CN104928253B - 一种抗原性增强的肿瘤细胞及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗原性增强的包含erbB‑1基因和Rae‑1基因的肿瘤细胞，及其构建方法。还提供了一种重组质粒pEF1alpha‑IRES‑erbB‑1‑Rae‑1Vector。本发明所构建的肿瘤细胞可以作为高效致敏DC细胞的抗原来源。

Description

一种抗原性增强的肿瘤细胞及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物学及医学领域，具体涉及不同肿瘤细胞的分离、培养和建系，并采用所建立的细胞系对树突状细胞(Dendritic cell，DC)进行高效致敏、活化的方法。

目前随着肿瘤免疫学的迅速，肿瘤的免疫治疗成为继手术、化疗、放疗之后的一种新的治疗模式，肿瘤免疫治疗的中心环节就是诱导机体产生特异性和非特异性抗肿瘤免疫，而DC细胞作为最主要的连接非特异免疫和特异性免疫的桥梁，可以捕获侵入机体的微生物、被病毒感染的细胞及发生变异的肿瘤细胞的抗原信息，呈递给特异性免疫系统，激活T细胞和B细胞，使其产生特异性的免疫反应。

DC细胞是启动免疫系统对肿瘤识别和杀伤的关键细胞，被认为是唯一专职的抗原提呈细胞，利用DC的抗原提呈能力，研究人员可以在体外加入各种形式的抗原刺激DC，使其致敏，致敏后的DC再与T淋巴细胞共培养，即可将抗原提呈给T细胞，促进T细胞分化成为具有特异性杀伤功能的细胞毒性T细胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)。

目前主要用于刺激DC的抗原来源于包括合成的肿瘤相关抗原肽、肿瘤细胞株以及患者手术获得的肿瘤组织裂解液等。其中来源于肿瘤相关抗原肽等的合成短肽和肿瘤细胞株，由于所含的抗原信息不明确，很难与患者个体的肿瘤抗原信息一致，其免疫原性较低，最终得到的CTL的杀伤活性较低；而肿瘤组织中由于90％以上的成分是一些内皮细胞、基质细胞或浸润的淋巴细胞等，所含肿瘤细胞的数量有限，所以其裂解液致敏DC的效果较差，且肿瘤组织的数量有限，只能进行有限几次的致敏操作。

因此，本领域迫切需要寻找一种临床获取方便、抗原靶点完整、抗原性强且稳定的可以高效刺激DC细胞致敏的大量的肿瘤细胞抗原，从而激发机体产生强大的抗肿瘤免疫应答。

采用肿瘤疫苗诱导机体的特异性抗肿瘤免疫，对于抑制肿瘤的生长及转移至为重要。抗肿瘤免疫面对的是“自身”抗原(肿瘤抗原)，以细胞免疫为主，需要包括如CD8⁺和CD4⁺T细胞在内的多种细胞参与。当肿瘤细胞不表达抗原表位、抗原加工缺陷、抗原脱变、缺乏主要组织相容性复合体I(major histocompatibility complex，MHC-I)类分子、缺乏免疫共刺激分子、肿瘤细胞表达细胞凋亡调控因子配体(FasL)等，或由于机体免疫功能缺陷、免疫抑制等造成自然杀伤细胞(natural killer，NK)和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicityTlymphocyte，CTL)的活性降低而引发肿瘤“免疫逃逸”(immune escape)。

发明内容：

本发明的目的是提供一种抗原性增强的可以作为高效致敏DC细胞的抗原来源的肿瘤细胞。本发明的目的是通过这样的技术方案来实现的：即从肿瘤组织中分离得到肿瘤细胞，通过erbB-1基因的转染，使其形成特定肿瘤细胞系，并通过连续多次高效致敏DC细胞，从而产生高效、特异性杀伤功能的CTL细胞；通过Rae-1基因的转染，促进肿瘤细胞表达NKG2D配体(即Rae-1)，进一步促进肿瘤细胞被机体免疫系统(主要为CTL细胞和NK细胞)识别，从而激发机体产生强大的抗肿瘤免疫应答。

