WO2017101244A1 - 慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法 - Google Patents

慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法 Download PDF

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Abstract

提供了一种用于双基因表达的慢病毒表达载体及其制备方法和应用。该慢病毒表达载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列被替换为双基因表达盒子Dual得到。

Description

慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法 技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法。
背景技术
基因表达是细胞在生命过程中，把储存在DNA序列中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程。通过基因工程可以实现外源基因在生物细胞甚至生物体内的表达，从而达到人为调控细胞或实物体性状的目的。
真核细胞，尤其是哺乳动物细胞的外源基因的导入，主要通过物理方法、化学方法或生物学方法完成。物理方法主要包括DNA显微注射法、电穿孔法和金属颗粒轰击法等方法；化学方法主要包括脂质体介导和受体介导等方法；生物学方法主要是通过各种病毒实现，如腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒等。物理方法和化学方法可以负载大量外源基因片段，并且有部分方法可以实现将外源基因插入到细胞或生物体的基因组中，但总体来说，通过这两类方法实现外源基因表达的效率不高，而且大多数时候无法很好地实现外源基因插入细胞或生物体基因组，进而无法实现外源基因的稳定永久表达。生物学方法中的腺相关病毒、慢病毒等方法则可以很好地实现这一目标，它们可以将外源基因整合到细胞或生物体的基因组中，从而实现外源基因的稳定永久表达。其中，慢病毒以其具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段更大等优点受到科学界的青睐。
目前，不管是在实验室还是在产业界，慢病毒的应用都非常广泛。随着应用领域的不断扩大，对慢病毒的要求也在不断提高。当前，在科研和实际运用中，通过慢病毒一次导入两个基因并实现其高效表达的需求也越来越大，例如2013年《Science》杂志评选出的十大科学突破之首—癌症免疫疗法，包括TCR-T 等技术。由于TCR-T技术能够表达特异性受体靶向识别特异性的细胞如肿瘤细胞，受到广泛的关注和研究，并从初期的基础免疫研究转变为现在的临床应用。由于TCR-T技术需要将T细胞受体(TCR)两个亚基对应的DNA序列同时导入到T细胞中，因此其对能实现双基因快速导入技术的需求非常迫切，而现有的慢病毒载体尚不能很好地满足这一需求。
当前的慢病毒技术主要通过两种方式实现双基因的导入：在慢病毒载体的基因表达区构建双启动子或一个启动子+一个内部核糖体进入位点序列(IRES)，通过两个启动元件在转录水平实现两个外源基因的表达。这两种方式均可以实现双基因的表达，但存在以下两个主要的缺点：1、位于载体上游和下游基因的表达水平不一致。由于不同启动元件效率的不同以及两者之间可能存在的相互作用，从而导致上下游基因的表达水平差异很大(如10倍的差异)，甚至出现其中一个基因不表达的情况；2、慢病毒对外源基因的负载容量一般在8000bp～10000bp左右，而启动元件的大小一般在500bp～700bp左右。可以看到，单个启动元件占慢病毒负载容量的比例接近10％，因此多引入一个启动元件就意味着通过慢病毒导入的外源基因序列，就意味着可用于导入外源基因容量的减少。因此使用这两种方式实现的慢病毒双基因表达均不是特别理想。现有技术中尚无可解决以上问题的慢病毒载体。
发明内容
基于此，有必要提供一种双基因表达效果较好的慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法。
一种慢病毒表达载体，所述慢病毒表达载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体，所述pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列被替换为双基因表达盒子Dual得到；
所述双基因表达盒子Dual包括从5’到3’端依次排列的如下结构：第一多克隆位点-弗林蛋白酶切割位点-V5标签-Spacer-2A肽-第二多克隆位点，其中，“-”代表连接。
在一个实施例中，所述双基因表达盒子Dual的序列如SEQ ID No.1所示。
在一个实施例中，所述第一多克隆位点包括从5’到3’端依次排列的如下结构：Asc I酶切位点、BstBI酶切位点、Bam HI酶切位点和Age I酶切位点；
所述第二多克隆位点包括从5’到3’端依次排列的如下结构：Xho I酶切位点、Spe I酶切位点、Xma I酶切位点和Sal I酶切位点。
