BRPI0619023B1

BRPI0619023B1 - Composto que inibe a ativação do complemento

Info

Publication number: BRPI0619023B1
Application number: BRPI0619023-5A
Authority: BR
Inventors: John D. Lambris; Madan Katragadda
Original assignee: The Trustees Of The University Of Pennsylvania
Priority date: 2005-11-28
Filing date: 2006-11-28
Publication date: 2022-09-27
Also published as: IL191674A; EP2377877B1; WO2007062249A2; ES2677947T3; RU2012147267A; RU2008126232A; ES2677619T3; US20170305971A1; BRPI0619023A2; US9169307B2; CN101400692A; HRP20120621T1; RU2474586C2; JP5302004B2; US20190016758A1; CN106188239A; CN106188239B; US20160096866A1; RU2656102C2; CN102977191A

Abstract

COMPOSTO QUE INIBE A ATIVAÇÃO DO COMPLEMENTO São descritos compostos compreendendo peptídeos e peptidomiméticos, capazes de ligarem-se à proteína C3 e inibir a ativação do complemento. Estes compostos exibem atividade inibitória da ativação complementar grandemente aperfeiçoada, em comparação com os compostos atualmente disponíveis.

Description

Este reivindica benefício do Pedido Provisório tLS. no. 60/740.205, depositado em 28 de novembro de 2005, cujo inteiro conteúdo é incorporado aqui por referência.

PATROCÍNIO GOVERNAMENTAL

De acordo com 35 U.S.C. § 202(c), é reconhecido de que o governo dos Estados Unidos pode ter certos direitos sobre a invenção aqui descrita, que foi produzida em parte com fundos do National Institutes of Health sob a Subvenção No. GM 62134.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se à ativação da cascata de complement do corpo. Em particular, esta invenção fornece peptídeos e peptidomiméticos capazes de ligarem-se à proteína C3 e inibir a ativação do complemento.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Várias publicações, incluindo patente, pedidos publicados, artigos técnicos e artigos escolares são citados por todo o relatório. Cada uma destas publicações citadas é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Citações totais de publicações não mencionadas na íntegra dentro do relatório são expostas no final do relatório.

O sistema do complemento é a primeira linha de defesa imunológica contra patógenos estranhos. Sua ativação através dos vias clássicas, alternativas ou de lectina resulta na geração de peptídeos anafilatóxicos C3a e C5a e formação do complexo de ataque de membrana C5b-9. O componente do complemento C3 representa um papel central na 25 ativação de todas três vias. A ativação de C3 pela convertases do via de complemento C3 e sua subseqüente fixação à superfície alvo resulta na montagem do complexo de ataque de membrana e, finalmente, na avaria ou lise das células alvo. O C3 é único pelo fato de possuir uma arquitetura rica, que supre uma multiplicidade de diversos sítios de ligação de ligando, que são importantes nas vias de vigilância imune e resposta imune.

Ativação inapropriada do complemento pode resultar em avaria da célula hospedeira. O complemento está implicado em diversos estados doentios, incluindo várias doenças autoimunes e descobriu-se contribuir para outras condições clínicas, tais como síndrome respiratória de adulto, ataque cardíaco, rejeição em seguida a xenotransplante e lesões por queimadura. A lesão de tecido mediada pelo complemento constatou-se também resultar das situações de bioincompatibilidade, tais como aquelas encontradas em pacientes sofrendo diálise ou derivação cardiopulmonar.

As lesões de tecido mediadas por complemento são 1 diretamente mediadas pelo complexo de ataque de membrana e indiretamente pela geração de C3a e C5a. Estes peptídeos induzem avaria através de seus efeitos em várias células, incluindo neutrófílos e mastócitos. in vivo, a regulação do complemento nas etapas de ativação de C3 e C5 é provida por 15 proteínas tanto de plasma como de membrana. Os inibidores da proteína de plasma são fator-H e proteína de ligação-C4 e as proteínas da membrana reguladora, localizadas nas superfícies das células, são receptores de complemento 1 (CRI), fator de aceleração de declínio (DAF) e proteína de cofator de membrana (MCP). Estas proteínas inibem as convertases de C3 e C5 (proteases de multi-subunidades) promovendo a dissociação dos complexos de multi-subunidades e/ou inativando os complexos através da proteólise (catalisada pelo fator I). Diversos agentes farmacológicos, que regulam ou modulam a atividade do complemento, foram identificados por ensaio in vitro, porém a maioria mostrou in vivo ser de baixa atividade ou 25 tóxica.

Até hoje não há inibidores de ativação de complemento aprovados para uso em clínica, embora certos candidatos para uso clínico existam, especificamente, em uma forma recombinante do receptor de complemento 1, conhecido como receptor de complemento 1 solúvel (sCRl) e um anticorpo anti-C5 monoclonal humanizado (5Gl.l-scFv). Ambas estas substâncias mostraram suprimir a ativação do complemento em modelos animais in vivo (Kalli KR et al., 1994; e Wang et al., 1996). Entretanto, cada substância possui a desvantagem de ser uma proteína de grande peso molecular (240 kDa e 26 kDa, respectivamente), que é de difícil manufatura e deve ser administrada por infusão. Portanto, pesquisa recente enfatizou o desenvolvimento de menores agentes ativos, que são de mais fácil suprimento, mais estáveis e de manufatura menos dispendiosa.

A Patente U.S. No. 6.319.897 de Lambris et al. descreve o uso de uma biblioteca de peptídeo aleatória combinatorial exibida por fago para identificar um peptídeo de 27-resíduos, que se liga a C3 e inibe a ativação do complemento. Este peptídeo foi truncado em um segmento cíclico de 13- resíduos, que manteve completa atividade, que é referido na arte como compstatina. A compstatina inibe a clivagem de C3 a C3a e C3b por convertases de C3. A compstatina foi testada em uma série de experimentos de interface in vitro, in vivo, ex vivo e in vivo/ex vivo e demonstrou: (1) inibir a ativação do complemento em soro humano (Sahu A et al., 1996); (2) inibir a ativação do complemento induzida pela heparina/protamina em primatas, sem significativo efeitos colaterais (Soulika AM et al., 2000); (3) prolongar o tempo de vida de um xenoenxerto de porcino em humano perfundido com sangue humano (Fiane AE et al., 1999a; Fiane AE et al., 1999b; e Fiane AE et al., 2000); (4) inibir a ativação do complemento em modelos de derivação cardiopulmonar, plasmaferese e circuitos extra-corporais de diálise (Nilsson B et al., 1998); e (5) possuir baixa toxicidade (Furlong ST et al., 2000).

A compstatina é um peptídeo compreendendo a seqüência ICVVQDWGHHRCT-=NH2 (SEQ ID NO: 1), em que Cys2 e Cysl2 formam uma ponte dissulfeto. Sua estrutura tridimensional foi determinada empregando-se espectroscopia NMR 2D homonuclear, em combinação com duas metodologias computacionais experimentalmente restringidas separadas.

A primeira metodologia envolveu geometria de distância, dinâmica mpfèêul^r^ g- e recozimento simulado (Morikis D et al., 1998; WO 99/13899) e a s§g^dao^,^ metodologia envolveu otimização global (Klepeis et al., J. Computational Chem., 20: 1344 - 1370, 1999). A estrutura da compstatina revelou uma superfície molecular que compreende uma placa polar e uma placa não-polar. A parte polar inclui uma volta-β Tipo I e a placa não-polar inclui a ponte dissulfeto. Além disso, uma série de análogos com substituições de alanina (uma varredura de alanina) foi sintetizada e testada quanto à atividade, revelando que os quatro resíduos da volta-B e da ponte dissulfeto, com o 10 agrupamento hidrofóbico circundante, representam importantes papéis na 1 atividade inibitória da compstatina (Morikis et al., 1998; WO 994/13899).

Empregando-se um ensaio de atividade de complemento, compreendendo medir a lise de eritrócito mediada por via alternativa, a IC50 da compstatina foi medida a 12 μM. Certos análogos anteriormente testados 15 demonstraram atividade equivalente a ou maior do que aquela da compstatina.

O pedido Internacional Publicado No. WO 2004/026328 descreve análogos e miméticos da compstatina com variações nos terminais-N e C e nas posições 4 e 9, que dão melhorada atividade no ensaio supracitado. Os aperfeiçoamentos de até 99-vezes em relação à compstatina foram informados (20 para certos análogos (vide também Mallik et al., 2005). O desenvolvimento dos análogos ou miméticos da compstatina com mesmo maior atividade constituiria um avanço significativo na arte.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece análogos e miméticos do peptídeo inibidor do complemento, compstatina (HOOC-ICVVQDWGHHRCT-NH2; SEQ ID NO: 1), que melhoraram a atividade inibitória do complemento, em comparação com compstatina.

Em um aspecto, a invenção caracteriza um composto que inibe a ativação do complemento, que compreende um peptídeo tendo uma seqüência: Xaal - Cys - Vai - Xaa2 - Gin - Asp - Xaa3 - Gly - Xaa4 - His - Arg - Cys - Xaa5 (SEQ ID NO: 26); em que: Xaal é He, Vai, Leu, Ac-Ile, Ac-Val, Ac-Leu ou um dipeptídeo compreendendo Gly-Ile; Xaa2 é Trp ou um análogo de Trp, em que o análogo de Trp tem aumentado caráter hidrofóbico, em comparação com Trp, com a condição de que, se Xaa3 for Trp, Xaa2 seja o análogo de Trp; Xaa3 é Trp ou um análogo de Trp compreendendo uma modificação química em seu anel indol, em que a modificação química aumenta o potencial de ligação de hidrogênio do anel indol; Xaa4 é His, Ala, Phe ou Trp; Xaa5 é L-Thr, D-Thr, Ile, Vai, Gly, um dipeptídeo compreendendo Thr-Asn ou um dipeptídeo compreendendo Thr-Ala ou um tripeptídeo compreendendo Thr-Ala-Asn, em que um terminal carbóxi -OH de qualquer um de L-Thr, D-Thr, Ile, Vai, Gly ou Asn é opcionalmente substituído por-NH2; e os dois resíduos Cys são ligados por uma ligação dissulfeto.

Em certas formas de realização, Xaa2 participa de uma interação não-polar com C3. Em outras formas de realização, Xaa3 participa de uma ligação de hidrogênio com C3. Em outras formas de realização, Xaa2 participa de uma interação não-polar com C3 e Xaa3 participa de uma ligação de hidrogênio com C3.

Em várias formas de realização, o análogo de Trp de Xaa2 é um triptofano halogenado, tal como 5-fluoro-l-triptofano ou 6-fluoro-l- triptofano. Em outras formas de realização, o análogo de TYrp em Xaa2 compreende um substituinte alcóxi inferior ou alquila inferior na posição 5, p. ex., 5-metoxitriptofano ou 5-metiltriptofano. Em outras formas de realização, o análogo de Trp em Xaa 2 compreende um substituinte alquila inferior ou alquenoíla inferior na posição 1, com formas de realização exemplifiçáfiw [/ S compreendendo 1-metiltriptofano ou 1-formiltriptofano. Em outras forriiáç^deM^ço5r realização, o análogo de Trp de Xaa3 é um triptofano halogenado, tal como 5- fluoro-1-triptofano ou 6-fluoro-l-triptofano.

