CN104662171A - 个性化癌症疫苗和过继免疫细胞治疗 - Google Patents

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Abstract

鉴定了在来自癌症患者的癌细胞的表达基因中含有突变的癌抗原。通过将使用平行测序平台获得的来自癌细胞的序列与患者的正常基因或来自HLA匹配个体的正常基因比较来对该序列进行选择。通过鉴定癌症患者的HLA超类型并针对该HLA超类型选择在受影响基因中突变位置和/或相应野生型位置处具有特定氨基酸的序列，从而对序列进行进一步选择。可任选测试含有癌抗原的肽与癌症患者的HLA抗原的结合。评估含有癌抗原的肽对来自癌症患者或来自HLA匹配供体的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系的激活。针对癌症患者鉴定的癌抗原用于制备癌症疫苗并用于治疗该癌症患者。

Description

个性化癌症疫苗和过继免疫细胞治疗
相关申请的交叉参考
本申请要求2012年7月12日提交的美国临时申请61/670,931的权益，其通过引用纳入本文。
技术领域
本发明涉及来自癌症患者的癌细胞的表达基因中突变的鉴定和该突变在制备癌症疫苗和过继免疫细胞治疗中的用途。
发明背景
癌症是美国的第二大死因。估计在2010年，约570,000人会死于癌症并诊断出150万新病例(1)。对于早期癌症(未扩散到淋巴结且是非转移性的)，手术移除是非常有效的治疗。然而，对于较晚期的病例，使用标准的、非特异性癌症治疗(化疗和放疗)。这些治疗影响了许多健康细胞并导致毒性升高。医学伦理学最重要的原则之一“primum non nocere(首先不要造成伤害)”通常不适用于癌症治疗，其中需要对患者使用毒性很高的治疗方案，该治疗方案仅对一部分受治疗个体有效。此外，即使最初经成功治疗的个体也存在复发风险且在随后的各次复发后变得更难治疗。
使用适应性免疫系统杀死癌细胞而不损伤正常细胞的想法是数十年来的目标(关于综述，参见Dunn 2002(2))。为成为癌细胞，健康细胞经历了多次体细胞突变(3,4)。这类突变可以是适应性免疫系统的靶标，所述适应性免疫系统的功能是从自身中识别和消除微小变化。使用免疫疗法成功治疗癌症的可能性得到了以下发现的支持：(a)可从患有肿瘤的患者中分离肿瘤特异性淋巴细胞(6,7)；(b)浸润肿瘤(或在循环中)的肿瘤特异性淋巴细胞的存在与良好预后相关(8)；以及(c)已鉴定到肿瘤细胞上由T淋巴细胞识别的抗原(9,10,12)。相关的还有：(a)过继细胞免疫疗法对于经历骨髓移植(BMT)的患者中爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)相关的淋巴瘤和巨细胞病毒(CMV)感染显示出的有效性(11)，以及(b)过继细胞疗法在治疗患有转移性黑色素瘤的患者中的成功(7)。
然而，肿瘤抗原鉴定及其向免疫治疗的转化仍面临诸多问题。因此，能够在较早期以较有效的方式确定抗原是一个优势。如本文所述鉴定并使用抗原的方法使得对患者个性化的诊断和治疗成为可能，这增加了治疗成功的可能性。
发明内容
本发明提供了鉴定来自癌症患者的癌细胞的表达基因中的突变和使用该突变制备癌症疫苗和过继免疫细胞治疗以治疗癌症患者的方法。来自癌细胞的核酸序列获自平行测序平台，其采用平行处理癌细胞的核酸以生成序列读数并将序列读数映射至具有参考基因序列的数据库。在一些实施方式中，所述平行测序平台对测序结果使用某些过滤(如小于20x的覆盖深度)并且/或可不进行碱基比对质量(BAQ)算法过滤。
编码所有或部分表达基因的突变序列被鉴定为具有突变位置氨基酸，所述突变位置氨基酸取代了蛋白的野生型序列中同一位置的野生型位置氨基酸。
可通过鉴定HLA型和/或HLA超类型(supertype)癌症患者并随后针对特定HLA型和/或HLA超类型选择一种或多种氨基酸作为突变位置氨基酸和/或野生型位置氨基酸，从而实现突变序列的进一步选择。图7显示了各HLA型和/或HLA超类型的候选突变位置氨基酸和/或野生型位置氨基酸。或者，可以忽视个体的HLA型和/或HLA超类型并使用选自酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸和丙氨酸的一种或多种氨基酸进行进一步选择。
根据本发明，对含有感兴趣突变序列的肽评估其结合癌症患者的HLA组织相容性抗原的能力。这可使用基于计算机的算法进行计算机模拟以预测HLA结合的肽。或者或另外，可通过合成肽并测试其与HLA组织相容性抗原的结合来评估结合HLA组织相容性抗原的能力。对序列与HLA组织相容性抗原之间结合的测试并非必须，但可用于在进一步测试前缩小潜在的癌抗原组。
在其他实施方式中，可合成含有感兴趣突变序列的肽并评估其对从癌症患者或HLA匹配供体(匹配类和/或超类型)中制备的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系的激活。在这些情况下，通过接触以下两种细胞类型获得CTL细胞系：来自癌症患者或HLA匹配供体的单核细胞和来自癌症患者的癌细胞。CTL细胞系可使用就CD8+细胞进行富集的单核细胞制备且还包括添加来自癌症患者的自体CD4+T细胞和/或树突细胞或者来自HLA匹配供体的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。在仅使用肽刺激CTL的实施方式中，只需要匹配HLA型和/或亚型的供体。
在另一个实施方式中，鉴定来自癌症患者的癌细胞的表达基因中突变并使用该突变以制备癌症疫苗和用于治疗癌症患者的过继免疫细胞治疗的方法包括通过所述平行测序平台获得来自癌细胞的核酸序列。编码所有或部分表达基因的突变体序列被鉴定为具有突变位置氨基酸，该突变位置氨基酸取代了野生型蛋白序列中同一位置的野生型位置氨基酸。合成含有感兴趣突变序列的肽和任选的对应野生型序列肽并评估其对从癌症患者或HLA匹配供体中制备的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系的激活。在这些情况下，通过使来自癌症患者或HLA匹配供体的单核细胞接触来自癌症患者的癌细胞来获得CTL细胞系。CTL细胞系可使用就CD8+细胞进行富集的单核细胞制备且还包括添加来自癌症患者的自体CD4+T细胞和/或树突细胞或者来自HLA匹配供体的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。
具体而言，在一个方面，本发明提供了一种鉴定用于制备癌症疫苗的癌抗原的方法，该方法包括
a)获取来自癌症患者的癌细胞的核酸的多条突变序列，该突变序列编码所有或部分表达基因且所述突变序列各具有突变位置氨基酸，该突变位置氨基酸取代了野生型蛋白序列中同一位置的野生型位置氨基酸或其他突变(如插入或缺失)，所述突变序列通过使用平行测序平台获得，该平行测序平台对所述癌细胞的核酸进行平行处理以生成序列读数并将序列读数映射至具有参考基因序列的数据库；以及
b)通过鉴定癌症患者的HLA型或超类型从步骤a)中鉴定到的序列中选择突变序列并随后使用图7为所述HLA型或超类型的氨基酸选择作为突变位置氨基酸和/或野生型位置氨基酸的氨基酸，其中鉴定了用于制备癌症疫苗的癌抗原。
在另一个方面，本发明提供了一种鉴定用于制备癌症疫苗的癌抗原的方法，该方法包括
a)获取来自癌症患者的癌细胞的核酸的多条突变序列，该突变序列编码所有或部分表达基因且该突变序列各具有突变位置氨基酸，该突变位置氨基酸取代了野生型蛋白序列中同一位置的野生型位置氨基酸或其他突变(如插入或缺失)，该突变序列通过使用平行测序平台获得，该平行测序平台对所述癌细胞的核酸进行平行处理以生成序列读数并将序列读数映射至具有参考基因序列的数据库；以及
b)通过确定由至少一条突变序列编码的至少一个肽结合癌症患者的HLA型或超类型，从步骤a)中获得的多条突变序列中鉴定用于制备癌症疫苗的至少一条突变序列。
