CN101039957A - 合成的趋化因子受体配体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了合成CXCR3配体，包括共有CXCR3配体和杂合CXCR3配体；也提供了包括该配体的组合物。本发明提供了编码合成CXCR3配体的多核苷酸；包含该多核苷酸的表达载体；和包含该多核苷酸的宿主细胞。本发明也提供了治疗纤维变性病症的方法；治疗血管生成病症的方法；治疗癌症的方法；和治疗细菌感染的方法。这些方法一般性地涉及将有效剂量的目标合成CXCR3配体给予需要的个体。

Description

合成的趋化因子受体配体及其使用方法
交叉引用
[0001]本申请要求2003年5月16日提交的美国临时专利申请60/471,404的权益，该临时申请通过引用方式整体并入本文。
技术领域
[0002]本发明的领域为趋化因子受体的配体，以及纤维变性病症(fibroticdisorders)、血管生成病症(angiogenic disorder)、癌症和细菌感染的治疗。
背景技术
[0003]趋化因子是炎症中产生的小细胞因子家族，它们调节白细胞的募集(leukocyte recruitment)。趋化因子能够选择性地诱导血液的构成成分(除了血红细胞之外)的趋化性，包括白细胞，诸如嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞诸如T细胞和B细胞。除了刺激趋化性外，应答细胞中的趋化因子还能选择性地诱发其他变化，包括细胞形状变化、细胞内游离钙离子浓度的瞬时增加、颗粒胞吐作用(granule exocytosis)、整联蛋白增量调节(integrin upregulation)、形成生物活性类脂(例如白三烯)和突发性呼吸(respiratory burst)，这些变化与白细胞激活相关。因此，趋化因子是炎症反应的早期触发物(trigger)，引起炎症介质释放、化学趋向和外渗到感染或炎症位点。
[0004]已经鉴定到4个趋化因子家族，根据保守的氨基末端半胱氨酸模体(motifs)的数目和排列分组：C、CC、CXC和CX3C，其中“X”是非保守氨基酸残基。CXC趋化因子包括IL-8、IP-10、Mig、PF4、ENA-78、GCP-2、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2、NAP-4’。许多CXC趋化因子吸引嗜中性粒细胞。例如，CXC趋化因子白介素8(IL-8)、血小板因子4(PF4)和嗜中性白细胞活化肽2(NAP-2)是嗜中性粒细胞的强效化学吸引剂(chemoattractants)和激活剂。命名为Mig(γ干扰素诱导的单核因子)和IP-10(干扰素-γ可诱导的10kDa蛋白)的CXC趋化因子在诱导被激活的外周血淋巴细胞的趋化性中具有活性。
[0005]CC和CXC趋化因子通过受体发挥功能，该受体属于7次跨膜G蛋白偶联受体超家族。这个G蛋白偶联(蛇根碱)受体家族包括一大组的整合膜蛋白，它们含有7个跨膜区域。受体被偶联到G蛋白，G蛋白是异源三聚体调控蛋白，能够结合GTP并介导来自偶联受体的信号转导，例如通过产生胞内介质来进行介导。
[0006]CXC趋化因子受体1至4(CXCR1-4)结合CXC趋化因子。CXCR3(CD183)是IP10、Mig和I-TAC的受体。经由CXCR3的信号传导，诱发炎症相关的效应物T细胞(effectors T cells)的趋化性迁移(chemotactic migration)。
[0007]本领域需要对病症如癌症、纤维变性病症和细菌感染的改进治疗。本发明解决了该需要。
参考文献
[0008]美国专利6,184,358；美国专利6,491,906；美国专利5,871,723；Cole et al.(2001)J.Immunol.167：623-627。
发明概述
[0009]本发明提供了合成的CXCR3配体(synthetic CXCR3 ligand)，包括共有CXCR3配体(consensus CXCR3 ligand)和杂合CXCR3配体(hybrid CXCR3 ligand)；也提供了包括该配体的组合物。本发明提供了编码合成CXCR3配体的多核苷酸；包括该多核苷酸的表达载体；和包括该多核苷酸的宿主细胞。本发明也提供了治疗纤维变性病症的方法；治疗血管生成病症的方法；治疗癌症的方法；和治疗细菌感染的方法。这些方法一般涉及将有效剂量的目标合成CXCR3配体给予需要的个体。
附图简述
[0010]图1提供了示范性CXCR3共有配体的氨基酸序列“IP-10共有序列”(SEQID NO：01)、“I-TAC共有序列”(SEQ ID NO：02)、“Mig共有序列”(SEQ ID NO：03)；和“多数”序列(″Majority″sequence)(SEQ ID NO：11)。
[0011]图2提供了IP-10(SEQ ID NO：12)；iTAC(SEQ ID NO：13)；和MIG(SEQ IDNO：14)之间的氨基酸序列比对(alignment)。
[0012]图3提供了示范性杂合CXCR3配体的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。
[0013]图4提供了示范性杂合CXCR3配体的氨基酸序列(SEQ ID NO：16)。
[0014]图5提供了示范性杂合CXCR3配体的氨基酸序列(SEQ ID NO：17)。
[0015]图6提供了示范性杂合CXCR3配体的氨基酸序列(SEQ ID NO：18)。
[0016]图7提供了示范性杂合CXCR3配体的氨基酸序列(SEQ ID NO：19)。
[0017]图8提供了示范性杂合CXCR3配体的氨基酸序列(SEQ ID NO：20)。
定义
[0018]术语“多肽(polypeptide)”指氨基酸聚合物，并且不是指特定长度的产物，因此，肽、寡肽和蛋白质都包括在多肽的定义之内。该术语也不仅仅指，也不排除多肽翻译后的修饰，例如糖基化作用、乙酰化作用、磷酸化作用和类似修饰。包括在术语“多肽”中的例如是含有一个或多个氨基酸类似物(例如包括非天然氨基酸、非编码氨基酸等)的多肽，具有替代键(substituted linkage)以及本领域已知的其他修饰的多肽，这些修饰可以是自然发生的，也可以是非自然发生的。术语“多肽”包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列的融合蛋白，具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基的融合蛋白；免疫标记的蛋白质；和类似蛋白。
[0019]术语“多核苷酸(polynucleotide)”和“核酸分子(nucleic acid molecule)”在本文中交替使用，指具有任何长度的、聚合形式的核苷酸。多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。核苷酸可以具有任何三维结构，并可以发挥任何功能，已知的或未知的功能。术语“多核苷酸”包括单链、双链和三螺旋分子。“寡核苷酸(Oligonucleotide)”一般指长度在约5至约100核苷酸之间的单链或双链DNA这样的多核苷酸。然而，对于本公开内容，对寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为寡聚体或低聚物，并且可以从基因中分离得到，或用本领域已知的方法化学合成。术语“多核苷酸”包括发现于任何形式的双链DNA：在线性DNA分子(例如限制性片段)、病毒、质粒和染色体中发现的双链DNA。
[0020]下面是多核苷酸的非限制性实施方案：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。核酸分子也可以包括修饰的核酸分子，诸如甲基化的核苷酸分子和核苷酸分子类似物。嘌呤和嘧啶的类似物是本领域已知的。核酸可以是天然存在的，例如DNA或RNA，或可以是本领域已知的合成类似物。因为在分析条件下具有优异的稳定性，此种类似物可以优选用作探针。在天然结构中进行的修饰，包括在主架、糖或杂环碱基中的变化(alteration)，已经显示出能够增加胞内稳定性和结合亲合性。其中，对主架化学特性进行的有用的变化结果是硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯，其中两个非桥氧(non-bridging oxygens)都用硫取代；氨基磷酸酯(phosphoroamidite)；烷基磷酸三酯和硼磷酸酯(boranophosphate)。手性磷酸酯衍生物包括3′-O′-5′-S-硫代磷酸酯、3′-S-5′-O-硫代磷酸酯、3′-CH2-5′-O-膦酸酯和3′-NH-5′-O-氨基磷酸酯。肽核酸(Peptide nucleic acids)用肽键替换了整个核糖磷酸二酯主架。
[0021]多核苷酸或多肽与其他多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列同一性”，这表明当比对(aligned)时，在将两序列进行比较时，该百分比的碱基或氨基酸是相同的。可以用许多不同的方式，测定序列相似性。为了测定序列同一性，可以用各种方法和计算机软件对序列进行比对，包括BLAST，获自全球网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。参见Altschul et al.(1990)，J Mol.Biol.215：403-10。另一比对方法是FASTA，获自Genetics Computing Group(GCG)软件包，Madison，Wisconsin，USA，Oxford Molecular Group，Inc的全资子公司。其他比对技术描述于Methods in Enzymology，vol.266：Computer Methods for Macromolecular SequenceAnalysis(1996)，ed.Doolittle，Academic Press，Inc.，a division of Harcourt Brace & Co.，San Diego，California，USA中。特别有益的是允许在序列中出现缺口(gaps)的比对程序。Smith-Waterman是在序列比对中允许出现缺口的一类方法。参见Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)。还有，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP程序可以用于比对序列，参见J.Mol.Biol.48：443-453(1970)。
[0022]术语“宿主细胞(host cell)”包括单个细胞或细胞培养物，其可以成为或已经成为本发明的任何重组质粒或分离的多核苷酸的接受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于自然、偶然或人为有意突变和/或变化的缘故，该后代可以不必与原始母细胞完全相同(在形态上或在总DNA互补上)。宿主细胞包括在体内或体外用本发明的重组质粒或多核苷酸转染或感染的宿主细胞。包括本发明的重组载体的宿主细胞是“重组宿主细胞”。
[0023]术语“DNA调节序列(DNA regulatory sequences)”和“调节元件(regulatoryelements)”在本文中可以交换使用，指转录和翻译控制序列，诸如启动子、增强子、多腺苷酸化信号(polyadenylation signals)、终止子、蛋白质降解信号和类似物，它们提供和/或调节宿主细胞内编码序列的表达和/或编码多肽的产生。
[0024]术语“转化(transformation)”与“遗传修饰(genetic modification)”可交换使用，指在引入新的DNA(即，相对于细胞为外源的DNA)后在细胞内诱发的永久性的或瞬时的遗传变化。或者通过将新的DNA掺入宿主细胞基因组，或者通过作为附加体元件(episomal element)瞬时地或稳定地维持新的DNA，可以实现遗传变化(“修饰”)。当细胞是哺乳动物细胞时，通常通过将DNA引入细胞基因组中实现永久遗传变化。
[0025]“可操作性连接(Operably linked)”指一种并列关系(juxtaposition)，其中，由此被描述的组分处于它们可以以它们的预期方式发挥功能的关系中。例如，如果启动子影响编码序列转录或表达，那么就可以说启动子可操作性地连接到编码序列上。
[0026]“构建物(construct)”指重组核酸，通常为重组DNA，它们为了表达特定核苷酸序列的目的而产生，或者是用于构建其他重组核苷酸序列。
[0027]术语“特异性结合(binds specifically)”在用于涉及抗体结合的内容时是指，抗体与特定的多肽具有高亲合力和/或高亲合性结合，这里，抗体与特定的多肽结合也就是，抗体与多肽例如合成的CXCR3配体(例如杂合CXCR3配体或共有CXCR3配体)的表位结合。例如，抗体与特定的合成CXCR3配体多肽或其片段上的表位的结合强于与任何其他表位——特别是那些存在于与同一样品相关的或在同一样品中的分子中的任何其他表位——的结合，例如，感兴趣的特定多肽与特定的合成CXCR3配体(例如杂合CXCR3配体或共有CXCR3配体)的结合强于与不同的别的合成CXCR3配体(例如杂合CXCR3配体或共有CXCR3配体)表位的结合，这样，通过调节结合条件，抗体几乎排他性地结合到特定的合成CXCR3配体(例如杂合CXCR3配体或共有CXCR3配体)的表位上，而不结合到任何其他合成CXCR3配体(例如杂合CXCR3配体或共有CXCR3)的表位上，也不结合到任何其他不包括该表位的合成CXCR3配体(例如杂合CXCR3配体或共有CXCR3)多肽(或片段)或任何其他多肽。特异性结合到多肽的抗体可以能够以弱的但可检测的水平结合其他多肽(例如，与感兴趣多肽的结合水平的10％或少于10％)。此种弱结合或背景结合(background binding)例如通过使用合适的对照，可以容易地与结合目标多肽的特异性抗体分辨开来。一般地，特异性抗体以10-7M或更大，例如10-8M或更大(例如10-9M、10-10M、10-11M等)的结合亲合性结合给定的多肽。一般地，结合亲合性为10-6M或更小的抗体不可用，这是因为它不能以用现在使用的常规方法可检测的水平结合抗原。
[0028]如本文中所使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和类似术语，指获得期望的药理学和/或生理学效果。效果可以是预防性的，完全或部分地预防疾病或疾病的症状，和/或效果可以是治疗性的，部分或完全地治疗疾病和/或疾病引起的不利结果。如本文中所使用地，“治疗”覆盖了对哺乳动物特别是人类疾病的任何治疗，包括：(a)增加存活时间；(b)减少因疾病引起的死亡的危险性；(c)预防某对象患某种疾病，所述对象可能患这种疾病但还没有诊断出患有该疾病；(d)抑制疾病，即阻止疾病发展(例如减少疾病发展的速度)；和(e)缓解疾病，例如引起疾病衰退(regression of the disease)。
[0029]术语“个体(individual)”、“宿主(host)”、“患者(patient)”和“对象(subject)”在本文中可以交换使用，指哺乳动物，例如人。
[0030]术语“治疗上有效数量(therapeutically effective amount)”指有效地帮助获得期望的治疗效果的治疗剂数量或治疗剂传送速度。依据待治疗的病状、待给药的制剂、以及本领域普通技术人员知道的各种其他因素，精确的期望治疗效果将有所变化。
[0031]术语“纤维变性状况(fibrotic condition)”、“纤维变性疾病(fibrotic disease)”和“纤维变性症状(fibrotic disorder)”在本文中交换使用，指通过给予含有抗纤维变性的活性的化合物可以治疗的状况、疾病或症状。纤维变性症状包括但不限于肺纤维化-包括特发性肺纤维化(IPF)和由已知病因引起的肺纤维化、肝纤维化和肾纤维化。其他示范性纤维变性状况包括肌肉骨骼纤维化、心脏纤维化、术后粘着(post-surgical adhesions)、硬皮病、青光眼和皮肤损害诸如瘢痕疙瘩。
[0032]术语“癌症(cancer)”、“瘤(neoplasm)”和“肿瘤(tumor)”本文中可以交换使用，指这样的细胞，它们显示出相对自发生长(autonomous growth)的特性，这样便展示出异常的生长表现型，特征为严重失去对细胞增殖的控制。癌细胞可以是良性的或恶性的。
[0033]如本文中所使用的术语“给药活动(dosing event)”指投药给需要的患者抗病毒剂，该活动可以包括抗病毒剂从药物分配装置(drug dispensing device)中一下子或多次释放出来。因此，术语“给药活动”包括但不限于：安装使用连续传送装置(continuous delivery device)(例如泵或其他受控释放注射系统(controlled releaseinjectable system))；以及单次皮下注射(single subcutaneous injection)，然后安装使用连续传递装置。
[0034]“规范的(Patterned)”或“时期性的(temporal)”在应用于涉及药物传递的内容时是指一种药物传递模式，一般是以基本上规则的模式在预先选定的时间期间(例如，除了与例如弹丸注射相关的一段时间之外的时间期间)内传递药物。“规范的”或“时期性的”药物传递旨在包括以不断增加的、不断减少的、基本上恒定的或脉冲式的速率(例如每单位时间的药物数量，或每单位时间的药物制剂体积)或速率范围传递药物，还包括连续的或基本上连续的或长期的药物传递。
[0035]术语“受控药物传递装置(controlled drug delivery device)”旨在包括任何装置，其中包含在该装置中的药物或其他期望的物质的释放(例如释放的速率、定时)受到装置本身的控制或测定，并且基本上不受使用环境的影响，或者在使用环境中可以以可重现的速率释放。
[0036]本文中使用的“基本上连续的(substantially continuous)”，例如在“基本上连续的灌输(substantially continuous infusion)”或“基本上连续的传递(substantiallycontinuous delivery)”中使用的情况，是指在预先选定的药物传送时间期间内，以基本上不间断的方式传递药物，其中患者在预选时间期间的任何8小时时间段内，患者接受的药物数量绝不降到零。此外，“基本上连续的”药物传递也可以包括以基本上恒定的、预选的速度(例如每单位时间的药物数量或每单位时间的药物制剂的体积)或速度范围来传递药物，该过程在预选的药物传递时间期间内基本上不间断。
[0037]“特定的吡非尼酮类似物(specific pirfenidone analog)”和其所有语法学上的变体，是指并限于表1中示出的所有的每个吡非尼酮类似物。
[0038]术语“化学治疗剂(chemotherapeutic agent)”或“化学治疗的(chemotherapeutic)”(或“化学治疗(chemotherapy)”，用化学治疗剂进行治疗的情况)，包括用于癌症治疗的任何非蛋白质类(non-proteinaceous)(即非肽类)化学化合物。化学治疗剂的例子包括烷化剂，诸如三胺硫磷和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺和methylamelamines，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；聚乙酸(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)；喜树碱(包括合成类似物拓朴替康)；草苔虫素；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；隐藻素(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；dolastatin；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI)；软珊瑚醇；pancratistatin；sarcodictyin；海绵素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、ifosfamide、双氯乙基甲胺、氢氧化双氯乙基甲胺、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、佛莫司汀(foremustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔类抗生素(例如卡奇霉素，特别是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素phiI1，例如参见Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐，诸如氯膦酸盐；针棘霉素；以及新制癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、争光霉素、cactinomycin、carabicin、卡柔比星、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、亚德利亚霉素(AdramycinTM)(包括吗啉基-亚德利亚霉素、氰基吗啉基-亚德利亚霉素、2-吡咯啉基-亚德利亚霉素和脱氧亚德利亚霉素)、表阿霉素、依索比星、盐酸去甲柔红霉素、麻西罗霉素，丝裂霉素，诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、quelamycin、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如demopterin、氨甲蝶呤、蝶并蝶呤、三甲氧蝶呤；嘌呤类似物，诸如阿糖氟腺嘌呤、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟苷；雄性激素，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药(anti-adrenals)，诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸replinisher诸如frolinic acid；醋葡醛内酯；醋磷酰胺糖苷；氨基月桂酸；eniluracil；安吖啶；百垂布昔；比生群；伊达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；埃坡霉素；托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类化合物，诸如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝丫啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙肼(2-ethylhydrazide)；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(特别是T-2毒素、疣孢霉素A、漆斑菌素A和蛇形菌素)；氨基甲酸酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(″Ara-C″)；环磷酰胺；thiopeta；taxoids，例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol Meyers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多烯紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(GemzarTM)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和碳铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；ifosfamide；mitroxantrone；vancristine；长春瑞宾(NavelbineTM)；novantrone；替尼泊苷；伊达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；xeoloda；ibandronate；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素，诸如视黄酸；卡培他滨；和上述任何物质治疗上可接受的盐、酸或衍生物。也包括在“治疗剂”的定义中的是抗激素药，其用作调节或抑制激素对肿瘤的作用，诸如抗雌性激素剂和选择性雌性激素受体调节物(SERMs)，例如包括他莫昔芬(包括NolvadexTM)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(FarestonTM)；调节雌性激素在肾上腺中的产生的芳香化酶的抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(MegaceTM)、依西美坦、福美司坦、法倔唑、伏氯唑(RivisorTM)、来曲唑(FemaraTM)和 阿那曲唑(anastrozole)(ArimidexTM)；和抗雄性激素剂，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任何物质治疗上可接受的盐、酸或衍生物。
[0039]术语“抗肿瘤(antineoplastic)”剂、药物或化合物旨在指任何试剂，包括任何化学治疗剂、生物应答调节物(biological response modifier)(非限制性地包括(i)蛋白质类物质即肽分子，其能够产生或改变生物应答，和(ii)非蛋白质类物质即非肽分子，其能够产生或改变生物应答)、细胞毒性剂或细胞生长抑制剂，它们减少肿瘤细胞的增殖。
[0040]术语“生物应答调节物(biological response modifier)”指任何的蛋白质类(即，肽)分子或任何非蛋白质类(即，非肽)分子，其能够产生或改变与癌症治疗相关的生物应答。生物应答调节物的例子包括与肿瘤相关的抗原的拮抗剂，诸如抗肿瘤抗原抗体；能够诱导细胞增殖的细胞受体的拮抗剂；能够诱导细胞凋亡的细胞受体的激动剂，诸如Apo-2配体，I型干扰素受体激动剂，诸如干扰素-α分子和干扰素-β分子；II型干扰素受体激动剂，诸如干扰素-γ分子；III型干扰素受体激动剂，诸如IL-28A、IL-28B和IL-29；炎症细胞因子的拮抗剂，包括肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂，诸如抗TNF抗体(例如REMICADETM抗TNF单克隆抗体)和可溶性TNF受体(例如ENBRELTMTNF受体-Ig免疫粘附素)，生长因子细胞因子(growth factorcytokines)，诸如造血细胞因子，包括促红细胞生成素，诸如EPOGENTM阿法依泊汀，粒细胞集落刺激因子(G-CSFs)，诸如NEUPOGENTM重组人粒细胞集落形成刺激因子(filgrastim)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSFs)，和血小板生成素，淋巴细胞生长因子细胞因子(lymphocyte growth factor cytokines)，诸如白介素-2，和生长因子细胞因子的拮抗剂，包括血管生成因子的拮抗剂，例如血管内皮细胞生长因子(VEGF)拮抗剂，诸如AVASTINTMbevacizumab(抗-VEGF单克隆抗体)。
[0041]如本文中所使用的，术语“I型干扰素受体激动剂”指任何天然存在的或非天然存在的人I型干扰素受体配体，其结合受体并引起信号转导。I型干扰素受体激动剂包括干扰素，包括天然存在的干扰素、修饰的干扰素、合成的干扰素、加聚乙二醇的干扰素(pegylated interferon)、包含干扰素和异源蛋白的融合蛋白、重排(shuffled)干扰素；对干扰素受体具有特异性的抗体；非肽化学激动剂；和类似物。
[0042]如本文中所使用的，术语“II型干扰素受体激动剂”指任何天然存在的或非天然存在的人II型干扰素受体配体，其结合受体并引起信号转导。II型干扰素受体激动剂包括干扰素，包括天然存在的干扰素、修饰的干扰素、合成的干扰素、加聚乙二醇的干扰素、包含干扰素和异源蛋白的融合蛋白、重排干扰素；对干扰素受体具有特异性的抗体；非肽化学激动剂；和类似物。
[0043]如本文中所使用的，术语“III型干扰素受体激动剂”指任何天然存在的或非天然存在的人IL-28受体α(“IL-28R”)配体，其氨基酸序列由下文中的Sheppard等描述，其结合到受体并引起信号转导。
[0044]在本发明作进一步描述之前，应该理解的是，本发明不限于被描述的特定实施方案，因此当然可以进行变化。也应该理解，本文中使用的术语只是用于描述特定实施方案的目的，不是限制性的，因此本发明的范围将仅仅由权利要求来限定。
[0045]当提供数值范围时，应该理解每个间插值(intervening value)——在该范围的上限和下限之间按下限的十分之一单位进行间插的值，除非上下文另外清楚地规定；以及在上述设定的范围内任何其他指明的值或间插的值——都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，除了在所述的设定范围内特意排除的边界值。当设定的范围包括一个或两个边界值(limits)时，排除了所述边界值中的一个或者两个的范围也包括在本发明中。
[0046]除非另外定义，所有本文中使用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员所理解的相同的意思。尽管与本文中描述的相似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实施或测试，但现在描述的是优选的方法和材料。所有本文中描述的公开文献通过引用方式并入本文，以便联系这些被引用的公开文献中的内容来公开和描述方法和/或材料。
[0047]必须指出的是，本文中以及权利要求书用到的单数形式的“一(a)”、和“一(and)”、“定冠词(the)”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地规定。因此，例如“一个合成CXCR3配体(a synthetic CXCR3 ligand)”包括多个这样的配体，“制剂(the formulation)”包括一种或多种制剂和其在本领域已知的等同物，诸如此类。
[0048]本文中讨论到的公开出版物仅仅是提供了在本申请提交日之前的公开内容。本文从未因此将其解释为：承认本申请无权作为在先发明获得比这些公开物更早的地位。还有，给出的公开日可能与实际的公开日不同，其可能需要单独进行确认。
发明详述
[0049]本发明提供了合成的CXCR3多肽配体，例如杂合CXCR3多肽配体和共有CXCR3多肽配体，以及包括合成的CXCR3多肽配体的组合物和制剂。目标合成CXCR3配体用于治疗各种病症，参看下面的讨论。
合成的CXCR3配体
[0050]本发明提供了合成CXCR3多肽配体。在一些实施方案中，合成CXCR3配体是共有CXCR3配体。在其他实施方案中，合成CXCR3配体是杂合CXCR3配体。因此，如本文中所使用的，术语“合成CXCR3配体”包括“共有CXCR3配体”和“杂合CXCR3配体”。本发明还提供了包括目标合成CXCR3配体(subjectsynthetic CXCR3 ligand)的组合物，包括药物组合物。目标合成CXCR3配体可用于治疗各种病症，如本文中所述；可用于实验应用，参见下面更充分的描述。
[0051]目标合成CXCR3配体——包括共有CXCR3配体和杂合CXCR3配体——长度为约70个氨基酸至约125个氨基酸，例如约70个氨基酸至约73个氨基酸、约73个氨基酸至约75个氨基酸、约75个氨基酸至约77个氨基酸、约77个氨基酸至约80个氨基酸、约80个氨基酸至约90个氨基酸、约90个氨基酸至约100个氨基酸、约100个氨基酸至约102个氨基酸、约102个氨基酸至约105个氨基酸、约105个氨基酸至约110个氨基酸、约110个氨基酸至约115个氨基酸、约115个氨基酸至约120个氨基酸、或约120个氨基酸至约125个氨基酸。在一些实施方案中，例如当目标CXCR3配体是融合蛋白时，目标合成CXCR3配体包括125个以上的氨基酸。
[0052]在一些实施方案中，目标合成CXCR3配体包括信号序列。在其他实施方案中，目标合成CXCR3配体缺少信号序列。
[0053]目标合成CXCR3配体——包括共有CXCR3配体和杂合CXCR3配体——结合细胞表面上的CXCR3受体。通常，目标合成CXCR3配体是CXCR3激动剂。在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体具有下述活性中的一种或多种：抗增殖活性、抗细菌活性、抗血管生成活性和抗纤维变性活性。目标合成CXCR3配体是否发挥CXCR3激动剂的功能，容易用已知的分析方法测定。例如，CXCR3激动剂活性的分析测定方法论述于美国专利6,184,358和美国专利6,491,906中。
杂合CXCR3配体
[0054]本发明提供了杂合CXCR3配体，所述杂合CXCR3配体包括由约70至约125个氨基酸组成的多肽，其可任选地(optionally)具有附着到N末端的通常第一个氨基酸(ordinarily first amino acid)上的额外的甲硫氨酸，该多肽的氨基酸序列顺次地(in sequence)包括分立的(discrete)子序列(sub-sequences)，这些子序列在氨基酸组成(identity)和氨基酸数目上对应于不同的、天然存在的CXCR3配体(例如IP-10、I-TAC和Mig)的子序列，其中该杂合CXCR3多肽的氨基酸序列不同于天然存在的CXCR3配体(例如IP-10、I-TAC和Mig)的氨基酸序列。
[0055]目标杂合CXCR3配体包括二、三、四、五、六、七、八、九或十或更多个分立的子序列，所述子序列在氨基酸组成和数目上对应于不同的、天然存在的CXCR3配体(例如IP-10、I-TAC和Mig)的子序列。在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体包括二、三、四、五、六、七、八、九或十或更多个分立的子序列，所述子序列在氨基酸组成和数目上对应于天然存在的IP-10、TAC和Mig的子序列。分立的子序列是天然存在的CXCR3配体的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约75至约80个、约80至约85个，或约85至约90个连续氨基酸。在一些实施方案中，分立的子序列选自图2中描述的氨基酸序列。
[0056]在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体从N末端至C末端依次包括第一CXCR3结合趋化因子(a first CXCR-3 binding chemokine)的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约75至约80个、约80至约85个、或约85至约90个连续氨基酸，其中第一CXCR3结合趋化因子选自天然存在的IP-10、I-TAC和Mig；和第二CXCR3结合趋化因子的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约75至约80个、约80至约85个，或约85至约90个连续氨基酸，其中第二CXCR3结合趋化因子选自天然存在的IP-10、I-TAC和Mig，其中第一和第二趋化因子是不同的。
[0057]在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体还包括第三CXCR3结合趋化因子的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约75至约80个、约80至约85个或约85至约90个连续氨基酸，第三CXCR3结合趋化因子选自天然存在的IP-10、I-TAC和Mig，其中第三趋化因子和第二趋化因子是不同的，在一些实施方案中，第三趋化因子与第一和二趋化因子都是不同的。
[0058]在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体还包括第四CXCR3结合趋化因子的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约75至约80个、约80至约85个或约85至约90个连续氨基酸，第四CXCR3结合趋化因子选自天然存在的IP-10、I-TAC和Mig，其中第四趋化因子和第三趋化因子是不同的。
[0059]在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体还包括第五CXCR3结合趋化因子的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约75至约80个、约80至约85个或约85至约90个连续氨基酸，第五CXCR3结合趋化因子选自天然存在的IP-10、I-TAC和Mig，其中第五趋化因子和第四趋化因子是不同的。
[0060]下述是非限制性的实例。
[0061]实施例1.在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体从N末端至C末端依次包括IP-10的约2至约70个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、或约65至约70个连续氨基酸；和I-TAC的约2至约70个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个或约65至约70个连续氨基酸。
[0062]实施例2.在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体从N末端至C末端依次包括I-TAC的约2至约70个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、或约65至约70个连续氨基酸；和IP-10的约2至约70个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个或约65至约70个连续氨基酸。
[0063]实施例3.在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体从N末端至C末端依次包括IP-10的约2至约70个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个或约65至约70个连续氨基酸；和Mig的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约70至约75个、约75至约80个或约80至约90个连续氨基酸。
[0064]实施例4.在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体从N末端至C末端依次包括Mig的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约70至约75个、约75至约80个或约80至约90个连续氨基酸；和IP-10的约2至约70个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个或约65至约70个连续氨基酸。
[0065]实施例5.在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体从N末端至C末端依次包括Mig的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约70至约75个、约75至约80个、或约80至约90个连续氨基酸；和I-TAC的约2至约70个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个或约65至约70个连续氨基酸。
[0066]实施例6.在一些实施方案中，目标杂合CXCR3配体从N末端至C末端依次包括I-TAC的约2至约70个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60、约60至约65、或约65至约70个连续氨基酸；和Mig的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约70至约75个、约75至约80个、或约80至约90个连续氨基酸。
[0067]在一些实施方案中，实施例1-6中的其中一个实施例的多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0068]在一些实施方案中，实施例1-6中的其中一个实施例的多肽在N末端或在C末端还进一步包括I-TAC或IP-10的约2至约70个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、或约65至约70个连续氨基酸；或Mig的约2至约90个连续氨基酸，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个、约35至约40个、约40至约45个、约45至约50个、约50至约55个、约55至约60个、约60至约65个、约65至约70个、约70至约75个、约75至约80个、或约80至约90个连续氨基酸。在这些实施方案中的一些实施方案中，多肽还进一步包括额外的N-末端甲硫氨酸。
[0069]下述杂合CXCR3配体的实施例仅仅提供用于示范作用，而不是限制性的。