在一个实施例中，所述第一多克隆位点的序列如SEQ ID No.2所示；
所述第二多克隆位点的序列如SEQ ID No.3所示；
所述弗林蛋白酶切割位点的序列如SEQ ID No.4所示；
所述V5标签的序列如SEQ ID No.5所示；
所述Spacer的序列如SEQ ID No.6所示；
所述2A肽的序列如SEQ ID No.7所示。
在一个实施例中，所述第一多克隆位点插入有第一目的基因，所述第二多克隆位点插入有第二目的基因；
所述第一目的基因为小鼠TCRα基因，所述小鼠TCRα基因的NCBI编号为DQ452619，所述第二目的基因为小鼠TCRβ，所述小鼠TCRβ基因的NCBI编号为DQ452620。
一种如上述的慢病毒表达载体的制备方法，包括如下步骤：
设计双基因表达盒子Dual，并委托合成所述双基因表达盒子，得到含有pUC-Dual质粒的大肠杆菌菌液，所述pUC-Dual质粒中含有所述双基因表达盒子Dual，所述双基因表达盒子Dual包括从5’到3’端依次排列的如下结构：第一多克隆位点-弗林蛋白酶切割位点-V5标签-Spacer-2A肽-第二多克隆位点，“-”代表连接；
将所述含有pUC-Dual质粒的大肠杆菌菌液跟选择性LB液体培养基混合，在37℃恒温摇床中300rpm培养12h～16h至OD600为0.6～0.8，将得到的菌液离心后保留第一沉淀，将所述第一沉淀裂解后提取所述pUC-Dual质粒；
在37℃下用Asc I内切酶和Sal I内切酶处理pUC-Dual质粒，充分反应后回收，得到所述双基因表达盒子Dual的片段；
在37℃下用Asc I内切酶和Sal I内切酶处理 pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体，将所述pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列切除，充分反应后回收，得到线性化的pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体；
按照摩尔比为3～10：1将所述双基因表达盒子Dual的片段与所述线性化pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体混合，再加入T4 DNA连接酶，4℃下连接过夜，得到含有连接质粒的连接产物；以及
将所述含有连接质粒的连接产物转化感受态Top10大肠杆菌，并均匀涂布到选择性的LB平板上，37℃倒置培养12h～16h，挑取阳性菌落置于所述选择性LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中300rpm培养12h～16h至OD600为0.6～0.8，将得到的菌液离心后保留第二沉淀，将所述第二沉淀裂解后提取所述连接质粒，所述连接质粒即为所述慢病毒表达载体。
在一个实施例中，还包括在得到所述双基因表达盒子Dual的片段之后，在所述双基因表达盒子Dual的片段的所述第一多克隆位点插入第一目的基因，在所述双基因表达盒子Dual的片段的所述第二多克隆位点插入第二目的基因的操作；
所述第一目的基因为小鼠TCRα基因，所述小鼠TCRα基因的NCBI编号为DQ452619，所述第二目的基因为小鼠TCRβ基因，所述小鼠TCRβ基因的NCBI编号为DQ452620。
一种慢病毒表达试剂盒，包括如上述的慢病毒表达载体。
一种重组慢病毒的制备方法，包括如下步骤：
提供上述的慢病毒表达载体，并在所述双基因表达盒子Dual的片段的所述第一多克隆位点插入第一目的基因，在所述双基因表达盒子Dual的片段的所述第二多克隆位点插入第二目的基因，得到携带有目的基因的慢病毒表达载体；
将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体、pMDLg/pRRE载体、pRSV-Rev载体和pMD-G载体按照摩尔比为2：1：1：1混合后转染到293FT细胞中，转染后4h～6h更换为完全培养基培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm过滤头过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。
在一个实施例中，还包括在得到所述重组慢病毒的溶液后，对所述重组慢 病毒的溶液的滴度进行检测的步骤，具体为：
第一天，将293FT细胞接种到多孔板中，每个孔接种2×105个细胞，每个孔加入500μL培养基，37℃、5％CO2培养过夜；
第二天，按所述重组慢病毒的溶液的稀释比例为1、101、102、103、104、105、106、107和108，用培养基将所述重组慢病毒的溶液梯度稀释，接着分别将100μL梯度稀释的所述重组慢病毒的溶液与100μL多孔板中的细胞培养液在多孔板的不同孔中混合转染，转染开始后24h，吸去培养基并换成500μL含5UDNaseI的新鲜培养基，37℃下培养30min以去除可能附着于细胞表面的残余质粒DNA，然后将培养基换成1mL正常培养基，继续培养48h；
