p la ta fo rm a de se cu e n c ia c ió n de A D N b a sa d a en lig a sa con te c n o lo g ía de n a n o b o la de A D N (D N B ) d e n o m in a d a lig a c ió n de so n d a -a n c la je (cP A L )), te c n o lo g ía basad a en m ic ro sco p ía e le c tró n ica para se cu e n c ia c ió n de m o lé cu la ún ica , y se cu e n c ia c ió n de se m ic o n d u c to re s ión icos.
El m é to do co m p re n d e in d u c ir cé lu la s p re se n ta d o ra s de a n tíg e n o a u tó lo g a s (A P C ) del p ac ie n te para q ue p resen ten la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados . Las A P C p ueden in c lu ir cu a lq u ie r cé lu la que p re se n te fra g m e n to s p e p tíd ico s de p ro te ín a s en a so c ia c ió n con m o lé cu la s del co m p le jo m a yo r de h is to co m p a tib ilid a d (M H C ) en su su p e rfic ie ce lu la r. Las A P C p ueden inc lu ir, por e je m p lo , uno c u a lq u ie ra o m ás de los m a cró fa go s, las DC, cé lu las de L an ge rh an s, lin fo c ito s B y cé lu la s T. P re fe rib le m e n te , las A P C son DC. M e d ia n te el uso de A P C a u tó lo g a s del p ac ien te , los m é to d o s de la in ve n c ió n id e n tifica n los TC R , y p artes de un ión a a n tíg e n o del m ism o, que tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica p o r una s e c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a p or una m u ta c ió n e sp e c ífica de c á n c e r q ue se p re se n ta en el co n te x to de una m o lé cu la de M H C e xp re sa d a p o r el pac ien te . La m o lé cu la de M H C p ue de se r cu a lq u ie r m o lé cu la de M H C e xp re sa d a por el p ac ien te , in c lu ye n d o , p e ro s in lim ita rse a, m o lé cu la s de M H C de c lase I, M H C de c lase II, H LA -A , H LA -B , H LA-C , H LA -D M , H LA -D O , H LA -D P , H LA -D Q , y H LA -D R . Los m é to d o s de la in ve n c ió n id e n tifica n se cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta d o s p re se n ta d a s en el co n te x to de c u a lq u ie r m o lé cu la de M H C e xp re sa d a p or el p a c ie n te s in usar, p o r e je m p lo , a lg o ritm o s de p red icc ió n de e p íto p o s para id e n tif ic a r m o lé cu la s de M H C o se cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u tados , q ue p ueden s e r ú tiles so lo para a lg u no s a le lo s de M H C de c lase I se le cc io n a d o s y p ueden e s ta r lim ita d o s por la d is p o n ib ilid a d lim ita d a de re ac tivos para s e le cc io n a r cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ió n (p o r e je m p lo , un c o n ju n to in co m p le to de te trá m e ro s de M H C ). Por co n s ig u ie n te , en una re a liza c ió n de la inve nc ión , los m é to d o s de la in ve n c ió n id e n tifica n ve n ta jo sa m e n te se cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta d o s p re se n ta d a s en el co n te x to de cu a lq u ie r m o lé cu la de M H C e xp re sa d a por el p a c ie n te y no se lim itan a n in g u n a m o lé cu la de M H C p a rticu la r. P re fe rib le m e n te , las A P C a u tó lo g a s son A P C a u tó lo g a s n eg a tivas para a n tígeno .
La ind u cc ió n de A P C a u tó lo g a s del p ac ie n te para que p rese n te n la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s puede lle va rse a cab o u sa nd o cu a lq u ie r m é to do a d e cu a d o con o c id o en la té cn ica . En una re a liza c ió n de la inve nc ión , in d u c ir A P C a u tó lo g a s del p ac ie n te para q ue p rese n te n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co m p re n d e a d m in is tra r m e d ia n te p u lsos a las A P C a u tó lo g a s p é p tid os que co m p re n d e n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s o un g rup o de p ép tid os , c o m p re n d ie n d o cad a p ép tid o en el g rup o una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s d ife re n te . C ada una de las se cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta d o s en el g rup o p uede e s ta r c o d ifica d a por un gen que co n tie n e una m u ta c ió n e sp e c ífica de cán ce r. A e ste respecto , las A P C a u tó lo g a s p ueden cu ltiva rse con un p ép tid o o un g rup o de p é p tid o s q ue co m p re n d e n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s de ta l m a n e ra q ue las A P C in te rio riza n e l/lo s p ép tid o (s ) y m u e s tra n la (s ) se cu e n c ia (s ) de a m in o á c id o s m u tados , u n id a (s ) a una m o lé cu la de M H C, en la m e m b ra n a ce lu la r. En una re a liza c ió n en la q ue se id e n tifica m ás de un gen, co n te n ie n d o cad a gen una m u ta c ión e sp e c ífica de c á n ce r que co d ifica una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s , el m é to do p uede c o m p re n d e r a d m in is tra r m e d ia n te p u lsos a las A P C a u tó lo g a s un g rup o de p ép tid os , c o m p re n d ie n d o cad a p ép tido en el g rup o una s e c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s d ife ren te . M é to d o s de a d m in is tra c ió n m e d ia n te p u lsos a las A P C se co n o ce n en la té c n ica y se d esc ribe n en, p o r e je m p lo , S o lh e im (E d.), Antigen Processing and Presentation Protocols (Methods in Molecular Biology), H um a n P ress, (2010 ). E l/los p é p tid o (s ) u sa d o (s ) para a d m in is tra r m e d ia n te p u lsos a las A P C p ue d e (n ) in c lu ir e l/los a m in o á c id o (s ) m u ta d o (s ) co d ifica d o (s ) por la m u ta c ión e sp e c ífica de cán cer. E l/los p ép tid o (s ) p u e d e (n ) c o m p re n d e r a d e m á s cu a lq u ie r n úm e ro a d e cu a d o de a m in o á c id o s co n tig u o s de la p ro te ín a e n d ó g e n a co d ifica d a p o r el gen id e n tif ica d o en cad a uno del lado ca rb o x ilo y el lad o a m ino d e l/de los a m in o á c id o (s ) m u ta do (s ). El n ú m e ro de a m in o á c id o s co n tig u o s de la p ro te ín a e n d ó g e n a q ue fla n q u e a cada lad o de la m u ta c ió n no se lim ita y p uede ser, p o r e je m p lo , a p ro x im a d a m e n te 4, a p ro x im a d a m e n te 5, a p ro x im a d a m e n te 6, a p ro x im a d a m e n te 7, a p ro x im a d a m e n te 8, a p ro x im a d a m e n te 9, a p ro x im a d a m e n te 10, a p ro x im a d a m e n te 11, a p ro x im a d a m e n te 12, a p ro x im a d a m e n te 13, a p ro x im a d a m e n te 14, a p ro x im a d a m e n te 15, a p ro x im a d a m e n te 16, a p ro x im a d a m e n te 17, a p ro x im a d a m e n te 18, a p ro x im a d a m e n te 19, a p ro x im a d a m e n te 20, o un in te rva lo d e fin id o por d os c u a lq u ie ra de los v a lo re s a n te rio res . P re fe rib le m e n te , e l/lo s p é p tid o (s ) co m p re n d e (n ) a p ro x im a d a m e n te 12 a m in o á c id o s co n tig u o s de la p ro te ín a e n d ó g e n a en cada lado d e l/de los a m in o á c id o (s ) m u ta do (s ).
En una re a liza c ió n de la inve n c ió n , in d u c ir A P C a u tó lo g a s del p a c ie n te p ara que p rese n te n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co m p re n d e in tro d u c ir una s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s en las A P C . La se cu e n c ia de n u c le ó tid o s se in tro d u ce en las A P C de m o do q ue las A P C e xp re se n y m u es tre n la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados , u n ida a una m o lé cu la de M H C, en la m e m b ra n a ce lu la r. La se cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica el a m in o á c id o m u ta do p uede s e r A R N o A D N . La in tro d u cc ió n de una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s en las A P C p uede lle va rse a cab o en cu a lq u ie ra de una va r ie d a d de d ife re n te s fo rm a s co n o c id a s en la té c n ica com o se d e sc rib e en, p o r e je m p lo , S o lh e im et al. m e n c io n a d o a n te rio rm e n te . E je m p lo s no lim ita n te s de té c n ica s q ue son ú tiles para in tro d u c ir una s e c u e n c ia de n u c le ó tid o s en A P C inc lu ye n tra n s fo rm a c ió n , tra n sd u cc ió n , tra n s fe c c ió n y e le c tro p o ra c ió n . En una re a liza c ió n en la q ue se id e n tifica m ás de un gen, el m é to d o p ue de c o m p re n d e r p re p a ra r m ás de una s e cu e n c ia de nuc leó tido s , c o d ifica n d o cada uno una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a p or un gen d ife re n te , e in tro d u c ir cad a se c u e n c ia de n u c le ó tid o s en una p ob lac ión d ife re n te de A P C a u tó lo ga s . A e ste respecto , p ueden o b te n e rse m ú ltip le s p o b la c io n e s de A P C a u tó lo ga s , e xp re sa n d o cad a p ob lac ión y m o s tra n d o una s e c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s d ife ren te .
En una re a liza c ió n en la q ue se id e n tifica m á s de un gen, co n te n ie n d o ca d a gen una m u ta c ión e sp e c ífica de c á n ce r q ue co d ifica una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s , el m é to do p uede c o m p re n d e r in tro d u c ir una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica m á s de un gen. A e s te re specto , en una re a liza c ió n de la inve nc ión , la s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s in tro d u c id a en las A P C a u tó lo g a s es una co n s tru cc ió n de TM G , c o m p re n d ie n d o ca d a m in igé n un gen d ife re n te , in c lu ye n d o cad a gen una m u ta c ió n e sp e c ífica de cá n ce r que co d ifica una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s . C ad a m in igé n p ue de c o d ific a r una m u ta c ión id e n tif ica d a p o r los m é to d o s de la in ve n c ió n f la n q u e a d o s en ca d a lado de la m u ta c ión p o r cu a lq u ie r n úm e ro a d e cu a d o de a m in o á c id o s co n tig u o s de la p ro te ín a e n d ó g e n a co d ifica d a p o r el gen ide n tificad o , com o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to con re sp e c to a o tro s a sp e c to s de la inve nc ión . El n ú m e ro de m in ig e n e s en la co n s tru cc ió n no se lim ita y p ue de inc lu ir, p o r e je m p lo , a p ro x im a d a m e n te 5, a p ro x im a d a m e n te 10, a p ro x im a d a m e n te 11, a p ro x im a d a m e n te 12, a p ro x im a d a m e n te 13, a p ro x im a d a m e n te 14, a p ro x im a d a m e n te 15, a p ro x im a d a m e n te 20, a p ro x im a d a m e n te 25, o m ás, o un in te rva lo d e fin id o p o r dos c u a lq u ie ra de los va lo re s a n te rio re s . Las A P C e xp re sa n las se cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta d o s c o d ifica d a s por la co n s tru cc ió n de T M G y m u es tra n las s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u tados , u n id as a una m o lé cu la de M H C, en las m e m b ra n a s ce lu la res . En una re a liza c ió n , el m é to do p uede c o m p re n d e r p re p a ra r m ás de una co n s tru cc ió n de T M G , cad a co n s tru cc ió n q ue co d ifica un co n ju n to d ife re n te de s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a s p o r d ife re n te s genes, e in tro d u c ir cad a co n s tru cc ió n de T M G en una p ob lac ión d ife re n te de A P C a u tó lo ga s . A este re spe cto , p ueden o b te n e rse m ú ltip le s p o b la c io n e s de A P C a u tó lo ga s , e xp re sa n d o cad a p ob la c ió n y m o stran do s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a s p o r d ife re n te s c o n s tru cc io n e s de TM G .
El m é to do co m p re n d e cu ltiva r cé lu la s T a u tó lo g a s de un tu m o r del p a c ie n te con las A P C a u tó lo g a s que p rese n ta n la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s . Las cé lu la s T p ueden o b te n e rse de n u m e ro sa s fu e n te s en el pac ien te , inc lu ye nd o , p e ro s in lim ita rse a tum o r, san gre , m é du la ósea, g a n g lio lin fá tico , el tim o , u o tro s te jid o s o flu id o s . Las cé lu la s T p ueden in c lu ir cu a lq u ie r tip o de cé lu la T y p ueden e s ta r en cu a lq u ie r e ta pa de d esa rro llo , inc lu ye nd o , pero s in lim ita rse a, cé lu las T d ob le p o s itiva s C D 4 /C D 8 , cé lu la s T a u x ilia re s C D 4+, p o r e je m p lo , cé lu la s Th1 y Th2, cé lu la s T C D 8 (p o r e je m p lo , cé lu la s T c ito tóx icas ), cé lu la s in filtra n te s tu m o ra le s (p o r e je m p lo , lin fo c ito s in filtra n te s de tu m o r (T IL )), cé lu la s T de sa n g re p erifé rica , cé lu la s T de m e m oria , cé lu la s T in d ife re n c ia d a s , y s im ila re s . Las cé lu la s T p ueden s e r cé lu la s T C D 8+, cé lu la s T C D 4+, o cé lu la s T ta n to C D 4 com o C D 8+. El m é to do p ue de c o m p re n d e r cu ltiv a r de m a n e ra co n ju n ta las cé lu la s T a u tó lo g a s y las A P C a u tó lo g a s de m o do q ue las cé lu la s T e n cu e n tre n la se c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s p re se n ta d a p or las A P C de ta l m a ne ra q ue las cé lu las T a u tó lo g a s se unen e sp e c ífica m e n te y re co n o ce n in m u n o ló g ic a m e n te una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s p re se n ta d a por las A P C . En una re a liza c ió n de la inve nc ión , las cé lu la s T a u tó lo g a s se cu ltivan de m a ne ra con ju n ta en co n ta c to d ire c to con las A P C au tó lo ga s .
El m é to do co m p re n d e s e le cc io n a r las cé lu la s T a u tó lo g a s que (a ) se cu ltiva ro n de m a ne ra co n ju n ta con las A P C a u tó lo g a s que p rese n ta n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s y (b) tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica por la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s p re se n ta d a en el co n te x to de una m o lé cu la de m H c e xp re sa d a p or el pac ien te . La e xp re s ió n “ e sp e c ific id a d a n tig é n ic a ” , com o se usa en el p re se n te d ocum e n to , s ig n ifica q ue un TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, e xp re sa d o p or las cé lu la s T a u tó lo g a s p ue de u n irse e sp e c ífica m e n te y re co n o ce r in m u n o ló g ic a m e n te la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a por la m u ta c ió n e sp e c ífica de cán ce r. La se le cc ió n p uede c o m p re n d e r id e n tif ic a r las cé lu la s T que tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s y s e p a ra r la s de las cé lu la s T q ue no tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s . La se le cc ió n de las cé lu la s T a u tó lo g a s q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s p uede lle va rse a cab o de cu a lq u ie r m a ne ra a de cu a d a . En una re a liza c ió n de la inve nc ión , el m é to d o co m p re n d e e xp a n d ir los n ú m e ro s de cé lu la s T a u tó lo ga s , p o r e je m p lo , m e d ia n te cu ltivo co n ju n to con un fa c to r de c re c im ie n to de cé lu la s T, ta le s com o in te rle u c in a (IL )-2 o IL-15, o com o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to con re sp e c to a o tros a sp e c to s de la inve nc ión , a n tes de s e le cc io n a r las cé lu la s T a u tó lo ga s . En una re a liza c ió n de la inve nc ión , el m é to do no co m p re n d e e xp a n d ir los n ú m e ro s de cé lu la s T a u tó lo g a s con un fa c to r de c re c im ie n to de cé lu las T, ta le s com o IL-2 o IL -15 an tes de s e le cc io n a r las cé lu la s T au tó lo ga s .
P o r e je m p lo , tra s el cu ltivo co n ju n to de las cé lu la s T a u tó lo g a s con las A P C q ue p rese n ta n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s , las cé lu la s T q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica p ara la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s p ueden e xp re sa r uno c u a lq u ie ra o m ás de una va r ie d a d de m a rca d o re s de a c tivac ión de cé lu la s T q ue pueden u sa rse para id e n tif ic a r a q u e lla s cé lu la s T q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s . T a le s m a rca d o re s de a c tiva c ió n de cé lu la s T p ue de n inc lu ir, pero no se lim itan a, m u erte ce lu la r p ro g ra m a d a 1 (P D -1 ), gen de a c tiva c ió n de lin fo c ito s 3 (L A G -3), in m u n o g lo b u lin a de cé lu la s T y d o m in io de m u cin a 3 (T IM -3), 4 -1B B , O X 40, y C D 107 a. P o r co n s ig u ie n te , en una re a liza c ió n de la inve nc ión , s e le cc io n a r las cé lu la s T a u tó lo g a s q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co m p re n d e se le cc io n a r las cé lu la s T que e xp re sa n uno cu a lq u ie ra o m ás de P D -1, LAG -3 , T IM -3 , 4 -1B B , O X 40 y C D 107 a . Las cé lu la s que e xp re sa n uno cu a lq u ie ra o m ás m a rca d o re s de a c tiva c ió n de cé lu la s T p ueden c la s ifica rse b a sá n d o se en la e xp re s ió n del m a rca d o r u sa nd o c u a lq u ie ra de una v a r ie d a d de té c n ica s c o n o c id a s en la té c n ica ta le s com o, por e je m p lo , c la s ifica c ió n de cé lu la s a c tiva d a s p o r flu o re sc e n c ia (F A C S ) o c la s ifica c ió n de cé lu la s a c tiva d a s m a g n é tica m e n te (M A C S ) com o se d e sc rib e en, p o r e je m p lo , los d o cu m e n to s de T u rco tte et al., C lin . C a n ce r Res., 20 (2 ): 331 -43 (2013 ) y G ros et al., J. C lin . Invest., 124(5): 2246 -59 (2014).
En o tra re a liza c ió n de la inve nc ión , s e le cc io n a r las cé lu la s T a u tó lo g a s q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica p ara la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co m p re n d e s e le cc io n a r las cé lu la s T (i) q ue se c re ta n una m a yo r ca n tid a d de una o m ás c ito c in a s tra s el cu ltivo co n ju n to con A P C q ue p rese n ta n la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s en co m p a ra c ió n con la ca n tid a d de la una o m ás c ito c in a s se c re ta d a s p o r un con tro l n eg a tivo o (ii) en d on de al m enos el d ob le de los n ú m e ro s de cé lu la s T se c re ta n una o m ás c ito c in a s tra s el cu ltivo co n ju n to con A P C q ue p rese n ta n la se c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s en co m p a ra c ió n con los n ú m e ro s de cé lu la s T de con tro l n e g a tivo que se c re ta n la una o m á s c ito c ina s . La una o m ás c ito c in a s p ueden c o m p re n d e r cu a lq u ie r c ito c in a cu ya se c re c ió n por una cé lu la T se a ca ra c te rís tica de la a c tiva c ió n de cé lu la T (p o r e je m p lo , un T C R e xp re sa d o p or las cé lu la s T que se unen e sp e c ífica m e n te y re con oce n in m u n o ló g ic a m e n te la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s). E je m p lo s no lim ita n te s de c ito c ina s , cuya s e c re c ió n es c a ra c te rís tica de la a c tiva c ió n de cé lu la s T, in c lu ye n IFN -y ,IL-2, y fa c to r de n e c ro s is tu m o ra l a lfa (T N F -a ), fa c to r e s tim u la n te de co lo n ia s de g ra n u lo c ito s /m o n o c ito s (G M -C S F ), IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL -17 y IL-22.
P o r e je m p lo , un TC R , o una parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, o una cé lu la T q ue e xp re sa el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, p ue de c o n s id e ra rse que tie n e “ e sp e c ific id a d a n tig é n ic a ” para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s si las cé lu la s T, o cé lu la s T que e xp re sa n el t C r , o la p a rte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, s e c re ta r al m e no s el d ob le de IFN -y tra s el cu ltivo co n ju n to con (a ) A P C n eg a tiva s p ara a n tíg e n o a las q ue se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos una c o n ce n tra c ió n de un p ép tid o q ue co m p re n d e la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s (p o r e je m p lo , de a p ro x im a d a m e n te 0 ,05 ng/m l a a p ro x im a d a m e n te 10 |ig /m l, p o r e je m p lo , 0 ,05 ng/m l, 0,1 ng/m l, 0 ,5 ng/m l, 1 ng/m l, 5 ng/m l, 100 ng/m l, 1 |ig /m l, 5 |ig /m l, o 10 | ig /m l) o (b) A P C en las que se ha in tro d u c id o una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s en co m p a ra c ió n con la can tida d de IFN -y se c re ta d a p or un con tro l n ega tivo . El con tro l n eg a tivo p uede ser, p o r e je m p lo , (i) cé lu la s T q ue exp re sa n el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, cu ltiva d a s de m a ne ra co n ju n ta con (a) A P C n e g a tiva s para a n tíg e n o a las que se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos la m ism a c o n ce n tra c ió n de un p ép tid o irre le va n te (p o r e jem p lo , la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de tip o s ilve s tre , o a lgún o tro p ép tid o con una se cu e n c ia d ife re n te de la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s ) o (b) A P C en las q ue se ha in tro d u c id o una s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica una s e cu e n c ia de p é p tid o s irre le van te , o (ii) cé lu la s T no tra n s d u c id a s (p o r e je m p lo , d e riva d a s de P B M C , q ue no e xp re sa n el TC R , o p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o) cu ltiva d a s de m a ne ra co n ju n ta con (a ) A P C n e g a tiva s a a n tíg e n o a las q ue se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos la m ism a c o n ce n tra c ió n de un p ép tid o que co m p re n d e la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s o (b ) A P C en las q ue se ha in tro d u c id o una s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s . Un TC R , o una p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, o una cé lu la T que e xp re sa el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, ta m b ié n p uede te n e r “ e sp e c ific id a d a n tig é n ic a ” para la s e c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s si las cé lu la s T, o cé lu la s T q ue e xp re sa n el TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, se c re ta n una m a yo r ca n tid a d de IFN -y tra s el cu ltivo co n ju n to con A P C n e g a tiva s para a n tíg e n o a las que se a d m in is tró m e d ia n te pu lsos co n ce n tra c io n e s m ás a lta s de un p ép tid o q ue co m p re n d e la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s en co m p a ra c ió n con un con tro l nega tivo , p o r e je m p lo , cu a lq u ie ra de los co n tro le s n e g a tivo s d e sc rito s a n te rio rm e n te . La se c re c ió n de IF N -y p uede m e d irse m e d ia n te m é to d o s co n o c id o s en la té c n ica ta le s com o, p or e je m p lo , e n sa yo p o r in m u n o a b so rc ió n liga d o a e n z im a s (E L IS A ).