[0070]在一种示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括IP-10的氨基酸1-25；I-TAC的氨基酸36-73；在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0071]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括I-TAC的氨基酸1-35；IP-10的氨基酸36-77。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0072]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括IP-10的氨基酸1-35；Mig的氨基酸36-102。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0073]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括Mig的氨基酸1-35；IP-10的氨基酸36-77。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0074]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括I-TAC的氨基酸1-35；和Mig的氨基酸36-102。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0075]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括Mig的氨基酸1-35；和I-TAC的氨基酸36-73。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0076]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括IP-10的氨基酸1-20；I-TAC的氨基酸21-60；和Mig的氨基酸61-102。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0077]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括I-TAC的氨基酸1-20；IP-10的氨基酸21-60；和Mig的氨基酸61-102。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0078]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括IP-10的氨基酸1-20；Mig的氨基酸21-60；和I-TAC的氨基酸61-73。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0079]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括Mig的氨基酸1-20；IP-10的氨基酸21-60；和I-TAC的氨基酸61-73。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0080]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括Mig的氨基酸1-20；I-TAC的氨基酸21-60；和IP-10的氨基酸61-77。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0081]在另一示范性实施方案中，杂合CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括I-TAC的氨基酸1-20；Mig的氨基酸21-60；IP-10的氨基酸61-77。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0082]在特定实施方案中，目标杂合CXCR3配体包括在图3中示出的、描述于SEQ ID NO：15中的氨基酸序列。在该实施方案中，目标CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括MIG的氨基酸1-20；iTAC的氨基酸21-38；IP10的氨基酸39-59；MIG的氨基酸61-79；iTAC的氨基酸80-88；和IP10的氨基酸89-98。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0083]在另一特定实施方案中，目标杂合CXCR3配体包括在图4中示出的、描述于SEQ ID NO：16中的氨基酸序列。在该实施方案中，目标CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括IP10的氨基酸1-30；iTAC的氨基酸32-61；MIG的氨基酸63-125。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0084]在另一特定实施方案中，目标杂合CXCR3配体包括在图5中示出的、描述于SEQ ID NO：17中的氨基酸序列。在该实施方案中，目标CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括IP10的氨基酸1-14；iTAC的氨基酸15-79；MIG的氨基酸80-125。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0085]在另一特定实施方案中，目标杂合CXCR3配体包括在图6中示出的、描述于SEQ ID NO：18中的氨基酸序列。在该实施方案中，目标CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括IP10的氨基酸1-38；iTAC的氨基酸39-88；和MIG的氨基酸90-125。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0086]在另一特定实施方案中，目标杂合CXCR3配体包括在图7中示出的、描述于SEQ ID NO：19中的氨基酸序列。在该实施方案中，目标CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括IP10的氨基酸1-21；iTAC的氨基酸22-30；MIG的氨基酸32-49；IP10的氨基酸49-59；iTAC的氨基酸60-88；MIG的氨基酸90-125。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
[0087]在另一特定实施方案中，目标杂合CXCR3配体包括在图8中示出的、描述于SEQ ID NO：20中的氨基酸序列。在该实施方案中，目标CXCR3配体从N-末端至C-末端依次包括iTAC的氨基酸1-18；IP10的氨基酸19-38；MIG的氨基酸40-60；IP10的氨基酸60-80；iTAC的氨基酸81-88；IP10的氨基酸89-98。在一些实施方案中，该多肽还包括额外的N-末端甲硫氨酸残基。
共有CXCR3配体
[0088]本发明提供了共有(consensus)CXCR3配体多肽，以及包括所述多肽的组合物。如本文中所使用的，术语“共有CXCR3配体”指非天然存在的多肽，该多肽通常长度为约70个氨基酸至约125个氨基酸，其可任选地在N末端的通常第一个氨基酸上附着有额外的甲硫氨酸，该多肽支配性地包括了IP-10、Mig和I-TAC共有(common)的那些氨基酸残基，而在没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸出现的位置中的一个或多个位置上，则包括了在那个位置主要出现的(predominantlyoccurs)氨基酸，绝不包括在至少一个天然存在的IP-10、Mig或I-TAC氨基酸序列中的那个位置上不存在的任何氨基酸残基。
[0089]在一些实施方案中，共有CXCR3配体主要包括了IP-10、Mig和I-TAC共有的那些氨基酸残基，并且在没有IP-10、Mig和I-TAC所共有的氨基酸、但有IP-10、Mig和I-TAC中的两个所共有的氨基酸的一个或多个位置上，包括了IP-10、Mig和I-TAC中的两个所共有的氨基酸残基。
[0090]在一些实施方案中，目标共有CXCR3配体主要包括了IP-10、Mig和I-TAC中共有的那些氨基酸残基，并且在没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸残基的一个或多个位置上，包括了在IP-10中的那个位置上发现的残基，这样的位置为2至30个连续位置，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约18个、约18至约20个、约20至约22个、约22至约25个、约25至约27个、或约27至约30个连续位置，在这些连续位置上没有IP-10、Mig和I-TAC共有的氨基酸残基。
[0091]在一些实施方案中，目标共有CXCR3配体主要包括了IP-10、Mig和I-TAC中共有的那些氨基酸残基，并且在没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸残基的一个或多个位置上，包括了在I-TAC中的那个位置上发现的残基，这样的位置为2至30个连续位置，例如约2至约5、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15约18个、约18至约20个、约20至约22个、约22至约25个、约25至约27个、或约27至约30个连续位置，在这些连续位置上没有IP-10、Mig和I-TAC中共有的氨基酸残基。
[0092]在一些实施方案中，目标共有CXCR3配体主要包括了IP-10、Mig和I-TAC中共有的那些氨基酸残基，并且在没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的一个或多个位置上，包括了在Mig中的那个位置发现的残基，这样的位置为2至30个连续位置，例如约2至约5个、约5至约7个、约7至约10个、约10至约15个、约15至约18、约18至约20个、约20至约22个、约22至约25个、约25至约27个、或约27至约30个连续位置，在这些连续位置上没有IP-10、Mig和I-TAC中共有的氨基酸残基。
[0093]在一些实施方案中，共有CXCR3配体主要包括了IP-10、Mig和I-TAC中共有的那些氨基酸残基，并且在没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的一个或多个位置上，包括了在IP-10出现的氨基酸。在这些实施方案中的一些实施方案中，对于没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的位置处的每一个残基，将IP-10中发现的残基用于共有序列中。对于没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的位置处的每一个残基，IP-10中发现的残基被用于共有序列中时，该蛋白质被称为“共有序列1(consensus 1)”。在一些实施方案中，共有序列1多肽包括在图1中示出的氨基酸序列，其被命名为“IP-10共有序列”(SEQ ID NO：01)。
[0094]在一些实施方案中，共有CXCR3配体主要包括了IP-10、Mig和I-TAC中共有的那些氨基酸残基，并且在没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的一个或多个位置上，包括了在I-TAC出现的氨基酸。在这些实施方案中的一些实施方案中，对于没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的位置上的每一个残基，I-TAC中发现的残基被用于共有序列中。对于没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的位置上的每一个残基，I-TAC中发现的残基被用于共有序列中时，该蛋白质被称为“共有序列2(consensus 2)”。在一些实施方案中，共有序列2多肽包括在图1中示出的氨基酸序列，其被命名为“I-TAC共有序列”(SEQ ID NO：02)。
[0095]在一些实施方案中，共有CXCR3配体主要包括了IP-10、Mig和I-TAC中共有的那些氨基酸残基，并且在没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的一个或多个位置上，包括了在Mig出现的氨基酸。在这些实施方案中的一些实施方案中，对于没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的位置处的每一个残基，Mig中发现的残基被用于共有序列中。在这些实施方案中，当有缺口存在于“多数”序列中时，Mig中发现的氨基酸被使用。对于没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的位置处的每一个残基，Mig中发现的残基被用于共有序列中时，该蛋白质称为“共有序列3(consensus 3)”。在一些实施方案中，共有序列3多肽包括在图1中示出的氨基酸序列，其被命名为“Mig共有序列”(SEQ ID NO：03)。
[0096]人IP-10的氨基酸序列参见GenBank登记号P02778、NP_001556和1312356A。GenBank登记号P02778、NP_001556和1312356A的序列的氨基酸1-21是信号序列，成熟IP-10是氨基酸22-98。
[0097]人Mig的氨基酸序列参见GenBank登记号NP_002407和Q07325。GenBank登记号为NP_002407和Q07325的序列的氨基酸1-22是信号序列，成熟Mig是氨基酸23-125。
[0098]人I-TAC的氨基酸序列参见GenBank登记号Q14625和AAD38867。氨基酸1-21是信号序列，成熟I-TAC是氨基酸22-94。
[0099]在特定的实施方案中，目标共有CXCR3配体具有图1中描述的氨基酸序列的其中一个。
修饰
[00100]在一些实施方案中，目标合成CXCR3配体(例如杂合CXCR3配体；共有CXCR3配体)包括一种或多种修饰。可以改变或不必改变一级氨基酸序列的感兴趣的修饰包括：对多肽进行的化学衍生化作用，例如乙酰化作用或羧化作用；引入或除去糖基化位点的氨基酸序列变化；使得蛋白质容易进行PEG化(加入聚乙二醇部分)的氨基酸序列变化；和类似修饰。在一种实施方案中，本发明考虑使用具有一个或多个非天然存在的糖基化和/或聚乙二醇化位点的合成CXCR3配体变体，这样的糖基化和/或聚乙二醇化位点由工程化改造而得到，从而可以提供具有降低的血清清除作用的糖基衍生和/或PEG衍生多肽。因此，本发明包括PEG化的合成CXCR3配体。也包括了糖基化作用的修饰，例如在多肽的合成和加工或进一步的加工步骤中，通过修改多肽的糖基化型式(patterns)进行的糖基化修饰；例如通过将多肽暴露于影响糖基化的酶诸如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶而进行的糖基化修饰。也包括了具有磷酸化的氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的序列。在一些实施方案中，例如，当用于产生目标合成CXCR3配体的宿主细胞是细菌宿主细胞时，合成的CXCR3配体被修饰以包括N-末端甲硫氨酸。
[00101]在一些实施方案中，目标合成CXCR3配体多肽是融合蛋白，该融合蛋白包含合成CXCR3配体多肽和异源多肽(例如融合伴侣(fusion partner))。合适的融合伴侣包括这样的肽和多肽，该肽或多肽赋予了增强的体内稳定性(例如增加的血清半衰期)；使得容易纯化，例如(His)n，例如6His和类似情况；使得能从细胞分泌出该融合蛋白；提供表位标记，例如GST、红细胞凝集素(HA；例如CYPYDVPDYA；SEQ ID NO：4)、FLAG(例如DYKDDDDK；SEQ ID NO：5)、c-myc(例如CEQKLISEEDL；SEQ ID NO：6)和类似物；提供可检测的信号，例如产生可检测的产物的酶(例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶)，或本身可检测的蛋白质，例如绿色荧光蛋白等；使得能进行多聚化作用，例如多聚化结构域诸如免疫球蛋白的Fc部分；和类似情况。
[00102]融合蛋白可以包括利于将融合蛋白从细胞中分泌出去的氨基酸序列。本领域技术人员知道此种分泌信号序列。适用于细菌的分泌信号包括但不限于：大肠杆菌(E.coli)、粘质沙雷氏菌(S.marcescens)、E.amylosora、摩氏摩根菌(M.morganii)和奇异变形杆菌(P.mirabilis)的Braun′s脂蛋白的分泌信号；大肠杆菌和沙门氏菌的TraT蛋白的分泌信号；地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和腊状芽孢杆菌(B.cereus)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的青霉素酶(PenP)蛋白质的分泌信号；肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和产气克雷伯菌(Klebsiella aerogenese)的支链淀粉酶蛋白质的分泌信号；大肠杆菌脂蛋白lpp-28、Pal、RplA、RplB、OsmB、NIpB和Orl17的分泌信号；V.harseyi的几丁二糖酶蛋白质的分泌信号；青枯假单胞细菌(Pseudomonas solanacearum)的β-1，4-内切葡聚糖酶蛋白质的分泌信号；流感嗜血杆菌(H.influenzae)的Pal和Pcp蛋白质的分泌信号；绿脓杆菌(P.aeruginosa)的OprI蛋白质的分泌信号；肺炎链球菌(S.pneumoniae)的MalX和AmiA蛋白质的分泌信号；苍白螺旋体(Treponema pallidum)的34kda抗原和TpmA蛋白质的分泌信号；猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)的P37蛋白质的分泌信号；解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的中性蛋白酶的分泌信号；立氏立克次氏体(Rickettsiarickettsii)的7kda抗原的分泌信号；适用于酵母菌的信号序列是本领域已知的，也可以使用。参见例如美国专利5,712,113。
[00103]在一些实施方案中，目标合成CXCR3配体是包含目标合成CXCR3多肽和融合伴侣的融合多肽，其中，蛋白酶切割位点位于合成CXCR3多肽和融合伴侣之间。
[00104]蛋白水解切割位点对本领域技术人员是已知的；许多是已知的，并已经详细地描述于许多文献中，包括例如 Handbook of Proteolytic Enzymes(1998)AJBarrett，ND Rawlings，and JF Woessner，eds.，Academic Press。蛋白水解切割位点包括但不限于肠激酶切割位点：(Asp)4Lys(SEQ ID NO：07)；Xa因子切割位点：Ile-Glu-Gly-Arg(SEQ ID NO：08)；凝血酶切割位点，例如Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(SEQ ID NO：09)；肾素切割位点，例如His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His(SEQ ID NO：10)；胶原酶切割位点，例如X-Gly-Pro(其中X是任何氨基酸)；胰蛋白酶切割位点，例如Arg-Lys；病毒蛋白酶切割位点，诸如病毒2A或3C蛋白酶切割位点，包括但不限于来自小RNA病毒的蛋白酶2A的切割位点(例如参见Sommergruber et al.(1994)Virol.198：741-745)、肝炎A病毒3C切割位点(参见例如Schultheiss et al.(1995)J.Virol.69：1727-1733)、人鼻病毒2A蛋白酶切割位点(参见例如Wang et al.(1997)Biochem.Biophys.Res.Comm.235：562-566)，和小RNA病毒3蛋白酶切割位点(参加例如Walker et al.(1994)Biotechnol.12：601-605)。
目标合成CXCR3配体的制备
[00105]使用任何已知的方法，可方便地制备目标合成CXCR3配体，方法包括化学合成方法，利用标准的重组技术进行生产的方法和这些方法的组合。例如，使用自动固相叔丁氧羰基和苯甲基保护策略(automated solid-phasetert-butyloxycarbonyl and benzyl protection strategy)，可以合成目标合成CXCR3配体。目标合成CXCR3配体可以用自然的化学连接的方法合成，例如，长度为约15至约40个氨基酸的片段(例如长度为约15至约20个、约20至约25个、约25至约30个、约30至约35个或约35至约40个氨基酸的片段)可以用标准的化学合成方法合成，片段用Dawson，et al.(1994)Science 266：776-779中描述的方法连接。合成的多肽的纯度可以通过反相HPLC和等电聚焦测定。配体的一级结构可以用Edman测序方法确定。
[00106]在许多实施方案中，使用常规的方法，制备包括编码目标合成CXCR3配体的核苷酸序列的表达载体，并引入宿主细胞。表达载体用于在宿主细胞中产生目标合成CXCR3配体。
[00107]因此，本发明提供了产生合成CXCR3配体的方法，该方法包括：在有利于宿主细胞产生合成CXCR3配体的条件下，培养宿主细胞，该宿主细胞包括表达载体，所述表达载体包括编码目标CXCR3配体的核苷酸序列；从培养物(例如从宿主细胞裂解物和/或从培养基)分离合成CXCR3配体。该方法可以用真核细胞或原核细胞来实施。
[00108]取决于表达的目的，依据常规方法，多肽可以在原核生物或真核生物中表达。对于大规模的蛋白质生产，单细胞生物，诸如大肠杆菌、枯草杆菌(B.subtilis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、包含杆状病毒载体的昆虫细胞或高等生物的细胞诸如脊椎动物，特别是哺乳动物，例如COS7细胞、CHO细胞、HEK293细胞和类似细胞可以用作表达宿主细胞。在一些实施方案中，在真核生物细胞中表达基因是有利的，其中蛋白质会受益于自然折叠和翻译后修饰。然后使用亲合层析方法或离子交换/大小排阻层析方法，多肽可以从细胞培养物上清液或从细胞裂解物中分离得到，参见上面所述。
[00109]利用表达宿主可获得大量的蛋白质或其片段，此时蛋白质可以用常规的方法分离和纯化。裂解物可以由表达宿主制备，裂解物用高效液相层析(HPLC)、排阻层析、凝胶电泳、亲合层析或其他纯化技术纯化。
[00110]目标合成CXCR3配体也可以依据常规的重组合成方法进行分离和纯化。裂解物可以由表达宿主制备，裂解物用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲合层析或其他纯化技术纯化。在很大程度上，同与产物制备和纯化方法有关的污染物相比，被应用的组合物按重量计将包括至少20％的期望产物，更常见地，按重量计包括至少约75％的期望产物，优选按重量计包括至少约95％的期望产物，对于治疗目的，通常包括按重量计包括至少约99.5％的期望产物。通常，百分比是基于总蛋白来计算。
[00111]本发明提供包括目标CXCR3配体的组合物。在许多实施方案中，CXCR3配体是纯的，例如至少约90％的纯度(没有非CXCR3的多肽和/或其他大分子)、至少约95％的纯度、至少约98％的纯度、或至少约99％的纯度、或大于99％的纯度。
[00112]除了CXCR3配体，目标CXCR3配体组合物还包括缓冲液、盐、pH调节剂、增溶剂、螯合剂、去污剂、非离子去污剂、蛋白酶抑制剂、佐剂等中的一种或多种物质。
[00113]在一些实施方案中，目标组合物包括目标合成CXCR3配体；和药学上可接受的赋形剂。许多药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，无需在本文中详细论述。药学上可接受的赋形剂在许多公开文献中已经详细描述，包括例如A.Gennaro(2000)″Remington：The Science and Practice of Pharmacy″，20th edition，Lippincott，Williams，& Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(1999)H.C.Ansel et al.，eds 7th ed.，Lippincott，Williams，& Wilkins；和Handbook of Pharmaceutical excipients(2000)A.H.Kibbe et al.，eds.，3rd ed.Amer.Pharmaceutical Assoc.
多核苷酸、载体和宿主细胞
[00114]本发明还提供了包括编码目标合成CXCR3配体的核苷酸序列的多核苷酸、包括目标多核苷酸的载体，和包括目标多核苷酸或载体的宿主细胞。目标多核苷酸可用于产生目标表达载体和遗传修饰了的宿主细胞，宿主细胞对于产生目标配体是有用的。本发明还提供了包括目标多核苷酸的组合物。
[00115]目标发明提供了编码目标合成CXCR3配体的核酸组合物；以及此种核酸的互补物(complement)。核酸组合物指这样的组合物，其包括核酸分子序列，该核酸分子序列具有编码目标发明的合成CXCR3配体的开放阅读框，且该核酸组合物在合适的条件下能够被表达，这样产生合成CXCR3配体。也包括在该术语中的是与编码目标合成CXCR3配体的核酸同源或基本上类似或相同的核酸。
[00116]因此，目标发明提供了包括编码目标合成CXCR3配体的核苷酸序列的核酸，和具有与此种核酸基本上相同的核苷酸序列的核酸(例如同源物)。在许多实施方案中，目标核酸包括编码目标合成CXCR3配体的核苷酸序列，以及这样的核苷酸序列：其与编码目标合成CXCR3配体的核苷酸序列(例如与CXCR3配体编码序列)具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％、或更大百分比的序列同一性的核苷酸序列，或它们的互补序列。
[00117]序列相似性是基于参考序列来计算，参考序列可以是较大序列的子集(subset)，诸如保守模体、编码区域、侧翼区域(flanking region)等。参考序列通常至少约18nt长，更通常为至少约30nt长，并且可以延伸到被比较的整个序列。序列分析的算法是本领域已知的，诸如BLAST，描述于Altschul et al.(1990)，J.Mol.Biol.215：403-10(其使用默认设置(default setting)，即参数w＝4和T＝17)。
[00118]本发明也提供了在严谨型条件(stringent conditions)下，与上述核酸杂交的核酸。严谨型杂交条件的一个例子是在50℃或更高的温度和0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)中进行的杂交。严谨型杂交条件的另一个例子是，在下述溶液中于42℃的温度下温育过夜：50％的甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％的硫酸葡聚糖和20μg/ml变性的已剪切鲑精DNA，然后在约65℃下在0.1×SSC中洗涤滤膜。严谨型杂交条件是至少具有上述典型条件所代表的严谨性的杂交条件。其他严谨型杂交条件是本领域已知的，也可以用于鉴定本发明特定实施方案的核酸。
[00119]如本文中所使用的，术语“严谨型杂交条件(stringent hybridizationcondition)”是指那些通常被本领域技术人员用于在DNA或DNA和RNA的互补片段(complementary pieces)之间，建立至少90％序列序列同一性的杂交条件。在一些实施方案中，本发明的核酸分子能够杂交到核酸分子的CXCR3编码序列上，该序列包括编码如SEQ ID NO：01、02、03、15、16、17、18、19和20中的任一个所述CXCR3配体的核苷酸序列，或这样的核酸序列的编码区域的互补物，杂交在严谨型杂交条件进行，严谨型杂交条件包括：在65℃对含有核酸的滤膜预杂交8小时至过夜，预杂交在包含下述物质的溶液中进行：6×单强度柠檬酸盐(single strength citrate)(SSC)(1×SSC是0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠；pH 7.0)、5×Denhardt溶液、0.05％焦磷酸钠和100μg/ml鲱鱼精DNA；在65℃杂交18-20小时，杂交在含有下述物质的溶液中进行：6×SSC、1×Denhardt溶液、100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸钠；在含有0.2×SSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中，在65℃洗涤滤膜1小时。
[00120]在特定的实施方案中，目标核苷酸包括编码CXCR3配体的核苷酸序列，所述配体包括SEQ ID NO：01、02、03、15、16、17、18、19和20中任一个描述的氨基酸序列；目标核苷酸也包括这样的核酸的互补序列。
[00121]在许多实施方案中，编码本发明的蛋白质和多肽的核酸是DNA，包括cDNA。本文中所使用的术语“合成CXCR3配体核酸(synthetic CXCR3 ligandnucleic acid)”、“杂合CXCR3配体核酸(hybrid CXCR3 ligand nucleic acid)”和“共有CXCR3配体核酸(consensus CXCR3 ligand nucleic acid)”指编码特定目标合成CXCR3蛋白和多肽、杂合CXCR3蛋白和多肽、共有CXCR3蛋白和多肽的开放阅读框，以及邻近的5′和3′非编码核苷酸序列，这些非编码核苷酸序列涉及对表达的调节，它们在例如编码区域外约100bp至最高达约20kb远处，而且可能在两个方向的任一一个方向上。核酸可以被引入合适的载体中，可以保持在染色体外，或整合入宿主基因组中，参见下面更详细的描述。
[00122]目标发明的核酸组合物可以编码目标合成CXCR3配体的整个部分或其中一部分。通过可以采用常规的方法，即限制酶消化、聚合酶链式反应(PCR)扩增等，利用化学合成的寡核苷酸，从DNA序列中获得双链或单链片段。
[00123]目标核酸分子通常通过将分子置于载体中而得以增殖。可以使用病毒或非病毒载体，包括质粒。质粒的选择取决于要在其中进行增殖的细胞类型和增殖的目的。某些载体可以用于扩增和制备大量的期望的DNA序列。
[00124]本发明还提供了重组载体(“构建物(constructs)”)，其包括目标多核苷酸。重组载体包括用于增殖本发明多核苷酸的载体，和表达载体。重组载体可用于增殖目标多核苷酸(克隆载体)。目标重组表达载体可用于实现目标多核苷酸在细胞中的表达，例如用于产生目标合成CXCR3配体。合适载体的选择包括在本发明的技术范围之内。许多这样的载体可以从商业渠道获得。
[00125]表达载体适合于在培养的细胞内进行表达。这些载体通常包括调控序列(“控制序列(control sequence)”或“控制区域(control region)”)，调控序列是表达目标多核苷酸所必需的，调控序列可操作性地连接到目标多核苷酸。还有其他载体是适合于在整个生物或人的细胞中进行转移和表达。
[00126]表达载体通常在启动子序列附近具有操作方便的限制性位点，以插入编码异源蛋白质的核酸序列。也可以存在在表达宿主中有效用的选择性标记。表达载体可以用于产生融合蛋白，此时，外源融合肽可以提供额外的功能，即，增加的蛋白质合成量、稳定性、与特定抗血清的反应性、酶标记物，例如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、辣根过氧化物酶等。
[00127]可以制备表达盒(Expression cassette)，表达盒包括：转录起始区域、启动子区域、目标多核苷酸和转录终止区域。在引入DNA后，含有该构建物的细胞可以用选择性标记进行筛选，对细胞进行扩增，然后用于表达。
[00128]表达盒可以引入到许多种载体中，例如质粒、BAC、HAC、YAC、噬菌体诸如λ、P1、M13等，动物或植物病毒，和类似载体，其中载体通常具有这样的特征，即提供了筛选含有表达载体的细胞的能力。载体可以维持在染色体外，特别是如质粒或病毒，或整合入宿主染色体中。当希望维持在染色体外时，可以提供起始序列以有助于质粒复制，质粒可以是低拷贝数的或高拷贝数的。有许多标记可用于筛选，特别是那些抵抗毒素特别是抗生素进行侵害的标记。所选择的特定标记依据宿主的特性进行选择，其中在一些情况下，补充性(complementation)标记可以用于营养缺陷型宿主。可以用任何传统的方法将DNA构建物引入宿主细胞中，例如接合、细菌转化、钙沉淀DNA(calcium-precipitated DNA)、电穿孔、融合、转染、用病毒载体感染、基因枪(biolistics)等方法。
[00129]本发明还提供遗传修饰了的宿主细胞，其可以是分离的宿主细胞，该宿主细胞包括目标多核苷酸，或在一些实施方案中包括目标表达载体。合适的宿主细胞包括原核生物，诸如大肠杆菌、枯草杆菌，真核生物，包括带有杆状病毒载体的昆虫细胞、酵母细胞诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或高等生物的细胞诸如脊椎动物，包括两栖类动物(例如 光滑爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞)的细胞，以及哺乳动物的细胞，例如COS细胞、CHO细胞、HEK293细胞、MA-10细胞和类似细胞可以用作表达用宿主细胞。宿主细胞可以用于增殖目标多核苷酸的目的，可以用于产生合成CXCR3配体多肽。
抗体组合物
[00130]本发明也提供了特异性结合到目标合成CXCR3配体多肽的抗体。通过用包括目标蛋白质的整个部分或其中一部分的肽免疫宿主动物，获得合适的抗体。合适的宿主动物包括小鼠、大鼠、绵羊、山羊、仓鼠、兔等动物。在许多实施方案中，分离得到目标抗体；在许多实施方案中，纯化目标抗体。
[00131]本发明也提供了包括目标抗体的组合物。除了目标抗体外，目标抗体组合物还包括下述一种或多种物质：缓冲液、盐、pH调节剂、增溶剂、螯合剂、去污剂、非离子去污剂、蛋白酶抑制剂等。
[00132]免疫源(immunogen)可以包括完整蛋白或其片段和衍生物。典型的免疫源包括蛋白质的整个部分或其中一部分，其中这些残基含有在天然目标蛋白中发现的翻译后修饰。免疫源用本领域已知的各种方法产生，例如用常规的重组方法表达克隆的基因，用化学方法合成合成CXCR3配体多肽等方法。
[00133]为了制备多克隆抗体，第一步是用目标蛋白免疫宿主动物，其中目标蛋白优选是基本上纯的形式，包括少于约1％的污染物。免疫源可以包括全目标蛋白，其片段或衍生物。为了增加宿主动物的免疫应答，目标蛋白可以与佐剂混合，其中合适的佐剂包括明矾、葡聚糖、硫酸盐、大聚合阴离子(large polymeric anions)、油和水乳液，例如弗氏佐剂、弗氏完全佐剂和类似物。目标蛋白也可以偶联到合成的载体蛋白或合成的抗原上。可以对各种宿主免疫，以产生多克隆抗体。这样的宿主包括兔，豚鼠，啮齿类动物例如小鼠、大鼠，绵羊，山羊，和类似动物。将目标蛋白给予宿主，通常是皮内给予，在给予最初剂量之后，再给予一次或多次，通常至少两次额外的加强剂量。免疫之后，收集宿主血液，将血清与血细胞分离开来。存在于所得到的抗血清中的Ig可以进一步用已知的方法进行分级分离，方法诸如铵盐分离法(ammonium salt fractionation)、DEAE层析和类似方法。
[00134]单克隆抗体用常规的技术产生。通常，免疫的宿主动物的脾和/或淋巴结提供浆细胞源。通过与骨髓瘤细胞融合，使浆细胞永生化，产生杂交瘤细胞。使用标准技术筛选单个杂交瘤的培养物上清液，以鉴定那些产生具有期望的特异性抗体的杂交瘤。产生针对人蛋白的单克隆抗体的合适动物包括小鼠、大鼠、仓鼠等。为了获得(raise)针对小鼠蛋白的抗体，动物通常是仓鼠、豚鼠、兔等。通过常规技术，抗体可以由杂交瘤细胞上清液或腹水纯化得到，常规技术诸如亲合层析，其使用结合到不溶性支持物如蛋白质A琼脂糖等的蛋白质。
[00135]抗体可以以单链的形式产生，而不是常见的多聚体结构(multimericstructure)。单链抗体描述于Jost et al.(1994)J.Biol.Chem.269：26267-73和其他文献中。将编码重链可变区域和轻链可变区域的DAN序列连接到间隔子(spacer)，该间隔子编码至少约4个氨基酸的小的中性氨基酸，包括甘氨酸和/或丝氨酸。通过这种融合作用编码的蛋白质允许对功能性可变区域进行装配，其保留了原始抗体的特异性和亲合性。
[00136]在某些实施方案中，感兴趣的是人源化抗体。对抗体进行人源化处理的方法是本领域已知的。人源化抗体可以是具有转基因的人免疫球蛋白恒定区基因的动物的产物(参见例如国际专利申请WO 90/10077和WO 90/04036)。可选择地，感兴趣的抗体可以用重组DNA技术工程化，以用相应的人序列取代CH1、CH2、CH3、铰链区和/或构架结构区(参见WO 92/02190)。
[00137]使用Ig cDNA来构建嵌合免疫球蛋白基因是本领域已知的(Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439和(1987)J.Immunol.139：3521)。mRNA是从产生抗体的杂交瘤或其他细胞中分离的，并用于产生cDNA。感兴趣的cDNA可以用特定的引物，通过聚合酶链反应扩增(美国专利4,683,195和4,683,202)。可选择地，制备文库并筛选分离感兴趣的序列。然后，将编码抗体可变区的DNA序列融合到人恒定区序列。人恒定区基因序列可以参见Kabat et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，N.I.H.publication no.91-3242。人C区基因可容易地由已知的克隆获得。同种型(isotype)的选择将在期望的效应物功能，诸如补体结合，或抗体依赖型细胞毒性中的活性的指导下进行。优选的同种型是IgG1、IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定区κ或λ中的其中之一。嵌合的人源化抗体然后通过常规的方法来表达。
[00138]抗体片段，诸如Fv、F(ab′)2和Fab可以通过切割完整的蛋白质制备得到，例如通过蛋白酶进行切割，或通过化学方法进行切割。可选择地，设计截短的基因。例如，编码F(ab′)2片段的一部分的嵌合基因将包括编码H链的CH1区域和铰链区的DNA序列，随后是翻译终止密码子，以产生截短的分子。
[00139]H和LJ区域的共有序列可以用于设计寡核苷酸，寡核苷酸被用作引物，将有用的限制性位点引入J区域，这样便可随后将V区域片段连接到人C区域片段。用定点突变，可以对C区域cDNA进行修饰，以将限制性位点置于人序列的类似位置上。
[00140]表达载体包括质粒、逆转录病毒、YACs、EBV衍生的附加体和类似物。易操作的载体是这样的载体，其编码功能上完整的人CH或CL免疫球蛋白序列，并经工程化处理而具有了合适的限制性位点，这样任何VH或VL序列可以容易地插入进来并表达。在这样的载体中，剪接通常发生在插入的J区域中的剪接供体位点(splice donor site)和人C区域前的剪接受体位点(splice acceptor site)之间，也可发生在人CH外显子内的剪接区域。多聚腺苷酸化和转录终止发生在编码区域下游的天然染色体位点。所得到的嵌合抗体可以连接到任何强启动子，包括逆转录病毒LTRs，例如SV-40早期启动子(Okayama et al.(1983) Mol.Cell.Bio.3：280)、劳氏肉瘤病毒LTR(Gorman et al.(1982) P.N.A.S.79：6777)，和莫洛尼鼠白血病毒LTR(Grosschedl et al.(1985) Cell 41：885)；天然Ig启动子等。
治疗纤维变性病症的方法
[00141]本发明提供了治疗患有纤维变性症状的个体的纤维变性症状的方法。该方法通常包括给予有效数量的目标合成CXCR3配体。本发明提供了纤维变性疾病的治疗，纤维变性疾病包括那些影响到肺的纤维变性疾病，例如特发性肺纤维化、由已知病因引起的肺纤维化、肝纤维化或硬化、心脏和肾纤维化。病因可以是由任何急性或慢性伤害(insult)，包括毒性试剂、代谢试剂、基因试剂和传染试剂引起。
[00142]纤维变性通常的特征是胶原结缔组织(collagenous connective tissue)病理性积累或过量积累。纤维变性病症包括但不限于：胶原性疾病、间质性肺疾病、人纤维变性肺疾病(例如闭塞性细支气管炎、特发性肺纤维化、由已知病因引起的肺纤维化、肺病中的肿瘤基质、侵袭肺的全身性硬化症(systemic sclerosis affectingthe lungs)、赫-普二氏综合症、煤炭工人尘肺病、石棉沉着病、矽肺病、慢性肺动脉高血压、与AIDS相关的肺动脉高血压、肉样瘤病和类似疾病)、纤维变性血管疾病、动脉硬化症、动脉粥样硬化、静脉曲张、冠状动脉梗塞(coronary infarcts)、脑梗塞、心肌纤维化、肌肉骨骼纤维化、术后粘着(post-surgical adhesions)、人类肾脏疾病(例如肾脏综合症、Alport′s综合症、与HIV相关的肾病、多囊性肾病、法布里病、糖尿病性肾病、慢性肾小球肾炎、与系统性狼疮相关的肾炎，和类似疾病)、皮肤瘢痕形成、进行性系统性硬化症(PSS)、原发性硬化性胆管炎(PSC)、肝纤维化、肝硬化、肾纤维化、肺纤维化、囊性纤维化、慢性移植物抗宿主疾病(chronic graft versus host disease)、硬皮病(局部的或全身性的)、格雷夫斯氏眼病、糖尿病性视网膜病、青光眼、佩罗尼氏病、阴茎纤维化、使用膀胱镜检测之后的尿道狭窄、术后内生长(inner accretion)、疤痕形成、骨髓纤维化、特发性腹膜后纤维化、已知病因引起的腹膜纤维化、药物诱发的麦角中毒(ergotism)、因良性或恶性癌症引起的纤维变性、微生物感染(例如病毒、细菌、寄生虫、真菌等)引起的纤维变性、阿耳茨海默病、炎症性肠病(包括在克罗恩病中的狭窄形成和显微结肠炎(microscopic colitis))引起的纤维变性、由化学或环境伤害(insult)(例如癌症化学治疗、杀虫剂、辐射(例如癌症放射治疗)和类似情况)诱发的纤维变性，和类似疾病。
[00143]在一些实施方案中，有效数量的合成CXCR3配体是这样的数量，即当投药给患有纤维变性症状的个体时，相比起治疗之前的个体的纤维变性程度，或相比起没有用合成CXCR3配体进行治疗时个体所经历的纤维变性发展速度，该数量的合成CXCR3配体有效地将纤维变性或纤维变性发展速度减少至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％或更多。
[00144]在一些实施方案中，有效数量的合成CXCR3配体是这样的数量，即当投药给患有纤维变性症状的个体时，相比起治疗之前的个体的器官功能的基本水平，或相比起在没有用合成CXCR3配体进行治疗时个体所经历的器官功能退化速度，该数量的合成CXCR3配体有效地将由纤维变性(例如肺、肝脏、肾脏等)影响到的至少一种器官功能的退化速度增加或减少至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％或更多。
[00145]测定给定器官中的纤维变性程度的方法和测定任何给定器官的功能的方法是本领域已知的。
联合疗法(Combination therapies)
[00146]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，来治疗纤维变性症状。因此，本发明提供了治疗纤维变性症状的方法，通常涉及与第二治疗剂形成的联合疗法中给予目标合成CXCR3配体。合适的第二治疗剂包括但不限于I型干扰素受体激动剂、III型干扰素受体激动剂、II型干扰素受体激动剂、吡非尼酮或吡非尼酮类似物、TNF拮抗剂、TGF-β拮抗剂、内皮缩血管肽受体拮抗剂、应激激活蛋白激酶抑制剂等。
[00147]在其他实施方案中，本发明提供了治疗纤维变性症状的方法，包括给予目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的协同联合物(synergistic combination)。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的“协同联合物”是这样的联合剂量(combined dosage)，其在纤维变性症状的治疗性或预防性治疗中，相比起由仅仅简单的累加性联合(additive combination)所能预测或期望的治疗结果中的增量改善，更加有效，累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当第二治疗剂作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
[00148]在一些实施方案中，本发明提供了方法，涉及给予目标合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定的吡非尼酮类似物的“协同联合物”是这样的联合剂量(combined dosage)，其在纤维变性症状的治疗性或预防性治疗中，相比起由只是累加性联合(additive combination)所能预测或期望的治疗结果中的增量改善，更加有效，其中累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
治疗特发性肺纤维化的方法
[00149]本发明提供了治疗特发性肺纤维化(IPF)的方法。该方法通常包括给予患有IPF的个体有效数量的目标合成CXCR3配体。
[00150]在一些实施方案中，通过在对肺组织进行的组织病理学评价中发现普通型间质性肺炎(UIP)，IPF的诊断得到确认，肺组织通过手术活体组织检查获得。IPF的诊断标准是已知的。参见Ryu et al.(1998)Mayo Clin.Proc.73：1085-1101。
[00151]在其他实施方案中，IPF的诊断是由高分辨率计算机射线断层摄影术(highresolution computer tomography)(HRCT)所作出的明确或可能的IPF诊断。在HRCT所作的诊断中，注意是否存在下述特征：(1)存在具有基部和周围优势(basal andperipheral predominance)的网状畸形和/或牵引性支气管扩张；(2)存在具有基部和周围优势的蜂窝样；和(3)不存在非典型特征诸如微结(micronodules)、支气管周围血管结(peribronchovascular nodules)、实变(consolidation)、分离的(非蜂窝样)囊肿、毛玻璃弱化(ground glass attenuation)(或者如果存在的话，广泛性小于网状不透明(reticular opacity))和纵隔腺病(mediastinal adenopathy)(或者如果存在的话，广泛性不足以在胸X-射线中看得见)。如果满足特征(1)、(2)和(3)，得出明确的IPF的诊断结果。如果满足特征(1)和(3)，得出可能为IPF的诊断结果。