Em certas formas de realização, Xaa2 compreende um substituinte alquenoíla inferior ou alquila inferior na posição 1 de triptofano, Xaa3 opcionalmente compreende um triptofano halogenado e Xaa4 compreende Alanina. Em formas de realização particulares, Xaa2 é 1- metiltriptofano ou 1-formiltriptofano e Xaa3 opcionalmente compreende 5- fluoro-1-triptofano. Alguns compostos exemplificativos da invenção compreendem quaisquer das SEQ ID NOS: 15-25.

Em algumas formas de realização, o composto compreende um peptídeo produzido pela expressão de um polinucleotídeo codificando o peptídeo. Em outras formas de realização, o composto é produzido pelo menos em parte por síntese de peptídeo. Uma combinação de métodos sintéticos pode também ser usada.

Em certas formas de realização, os análogos da compstatina são, em que o composto é PEGuilado pelo composto compreendendo a SEQ ID NO: 36.

Em outras formas de realização, o análogo da compstatina compreende ainda um componente de peptídeo adicional, que estende a retenção in vivo do composto. Por exemplo, o adicional componente de peptídeo pode ser um peptídeo de ligação da albumina. Um conjugado de peptídeo de ligação da compstatina-albumina exemplar compreende a SEQ ID 25 NO: 39.

Outro aspecto da invenção caracteriza um composto que inibe a ativação do complemento, compreendendo um mimético de não-peptídeo ou peptídeo parcial da SEQ ID NO: 26 ou qualquer uma das outras seqüências de análogos e conjugados descritos acima. Estes miméticos de não-peptídeo ou peptídeo parcial são projetados para ligarem-se a C3 e inibir a ativação'dp complemento com pelo menos 100-vezes maior atividade do que um peptídeo compreendendo a SEQ ID NO:1 sob condições de ensaio equivalentes.

Os análogos, conjugados e miméticos da compstatina, da invenção são de utilidade prática para qualquer finalidade para a qual a própria compstatina seja utilizada, como sabido na arte e descrito com maiores detalhes aqui. Certos destes usos envolvem a formulação dos compostos em composições farmacêuticas para administração a um paciente. Tais formulações podem compreender sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos, bem como um ou mais diluentes, veículos, excipientes e similares farmaceuticamente aceitáveis, como estaria dentro do campo de ação doartífice hábil.

Vários aspectos e vantagens da presente invenção serão entendido por referência à descrição, desenhos e exemplos detalhados que seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Atividade da compstatina expressa e seus análogos. Plotagens da inibição de complemento versus concentração de peptídeo percentuais para Ac-V4W7H9A (SEQ ID NO:5) (quadrados) e compstatina expressa com triptofano (SEQ ID NO: 15) círculos), 5-fluoro- triptofano (SEQ ID NO: 16) (triângulos), 6-fluoro-triptofano (SEQ ID NO: 17 (estrelas), 5-hidróxi-triptofano (SEQ ID NO:27) (hexágonos), 7-aza-triptofano (SEQ ID NO: 28) (losangos).

Figura 2. Atividade de análogos sintéticos da compostatina. Plotagens de inibição de complemento versus concentração de peptídeo percentuais para Ac-V4W/H9A (SEQ ID NO:5) (quadrados) e dos análogos da compstatina com incorporação de 5-fluoro-/-triptofano na posição 4 (SEQ ID NO: 18) (círculos), posição 7 (SEQ ID NO: 19) (triângulos), ambas posições 4 e 7 (SEQ ID NO: 20) (losangos).

Figura 3. Atividade dos análogos da compstatina sintéticos -J7 adicionais. Plotagens da inibição do complemento vs. concentração de peptídeo percentuais para (A) Ac-V4W/H9A (SEQ ID NO: 5) (triângulos), em comparação com Ac-V4(5f-Z-W)/H9A (SEQ ID NO: 18) (triângulo invertido), Ac-V4(5-metil-W)/H9A (SEQ ID NO: 22) (círculos), Ac-V4(l- metil-W)/H9A (SEQ ID NO:23) (losangos), Ac-V4(2-Nal)/H9A (SEQ ID NO:7) (quadrados); (B) Ac-V4W/H9A (SEQ ID NO:5) (triângulos), em comparação com Ac-V4W/W7(5f-Z-W)/H9A (SEQ ID NO: 19) hexágonos); e (C) compstatina tipo selvagem (SEQ ID NO:1) (triângulos), em comparação com Ac-V4 (l-metil-W)/W7(5f-Z-W)ZH9A (SEQ ID NO:24) (triângulo apontando para a esquerda).

Figura 4. Caracterização termodinâmica da interação dos análogos da compstatina adicionais com C3. Os dados ITC representando a ligação de (A) Ac-V4W/H9A (SEQ ID NO:5); (B) Ac-V4(5f-Z-W)/H9A (SEQ ID NO: 18); (C) Ac-V4(5-metil-W)/H9A (SEQ ID NO:22); (D) Ac-V4(l- metil-W)/H9A (SEQ ID NO:23); (E) Ac-V4(2-Nal)/H9A (SEQ ID NO:7); e (F) Ac-V4W/W7(5f-Z-W)/H9A (SEQ ID NO: 19) a C3. As plotagens foram obtidas por ajustamento dos dados brutos corrigidos a um modelo de “um conjunto de sítios” de Origin 7.0.

Figura 5. Plotagens mostrando a relação entre hidrofobicidade dos análogos indicados pelo log P e a constante inibitória (A), entropia indicada por TΔS (B) e a constante de ligação (C).

Figura 6. Atividade de um análogo da compstatina sintética adicional. Plotagens de inibição de complemento vs. concentração de peptídeos percentuais, para Ac-V4(l-metil-W)/H9A (SEQ ID NO:23) (círculos) e Ac-V4(l-formil-W)/H9A (SEQ ID NO:25) (quadrados)

Figura 7. Atividade do análogo da compstatina PEGuilada.Plotagens da inibição do complemento vs. concentração de peptídeo percentuais para Ac-V4(l-metil-W)/H9A (SEQ ID NO:23) (círculos) e Ac- V4(l-metil-W)/H9A-K-PEG 5000 (SEQ ID NO:36) (quadrados).

Figura 8. Atividade do análogo da compstatina conjugada^ com proteína de ligação de albumina. Plotagens da inibição dó complemento vs. concentração de peptídeo percentuais para Ac-V4(l-metil- W)/H9A (SEQ ID NO:23) (círculos) peptídeo de fusão (Ac- ICV(IMeW)QDWGAHRCTRLIEDICLPRWGCLWEDD-NH2) (SEQ ID NO:39) (quadrados).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO ILUSTRATIVAS

Vários termos relativos aos métodos e outros aspectos da presente invenção são usados por todo o relatório e reivindicações. Tais termos são para receber seus significados ordinários na arte, a menos que de outro modo indicado. Outros termos especificamente definido são para ser interpretados de uma maneira consistente com a definido aqui fornecida.

Definições:

As seguintes abreviações podem ser usadas no relatório e exemplos: Ac, grupo acetila; NH2, amida; MALDI, ionização de dessorção a leiser assistida por matriz; TOF, tempo de vôo; ITC, calorimetria de titulação isotérmica; HPLC, cromatografia líquida de elevado desempenho, NA, não 30 ativo; dT, D-treonina; 2-Nal, 2-naftialanina, 1-Nal, 1-naftilalanina; 2-Igl, 2- indanilglicina; Dht, diidrotriptofano; Bpa, 4-benzoil-L-fenilalanina; 5f-Z-W, 5- fluoro-Z-triptofano; 6f-Z-W, 6-fluoro-Z-triptofano; 5-OH-W, 5-hidroxitriptofano; 5-metóxi-W, 5-metoxitriptofano; 5-metil-W, 5-metiltriptofano; 1-metil-W, 1-metiltriptofano; as abreviações amino ácidas utilizam a nomenclatura padrão de três letras ou letra única, por exemplo, Trp ou W para triptofano.

O termo “cerca de” como aqui usado quando referindo-se a uma valor mensurável, tal como uma quantidade, uma duração temporal e similares, significa abranger variações de ±20% ou ± 10%, em algumas formas de realização ± 5%, em algumas formas de realização ± 1% e erfr-V J? algumas formas de realização ± 0,1% do valor especificado, como variações são de realização apropriada e usadas nos compostos e composições descritos.

Os termos “farmaceuticamente ativo” e “biologicamente ativo” referem-se à capacidade dos compostos da invenção de ligarem-se a C3 ou seus fragmentos e inibirem a ativação do complemento. Esta atividade biológica pode ser medida por um ou mais de diversos ensaios reconhecidos na arte, como descrito mais detalhadamente aqui.

Como aqui usada, “alquila” refere-se a um hidrocarboneto ' opcionalmente substituído, de cadeia reta, ramificada ou cíclica, tendo de cerca de 1 a cerca de 10 átomos de carbono (e todas as combinações e sub- combinações de faixas e números específicos de átomos de carbono nele), com de cerca de 1 a cerca de 7 átomos de carbono sendo preferidos. Os 15 grupos alquila incluem mas não são limitados a metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, t-butila, n-pentila, ciclopentila, isopentila, neopentila, n-hexila, isoexila, cicloexila, ciclooctila, adamantila, 3- metilpentila, 2,2-dimetilbutila, e 2,3-dimetilbutila. A expressão “alquila inferior” refere-se a um hidrocarboneto opcionalmente substituído, saturado, p0 reto, ramificado ou cíclico, tendo de cerca de 1 a cerca de 5 átomos de carbono (e todas combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono dele). Grupos alquila inferior incluem mas não são limitados a metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, t- butila, n-pentila, ciclopentila, isopentila e neopentila.

Como aqui usado, “halo” refere-se a F, Cl, Br ou I.

Como aqui usado, “alcanoíla”, que pode ser usada intercambiavelmente com “acila”, refere-se a um resíduo acíclico alifático reto ou ramificado, opcionalmente substituído, tendo de cerca de 1 a cerca de 10 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono ali), com de cerca de 1 a 7 átomos de carbono sendo preferidos. Os grupos alcanoíla incluem más^oãq^^ são limitados a formila, acetila, propionila, butirila, isobutirila pentanoíla, isopentanoíla, 2-metil-butirila, 2,2-dimetilpropionila, hexanoíla, heptanoíla, octanoíla, e similares. A expressão “alcanoíla inferior” refere-se a um resíduo opcionalmente substituído, reto ou ramificado, alifático, acílico, tendo de cerca de 1 a cerca de 5 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono ali. Os grupos alcanoíla inferior incluem mas não são limitados a formila, acetila, n- propionila, iso-propionila, butirila, iso-butirila, pentanoíla, iso-pentanoíla, e similares.

