CN1040504A - 用双链核糖核酸调节淋巴激活素抗性细胞状态 - Google Patents

Abstract

使肿瘤细胞与外源性失配dsRNA接触可使对淋巴激活素特别是干扰素和白细胞介素的抗增殖作用无反应性或只有低反应性的肿瘤细胞变为有反应性的。这些dsRNA本身可调节感受性肿瘤的细胞生长使之趋于正常化和丢失肿瘤细胞表型。

Description

本发明涉及单独使用或与淋巴激活素结合使用双链核糖核酸（以下简称dsRNA）以抑制动物包括人体内的瘤细胞增殖、纠正动物包括人体内肿瘤或癌性细胞中的缺陷、并治疗因某些个体具有易感受肿瘤或癌性条件的素质所致的免疫系统紊乱，而不管这种素质产生于遗传还是环境因素。本发明还涉及dsRNA与其他化学和生物学制剂结合以治疗肿瘤或癌性状态的应用。

Ⅰ.IFN功能及作为IFN诱导剂的dsRNA

干扰素（下称IFN）构成一类能抑制动物细胞内病毒复制的蛋白质。它们是细胞来源的，可在体外或体内产生，并可被相当广泛的材料刺激（The    Encyclopedia    of    Biochemistry，Roger    Williams和Edwin    Lansford编，Reinhold    Publishing    Company，1967）。已知IFN具有抗增殖作用及抗病毒作用（Natare    262，300，1978）、重建接触抑制作用（J.Cell    Bio;56，846，1973），并抑制瘤细胞在半固态琼脂中生长（Nature，231，20，1971）。

dsRNA是包括z（白细胞）、β（成纤维细胞）和7（免疫）型等不同人IFN分子的诱导剂（J.Reticuloendothelial    Society，23，299，1978），天然和合成的dsRNA均可刺激IFN产生。例如Lampson等人在美国专利3666646号中所述以多聚核糖肌苷酸和多聚核糖胞苷酸（以下简称r    In·r    Cn或Poly    IC）之复合物形式存在的合成的dsRNA，严格地说即是一种已知的干扰素诱导剂。除了其诱导IFN的作用外，dsRNA还是各种IFN诱导的酶即一种蛋白激酶和一种2′-5′寡聚腺苷酸合成酶的激活剂（Proc.Natl.Acad.Sci.，75，5893，1978）。然而，尚不知道干扰素抗增殖和抗恶变作用的分子基础及它们与dsRNA的关系，而且在本发明之前也不知道dsRNA除作为干扰素诱导剂之外的任何抗增殖作用。

Ⅱ.合成的dsRNA的失配类似物

最近发现IFN也能被r    In·r    Cn的失配类似物诱导（见Ts′o和Carter的美国专利4130641及4024222号）。这些类似物是经修饰r    In·r    Cn以沿着多聚核糖胞苷酸（r    Cn）链掺入未配对的碱基（尿嘧啶或鸟嘌呤）或经修饰多聚核糖肌苷酸（r    In）之核糖基骨架而形成的。失配的类似物，特别是以r    Cn链修饰的类似物只要符合某些结构要求，即可保留诱导干扰素的能力。如图解所示，优选碱基完全配对的dsRNA的长区域并不适于诱导干扰素的要求。实际上，适于激发干扰素合成的结构上的先决条件似乎在于保留1/2到1圈碱基完全配对之dsRNA螺旋。

已注意到当失配多聚物与核酸酶接触时可加快水解速度（J.Molec.Biol.，70，567，1972），另外就干扰素诱导作用来说这些dsRNA的活性接近于未修饰的r In·r Cn。有人提出延长保留完整的双螺旋结构与常常视为药物毒性的对dsRNA的许多其他生物学反应有关。在各种动物系统中研究HEM Research有限公司（Rockville，Md.，10852，USA）的美国注册商标为Ampligen

的失配类似物r In·r（C_11-14，U）n，表明r In·r（C₁₂，U）n的毒性小于r In·r Cn（见Poly IC with mismatched bases，prospects for cancer therapy，Augmenting Agents in Cancer Therapy，E.M.Hersh等人编，Raven Press，New York，177，1981）。特别是，对小鼠重复给予r In·r（C_-，U）n，对小鼠骨髓成分、肝细胞、胸腺细胞和脾细胞等极敏感的器管将产生小得多的毒性（J.Molec.Biol.70，567，1972），但同时又保留了阻止各种致死性病毒攻击的效能（Molec.Pharm.，12，299，1976）。