第四天，吸去所述多孔板的每个孔中的培养基，加入500μL胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃反应1分钟，接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下，离心收集每个孔的细胞，抽提每孔细胞的总RNA，接着逆转录得到每孔细胞的总cDNA；以及
分别对得到的所述每孔细胞的总cDNA进行荧光定量PCR，得到每孔细胞的Ct值，选择与对照组Ct值差异最小但超过2的实验组，得到其稀释倍数，按照以下公式计算慢病毒滴度：
T＝R×20×103，其中，T为慢病毒滴度，T的单位为TU/mL，R为稀释倍数。这种慢病毒表达载体利用2A肽实现双外源基因在哺乳动物细胞内的表达，2A肽具有“自我剪切”的特性，在蛋白质的翻译过程中，2A肽改变了核糖体的活性，促进2A肽残基Gly与tRNAGly之间酯链的水解，从转录复合物上释放上游多肽的同时又起始下游多肽的翻译，在翻译水平上实现的双基因表达。据研究，2A肽能几乎实现完全剪切。因此，这种慢病毒表达载体可以从理论上保证了双外源基因在哺乳动物细胞内的等量表达，相对于传统的用于双基因表达的慢病毒载体，这种慢病毒表达载体的双基因表达效果较好。
附图说明
图1为一实施方式的慢病毒表达载体的结构示意图；
图2为如图1所示的慢病毒表达载体的制备方法的流程图；
图3为实施例5中流式细胞术检测TCR在CD4+T淋巴细胞表面表达情况的结果；
图4为实施例5中流式细胞术检测TCR在CD8+T淋巴细胞表面表达情况的结果。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对慢病毒表达载体及其制备方法和应用、重组慢病毒的制备方法作进一步详细的说明。
本发明中未说明的药品、试剂均为本领域商用产品(购自生工生物工程(上海)股份有限公司、宝生物工程(大连)有限公司、德国QIAGEN公司、美国Life Technologies公司、美国GIBCO公司等)，未说明的操作均采用本领域常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。
如图1所示的一实施方式的慢病毒表达载体，为pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体。pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列被替换为双基因表达盒子Dual(Dual-gene expression cassette)得到。
pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体由购自addgene的商业化的质粒pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE改造而来，将质粒pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE的PGK启动子换成了MSCV启动子即可。
GFP序列被替换具有如下优点：1、替换GFP可以容纳更大的外源基因(GFP基因本身也有超过700bp的序列)；2、GFP所在位置正好处于MSCV启动子之后，将其替换可以提高外源基因的表达水平。
pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列可以采用Asc I内切酶和Sal I内切酶切除，然后用T4 DNA连接酶将经过相同处理的双基因表达盒子Dual的片段和切除了GFP序列的pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体连接，构建得到上述pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体。
双基因表达盒子Dual包括从5’到3’端依次排列的如下结构：第一多克隆位点-弗林蛋白酶切割位点-V5标签-Spacer-2A肽-第二多克隆位点，其中，“-”代表连接。
这种慢病毒表达载体利用2A肽实现双外源基因在哺乳动物细胞内的表达，2A肽具有“自我剪切”的特性，在蛋白质的翻译过程中，2A肽改变了核糖体的活性，促进2A肽残基Gly与tRNAGly之间酯链的水解，从转录复合物上释放上游多肽的同时又起始下游多肽的翻译，在翻译水平上实现的双基因表达。据研究，2A肽能几乎实现完全剪切。因此，这种慢病毒表达载体可以从理论上保证了双外源基因在哺乳动物细胞内的等量表达，相对于传统的用于双基因表达的慢病毒载体，这种慢病毒表达载体的双基因表达效果较好。
优选的，双基因表达盒子Dual的序列如SEQ ID No.1所示。
第一多克隆位点包括从5’到3’端依次排列的如下结构：Asc I酶切位点、BstBI酶切位点、Bam HI酶切位点和Age I酶切位点。
第二多克隆位点包括从5’到3’端依次排列的如下结构：Xho I酶切位点、Spe I酶切位点、Xma I酶切位点和Sal I酶切位点。
优选的，第一多克隆位点的序列如SEQ ID No.2所示。
优选的，第二多克隆位点的序列如SEQ ID No.3所示。
优选的，弗林蛋白酶切割位点的序列如SEQ ID No.4所示。
优选的，V5标签的序列如SEQ ID No.5所示。
优选的，Space的序列如SEQ ID No.6所示。
优选的，2A肽的序列如SEQ ID No.7所示。