在另一个方面，本发明提供了一种用于预测本文所述疗法(如过继转移和疫苗接种)有效性的方法，该方法包括(a)从患者中(如从患者的癌症中)鉴定至少一条突变核酸序列，该突变序列编码所有或部分表达基因且编码的蛋白或肽包含相对于野生型的突变氨基酸取代或其他突变，且(b)确定突变肽与患者的HLA型或超类型的结合能力，其中HLA结合的强度、量和/或能力表示患者对治疗可能的应答，结合越强表示应答越高。可使用计算机技术(如本文所述技术)或通过体外测试确定结合能力，在体外测试中，评价经鉴定的突变肽与任意一种或多种患者的表达HLA的细胞(如本文所述)或表达与患者相同的HLA型或超类型的另一种细胞的结合。
本发明还提供了与癌症相关的突变序列，该序列选自图4和图5公开的任意序列。
还提供了使用通过上述方法中任意一种鉴定的一种或多种癌抗原制备的癌症疫苗。所述癌症疫苗可以是含有一种或多种癌抗原的多肽或者是编码用于表达一种或多种癌抗原的核酸。
还提供了一种通过上述任一方法鉴定来自获自癌细胞的核酸的癌抗原并通过使用一种或多种癌抗原制备疫苗来治疗癌症患者的方法。通过给予疫苗以在患者中生成CTL和/或给予通过使癌症患者或HLA匹配供体的单核细胞接触癌抗原疫苗从而在体外制备的CTL细胞系来治疗患者，或者通过使用疫苗免疫供体并将免疫的供体CTL转移至癌症患者来治疗患者。该接触可包括添加来自癌症患者或来自HLA匹配供体的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。
在另一个实施方式中，从通过上述任意方法从癌细胞中获得的核酸中鉴定癌抗原，使用一种或多种癌抗原制备疫苗，使癌症患者或HLA匹配供体(HLA型和/或超类型匹配)的单核细胞接触癌抗原疫苗以刺激CTL细胞系，并将CTL细胞系给予癌症患者以治疗癌症，从而治疗癌症患者。该接触可包括添加来自癌症患者或来自HLA匹配供体的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。
附图说明
图1a-c是一组流程图，涉及来自HLA-A1患者的急性髓细胞性白血病(AML)细胞中突变的鉴定。图1a显示了突变序列的初始选择，其通过对从白血病细胞、来自癌症患者的EBV转化细胞和来自HLA匹配供体的EBV转化细胞中制备的核酸进行的下一代测序来确定。获得了128,161条序列的初始组，并从其中选择了3,276条序列的组(命名为“L-seq1”)，其中与来自患者和供体的EBV细胞相比，来自癌细胞的基因中编码的氨基酸存在变化。图1b显示了从L-seq1组中进一步选择突变序列，突变体涉及来自患者癌细胞的蛋白中一个酪氨酸的获得或缺失。使用HLA肽结合软件通过计算机模拟测试含有涉及酪氨酸的突变序列的肽序列对HLA-A1抗原的结合。图1c显示了从L-seq1组中针对被报道与癌症相关的蛋白选择突变序列。使用HLA肽结合软件通过计算机模拟测试含有癌症相关基因中存在的突变的肽序列对HLA-A1抗原的结合。缩写如下所示：L：白血病；P：患者；D：供体；ref：参考；var：变体；IEDB：免疫表位数据库。
图2a-b是第二组流程图，涉及图1a-c所用的相同急性髓细胞性白血病(AML)细胞和供体细胞中突变的鉴定。图2a显示了23,947条序列的初始组的选择，并从其中选择了242条序列的组(命名为“L-seq2”)，其中与来自患者和供体的EBV细胞相比，来自白血病细胞的基因中编码的氨基酸存在变化。图2b显示了从L-seq2组中进一步选择突变序列，突变体与白血病细胞所表达基因相关(FPKM>0)或者涉及来自患者白血病细胞的蛋白中一个酪氨酸的获得或缺失。使用HLA肽结合软件通过计算机模拟测试含有涉及酪氨酸的突变序列或含有表达的突变序列的肽序列对HLA-A1抗原的结合。缩写如下所示：L：白血病；P：患者；D：供体；ref：参考；var：变体；IEDB：免疫表位数据库。
图3显示了L-seq1组中3,276条序列的患者和供体(P＝D)EBV细胞和白血病细胞在氨基酸分布上的差异(在来自P＝D的两个等位基因上L均有区别)。高亮的氨基酸涉及结合HLA-A1。
图4鉴定了L-seq1中具有涉及酪氨酸的氨基酸变化的蛋白并提供了患者和供体(P/D)的31个氨基酸的肽序列以及癌症患者的相应白血病细胞(L)。
图5从来自L-seq2的32个蛋白中鉴定了肽并提供了在白血病癌细胞(T)中的序列以及患者和供体(P/D)中的相应序列。还提供了各序列的HLA-A1结合评分。
图6鉴定了73个肿瘤相关基因。
图7鉴定了多个HLA超类型以及突变和野生型位置氨基酸，其可用于选择由NGS鉴定的突变序列。
图8是一组流程图，涉及来自实施例3中所述患者#2的急性髓细胞性白血病(AML)细胞中突变的鉴定。图8a显示了突变序列的初始选择，其通过对从白血病细胞、来自癌症患者的PHA刺激的淋巴细胞和来自HLA匹配供体的PHA刺激的淋巴细胞中制备的核酸进行的下一代测序来确定。获得了121,719条序列的初始组，并从其中选择了980条序列的组(命名为“L-seq”)，其中与来自患者和供体的PHA刺激的淋巴细胞相比，来自癌细胞的基因中编码的氨基酸存在变化。图8b显示了从L-seq中进一步选择通过转录组分析测得处于表达状态的突变序列。使用HLA肽结合软件使用计算机模拟测试了L-seq组的980个31聚体对多种HLA亚型的结合。预测那些31聚体中的571个表现出通过肽的至少一个区域对至少一种HLA亚型的HLA结合活性。总共有905个预测的结合区域，其中452个是野生型序列，453个是突变的序列。插入的表格显示了预测与各特定HLA结合的肽的数目。插入的表格中HLA结合序列的总数大于571，原因是有几种肽结合超过一种HLA等位基因。
图9显示了某些突变蛋白的列表，其中突变导致预测结合亲和性小于3％且与相应野生型肽相比结合出现了3倍的增长。各行代表一个含有突变的31聚体的结合分析。与一种以上MHC的结合表明在31聚体内存在一种以上肽序列负责结合。(a)体细胞突变目录＝COSMIC以及(b)H和L＝造血和淋巴组织。
具体实施方式
可用于免疫治疗的T细胞抗原的鉴定仍面临诸多问题。对抗原的搜索是十分费力的，且在发现抗原后，有一种推广抗原适应性的强烈倾向，假设在一个个体中有用的抗原会是用于治疗另一个体中相同类型肿瘤的抗原。该倾向基于以下概念：为成为有用的抗原，抗原需要在尽可能广泛的患者群体中发挥作用。该“推广”肿瘤抗原的实践并不考虑各肿瘤表达许多独特抗原以及个体的MHC分子限制T细胞应答的事实。因此，适用于治疗一个个体的抗原对另一个人可能并非是理想的。此外，迄今为止鉴定到的许多抗原是正常组织特异性抗原，这引发了自身免疫的问题。
肿瘤抗原的发现和免疫治疗应用的本范例旨在寻找“通用”或共同的肿瘤抗原(即在大部分个体中诱导良好免疫的抗原)并使用这些抗原以用于疫苗接种目的。使用这些方法获得的结果是令人失望的。实际上，对于受一种肿瘤影响的各患者，最好的免疫应答是有差异的。只有在使用系统性或无偏向的方法对许多个体鉴定到免疫库后，才可能确定免疫原性突变的共有模式。例如，一些基因受共有突变簇影响的发现可导致个性化较低的疗法的应用。
本发明提供了鉴定构成来自单个癌症患者的癌细胞中肿瘤相关和/或肿瘤排斥抗原的可用突变以及使用该抗原免疫来自患者的T细胞或HLA匹配供体的T细胞以识别并杀死癌细胞的方法。为此，使用下一代测序技术对癌细胞的转录组和外显子组以及来自癌症患者的EBV淋巴母细胞或PHA刺激的T细胞的外显子组进行测序。在使用骨髓移植的特定癌症中(例如在白血病中)，还可将来自癌症患者细胞的经测序的外显子组与来自HLA匹配的骨髓供体的EBV淋巴母细胞或PHA刺激的细胞的外显子组比较。该比较将得到被翻译成肽并用于过继转移治疗的基因的全部列表。
下一代测序策略使得能够在鉴定涉及转化的基因的尝试中进行肿瘤细胞的广泛分子表征。可获得的信息包括拷贝数目、表达水平和体细胞突变。
本文所用术语“下一代测序”(“NGS”)、“第二代测序”和“大规模平行测序”包括与测序过程平行的高通量测序方法，同时生成数千至数百万条序列(16,17)。平行化测序所产生的序列数目通常超过10,000，更通常超过100,000且最通常超过1,000,000。NGS设计与桑格(Sanger)测序不同，后者也称作“毛细管测序”或“第一代测序”，其基于单个测序反应中生成的链终止产物的电泳分离。