[00152]在一些实施方案中，“有效数量”的合成CXCR3配体是这样的剂量，即当与安慰剂对照或未治疗的对照相比时，有效地将疾病发展降低至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％或更多。
[00153]疾病发展(Disease progression)是指发生下述一种或多种情况：(1)预测的FVC减少10％或更多；(2)A-a梯度(A-a gradient)增加5mm Hg或更多；(3)单次呼吸DLco(single breath DLco)减少15％或更多。在相隔4至14周的时间接连两次测量这些参数中的一个或多个参数，并将这些值与基准值(baseline)相比较，确定是否出现疾病发展。
[00154]因此，例如当未进行治疗的或用安慰剂治疗的患者在一段时间中显示FVC减少50％，那么给予了有效数量的目标CXCR3配体的个体在同样的时间段中，显示FVC减少45％、约42％、约40％、约37％、约35％、约32％、约30％或更少。
[00155]在一些实施方案中，“有效数量”的合成CXCR3配体是这样的剂量，即当与安慰剂治疗对照或未治疗的对照个体相比时，有效地将没有发展现象的存活时间(progression-free survival time)，例如从基准点(例如在开始治疗之前1至28天内的时间点)至死亡或疾病发展的时间，增加至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍或更多倍数。因此，例如在某些实施方案中，有效数量的合成CXCR3配体是，当与安慰剂治疗的或未治疗的对照个体相比时，有效地增加无发展现象的存活时间的剂量，即增加至少约1周、至少约2周、至少约3周、至少约4周、至少约2月、至少约3月、至少约4月、至少约5月、至少约6月、至少约8月、至少约10月、至少约12月、至少约18月、至少约2年、至少约3年或更长时间。
[00156]在一些实施方案中，合成CXCR3配体的有效数量是有效地增加至少一种肺功能参数的数量，例如，当与未治疗个体或安慰剂治疗的对照个体相比时，有效数量的合成CXCR3配体将至少一种肺功能参数增加至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍或更多。在这些实施方案中的一些实施方案中，通过将基准值与开始治疗之后任何时间点的值，例如开始治疗后48周的值比较，或比较两时间点，例如将在开始治疗后相隔约4周至14周的两时间点之间的值进行比较，测定肺功能参数是否增加。
[00157]在一些实施方案中，有效数量的合成CXCR3配体是这样的剂量，即当与相隔4至14周的两连续时间点的基准进行比较，有效地将FVC增加至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍或更多倍数的剂量。
[00158]在一些实施方案中，有效数量的合成CXCR3配体是这样的剂量，即当与基准相比时，将肺泡：动脉(A-a)梯度减少至少约5mm Hg、至少约7mm Hg、至少约10mm Hg、至少约12mm Hg、至少约15mm Hg或更多的剂量。
[00159]在一些实施方案中，有效数量的合成CXCR3配体是这样的剂量，当与基准相比时，将单次呼吸DLco增加至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍或更多的剂量。DLco是针对一氧化碳的肺扩散容量，用mL CO/mm Hg/秒表示。
[00160]肺功能的参数包括但不限于用力肺活量(FVC)；用力呼吸量(FEV1)；肺总容量；休息时的动脉氧分压(partial pressure of arterial oxygen at rest)；最大运动时的动脉氧分压(partial pressure of arterial oxygen at maximal exertion)。
[00161]肺功能可以用任何已知的方法测量，包括但不限于肺量测定法。
联合疗法
[00162]在一些实施方案中，本发明提供了治疗IPF的联合疗法。因此，本发明提供了治疗IPF的方法，通常涉及在与第二治疗剂形成的联合疗法中给予目标合成CXCR3配体。合适的第二治疗剂包括但不限于I型干扰素受体激动剂、III型干扰素受体激动剂、II型干扰素受体激动剂、吡非尼酮或吡非尼酮类似物、TNF拮抗剂、TGF-β拮抗剂、内皮缩血管肽受体拮抗剂、应激激活蛋白激酶抑制剂等。
[00163]在其他实施方案中，本发明提供了治疗IPF的方法，包括给予目标合成CXCR3配体和和第二治疗剂的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的“协同联合物”是这样的联合剂量，其在IPF的治疗性或预防性治疗中，比起由仅仅累加性联合所能预测或期望的治疗结果中的增量提高更加有效，累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当第二治疗剂作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
[00164]在一些实施方案中，本发明提供了方法，该方法涉及给予目标合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定的吡非尼酮类似物的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物的“协同联合物”是这样的联合剂量，其在IPF的治疗性或预防性治疗中，比起由仅仅累加性联合所能预测或期望的治疗结果中的增量提高更加有效，其中累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
治疗肝纤维化的方法
[00165]本发明提供了治疗肝纤维化的方法，包括减少临床肝纤维化、减少发生肝纤维化的可能性、减少与肝纤维化相关的参数。该方法通常包括将有效数量的目标合成CXCR3配体的组合给予需要它们的个体。在许多实施方案中特别有意义的是对人的治疗。
[00166]肝纤维化是与肝硬化相关的并发症的前兆(precursor)，与肝硬化相关的并发症诸如门静脉高压症、进行性肝机能不全(progressive liver insufficiency)和肝细胞癌。肝纤维化的减少因而降低这类并发症的发生率。因此，本发明还提供了降低个体患与肝脏硬化症相关的并发症的可能性的方法。
[00167]本方法通常涉及给予治疗上有效剂量的目标合成CXCR3配体。如本文中所使用的，“有效剂量”的目标合成CXCR3配体是这样的剂量，其有效地降低肝纤维化或降低肝纤维化发展速度；和/或有效地减少个体患肝纤维化的可能性；和/或有效地降低与肝纤维化相关的参数；和/或有效地减少与肝脏硬化症相关的病症。
[00168]本发明也提供了治疗个体肝纤维化的方法，包括给予个体一定数量的目标合成CXCR3配体，其有效地预防或治疗个体的肝纤维化，例如增加存活的可能性、减少死亡的危险性、缓解疾病负荷(disease burden)或减缓疾病在个体中的发展速度。
[00169]用目标合成CXCR3配体进行的治疗是否有效地减少肝纤维化，用许多得到广泛公认的测量肝纤维化和肝功能的技术中的任何技术来确定。通过分析肝脏活体组织样品，确定肝纤维化是否减少。对肝脏活体组织的分析包括两种主要方面的评测：坏死性炎症(necroinflammation)，其用“级(grade)”来进行评价，量度了严重性和正在发作的疾病的活性，和纤维变性损伤，以及实质(parenchymal)或血管重塑，用反映长期的疾病发展的“阶段(stage)”来评价。参见例如Brunt(2000)Hepatol.31：241-246；和METAVIR(1994)Hepatology 20：15-20。基于对肝脏活组织的分析，赋予分数值。现在有许多标准的评分系统，这些评分系统对纤维变性的程度和严重性进行定量评测。这些评分系统包括METAVIR、Knodell、Scheuer、Ludwig和Ishak评分系统。
[00170]METAVIR评分系统是基于对肝脏活体组织的各种特征进行的分析，这些特征包括：纤维变性(肝门纤维变性(portal fibrosis)、小叶中心纤维变性(centrilobular fibrosis)和硬化)；坏死(碎片和小叶坏死(piecemeal and lobularnecrosis)、嗜酸性收缩(acidophilic retraction)和气囊样恶化(ballooningdegeneration))；炎症(门道炎症(portal tract inflammation)、门淋巴凝集(portallymphoid aggregates)和门炎症分布(distribution of portal inflammation))；胆管变化；和Knodell指数(门脉周坏死(periportal necrosis)、小叶坏死、门炎症(portalinflammation)、纤维变性和总疾病活性(overall disease activity)的分数)。METAVIR系统中每一阶段的定义如下：分数：0，无纤维变性；分数：1，门道(portal tract)星形扩张，但无隔壁(septa)形成；分数：2，门道扩张，形成稀少的隔壁；分数：3，形成大量隔壁，但未硬化；和分数：4，硬化。
[00171]Knodell′s评分系统，也称为肝炎活性指数，基于四类组织特征的分数，对样品进行分类，这四类组织特征是：I.门周和/或桥坏死(Periportal and/or bridgingnecrosis)；II.小叶内恶化(Intralobular degeneration)和灶状坏死；III.门炎症；和IV.纤维变性。在Knodell分阶段系统(staging system)中，分数如下：分数：0，无纤维变性；分数：1，轻微纤维变性(纤维化门膨胀(fibrous portal expansion))；分数：2，中等纤维变性；分数：3，严重纤维变性(桥式纤维变性)；和分数：4，硬化。分数越高，肝脏组织破坏就越严重。参见Knodell(1981)Hepatol.1：431。
[00172]在Scheuer评分系统中，分数如下：分数：0，无纤维变性；分数：1，扩大的纤维化门道；分数：2，门周或门-门间隔(periportal or portal-portal septa)形成，但结构完整；分数：3，纤维变性，结构扭曲，但无明显硬化；分数：4，很可能有或明确有硬化。参见Scheuer(1991)J.Hepatol.13：372。
[00173]Ishak评分系统描述于Ishak(1995)J.Hepatol.22：696-699。阶段0，无纤维变性；阶段1，一些门区域(portal areas)发生纤维化膨胀，有或无短的纤维化间隔(short fibrous septa)；阶段2，大部分门区域发生纤维化膨胀，有或无短的纤维化间隔；阶段3，大部分门区域发生纤维化膨胀，偶尔出现门对门(P-P)桥接(portalto portal(P-P)bridging)；阶段4，门区域发生纤维化膨胀，出现显著的(P-P)以及门-中心(portal-central)(P-C)桥接；阶段5，显著的桥接(P-P和/或P-C)，偶尔出现结节(不完全硬化)；阶段6，硬化，很可能的或明确的。抗纤维变性治疗的效果也可以使用Child-Pugh评分系统测量和评价，该评分系统包括多组分点系统(multicomponent point system)，其基于血清胆红素水平、血清白蛋白水平、凝血酶原时间的异常，腹水的存在和严重性和脑病变的存在和严重性。基于这些参数异常与否以及严重性，可以将患者归于三类：A、B或C，它们的临床疾病的严重性依次增加。
[00175]在一些实施方案中，治疗上有效数量的目标合成CXCR3配体是这样的数量，依据治疗前和治疗后的肝脏组织切片，发现该数量的目标合成CXCR3配体引起纤维变性阶段发生一个单位(unit)或多个单位的变化。在特定的实施方案中，治疗上有效数量的目标合成CXCR3配体在METAVIR、Knodell、Scheuer、Ludwig或Ishak评分系统中将肝纤维化减少至少一个单位。
[00176]第二，或间接的，肝功能指标也可以用于评价目标合成CXCR3配体治疗的功效。基于对胶原蛋白和/或肝纤维化的血清标记物特异性染色，对肝纤维化的定量程度(quantitative degree)的形态测量学计算机半自动评估，也可以作为目标治疗方法效率的指示。肝功能的二级指数(secondary indices)包括但不限于血清转氨酶水平、凝血酶原时间、胆红素、血小板数、门压(portal pressure)、白蛋白水平和Child-Pugh分数的评价。
[00177]在另一实施方案中，有效数量的目标合成CXCR3配体是这样的数量，相比起未治疗的个体或安慰剂治疗的个体中的肝功能指标，其有效地将肝功能指标增加至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％或更多。使用标准测定方法，本领域技术人员可以容易地测量此类肝功能指标，其中许多可以在市场上购得，并普遍用于临床中。
[00178]肝纤维化的血清标记也可以作为目标治疗方法效率的指示来测量。肝纤维化的血清标记包括但不限于透明质酸、N-末端前胶原III肽、IV型胶原蛋白的7S结构域、C-末端前胶原I肽和层粘连蛋白。肝纤维化的其他生物化学标记包括α-2-巨球蛋白、结合珠蛋白、γ球蛋白、载脂蛋白A和γ谷氨酰转肽酶。
[00179]在另一实施方案中，治疗上有效数量的目标合成CXCR3配体是这样的数量，其相比起未治疗个体或安慰剂治疗的个体中的标记水平，其将肝纤维化的血清标记水平减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％或至少约80％或更多。使用标准测定方法，本领域技术人员可以容易地测量此类肝纤维化血清标记，其中许多可以在市场上购得，并常用于临床中。测量血清标记的方法包括以免疫学为基础的方法(immunological-based methods)，例如酶联免疫吸附测定方法(ELISA)、放射性免疫测定方法和类似方法，它们使用对给定血清标记具有特异性的抗体进行。
[00180]对功能性肝贮备(functional liver reserve)的定量测试也可以用于评价用目标合成CXCR3配体进行治疗的功效。这包括：靛蓝花青的清除试验(indocyaninegreen clearance)(ICG)、半乳糖清除能力(GEC)试验、氨基吡啉呼吸试验(ABT)、安替比林清除试验、单乙基甘氨酸二甲苯胺(MEG-X)清除试验和咖啡因清除试验。
[00181]如本文中所使用的，“与肝脏硬化症相关的并发症”指代谢失调肝病(decompensated liver disease)的后遗症(sequellae)，即，或者在肝纤维化后发生或者是肝纤维化发展的结果，包括但不限于出现腹水、曲张静脉出血、门静脉高压症、黄疸、进行性肝机能不全、脑病变、肝细胞癌、需要做肝脏移植的肝脏衰竭、和与肝脏相关的死亡。
[00182]在另一实施方案中，治疗上有效数量的目标合成CXCR3配体这样的数量，即相比起未经治疗的个体或安慰剂治疗的个体，其有效地将与肝脏硬化症相关的病症的发病率(例如个体患病的可能性)减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％或更多。
[00183]本领域技术人员可以容易地确定用目标合成CXCR3配体进行联合治疗是否有效地降低与肝脏硬化相关的病症的发病率。
[00184]肝纤维化的减少导致肝功能增强。因此，本发明提供了增加肝功能的方法，通常涉及给予治疗上有效数量的目标合成CXCR3配体。肝功能包括但不限于：蛋白质合成功能，诸如血清蛋白(例如白蛋白、凝血因子、碱性磷酸酶、氨基转移酶(例如丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶)、5′-核苷酶、γ-谷氨酰胺转肽酶等)，胆红素合成，胆固醇合成和胆汁酸合成；肝脏代谢功能，包括但不限于：碳水化合物代谢、氨基酸和氨的代谢、激素代谢和脂类代谢；外源药物的解毒功能；血液动力学功能，包括内脏和肝门血液动力学功能；和类似功能。
[00185]使用得到广泛公认的的肝功能试验，本领域技术人员容易确定肝功能是否增强。因此，使用标准的免疫学和酶技术，肝功能标记诸如白蛋白、碱性磷酸酶、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、胆红素和类似物的合成也能够通过测量在血清中的这些标记的水平而得以评价。使用标准万法，通过肝门楔压(portal wedgepressure)和/或抵抗力，可以测量内脏循环和肝门血液动力学。通过测量血清中氨的水平，可以测量代谢功能。
[00186]使用标准的免疫学和酶测定方法，通过测量血清蛋白的水平，可以测定通常由肝脏分泌的血清蛋白是否在正常的范围内。本领域技术人员知道此类血清蛋白正常的范围。下面是非限制性例子。丙氨酸转氨酶的正常范围在每升血清约7至约56单位范围内。天冬氨酸转氨酶的正常范围在每升血清约5至约40单位范围内。胆红素用标准方法测量。正常的胆红素水平通常少于约1.2mg/dL。血液白蛋白水平用标准测定方法测量。血清白蛋白的正常水平在约35至约55g/L范围内。凝血酶原时间的延长用标准测定方法测量。正常的凝血酶原时间比对照长少于约4秒钟。
[00187]在另一实施方案中，治疗上有效数量的目标合成CXCR3配体是有效地将肝功能增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或更多的数量。例如，治疗上有效数量的目标合成CXCR3配体是将肝功能的升高的血清标记水平降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或更多的数量，或将肝功能血清标记水平降低至正常范围内的数量。治疗上有效数量的目标合成CXCR3配体是将肝功能血清标记水平增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或更多的数量，或将肝功能血清标记水平增加至正常范围内的数量。
联合疗法
[00188]在一些实施方案中，本发明提供了治疗肝纤维化的联合疗法。因此，本发明提供了治疗肝纤维化的方法，通常涉及在与第二治疗剂形成的联合疗法中给予目标合成CXCR3配体。合适的第二治疗剂包括但不限于I型干扰素受体激动剂、III型干扰素受体激动剂、II型干扰素受体激动剂、吡非尼酮或吡非尼酮类似物、TNF拮抗剂、TGF-β拮抗剂、内皮缩血管肽受体拮抗剂、应激激活蛋白激酶抑制剂等。
[00189]在其他实施方案中，本发明提供了治疗肝纤维化的方法，涉及给予目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的“协同联合物”是这样的联合剂量(combined dosage)，其在肝纤维化的治疗性或预防性治疗中，比起由仅仅累加性联合(merely additivecombination)所能预测或期望的治疗结果中的增量改善(incremental improvement)更加有效，累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当第二治疗剂作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
[00190]在一些实施方案中，本发明提供了方法，该方法涉及给予目标合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定的吡非尼酮类似物的“协同联合物”是这样的联合剂量(combined dosage)，其在肝纤维化的治疗性或预防性治疗中，比起由只是仅累加性联合(additive combination)所能预测或期望的治疗结果中的增量改善更加有效，其中累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
治疗肾纤维化的方法
[00191]肾纤维化的特征是胞外基质(ECM)组分的过量积累。转化生长因子-β(TGF-β)的过量产生被认为是由ECM过度沉积引起的组织纤维变性并从而导致疾病的原因所在。TGF-β的成纤维作用(fibrogenic action)是由同时发生的对基质蛋白合成的刺激作用和对基质降解的抑制作用，以及帮助ECM聚集(ECM assembly)的整联蛋白表达的增加导致的。
[00192]本发明提供了治疗肾纤维化的方法。该方法通常涉及给予患有肾纤维化的个体有效数量的目标合成CXCR3配体。如本文中所使用的，“有效数量”的目标合成CXCR3配体是有效地减少肾纤维化的数量；和/或有效地降低个体患肾纤维化可能性的数量；和/或有效地降低与肾纤维化相关的参数的数量；和/或有效地减少与肾脏纤维化相关的病症的数量。
[00193]在一种实施方案中，有效数量的目标合成CXCR3配体是这样的数量，即与治疗之前的个体的肾纤维化程度相比较，或与未进行治疗时患者所经历的肾纤维化发展速度相比较时，足以将肾纤维化减少，或将肾纤维化的发展速度减少至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％。
[00194]使用任何已知的方法，测定在肾脏中纤维变性是否减少。例如，对肾脏活体组织样品进行组织化学分析，以测定ECM沉积和/或纤维变性的程度。其他方法是本领域已知的，参见例如Masseroli et al.(1998)Lab.Invest.78：511-522；美国专利6,214,542。
[00195]在一些实施方案中，有效数量的目标合成CXCR3配体是相比起治疗之前的个体基础肾功能水平，有效地将肾功能增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的数量。
[00196]在一些实施方案中，有效数量的目标合成CXCR3配体是相比起不进行治疗时会发生的肾功能衰竭，有效地将肾功能衰竭减缓至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％的数量。
[00197]肾功能可以用任何已知的测定方法测量，包括但不限于：血浆肌酸酐水平(其中正常水平通常在约0.6至约1.2mg/dL范围内)；肌酸酐清除率(其中肌酸酐清除率的正常水平，对男性来说通常在约97至约137mL/分钟范围内，对于女性来说通常在约88至约128mL/分钟范围内)；肾小球滤过率(由菊粉清除率或其他方法测量或获得)；血液尿素氮(其中正常水平通常在约7至约20mg/dL范围内)；和尿蛋白水平。
[00198]在其他实施方案中，本发明提供了方法，该方法涉及给予目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的“协同联合物”是这样的联合剂量(combined dosage)，其在肾纤维化的治疗性或预防性治疗中，比起由只是累加性联合(additive combination)所能够预测或期望的治疗结果中的增量改善更加有效，累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当第二治疗剂作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
[00199]本发明也提供了治疗个体肾纤维化的方法，包括给予个体目标合成CXCR3配体，给药数量有效地预防或治疗个体肾纤维化，例如增加血清肌酸酐水平加倍所需的时间，增加到达需要肾置换治疗(例如透析或移植)的末期肾病的时间，增加存活可能性，减少死亡危险性，缓解疾病负荷，或减缓疾病在个体中的发展速度。
联合疗法
[00200]一些实施方案中，本发明提供了治疗肾纤维化的联合疗法。因此，本发明提供了治疗肝纤维化的方法，通常涉及在与第二治疗剂组成的联合疗法中给予目标合成CXCR3配体。合适的第二治疗剂包括但不限于I型干扰素受体激动剂、III型干扰素受体激动剂、II型干扰素受体激动剂、吡非尼酮或吡非尼酮类似物、TNF拮抗剂、TGF-β拮抗剂、内皮缩血管肽受体拮抗剂、应激激活蛋白激酶抑制剂等。
[00201]在其他实施方案中，本发明提供了治疗肾纤维化的方法，包括给予目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的“协同联合物”是这样的联合剂量，其在肾纤维化的治疗性或预防性治疗中，比起由仅仅累加性联合能够预测或期望的治疗结果中的增量提高更加有效，累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当第二治疗剂作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
[00202]在一些实施方案中，本发明提供了方法，该方法涉及给予目标合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定的吡非尼酮类似物的“协同联合物”是这样的联合剂量，其在肾纤维化的治疗性或预防性治疗中，比起由仅仅累加性联合能够预测或期望的治疗结果中的增量提高更加有效，其中累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
治疗癌症的方法
[00203]本发明提供了治疗癌症的方法。该方法通常涉及将有效数量的目标合成CXCR3配体给予需要的个体。
[00204]当与合适的对照相比时，该方法有效地将肿瘤负荷(tumor load)减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约85％、或至少约90％、最多时全部根除肿瘤。因此，在这些实施方案中，“有效数量”的目标合成CXCR3配体是这样的数量，即，当与合适的对照相比较时，足以将肿瘤负荷减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约85％、或至少约90％，最多时全部根除肿瘤的数量。在实验动物系统中，合适的对照可以是遗传上一致的动物，该动物没有用合成CXCR3配体处理。在非实验系统中，合适的对照可以是给予合成CXCR3配体之前存在的肿瘤负荷。其他合适的对照可以是安慰剂对照。
[00205]使用任何已知的方法，可以确定肿瘤负荷是否已经减少，方法包括但不限于：测量实体肿瘤质量；使用细胞测定方法对肿瘤细胞数目计数；荧光激活细胞分选方法(例如使用对肿瘤相关抗原具有特异性的抗体)以测定带有给定肿瘤抗原的细胞的数量；对肿瘤进行计算层析X-射线扫描术(computed tomographyscanning)，核磁共振成像，和/或X-射线成像，以评估和/或监控肿瘤大小；测量肿瘤相关抗原在生物样品诸如例如血液中的数量；和类似方法。
[00206]当与合适的对照相比时，该方法有效地将肿瘤的生长速度减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约85％、或至少约90％，最多时完全抑制肿瘤的生长。因此，在这些实施方案中，“有效数量”的合成CXCR3配体是这样的数量，当与合适的对照相比时，足以将肿瘤生长速度减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约85％或至少约90％，最多时完全抑制肿瘤生长的数量。在实验动物系统中，合适的对照可以是遗传上一致的动物，该动物没有用合成CXCR3配体处理。在非实验系统中，合适的对照可以是给予合成CXCR3配体之前存在的肿瘤负荷。其他合适的对照可以是安慰剂对照。
[00207]使用任何已知的方法，可以确定肿瘤的生长是否被抑制，方法包括但不限于：体外增殖测定方法；3H-胸苷摄取测定方法(3H-thymidine uptake assay)；和类似方法。
[00208]所述方法可用于治疗各种癌症，包括癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。
[00209]可以使用目标方法来治疗的癌症包括但不限于：食道癌、肝细胞癌、基底细胞癌(一种皮肤癌)、鳞状细胞癌(各种组织)、膀胱癌，包括过渡细胞癌(transitionalcell carcinoma)(一种恶性膀胱肿瘤)、支气管癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌，包括肺小细胞癌(small cell carcinoma)和肺非小细胞癌、肾上腺皮质癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、类腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肾细胞癌、导管原位癌(ductal carcinoma in situ)或胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、骨源性癌、上皮细胞癌(epithelieal carcinoma)和鼻咽癌等。
[00210]可以使用目标方法来治疗的肉瘤包括但不限于：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤和其他软组织肉瘤。
[00211]可以使用目标方法来治疗的其他实体肿瘤包括但不限于：胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、menangioma、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
[00212]可以使用目标方法来治疗的白血病包括但不限于：a)慢性骨髓增生性综合症(多能造血干细胞的瘤性病症)；b)急性骨髓性白血病(多能造血干细胞或具有限制性谱系潜能的造血细胞的瘤性转化)；c)慢性淋巴细胞白血病(CLL；免疫上不成熟和功能不完全的小淋巴细胞的无性增殖)，包括B-细胞CLL、T-细胞CLL前淋巴细胞白血病和毛细胞白血病；和d)急性淋巴细胞白血病(以淋巴细胞积累为特征)。可以使用目标方法来治疗的淋巴瘤包括但不限于：B-细胞淋巴瘤(例如伯基特淋巴瘤)；何杰金氏淋巴瘤；和类似淋巴瘤。
联合疗法
[00213]在一些实施方案中，本发明提供了治疗癌症的联合疗法。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，通常涉及给予目标合成CXCR3配体，目标合成CXCR3配体与至少一种第二治疗剂组合进行联合治疗。合适的第二治疗剂包括但不限于I型干扰素受体激动剂；II型干扰素受体激动剂；III型干扰素受体激动剂；吡非尼酮或吡非尼酮类似物；抗增生试剂，抗增生试剂选自烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗体、类固醇激素、长春花生物碱、生物应答调节物和紫杉烷(taxane)。
[00214]在其他实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，该方法涉及给予目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的“协同联合物”是这样的联合剂量，其在癌症的治疗性或预防性治疗中，比起由只是累加性联合所能够预测或期望的治疗结果中的增量改善更加有效，累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当第二治疗剂作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
[00215]在一些实施方案中，合成CXCR3配体作为标准癌症治疗的辅助治疗而给药。标准癌症治疗包括手术(例如通过手术除去癌组织)、放射疗法、骨髓移植、化学治疗、生物应答调节物治疗和上述方法的某些组合。
[00216]放射疗法包括但不限于x-射线或γ-射线，它们或者由外部应用源诸如光束传递，或者通过植入小的放射性源而传递。
[00217]化学治疗剂是非肽类(即non-proteinaceous)化合物，其减少癌细胞的增殖，化学治疗剂包括细胞毒素剂和细胞生长抑制剂。化学治疗剂的非限制性例子包括：烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。
[00218]用于减少细胞增殖的试剂是本领域已知的，并广泛使用。此类试剂包括：烷化剂，诸如氮芥、亚硝基脲、乙撑亚胺衍生物、烷基磺酸盐和三氮烯，包括但不限于双氯乙基甲胺、环磷酰胺(CytoxanTM)、美法仑(L-sarcolysin)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基CCNU)、链脲菌素、氯脲菌素、尿嘧啶氮芥、氮芥、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基蜜胺、triethylenethiophosphoramine、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。
[00219]抗代谢剂包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物，和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟苷(FudR)、6-硫代鸟嘌呤、6-巯嘌呤(6-MP)、喷司他丁、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲蝶呤、10-propargyl-5，8-dideazafolate(PDDF，CB3717)、5，8-dideazatetrahydrofolicacid(DDATHF)、亚叶酸、氟达拉滨磷酸盐、喷司他丁和吉西他滨。
[00220]合适的天然产物和它们的衍生物(例如长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)包括但不限于：Ara-C、紫杉醇(Taxol)、多烯紫杉醇(Taxotere)、脱氧肋间型霉素(deoxycoformycin)、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤；布喹那；生物碱，例如长春新碱、长春花碱、长春瑞宾、长春地辛等；例如鬼臼毒素，例如依托泊苷、替尼泊苷等；例如抗生素，例如蒽环类抗肿瘤抗生素、盐酸道诺霉素(道诺霉素、柔红霉素、cerubidine)、依达比星、亚德利亚霉素、表阿霉素和吗啉代衍生物等；phenoxizone biscyclopeptides，例如放线菌素D；碱性糖肽(basic glycopeptides)，例如争光霉素；蒽醌糖苷类抗生素(anthraquinoneglycosides)，例如普卡霉素(光辉霉素)；大黄素类抗生素(anthracenediones)，例如米托蒽醌；azirinopyrrolo indolediones，例如丝裂霉素；大环类免疫抑制剂(macrocyclic immunosuppressants)，例如环胞霉素、FK-506(他克莫司、prograf)、雷帕霉素，等；和类似物。
[00221]其他抗增殖细胞毒性剂是navelbene、CPT-11、阿那曲唑、来曲唑、卡培他滨、reloxafine、环磷酰胺、异环磷酰胺和屈洛昔芬(droloxafine)。
[00222]具有抗增殖活性的微管影响剂(Microtubule affecting agents)也适用于本发明，包括但不限于异秋水仙素(allocolchicine)(NSC 406042)、Halichondrin B(NSC609395)、秋水仙素(NSC 757)、秋水仙素衍生物(例如NSC 33410)、dolstatin 10(NSC 376128)、美登素(NSC 153858)、根瘤菌素(NSC 332598)、紫杉醇(Taxol)、Taxol衍生物、多烯紫杉醇(Taxotere)、硫代秋水仙素(thiocolchicine)(NSC361792)、trityl cysterin、长春花碱硫酸盐、长春新碱硫酸盐、天然的和合成的埃坡霉素，包括但不限于埃坡霉素A、埃坡霉素B、替斯利得；雌莫司汀、诺考达唑和类似物。
[00223]适用的激素调节剂(Hormone modulators)和类固醇(包括合成的类似物)包括但不限于：肾上腺皮质激素，例如泼尼松、地塞米松等；雌激素和雄激素，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雌二醇、氯米芬、他莫昔芬；等；和肾上腺皮质抑制剂(adrenocortical suppressants)，例如氨鲁米特；17α-乙炔雌二醇；二乙基己烯雌酚、睾酮、氟甲睾酮、屈他雄酮丙酸酯、睾内酯、甲基泼尼松龙、甲基-睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、三对甲氧苯基氯乙烯、羟基孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺(Drogenil)、托瑞米芬(Fareston)和Zoladex。雌激素刺激增殖和分化，因此结合雌激素受体的化合物可以用来阻断该活性。皮质类甾醇能抑制T细胞增殖。
[00224]其他化学治疗剂包括金属络合物，例如顺铂(cis-DDP)、碳铂等；尿素类(ureas)，例如羟基脲；和肼类，例如N-甲基肼；epidophyllotoxin；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽醌；亚叶酸；替加氟；等。其他感兴趣的抗增殖剂包括免疫抑制剂，例如麦考酚酸、沙利度胺、去氧斯伯格埃林(desoxyspergualin)、azasporine、来氟米特、咪唑立宾、azaspirane(SKF 105685)；Iressa(ZD 1839，4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)；等。
[00225]“紫杉烷”包括紫杉醇，以及任何具有活性的紫杉烷衍生物或药物前体。利用本领域技术人员已知的技术，“紫杉醇”(其在本文中应该理解为包括它的类似物、制剂和衍生物，诸如多烯紫杉醇、Taxol、Taxotere(多烯紫杉醇制剂)、紫杉醇的10-去乙酰类似物，和紫杉醇的3′N-去苯甲酰-3′N-叔丁氧羰基类似物)容易制备得到(也可参见WO 94/07882、WO 94/07881、WO 94/07880、WO 94/07876、WO93/23555、WO 93/10076；美国专利5,294,637；5,283,253；5,279,949；5,274,137；5,202,448；5,200,534；5,229,529；和EP 590,267)，或从各种商业渠道获得，例如从Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.获得(来自短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的T7402；或来自云南红豆杉(Taxus yannanensis)的T-1912)。
[00226]紫杉醇应该理解为不仅指常见的、化学上可获得的紫杉醇形式，也指类似物和衍生物(例如Taxotere多烯紫杉醇，如上指出)和紫杉醇结合物(例如紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖或紫杉醇-木糖)。
[00227]也同时包括在术语“紫杉烷”中的是各种已知的衍生物，包括亲水性衍生物以及疏水性衍生物。紫杉烷衍生物包括但不限于描述于国际专利申请WO 99/18113中的半乳糖和甘露糖衍生物；描述在WO 99/14209中的哌嗪和其他衍生物；描述在WO 99/09021、WO 98/22451和美国专利5,869,680中的紫杉烷衍生物；描述在WO 98/28288中的6-硫代衍生物；描述在美国专利5,821,263中的亚磺酰胺衍生物；和美国专利5,415,869中的红豆杉醇(taxol)衍生物。还包括紫杉醇的药物前体，包括但不限于描述在WO 98/58927；WO 98/13059；和美国专利5,824,701中的药物前体。
[00228]适合与本发明方法一起使用的生物应答调节物包括但不限于(1)酪氨酸激酶(RTK)活性的抑制剂；(2)丝氨酸/苏氨酸激酶活性的抑制剂；(3)肿瘤相关的抗原拮抗剂，诸如特异性结合到肿瘤抗原的抗体；(4)细胞凋亡受体激动剂；(5)白细胞介素-2；(6)IFN-α；(7)IFN-γ；(8)集落刺激因子；(9)血管生成的抑制剂；和(10)肿瘤坏死因子的拮抗剂。
治疗血管生成病症的方法
[00229]本发明提供了治疗血管生成病症的方法。该方法通常涉及将有效数量的目标合成CXCR3配体给予需要它们的个体。
[00230]在治疗血管生成病症的目标方法中，“有效数量”的目标合成CXCR3配体是起到抑制血管作用的数量，例如是当与不用合成CXCR3配体治疗时的血管生成水平相比较时，将血管生成减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％或更多。
[00231]有许多系统用于评价血管生成。例如，因为血管生成是实体肿瘤生长所需要的，在动物模型中肿瘤生长的抑制作用可以用作血管生成抑制的指标。血管生成也可以根据皮肤或器官伤口修复和慢性炎症，例如类风湿性关节炎，动脉粥样硬化和特发性肺纤维化(IPF)的伤口-愈合模型进行评价。也可以通过对组织截面的血管计数而进行评价，例如在对标记分子例如CD3H、因子VIII或PECAM-1染色之后进行血管计数。
[00232]使用任何本领域已知的方法，可以确定血管生成是否减少，方法例如用松弛素浸渍的移植物中的新血管生成的刺激；在角膜或前眼室内血管生长的刺激；内皮细胞体外增殖、迁移或管形成的刺激；和鸡胚绒毛尿囊膜测定方法(chickchorioallantoic membrane assay)；仓鼠颊囊测定方法(hamster cheek pouch assay)；聚乙烯醇海绵盘测定方法(polyvinyl alcohol sponge disk assay)。此类测定方法是本领域熟知的，并已经描述在大量公开资料中，包括例如Auerbach et al.((1991)Pharmac.Ther.51：1-11)和本文引用的文献。
[00233]用于评测血管生成的广泛使用的系统是对新血管生成进行角膜微袋测定方法(corneal micropocket assay)。该体内模型被广泛接受，对临床效用具有预测性作用。参见例如O’Reilly et.al.(1994)Cell 79：315-328；Li et.al.(1991)Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.32(11)：2898-905；和Miller et.al.(1994)Am.J Pathol.145(3)：574-84。
[00234]该目标方法可用于治疗血管生成病症，例如任何以病理性新血管生成为特征的疾病。此类病症包括但不限于实体肿瘤、血管瘤、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和特发性肺纤维化(IPF)；也包括BPH、血管再狭隘、动静脉畸形(AVM)、视网膜病，包括糖尿性视网膜病、脑膜瘤、血管瘤、甲状腺增生(包括Grave′s病)、新血管生成性青光眼、与角膜损伤相关的新血管生成、与角膜移植相关的新血管生成、与角膜移植相关的新血管生成、牛皮癣、纤维血管瘤、血友病性关节、肥大性瘢、奥-瓦二氏综合症(osler-weber syndrome)、老年黄斑变性、脓性肉芽肿、晶状体后纤维增生、硬皮病、沙眼、血管粘着(vascular adhesions)、滑膜炎、皮炎和子宫内膜组织异位。
联合疗法
[00235]在一些实施方案中，本发明提供了治疗血管生成病症的联合疗法。因此，本发明提供了治疗血管生成病症的方法，通常涉及在与至少第二治疗剂形成的联合疗法中给予目标合成CXCR3配体。合适的第二治疗剂包括但不限于I型干扰素受体激动剂、II型干扰素受体激动剂、III型干扰素受体激动剂，和吡非尼酮或吡非尼酮类似物。
[00236]在其他实施方案中，本发明提供了治疗血管生成病症的方法，该方法包括给予目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的“协同联合物”是这样的联合剂量，其在血管生成病症的治疗性或预防性治疗中，比起能够由只是累加性联合预测或期望的治疗结果的增量提高更加有效，累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当第二治疗剂作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
