CN110129373A - 一种rff1细胞的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开提供了一种RFF1细胞的构建方法，属于生物技术领域。该方法用于构建一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，是一种攻防兼顾的超级T细胞，精准性高、杀伤率高。该构建方法包括以下步骤：PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击；冲击后扩大培养，得到FF细胞；以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激该FF细胞以筛选精准多肽；基于CRISPR技术敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子；以所述精准多肽负载PBMC并与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合后共培，在共培过程中，用精准多肽进行多次冲击，得到RFF1细胞。该构建方法可用于细胞免疫治疗技术。

Description

一种RFF1细胞的构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RFF1细胞的构建方法，即一种用于细胞免疫治疗的T细胞的构建方法。
背景技术
肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式，它从病人体内采集免疫细胞，然后进行体外培养和扩增，再回输到病人体内，来激发以及增强机体的自身免疫功能以治疗肿瘤。肿瘤细胞免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。
正常或生物工程改造过的人体细胞移植或输入患者体内，新输入的细胞可以替代受损细胞、或者具有更强的免疫杀伤功能，从而达到治疗疾病的目的。
生物工程改造过的人体细胞用特殊方法在体外培养过程中加以改造，可有效杀除患者体内肿瘤细胞。如，中国专利申请CN201210194280.5提供了一种人细胞因子诱导的杀伤细胞。中国专利申请CN201510034781.0提供一种肿瘤细胞特异性多克隆T细胞。中国专利申请CN201510013987.5提供一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。中国专利申请CN201711060030.1提供一种治疗艾滋病合并淋巴瘤的CAR-T细胞及其制备方法和应用。CN201610824893.0提供一种抗体调控的双抗原特异性T细胞及其制备方法和应用。
发明内容
本发明旨在提供一种RFF1细胞的构建方法，构建一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞。通过联合多肽冲击及体外共培，将普通T细胞改造为攻防兼备的超级T细胞，解决了免疫细胞在细胞免疫治疗中攻防不能兼顾的问题，精准性好、杀伤率高。
本发明提供一种RFF1细胞的构建方法，其中所述RFF1细胞为用于细胞免疫治疗的T细胞，所述构建方法包括以下步骤：
S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；
所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：
1)外显子测序
对肿瘤细胞进行全外显子测序；
将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；
2)抗原表位预测
以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，得到一段21个氨基酸的多肽，以此作为潜在抗原表位；
IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；
3)合成多肽
采用多肽固相合成法合成抗原表位肽；
S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；
S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；
S4)基于CRISPR技术敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子，所述信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)；
S5)以筛选的精准多肽负载PBMC细胞，再与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合，共培养；
S6)在共培过程中，用精准多肽进行多次冲击；
S7)冲击后继续培养，得到RFF1细胞。
进一步地，步骤S2包括：
将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；
培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；
培养一段时间后，再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。
进一步地，在步骤S3中，精准多肽的筛选标准为：
以FF细胞作为基线，设置两个独立重复，检测值高的为高基线，检测值低的为低基线；