虽然各NGS平台在工程构造和测序化学方面具有差异，但大多数平台的共同点是通过使用流动池(flow cell)平行处理的单个DNA分子或空间分离且克隆扩增的DNA模板。将来自平行处理的大量输出物由主要成像输出物或检测输出物转化为序列。集成算法包进行了核心主要数据转化步骤：图像分析、强度评分、碱基读出以及将子序列读数与参考序列比对。参考序列包括人参考基因组NCBI37/hg19序列，其可获自加州大学圣克鲁兹分校(University of California Santa Cruz)的基因组生物信息学组(Genome Bioinformatics Group)(也可获自万维网)。公共序列信息的其他来源包括GenBank、dbEST、dbSTS、EMBL(欧洲分子生物学实验室(theEuropean Molecular Biology Laboratory))和DDBJ(日本DNA数据库(the DNADatabank of Japan))。因此，NGS指使用核酸的平行处理以进行序列读取并将序列读数映射至具有参考基因序列的数据库的平行测序平台。
用于使用NGS选择癌症特异性序列的本方法具有鉴定稀有突变体的潜力，该稀有突变体可能在使用更广泛的序列过滤时丢失。即使单个肿瘤也可含有不同类型的癌细胞和不同类型的干细胞，其持续进行自我复制并产生这些类型的癌细胞。排除序列比对和突变序列选择步骤之间的过滤可能导致更多的假阳性，但也提供了需要针对其进行免疫以治疗癌症的稀有序列突变
可对来自NGS系统的序列数据进行过滤以提供有助于准确性的早期选择标准。常见的过滤是“覆盖的深度”、“测序覆盖”或“覆盖深度”，指序列读数中给定DNA核苷酸出现的平均次数(换言之，这是覆盖任意特定碱基的读取的平均数目)(参见例如Nielsen等，Nature Reviews Genetics 12:4432011)。覆盖越大，准确读出序列差异的可能性越大。对于如本文所述进行癌症突变的检测，使用小于20x的覆盖深度，但更优选的覆盖深度是小于15x、小于10x、小于7x、小于5x、小于4x、小于3x、小于2x和1x。覆盖深度也可以在突变的情况下表示为对于任意特定碱基参考和变体组合的平均读取数目(例如参考是患者或供体EBV B细胞序列且变体是癌细胞序列)。对于癌症突变，参考+变体大于等于20可用于以低深度置信区间进行鉴定(例如对参考18x加对突变2x)。
另一种过滤是碱基比对质量(BAQ)，该方法精确测量读取的碱基被错误比对的概率(例如参见Li,Bioinformatics；27(8):1157–1158[2011])。通过默认开启碱基比对质量(BAQ)计算并调节覆盖深度值以更好地模拟局部重新比对。BAQ是一种类似Phred的评分，代表读取的碱基被错误比对的概率；其降低了插入缺失附近错配读数的碱基质量评分。这旨在帮助排除由于小插入缺失附近比对矫作物而导致的假阳性SNP读数。可通过使用参数调节过滤。可使用-B参数禁用BAQ或使用-E参数进行更灵敏的BAQ计算。
密码子编码公司(CodonCode Corporation，58Beech Street，马萨诸塞州戴德姆，02026)提供了Phrap、Phred和Cross_match的Windows、Mac OS X和Unix版本，用于序列组装、质量碱基读出和快速序列比较的Phil Green程序。密码子编码公司还提供了Consed的Unix和Linux版本、David Gordon毗连群编辑器(contigeditor)和用于Phred和Phrap的自动完成工具。读出碱基后，Phred检查各碱基读数周围的峰以向各碱基读数分配质量评分。质量评分范围从4至约60，数值越高对应质量越高。质量评分与错误概率对数相关，如下表所示：
另一种序列数据过滤是概率建模，其使用算法以过滤低频率变体。
NGS测序技术包括焦磷酸测序、使用逆染料终止子的合成法测序、寡核苷酸探针连接测序和实时测序。NGS测序技术是市售可得的，如来自昂飞公司(Affymetrix Inc.)(加利福尼亚州萨尼维尔)的杂交测序平台和来自454生命科学公司(454Life Sciences)(康涅狄格州布拉德福德)、螺旋生物科学公司(HelicosBioSciences)(马萨诸塞州剑桥)、亿明达/索来萨公司(Illumina/Solexa)(加利福尼亚州海沃德)的合成测序平台以及来自生命技术公司(Life Technologies)(加利福尼亚州圣迭戈)的连接测序平台。数个公司提供针对$10,000或更低客户的NGS测序。
NGS测序技术的第一个熟知的示例是454(罗氏)生命科学公司测序系统(例如参见Margulies,M.等Nature 437:376-380[2005])。在454测序中，首先将DNA剪切成约300-800碱基对的片段，并使该片段具有钝端。将用作扩增和片段测序引物的寡核苷酸衔接子连接至片段的末端。将衔接的片段与DNA捕获珠相连并在油-水乳液的液滴中对珠使用PCR进行单个扩增以在各珠上生成克隆扩增的DNA片段的多个拷贝。在孔中捕获珠，并在其中对各DNA片段平行地进行焦磷酸测序。焦磷酸测序使用焦磷酸(PPi)，其在加入核苷酸时释放，在存在腺嘌呤5′磷酰硫酸的情况下通过ATP硫酸化酶转化成ATP，该ATP随后用于将荧光素转化成氧化荧光素，生成可检测和测量的光。
其他示例性NGS测序技术包括Helicos True单分子测序(tSMS)(例如参见Harris T.D.等Science 320:106-109[2008])、纳米孔测序法(例如参见Soni G V等Clin Chem 53:1996-2001[2007])、化学敏感性场效应晶体管(chemFET)阵列(例如参见美国专利申请公开号20090026082)、使用透射电子显微镜(TEM)的HM公司(Halcyon Molecular)的方法(例如参见PCT专利公开WO 2009/04644)、亿明达公司的合成测序和基于可逆终止子的测序化学(例如参见Bentley等Nature6:53-59[2009])、SOLiDTM(生命技术公司)连接测序技术(例如参见McKernan等Genome Research 19(9):1527–41(2009])、太平洋生物科学公司(PacificBiosciences)的单分子实时(SMRTTM)测序技术(例如参见Levene等，Science.299682-686[2003])以及生命技术公司在半导体芯片上的Ion Torrent单分子测序。
NGS可用于生成全基因组序列或全基因组序列的子集(如外显子组序列或转录组序列)。本文所用术语“基因组序列”可指“基因组文库”或“序列的基因组文库”。类似地，术语“外显子组序列”和“转录组序列”也可分别指“外显子组文库”或“序列的外显子组文库”或者“转录组文库”或“序列的转录组文库”。
通过对全部的基因组DNA应用NGS获得全基因组序列。外显子组代表基因组内所用基因的蛋白编码序列。例如，通过制备基因组文库并使用目标富集法(如杂交捕获或溶液内捕获)选择外显子组序列来获得外显子组序列。由于富集不完全，外显子组文库可含有内含子或其他非外显子序列。例如，外显子组文库可以是相对于外显子序列仅约50％纯。
可使用已知方法通过全转录组测序鉴定来自癌细胞的突变序列(13-15)。转录组是所有RNA分子的集合，包括一种细胞或细胞群体生成的mRNA、rRNA、tRNA和其他非编码RNA。使用cDNA文库通过下一代测序技术在核苷酸水平研究转录组称为RNA-Seq(例如参见Wang等，Nature Rev.Genetics 10(1):57-63[2009])。RNA-Seq在多个水平上对基因组的转录提供了深入理解，其生成序列、剪接和表达水平信息，从而能够鉴定新转录本和序列改变。转录组序列也可通过对RNA应用目标富集法(如杂交捕获或溶液内捕获)来获得(例如寡核苷酸“饵”捕获)。RNA-seq不需要参考基因组以获得有用的转录组信息。RNA-Seq方法(例如参见来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)、生命技术公司(Life TechnologiesCorporation)的SOLiDTM全转录组分析试剂盒)保留了链特异性并可以检测缺少核糖或聚A的RNA。然而，可将转录组序列映射到国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information,NCBI)的参考序列(RefSeq)mRNA数据库。
可通过评价在转录组文库上进行的NGS获得来自NGS的基因序列的表达水平。单位FPKM(预期的片段/千碱基转录本/百万测序的片段)提供了用于估计各转录本比例的数值。