A lte rn a tiv a o a d ic io n a lm e n te , un TC R , o una p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, o una cé lu la T que e xp re sa el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, p ue de c o n s id e ra rse que tie n e “ e sp e c ific id a d a n tig é n ic a ” para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s si al m enos el d ob le de los n ú m e ro s de cé lu la s T, o cé lu la s T q ue e xp re sa n el TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, s e c re ta n IFN -y tra s el cu ltivo co n ju n to con (a) A P C n e g a tiva s para a n tíg e n o a las q ue se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos una c o n ce n tra c ió n de un p ép tid o q ue co m p re n d e la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s o (b) A P C en las q ue se ha in tro d u c id o una se c u e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s en co m p a ra c ió n con los n ú m e ro s de cé lu la s T de con tro l n e g a tivo q ue se c re ta n IFN-y. La c o n ce n tra c ió n de p ép tid o y el con tro l n eg a tivo p uede s e r com o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to con re sp e c to a o tros a sp e c to s de la inve nc ión . Los n ú m e ro s de cé lu la s q ue s e c re ta n IFN -y p ueden m e d irse m e d ia n te m é to d o s co n o c id o s en la té c n ica ta le s com o, p or e je m p lo , E L IS P O T .
M ie n tra s q ue las cé lu la s T que tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica p or la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s p ueden (1) e xp re sa r uno cu a lq u ie ra o m á s m a rca d o re s de a c tivac ión de cé lu la s T d e sc rito s en el p re se n te d o cu m e n to y (2) s e c re ta r una m a yo r can tid a d de una o m ás c ito c in a s co m o se d e sc rib e en el p re se n te d ocum e n to , en una re a liza c ió n de la inve n c ió n , las cé lu la s T q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica p o r la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s p ueden e xp re sa r uno cu a lq u ie ra o m ás m a rca d o re s de a c tiva c ió n de cé lu la s T s in s e c re ta r una m a yo r ca n tid a d de una o m ás c ito c in a s o p ueden s e c re ta r una m a yo r ca n tid a d de una o m ás c ito c in a s s in e xp re sa r uno cu a lq u ie ra o m ás m a rca d o re s de a c tiva c ió n de cé lu la s T.
En o tra re a liza c ió n de la inve nc ión , s e le cc io n a r las cé lu la s T a u tó lo g a s q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica p ara la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co m p re n d e h a ce r c re ce r s e le c tiv a m e n te las cé lu la s T a u tó lo g a s q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la se c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s . A e ste re spe cto , el m é to do p ue de co m p re n d e r c u ltiv a r de m a ne ra co n ju n ta las cé lu la s T a u tó lo g a s con A P C a u tó lo g a s de ta l m a ne ra q ue se fa v o re z c a el c re c im ie n to de las cé lu la s T q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s sob re las cé lu la s T q ue no tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados . P o r con s ig u ie n te , se p ro p o rc io n a una p ob la c ió n de cé lu la s T q ue tie n e una m a yo r p ro p o rc ió n de cé lu la s T q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s en co m p a ra c ió n con las cé lu la s T q ue no tien en e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados.
En una re a liza c ió n de la inve nc ión , el m é to do co m p re n d e a d e m á s o b te n e r m ú ltip le s fra g m e n to s de un tu m o r del p ac ien te , cu ltiva r de m a n e ra co n ju n ta p o r se p a ra d o cé lu la s T a u tó lo g a s de cada uno de los m ú ltip le s fra g m e n to s con las A P C a u tó lo g a s q ue p rese n ta n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s com o se d e sc rib e en el p rese n te d o cu m e n to con re sp e c to a o tros a sp e c to s de la inve nc ión , y e va lu a r por s e p a ra d o las cé lu la s T de cada uno de los m ú ltip le s fra g m e n to s para d e te rm in a r la e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s , com o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to con re spe cto a o tro s a sp e c to s de la inve nc ión .
En una re a liza c ió n de la inve n c ió n en la que las cé lu la s T se cu ltivan de m a ne ra co n ju n ta con A P C a u tó lo g a s que e xp re sa n m ú ltip le s s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta do s (p o r e je m p lo , m ú ltip le s s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta d o s c o d ifica d a s p o r una co n s tru cc ió n de T M G o m ú ltip le s se cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta d o s en un g rupo de p é p tid o s a d m in is tra d o s m e d ia n te p u lsos en A P C a u tó lo ga s ), s e le cc io n a r las cé lu las T a u tó lo g a s p uede c o m p re n d e r a d e m á s e va lu a r p o r s e p a ra d o cé lu la s T a u tó lo g a s para d e te rm in a r la e sp e c ific id a d a n tig é n ica para cad a una de las m ú ltip le s se cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta do s . P o r e je m p lo , el m é to do de la in ve n c ió n puede c o m p re n d e r a d e m á s in d u c ir por se p a ra d o A P C a u tó lo g a s del p ac ie n te para que p rese n te n cada s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a p or la co n s tru cc ió n (o in c lu id a en el g rupo ), com o se d e sc rib e en el p rese n te d o cu m e n to con re sp e c to a o tros a sp e c to s de la in ve n c ió n (p o r e je m p lo , p ro p o rc io n a n d o p o b la c io n e s de A P C se p a ra d a s , cad a una p re se n ta n d o una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s d ife re n te co d ifica d a por la con s trucc ión (o in c lu id a en el g rup o )). El m é to d o p ue de c o m p re n d e r a d e m á s cu ltiva r de m a ne ra co n ju n ta por se p a ra d o cé lu las T a u tó lo g a s del p ac ie n te con las d ife re n te s p o b la c io n e s de A P C a u tó lo g a s q ue p rese n ta n cad a s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s , com o se d e sc rib e en el p rese n te d o cu m e n to con re sp e c to a o tros a sp e c to s de la inve nc ión . El m é to d o p uede c o m p re n d e r a d e m á s s e le cc io n a r p or s e p a ra d o las cé lu la s T a u tó lo g a s que (a ) se cu ltiva ro n de m a n e ra co n ju n ta con las A P C a u tó lo g a s q ue p rese n ta n la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s y (b) tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica p o r la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s p re se n ta d a en el co n te x to de una m o lé cu la de M H C e xp re sa d a por el p ac ien te , com o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to con re sp e c to a o tros a sp e c to s de la inve nc ión . A e ste re specto , el m é to d o p ue de c o m p re n d e r d e te rm in a r q ué s e c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s c o d ifica d a p o r una co n s tru cc ió n de T M G q ue co d ifica m ú ltip le s se cu e n c ia s de a m in o á c id o s m u ta d o s (o inc lu id a s en el g rup o ) son in m u n o ló g ic a m e n te re co n o c id a s por las cé lu la s T a u tó lo g a s (p o r e je m p lo , p o r p ro ce so de e lim in a c ió n ).
El m é to d o co m p re n d e a d e m á s a is la r una s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, de las cé lu la s T a u tó lo g a s se le cc io n a d a s , en el q ue el TC R , o la parte de un ión a an tíge no del m ism o, tie n e e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a p o r la m u tac ión e sp e c ífica de cán cer. En una re a liza c ió n de la inve nc ión , an tes de a is la r la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue cod ifica el TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, pueden e xp a n d irse los n ú m e ro s de cé lu la s T a u tó lo g a s se le cc io n a d a s q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados. La e xp a n s ió n de los n ú m e ro s de cé lu la s T p uede lo g ra rse m e d ia n te cu a lq u ie ra de un n ú m e ro de m é to d o s com o se con o ce n en la té c n ica co m o se d e sc rib e en, p o r e je m p lo , en la p a ten te e s ta d o u n id e n se 8.034.334 ; pa ten te e s ta d o u n id e n se 8.383.099 ; U .S. p u b lica c ió n de so lic itu d de p a te n te n.° 2012 /0244133 ; el d o cu m e n to de D ud ley et al., J. Im m u n o th e r., 26 :332 -42 (2003 ); y el d o cu m e n to de R idde ll et al., J. Im m uno l. M e thods , 128 :189 -201 (1990 ). En una re a liza c ió n , la e xp a n s ió n de los n ú m e ro s de cé lu las T se lle va a ca b o cu ltiva n d o las cé lu la s T con a n ticue rp o O K T 3, IL-2, y P B M C a lim e n ta d o ra s (p o r e je m p lo , P B M C a lo g é n ica s irrad iad as ). En o tra re a liza c ió n de la inve nc ión , los n ú m e ro s de cé lu la s T a u tó lo g a s se le cc io n a d a s que tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s no se e xp a n d e n a n te s de a is la r la s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o.
La “ p arte de un ión a a n tíg e n o ” del TC R , com o se usa en el p re se n te d o cu m e n to , se re fie re a cu a lq u ie r parte que co m p re n d e a m in o á c id o s co n tig u o s del T C R del q ue fo rm a parte , s ie m p re que la parte de un ión a a n tíg e n o se una e sp e c ífica m e n te a la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s co d ifica d a p or el gen id e n tifica d o co m o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to con re sp e c to a o tro s a sp e c to s de la inve nc ión . El té rm in o “ parte de un ión a a n tíg e n o ” se re fie re a cu a lq u ie r parte o fra g m e n to del T C R de la inve nc ión , p a rte o fra g m e n to q ue re tiene la a c tiv id a d b io lóg ica del T C R del cua l fo rm a p arte (e l T C R o rig in a l). Las p arte s de un ión a a n tíg e n o aba rcan , p o r e je m p lo , a qu e lla s p arte s de un T C R q ue re tien en la ca p a c id a d de u n irse e sp e c ífica m e n te a la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m utados, o de tec ta r, tra ta r, o p re ve n ir el cán cer, en una m e d id a s im ila r, en una m ism a m ed ida , o en una m e d id a sup e rio r, en co m p a ra c ió n con el T C R o rig in a l. En re fe re n c ia al T C R o rig in a l, la p a rte fu n c io n a l p ue de co m p re n d e r, por e je m p lo , a p ro x im a d a m e n te el 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 68 %, 80 %, 90 %, 95 %, o m ás, del T C R orig ina l.
La parte de un ión a a n tíg e n o p ue de c o m p re n d e r una parte de un ión a a n tíg e n o de c u a lq u ie ra o a m b a s de las c a d e n a s a y p del T C R de la inve nc ión , ta l co m o una p arte q ue co m p re n d e una o m ás de la re g ión d e te rm in a n te de co m p le m e n ta rie d a d (C D R )1, C D R 2, y C D R 3 de la (s ) re g ió n (e s ) v a r ia b le (s ) de la ca d e n a a y /o ca d e n a p del T C R de la inve nc ión . En una re a liza c ió n de la inve nc ión , la p a rte de un ión a a n tíg e n o p ue de c o m p re n d e r la se c u e n c ia de a m in o á c id o s de la CDR1 de la ca d e n a a (C D R 1 a ), la C D R 2 de la ca d e n a a (C D R 2 a ), la C D R 3 de la ca d e n a a (C D R 3 a ), la CDR1 de la ca d e n a p (C D R 1 p), la C D R 2 de la ca d e n a p (C D R 2 p), la C D R 3 de la cad en a p (C D R 3 p), o cu a lq u ie r co m b in a c ió n de las m ism as. P re fe rib le m e n te , la p a rte de un ión a a n tíg e n o co m p re n d e las se cu e n c ia s de a m in o á c id o s de C D R 1 a , C D R 2 a y C D R 3 a las s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s de C D R 1p , C D R 2 p y C D R 3 p o las s e cu e n c ia s de a m in o á c id o s de to d a s de CDR1 a, C D R 2 a , C D R 3 a , CDR1 p, C D R 2 p y C D R 3 p del TC R de la inve nc ión .
En una re a liza c ió n de la inve nc ión , la parte de un ión a a n tíg e n o p uede co m p re n d e r, p o r e je m p lo , la reg ión v a ria b le del T C R de la in ve n c ió n q ue co m p re n d e una co m b in a c ió n de las re g io n e s de C D R e xp u e s ta s a n te rio rm e n te . A e s te respecto , la parte de un ión a a n tíg e n o p uede c o m p re n d e r la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión v a ria b le de la ca d e n a a (V a ), la se c u e n c ia de a m in o á c id o s de la reg ión va r ia b le de la ca d e n a p (Vp), o las se cu e n c ia s de a m in o á c id o s ta n to de V a com o de V p del T C R de la inve nc ión .
En una re a liza c ió n de la inve nc ión , la p a rte de un ión a a n tíg e n o p uede c o m p re n d e r una co m b in a c ió n de una reg ión va r ia b le y una re g ión con s ta n te . A e ste re specto , la p a rte de un ión a a n tíg e n o p uede c o m p re n d e r la lon g itu d co m p le ta de la ca d e n a a o p, o a m b a s de las ca d e n a s a y p, del T C R de la inve nc ión .
El a is la m ie n to de la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica el TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, de las cé lu la s T a u tó lo g a s se le cc io n a d a s p uede lle va rse a cab o de cu a lq u ie r m a n e ra a d e cu a d a co n o c id a en la técn ica . P o r e je m p lo , el m é to do p ue de c o m p re n d e r a is la r A R N de las cé lu la s T a u tó lo g a s y s e c u e n c ia r el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, u sa nd o té c n ica s de c lo n a c ió n m o le cu la r e s ta b le c id a s y re a c tivo s ta le s com o, por e je m p lo , la re acc ión en ca d e n a de la p o lim e ra sa (P C R ) de a m p lif ica c ió n rá p ida de e x tre m o s de A D N c (R A C E ) de e x tre m o 5' u tiliza n d o c e b a d o re s c o n s ta n te s de ca d e n a s de T C R -a y -p.
En una re a liza c ió n de la inve nc ión , el m é to d o p uede c o m p re n d e r c lo n a r la s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue cod ifica el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en un v e c to r de e xp re s ió n re co m b in a n te u sa nd o té cn ica s de c lo n a c ió n m o le c u la r e s ta b le c id a s com o se d e sc rib e en, p o r e je m p lo , el d o cu m e n to de G reen et al. (E ds.), M o le cu la r C lon ing : A L a b o ra to ry M anua l, C o ld S p rin g H a rb o r L a b o ra to ry P ress; 4a Ed. (2012 ). Para los fin e s del p rese n te d o cu m e n to , el té rm in o “v e c to r de e xp re s ió n re co m b in a n te ” s ig n ifica una co n s tru cc ió n de o lig o n u c le ó tid o s o p o lin u c le ó tid o s g e n é tic a m e n te m o d ifica d o s que p erm ite la e xp re s ió n de un A R N m , p ro te ína , p o lip é p tid o o p ép tido p o r una cé lu la h osp e d a d o ra , cu a n d o la co n s tru cc ió n co m p re n d e una s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica el A R N m , p ro te ína , p o lip é p tid o o pép tido , y el v e c to r se p one en co n ta c to con la cé lu la ba jo co n d ic io n e s su fic ie n te s p ara te n e r el A R N m , p ro te ína , p o lip é p tid o o p ép tid o e xp re sa d o d en tro de la cé lu la . Los v e c to re s de la in ve n c ió n no son de o rige n natu ra l en su con jun to . S in e m ba rg o , p a rtes de los ve c to re s p ueden s e r de o rigen natu ra l. Los v e c to re s de e xp re s ió n re co m b in a n te s p ue de n c o m p re n d e r c u a lq u ie r tip o de n uc leó tido s , in c lu ye n d o , pero sin lim ita rse a A D N y A R N , q ue p uede s e r m o n o ca te n a rio o b ica ten a rio , s in te tiza d o u o b te n id o en p arte a p a rtir de fu e n te s n a tu ra les , y q ue p ue de c o n te n e r n u c le ó tid o s n a tu ra le s , no n a tu ra le s o a lte ra do s . Los v e c to re s de e xp re s ió n re co m b in a n te s p ueden c o m p re n d e r e n la ce s e n tre n u c le ó tid o s n a tu ra le s , no na tu ra le s , o a m bo s tip o s de en laces. P re fe rib le m e n te , e n la ce s e n tre n u c le ó tid o s de o rige n no natu ra l o n u c le ó tid o s a lte ra d o s no d ificu lta n la tra n sc rip c ió n o re p lica c ió n del vec to r.
El v e c to r de e xp re s ió n re co m b in a n te de la inve n c ió n p ue de se r cu a lq u ie r v e c to r de e xp re s ió n re co m b in a n te a de cu a d o , y p uede usa rse para tra n s fo rm a r o tra n s fe c ta r cu a lq u ie r cé lu la h o sp e d a d o ra a de cu a d a . V e c to re s a d e cu a d o s in c lu ye n a q u e llo s d is e ñ a d o s para p ro p a g a c ió n y e xp a n s ió n o p ara e xp re s ió n o a m bo s, ta le s com o p lá sm id o s y v iru s . El v e c to r p uede se le cc io n a rse del g rup o que co n s is te en tra n sp o s ó n /tra n s p o sa s a , la se rie pUC (F e rm e n ta s L ife S c ien ce s), la se r ie p B lu e sc rip t (S tra tag en e , LaJo lla , CA), la se rie p E T (N o va g e n , M a d ison , W I), la se r ie p G E X (P h a rm a c ia B io tech , U ppsa la , S uec ia ), y la se r ie p E X (C lon tech , P a lo A lto , CA). T a m b ié n p ueden u sa rse ve c to re s de b ac te rió fa g o s , ta le s com o X G T10, XG T11, XZapII (S tra ta g e n e ), X E M B L4, y X N M 1149. E je m p lo s de ve c to re s de e xp re s ió n v e g e ta le s in c lu ye n pB I01, p B I101.2, pB1101.3, pB1121 y p B IN 19 (C lon tech ). E je m p lo s de v e c to re s de e xp re s ió n a n im a le s in c lu ye n p E U K -C l, pM A M y p M A M n e o (C lo n te ch ). P re fe rib le m e n te , el v e c to r de e xp re s ió n re co m b in a n te es un v e c to r v ira l, p o r e je m p lo , un v e c to r re trovira l.
El TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, a is la do p o r los m é to d o s de la in ve n c ió n p uede s e r útil para p re p a ra r cé lu la s para te ra p ia s a d o p tiva s de cé lu las . A e ste re spe cto , la inve n c ió n p ro p o rc io n a un m é to do para p re p a ra r una p ob la c ió n de cé lu la s q ue e xp re sa n un TC R , o una p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, q ue tien e e sp e c ific id a d a n tig é n ica para una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a p o r una m u ta c ión e sp e c ífica de cán cer, c o m p re n d ie n d o el m é to do a is la r un TC R , o una parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, com o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to con re spe cto a o tro s a sp e c to s de la inve nc ión , e in tro d u c ir la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica el T C R a is lado , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en P B M C para o b te n e r cé lu la s q ue e xp re sa n el TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o.
La in tro d u cc ió n de la s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s (p o r e je m p lo , un v e c to r de e xp re s ió n re co m b in a n te ) que co d ifica el T C R a is la do , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en P B M C p uede lle va rse a ca b o en c u a lq u ie ra de una v a r ie d a d de fo rm a s d ife re n te s c o n o c id a s en la té cn ica co m o se d e sc rib e en, p o r e je m p lo , el d o cu m e n to de G reen et al. m e n c io n a d o a n te rio rm e n te . E je m p lo s no lim ita n te s de té c n ica s q ue son ú tiles para in tro d u c ir una se cu e n c ia de n u c le ó tid o s en P B M C in c lu ye n tra n s fo rm a c ió n , tra n sd u cc ió n , tra n s fe c c ió n y e le c tro p o ra c ió n .