此外，r In·r（C_11-14，U）n在兔体内表现降低了（100倍）与r In·r Cn有关的热原性、体外降低（5-10倍）小鼠和人细胞的有丝分裂性，并在兔和小鼠体内减少了（5-10倍）ds RNA抗体形成。相对这一降低细胞毒性的背景，r In·r（C_11-14，U）n保留了其诱导干扰素、刺激天然杀伤（NK）细胞功能（J.Immuno，124，1852，1980）及激活上述细胞内介体2′-5′寡聚腺苷酸合成酶和特异性蛋白激酶的能力。因此可见，在各种试验系统（兔、小鼠和人）中及测定各种毒性和治疗作用的不同剂量范围下，失配类似物r In·（C_11-14，U）n（Ampligen

）均表现提高了治疗方面的作用。文献已述及了这种失配诱导剂/激活剂的制备和配制（J.Molec.Bio.70，567，1972）。

已知使用修饰的r    In·r    Cn类似物的唯一目的是在动物细胞中诱导干扰素产生以对抗病毒攻击，如参见前述的美国专利4130641和4024222号。但就其作为抗增殖剂的应用来说，对IFN（及其他单独给予的淋巴激活素）治疗上的一个障碍在于这类淋巴激活素在许多个体中只表现出边际效应。因此，需要给予相对大量的淋巴激活素，导致体内非天然地高淋巴激活素水平，而这种情况在正常人体对一般性病毒感染、免疫细胞分化或与抗癌、抗病毒有关的天然免疫监视机制及宿主防御机制的反应过程中是不应发生的。在这种情况下，机体可作为外来物质处理淋巴激活素如IFN，而且被治疗的个体具有产生抗各种淋巴激活素如IFN之抗体的能力。这些所得抗体一般可破坏任何余留的治疗效果。

再者，瘤细胞特别具有对各种淋巴激活素如IFN和白细胞介素家族不同成员的治疗性质产生抗性的能力。正如下面将被证明的，瘤细胞系的这种发展抗IFN抗性的能力是作为非随机表现型而获得的，因此这便造成基于单独使用淋巴激活素来抑制增殖之治疗方法的一个严重缺点。本发明通过所公开的阻止或显著地抑制癌细胞（无论该细胞是否已发展到了淋巴激活素抗性）增加的新的抗增殖剂和组合物而克服了现有技术中的这一缺陷。此外，本发明提供了含有干扰素的组合物，其中虽然干扰素的整体水平比现有技术中所达到的水平低20至50倍，但其可产生更大的治疗效果。因为本发明的组合物含有起协同作用的dsRNA，所以dsRNA比现有技术中公开者能发挥大得多的治疗效果，并确实对骨基质之掩敝区内的肿瘤发挥治疗作用，而该肿瘤掩敝区显然可阻止当外界提供的淋巴激活素作为单一治疗剂给予时接近该区域。

Ⅲ.作为抗肿瘤细胞之免疫监视机制的天然杀伤（NK）细胞

已发表了许多认为NK细胞群在抗瘤细胞的免疫监视机制中起中心作用的文章。证明具有高NK细胞活性的小鼠比具有低NK细胞活性的小鼠对NK敏感性肿瘤细胞的生长有着更大抗性（Immunol.Rev.，44，165，1979）。还有人报导，具有选择性NK细胞缺乏的C57BL/6米色小鼠比具有正常NK细胞活性的同系小鼠对肿瘤生长更为敏感（Nature（Lond.），284，622，1980;Nature，284，624，1980）。在患有Chediak-Higashi综合症的病人体内存在相似情况，而且有人认为这种疾病中的NK细胞缺乏可能与继后在这些病人身上发生淋巴瘤有关（J.Exp.Med.，151，1039，1980;J.Exp.Med.，151，1049，1980）;Nature（Lond.），284，553，1980）。已知患有慢性淋巴细胞白血病（CLL）的病人继发性恶性肿瘤的发病率很高。Ziegler和Zarling（Int.J.Cancer，27，321，1981）。在除去白血病细胞后估计了慢性白血病病人淋巴细胞中的NK细胞活性。值得注意的是，虽然大多数CLL病人都有与NK敏感性靶组织结合的淋巴细胞，但很少或完全测不到NK细胞活性。另外，用高剂量免疫抑制药物治疗的肾脏同种异体移植受体，发展恶性肿瘤的危险约高100倍，并且极度地抑制或消除了NK细胞活性（Transplantation，29，214，1980）。相反地，这些接受者中抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）并没有受到抑制。这一点提示免疫细胞活性的缺乏是一种特异性改变，而且与恶性肿瘤的发展/复发倾向有关。