在实际应用中，第一多克隆位点插入有第一目的基因，第二多克隆位点插入有第二目的基因。
优选的，第一目的基因为小鼠TCRα基因，小鼠TCRα基因的NCBI编号为DQ452619，第二目的基因为小鼠TCRβ基因，小鼠TCRβ基因的NCBI编号为DQ452620。
本发明还提供了一种慢病毒表达试剂盒，包括上述的慢病毒表达载体。
与现有技术相比，这种慢病毒表达试剂盒具有使用方便、高效，可很好地 实现哺乳动物细胞双外源基因的高效表达，而且可以容纳更多的基因片段，可作为有力的工具应用于科研和产业界，如肿瘤的细胞免疫治疗。细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的抗肿瘤疗法，弥补了传统的手术、放化疗的弊端，已被公认为肿瘤综合治疗模式中最有发展前途，也是目前唯一有希望完全消灭肿瘤的治疗手段。细胞毒性T细胞(CTL)的免疫功能在抗肿瘤免疫中起决定作用，肿瘤抗原激活CTL及CTL杀伤肿瘤细胞的前提是CTL对肿瘤抗原的有效识别，为了增强CTL对肿瘤细胞的免疫应答，多种治疗策略正处于临床试验阶段，譬如T细胞移植、肿瘤抗原或者DC细胞的免疫。目前常用的肿瘤特异性CTL包括TIL、DC诱导的CTL及基因修饰的T细胞(TCR-T和CAR-T)，这些技术都具有特异性的杀伤表达该抗原的肿瘤细胞的功能，是未来细胞免疫治疗的重要发展方向。
如图2所示的上述的慢病毒表达载体的制备方法，包括如下步骤：
S10、设计双基因表达盒子Dual，并委托合成双基因表达盒子Dual，得到含有pUC-Dual质粒的大肠杆菌菌液。
双基因表达盒子Dual的合成委托商业公司完成，直接获得含有pUC-Dual质粒的大肠杆菌菌液。
pUC-Dual质粒中含有双基因表达盒子Dual，双基因表达盒子Dual包括从5’到3’端依次排列的如下结构：第一多克隆位点-弗林蛋白酶切割位点-V5标签-Spacer-2A肽-第二多克隆位点，“-”代表连接。
S20、将S10得到的含有pUC-Dual质粒的大肠杆菌菌液跟选择性LB液体培养基混合，在37℃恒温摇床中300rpm培养12h～16h至OD600为0.6～0.8，将得到的菌液离心后保留第一沉淀，将第一沉淀裂解后提取pUC-Dual质粒。
选择性LB液体培养基为含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基。
S30、在37℃下用Asc I内切酶和Sal I内切酶处理S20得到的pUC-Dual质粒，充分反应后回收，得到双基因表达盒子Dual的片段。
S40、在37℃下用Asc I内切酶和Sal I内切酶处理pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体，将pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列切除，充分反应后回收，得到线性化的 pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体。
pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体由购自addgene的商业化的pRRLSIN.cPPT.PGK/GFP.WPRE改造而来，将PGK启动子换成了MSCV启动子即可。
S50、按照摩尔比为3～10：1将S30得到的双基因表达盒子Dual的片段与S40得到的线性化pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体混合，再加入T4 DNA连接酶，4℃下连接过夜，得到含有连接质粒的连接产物。
优选的，双基因表达盒子Dual的片段与线性化pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的摩尔比为3：1。
S60、将S50得到的含有连接质粒的连接产物转化感受态Top10大肠杆菌，并均匀涂布到选择性的LB平板上，37℃倒置培养12h～16h，挑取阳性菌落置于选择性LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中300rpm培养12h～16h至OD600为0.6～0.8，将得到的菌液离心后保留第二沉淀，将第二沉淀裂解后提取连接质粒，连接质粒即为慢病毒表达载体。
这种慢病毒表达载体的制备方法还包括在得到双基因表达盒子Dual的片段之后，在双基因表达盒子Dual的片段的第一多克隆位点插入第一目的基因，在双基因表达盒子Dual的片段的第二多克隆位点插入第二目的基因的操作。
优选的，第一目的基因为小鼠TCRα基因，小鼠TCRα基因的NCBI编号为DQ452619，第二目的基因为小鼠TCRβ基因，小鼠TCRβ基因的NCBI编号为DQ452620。
一种重组慢病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供上述的慢病毒表达载体，并在双基因表达盒子Dual的片段的第一多克隆位点插入第一目的基因，在双基因表达盒子Dual的片段的第二多克隆位点插入第二目的基因，得到携带有目的基因的慢病毒表达载体；将携带有目的基因的慢病毒表达载体、pMDLg/pRRE载体、pRSV-Rev载体和pMD-G载体按照摩尔比为2：1：1：1混合后转染到293FT细胞中，转染后4h～6h更换为完全培养基培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并将上清用0.45μm过滤头过滤，保留滤液即为重组慢病毒的溶液。