Como aqui usado, “arila” refere-se a um sistema de anéis aromático, opcionalmente substituído, mono ou bicíclico, tendo de cerca de 5 a cerca de 14 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono ali), com de cerca de 6 a cerca de 10 carbonos sendo preferidos. Exemplos não limitativos incluem, por exemplo, fenila e naftila.

Como aqui usado, “aralquila” refere-se a radicais alquila contendo um substituinte arila e tendo de cerca de 6 a cerca de 20 átomos de carbono (e todas as combinações e subcombinações de faixas e números específicos de átomos de carbono ali), com de cerca de 6 a cerca de 12 átomos de carbono sendo preferido. Os grupos aralquila podem ser opcionalmente substituído. Exemplos não limitativos incluem, por exemplo, benzila, naftilmetila, difenilmetila, trifenilmetila, feniletila e difeniletila.

Como aqui usados, os termos “alcóxi” e “alcoxila” refere-se a um grupo alquila-0 opcionalmente substituído, em que a alquila é como anteriormente definida. Grupos alcóxi e alcoxila exemplares incluem metóxi, etóxi, n-propósi, i-propóxi, n-butóxi e heptóxi, entre outros.

Como aqui usado, “carbóxi” refere-se a um grupo -C(-O)OH.

Como aqui usado, “alcoxicarbonila” refere-se a um grupo<^ C(=O)O-alquila, em que alquila é como anteriormente definida.

Como aqui usada, “aroíla” refere-se a um grupo -C(=O)-arila, em que arila é como anteriormente definida. Grupos aroíla exemplares incluem benzoíla e naftoíla.

Tipicamente, os componentes químicos substituídos incluem um ou mais substituintes que substituem hidrogênio em locais selecionados de uma molécula. Substituintes exemplares incluem, por exemplo, halo, alquila, cicloalquila, aralquila, arila, sulfidrila, hydroxila (-OH), alcoxila, ciano (-CN), 10 carboxila (-COOH), acila (alcanoíla: -C(=O)R); -C(=O)O-alquila, 1 aminocarbonila (-C(O)NH2), aminocarbonila (-C(=O)NHR” -N- substituída, CF3, CF2CF3, e similares. Em relação aos substituintes supracitados, cada componente R” pode ser, independentemente, qualquer um de H, alquila, cicloalquila, arila ou aralquila, por exemplo.

Como aqui usado, “ácido L-amino” refere-se a qualquer um dos alfa-aminoácidos levorrotativos naturalmente ocorrentes, normalmente presentes em proteínas ou os ésteres de alquila destes alfa-aminoácidos. A expressão “D-aminoácido” refere-se a alfa-aminoácidos dextrorrotativos. A menos que de outro modo especificado, todos os aminoácidos referidos aqui pO são L-aminoácidos.

“Hidrofóbico” ou “não-polar” são usados sinonimamente aqui e referem-se a qualquer interação inter ou intra-molecular, não caracterizada por um dipolo.

Como aqui usado “caráter pi” refere-se à capacidade da 25 compstatina de participar de uma ligação pi com C3. As ligações pi resultam da sobreposição lateral de dois orbitais p paralelos.

Como aqui usado, “potencial de ligação de hidrogênio” refere- se à capacidade da compstatina de participar de uma atração eletrostática com C3 envolvendo componentes eletronegativos nos resíduos de triptofano ou análogos de triptofano modificados da compstatina e átomos de hidrogênitx de C3. Um exemplo não limitativo de tal componente eletronegativo é um átomo de flúor.

“PEGuilação” refere-se à reação em que pelo menos um 5 componente de polietileno glicol (PEG), independente de tamanho, é quimicamente ligado a uma proteína ou peptídeo para formar um conjugado de PEG-peptídeo. “PEGuilado” significa que pelo menos um componente PEG, independente de tamanho, é quimicamente fixado a um peptídeo ou proteína. O termo PEG é geralmente acompanhado por um sufixo numérico 10 que indica o peso molecular médio aproximado dos polímeros PEG; por F exemplo, PEG-8000 refere-se a polietileno glicol tendo um peso molecular médio de cerca de 8000.

Como aqui usado, “sais farmaceuticamente aceitáveis” refere- se a derivados dos compostos descritos, em que o composto precursor é 15 modificado ao produzir sais de ácido ou de base dele. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis incluem mas não são limitados a sais de ácido mineral ou orgânico de resíduos básicos, tais como aminas; sais alcalinos ou orgânicos de resíduos ácidos, tais como ácidos carboxílicos; e similares. Assim, o termo “sal de adição de ácido” refere-se ao correspondente derivado de sal de um composto precursor que foi preparada pela adição de um ácido. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais convencionais ou os sais de amónio quaternário do composto precursor formado, por exemplo, de ácidos inorgânicos ou orgânicos. Por exemplo, tais sais convencionais incluem mas não são limitados àqueles derivados de ácidos inorgânicos tais 25 como clorídrico, bromídrico, sulfurico, sulfamico, fosfórico, nítrico e similares; e os sais preparados dos ácidos orgânicos, tais como acético, propiônico, succínico, glicólico, esteárico, lático, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, pamóico, maleico, hidroximaleico, fenilacético, glutâmico, benzóico, salicílico, sulfanílico, 2-acetoxibenzóico, fumárico, toluenossulfônico, metanossulfônico, etano dissulfônico, oxálico, isetiônicóke similares. Certos compostos ácidos ou básicos da presente invenção podem existir como zwitterions. Todas as formas dos compostos, incluindo ácido livre, base livre e zwitterions, são contempladas como situando-se dentro do 5 escopo da presente invenção.

Descrição:

De acordo com a presente invenção, informações acerca das características biológicas e físico-químicas da compstatina foram empregadas para projetar análogos da compstatina com significativamente melhorada 10 atividade, em comparação com o peptídeo de compstatina precursor. Em J algumas formas de realização, os análogos têm pelo menos 50-vezes maior atividade do que a compstatina. Em outras formas de realização, os análogos têm 60-, 65-, 70-, 75-, 80-, 85-, 90-, 95-, 100-, 105-, 110-, 115-, 120-, 125-, ou 130-vezes ou mais de atividade do que a compstatina. Em ainda outras formas de realização, os análogos têm 135-, 140-, 145-, 150-, 155-, 160-, 165- , 170-, 175-, 180-, 185-, 190-, 195-, 200-, 205-, 210-, 215-, 220-, 225-, 230-, 235-, 240-, 245-, 250-, 255-, 260-, 265-vezes ou mais atividade do que a compstatina, quando comparado utilizando os ensaios descritos nos exemplos.

Os análogos da compstatina, sintetizados de acordo com outras abordagens, mostraram possuir atividade um tanto melhorada quando comparados com o peptídeo precursor, isto é, até cerca de 99-vezes (Mallik, B. et al, 2005, supra; WO 2004/026328). Os análogos produzidos de acordo com a presente invenção possuem mesmo maior atividade do que o peptídeo precursor ou seus análogos produzidos ate hoje, como demonstrado por ensaios in vitro, como mostrado nas figuras e nos Exemplos aqui.

A Tabela 1B mostra seqüência amino ácida e atividades inibitórias do complemento da compstatina e análogos selecionados com atividade significativamente melhorada. Os análogos selecionados são referidos por modificações específicas de posições designadas (1 - 13), em comparação com o peptídeo precursor, compstatina (SEQ ID NO: 1) e compeptídeos da SEQ ID NOS: 2-14, mostrados na Tabela IA, que foram descritos no WO 2004/026328. Os peptídeos das SEQ ID NOS: 15 -24 são representativos de modificações feitas de acordo com a presente invenção, resultando em análogos da compstatina significativamente mais potentes.

Como descrito mais detalhadamente abaixo, deve ser entendido que certas modificações feitas em triptofano na posição 4, como exposto nas SEQ ID NOS: 2-13, podem ser combinadas com uma substituição de análogo de triptofano na posição 7, para formar ainda potentes análogos da compstatina adicionais.TABELA 1

As abreviações usadas nesta tabela são como seguem: dT ” D-treonina 2-Nal = 2-naftilalanina 2-Nal = 1-naftilalanina 2-Igl = 2-indanilglicina Dht = diidrotriptofano Bpa = 4-benzoil-L-fenilalanina 5f-Z-W = 5-fluoro-Z-triptofano 6f-Z-W = 6-fluoro-Z-triptofano 5-OH-W = 5-hidroxitriptofano 5-metóxi-W ~ 5-metoxitriptofano 5-metil-W = 5-metiltriptofano 1-metil-W = 1-metiltriptofano 1-formil-W = 1-formiltriptofano

Modificações no termino-N. A acetilação do término-N tipicamente aumenta a atividade inibidora do complemento da compstatina e seus análogos, como pode ser visto especificamente comparando-se a SEQ ID NO: 1 com a SEQ ID NO: 2. Portanto, a adição de um grupo acila no término amino do peptídeo, incluindo mas não limitado a N-acetilação, é uma forma de realização preferida da invenção, de utilidade particular quando os ^0 peptídeos são preparados sinteticamente. Entretanto, é às vezes vantajoso preparar os peptídeos por expressão de uma molécula de ácido nucléico codificando peptídeo em um sistema de expressão procariótico ou eucariótico, ou por transcrição e translação in vitro. Para estas formas de realização, o término-N naturalmente ocorrente pode ser utilizado. Um exemplo de um 25 análogo da compstatina adequado para expressão in vitro ou in vivo é representado pelas SEQ ID NOS: 15 - 17, em que o grupo acetila é substituído por glicina não modificada no término-N. As SEQ ID NOS: 15 - 17, que adicionalmente compreendem modificações dentro dos peptídeos e nos términos-C, como examinado abaixo, são entre cerca de 45 e cerca de 125-vezes mais ativas do que a compstatina no ensaio de inibiçac complemento aqui descrito.

Modificação dentro do peptídeo. Empregando-se métodos computacionais que não as seqüências de energia situando-se em baixo grau, foi anteriormente determinado que Tyr e Vai eram os candidatos mais prováveis na posição 4 para suportar estabilidade e atividade do peptídeo (Klepeis JL et al., 2003). Foi descrito no WO 2004/026328 que Trp na posição 4, especialmente combinado com Ala na posição 9, produz atividade muitas vezes maior do que aquela do peptídeo precursor (por exemplo, comparem-se as atividades das SEQ ID NOS: 4, 5 e 6 com aquelas das SEQ ID NOS: 2 e 3). WO 2004/026326 também descreveu que os peptídeos compreendendo os análogos de triptofano 2-naftilalanina (SEQ ID NOS: 7, 8), 1-naftilalanina (SEQ ID NO: 9), 2-indanilglicina (SEQ ID NOS: 10, 11) ou diidrotriptofano (SEQ ID NO: 12) na posição 4 foram todos constatados possuírem aumentada atividade inibitória de complemento, variando de 5- vezes a 99-vezes mais do que a compstatina. Além disso, um peptídeo compreendendo o análogo da fenilalanina, 4-benzoil-L-alanina, na posição 4 (SEQ ID NO: 13), possuía 49-vezes mais atividade do que a compstatina.