本发明是以多方面的发现为基础的，其包括已观察到既使肿瘤细胞可能是抗IFN的，但就抗增殖作用来说，将特异性淋巴激活素与失配dsRNA结合使用可产生协同或强有力的效力。即是说，在对单一淋巴激活素治疗只表现边际反应的个体中单独使用失配dsRNA或结合使用淋巴激活素时，可提高使用失配dsRNA的抗增殖/免疫调节效果，优于只使用失配dsRNA所获得的治疗效果。

此外，对于许多个体，淋巴激活素（如IFN）治疗构成了一种有利的治疗方法。即，这些个体并不需要异常大剂量的IFN，因此他们产生抗淋巴激活素抗体或遭受因给予淋巴激活素所致付作用的危险很小，而这些付作用是与淋巴激活素剂量有直接关系的。在这些被实验者中，dsRNA增强了淋巴激活素的作用，从而使IFN治疗成为一种更为有效的治疗方法。因此，本文公开的治疗方法和组合物改进了已有的以单独给予淋巴激活素为基础的治疗方法，同时使因上述一种或多种原因不能得以有效治疗的个体可以接受这些治疗方法。

本发明的一个优选实施方案是使用r    In·r    Cn的失配类似物。正如前面提到的，这些失配类似物是由于尿嘧啶或鸟嘌呤等未配对碱基（即没有形成Watson-Crick碱基对）干扰了任一条链而形成的。使用这些失配类似物代表了优选实施方案，原因在于它们保留了未修饰之r    In·r    Cn的抗增殖作用，同时显示大大降低了引起发烧、非特异性细胞死亡（即正常体细胞死亡）及抗原性等付作用的倾向。

此外我还发现，特异性失配类似物r In·r（C_11-14，U）n具有显著的治疗效果，就其抗增殖能力来说优于典型的dsRNA（如r In·r Cn）。特别是这些类似物还可用于纠正某些病例中肿瘤细胞的缺陷，从而改变这些肿瘤细胞并在功能上将其转化为正常细胞。实际上我已从患者体内分离出肿瘤细胞并反复观察到这一现象。另外，我还发现在淋巴激活素对所说的治疗实际上造成完全障碍的情况下，Ampligen可作为癌细胞正常化剂而发挥功能。已知某些化学和生物学物质具有独立地使癌细胞正常化的功能。失配dsRNA，特别是r In·r（C_11-14，U）n能放大这种肿瘤细胞正常化活性，而某些淋巴激活素则具有相反的作用，即它们可降低或消除这一正常化过程。

另外，本发明的方法可进一步纠正某些因家族背景（即遗传因素）或免疫系统之缺陷而易患肿瘤者体内的免疫功能紊乱。这种能力显然不是IFN等淋巴激活素的作用，其证据在于失配dsRNA能够以一种定量方式来影响肿瘤细胞，而单用淋巴激活素则不能。