第一目的基因为小鼠TCRα基因，小鼠TCRα基因的NCBI编号为DQ452619，第二目的基因为小鼠TCRβ基因，小鼠TCRβ基因的NCBI编号为DQ452620。
在双基因表达盒子Dual的片段的第一多克隆位点插入第一目的基因后需要对插入的第一目的基因进行测序，测序引物为：MCS I上游引物和MCS I下游引物，测序完成后选取测序结果与预期完全相符的载体供下一步使用。
在双基因表达盒子Dual的片段的第二多克隆位点插入第二目的基因后需要对插入的第二目的基因进行测序，测序引物为：MCS II上游引物和MCS II下游引物，测序完成后选取测序结果与预期完全相符的载体供下一步使用。
MCS I上游引物的序列如SEQ ID No.8所示。
MCS I下游引物的序列如SEQ ID No.9所示。
MCS II上游引物的序列如SEQ ID No.10所示。
MCS II下游引物的序列如SEQ ID No.11所示。
pMDLg/pRRE载体、pRSV-Rev载体和pMD-G载体均为常规的慢病毒组装载体。
这种重组慢病毒的制备方法还包括在得到重组慢病毒的溶液后，对重组慢病毒的溶液的滴度进行检测的步骤，具体为：
第一天，将293FT细胞接种到多孔板中，每个孔接种2×105个细胞，每个孔加入500μL培养基，37℃、5％CO2培养过夜；
第二天，按重组慢病毒的溶液的稀释比例为1、101、102、103、104、105、106、107和108，用培养基将重组慢病毒的溶液梯度稀释，接着分别将100μL梯度稀释的重组慢病毒的溶液与100μL多孔板中的细胞培养液在多孔板的不同孔中混合转染，转染开始后24h，吸去培养基并换成500μL含5U DNaseI的新鲜培养基，37℃下培养30min以去除可能附着于细胞表面的残余质粒DNA，然后将培养基换成1mL正常培养基，继续培养48h；
第四天，吸去多孔板的每个孔中的培养基，加入500μL胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃反应1分钟，接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下，离心收集每个孔的细胞，抽提每孔细胞的总RNA，接着逆转录得到每孔细胞的 总cDNA；以及
以上述的MCS I上游引物和MCS II下游引物分别为上下游引物，按照下表加样，然后进行荧光定量PCR，获取各孔细胞荧光定量PCR反应的Ct值。
试剂 使用量(μL) 终浓度
上游引物(10μM) 0.4μL 0.2μM
下游引物(10μM) 0.4μL 0.2μM
ROX染料(50×) 0.4μL 1×
cDNA模板 2.0μL  
预混合Taq酶(2×) 10μL 1×
dH2O 6.8μL  
总量 20.0μL  
根据得到的每孔细胞的Ct值，选择与对照组Ct值差异最小但超过2的实验组，得到其稀释倍数，按照以下公式计算慢病毒滴度：
T＝R×20×103，其中，T为慢病毒滴度，T的单位为TU/mL，R为稀释倍数。
一般认为，只要慢病毒滴度达到107TU/mL以上，即认为成功获得所需慢病毒液。
具体实施例。具体实施例中使用的质粒为pRRLSIN.cPPT.MSCV改造得到，GFP.WPRE、293FT细胞为市售商品，所使用的试剂均为市售商品。
实施例1 双基因表达盒的设计
双基因表达盒的核心是表达2A肽(SEQ ID No.7)，在有第一多克隆位点(SEQ ID No.2)、2A肽(SEQ ID No.7)和第二多克隆位点(SEQ ID No.3)存在的情况下即可用于实现双外源基因的等量表达。但通过该方式得到的外源基因表达量不高，且在2A肽上游的多肽序列末端会被加上13个源自2A肽的氨基酸残基，这可能会对该多肽的特性产生一定的影响。
进一步地，在上一步的双基因表达盒的第一多克隆位点和2A肽之间插入Spacer(SEQ ID No.6)能有效提高外源基因的表达水平。
进一步地，在上一步得到的双基因表达盒的第一多克隆位点和Spacer之间插入弗林蛋白酶切位点(SEQ ID No.4)，可以使2A肽上游的多肽在表达后再经弗林蛋白酶的切割，其末端仅会残留4个氨基酸残基。出乎意料的，外源基因的表达水平又有了进一步的提高。
最优地，在上一步得到的双基因表达盒的弗林蛋白酶切位点和Spacer之间插入V5标签(SEQ ID No.5)能再次提升外源基因的表达水平，实现双外源基因的最高效等量表达。
如图1所示，最终得到的双基因表达盒的序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2 pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体的构建
委托上海生工生物工程技术服务有限公司对双基因表达盒的序列进行合成，得到的序列包含在大肠杆菌体内的pUC57-DGEC载体中。对该大肠杆菌进行扩大培养，并提取其中的pUC57-DGEC载体，然后测定其纯度和浓度，结果如下表所示。
pUC57-DGEC载体的纯度和浓度