De acordo com a presente invenção, os peptídeos compreendendo 5-fluoro-/-triptofano (SEQ ID NO: 19) ou 5-metóxi-, 5-metil- ou 1-metil-triptofano, ou 1-formil-triptofano (SEQ ID NOS: 21, 22, 23 e 25, respectivamente) na posição 4 possuem 31-264-vezes maior atividade do que a compstatina. A incorporação de 1-metil ou 1-formil-triptofano aumentou a atividade e a afinidade de ligação na maior parte em comparação com outros análogos. Acredita-se que uma ligação de hidrogênio mediada por indol ‘N’, não é necessária na posição 4 para a ligação e atividade da compstatina. A ausência desta ligação ou redução hidrogênio do caráter polar pela substituição do hidrogênio por alquila inferior, alcanoíla ou nitrogênio de indol na posição 4 aumenta a ligação e atividade da compstatina. Sem Rub;, pretendermos ficar limitados a qualquer teoria particular ou mecanismó<^_ ação, acredita-se que uma interação ou efeito hidrofóbico na posição 4 fortifica a interação da compstatina com C3. Por conseguinte, modificações de Trp na posição 4 (p. ex., alterando a estrutura da cadeia lateral de acordo com métodos bem conhecidos na arte), ou substituições de análogos de Trp que mantêm ou aumentam a interação hidrofóbica supracitada, são contempladas na presente invenção para produzir análogos de compstatina com mesmo maior atividade. Tais análogos são bem conhecidos na arte e incluem mas não são limitados aos análogos exemplificados aqui, bem como seus derivados não substituídos ou altemativamente substituídos. Exemplos de análogos adequados podem ser encontrados por referência às seguintes publicações e muitas outras: Beene, et al (2002) Biochemistry 41 : 10262- 10269 (descrevendo, inter alia, análogos de Trp halogenados sozinhos e multiplamente); Babitzky & Yanofsky (1995) J. Biol. Chem. 270: 12452- 12456 (descrevendo, inter alia, Trp metilado e halogenado e outros Trp e análogos de indol); e Patentes U.S. Nos. 6.214.790, 6.169.057, 5.776.970, 4.870.097,4.576.750 e 4.299.838. Os análogos de Trp podem ser introduzidos dentro do peptídeo de compstatina por expressão in vitro ou in vivo, ou por síntese de peptídeo, como sabido na arte e descrito mais detalhadamente nos exemplos.

Em certas formas de realização, o Trp na posição 4 da compstatina é substituído por um análogo compreendendo um substituinte 1 - alquila, mais particularmente um substituinte alquila inferior (p. ex., CrC5) como definido acima. Estes incluem mas não são limitados a N(cc) metil triptofano e 5-metiltriptofano. Em outras formas de realização, Trp na posição 4 da compstatina é substituído por um análogo compreendendo um substituinte 1-alcanoíla, mais particularmente um substituinte alcanoíla inferior (p. ex., Ci-C5) como definido acima. Além dos análogos exemplificados, estes incluem mas não são limitados a 1-acetil-L-triptofano e L-β-homotriptofano. t

Experimentos termodinâmicos mostraram que a incorporação^ de 5-fluoro-/-triptofano na posição 7 da compstatina aumentou a entalpia da interação entre a compstatina e C3, em relação à compstatina tipo selvagem, enquanto que a incorporação de 5-fluoro-triptofano na posição 4 na compstatina diminuiu a entalpia desta interação. Sem pretendermos ficar ligados a qualquer mecanismo particular, os primeiros resultados indicam que a substituição dos hidrogénios de indol por um átomo de flúor em um resíduo Trp na posição 7 da compstatina pode fortalecer o potencial da ligação de hidrogênio do anel indol, introduzir novo potencial de ligação de hidrogênio ou mediar uma interação com C3 através de uma molécula de água na interface de ligação (Katragadda M et al, 2004). Em conseqüência, modificações de Trp na posição 7 (p. ex., alterando a estrutura da cadeia lateral de acordo com métodos bem conhecidos na arte) ou substituições de análogos de Trp que mantêm ou aumentam o potencial de ligação de hidrogênio supracitado, ou mediam uma interação com C3 através de uma molécula de água na interface de ligação, são contempladas na presente invenção para produzir análogos com mesmo maior atividade. Em certas formas de realização, os análogos de TRP, cujos anéis indol têm modificações 20 que resultam em aumentado potencial de ligação de hidrogênio ou medeiam uma interação com C3 através de uma molécula de água na interface de ligação, podem ser introduzidos na posição 7 do peptídeo de compstatina por expressão in vitro ou in vivo, ou por síntese de peptídeo. Um peptídeo compreendendo o análogo de triptofano 5-fluoro-triptofano (SEQ ID NO: 19) 25 na posição 7 foi constatado possuir uma atividade 121-vezes aumentada, em comparação com a compstatina.

Em outra forma de realização, análogos de Trp são incorporados em ambas as posições 4 e 7 da molécula de compstatina e His na posição 9 da compstatina é opcionalmente substituído por Ala. Experimentos termodinâmicos mostraram que a incorporação de 5-fluoro-triptofanoun3& posições 4 e 7 da compstatina aumentou a entalpia da interação entre a compstatina e C3, em relação à compstatina tipo selvagem. Desta maneira, modificações de Trp nas posições 4 e 7 (p. ex., alterando a estrutura da cadeia 5 lateral de acordo com métodos bem conhecidos na arte), ou substituições de análogos de Trp, que mantêm ou aumentam a interação hidrofóbica supracitada com C3 via posição 4 e mantêm ou aumentam o potencial de ligação de hidrogênio supracitado com C3, via posição 7, ou interação com C3 através de uma molécula de água na interface de ligação via posição 7, são 10 contempladas na presente invenção para produzir análogos de compstatina ' com mesmo maior atividade. Tais Trp ou análogos de Trp modificados podem ser introduzidos dentro do peptídeo de compstatina nas posições 4 e 7 por expressão in vitro ou in vivo, ou por síntese de peptídeo. Peptídeos compreendendo análogos de triptofano 5-fluoro-triptofano (SEQ ID NO: 16) 15 e compreendendo análogos de triptofano 6-fluoro-triptofano (SEQ ID NO:17) nas posições 4 e 7 foram constatados possuírem atividade significativamente aumentada em relação à compstatina, variando de um aumento de atividade de 112 a 264 vezes. Além disso, os peptídeos compreendendo o análogo de triptofano 1-metil-triptofano na posição 4 e 5- pO fluoro-triptofano na posição 7 (SEQ ID NO: 24) foram constatados possuírem um aumento de 264-vezes na atividade em relação à compstatina.

Modificações no término carbóxi. Os peptídeos produzidos por métodos sintéticos são comumente modificados no término carbóxi para compreender uma amida em vez de um ácido; esta modificação comum pode 25 ser vista na Tabela 1 na compstatina (SEQ ID NO: 1) e em diversos análogos.

Na realidade, em alguns exemplos, foi determinado que os peptídeos contendo amida terminal possuem maior atividade do que os peptídeos contendo ácido terminal (comparem-se, por exemplo, as SEQ ID NOS: 5 e 7 com SEQ ID NOS: 4 e 8, respectivamente). Desta maneira, uma forma de realização preferida da invenção utiliza as modificações amina de teπfiinal-C>Jj Entretanto, algumas circunstâncias favorecem o uso de um ácido no térmifio-í^’^^ C. Tais circunstâncias incluem mas não são limitados a considerações de solubilidade e à expressão dos peptídeos in vitro ou in vivo das moléculas de ácido nucléico codificando peptídeo.

O resíduo terminal carbóxi da compstatina é treonina. Em algumas formas de realização da presente invenção, o treonina de terminal-C é substituída por um ou mais aminoácidos ou análogos naturalmente ocorrentes. Por exemplo, o peptídeo tendo a SEQ ID NO: 6 compreende D- 10 treonina em lugar de L-treonina e possui ainda um grupo COOH no término 1 C. Este peptídeo mostra atividade igual àquela do peptídeo de SEQ ID NO: 5, compreendendo L-treonina e CONH2 no término-C. Além disso, Ile substituiu Thr na posição 13, para obter-se um peptídeo com atividade 21-vezes maior do que aquela da compstatina. Além disso, os peptídeos das SEQ ID NOS: 15 14-17, que compreendem uma extensão de Asn de peptídeo de terminal-C, ou uma extensão de Ala-Asn de dipeptídeo, juntamente com um COOH no término-C e um término-N não-acetilado, demonstra entre 38 e 126 vezes maior atividade do que a compstatina. Eles são também adequados para produção via um sistema de expressão procariótico ou eucariótico, como 20 descrito mais detalhadamente abaixo.

Os análogos da compstatina da presente invenção podem ser preparados por vários métodos sintéticos de síntese do peptídeo, via condensação de um ou mais resíduos aminoácidos, de acordo com métodos de síntese de peptídeo convencionais. Por exemplo, os peptídeos são sintetizados 25 de acordo com metodologias de fase sólida padrão, tais como podem ser realizadas em um sintetizador de peptídeo Applied Biosystems Model 431A (Applied Biosystems, Foster City, Calif), de acordo com instruções do fabricante. Outros métodos de sintetizar peptídeos ou peptidomiméticos, por metodologias de fase sólida ou em fase líquida, são bem conhecidos daqueles hábeis na arte. Durante o curso da síntese do peptídeo, grupos amino carboxila de cadeia ramificada podem ser protegidos/desprotegidos como necessário, empregando-se grupos de proteção comumente conhecidos. Um exemplo de um método sintético de peptídeo adequado é dado no Exemplo 3.

Modificação utilizando grupos de proteção alternativos para peptídeos e derivados de peptídeo serão evidentes para aqueles hábeis na arte.

Altemativamente, certos peptídeos da invenção podem ser produzidos por expressão em um sistema procariótico ou eucariótico adequado. Por exemplo, uma construção de DNA pode ser inserida dentro de 10 um vetor de plasmídeo, adaptado para expressão em uma célula bacteriana ' (tal como E. coli) ou uma célula de levedura (tal como Saccharomyces cerevisiaé) ou dentro de um vetor de baculovírus para expressão em uma célula de inseto ou um vetor virai para expressão em uma célula mamífera. Tais vetores compreendem os elementos reguladores, necessários para 15 expressão do DNA na célula hospedeira, posicionados de tal maneira a permitir a expressão do DNA dentro da célula hospedeira. Tais elementos reguladores, requeridos para expressão, incluem seqüências promotoras, seqüências de iniciação de transcrição e, opcionalmente, seqüências intensificadoras.

Os peptídeos das SEQ ID NOS; 14 - 17, e outros similarmente projetados, são adequados para produção por expressão de uma molécula de ácido nucléico in vitro ou in vivo. Uma construção de DNA codificando um concatêmero dos peptídeos, o limite superior do concatêmero sendo dependente do sistema de expressão utilizado, pode ser introduzido dentro de um sistema de expressão in vivo. Após o concatêmero ser produzido, a divagem entre o terminal-C Asn e o seguinte terminal-N G é realizada por exposição do polipeptídeo à hidrazina.