因此，一方面，本发明提供了一种抗原性增强的肿瘤细胞，其特征在于包含erbB-1基因和Rae-1基因。其中基因erbB-1核苷酸序列为SEQ ID NO：1。基因Rae-1核苷酸序列为：SEQ ID NO：3，Gene ID：NM_175112.5

另一方面，本发明提供了一种抗原性增强的肿瘤细胞的构建方法，其特征在于构建包含erbB-1基因和Rae-1基因的重组载体，用该载体转染肿瘤细胞。本发明所述肿瘤细胞包括来自肺癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌或卵巢癌的肿瘤细胞。优选包括结直肠癌细胞、原发性肝癌细胞、胃腺癌细胞、肺癌细胞。

再一方面，本发明还提供了包含erbB-1基因和Rae-1基因的重组质粒。本发明提供了构建pEF1alpha-IRES-erbB-1-Rae-1Vector的方法，其中所述的pEF1alpha-IRES Vector购自日本Takara公司，货号：631970；erbB-1基因、Rae-1基因均是已知的，并已经商业化。

在本发明的优选实施方案中，所设计的PCR引物能够在erbB-1基因的5′端添加Xba1酶切位点，3′端添加Sal1酶切位点；在Rae-1基因的5′端添加Sal1酶切位点，3′端添加Not1酶切位点。在本发明的优选实施方案中，所述PCR引物优选为：

erbB-1基因PCR引物：

F：5′-CTAGTCTAGACTAGATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGG-′3

(SEQ ID NO：5)

R：5′-GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT

T-`3(SEQ ID NO：6)

Rae-1基因PCR引物：

F：5′-GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGATGAGCCTGTTTGGAACAACCTCAG-′3

(SEQ ID NO：7)

R：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAACTACTTCTTATTCCTGGGCTTTAGC-3′

(SEQID NO：8)

本发明所述优选方法中，erbB-1基因与Rae-1基因片段插入顺序优选为：先将erbB-1基因片段插入。其中，erbB-1基因片段插入方法优选为erbB-1基因片段与pEF1alpha-IRES Vector经Xba1和Sal1双酶切后连接，得到pEF1alpha-IRES-erbB-1。其中，Rae-1基因片段插入方法优选为Rae-1片段与目的载体pEF1alpha-IRES-erbB-1经Sal1和Not1双酶切后连接，得到pEF1alpha-IRES-erbB-1-Rae-1载体。

本发明的另一个目的是提供一种上述方法构建的pEF1alpha-IRES-erbB-1-Rae-1载体。

本发明还提供用本发明抗原性增强的肿瘤细胞制备的生物制剂或者包含本发明抗原性增强的肿瘤细胞的生物制品。本发明还提供了本发明抗原性增强的肿瘤细胞在制备用于高效致敏DC细胞的生物制剂中的用途。

优选地，本发明的抗原性增强的肿瘤细胞的构建方法包括以下步骤：

(1)从离体肿瘤组织分离、纯化肿瘤细胞，将收集的细胞用RPMI-1640培养基重悬后接种到细胞培养板中；

(2)基因转染：细胞贴壁后，将含有特定基因erbB-1和Rae-1的慢病毒加入到细胞培养板中进行转染；

(3)将基因转染后的肿瘤细胞进行体外培养，用胰蛋白酶消化后，进行细胞传代建立肿瘤细胞系。

更优选地，本发明的肿瘤细胞的构建方法包括以下步骤：

(1)从离体肿瘤组织分离、纯化肿瘤细胞：用RPMI-1640培养基冲洗肿瘤周边部组织，剪除周围非肿瘤组织，将肿瘤组织剪碎研磨后经研磨离心收集肿瘤细胞；用RPMI-1640培养基重悬肿瘤细胞制成单细胞悬液；将细胞悬液加在肿瘤细胞分离液上，离心后收集中间白色细胞层，将收集的细胞用RPMI-1640培养基重悬后接种到细胞培养板中；