重组载体 A260/A280 浓度(ng/μL)
pUC57-DGEC 1.93 626.3
用Asc I和SalI分别对重组pUC57载体和pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体进行双酶切，电泳后分别回收重组pUC57载体酶切产物中的小片段以及pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体酶切产物的大片段。按pUC51载体酶切产物的小段：线性化的pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的摩尔比为3:1混匀后，并加入T4 DNA连接酶，置于4℃连接过夜。
将连接产物转化感受态Top10大肠杆菌，并均匀涂布到含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上。37℃倒置培养12-16h。挑取多个阳性菌落，分别置于5mLLB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，于恒温空气摇床上37℃，300rpm培养12-16h至OD600＝0.6-0.8，将得到的菌液置于离心机中，10000rpm离心1min，弃上清，获得所需菌体，并进行测序，测序验证后提取其中的质粒。测序结果与预期完全相符，说明成功构建pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体。
实施例3 表达小鼠靶向黑色素瘤相关抗原gp100(154-162)TCRα和TCRβ的载体构建
根据NCBI中提供的基因序列(TCRα和TCRβ，编号分别为DQ452619和DQ452620)，并在TCRα基因的上下游分别加入Asc I和Age I酶切位点，并去除其终止密码子；TCRβ基因的上下游分别加入Xho I和Sal I酶切位点。委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行合成。
合成获得两株大肠杆菌，分别包含pUC57-TCRα和pUC57-TCRβ载体。对这两株大肠杆菌进行扩大培养，分别提取其中的pUC57-TCRα和pUC57-TCRβ载体，然后测定其纯度和浓度，结果如下表所示。
pUC57-TCRα和pUC57-TCRβ载体的纯度和浓度
重组载体 A260/A280 浓度(ng/μL)
pUC57-TCRα 1.86 813.7
pUC57-TCRβ 1.97 759.4
用Asc I与Age I酶对pUC57-TCRα载体进行处理，Xho I和Sal I酶对pUC57-TCRβ载体进行处理，电泳后分别回收获得两者的小片段TCRα和TCRβ。对上一步获得的pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体用Asc I与Age I酶进行双酶切处理，电泳后回收载体，然后用T4 DNA连接酶将其与TCRα进行连接，获得pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE-TCRα载体。用MCS I上游引物(SEQ ID No.8)和MCS I下游引物(SEQ ID No.9)，进行测序，结果与预期完全相符。
用Xho I和Sal I酶对pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE-TCRα载体进行双酶切处理，电泳后回收载体，然后用T4 DNA连接酶将其与TCRα进行连接，获得pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE-TCRα-TCRβ载体。用MCS II上游引物(SEQ ID No.10)和MCS II下游引物(SEQ ID No.11)进行测序，结果与预期完全相符。至此，用于表达小鼠靶向黑色素瘤相关抗原gp100(154-162)TCRα和TCRβ的pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE-TCRα-TCRβ载体已成功构建完成。
实施例4 慢病毒包装
培养293FT细胞，取生长状态良好的细胞接种到10cm培养皿中，每个皿接种5×106个细胞，加入DMEM无双抗培养基培养细胞约18h后至融合度达到80-90％后，取pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE-TCRα-TCRβ载体10μg、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD-G载体各5μg，用Lipofectamine 2000转染至293FT细胞中，转染后4-6h更换成DMEM完全培养基。48h后收集含病毒的上清培养基，6000g离心10min后，取上清液再用0.45μm过滤头进行过滤，获得病毒液。