Os peptídeos produzidos por expressão genética em um sistema procariótico ou eucariótico podem ser purificados de acordo com métodos conhecidos na arte. Os Exemplos 1 e 2 expõem métodos adequados para uso na presente invenção. Em uma forma de realização, um sistema de expressão/secreção comercialmente disponível pode ser usado, por meio do que o peptídeo recombinante é expressão e, em seguida, secretado da célula 5 hospedeira, para ser facilmente purificado pelo meio circundante.

Uma combinação de expressão genética e métodos sintéticos pode também ser utilizada para produzir análogos de compstatina. Por exemplo, um análogo pode ser produzido por expressão genética e, em seguida, submetido a um ou mais processos sintéticos pós-translacionais, p. 10 ex., para modificar o término-N ou C ou para ciclizar a molécula.

A estrutura da compstatina é conhecida na arte e as estruturas dos análogos precedentes são determinadas pro meios similares. Uma vez uma conformação desejada particular de um peptídeo curto tenha sido verificada, métodos para projetar um peptídeo ou peptidomimético para 15 ajustarem-se àquela conformação são bem conhecidos na arte. Vide, p. ex., G.R. Marshall (1993), Tetrahedron, 49: 3547 - 3558; Hruby e Nikiforovich (1991), em Molecular Conformation and Biological Interactions, P. Balaram & S. Ramasehan, eds., Indian Acad, of Sci., Bangalore, PP. 429-455). De particular relevância para a presente invenção, o projeto de análogos de pO peptídeo pode ser ainda refinado considerando-se a contribuição de várias cadeias laterais de resíduos aminoácidos, como examinado acima (isto é, para o efeito de grupos funcionais ou para considerações estéricas).

Será observado por aqueles hábeis na arte que um imitação de peptídeo pode servir igualmente bem como um peptídeo para fins de prover a 25 conformação de cadeia principal específica e as funcionalidades de cadeia lateral requeridas para ligar-se a C3 e inibir a ativação do complemento. Por conseguinte, é contemplado como estando dentro do escopo da presente invenção produzir ligação-C3, compostos de inibição de complemento através do uso de aminoácidos naturalmente ocorrentes, derivados de aminoácido, análogos ou moléculas de não-aminoácido capazes de serem unidasjSàr-a^^^)? formar a apropriada conformação de cadeia principal. Um análogo de fíãjo-ír. ■ * peptídeo ou um análogo compreendendo peptídeo e componentes não- peptídeo é às vezes referido aqui como um “peptidomimético” ou “mimético isostérico”, para designar substituições ou derivações dos peptídeos da invenção, que possuem as mesmas características conformacionais da cadeia principal e/ou outras funcionalidades, a fim de ser suficientemente similar aos peptídeos exemplificados para inibir a ativação do complemento.

O uso de peptidomiméticos para o desenvolvimento de análogos de peptídeo de alta afinidade é bem conhecido na arte (vide, p. ex., Zhao B et al., 1995; Beeley, N. 1994; e Hruby, VJ 1993). Presumindo restrições rotacionais similares àquelas dos resíduos aminoácidos dentro de um peptídeo, análogos compreendendo componentes não-aminoácidos podem ser analisados e seus motivos conformacionais verificados, por meio da plotagem Ramachandran (Hruby & Nikiforovich 1991), entre outras técnicas conhecidas.

Os análogos da compstatina da presente invenção podem ser modificados pela adição de componentes de polietileno glicol (PEG) ao peptídeo. Como é bem sabido na arte, a PEGuilação pode aumentar a meia- pO vida dos peptídeos e proteínas terapêuticos in vivo. Em uma forma de realização, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 1000 a cerca de 50.000. Em outra forma de realização, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 1000 a cerca de 20.000. Em outra forma de realização, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 1.000 a cerca de 10.000. Em uma forma 25 de realização exemplar, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 5000. O polietileno glicol pode ser uma cadeia ramificada ou reta e, preferivelmente, é uma cadeia reta.

Os análogos da compstatina da presente invenção podem ser covalentemente ligados a PEG via um grupo de ligação. Tais métodos são bem conhecidos na arte (Recapitulado in Kozlowski A. et al. 2O0i';5 também Harris JM e Zalipsky S, eds. Poly(etilene glycol), Chemishyi%ai|^^^' Biological Applications, ACS Symposium Series 680 (1997)). Exemplos não limitativos de grupos de ligação aceitáveis incluem um grupo éster, um grupo amida, um grupo imida, um grupo carbamato, um grupo carboxila, um grupo hidroxila, um carboidrato, um grupo succinimida (incluindo, sem limitação, succinato de succinimidila (SS), propionato de succinimidila (SPA), carboximetilato de succinimidila (SCM), succinimidil succinamida (SSA) e N-hidróxi succinimida (NHS)), um grupo epóxi, um grupo oxicarbonilimidazol (incluindo, sem limitação, carbonildimidazol (CDI), um grupo nitro fenila (incluindo sem limitação carbonato de nitrofenila (NPC) ou carbonato de triclorofenila (TPC)), um grupo trisilato, um grupo aldeído, um grupo isocianato, um grupo vinilsulfona, um grupo tirosina, um grupo cisteína, um grupo histidina ou uma amina primária. Em certas formas de realização, o grupo de ligação é um grupo succinimida. Em uma forma de realização, o grupo de ligação é NHS.

Os análogos da compstatina da presente invenção podem altemativamente ser acoplados diretamente a PEG (isto é, sem um grupo de ligação) através de um grupo amino, um grupo sulfidrila, um grupo hidroxila ou um grupo carboxila. Em uma forma de realização, PEG é acoplado a um resíduo de lisina adicionado ao término-C da compstatina.

A PEGuilação é uma maneira de aumentar a retenção in vivo dos peptídeos e proteínas terapêuticos. A depuração in vivo dos peptídeos pode ser também reduzida pela ligação dos peptídeos a certos outros peptídeos. Por exemplo, certos peptídeos de ligação da albumina exibem uma meia-vida incomumente longa de 2,3 h quando injetados por bolo intravenoso em coelhos (Dennis et al., 2002). Um peptídeo deste tipo, fundido ao Fab de fator anti-tecido de D3H44 possibilitou que Fab se ligasse à albumina, enquanto retendo a capacidade de Fab ligar-se ao fator de tecido (Nguyen et a albumina resultou em depúfàção^J7/| $ e prolongada meia vida em camundongo^ e coelhos, quando comparada com Fab tipo selvagem D3H44, comparáveis com aquelas vistas para fusões de moléculas Fab PEGuiladas, imunoadesinas e albumina. Como descrito no Exemplo 11 aqui, os inventores sintetizaram um análogo da compstatina fundido com um peptídeo de ligação-albumina e demonstraram que a proteína de fusão é ativa na inibição da ativação do complemento.

A atividade de inibição da ativação de complemento dos análogos da compstatina, peptidomiméticos e conjugados pode ser testada por uma variedade de ensaios conhecidos na arte. Em uma forma de realização preferida, o ensaio descrito no Exemplo 4 é utilizado. Uma lista não-exaustiva de outros ensaios é dada na Patente U.S. No. 6.319.897, incluindo mas não limitado a (1) ligação de peptídeo a C3 e fragmentos de C3; (2) vários ensaios 15 hemolíticos; (3) medição de divagem de C3 mediata por convertase de C3; e (4) medição da clivagem do Fator B pelo Fator D.

Os peptídeos e peptidomiméticos descritos aqui são de utilidade prática para qualquer finalidade para a qual a própria compstatina é utilizada, como sabido na arte. Tais usos incluem mas não são limitados a: (1) p0 inibição da ativação do complemento do soro, tecidos ou órgãos de um paciente (humano ou animal) que possa facilitar o tratamento de certas doenças ou condições, incluindo mais não limitado a degeneração macular relacionada com a idade, artrite reumatóide, lesão do cordão espinhal, doença de Parkinson e doença de Alzheimer; (2) inibição da ativação do 25 complemento, que ocorre durante o uso de órgãos ou implantes artificiais (p. ex., revestindo-se ou de outro modo tratando-se o órgão ou implante artificial com um peptídeo da invenção); (3) inibição da ativação do complemento, que ocorre durante o desvio extracorpóreo de fluidos fisiológicos (sangue, urina) (p. ex., revestindo-se a tubulação através da qual os fluidos são desviados com um peptídeo da invenção; e (4) na seleção de pequenas bibliotec^§ubde-4—~ 'Q^ moléculas para identificar outros inibidores de ativação da compstatina^^- ex., ensaios de alta produção de fase líquida ou sólida, projetados para medir a capacidade de um composto de teste competir com um análogo da compstatina para ligar-se com C3 ou um fragmento de C3).

Os seguintes exemplos são providos para descrever a invenção mais detalhadamente. Eles são destinados a ilustrar, não limitar, a invenção. Os materiais e métodos dados nos Exemplos 1 - 5 foram utilizados para gerar os resultados descritos nos Exemplos 6-11.

EXEMPLO 1 Expressão Bacteriana da Compstatina

Um análogo da compstatina com a seguinte seqüência, NH2- GICVWQDWGAHRCTN-OH (“G(-1)/V4W/H9A/N14”) (SEQ ID NO: 15) foi expresso em fusão com domínio de ligação de quitina e a inteína DnaB (New England Biolabs, Beverly, MA). Guiado pela seqüência de peptídeo e o uso do códon para E. coli, o seguinte código genético foi usado para regar um gene sintético para este peptídeo com a seguinte seqüência: 5ATTTGCGTTTGGCAGGATTGGGGTGCGCACCGTTGCACCAATTAA 3’ (SEQ ID NO: 29)

Para clonar o gene sintético no vetor pGEM-T, uma região flanqueante 5’, contendo um sítio SapI e uma região flanqueante 3’, contendo um sítio Pstl, foram projetadas. Para construir o gene sintético, os quatro oligonucleotídeos sobrepondo-se, mostrados abaixo, foram projetados utilizando-se software DnaWorks e sintetizados em Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA): 5GGTGGTGCTCTTCCAACGGTATTTGCGTTTGGCAGGA3' (SEQ ID NO: 30) 5TTGGGGTGCGCACCGTTGCACCAATTAACTGCAGG3' (SEQ ID NO: 31) 3CAACGTGGTTAATTGACGTCCGC5’ (SEQ ID NO: 32)

Os fragamentos de DNA de sobreposição foram montados por PCR como descrito por Stemmer et al., 1995. O gene resultante foi amplificado usando-se os seguintes iniciadores: ’ CGCCTGCAGTTAATTGGT3' (SEQ ID NO: 34) 5'GGTGGTGCTCTTCCAACG3' (SEQ IDNO: 35)

Os fragamentos amplificados por PCR da compstatina foram então clonados dentro do vetor pGEM-T e o clone resultante foi digerido com PstI e Sapl. O fragmento Pstl-Sapl, codificando o análogo da compstatina, foi ainda sublonado dentro do vetor de expressão pTWINl, que tinha sido pré- digerido com PstI e Sapl; a seqüência do clone foi verificada por seqüenciamento de DNA.