两个基线的差异为系统误差，数据分析时，对检测值>低基线、>高基线以及>高基线+系统误差的，分别进行标注；检测值>高基线+系统误差即为有效的精准多肽。
进一步地，步骤S5中，负载多肽后的PBMC细胞与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞以1:1～1:20的比例混合。
进一步地，步骤S1、S3和S6中，进行多肽冲击时，所用多肽溶液的浓度为10～100μg/mL；优选可以为50μg/mL。
进一步地，步骤S6中，在共培过程中，重复多肽冲击3～4次。
进一步地，在步骤S6中，每隔3～4天进行一次多肽冲击。每次可以为1～4h。
进一步地，步骤S6中，在共培过程中用精准多肽进行多肽冲击包括：将负载突变多肽的PBMC与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC混合后在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养，培养一段时间后用步骤S3所得精准多肽进行多肽冲击；
转移至含有培养液OKM100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养，每隔3～4天分别用步骤S3所得精准多肽进行多肽冲击。
进一步地，步骤S7中，所述冲击后继续培养以得到RFF1细胞包括：多肽冲击后在含有培养液OKM200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养，以得到RFF1细胞。
进一步地，所述肿瘤细胞来源于工程细胞系，所述工程细胞系包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种RFF1细胞的构建方法，构建了一种攻防兼备的超级T细胞。通过筛选出有效的精准多肽并将其对PBMC细胞进行二次多肽冲击，得到更有特异杀伤作用的T细胞，杀伤效率更高。
现有技术中，一般是通过DC细胞递呈T细胞，产生特异杀伤的T细胞；或者用病毒作为载体，通过慢病毒转染技术诱导T细胞的特异性杀伤。在本发明中，通过二次多肽冲击技术诱导T细胞的特异性杀伤。首先第一次多肽冲击，用混合多肽直接刺激PBMC细胞；而后以精准多肽直接刺激PBMC，并在共培养过程中，多次以精准多肽刺激。通过多次刺激将普通T细胞改造成为具有更精准的杀伤能力的超级T细胞。相比慢病毒转染，简单方便、安全性高。此外，本申请中联合靶点敲除防护技术和体外共培及体外扩增，提高T细胞对复杂的肿瘤微环境的适应力，覆盖多种瘤种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本发明实施例所述RFF1细胞的构建方法的流程示意图；
图2示出了抗原负载效率检测；
图3示出了精准多肽筛选结果；
图4示出了流式检测特异性T细胞比例；
图5示出了流式检测免疫抑制性信号分子的敲除情况；
图6示出了RFF1细胞对肿瘤的杀伤作用；
图7示出了RFF1细胞对细胞因子IFN-γ的释放；
图8示出了荷瘤小鼠生存曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式。在肿瘤细胞免疫治疗方面，现有的LAK细胞、DC细胞、CIK细胞、DC-CIK细胞已基本被证明无效。本发明实施例提供一种新的T细胞，用于细胞免疫治疗。
本发明实施例提供一种RFF1细胞的构建方法，其中所述RFF1细胞的制备方法包括以下步骤：
S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；
S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；
S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；
S4)敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子，所述信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)；
S5)以筛选的精准多肽负载PBMC细胞，再与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合，共培养；
S6)在共培过程中，用精准多肽进行多次冲击；
S7)冲击后继续培养，得到RFF1细胞。
定义“RFF1”细胞涉及的含义如下：
R—精准多肽二次冲击技术；
FF—混合多肽技术；
1—靶点敲除防护技术。
本文中，“RFF1”细胞为通过联合精准多肽二次冲击技术、混合多肽技术以及靶点敲除防护技术改造得到的T细胞。其中，“FF”细胞为由混合多肽技术，没有经过精准多肽二次冲击(FF方案)改造得到的T细胞。“RFF”细胞为通过精准多肽二次冲击(RFF方案)改造得到的T细胞。
本发明实施例提供一种RFF1细胞的构建方法，筛选出了真正有效的精准多肽，并用其对PBMC细胞进行二次多肽冲击，得到攻防兼备的“超级T细胞”，特异杀伤作用更强。在此基础上联合靶点敲除防护技术，提高T细胞对体内的免疫抑制微环境的适应力，增强T细胞的自身防护。
在步骤S1之前，所述致肿瘤突变的多肽可以由以下方法合成得到：1)外显子测序；2)抗原表位预测；3)合成多肽。
1)外显子测序
使用肿瘤细胞进行全外显子测序，而后利用软件对测序信息进行分析，一方面得到MHC类型信息；另一方面，将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点。