培养293FT细胞，取生长状态良好的293FT细胞接种到24孔板中，每个孔接种2×105个细胞，加入500μL培养基，37℃，5％CO2培养过夜。第二天，按病毒原液：培养基的稀释比例为100-108分别制备病慢毒梯度稀释液各100μL，然后吸取各孔原培养基各100μL，再加入慢病毒稀释液各100μL开始转染。转染开始后24h，吸出含慢病毒的培养基，换成500μL含5UDNaseI的新鲜培养基，37℃下培养30min以去除可能附着于细胞表面的残余质粒DNA。然后将培养基换成1mL正常培养基，继续培养48h。
小心吸走每个孔的全部培养基，加入500μL胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃反应1分钟。接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下，离心收集每个孔的细胞。抽提每孔细胞的总RNA，接着逆转录为cDNA。以MCSI上游引物和MCSII下游引物分别为上下游引物，按照下表加样：
试剂 使用量(μL) 终浓度
上游引物(10μM) 0.4μL 0.2μM
下游引物(10μM) 0.4μL 0.2μM
ROX染料(50×) 0.4μL 1×
cDNA模板 2.0μL  
预混合Taq酶(2×) 10μL 1×
dH2O 6.8μL  
总量 20.0μL  
然后进行荧光定量PCR，获取各孔细胞荧光定量PCR反应的Ct值。反应条件如下：
预变性：95℃30秒，循环1次；
PCR反应：95℃5秒，58℃30秒，循环40次；
解离：95℃15秒。
一般认为，与对照组细胞相比，Ct值差异达到2以上即可认为存在显著差异，因此找出与对照组Ct值差异最小但超过2的实验组，得到其稀释倍数，按照以下公式计算慢病毒滴度：
T＝R×20×103，其中，T为慢病毒滴度，T的单位为TU/mL，R为稀释倍数。
经计算，本次包装的慢病毒滴度大于107TU/mL，表明此次慢病毒的包装是成功的。
实施例5 细胞转染与基因表达情况检测
利用MyltenyiBiotec的磁珠技术从肿瘤患者的外周血淋巴细胞(PBL)中分离CD4+及CD8+T淋巴细胞，然后按照每个T细胞3TU的比例加入慢病毒进行转染，32℃离心2h后，将细胞置于37℃CO2培养箱进行培养。3天后，利用流式细胞术检测TCR对应多肽的四聚体(Tetramer)来观察TCR在T细胞表面的表达，其结果如图3和图4所示。
由图3和图4可以看到，经慢病毒处理后的实验组CD4+和CD8+T淋巴细胞，其TCR在细胞表面的表达水平与未经处理的对照组均有显著提高，说明pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体能很好地用于哺乳动物细胞双外源基因的高效表达。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Figure PCTCN2016080422-appb-000001
Figure PCTCN2016080422-appb-000002
Figure PCTCN2016080422-appb-000003
Figure PCTCN2016080422-appb-000004

Claims (10)

  1. 一种慢病毒表达载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体，所述pRRLSIN.cPPT.MSCV-Dual.WPRE载体为pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列被替换为双基因表达盒子Dual得到；
    所述双基因表达盒子Dual包括从5’到3’端依次排列的如下结构：第一多克隆位点-弗林蛋白酶切割位点-V5标签-Spacer-2A肽-第二多克隆位点，其中，“-”代表连接。
  2. 根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述双基因表达盒子Dual的序列如SEQ ID No.1所示。
  3. 根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述第一多克隆位点包括从5’到3’端依次排列的如下结构：Asc I酶切位点、BstBI酶切位点、Bam HI酶切位点和Age I酶切位点；
    所述第二多克隆位点包括从5’到3’端依次排列的如下结构：Xho I酶切位点、Spe I酶切位点、Xma I酶切位点和Sal I酶切位点。
  4. 根据权利要求1或3所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述第一多克隆位点的序列如SEQ ID No.2所示；
    所述第二多克隆位点的序列如SEQ ID No.3所示；
    所述弗林蛋白酶切割位点的序列如SEQ ID No.4所示；
    所述V5标签的序列如SEQ ID No.5所示；
    所述Spacer的序列如SEQ ID No.6所示；
    所述2A肽的序列如SEQ ID No.7所示。
  5. 根据权利要求1所述的慢病毒表达载体，其特征在于，所述第一多克隆位点插入有第一目的基因，所述第二多克隆位点插入有第二目的基因；
    所述第一目的基因为小鼠TCRα基因，所述小鼠TCRα基因的NCBI编号为DQ452619，所述第二目的基因为小鼠TCRβ，所述小鼠TCRβ基因的NCBI编号为DQ452620。
