CN110093316A - 一种aff细胞的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种AFF细胞的构建方法。所述AFF细胞的构建方法，包括以下主要步骤：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测并合成突变多肽；2)使用外周血制备永生化DC，并负载所述突变多肽，与PBMC共孵育，获得AFF细胞。

Description

一种AFF细胞的构建方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种AFF细胞的构建方法。

背景技术：

目前，在肿瘤的特异性免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的，而NK、CAR-NK、TIL、等细胞技术还有待成熟，CAR－T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。

现有技术一般通过改造DC细胞，由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞，诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC，诱导T细胞。还有实验室利用TCR-T技术，靶向递呈MAGE A3抗原。

以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外，有的虽然进行了抗原体外冲击，但没有进行体外共培育和体外扩增，让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤微环境，因此，很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递呈和共培育，但靶点单一(MAGE-3)，仅对非小细胞肺癌等个别癌种起效。虽然也有尝试慢毒为载体的方法进行转染递呈，但安全性、方便性不如多肽方式。而简单混合多肽的直接刺激，虽然简单方便，但效率较低。特异性精准多肽的二次刺激不如T细胞受体转导的肿瘤特异性抗原更直接。现有的TCR-T在治疗血液肿瘤和实体肿瘤的解决方案中，缺乏覆盖更多瘤种的精准的TCR。

上述方案均没有考虑T细胞的自我防护技术，使得数量不多的特异性T细胞直接面对强大的肿瘤微环境。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一种AFF细胞的构建方法，包括以下主要步骤：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测并合成突变多肽；2)使用外周血制备永生化DC，并负载所述突变多肽，与PBMC共孵育，获得AFF细胞。

AFF细胞具体制备步骤如下：

1、全外显子测序

使用人源外周血进行ctDNA测序或者以肿瘤组织进行全外显子测序，将测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点；

所述外周血也可以是市售工程细胞系，如H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞等，对其进行全外显子测序；

2、抗原表位预测

(1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将这段21个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”；

(2)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，将IC50＜1000nM的潜在抗原表位确定为“抗原表位”；

3、永生化DC负载突变多肽

(1)将外周血中的树突状细胞，采用TAX-GFP慢病毒进行感染，并选取理想的克隆作为永生DC；

(2)将“抗原表位”合成突变多肽，对上述永生DC进行负载；

4、负载突变多肽的DC与PBMC共孵育

将负载突变多肽的DC与PBMC共孵育，即可获得AFF细胞。

有益效果：

1.本发明提供的AFF细胞，以肿瘤抗原为突变抗原，与其它组织不同，靶点专一性强，不易发生脱靶效应，安全性高；

2.本发明获得的特异性细胞比例高，通常能够识别肿瘤抗原的特异性细胞，在PBMC的分布为0.5％以下，经过AFF方案改造的细胞，识别肿瘤抗原的特异性T细胞比例为20％以上。

附图说明：

图1显微镜观察DC形态；

图2DC负载多肽的效率；

图3AFF细胞分型检测；

图4ELISA检测细胞因子IFN-γ的释放；

图5流式检测识别多肽抗原的特异性T细胞比例；

图6细胞杀伤效率检测；

图7细胞对肿瘤荷瘤小鼠的生存改善情况。

具体实施方式：

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

对于专用名词AFF的解释，其中，A：永生化DC技术；FF：混合多肽刺激技术。AFF细胞表示采用上述技术联合制备获得的细胞。

实施例1

本实施例将以肺癌患者为例，提供具有针对性的AFF细胞及其制备方法：

1.全外显子测序

1)取肺癌患者外周血，进行ctDNA的测序和HLA分型检测；

2)利用软件对测序信息进行分析：将ctDNA测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点；

2.抗原表位预测

1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将这段21个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”；

2)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50(推荐软件：NetMHCpan 3.0、PickPocket、artificial neural networks(ANN))，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为“抗原表位”；

3.合成多肽

委托技术服务公司将“抗原表位”合成突变多肽；

4.永生化DC

1)抽取患者外周血100ml；

2)Ficol密度梯度离心分离PBMC；

3)采用美天旎树突状细胞分离试剂盒分离树突状细胞，重悬于培养基中；

4)TAX-GFP慢病毒感染所分离的树突状细胞，37℃孵箱静止培养，观察；

5)待细胞克隆化生长后，挑选克隆于96孔板分别培养；

6)单克隆表型分析；

7)选取理想的克隆作为永生DC；

5.永生DC负载突变多肽

1)配制多肽溶液：采用步骤3合成的突变多肽进行配制，每条多肽的终浓度为10～100μg/mL，优选50μg/mL，备用；

2)离心收集获得的永生DC，以配制的多肽溶液重悬，并置于细胞培养板中进行多肽负载；

3)37℃5％CO₂，冲击1～4h，优选4h，备用；

6.负载突变多肽的DC与PBMC共孵育

1)刺激因子OKM-25预铺板，40μL OKM-25+4mL PBS，2mL/皿(4.5cm²)室温4h，4℃备用；

2)将负载突变多肽的DC与PBMC，以1：50～1：500的比例进行混合，优选1：100，并转移至预铺OMK25的细胞培养板或培养瓶中；

3)晃匀，37℃5％CO₂培养，记为第0天；

4)观察共培养细胞情况，根据细胞密度，在第5天，将共培养细胞转移至大培养瓶中，补新鲜的培养液OKM-100+12％FBS，20mL于75cm²培养瓶中；

5)共培养第7天，再加入20mL新鲜OKM-100+12％FBS；

6)共培养第10天，培养液为OKM-200+5％FBS，将共培养细胞从75cm²瓶中那个转移至175cm²大瓶中；转移方法：25mL培养液OKM-200+5％FBS吹打，再转入大瓶，重复2次；以培养液OKM-200+5％FBS补足至200mL。