近期出版物报道了无需克隆cDNA文库或者甚至简单扩增mRNA(19)即可进行转录组测序、分析互补DNA(RNA-seq)(18)。新方法消除了由于RNA/DNA扩增和克隆而导入错误的步骤。这些新方法不仅能够检测突变而且成为涉及全基因组分析中拷贝数目变化和基因表达的研究中微阵列的替代方法。
适用于分析的癌症通常包括癌、白血病或淋巴瘤，和肉瘤。癌可以是乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊和胆管癌、小肠癌、尿道癌、女性生殖道癌、男性生殖道癌、内分泌癌和皮肤癌。其他合适的癌症包括血管瘤、黑色素瘤以及脑、神经、眼和脑膜的肿瘤。
来自NGS的序列读数可编码癌细胞中的所有或部分表达基因。感兴趣的突变可来自野生型氨基酸的替换，但也可来自编码核酸中核苷酸序列的缺失或插入导致的氨基酸变化。如本文中所用，“突变”指DNA序列中偏离正常的任何变化(或氨基酸序列中的变化)。因此，当群体中存在普遍的正常等位基因时，突变将其改变为稀有和异常的变体。相反地，“多态性”是群体中常见的DNA序列差异。在该情况下，不存在被认为是标准序列的单个等位基因。而是存在两种或多种可接受程度相同的野生型序列替代形式。如本文中所用，突变和多态性之间的截留点可以是百分之一。因此，当最少见的等位基因在群体中具有至少百分之一的频率时，产生了多态性。如果频率低于1％，则该等位基因被认为是突变。
将来自癌细胞的外显子组和/或转录组文库的编码序列与来自患者的EBV淋巴母细胞(或PHA母细胞)或任何其他细胞(除来自癌症患者的肿瘤细胞外)的外显子组比较，并在一些情况下与来自HLA匹配的骨髓供体的EBV淋巴母细胞(或PHA母细胞)的外显子组比较。优选的突变是癌症中基因编码区序列不同于来自患者的正常细胞或实质上是野生型的细胞(例如EBV转化细胞)的相同基因和(如果使用)来自HLA匹配的骨髓供体的相同基因的那些突变。优选地，来自正常细胞或实质上是野生型的细胞(例如EBV转化细胞)中基因的序列和来自HLA匹配的骨髓供体中基因的序列是相同的。该方法如图1(a)和2(a)所示。
可通过鉴定在癌细胞基因序列中具有特定氨基酸和/或在野生型基因序列中相应位置具有特定氨基酸的那些序列，从而进一步选择在癌细胞中表达的基因的编码区中鉴定到的突变。来自癌细胞中基因相应位置和来自相应野生型序列的氨基酸可以分别称作“突变位置氨基酸”和“野生型位置氨基酸”。
基于特定突变位置氨基酸和野生型位置氨基酸的序列选择可取决于癌症患者的I型或II型超类型主要组织相容性复合物(MHC)的性质。如本文中所用，MHC指所有脊椎动物中由大基因家族编码的细胞表面分子。MHC分子介导白细胞的相互作用，白细胞也称为血白细胞(WBC)，其是免疫细胞(还有其他白细胞或体细胞)并通过交叉免疫确定个体对自身免疫疾病的易感性和器官移植供体的相容性。在人中，MHC也可指人白细胞抗原(HLA)。
MHC基因家族分为三个亚组：I型、II型和III型。I型和II型MHC介导的抗原呈递多样性以多种方式实现：1)MHC的遗传编码是多遗传的；2)MHC基因是高度多态性的且具有许多变体；以及3)几种MHC基因由两种遗传等位基因表达。
MHC的功能是在细胞表面上展示蛋白分子的肽片段(表位)用于T淋巴细胞(T细胞)的识别，所述肽片段可以是宿主自身的表型或其他生物实体的。II型MHC抗原通常介导针对抗原的免疫(特异性免疫)，而I型MHC抗原通常介导展示该抗原的宿主细胞的破坏。
HLA I型分子可分成各组(命名为超类型)，代表共有明显重叠的肽结合特异性的分子组。可通过超基序(supermotif)描述各超类型，该超基序反映了由相应超类型内分子识别的宽的主要锚定基序。
根据本发明的一个实施方式，通过鉴定癌症患者的I型或II型MHC并随后选择一个或多个在癌细胞中变化的野生型位置氨基酸和/或突变位置氨基酸，从而进一步选择最初通过NGS鉴定的大量突变序列。因此，通过鉴定癌症患者的HLA超类型并随后使用图7为HLA超类型选择一个或多个氨基酸作为突变位置氨基酸和/或野生型位置氨基酸，从而选择突变序列。图7中的氨基酸构成了已知的HLA口袋对特定HLA超类型的氨基酸结合偏好(参见例如Sydney等，BMC Immunology2008,9:1；Ramensee等，Immunogenetics(1999)50:213)。粗体和下划线高亮显示的氨基酸是优选的结合残基。例如，当癌症患者表达HLA-A1作为I型MHC抗原时，特定的突变位置氨基酸或野生型位置氨基酸选自：酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸，更优选地选自亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，且更优选地是酪氨酸。在一个实施方式中，可针对突变氨基酸位置和野生型基因序列中相应氨基酸位置涉及任意酪氨酸的获得或缺失来对通过NGS获得的突变体和相应野生型序列的初始组进行选择。该选择步骤如图1(b)和2(b)所示。选择HLA超类型的一个或多个氨基酸作为突变位置氨基酸和/或野生型位置氨基酸，所述一个或多个氨基酸可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。基于一个或两个氨基酸的选择足以将文库限定为可管理数目的候选突变序列。
在一些实施方式中，可忽视个体的HLA型和/或超类型并基于特定突变位置氨基酸和/或野生型位置氨基酸进一步选择突变体。在这种情况下，一个或多个氨基酸可选自酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸和丙氨酸。对于与HLA超类型无关的突变体选择，可从该组中选择1、2、3、4、5或6个氨基酸。
通过评价含有突变序列的肽结合癌症患者表达的MHC抗原的能力，可进一步选择来自癌细胞的突变序列，该突变序列是被细胞毒性T淋巴细胞识别的潜在T细胞表位。术语“肽”、“多肽”和“蛋白”互换使用以表示氨基酸残基的聚合物。这些术语还指所有氨基酸都是天然产生的或者一个或多个氨基酸残基是相应天然产生的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。氨基酸可以是L或D形式，前提是保持肽的结合功能。
所有肽序列都根据通常接受的习惯书写，其中α-N端氨基酸残基位于左侧而α-C端氨基酸残基位于右侧。本文所用术语“N端”指肽中氨基酸的游离α-氨基基团，而“C端”指肽中氨基酸的游离α-羧酸末端。使用基团N端封闭的肽指在N端氨基酸残基的α-氨基氮上携带基团的肽。使用基团N端封闭的氨基酸指在α-氨基氮上携带基团的氨基酸。
可使用用于预测肽与特定MHC分子结合的IC50值的基于计算机算法通过计算机模拟选择来自癌细胞的突变序列，该突变序列是被细胞毒性T淋巴细胞识别的潜在T细胞表位。预测工具可容易地在线获得，例如免疫表位数据库(IEDB)(24,25)、NetMHC-3.0(26)和SYFPEITHI数据库(Ramensee Immunogenetics 1999)可用于预测肽序列。对于IEDB，通过比较肽的评分与选自SWISSPROT数据库的500万个随机15聚体的评分，使用三种方法(ANN、SMM_align和Sturniolo)生成各肽的百分等级(percentile rank)。随后使用三种方法的百分等级生成复合方法的等级。数字小的百分等级表示高亲和性T细胞表位。成为结合分子(binder)对比不结合的可能性之间的比例也被用于评价结合表位(参见例如美国专利公开2012/0070493)。
MHC I型分子呈递的T细胞表位通常是长度为8至11个氨基酸的肽，而MHCII型分子呈递长度为13-17个氨基酸的较长的肽。然而，T细胞表位上仅有的实际限制是其能够结合MHC分子，需要时可通过经验来确定。在线T细胞表位预测程序是非常精确的，所预测肽序列的精确性为95％(26)。
可通过合成肽并测试其与表达MHC抗原的抗原呈递细胞的结合以使用有用的T细胞表位对肽进行选择(参见例如Peters等，2006年6月，PLoS ComputationalBiology 2:6e65)。用于测试癌症特异性T细胞系的特异性的肽优先级可根据其涉及癌基因的程度并随后通过其与患者MHC的亲和性来确定。