  6. 一种如权利要求1～5中任一项所述的慢病毒表达载体的制备方法，其特 征在于，包括如下步骤：
    设计双基因表达盒子Dual，并委托合成所述双基因表达盒子，得到含有pUC-Dual质粒的大肠杆菌菌液，所述pUC-Dual质粒中含有所述双基因表达盒子Dual，所述双基因表达盒子Dual包括从5’到3’端依次排列的如下结构：第一多克隆位点-弗林蛋白酶切割位点-V5标签-Spacer-2A肽-第二多克隆位点，“-”代表连接；
    将所述含有pUC-Dual质粒的大肠杆菌菌液跟选择性LB液体培养基混合，在37℃恒温摇床中300rpm培养12h～16h至OD600为0.6～0.8，将得到的菌液离心后保留第一沉淀，将所述第一沉淀裂解后提取所述pUC-Dual质粒；
    在37℃下用Asc I内切酶和Sal I内切酶处理pUC-Dual质粒，充分反应后回收，得到所述双基因表达盒子Dual的片段；
    在37℃下用Asc I内切酶和Sal I内切酶处理pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体，将所述pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的GFP序列切除，充分反应后回收，得到线性化的pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体；
    按照摩尔比为3～10：1将所述双基因表达盒子Dual的片段与所述线性化pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体混合，再加入T4 DNA连接酶，4℃下连接过夜，得到含有连接质粒的连接产物；以及
    将所述含有连接质粒的连接产物转化感受态Top10大肠杆菌，并均匀涂布到选择性的LB平板上，37℃倒置培养12h～16h，挑取阳性菌落置于所述选择性LB液体培养基中，在37℃恒温摇床中300rpm培养12h～16h至OD600为0.6～0.8，将得到的菌液离心后保留第二沉淀，将所述第二沉淀裂解后提取所述连接质粒，所述连接质粒即为所述慢病毒表达载体。
  7. 根据权利要求6所述的慢病毒表达载体，其特征在于，还包括在得到所述双基因表达盒子Dual的片段之后，在所述双基因表达盒子Dual的片段的所述第一多克隆位点插入第一目的基因，在所述双基因表达盒子Dual的片段的所述第二多克隆位点插入第二目的基因的操作；
    所述第一目的基因为小鼠TCRα基因，所述小鼠TCRα基因的NCBI编号 为DQ452619，所述第二目的基因为小鼠TCRβ基因，所述小鼠TCRβ基因的NCBI编号为DQ452620。
  8. 一种慢病毒表达试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～5中任一项所述的慢病毒表达载体。
  9. 一种重组慢病毒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
    提供如权利要求1～4中任一项所述的慢病毒表达载体，并在所述双基因表达盒子Dual的片段的所述第一多克隆位点插入第一目的基因，在所述双基因表达盒子Dual的片段的所述第二多克隆位点插入第二目的基因，得到携带有目的基因的慢病毒表达载体；
    将所述携带有目的基因的慢病毒表达载体、pMDLg/pRRE载体、pRSV-Rev载体和pMD-G载体按照摩尔比为2：1：1：1混合后转染到293FT细胞中，转染后4h～6h更换为完全培养基培养，48h后收集培养液，离心后保留上清并将所述上清用0.45μm过滤头过滤，保留滤液，所述滤液即为重组慢病毒的溶液。
  10. 根据权利要求9所述的重组慢病毒的制备方法，其特征在于，还包括在得到所述重组慢病毒的溶液后，对所述重组慢病毒的溶液的滴度进行检测的步骤，具体为：
    第一天，将293FT细胞接种到多孔板中，每个孔接种2×105个细胞，每个孔加入500μL培养基，37℃、5％CO2培养过夜；
    第二天，按所述重组慢病毒的溶液的稀释比例为1、101、102、103、104、105、106、107和108，用培养基将所述重组慢病毒的溶液梯度稀释，接着分别将100μL梯度稀释的所述重组慢病毒的溶液与100μL多孔板中的细胞培养液在多孔板的不同孔中混合转染，转染开始后24h，吸去培养基并换成500μL含5UDNaseI的新鲜培养基，37℃下培养30min以去除可能附着于细胞表面的残余质粒DNA，然后将培养基换成1mL正常培养基，继续培养48h；
    第四天，吸去所述多孔板的每个孔中的培养基，加入500μL胰酶-EDTA溶液消化细胞，在37℃反应1分钟，接着加入培养基终止消化反应并将细胞吹洗下，离心收集每个孔的细胞，抽提每孔细胞的总RNA，接着逆转录得到每孔细胞的总cDNA；以及
    分别对得到的所述每孔细胞的总cDNA进行荧光定量PCR，得到每孔细胞的Ct值，选择与对照组Ct值差异最小但超过2的实验组，得到其稀释倍数，按照以下公式计算慢病毒滴度：
    T＝R×20×103，其中，T为慢病毒滴度，T的单位为TU/mL，R为稀释倍数。
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