En una re a liza c ió n de la inve nc ión , el m é to do co m p re n d e in tro d u c ir la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica el T C R a is lado , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en P B M C q ue son a u tó lo g a s para el p ac ien te . A este re spe cto , los TC R , o las p artes de un ión a a n tíg e n o del m ism o, id e n tif ica d o s y a is la d o s m e d ia n te los m é to do s de la inve n c ió n p ueden p e rso n a liza rse para cad a p ac ien te . S in e m ba rg o , en o tra re a liza c ió n , los m é to d o s de la in ve n c ió n p ue de n id e n tif ic a r y a is la r TC R , o las p artes de un ión a a n tíg e n o del m ism o, q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica fre n te a una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s q ue e stá co d ifica d a p o r una m u ta c ión e sp e c ífica de c á n c e r re cu rre n te (ta m b ié n d e n o m in a d a “ pun to c a lie n te ” ). A e ste re specto , el m é to d o p uede c o m p re n d e r in tro d u c ir la se c u e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica el T C R a is lado , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en P B M C que son a lo g é n ica s para el p ac ien te . P o r e je m p lo , el m é to do p uede c o m p re n d e r in tro d u c ir la s e cu e n c ia de n uc leó tido s q ue co d ifica el T C R a is lado , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en P B M C q ue son a lo g é n ica s al pac ien te . P o r e je m p lo , el m é to d o p uede c o m p re n d e r la in tro d u cc ió n de la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica el T C R a is la d o o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en las P B M C de o tro p ac ie n te cu yo s tu m o re s e xp re sa n la m ism a m u ta c ión en el co n te x to de la m ism a m o lé cu la de M HC.
En una re a liza c ió n de la inve nc ión , las P B M C in c lu ye n cé lu la s T. Las cé lu la s T p ueden s e r cu a lq u ie r tip o de cé lu la
T, p o r e je m p lo , cu a lq u ie ra de los d e sc rito s en el p re se n te d o cu m e n to con re sp e c to a o tros a sp e c to s de la inve nc ión .
S in lim ita rse a una te o ría o m e ca n ism o p articu la r, se c ree q ue las cé lu la s T m enos d ife re n c ia d a s , “ m ás jó v e n e s ” p ue de n a so c ia rse con una cu a lq u ie ra o m ás de m a yo r p e rs is te n c ia in vivo, p ro life ra c ió n y a c tiv id a d a n titu m o ra l en co m p a ra c ió n con las cé lu la s T m ás d ife re n c ia d a s , “ m ás m a yo re s ” . P or co n s ig u ie n te , los m é to d o s de la inve nc ión p ue de n , ve n ta jo sa m e n te , id e n tif ic a r y a is la r un TC R , o una p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, q ue tien e e sp e c ific id a d a n tig é n ica p o r la s e c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s e in tro d u c ir el TC R , o una p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en cé lu la s T “ m ás jó v e n e s ” q ue p ue de n p ro p o rc io n a r una c u a lq u ie ra o m ás de m a yo r p e rs is te n c ia in vivo, p ro life ra c ió n , y a c tiv id a d a n titu m o ra l en co m p a ra c ió n con las cé lu la s T “ m ás m a yo re s ” (p o r e je m p lo , cé lu la s e fe c to ra s en un tu m o r de un p ac ien te ) a p a rtir de las cu a le s p ue de h a b e rse a is la d o el TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o.
En una re a liza c ió n de la inve nc ión , el m é to d o co m p re n d e a d e m á s e xp a n d ir los n ú m e ro s de P B M C que e xp re sa n el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o. Los n ú m e ro s de P B M C p ueden e xp an d irse , por e je m p lo , com o se d e sc rib e en el p re se n te d o cu m e n to con re sp e c to a o tro s a sp e c to s de la inve nc ión . A e ste re spe cto , los m é to do s de la in ve n c ió n p ue de n , ve n ta jo sa m e n te , g e n e ra r un g ran n úm e ro de cé lu la s T q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tigé n ica p ara la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados.
A l in tro d u c ir la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica el T C R a is lado , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en
P B M C , los m é to d o s de la inve n c ió n pueden , ve n ta jo sa m e n te , p ro p o rc io n a r una p ob lac ión de cé lu la s que co m p re n d e una a lta p rop o rc ión de cé lu la s P B M C q ue e xp re sa n el T C R a is la d o y tie n e n e sp e c ific id a d a n tigé n ica p ara la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados . En una re a liza c ió n de la inve n c ió n , de a p ro x im a d a m e n te 1 % a a ro x im a d a m e n te un 100 % o r e e m lo de a ro x im a d a m e n te un 1 % a ro x im a d a m e n te un 5 %
Figure imgf000011_0001
a p ro x im a d a m e n te un 98 %, a p ro x im a d a m e n te un 99% , o a p ro x im a d a m e n te un 100% , o un in te rva lo d e fin id o por d os cu a lq u ie ra de los va lo re s a n te rio res , de la p ob lac ión de cé lu la s co m p re n d e cé lu la s P B M C q ue e xp re sa n el
T C R a is la d o y tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados . Sin lim ita rse a una te o ría o m e ca n ism o p a rticu la r, se c ree q ue las p o b la c io n e s de cé lu la s q ue co m p re n d e n una a lta p ro p o rc ió n de cé lu las
P B M C que e xp re sa n el T C R a is la d o y tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s tie n e n una m e n o r p rop o rc ión de cé lu la s irre le va n te s q ue p ueden d ificu lta r la fu n c ió n de las P B M C , p o r e jem p lo , la c a p a c id a d de las Pb Mc para s e le cc io n a r com o o b je tivo la d e s tru cc ió n de cé lu la s ca n ce ro sa s y /o tra ta r o p reve n ir el cáncer.
El c á n c e r es c á n c e r de co lon , o cá n ce r recta l.
El m a m ífe ro al que se hace re fe re n c ia en los m é to d o s de la inve n c ió n p uede s e r cu a lq u ie r m a m ífe ro . C om o se usa en el p re se n te d o cu m e n to , el té rm in o “ m a m ífe ro ” se re fie re a cu a lq u ie r m a m ífe ro , inc lu ye nd o , pero s in lim ita rse a, m a m ífe ro s del o rde n R od en tia , ta le s co m o ra to n e s y hám ste res , y m a m ífe ro s del o rde n L og o m o rp h a , ta le s com o con e jo s . Se p re fie re q ue los m a m ífe ro s sea n del o rden C arn ivo ra , in c lu ye n d o fe lin o s (g a to s ) y cá n id o s (perros).
P re fe rib le m e n te , los m a m ífe ro s son del o rden A rtio d a c ty la , in c lu ye n d o b ov ino s (va ca s ) y p o rc in o s (ce rd o s ) o del o rde n P e rsso d a c ty la , in c lu id o s los e q u in o s (ca ba llos ). P re fe rib le m e n te , los m a m ífe ro s son del o rde n P rim ates ,
C éb ido s, o S im o id e s (m o n o s ) o del o rde n de los A n tro p o id e s (h u m a n o s y s im ios ). Un m a m ífe ro m ás p re fe rid o es el s e r hum ano . En una re a liza c ió n e sp e c ia lm e n te p re fe rid a , el m a m ífe ro es el p ac ie n te q ue e xp re sa la m u tac ión e sp e c ífica de cáncer.
Los s ig u ie n te s e je m p lo s ilus tran a d ic io n a lm e n te la inve n c ió n pero , p o r sup ue s to , no d eben in te rp re ta rse de n inguna m a n e ra com o lim ita n te s de su a lca nce .
E je m p lo s
Los m a te ria le s y m é to d o s para los e je m p lo s 1-7 se e xp on en a co n tinu ac ión .
S e cu e n c ia c ió n de e xo m a co m p le to
La se cu e n c ia c ió n de e xo m a co m p le to de te jid o tu m o ra l c r io p re se rva d o ( in te g ra d o en O C T ) y cé lu la s de san g re p e rifé rica norm a l se re a lizó p or P e rson a l G e n o m e D ia g n o s tics (P G D x, B a ltim o re , M D ) co m o se d e sc rib e en el d o cu m e n to de Jo n e s et al., S c ie n ce 330: 228-231 (2010 ). El n úm e ro p ro m e d io de le c tu ra s de se cu e n c ia de a lta ca lid a d d is tin ta s en cada base fu e de 155 y 160 para el A D N (P B M C ) tu m o ra l y no rm a l, re sp e c tiva m e n te .
T ra ta m ie n to de p a c ie n te s y g e n e ra c ió n de lin fo c ito s in filtra n te s de tu m o r (T IL ) para te ra p ia a d o p tiva de cé lu las
El p a c ie n te 3737 se in sc rib ió en el p ro to co lo a p ro b a d o p or la ju n ta de re v is ión in s titu c io n a l (IR B ): “ Un e s tu d io de fa se II u sa nd o lin fo c ito s in filtra n te s de tu m o ra l a u tó lo g o s cu ltiva d o s a co rto p lazo d e sp u é s de un ré g im en de a g o ta m ie n to de lin fo c ito s en cá n ce re s de tra c to d ig e s tivo m e ta s tá s ico s ” (ID de re g is tro del ensayo : N C T 01174121), q ue se d ise ñ ó p ara e va lu a r la s e g u rid a d y e fica c ia de la tra n s fe re n c ia a d o p tiva de lin fo c ito s in filtra n te s de tu m o r (T IL ) e xp a n d id o s ex vivo a u tó lo g o s en p a c ie n te s con cá n ce re s g a s tro in te s tin a le s .
Los T IL u sa do s para el p rim e r tra ta m ie n to del p a c ie n te se g e n e ra ro n com o se d e sc rib e en el d o cu m e n to de J in et al., J. Im m u n o th e r., 35: 283 -292 (2012 ). B re vem e n te , los tu m o re s re se ca d o s se tro ce a ro n en fra g m e n to s de a p ro x im a d a m e n te 1-2 m m y los fra g m e n to s in d iv id u a le s se co lo ca ro n en p oc illos de una p laca de 24 p oc illos que co n te n ía n 2 ml de m e d io s co m p le to s (C M ) que co n te n ía a lta d os is de IL -2 (6000 U I/m l, C h iron , E m e ryv ille , CA). El C M co n s is tió en R PM I e n riq u e c id o con su e ro h u m a n o o b te n id o in te rn a m e n te al 10% , L -g lu ta m in a 2 m M , H E P E S 25 m M y 10 |ig /m l de g e n ta m ic in a . A d ic io n a lm e n te , ta m b ié n se cu ltivó una d ig e stió n tu m o ra l m ix ta en C M con a lta d os is de IL-2. D e sp u é s del c re c im ie n to in ic ia l de las cé lu la s T (e n tre 2 -3 sem a n a s ), se e xp a n d ie ro n rá p id a m e n te 5 x 106 cé lu la s T de cu ltivo s se le cc io n a d o s en m a tra ce s G -R e x100 p e rm e a b le s a g as u sa nd o P B M C a lo g é n ica s irra d ia d a s en una p ro p o rc ió n de 1 a 100 en 400 ml de m e d io s 50/50 , e n riq u e c id o s con su e ro A B h u m a n o al 5 %, 3000 U I/m l de IL-2, y 30 ng/m l de a n ticu e rp o O K T 3 (M ilte ny i B io tec, B e rg isch G la d ba ch , A le m a n ia ). Los m e d io s 50 /50 se co m p u s ie ro n p or una m e zc la 1 a 1 de C M con m e d io s A IM -V . T o d a s las cé lu la s se cu ltiva ro n a 37 °C con C O 2 al 5 % . El n ú m e ro de cé lu la s se e xp a n d ió rá p id a m e n te d u ra n te d os s e m a n a s a n tes de la in fu s ió n . El p ac ien te 3737 se so m e tió a un ré g im en de a g o ta m ie n to de lin fo c ito s no m ie lo s u p re s o r co m p u e s to p o r c ic lo fo s fa m id a y f lu d a ra b in a a n tes de re c ib ir 42 ,4 m il m illo ne s de cé lu las T to ta le s ju n to con cua tro dos is de IL-2 de d os is alta.
Los T IL u tiliza d o s para el s e g u n d o tra ta m ie n to del pac ien te se g e n e ra ro n de m a n e ra s im ila r al p rim e r tra ta m ie n to con los s ig u ie n te s cam b ios . El p rim e r p ro d u c to de tra ta m ie n to (p a c ie n te 3737 -T IL ) se co m p u so p o r una co m b in a c ió n de 5 cu ltivo s de T IL in d iv id u a le s . E s tos 5 cu ltivo s se e va lu a ro n in d iv id u a lm e n te para d e te rm in a r la e xp re s ió n de C D 4 y V p22 , y re a c tiv id a d con tra E R B B 2 IP m u ta do , y se e n co n tró q ue un cu ltivo e s ta ba a lta m e n te e n riq u e c id o en cé lu la s T C D 4+ re a c tiva s a m u ta c ió n de E R B B 2 IP V p22 . E ste cu ltivo de T IL (d e sp u é s del c re c im ie n to in ic ia l con IL -2 de d os is a lta ) se e xp a n d ió rá p id a m e n te com o se d e sc rib ió a n te rio rm e n te . El p ac ien te se so m e tió a un ré g im en de a g o ta m ie n to de lin fo c ito s no m ie lo s u p re s o r id é n tico al del p rim e r tra ta m ie n to a n tes de re c ib ir 126 mil m illo n e s de cé lu la s T to ta le s ju n to con cu a tro d os is de IL-2 de d os is alta.
G e n e ra c ió n de c o n s tru cc io n e s de T M G
B re ve m e n te , para cad a m u ta c ión de s u s titu c ió n no s in ó n im a id e n tif ica d a p or se cu e n c ia c ió n de e xo m a com p le to , se re a lizó una co n s tru cc ió n de “ m in ig é n ” q ue co d ifica el ca m b io de a m in o á c id o co rre sp o n d ie n te f la n q u e a d o p o r 12 a m in o á c id o s de la se cu e n c ia de p ro te ín a de tip o s ilve s tre . Se fu s io n a ro n g e n é tica m e n te m ú ltip le s m in ig e n e s para g e n e ra r una co n s tru cc ió n de TM G . E s ta s co n s tru c c io n e s de m in ig e n e s se o p tim iza ro n p o r co d o n e s y se s in te tiza ro n com o c o n s tru cc io n e s de ca d e n a de A D N (L ife T e ch n o lo g ie s , C a rlsb a d C A). Los T M G se c lon aron lue g o para d a r el v e c to r pcD N A 3. 1 u sa n d o te cn o lo g ía In-Fusion (C lon tech , M o un ta in V iew , C A). Se usó m u ta g é n e s is d ir ig id a al s itio para g e n e ra r las nue ve co n s tru c c io n e s de TM G -1 de “ re ve rs ió n de tip o s ilv e s tre ” (G ene O rac le , M o u n ta in V iew , C A). La s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s de to d o s los T M G se ve r ific ó m e d ia n te se cu e n c ia c ió n de S a n g e r e s tá n d a r (M a c ro g e n y G e n e O rac le ).
G e n e ra c ió n de A P C a u tó lo g a s
Se g en e ra ro n , DC in m a d u ra s d e riva d a s de m o n o c ito s u sa nd o el m é to do de a d h e re n c ia a p lás tico . B re vem e n te , las m u e s tra s de a fé re s is a u tó lo g a se d e sco n g e la ro n , se lava ro n y se fija ro n a 5 -10 x 106 cé lu la s /m l con m e d io s A IM -V s in d ilu ir (L ife T e ch n o lo g ie s ) y luego se in cu b a ro n a a p ro x im a d a m e n te 1 x 106 cé lu la s /cm 2 en un m a traz de cu ltivo tisu la r de ta m a ñ o a p ro p ia d o y se in cu b a ro n a 37 °C, C O 2 al 5 %. D e sp u é s de 90 m in u tos (m in ), se re cog ie ron cé lu la s no a d h e re n te s , y los m a tra ce s se la va ro n v ig o ro sa m e n te con m e d io s A IM -V , y d e sp u é s se in cu b ó con m e d io s A IM -V d u ra n te o tros 60 m in. Los m a tra ce s se lava ro n lue g o v ig o ro sa m e n te n ue va m e n te con m e d io s A IM -V y lue g o las cé lu la s a d h e re n te s se in cu b a ro n con m e d io s de DC. Los m e d io s de DC co m p u e s to s p o r RPM I que c o n tie n e su e ro h um a no al 5 % (re co g id o y p ro ce sa d o in te rn a m e n te ), 100 U /m l de p en ic ilin a y 100 |ig /m l de e s tre p to m ic in a , L -g lu ta m in a 2m M , 800 U I/m l de G M -C S F y 800 U /m l de IL-4 (los e le m e n to s de e n riq u e c im ie n to de m e d io s fu e ro n de L ife T e ch n o lo g ie s y las c ito c in a s fu e ro n de P ep ro tech ). El d ía 3, se a ña d ie ro n m e d io s de DC fre sc o s a los cu ltivos . Se usa ron DC fre sc a s o co n g e la d a s /d e s co n g e la d a s en e xp e rim e n to s el d ía 5-7 d e sp u é s de la e s tim u la c ió n in ic ia l. En to d o s los e xp e rim e n to s , se usó c ito m e tría de f lu jo para fe n o tip a r las cé lu las para la e xp re s ió n de C D 11c, C D 14, C D 80, C D 86, y H L A -D R (todos de BD B io sc ie n ce ) para g a ra n tiza r q ue las cé lu las fu e ra n DC p re d o m in a n te m e n te in m a d u ra s (C D 11 c+ , c D14-, C D 80 baja, C D 86+ y H LA -D R ; d a tos no m o strad os).
Las cé lu la s B p re se n ta d o ra s de a n tíg e n o se g en e ra ro n u sa nd o el m é to do de e s tim u la c ió n de C D 40 L e IL-4. En re sum e n , se u sa ron m ic ro p e rla s de C D 19 h um a na (M ilte ny i B io te c) para s e le cc io n a r p o s itiva m e n te cé lu la s B de m u e s tra s de a fé re s is a u tó loga . Las cé lu la s C D 19 se cu ltiva ro n lue g o con cé lu la s 3T3 irra d ia d a s (6000 rad) que e xp re sa n de m a ne ra e s ta b le C D 40 L (3 T 3 -C D 40 L ) a una re lac ió n de a p ro x im a d a m e n te 1:1 en m e d io s de cé lu las B. Los m e d io s de cé lu la s B c o m p u e s to s p or m e d io s de IM D M (L ife T e ch n o lo g ie s ) e n riq u e c id o s con su e ro h um a no al 7 ,5 -10 % (o b te n id o in te rn a m e n te ), 100 U /m l de p en ic ilin a y 100 |ig /m l de e s tre p to m ic in a (L ife T e ch n o lo g ie s ), 10 |ig /m l de g e n ta m ic in a (C e llG ro , M a na ssa s, V A ), L -g lu ta m in a 2 m M (L ife T e ch n o lo g ie s ), y 200 U /m l de IL-4 (P e p ro te ch ). Se a ña d ie ro n m e d io s de cé lu la s B fre sco a p a rtir del d ía 3, y se a ñ a d ie ro n o re e m p la za ro n m edios cad a 2 -3 d ías a p a rtir de e n ton ces . T a m b ié n se a ña d ie ro n c é lu la s a lim e n ta d o ra s 3 T 3 -C D 40 L irra d ia d a s a d ic ion a le s se g ú n se re qu e ría . Las cé lu las B p re se n ta d o ra s de a n tíg e n o se u sa ron típ ic a m e n te en e xp e rim e n to s 2 -3 se m a n a s d e sp u é s de la e s tim u la c ió n in ic ia l.
G e n e ra c ió n de A R N tra n s c rito in v itro (IV T)
P lá sm id o s que cod ifica n los m in ig e n e s en tá n d e m se lin e a liza ro n con la e n z im a de re s tr icc ió n S a c II. Un ve c to r p cD N A 3.1 /V 5 -H is -T O P O de con tro l q ue co d ifica G F P se lin e a lizó con N o t I. Las d ig e s tio n e s de re s tr icc ió n se fin a liza ro n con E D TA , se re a lizó p re c ip ita c ió n con a ce ta to de so d io y e tano l. La d ig e s tió n p la sm íd ica co m p le ta se v e r ific ó m e d ia n te e le c tro fo re s is e s tá n d a r en gel de a ga ro sa . S e usó a p ro x im a d a m e n te 1 | ig de p lá sm id o lin e a liza d o p ara la g e n e ra c ió n de A R N IV T u sa nd o el k it M e ssa g e M a ch ine T 7 U ltra (L ife T e ch n o lo g ie s ) se g ú n las in s tru cc io n e s del fa b rica n te . El A R N se p re c ip itó u sa nd o el m é to d o de L iC h, y se e va lu a ro n la p ureza y las c o n c e n tra c io n e s de A R N u sa n d o un e sp e c tro fo tó m e tro N an oD ro p . A con tin u a c ió n , el A R N se d iv id ió en a lícu o ta s en m ic ro tu b o s y se a lm a ce n ó a -80 °C hasta su uso.
T ra n s fe cc io n e s de A R N
Se o b tu v ie ro n A P C (D C o cé lu la s B), se lava ro n una ve z con PBS, y lue g o se re su sp e n d ie ro n en O p ti-M E M (L ife T e ch n o lo g ie s ) a 10-30 x 106 cé lu las /m l. El A R N IV T (4 | ig u 8 |ig ) se d iv id ió en a lícu o ta s en fo n d o de una cub e ta de e le c tro p o ra c ió n de 2 m m de a be rtu ra , y 50 |il o 100 |il de A P C se a ñ a d ie ro n d ire c ta m e n te a la cubeta . La co n ce n tra c ió n fina l de A R N u tiliza d a en e le c tro p o ra c io n e s fu e de 80 |ig /m l. Las e le c tro p o ra c io n e s se lle va ro n a ca b o u sa nd o un e le c tro p o ra d o r de o nd a cu a d ra d a B T X -830. Las DC se e le c tro p o ra ro n con 150 V, 10 m s, y 1 pulso, y las cé lu la s B se e le c tro p o ra ro n con 150 V, 20 m s y 1 pu lso . Las e fic ie n c ia s de tra n s fe cc ió n u sa n d o e s to s a ju s tes se e va lu a ro n ru tin a ria m e n te e n tre un 70 -90 % seg ún lo e va lu a d o con A R N de G F P (d a to s no m o strad os ). T o da s las e ta p a s se lle va ro n a cabo a te m p e ra tu ra a m b ie n te . D e sp u é s de la e le c tro p o ra c ió n , las cé lu la s se tra n s fir ie ro n in m e d ia ta m e n te a tu b o s de p o lip ro p ile n o q ue co n te n ía n m e d io s de DC o cé lu la s B e n riq u e c id o s con las c ito c in a s a p ro p ia d a s . Las cé lu la s tra n s fe c ta d a s se in cu b a ro n d u ra n te la n oche (12 -14 h) a 37 °C, C O 2 al 5 % . Las cé lu la s se la va ro n 1 ve z con P B S a n te s de su uso en e n sa yo s de cu ltivo con jun to .