预测与II型MHC抗原结合的肽难于I型MHC抗原。对于II型MHC，可合成较长的肽(如31聚体)并通过体外实验根据与表达II型的细胞的结合进行选择，从而实现上述目的。例如，针对肽诱导II型限制性T细胞的能力或者作为辅助细胞表位并辅助诱导I型限制性T细胞的能力。由于其长度，II型肽较混杂并结合多种II型等位基因。在31聚体中，可发现结合多种I型等位基因的表位。
可对经预测或显示结合由癌症患者的细胞表达的I型或II型MHC抗原的肽进行测试以确定其是否被由癌症患者或HLA匹配供体制备的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系识别。这可通过标准试验确定。例如，对于由患者制备的CTL系，可使用已公开的方法(23)测试其针对患者白血病母细胞(LB)、PHA诱导的T淋巴细胞细胞系以及皮肤成纤维细胞(FB)的细胞毒性。还可对来自患者的CTL系进行测试以确定其是否抑制非白血病造血祖细胞的生长(22，表1)。多克隆CTL制备物富含CD8+但含有一些CD4+细胞(22)。CTL系的激活可通过使用ELISpot试验或ELISA确定干扰素γ(IFNγ)分泌水平来测量，ELISA能够容易地适用于高通量筛选。
这些方法可用于获得来自癌症患者的多克隆、白细胞特异性T细胞系，还用于其富集或克隆。通过使用这些方法，可确定通过NGS选择的特定突变是否能够激活来自患者的CTL细胞系，从而杀死患者的癌细胞而对来自癌症患者或MHC匹配的正常供体的正常细胞(如EBV淋巴母细胞)没有作用。激活CTL的具有突变序列的肽能够鉴定患者癌细胞中对于维持白细胞表型至关重要的突变基因(司机突变(driver mutation))，或者鉴定不涉及癌症表型的任何其他基因中的突变(过客突变(passenger mutation))。
可使用以下方法中的一种或多种评价激活患者(或HLA匹配个体)中对癌细胞特异的CTL系的来自癌细胞的具有突变序列的肽的MHC限制作用(MHCrestriction)：由MHC特异性抗体封闭，有一个等位基因区别的成对的EBV转化细胞系的识别，和/或.221细胞系(不含I型MHC的EBV转化细胞系)单个等位基因转染子的识别(22)。具有广泛MHC限制作用的突变肽可用于激活具有不同I型和II型MHC抗原的来自癌症患者的癌症特异性CTL。
激活来自癌症患者的CTL系或者已通过其他方法进行选择(即预测结合癌症患者HLA中一种)的突变肽可用于在体外从来自患者或来自HLA匹配对象的单核细胞中诱导白血病特异性CTL。希望使用突变肽在体外直接刺激单核细胞以诱导识别并杀死肿瘤细胞的T细胞系。这将避免使用癌症细胞来刺激T细胞诱导(在实体瘤的病例中非常希望的特征)并使CTL系可以更快速和廉价的方式使用。可通过ELISpot试验测试使用该方法制备的效应细胞对肽和白血病细胞的识别。还可通过测定杀死肿瘤所需的细胞数目来测试CTL系的亲和性。
含有特定序列的突变肽可用于癌症疫苗的制备，该序列含有来源于患者或HLA匹配供体或已通过其他方法进行选择(即预测结合癌症患者HLA中的一种)的癌症特异性CTL系所识别的表位。这类疫苗代表可给予患有癌症的个体以引发CTL的免疫原性组合物，该CTL能够特异性识别癌症细胞表达的突变序列并导致杀死癌细胞。因此，疫苗组合物包含对应于通过本文所述方法鉴定的肿瘤特异性新抗原的突变肽或突变多肽。
合适的疫苗优选含有至少一种突变肽序列，且更优选地含有多种突变肽序列(如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种)。根据与接受疫苗的癌症患者表达的MHC抗原的结合能力选择疫苗中使用的突变肽抗原。更好地，它们是被对肿瘤特异的CTL系识别的肽或可诱导对肿瘤特异的CTL系。
该疫苗可含有不同肽序列的混合物或包含多种突变序列的单个多肽，后者也称作多聚蛋白(polyprotein)。该肽或多聚蛋白可通过肽合成化学制备。对于长度超过约50个氨基酸的蛋白，肽合成的效率成本需要通过本领域熟知的重组DNA表达方法(如前文所述的细菌和酵母中的表达系统)生产多肽或多聚蛋白(参见例如美国专利号5,116,943)。通常，可将编码突变肽序列的核酸克隆至表达载体中用于编码产物的高产量表达。该表达载体可以是病毒、质粒的一部分，或者可以是核酸片段。该表达载体包括表达盒，其中克隆有与启动子可操作相连的编码突变肽序列的核酸。该表达盒还可包括其他特征，如复制起始和/或染色体整合元件(如逆转录病毒LTR或腺相关病毒(AAV)ITR)。如果需要分泌突变肽序列，可将编码信号序列的DNA置于编码成熟氨基酸的核酸上游。
适用于复制和支持突变肽序列表达的细胞是本领域熟知的。这类细胞可使用特定表达载体适当地转染或转导，并可使含有大量载体的细胞生长以接种大规模发酵罐，从而获得足量的突变肽序列以用于临床应用。这类细胞可包括原核微生物(如大肠杆菌)或多种其他真核细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、昆虫细胞等)。在这些系统中表达外源基因的标准技术是本领域已知的。
该疫苗还可以核酸载体的形式给予，该核酸载体编码突变序列并能够在载体进入适当细胞后表达该序列。该载体中包括多种本领域技术人员熟知的调节序列以确保在目标细胞中表达突变序列。示例性载体可以是来自病毒，如牛痘或腺病毒。进入合适的宿主细胞后，突变肽序列从载体中表达并引发宿主CTL应答。
该载体可通过“小基因”方法编码多聚蛋白序列，其中编码多个突变肽序列(即多个CTL表位)的序列包含在表位之间含有或不含有接头序列的单个开放阅读框中。因此，这些编码表位的DNA序列是直接相连的，形成连续的多肽序列。高效基因表达所需的其他载体修饰可包括使用内含子。还可考虑加入mRNA稳定化序列的以增强小基因表达以及免疫调节序列(如CpG)。构建小基因的一种替代方法是在独立的表达控制下具有不同的突变表位，如在多顺反子系统下或使用完全独立的控制(如使用独立的启动子和相关表达元件)。
在一些实施方式中，编码多种突变肽序列的载体也可编码第二蛋白，该第二蛋白被包括其中以增强免疫原性。可有益地增强免疫应答的蛋白或多肽的示例包括细胞因子(如IL2、IL12、GM-CSF)、细胞因子诱导分子(如LeIF)或共刺激分子和辅助T细胞(参见例如Vitiello等，1995.Journal of Clinical Investigation 95,341)。这些免疫增强蛋白的表达可通过全调节、部分调节(例如双顺反子表达载体)和使用单独的载体来实现。
该疫苗可包含运载体以增强所得针对肽突变序列的免疫应答。本文所用“运载体”是增加抗原分子量从而呈现抗原免疫原性的分子。运载体可以是任何合适的蛋白，例如钥孔血蓝素、血清蛋白(如转铁蛋白、血清白蛋白等)、骨架结构(如多肽)或抗原呈递细胞(如树突细胞)。
该疫苗可与佐剂共同给予。本文所用术语“佐剂”指增强针对抗原的免疫应答的任何物质。因此，佐剂用于通过刺激免疫系统使其对疫苗作出更强烈的应答来修改或扩大疫苗作用。佐剂可包括脂质体、脂多糖(LPS)、抗原的分子笼、细菌细胞壁的组分和内吞的核酸(如双链RNA(dsRNA)、单链DNA(ssDNA)、白介素(如IL-12)和含有未甲基化的CpG二核苷酸的DNA)(参见例如美国专利号6,406,705)。佐剂可与疫苗混合或可共价或非共价地与突变序列肽或多肽相连。
可以足够的量给予突变肽疫苗(多肽或多肽表达载体)以治疗具有表达突变肽序列的癌细胞的癌症患者。选择会结合由癌症患者表达的MHC抗原以及由其呈递的突变肽序列。给予的疫苗会在患者中针对癌细胞生成CTL，该细胞会杀死癌细胞从而对患者进行治疗。或者或另外，可给予患者由癌症患者或从HLA匹配供体制备的CTL细胞系，该CTL细胞系会特异性杀死患者中的癌细胞。可使来自癌症患者或来自HLA匹配供体的单核细胞在体外接触疫苗或接触来自患者的癌细胞，从而制备这些CTL细胞系。