本发明提供了治疗癌症、肿瘤和赘生细胞的治疗组合物及方法。本文中所说的“治疗”，以总的概念上说是指预防和抑制肿瘤（部分地或全部地）、使先前已用已知方法治疗过的病人体内的肿瘤失去再发能力、将肿瘤细胞转化为正常细胞、纠正肿瘤相关免疫缺陷并提高宿主抗病毒感染及各种自发免疫/炎症状态的防御能力。特别重要的是要了解到本发明不仅当肿瘤或癌症在临床上表现出明显症状时可用于治疗这些肿瘤或癌症，而且当处于早期或亚临床阶段时即可抑制或消除这些恶性肿瘤。即是说，癌症性条件在变为明显的并进而成为已有治疗方法的对象之前可在长达几十年的时间里处于亚临床状态。另一方面，本发明可使如具有高度易患肿瘤之背景的人在病情达到明显可见的临床阶段之前避免肿瘤的侵害。从一不同的角度看，肿瘤只有生物学连续过程的一部分（可潜在几十年），其中该连续过程的早期阶段可能只是一种易感倾向。本发明不仅适于纠正十分明显的肿瘤，而且可以阻止在这一连续过程（可能在其实际发生之前几十年）的早期阶段作过治疗的肿瘤的发生发展。

因此本发明的一个目的是提供用于治疗动物包括人之肿瘤的方法和组合物，“治疗”（当与癌症、肿瘤等结合使用时）是一个包括预防肿瘤、消灭癌肿（部分地或全部地）、使先前已经用已知治疗方法处理过的病人免于肿瘤再发、使肿瘤细胞转化为正常细胞、或纠正肿瘤相关免疫缺陷及提高宿主机体抗病毒感染及各种自发免疫/炎症状态所必需的防御能力。

本发明另一目的是提供抑制动物包括人体内恶性肿瘤细胞增殖的改良的治疗方法，其包括对需要作这种治疗的动物给予失配dsRNA。

本发明的另一目的是提供抑制需要进行治疗之动物体内的抗IFN肿瘤细胞增殖的改良的治疗方法。

本发明的另一目的是提供强化dsRNA对动物包括人体内恶性肿瘤细胞之抗增殖作用的方法和组合物，其包括对动物联合给予失配dsRNA和淋巴激活素。

本发明的另一目的是提供治疗动物包括人体内之肿瘤、包括抗IFN的肿瘤的方法和组合物，其包括对动物单独给予失配dsRNA或联合给予失配dsRNA与淋巴激活素。

本发明的另一目的是提供能使动物包括人体内的癌或肿瘤细胞功能上转化为正常细胞的方法，其包括对动物给予失配dsRNA。

本发明的另一目的是提供能使动物体内的癌或肿瘤细胞从功能上转化为正常细胞的方法和组合物，其包括对动物联合给予一种失配dsRNA与另一种独立具有使恶性肿瘤细胞正常化之能力的化学或生物学物质。

本发明的另一目的是提供可改善或阻止免疫和慢性病毒性疾病的方法，其包括对这类患病个体给予有效量的失配dsRNA。

可参照下列附图进一步证明本发明的应用效果。

图1    A显示经检测用失配dsRNA（两个浓度）处理（30分钟）的人种经胶质瘤细胞中的腺苷酸催化酶活性以间接测定对c    AMP水平的诱导作用;

图1    B所示结果与图1A相似，但处理时间为24小时;

图2    A显示通过以RIA法检测用失配dsRNA（两个浓度）处理（30分钟）的人神经胶质瘤细胞中c    AMP水平以直接测定对c    AMP水平的诱导作用;

图2    B所示结果与图2A相似，但处理时间为24小时;

图3为一线条图，其显示在24、48和72小时内人神经胶质瘤细胞（未处理的、IFN处理的、dsRNA处理的和用IFN及dsRNA联合处理的）中蛋白质合成情况，所说的细胞中dsRNA处理的细胞呈进行性分化并损失恶性细胞表型，为非淋巴激活素性质的。

图4显示在非处理（对照）、IFN和dsRNA处理的无胸腺小鼠体内植入肿瘤后31天测定肿瘤大小（长乘宽）的实验结果。

图5显示对增加z-IFN、β-IFN和dsRNA量的黑素瘤细胞所作集落形成试验的结果;

图6显示对单独给予z-IFN或联合给予0和100、300及1000单位z-IFN与50和100μg/ml    dsRNA的人肾癌细胞所作集落形成试验的结果，其证明联合给药的协同抗增殖作用。

图7显示在进行dsRNA治疗前和后75天以上，以肿瘤体积及2′，5′-腺苷酸合成酶活性表示的恶性黑素瘤病人对治疗的反应;