(2)基因转染：细胞贴壁后，将含有特定基因erbB-1和Rae-1的慢病毒加入到细胞培养板中进行转染，病毒滴度大于10⁷U/ml；

(3)将基因转染后的肿瘤细胞进行体外培养，培养5-7天后将培养的肿瘤细胞用胰蛋白酶消化后，进行细胞传代建立肿瘤细胞系。

在上述步骤(1)中，用RPMI-1640培养基冲洗肿瘤周边部组织(避免肿瘤中心的坏死组织)0.5-1.0cm³(可置于液氮或-80℃冰箱保存备用)。

在本发明方法中，待肿瘤细胞扩增到一定数量后，收集肿瘤细胞，经反复冻融使细胞彻底裂解后，将裂解液加入培养至树突状细胞DC中，收集刺激致敏的DC细胞并加入到CIK(Cytokine induced killer)细胞中，用原肿瘤细胞作为靶细胞，检测CIK细胞的特异性杀伤活性。结果显示经本发明肿瘤细胞致敏的CIK细胞对患者肿瘤细胞的杀伤活性显著高于未致敏组。

本发明方法所构建的肿瘤细胞可以在最大限度的保留肿瘤抗原信息，同时可以多次传代。本发明的主要特点是在分离、浓缩得到较高纯度的肿瘤细胞中，通过转染入erbB-1和Rae-1基因，高效构建出特定肿瘤细胞系，并可以用于持续刺激DC细胞致敏。

附图说明：

图1是pEF1alpha-IRES-erbB-1-Rae-1Vector质粒图。

下面通过具体实施例对本发明所述细胞，其制备方法、载体及其应用进行详细介绍和描述，以使更好的理解本发明的内容，但应当理解的是下面所述实施例并不限制本发明范围。

具体实施方式：

实施例1结直肠癌肿瘤细胞的分离

从结直肠癌手术样品中体外分离、浓缩肿瘤细胞：用RPMI-1640培养基冲洗肿瘤周边部组织(避免肿瘤中心的坏死组织)0.5-1.0cm³(可置于液氮或-80℃冰箱保存备用)，用手术剪剪除周围非肿瘤组织(例如脂肪组织和血管)后将肿瘤组织剪碎、研磨，后经300目钢网过滤后，将细胞悬液300g离心5min弃上清；余细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬肿瘤细胞制成单细胞悬液；将细胞悬液轻轻滴加在肿瘤细胞分离液(密度为1.06mg/ml的蔗聚糖-泛影葡胺分离液)上，800g离心15min，收集液体界面中间白色细胞层，将收集的细胞用RPMI-1640培养基重悬后稀释至2X10⁶个/ml接种到24孔细胞培养板中，每孔1ml。

实施例2载体的制备

一.引物设计

erbB-1基因PCR引物：

F：5′-CTAGTCTAGACTAGATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGG-′3

R：5′-GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGCTCATGCTCCAATAAATTCACTGCT

T-`3

Rae-1基因PCR引物：

F：5′-GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGGATGAGCCTGTTTGGAACAACCTCAG-′3

R：5′-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAACTACTTCTTATTCCTGGGCTTTAGC-3′

上述引物中，下划线部分为酶切位点。

二.将erbB-1基因插入pEF1alpha-IRES载体，制备pEF1alpha-IRES-erbB-1

1)将erbB-1基因PCR产物和pEF1alpha-IRES载体分别用Xba1和Sal1进行双酶切，酶切体系如下：

2)经37℃酶切4小时后，电泳分离酶切片段，切胶回收目的片段。

3)T4DNA连接酶连接上述酶切后的PCR产物及目的载体，连接体系如下：

4)将10ul连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄抗性的LB平皿上，37℃培养过夜。

5)次日后挑取单菌落进行菌落PCR扩增，PCR扩增体系及循环体系如下：

成分	体积
		ddH2O	9.5ul
10X Reaction Buffer	1.5ul
		MgCl2(25mM)	1.5ul
dNTPs(10mM)	0.5ul
		引物F(10mM)	0.5ul
引物R(10mM)	0.5ul
		Taq(5U/ul)	0.1ul
模板	1
		总体积	15