本文所用短语“有效量”指足以提供足够高浓度以对其接受者给予有益效果的剂量。针对任何特定对象的特定治疗有效剂量水平取决于多种因素，包括所治疗疾病、疾病的严重程度、特定化合物的活性、给药途径、化合物的清除速率、治疗的持续时间、与化合物联用或相符的药物、对象的年龄、体重、性别、饮食和总体健康，以及医疗领域和科学中熟知的其他因素。用于确定“治疗有效量”的各种总体考虑是本领域技术人员已知的且描述于例如Gilman等编，Goodman And Gilman's:The Pharmacological Bases of Therapeutics(《Goodman和Gilman的治疗剂的药理学基础》)，第8版，培格曼出版公司(Pergamon Press)，1990；以及Remington'sPharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)，第17版，马克出版公司(MackPublishing Co.)，宾夕法尼亚州伊斯顿，1990。剂量水平通常落入约0.001至最多100mg/kg/天的范围内，其中通常适用约0.05至最多10mg/kg/天的范围。可经胃肠道外给予组合物，如血管内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、口服等。该组合物可以推注或缓慢输注的方式给予。
最初可通过测定IC50由细胞培养试验估计治疗有效剂量。随后可在动物模型中配制剂量以实现包括细胞培养中测得的IC50的循环血浆浓度范围。可利用这些信息更精确地确定人用初始剂量。可通过例如HPLC测量血浆中活性成分水平。可以由单个医师根据患者的病症选择确切的制剂、给药途径和剂量。
如果患者从癌症中痊愈或如果癌症处于缓解期，则通过本发明的方法治疗癌症患者。如本文所用，缓解指患有慢性疾病的患者中疾病活性不存在的状态。因此，处于缓解期的癌症患者中，其癌症得到治愈或癌症得到控制。因此，当肿瘤无法扩大或转移时，癌症处于缓解期。完全缓解指缺少疾病活性，且诊断方法(如成像(如CT和PET)以及有时通过骨髓活检)显示没有疾病迹象。当癌症患者处于缓解期时，可伴随复发，此时癌症重新出现。复发期间还可通过过继转移来治疗癌症患者。
可通过来自患者或来自HLA匹配供体的T细胞在体外接触突变(和任选的野生型)肽疫苗(多肽或多肽表达载体)以刺激癌症特异性CTL细胞系。可扩大CTL细胞系以生成足够的细胞数量并随后给予癌症患者以治疗癌症。体外接触还可包括添加来自癌症患者或来自HLA匹配供体的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。在给予CTL期间或之后，可给予患者疫苗以进一步刺激针对患者中癌细胞的CTL活性。
术语“CD4+T细胞”指生产CD4蛋白并与树突细胞相互作用以诱导抗原呈递或树突细胞成熟的淋巴细胞。CD4+T细胞可分离自天然来源，如血液、培养基中生长的细胞系和CD4+T细胞克隆。
术语CD8+T细胞指生产CD8蛋白的淋巴细胞。能够杀死目标细胞的CD8+T细胞称作CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。CD8+T细胞可分离自天然来源，如血液、培养基中生长的细胞系和CD8+T细胞克隆。
用于形容CD8+CTL时，术语“选择性”或“特异性”指与正常细胞相比，优先识别癌细胞并对其具有细胞毒性活性的CD8+CTL。选择性CTL可区分(或可经制备以区分)目标病理异常细胞与非目标细胞且基本不与非目标细胞发生交叉反应。病理异常细胞指由于疾病或异常病症相关生理特性或表型的变化而异于正常细胞的细胞。癌细胞是病理异常细胞的一个示例。
用于形容细胞时，术语“离体”旨在表示位于体外的细胞。因此，离体细胞培养方法涉及从个体中收获细胞。离体培养方法适用于收获自个体的任何组织或器官的细胞。
用于形容选择性CTL活性时，术语“原位”旨在表示选择性CTL可破坏身体完整结构中的目标病理异常细胞。例如，选择性CTL可破坏细胞的异质群体中的目标细胞。具体而言，选择性CTL可从组织(如血液或骨髓)中清除病理异常细胞(如肿瘤细胞)。
在用于诱导加强CD8+CTL活性时，术语“足够时间”指通过树突细胞加工和呈递抗原、通过CD8+CTL识别抗原和细胞毒性激活的时间。允许该过程完成的足够时间可根据方法中各种细胞群体的差异而不同，并导致抗原摄取速率的差异。影响用于CD8+CTL诱导的足够时间的因素可包括培养基中的细胞类型、各种细胞类型的纯度、细胞类型的浓度和树突细胞是不成熟的还是在培养时正在呈递抗原。
用于形容细胞时，本文所用术语“分离的”指细胞独立于天然状态下与之相连的一种或多种组分。分离的细胞还包括纯化自非细胞组织组分(如结缔组织纤维)的细胞。分离的细胞可以是例如新鲜纯化自非细胞组织组分或培养了一代或数代的原代细胞。分离的细胞的示例是分离自血液的细胞，如外周血单核细胞(PBMC)的细胞制备物。
除非另有说明，术语“基本上”指大于90％，更优选地大于95％且更优选地大于99％。
本文所用术语“抗原”指可由抗原呈递细胞加工和呈递并随后由T细胞受体识别的分子。这种分子可以是例如多肽或肽。
用于形容CD8+T细胞的免疫反应性时，术语“目标”指任何预定抗原。预定抗原可以是例如细胞或多肽。
用于形容CD8+T细胞时，本文所用术语“幼稚(naive)”指CD8+T细胞未在体内接触特定目标细胞或抗原。因此，幼稚CD8+T细胞与特定目标细胞或抗原离体接触以使其具有选择性针对特定目标细胞或抗原的CTL活性。
本文所用术语单核细胞指具有单个细胞核的细胞。单核细胞可以是免疫细胞且可获自体内多个位点中的任意位点，如血液、淋巴、脾、淋巴结、胸腺和骨髓。
本文所用术语“治疗”旨在表示病理异常细胞所介导的病理病症的严重程度下降或预防。严重程度下降包括例如临床症状、生理指标、生物化学标记或代谢指标的阻滞或降低。疾病的预防包括例如排除疾病发生或在疾病发生前使患病个体恢复至其健康状态。癌症的治疗可反映为肿瘤尺寸的维持或下降、不存在转移或不存在额外的转移、无疾病间隔期的增多或存活期的延长。
本文所用术语“有效量”旨在表示给予个体时使病理病症扩散的程度、量或速率下降所需的CD8+CTL的量。治疗有效所需的CTL制剂的剂量可取决于例如待治疗病理病症和目标抗原的丰度和密度水平以及个体的重量和状态和前期或同时的治疗。被认为对本方法所提供的选择性CTL的特定应用是有效剂量的合适量可由本领域技术人员使用本文所提供的指引确定。本领域技术人员应理解，需要在整个治疗期间监测患者的病症并根据个体对治疗的应答调节所给予组合物的量。
以下实施例用来说明本发明。在任何情况下，这些实施例都不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：使用NGS从外显子组和转录组文库中鉴定癌症突变
图1a-c显示了用于鉴定可作为免疫识别目标的癌细胞中突变的示意图。白血病细胞(L)和爱波斯坦-巴尔病毒转化的B细胞(患者EBV细胞系)(P)获自造血干细胞移植(HSCT)前的患者#1。使用先前发表的方法从血液中分离白血病细胞(22,27)并制备EBV细胞(参见例如Caputo JL等，J.Tissue Culture Methods 13:39-44,1991)。也可从骨髓供体(D)中以类似方法生产EBV细胞系。将细胞冻存在液氮中。
根据与北卡罗来纳州达勒姆的表达分析公司(Expression Analysis,Inc.)的合同，从患者#1白血病细胞、患者#1EBV细胞系和供体EBV细胞系中使用NGS方法制备DNA外显子组文库。使用患者白血病细胞通过表达分析公司制备RNA转录组文库。除测序外，还使用转录组文库评价白血病细胞样品中已知基因的表达水平。
首先使用参考+变体大于等于20x的覆盖深度的对来自各文库的测序结果进行过滤，不使用碱基比对质量(BAQ)校正和概率建模来过滤掉低频率变体。在该方法下，与参考基因序列(人参考基因组NCBI37/hg19序列(加州大学圣克鲁兹分校的基因组生物信息学组，可获自万维网))不同的来自各细胞来源的序列生成了128,161个突变的初始组(“128K组”)(图1)。
使用下文所列标准对128K突变组进行进一步选择：
弃去在外显子外产生的所有变体；
选择碱基差异导致非同义氨基酸(aa)变化的序列；以及
选择白血病细胞的基因中特定位置氨基酸在来自患者和供体的EBV细胞系在两个等位基因中都不同的序列，和在患者和供体的EBV细胞系中氨基酸是相同(纯合子或杂合子)的序列。这可总结为(在两个等位基因处)L的氨基酸(aa)均不同于P和D(在两个等位基因处L均不同于P＝D)。