在外显子测序中，肿瘤细胞可以来自于工程细胞系，也可以来自于患者，比如患者外周血、肿瘤组织等。
工程细胞系可以包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。
2)抗原表位预测
在抗原表位预测中，以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将这段21个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”。使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50(推荐软件：NetMHCpan 3.0、PickPocket、artificial neural networks(ANN))。若IC50＜1000nM则将此潜在抗原表位认定为“抗原表位”。
3)合成多肽
采用多肽固相合成法合成抗原表位肽。
在步骤S1中，用致肿瘤突变的混合多肽对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击，直接刺激负载多肽后的PBMC细胞，进行第一次刺激。
具体地，PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击具体可以为：
以RPMI 1640+10％FBS(胎牛血清)或OKM100+12％FBS溶解混合多肽，多肽的终浓度为10～100μg/mL，优选50μg/mL，以此进行多肽冲击。
进一步地，多肽冲击的时间可以为1～4h，例如可以1h、3h、或4h，优选可以为4h。
在步骤S2中，冲击后扩大培养以得到FF细胞。将多肽冲击后的PBMC细胞与细胞刺激因子OKM-25共培，以得到FF细胞。
步骤S2具体可以为：
将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；
培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；
培养一段时间后再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。
具体而言，扩大培养后可得到FF细胞组合物。通过离心可从所述FF细胞组合物中分离提取T细胞(即FF细胞)。
步骤S3中，以多肽作为抗原直接刺激T细胞以筛选精准多肽。
精准多肽的筛选标准为：
以FF细胞作为基线，两个独立重复，检测值高的为高基线，低的为低基线；
两个基线的差异为系统误差，数据分析时，对检测值>低基线、>高基线以及>高基线+系统误差的，分别进行标注；检测值>高基线+系统误差即为有效的精准多肽。
步骤S3具体可以包括：
1)离心所获得的FF细胞组合物，1500rpm离心5min收集T细胞，加入10mL PBS重悬细胞并计数，1500rpm离心5min，收集T细胞以1640+10％FBS+200U/mL IL2重悬，计数调整至1×106个/mL；
2)以排枪将T细胞分至96孔平底板中，200μL/孔，细胞数为2×105个；再分别加入1mg/mL的突变多肽10μL，终浓度为50μg/mL，每条多肽设置3复孔；
3)设置阳性对照：T细胞+100ng/mL OKT3(CD3单克隆抗体)；阴性对照：RPMI 1640+10％FBS+200U/mL IL2(白细胞介素2)；两个T细胞对照作为本底释放检测，分别为第一次加T细胞，和最后一次加T细胞；以两个本底释放的差异作为系统误差；
4)37℃、5％CO2刺激24h后，1500rpm离心10min，转移140μL上清至新的96孔板中；
5)再将96孔板进行离心，1500rpm 10min，取样品进行ELISA(酶联免疫吸附测定)检测(或将样品至于-80℃保存)；
6)筛选精准多肽：
多肽作为抗原的以FF细胞作为基线；
每组实验为两个基线，高基线和低基线(检测值高的为高基线，低的为低基线)，两个基线的差异为系统误差，数据分析时，对检测值>低基线、>高基线以及>高基线+系统误差的，分别进行标注；检测值>高基线+系统误差即为有效的精准多肽。
步骤S4中，利用CRISPR技术敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子。所述信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGHT、2B4(CD244)。
具体地，构建敲除免疫抑制性信号分子的CRISPR慢病毒载体，以期感染PBMC细胞，得到敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞。
详细操作具体可以包括以下步骤：
1)分析抑制性信号分子的外显子，在pubmed数据库上找到基因的mRNA的CDS区，分别将每个外显子进行敲除靶点的预测；
2)设计合成sgRNA所需的正向引物和反向引物，将正向引物和反向引物1：1混合后，95℃处理5～60min，再进行缓慢降温，形成sgRNA的DNA序列；
3)将CRISPR慢病毒表达载体进行双酶切，并与sgRNA对应的双链DNA进行连接，转入克隆感受态细胞，12h后，挑取单克隆进行测序，保留测序正确的克隆；
4)提取携带sgRNA对应DNA序列的CRISPR慢病毒载体质粒，进行病毒包装；
5)以RPMI1640+10％FBS复苏PBMC，第1天至第4天时，进行CRISPR慢病毒感染；