循环体系如下：

6)将PCR鉴定呈阳性的克隆接种至LB液体培养基中，摇菌过夜待次日提取质粒。同时将菌落PCR呈阳性菌落的质粒进行酶切鉴定，酶切体系如下：

7)以人外周血cDNA为模板PCR扩增Rae-1片段与目的载体pEF1alpha-IRES-erbB-1经Sal1和Not1双酶切、连接、转化，菌落PCR和质粒酶切鉴定，挑选阳性克隆，经测序验证后获得pEF1alpha-IRES-erbB-1-Rae-1载体。

实施例3转染

基因转染：实施例1获得的细胞贴壁后，用实施例2制备的重组载体转染细胞。

将5X10⁶个Lenti-X293T包装细胞(购自日本Takara公司，货号：632180)接种到培养皿中；24h后，实施例2获得的基因载体与体积为36ul Lenti-X HTXPackaging Mix(购自日本Takara公司，货号：631259)；7.5ul Xfect Polyer(购自日本Takara公司，货号：631258)，1150ul Xfect Reaction buffer(购自日本Takara公司，货号：631258)混合后，室温静置10min，然后加入至培养皿中，37％、5％CO₂培养箱中过夜，更换培养基后48h，收集病毒上清液，经过0.45um滤膜过滤为含有目的基因的病毒悬液；检测病毒滴度为5X10⁷U/ml。

肿瘤细胞培养4天后，观察到细胞贴壁良好，状态稳定。将制备好的病毒悬液滴加入24孔板内的肿瘤细胞中，500ul/孔。

转染3天后的肿瘤细胞进入快速增殖期，经0.25％胰酶进行细胞传代；每3天进行一次。

对传代5次以上的肿瘤细胞进行抗性筛选(pEF1alpha-IRES Vector中带有neo抗性基因)。在肿瘤细胞培养液中加入800U/ml的G418抗生素(购自日本Takara公司，货号：631307)，每次传代或更换培养液时均补充800U/ml的G418，每次传代或更换培养液时均补充800U/ml的G418，持续2周，存活的细胞即为成功转入erbB-1和Rae-1基因的细胞。软琼脂培养结果显示，筛选后细胞在低浓度条件下可以再琼脂中形成集落克隆；且经过动物致瘤性试验显示，裸鼠皮下接种1X10⁷筛选后的细胞2周后，可以形成实体肿瘤块。

待肿瘤细胞扩增到一定数量后，收集肿瘤细胞10⁷细胞，经反复冻融使细胞彻底裂解后，将裂解液加入培养至第6天的DC中，刺激48h后收集刺激致敏的DC细胞并加入到CIK细胞中，24h后收集CIK细胞，用原肿瘤细胞作为靶细胞，检测CIK细胞的特异性杀伤活性。结果显示经本发明肿瘤细胞系致敏的CIK细胞对患者肿瘤细胞的杀伤活性在效靶比为20∶1的条件下，可以达到38.6％，显著高于未致敏组(16.8％)。

实施例4

从原发性肝癌手术样品分离浓缩肿瘤细胞：用RPMI-1640培养基冲洗肿瘤周边部组织(避免肿瘤中心的坏死组织)0.5-1.0cm³(可置于液氮或-80℃冰箱保存备用)，用手术剪剪除周围非肿瘤组织(例如脂肪组织和血管)后将肿瘤组织剪碎、研磨，后经300目钢网过滤后，将细胞悬液300g离心5min弃上清；余细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬肿瘤细胞制成单细胞悬液；将细胞悬液轻轻滴加在肿瘤细胞分离液(密度为1.06mg/ml的蔗聚糖-泛影葡胺分离液)上，800g离心15min，收集液体界面中间白色细胞层，将收集的细胞用RPMI-1640培养基重悬后稀释至2X10⁶个/ml接种到24孔细胞培养板中，每孔1ml。