8)培养至14-21天时，即可获得AFF方案细胞。

7.构建肿瘤模型生存实验

1)稳定过表达特异性抗原肽(6号多肽)的肿瘤细胞系接种NGS小鼠，做异位荷瘤动物模型；将5×10⁵表达特异性抗原的肿瘤细胞悬于100μl生理盐水中，分别皮下注射至30只NSG小鼠的右侧胁肋部皮下，同时对小鼠进行编号；

2)在肿瘤生长至100-120mm³左右时分组回输细胞，根据肿瘤体积大小，将动物模型随机分成三组，每组5-6只小鼠，一组给予安慰剂生理盐水，一组给予没有进行任何遗传操作的T细胞(对照组)1×10⁷，一组给予AFF细胞1×10⁷，首次注射细胞7天后进行第二次注射，7天之后第三次注射细胞，连续观察60天，统计存活数据，绘制生存曲线。

实验结果：

1.突变位点及抗原表位预测

表1为测序检测到的突变位点及抗原表位预测结果，下划线标出的为突变的氨基酸；

表1抗原表位预测

2.永生DC形态观察

诱导DC成熟后，显微镜先观察形态，看可以观察到明显的树突状细胞(图1)；

3.DC抗原负载效率检测

根据表1合成预测的突变抗原，并进行生物素的标记，抗原负载DC后，以PE标记的亲和链霉素检测生物素在细胞表面的分布情况，以检测DC提呈多肽抗原的效率；结果如图2所示：深色(左侧)为没有负载标记多肽的检测结果，浅色(右侧)为负载生物素多肽的检测结果，结果表明：DC的负载效率为82.8％；

4.AFF方案细胞分型检测

AFF方案细胞培养结束后，进行CD4+、CD8+、NK和NKT细胞的分型检测，结果如图3所示：CD8+T细胞为45.7％以上，CD4+T细胞为43.2％，NKT细胞为21.4％，NK细胞为15.2％；

5.AFF细胞释放细胞因子的检测

以多肽刺激效应细胞时，由于效应细胞可以识别突变抗原，因此，会产生一系列的细胞因子，IFN-γ是抗肿瘤作用中最主要的细胞因子之一，图4为AFF培养方式细胞，经多肽刺激后，释放的IFN-γ的检测，结果表明：18条多肽中，6号和17号，可以刺激细胞释放更多的IFN-γ，说明：AFF方案细胞可以有效的提高抗肿瘤能力。

6.识别6号多肽的特异性细胞比例

以筛选的6号多肽，刺激AFF方案细胞，以流式检测释放IFN-γ细胞的比例，结果如图5所示，特异性T细胞比例为22.8％；

7.AFF细胞对靶细胞的杀伤作用

分别以AFF细胞和对照细胞对突变抗原表位来源的靶细胞进行杀伤效率的检测，结果如图6所示，与对照组相比，AFF细胞对靶细胞均有一定杀伤效果，且在10：1、20：1和40：1(效应细胞：靶细胞)时，与Mock(对照)组差异明显；说明AFF方案培养的细胞可以有效的提高对肿瘤细胞的杀伤效率。

8.构建特异性抗原表达靶细胞及肿瘤模型生存实验

成功构建了抗原表达肿瘤靶细胞系，建立荷瘤动物模型，结果显示(图7)，AFF细胞对肿瘤荷瘤小鼠的生存改善具有显著影响作用。

Claims (4)

1.一种AFF细胞的构建方法，其特征在于，包括由以下步骤：

(1)对外周血进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测并合成突变多肽；

抗原表位预测的方法为：以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位；分析潜在抗原表位的IC50，将IC50＜1000nM的潜在抗原表位确定为抗原表位；

(2)将外周血中的树突状细胞，采用TAX-GFP慢病毒进行感染，并选取理想的克隆作为永生DC，用突变多肽对上述永生DC进行负载，并与PBMC共孵育，获得AFF细胞。

2.如权利要求1所述AFF细胞的构建方法，其特征在于，所述外周血也可以是市售工程细胞系。

3.如权利要求2所述的AFF细胞的构建方法，其特征在于，所述工程细胞系为H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323 B16F1、CRL-25394T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞或G422小鼠神经胶质瘤细胞。

4.如权利要求1所述AFF细胞的构建方法，其特征在于，永生化DC的方法如下：

1)抽取患者外周血100ml；

2)Ficol密度梯度离心分离PBMC；

3)分离树突状细胞，重悬于培养基中；

4)TAX-GFP慢病毒感染所分离的树突状细胞，37℃孵箱静止培养，观察；

5)待细胞克隆化生长后，挑选克隆于96孔板分别培养；

6)单克隆表型分析；

7)选取理想的克隆作为永生DC。