6)感染后，在RPMI 1640+10％FBS中培养0-3天即为敲除免疫抑制性信号分子的PBMC。
步骤S5中，以步骤S3所筛选的精准多肽负载PBMC细胞，并与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞以1：1～1：20的比例进行混合，优选可以以1:10的比例混合。
步骤S6中，用精准多肽再次进行多肽冲击。冲击时间可以为1-4h。
相比步骤S1，在步骤S6中采用加量的精准多肽冲击。也就是说，用所筛选的精准多肽对共培后的细胞进行多次多肽冲击刺激。在共培过程中，可重复多肽冲击3～4次。
进一步地，在步骤S6中，可以每隔3～4天进行一次多肽冲击，每次可以1～4h。
例如，将负载精准多肽的PBMC与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC混合后在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养，培养一段时间后用步骤S3所得精准多肽进行多肽冲击；
多肽冲击后转移至含有培养液OKM100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养，每隔3～4天分别用步骤S3所得精准多肽进行多肽冲击。
步骤S7中，冲击后继续培养以得到RFF1细胞。具体可以包括：多肽冲击后在含有培养液OKM200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养，以得到RFF1细胞。
本发明提供了一种RFF1细胞的构建方法，体外构建一种用于细胞免疫治疗的RFF1细胞，是一种攻防兼备的超级T细胞。在本发明方法中，筛选出真正有效的精准多肽并用其对PBMC细胞进行二次冲击。第一次用混合多肽进行多肽冲击，第二次用筛选的精准多肽进行多次多肽冲击，从而得到更有特异杀伤作用的RFF细胞，精准性高、杀伤力高。在制备过程中，通过靶点敲除防护技术以及体外共培和体外扩增，增强了所得RFF1细胞对患者体内的复杂的肿瘤微环境的适应能力。
下文进一步对本发明实施例所述的RFF1细胞的构建方法进行详述。
(一)全外显子测序
1)使用LLC小鼠Lewis肺癌细胞进行全外显子测序；
2)利用软件对测序信息进行分析：一方面得到MHC类型信息；另一方面，将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点。
(二)抗原表位预测
1)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将这段21个氨基酸的多肽作为“潜在抗原表位”；
2)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50(推荐软件：NetMHCpan 3.0、PickPocket、artificial neural networks(ANN))，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为“抗原表位”。
(三)合成多肽
抗原表位肽合成方法采用多肽固相合成法
1)锚定：把第一个氨基酸锚定在固相树脂上；
2)去保护：保护的氨基酸使用碱性溶剂去除氨基的保护基团；
3)活化：使用活化剂活化待连接的氨基酸羧基；
4)键联：活化的羧基与前一个氨基酸裸露的氨基反应，形成肽；
5)重复步骤2-4)，使整条抗原表位肽链完全合成。
(四)PBMC负载突变多肽并对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击
1)配制多肽溶液：以RPMI 1640+10％FBS溶解多肽，每条多肽的终浓度为50μg/mL，备用；
2)PBMC提前1天复苏，吹打细胞，吸取15mL，并计数，离心；
3)以配制的多肽溶液将PBMC重悬；
4)至于细胞培养板中进行冲击；
5)37℃、5％CO2，冲击4h，得到冲击后的PBMC细胞，备用。
(五)PBMC经多肽冲击后的扩大培养
1)刺激因子OKM-25预铺板，40μL OKM-25+4mL PBS，2mL/皿(4.5cm2)室温4h，4℃备用；
2)将冲击后的PBMC转移至预铺OMK25的细胞培养板或培养瓶中；
3)晃匀，37℃5％CO2培养，记为第0天；
4)观察共培养细胞情况，根据细胞密度，在第5天，将共培养细胞转移至大培养瓶中，补新鲜的培养液OKM-100+12％FBS，20mL于T75培养瓶中；
5)共培养第7天，再加入20mL新鲜OKM-100+12％FBS；
6)共培养第10天，培养液为OKM-200+5％FBS，将共培养细胞从T25瓶中那个转移至T75大瓶中；
7)25mL培养液OKM-200+5％FBS吹打，再转入大瓶，重复2次；以培养液OKM-200+5％FBS补足至200mL。
8)培养至14-21天时，获得FF细胞组合物。
(六)多肽作为抗原直接刺激FF细胞筛选精准多肽
1)通过离心分离从FF细胞组合物中提取T细胞，即FF细胞。1500rpm离心5min收集T细胞，加入10mL PBS重悬细胞并计数，1500rpm离心5min，收集T细胞以1640+10％FBS+200U/mL IL2重悬，计数调整至1×106个/mL；
2)以排枪将T细胞分至96孔平底板中，200μL/孔，细胞数为2×105个；再分别加入10μL 1mg/mL的突变多肽，终浓度为50μg/mL，每条多肽设置3复孔；
3)设置阳性对照：FF细胞+100ng/mL OKT3；阴性对照：1640+10％FBS+200U/mLIL2；两个FF细胞对照作为本底释放检测，分别为第一次加FF细胞，和最后一次加FF细胞；以两个本底释放的差异作为系统误差；