图8显示对图7所述病人进行dsRNA治疗前或开始治疗后，检测其体内各种寡聚体特别是P₃A₃所得的四个HPLC图。

图9显示与未接受dsRNA治疗的实体瘤病人及作为对照的正常病人的LAK活性比较，经过30个月以上dsRNA治疗后的稳定的类癌瘤病人体内LAK活性的提高情况，并用以监测为在长时期内维持有利的临床效果所需的dsRNA的维持量;

图10显示在进行失配dsRNA治疗前和治疗后近400天，根据NK细胞活性和纵隔肿瘤大小判断的肺腺癌病人对治疗的反应。

本发明介绍了对肿瘤细胞使用外源性失配dsRNA，如给病人使用失配dsRNA并增加病人细胞内dsRNA水平以调节肿瘤细胞生长使之正常化并失去恶性细胞表型的方法和治疗组合物。从而使对淋巴激活素不起反应或反应差的肿瘤细胞具有反应性。dsRNA可与淋巴激活素同时连续给药。特别显著的反应是使顽固的肿瘤细胞对干扰素的抗增殖作用起反应而达到的。

正如前面提到的，许多个体对基于单纯使用IFN的抗肿瘤治疗并不能产生令人满意的反应。因此便需要使用很大剂量，结果这些个体就实际上能够产生抗其天然产物IFN的抗性。此外，事实上瘤细胞也可发展作为非随机获得之表现型的另一种抗性，而这对于了群本发明的治疗组合物和方法较之任何通过单独使用IFN来抑制增殖的方法有着显著改善是极为重要的。

“联合”给予IFN和任何dsRNA即完全碱基配对的或失配的dsRNA，包括在实施中将两种药剂作为治疗混合物一起使用，也可以分开但同时给予，如将两者分别经静脉内途径注入同一个体体内。“联合”给药还包括分开给予这些药剂，即先给予一种然后在短时间内给予第二种。所有这三种实施方案都有其本来的优点。例如，分别但同时给药可以单独控制每种药剂，从而对不同病人提供治疗最宜量。分开给药可使IFN单独对细胞发挥作用，但只是作用于边缘区，然后再使用dsRNA以放大这种效果。当然，在先前已确定了最适剂量水平的情况下，作为混合物给予IFN和dsRNA制剂，可使治疗对象即时得到这种治疗组合物。上面的解释适用于出现于本说明书（包括权利要求）中的所有涉及将一种治疗剂与另一种“联合”给药的情况。

相似地，本发明的治疗剂和组合物可以通过任何医学上使用的和已知的常规途径给药。已提到静脉内给药，但包括肌肉内、鞘内、颅内和腹腔内等其他给药途径也在本公开的范围之内。

淋巴激活素包括干扰素（x、β、γ）特别是干扰素z、白细胞介素特别是白细胞介素1、2或3及重组的白细胞介素-2（r    IL-2），以及肿瘤坏死因子（TNF）。还包括在对淋巴激活素反应中在动物体内形成之淋巴激活素激活的杀伤细胞（LAK）。

当所用淋巴激活素为干扰素（z）时，所提供的量为每毫升病人体液0.01至100，00IRU。当所用淋巴激活素为IL-2（最好是r IL-2）时，给药量可由大约每公斤病人体重10²IL-2单位高至在该病人体内的毒性达到不可接受的水平，即可高达10⁶IL-2单位。但一般在每公斤体重给予10³至10⁴IL-2单位。

如前所述，当须给予dsRNA和淋巴激活素这两种药剂时，可将它们作为混合物给药、分开但同时给药或相继给药。

当淋巴激活素和任何一种dsRNA联合给药时，所给dsRNA的量应达到1-1，000    μg/ml体液（即血清、盐、维生素等的溶液，其在生物体内循环并侵入组织。例如对一体重为160磅的病人投予含10mgdsRNA的组合物，可使dsRNA水平达到约1    μg/ml。相似地，当联合给予dsRNA-.IFN时，其中IFN的剂量应达到1-100，000IRU/ml体液的水平。联合给药方式如前所述，即可作为混合物、分开但同时给药或相继给药。这里重要的在于给药应是功能上协同起作用的，而不在乎其所取的物理体现。