治疗细菌感染的方法
[00237]本发明提供了治疗细菌感染的方法。该方法通常涉及将有效数量的目标合成CXCR3配体给予需要它们的患者。需要它们的个体包括经诊断患有细菌感染的个体，例如病原性细菌感染(包括机会感染)。
[00238]用本发明的方法可以治疗的细菌感染包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、好氧菌或厌氧菌感染，包括但不限于葡萄球菌属(Staphylococcus)、乳酸菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、八叠球菌属(Sarcina)、大肠杆菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、变形杆菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、奈瑟球菌属(Nisseria)、芽孢杆菌属(Baccillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、消化球菌属(Peptococcus)、梭菌属(Clostridium)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、沙雷氏菌属(Serratia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、布氏杆菌属(Brucella)的菌和其他生物体。
[00239]肠杆菌科(Enterobacteriaceae)所有临床上重要的成员包括但不限于：大肠杆菌属所有临床上重要的种，特别有意义的是大肠杆菌；克雷伯菌属所有临床上重要的种，特别有意义的是肺炎克雷伯菌；志贺氏菌属所有临床上重要的种，特别有意义的是痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)；沙门氏菌所有临床上重要的种，包括S.abortus-equi、伤寒沙门氏菌(S.typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、纽波特沙门菌(S.newport)、副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)-A、副伤寒沙门氏菌-B、波斯坦沙门氏菌(S.potsdam)和S.pollurum；沙雷氏菌属所有临床上重要的种，最著名的是粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；耶尔森菌属(Yersinia)所有临床上重要的种，最著名的是鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)；肠杆菌属所有临床上重要的种，最著名的是阴沟肠杆菌(E.cloacae)；所有临床上重要的肠球菌属(Enterococci)的菌，最著名的是粪肠球菌(E.faecalis)和屎肠球菌(E.faecium)；所有临床上重要的嗜血杆菌属菌株，最著名的是流感嗜血杆菌；所有临床上重要的枝杆菌属(Mycobacteria)，最著名的是结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、鸟胞内分枝杆菌(M.avium-intracellulare)、牛分枝杆菌(M.bovis)和麻风分枝杆菌(M.leprae)；淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)；所有临床上重要的假单胞菌属，特别有意义的是P.aeuruginosa；所有临床上重要的葡萄球菌属，特别有意义的是金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)；所有临床上重要的链球菌属，特别有意义的是肺炎链球菌；和霍乱弧菌(Vibrio cholera)。
[00240]治疗细菌感染的目标方法涉及给予有效数量的目标合成CXCR3配体。有效数量的目标合成CXCR3配体是这样的剂量，即，当与没有用合成CXCR3配体治疗时相比，以一剂量或多剂量给药，其有效地将与细菌感染相关的症状或参数降低至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。
[00241]与细菌感染相关的参数包括在感染个体或感染个体的特定组织、流体或器官中的细菌数目。因此，在一些实施方案中，有效数量的目标合成CXCR3配体是这样的数量，即，当以一剂量或多剂量给药时，相比起未用合成CXCR3配体处理，其有效地将个体或个体组织、流体或器官中的细菌数目减少至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。
[00242]与细菌感染相关的症状包括但不限于伤寒、发热、呕吐、白血细胞数量增加和类似症状。实际的化合物给药量和给药途径将取决于特定的疾病或细菌以及其他因素诸如待被治疗的个体的大小、年龄、健康状况和性别，用常规分析方法确定。
[00243]使用任何已知的方法，可以确定目标治疗方法是否有效地降低了与细菌感染相关的参数或症状。例如，使用标准测定方法确定细菌数。例如，通过下述方法测定个体的生物样品中的细菌数目：在设计好的可以让给定的致病菌能够生长的培养基上培养样品，生长一段时间之后，对细菌数计数。通过在显微镜下对观察到的细菌计数，可以确定在流体样品中的细菌数目。
联合疗法
[00244]在一些实施方案中，本发明提供了治疗细菌感染的联合疗法。因此，本发明提供了治疗细菌感染的方法，通常涉及在与至少第二治疗剂形成的联合疗法中给予目标合成CXCR3配体。合适的第二治疗剂包括但不限于II型干扰素受体拮抗剂，和标准的抗生素例如β-内酰胺类抗生素、大环内酯类抗生素、林可胺类抗生素(lincosamide)、氨基糖苷类抗生素、四环类抗生素、多肽类抗生素、磺胺类抗生素和糖肽类抗生素，例如万古霉素、达托霉素、去甲万古霉素和oritavancin。
[00245]在其他实施方案中，本发明提供了治疗细菌感染的方法，该方法涉及给予目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的协同联合物。如本文中所使用的，目标合成CXCR3配体和第二治疗剂的“协同联合物”是这样的联合剂量，其在细菌感染的治疗性或预防性治疗中，比起能够由只是累加性联合预测或期望的治疗结果的增量提高更加有效，累加性联合是指(i)当目标合成CXCR3配体作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果和(ii)当第二治疗剂作为单一疗法以同样的剂量给药时所得到的治疗性或预防性效果的联合。
实验用途
[00246]目标合成CXCR3配体可作为试剂用于体外或体内模型系统，来研究CXCR3的生物学特征；和分析CXCR3激动剂和拮抗剂的效果。
肿瘤发生(tumorigenesis)的动物模型
[00247]在一些实施方案中，在出现肿瘤的非人哺乳动物模型中合成CXCR3配体被用来抑制肿瘤生长。任何具有肿瘤发生的非人动物模型都是适合使用的。实验模型论述于美国专利6,491,906中。该模型用于评价肿瘤发生、自发性转移(spontaneous metastasis)和试验肺定殖化作用(experimental lung colonization)。使用人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系。可以使用完整的NSCLC肿瘤或细胞系。肿瘤生长用肿瘤大小和质量衡量，而自发性转移和肺定殖化作用(试验性转移(experimental metastasis))通过对肺进行组织病理学分析而测定。在该系统中，合成CXCR3配体可以用作肿瘤生长抑制活性的阳性对照。此外，该系统可以被用来筛选合成CXCR3配体活性的激动剂或拮抗剂。
[00248]人NSCLC/SCID小鼠模型特别涉及使用年龄在4至6周的SCID小鼠。仅仅当它们的血清Ig＜1μg/ml时，才使用SCID小鼠。肿瘤植入之前24小时，通过尾静脉，人NSCLC/SCID小鼠嵌合体吸收20μl的anti-asialo GM1(aASGM1；WakoChemicals，Dallas Tex.)。该治疗除去由宿主产生的NK细胞。
[00249]使用完整的人NSCLC，将1mm3样品(基本上没有坏死并称重)以皮下的方式置于分组的(cohort group)SCID小鼠的两侧区域(bilateral flank regions)。使用NSCLC细胞系(Calu-6、A549、Calu-1和Calu-3)，收获半汇合生长的肿瘤细胞(semiconfluent grown tumor cells)，分别给予分组的SCID以106细胞和5×105细胞，细胞置于100μl PBS中，注射到两侧区域和尾静脉。至少一组SCID小鼠构成治疗组，给予其目标合成CXCR3配体。对所有小鼠每天进行疾病监控，并用数字工程师测径器(digital engineers caliper)测量肿瘤大小。
[00250]以周为基础，16周或早些时间宰杀动物，此时肿瘤大小达到3cm或动物似乎生病。杀死生病的动物，进行尸体检验(necropsy)，如果它们因肿瘤之外的其他原因而生病，则排除在研究之外。杀死时，测量皮下位置的肿瘤并称重。然后测定试验肺肿瘤定植现象或自发性肺转移现象。
[00251]给予目标合成CXCR3配体将大大削弱肿瘤在SCID小鼠内的生长。因此，合成CXCR3配体的肿瘤生长抑制活性可以作为阳性对照，用来与候选抗癌化合物的肿瘤生长抑制活性相比较。可替代地，该系统可以用于评价合成CXCR3配体的肿瘤生长抑制活性的候选激动剂或拮抗剂的活性。
内皮细胞趋化性分析
[00252]目标合成CXCR3配体也可以用于评估候选试剂的内皮细胞趋化活性。内皮细胞趋化性分析是在48孔的盲孔趋化室(48-well，blind well chemotaxischambers)(Nucleopore Corp.，Maryland)中进行。通过将它们先后浸在3％乙酸中过夜，在0.1mg/ml明胶中2小时，来制备Nucleopore趋化膜(chemotaxis membranes)(5微米孔尺寸)。将膜在无菌水中漂洗，无菌空气中干燥，并保存在室温中，最多保存时间为1月。牛肾上腺毛细管内皮细胞(BCE)——其保存在含10％FBS的DME中，置于明胶包覆的瓶中——被用作目标细胞。使用前24小时，在含有0.1％BSA的DME中饥饿培养BCE。将以1×106细胞/ml的浓度悬浮于含0.1％BSA的DME中的25微升细胞分配入每个底部孔(bottom well)中。将趋化膜放置在底部孔的顶部，将室密封，倒放，温育2小时，以使得细胞粘附到膜上。然后将室再倒过来，将50ml测试培养基分配入顶部孔(top well)中，再温育2小时。然后固定膜，用Diff-Quick染色试剂盒(American Scientific Products)染色，以便对膜结合的细胞进行计数，并对通过膜迁移到达反面的细胞进行计数。
[00253]目标合成CXCR3配体在测试培养基中的存在，将诱导细胞迁移通过室膜(chamber membrane)。因此，目标合成CXCR3配体在系统中可以用作阳性对照。可选择性地，该系统可以用于评价合成CXCR3配体的趋化活性的候选激动剂或拮抗剂。
体内血管生成分析
[00254]此外，合成CXCR3配体可以用于评价候选试剂在体内血管生成模型中的抗血管生成活性。已经得到充分描述的大鼠角膜微袋模型适合于此用途。例如，将5mg的测试样品总蛋白与等体积的无菌Hydron铸形液(casting solution)混合，并将5ml的等分试样吸放到1mm Teflon杆(Teflon rod)的表面上，而Teflon杆粘合到玻璃器皿的表面上。丸状物在层流罩(laminar flow hood)中进行空气干燥(1小时)，并冷冻过夜。植入之前，丸状物用一滴乳酸林格氏溶液重新水合。
[00255]动物用甲氧基氟烷(metofane)麻醉，腹膜内注射戊巴比妥钠。在将Hydron小球(Hydron pellet)植入距边缘(limbus)约1.5mm的手术产生的角膜内袋之前，将0.1ml的2％利多卡因注射入眼球后部位。动物每天用立体显微镜检查。植入7天之后，动物重新麻醉，连续用乳酸钠林格氏液和胶质炭灌输。收获角膜，铺平并照相。
[00256]仅仅当观察到朝向移植物的毛细管芽持续定向内生长(sustained directionalingowth of capillary sprouts)和发夹环(hairpin loop)，才记录为阳性新血管生成应答。没有观察到生长现象或者仅仅检测到偶然的芽或发夹环且没有显示出持续生长的迹象时，则记录为阴性应答。
[00257]合成CXCR3配体的存在将抑制试验样品中血管生成剂的活性。因此，合成CXCR3配体可以用作阳性对照，以在该系统中评价候选的血管生成抑制剂。可选择性地，该系统可以用来评价合成CXCR3配体的抗血管生成活性的候选激动剂或拮抗剂的活性。
I型干扰素受体激动剂
[00258]如上所述，在一些实施方案中，I型干扰素受体激动剂与合成CXCR3配体联合给药，构成联合治疗。I型干扰素受体激动剂包括IFN-α；IFN-β；IFN-tau；IFN-ω；对I型干扰素受体具有特异性的抗体激动剂；I型干扰素受体的任何其他激动剂，包括非多肽激动剂。
干扰素-α(IFN-α)
[00259]本文中使用的术语“干扰素-α”指一个家族的相关多肽，其抑制病毒复制和细胞增殖并调节免疫应答。术语“IFN-α”包括天然存在的IFN-α多肽；非天然存在的IFN-α多肽；天然存在的或非天然存在的IFN-α多肽的类似物，其保留了天然存在的或非天然存在的IFN-α母体的抗病毒活性。
[00260]合适的α干扰素包括但不限于：天然存在的IFN-α(包括但不限于天然存在的IFN-α2a、IFN-α2b)；重组干扰素α-2b诸如IntronA干扰素，可获自ScheringCorporation，Kenilworth，N.J.；重组干扰素α-2a诸如Roferon干扰素，可获自Hoffmann-La Roche，Nutley，N.J.；重组干扰素α-2C诸如Beroforα2干扰素，可获自Boehringer Ingelheim Pharmaceutical，Inc.，Ridgefield，Conn.；干扰素α-n1，天然α干扰素的纯化混合物，诸如Sumiferon，可获自Sumitomo，Japan或诸如Wellferon干扰素α-n1(INS)，可获自Glaxo-Wellcome Ltd.，London，Great Britain；和干扰素α-n3，由Interferon Sciences制造的天然α干扰素的混合物，可获自Purdue FrederickCo.，Norwalk，Conn.，商标名Alferon。
[00261]如本文中所使用的，术语“IFN-α”也包括杂合IFN-α。如本文中所使用的，术语“杂合IFN-α”指非天然存在的多肽，其包括了所有天然存在的人白细胞IFN-α亚型序列所共有的那些氨基酸残基，而在没有所有亚型共有的氨基酸的位置中的一个或多个位置，包括了在那个位置主要出现的氨基酸，前提是，在任何这样的没有所有亚型共有的氨基酸的位置，该多肽排除了任何的没有在任何一个天然存在的亚型中存在的氨基酸残基。所有天然存在的人白细胞IFN-α亚型序列共有的氨基酸残基(“共有氨基酸残基”)和出现在非共有残基位置的主要氨基酸残基(“杂合氨基酸残基”)是本领域已知的。
[00262]术语“IFN-α”也包括杂合IFN-α。杂合IFN-α(也称为“CIFN”和“IFN-con”和“杂合干扰素”)包括但不限于命名为IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3的氨基酸序列，它们公开在美国专利4,695,623和4,897,471中；和杂合干扰素，如由天然存在的干扰素α的杂合序列的测定结果所定义的(例如Infergen，InterMune，Inc.，Brisbane，Calif.)。IFN-con1是Infergenalfacon-1产品中的杂合干扰素试剂。Infergen杂合干扰素产品在这里通过它的商标名(Infergen)或者它的属名(干扰素alfacon-1)来表示。编码IFN-con的DNA序列可以用前面提到的专利中描述的方法或其他标准方法合成。CIFN的用途特别有意义。
[00263]也适用于本发明用途的是融合多肽，融合多肽包含了IFN-α和异源多肽。合适的IFN-α融合多肽包括但不限于Albuferon-alphaTM(人白蛋白和IFN-α的融合产物；Human Genome Sciences；参见例如Osborn et al.(2002)J.Pharmacol.Exp.Therap.303：540-548)。也适用于本发明用途的是基因重排形式的IFN-α。参见例如Masci et al.(2003)Curr.Oncol.Rep.5：108-113。
[00264]IFN-α多肽可以由任何已知的方法产生。编码IFN-con的DNA序列可以用上述专利中描述的方法和其他标准方法合成。在许多实施方案中，IFN-α多肽是人工DNA序列的表达产物，这些人工DNA序列转化或转染入细菌宿主细胞，例如大肠杆菌，或真核生物宿主细胞(例如酵母；哺乳动物细胞，诸如CHO细胞；和类似细胞)。在这些实施方案中，IFN-α是“重组IFN-α”。当宿主细胞是细菌宿主细胞时，IFN-α被修饰，以包括N-末端甲硫氨酸。大肠杆菌中产生的IFN-α通常用本领域技术人员知道的方法进行纯化，对于IFN-con1，其一般性地描述在Klein et al.((1988)J.Chromatog.454：205-215)中。
[00265]细菌产生的IFN-α可以包括与N-末端氨基酸残基有关的同种型(isoforms)混合物。例如，纯化的IFN-con可以包括与N-末端甲硫氨酸状态有关的同种型的混合物。例如，在一些实施方案中，IFN-con包括下述物质的混合：N-末端甲硫氨酰IFN-con，具有未封端的(unblocked)N-末端的去甲硫氨酰(des-methionyl)IFN-con，和具有封端的(blocked)N-末端的去甲硫氨酰IFN-con。作为一个非限制性例子，纯化的IFN-con1包括甲硫氨酰IFN-con1、去甲硫氨酰IFN-con1和具有封端的N末端的去甲硫氨酰IFN-con1的混合物。Klein et al.((1990)Arch.Biochemistry & Biophys.276：531-537)。可选择性地，IFN-con可以包括特定的分离的同种型。IFN-con的同种型通过诸如等电聚焦的技术相互分离开来，这些技术对本领域技术人员是已知的。
[00266]应该理解，本文中描述的IFN-α可以包括一个或多个修饰的氨基酸残基，例如糖基化作用、化学修饰和类似修饰。
PEG化的IFN-α
[00267]术语“IFN-α”也包括IFN-α的衍生物，IFN-α被衍生化(例如进行化学修饰)，以改变某些特性诸如血清半衰期。因此，术语“IFN-α”包括糖基化的IFN-α；用聚乙二醇衍生化的IFN-α(“PEG化的IFN-α”)；和类似物。PEG化的IFN-α，和其制备方法论述在例如美国专利5,382,657；5,981,709和5,951,974中。PEG化的IFN-α包括PEG和任何上述IFN-α分子的结合物，包括但不限于PEG结合到干扰素α-2a(Roferon，Hoffman La-Roche，Nutley，N.J.)、干扰素α-2b(Intron，Schering-Plough，Madison，N.J.)、干扰素α-2c(Berofor Alpha，Boehringer Ingelheim，Ingelheim，Germany)和杂合干扰素，如天然存在的干扰素α的杂合序列(Infergen，InterMune，Inc.，Brisbane，Calif.)。
[00268]上述IFN-α多肽中的任何一个都可以用一个或多个聚乙二醇部分(moieties)修饰，也就是加入聚乙二醇(聚乙二醇化或PEG化)(PEGylated)。PEG化的IFN-α多肽的PEG分子结合到IFN-α多肽的一个或多个氨基酸侧链上。在一些实施方案中，PEG化的IFN-α在唯一一个氨基酸上含有PEG分子。在其他实施方案中，PEG化的IFN-α在两个或更多个氨基酸上含有PEG分子，例如，IFN-α含有附着到一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个不同氨基酸残基上的PEG分子。
[00269]通过氨基、巯基、羟基或羧基，IFN-α可以直接偶联到PEG(也就是说，不用连接基团)。
[00270]在一些实施方案中，PEG化的IFN-α在IFN-α多肽的氨基末端(N-末端)上或附近加入PEG。例如，在氨基酸1至氨基酸4，或氨基酸5至约氨基酸10的一个或多个氨基酸残基处，PEG分子结合到IFN-α多肽。
[00271]在其他实施方案中，PEG化的IFN-α在从约10至约28的一个或多个氨基酸残基处发生PEG化。
[00272]在其他实施方案中，PEG化的IFN-α在IFN-α多肽的羧基末端(C-末端)或附近发生PEG化，例如在156-166位氨基酸或150-155位氨基酸的一个或多个残基上发生PEG化。
[00273]在其他实施方案中，PEG化的IFN-α在氨基酸100-114中的一个或多个氨基酸残基处聚乙二醇化。
[00274]利用蛋白质的受体结合和/或活性位点结构域内的每一个位点的作用，来确定IFN-α上聚乙二醇结合位点的选择，这对技术人员来说是已知的。总之，避免进行PEG化作用的氨基酸，包括从氨基酸30或氨基酸40的氨基酸残基；和从氨基酸113至氨基酸149的氨基酸残基。
[00275]在一些实施方案中，PEG通过连接基团附着到IFN-α上。连接基团是任何生物相容性连接基团，“生物相容性的”表示化合物或基团是无毒的，可以用于体外或体内，而不引起伤害、不良反应、疾病或死亡。例如通过醚键、酯键、硫醇键或酰胺键，PEG可以结合到连接基团上。合适的生物相容性连接基团包括但不限于：酯基团、酰胺基团、酰亚胺基团、氨基甲酸酯基团、羧基基团、羟基基团、碳水化合物、琥珀酰亚胺基团(包括例如琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(succinimidylsuccinate)(SS)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基羧甲基酯(succinimidylcarboxymethylate)(SCM)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(succinimidyl succinamide)(SSA)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS))、环氧化物基团、氧代羰基咪唑(oxycarbonylimidazole)(包括例如羰基二咪唑(CDI))、硝基苯基(nitro phenyl)基团(包括例如硝基苯基碳酸酯(nitrophenyl carbonate)(NPC)或三氯苯基碳酸酯(trichlorophenyl carbonate)(TPC))、trysylate基团、醛基基团、异氰酸酯基团、乙烯基砜(vinylsulfone)基团、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团或伯胺。
[00276]制备琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)和琥珀酰亚胺基丁酸酯(SBA)酯活化PEG的方法描述于美国专利5,672,662(Harris等)和WO 97/03106中。
[00277]将PEG附着到IFN-α多肽的方法是本领域已知的，并且可以使用任何已知的方法。参见例如Park et al，Anticancer Res.，1：373-376(1981)；Zaplipsky and Lee，Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，J.M.Harris，ed.，Plenum Press，NY，Chapter 21(1992)；和美国专利5,985,265；美国专利5,672,662(Harris等)和WO 97/03106。
[00278]PEG化的IFN-α和制备它们的方法描述于例如美国专利5,382,657；5,981,709；5,985,265和5,951,974。PEG化的IFN-α包括PEG和任何上述IFN-α分子的结合物，包括但不限于：PEG结合到干扰素α-2a(Roferon，Hoffman LaRoche，Nutley，N.J.)，其中PEG化的Roferon称之为PEGASYS(Hoffman LaRoche)；干扰素α-2b(Intron，Schering-Plough，Madison，N.J.)，其中PEG化的Intron称为PEG-INTRON(Schering-Plough)；干扰素α-2c(Berofor Alpha，Boehringer Ingelheim，Ingelheim，Germany)；杂合干扰素(CIFN)，定义为天然存在的干扰素α的杂合序列(Infergen，Amgen，Thousand Oaks，Calif.)，其中PEG化的Infergen称为PEG-INFERGEN。
[00279]通常，PEG部分连接到暴露在表面的赖氨酸(″lys″)残基上。赖氨酸是否是暴露于表面，可以用任何已知的方法测定。通常，使用合适的计算机程序，进行亲水性分析(例如Kyte-Doolittle和Hoppe-Woods分析)和/或预测的表面形成区域分析(例如Emini surface-forming probability analysis)，这些计算机程序是本领域技术人员所知道的。合适的计算机程序包括PeptideStructure和类似程序。可选择性地，根据在光谱中特定功能基团的质子的化学迁移，NMR研究可以鉴定可表面接近的残基。在其他情况中，可以用荧光评测溶剂或环境能否可接触残基。在其他情况下，可接触的赖氨酸的表面暴露性可以利用与水溶性试剂例如三硝基苯磺酸酯或TNBS的化学活性和类似的测定方法确定。
[00280]在许多实施方案中，PEG是单甲氧基PEG分子(monomethoxy PEGmolecule)，其与IFN-α多肽上的伯胺基团反应。通过还原性烷基化作用，用单甲氧基PEG对多肽进行修饰的方法是本领域已知的。参见例如Chamow et al.(1994)Bioconj.Chem.5：133-140。
[00281]在许多实施方案中，PEG是单甲氧基PEG分子，其与IFN-α多肽上的伯胺基团反应。通过还原性烷基化作用，用单甲氧基PEG对多肽进行修饰的方法是本领域已知的。参见例如Chamow et al.(1994)Bioconj.Chem.5：133-140。
[00282]在一个非限制性实施例中，PEG通过SPA连接基团连接到IFN-α。PEG的SPA酯和制备它们的方法描述于美国专利5,672,662中。SPA连接物使得能够连接到IFN-α多肽上的游离胺基团上。
[00283]例如，PEG分子通过连接(linkage)被共价结合，所述连接包括PEG部分的丙酰基基团和IFN-α多肽中的表面暴露的赖氨酸残基的ε氨基基团之间的酰胺键。此种键可以例如通过PEG(mPEGspa)的α-甲氧基、Ω丙酸活性酯的缩合作用而形成。
[00284]在一些实施方案中，PEG化的IFN-α是单PEG化的IFN-α。在其他实施方案中，单PEG化的IFN-α是IFN-α多肽通过IFN-α多肽的赖氨酸残基或N-末端氨基酸残基共价连接到单个PEG部分而形成。在其他实施方案中，单PEG化的IFN-α是这样一种IFN-α多肽，其通过IFN-α多肽的赖氨酸残基的ε-氨基基团或α-氨基基团与PEG部分的活化羧基之间的酰胺键，共价连接到单个PEG部分。在其他实施方案中，单PEG化的IFN-α是共价连接到单个线型PEG分子的IFN-α多肽。在其他实施方案中，单PEG化的IFN-α是共价连接到单个、线型的30kD PEG部分的IFN-α多肽。在其他实施方案中，单PEG化的IFN-α是这样一种IFN-α多肽，其通过IFN-α多肽的赖氨酸残基的ε-氨基基团或α-氨基基团和PEG部分的活化羧基基团之间的酰胺键，共价连接到单个、线型的30kD PEG分子。在其他实施方案中，单PEG化的IFN-a是这样的IFN-α多肽，其通过IFN-α多肽的赖氨酸残基的ε-氨基基团或α-氨基基团和PEG部分的活化丙酰基基团之间的酰胺键，共价连接到单个、线型30kD PEG。在其他实施方案中，单PEG化的IFN-α是共价连接到单个、线型的单甲氧基-PEG(mPEG)的IFN-α多肽。在其他实施方案中，单PEG化的IFN-α是IFN-α多肽和线型的琥珀酰亚胺基丙酸酯酯活化的30kD mPEG之间缩合反应的产物。在任何前述使用PEG化的IFN-α的方法中，IFN-α多肽可以是杂合干扰素(CIFN)多肽。在任何前述使用PEG化的IFN-α的方法中，IFN-α多肽可以是CIFN多肽，CIFN多肽是干扰素alfacon-1。
[00285]在一些实施方案中，PEG化的IFN-α包括在赖氨酸残基的ε氨基基团处发生PEG化的CIFN。
[00286]作为一个非限制性例子，本文中优选使用的单PEG化的CIFN偶联物具有约30kD的PEG分子，该PEG分子通过共价连接结合到CIFN多肽，其中所述共价连接是PEG部分的丙酰基基团和CIFN多肽中表面暴露的赖氨酸残基的ε氨基基团之间的酰胺键，其中表面暴露的赖氨酸残基选自lys31、lys50、lys71、lys84、lys121、lys122、lys134、lys135和lys165，酰胺键通过α-甲氧基，PEG的Ω丙酸活化酯的缩合作用而形成。
聚乙二醇
[00287]适合于结合到IFN-α多肽的聚乙二醇在室温中可溶于水，并且具有通式R(O-CH2-CH2)nO-R，其中R是氢或保护性基团诸如烷基或烷醇基团，其中n是1至1000的整数。当R是保护基团时，它通常具有1至8个碳。
[00288]在许多实施方案中，PEG具有至少一个羟基，例如末端羟基基团，该羟基基团被修饰，以产生可与氨基基团反应的功能基团，所述氨基基团例如多肽的赖氨酸残基的ε氨基基团，在多肽N-末端的自由氨基基团，或任何氨基基团诸如天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸和组氨酸的氨基基团。
[00289]在其他实施方案中，PEG被衍生化，这样它与IFN-α多肽中的游离羧基基团反应，游离羧基例如在IFN-α多肽羧基末端的自由羧基。与IFN-α羧基末端上的自由羧基反应的合适的PEG衍生物包括但不限于PEG的PEG胺和肼衍生物(例如PEG-NH-NH2)。
[00290]在其他实施方案中，PEG被衍生化，这样它包括末端硫代羧酸基团，-COSH，其选择性与氨基基团反应，产生酰胺衍生物。由于硫取代酸(thoi acid)的反应特质，相对于其他氨基基团获得了对某些氨基基团的选择性。例如，在合适的pH条件下，在与N-末端氨基的反应中，-SH显示出足够的离去基团能力，这样赖氨酸残基中的ε-氨基被质子化并保持非亲核性。另一方面，在合适的pH条件下进行的反应可以使得一些可接触的赖氨酸残基进行选择性反应。
[00291]在其他实施方案中，PEG在PEG链的末端包括活性酯，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxy succinimidate)。此种含N-羟基琥珀酰亚胺酯的PEG分子在特定的pH条件下诸如中性6.5-7.5下与选定的氨基反应。例如，N-末端氨基可以在中性pH条件下被选择性修饰。然而，如果试剂的活性极大，赖氨酸的可接触的NH2基团也可以反应。
[00292]PEG可以直接结合到IFN-α多肽，或通过连接物结合到IFN-α多肽。在一些实施方案中，连接物被加到IFN-α多肽，形成经连接物修饰的IFN-α多肽。此种连接物提供了各种功能基团，例如活性基团诸如巯基、氨基或羧基基团，以便将PEG试剂偶联到经连接物修饰的IFN-α多肽上。
[00293]在一些实施方案中，结合到IFN-α多肽的PEG是线型的。在其他实施方案中，结合到IFN-α多肽的PEG是支链化的。支链化的PEG衍生物，诸如那些描述在美国专利5,643,575中的PEG衍生物，和“星型-PEG′s”和多臂(multi-armed)PEG′s，诸如描述在Shearwater Polymers，Inc.catalog″Polyethylene GlycolDerivatives 1997-1998.″中的PEG衍生物。星型PEGs在本领域中被描述，包括例如在美国专利6,046,305中。
[00294]通常使用分子量在约2kDa至约100kDa范围内的PEG，其中，在谈及PEG时，术语“约”表示在聚乙二醇的制剂中，一些分子的分子量会比指出的分子量大，一些比指出的分子量小。例如，适合于结合到IFN-α的PEG的分子量为约2kDa至约5kDa、约5kDa至约10kDa、约10kDa至约15kDa、约15kDa至约20kDa、约20kDa至约25kDa、约25kDa至约30kDa、约30kDa至约40kDa、约40kDa至约50kDa、约50kDa至约60kDa、约60kDa至约70kDa、约70kDa至约80kDa、约80kDa至约90kDa、或约90kDa至约100kDa。
制备PEG-IFN-α结合物
[00295]如上所述，PEG部分可以直接或通过连接物附着到内部N-末端氨基酸残基上或附近，或IFN-α多肽的C-末端或附近。接合可以在溶液或固相中进行。
N-末端连接
[00296]将PEG部分附着到IFN-α多肽的N-末端或附近的氨基酸残基上的方法是本领域已知的。参见例如美国专利5,985,265。
[00297]在一些实施方案中，使用已知的用于选择性获得N-末端化学修饰的IFN-α的方法。例如，可以使用通过还原性烷基化作用进行蛋白质修饰的方法，该方法利用了在特定的蛋白质中可用于进行衍生化作用的不同类型的伯胺基团(赖氨酸的，N-末端的)的差异性活性。在合适的反应条件下，实现蛋白质的基本上具有选择性的衍生化作用，在N-末端带上含有聚合物的羰基基团。反应在一定的pH中进行，该pH使得反应能够利用赖氨酸残基的ε-氨基和蛋白质的N-末端残基的α-氨基之间的pKa差异。通过此种选择性衍生化作用，PEG分子附着到IFN-α的反应得到控制：与聚合物的结合主要发生在IFN-α的N-末端，而其他活性基团，诸如赖氨酸侧链氨基没有发生明显的修饰。
C-末端连接
[00298]N-末端特异性偶联方法，诸如描述在美国专利5,985,265中的方法主要提供单PEG化的产物。然而，以除去过量的试剂和少量多重PEG化产物为目标的纯化程序去除了N-末端封闭多肽。就治疗而言，这样的程序导致生产成本大大增加。例如，充分表征的InfergenAlfacon-1 CIFN多肽氨基酸序列的结构的检测显示，剪辑(clipping)在羧基末端为约5％，因此只有一个主要的C-末端序列。因此，在一些实施方案中，不使用N-末端PEG化的IFN-α；相反，IFN-α多肽在C-末端进行PEG化。
[00299]用于获得单PEG化的Infergen产物的有效的合成以及治疗方法可以如下：
[00300]制备出对C-末端有选择性的PEG试剂，其带有间隔子或不带间隔子。例如，在一个末端修饰为甲基酯并在另一端具有氨基功能的聚乙二醇可以用作起始材料。
[00301]可以制备或获得水溶性碳二亚胺作为缩合剂(condensing agent)。IFN-α(例如InfergenAlfacon-1 CIFN或杂合干扰素)与作为缩合剂的水溶性碳二亚胺的偶合，通常在含有合适缓冲液体系的含水介质中进行，所述含水介质具有有助于形成酰胺键(amide linkage)的最佳pH。高分子量的PEG可以以共价方式加入到蛋白质中，以增加分子量。
[00302]试剂的选择将取决于过程最优化研究(process optimization studies)。合适试剂的非限制性例子是EDAC或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。EDAC的水溶性特性允许其能够直接加入到反应中，而无需预先溶于有机溶剂。过量的试剂和作为交联反应的副产物产生的异脲都是水溶性的，并且可以通过透析或凝胶过滤的方法容易地除去。制备EDAC的浓缩水溶液，以有助于将小摩尔量的物质加入到反应中。考虑到试剂的水不稳定性，可以制备贮存液，并即刻使用。文献中的大部分合成方案都建议，最佳的反应介质的pH在4.7至6.0之间的范围内。然而，缩合反应确实能在最高达pH 7.5的条件中进行，而产量不会有重大损失。水可以用作溶剂。根据Infergen预期的用途，优选介质可以是2-(N-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液，该缓冲液预先滴定到pH在4.7至6.0之间。然而，如果考虑到产物是在同样的缓冲液中，也可以使用pH 7-7.5的0.1M磷酸盐。将PEG胺与IFN-α分子的比率最优化，这样C-末端羧基残基选择性地进行PEG化，产生单PEG化的衍生物。
[00303]尽管在上面以名字或结构的形式提及了PEG胺的用途，但此种衍生物只是示范性的，也使用其他基团，诸如PEG-NH-NH2形式的肼衍生物，其也将与IFN-α蛋白质的羧基基团缩合。除了水相外，反应也可以在固相中进行。聚乙二醇可以选自分子量在300-40000范围内的一系列化合物。各种聚乙二醇的选择也将由纯化的衍生物的体外和体内偶联效率和生物学性能，即循环时间和抗病毒活性等决定。
[00304]此外，合适的间隔物可以加入到蛋白质的C-末端。间隔物可以具有活性基团，诸如SH、NH2或COOH，以便与合适的PEG试剂偶联，给出高分子量的IFN-α衍生物。可以设计组合固/液相(combined solid/solution phase)方法，用于制备C-末端PEG化的干扰素。例如，使用Gly-Gly-Cys-NH2间隔物，IFN-α的C-末端在固相上延伸，然后使用具有合适分子量的活化的二硫吡啶基-PEG试剂，在溶液中进行单PEG化作用。因为在C-末端的偶联作用独立于N-末端的封闭作用，从成本角度考虑，预想的方法和产物将是有益的(与N-末端PEG化方法相比，三分之一的蛋白质未被浪费)，并且对发展出治疗慢性肝炎C感染、肝纤维化等的经济疗法具有贡献。
[00305]在分子的其他地方可以具有更具活性的氨基酸残基羧基基团，该羧基基团与PEG试剂反应，导致在那个位置发生单PEG作用，或者导致在除了IFN-α的C-末端COOH基团之外的位置发生多PEG作用。可以预见，由于在分子的C-末端的空间自由度(steric freedom)，以及碳二亚胺和PEG试剂诸如在支链分子中所赋予的位阻的缘故，这些反应最好最小化。因此，对于Infergen和类似的此类蛋白质，无论是天然的还是宿主细胞中表达的，它都是优选的PEG修饰模式，这些蛋白可以具有不同程度的封闭的N-末端，从而提高效率并保持更高的体内生物学活性。
[00306]实现C-末端PEG化作用的另一种方法描述于下。使用位阻试剂(stericallyhindered reagent)，实现选择性地进行C-末端PEG化作用，该位阻试剂排除了埋在螺旋中或在IFN-α.内部的羧基残基上的反应。例如，一种这样的试剂可以是分子量为～40kd的支链PEG，并且该试剂可以用下述方法合成：
[00307]OH3C-(CH2CH2O)n-CH2CH2NH2+谷氨酸，即HOCO-CH2CH2CH(NH2)-COOH，与合适的试剂例如二环己基碳二亚胺或水溶性EDC缩合，从而得到支链PEG试剂，OH3C-(CH2CH2O)n-CH2CH2NHCOCH(NH2)CH2OCH3-(CH2CH2O)n-CH2CH2NHCOCH2。
Figure A20048001972000631
[00308]该试剂可以过量使用，以将氨基和IFN-α的游离的和柔性的羧基基团偶联，形成肽键。
[00309]如果需要，使用任何已知的方法，包括但不限于离子交换层析、大小排阻层析和它们的组合方法，将PEG化的IFN-α与未PEG化的IFN-α分离开来。例如，当PEG-IFN-α结合物是单PEG化的IFN-α时，产物首先用离子交换层析分离，获得具有单PEG化物质的电荷特征的物质(具有同样的表观电荷(apparent charge)的其他多PEG化的物质可以存在)，然后，单PEG化的物质用大小排阻层析分离。
IFN-α的混合群体(Mixed populations)
[00310]在一些实施方案中，被施用的IFN-α是一群IFN-α多肽，包括PEG化的IFN-α多肽和非PEG化的IFN-α多肽。通常，PEG化的IFN-α代表了群体中的全部IFNα多肽分子的约0.5％至约99.5％，例如特定的PEG化的IFN-α在群体中代表了全部IFNa多肽分子的约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％、或约99.5％。
IFN-β
[00311]术语干扰素-β(“IFN-β”)包括天然存在的IFN-β多肽；非天然存在的IFN-β多肽；和天然存在的或非天然存在的IFN-β的类似物和变体，所述类似物和变体保留原天然存在的或非天然存在的IFN-β的抗病毒活性。
[00312]许多β干扰素都可以用于目标联合疗法。合适的β干扰素包括但不限于天然存在的IFN-β；IFN-β1a，例如Avonex(Biogen，Inc.)和Rebif(Serono，SA)；IFN-β1b(Betaseron；Berlex)；和类似物。
[00313]IFN-β制剂可以包括N-封闭的种类，其中，N-末端氨基酸用酰基基团酰化，酰基基团诸如甲酰基基团、乙酰基、丙二酰基团和类似基团。也适用的是杂合IFN-β。
[00314]IFN-β多肽可以用任何已知的方法产生。可以用标准的方法合成编码IFN-β的DNA序列。在许多实施方案中，IFN-β多肽是转化或转染入细菌宿主例如大肠杆菌或真核生物宿主细胞(例如酵母；哺乳动物细胞，诸如CHO细胞；和类似细胞)中的人造DNA序列的表达产物。在这些实施方案中，IFN-β是“重组IFN-β”。当宿主细胞是细菌宿主细胞时，IFN-β被修饰，以包括N-末端甲硫氨酸。
[00315]应该理解，本文中描述的IFN-β可以包括一个或多个修饰的氨基酸残基，所述修饰例如糖基化作用、化学修饰和类似修饰。
IFN-tau
[00316]术语干扰素-tau包括天然存在的IFN-tau多肽；非天然存在的IFN-tau多肽；和天然存在的或非天然存在的IFN-tau的类似物和变体，其保留原天然存在的或非天然存在的IFN-tau的抗病毒活性。
[00317]合适的tau干扰素包括但不限于天然存在的IFN-tau；Tauferon(PepgenCorp.)；和类似物。
[00318]IFN-tau可以包括GenBank登记号P15696；P56828；P56832；P56829；P56831；Q29429；Q28595；Q28594；S08072；Q08071；Q08070；Q08053；P56830；P28169；P28172和P28171中任一一个描述的氨基酸序列。任何已知的IFN-tau多肽的序列可以用本领域已知的各种方法改变，以在序列中产生目标变化。变体多肽通常将与本文中提供的序列基本上相似，也就是说差异至少一个氨基酸，可以差异至少两个氨基酸，但不超过十个氨基酸。序列变化可以是置换、插入或剔除。保守的氨基酸置换通常包括下述各组内的置换：(甘氨酸，丙氨酸)；(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)；(天冬氨酸、谷氨酸)；(天冬酰胺、谷氨酰胺)；(丝氨酸、苏氨酸)；(赖氨酸、精氨酸)；或(苯丙氨酸、酪氨酸)。
[00319]感兴趣的修饰可以涉及一级氨基酸序列的改变或不涉及一级氨基酸序列的改变，这样的修饰包括多肽的化学衍生化作用，例如乙酰化作用，或羧化作用；可导入或去除糖基化位点的氨基酸序列变化；使得蛋白质容易被PEG化的氨基酸序列变化；和类似修饰。也包括对糖基化作用进行修饰，例如那些通过在多肽合成和加工或进一步的加工步骤中对多肽的糖基化型式进行修饰而实现的糖基化修饰；例如通过将多肽暴露给酶而实现的修饰，这些酶影响糖基化作用，诸如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。也包括了具有磷酸化的氨基酸残基的序列，磷酸化的氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
[00320]IFN-tau制剂可以包括N-末端封闭的种类，其中N-末端氨基酸用酰基基团酰化，酰基基团诸如甲酰基基团、乙酰基、丙二酰基团和类似物。也适用的是杂合IFN-tau。