4)37℃、5％CO2刺激24h后，1500rpm离心10min，转移140μL上清至新的96孔板中；
5)再将96孔板进行离心，1500rpm 10min，取样品进行ELISA检测或将样品至于-80℃保存。
(七)精准多肽评判标准：
1)阳性对照和阴性对照正常，则说明此数据可信；
2)多肽作为抗原的以FF细胞作为基线；
3)每组实验为两个基线，高基线和低基线，两个基线的差异为系统误差，数据分析时，对检测值>低基线、>高基线以及>高基线+系统误差的，分别进行标注；检测值>高基线+系统误差即为有效的精准多肽。
(八)利用CRISPR技术敲除PBMC上的免疫抑制性信号分子
1)PBMC表面免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)；
2)分析抑制性信号分子的外显子，在pubmed数据库上找到基因的mRNA的CDS区，分别将每个外显子进行敲除靶点的预测；
3)设计合成sgRNA所需的正向引物和反向引物，将正向引物和反向引物1：1混合后，95℃处理5～60min，再进行缓慢降温，形成sgRNA的DNA序列；
4)将CRISPR慢病毒表达载体进行双酶切，并与sgRNA对应的双链DNA进行连接，转入克隆感受态细胞，12h后，挑取单克隆进行测序，保留测序正确的克隆；
5)提取携带sgRNA对应DNA序列的CRISPR慢病毒载体质粒，进行病毒包装；
6)以1640+10％FBS复苏PBMC，第1天至第4天时，进行CRISPR慢病毒感染；
7)感染后，在1640+10％FBS中培养0-3天即为敲除免疫抑制性信号分子的PBMC。
(九)RFF1细胞的制备
1)刺激因子OKM-25预铺板，40μL OKM-25+4mL PBS，2mL/皿(4.5cm2)室温4h，4℃备用；
2)将负载精准多肽的PBMC与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC，以1：10的比例进行混合，并转移至预铺OMK25的培养瓶中；
3)晃匀，37℃5％CO2培养，记为第0天；
4)培养至第3天时，进行精准多肽的再冲击；
5)取2×107的PBMC细胞，加入终浓度为50μg/mL的多肽，冲击4h；
6)冲击4h后，转入T25培养瓶，补OKM100+12％FBS，37℃5％CO2培养，根据细胞生长情况，转移至T75培养瓶中，尽量保持细胞密度在1×106个/mL；
7)在培养第7天、10天和14天时，重复步骤5)和6)；
8)细胞进入T75培养瓶中时，培养基为OKM200+5％FBS，培养10～21天即可得到RFF1细胞。
(十)荷瘤小鼠生存实验
1)取肿瘤细胞系接种NSG小鼠，做异位荷瘤动物模型。将5×105表达特异性抗原的肿瘤细胞悬于100μL生理盐水中，分别皮下注射至30只NSG小鼠的右侧胁肋部皮下，同时对小鼠进行编号。
2)在肿瘤生长至100-120mm3左右时分组回输细胞，根据肿瘤体积大小，将动物模型随机分成三组，每组5只小鼠，一组给予安慰剂生理盐水，一组给予没有进行任何遗传操作的T细胞(对照组)1×107，一组给予RFF1细胞1×107，首次注射细胞7天后进行第二次注射，7天之后第三次注射细胞，连续观察50天，统计存活数据，绘制生存曲线。
实验结果
1.突变位点及抗原表位预测
表1为测序检测到的突变位点及抗原表位预测结果，下划线标出的为突变的氨基酸。
表1抗原表位预测
2.抗原负载效率检测
根据表1合成预测的突变抗原，并进行生物素的标记，抗原负载PBMC后，以PE标记的亲和链霉素检测生物素在细胞表面的分布情况，以检测PBMC提成多肽抗原的效率；结果如图2——抗原负载效率检测所示：a为没有负载标记多肽的检测结果，b为负载生物素多肽的检测结果，结果表明：PBMC的负载效率为55.4％(FL2-H 55.4％表示PI染剂所染到的细胞占55.4％)。
3.筛选精准多肽
如图3所示，以13条多肽分别刺激培养的FF细胞，通过检测IFN-γ的分泌，检测有效的多肽，结果如图2所示：6号和9号多肽引起的IFN-γ的释放量>高基线+系统误差，属于有效精准多肽。
4.特异性T细胞比例检测
以筛选的9号多肽，在FF细胞基础上进行多次刺激，培养后，以流式检测对精准多肽特异性的T细胞比例，结果如图4所示，方框内为特异性T细胞：与无处理的对照组相比，RFF细胞，经过多次冲击刺激后，9号多肽引起的释放IFN-γ的细胞比例，明显高于没有多次冲击刺激的细胞(FF细胞)。以流式细胞仪进行CD8+IFN-γ+(方框内)细胞的分选。
5.RFF1细胞免疫抑制性信号分子的敲除
利用CRISPR技术，将PBMC上的抑制性信号分子进行敲除，结果如图5所示。
6.RFF1细胞对靶细胞的杀伤作用
以本发明实施例RFF1细胞对突变抗原表位来源的靶细胞进行杀伤效率的检测，以无处理的细胞作为对照(Mock)，结果如图6所示，与对照组相比，本发明实施例RFF1细胞对靶细胞均有一定杀伤效果，在20：1和40：1(效应细胞：靶细胞)时，与Mock组差异明显(RFF1-1：步骤九中第3、10天进行了精准多肽再冲击；RFF1-2：步骤九中第3、7、10、14天进行了精准多肽再冲击)。
7.RFF1细胞释放细胞因子的检测