“失配dsRNA”是指其中对应链之间的氢键键合（碱基层叠堆积）是相对完整的dsRNA，即每29个连续的碱基残基中平均有不到1个碱基对被打乱。从而也便可了解了“失配dsRNA”的意义。dsRNA可以是多聚肌苷酸和多聚胞苷酸的聚合物，其中尿嘧啶碱基或鸟嘌呤碱基的比例可由5个碱基中含有1个到30个碱基中含有1，个（Poly I.poly（C₄-C₂₉X＞U或G）。此外，在某些条件下，适当的寡核苷酸（小的核苷酸片段）可与适当的互补多核苷酸或寡核苷酸相复合。

dsRNA可以是poly    I.poly    C，U，其中C对U的比例约为13至1，poly    I和poly    C，U的沉降系数均小于9并彼此相差2单位以内，且两者均最好为大约6.6至7.5。

dsRNA可以是结构通式为r In·r（C_11-14，U）n，特别是r In·r（C₁₂，U）n者。下面讨论dsRNA的其他适当例子。

用于本发明的优选的失配dsRNA是以选自poly（Cn·U）和poly（Cn，G）的共聚核苷酸为基础的，其中n是4至29的正整数，并包括经加入2′-邻-甲基核糖基而形成之多聚核糖胞苷酸（r Cn）复合物的失配类似物。这些r In·r Cn的失配类似物中，优选的是Carter和Ts′o在美国专利4130640和4024222号中所述的通式为r In·r（C₁₂，U）n者。本文所述及的dsRNA一般均可适用于本发明。

用于本发明之失配dsRNA的特例包括：

poly（I）·poly（C₄，U）

poly（I）·poly（C₇，U）

poly（I）·poly（C₁₃，U）

poly（I）·poly（C₂₂，U）

poly（I）·poly（C₂₀，G）

poly（I）·poly（C₂₉，G）和

poly（I）·poly（Cp）23G＞p

失配dsRNA的给药量最好足以达到峰血液浓度，即在给药后于远离输注点的全身血循环中的浓度应为每毫升dsRNA0.01微克到1，000微克。

如前所述，当将dsRNA用于抑制恶性细胞增殖时，本发明优选的结构通式为r In·r Cn（C_11-14，U）n的失配dsRNA。我们发现，相对于完全碱基配对的dsRNA，失配dsRNA可产生较温和的药理学作用。

除人成纤维细胞IFN外，还检验了其他几个类型IFN的活性，其中包括人白细胞IFN的天然变种以及使用DNA重组技术在细菌中生产的IFN（γIFN）。所有例子中，均证明单独注射IFN对瘤细胞生长的抑制作用要比一同或随后注射dsRNA（可以是匹配的（r In·r Cn）或失配的r In·r（C_11-14，U）n）时效果差。单独给予注射不同浓度（每天10⁵至3×10⁶IRU）的任何一种IFN，人肿瘤细胞生长最大降低大约33%;相反地，用小量IFN（每天10⁵IRU）结合使用dsRNA处理动物，则人肿瘤细胞生长降低到65%以上。因此，将dsRNA与单一类型IFN联合使用可产生数量上占优势的效果。此外，人类肿瘤一般都需要作人体化治疗，以产生最佳治疗效果。在以dsRNA与IFN联合用药的情况下，进一步努力达到治疗程序的个体化，可望产生10倍或更大的治疗效果。

资料表明，dsRNA将放大所有形式之IFN的治疗效果，包括天然的、合成的和杂交形式的，如部分衍生于xIFN的和部分衍生于β或γIFN的，而所有这些都是在本发明之范围内的。因此结合使用dsRNA，特别是失配dsRNA，最好是r In·r（C_11-14，U），构成了抗癌的强有力药剂，其效力远远超过单用IFN。另外，已知所研究的人类肿瘤材料含有各种类型的病毒遗传信息，其肯定与人体组织中的恶变过程和/或引起组织疾病及破坏的病理学过程有关。为此资料有力地证明，dsRNA-IFN结合不仅是一种有效的抗癌剂，而且还起到对抗病毒成分和疾病的作用。确实，本发明的治疗组合物可对任何适于用IFN治疗的疾病起作用，其包括处于急性、亚急性、潜伏或慢性期的病毒性疾病，同时还包括那些人类免疫功能障碍性疾病，在这些疾病中病毒活性起到发动人类疾病病理过程的作用，但亦可随着人体“自身免疫”病变成自身永久存在的疾病而消失。