Para expressar o análogo da compstatina, as células de E.coli ER2566, transformadas com o clone de compstatina, foram cultivadas em meio SOB (20 g/1 triptona, 5 g/1 de extrato de levedura, 0,5 g/1 NaCl, 2,5 mM KC1, 10 mM MgCl2) a 37 °C. Quando um OD6oo 0,7 foi alcançado, a expressão foi induzida pela adição de IFPTG a uma concentração final de 0,3 mM, seguido por uma incubação adicional a 37 °C por 4 h. As células foram coletadas por centrifugação e lisadas por sonicação em tampão B1 (tampão de fosfato 20 mM, pH 8,5, com 500 mM NaCl e 1 mM EDTA) suplementado com 0,2% de Tween-20. O extrato de célula foi centrifugado e a fração solúvel foi aplicada a uma coluna de ligação de quitina (New England Biolabs, Beverly, MA), pré-equilibrada com tampão B1. A coluna foi lavada com 100 ml de tampão Bl, seguido por uma rápida lavagem com 3 volumes de coluna de tampão B2 (50 mM acetato de amónio, pH 7,0). A coluna foi incubada em temperatura ambiente por 20 h e o peptídeo foi eluído com Tampão B2, liofilizado e mais purificado em uma coluna HPLC Cl8. O peptídeo purificado foi identificado empregando-se espectrometria de massa MALDI-TOF.

EXEMPLO 2 Expressão de Análogos de Triptofano de Compstatina em E. coli

Para expressar análogos de compstatina contendo derivados de triptofano, o clone da compstatina pTWINl foi transformado no auxotrófico ER2566 Trp 82. A expressão foi realizada em meio mínimo de M9, suplementado com 1 mM L-triptofano como descrito acima. As células foram cultivadas em um OD60o - 1,0, então coletadas por centrifugação e recolocadas em suspensão em meio mínimo fresco, contendo 2 mM dos desejado(s) análogo(s) de triptofano: 5-fluoro-triptofano, 6-fluoro-triptofano, 7-aza-triptofano ou 5-hidróxi-triptofano. Os análogos de compstatina expressos foram ainda purificados como descrito no Exemplo 1.

EXEMPLO 3 Síntese de Peptídeo

A síntese e purificação de peptídeo foram realizadas como descrito por Sahu et al., 2000; e Mallik et al., 2005. Resumidamente, os peptídeos foram sintetizados em um sintetizador de peptídeo Applied Biosystem (modelo 431 A), empregando-se resina de amida Fmoc e grupos de proteção de cadeia lateral padrão. Os peptídeos foram clivados da resina por ^20 incubação por 3 horas a 22 °C com uma mistura de solvente contendo 5% fenol, 5% de tioanisol, 5% de água, 2,5 % de etanoditiol e 82,5% de ácido trifluoroacético (TFA). A mistura de reação foi filtrada através de um funil fritado, precipitada com éter frio, dissolvida em 50% de acetonitrila contendo 0,1% de TF A e liofilizada.

Os peptídeos brutos obtidos após clivagem foram dissolvidos em 10% de acetonitrila contendo 0,1% TFA e purificados utilizando-se uma coluna C-18 de fase inversa (Waters, Milford, MA). Oxidação dissulfeto foi obtida por um método de ciclização sobre resina, utilizando-se o reagente trifluoroacetato de Tálio (III). Este método elimina as etapas de oxidação de solução diluída e subseqüente concentração consumidora de tempo, g-das etapas de liofilização, antes de HPLC de fase reversa. Empregando-^este ^^ método, a formação do multímero era não-existente e um elevado nível dè (-90%) de material oxidado ou ciclizado, totalmente desprotegido, foi obtido.

A identidade e pureza de todos os peptídeos foram confirmadas por espectroscopia de massa de dessorção a leiser e HPLC.

Para a síntese do 5-fluoro-triptofano, 1-metil-triptofano e análogos de 5-metil-triptofano, derivados-Fmoc-dZ foram usados. A separação dos peptídeos enantioméricos foi realizada como descrito por Meyers et al., 10 1978. A mistura dl de cada peptídeo foi separada em peptídeos isoméricos d e em uma coluna HPLC de fase reversa Cl8, usando-se 10% de acetonitrila em acetato de amónio 0,0IM, pH 4,1. A identidade isomérica dos peptídeos eluídos foi determinada tratando-se os peptídeos com protease V8, seguido por análise usando-se espectrometria de massa MALDI-TOF (MicroMass 15 TOFspec2E).

EXEMPLO 4 Ensaios de Inibição de Complemento

A atividade inibitória da compstatina e seus análogos sobre o sistema de complemento foi determinada medindo-se seu efeito sobre a ativação do sistema do complemento por imunocomplexos. A inibição da ativação do complemento foi avaliada medindo-se a inibição da fixação de C3 aos complexos de ovalbumina - anti-ovalbumina no plasma humano normal. Os poços de microtítulo foram revestidos com 50 μl de ovalbumina (10 mg/ml) por 2 h a 25 °C (durante a noite a 4 °C). Os poços foram saturados 25 com 200 μl de 10 mg/ml de BS A por 1 h a 25 °C e então um anticorpo anti- ovalbumina de coelho foi adicionado para formar um imunocomplexo pelo qual o complemento pode ser ativado. Trinta microlitros de peptídeos em várias concentrações foram adicionados diretamente a cada poço, seguido por 30 μl de uma diluição 1:80 de plasma humano. Após 30 min de incubação, C3b/iC3b ligado foi detectado usando-se um anticorpo conjugado-HRP (B3, 's7l anti-humano de cabra. A cor foi desenvolvida adicionando-se substrato de peroxidase ABTS e densidade óptica medida a 405 nm.

Os dados de absorvência obtidos a 405 nm foram transladados 5 para % de inibição com base na absorvência correspondendo a 100% da ativação do complemento. A % de inibição foi plotada em relação à concentração de peptídeo e os dados resultantes ajustados para adaptarem-se à função de dose-resposta logística, usando-se o software 7.0. A concentração do peptídeo causando 50% de inibição de deposição de C3b/iC3b foi adotada 10 como a IC50 e usada para comparar as atividades de vários peptídeos. Os valores IC50 foram obtidos de parâmetros ajustados, que obtiveram o mais baixo valor qui-quadrado.

EXEMPLO 5 Análise Calorimétrica de Titulação Isotérmica da Interação de C3 com 15 Compstatina e seus Análogos

Experimentos de calorimetria de titulação isotérmica foram realizados utilizando-se o calorímetro VP-ITC Microcal (Microcal Inc., Northampton, MA). Concentrações de proteína de 3,5 - 5 μM e concentrações de peptídeo de 80 — 200 μM foram usadas para estes p0 experimentos. Todas as titulações foram realizadas em PBS (10 Mm tampão de fosfato com 150 mM NaCl, pH 7,4). Em cada experimento, a proteína alvo, C3, foi carregada dentro da célula e o peptídeo foi carregado dentro da seringa. Todos os experimentos foram realizados a 25 °C e para cada experimento 2 μl de injeções de peptídeo foram feitas dentro da célula 25 contendo a proteína. Em cada experimento, as isotermas brutas foram corrigidas para os calores de diluição, subtraindo-se as isotermas representando injeções de peptídeo dentro do tampão. As isotermas resultantes foram ajustadas a vários modelos dentro do software Origin 7.0 e o modelo que obteve o mais baixo valor qui-quadrado foi julgado ser apropriado para o respectivo conjunto de dados. Os valores de afinida^é ligação e entropia foram plotados em relação aos valores log P.

EXEMPLO 6 Papel do Triptofano em Interação de C3-Compstatina, como Avaliado 5 por Análogos de Compstatina Bacterianamente Expressos

Quatro diferentes análogos de triptofano, que diferem na natureza química do anel indol, foram incorporados dentro da compstatina usando-se um sistema de expressão de proteína mediado por inteína. Em seguida à expressão, os peptídeos foram purificados em uma única etapa com 10 uma produção final de 2 mg/1 de cultura. Os análogos de triptofano 5-fluoro- triptofano, 6-fluoro-triptofano, 7-aza-triptofano e 5-hidróxi-triptofano foram também expressos empregando-se o auxótrofo ER2566/Trp 82, como indicado pelos perfis de MALDI e os peptídos resultantes foram purificados à homogeneidade. Compstatina e análogos nativos foram ciclizados in vivo 15 através de uma ligação dissulfeto, como evidenciado por sua incapacidade de reagir com PHMB. Todos os peptídeos foram ainda purificados em uma coluna HPLC Cl8 de fase reversa.

A atividade do análogo da compstatina expresso G(- 1)/V4W/H9A/N14 (SEQ ID NO: 15) exibiu uma IC50 de 1,2 μm, que é 30 similar à atividade observada para o análogo Ac-V4W/H9A (SEQ ID NO: 5). Este achado indica que a glicina localizada no término-N do peptídeo expresso representa um papel similar àquele do grupo acetila, localizado no término-N do análogo Ac-V4W/H9A.

Todos os análogos da compstatina expressos, exceto o análogo 25 de triptofano 7-aza, foram constatados serem ativos nas concentrações testadas. Entretanto, o peptídeo mostrou diferentes níveis de atividade em relação ao análogo, Ac-V4W/H9A (Figura 1; Tabela 2). A compstatina contendo 6-fluoro-triptofano e 5-fluoro-triptofano, bem como alanina na posição 9 exibiu uma atividade 2,8 e 2,5-vezes mais elevada, respectivamente, Tabela 2. Atividade inibitória do com demento dos peptídeos expressos

Sem ficarmos limitados a qualquer mecanismo particular, acredita-se que adicionando-se átomo de flúor aumenta-se a atividade do peptídeo aumentando-se a hidrofobicidade do anel indol. A incorporação de análogos de triptofano menos hidrofóbicos 5-hidróxi triptofano e 7-aza- triptofano foi também investigada. Ao contrário dos resultados com os análogos 5-fluoro e 6-fluoro, os análogos da compstatina contendo 5-hidróxi- triptofano mostraram 27,5 vezes perda de atividade em comparação com o análogo Ac-V4W/H9A (SEQ ID NO: 5) e o peptídeo contendo 7-aza- triptofano não mostrou nenhuma atividade em absoluto nas concentrações testadas. O 7-aza-triptofano parece-se com o triptofano em estrutura molecular, exceto que ele tem um átomo de nitrogênio na posição 7 do anel indol, o oposto a um átomo de carbono. A perda de atividade observada na substituição de 7-aza-triptofano mostrou a importância relativa deste átomo de carbono.