肿瘤细胞与效应细胞共培养时，由于效应细胞，可以识别肿瘤细胞上突变抗原，因此，会产生一系列的细胞因子，IFN-γ是抗肿瘤作用中最主要的细胞因子之一，图7为不同培养方式细胞，与肿瘤细胞共培养时，释放的IFN-γ的检测，结果表明：与效应细胞自身产生的IFN-γ相比(仅效应细胞)，与肿瘤细胞共培养后，本发明实施例RFF1细胞可产生大量的IFN-γ，说明：抑制性靶点的敲除可以更有效的提高抗肿瘤能力(RFF1-1：步骤九中第3、10天进行了精准多肽再冲击；RFF1-2：步骤九中第3、7、10、14天进行了精准多肽再冲击)。
8.荷瘤小鼠生存实验
结果如图8所示，回输本发明实施例的RFF1细胞对肿瘤荷瘤小鼠的生存改善具有显著影响作用。
9.临床案例
给药过程：
第一疗程：每个月一次RFF1细胞，数量1×10 9个细胞，共2次；
第二疗程：每半年一次RFF1细胞，数量1×10 9个细胞，共2次。
表2
编号 性别 年龄 疾病诊断 给药结束后无进展生存时间
1 女 67 卵巢癌 2016.4-至今
2 女 61 胃癌 2017.11-至今
3 男 63 胃癌 2017.11-至今
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种RFF1细胞的构建方法，所述RFF1细胞为用于细胞免疫治疗的T细胞，所述构建方法包括以下步骤：
S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；
其中，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：
外显子测序
对肿瘤细胞进行全外显子测序；
将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；
抗原表位预测
以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将一段21个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位；
IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；
合成多肽
采用多肽固相合成法合成抗原表位肽；
S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；
S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；
S4)基于CRISPR技术敲除PBMC细胞上的免疫抑制性信号分子，所述信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)；
S5)以筛选的精准多肽负载PBMC，再与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞混合，共培养；
S6)在共培过程中，用精准多肽进行多次冲击；
S7)冲击后继续培养，以得到RFF1细胞。
2.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S3中，精准多肽的筛选标准为：
以FF细胞作为基线，设置两个独立重复，检测值高的为高基线，检测值低的为低基线；
两个基线的差异为系统误差，数据分析时，对检测值>低基线、>高基线以及>高基线+系统误差的，分别进行标注；检测值>高基线+系统误差即为有效的精准多肽。
3.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，步骤S5中，负载精准多肽后的PBMC细胞与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC细胞以1:1～1:20的比例混合。
4.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，步骤S1、S3和S6中，进行多肽冲击时，所用多肽溶液的浓度为10～100μg/mL。
5.根据权利要求4所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，步骤S1、S3和S6中，进行多肽冲击时，所用多肽溶液的浓度为50μg/mL。
6.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，步骤S6中，在共培过程中用精准多肽进行多肽冲击包括：
将负载精准多肽的PBMC与敲除免疫抑制性信号分子的PBMC混合后在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养，培养一段时间后用步骤S3所得精准多肽进行多肽冲击；
转移至含有培养液OKM100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养，每隔3～4天分别用步骤S3所得精准多肽进行多肽冲击。
7.根据权利要求6所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S6中，进行多肽冲击时，每次冲击1～4h。
8.根据权利要求1所述的RFF1细胞的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞来源于工程细胞系，所述细胞工程系包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323 B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。
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