[00321]IFN-tau多肽可以由任何已知的方法产生。编码IFN-tau的DNA序列可以用标准的方法合成。在许多实施方案中，IFN-tau多肽是人工DNA序列的表达产物，这些人工DNA序列转化或转染入细菌宿主，例如大肠杆菌，或真核生物宿主细胞(例如酵母；哺乳动物细胞诸如CHO细胞和类似细胞)。在这些实施方案中，IFN-tau是“重组IFN-tau”。当宿主细胞是细菌宿主细胞，IFN-tau被修饰以包含N-末端甲硫氨酸。
[00322]应该理解，本文中描述的IFN-tau可以包括一个或多个修饰的氨基酸残基，所述修饰例如糖基化作用、化学修饰和类似修饰。
IFN-ω
[00323]术语干扰素-ω(″IFN-ω″)包括天然存在的IFN-ω多肽；非天然存在的IFN-ω多肽；天然存在的或非天然存在的IFN-ω的类似物和变体，这些类似物和变体保留原天然存在或非天然存在的IFN-ω的抗病毒活性。
[00324]任何已知的ω干扰素可以用于目标联合治疗方法中。合适的IFN-ω包括但不限于天然存在的IFN-ω；重组IFN-ω，例如Biomed 510(BioMedicines)和类似物。
[00325]IFN-ω可以包括GenBank登记号NP_002168或AAA70091中阐述的氨基酸序列。任何已知的IFN-ω多肽的序列可以用各种本领域已知的方法改变，以在序列中产生目标变化。变体多肽通常将与本文中提供的序列基本上类似，即差异至少一个氨基酸，可以差异至少两个氨基酸，但不超过十个氨基酸。序列变化可以是置换、插入或剔除。保守的氨基酸置换通常包括下述各组中的置换：(工甘氨酸、丙氨酸)；(缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)；(天冬氨酸、谷氨酸)；(天冬酰胺、谷氨酰胺)；(丝氨酸、苏氨酸)；(赖氨酸、精氨酸)；或(苯丙氨酸、酪氨酸)。
[00326]感兴趣的修饰可以涉及一级氨基酸序列的改变或不涉及一级氨基酸序列的改变，这样的修饰包括多肽的化学衍生化作用，例如乙酰化作用，或羧化作用；可导入或去除糖基化位点的氨基酸序列变化；使得蛋白质容易被PEG化的氨基酸序列变化；和类似修饰。也包括对糖基化作用进行修饰，例如那些通过在多肽合成和加工或进一步的加工步骤中对多肽的糖基化型式进行修饰而实现的糖基化修饰；例如通过将多肽暴露给酶而实现的修饰，这些酶影响糖基化作用，诸如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。也包括了具有磷酸化的氨基酸残基的序列，磷酸化的氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
[00327]IFN-ω制剂可以包括N-封闭的种类，其中N-末端氨基酸用酰基基团酰化，酰基基团诸如甲酰基基团、乙酰基、丙二酰基团和类似物。也适用的是杂合IFN-ω。
[00328]IFN-ω多肽可以由任何已知的方法产生。编码IFN-ω的DNA序列可以用标准的方法合成。在许多实施方案中，IFN-ω多肽是人工DNA序列的表达产物，这些人工DNA序列转化或转染入细菌宿主，例如大肠杆菌，或真核生物宿主细胞(例如酵母；哺乳动物细胞诸如CHO细胞和类似细胞)。在这些实施方案中，IFN-ω是“重组IFN-ω”。当宿主细胞是细菌宿主细胞，IFN-ω被修饰以包含N-末端甲硫氨酸。
[00329]应该理解，本文中描述的IFN-ω可以包括一个或多个修饰的氨基酸残基，所述修饰例如糖基化作用、化学修饰和类似修饰。
II型干扰素受体激动剂
[00330]II型干扰素受体激动剂包括任何天然存在的或非天然存在的人II型干扰素受体配体，其结合于受体结合并通过该受体引起信号转导。II型干扰素受体激动剂包括干扰素，包括天然存在的干扰素、修饰的干扰素、合成的干扰素、聚乙二醇化的干扰素、包含干扰素和异源蛋白的融合蛋白、重排干扰素；对干扰素受体具有特异性的抗体；非肽类化学激动剂；和类似物。
[00331]II型干扰素受体激动剂的具体例子是IFN-γ和其变体。尽管本发明举例的是干扰素-γ多肽的应用，但显而易见地是，任何II型干扰素受体激动剂都可以用于目标方法。
干扰素-γ
[00332]编码IFN-γ多肽的核酸序列可以从公共数据库获得，例如从Genbank、期刊出版物等获得。尽管各种哺乳动物IFN-γ多肽都有意义，对于治疗人类疾病，通常使用人的蛋白质。人IFN-γ编码序列可以参见Genbank登记号X13274；V00543和NM 000619。相应的基因组序列可以参见Genbank登记号J00219；M37265和V00536。参见例如Gray et al.(1982)Nature 295：501(Genbank X13274)和Rinderknecht et al.(1984)J.B.C.259：6790。
[00333]干扰素-γ1b(Actimmune；人干扰素)是140个氨基酸的单链多肽。它在大肠杆菌中重组产生，并且是未糖基化的。参见Rinderknecht et al.(1984)J.Biol.Chem.259：6790-6797。如美国专利6,497,871中描述的重组IFN-γ也适用于本文的用途。
[00334]被用于本发明方法的IFN-γ可以是任何天然干扰素-γ、重组干扰素-γ和它们的衍生物，只要它们具有IFN-γ活性就可以，特别是人干扰素-γ活性。人干扰素-γ展示出干扰素的抗病毒和抗增殖性质特征，以及许多其它免疫调节活性，这些是本领域所知道的。尽管IFN-γ是基于上面提供的序列，但蛋白的产生过程和蛋白水解加工能够产生它的加工变体。Gray et al.，supra提供的未经加工的序列由166个氨基酸(aa)组成。尽管在大肠杆菌中产生的重组IFN-γ最初被认为是146个氨基酸(从氨基酸20开始)，但随后发现，天然的人IFN-γ在残基23之后被切割，产生143个氨基酸的蛋白质，或144个氨基酸，如果末端甲硫氨酸存在的话，末端甲硫氨酸是对于在细菌中的表达所必需的。纯化期间，成熟蛋白质可以在C末端残基162后另外进行切割(参考Gray et al.序列)，产生139个氨基酸的蛋白质，或140个氨基酸的蛋白质，如果起始甲硫氨酸存在的话，起始甲硫氨酸例如是对于在细菌中的表达所必需的。N-末端甲硫氨酸是由mRNA翻译“起始”信号AUG编码的人工产物，在特定的大肠杆菌表达的例子中，N-末端甲硫氨酸未被加工去掉。在其他微生物系统或真核动物表达系统中，可以除去甲硫氨酸。
[00335]对于在目标方法中的应用，可以使用任何天然的IFN-γ肽、它的修饰体和变体，或一种或多种肽的组合。感兴趣的干扰素-γ肽包括片段，并且可以相对于全长序列在羧基末端以各种方式进行截短。只要氨基酸24至约149(按未加工的多肽的残基来计数)存在就可以，这样的片段继续展示出人γ干扰素的特征性特性。外源序列可以置换氨基酸155之后的氨基酸序列，而不失去活性。参见例如美国专利5,690,925。天然IFN-γ部分(moieties)包括由氨基酸残基24-150；24-151，24-152；24-153，24-155和24-157延伸开来的各种分子。具有IFN-γ活性的本领域已知的这些变体以及其它变体中的任何一种都可以用于本方法。
[00336]IFN-γ多肽的序列可以用本领域已知的各种方法改变，以在序列中产生目标变化。变体多肽通常将与本文中提供的序列基本上类似，即差异至少一个氨基酸，可以差异至少两个氨基酸，但差异不超过十个氨基酸。序列变化可以是置换、插入或剔除。系统性地引入丙氨酸或其他残基的扫描突变(scanning mutations)，可以用来确定关键的氨基酸。特定的感兴趣的氨基酸置换包括保守性和非保守性变化。保守的氨基酸置换通常包括下述各组中的置换：(甘氨酸，丙氨酸)；(缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸)；(天冬氨酸，谷氨酸)；(天冬酰胺，谷氨酰胺)；(丝氨酸，苏氨酸)；(赖氨酸，精氨酸)；或(苯丙氨酸，酪氨酸)。
[00337]可以改变或不必改变一级氨基酸序列的感兴趣的修饰包括对多肽进行的化学衍生化作用，例如乙酰化作用或羧化作用；引入或除去糖基化位点的氨基酸序列变化；使得蛋白质容易被PEG化的氨基酸序列变化；和类似修饰。在一种实施方案中，本发明考虑使用具有一个或多个非天然存在的糖基化位点和/或聚乙二醇化位点的IFN-γ变体，这些位点通过工程化加工被导入干扰素-γ变体，从而提供血清清除率降低的糖基衍生化和/或PEG衍生化多肽，诸如描述于国际专利公开号WO 01/36001和WO 02/081507的IFN-γ多肽变体。也包括糖基化作用的修饰，例如那些通过在合成和加工或进一步的加工步骤中对多肽的糖基化型式进行修饰而实现的糖基化作用修饰；例如通过将多肽暴露给酶而进行的修饰，这些酶影响糖基化作用，诸如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。也包括了具有磷酸化的氨基酸残基的序列，磷酸化的氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
[00338]也可用于目标发明的包括已用常见的化学技术修饰过的IFN-γ多肽，所述的修饰是为了改善它们对蛋白水解降解的抗性、优化溶解性质或使得它们更适合用作治疗剂。例如，肽的主架可以被环化以增加稳定性(参见Friedler et al.(2000)J.BioL.Chem.275：23783-23789)。可以使用类似物，其包括除了天然存在的L-氨基酸之外的残基，诸如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸。蛋白质可以聚乙二醇化以增加稳定性。
[00339]多肽可以通过重组方法，使用本领域已知的常规方法，体外合成制备而得，或可以从经诱导而产生该蛋白质的细胞或自然产生该蛋白质的细胞分离得到。特定的序列和制备方式将由期望的操作便利性、经济性和纯度以及类似要求来确定。如果需要，可以在合成或表达期间，将各种基团引入多肽，以便它能够连接到其他分子或表面。因此，半胱氨酸可以用来制备硫醚，组氨酸可以用来连接金属离子复合物，羧基基团可以用来形成酰胺或酯，氨基可以用来形成酰胺，以及类似情况。
[00340]也可以根据重组合成这样的常规方法来分离和纯化多肽。裂解物由表达宿主制备，并且裂解物用HPLC、排阻层析、凝胶电泳、亲合层析或其他纯化技术纯化。对于大部分而言，相对于与产物的制备方法和纯化方法有关的污染物，被使用的组合物按重量计将包括至少20％的期望产物，更通常地按重量计包括至少约75％的期望产物，优选按重量计至少约95％的期望产物，对于治疗用途，通常按重量计包括至少约99.5％的期望产物。通常，百分比是基于总蛋白来计算。
III型干扰素受体激动剂
[00341]在上述方法的任何方法中，干扰素受体激动剂在一些实施方案中是III型干扰素受体的激动剂(例如“III型干扰素激动剂”)。III型干扰素激动剂包括IL-28b多肽；和IL-28a多肽；和IL-29多肽；对III型干扰素受体具有特异性的抗体；和III型干扰素受体的任何其他激动剂，包括非多肽激动剂。
[00342]IL-28A、IL-28B和IL-29(本文中统称为″III型干扰素″或″III型IFN″)描述于Sheppard et al.(2003)Nature 4：63-68中。每个多肽都结合由IL-10受体β链和IL-28受体α组成的异源二聚体受体。参见Sheppard et al.(2003)，supra。IL-28A、IL-28B和IL-29的氨基酸序列分别参见GenBank登记号NP_742150、NP_742151和NP_742152。
[00343]III型IFN多肽的氨基酸序列可以用本领域已知的各种方法改变，以在序列中产生目标变化。变体多肽通常将与本文中提供的序列基本上类似，即差异至少一个氨基酸，并且可以差异至少两个氨基酸，但不超过十个氨基酸。序列变化可以是置换、插入或剔除。系统性地引入丙氨酸或其他残基的扫描突变，可以用于确定关键的氨基酸。特定的、感兴趣的氨基酸置换包括保守性和非保守性变化。保守的氨基酸置换通常包括下述各组中的置换：(甘氨酸，丙氨酸)；(缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸)；(天冬氨酸，谷氨酸)；(天冬酰胺，谷氨酰胺)；(丝氨酸，苏氨酸)；(赖氨酸，精氨酸)；或(苯丙氨酸，酪氨酸)。
[00344]感兴趣的修饰可以涉及一级氨基酸序列的改变或不涉及一级氨基酸序列的改变，这样的修饰包括多肽的化学衍生化作用，例如乙酰化作用，或羧化作用；可导入或去除糖基化位点的氨基酸序列变化；使得蛋白质容易被PEG化的氨基酸序列变化；和类似修饰。也包括对糖基化作用进行修饰，例如那些通过在多肽合成和加工或进一步的加工步骤中对多肽的糖基化型式进行修饰而实现的糖基化修饰；例如通过将多肽暴露给酶而实现的修饰，这些酶影响糖基化作用，诸如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。也包括了具有磷酸化的氨基酸残基的序列，磷酸化的氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸。
[00345]也用于目标发明的包括已用常见的化学技术修饰过的多肽，修饰是为了改善它们对蛋白水解降解的抗性、优化溶解特性，或使得它们更适合用作治疗剂。例如，肽的主架可以被环化以增加稳定性(参见Friedler et al.(2000)J.BioL.Chem.275：23783-23789)。可以使用包含除了天然存在的L-氨基酸之外的残基诸如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸的类似物。蛋白质可以聚乙二醇化以增加稳定性。
多肽可以融合到白蛋白。
[00346]多肽可以通过重组方法，使用本领域已知的常规方法，体外合成制备而得，或可以从经诱导而产生该蛋白质的细胞或自然产生该蛋白质的细胞分离得到。特定的序列和制备方式将由期望的操作便利性、经济性和纯度以及类似要求来确定。如果需要，可以在合成或表达期间，将各种基团引入多肽，以便它能够连接到其他分子或表面。因此，半胱氨酸可以用来制备硫醚，组氨酸可以用来连接金属离子复合物，羧基基团可以用来形成酰胺或酯，氨基可以用来形成酰胺，以及类似情况。
吡非尼酮和其类似物
[00347]一些实施方案中，吡非尼酮(5-甲基-1-苯基-2-(1H)-吡啶酮)和特定的吡非尼酮类似物被应用于目标组合治疗中。
                               吡非尼酮
Figure A20048001972000701
                             吡非尼酮类似物
Figure A20048001972000702
取代物R1、R2、X的描述
[00348]R1：碳环取代物(饱和的和未饱和的)、杂环取代物(饱和的或未饱和的)、烷基取代物(饱和的和未饱和的)。例子包括苯基、苄基、嘧啶基、萘基、吲哚基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、环己基、哌啶基、吡咯啉基、吗啉基、环己烯基、丁二烯基、和类似物。
[00349]R1还可以包括在碳环或杂环部分上带有取代物的取代基，所述取代物诸如卤素、硝基、氨基、羟基、烷氧基、羧基、腈基、硫、烷基、芳基、杂烷基、杂芳基和其组合，例如4-硝基苯基、3-氯苯基、2，5-二硝基苯基、4-甲氧基苯基、5-甲基-吡咯基、2，5-二氯环己基、胍基-环己烯基和类似物。
[00350]R2：烷基、碳环、芳基、杂环。例子包括：甲基、乙基、丙基、异丙基、苯基、4-硝基苯基、噻吩基和类似物。
[00351]X：可以是碳环或杂环上任何数目(1至3个)的取代基。取代基可以是相同的或不同的。取代基可以包括氢、烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、卤素、硝基、羧基、羟基、腈基、氨基、硫、烷基氨基、卤代芳基和类似物。
[00352]所述取代基还可以任意地用1-3个取代物进一步取代，这些取代物来自烷基、芳基、硝基、烷氧基、羟基和卤素基团。例子包括：甲基、2，3-二甲基、苯基、p-甲苯基、4-氯苯基、4-硝基苯基、2，5-二氯苯基、呋喃基、噻吩基和类似物。
[00353]具体的例子包括表1中示出的那些：
                                            表1
IA             p                                                  IIB
  5-甲基-1-(2′-吡啶基)-2-(1H)吡啶，   6-甲基-1-苯基-3-(1H)吡啶酮，
  6-甲基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮，   5-甲基-1-p-甲苯基-3-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-3-苯基-1-(2′-噻吩基)-2-(1H)吡啶酮，   5-甲基-1-(2′-萘基)-3-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-(2′-萘基)-2-(1H)吡啶酮，   5-甲基-1-苯基-3-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-p-甲苯基-2-(1H)吡啶酮，   5-甲基-1-(5′-喹啉基)-3-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-(1′萘基)-2-(1H)吡啶酮，   5-乙基-1-苯基-3-(1H)吡啶酮，
  5-乙基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮，   5-甲基-1-(4′-甲氧基苯基)-3-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-(5′-喹啉基)-2-(1H)吡啶酮，   4-甲基-1-苯基-3-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-(4′-喹啉基)-2-(1H)吡啶酮，   5-甲基-1-(3′-吡啶基)-3-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-(4′-吡啶基)-2-(1H)吡啶酮，   5-甲基-1-(2′-噻吩基)-3-(1H)吡啶酮，
  3-甲基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮，   5-甲基-1-(2′-吡啶基)-3-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-(4′-甲氧基苯基)-2-(1H)吡啶酮，   5-甲基-1-(2′-喹啉基)-3-(1H)吡啶酮，
  1-苯基-2-(1H)吡啶酮，   1-苯基-3-(1H)吡啶，
  1，3-二苯基-2-(1H)吡啶酮，   1-(2′-呋哺基)-5-甲基-3-(1H)吡啶酮，
  1，3-二苯基-5-甲基-2-(1H)吡啶酮，   1-(4′-氯苯基)-5-甲基-3-(1H)吡啶。
  5-甲基-1-(3′-三氟甲基苯基)-2-(1H)-吡啶酮，
  3-乙基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-(3′-吡啶基)-2-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-(3-硝基苯基)-2-(1H)吡啶酮，
  3-(4′-氯苯基)-5-甲基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-(2′-噻吩基)-2-(1H)吡啶酮，
  5-甲基-1-(2′-噻唑基)-2-(1H)吡啶酮，
  3，6-二甲基-1-苯基-2-(1H)吡啶酮，
  1-(4′氯苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮，
  1-(2′-咪唑基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮，
  1-(4′-硝基苯基)-2-(1H)吡啶酮，
  1-(2′-呋喃基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮，
  1-苯基-3-(4′-氯苯基)-2-(1H)吡啶
[00354]美国专利3,974,281；3,839,346；4,042,699；4,052,509；5,310,562；5,518,729；5,716,632和6,090,822描述了适用于本发明方法的药物组合物中的吡非尼酮和吡非尼酮类似物的合成以及制剂。
TNF拮抗剂
[00355]在一些实施方案中，目标方法涉及给予目标合成CXCR3配体和TNF拮抗剂。本文中使用的合适的TNF-α拮抗剂包括降低TNF-α合成水平的试剂，阻断或抑制TNF-α结合到TNF-α受体(TNFR)的试剂，和阻断或抑制TNFR介导的信号转导的试剂。除非另外清楚的表明，在本文中每次提及″TNF-α拮抗剂″或″TNF拮抗剂″时，将理解为指TNF-α拮抗剂，除了(i)吡非尼酮和吡非尼酮类似物和(ii)SAPK抑制剂。
[00356]如本文中所使用的，术语“TNF受体多肽”和“TNFR多肽”指源自TNFR(来自任何物种)的多肽，其能够结合TNF。已经描述了两种不同的细胞表面TNFR：II型TNFR(或p75TNFR或TNFR II)和I型TNFR(或p55 TNFR或TNFR I)。成熟的全长人p75 TNFR是糖蛋白，分子量约75-80千道尔顿(kD)。成熟的全长人p55TNFR是糖蛋白，分子量约55-60kD。示范性TNFR多肽是源自TNFR I型和/或TNFR II型。可溶性TNFR包括p75TNFR多肽；p75TNFR与异源融合伴侣的融合蛋白，例如与免疫球蛋白的Fc部分的融合蛋白。
[00357]TNFR多肽可以是完整的TNFR，或合适的TNFR片段。美国5,605,690给出了TNFR多肽的例子，包括可溶性TNFR多肽，其适用于本发明。在许多实施方案中，TNFR多肽包括TNFR的胞外结构域。在一些实施方案中，TNFR多肽是融合多肽，包括连接到免疫球蛋白分子的恒定区的TNFR胞外结构域。在其他实施方案中，TNFR多肽是融合多肽，包括连接到IgG1分子恒定区的p75 TNFR胞外结构域。在一些实施方案中，当考虑投药给人时，用于融合蛋白的Ig是人来源的，例如人IgG1。
[00358]单价和多价形式的TNFR多肽可以用于本发明。多价形式的TNFR多肽拥有一个以上的TNF结合位点。在一些实施方案中，TNFR是二价的，或二聚体形式的TNFR。例如，如美国专利5,605,690和Mohler et al.，1993，J.Immunol.，151：1548-1561中描述的，与TNFR胞外结构域形成的嵌合抗体多肽将为本发明提供TNFR多肽，所述TNFR胞外结构域取代了免疫球蛋白重链或轻链其中之一或两者的可变区域。通常，当这样的嵌合TNFR：抗体多肽由细胞产生时，它通过免疫球蛋白结构域之间的二硫键形成二价分子。这样的嵌合TNFR：抗体多肽被称作TNFR：Fc。
[00359]在一种实施方案中，目标方法涉及给予有效数量的可溶性TNFRENBREL依那西普(etanercept)。ENBREL是二聚体融合蛋白，由连接到人IgG1的Fc部分的人75千道尔顿(p75)TNFR胞外配体结合部分组成。ENBREL的Fc组分含有CH2结构域、CH3结构域和铰链区，但是不含有IgG1的CH1结构域。ENBREL在中国仓鼠卵巢(CHO)哺乳动物细胞表达系统中产生。它由934个氨基酸组成，并具有约150千道尔顿的表观分子量。参见Smith et al.(1990)Science 248：1019-1023；Mohler et al.(1993)J.Immunol.151：1548-1561；美国专利5,395,760；和美国专利5,605,690。
[00360]也适用的是结合TNF-α的单克隆抗体。单克隆抗体包括“人源化的”鼠单克隆抗体；嵌合抗体；在氨基酸序列中含至少约80％、至少约90％、至少约95％或100％人氨基酸序列的单克隆抗体；和类似物。参见例如WO 90/10077；WO90/04036；和WO 92/02190。合适的单克隆抗体包括抗体片段，诸如Fv、F(ab′)2和Fab；合成抗体；人造抗体；噬菌体展示抗体(phage display antibodies)；和类似物。
[00361]合适的单克隆抗体的例子包括infliximab(REMICADE，Centocor)和adalimumab(HUMIRATM，Abbott)，REMICADE是嵌合单克隆抗TNF-α抗体，包括约25％的小鼠氨基酸序列和约75％的人氨基酸序列。REMICADE包括融合到人IgG1恒定区的鼠单克隆抗TNF-α抗体可变区。参见Elliott et al.(1993)ArthritisRheum.36：1681-1690；Elliott et al.(1994)Lancet 344：1105-1110；Baert et al.(1999)Gastroenterology 116：22-28。HUMIRATM是人全长IgG1单克隆抗体，其用噬菌体展示技术鉴定。参见Piascik(2003)J.Am.Pharm.Assoc.43：327-328。
[00362]评测TNF拮抗剂活性的方法是本领域已知的，并在本文中举例说明。例如，TNF拮抗剂活性可以用以细胞为基础的竞争性结合测定(cell-based competitivebinding assay)评测。用这种测定方法，放射性标记的TNF与一系列稀释的TNF拮抗剂和表达细胞膜结合TNFR的细胞混合。将悬浮液的一部分离心以分离游离的TNF和结合的TNF，并测定在游离和结合级分中的放射活性的量。通过在存在TNF拮抗剂的条件下，对TNF结合到细胞的抑制作用，测定TNF拮抗剂活性。
[00363]在另一例子中，使用对TNF的细胞毒性活性敏感的细胞作为目标细胞，可以在体外的生物学分析中，分析TNF拮抗剂中和(neutralize)TNF活性的能力。在此种分析方法中，用TNF培养的目标细胞用变化数量的TNF拮抗剂处理，并随后检测细胞裂解。利用在存在TNF拮抗剂的情况下，TNF诱导的目标细胞裂解的减少情况，评定TNF拮抗剂活性。
TGF-β拮抗剂
[00364]在一些实施方案中，目标方法涉及给予目标合成CXCR3配体和TGF-β拮抗剂。适用于目标治疗方法的TGF-β拮抗剂包括降低TGF-β合成水平的试剂、阻断或抑制TGF-β结合到TGF-β受体的试剂，和阻断或抑制TGF-β受体介导的信号转导的试剂。如本文中所使用的，术语″TGF-β″包括任何TGF-β亚型，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。合适的TGF-β拮抗剂包括但不限于对TGF-β具有特异性的抗体(包括对特定TGF-β亚型具有特异性的抗体；以及与一种或多种TGF-β亚型交叉反应(cross-reactive)的抗体)；TGF-β受体的抗体；可溶性TGF-β受体；decorin；抑制TGF-β信号传导的试剂。
[00365]合适的TGF-β拮抗剂包括对TGF-β具有特异性的抗体。对TGF-β具有特异性的抗体是本领域已知的。参见例如美国专利5,783,185；5,772,998；5,674,843；5,571,714；5,462,925和5,426,098；WO 97/13844；和美国专利公开号20030064069和20030091566。合适的抗TGF-β抗体的非限制性例子包括CAT-152(lerdelibumab，TrabioTM；Cambridge Antibody Technology)，人抗TGF-β2单克隆抗体；CAT-192(metelimumab；Cambridge Antibody Technology)，人抗TGF-β1单克隆抗体；和GC-1008(Genzyme Corp.)，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3的泛-特异性人单克隆抗体。
[00366]合适的TGF-β拮抗剂包括可溶性TGF-β受体。可溶性TGF-β受体通常缺少天然存在的TGF-β受体的跨膜部分的大部分或整个跨膜部分，这样蛋白质不具有膜结合性，但保留TGF-β结合特性。可溶性的TGF-β受体包括可溶性的融合蛋白，包括按阅读框架(in-frame)融合到异源(非TGF-β受体)蛋白(″融合伴侣″)的TGF-β受体的一部分。融合伴侣的非限制性例子是免疫球蛋白Fc、多组氨酸和类似物。可溶性TGF-β受体在本领域中已经被描述过。参见例如Wang et al.(1999)Thorax 54：805-812；George et al.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：12719-12724；Muraoka et al.(2002)J.Clin.Invest.109：1551-1559；和Yata et al.(2002)Hepatology35：1022-1030。
[00367]TGF-β拮抗剂包括GleevecTM。GleevecTM(也称为STI-571或CGP57148B)化学名为4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基-苯基]苯甲酰胺甲磺酸酯(benzamide methanesulfonate)，通常称为甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)，并以商标名GleevecTM出售。GleevecTM是2-苯基氨基嘧啶，其靶向Bcr-Abl酪氨酸激酶的激酶结构域的ATP结合位点。(参见例如Druker et al.(1996)Nature Med.2，561；和Buchdunger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：2558-2562)。
[00368]在某些实施方案中，试剂是嘧啶衍生物，如描述在美国专利5,521,184中，该专利的公开内容通过引用方式整体并入本文。在这些实施方案中，感兴趣的是式(I)的N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物：
Figure A20048001972000751
[00369]其中：
[00370]R1’是4-吡嗪基；1-甲基-1H-吡咯基；氨基-或氨基-低级烷基取代的苯基，其中在每一种情况中氨基是自由的、烷基化的或酰化的；1H-吲哚基或1H-咪唑基，其结合在五元环碳原子上；或未取代的或低级烷基取代的吡啶基，其结合在环的碳原子上，为未取代的或在氮原子处被氧取代。
R2’和R3’各自独立地是氢或低级烷基，
基团R4′，R5′，R6′，R7′和R8′中的一个或两个各自是硝基、氟取代的低级烷氧基或式(II)的基团：
[00371]-N(R9’)-C(＝X)-(Y)k-R10    (II)
[00372]其中，
[00373]R9’是氢或低级烷基，
[00374]X是氧、硫、亚氨基、N-低级烷基-亚氨基、肟基或O-低级烷基-肟基，
[00375]Y是氧或基团NH，
[00376]k是0或1，和
[00377]R10是具有至少5个碳原子的脂肪族基团，或芳香族、芳香族-脂肪族、脂环族、脂环族-脂肪族、杂环或杂环-脂肪族基团，
[00378]和剩余的基团R4′、R5′、R6′、R7′和R8′各自独立地是氢，低级烷基，其是未取代的或被自由的或烷基化的氨基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基取代或被吗啉基取代，或低级烷酰基，三氟甲基，自由、醚化或酯化的羟基，自由、烷基化或酰基化的氨基或自由或酯化的羧基。
[00379]和具有至少一个成盐基团(salt-forming group)的此类化合物的盐。
[00380]在这些实施方案中，
[00381]1-甲基-1H-吡咯基优选是1-甲基-1H-吡咯-2-基或1-甲基-1H-吡咯-3-基。
[00382]氨基-或氨基-低级烷基取代的苯基R1是在任何期望的位置(邻、间或对位)被取代的苯基，其中在每一种情况中，氨基是自由的、烷基化的或酰化的，其中烷基化氨基优选单-或二-低级烷基氨基，例如二甲基氨基，氨基-低级烷基的低级烷基部分优选线性C1-C3烷基，特别是诸如甲基或乙基。
[00383]结合在5元环的碳原子上的1H-吲哚基是1H-吲哚-2-基或1H-吲哚-3-基。
[00384]结合在环的碳原子上的未取代的或低级烷基取代的吡啶基，是低级烷基取代的——或优选是未取代的——2-或优选是3-或4-吡啶基，例如3-吡啶基、2-甲基-3-吡啶基、4-甲基-3-吡啶基或4-吡啶基。在氮原子位置被氧取代的吡啶基是从吡啶N-氧化物，即N-氧代-吡啶基，例如N-氧代-4-吡啶基衍生而来的基团。
[00385]氟取代的低级烷氧基是这样的低级烷氧基，其携带至少一个但是优选若干个氟取代基，特别是三氟甲氧基，或优选1，1，2，2-四氟-乙氧基。
[00386]当X是氧、硫、亚氨基、N-低级烷基-亚氨基、肟基或O-低级烷基-肟基时，基团C＝X按上述次序分别是自由基C＝O、C＝S、C＝N-H、C＝N-低级烷基、C＝N-OH或CN-O-低级烷基。X优选是氧。
[00387]k优选是0，也就是基团Y不存在。
[00388]如果存在，Y优选是基团NH。
[00389]术语″低级(lower)″在本文范围内表示具有最高7个包括7个碳原子的基团，优选最高4个并包括4个碳原子。
[00390]低级烷基R1′、R2′、R3′和R9′优选是甲基或乙基。
[00391]具有至少5个碳原子的脂肪族基团R10优选具有不超过22个碳原子，通常不超过10个碳原子，其为取代的或优选未取代的脂肪族烃基基团(hydrocarbonradical)，即，取代的或优选未取代的炔基、烯基或优选烷基，诸如C5-C7烷基，例如正戊基。芳香族基团R10具有最多20个碳原子，其是未取代的或取代的，例如是，未取代的或取代的萘基诸如2-萘基或优选地苯基，取代基优选选自氰基；未取代的或羟基、氨基或4-甲基哌嗪基取代的低级烷基，所述烷基诸如甲基、三氟甲基；自由的、醚化的或酯化的羟基；自由的、烷基化的或酰化的氨基或自由的或酯化的羧基。在芳香族-脂肪族基团R10中，芳香族部分如上限定，脂肪族部分优选是低级烷基，诸如特别是C1-C2烷基，其是取代的或优选未取代的，例如苄基。脂环族基团R10具有最多达30个碳原子、更经常地具有最多达20个碳原子、最常见地具有最多达10个碳原子，其是单环或多环的，是取代的或优选是未取代的，例如此类环烷基，尤其是此类5-或6-元环烷基，例如优选是环己基。在脂环族-脂肪族基团R10中，脂环族部分如上限定，脂肪族部分优选是低级烷基，诸如尤其是C1-C2烷基，其是取代的或优选是未取代的。杂环基团R10特别地含有最多20个碳原子，并且是优选具有5或6个环原子(ring member)和1-3个杂原子的饱和的或未饱和的单环基团，杂原子优选选自氮、氧和硫，特别地，例如噻吩基或2-、3-或4-吡啶基，或双环或三环基团，其中，例如，一个或两个苯基团稠合(融合)到所述单环基团上。在杂环-脂肪族自由基R10中，杂环如上限定，脂肪族部分优选低级烷基，例如尤其是C1-C2烷基，其是取代的或优选未取代的。
[00392]醚化的羟基优选是低级烷氧基。酯化的羟基优选是用有机羧酸诸如低级烷酸或无机酸诸如氢卤酸酯化的羟基，例如低级烷酰氧基或特别是卤素，诸如碘、溴或特别是氟或氯。
[00393]烷基化的氨基例如是低级烷基氨基，诸如甲基氨基或双-低级烷基氨基，诸如二甲基氨基。酰化的氨基例如是低级烷酰基氨基或苯酰基氨基。
[00394]酯化的羧基例如是低级烷氧基羰基，诸如甲氧基羰基。
[00395]取代的苯基基团可以最多携带5个取代基，诸如氟，但是在取代基相对较大的情况下，通常仅被1至3个取代基取代。特别提及的取代的苯基的例子是4-氯-苯基、五氟-苯基、2-羧基-苯基、2-甲氧基-苯基、4-氟苯基、4-氰基-苯基和4-甲基-苯基。
[00396]式(I)化合物中的成盐基团是具有碱性或酸性的基团或自由基。具有至少一个碱性基团或至少一个碱性自由基例如自由氨基、吡嗪基自由基或吡啶基自由基的化合物可以与例如无机酸形成酸加成盐(acid addition salts)，无机酸诸如盐酸、硫酸或磷酸；或与合适的有机羧酸或磺酸形成酸加成盐，合适的有机羧酸或磺酸诸如脂肪族单羧酸或二羧酸，诸如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、羟基顺丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或草酸，或氨基酸诸如精氨酸或赖氨酸，芳香族羧酸，诸如苯甲酸、2-苯氧基-苯甲酸、2-乙酸基苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸，芳香族-脂肪族羧酸，诸如扁桃酸或肉桂酸，杂芳族羧酸，诸如烟酸或异烟酸，脂肪族磺酸，诸如甲烷-、乙烷-或2-羟基乙烷-磺酸，或芳香族磺酸，例如苯磺酸、p-甲苯磺酸或萘-2-磺酸。当若干碱性基团存在时，可以形成单-或多酸加成盐。
[00397]具有酸性基团例如在基团R10中的自由羧基的式(I)化合物可以形成金属盐或铵盐，诸如碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐、镁盐或钙盐，或与氨或合适的有机胺形成胺盐，诸如叔单胺(tertiary monoamines)，例如三乙胺或三-(2-羟乙基)-胺，或涉及杂环碱，例如N-乙基哌啶或N，N′-二甲基-哌啶。具有酸性和碱性基团的式(I)化合物可以形成内盐。
[00398]在这些实施方案中，特别感兴趣的是嘧啶衍生物，其中，R1’是3-吡啶基，R2’、R3’、R5’、R6’和R8’各自是氢，R4’是甲基，R7’是式(II)的化合物，其中，R9’是氢，X是氧，k是0，和R10是4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]苯基。该化合物的甲磺酸盐具有化学名4-[(4-甲基-1-哌嗪基)甲基]-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基-苯基]苯甲酰胺甲磺酸酯，现在通常称为伊马替尼甲磺酸，并以商标GleevecTM出售。
内皮缩血管肽受体拮抗剂
[00399]在一些实施方案中，目标方法包括给予目标合成CXCR3配体和内皮缩血管肽受体拮抗剂。适用于本发明的内皮缩血管肽受体拮抗剂包括：降低内皮缩血管肽合成水平的试剂，阻断或抑制内皮缩血管肽结合到内皮缩血管肽受体的试剂，阻断或抑制内皮缩血管肽受体介导的信号转导的试剂。如本文中所使用的，术语“内皮缩血管肽拮抗剂”或“内皮缩血管肽受体拮抗剂”指：降低内皮缩血管肽合成水平的任何试剂，阻断或抑制内皮缩血管肽结合到内皮缩血管肽受体的任何试剂，阻断或抑制内皮缩血管肽受体介导的信号转导的任何试剂。
[00400]在一些实施方案中，内皮缩血管肽受体拮抗剂对内皮缩血管肽A(ETA)受体具有选择性。在一些实施方案中，内皮缩血管肽受体拮抗剂对内皮缩血管肽B(ETB)受体具有选择性。在其他实施方案中，内皮缩血管肽受体拮抗剂是ETA和ETB受体两者的拮抗剂。
[00401]用于本发明的内皮缩血管肽拮抗剂的具体例子包括但不限于：阿曲生坦(ABT-627；Abbott Laboratories)、VeletriTM(tezosentan；Actelion Pharmaceuticals，Ltd.)、sitaxsentan(ICOS-Texas Biotechnology)、enrasentan(GlaxoSmithKline)、达卢生坦(LU135252；Myogen)、BMS-207940(Bristol-Myers Squibb)，BMS-193884(Bristol-Myers Squibb)、BMS-182874(Bristol-Myers Squibb)、J-104132(Banyu Pharmaceutical)、VML 588/Ro 61-1790(Vanguard Medica)、T-0115(TanabeSeiyaku)、TAK-044(Takeda)、BQ-788(Banyu Pharmaceutical)、BQ123，YM-598(Yamanouchi Pharma)、PD 145065(Parke-Davis)、A-127722(AbbottLaboratories)、A-192621(Abbott Laboratories)、A-182086(Abbott Laboratories)、TBC3711(ICOS-Texas Biotechnology)、BSF208075(Myogen)、S-0139(Shionogi)、TBC2576(Texas Biotechnology)、TBC3214(Texas Biotechnology)、PD156707(Parke-Davis)、PD180988(Parke-Davis)、ABT-546(Abbott Laboratories)、ABT-627(Abbott Laboratories)、SB247083(GlaxoSmithKline)、SB209670(GlaxoSmithKline)；和本领域论述的内皮缩血管肽受体拮抗剂，例如Davenport and Battistini(2002)Clinical Science 103：15-35，Wu-Wong et al.(2002)Clinical Science 103：1075-1115和Luescher and Barton(2000)Circulation 102：2434-2440中论述的。
[00402]合适的内皮缩血管肽受体拮抗剂是TRACLEERTM(bosenta；ActelionPharmaceuticals，Ltd.制造)。TRACLEERTM是具有口服活性的双重内皮缩血管肽受体拮抗剂，其阻断内皮缩血管肽结合到它的两种受体，内皮缩血管肽受体A和内皮缩血管肽受体B。
[00403]TRACLEERTM属于一类高度取代的嘧啶衍生物，无手性中心。它化学命名为4-叔丁基-N-[6-(2-羟基-乙氧基)-5-(2-甲氧基-苯氧基)-[2，2’]-双嘧啶-4-基]-苯磺酰胺一水合物，并具有下述结构式：
Figure A20048001972000801
[00404]在一些实施方案中，TRACLEERTM治疗以62.5mg的剂量口服给药4周，然后剂量维持在125mg的剂量，口服一日2次。
SAPK抑制剂
[00405]适用于目标联合疗法的应激激活蛋白激酶(SAPK)抑制剂是不同于吡非尼酮或吡非尼酮类似物的试剂。适用于本文用途的SAPK抑制剂是这样的试剂，当与不存在SAPK抑制剂时的SAPK酶活性比较时，可将SAPK的酶活性抑制至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、或至少约90％或更多的试剂。
[00406]适用于目标联合治疗的应激激活蛋白激酶抑制剂包括但不限于：公开于美国专利6,548,520中的2-烷基咪唑；公开于美国专利6,489,325的所有1，4，5-取代的咪唑化合物；公开美国专利6,569,871的1，4，5-取代的咪唑化合物；公开于美国专利申请2003/0073832的杂芳基氨基苯基酮化合物；公开于美国专利6,288,089的吡啶基咪唑化合物；和公开于美国专利6,432,962的杂芳基氨基二苯甲酮。也适用的是公开于美国专利6,214,854的化合物。也适用的是论述于WO 99/61426中的杂环化合物；和论述于美国专利公开号20030149041中的SAPK抑制剂化合物。其他合适的SAPK抑制剂是BIRB796(1-(5-叔丁基-2-p-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-[4-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-萘-1-基]-尿素)；参见美国专利6,319,921。其他合适的SAPK抑制剂是2(1H)-喹唑酮。也适用的是它们的药学上具有活性的衍生物、类似物、酯、药物前体，和任何前述SAPK抑制剂的盐。
[00407]测定SAPK活性的方法是本领域已知的。测定SAPK的酶活性的测定方法的一个非限制性例子描述如下：在25μl的最终反应体积中，SAPK2a(p38α；5-10mU)与下述物质温育：25mM Tris pH 7.5，0.02mM EGTA，0.33mg/ml髓磷脂碱性蛋白，10mM醋酸镁和[γ-33P-ATP](比活性约500cpm/pmol，浓度取决于需要)。反应由加入Mg/ATP混合物开始。室温下温育40分钟之后，通过加入5μl的3％磷酸溶液停止反应。然后将10μl的反应溶液点样到P30滤垫(filtermat)，在75mM磷酸中洗涤5分钟共3次，再在甲醇中洗涤1次，然后干燥并进行闪烁计数。