EXEMPLO 7 Papel dos Triptofanos Individuais na Interação de C3-Compstatína

Síntese de peptídeo de fase sólida foi usada para gerar análogos da compstatina com 5-fluoro-triptofano incorporado seletivamente na posição 4, posição 7 ou ambas as posições 4 e 7, com alanina na posição 9. A síntese foi realizada usando-se Fmoc-5-fluoro-<#-triptofano. Esta reação produziu uma mistura enantiomérica dos peptídeos contendo 5-fluoro-ã^ triptofano e 5-fluoro-Z-triptofano. Três diferentes peptídeos foram sintetizados: dois peptídeos com substituição única independentemente na posição 4 ou 7 e um peptídeo com substituições em ambas as posições 4 e 7. Embora uma mistura de análogos de 5-fluoro-Z-triptofano e 5-fluoro-óZ- triptofano pudesse ocorrer no caso de substituições únicas, uma mistura de quatro combinações enantioméricas foi possível no caso da dupla substituição. Cada uma das misturas de peptídeo foi ainda submetida a HPLC de fase reversa, para separar os enantiômeros de peptídeo. A identificação dos enantiômeros foi realizada digerindo-se os peptídeos com protease V8 e, subseqüentemente, analisando-se o produto digerido usando-se MALDI. A protease V8 cliva no lado do terminal-C dos resíduos Asp somente quando seguida por um Z-aminoácido. A identificação dos produtos de clivagem nos espectros de massa indicou que o peptídeo Z-enantiomérico eluiu primeiro, seguido pela forma-íZ, onde não foram detectados fragmentos de clivagem.

Todos os peptídeos contendo 5-fluoro-Z-triptofano ou 5-fluoro- cZ-triptofano ou ambos foram testados quanto a sua atividade inibitória de complemento. O peptídeo sintético substituído por 5-fluoro-Z-triptofano em ambas as posições mostrou uma atividade 2,5 vezes mais elevada do que aquela de Ac-V4W/H9A (SEQ ID NO: 5) (Tabela 3).Tabela 3. Atividade inibitória do complemento dos análogos da compstatina sintética contendo 5-fluoro-l-tríptofano

Ensaios de inibição do complemento (Figura 2; Tabela 3) indicaram que (a) a substituição de 5-fluoro-Z-triptofano na posição 4 sozinho tomou o peptídeo pelo menos 1,5 vezes menos ativo do que Ac-V4W/H9A (SEQ ID NO: 5). A substituição de 5-fluoro-Z-triptofano na posição 7 soffia^ aumentou a atividade de 2,7-vezes quando comparado com Ac-V4W/H9A. A substituição de 5-fluoro-Z-triptofano simultaneamente nas posições 4 e 7 também produziu um aumento de 2,5 vezes na atividade relativa para Ac- V4W/H9A (SEQ ID NO: 5). A substituição de 5-fluoro-íZ-triptofano na posição 4 ou 7, ou em ambas, tomou o peptídeo inativo.

EXEMPLO 8 Base Termodinâmica para o Reconhecimento Mediado por triptofano da Compstatina por C3

Calorimetria de titulação isotérmica foi usada para examinar a ligação dos peptídeos a C3 e investigar a base termodinâmica para suas atividades. Os dados calorimétricos obtidos para a interação de todos os peptídeos com C3 ajustarem-se a um conjunto de modelo de sítios com estequiometria próxima de 1. Acredita-se que a ligação destes peptídeos em C3 ocorre em uma relação 1 : 1. Os parâmetros termodinâmicos resultantes destes ajustes são mostrados na Tabela 4. Como evidente pelos valores Kd, o peptídeo com uma única substituição de 5-fluoro-Z-triptofano na posição 7 e uma dupla substituição nas posições 4 e 7 exibiu ligação mais estreita do que os análogos de Ac-V4W/H9A (SEQ ID NO: 5) e Ac-V4(5f-Z-W)/H9A (SEQ ^0 ID NO: 18). Este achado está de acordo com as atividades relativas observadas no ensaio de inibição de complemento (Tabela 3), indicando que existe uma correlação de atividade de ligação.

Todos os peptídeos ligaram-se a C3 com uma entalpia negativa e entropia positiva. Tal ligação é uma característica da interação da 25 compstatina com C3. Entre todos os peptídeos examinados, o análogo de Ac- V4W/W7(5f-Z-W)/H9A substituído na posição 7 (SEQ ID NO: 19) exibiu uma mais elevada entalpia de ligação (ΔH = -21,83, ΔΔH = -3,69) do que sua contraparte tipo selvagem. O análogo Ac-V4(5f-Z-W)/H9A substituído na posição 4 (SEQ ID NO: 18) ligou-se a C3 com uma entalpia de -16,69 kcal/mol, 1,45 kcal/mol, menor do que aquela exibida por sua contrapartβuti selvagem.

A incorporação de 5-fluoro-triptofano na posição 4 resulta na perda de entalpia de 1,45 kcal/mol em relação àquela do triptofano desta posição (Tabela 4). Uma vez que a única diferença entre o triptofano e 5- fluoro-triptofano é o átomo de flúor em C5 do indol, esta perda de entalpia pode ser atribuída à substituição de hidrogênio por flúor.Tabela 4. Parâmetros termodinâmicos para a interação dos análogos sintéticos da compstatina contendo 5-fluoro-Z-triptofano e C3

A incorporação de 5-fluoro-triptofano na posição 7 aumentou a entalpia em 3,69 kcal/mol em relação ao tipo selvagem (Tabela 4). Sem ficarmos limitados a qualquer mecanismo particular, acredita-se que o triptofano na posição 7 está participando de uma interação entalpicamente favorável, tal como ligação de hidrogênio. Substituindo-se um dos hidrogénios do indol por um átomo de flúor poderia fortalecer o caráter da ligação de hidrogênio do NH de indol, devido à queda de pKa. Altemativamente, o flúor forma uma ligação de hidrogênio como um resultado de sua natureza doadora de elétrons, como foi demonstrado na estrutura da tetradeca (3-fluorotirosil)glutationa transferase.

Outra explicação para o aumento observado na entalpia é que uma molécula de água faz ponte da interação entre o átomo de flúor e um aceitador de hidrogênio em C3, em cujo caso duas ligações de hidrogênio (equivalentes a cerca de 4 kcal/mol de energia) precisam ser formadas. Suporte para esta teoria vem da diminuição da entropia observada para a interação do análogo de Ac-V4W/W7(5fW)/H9A substituição na pósiyão (SEQ ID NO: 19) em relação ao análogo tipo selvagem (Tabela 4), uSia^’- 5< diminuição que poderia ser produzida pela ligação de uma molécula de água adicional na interface. Interações mediadas por água entre átomos de flúor e 5 outros aceitadores de ligação de hidrogênio foram observadas em outros sistemas.

A ligação do análogo duplamente substituído a C3 produziu uma mudança de entalpia de -19,85 kcal/mol, uma mudança de entropia de - 9,35 kcal/mol e uma mudança de energia livre de -10,5 kcal/mol. Acredita-se que a incorporação de 5-fluoro-triptofano simultaneamente em ambas as posições ab-roga os efeitos das únicas substituições.

EXEMPLO 9 Análogos Adicionais de Compstatina

Incorporação de análogos de triptofano na posição 4. Foi mostrado nos Exemplos 5 e 6 que a substituição de valina por triptofano na posição 4 da compstatina aumentou sua atividade 45-vezes. Para investigar mais a natureza da interação mediada pelo resíduo na posição 4 durante o curso da ligação da compstatina com C3, o triptofano na posição 4 foi substituído por análogos de triptofano e 2-naftilalanina.

Ensaios baseados em ELISA foram usados para testar a atividade de todos os análogos de peptídeo contendo análogos de triptofano na posição 4 e alanina na posição 9. Embora a substituição com 1-metil- triptofano (Ac-V4(l-metil-W)/H9A) (SEQ ID NO: 23) e 2-naftilalanina (Ac- V4(2-Nal)/H9A) (SEQ ID NO: 7) aumentasse a atividade em relação à 25 compstatina 264 e 99-vezes, respectivamente, a substituição de 5-fluoro- triptofano (Ac-V4(5f-/-W)/W7/H9A) (SEQ ID NO: 18 e 5-metil triptofano (Ac-V4(5-metil-W)/H9A) (SEQ ID NO:22) resultou em uma atividade mais baixa; para 31 e 67 vezes maior do que a atividade exibida pelo peptídeo tipo selvagem (Tabela 5). A Figura 3 mostra as curvas inibitórias representando a atividade e a Tabela 5 mostra os valores IC50 calculados pelas curvas e as atividades relativas dos peptídeos em comparação com a atividade da compstatina original. A Figura 5 mostra constantes inibitórias (IC50) plotadas em relação aos valores log P dos análogos de triptofano e 2-naftilalanina.Tabela 5. Atividade inibitória do complemento dos análogos da compstatina

A ligação dos peptídeos da compstatina foi também investigada usando-se calorimetria de titulação isotérmica. Os dados calorimétricos obtidos para a interação de todos os peptídeos com C3 ajustam-se a um conjunto de modelo de sítios com estequiometria próxima de 1 (Figura 4). Este resultado sugere que a ligação dos peptídeos a C3 ocorre em uma relação 1 : 1. Os parâmetros termodinâmicos resultados destes ajustes são mostrados na Tabela 6. Como evidente pelos valores Kd, Ac-V4 (1-metil- W)/H9A exibiu afinidade de ligação mais elevada (Kd = 0,015 μm), em comparação com todos os outros peptídeos tendo uma única substituição na posição 4. A plotagem destes valores em relação aos valores log P de análogos indica que existe uma correlação entre a afinidade de ligação e a natureza hidrofóbica dos análogos de triptofano e 2-naftilalanina. De acordo com a correlação, a afinidade de ligação aumenta com o aumento da hidrofobicidade do análogo incorporado na posição 4. Esta observação é consistente com a correlação mostrada entre log P e as constantes inibitórias. Tabela 6. Parâmetros termodinâmicos para a interação dos análogpjsdjj compstatina sintéticos contendo 5-fluoro-l-triptofano e C3

Todos os peptídeos ligados a C3 com uma entalpia negativa e entropia positiva, sugerindo que a ligação é acionada pela entalpia. Tal ligação é uma característica da interação da compstatina com C3. Entretanto, a ligação destes peptídeos é caracterizada por uma mudança de entalpia menor do que a do tipo-selvagem e a mudança de entropia mudou para terminação favorável. A Figura 5B mostra uma plotagem de log P vs. -TΔS, que indica que, com um aumento da hidrofobicidade dos análogos incorporados na posição 4, a entropia é mais favorecida, assim fazendo um impacto positivo na mudança de energia livre.

Incorporação de análogos de triptofano na posição 7. Foi proposto no Exemplo 7 que o triptofano na posição 7 produz uma ligação de hidrogênio com um resíduo em C3. Para examinar esta possibilidade mais, triptofano na posição 7 foi substituído por análogos de triptofano similares às substituições na posição 4, para elucidar a natureza da interação feita por triptofano nesta posição. A substituição por 5-fluoro-triptofano (Ac- V4W/W7(5f-Z-W)/H9A) (SEQ ID NO:19) produziu um peptídeo 121 vezes mais ativo (Figura 3, Tabela 5). As substituições de triptofano 7 pelo análogo 5-metil trp ou 1-metil trp tomou a compstatina inativa (dados não mostrados). Assim, nenhuma correlação entre a atividade e hidrofobicidade dos análogos de triptofano foi observada. Oz

As propriedades termodinâmicas dos diferentes análogÓs-Tfp7 foram investigadas em paralelo por calorimetria (Tabela 6). Uma vez que nenhuma ligação foi detectada para peptídeos contendo o 5-metil trp ou 1- metil trp na posição 7, os parâmetros de ligação não existem. Somente o peptídeo Ac-V4W/W7(5f-l-W)/H9A (SEQ ID NO: 19) ligou-se a C3. A afinidade de ligação foi de 0,035 μm, que é maior do que aquela observada para todos os peptídeos tendo um análogo de Trp na posição 4, exceto para o peptídeo Ac-V4(l-metil-W)ZH9A (SEQ ID NO:23). Ao contrário dos peptídeos tendo uma anólogo de Trp na posição 4, Ac-V4W/W7(5f-l-W)ZH9A (SEQ ID NO: 19) ligou-se a C3 com elevada mudança de entalpia de ligação favorável (ΔH = -21,83, ΔΔH = -3,69) e mudança de entropia desfavorável (- TΔS = 11,56, -TΔΔS = 2,77), sugerindo interações não-covalentes favoráveis adicionais de natureza polar.