A d m in is tra c ió n m e d ia n te p u lsos de p ép tid os
Se o b tu v ie ro n cé lu la s B a u tó lo ga s , se lava ro n , y d e sp u é s se re su sp e n d ie ro n a 1 x 106 cé lu la s /m l en m e d io s de cé lu la s B e n riq u e c id o s con IL-4, y d e sp u é s se in cu b a ro n con 1 |ig /m l de un p ép tid o 25 -m e r d u ra n te la n oche (12 ­ 14 h) a 37 °C, C O 2 al 5 %. D e sp u é s de la a d m in is tra c ió n m e d ia n te p u lsos d u ra n te la noche , a co n tin u a c ió n , las cé lu la s B se lava ro n 2 v e ce s con PBS, y d e sp u é s se re su sp e n d ie ro n en m e d io s de cé lu la s T y se usa ron in m e d ia ta m e n te en e n sa yo s de cu ltivo con jun to . Los p é p tid o s u sa d o s fue ro n : E R B B 2 IP m u ta do (T S F L S IN S K E E T G H L E N G N K Y P N L E (S E Q ID NO: 73)); E R B B 2 IP de tip o s ilve s tre (T S F L S IN S K E E T E H L E N G N K Y P N L E (S E Q ID NO: 45)); y, com o con tro l n ega tivo , A L K m u ta do (R V L K G G S V R K L R H A K Q L V L E L G E E A (S E Q ID NO: 46)). El p é p tid o E R B B 2 IP m u ta do se a d q u irió de tre s fu e n te s d ife re n te s (G en S crip t, P isca taw ay , NJ, P ép tido 2.0, C ha n tilly , VA , y S e lle ckC h e m , H ou sto n T X ) con to d o s p ro d u c ie n d o los m ism os re su lta d o s in vitro, m ie n tra s que los p é p tid o s E R B B 2 IP de tip o s ilve s tre y A L K m u ta do se a d q u irie ro n del p ép tid o 2.0. P ara c u ltiv a r cé lu la s B E B V a lo g é n ica s , se u sa ron los m e d io s R P M i q ue con ten ía n FB S al 10 %, 100 U /m l de p en ic ilin a y 100 |ig /m l de e s tre p to m ic in a (L ife T e ch n o lo g ie s ), 10 |ig /m l de g e n ta m ic in a (C e llG ro ), y L -g lu ta m in a 2 m M en lu g a r de los m e d io s de c é lu la s B.
C la s ifica c ió n , e xp a n s ió n y c lo n a c ió n de cé lu la s T
Se u sa ron BD F A C S A ria 11 u y BD F A C S Ja zz en to d o s los e xp e rim e n to s que re qu irie ro n c la s ifica c ió n ce lu la r. En los e xp e rim e n to s ind icad os , las cé lu la s T c la s if ica d a s se e xp a n d ie ro n u sa n d o cé lu la s a lim e n ta d o ra s a lo g é n ica s irra d ia d a s en e xce so (4000 rad) (g ru p o de tre s m u e s tra s de le u ca fé re s is de d o n a n te s d ife re n te s ) en m e d io s 50 /50 q ue co n te n ía n 30 ng/m l de a n ticu e rp o a n ti-C D 3 (O K T 3 ) y 3000 U I/m l de IL-2. La c lo n a c ió n de d ilu c ió n lim ita n te se llevó a cabo en p la cas de fo n d o re d o n d o de 96 p oc illos u sa nd o las co n d ic io n e s de e s tim u la c ió n a n te r io re s con 5e4 cé lu la s a lim e n ta d o ra s por p oc illo y 1-2 cé lu la s T p or poc illo . Los m e d io s se in te rca m b ia ro n co m e n za n d o a p ro x im a d a m e n te 1 se m a n a d e sp u é s de la e s tim u la c ió n y lue g o cad a d os d ías o se g ú n se re qu is ie ra . Las cé lu las se u sa ron n o rm a lm e n te en e nsayo s, o se e xp a n d ie ro n a d ic io n a lm e n te , a p ro x im a d a m e n te 2 -3 se m a n a s d e sp u é s de la e s tim u la c ió n in ic ia l.
E n sa yo s de cu ltivo con jun to : E L IS P O T y E L IS A de IFN-y, c ito m e tría de flu jo para m a rca d o re s de a c tiva c ió n de su p e rfic ie ce lu la r, y t in c ió n in tra c e lu la r de c ito c in a s (IC S )
C u a n d o se u sa ron DC co m o A P C , se u sa ron de a p ro x im a d a m e n te 3 ,5 x 104 a 7 x 104 DC p o r p oc illo de una p laca p la n a o de fo n d o re do n do de 96 poc illos . C u a n d o se u sa ron cé lu la s B com o A P C , se u sa ron a p ro x im a d a m e n te 2 x 105 cé lu la s p or p oc ilio de una p laca de fo n d o re do n do de 96 poc ilios . En e n sa yo s E L IS P O T , se u sa ron 1 x 103 a 1 x 104 cé lu la s T e fe c to ra s por poc illo , y en e n sa yo s de c ito m e tría de flu jo , se u sa ron 1 x 105 cé lu la s T e fe c to ra s p o r poc illo . Las cé lu la s T se d e sco n g e la ro n n o rm a lm e n te y se d e ja ron re p o sa r en m e d io s 50 /50 q ue co n te n ía n IL-2 (3000 U I/m l de IL-2) d u ra n te d os d ía s y lue g o se lava ro n con P B S (3 v e ce s ) a n tes de los e n sa yo s de cu ltivo con jun to . T o d o s los cu ltivo s co n ju n to se re a liza ro n en a u se n c ia de c ito c in a s a ñ a d id a s e xó g e n a m e n te . P ara to d o s los e nsayo s, se usó O K T 3 u n ido a p laca (0,1 |ig /m l o 1 |ig /m l) com o con tro l pos itivo .
En e xp e rim e n to s q ue im p lica n a n ticu e rp o s de b lo q ue o de HLA, se u sa ron los s ig u ie n te s a n ticu e rp o s : pan -c lase -II (c lon: IV A 12), pan -c lase -I (c lon: W 6 /32 ), H L A -D R (c lon : H B 55), H L A -D P (c lon : B 7/21), y H L A -D Q (c lon : S P V -L3). Las cé lu la s se b lo q u e a ro n con 20 -50 |ig /m l del a n ticu e rp o in d ica d o d u ra n te 1-2 h a 37 °C, C O 2 al 5% a n te s del cu ltivo co n ju n to con cé lu la s T. Las T4 son cé lu la s T q ue se han tra n s d u c id o con un T C R re s tr in g id o a H LA -D R 4 q ue es re ac tivo fre n te a un e p íto p o en tiro s in a sa . La D M F 5 es una líne a de cé lu la s T re s tr in g id a a H LA -A 2 re ac tiva fre n te a M A R T -1. La 624 -C IIT A es una lín e a ce lu la r de m e la n o m a p o s itiva para H L A -D R 4 y H LA -A 2 q ue exp re sa de m a n e ra e s ta b le M H C -II d e b id o a la e xp re s ió n e c tó p ica de C IIT A (c la se II, M H C, tra n sa c tiva d o r), y es p os itiva p ara la e xp re s ió n de M A R T-1 y tiro s in asa .
P ara e n sa yo s E L IS P O T de IFN-y, en re sum e n, se tra ta ro n p re v ia m e n te p la cas E L IIP (M illip o re , M A IP S W U ) con 50 |il de e ta no l al 70 % p o r p oc illo d u ra n te 2 m in, se lava ron 3 v e ce s con PBS, y lue g o se re cu b rie ro n con 50 |il de a n ticu e rp o de ca p tu ra de IFN -y 10 |ig /m l (M ab te ch , c lon : 1 -D 1K ) y se in cu b a ro n d u ra n te la n oche en el frig o rífico . P ara co n tro le s de O K T 3, los p oc illos se re cu b rie ro n con una m e zc la de a n ticu e rp o de ca p tu ra de IFN - y (10 |ig /m l) y O K T 3 (1 |ig /m l). A n te s del cu ltivo con jun to , las p la cas se lava ro n 3 v e c e s con PBS, se g u id o de b lo q ue o con m e d io s 50 /50 d u ra n te al m e no s 1 h a te m p e ra tu ra a m b ie n te (TA ). D e sp u é s de 20 -24 h de cu ltivo con jun to , las cé lu la s se re tira ro n de la p laca, se lava ro n 6 v e ce s con P B S T w e e n -20 al 0 ,05% (P B S -T ), y d e sp u é s se incu ba ro n d u ra n te 2 h a T A con 100 |il/p o c illo de una d iso lu c ió n de a n ticu e rp o de d e te cc ió n de IFN -y a n ti-h u m a n o b io tin ila do 1 |ig /m l de f iltra d o de 0 ,22 |im (M ab te ch , c lon : 7 -B 6 -1 ). D espu és , la p laca se lavó 3 v e ce s con P B S -T , se g u id o de una in cu b a c ió n de 1 h con 100 | il/p o c illo de e s tre p ta v id in a -A L P (M a b te ch , C inc ina tti, O H, d ilu ido 1 :3000). D espués, la p laca se lavó 6 v e c e s con P B S se g u id o de d e sa rro llo con 100 | il/p o c illo de d iso lu c ió n de su s tra to de B C IP /N B T de f iltra d o de 0 ,45 |im (KPL, Inc.). La re acc ión se d e tu vo e n ju a g a n d o a fo n d o con a gu a fría del g rifo . Las p la cas E L IS P O T se e sca n e a ro n y se co n ta ro n u sa nd o un le c to r de p la cas Im m u n o S p o t y el so ftw a re a so c ia d o (C e llu la r T e ch n o lo g ie s , Ltd, S h a ke r H e ig h ts , O H).
La e xp re s ió n de los m a rca d o re s de a c tiva c ió n de cé lu las T O X 40 y 4 -1 B B se e va lu ó m e d ia n te c ito m e tría de f lu jo a a p ro x im a d a m e n te t = 22 -26 h d e sp u é s de la e s tim u la c ió n . En re sum e n , las cé lu la s se se d im e n ta ro n , se lava ron con ta m p ó n F A C S (IX P B S e n riq u e c id o con FB S al 1 % y E D T A 2 m M ), y d e sp u é s se tiñ e ro n con los a n ticu e rp o s a p ro p ia d o s d u ra n te a p ro x im a d a m e n te 30 m in, a 4 °C en la o scu rid a d . Las cé lu la s se lava ro n al m e no s una ve z con ta m p ó n F A C S a n tes de la a d q u is ic ió n en una c ito m e tría de flu jo BD F A C S C a n to II. T o d o s los d a tos se se le cc io n a ro n en cé lu la s in d iv id u a le s v iva s (PI nega tivo ).
La p rod u cc ión de c ito c in a s se e va lu ó u sa nd o tin c ió n de c ito c in a s in tra ce lu la re s (IC S ) y c ito m e tría de flu jo . En re sum e n , d e sp u é s se co m b in a ro n las cé lu la s d ia n a y e fe c to ra s en los p oc illos de una p laca de 96 poc illos , tan to G o lg iS to p co m o G o lg iP lu g se a ñ a d ie ro n al cu ltivo (B D B io sc ie n ce s ). Se u sa ron G o lg iS to p y G o lg iP lu g a 1/2 de la c o n ce n tra c ió n re co m e n d a d a p o r el fa b rica n te . A t = 6 h d e sp u é s de la e s tim u la c ió n , las cé lu la s se p roce sa ro n u sa n d o el k it C y to fix /C y to p e rm (B D B iosc ien ces , S an José , C A ) se g ú n las in s tru cc io n e s del fa b rica n te . En resum en, las cé lu la s se s e d im e n ta ro n , se lava ro n con ta m p ó n FA C S , y d e sp u é s se tiñ e ro n para m a rca d o re s de su p e rfic ie c e lu la r (d e sc rito s a n te rio rm e n te ). A co n tin u a c ió n , las cé lu la s se lava ro n 2 v e c e s con ta m p ó n F A C S an tes de la f ija c ió n y la p e rm e a b iliza c ió n . D espu és , las cé lu las se lava ro n con ta m p ó n P e rm /W a sh y se t iñ e ro n con a n ticu e rp o s co n tra c ito c in a s d u ra n te 30 m in, a 4 °C en la o scu rid a d . Las cé lu la s se lava ro n 2 v e c e s con ta m p ó n P e rm /W a sh y se re su sp e n d ie ro n en ta m p ó n F A C S a n tes de la a d q u is ic ió n en una c ito m e tría de flu jo F A C S C a n to II. T o d o s los d a tos de c ito m e tría de flu jo se a n a liza ro n u sa nd o el so ftw a re F L O W 10 (T re e S ta r Inc).
Se d e te c tó IF N -y en m u e s tra s de su e ro u sa nd o un k it E L IS A de IF N -y h u m a n o seg ún d ire c trice s del fa b rica n te (T h e rm o S c ien tific , W a lth a m , M A).
A n tic u e rp o s de c ito m e tría de flu jo
Se u sa ron los s ig u ie n te s a n ticu e rp o s a n ti-h u m a n o s va lo ra d o s para la tin c ió n de la s u p e rfic ie ce lu la r: C C R 7 -F IT C (c lon : 150503), C D 45 R O -P E -C y7 (c lon : U C H L1), C D 62 L -A P C (c lon : D R E G -56 ), C D 27 -A P C -H 7 (c lon : M -T 271), C D 4 -e flu o r 605 N C (c lon : O K T 4), C D 57 -F IT C (c lon: N K -1), C D 28 -P E -C y7 (c lon: C D 28.2 ), C D 127 -A P C (c lon: e B io R D R 5 ), C D 3 -A F 700 (c lon: U C H T 1), C D 4 -F IT C , P E -C y7 , A P C -H 7 (c lon: S K 3), C D 8 -P E -C y7 (c lon: SK I), VP22-PE (c lon: IM M U 546), V P 5.2 -P E (c lon: 36213 ), O X 40 -P E -C y7 o F ITC (c lon : B e r-A C T 35), 4 -1 B B -A P C (c lon : 4 B 4 -1), y C D 107 a -A P C -H 7 (c lon: H 4 A 3 ). T o d o s los a n ticu e rp o s e ran de BD B iosc ien ces , e xce p to C D 4 -e flu o r605 N C (e B io sc ie n ce ), V P 22-P E y Y P 5.2 -P E (B e ckm a n C ou lte r), y 4 -1 B B -A P C y O X 40 -P E -C y7 (B io L e g e n d ). Se u sa ron los s ig u ie n te s a n ticu e rp o s a n ti-h u m a n o s ó p tim a m e n te va lo ra d o s para la tin c ió n de c ito c in a s in tra ce lu la re s : IFN -y-F ITC (c lon : 4 S .B 3 ), IL -2 -A P C (c lon: M Q 1 -17 H 12 ), T N F -P e rC P C y 5.5 o A P C (c lon : M A b 11 ), IL -17 -P E (c lon: e B io 64 D E C 17 ), e IL -4 -P E -C y7 (c lon: 8D 4 -8 ). T o d o s los a n ticu e rp o s IC S fu e ro n de e B io sc ie n ce e xce p to IL -4 -P E C y7 (B D B iosc ien ce ). El k it IO M a rk B M a rk T C R V se usó para e va lu a r el re p e rto rio de T C R -V p.
S e cu e n c ia c ió n de la m u ta c ión de E R B B 2 IP
Se usó la se cu e n c ia c ió n de S a n g e r para v a lid a r la m u ta c ión de E R B B 2 IP e n co n tra d a p o r se cu e n c ia c ió n de e xo m a com p le to . El A R N to ta l se e x tra jo de cé lu la s T o te jid o s tu m o ra le s c o n g e la d o s a p res ión (b lo q u e O C T ) u sa nd o el m in i k it R N e asy (Q iag en ). El A R N to ta l se tra n s c rib ió in ve rsa m e n te a A D N c u sa nd o la tra n s c rip ta s a inve rsa T h e rm o S c rip t con ce b a d o re s o lig o -d T (L ife T e ch n o lo g ie s ). L ue go se u sa ron A D N c norm a l y tu m o ra l com o m o lde s en una P C R con los s ig u ie n te s c e b a d o re s E R B B 2 IP q ue fla n q u e a n la m u tac ión : d irec to de se q E R B B 2IP : 5 '-T G T T G A C T C A A C A G C C A C A G -3 ' (S E Q ID NO: 47); e in ve rso de se q E R B B 2 IP : 5 '-C T G G A C C A C T T T T C T G A G G G -3 ' (S E Q ID NO: 48). La A D N p o lim e ra sa de P hu s ion (T h e rm o S c ie n tific ) se usó con el p ro to co lo de 3 e tapas re co m e n d a d o con una te m p e ra tu ra de h ib rid ac ió n de 58 °C (15 se g u n d o s ) y una e x te n s ió n a 72 °C (30 seg un do s ). Los p ro d u c to s de P C R se a is la ro n m e d ia n te e le c tro fo re s is en gel de a g a ro sa e s tá n d a r y e x tra cc ió n en gel (C lo n te ch ). Los p ro d u c to s se s e cu e n c ia ro n d ire c ta m e n te u sa nd o los m ism o s ce b a d o re s de p C r (M ac ro ge n ).
P C R cu a n tita tiva
El A R N to ta l se e xtra jo de cé lu la s T o te jid o s tu m o ra le s c o n g e la d o s a p res ión (b lo q u e O C T ) u sa nd o el m in i kit R N e a sy (Q iag en , V en lo , P a íse s B a jos). El A R N to ta l se tra n s c rib ió in ve rsa m e n te a A D N c u sa nd o q S c rip t D N A c S u p e rm ix (Q u a n ta B iosc ien ces , G a ith e rsb u rg , M D). Se a d q u irie ro n co n ju n to s de ce b a d o re s y so n d a s T a q m a n e sp e c ífico s de g en es para la p -a c tin a h u m a n a (n.° de ca tá log o : 401846 ) y E R B B 2 IP (n.° de ca tá log o : 4331182 ) de L ife T e ch n o lo g ie s . La P C R cu a n tita tiva se llevó a cab o con T A Q M A N F a s t A d v a n c e d M a s te r M ix u sa nd o la m á qu ina 7500 F a st Real T im e P C R (a m b a s de A p p lie d B iosys te m s). La e sp e c ific id a d de los p ro d u c to s a m p lif ica d o s se ve r ific ó m e d ia n te e le c tro fo re s is e s tá n d a r en gel de a ga ro sa . T o d o s los c ic lo s u m bra l c a lcu la d o s (C t) fu e ro n 30 o in fe rio re s .
S e cu e n c ia c ió n e xh a u s tiva de T C R -V p
La se cu e n c ia c ió n e xh a u s tiva de T C R -V p se re a lizó p or im m u n o S E Q , A d a p tiv e B io te ch n o lo g ie s (S e a ttle , W A ) en A D N g e n ó m ico a is la d o de , cé lu la s T de sa n g re p e rifé rica , y te jid o tu m o ra l co n g e la d o u sa nd o el k it de sa n g re y te jid o D N e a sy (Q iag en ). El n ú m e ro to ta l de le c tu ra s de T C R p ro d u c tiva s p o r m u e s tra va r ió de 279.482 a 934.672. S o lo se usa ron re o rd e n a c io n e s de T C R p ro d u c tiva s en los cá lcu lo s de las fre cu e n c ia s de TC R .