N-乙酰半胱氨酸(NAC)
[00408]N-乙酰半胱氨酸(NAC)是含硫氨基酸(sulfur amino acid)L-半胱氨酸的一种稳定形式。NAC是清除H2O2和其他自由基的抗氧化剂。它是谷胱甘肽(一种主要的抗氧化剂)的前体，为谷胱甘肽合成提供了半胱氨酸底物。NAC可作为非处方营养补充物或营养补充产品(nutraceutical product)从市场获得。用于本文中的合适的NAC产品包括由下述厂商制造的NAC营养补充产品：Source Naturals(1000mg片剂)、Biochem(750mg片剂)、Twinlab(600mg片剂)、Nutricology/AllergyResearch Group(500mg片剂)和类似产品。此类产品可以以很小的花费从保健食品商店和营养品零售商诸如General Nutrition Center(GNC)购得。
剂量(DOSAGES)、制剂(formulation)和给药途径
[00409]活性试剂(例如，目标合成CXCR3配体；至少一种第二治疗剂，诸如II型干扰素受体激动剂、I型干扰素受体激动剂、吡非尼酮或吡非尼酮类似物、TNF拮抗剂、TGF-β拮抗剂、内皮缩血管肽受体激动剂、SAPK抑制剂等)与药学上可接受的赋形剂构成制剂(例如，分开的制剂的形式(separate formulations))，被投药给需要它们的个体。各种药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，在本文中不需要详细论述。药学上可接受的赋形剂已经充分描述于各种公开物中，包括例如A.Gennaro(2000)″Remington：The Science and Practice of Pharmacy″，20th edition，Lippincott，Williams，& Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(1999)H.C.Ansel et al.，eds 7th ed.，Lippincott，Williams，& Wilkins；和Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe et al.，eds.，3rd ed.Amer.Pharmaceutical Assoc。
[00410]在目标方法中，通过使用任何常规的手段，活性试剂可以投药给宿主，从而能够产生期望的治疗效果。因此，试剂可以被掺入到用于治疗性给药的各种制剂中。更特别地，本发明的试剂可以通过与合适的药学上可接受的载体或稀释剂组合，配制入药物组合物，可以配制成各种形式的制剂，例如为固体、半固体、液体或气体形式，诸如片剂、胶囊、粉末、颗粒、膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。
[00411]因此，可以用各种方法完成试剂的给药，包括口服给药、口腔含化(buccal)、直肠给药、肠胃外给药、腹腔内给药、皮内给药、静脉内给药、皮下给药、肌内给药、肿瘤内给药、经皮给药、气管内给药等给药方法。在一些实施方案中，使用两种不同的给药途径。例如，在一些实施方案中，目标合成CXCR3配体通过诸如肌内、皮下或静脉内的方式给药，而吡非尼酮或吡非尼酮类似物口服给药。
[00412]活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；另外的治疗剂等)的皮下给药通过使用标准的方法和仪器完成，例如，针和注射器、皮下注射门传递系统(subcutaneousinjection port delivery system)和类似物。参见例如美国专利3,547,119；4,755,173；4,531,937；4,311,137和6,017,328。皮下注射阀门和通过该门将活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；另外的治疗剂等)施予患者的装置的组合称为“皮下注射门传递系统”。在一些实施方案中，通过各种装置的组合完成皮下给药，例如利用针和注射器进行弹丸传递给药，然后用持续传递系统传递药物。
[00413]在一些实施方案中，活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；另外的治疗剂等)通过持续传递系统传递。术语“持续传递系统(continuous delivery system)”在本文中与“受控传递系统(controlled delivery system)”交替使用，包括了持续(例如受控)传递装置(例如泵)与导管、注射装置和类似物的组合，它们都是本领域已知的。
[00414]机械或机电灌输泵也可以适用于本发明。此类装置的例子包括那些描述在例如美国专利4,692,147；4,360,019；4,487,603；4,360,019；4,725,852；5,820,589；5,643,207；6,198,966中的装置和类似物。总之，药物传递的方法可以用任何可再充的泵系统来实现。泵在一段时间里提供了一致的受控的释放。通常，试剂(例如干扰素受体激动剂)是处于液体制剂中，该液体制剂置于药物不能渗透的容器中，并以持续的方式传递给个体。
[00415]在一种实施方案中，药物传递系统是至少部分可植入的装置。该可植入装置可以使用本领域已知的方法和装置在任何合适的植入位点植入。植入位点是对象体内的位点，在该位点药物传递装置被引入并安放。植入位点包括但不必限于表皮下、皮下、肌内位点或对象体内的其他合适的位点。考虑到植入和移去药物传递装置的操作方便性，通常优选皮下植入位点。
[00416]适用于本发明的药物释放装置可以基于各种操作模式的任何一种。例如，药物释放装置可以基于扩散系统、对流系统或可侵蚀系统(例如，基于侵蚀的系统(erosion-based system))。例如，药物释放装置可以是电化学泵、渗透泵、电渗透泵、气压泵、或渗透爆出基质(osmotic bursting matrix)，例如，其中药物可以掺入聚合物，而该聚合物在释放药物制剂的同时会发生药物包埋聚合物材料(drug-impregnated polymeric material)(例如生物可降解的、药物包埋聚合物材料)的降解。在其他实施方案中，药物释放装置是基于电扩散系统、电解泵(electrolyticpump)、起泡泵(effervescent pump)、压电泵(piezoelectric pump)、水解系统等。
[00417]基于机械或机电灌输泵的药物释放装置也可适用于本发明。此类装置的例子包括那些描述于例如美国专利4,692,147；4,360,019；4,487,603；4,360,019；4,725,852中的装置，和类似物。总之，药物传递的方法可以使用任何的可再充的、非交换式的泵系统(refillable，non-exchangeable pump systems)实现。一般优选泵和其他传送性系统，因为它们通常可以在一段时间里提供更加一致的、受控的释放。渗透泵是特别优选的，这是因为它们既具有更一致的受控的释放特性，又具有相对小的尺寸。(参见例如PCT国际申请WO 97/27840和美国专利5,985,305和5,728,396)。适用于本发明的示范性渗透性驱动的装置(osmotically-driven devices)包括但不必限于在下述专利中描述的装置：美国专利3,760,984；3,845,770；3,916,899；3,923,426；3,987,790；3,995,631；3,916,899；4,016,880；4,036,228；4,111,202；4,111,203；4,203,440；4,203,442；4,210,139；4,327,725；4,627,850；4,865,845；5,057,318；5,059,423；5,112,614；5,137,727；5,234,692；5,234,693；5,728,396；和类似装置。
[00418]在一些实施方案中，药物传递装置是可植入的装置。药物传递装置可以使用本领域已知的方法和装置植入到任何合适的植入位点。如在下文中指出的，植入位点是对象体内的位点，在该植入位点引入并安置药物传递装置。植入位点包括但不必限于表皮下、皮下、肌内位点或对象体内其他合适的位点。
[00419]在一些实施方案中，活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；额外的治疗剂；等)使用可植入的药物传递系统被传送，可植入的药物传递系统例如是可以进行编程以给予活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；额外的治疗剂；等)的系统。示范性的可编程的可植入的系统包括可植入灌输泵(implantable infusion pump)。示范性的可植入灌输泵，或与此类泵联合使用的装置描述于例如美国专利4,350,155；5,443,450；5,814,019；5,976,109；6,017,328；6,171,276；6,241,704；6,464,687；6,475,180和6,512,954中。适用于本发明的其他示范性仪器是同步灌输泵(Synchromed infusion pump)(Medtronic)。
[00420]在治疗剂型中，活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；额外的治疗剂；等)可以以它的药学上可接受的盐的形式给药，可以单独使用，或与其他药学上具有活性的化合物以合适的联合(in association)以及组合(in combination)方式给药。下面的方法和赋形剂只是示范性的，绝不是限制性的。
[00421]对于口服制剂，活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；额外的治疗剂；等)可以单独使用，或与合适的添加剂联合，制备成片剂、粉末、颗粒或胶囊，例如与常规的添加剂，诸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉联合；与粘合剂，诸如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶联合；与崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠联合；与润滑剂，诸如云母或硬脂酸镁联合；并且如果需要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和增味剂联合。
[00422]活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；额外的治疗剂；等)可以配制成用于注射的制剂，通过将它们溶于、悬浮于或乳化入含水或不含水的溶剂中来进行，所述溶剂诸如植物油或其他类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸的酯或丙二醇；如果需要，与常规的添加剂诸如增溶剂、等渗压剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂一起配制。
[00423]而且，通过与各种碱诸如乳化碱(emulsifying bases)或水溶性碱(water-soluble bases)混合，活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；额外的治疗剂等)可以制成栓剂。活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；额外的治疗剂等)可以通过栓剂直肠给药。栓剂可以包括载体诸如可可油、有机蜡和聚乙二醇，它们在体温中融化，在室温中固化。
[00424]可以提供用于口服或直肠给药的单位剂量形式，诸如糖浆剂、酊剂和悬浮剂，其中每一剂量单位，例如一茶匙、一汤匙、一片剂或一栓剂含有预定数量的组合物，该组合物含有一种或多种活性试剂。类似地，被注射或静脉内给药的单位剂量形式中的活性试剂可以被包括组合物中，所述组合物是以无菌水、生理盐水或其他药学上可接受的载体配制的溶液。
[00425]如本文中所使用的，术语“单位剂量形式(unit dosage forms)”指物理上分离的单位，其适合作为人和动物个体的单元剂量，每一单位含有预定数量的活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；额外的治疗剂；等)，所述数量经过计算，足以与药学上可接受的稀释剂、载体或介质联合产生期望的效果。活性试剂(例如目标合成CXCR3配体；额外的治疗剂；等)的规格(specification)取决于所使用的特定化合物，以及待获得的效果和每一化合物在宿主中相关的药效学特性。
[00426]药学上可接受的赋形剂，诸如介质、佐剂、载体或稀释剂可以容易地从公开来源获得。而且，药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、渗透压调节剂、稳定剂、润湿剂和类似物可以容易地从公开来源获得。
[00427]当被给予的试剂是目标合成CXCR3配体多肽时，编码目标合成CXCR3配体的多核苷酸可以通过任何途径引入组织或宿主细胞，包括病毒感染、显微注射或囊泡融合(fusion of vesicles)。快速注射(Jet injection)也可以用于肌内给药，如Furth et al.(1992)，Anal Biochem 205：365-368所描述。DNA可以涂到金颗粒上，并通过颗粒轰击装置或“基因枪”皮内给药，如文献中所述(参见例如Tang et al.(1992)，Nature 356：152-154)，其中金微射弹(microprojectiles)用治疗用DNA涂覆，然后轰击到皮肤细胞中。
[00428]在一些实施方案中，第二治疗剂在整个合成CXCR3配体治疗期间被给药。示范性第二治疗剂包括一种或多种吡非尼酮或吡非尼酮类似物；I型干扰素受体激动剂；II型干扰素受体激动剂；一种或多种抗肿瘤剂；TNF拮抗剂；TGF-β拮抗剂；内皮缩血管肽受体拮抗剂；和SAPK抑制剂。在其他实施方案中，第二治疗剂被给药一段时间，该段时间与合成CXCR3配体治疗的给药时间重叠，例如第二治疗剂治疗可以在合成CXCR3配体治疗开始之前开始，并在合成CXCR3配体治疗结束之前结束；第二治疗剂治疗可以在合成CXCR3配体治疗开始之后开始，并在合成CXCR3配体治疗结束之后结束；第二治疗剂治疗可以在合成CXCR3配体治疗开始之后开始，并在合成CXCR3配体治疗结束之前结束；或者，第二治疗剂治疗可以在合成CXCR3配体治疗开始之前开始，并在合成CXCR3配体治疗结束之后结束。
[00429]例如，在一些实施方案中，第二治疗剂在整个合成CXCR3配体治疗期间被给药。在其他实施方案中，吡非尼酮或吡非尼酮类似物被给药一段时间，该段时间与合成CXCR3配体治疗的给药时间重叠，例如，吡非尼酮或吡非尼酮类似物治疗可以在合成CXCR3配体治疗开始之前开始，并在合成CXCR3配体治疗结束之前结束；吡非尼酮或吡非尼酮类似物治疗可以在合成CXCR3配体治疗开始之后开始，并在合成CXCR3配体治疗结束之后结束；吡非尼酮或吡非尼酮类似物治疗可以在合成CXCR3配体治疗开始之后开始，并在合成CXCR3配体治疗结束之前结束；吡非尼酮或吡非尼酮类似物治疗可以在合成CXCR3配体治疗开始之前开始，并在合成CXCR3配体治疗结束之后结束。
[00430]有效剂量的目标合成CXCR3配体每剂在0.1μg至1000μg范围内，例如每剂约0.1μg至约0.5μg、每剂约0.5μg至约1.0μg、每剂约1.0μg至约5.0μg、每剂约5.0μg至约10μg、每剂约10μg至约20μg、每剂约20μg至约30μg、每剂约30μg至每剂约40μg、每剂约40μg至约50μg、每剂约50μg至约60μg、每剂约60μg至约70μg、每剂约70μg至约80μg、每剂约80μg至约100μg、每剂约100μg至约150μg、每剂约150μg至约200μg、每剂约200μg至约250μg、每剂约250μg至约300μg、每剂约300μg至约400μg、每剂约400μg至约500μg、每剂约500μg至约600μg、每剂约600μg至约700μg、每剂约700μg至约800μg、每剂约800μg至约900μg、或每剂约900μg至每剂约1000μg范围内。
[00431]在一些实施方案中，有效剂量的目标合成CXCR3配体以mg/kg体重表示。在这些实施方案中，有效剂量的目标合成CXCR3配体为约0.1mg/kg体重至约10mg/kg体重，例如约0.1mg/kg体重至约0.5mg/kg体重、约0.5mg/kg体重至约1.0mg/kg体重、约1.0mg/kg体重至约2.5mg/kg体重、约2.5mg/kg体重至约5.0mg/kg体重、约5.0mg/kg体重至约7.5mg/kg体重、或约7.5mg/kg体重至约10mg/kg体重。
[00432]在许多实施方案中，目标合成CXCR3配体被给药一段时期，所述时期为约1天至约7天、或约1周至约2周、或约2周至约3周、或约3周至约4周、或约1月至约2月、或约3月至约4月、或约4月至约6月、或约6月至约8月、或约8月至约12月、或至少一年，并且可以在更长的时期内给药。干扰素受体激动剂可以一日三次、一日两次、一日一次、每隔一天、每周两次、每周三次、每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次、基本上连续、或连续给药。
[00433]在许多实施方案中，给予多剂量的目标合成CXCR3配体。例如干扰素受体激动剂以每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天一次(qd)、每天两次(qid)、或每天三次(tid)、基本上连续、或连续给药；给药时间范围为约1天至约1周、约2周至约4周、约1月至约2月、约2月至约4月、约4月至约6月、约6月至约8月、约8月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年或更长时间。
合成CXCR3配体与吡非尼酮的联合疗法
[00434]在一些实施方案中，在与吡非尼酮的联合疗法中给予目标合成CXCR3配体，以治疗癌症、纤维变性症状或血管生成病症。所述方法一般性地涉及给予需要的患者有效数量的合成CXCR3配体和有效数量的吡非尼酮或吡非尼酮类似物。
[00435]总的来讲，有效剂量的吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物可以为约0.5mg/kg/天至约200mg/kg/天，或每天约400mg至约3600mg、或每天约50mg至约5,000mg、或每天约100mg至约1,000mg的固定剂量，口服给药，可任选地以两次或多次分批剂量给药。适用于治疗癌症的目标方法的吡非尼酮和吡非尼酮类似物的其它剂量和制剂描述于美国专利3,974,281；3,839,346；4,042,699；4,052,509；5,310,562；5,518,729；5,716,632和6,090,822中。
[00436]本领域技术人员将很容易认识到，吡非尼酮或吡非尼酮类似物的剂量水平将随特定化合物、症状的严重性和患者对副反应的敏感性的不同而变化。本领域技术人员利用各种手段容易确定给定化合物的优选剂量。
[00437]吡非尼酮(或吡非尼酮类似物)以每天一次、每天两次、或每天三次的频率被给药，或以每天2次至每天5次范围内的分批的日剂量给药，给药的时长范围为约1天至约1周、约2周至约4周、约1月至约2月、约2月至约4月、约4月至约6月、约6月至约8月、约8月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年或更长时间。
[00438]目标合成CXCR3配体和吡非尼酮(或吡非尼酮类似物)通常以分开的制剂形式被给药。目标合成CXCR3配体和吡非尼酮(或吡非尼酮类似物)可以基本上同时被给药，或在约30分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约8小时、约16小时、约24小时、约36小时、约72小时、约4天、约7天或约2周的时间里交替给药。
[00439]在一种实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法使用有效数量的目标合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者一定剂量的目标合成CXCR3配体，其中每剂目标合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的量，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予一定剂量的吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物，其中每剂吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物含有约100mg至约1,000mg的量，口服一日一次，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，给药持续一段期望的治疗时间。
[00440]在一种实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状、或血管生成病症，该方法包括给予患者一定剂量的合成CXCR3配体，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予一定剂量的吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物，其中每剂含有约100mg至约1,000mg量的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，给药持续一段期望的治疗时间。
[00441]在一种实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者一定剂量的合成CXCR3配体剂量，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的量，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地肌内给药；该方法还联合给予一定剂量的吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物，其中每剂含有约100mg至约1,000mg的量，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，给药持续一段期望的治疗时间。
[00442]在一种实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者一定剂量的合成CXCR3配体，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予一定剂量的吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物，其中每剂含有约50mg至约5,000mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，给药持续一段期望的治疗时间。
[00443]在一种实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者一定剂量的合成CXCR3配体，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地肌内给药；该方法还联合给予一定剂量的吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物，其中每剂含有约50mg至约5,000mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，给药持续一段期望的治疗时间。
[00444]在一种实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者一定剂量的合成CXCR3配体，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约50μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予一定剂量的吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物，其中每剂含有约500mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，给药持续一段期望的治疗时间。
[00445]在一种实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者一定剂量的合成CXCR3配体，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约50μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地肌内给药；该方法还联合给予一定剂量的吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物，其中每剂含有约500mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药；给药持续一段期望的治疗时间。
合成CXCR3配体和I型干扰素受体激动剂的联合疗法
[00446]在一些实施方案中，目标合成CXCR3配体与I型干扰素受体激动剂一起联合用于治疗癌症、纤维变性症状或血管生成病症。该方法通常涉及给予需要的个体效数量的目标合成CXCR3配体和有效数量的I型干扰素受体激动剂。在一些实施方案中，I型干扰素受体激动剂是IFN-α。
[00447]有效剂量的IFN-α可以在0.3μg至100μg范围内。有效剂量的Infergen共有IFN-α每剂含有约3μg、约9μg、约15μg、约18μg或约27μg的药物。有效剂量的IFN-α2a和IFN-α2b每剂含有约3百万单位(MU)至约10MU的药物。有效剂量的PEGASYSPEG化的IFN-α2a每剂含有约90μg至约180μg，或约135μg的药物。有效剂量的PEG-INTRONPEG化的IFN-α2b每剂含有每kg体重约0.5μg至约1.5μg的药物。有效剂量的PEG化的杂合干扰素(PEG-CIFN)每剂PEG-CIFN含有约18μg至约90μg或约27μg至约60μg或约45μg的CIFN氨基酸重量。有效剂量的单PEG(30kD，线型)化的CIFN每剂可以含有约3μg至约300μg或约9μg至约90μg或约27μg的药物。
[00448]IFN-α通常皮下给药。例如，IFN-α可以一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天基本上连续或连续地皮下给药，给药时间为约2周至约52周、约52周至约2年或更长时间。
[00449]在一种实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的INFERGEN共有IFN-α、合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者INFERGEN剂量，其中每剂INFERGEN含有约1μg至约30μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物剂量，其中每剂含有约50mg至约5,000mg量的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，还给予合成CXCR3配体剂量，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地肌内或皮下给药；给药持续一段期望的治疗时间。
[00450]在另一实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的INFERGEN共有IFN-α、合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者INFERGEN剂量，其中每剂INFERGEN含有约1μg至约9μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物剂量，其中每剂含有约100mg至约1,000mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，还给予合成CXCR3配体剂量，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地肌内或皮下给药；给药持续一段期望的治疗时间。
[00451]在另一实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的INFERGEN共有IFN-α、合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者INFERGEN剂量，其中每剂INFERGEN含有约9μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物剂量，其中每剂含有约500mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或多次分批剂量给药，还给予合成CXCR3配体剂量，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天基本上连续或连续地肌内或皮下给药；给药持续一段期望的治疗时间。
[00452]在另一实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的INFERGEN共有IFN-α、合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者INFERGEN剂量，其中每剂INFERGEN含有约30μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物剂量，其中每剂含有约1,000mg至约2,000mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或多次分批剂量给药，还给予合成CXCR3配体剂量，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地肌内或皮下给药；给药持续一段期望的治疗时间。
[00453]在另一实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的共有IFN-α、合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者PEG化的共有IFN-α(PEG-CIFN)剂量，其中每剂PEG-CIFN含有约10ug至约150μg的CIFN氨基酸重量，每周一次、每隔一周、每月三次或每月皮下给药；该方法还联合给予吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物剂量，其中每剂含有约50mg至约5,000mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，还给予合成CXCR3配体剂量，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地肌内或皮下给药；给药持续一段期望的治疗时间。
[00454]在另一实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的共有IFN-α、合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者单PEG(30kD，线型)化的共有IFN-α剂量，其中每剂含有约3ug至约300μg的药物，每周一次、每隔一周、每月三次或每月皮下给药；该方法还联合给予吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物剂量，其中含有约50mg至约5,000mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，还给予合成CXCR3配体剂量，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次、或每天基本上连续或连续地肌内或皮下给药；给药持续一段期望的治疗时间。
[00455]在另一实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的INFERGEN共有IFN-α、合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者INFERGEN剂量，其中每剂INFERGEN含有约5μg至约150μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物剂量，其中每剂含有约1,000mg至约10,000mg量的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，还给予合成CXCR3配体剂量，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg量的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天基本上连续或连续地肌内或皮下给药；给药持续一段期望的治疗时间。
[00456]在另一实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的INFERGEN共有IFN-α、合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者INFERGEN剂量，其中每剂INFERGEN含有约5μg至约45μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物剂量，其中每剂含有约1,000mg至约3,000mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，还给予合成CXCR3配体剂量，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg量的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天基本上连续或连续地肌内或皮下给药；给药持续一段期望的治疗时间。
[00457]在另一实施方案中，本发明提供了方法，该方法使用有效数量的INFERGEN共有IFN-α、合成CXCR3配体和吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物来治疗患者癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该方法包括给予患者INFERGEN剂量，其中每剂INFERGEN含有约45μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天基本上连续或连续地皮下给药；该方法还联合给予吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物剂量，其中每剂含有约1,000mg至约2,000mg的药物，口服一日一次给药，可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，还给予合成CXCR3配体剂量，其中每剂合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的药物，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天基本上连续或连续地肌内或皮下给药；给药持续一段期望的治疗时间。
合成CXCR3配体和II型干扰素受体激动剂的联合疗法
[00458]在另一方面，本发明提供了联合疗法，其用于治疗癌症、纤维变性症状、血管生成病症或细菌感染，该治疗包括共同给予患者有效数量的目标合成CXCR3配体和II型干扰素受体激动剂。在一些实施方案中，II型干扰素受体激动剂是干扰素-γ。
[00459]有效剂量的目标合成CXCR3配体是上面论述的剂量。
[00460]有效剂量的IFN-γ为约0.5μg/m2至约500μg/m2，通常约1.5μg/m2至200μg/m2，这取决于患者的大小。活性是基于每50μg蛋白106个国际单位(internationalunits)(U)。IFN-γ可以每天给药、每隔一天给药、一周3次给药、每周2次给药，或基本上持续或持续地给药，给药时间约2周至约52周、约52周至约2年或更长时间。
[00461]在某些实施方案中，IFN-γ以约25μg至约500μg、约50μg至约400μg、或约100μg至约300μg的单位剂量形式，投药给个体。在特别感兴趣的实施方案中，剂量为约200μgIFN-γ。在许多感兴趣的实施方案中，给予IFN-γ1b。
[00462]当剂量是每剂有200μg IFN-γ时，单位体重(假设体重范围为约45kg至约135kg)的IFN-γ量在每kg体重约4.4μg IFN-γ至每kg体重约1.48ug IFN-γ范围内。
[00463]目标个体的身体表面积通常在约1.33m2至约2.50m2范围内。因此，在许多实施方案中，IFN-γ剂量范围在约150μg/m2至约20μg/m2。例如，IFN-γ剂量范围为约20μg/m2至约30μg/m2、约30μg/m2至约40μg/m2、约40μg/m2至约50μg/m2、约50μg/m2至约60μg/m2、约60μg/m2至约70μg/m2、约70μg/m2至约80μg/m2、约80μg/m2至约90μg/m2、约90μg/m2至约100μg/m2、约100μg/m2至约110μg/m2、约110μg/m2至约120μg/m2、约120μg/m2至约130μg/m2、约130μg/m2至约140μg/m2或约140μg/m2至约150μg/m2。在一些实施方案中，剂量组的范围(dosage groups range)为约25μg/m2至约100μg/m2。在其他实施方案中，剂量组的范围为约25μg/m2至约50μg/m2。
进一步的联合疗法
[00464]本发明还考虑了用于治疗癌症、纤维变性症状或血管生成病症的联合疗法，所述疗法涉及给予有效数量的目标合成CXCR3配体、有效数量的I型干扰素受体激动剂(例如IFN-α)和有效数量的吡非尼酮或吡非尼酮类似物。有效剂量是上面论述的剂量。
[00465]本发明还考虑了联合疗法，用于治疗癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该疗法涉及给予有效数量的合成CXCR3配体、有效数量的II型干扰素受体激动剂(例如IFN-γ)和有效数量的吡非尼酮或吡非尼酮类似物。有效剂量是上面论述的剂量。
[00466]本发明还考虑了联合疗法，用于治疗癌症、纤维变性症状或血管生成病症，该疗法涉及给予有效数量的合成CXCR3配体、有效数量的I型干扰素受体激动剂(例如IFN-γ)、有效数量的II型干扰素受体激动剂(例如IFN-α)和有效数量的吡非尼酮或吡非尼酮类似物。有效剂量是上面论述的剂量。
合成CXCR3配体联合疗法，作为癌症的辅助疗法
[00467]在一些实施方案中，本发明提供了使用了合成CXCR3配体疗法的联合疗法，作为标准的癌症治疗的辅助疗法。标准的癌症疗法包括手术(例如手术切除癌组织)、放射疗法、骨髓移植、化学治疗方法、生物应答调节物治疗方法和前述方法的某些组合。
[00468]放射疗法包括但不限于x-射线或γ-射线，x-射线或γ-射线来源于外部供应源(externally applied source)例如光束或来源于植入的小的放射性源。
[00469]化学治疗剂是非肽类(即非蛋白类)化合物，所述化合物减少癌细胞的增殖，包括细胞毒性剂和细胞生长抑制剂。化学治疗剂的非限制性例子包括烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱和类固醇激素。
[00470]减少细胞增殖的试剂是本领域已知的，并广泛使用。此类试剂包括烷化剂，诸如氮芥、亚硝基脲、乙撑亚胺衍生物、烷基磺酸酯和三氮烯，包括但不限于双氯乙基甲胺、环磷酰胺(CytoxanTM)、美法仑(L-沙可来新)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链脲菌素、氯脲菌素、尿嘧啶氮芥、氮芥、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、哌泊溴烷、三亚乙基蜜胺、三亚乙基硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramine)、白消安、达卡巴嗪和替莫唑胺。
[00471]抗代谢物包括叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂，包括但不限于阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟苷(FudR)、6-硫代鸟嘌呤、6-巯基嘌呤(6-MP)、喷司他丁、5-氟尿嘧啶(5-FU)、氨甲蝶呤、10-炔丙基-5，8-dideazafolate(PDDF，CB3717)、5，8-dideazatetrahydrofolic acid(DDATHF)、亚叶酸、阿糖氟腺嘌呤磷酸盐、喷司他汀和吉西他滨。
[00472]合适的天然产物和它们的衍生物(例如长春花生物碱、抗肿瘤抗生素、酶、淋巴因子和表鬼臼毒素)包括但不限于Ara-C、紫杉醇(Taxol)、多烯紫杉醇(Taxotere)、脱氧肋间型霉素、丝裂霉素-C、L-天冬酰胺酶、硫唑嘌呤；布喹那；生物碱，例如长春新碱、长春花碱、长春瑞宾、长春地辛等；鬼臼脂毒素，例如依托泊苷、替尼泊苷等；抗生素，例如蒽环类抗肿瘤抗生素、盐酸道诺霉素(道诺霉素、柔红霉素、cerubidine)、依达比星、亚德利亚霉素、表阿霉素和吗啉代衍生物等；phenoxizone biscyclopeptides，例如放线菌素；碱性糖肽，例如争光霉素；蒽醌类糖苷，例如普卡霉素(光辉霉素)；蒽醌类抗生素，例如米托蒽醌；azirinopyrroloindolediones，例如丝裂霉素；大环类免疫抑制剂，例如环胞霉素、FK-506(他克莫司、prograf)、雷帕霉素等；和类似物。
[00473]其他抗增殖细胞毒性试剂是navelbene、CPT-11、阿那曲唑(anastrazole)、来曲唑、卡培他滨、reloxafine、环磷酰胺、ifosamide和屈洛昔芬。
[00474]具有抗增殖活性的微管影响剂也是适用的，包括但不限于异秋水仙素(NSC 406042)、Halichondrin B(NSC 609395)、秋水仙素(NSC 757)、秋水仙素衍生物(例如NSC 33410)、dolstatin 10(NSC 376128)，美登素(NSC 153858)、根瘤菌素(NSC 332598)、紫杉醇(Taxol)、Taxol衍生物、多烯紫杉醇(Taxotere)、硫代秋水仙素(NSC 361792)、三苯甲基半胱氨酸、长春花碱硫酸盐、长春新碱硫酸盐、天然和合成的埃坡霉素，包括但不限于埃坡霉素A、埃坡霉素B、替斯利得；雌莫司汀、诺考达唑和类似物。
[00475]也适用的激素调节剂和类固醇(包括合成的类似物)包括但不限于肾上腺皮质类固醇，例如泼尼松、地塞米松等；雌激素和雄激素，例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、雌二醇、氯米芬、他莫昔芬；等；和肾上腺皮质抑制剂，例如氨鲁米特；17α-乙炔雌二醇；二乙基己烯雌酚、睾酮、氟甲睾酮、屈他雄酮丙酸酯、睾内酯、甲基泼尼松龙、甲基-睾酮、泼尼松龙、曲安西龙、三对甲氧苯基氯乙烯、羟基孕酮、氨鲁米特、雌莫司汀、醋酸甲羟孕酮、亮丙瑞林、氟他胺(Drogenil)、托瑞米芬(Fareston)和Zoladex。雌激素刺激增殖和分化，因此，结合到雌激素受体的化合物可以用于阻断该活性。皮质类甾醇可以抑制T细胞增殖。