2、基因转染：根据实施例2的方法制备载体。并且根据实施例3的方法转染细胞。即细胞贴壁后，将含有特定基因erbB-1(基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQID NO：2)和Rae-1(基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，氨基酸序列为SEQ ID NO：4)片段分别插入到慢病毒表达载体pEF1alpha-IRES Vector的两个多克隆位点，构建目的基因载体。pEF1alpha-IRES Vector购自clontech(Cat.No.631605)。

将5X10⁶个Lenti-X293T包装细胞接种到培养皿中；24h后将适量的目的基因载体与体积为36ul Lenti-X HTX Packaging Mix；7.5ul Xfect Polyer，1150ul XfectReaction buffer混合后，室温静置10min，然后加入至培养皿中，37％、5％CO₂培养箱中过夜，更换培养基后48h，收集病毒上清液，经过0.45um滤膜过滤为含有目的基因的病毒悬液；检测病毒滴度为5X10⁷U/ml。

肿瘤细胞培养4天后，观察到细胞贴壁良好，状态稳定。将制备好的病毒悬液滴加入24孔板内的肿瘤细胞中，500ul/孔。

转染3天后的肿瘤细胞进入快速增殖期，经0.25％胰酶进行细胞传代；每3天进行一次。

对传代5次以上的肿瘤细胞进行抗性筛选(pEF1alpha-IRES Vector中带有neo抗性基因)。在肿瘤细胞培养液中加入800U/ml的G418抗生素，每次传代或更换培养液时均补充800U/ml的G418，每次传代或更换培养液时均补充800U/ml的G418，持续2周，存活的细胞即为成功转入erbB-1和Rae-1基因的细胞。软琼脂培养结果显示，筛选后细胞在低浓度条件下可以再琼脂中形成集落克隆；且经过动物致瘤性试验显示，裸鼠皮下接种1X10⁷筛选后的细胞2周后，可以形成实体肿瘤块。

待肿瘤细胞扩增到一定数量后，收集肿瘤细胞10⁷细胞，经反复冻融使细胞彻底裂解后，将裂解液加入培养至第6天的DC中，刺激48h后收集刺激致敏的DC细胞并加入到CIK细胞中，24h后收集CIK细胞，用原肿瘤细胞作为靶细胞，检测CIK细胞的特异性杀伤活性。结果显示经本发明肿瘤细胞系致敏的CIK细胞对患者肿瘤细胞的杀伤活性在效靶比为20∶1的条件下，可以达到28.6％，显著高于未致敏组(12.8％)。

实施例5

从包括胃腺癌等消化道肿瘤经手术样品分离浓缩肿瘤细胞：用RPMI-1640培养基冲洗肿瘤周边部组织(避免肿瘤中心的坏死组织)0.5-1.0cm³(可置于液氮或-80℃冰箱保存备用)，用手术剪剪除周围非肿瘤组织(例如脂肪组织和血管)后将肿瘤组织剪碎、研磨，后经300目钢网过滤后，将细胞悬液300g离心5min弃上清；余细胞沉淀用RPMI-1640培养基重悬肿瘤细胞制成单细胞悬液；将细胞悬液轻轻滴加在肿瘤细胞分离液(密度为1.06mg/ml的蔗聚糖-泛影葡胺分离液)上，800g离心15min，收集液体界面中间白色细胞层，将收集的细胞用RPMI-1640培养基重悬后稀释至2X10⁶个/ml接种到24孔细胞培养板中，每孔1ml。

2、基因转染：根据实施例2的方法制备载体。并且根据实施例3的方法转染细胞。即细胞贴壁后，将含有特定基因erbB-1(基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQID NO：2)和Rae-1(基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，氨基酸序列为SEQ ID NO：4)片段分别插入到慢病毒表达载体pEF1alpha-IRES Vector的两个多克隆位点，构建目的基因载体。pEF1alpha-IRES Vector购自clontech(Cat.No.631605)。