S e cu e n c ia c ió n de T C R y co n s tru cc ió n del T C R re a c tivo a m u ta c ió n de E R B B 2 IP
Las cé lu la s T se se d im e n ta ro n y el A R N to ta l a is la d o (m in i k it R N easy, Q ia g en ). A con tin u a c ió n , el A R N to ta l se so m e tió a 5 'R A C E seg ún lo in d ica d o p o r el fa b ric a n te (k it de a m p lifica c ió n de A D N c S M A R T e r R A C E , C lo n te ch ) u sa nd o c e b a d o re s co n s ta n te s de ca d e n a T C R - a y P .El p ro g ra m a 1 del k it se usó para la PC R, con una m o d ifica c ió n en el tie m p o de e x te n s ió n (2 m in en lu g a r de 3 m in). Las se cu e n c ia s de los ce b a d o re s c o n s ta n te s de ca d e n a a y p son: T C R -a , 5 '-G C C A C A G C A C T G T G C T C T T G A A G T C C -3 ' (S E Q ID NO: 49); T C R -p , 5 '-C A G G C A G T A T C T G G A G T C A T T G A G -3 (S E Q ID NO: 50). Los p ro d u c to s de P C R de T C R se a is la ro n lue g o m e d ia n te e le c tro fo re s is en gel de a g a ro sa e s tá n d a r y e x tra cc ió n en gel (C lon tech ). Los p rod u cto s se s e cu e n c ia ro n d ire c ta m e n te o se c lo n a ro n T O P O -T A se g u id o de se cu e n c ia c ió n de co lo n ia s in d iv id u a le s (M ac ro ge n ). P ara la se cu e n c ia c ió n de c lo n e s de cé lu la s T V p22 con oc id os , se g e n e ró A D N c a p a rtir de A R N u sa nd o q S c rip t cD N A S u p e rm ix (Q u a n ta B io sc ien ces). E s tos A D N c se u sa ron lue g o com o m o lde s en una PC R u sa n d o el ce b a d o r co n s ta n te T C R -p (a rr iba ) y el c e b a d o r e sp e c ífico de V p22 : 5 '-C A C C A T G G A T A C C T G G C T C G T A T G C -3 ' (S E Q ID NO: 51). Los p ro d u c to s de P C R se a is la ro n m e d ia n te e le c tro fo re s is en gel de a g a ro sa e s tá n d a r y e x tra cc ió n en gel (C lo n te ch ). Los p ro d u c to s se s e cu e n c ia ro n d ire c ta m e n te (M a c ro g e n ) u sa nd o el c e b a d o r co n s ta n te de ca d e n a de T C R -p : 5 '- A T T C A C C C A C C A G C T C A G -3 ' (S E Q ID NO : 52).
La co n s tru cc ió n del T C R de m u ta c ió n de E R B B 2 IP V p 22 se re a lizó fu s io n a n d o las re g io n e s V -D -J de T C R -a V p22 con la ca d e n a co n s ta n te del T C R -a de ra tón, y las re g io n e s V -D -J de T C R -p V p 22 con las ca d e n a s c o n s ta n te s del T C R -p de ra tón . Las ca d e n a s a y p se se p a ra ro n p or un c o n e c to r S G S G P 2 A de fu rina . El uso de re g io n e s c o n s ta n te s de T C R de ra tón p ro m u e ve el e m p a re ja m ie n to del T C R in tro d u c id o y ta m b ié n fa c ilita la id e n tif ica c ió n de cé lu la s T tra n s d u c id a s p o s itiva m e n te p o r c ito m e tría de f lu jo u sa nd o un a n ticu e rp o e sp e c ífico para la ca d e n a T C R - p (e B io sc ie n ce ) La co n s tru cc ió n de T C R se s in te tizó y se c lon ó en el v e c to r re tro v ira l M SG V1 (G en e O rac le ).
T ra n sd u cc ió n de T C R de cé lu la s T de sa n g re p e rifé rica
Las m u e s tra s de a fé re s is a u tó lo g a se d e sco n g e la ro n y se fija ro n a 2 x 106 cé lu las /m l en m e d io s de cé lu la s T, que co n s is te n en una m e zc la 50 /50 de m e d io s de R PM I y A IM -V e n riq u e c id o s con su e ro h um a no o b te n id o in te rn a m e n te al 5 % , 10 |ig /m l de g e n ta m ic in a (C e llG ro ), 100 U /m l de p e n ic ilin a y 100 |ig /m l de e s tre p to m ic in a , 1,25 |ig /m l de a n fo te ric in a B (F u n g izo n e ) y L -g lu ta m in a 2 m M (to do s de L ife T e ch n o lo g ie s ). Se e s tim u la ro n 2 x 106 cé lu la s (1 m l) en una p laca de 24 p oc illos con 50 ng/m l de O K T 3 so lu b le (M ilte ny i B io te c) y 300 U I/m l de rhu IL -2 (C h iron ) d u ra n te 2 d ías a n tes de la tra n sd u cc ió n re tro v ira l. P ara g e n e ra r so b re n a d a n te s re tro v ira le s tra n s ito rio s , se cu ltiva ro n de m a ne ra co n ju n ta el v e c to r re tro v ira l M SG V1 q ue co d ifica el T C R e sp e c ífico de m u ta c ión de E R B B 2 IP p o s itiva para V p22 (1,5 | ig /p o c illo ) y el p lá sm id o de co d ifica c ió n de e n vo ltu ra R D 114 (0 ,75 |ig /p o c illo ) en la líne a c e lu la r de e m p a q u e ta m ie n to re tro v ira l 293 G P (1 x 106 cé lu la s p o r p oc illo de p la cas re cu b ie rta s con p o li-D -lis in a de 6 poc illos , se se m b ra ro n el d ía a n te s de la tra n s fe c c ió n ) u sa nd o lip o fe c ta m in a 2000 (L ife T e ch n o lo g ie s ). Los so b re n a d a n te s re tro v ira le s se re co g ie ro n a las 42 -48 h d e sp u é s de la tra n s fe cc ió n , se d ilu ye ro n 1:1 con m e d io s D M E M , y d e sp u é s se ce n trifu g a ro n so b re p la cas de 6 p oc illos tra ta d a s con cu ltivo no tisu la r re cu b ie rta s con re tro n e c tin a (10 |ig /m l, T a ka ra ), en 2.000 g d u ra n te 2 h a 32 °C. D e sp u é s se c e n tr ifu g a ro n cé lu la s T a c tiva d a s (2 x 106 p or poc illo , a 0 ,5 x 106 cé lu la s /m l en m e d io s de cé lu la s T q ue co n tie n e n IL -2) en las p la cas de re tro v iru s d u ra n te 10 m in u to s a 300 g. Las cé lu la s T a c tiva d a s se tra n s d u je ro n d u ra n te la noche , se re tira ro n de las p la cas y se cu ltiva ro n a d ic io n a lm e n te en m e d io s de cé lu las T q ue co n te n ía n IL-2. Los co n tro le s de tra n s d u c c ió n de m a n e ra s im u la d a y G F P se inc lu ye ro n en e xp e rim e n to s de tra n sd u cc ió n . Las cé lu la s se a n a liza ro n n o rm a lm e n te 10-14 d ías d e sp u é s de la tra n sd u cc ió n re tro v ira l.
E je m p lo 1
E ste e je m p lo m u e s tra un m é to d o para id e n tif ic a r uno o m ás g e n e s en el á c id o n u c le ico de una cé lu la can ce ro sa de un p ac ien te , co n te n ie n d o cad a gen una m u ta c ión e sp e c ífica de c á n ce r que co d ifica una s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados.
U na m u je r de 43 año s de e da d con co la n g io c a rc in o m a a m p lia m e n te m e ta s tá s ico (P a c ie n te (P t.) 3737) que p ro g re só a tra vé s de m ú ltip le s re g ím e n e s de q u im io te ra p ia se in sc rib ió en un p ro to co lo de te ra p ia a do p tiva de cé lu la s (A C T ) b asad a en T IL p ara p a c ie n te s con cá n ce re s g a s tro in te s tin a le s (G I). Las c a ra c te rís tica s c lín ica s del p a c ie n te 3737 se m u e s tra n en la ta b la 1.
T a b la 1
Sexo Edad Primario Sitios Terapia IL-2 Sitio de Estado HLA-I HLA-II metastásicos anterior antes recogida* ECOG*
F 43 Colangiocarcinoma intrahepático Pulmones, Cisplatino gemcitibina, No Pulmón 0 A*26 DRB10
(poco diferenciado) hígado gemcitibina, taxotere 405 B*38 DRB1 *1 502 B*52 DQB1*0 301 C*12 DQB1*0 601 DPB1*0 401 DPB1*1 0401
* S itio de re co g id a p ara g e n e ra c ió n de T IL y para se cu e n c ia c ió n de e xo m a com p le to .
E s ta d o fu n c io n a l: E C O G , G ru p o O n co ló g ico C o o p e ra tivo de la C os ta Este
Las m e tá s ta s is p u lm o n a re s se re seca ron y se usa ron com o fu e n te para la se cu e n c ia c ió n de e xo m a co m p le to y la g e n e ra c ió n de cé lu la s T para el tra ta m ie n to . La ta b la 2 m u e s tra las m u ta c io n e s s o m á tica s id e n tif ica d a s p o r la se cu e n c ia c ió n de e xo m a co m p le to de un n ódu lo p u lm o n a r m e ta s tá s ico del p ac ie n te 3737. Se e s tim ó q ue el n ódu lo tu m o ra l e ra a p ro x im a d a m e n te 70 % de tu m o r m e d ia n te a ná lis is p a to ló g ico de una se cc ió n te ñ id a con h e m a to x ilin a y e o s in a (H & E ). La se cu e n c ia c ió n de e xo m a co m p le to reve ló 26 m u ta c io n e s no s in ó n im a s (ta b la 2).
T a b la 2
Figure imgf000016_0001
Figure imgf000017_0001
E je m p lo 2
E ste e je m p lo m u e s tra un m é to d o para in d u c ir A P C a u tó lo g a s de un p ac ie n te para q ue p rese n te n la se c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s ; c u ltiv a r de m a n e ra co n ju n ta una p ob lac ión de cé lu la s T a u tó lo g a s del p a c ie n te con las A P C a u tó lo g a s que p re se n ta n la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta do s ; y s e le c c io n a r las cé lu la s T a u tó lo g a s que (a) se c u ltiva ro n de m a ne ra co n ju n ta con las A P C a u tó lo g a s que p re se n ta n la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s y (b) t ie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica p o r la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s p re se n ta d a en el co n te x to de una m o lé cu la de M H C e xp re sa d a p o r el pac ien te .
P ara cad a m u ta c ió n id e n tifica d a en el e je m p lo 1, se d ise ñ ó una co n s tru cc ió n de m in igé n co d ifica d a para el a m in o á c id o m u ta do f la n q u e a d o en cad a lado p o r 12 a m in o á c id o s de la p ro te ína e n d ó g e n a . S e s in te tiza ro n m ú ltip le s m in ig e n e s en tá n d e m para g e n e ra r c o n s tru cc io n e s (T M G ) de m in igé n en tá n d e m (ta b la 3). En la ta b la 3, el s u b ra ya d o ind ica a m in o á c id o s m u ta d o s y n e o se cu e n c ia s co d ifica d a s p o r m u ta c io n e s p u n tu a le s , o d e le c io n e s o in se rc io n e s de n u c le ó tid o s . Para m u ta c io n e s d o n a n te s de s itio de e m p a lm e (HLA-DOA y LONRF3), se d ise ña ro n tra n s c rito s de m in ig e n e s m u ta n te s que co n tin u a ro n en el in trón en d ire cc ió n 3 ’ has ta e l s ig u ie n te codón fin a liza d o r, b a sá n d o se en la su p o s ic ió n de q ue las m u ta c io n e s im p id ie ro n el co rte y e m p a lm e en ese s itio . No se e va lu ó la m u ta c ión a ce p to ra de s itio de e m p a lm e en DIP2C.
T a b la 3
Figure imgf000018_0001
Las c o n s tru cc io n e s de T M G se u sa ron luego co m o m o lde s p a ra la g e n e ra c ió n de A R N tra n sc rito in vitro (IV T ). A co n tin u a c ió n , cad a uno de e s to s A R N de T M G IVT se tra n s fe c tó in d iv id u a lm e n te en A P C a u tó lo g a s (D C ) seg u id o de un cu ltivo co n ju n to con T IL p a ra d e te rm in a r si a lg u n o de los a n tíg e n o s m u ta d o s p ro ce sa d o s y p re se n ta d o s se re co n o c ió p o r T lL . Se o b se rvó q ue 3737 -T IL fue ro n re a c tiva s a un a n tíg e n o m u ta do p re se n te en T m G -1, pe ro no T M G -2 o T M G -3 (fig u ra 1A). A d e m á s , la re a c tiv id a d p re d o m in ó en la p ob lac ión de c é lu la s T C D 4 com o lo d e m u e s tra la re gu lac ió n p or in c re m e n to de los m a rca d o re s de a c tiva c ió n O X 40 y 4 -1 B B (ta b la s 4 A y 4B). Las ta b la s 4 A y 4 B m u es tra n el p o rce n ta je de 3737 -T IL d e te c ta d o p o r c ito m e tría de flu jo q ue tie n e el fe n o tip o in d ica d o d e sp u é s del cu ltivo co n ju n to con d C cu lt iva d a s con el e s tim u la d o r no e sp e c ífico o K T 3 o DC tra n s fe c ta d a s con A R N de p ro te ín a flu o re sc e n te ve rd e (G FP ), o la co n s tru cc ió n de m in igé n en tá n d e m (T M G ) in d ica d a que cod ifica las d ive rsa s m u ta c io n e s id e n tif ica d a s p o r se cu e n c ia c ió n de e xo m a com p le to . Las cé lu la s tra n s fe c ta d a s de fo rm a s im u la d a se tra ta ro n con re ac tivo de tra n s fe c c ió n so lo s in a d ic ión de á c id o n uc le ico . Los d a tos se s e le cc io n a ro n en cé lu la s C D 3+ v ivas .
T a b la 4 A
Figure imgf000019_0001
T a b la 4B
Figure imgf000019_0002
A u n q u e se o b se rvó una re gu lac ió n por in c re m e n to de 4 -1B B en la p ob la c ió n de cé lu la s T n eg a tiva s para C D 4 (C D 8+ ), e s ta s cé lu la s se c la s ifica ro n y no se e nco n tró re a c tiv id a d fre n te al TM G . P ara d e te rm in a r cuá l de las 9 m u ta c io n e s en TM G -1 e s ta ba re co n o c ié n d o se p or 3737 -T IL , se s in te tiza ro n 9 c o n s tru cc io n e s de TM G -1 a d ic io n a le s , cada una co n te n ie n d o una re ve rs ió n de una de las m u ta c io n e s de vu e lta a la se cu e n c ia de tip o s ilve s tre . La re a c tiv id a d de 3737 -T IL con re sp e c to a TM G -1 se a nu ló so lo cu a n d o la m u ta c ió n de la p ro te ín a que in te ra c tú a con E R B B 2 (E R B B 2 IP ) se re v irtió de n ue vo a la se c u e n c ia de tip o s ilve s tre , lo q ue ind ica q ue los T IL re co n o c ie ro n e sp e c ífica m e n te la m u ta c ió n E R B B 2 IP E805G (fig u ra 1B).
La re sp u e s ta de cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ió n de E R B B 2 IP se ca ra c te r izó m o le cu la rm e n te . S e re a lizó un e nsayo E L IS P O T de IFN-y, y los re su lta d o s se m id ie ron a las 20 horas. Las 3737 -T IL de p a c ie n te se cu ltiva ro n de m a nera co n ju n ta con DC tra n s fe c ta d a s con TM G -1 q ue se hab ían in cu b a d o p re v ia m e n te s in nada, o los a n ticu e rp o s b lo q u e a d o re s de H L A in d ica d o s (fre n te a M H C -I, M H C -II, H LA -D P , H L A -D q o H LA -D R ) (fig u ra 2A). C om o con tro le s p ara el b lo q ue o de a n ticu e rp o s , cé lu la s T re a c tiva s a M A R T re s tr in g id a s a H L A -A 2 D M F 5 (fig u ra 2 B ) y las cé lu las T re a c tiva s a tiro s in a sa re s tr in g id a s a H LA -D R T 4 (fig u ra 2 C ) se cu ltiva ro n de m a n e ra con ju n ta con la líne a ce lu la r de m e la n o m a 624 -C IIT A p o s itiva a tiro s in a sa y M A R T q ue se hab ía in cu b a d o p re v ia m e n te s in nada, o los a n ticu e rp o s b lo q u e a d o re s de H L A ind icad os . La re spu es ta de 3737 -T IL se b lo q u e ó p or a n ticu e rp o s a n ti-H L A -D Q (fig u ra 2A).
Se re a lizó o tro e n sa yo E L IS P O T de IF N -y los re su lta d o s se m id ie ron a las 20 horas. Las 3737 -T IL de p ac ie n te se cu ltiva ro n de m a ne ra co n ju n ta con cé lu la s B a u tó lo g a s o cé lu la s B E B V a lo g é n ica s p a rc ia lm e n te e m p a re ja d a s en el locus H LA -D Q a los q ue se ha a d m in is tra d o m e d ia n te p u lsos d u ra n te la n oche D M SO , A L K m u ta d o (m ut) o p é p tid o s la rgo s E R B B 2 IP 25 -A A m u t (fig u ra 2D).
Se re a lizó o tro e n sa yo E L IS P O T de IFN - y, los re su lta d o s se m id ie ron a las 20 horas. Las 3737 -T IL de p a c ie n te se cu ltiva ro n de m a ne ra co n ju n ta con cé lu la s B a u tó lo g a s a las q ue se ha a d m in is tra d o m e d ia n te p u lsos d u ra n te la n oche el p ép tid o E R B B 2 IP 25 -A A m ut, o los p é p tid o s E R B B 2 IP m u ta d o s tru n c a d o s in d ica d o s (fig u ra 2E).
C o m o se m u e s tra en las fig u ra s 2 A -2E , la re spu es ta de 3737 -T IL se re s tr in g ió por el a le lo H L A -D Q B 1*0601 y el e p íto p o m ín im o se loca lizó d en tro de la se cu e n c ia de 13 a m in o á c id o s N S K E E T G H L E N G N (S E Q ID NO: 29).
E je m p lo 3
E ste e je m p lo d e m u e s tra que las cé lu la s T de sa n g re p e rifé rica de re p e rto rio a b ie rto a u tó lo g a s m o d ifica d a s g e n é tica m e n te con la ca d e n a de T C R -V p 22 de las cé lu la s T C D 4 e sp e c ífica s de E R B B 2 IP id e n tifica d a s en el e je m p lo 2 e m p a re ja d a s con su ca d e n a a co n fir ie ro n re a c tiv id a d e sp e c ífica al p ép tid o E R B B 2 IP m u tado .
La c a p a c id a d de c lo n a c ió n de las cé lu la s T C D 4 e sp e c ífica s de E R B B 2 IP m u ta d a s id e n tif ica d a s en el e je m p lo 2 se ca ra c te r iza ro n c la s if icá n d o la s d e sp u é s de la a c tiva c ió n e sp e c ífica de a n tíg e n o , u sa n d o O X 40 com o m a rc a d o r de a c tiva c ió n . E s tas cé lu la s se e xp a n d ie ro n e n to n ce s en m asa y se c lo n a ro n m e d ia n te d ilu c ió n lim itan te . Un e s tu d io b asad o en c ito m e tría de flu jo de l re p e rto rio de T C R -V p d e m o s tró que la p o b la c ió n e xp a n d id a en m a sa e ra > 95% de V p 22 , y que 10/11 c lo n e s e va lu a d o s e ran p u ra m e n te V p 22 . El a n á lis is de la se cu e n c ia de T C R re ve ló la m ism a se cu e n c ia V -D -J de T C R p en 6 /6 c lo n e s V p 22 so m e tid o a p rue b a (ta b la 5), m o s tra n d o q ue la m a yo ría de las cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ió n E R B B 2 IP e s ta ba co m p u e s ta p o r un c lon de cé lu la s T V p 22 d om in an te .
T a b la 5
Figure imgf000020_0001
Los c lo n e s de cé lu la s T que e xp re sa n e ste T C R Vp22 p ro d u je ro n e sp e c ífica m e n te la c ito c in a IF N -y tra s la e s tim u la c ió n con el pép tid o E R B B 2 IP m u ta do (ta b la 6). Los c lo n e s C D 4 V p 22 se cu ltiva ro n de m a n e ra co n ju n ta d u ra n te 6 ho ra s con O K T 3 o con cé lu la s B a u tó lo g a s a las que se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos d u ra n te la n oche p é p tid o s la rgo s E R B B 2 IP 25 -A A m u t , A L K (m ut) m u ta do o E R B B 2 IP de tipo s ilve s tre (w t),. La ta b la 6 m u es tra el p o rce n ta je de c lo n e s C D 4 V p 22 y V p 22 - que p rod u ce n IF N - y in tra c e lu la r ( IF N - y +) o no p rod u ce n IF N - y in tra c e lu la r ( IF N - y-) tra s el cu ltivo co n ju n to m e d id o p o r c ito m e tría de flu jo . Los d a tos son re p re se n ta tivo s de 2 c lo n e s que co m p a rte n la m ism a se cu e n c ia T C R -V p .
T a b la 6
Figure imgf000020_0002
A d e m á s , las cé lu la s T de sa n g re p e rifé rica de re p e rto rio a b ie rto a u tó lo g a s g e n é tica m e n te m o d ifica d a s con esta ca d e n a de T C R -V p22 e m p a re ja d a con su ca d e n a a (ta b la 7) co n fir ie ro n re a c tiv id a d e sp e c ífica a l p ép tid o E R B B 2IP m u ta do (ta b la s 8 A y 8 B ),d e m o s tra n d o que e ste T C R re co n o c ió e sp e c ífica m e n te la m u ta c ión E r B b 2 IP E805G. Se tra n sd u je ro n cé lu la s T de sa n g re p e rifé rica de re p e rto rio a b ie rto a u tó lo g a s (T d) con el T C R d e riva d o de l c lon V p 22 (ta b la 8A), o se tra ta ro n con re ac tivo de tra n sd u cc ió n so lo s in a d ic ión de á c id o n u c le ico (s im u la d o ) (tab la 8B), y lue g o se e va lu ó la re a c tiv id a d com o se d e sc rib e para la ta b la 6. Las re g io n e s co n s ta n te s de T C R V p 22 e n d ó g e n a s se in te rca m b ia ro n con re g io n e s c o n s ta n te s de ra tón , p e rm itie n d o la d e te cc ió n de l T C R in tro d u c id o u sando a n ticu e rp o s fre n te a la reg ión co n s ta n te de T C R p de ra tón (m T C R p). S e usó O K T 3 un id o a p la ca co m o con tro l en to d o s los e nsayo s. Las ta b la s 8 A y 8B m u e s tra n el p o rce n ta je de cé lu la s m T C R p y m T C R p - q ue p ro d u ce n IF N -y in tra c e lu la r (IF N -y+) o no p ro d u ce n IF N -y in tra c e lu la r (IF N -y-) ta l com o se m id e p o r c ito m e tría de flu jo .