Os resultados mostram que a incorporação de 5-fluoro-triptofano na posição 7 resulta em um aumento da atividade da compstatina, enquanto que a incorporação de análogos de 5-metil-triptofano e 1-metil- triptofano toma a compstatina inativa. A perda de atividade da compstatina na incorporação de 1-metil-triptofano suporta a conclusão de que a ligação de p0 hidrogênio, mediada por N-H de Trp 7, é importante para a interação da compstatina com C3. Além disso, a perda completa de atividade da compstatina na incorporação de 5-metil-triptofano sugere que um aminoácido hidrofóbico não é bem tolerado na posição 7.

Incorporação de análogos de triptofano em ambas as posições 4 e 7. Uma vez que a substituição de triptofanos na posição 4 por 1- metil-triptofano e posição 7 por 5-fluoro-triptofano produziu análogos de compstatina que mostraram um aumento drástico na atividade, um análogo de compstatina contendo substituições nas posições 4 e 7 foi gerado. O peptídeo resultante (Ac-V4(l-metil-W)/W7(5f-1-W)/H9A) (SEQ ID NO:24) gerou F's., 1 Rub: uma curva de inibição similar àquela da única substituição com T*meti triptofano (Ac-V4(l-metil-W)/H9A) (SEQ ID NO:23) (Figura 3, Tabelalft).^'

A afinidade de ligação (Kd = 0,017) observada para este peptídeo no calorímetro é também similar àquela de Ac-V4(l-metil-W)/H9A (SEQ ID 5 NO:23). Estas observações sugerem que 5-fluoro-triptofano não tem efeito na posição 7 na presença de 1-metil-triptofano na posição 4 sob estas condições experimentais.

Incorporação de outro análogo de triptofano na posição 4.

Para investigar mais a natureza da interação mediada pelo resíduo na posição 10 4 durante o curso da ligação da compstatina a C3, o triptofano na posição 4 foi substituído pelo análogo de triptofano 1-formil-trÍptofano.

A Figura 6 mostra uma comparação de inibição de complemento percentual vs. concentração de peptídeo para Ac-V4(l-metil- W)/H9A (SEQ ID NO:23) (círculos) e Ac-V4(l-formil-W)/H9A (SEQ ID 15 NO:25). Como pode ser visto, o análogo de 1-formil-W era essencialmente idêntico ao análogo de 1-metil-W em sua atividade de inibição de complemento.

EXEMPLO 10 Pegilação do Análogo da Compstatina

Uma meia-vida prolongada da compstatina é vantajosa para seu uso em tratamentos crônicos. A extensão da meia-vida dos peptídeos terapêuticos testados foi conseguida em diversos exemplos através da PEGuilação (vide Veronese et al., 2001), visto que PEG tem a capacidade de retardar a eliminação das biomoléculas da circulação, através de uma 25 variedade de mecanismos, incluindo decrescente depuração renal, proteólise e imunogenicidade. A PEGuilação envolve ligação covalente de polímeros PEG a macromoléculas, preferivelmente na amina primária das lisinas.

Este exemplo descreve a preparação de um análogo de compstatina PEGuilado, Ac-V4(l-metil-W)/H9A-K-PEG 5000 (SEQ ID NO:36) e avaliação do composto quanto a sua capacidade de inibirei ‘A, do complemento.

Fmoc-NH-NHS-5000 PEG foi comprado da Nektar transforming therapeutics, 490 discovery Dr, Huntsville, AL 35806.

O composto Ac-V4(l-metil-W)/H9A-K-PEG 5000 (SEQ ID NO:36) foi sintetizado quimicamente por química de peptídeo de fase sólida Fmoc, de acordo com um protocolo padrão modificado. Resumidamente, PEG foi dissolvido em 3 ml de diclorometano, 1 ml de 2M DIEA foi adicionado manualmente e PEG foi misturado por 5 minutos.

Em seguida o PEG foi transferido para o vaso e deixado para acoplar durante a noite. O PEG foi então desprotegido com 20% de piperidina pro 20 min.

Em seguida, a síntese prosseguiu para o protocolo padrão, com uma lisina incorporada no término-C da molécula para fins de ligação do PEG a sua cadeia lateral.

Clivagens finais dos peptídeos foram conseguidas com Reagente D (TFA:H2O:TIS;Fenol, 87,5:5:2,5:5) (4 ml) a 25 C por 90 min, para fornecer o produto desejado. O peptídeo foi então purificado em uma coluna HPLC de fase reversa Cl 8, liofilizado e caracterizado por MALDI-TOF.

O análogo da compstatina PEGuilado foi testado quanto à atividade inibidora do complemento, utilizando-se o ensaio in vitro descrito no Exemplo 4. Como mostrado na Figura 7, o análogo PEGuilado era ativo na inibição da ativação do complemento, entretanto, sete vezes mais conjugado foram necessários para obter-se a mesma quantidade de inibição como o análogo não-PEGuilado, Ac-V4(l-metil-W)/H9A (SEQ ID NO:23).

EXEMPLO 11 Conjugado de Proteína de Ligação de Albumina de Análogo da Compstatina

Dennis et al. (2002) identificou uma série de peptídeos tendo a seqüência de núcleo DICLPRWGCLW (SEQ ID NO:37),< especificamente ligou-se à albumina do soro de múltiplas espécies com alta afinidade. Estes peptídeos ligaram-se à albumina com estequiometria de 1 : 1 em um sítio distinto dos sítios de ligação de molécula pequena conhecidos. O peptídeo SA21 (AcRLIEDICLPRWGCLWEDDNH2; SEQ ID NO:38) tem uma meia-vida incomumente longa de 2,3 h, quando injetado por bolo intravenoso em coelhos. Como mencionado na Descrição Detalhada, uma seqüência relacionada, fundida ao fator anti-tecido Fab de D3H44, possibilitou o Fab ligar-se ao fator 1 de tecido (Nguyen et al. 2006). Esta 10 interação com albumina resultou em reduzido depuração in vivo de 25 e 58- vezes em camundongos e coelhos, respectivamente, quando comparada com D3H44 Fab tipo selvagem. A meia-vida foi estendida 37-vezes a 31,4 h em coelhos e 26-vezes a 10,4 h em camundongos, obtendo-se 25-43% da meia- vida da albumina nestes animais. Estas meias-vidas excederam aquelas de um 15 Fab 2 e são comparáveis com aquelas vistas para moléculas Fab PEGuiladas, imunoadesinas e fusões de albumina.

Este exemplo descreve a síntese de um análogo de compstatina fundido com um peptídeo de ligação de albumina e sua atividade em ensaios in vitro para inibição do complemento.

O composto 4(lMeW)-ABP foi sintetizado quimicamente por química de peptídeo de fase sólida Fmoc, de acordo com protocolos padrão. Os términos N e C do peptídeo foram protegidos com grupos acetila e amida. O peptídeo foi ainda purificado em uma coluna HPLS de fase reversa Cl8, liofilizado e caracterizado por espectrometria de massa MALDI.

Para ciclização, a resina-peptídeo (0,10 mmol/g de carga com base em análise de aminoácido) foi dilatada em diclorometano (DCM) (2 ml) por 5 min, filtrada e tratada com 94:1:5 DCM/TFA/TIS (5 ml) a 25 °C 3 vezes x 2 min cada, para seletivamente desproteger os grupos de proteção S-Mmt, removendo-se a pressão N2 do solvente. Este intermediários de bis(tiol), bis(Acm)-peptídeo-resina foram lavados com CH2CI2, DMF e NMP (eax^a 5n vezes x 2 min, 2 ml), dilatados mais em NMP (2 ML) por 5 min e ent^P“ tratados com Et3N (2 eq.) em NMP a 25 °C por 4 h. O peptídeo-resina foi então lavado com DMF e CH2CI2 (cada 5 vezes x 2 min, 2 ml). Em seguida às formações ligadas por resina do primeiro circuito fechado, o peptídeo-resina foi novamente lavado com DMF (5 vezes x 2 min, 2 ml) e dilatado em DMF (2 ML) por 5 min, filtrado e tratado com Tl(tfa)3 (1,5 eq.) em DMF-anisol (4 ml) para ciclizar os segundos circuito fechados de dissulfeto. Após suave agitação a 25 °C por 4 h, os reagentes de tálio foram removidos com DMF (8 vezes x 2 min, 2 ml) e as resinas de peptídeo foram lavadas mais com CH2CI2 (5 vezes x 2 min, 2 ml). Clivagens finais do peptídeo bicíclico foram conseguidas com Reagent D (TFA: H2O:TIS:Fenol, 87,5:5:2,5:5) (4 ml) a 25 °C por 90 min, para fornecer o produto desejado.

O peptídeo conjugado resultante (SEQ ID NO:39) é mostrado abaixo.

O peptídeo-compstatina de ligação com albumina foi testado quanto à atividade de inibição do complemento, utilizando-se o ensaio in vitro descrito no Exemplo 4. Como mostrado na Figura 8, o conjugado era ativo na inibição da ativação do complemento, entretanto, sete-vezes mais conjugado foi necessário para obter-se a mesma quantidade de inibição que o análogo não conjugado, Ac-V4(l-metil-W)/H9A (SEQ ID NO:23).

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A presente invenção não é limitada às formas de realização descritas e exemplificadas acima, porém é capaz de variação e modificação dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims

1. Composto que inibe a ativação do complemento, caracterizado pelo fato de compreender um peptídeo tendo uma sequência SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 36, ou SEQ ID NO: 39.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 20.

3. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 16.

4. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 17.

5. Composto de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 20.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 25.

7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 23.

8. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 24.

9. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 25.

10. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 ou SEQ ID NO: 24.

11. Composto de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 19.

12. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo tem a sequência SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 ou SEQ ID NO: 20.

13. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o composto ser PEGuilado.

14. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de compreender a SEQ ID NO: 36, em que PEG 5000 está conjugado à lisina C-terminal.

15. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda um componente de peptídeo adicional, que prolonga a retenção IN VIVO do composto, em que o componente de peptídeo adicional é um peptídeo de ligação de albumina.

16. Composto de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de compreender a SEQ ID NO:39.