应用于128K组的这些额外选择的结果是产生了3,276个非同义白血病特异性序列的较小的组(L-seq1)。可通过选择与73个已知肿瘤相关基因(TAG)文库中任一文库相关的那些序列获得3,276组的进一步选择(参见图6)。与TAG相连的该突变组随后减少至92(图3)。
图2a-b显示了用于加工获自患者#1的原始测序信息的第二种方法。对初始序列过滤至至少20个读数(大于等于20x)的深度，排除稀少的变体并进行BAQ校正。在该方法下，与参考基因序列不同的来自各细胞来源的序列生成了23,947(24K)个突变的组。
使用下文所列标准对24K突变组进行进一步选择：
弃去在外显子外产生的所有变体；
选择碱基差异导致非同义氨基酸(aa)变化的序列；
选择白血病细胞的基因中特定位置氨基酸在来自患者和供体的EBV细胞系在两个等位基因中都不同的序列，和在患者和供体的EBV细胞系中氨基酸是相同(纯合子或杂合子)的序列。这可总结为(在两个等位基因处)L的氨基酸(aa)均不同于P和D(在两个等位基因处L均不同于P＝D)。
应用于24K组的这些额外选择的结果是产生了242个非同义白血病特异性序列的较小的组(L-seq2)。仅选择通过转录组文库测得的表达水平(FPKM)大于零的那些序列，从而将该组进一步减少至127条序列(图2b)。
实施例2：选择具有潜在HLA结合基序的癌症特异性突变
对来自L-seq1和Lseq2的突变组进行进一步选择以鉴定具有结合癌症患者HLA抗原前景的较小亚组。为此，评估各L-seq中是否具有涉及酪氨酸获得或缺失的突变。对于L-seq1，有15条序列具有酪氨酸获得并有184条序列具有酪氨酸缺失(图1b)。对于来自癌细胞表达的基因的L-seq2中的127条序列，有5条序列具有酪氨酸获得并有10条序列具有酪氨酸缺失(图2b)。
将含有涉及酪氨酸(获得和缺失)的突变序列的肽序列和相应的野生型肽(通过计算机模拟)转录为21聚体肽，其中在涉及酪氨酸的位点两侧均含有10个氨基酸。随后评估该21聚体肽是否具有在IEDB的T细胞表位预测程序下表现出与HLA-A1结合的8-11个氨基酸的表位。鉴定了结合3.5％百分位以下且显示预测的结合比大于3的肽序列。
从L-seq1中，酪氨酸获得组显示了12/16个IEDB预测的结合分子，酪氨酸缺失组显示了166/184个IEDB预测的结合分子(图1b)。从L-seq2中，酪氨酸获得组显示了5/5个IEDB预测的结合分子，酪氨酸缺失组显示了9/10个IEDB预测的结合分子(图2b)。因此，在针对涉及酪氨酸变化的筛选中，来自选择酪氨酸组的预测的HLA-A1结合分子的百分比大于未选择组。然而，导致预期突变的128K组(对比24K组)的前期过滤的减少导致了预期为HLA-A1结合分子的大量突变。
含有127个表达的癌症特异性突变但不涉及酪氨酸变化选择的L-seq2组显示了较少量的HLA-A1结合分子，其中11个获得了HLA-A1结合而21个丧失了HLA-A1结合(图2b)。最终，对于与肿瘤相关基因相关的L-seq1的92条序列，3/92个获得了HLA-A1结合而13/92个丧失了HLA-A1结合(图1c)。
图3是L-seq1组中3,276条序列的患者和供体和相应癌症患者的癌细胞中氨基酸的列表。高亮的氨基酸是已知涉及与HLA-A1结合的T细胞表位的那些氨基酸。对于酪氨酸，获得了氨基酸变化(获得或缺失)的最高的P＝D与肿瘤比例。其他高亮的氨基酸也显示了显著的P＝D肿瘤氨基酸变化比例。
图4鉴定了L-seq1中的蛋白，该L-seq1含有涉及酪氨酸的突变肽序并提供了在位置16的氨基酸处具有突变的31聚体肽。
图5从来自L-seq2的32个蛋白中鉴定了肽并提供了在癌细胞(T)中的序列以及参考(P/D)中的相应序列。还提供了各序列的HLA-A1结合评分。
实施例3：鉴定癌症突变–患者#2
用于鉴定可用于免疫识别目标的癌细胞中突变的经修饰示意图被用于获自患者#2的样品并如图8a所示。白血病细胞(L)和爱波斯坦-巴尔病毒转化的B细胞(患者PHA细胞系)(P)获自造血干细胞移植(HSCT)前的患者。使用先前发表的方法从血液中分离白血病细胞(22,27)并制备EBV细胞(参见例如Caputo JL等，J.Tissue Culture Methods 13:39-44,1991)。也可从骨髓供体(D)中以类似方法生成EBV细胞系。将细胞冻存在液氮中。
根据与北卡罗来纳州达勒姆的表达分析公司(Expression Analysis,Inc.)的合同，从患者白血病细胞、患者EBV细胞系和供体EBV细胞系中使用NGS方法制备DNA外显子组文库。使用患者白血病细胞通过表达分析公司制备RNA转录组文库。除测序外，还使用转录组文库评价白血病细胞样品中已知基因的表达水平。
使用BWA(版本0.5.9)比对通过外显子测序获得的序列，其中使用默认参数，不同之处是将种长度(seed length)(-l)设为12bp以尽可能多地聚集比对。使用默认参数使用Samtools mpilup(http://samtools.sourceforge.net/samtools.shtm)生成进一步下游加工中使用的Pileups，随后使用先前所述方法读取变体(Holbrok等，2011)。使用Bowtie2比对通过转录组测序获得序列并使用UCSC hg19参考基因组标注转录本。使用RSEM对RNA转录本进行定量(参考文献：Li,B和Dewey,CN，RSEM:accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without areference genome.(RSEM：对带有或不带有参考基因组的RNA-Seq数据进行精确转录本定量)2011,BMC Bioinformatics 12:323)。获得了121,719个突变的初始组(“121K组”)。
如患者#1数据所述，通过以下方法对来自患者#2的121K突变组进行进一步选择：(1)弃去在外显子外产生的所有变体，(2)选择碱基差异导致非同义氨基酸变化的序列，以及(3)选择白血病细胞的基因中特定位置氨基酸在来自患者和供体的EBV细胞系在两个等位基因中都不同的序列，和在患者和供体的EBV细胞系中氨基酸是相同(纯合子或杂合子)的序列，这可总结为(在两个等位基因处)L的氨基酸(aa)均不同于P和D(在两个等位基因处L均不同于P＝D)。
应用于121K组的这些额外选择的结果是产生了980条非同义白血病特异性序列的较小的组(“L-seq”，图8a)。从L-seq中进一步选择通过转录组分析测得处于表达状态的突变序列。使用HLA肽结合软件使用计算机模拟测试了L-seq组的980个31聚体对多种HLA亚型的结合。预测那些31聚体中的571个表现出通过肽的至少一个区域对至少一种HLA亚型的HLA结合活性。总共有905条预测的结合区域，其中452条是野生型序列，453条是突变的序列。插入的表格显示了预测与各特定HLA结合的肽的数目。插入的表格中HLA结合序列的总数大于571，原因是有几种肽结合超过一种HLA等位基因。
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本说明书中涉及的所有专利和出版物指示本发明涉及领域普通技术人员的水平。本文中所有专利和出版物通过引用纳入本文，就如各出版物被具体地和单独地说明通过引用纳入本文一样。
本发明示例性地描述的本发明可以在缺少本文未具体描述的任意一个元素或多个元素、一个限制或多个限制的情况下实施。因此，例如，在本文的各个例子中，术语“包括”、“基本由……组成”和“由……组成”中的任何一个都可用其它两个中的任意一个代替。已经使用的术语和表达用作说明而非限制性的术语，这些术语和表达的使用并不排除所显示和所描述的特征或其部分的任何等同特征或其部分，但应认识到各种修饰都可能落入本发明要求的范围之内。因此，应理解尽管本发明通过优选的实施方式和任选的特征进行了具体地公开，但是本领域技术人员能够想到本文所揭示的内容的改变和变化，这些改变和变化应认为落在本发明权利要求书所限定的范围内。其他实施方式示于以下权利要求内。

Claims (29)

1.一种鉴定用于制备癌症疫苗的癌抗原的方法，所述方法包括
a)获取来自癌症患者的癌细胞的核酸的多条突变序列，所述突变序列编码所有或部分表达基因且所述突变序列各具有突变位置氨基酸，所述突变位置氨基酸取代了野生型蛋白序列中同一位置的野生型位置氨基酸，所述突变序列通过使用平行测序平台获得，所述平行测序平台对所述癌细胞的核酸进行平行处理以生成序列读数并将序列读数映射至具有参考基因序列的数据库；以及