T a b la 7
Figure imgf000021_0001
T a b la 8 A
Figure imgf000021_0002
T a b la 8B
Figure imgf000021_0003
E je m p lo c o m p a ra tiv o 4
E ste e je m p lo m u e s tra un m é to d o para tra ta r el cá n c e r u sa n d o las cé lu la s a u tó lo g a s id e n tif ic a d a s en el e je m p lo 2. El p a c ie n te 3737 se so m e tió a una tra n s fe re n c ia a d o p tiva de 42 ,4 m il m illo n e s de T IL que co n te n ía n cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ión E R B B 2 IP C D 4 se g u id o de cu a tro d o s is de IL -2 para m e jo ra r la p ro life ra c ió n y fu n c ió n de las cé lu la s T. P ara el tra ta m ie n to , el p a c ie n te 3737 se so m e tió a una re secc ión de le s io n e s p u lm o n a re s . Los tu m o re s se tro ce a ro n lue g o en p e q u e ñ o s fra g m e n to s y se in cu b a ro n con IL -2 de d os is a lta para e x p a n d ir los lin fo c ito s in filtra n te s de tu m o r (T IL). D espu és de una e xp a n s ió n in ic ia l de los n ú m e ro s de cé lu la s en iL-2, los n ú m e ro s de cu ltivo s de T IL s e le cc io n a d o s se e xp a n d ie ro n a d ic io n a lm e n te d u ra n te 2 s e m a n a s u sa n d o un p ro to co lo de e xp a n s ió n rá p id a (R E P ) in c lu ye n d o cé lu la s a lim e n ta d o ra s de s a n g re p e rifé rica a lo g é n ica s irra d ia d a s , O K T 3 e IL-2. A n te s de la in fu s ió n ce lu la r, el p a c ie n te se a co n d ic io n ó p re v ia m e n te con c ic lo fo s fa m id a (C T X : 60 m g /kg , una v e z al d ía d u ra n te d os d ía s ) se g u id o de flu d a ra b in a (F lu: 25 m g /m 2 d u ra n te 5 d ías). Las 3737 -T IL de p ac ien te in c lu ye ro n 42 ,4 m il m illo n e s de T IL q ue co n te n ía n m ás de 10 m il m illo n e s (25 % ) de cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ión de E R B B 2 IP , y se a d m in is tró el d ía 0, se g u id o de IL -2 (A ld e s le u c in a , 7 ,2 e5 U I/kg ) cad a 8 horas. El p a c ie n te rec ib ió un to ta l de 4 d os is de IL-2.
S e cu ltiva ro n de m a n e ra co n ju n ta 3737 -T IL con D C tra n s fe c ta d a s con TM G -1 o T M G -1 que co d ifica n la re ve rs ió n de E R B B 2 IP de tip o s ilve s tre (w t), y se usó c ito m e tría de flu jo para e va lu a r la e xp re s ió n de O X 40 y V p 22 en cé lu las T C D 4 a las 24 ho ra s tra s la e s tim u la c ió n . La e s tim u la c ió n de O K T 3 u n id o a la p laca se usó com o con tro l pos itivo . El a n á lis is de c ito m e tría de flu jo d e m o stró q ue a p ro x im a d a m e n te el 25 % de to d o el p ro d u c to de 3737 -T IL a d m in is tra d o e s ta b a co m p u e s to p o r las cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ión V p 22 (fig u ra 3A, ta b la 9), igua l a la in fu s ió n de m ás de 10 mil m illo n e s de cé lu la s T C D 4 e sp e c ífica s de m u ta c ión E R B B 2IP . La ta b la 9 m u e s tra el p o rce n ta je de cé lu la s V p 22 y V p 22 - q ue e xp re sa n O X 40 (O X 40 ) o no e xp re sa n O X 40 (O X 40 -) ta l co m o se m ide por c ito m e tría de flu jo .
Se re a lizó un e n sa yo E L IS A de IFN -y en m u e s tra s de su e ro del p ac ien te 3737 an tes y d e sp u é s de la tra n s fe re n c ia a d o p tiva de cé lu la s de 3737 -T IL . Los re su lta d o s se m u e s tra n en la fig u ra 3B. C om o se m u e s tra en la fig u ra 3B, se d e te c ta ro n n ive les e le va d o s de IFN -y en el su e ro del p a c ie n te d u ra n te los p rim e ro s c inco d ías d e sp u é s de la in fu s ió n ce lu la r.
A u n q u e el p a c ie n te te n ía e v id e n c ia c la ra de e n fe rm e d a d p ro g re s iva a n tes de la in fu s ió n ce lu la r, se o bse rvó re g re s ió n tu m o ra l en los dos m e se s de se g u im ie n to , y to d a s las le s io n e s p u lm o n a re s y h e p á tica s d ia n a co n tin u a ro n re tro ce d ie n d o , a lca n za n d o una re d u cc ió n m á x im a del 30% a los 7 m e se s d e sp u é s del tra ta m ie n to (fig u ra 3C). El p a c ie n te e xp e rim e n tó e s ta b iliza c ió n de la e n fe rm e d a d d u ra n te a p ro x im a d a m e n te 13 m e se s d e sp u é s de la in fu s ió n ce lu la r, d e sp u é s de lo cua l se o b se rvó p ro g re s ió n de la e n fe rm e d a d so lo en los p u lm o n e s pero no en el h ígado.
T a b la 9
Figure imgf000022_0001
E je m p lo 5
E ste e je m p lo d e m u e s tra el fe n o tip o in vitro y la fu n c ió n de las cé lu la s del e je m p lo 4.
P ara d e te rm in a r si hab ía e v id e n c ia de que las cé lu las T re a c tiva s a m u ta c ión de E R B B 2 IP C D 4 d e se m p e ñ a ro n un papel en la e s ta b iliza c ió n de la e n fe rm e d a d , se e va lua ro n el fe n o tip o in vitro y la fu n c ió n de las cé lu las . Se cu ltiva ro n de m a n e ra co n ju n ta 3737 -T IL d u ra n te 6 hora s con cé lu la s B a u tó lo g a s a las q ue se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos d u ra n te la n oche E R B B 2 IP de tip o s ilve s tre (w t), A L K m u ta d o (m ut) o p é p tid o s la rgo s E R B B 2 IP 25 -A A mut. S e usó c ito m e tría de f lu jo para e va lu a r la e xp re s ió n de V p22 y para d e te c ta r la p rod u cc ió n in tra c e lu la r de IFN -y (ta b la 10A), fa c to r de n e c ro s is tu m o ra l (T N F ) (ta b la 10B), y IL -2 (ta b la 10C ) en la p ob lac ión de C D 4+. El p o rce n ta je de cé lu la s que tie n e n los fe n o tip o s in d ica d o s se m u es tra en las ta b la s 10A -10C . La ta b la 10D v isu a liz a el p o rce n ta je de cé lu la s V p22 q ue e xp re sa n el n úm e ro in d ica d o de c ito c ina s . S e e n co n tró q ue las cé lu la s T C D 4 re a c tiva s a m u ta c ión de E R B B 2 IP V p22 e ran cé lu la s Th1 p o lifu n c io n a le s , ya que la e s tim u la c ió n con el p ép tid o E R B B 2 IP m u ta do ind u jo la e xp re s ió n de m a n e ra co n ju n ta ro b u s ta de IF N -y , T N F y IL -2 (ta b la s 10A -10C ), pero poca o n in g u n a de IL -4 o IL-17.
T a b la 10A
Figure imgf000022_0003
T a b la 10B
Figure imgf000022_0004
T a b la 10C
Figure imgf000022_0002
Figure imgf000023_0002
T a b la 10D
Figure imgf000023_0003
La ca ra c te r iza c ió n fe n o típ ic a a d ic io n a l re ve ló q ue e s ta s cé lu la s e ran p re d o m in a n te m e n te cé lu la s T C D 4 de m e m o ria e fe c to ra s con p o ten c ia l c ito lítico (ta b la s 11 y 12). Las 3737 -T IL de p a c ie n te se e va lu a ro n m e d ia n te c ito m e tría de flu jo para d e te rm in a r la e xp re s ió n de V p22 (q u e re p re se n ta cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ión de E R B B 2 IP ) y los m a rca d o re s de d ife re n c ia c ió n de cé lu la s T c D28, C D 45R O , C D 57, C C R 7, C D 127 , C D 62 L y C D 27. L os d a tos se se le cc io n a ro n a p a rtir de cé lu la s C D 3 C D 4 v iva s . Las se le cc io n e s de cu a d ra n te s p os itivo s y n e g a tivo s se e s ta b le c ie ro n u sa nd o cé lu la s s in te ñ ir o te ñ id a s con iso tipo . El p o rce n ta je de cé lu la s q ue tie n e n los fe n o tip o s in d ica d o s se m u es tra en la ta b la 11. S e in c lu ye ro n cé lu la s de sa n g re p e rifé rica h um a na (que con ten ía n cé lu la s T de to d a s las fa se s de d ife re n c ia c ió n ) en e xp e rim e n to s para g a ra n tiz a r que los a n tic u e rp o s esta ba n fu n c io n a n d o .
T a b la 11
Figure imgf000023_0004
Las 3737 -T IL de p ac ie n te se cu ltiva ro n de m a ne ra co n ju n ta d u ra n te 6 hora s con O K T 3 o cé lu la s B a u tó lo g a s a las que se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos d u ra n te la n oche E R B B 2 IP de tip o s ilve s tre (w t), A L K m u ta d o (m ut) o p ép tid os la rg o s E R B B 2 IP 25 -A A m u ta do s . Se a ñ a d ie ro n a n ticu e rp o s e sp e c ífico s para el m a rca d o r de d e sg ra n u la c ió n C D 107 a al co m ie n zo del cu ltivo con jun to . Se usó c ito m e tría de flu jo para e va lu a r la e xp re s ió n de V p 22 y para d e te c ta r la m o v iliza c ió n de su p e rfic ie ce lu la r de C D 107 a. Los d a tos se s e le cc io n a ro n en la p ob la c ió n de C D 4+. El p o rce n ta je de cé lu la s q ue tie n e n los fe n o tip o s in d ica d o s se m u e s tra en la ta b la 12.
T a b la 12
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
T a m b ié n se a p re c ió q ue e x is tía una p ob lac ión m e n o r de cé lu la s T C D 4 re a c tiva s a m u ta c ión de E R B B 2 IP neg a tiva para V p22 p re se n te s en 3737 -T IL (ta b la s 9 y 10). E s ta s cé lu la s n e g a tiva s para V p22 se c la s ifica ro n m e d ia n te FA C S y d e sp u é s se d e ja ron re p o sa r en m e d io s que co n te n ía n IL -2 d u ra n te 2 d ías a n tes de cu ltiva rse de m a ne ra con ju n ta con cé lu la s B a u tó lo g a s a las q ue se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos d u ra n te la n oche E R B B 2 IP de tip o s ilve s tre (w t), A L K m u ta do (m ut) o p é p tid o s la rg o s E R B B 2 IP 25 -A A m u tados. S e usó c ito m e tría de f lu jo para e va lu a r la e xp re s ió n de V p22 y para d e te c ta r la p rod u cc ión in tra c e lu la r de IL-2 (ta b la 13C ), T N F (ta b la 13B), e IFN -y (ta b la 13A) en la p ob lac ión de C D 4 a las 6 hora s (h) d e sp u é s de la e s tim u la c ió n . El p o rce n ta je de cé lu la s que tie n e n los fe n o tip o s in d ica d o s se m u e s tra en las ta b la s 13A -13C .
T a b la 13A
Figure imgf000024_0004
T a b la 13B
Figure imgf000024_0005
T a b la 13C
Figure imgf000024_0006
Se usó c ito m e tría de f lu jo para e va lu a r la e xp re s ió n de O X 40 y V p22 en la p ob lac ión de C D 4 a las 24h tra s la e s tim u la c ió n . S e c la s ifica ro n las cé lu la s q ue re gu la ron p or in c re m e n to O X 40 y se e xp a n d ió el n úm e ro de cé lu las , y se a n a lizó el re p e rto rio de T C R -V p p or c ito m e tría de flu jo . Los re su lta d o s se m u es tra n en la fig u ra 3D. La c la s if ica c ió n de las cé lu la s n e g a tiva s para V p22 se g u id a de la a c tiva c ió n de e s ta s cé lu la s reve ló q ue uno o m ás c lo n o tip o s a d ic io n a le s re a c tivo s a e ste e p íto p o e s ta b a n p re se n te s en 3737 -T IL (ta b la s 13A -13C ), el c lo n o tip o m ás d o m in a n te de los cu a le s fu e V p5.2 (fig u ra 3D).
Las cé lu la s c la s if ica d a s d e sc rita s en la fig u ra 3D se cu ltiva ro n de m a n e ra co n ju n ta d u ra n te 6 h con cé lu la s B a u tó lo g a s a las q ue se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos d u ra n te la n oche E R B B 2 IP w t, A L K m u t o p é p tid o s la rgo s de E R B B 2 IP 25 -A A m ut. Se usó c ito m e tría de flu jo para e va lu a r la e xp re s ió n de V p5.2 y para d e te c ta r la p rod u cc ión in tra c e lu la r de IL -2 (ta b la 14C), T N F (ta b la 14B), e IFN -y (ta b la 14A) en la p ob lac ión de C D 4+. La ta b la 15 m uestra el p o rce n ta je de cé lu la s V p5.2+ q ue e xp re sa n el n úm e ro in d ica d o de c ito c ina s .
T a b la 14A
Figure imgf000024_0002
T a b la 14B
Figure imgf000024_0003
Figure imgf000025_0003
T a b la 14C
Figure imgf000025_0004
T a b la 15
Figure imgf000025_0002
S e c la s ifica ro n las cé lu la s n e g a tiva s p a ra V p22 q ue re g u la b a n p o r in c re m e n to O X 40 tra s la e s tim u la c ió n con E R B B 2 IP m u ta d o y se e xp a n d ió el n ú m e ro de cé lu las . A co n tin u a c ió n , se a is ló A R N de es ta s cé lu la s y se so m e tió a a m p lif ica c ió n rá p id a de e x tre m o s de A D N co m p le m e n ta rio s 5' (5 'R A C E ) con c e b a d o re s de ca d e n a co n s ta n te de T C R -p p a ra id e n tif ic a r las s e cu e n c ia s de T C R -V p e xp re sa d o . La c lo n a c ió n de T O P O -T A se re a lizó en los p ro d u c to s d e re a cc ió n en ca d e n a de la p o lim e ra sa (P C R ) y d e sp u é s se s e cu e n c ia ro n c o lo n ia s in d iv id u a le s . La c ito m e tría de flu jo d e m o s tró q ue el 40 -50 % de es ta s cé lu la s T fu e ro n V p 5.2 (T R B V 5 -6 ). P o r se cu e n c ia c ió n de S an g er, 3 /7 de las c o lo n ia s de T O P O -T A fu e ro n V p 5.2 (T R B V 5 -6 ) con la se c u e n c ia m o s tra d a en la ta b la 16. La ta b la 16 m u e s tra la s e cu e n c ia V -D -J de T C R -p m ás fre cu e n te de cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ió n de E R B B 2 IP n e g a tiva s p a ra V p22.
T a b la 16
Figure imgf000025_0001
La m a yo ría d e las cé lu la s V p 5.2 p ro d u je ro n m ú ltip le s c ito c in a s de una m a n e ra e sp e c ífica de a n tíg e n o (ta b la s 14A -14C , 15 y 16). T a m b ié n se a p re c ió q ue e x is tía una p o b la c ió n m e n o r de c é lu la s T C D 4 n e g a tiva s p a ra V p5.2 (y n e g a tiva s p a ra V p22 ) q ue re co n o c ie ro n E R B B 2 IP m u ta d o (ta b la s 14A -14 C y 15). P o r lo tan to , los T IL u sa do s p a ra tra ta r al p a c ie n te 3737 c o n te n ía n al m e no s tre s c lo n e s d e cé lu la s T C D 4 p o lifu n c io n a le s d ife re n te s que re co n o c ie ro n la m ism a m u ta c ió n en E R B B 2IP , m o s tra n d o q ue e s ta m u ta c ió n e ra a lta m e n te in m u n o g é n ica . E je m p lo 6
E ste e je m p lo d e m u e s tra la p e rs is te n c ia in vivo de las c é lu la s de l e je m p lo 4.
P ara d e te rm in a r si h a b ía e v id e n c ia de q ue las cé lu la s T re a c tiva s a m u ta c ió n de E R B B 2 IP C D 4 d e se m p e ñ a ro n un pape l en la e s ta b iliza c ió n de la e n fe rm e d a d , se e va lu ó la p e rs is te n c ia in vivo de las cé lu las . La s e cu e n c ia c ió n e xh a u s tiva de T C R -V p re ve ló q ue e s to s c lo n o tip o s e ran ra ro s o no d e te c ta b le s en la sa n g re p e rifé rica a n tes de A C T (fig u ra s 4 A y 4B). D iez d ías d e sp u é s de A C T , a m bo s c lo n e s e s ta ba n p re se n te s en m ás del 2% de las cé lu las T to ta le s en la sa n g re p erifé rica , pero d ism in u yó a m e no s del 0 ,3 % en el d ía 34 d e sp u é s de la in fu s ió n de cé lu las (fig u ra s 4 A y 4B). T re s m e tá s ta s is p u lm o na re s , q ue se re se ca ro n casi un a ño y m e d io d e sp u é s de la A C T , se in filtra ro n p or las cé lu la s T re ac tivas a m u ta c ión de E R B B 2 IP (fig u ra s 4 A y 4B), q ue m u es tra n q ue e s ta s cé lu las co n trib u ye n a la re g res ió n del c á n ce r y a la e s ta b iliza c ió n de la e n fe rm e d a d . El c lon re a c tivo a m u ta c ión de E R B B 2 IP V p 22 fu e el c lon m ás fre cu e n te d e te c ta d o en el n ód u lo tu m o ra l 3 (T u -3 -P o s t) y re p re se n tó casi el 8% del to ta l de cé lu la s T en el tu m o r (fig u ra s 4 A y 4B ), m ie n tra s q ue e ste c lon fu e el s e g u n d o y el d u o d é c im o m ás fre cu e n te en n ód u lo s tu m o ra le s 1 y 2, re sp e c tiva m e n te . El c lon re ac tivo a m u ta c ión de E R B B 2 IP V P5.2+ ta m b ié n se e n riq u e c ió en co m p a ra c ió n con su fre cu e n c ia en sa n g re en los tre s n ó d u lo s tu m o ra le s (fig u ra s 4 A y 4B). P o r lo tan to , el p ac ie n te 3737 e xp e rim e n tó re g res ió n tu m o ra l con e s ta b iliza c ió n de la e n fe rm e d a d d u ra n te m ás de un año d e sp u é s de re c ib ir m ás de 10 m il m illo n e s de cé lu la s Th1 p o lifu n c io n a le s e sp e c ífica s de m u ta c ió n de E R B B 2 IP q ue se in filtra ro n y p e rs is tie ro n en las le s io n e s m e ta s tá s ica s .
S e re a lizó el a n á lis is de P C R cu a n tita tiva de con re s tro tra n sc rip ta sa (R T -q P C R ) de la e xp re s ió n de ERBB2IP en el p a c ie n te 3737 -T IL (cé lu la s T ) y tu m o re s a n tes (T u -P re ) y d e sp u é s de la tra n s fe re n c ia a d o p tiva de cé lu las . T res le s io n e s p u lm o n a re s m e ta s tá s ica s s e p a ra d a s (Tu-1, -2, -3 -P o s t) se re se ca ro n a p ro x im a d a m e n te 17 m e se s d e sp u é s de la in fu s ió n ce lu la r. Los re su lta d o s se m u es tra n en la fig u ra 4C , y son re la tivo s a p-actina (ACTB). Un se g m e n to de 350 pare s de bases (pb) del gen E R B B 2 IP que co n tie n e la m u ta c ió n se a m p lificó p o r P C R a p a rtir de las m u e s tra s de A D N c d e sc rita s para la fig u ra 4C y se so m e tió a se cu e n c ia c ió n de S an g er. La lo ca liza c ió n de la m u ta c ió n fu e en la p os ic ió n de n u c le ó tid o 2414 de la s e cu e n c ia co d ifica n te , co rre sp o n d ie n te a un ca m b io en la p os ic ió n 805 de la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s . Se o b se rva ro n n ive les re la tiva m e n te a lto s de e xp re s ió n de ERBB2IP ta n to en las le s io n e s p u lm o n a re s o rig in a le s com o re cu rre n tes , seg ún lo d e te rm in a d o por R T -P C R c u a n tita tiva (fig u ra 4C ), y la se cu e n c ia c ió n de S a n g e r v a lid ó la p re se n c ia de la m u ta c ión de E R B B 2 IP en to d a s las les io ne s tu m o ra le s .