[00476]其他化学治疗剂包括金属络合物，例如顺铂(cis-DDP)、碳铂等；脲类，例如羟基脲；和肼类，例如N-甲基肼；epidophyllotoxin；拓扑异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽醌；亚叶酸；替加氟；等。其他感兴趣的抗增殖剂包括免疫抑制剂，例如麦考酚酸、沙利度胺、desoxyspergualin、azasporine、来氟米特、咪唑立宾、azaspirane(SKF 105685)；Iressa(ZD 1839、4-(3-氯-4-氟苯基氨基)-7-甲氧基-6-(3-(4-吗啉基)丙氧基)喹唑啉)；等。
[00477]“紫杉烷”包括紫杉醇，以及任何具有活性的紫杉烷衍生物或药物前体。利用本领域技术人员已知的技术，“紫杉醇”(其在本文中应该理解为包括类似物、制剂和衍生物，诸如多烯紫杉醇、Taxol、Taxotere(多烯紫杉醇的制剂)、紫杉醇的10-去乙酰基类似物，和紫杉醇的3′N-去苯酰基-3′N-叔丁氧羰基类似物)容易制备得到(也可参见WO 94/07882、WO 94/07881、WO 94/07880、WO 94/07876、WO93/23555、WO 93/10076；美国专利5,294,637；5,283,253；5,279,949；5,274,137；5,202,448；5,200,534；5,229,529和EP 590,267)，或从各种商业渠道获得，例如从Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.获得(来自短叶红豆杉的T7402；或来自云南红豆杉的T-1912)。
[00478]应该理解，紫杉醇不但指常见的化学上可获得的紫杉醇形式，而且指类似物和衍生物(例如TaxotereTM多烯紫杉醇，如上所述)和紫杉醇偶联物(例如紫杉醇-PEG、紫杉醇-葡聚糖或紫杉醇-木糖)。
[00479]也包括在术语“紫杉烷”中的是各种已知的衍生物，包括亲水性衍生物和疏水性衍生物。紫杉烷衍生物包括但不限于国际专利申请号WO 99/18113中描述的半乳糖和甘露糖衍生物；WO 99/14209中描述的哌嗪和其他衍生物；描述于WO99/09021、WO 98/22451和美国专利5,869,680中的紫杉烷衍生物；描述于WO98/28288中的6-硫代衍生物；描述于美国专利5,821,263中的亚磺酰胺衍生物；描述于美国专利5,415,869中的红豆杉醇衍生物。还包括紫杉醇的药物前体，包括但不限于WO 98/58927、WO 98/13059和美国专利5,824,701中描述的药物前体。
[00480]适合与本发明方法联合使用的生物应答调节物包括但不限于(1)酪氨酸激酶(RTK)活性抑制剂；(2)丝氨酸/苏氨酸激酶活性抑制剂；(3)肿瘤相关的抗原拮抗剂，诸如特异性结合到肿瘤抗原的抗体；(4)细胞凋亡受体激动剂；(5)白细胞介素-2；(6)IFN-α；(7)IFN-γ；(8)集落刺激因子；(9)血管生成的抑制剂；和(10)肿瘤坏死因子的拮抗剂。
[00481]在一个方面，本发明考虑将合成CXCR3配体治疗用作任何疗法的辅助方法，在所述的任何疗法中，癌症患者接受用至少一种另外的抗肿瘤药物进行的治疗，其中所述的另外的药物是酪氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，诸如I型受体酪氨酸激酶抑制剂(例如表皮生长因子受体的抑制剂)、II型受体酪氨酸激酶抑制剂(例如胰岛素受体的抑制剂)、III型受体酪氨酸激酶抑制剂(例如血小板来源的生长因子受体的抑制剂)、和IV型受体酪氨酸激酶抑制剂(例如成纤维生长因子受体)。在其他实施方案中，酪氨酸激酶抑制剂是非受体型酪氨酸激酶抑制剂，诸如src激酶或詹纳斯激酶(januskinases)的抑制剂。
[00482]另一方面，本发明考虑将合成CXCR3配体治疗作为任何疗法的辅助疗法，在所述任何疗法中，癌症患者接受用至少一种另外的抗肿瘤药物进行的治疗，其中所述另外的药物是受体酪氨酸激酶的抑制剂，所述受体酪氨酸激酶参与生长因子信号传导通路。在一些实施方案中，所述抑制剂是染料木黄酮。在其他实施方案中，所述抑制剂是EGFR酪氨酸激酶特异性拮抗剂，诸如IRESSATMgefitinib(ZD18398；Novartis)、TARCEVATM erolotinib(OSI-774；Roche；Genentech；OSI Pharmaceuticals)或酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)AG1478(4-(3-氯苯胺基)-6，7-二甲氧基喹唑啉。在其他实施方案中，抑制剂是描述在美国专利申请2002/0183364A1中的Flk-1/KDR(VEGF-R2)酪氨酸激酶活性的吲哚酮拮抗剂，诸如该美国专利申请第4-5页表1中描述的Flk-1/KDR(VEGF-R2)酪氨酸激酶活性的吲哚酮拮抗剂。在其它的实施方案中，抑制剂是公开于Sun，L.，et al.， J.Med.Chem.，43(14)：2655-2663(2000)中的Flk-1/KDR(VEGF-R2)、FGF-R1或PDGF-R酪氨酸激酶活性的任何取代的3-[(4，5，6，7-四氢-1H-吲哚-2-基)亚甲基]-1，3-二氢吲哚-2-酮拮抗剂。在另外的实施方案中，抑制剂是描述于Sun，L.，et al.， J.Med.Chem.， 42(25)：5120-5130(1999)中的Flt-1(VEGF-R1)、Flk-1/KDR(VEGF-R2)、FGF-R1或PDGF-R酪氨酸激酶活性的任何取代的3-[(3-或4-羧基乙基吡咯-2-基)亚甲基]二氢吲哚-2-酮拮抗剂。
[00483]另一方面，本发明考虑将合成CXCR3配体治疗作为任何疗法的辅助疗法，在所述任何疗法中，癌症患者接受用至少一种另外的抗肿瘤药物进行的治疗，其中所述的另外的药物是非受体酪氨酸激酶的抑制剂，所述的非受体酪氨酸激酶参与生长因子信号传导通路。在一些实施方案中，所述抑制剂是JAK2酪氨酸激酶活性的拮抗剂，诸如酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(2-氰基-3-(3，4-二羟基苯基)N-(苄基)-2-丙烯酰胺(propenamide))。在其他实施方案中，抑制剂是bcr-abl酪氨酸激酶活性的拮抗剂，诸如，GLEEVECTM甲磺酸伊马替尼(STI-571；Novartis)。
[00484]另一方面，本发明考虑将合成CXCR3配体治疗作为任何疗法的辅助疗法，在所述任何疗法中，癌症患者接受用至少一种另外的抗肿瘤药物进行的治疗，其中所述的另外药物是丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。在一些实施方案中，丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂是受体丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，诸如TGF-β受体丝氨酸/苏氨酸激酶活性的拮抗剂。在其他实施方案中，丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂是非受体丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，诸如MAP激酶、蛋白激酶C(PKC)、蛋白激酶A(PKA)或细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的拮抗剂。
[00485]另一方面，本发明考虑将合成CXCR3配体治疗作为任何疗法的辅助疗法，在所述任何疗法中，癌症患者接受用至少一种另外的抗肿瘤药物进行的治疗，其中所述另外的药物是一种或多种参与细胞周期调节的激酶的抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是CDK2激活的拮抗剂，诸如酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(2-氰基-3-(3，4-二羟基苯基)-N-(苄基)-2-丙烯酰胺)。在其他实施方案中，抑制剂是CDK1/细胞周期蛋白B活性的拮抗剂，诸如alsterpaullone。在其它的实施方案中，抑制剂是CDK2激酶活性的拮抗剂，诸如indirubin-3′-monoxime。在另外的实施方案中，抑制剂是ATP库(ATP pool)拮抗剂，诸如洛美曲索(描述于美国专利申请号2002/0156023 A1中)。
[00486]另一方面，本发明考虑将合成CXCR3配体治疗作为任何疗法的辅助疗法，在所述任何疗法中，癌症患者接受用至少一种另外的抗肿瘤药物进行的治疗，其中所述的另外的药物是肿瘤相关的抗原拮抗剂，诸如抗体拮抗剂。在一些涉及对HER2表达肿瘤进行治疗的实施方案中，肿瘤相关的抗原拮抗剂是抗HER2单克隆抗体，诸如HERCEPTINTM trastuzumab。在一些涉及对CD20表达肿瘤诸如B-细胞淋巴瘤进行治疗的实施方案中，肿瘤相关的抗原拮抗剂是抗CD20单克隆抗体，诸如RITUXANTM rituximab。
[00487]另一方面，本发明考虑将合成CXCR3配体治疗作为任何疗法的辅助疗法，在所述任何疗法中，癌症患者接受用至少一种另外的抗肿瘤药物进行的治疗，其中所述的另外的药物是肿瘤生长因子拮抗剂。在一些实施方案中，肿瘤生长因子拮抗剂是表皮生长因子(EGF)的拮抗剂，诸如抗EGF单克隆抗体。在其他实施方案中，肿瘤生长因子拮抗剂是表皮生长因子受体erbB1(EGFR)的拮抗剂，诸如抗EGFR单克隆抗体-EGFR激活或信号转导的抑制剂。
[00488]另一方面，本发明考虑将合成CXCR3配体治疗作为任何疗法的辅助疗法，在所述的任何疗法中，癌症患者接受用至少一种另外的抗肿瘤药物进行的治疗，其中所述的另外的药物是Apo-2配体激动剂。在一些实施方案中，Apo-2配体激动剂是描述于WO 97/25428的任何Apo-2配体多肽。
[00489]另一方面，本发明考虑将合成CXCR3配体治疗作为任何疗法的辅助疗法，在所述的任何疗法中，癌症患者接受用至少一种另外的抗肿瘤药物进行的治疗，其中所述的另外的药物是抗血管生成剂。在一些实施方案中，抗血管生成剂是血管内皮细胞生长因子(VEGF)拮抗剂，诸如抗VEGF单克隆抗体，例如AVASTINTMbevacizumab(Genentech)。在其他实施方案中，抗血管生成剂是视黄酸受体(RXR)配体，诸如描述于美国专利申请2001/0036955 A1或美国专利5,824,685；5,780,676；5,399,586；5,466,861；4,810,804；5,770,378；5,770,383或5,770,382中的任何RXR配体。在其他实施方案中，抗血管生成剂是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ配体，诸如描述于美国专利申请号2001/0036955 A1的任何PPARγ配体。
[00490]包括放射治疗和目标合成CXCR3配体治疗，或包括化学治疗剂治疗和目标合成CXCR3配体治疗的联合疗法的示范性非限制性例子描述于下：
[00491]1)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；和顺铂，剂量范围为约5mg/m2至约150mg/m2。
[00492]2)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；和碳铂，剂量范围为约5mg/m2至约1000mg/m2。
[00493]3)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；和辐射，剂量范围为约200cGy至约8000cGy。
[00494]4)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；和紫杉醇，剂量范围为约40mg/m2至约250mg/m2。
[00495]5)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；和剂量范围在约40mg/m2至约250mg/m2范围的紫杉醇；和剂量范围在约5mg/m2至约1000mg/m2的碳铂。
[00496]6)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；和剂量范围在约5mg/m2至约5000mg/m2范围的5FU；和剂量范围在约5mg/m2至约1000mg/m2的亚叶酸。
[00497]7)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；和trastuzumab，初始负荷剂量(loading dose)为4mg/kg，随后每周维持2mg/kg的剂量。
[00498]8)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；trastuzumab，初始负荷剂量为4mg/kg，随后每周维持2mg/kg的剂量；和剂量范围在约40mg/m2至约250mg/m2范围的紫杉醇。
[00499]9)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；剂量范围在约40mg/m2至约250mg/m2范围的紫杉醇；和剂量范围在5mg/m2至约1000mg/m2的雌莫司汀磷酸盐(Emcyte)。
[00500]10)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；剂量范围在约5mg/m2至约150mg/m2范围的顺铂；和剂量范围在约5mg/m2至约5000mg/m2的5FU。
[00501]11)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；剂量范围在约5mg/m2至约5000mg/m2的5FU；和剂量为约200cGy至约8000cGy的辐射。
[00502]12)目标合成CXCR3配体剂量，每剂含有约0.1μg至约1000μg的合成CXCR3配体；剂量范围在约5mg/m2至约5000mg/m2的5FU；和剂量范围在约40mg/m2至约250mg/m2范围的紫杉醇。
[00503]在一些实施方案中，任何上述方案(例如方案1-12)还包括给予吡非尼酮或特异性吡非尼酮类似物剂量，每剂含有约100mg至约1000mg的药物。
合成CXCR3配体联合疗法，用于治疗纤维变性病症
[00504]本发明提供了治疗纤维变性病症的联合疗法，通常涉及给予有效数量的目标合成CXCR3配体和至少一种第二治疗剂。治疗纤维变性病症的联合疗法——涉及给予有效数量的目标合成CXCR3配体和吡非尼酮或吡非尼酮类似物——描述于上。治疗纤维变性病症的联合疗法——涉及给予有效数量的目标合成CXCR3配体和I型干扰素受体激动剂(例如IFN-α)——描述于上。治疗纤维变性病症的联合疗法——涉及给予有效数量的目标合成CXCR3配体和II型干扰素受体激动剂(例如IFN-γ)——描述于上。
[00505]在一些实施方案中，本方面提供了治疗纤维变性病症的联合疗法，通常涉及给予效数量的目标合成CXCR3配体和第二治疗剂，该第二治疗剂选自TNF拮抗剂、TGF-β拮抗剂和内皮缩血管肽受体拮抗剂。在一些实施方案中，这些联合治疗方法中的任何方法都可被修改，以包括给予一种或多种下述物质：吡非尼酮或吡非尼酮类似物；II型干扰素受体激动剂；I型干扰素受体激动剂；和SAPK抑制剂(除了吡非尼酮)。
合成CXCR3配体与TNF拮抗剂的联合疗法，用于治疗纤维变性病症
[00506]在一些实施方案中，用于治疗纤维变性症状的目标治疗方案包括给予有效数量的目标合成CXCR3配体和TNF拮抗剂。有效剂量的TNF-α拮抗剂的范围是每剂0.1μg至40mg，例如每剂量约0.1μg至约0.5μg、每剂量约0.5μg至约1.0μg、每剂量约1.0μg至约5.0μg、每剂量约5.0μg至约10μg、每剂量约10μg至约20μg、每剂量约20μg至约30μg、每剂量约30μg至约40μg、每剂量约40μg至约50μg、每剂量约50μg至约60μg、每剂量约60μg至约70μg、每剂量约70μg至约80μg、每剂量约80μg至约100μg、每剂量约100μg至约150μg、每剂量约150μg至约200μg、每剂量约200μg至约250μg、每剂量约250μg至约300μg、每剂量约300μg至约400μg、每剂量约400μg至约500μg、每剂量约500μg至约600μg、每剂量约600μg至约700μg、每剂量约700μg至约800μg、每剂量约800μg至约900μg、每剂量约900μg至约1000μg、每剂量约1mg至约10mg、每剂量约10mg至约15mg、每剂量约15mg至约20mg、每剂量约20mg至约25mg、每剂量约25mg至约30mg、每剂量约30mg至约35mg、或每剂量约35mg至约40mg。
[00507]在一些实施方案中，TNF-α拮抗剂是ENBREL依那西普。有效剂量的依那西普范围为每剂量约0.1μg至约40mg，每剂量约0.1μg至约1μg、每剂量约1μg至约10μg、每剂量约10μg至约100μg、每剂量约100μg至约1mg、每剂量约1mg至约5mg、每剂量约5mg至约10mg、每剂量约10mg至约15mg、每剂量约15mg至约20mg、每剂量约20mg至约25mg、每剂量约25mg至约30mg、每剂量约30mg至约35mg、或每剂量约35mg至约40mg。
[00508]在一些实施方案中，有效剂量的TNF-α拮抗剂用mg/kg体重表示。在这些实施方案中，有效剂量的TNF-α拮抗剂范围为约0.1mg/kg体重至约10mg/kg体重，例如约0.1mg/kg体重至约0.5mg/kg体重、约0.5mg/kg体重至约1.0mg/kg体重、约1.0mg/kg体重至约2.5mg/kg体重、约2.5mg/kg体重至约5.0mg/kg体重、约5.0mg/kg体重至约7.5mg/kg体重、或约7.5mg/kg体重至约10mg/kg体重。
[00509]在一些实施方案中，TNF-α拮抗剂是REMICADE英利昔单抗(infliximab)。有效剂量的REMICADE范围为每剂约0.1mg/kg至约10mg/kg，约0.1mg/kg至约0.5mg/kg、约0.5mg/kg至约1.0mg/kg、约1.0mg/kg至约1.5mg/kg、约1.5mg/kg至约2.0mg/kg、约2.0mg/kg至约2.5mg/kg、约2.5mg/kg至约3.0mg/kg、约3.0mg/kg至约3.5mg/kg、约3.5mg/kg至约4.0mg/kg、约4.0mg/kg至约4.5mg/kg、约4.5mg/kg至约5.0mg/kg、约5.0mg/kg至约7.5mg/kg、或约7.5mg/kg至约10mg/kg。
[00510]在一些实施方案中，TNF-α拮抗剂是HUMIRATM阿达木单抗(adalimumab)。有效剂量的HUMIRATM范围为每剂约0.1μg至约35mg，约0.1μg至约1μg、约1μg至约10μg、约10μg至约100μg、约100μg至约1mg、约1mg至约5mg、约5mg至约10mg、约10mg至约15mg、约15mg至约20mg、约20mg至约25mg、约25mg至约30mg、约30mg至约35mg、或约35mg至约40mg。
[00511]在许多实施方案中，TNF-α拮抗剂的给药时间为约1天至约7天、或约1周至约2周、或约2周至约3周、或约3周至约4周、或约1月至约2月、或约3月至约4月、或约4月至约6月、或约6月至约8月、或约8月至约12月、或至少1年，或可以在更长的时间里给药。TNF-α拮抗剂可以一日三次、一日两次、一日一次、每隔一天、每周两次、每周三次、每周一次、每隔一周、每月3次、每月1次、基本上持续、或持续地给药。
[00512]在许多实施方案中，给予多剂量的TNF-α拮抗剂。例如，TNF-α拮抗剂每月1次、每月2次、每月3次、每隔1周(qow)、每周1次(qw)、每周2次(biw)、每周3次(tiw)、每周4次、每周5次、每周6次、每隔一天(qod)、每天1次(qd)、每天2次(bid)、每天3次(tid)、基本上持续或持续地给药，给药的时间范围为约1天至约1周、约2周至约4周、约1月至约2月、约2月至约4月、约4月至约6月、约6月至约8月、约8月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年、或更长时间。
[00513]本领域技术人员将容易认识到，剂量水平可以作为具体化合物、症状的严重性和患者对副作用的敏感性的函数而变化。通过各种手段，本领域技术人员容易确定给定化合物的优选剂量。优选的手段是测量给定化合物的生理效价(physiological potency)。
[00514]目标合成CXCR3配体和TNF拮抗剂通常以独立的制剂被给予。目标合成CXCR3配体和TNF拮抗剂可以基本上同时给药，或彼此之间在约30分钟内、约1小时内、约2小时内、约4小时内、约8小时内、约16小时内、约24小时内、约36小时内、约72小时内、约4天内、约7天内或约2周内给药。
[00515]在一种实施方案中，本发明提供了使用有效数量的目标合成CXCR3配体和TNF拮抗剂治疗患者纤维变性症状的方法，该方法包括给予患者：a)目标合成CXCR3配体剂量，每剂目标合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的量，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天基本上连续或连续地肌内或皮下给药；和b)TNF拮抗剂剂量，其含有约0.1μg至40mg，一日三次、一日两次、一日一次、每隔一天、每周两次、每周三次、每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次皮下给药；给药时间为期望的治疗持续时间，从而治疗纤维变性症状。
[00516]在一种实施方案中，本发明提供了使用有效数量的目标合成CXCR3配体和TNF拮抗剂治疗患者纤维变性症状的方法，包括给予患者：a)目标合成CXCR3配体剂量，每剂目标合成CXCR3配体含有的量为约0.1μg至约1000μg，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天，基本上连续或连续地肌内或皮下给药；b)TNF-α拮抗剂剂量，该TNF-α拮抗剂剂量选自：(i)ENBREL，数量为约25mg的药物，每周两次，皮下给药，(ii)REMICADE，数量为约3mg/kg至约10mg/kg的药物，每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次、每6周一次或每8周一次，静脉内给药，或(iii)HUMIRATM，数量为约40mg的药物，每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次、每6周一次或每8周一次，皮下给药；给药时间为期望的治疗持续时间，以治疗纤维变性症状。
[00517]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予患者目标CXCR3配体和TNF拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的吡非尼酮或吡非尼酮类似物。上面已经论述了吡非尼酮或吡非尼酮类似物的有效数量。
[00518]在一种实施方案中，本发明提供了使用有效数量的目标合成CXCR3配体、TNF拮抗剂和吡非尼酮或吡非尼酮类似物治疗患者纤维变性症状的方法，包括给予患者：a)目标合成CXCR3配体剂量，每剂目标合成CXCR3配体含有的量为约0.1μg至约1000μg，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天，基本上连续或连续地肌内或皮下给药；b)TNF-α拮抗剂剂量，选自：(i)ENBREL，数量为约25mg的药物，每周两次皮下给药，(ii)REMICADE，数量为约3mg/kg至约10mg/kg的药物，每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次、每6周一次或每8周一次静脉内给药，或(iii)HUMIRATM，数量为约40mg的药物，每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次、每6周一次或每8周一次皮下给药；和c)吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物剂量，每剂吡非尼酮或特定吡非尼酮类似物含有约100mg至约1,000mg的药物，一日一次口服给药，可任选地每日以两次或更多次分批剂量给药；给药时间为期望的治疗持续时间，以治疗纤维变性症状。
[00519]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和TNF拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的II型干扰素受体激动剂。上面已经论述了有效数量的II型干扰素受体激动剂。
[00520]在一种实施方案中，本发明提供使用有效数量的目标合成CXCR3配体、TNF拮抗剂和II型干扰素受体激动剂治疗患者纤维变性症状的方法，包括给予患者：a)目标合成CXCR3配体剂量，每剂目标合成CXCR3配体含有的量为约0.1μg至约1000μg，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天，基本上连续或连续地肌内或皮下给药；b)TNF-α拮抗剂剂量，该TNF-α拮抗剂剂量选自：(i)ENBREL，数量为约25mg的药物，每周两次皮下给药，(ii)REMICADE，数量为约3mg/kg至约10mg/kg的药物，每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次、每6周一次或每8周一次静脉内给药，或(iii)HUMIRATM，数量为约40mg的药物，每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次、每6周一次或每8周一次皮下给药，给药时间为期望的治疗持续时间；和c)ActimmuneIPN-γ1b剂量，含有的量为约25μg、50μg、100μg、150μg或200μg，每周三次皮下给药；给药时间为期望的治疗持续时间，以治疗纤维变性症状。
[00521]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予患者CXCR3配体和TNF拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的I型干扰素受体激动剂。上面已经论述了有效数量的I型干扰素受体激动剂。
[00522]在一种实施方案中，本发明提供了使用有效数量的目标合成CXCR3配体、TNF拮抗剂和I型干扰素受体激动剂治疗患者纤维变性症状的方法，包括给予患者：a)目标合成CXCR3配体剂量，每剂目标合成CXCR3配体含有的量为约0.1μg至约1000μg，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天、基本上连续或连续地肌内或皮下给药；b)TNF-α拮抗剂剂量，选自：(i)ENBREL，量为约25mg的药物，每周两次皮下给药，(ii)REMICADE，量为约3mg/kg至约10mg/kg的药物，每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次、每6周一次或每8周一次静脉内给药，或(iii)HUMIRATM，数量为约40mg的药物，每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次、每6周一次或每8周一次皮下给药，给药时间为期望的治疗持续时间；和c)IFN-α剂量，该IFN-α剂量选自：(i)INFERGEN，每剂INFERGEN含有约1μg至约30μg药物，一日一次、每隔一天、每周三次、每周两次、每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次或每天、连续或基本上连续地皮下给药，(ii)PEG化的共有IFN-α(PEG-CIFN)，每剂PEG-CIFN含有约10μg至约100μg或约45μg至约60μg的CIFN氨基酸重量，每周一次、每隔一周、每月三次或每月一次皮下给药，(iii)IFN-α2a、2b或2c，每剂IFN-α2a、2b或2c含有约3MU至约10MU的药物，一日一次、每隔一天、每周三次、每周两次或每天连续或基本上连续地皮下给药，(iv)PEGASYS，每剂PEGASYS含有约90μg至约360μg或约180μg的药物，每周一次、每隔一周、每月三次或每月一次皮下给药，(v)PEG-INTRON，每剂PEG-INTRON含有每千克体重约0.75μg至约3.0μg或约1.0μg至约1.5μg的药物，每周两次、每周一次、每隔一周、每月三次或每月一次皮下给药，或(vi)单PEG(30kD，线型)化的共有IFN-α，每剂单PEG(30kD，线型)化的共有IFN-α含有约100μg至约200μg或约150μg的药物，每周一次、每隔一周、每8天一次至每14天一次、每月三次或每月一次皮下给药；给药时间为期望的治疗持续时间，以治疗纤维变性症状。
[00523]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和TNF拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的SAPK抑制剂。
[00524]有效剂量的SAPK抑制剂的范围为约5μg至约3000mg，例如约5μg至约10μg、约10μg至约25μg、约25μg至约50μg、约50μg至约100μg、约100μg至约250μg、约250μg至约500μg、约500μg至约750μg、约750μg至约1mg、约1mg至约5mg、约5mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约500mg、约500mg至约1000mg、约1000mg至约1500mg、约1500mg至约2000mg、约2000mg至约2500mg、或约2500mg至约3000mg。
[00525]SAPK抑制剂可以每月1次、每月2次、每月3次、每周1次、每周2次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每隔一天1次、每天1次、每天2次给药，或每日将日剂量分为1次至5次进行给药。
[00526]SAPK抑制剂可以以任何频率给药，并且给药时间在约1天至约1周、约2周至约4周、约1月至约2月、约2月至约4月、约4月至约6月、约6月至约8月、约8月至约1年、约1年至约2年、约2你至约4年或更长的时间。
[00527]在一种实施方案中，本发明提供了使用有效数量的目标合成CXCR3配体、TNF拮抗剂和SAPK抑制剂治疗患者纤维变性症状的方法，包括给予患者：a)目标合成CXCR3配体剂量，每剂目标合成CXCR3配体含有的量为约0.1μg至约1000μg，一日一次、每隔一天1次、每周三次或每周两次或每天，基本上连续或连续地肌内或皮下给药，给药时间为期望的治疗持续时间；b)TNF-α拮抗剂剂量，选自：(i)ENBREL，其量为约25mg的药物，每周两次皮下给药，(ii)REMICADE，其量为约3mg/kg至约10mg/kg的药物，每周一次、每隔一周1次、每月三次、每月一次、每6周一次或每8周一次静脉内给药，或(iii)HUMIRATM，其量为约40mg的药物，每周一次、每隔一周一次、每月三次、每月一次、每6周一次或每8周一次皮下给药，给药时间为期望的治疗持续时间；和c)SAPK抑制剂剂量，以重量为基础，剂量在约10μg/kg/天至约10mg/kg/天的范围内，或每天约100μg至约1000mg、或每天约100μg至约1mg、或每天约1mg至约10mg、或每天约10mg至约100mg、或每天约100mg至约1000mg的固定剂量，口服给药，给药时间为期望的治疗持续时间，以治疗纤维变性症状。
[00528]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和TNF拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的TGF-β拮抗剂。有效数量的TGF-β拮抗剂论述于下。
[00529]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和TNF拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的内皮缩血管肽受体拮抗剂。有效数量的内皮缩血管肽受体拮抗剂论述于下。
合成CXCR3配体与TGF-β拮抗剂的联合疗法，用于治疗纤维变性病症
[00530]在一些实施方案中，用于治疗纤维变性症状的目标治疗方案涉及给予有效数量的目标合成CXCR3配体和TGF-β拮抗剂。有效数量的TGF-β拮抗剂包括基于重量的剂量，其范围为约0.25mg/kg/天至约25mg/kg/天，或包括每天约25μg至约1000mg的固定剂量(例如每天约25μg至约50μg、约50μg至约75μg、约75μg至约100μg、约100μg至约200μg、约200μg至约500μg、约500μg至约1mg、约1mg至约10mg、约10mg至约25mg、约25mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约200mg、约200mg至约300mg、约300mg至约400mg、约400mg至约500mg、约500mg至约750mg、或约750mg至约1000mg)，口服、皮下、静脉内或肌内给药。剂量将部分地取决于被给予的具体的TGF-β拮抗剂。
[00531]在一些实施方案中，TGF-β拮抗剂是GLEEVECTM。合适的GLEEVECTM剂量包括，例如每天约25mg至约1000mg，例如每天25mg至50mg、50mg至100mg、100mg至200mg、200mg至300mg、300mg至400mg、400mg至500mg、500mg至600mg、600mg至700mg、700mg至800mg、800mg至900mg或900mg至1000mg的GleevecTM。在某些实施方案中，总的日剂量分作两次日剂量——mg至50mg、50mg至100mg、100mg至200mg、200mg至300mg、300mg至400mg或400mg至500mg——被给予患者。在特定实施方案中，GLEEVECTM以每日口服400mg GLEEVECTM的数量被给予患者。在另一特定实施方案中，GLEEYECTM以每日口服600mg GLEEVECTM的剂量被给予患者。
[00532]TGF-β拮抗剂每月1次、每月2次、每月3次、每周1次、每周2次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次或每日一次给药，或以每天1次至每天5次的范围分批次地给予日剂量，给药时间的范围为约1天至约1周、约2周至约4周、约1月至约2月、约2月至约4月、约4月至约6月、约6月至约8月、约8月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年、或更长时间。
[00533]可以给予多剂量的TGF-β拮抗剂，例如TGF-β拮抗剂可以每月一次、每月两次、每月三次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、或每日一次给药，给药时间的范围为约1天至约1周、约2周至约4周、约1月至约2月、约2月至约4月、约4月至约6月、约6月至约8月、约8月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年、或更长时间。
[00534]在一种实施方案中，本发明提供了使用有效数量的i)目标合成CXCR3配体和ii)TGF-β拮抗剂的联合来治疗患者纤维变性症状的联合疗法，该方法包括共同给予患者：a)目标合成CXCR3配体剂量，每剂目标合成CXCR3配体含有的量为约0.1μg至约1000μg，一日一次、每隔一天一次、每周三次或每周两次或每天，基本上连续或连续地肌内或皮下给药，给药时间为期望的治疗持续时间；和b)TGF-β拮抗剂剂量，含有的量为每天约25μg至约1000mg，一日三次、一日两次、一日一次、每隔一天、每周两次、每周三次、每周一次、每隔一周、每月三次、每月一次口服给药、皮下给药、静脉内给药或肌内给药，给药时间为期望的治疗持续时间，以治疗纤维变性症状。
[00535]在一些实施方案中，本发明提供了使用有效数量的i)目标合成CXCR3配体和ii)TGF-β拮抗剂的联合来治疗患者纤维变性症状的联合疗法，该方法包括共同给予患者：a)目标合成CXCR3配体剂量，每剂目标合成CXCR3配体含有约0.1μg至约1000μg的量，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天，基本上连续或连续地肌内或皮下给药，给药时间为期望的治疗持续时间；和b)GLEEVECTM，含有的量为每天400mg或600mg，每天一次口服给药，给药时间为期望的治疗持续时间，以治疗纤维变性症状。
[00536]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和TGF-β拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的吡非尼酮或吡非尼酮类似物。有效数量的吡非尼酮或吡非尼酮类似物论述于上。
[00537]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和TGF-β拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的II型干扰素受体激动剂。有效数量的II型干扰素受体激动剂论述于上。
[00538]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和TGF-β拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的I型干扰素受体激动剂。有效数量的I型干扰素受体激动剂论述于上。
[00539]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和TGF-β拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的SAPK抑制剂。有效数量的SAPK抑制剂论述于上。
[00540]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和TGF-β拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的TNF拮抗剂。有效数量的TNF拮抗剂论述于上。
[00541]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和TGF-β拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的内皮缩血管肽受体拮抗剂。有效数量的内皮缩血管肽受体拮抗剂论述于下。
合成CXCR3配体与内皮缩血管肽受体拮抗剂的联合疗法，用于治疗纤维变性病症
[00542]在一些实施方案中，用于治疗纤维变性症状的目标治疗方案涉及给予有效数量的目标合成CXCR3配体和内皮缩血管肽受体拮抗剂。有效剂量的内皮缩血管肽受体拮抗剂包括基于重量的剂量，其范围为约0.25mg/kg/天至约25mg/kg/天，或包括每天约25μg至约1000mg的固定剂量(例如每天约25μg至约50μg、约50μg至约75μg、约75μg至约100μg、约100μg至约200μg、约200μg至约500μg、约500μg至约1mg、约1mg至约10mg、约10mg至约25mg、约25mg至约50mg、约50mg至约100mg、约100mg至约200mg、约200mg至约300mg、约300mg至约400mg、约400mg至约500mg、约500mg至约750mg或约750mg至约1000mg)。剂量将部分地取决于被给予的具体的内皮缩血管肽受体拮抗剂。尽管其他给药途径也可用，内皮缩血管肽受体拮抗剂通常口服、皮下、静脉内或肌内给药。
[00543]在一些实施方案中，内皮缩血管肽受体拮抗剂是TRACLEERTM。合适的TRACLEERTM剂量包括，例如约25mg至约150mg，每天一次或两次，例如每天一次或两次约25mg至约30mg、约30mg至约40mg、约40mg至约50mg、约50mg至约60mg、约60mg至约70mg、约70mg至约80mg、约80mg至约90mg、约90mg至约100mg、约100mg至约125mg或约125mg至约150mg的TRACLEERTM。在一些实施方案中，TRACLEERTM以62.5mg TRACLEERTM的量一日两次口服给药，持续4周，随后，以125mg的量，一日两次口服给予TRACLEERTM，持续一段期望的治疗时间。
[00544]内皮缩血管肽受体拮抗剂每月一次、每月两次、每月三次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每天一次给药，或以每天1次至每天5次范围内的分批日剂量给药，给药时间的范围为约1天至约1周、约2周至约4周、约1月至约2月、约2月至约4月、约4月至约6月、约6月至约8月、约8月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年、或更长时间。
[00545]可以给予多剂量的内皮缩血管肽受体拮抗剂，例如内皮缩血管肽受体拮抗剂可以每月一次、每月两次、每月三次、每隔一周(qow)、每周一次(qw)、每周两次(biw)、每周三次(tiw)、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天(qod)、每天一次(qd)、每天两次(bid)或每天三次(tid)给药，给药时间的范围为约1天至约1周、约2周至约4周、约1月至约2月、约2月至约4月、约4月至约6月、约6月至约8月、约8月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年或更长时间。
[00546]在一些实施方案中，本发明提供了使用有效数量的i)目标合成CXCR3配体和ii)内皮缩血管肽受体拮抗剂的联合来治疗患者纤维变性症状的联合疗法，该方法包括共同给予患者：a)目标合成CXCR3配体剂量，每剂目标合成CXCR3配体含有的量为约0.1μg至约1000μg，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天，基本上连续或连续地肌内或皮下给药，给药时间为期望的治疗持续时间；和b)内皮缩血管肽受体拮抗剂，含有的量为每天约25μg至约1000mg，一日三次、一日两次、一日一次、每隔一天、每周两次、每周三次、每周一次、每隔一周、每月三次或每月一次口服给药、皮下给药、静脉内给药或肌内给药，给药时间为期望的治疗持续时间，以治疗纤维变性症状。
[00547]在一些实施方案中，本发明提供了使用有效数量的i)目标合成CXCR3配体和ii)内皮缩血管肽受体拮抗剂的联合来治疗患者纤维变性症状的联合疗法，该方法包括共同给予患者：a)目标合成CXCR3配体剂量，每剂目标合成CXCR3配体含有的量为约0.1μg至约1000μg，一日一次、每隔一天、每周三次或每周两次或每天，基本上连续或连续地肌内或皮下给药，给药时间为期望的治疗持续时间；和b)TRACLEERTM剂量，含有的量为62.5mg或125mg，每天两次口服给药，给药时间为期望的治疗持续时间，以治疗纤维变性症状。
[00548]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和内皮缩血管肽受体拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的吡非尼酮或吡非尼酮类似物。有效数量的吡非尼酮或吡非尼酮类似物论述于上。
[00549]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和内皮缩血管肽受体拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的II型干扰素受体激动剂。有效数量的II型干扰素受体激动剂论述于上。