b)通过鉴定所述癌症患者的HLA型或超类型从步骤a)中鉴定到的序列中选择突变序列并随后使用图7为所述HLA型或超类型选择作为所述突变位置氨基酸和/或野生型位置氨基酸的氨基酸，其中鉴定了用于制备癌症疫苗的癌抗原。
2.如权利要求1所述的方法，其中，合成包含来自步骤b)的所述突变序列的肽并评估所述肽对从所述癌症患者或HLA匹配供体中制备的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系的激活，所述CTL细胞系通过使来自所述癌症患者或所述HLA匹配供体的单核细胞接触来自所述癌症患者的癌细胞来获得。
3.如权利要求1所述的方法，其中，评估包含步骤b)中所选序列的肽与HLA组织相容性抗原结合的能力。
4.如权利要求3所述的方法，所述与HLA组织相容性抗原结合的能力使用用于预测HLA结合肽的基于计算机的算法通过计算机模拟来评价。
5.如权利要求4所述的方法，其中，合成据计算机模拟与HLA组织相容性抗原结合的肽并评估所述肽对从所述癌症患者或HLA匹配供体中制备的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系的激活，所述CTL细胞系通过使来自所述癌症患者或所述HLA匹配供体的单核细胞接触来自所述癌症患者的癌细胞来获得。
6.如权利要求3所述的方法，所述与HLA组织相容性抗原结合的能力通过合成所述肽并测试所述肽与表达HLA组织相容性抗原的抗原呈递细胞的结合来评估。
7.如权利要求6所述的方法，其中，合成与HLA组织相容性抗原结合的肽并评估所述肽对从所述癌症患者或HLA匹配供体中制备的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系的激活，所述CTL细胞系通过使来自所述癌症患者或所述HLA匹配供体的单核细胞接触来自所述癌症患者的癌细胞来获得。
8.如权利要求1所述的方法，所述平行测序平台对测序结果使用某些小于20x的覆盖深度进行过滤并且/或可不进行碱基比对质量(BAQ)算法过滤。
9.如权利要求1所述的方法，所述HLA型或超类型是HLA-1且所述突变氨基酸或野生型氨基酸选自酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸，且所述癌症患者表达HLA-A1组织相容性抗原。
10.如权利要求2、5和7中任一项所述的方法，所述单核细胞就CD8+细胞进行富集。
11.如权利要求2、5和7中任一项所述的方法，所述接触还包括添加来自所述癌症患者的自体CD4+T细胞和/或树突细胞或者来自所述HLA匹配供体的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。
12.一种鉴定用于制备癌症疫苗的癌抗原的方法，所述方法包括
a)获取来自癌症患者的癌细胞的核酸的多条突变序列，所述突变序列编码所有或部分表达基因且所述突变序列各具有突变位置氨基酸，所述突变位置氨基酸取代了野生型蛋白序列中同一位置的野生型位置氨基酸，所述突变序列通过使用平行测序平台获得，所述平行测序平台对所述癌细胞的核酸进行平行处理以生成序列读数并将序列读数映射至具有参考基因序列的数据库；以及
b)通过确定由至少一条突变序列编码的至少一个肽结合所述癌症患者的HLA型或超类型，从步骤a)中获得的多条突变序列中鉴定用于制备癌症疫苗的至少一条突变序列。
13.如权利要求12所述的方法，包括翻译来自步骤b)的所述突变序列的全部或一部分来合成所述肽并评估所述肽对从所述癌症患者或HLA匹配供体中制备的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系的激活，所述CTL细胞系通过使来自所述癌症患者或所述HLA匹配供体的单核细胞接触来自所述癌症患者的癌细胞来获得。
14.如权利要求12所述的方法，其中，评估包含来自步骤b)的所选序列的肽与HLA组织相容性抗原结合的能力。
15.如权利要求14所述的方法，所述与HLA组织相容性抗原结合的能力使用用于预测HLA结合肽的基于计算机的算法通过计算机模拟来评价。
16.如权利要求15所述的方法，其中，合成据计算机模拟与HLA组织相容性抗原结合的肽并评估所述肽对从所述癌症患者或HLA匹配供体中制备的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系的激活，所述CTL细胞系通过使来自所述癌症患者或所述HLA匹配供体的单核细胞接触来自所述癌症患者的癌细胞来获得。
17.如权利要求14所述的方法，所述与HLA组织相容性抗原结合的能力通过合成所述肽并测试所述肽与表达HLA组织相容性抗原的抗原呈递细胞的结合来评估。
18.如权利要求17所述的方法，其中，合成与HLA组织相容性抗原结合的肽并评估所述肽对从所述癌症患者或HLA匹配供体中制备的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系的激活，所述CTL细胞系通过使来自所述癌症患者或所述HLA匹配供体的单核细胞接触来自所述癌症患者的癌细胞来获得。
19.如权利要求12所述的方法，所述平行测序平台对测序结果使用某些小于20x的覆盖深度进行过滤并且/或可不进行碱基比对质量(BAQ)算法过滤。
20.如权利要求12所述的方法，所述HLA型或超类型是HLA-1且所述突变氨基酸或野生型氨基酸选自酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸和苏氨酸，且所述癌症患者表达HLA-A1组织相容性抗原。
21.如权利要求13、16和18中任一项所述的方法，所述单核细胞就CD8+细胞进行富集。
22.如权利要求13、16和18中任一项所述的方法，所述接触还包括添加来自所述癌症患者的自体CD4+T细胞和/或树突细胞或者来自所述HLA匹配供体的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。
23.一种使用一种或多种癌抗原制备的癌症疫苗，所述癌抗原通过权利要求1-22中任一项所述方法鉴定。
24.如权利要求23所述的癌症疫苗，所述癌症疫苗是包含一种或多种所述癌抗原的多肽。
25.如权利要求23所述的癌症疫苗，所述癌症疫苗是编码用于表达一种或多种所述癌抗原的核酸。
26.一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括：
a)使用权利要求1-22中任一项所述方法从获自所述癌症患者的癌细胞的核酸中鉴定癌抗原；
b)使用一种或多种所述癌抗原制备疫苗，以及
c)将所述疫苗给予所述癌症患者以生成针对所述癌细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)；和/或
d)给予由所述癌症患者或HLA匹配供体制备的CTL细胞系，所述CTL细胞系是
i)通过使来自所述癌症患者或来自所述HLA匹配供体的血液单核细胞在体外接触所述疫苗来制备；或
ii)通过使用所述疫苗免疫供体并将免疫的供体CTL转移至所述癌症患者来制备。
27.如权利要求26所述的方法，所述接触还可包括添加来自所述癌症患者和/或来自所述HLA匹配供体的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。
28.一种治疗癌症患者的方法，所述方法包括：
a)使用权利要求1、4、12或15所述方法从获自所述癌症患者的癌细胞的核酸中鉴定癌抗原；
b)使来自所述患者或来自HLA匹配供体的T细胞在体外接触所述癌抗原以刺激癌症特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞系；以及
c)将所述CTL细胞系给予所述癌症患者以治疗所述癌症。
29.如权利要求28所述的方法，所述接触还包括添加来自所述癌症患者的自体CD4+T细胞和/或树突细胞或者来自所述HLA匹配供体的自体CD4+T细胞和/或树突细胞。
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