Se re a liza ro n a n á lis is in m u n o h is to q u ím ico s de in filtra d o s de cé lu la s T y e xp re s ió n de M H C a n te s y d e sp u é s de la A T C . Los tu m o re s d e sp u é s de A C T se re co g ie ro n a p ro x im a d a m e n te 17 m e se s d e sp u é s de la p rim e ra A C T . Se in c lu yó un con tro l p o s itivo (a m íg d a la ) para to d a s las tin c io n e s . El in filtra d o de cé lu la s T y la e xp re s ió n de M H C de los tu m o re s in situ se re sum e n en las ta b la s 17 y 18, re sp e c tiva m e n te .
T a b la 17
Figure imgf000026_0002
T a b la 18
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
E je m p lo 7
E ste e je m p lo d e m u e s tra la c o n trib u c ió n de las cé lu la s Th1 re a c tiva s a m u ta c ió n a la re spu es ta a n titum o ra l del e je m p lo 4.
P ara e va lu a r e sp e c ífica m e n te la co n trib u c ió n de las cé lu la s Th1 re a c tiva s a m u ta c ión a la re sp u e s ta a n titu m o ra l in vivo, se g e n e ró un p ro d u c to de T IL que e s ta b a c o m p u e s to por > 95 % de las cé lu la s Th1 re a c tiva s a m u ta c ión de E R B B 2 IP V p22 (a p ro x im a d a m e n te 120 mil m illo n e s de cé lu la s re a c tiva s a m u ta c ió n ) y se tra n s fir ió a d o p tiva m e n te al p a c ie n te 3737.
Se re a lizó un a n á lis is de c ito m e tría de flu jo del p ro d u c to de T IL usa do para el tra ta m ie n to de nuevo . La ta b la 19 m u es tra q ue d e sp u é s de s e le cc io n a r C D 3, el 97 % fu e ro n C D 4 /C D 8 -, y de estos, el 98 % fu e ro n V p22 d e sp u é s de la se le cc ió n a d ic io n a l de cé lu la s C D 4 (ta b la 20). Los T IL de tra ta m ie n to de nue vo se cu ltiva ro n de m a nera c o n ju n ta d u ra n te 6 h con cé lu la s B a u tó lo g a s a las q ue se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos d u ra n te la n oche p ép tid os la rg o s E R B B 2 IP 25 -A A de tip o s ilve s tre (w t) o m u ta d o s (m ut). S e usó c ito m e tría de flu jo para d e te c ta r la p rod u cc ión de T N F in tra c e lu la r en la p ob la c ió n de C D 4 (ta b la 20).
T a b la 19
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T a b la 20
Figure imgf000027_0002
De nuevo , el p ac ie n te e xp e rim e n tó una d ism in u c ió n en las le s io n e s d iana, p e ro a d ife re n c ia del p rim e r tra ta m ie n to , se o b se rvó re g res ió n tu m o ra l in c lu so en el p rim e r m es de se g u im ie n to y co n tin u ó a p a rtir del se g u im ie n to 4 m eses d e sp u é s del s e g u n d o tra ta m ie n to (fig u ra 4 d ). La re g res ió n tu m o ra l se co n tin u ó 8 m e se s d e sp u é s del se g u n d o tra ta m ie n to .
S e is m e se s d e sp u é s de la s e g u n d a a d m in is tra c ió n de cé lu las re a c tiva s a m u tac ión , se to m a ro n e xp lo ra c io n e s de to m o g ra fía c o m p u ta riza d a (T C ) de los p u lm o n e s del p a c ie n te 3737, y las im á g e n e s re su lta n te s se m u es tra n en las fig u ra s 7A -C . E s ta s im á g e n e s se c o m p a ra ro n con las to m a d a s a n tes de la se g u n d a a d m in is tra c ió n de cé lu las re a c tiva s a m u ta c ió n (fig u ra s 7D -7F ). C om o se m u e s tra en las fig u ra s 7 A -7F , se o b se rvó una d ism in u c ió n de a p ro x im a d a m e n te el 36 % en le s io n e s ca n ce ro sa s q ue p ro p o rc io n a ro n una re sp u e s ta parc ia l (R P ) p o r los c rite r ios de e va lu a c ió n de re sp u e s ta en tu m o re s s ó lid o s (R E C IS T ).
O ch o m e se s d e sp u é s de la s e g u n d a a d m in is tra c ió n de cé lu las re a c tiva s a m u ta c ión , se to m a ro n e xp lo ra c io n e s de to m o g ra fía p o r e m is ió n de p o s itro n e s (P E T ) del h íg ad o y los p u lm o ne s del p ac ie n te 3737. Se o b se rvó que las le s io n e s d ia n a co n tin u a ro n e n co g ié n d o se . El a n á lo g o de g lu co sa ra d io e tiq u e ta d o , FD G (flu o ro d e so x ig lu co sa ), se a d m in is tró para e va lu a r la ca p ta c ió n de g lu co sa p or los tu m o re s con el fin de m e d ir la a c tiv id a d m e ta b ó lica de los tu m o re s . Las e xp lo ra c io n e s de P E T no d e m o s tra ro n cap tac ión de g lu co sa en 2 le s io n e s h e p á tica s y so lo a lg o de ca p ta c ió n en las le s io n e s p u lm o na re s .
E je m p lo s 8 -10
Los m a te ria le s y m é to d o s para los e je m p lo s 8 -10 se e xp on en a con tin u a c ió n .
M a te ria le s del p a c ie n te y líne as ce lu la re s
T o d o s los m a te ria le s del p ac ien te se o b tu v ie ro n en el tra n s c u rso de un e n sa yo c lín ico a p ro b a d o p o r la Ju n ta de R ev is ión In s titu c io n a l del Ins titu to N ac ion a l del C án ce r. El p ac ie n te 2359 y el p ac ie n te 2591 se in sc rib ie ro n en e n sa yo s c lín ico s (ID de re g is tro de ensayo : N C T 00096382 e ID: N C T 00335127 , re sp e c tiva m e n te ) q ue se han d e sc rito en el d o cu m e n to de D ud ley et al., J. C lin . O nco l., 26: 5233 -9 (2008 ). Los p ac ie n te s se s o m e tie ro n a re se cc io n e s a p a rtir de las cu a le s se e s ta b le c ie ro n ta n to una líne a de T IL com o una línea de cé lu la s tum o ra le s . Los T IL u sa do s para e ste e s tu d io se g e n e ra ro n m e d ia n te m é to d o s d e sc rito s en el d o cu m e n to de D ud ley et al., J. Im m u n o th e r., 26: 332 -42 (2003 ). En re sum e n, se e x tirp a ro n fra g m e n to s tu m o ra le s y se cu ltiva ron en m e d io s que co n te n ía n IL-2. Los n ú m e ro s de cu ltivo s de T IL q ue se e xp a n d ie ro n se c rib a ro n para el re co n o c im ie n to de tu m o re s a u tó lo g o s o con H LA co m p a tib le , y los n ú m e ro s de T IL re a c tivo s se e xp a n d ió u tiliza n d o un p ro to co lo de e xp an s ión rá p ida (R E P ) con IL-2, a n ticu e rp o a n ti-C D 3 y cé lu la s a lim e n ta d o ra s irra d ia d a s a g ra n d e s c a n tid a d e s p ara la in fu s ió n del p ac ie n te (R idde ll etal., S c ien ce , 257 : 238-41 (1992 )). U na p eq u e ñ a p arte de los T IL se so m e tie ro n a un se g u n d o REP. P ara e n sa yo s de cu ltivo con jun to , las cé lu la s T y las cé lu la s tu m o ra le s se cu ltiva ro n en una p rop o rc ión de 1:1 en una p laca de 96 p oc illos con 200 | iL de m e d io s (m e d io s A IM -V e n riq u e c id o s con 5% de su e ro hum a no ) d u ra n te 16 hora s (h).
P ara e va lu a r la re a c tiv id a d a n tig é n ica de los T IL con a c tiv id a d c lín ica , se e s tu d ia ro n d os p a c ie n te s con m e la n o m a m e ta s tá s ico q ue e xp e rim e n ta ro n re sp u e s ta s co m p le ta s d u ra d e ra s a la te ra p ia a d o p tiva de T IL. El p ac ie n te 2359 te n ía un m e la n o m a cu tá n e o p rim a rio en la ro d illa d e re ch a que h izo m e tá s ta s is en el m uslo , g a n g lio s lin fá tico s ilíaco e ing u ina l. E ste in d iv id u o e xp e rim e n tó una re g res ió n co m p le ta de to d a s las le s io n e s m e ta s tá s ica s en re spu es ta a la tra n s fe re n c ia a u tó lo g a de T IL que e s tu vo en cu rso d u ra n te m á s de o ch o a ño s d e sp u é s del tra ta m ie n to . El p a c ie n te 2591 te n ía un m e la n o m a p rim a rio de la e sp a ld a q ue h izo m e tá s ta s is en la p ared a b d o m in a l, g a n g lio s lin fá tico s m e se n té rico s , co lon dere cho , y g a n g lio s lin fá tico s s u p ra c la v icu la re s . E s te in d iv id u o e xp e rim e n tó una re g res ió n co m p le ta de to d a s las le s io n e s m e ta s tá s ica s en re sp u e s ta a la tra n s fe re n c ia a u tó lo g a de T IL y p e rm a n e c ió lib re de e n fe rm e d a d n ue ve a ños d e sp u é s del tra ta m ie n to .
S e cu e n c ia c ió n de e xo m a co m p le to
El m é to do se ha d e sc rito en el d o cu m e n to de R o b b in s et al., Nat. M ed., 19: 747 -52 (2013 ). Se re a liza ro n pu rificac ió n de A D N g en ó m ico , co n s tru cc ió n de b ib lio te ca s , ca p tu ra de e xo m a de a p ro x im a d a m e n te 20.000 g en es co d ifica n te s y se cu e n c ia c ió n de p róx im a g e n e ra c ió n de m u e s tra s tu m o ra le s y n o rm a le s en P erson a l G e n o m e D ia g n o s tics (B a ltim o re , M D). En re sum e n, el A D N g e n ó m ico de las m u e s tra s tu m o ra le s y n o rm a le s se fra g m e n tó y se usó para la co n s tru cc ió n de la b ib lio te ca Illu m in a T R U S E Q (Illu m ina , S an D iego, CA). Las re g io n e s e xó n ica s se cap tu ra ro n en d iso lu c ió n u sa nd o el k it A g ile n t S U R E S E L E C T 50 M b (ve rs ión 3) de a cu e rd o con las in s tru cc io n e s del fa b rica n te (A g ilen t, S an ta C lara , CA). Se re a lizó se cu e n c ia c ió n de e x tre m o s e m p a re ja d o s , d an do com o re su lta d o 100 bases de cad a e x tre m o de cad a fra g m e n to , u sa nd o un a n a liza d o r g e n ó m ico H IS E Q 2000 (Illu m ina ). Los d a tos de s e cu e n c ia se m a pe aron con re sp e c to a la s e cu e n c ia del g e n o m a h u m a n o de re fe ren c ia , y se d e te rm in a ro n las a lte ra c io n e s de se cu e n c ia p or co m p a ra c ió n de m ás de 50 m illo n e s de b ases de tu m o r y A D N norm a l. Se o b tuv ie ro n m ás de 8 m il m illo n e s de b ases de d a tos de se cu e n c ia para cad a m u es tra , y una fra cc ió n a lta de las b ases era de las re g io n e s co d ifica n te s ca p tu ra d a s . Se a n a liza ro n m ás de 43 m illo n e s de b ases de A D N d ia n a en las m u e s tra s tu m o ra le s y n orm a le s , y se o b tu vo un p ro m e d io de 42-51 le c tu ra s en cada base en las m u e s tra s de A D N norm a l y tum o ra l.
Los a n á lis is b io in fo rm á tico s se lleva ro n a cabo p or P e rson a l G e n o m e D ia g n o s tic s y el G e n o m e T e ch n o lo g y A cce ss C en te r, S e rv ic io s G e n ó m ico s y P a to ló g ico s de la U n ive rs id a d de M e d ic in a de W a sh in g to n . Las e tiq u e ta s se a lin e a ro n con la se cu e n c ia de re fe re n c ia del g e n o m a h um a no (h g18 ) u sa n d o el a lg o ritm o E LA N D del so ftw a re C A S A V A 1.6 (Illu m ina ). El filtro de a b s tin e n c ia del so ftw a re B A S E C A L L de Illum in a se usó para s e le cc io n a r le c tu ra s de se cu e n c ia para a n á lis is p os te rio re s . S e a p licó el a lg o ritm o E L A N D v2 del so ftw a re C A S A V A 1.6 p ara id e n tif ica r m u ta c io n e s p u n tu a le s e in se rc io n e s y d e le c io n e s p eq ue ña s. Los p o lim o rfism o s c o n o c id o s re g is tra d o s en d bS N P se e lim in a ro n del a ná lis is . Las m u ta c io n e s s o m á tica s p o te n c ia le s se filtra ro n y se in s p e cc io n a ro n v isu a lm e n te com o se d e sc rib e en el d o cu m e n to Jo n e s et al., S c ien ce , 330: 228-31 (2010 ).
La co n s tru cc ió n de una b ib lio te ca de m in ig e n e s en tán de m
S e id e n tif ica ro n m u ta c io n e s no s in ó n im a s de m u e s tra s de m e la n o m a a p a rtir de d a tos de se cu e n c ia c ió n de e xom a com p le to . C o n s tru cc io n e s de m in ig e n e s en tá n d e m q ue cod ifica n p o lip é p tid o s que co n tie n e n 6 re s id u o s de a m in o á c id o s m u ta d o s id e n tif ica d o s fla n q u e a d o s en su s e x tre m o s te rm in a le s N y C, 12 a m in o á c id o s en a m bo s lados, se s in te tiza ro n ( In te g ra te d D N A T e ch n o lo g ie s , C ora lv ille , low a), y d e sp u é s se c lon a ron para d a r el v e c to r de e xp re s ió n pcD N A 3.1 u sa nd o el k it de c lo n a c ió n p or P C R IN -F U S IO N A d v a n ta g e (C lon tech ), seg ún las in s tru cc io n e s del fab rica n te .
E n sa yo de E L IS P O T de IFN -y
Las re sp u e s ta s d ir ig id a s con tra líne as c e lu la re s tu m o ra le s y cé lu la s d ia n a a las que se a d m in is tró m e d ia n te pu lsos p é p tid o s se c u a n tifica ro n en un e n sa yo de E L IS P O T de IFN -y u tiliza n d o p la cas de f iltro de m e m b ra n a P V D F de 96 p oc illos (E M D M illip o re , B ille rica , M A) re cu b ie rta con 15 |ig /m l del a n ticu e rp o m o n o c lo n a l a n ti-IF N -y 1D 1 K (M ab te ch , Inc., C inc in n a ti, O H ). La c ito c in a u n ida se d e te c tó u sa nd o 1 |ig /m l del a n ticu e rp o a n ti-IF N -y b io tin ila do 7-B 6-1 (M ab te ch ). A cé lu la s h E k 293 que e xp re sa n H L A -A *0201, H L A -A *0205 o H L A C * 0701 se les a d m in is tra ro n m e d ia n te p u lsos p é p tid o s d u ra n te 2 h a 37 °C. Se u sa ron los s ig u ie n te s pép tidos : M A R T -1 : A A G IG IL T V (S E Q ID NO: 54), K IF 2C m u ta do : R L F P G LT IK I (S E Q ID NO: 55), P O LA 2 m u tado : T R S S G S H F V F (S E Q ID NO: 56). Las cé lu la s T se cu ltiva ro n de m a ne ra co n ju n ta d u ra n te la n oche con cé lu la s d iana o m e d io s q ue co n te n ía n 50 ng/m l de P M A m ás io n o m ic in a 1 |iM (P M A /I). Se ca lcu la ro n los n úm e ro s de p u n to s p o r 105 cé lu la s T.
E je m p lo c o m p a ra tiv o 8
E ste e je m p lo d e m u e s tra q ue T IL 2359 re co n o ce n un a n tíg e n o m u ta do seg ún lo e va lu a d o p or el c rib a d o de la b ib lio te ca de m in ige ne s.
La re a c tiv id a d de T IL 2359 se e va lu ó u sa nd o co n s tru c c io n e s de T M G q ue se g e n e ra ro n b a sá n d o se en las m u ta c io n e s no s in ó n im a s id e n tif ica d a s p o r a n á lis is e xó m ico de A D N tu m o ra l y no rm a l. C ad a co n s tru cc ió n de T M G co d ificó h as ta se is fra g m e n to s de m in ig e n e s in d iv id u a le s que co rre sp o n d ía n al codón m u ta do f la n q u e a d o a cada lad o p o r los 12 co d o n e s a d ic io n a le s p re se n te s en el p ro d u c to g é n ico norm a l. Un e je m p lo se ilus tra en la fig u ra 5A.
Las cé lu la s C O S -7 se tra n s fe c ta ro n de m a ne ra tra n s ito r ia m e n te in d iv id u a l con uno de d oce m in ig e n e s en tán de m q ue co d ifica ro n los 71 m in ig e n e s b a sá n d o se en s e cu e n c ia s de A D N e xó m ico q ue co n te n ía n m u ta c io n e s p un tu a le s no s in ó n im a s id e n tif ica d a s de M el 2359. E s ta s cé lu las C O S -7 ta m b ié n se tra n s fe c ta ro n de m a n e ra co n ju n to con H L A -A *0205 , el e le m e n to de re s tr icc ió n de H L A d o m in a n te usa do para el re co n o c im ie n to de cé lu la s tu m o ra le s a u tó lo g a s p o r e s to s T IL. El cu ltivo co n ju n to de e stos tra n s fe c ta n te s con T IL 2359 d io com o re su lta d o el re co n o c im ie n to de una de las 12 c o n s tru cc io n e s de TM G , RJ-1 (fig u ra 5B). F ra g m e n to s m u ta d o s c o d ifica d o s por RJ-1 de los g en es EPHB2, KIF2C, SLC44A5, ABCA4, DENND4B y EPRS, co m o se m u e s tra en la fig u ra 5a . P o s te rio rm e n te , se g e n e ra ro n se is co n s tru c c io n e s va r ia n te s de R J-1, cada una de los cu a le s co d ificó el W T en lu g a r del re s idu o m u ta do p re se n te en uno de los se is m in ig e n e s (fig u ra 5C). T IL 2359 re co n o c ie ro n cé lu las C O S -7 tra n s fe c ta d a s de m a ne ra co n ju n ta con H L A -A *0205 m ás c inco de las se is v a r ia n te s de RJ-1 tra n s fe c ta d a s in d iv id u a lm e n te , pero no p ud ie ro n re co n o ce r la va r ia n te que co d ifica la se cu e n c ia de KIF2C W T , lo que ind ica que e s te m in igé n co d ificó un e p íto p o m u ta d o re co n o c id o por T IL 2359 (fig u ra 5C). P ara s o m e te r a p rue b a m ás esta o b se rva c ió n , Las cé lu la s C O S -7 se tra n s fe c ta ro n de m a ne ra co n ju n ta con tra n s c rito s de A D N c de KIF2C de lo n g itu d co m p le ta o b ien W T o b ien m u ta d o s q ue se a m p lifica ro n a p a rtir de M el 2359, ju n to con A D N c de H LA -A *0101 , HlAa *0201 o H LA -A *0205. El e xp e rim e n to de cu ltivo co n ju n to ind icó q ue las cé lu la s T de T IL 2359 re co n o c ie ro n cé lu la s C O S -7 tra n s fe c ta d a s de m a ne ra co n ju n ta con el p ro d u c to del gen KIF2C m u ta do pero no W T, de una m a n e ra re s tr in g id a a H L A -A *0205 (fig u ra 5D).
La reg ión c o d ifica n te de KIF2C m u ta do co n te n ía una tra n s v e rs ió n de C a A ú n ica en el n u c le ó tid o 46 q ue d io com o re su lta d o una su s titu c ió n de tre o n in a p o r a la n in a en la p os ic ió n 16 en la p ro te ína K IF 2C nativa. Los re su lta d o s de la se cu e n c ia c ió n e xó m ica in d ica ro n q ue el A D N de Mel 2359 co rre sp o n d ía e xc lu s iv a m e n te al re s id u o m u ta do pero no al re s idu o norm a l en la p os ic ió n 46, re su lta d o s co n firm a d o s por se cu e n c ia c ió n de S a n g e r d ire c ta de A D N de M el 2359, lo q ue ind icó la p é rd ida de h e te ro c ig o s id a d en e ste locus. En un in te n to por id e n tif ic a r el e p íto p o de K IF 2C m u ta do re co n o c id o p or T IL 2359, se s in te tiza ro n p é p tid o s q ue a b a rca n la m u ta c ió n de K IF 2C q ue se p red ijo q ue se u n irían de a lta a fin id a d a H L A -A *0205 (H o o f et al., In m u n o g e n e tics , 61: 1 -13 (2009 )), y se a dm in is tra ro n m e d ia n te pu lsos en cé lu la s H E K 293 que e xp re sa b a n de m a ne ra e s ta b le H L A -A *0205 (ta b la 21). A las cé lu las H E K 293 -A *0205 se les a d m in is tró m e d ia n te pu lsos un d e cá m e ro co rre sp o n d ie n te a los re s idu os 10-19 e s tim u la ron la lib e ra c ió n de a lto s n ive les de IFN -y de las cé lu la s T T IL 2359 , y el p ép tid o se re co n o c ió a una co n ce n tra c ió n m ín im a de 0,1 nM . P o r el con tra rio , el p é p tid o W T co rre sp o n d ie n te no ind u jo una lib e ra c ió n s ig n ifica tiva de IFN -y a una c o n ce n tra c ió n tan a lta co m o 10 |iM (fig u ra 5E).