[00550]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和内皮缩血管肽受体拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的I型干扰素受体激动剂。有效数量的I型干扰素受体激动剂论述于上。
[00551]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和内皮缩血管肽受体拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的SAPK抑制剂。有效数量的SAPK抑制剂论述于上。
[00552]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和内皮缩血管肽受体拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的TNF拮抗剂。有效数量的TNF拮抗剂论述于上。
[00553]在一些实施方案中，本发明提供了联合疗法，涉及对上述治疗方案中的任一方案进行修改，这些治疗方案的特征是给予目标CXCR3配体和内皮缩血管肽受体拮抗剂，其中所述修改涉及进一步给予有效数量的TGF-β拮抗剂。有效数量的TGF-β拮抗剂论述于上。合成CXCR3配体与N-乙酰半胱氨酸的联合疗法，用于治疗纤维变性病症
[00554]在一些实施方案中，治疗纤维变性症状的目标方法涉及给予有效数量的目标合成CXCR3配体和N-乙酰半胱氨酸。而且，治疗纤维变性症状的任何上述治疗方案可以进行修改以包括给予有效数量的N-乙酰半胱氨酸(NAC)。
[00555]有效剂量的NAC的范围可以在每天约100mg至约1000mg内、或每天约100mg至约500mg、或每天约500mg至约750mg、或每天约750mg至约1000mg、或每天约400mg至约3600mg、或每天约800mg至约2400mg、或每天约1000mg至约1800mg、或每天约1200mg至约1600mg。
[00556]NAC可以每月一次、每月两次、每月三次、每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每周六次、每隔一天一次、每天一次、每天两次、每天三次给药，或以每天1次至每天5次范围内的分批日剂量给药。
[00557]NAC可以以任何频率给药，给药时间的范围为约1天至约1周、约2周至约4周、约1月至约2月、约2月至约4月、约4月至约6月、约6月至约8月、约8月至约1年、约1年至约2年、或约2年至约4年或更长时间。
[00558]在一些实施方案中，NAC在整个目标联合治疗疗程期间被施用。在其他实施方案中，NAC的给药时间短于整个目标联合治疗疗程的时间，例如仅在联合治疗的第一阶段给药、仅在联合治疗的第二阶段给药、或在联合治疗疗程的其他部分时间给药。
[00559]在一些实施方案中，NAC以这样的NAC剂量被给药，其中含有的量为每天约500mg至约3000mg的NAC，口服给药，可任选地以每天两次或更多次分批剂量给药，给药持续一段期望的治疗时间。
[00560]在一些实施方案中，NAC以每剂500mg药物的剂量口服给药，每天一次、每天两次或每天三次给药，给药持续一段期望的治疗时间。
[00561]在其他实施方案中，NAC以每剂600mg药物的剂量口服给药，每天一次、每天两次或每天三次给药，给药持续一段期望的治疗时间。
[00562]在其他实施方案中，NAC以每剂750mg药物的剂量口服给药，每天一次、每天两次或每天三次给药，给药持续一段期望的治疗时间。
[00563]在其他实施方案中，NAC以每剂1000mg药物的剂量口服给药，每天一次、每天两次或每天三次给药，给药持续一段期望的治疗时间。
进一步的联合
[00564]作为非限制性的例子，任何上述以II型干扰素受体激动剂用药为特征的治疗方法可以进行修改，以用IFN-γ用药来替换目标II型干扰素受体激动剂用药，包括给予每剂含有25μg药物的IFN-γ剂量，每周三次皮下给药，给药时间持续一段期望的治疗时间。
[00565]作为非限制性的例子，任何上述以II型干扰素受体激动剂用药为特征的治疗方法可以进行修改，以用IFN-γ用药来替换目标II型干扰素受体激动剂用药，包括给予每剂含有50μg药物的IFN-γ剂量，每周三次皮下给药，给药时间持续一段期望的治疗时间。
[00566]作为非限制性的例子，任何上述以II型干扰素受体激动剂用药为特征的治疗方法可以进行修改，以用IFN-γ用药来替换目标II型干扰素受体激动剂用药，包括给予每剂含有100μg药物的IFN-γ剂量，每周三次皮下给药，给药时间持续一段期望的治疗时间。
[00567]作为非限制性的例子，任何上述以II型干扰素受体激动剂用药为特征的治疗方法可以进行修改，以用IFN-γ用药来替换目标II型干扰素受体激动剂用药，包括给予每剂含有200μg药物的IFN-γ剂量，每周三次皮下给药，给药时间持续一段期望的治疗时间。
[00568]作为非限制性的例子，任何上述以TGF-β拮抗剂用药为特征的治疗方法可以进行修改，以用GleevecTM用药来替换目标TGF-β拮抗剂用药，包括给予每剂含有400mg至800mg或600mg药物的GleevecTM剂量，每天口服给药，或可任选地每天以两次或更多次分批剂量给药，给药时间持续一段期望的治疗时间。
[00569]作为非限制性的例子，任何上述以内皮缩血管肽受体拮抗剂用药为特征的方法可以进行修改，以用内皮缩血管肽受体拮抗剂用药来替换目标内皮缩血管肽受体拮抗剂用药，包括给予含有62.5mg药物的TracleerTM剂量，每天2次口服给药先进行4周的治疗，然后给予含有125mg药物的TracleerTM剂量，每天2次口服给药进行剩余的治疗；给药时间持续一段期望的治疗时间。
[00570]作为非限制性的例子，任何上述以TNF拮抗剂用药为特征的治疗方法可以进行修改，以用TNF拮抗剂用药来替换目标TNF拮抗剂用药，包括给予TNF拮抗剂剂量，其选自(i)依那西普，每剂含有25mg的药物，每周两次皮下给药，(ii)infliximab，每剂含有每千克体重3mg的药物，在第0、2和6周静脉内给药，之后每8周进行给药，或(iii)adalimumab，每剂含有40mg的药物，每周1次、每两周1次皮下给药；给药时间持续一段期望的治疗时间。
[00571]目标发明提供了对任何上述治疗方法的修饰，这些方法被修饰，以包括给予有效数量的副作用控制剂(side effect management agent)(“治标剂(palliativeagent)”)，所述试剂在一段期望的治疗时间内被给予。在许多实施方案中，副作用控制剂选自一种或多种下述物质：对乙酰氨基苯酚、布洛芬和其他NSAIDs、H2阻断剂和制酸剂。例如，当联合疗法中的第二治疗剂是IFN-α或IFN-γ时，可以给予副作用控制剂。
[00572]合适的NSAIDs包括但不限于1)昔康类(oxicams)，诸如吡罗昔康、伊索昔康、替诺昔康和舒多昔康；2)水杨酸类(salicylates)，诸如阿斯匹林、双水杨酸、苯乐来、三水杨酸胆碱镁、safapryn、solprin、二氟尼柳和芬度柳；3)乙酸衍生物类，诸如双氯芬酸钠、芬氯酸、吲哚美辛、舒林酸、托美汀、伊索克酸、呋罗芬酸、硫平酸、齐多美辛、阿西梅辛、芬替酸、佐美酸(zomepiract)、环氯茚酸、奥昔平酸和联苯乙酸；4)芬那酯衍生物类(fenamates)，诸如甲芬那酸、甲氯胺苯酸、氟芬那酸、尼氟灭酸和托芬那酸；5)丙酸衍生物，诸如布洛芬、甲氧萘普酸、苯洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、菲诺洛芬、芬布芬、吲哚洛芬、吡洛芬、卡洛芬、丙嗪、普拉洛芬、米洛芬、硫洛芬、舒洛芬、阿米洛芬和噻洛芬酸；和6)吡唑类，诸如苯基丁氮酮、羟布宗、非普拉宗、阿扎丙宗和trimethazone，也可以使用这些非类固醇类抗炎剂的混合物，以及这些药剂的药学上可接受的盐和酯。
[00573]适合作为治标剂而应用于目标疗法的合适的H2阻断剂(组胺2型受体拮抗剂)包括但不限于：甲氰咪胍(例如西咪替丁、Peptol、Nu-cimet、apo-甲氰咪胍、非-甲氰咪胍)；雷尼替丁(例如Zantac、Nu-ranit、Novo-randine和apo-雷尼替丁)；和法莫替丁(Pepcid、Apo-法莫替丁和Novo-法莫替丁)。
适合治疗的对象
[00574]目标方法适合于治疗纤维变性症状，治疗对象包括诊断患有纤维变性疾病诸如IPF，肝纤维化或肾纤维化的个体。目标方法也适合于治疗可能会患纤维变性疾病的个体。
[00575]适合于用本发明的癌症治疗方法治疗的对象包括患有任何类型的癌症的个体。在特别的实施方案中，合适的对象是患有癌症的个体，而该癌症可用合成CXCR3配体疗法治疗。
[00576]适合于用本发明方法治疗的、患有肝纤维化的个体包括经临床诊断患有肝纤维化的个体，以及还未诊断有临床肝纤维化但被认为可能会患肝纤维化的个体。此类个体包括但不限于感染HCV的个体；感染HBV的个体；感染曼氏吸血虫(Schistosoma mansoni)的个体；接触已知能导致肝纤维化的化学试剂的个体；诊断患有威尔逊氏病的个体；诊断患有血色病的个体；和患有酒精性肝病的个体；患有非酒精性脂肪性肝炎(steatohepatitis)的个体；患有自身免疫性肝炎的个体；患有原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化症或α-1-抗胰蛋白酶缺乏症的个体。
[00577]在许多实施方案中，经临床诊断感染HCV的个体是特别感兴趣的。感染HCV的个体经鉴定在它们的血液中含有HCV RNA，和/或在它们的血清里含有抗HCV抗体。在许多实施方案中，感兴趣的个体包括：那些显示出因慢性HCV感染而引起的严重纤维变性或早期硬化症(非代谢失调的，Child′s-Pugh A级或分值更小)或更晚期的硬化症(代谢失调的，Child′s-Pugh B或C级)的个体；那些尽管已经用IFN-α疗法进行抗病毒治疗但依然有病毒血症的个体；那些不能耐受基于IFN-α的治疗的个体；或那些对此类治疗有禁忌的个体。在特别感兴趣的实施方案中，依据METAVIR评分系统，具有阶段3或4肝纤维化的HCV阳性个体适合于用本发明的方法治疗。在其他实施方案中，适合于用本发明方法治疗的个体是患有有临床表现的代谢失调硬化症的患者，包括患有重度肝硬化症的患者，包括那些等候肝脏移植的患者。在其他实施方案中，适合于用本发明方法治疗的个体包括患有轻度纤维变性的患者，包括患有早期纤维变性的患者(METAVIR、Ludwig和Scheuer评分系统中的阶段1和2；或Ishak评分系统中的阶段1、2或3)。
[00578]目标方法适合于治疗经诊断患有IPF的个体。这些方法也适合于治疗患有IPF的个体，所述个体在之前24个月内已用皮质类甾醇治疗，并且所述个体没有对先前的皮质类甾醇治疗产生应答。也包括这样的对象，其在治疗开始时具有这样的FVC，即，其为至少55％的预测FVC百分比。预测FVC百分比值是基于正常值，正常值是本领域已知的。参见例如Crapo et al.(1981)Am.Rev.Respir.Dis.123：659-664。用肺量测定的标准方法测量FVC。
[00579]尽管本发明参考其具体实施方案进行了描述，但本领域技术人员将理解，可以进行各种变化，等同物可以被取代，而不会脱离本发明的精神和范围。此外，可以进行许多修饰，以使得特定的条件、材料、物质组合物、方法、工艺步骤适合于本发明的目标、精神和范围。所有此类修饰都包括在权利要求书的范围内。
                              序列表
<110>L·M·布拉特(Blatt，Lawrence M)
<120>合成的趋化因子受体配体及其使用方法
<130>INTM-033WO
<140>Unassigned
<141>
<150>60/471,404
<151>2003-05-16
<160>20
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>77
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有IP-10序列
<400>1
Val Pro Leu Ser Arg Thr Gly Arg Cys Thr Cys Ile Ser Ile Ser Asn
 1               5                  10                  15
Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu Glu Ile Ile Pro Pro
            20                  25                  30
Ser Gln Phe Cys Pro Lys Ile Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Lys Asn
        35                  40                  45
Gly Glu Gln Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Ala Ile Lys Asn Leu
    50                  55                  60
Ile Lys Lys Val Ser Arg Glu Met Ser Lys Lys Ser Pro
65                  70                  75
<210>2
<211>74
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有I-TAC序列
<400>2
Phe Pro Met Phe Arg Arg Gly Arg Cys Leu Cys Ile Ser Pro Gly Val
 1               5                  10                  15
Lys Ala Val Lys Val Ala Ser Leu Glu Lys Leu Ser Ile Met Tyr Pro
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Lys Asn
        35                  40                  45
Gly Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys Gln Ala Lys Leu Leu
    50                  55                  60
Ile Lys Lys Val Glu Arg Lys Lys Asn Phe
65                  70
<210>3
<211>104
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>共有Mig序列
<400>3
Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser Cys Ile Ser Thr Asn Gln
 1               5                  10                  15
Gly Thr Val His Leu Gln Ser Leu Glu Lys Leu Lys Ile Phe Ala Pro
            20                  25                  30
Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Lys Asn
        35                  40                  45
Gly Val Gln Arg Cys Leu Asn Pro Asp Ser Lys Asp Val Lys Glu Leu
    50                  55                  60
Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys Lys Lys Gln Lys Asn
65                  70                  75                  80
Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys Val Arg Lys Val Gln
                85                  90                  95
Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr
            100
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>表位标记
<400>4
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
 1               5                  10
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>表位标记
<400>5
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
 1               5
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>表位标记
<400>6
Cys Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
 1               5                  10
<210>7
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酶切割位点
<400>7
Asp Asp Asp Asp Lys
 1               5
<210>8
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酶切割位点
<400>8
Ile Glu Gly Arg
 1
<210>9
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酶切割位点
<400>9
Leu Val Pro Arg Gly Ser
 1               5
<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>蛋白酶切割位点
<400>10
His Pro Phe His Leu Val Ile His
 1               5
<210>11
<211>104
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>″多数″序列
<221>可变
<222>1，3，4，6，10，14，15，16，17，18，20，21，22，28，30，31，34，35，37，50，57，60，61，63，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，96，98，99，100，103，104
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>11
Xaa Pro Xaa Xaa Arg Xaa Gly Arg Cys Xaa Cys Ile Ser Xaa Xaa Xaa
 1               5                  10                  15
Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Ser Leu Glu Lys Leu Xaa Ile Xaa Xaa Pro
            20                  25                  30
Ser Xaa Xaa Cys Xaa Lys Ile Glu Ile Ile Ala Thr Leu Lys Lys Asn
        35                  40                  45
Gly Xaa Gln Arg Cys Leu Asn Pro Xaa Ser Lys Xaa Xaa Lys Xaa Leu
    50                  55                  60
Ile Lys Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
65                  70                  75                  80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Xaa
                85                  90                  95
Arg Xaa Xaa Xaa Lys Lys Xaa Xaa
            100
<210>12
<211>98
<212>PRT
<213>人类(Homo sapien)
<400>12
Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu Thr Leu
 1               5                  10                  15
Ser Gly Ile Gln Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys
            20                  25                  30
Ile Ser Ile Ser Asn Gln Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys Leu
        35                  40                  45
Glu Ile Ile Pro Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala
    50                  55                  60
Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys
65                  70                  75                  80
Ala Ile Lys Asn Leu Leu Lys Ala Val Ser Lys Glu Met Ser Lys Arg
                85                  90                  95
Ser Pro
<210>13
<211>94
<212>PRT
<213>人类
<400>13
Met Ser Val Lys Gly Met Ala Ile Ala Leu Ala Val Ile Leu Cys Ala
 1               5                  10                  15
Thr Val Val Gln Gly Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys
            20                  25                  30
Ile Gly Pro Gly Val Lys Ala Val Lys Val Ala Asp Ile Glu Lys Ala
        35                  40                  45
Ser Ile Met Tyr Pro Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Val Ile Ile
    50                  55                  60
Thr Leu Lys Glu Asn Lys Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys
65                  70                  75                  80
Gln Ala Arg Leu Ile Ile Lys Lys Val Glu Arg Lys Asn Phe
                85                  90
<210>14
<211>125
<212>PRT
<213>人类
<400>14
Met Lys Lys Ser Gly Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Leu Leu Val
 1               5                  10                  15
Leu Ile Gly Val Gln Gly Thr Pro Val Val Arg Lys Gly Arg Cys Ser
            20                  25                  30
Cys Ile Ser Thr Asn Gln Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys Asp
        35                  40                  45
Leu Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu Lys Ile Glu Ile Ile
    50                  55                  60
Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala
65                  70                  75                  80
Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys
                85                  90                  95
Lys Lys Gln Lys Ash Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys
            100                 105                 110
Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr
        115                 120                 125
<210>15
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>杂合CXCR3配体
<400>15
Met Lys Lys Ser Gly Val Leu Phe Leu Leu Gly Ile Ile Leu Leu Val
 1               5                  10                  15
Leu Ile Gly Val Gln Gly Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu
            20                  25                  30
Cys Ile Gly Pro Gly Val Lys Pro Val Asn Pro Arg Ser Leu Glu Lys
        35                  40                  45
Leu Glu Ile Ile Pro Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Ile Glu Ile Ile
    50                  55                  60
Ala Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Lys
65                  70                  75                  80
Gln Ala Arg Leu Ile Ile Lys Lys Val Ser Lys Glu Met Ser Lys Arg
                85                  90                  95
Ser Pro
<210>16
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
                                                  4
<220>
<223>杂合CXCR3配体
<400>16
Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu Thr Leu
 1               5                  10                  15
Ser Gly Ile Gln Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Leu Cys
            20                  25                  30
Ile Gly Pro Gly Val Lys Ala Val Lys Val Ala Asp Ile Glu Lys Ala
        35                  40                  45
Ser Ile Met Tyr Pro Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Ile Ile Ala
    50                  55                  60
Thr Leu Lys Asn Gly Val Gln Thr Cys Leu Asn Pro Asp Ser Ala Asp
65                  70                  75                  80
Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys Lys
                85                  90                  95
Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys Val
            100                 105                 110
Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr
        115                 120
<210>17
<211>125
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>杂合CXCR3配体
<400>17
Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu Cys Ala
 1               5                  10                  15
Thr Val Val Gln Gly Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Leu Cys
            20                  25                  30
Ile Gly Pro Gly Val Lys Ala Val Lys Val Ala Asp Ile Glu Lys Ala
        35                  40                  45
Ser Ile Met Tyr Pro Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Val Ile Ile
    50                  55                  60
Thr Leu Lys Glu Asn Lys Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Ala
65                  70                  75                  80
Asp Val Lys Glu Leu Ile Lys Lys Trp Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys
                85                  90                  95
Lys Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys
            100                 105                 110
Val Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr
        115                 120                 125
<210>18
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>杂合CXCR3配体
<400>18
Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu Thr Leu
 1               5                  10                  15
Ser Gly Ile Gln Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys
            20                  25                  30
Ile Ser Ile Ser Asn Gln Ala Val Lys Val Ala Asp Ile Glu Lys Ala
        35                  40                  45
Ser Ile Met Tyr Pro Ser Asn Asn Cys Asp Lys Ile Glu Val Ile Ile
    50                  55                  60
Thr Leu Lys Glu Asn Lys Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys
65                  70                  75                  80
Gln Ala Arg Leu Ile Ile Lys Lys Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys Lys
                85                  90                  95
Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys Val
            100                 105                 110
Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr
        115                 120
<210>19
<211>124
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>杂合CXCR3配体
<400>19
Met Asn Gln Thr Ala Ile Leu Ile Cys Cys Leu Ile Phe Leu Thr Leu
 1               5                  10                  15
Ser Gly Ile Gln Gly Phe Pro Met Phe Lys Arg Gly Arg Cys Ser Cys
            20                  25                  30
Ile Ser Thr Asn Gln Gly Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys Asp Leu
        35                  40                  45
Glu Ile Ile Pro Ala Ser Gln Phe Cys Pro Arg Ile Glu Val Ile Ile
    50                  55                  60
Thr Leu Lys Glu Asn Lys Gly Gln Arg Cys Leu Asn Pro Lys Ser Lys
65                  70                  75                  80
Gln Ala Arg Leu Ile Ile Lys Lys Glu Lys Gln Val Ser Gln Lys Lys
                85                  90                  95
Lys Gln Lys Asn Gly Lys Lys His Gln Lys Lys Lys Val Leu Lys Val
            100                 105                 110
Arg Lys Ser Gln Arg Ser Arg Gln Lys Lys Thr Thr
        115                 120
<210>20
<211>98
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>杂合CXCR3配体
<400>20
Met Ser Val Lys Gly Met Ala Ile Ala Leu Ala Val Ile Leu Cys Ala
 1               5                  10                  15
Thr Val Ile Gln Gly Val Pro Leu Ser Arg Thr Val Arg Cys Thr Cys
            20                  25                  30
Ile Ser Ile Ser Asn Gln Thr Ile His Leu Gln Ser Leu Lys Asp Leu
        35                  40                  45
Lys Gln Phe Ala Pro Ser Pro Ser Cys Glu Lys Val Glu Ile Ile Ala
    50                  55                  60
Thr Met Lys Lys Lys Gly Glu Lys Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys
65                  70                  75                  80
Gln Ala Arg Leu Ile Ile Lys Lys Val Ser Lys Glu Met Ser Lys Arg
                85                  90                  95
Ser Pro

Claims (20)

1.合成的CXCR3多肽配体，其包括长度为约70至约125个氨基酸的多肽，可任选地进一步包括附着到N-末端通常第一个氨基酸上的额外的甲硫氨酸，所述多肽的氨基酸序列顺次地包括分立的子序列，所述子序列在氨基酸组成和数目上对应于不同的、天然存在的CXCR3配体的子序列，所述天然存在的CXCR3配体选自IP-10、I-TAC和Mig，其中所述合成CXCR3多肽的氨基酸序列不同于所述天然存在的CXCR3配体IP-10、I-TAC和Mig的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的合成CXCR3多肽配体，其中所述CXCR3配体包括SEQ IDNOs：15-20中任一个所述的氨基酸序列。
3.合成的CXCR3配体，其包括长度为约70至约125个氨基酸的多肽，可任选地进一步包括附着到N-末端通常第一个氨基酸上的额外的甲硫氨酸，所述多肽的氨基酸序列包含IP-10、Mig和I-TAC所共有的那些氨基酸残基，而在没有IP-10、Mig和I-TAC共有氨基酸的那些位置中的一个或多个位置，则包含了在那个位置主要出现的氨基酸。
4.如权利要求3所述的合成CXCR3配体，其中所述CXCR3配体包括SEQ ID NO：01、02和03中任一个所述的氨基酸序列。
5.组合物，其包含权利要求1-4中任一项所述的合成CXCR3配体。
6.多核苷酸，其包括编码权利要求1-4任一项所述的合成CXCR3配体的核苷酸序列。
7.如权利要求6所述的多核苷酸，其中所述合成CXCR3配体包括SEQ ID NO：01、02、03、15、16、17、18、19和20中任一个所述的氨基酸序列。
8.表达载体，其包含权利要求6所述的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接到启动子。
9.宿主细胞，其包含权利要求6所述的多核苷酸。
10.宿主细胞，其包含权利要求8所述的表达载体。
11.用于产生合成CXCR3配体的方法，所述方法包括：
在有利于产生所述合成CXCR3配体的条件下，培养权利要求10所述的宿主细胞；和
从培养物中分离出所述合成CXCR3配体。
12.抗体，其特异性地结合权利要求1-4任一项所述的合成CXCR3配体。
13.治疗在个体中的纤维变性疾病的方法，所述方法包括：
给予患有纤维变性疾病的个体一定数量的合成CXCR3配体，其有效地治疗或预防所述个体的纤维变性疾病。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述纤维变性疾病是肺纤维化。
15.如权利要求13所述的方法，其中，所述肺纤维化是特发性肺纤维化。
16.如权利要求13所述的方法，其中，所述肺纤维化由已知的病因引起。
17.如权利要求13所述的方法，其中，所述纤维变性疾病选自肝纤维化、肾纤维化、心脏纤维化和硬皮病。
18.减少在具有肿瘤的个体中的肿瘤生长的方法，所述方法包括给予所述个体有效数量的合成CXCR3配体。
19.如权利要求18所述的方法，进一步包括给予有效数量的抗肿瘤剂，所述抗肿瘤剂选自烷化剂、亚硝基脲、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、植物(长春花)生物碱、紫杉烷和类固醇激素。
20.如权利要求13-19中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
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