将5X10⁶个Lenti-X293T包装细胞接种到培养皿中；24h后将适量的目的基因载体与体积为36ul Lenti-X HTX Packaging Mix；7.5ul Xfect Polyer，1150ul XfectReaction buffer混合后，室温静置10min，然后加入至培养皿中，37％、5％CO₂培养箱中过夜，更换培养基后48h，收集病毒上清液，经过0.45um滤膜过滤为含有目的基因的病毒悬液；检测病毒滴度为5X10⁷U/ml。

肿瘤细胞培养4天后，观察到细胞贴壁良好，状态稳定。将制备好的病毒悬液滴加入24孔板内的肿瘤细胞中，500ul/孔。

转染3天后的肿瘤细胞进入快速增殖期，经0.25％胰酶进行细胞传代；每3天进行一次。

对传代5次以上的肿瘤细胞进行抗性筛选(pEF1alpha-IRES Vector中带有neo抗性基因)。在肿瘤细胞培养液中加入800U/ml的G418抗生素，每次传代或更换培养液时均补充800U/ml的G418，每次传代或更换培养液时均补充800U/ml的G418，持续2周，存活的细胞即为成功转入erbB-1和Rae-1基因的细胞。软琼脂培养结果显示，筛选后细胞在低浓度条件下可以再琼脂中形成集落克隆；且经过动物致瘤性试验显示，裸鼠皮下接种1X10⁷筛选后的细胞2周后，可以形成实体肿瘤块。

待肿瘤细胞扩增到一定数量后，收集肿瘤细胞10⁷细胞，经反复冻融使细胞彻底裂解后，将裂解液加入培养至第6天的DC中，刺激48h后收集刺激致敏的DC细胞并加入到CIK细胞中，24h后收集CIK细胞，用原肿瘤细胞作为靶细胞，检测CIK细胞的特异性杀伤活性。结果显示经本发明肿瘤细胞系致敏的CIK细胞对患者肿瘤细胞的杀伤活性在效靶比为20∶1的条件下，可以达到30.2％，显著高于未致敏组(11.6％)。

Claims (5)

1.一种抗原性增强的肿瘤细胞，其特征在于：包含erbB-1基因和Rae-1基因；其中，所述erbB-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Rae-1基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

2.根据权利要求1所述的抗原性增强的肿瘤细胞，其特征在于：所述肿瘤细胞是直肠癌细胞、原发性肝癌细胞、胃癌细胞或腺癌细胞。

3.权利要求1或2所述抗原性增强的肿瘤细胞的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)从离体肿瘤组织分离、纯化肿瘤细胞，将收集的细胞用RPMI-1640培养基重悬后接种到细胞培养板中；

(2)基因转染：细胞贴壁后，将含有特定基因erbB-1和Rae-1的慢病毒加入到细胞培养板中进行转染；

(3)将基因转染后的肿瘤细胞进行体外培养，用胰蛋白酶消化后，进行细胞传代建立肿瘤细胞系。

4.一种包含erbB-1基因和Rae-1基因的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为pEF1alpha-IRES-erbB-1-Rae-1Vector；

所述pEF1alpha-IRES-erbB-1-Rae-1Vector是通过如下方法制备获得的：

用erbB-1基因替换pEF1alpha-IRES Vector上XbaⅠ和SalⅠ之间的DNA片段，得到pEF1alpha-IRES-erbB-1；

用Rae-1基因替换pEF1alpha-IRES-erbB-1上SalⅠ和NotⅠ之间的DNA片段，得到所述pEF1alpha-IRES-erbB-1-Rae-1Vector；

所述erbB-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述Rae-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.权利要求1或2所述的抗原性增强的肿瘤细胞在制备用于高效致敏DC细胞的生物制剂中的用途。