T a b la 21
Figure imgf000029_0001
E je m p lo c o m p a ra tiv o 9
E ste e je m p lo d e m u e s tra q ue T IL 2591 re co n o ce n un a n tíg e n o m u ta d o id e n tif ica d o p o r el c rib a d o de b ib lio te ca de m in ige ne s.
El a n tíg e n o de cé lu la s T m u ta do re co n o c id o p o r T IL 2591 se id e n tificó s in te tiza n d o 37 co n s tru c c io n e s de T M G que co d ifica n los 217 m in ig e n e s b a sa d o s en se cu e n c ia s de A D N e xó m ico q ue co n tie n e n m u ta c io n e s p u n tu a le s no s in ó n im a s id e n tif ica d a s de Mel 2591. Los T IL 2591 re co n o c ie ro n cé lu la s tu m o ra le s a u tó lo g a s en el co n te x to de m ú ltip le s e le m e n to s de re s tr icc ió n de HLA. P o r lo tan to , las líne as c e lu la re s de H E K 293 que e xp re sa n e s ta b le m e n te ca d a una de las se is m o lé cu la s de H L A de c lase I de M H C a is la d a s de M el 2591 se tra n s fe c ta ro n de m anera in d iv id u a lm e n te tra n s ito r ia con las 37 co n s tru c c io n e s de TM G , se g u id o de un cu ltivo co n ju n to d u ra n te la n oche con T IL 2591. Los re su lta d o s in ic ia le s in d ica ro n que T IL 2591 re co n o c ie ro n cé lu la s H E K 293 H LA -C *0701 (H E K 293 -C *0701 ) q ue se tra n s fe c ta ro n tra n s ito r ia m e n te con el m in igé n D W -6, pero no re sp o n d ie ro n s ig n ific a tiv a m e n te a las o tras c o n s tru cc io n e s de m in ig e n e s (fig u ra 6A ). C ada uno de los se is m in ig e n e s m u ta d o s in d iv id u a le s en la co n s tru cc ió n en tá n d e m D W -6 (fig u ra 6 B ) se re v irtie ron in d iv id u a lm e n te a la se cu e n c ia W T (fig u ra 6C). La e va lu a c ió n de las re sp u e s ta s a las va r ia n te s W T ind icó q ue T IL 2591 re co n o c ie ro n cé lu la s C O S -7 tra n s fe c ta d a s con cad a una de las v a r ia n te s de D W -6, con la e xce p c ió n de una co n s tru cc ió n q ue co d ifica el fra g m e n to de POLA2 W T (fig u ra 6C ). P ara s o m e te r a p rue b a e s to s h a lla zg os , las cé lu la s C O S -7 se tra n s fe c ta ro n con una con s trucc ión de A D N c de POLA2 de lo n g itu d co m p le ta o b ien W T o b ien m u tado , ju n to con A D N c de H L A -C *0401, H LA -C *0701 o H L A -C *0702. Las cé lu la s T T IL 2591 so lo re co n o c ie ro n cé lu la s d ia n a tra n s fe c ta d a s con H LA -C *0701 m ás la co n s tru cc ió n de POLA2 m u tado , pero no el tra n s c rito W T co rre sp o n d ie n te (fig u ra 6D). La tra n s ic ió n de C a T ún ica en el n u c le ó tid o 1258 de la re g ión co d ifica n te de POLA2 d io com o re su lta d o una s u s titu c ió n de le u c in a por fe n ila la n in a en la p os ic ió n 420 de la p ro te ín a POLA2 W T . La se cu e n c ia c ió n de S a n g e r ind icó q ue ta n to el A D N g e n ó m ico com o el A D N c d e riva d o s del A R N de M el 2591 co n te n ía n ta n to el n u c le ó tid o W T co m o el nuc leó tido m u ta d o en la p os ic ión 1258, m ie n tra s q ue el A D N g e n ó m ico a is la d o de P B M C del p ac ien te 2591 c o rre sp o n d ía a la s e cu e n c ia W t , lo que ind ica q ue e sto re p re se n ta b a una m u ta c ión so m á tica h e te ro c ig ó tica en cé lu la s M el 2591.
D e sp u é s se usó un a lg o ritm o de un ión a H LA -C *0701 para id e n tif ic a r p é p tid o s de P O L A 2 c a n d id a to s que se s o la p a b a n con el re s idu o de le u c in a m u ta do en la p os ic ió n 420 (ta b la 22). Los re su lta d o s del cu ltivo con ju n to in d ica ro n q ue las cé lu la s H E K 293 H LA -C *0701 a las q ue se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos un d e cá m e ro co rre sp o n d ie n te a los re s id u o s 413 -422 de P O L A 2 m u ta d o e s tim u la ro n la lib e ra c ió n de IFN -y de las cé lu la s T T IL 2591 a una c o n ce n tra c ió n m ín im a de 10 nM. P o r el con tra rio , el p ép tid o W T co rre sp o n d ie n te no in d u jo libe ra c ión s ig n ifica tiva de IFN -y a una c o n ce n tra c ió n de hasta 10 |iM (fig u ra 6E).
T a b la 22
Figure imgf000030_0001
La p rop o rc ión de cé lu la s T en los T IL 2359 y 2591 que re co n o ce n los K IF 2C y P O L A 2 m u ta do s , re spe ctivam en te , a co n tin u a c ió n , se e s tim ó u sa nd o e n sa yo s de p u n to s de in m u n o a b so rc ió n liga d a a e n z im a s de IFN -y (E L IS P O T ). Los T IL 2359 g e n e ra ro n a p ro x im a d a m e n te 2.000 p u n to s por 100.000 cé lu la s T en re sp u e s ta a cé lu la s H LA -A*0205+ las q ue se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos el e p íto p o de K IF 2C m u ta do , s im ila r al o b se rva d o en re sp u e s ta al m e la n o m a a u tó lo g o (ta b la 23). Los T IL 2591 g e n e ra ro n m ás de 7.000 p u n to s en re sp u e s ta al e p íto p o M A R T-1 re s tr in g id o a H LA -A 2 , m ie n tra s q ue so lo p e q u e ñ a s fra cc io n e s de cé lu la s T re a cc io n a ro n co n tra el e p íto p o de P O L A 2 m u tado re s tr in g id o por H LA -C *0701 (ta b la 23).
T a b la 23
Figure imgf000030_0002
Figure imgf000031_0001
E je m p lo 10
E ste e je m p lo d e m u e s tra un m é to do para id e n tif ic a r cé lu las T re a c tiva s co n tra un a n tíg e n o m u ta do p rese n te en c á n c e r g a s tro in te s tin a l (G I) id e n tif ica d a s p o r el c rib ad o de b ib lio te ca de m in ige ne s.
La se cu e n c ia c ió n de e xo m a co m p le to se re a lizó en le s io n e s m e ta s tá s ica s de p ac ie n te s con c á n ce r GI para id e n tif ic a r m u ta c ion es . A co n tin u a c ió n , se g e n e ra ro n co n s tru c c io n e s de m in ig e n e s q ue c o d ifica b a n cad a m u ta c ión y se tra n s fe c ta ro n en A P C a u tó lo g a s para p e rm itir el p ro ce sa m ie n to y la p re se n ta c ió n de to d a s las m u ta c ion es e xp re sa d a s por el tum o r. E s ta s A P C se cu ltiva ro n de m a ne ra co n ju n ta lue g o con lin fo c ito s in filtra n te s de tu m o r (T IL ) y se d e te rm in ó la re a c tiv id a d de cé lu la s T con tra las m u ta c io n e s m e d ia n te E L IS P O T de IFN -y y la re gu lac ió n p o r in c re m e n to de 4 -1 B B y O X 40 p or c ito m e tría de flu jo .
En un p a c ie n te con c á n ce r de co lon , se e va lu a ro n 119 m u ta c io n e s para d e te rm in a r la re a c tiv id a d a m u ta c ión . Se e n co n tró que va rios , pero no tod os , de los cu ltivo s de T IL co n te n ía n p ro p o rc io n e s a lta m e n te va r ia b le s de cé lu las T C D 8 q ue re co n o c ie ro n e sp e c ífica m e n te una m u ta c ión en C A S P 8 (67 F ^ V). T ra s una e xp a n s ió n a d ic io n a l in vitro, e s ta s cé lu la s T C D 8 re a c tiva s a m u ta c ión se su p e ra ro n n o ta b le m e n te por o tras cé lu la s en cu ltivo . La a d m in is tra c ió n de 40 ,3 x 109 T IL , q ue se e s tim ó q ue co n te n ía a p ro x im a d a m e n te 0,31 % (a p ro x im a d a m e n te 127 m illo n e s) de cé lu la s re a c tiva s a m u ta c ión , al p a c ie n te no d io com o re su lta d o una re sp u e s ta c lín ica en el p rim e r se g u im ie n to a p ro x im a d a m e n te se is se m a n a s d e sp u é s de la a d m in is tra c ió n de cé lu las . El p ac ie n te m urió a p ro x im a d a m e n te se is se m a n a s d espu és . S in lim ita rse a una te o ría o m e ca n ism o p articu la r, se c ree q ue una c u a lq u ie ra o m ás de las fa s e s m uy ta rd ía s de la e n fe rm e d a d a n tes del tra ta m ie n to , el e s ta d o g en e ra l d e fic ie n te del p ac ien te , y la e sca sa to le ra n c ia del p ac ie n te a la q u im io te ra p ia de re du cc ió n de lin fo c ito s a d m in is tra d a a n tes de la te ra p ia a d o p tiva de cé lu la s p ueden h a b e r s id o fa c to re s q ue co n tr ib u ye ro n a la m u erte del p ac ien te . Se a is ló un T C R q ue e ra re ac tivo co n tra C A S P 8 m u ta d o de los T IL, y las cé lu la s T tra n s d u c id a s para e xp re sa r el T C R fue ro n re a c tiva s co n tra DC a las q ue se a d m in is tró m e d ia n te p u lsos C A S P 8 m utado .
En o tro p ac ie n te con c á n ce r recta l, 155 m u ta c io n e s se e va lu a ro n para d e te rm in a r la re a c tiv id a d a la m u ta c ión . Se e n co n tra ro n al m e no s 3 re a c tiv id a d e s a m u ta c ión d ife re n te s , c o m p re n d ie n d o d os re sp u e s ta s de cé lu la s T C D 8 y una re sp u e s ta de C D 4+. La a d m in is tra c ió n de T IL re a c tivo s a m u ta c ió n al p ac ie n te in ic ia lm e n te d io co m o re su ltad o una re spu es ta m ix ta a a p ro x im a d a m e n te 1,5 m e se s d e sp u é s del tra ta m ie n to , pero el p ac ien te d e sa rro lló m ás ta rde una e n fe rm e d a d p ro g re s iva a a p ro x im a d a m e n te 3 ,5 m e se s d e sp u é s del tra ta m ie n to . S e a is ló un T C R p o te n c ia lm e n te re ac tivo a m u ta c ión de los T IL C D 4 y de los T IL C D8+.
En un te rce r p ac ie n te (co la n g io ca rc in o m a ), no se d e te c ta ro n cé lu la s T re a c tiva s con tra 38 m u ta c io n e s so m e tid a s a p rueba . P ara e ste p ac ien te , se re du jo el um bra l de “ lla m a d a de m u ta c ió n ” , y se e va lu a rá n 125 m u ta c ion es p o s ib le s a d ic io n a le s . La “ lla m a d a de m u ta c ió n ” es un um bra l e s ta b le c id o a rb itra r ia m e n te en el q ue una se cu e n c ia se id e n tifica com o una m u ta c ión u sa nd o b io in fo rm á tica . En e ste caso , co m o p rim e r pase, el u m bra l e ra re la tiva m e n te a lto (p o r e je m p lo , p ro p o rc io n a n d o un a lto n ivel de co n fia n za de q ue las m u ta c io n e s id e n tif ica d a s e ran m u ta c io n e s rea les). L uego se re du jo el um bra l, p ro p o rc io n a n d o un m e n o r n ive l de co n fia n za de que las m u ta c io n e s id e n tif ica d a s e ran m u ta c io n e s rea les, s in e m ba rg o , p e rm a n e c ió la p o s ib ilid a d de q ue las m u ta c io n e s id e n tif ica d a s fu e ra n m u ta c io n e s rea les.
E s to s d a to s m u es tra n que la ca p a c id a d del s is te m a in m u n ita rio h um a no p ara re a liza r una re spu es ta de cé lu la s T co n tra m u ta c io n e s s o m á tica s en cá n ce re s GI m e ta s tá s ico s p ue de no s e r un e ve n to raro. El e s tu d io e stá en curso .
El uso de los té rm in o s “ u n ” y “ u n a ” y “e l/ la ” y “al m enos u n o ” y re fe re n te s s im ila re s en el co n te x to de la d e sc rip c ió n de la inve n c ió n (e sp e c ia lm e n te en el co n te x to de las s ig u ie n te s re iv in d ica c io n e s ) d ebe in te rp re ta rse para cu b rir ta n to el s in g u la r com o el p lu ra l, a m e no s q ue se in d iq u e lo co n tra rio en el p re se n te d o cu m e n to o se co n tra d ig a c la ra m e n te p or el con tex to . El uso del té rm in o “ al m e no s u n o ” se g u id o de una lis ta de uno o m á s e le m e n to s (p o r e je m p lo , “ al m e no s uno de A y B ”) d eb e in te rp re ta rse co m o un e le m e n to se le cc io n a d o de los e le m e n to s e n u m e ra d o s (A o B) o cu a lq u ie r co m b in a c ió n de d os o m ás de los e le m e n to s e n u m e ra d o s (A y B), a m enos que se in d iq u e lo co n tra rio en el p re se n te d o cu m e n to o se co n tra d ig a c la ra m e n te p o r el con tex to . Los té rm in o s “que co m p re n d e ” , “q ue t ie n e ” , “q ue in c lu ye ” y “ que co n tie n e ” d eben in te rp re ta rse com o té rm in o s a b ie rto s (es dec ir, que s ig n ifica n “q ue inc luye , pero s in lim ita rse a ,”) a m e no s q ue se in d iq u e lo con tra rio . La m e nc ión de in te rva lo s de v a lo re s en el p re se n te d o cu m e n to se p re te n d e ú n ica m e n te q ue s irvan com o un m é to do a b re v ia d o para hace r re fe re n c ia in d iv id u a lm e n te a cad a v a lo r se p a ra d o q ue cae d en tro del in te rva lo , a m e no s que se in d iq u e lo con tra rio en el p re se n te d o cu m e n to , y cad a v a lo r se p a ra d o se in co rp o ra en la m e m o ria d e sc rip tiva com o si se m e nc ion a ra in d iv id u a lm e n te en el p re se n te d ocum e n to .

Claims (10)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. M é to do para p re p a ra r una p ob lac ión a is la d a de cé lu la s T q ue e xp re sa n un re ce p to r de cé lu la s T (T C R ), o una p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, q ue tie n e e sp e c ific id a d a n tig é n ica para una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a p o r una m u ta c ió n e sp e c ífica de cán ce r, c o m p re n d ie n d o el m étodo :
id e n tif ic a r uno o m á s g e n e s en el á c id o n u c le ico de una cé lu la c a n ce ro sa de un pac ien te , en el q ue el c á n c e r se se le cc io n a de c á n ce r de co lon y c á n c e r recta l, co n te n ie n d o cad a gen una m u ta c ió n e sp e c ífica de cá n ce r que co d ifica una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados;
in d u c ir cé lu la s p re se n ta d o ra s de a n tíg e n o a u tó lo g a s (A P C ) del p a c ie n te para q ue p rese n te n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados;
cu ltiv a r de m a ne ra co n ju n ta cé lu la s T a u tó lo g a s de un tu m o r del p ac ie n te con las A P C a u tó lo g a s q ue p rese n ta n la se c u e n c ia de a m in o á c id o s m u tados;
s e le cc io n a r las cé lu la s T a u tó lo g a s q ue (a) se cu ltiva ro n de m a ne ra co n ju n ta con las A P C a u tó lo g a s q ue p rese n ta n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s y (b) tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica p or la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s p re se n ta d a en el co n te x to de una m o lé cu la de co m p le jo p rinc ip a l de h is to co m p a tib ilid a d (M H C ) e xp re sa d a p o r el pac ien te ;
a is la r una s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s q ue co d ifica el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, de las cé lu las T a u tó lo g a s se le cc io n a d a s , en el q ue el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, tie n e e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co d ifica d a p or la m u ta c ió n e sp e c ífica de cán ce r; e
in tro d u c ir la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica el T C R a is lado , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o, en cé lu la s m o n o n u c le a re s de sa n g re p e rifé rica (P B M C ) para o b te n e r cé lu la s q ue e xp re sa n el TC R , o la p arte de un ión a a n tíg e n o del m ism o.
2. M é to d o seg ún la re iv in d ica c ió n 1, en el que in d u c ir A P C a u tó lo g a s del p ac ien te para q ue p rese n te n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co m p re n d e a d m in is tra r m e d ia n te p u lsos a A P C p é p tid o s que co m p re n d e n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s o un g rup o de p ép tid os , c o m p re n d ie n d o cad a p ép tid o en el g rup o una se c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s d ife ren te .
3. M é to d o seg ún la re iv in d ica c ió n 1, en el que in d u c ir A P C a u tó lo g a s del p ac ien te para q ue p rese n te n la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co m p re n d e in tro d u c ir una s e cu e n c ia de n u c le ó tid o s que co d ifica la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s en las APC.
4. M é to do seg ún la re iv in d ica c ió n 3, en el que la se cu e n c ia de n u c le ó tid o s in tro d u c id a en las A P C a u tó lo g a s es una co n s tru cc ió n de m in igé n en tá n d e m (t M g ), c o m p re n d ie n d o cad a m in igén un gen d ife re n te , in c lu ye n d o cada gen una m u ta c ión e sp e c ífica de c á n ce r q ue co d ifica una se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados.
5. M é to d o se g ú n una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-4, en el q ue el m é to d o co m p re n d e a d e m á s o b te n e r m ú ltip le s fra g m e n to s de un tu m o r del p ac ien te , cu ltiva r de m a ne ra co n ju n ta por se p a ra d o cé lu la s T a u tó lo g a s de cad a uno de los m ú ltip le s fra g m e n to s con las A P C a u tó lo g a s q ue p rese n ta n la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m utados, y e va lu a r p o r se p a ra d o las cé lu la s T de cad a uno de los m ú ltip le s fra g m e n to s p ara la e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m utados.
6. M é to d o se g ú n una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-5, en el q ue s e le cc io n a r las cé lu la s T a u tó lo g a s que tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co m p re n d e h a ce r c re ce r s e le c tiva m e n te las cé lu la s T a u tó lo g a s q ue tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados.
7. M é to d o se g ú n una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-6, en el q ue s e le cc io n a r las cé lu la s T a u tó lo g a s que tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica para la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co m p re n d e s e le cc io n a r las cé lu la s T q ue e xp re sa n uno cu a lq u ie ra o m ás de m u erte ce lu la r p ro g ra m a d a 1 (P D -1 ), gen de a c tiva c ió n de lin fo c ito s 3 (L A G -3), in m u n o g lo b u lin a de cé lu la s T y d o m in io de m u c in a 3 (T IM -3), 4 -1B B , O X 40, y C D 107a.
8. M é to do seg ún una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-7, en el q ue s e le cc io n a r las cé lu la s T a u tó lo g a s que tie n e n e sp e c ific id a d a n tig é n ica p ara la se cu e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s co m p re n d e s e le cc io n a r las cé lu la s T (i) q ue se c re ta n una m a yo r ca n tid a d de una o m ás c ito c in a s tra s el cu ltivo c o n ju n to con A P C q ue p rese n ta n la se c u e n c ia de a m in o á c id o s m u ta d o s en co m p a ra c ió n con la ca n tid a d de la una o m ás c ito c in a s se c re ta d a s por un con tro l n e g a tivo o (ii) en el que al m enos el d ob le de los n ú m e ro s de cé lu la s T se c re ta n una o m ás c ito c in a s tras el cu ltivo co n ju n to con A P C q ue p rese n ta n la s e cu e n c ia de a m in o á c id o s m u tados , o p c io n a lm e n te en el que la una o m ás c ito c in a s co m p re n d e n in te rfe ró n ( IF N )-y , in te rle u c in a (IL )-2 , fa c to r de n e c ro s is tu m o ra l a lfa (T N F -a ), fa c to r e s tim u la n te de co lo n ia s de g ra n u lo c ito s /m o n o c ito s (G M -C S F ), IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-17, y IL-22.
9. M é to do se g ú n una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-8, en el q ue id e n tif ic a r uno o m ás g en es en el ácido n u c le ico de una cé lu la ca n ce ro sa co m p re n d e s e c u e n c ia r el e xo m a com p le to , el g e n o m a com p le to , o el tra n s c rip to m a co m p le to de la cé lu la can ce ro sa .
10. M é to do se g ú n una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-9, en el q ue el m é to d o co m p re n d e a d e m á s e xp a n d ir los n ú m e ro s de P B M C que e xp re sa n el TC R , o la parte de un ión a a n tíg e n o del m ism o.
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