应强调指出的是，任何dsRNA在协同增强任何结合的dsRNA-IFN治疗之效果中并不是作为IFN诱导剂起作用的，同时也不会观察到增效作用。更确切地说，失配dsRNA是一种起独特作用的药剂，其可补充和弥补IFN的作用，从而在治疗人类病毒病和癌症中提供了一定程度的可变通性和单用dsRNA或IFN所不能达到的效力。

我观察到一组包括肺癌病人和有肿瘤高发病率家族史的实验对象中，某些成员的NK细胞活性较低。下面将详细讨论有关观察结果。我通过加入各种类型干扰素和/或失配dsRNA来试验有高肿瘤发病率家族史的病人体内的低NK细胞活性能否恢复到正常水平。最近的报导表明，各天然型（Brit.J.Maem.，50，85，1982）和克隆的亚型（Can.Res.，42，1312，1982）干扰素之间NK细胞增加（自正常个体得到的细胞）的效力有所差异。我观察到，在有发生肿瘤之危险的个体中，失配dsRNA具有极明确的使NK细胞活性重新达到正常水平的能力。

下面将通过实施例进一步解释本发明，其中所用比例和百分比均为重量比。这些实施例中所用的dsRNA（失配的）为r In·r（C_11-14，U）n，有时指明为r In·（C₁₂，U）n。

A.dsRNA的生长调节新机制

失配RNA所展示的生长调节作用的新机制并没有原型淋巴激活素的参与。这一研究证明了dsRNA在调节异常人细胞的生长方面的广泛实用性，并证明其作用是通过诱导INF以外的机制产生的。特别是发现dsRNA可诱导已知对x-干扰素不敏感的细胞中的环腺苷酸（c    AMP）。这些研究中使用了定名H-7和HA1004的两种c    AMP激酶抑制物（蛋白激酶C和c    AMP激酶的已知代谢抑制物），以估计在使用x-干扰素作为原型淋巴激活素进行单一dsRNA治疗产生了抗性的情况下失配dsRNA的新的抗生长调节活性。

为了证明失配dsRNA并不是依靠诱导IFN失敏感细胞内干扰素的产生发挥功能的，用dsRNA将人神经胶质瘤（脑肿瘤）细胞（A1235）处理0至8小时。除去dsRNA并加入新鲜培养基保温24小时，然后用细胞病理作用检测法（cytopathic    effect    assay）（Finter，N.G.，J.Gen.Virol.，5，419-427，1969）检测干扰素效价（IRU/ml）。所得结果示于下表中，其中检测的下限为5    IRU/ml。

表1

dsRNA处理的人神经胶质瘤细胞中的干扰素诱导作用

处理时间（小时）

指示细胞    0    2    4    6    8

HFF    ＜5    ＜5    ＜5    ＜5    ＜5

WISH    ＜5    ＜5    ＜5    ＜5    ＜5

由上表所列数据可以看出，dsRNA并没有诱导这些IFN失敏感细胞中的干扰素产生。

另外，进一步用相似细胞进行试验，以确定在dsRNA对这些细胞产生的抗增殖作用中是否干扰素也起到一定的作用。该实验是使用抗干扰素抗体进行的，如果存在干扰素，它将与抗体结合并降低dsRNA诱导的抗增殖作用。其中使用了浓度为240中和单位/ml的三种不同的抗干扰素（x、β、γ）抗体及一个空白和对照组。按照Hubbell等人（Cancer    Res.，44，3252-3257，1984）所述方法进行细胞生长抑制分析。按下列公式计算抗体控制生长的百分比：

(处理的细胞（24小时）-对照细胞（0小时）)/(对照细胞（24小时）-对照细胞（0小时）) ×100

结果示于下表中：

表2

抗IFN抗体没有抑制人神经胶质瘤

细胞中dsRNA诱导的抗增殖作用

                                                                                抗体

处理        浓度                    O                抗－                抗－                  抗－

                                                            αIFN                βIFN              7IFN

A1235

0                                                    91.8±5.9    90.8±7.4      87.8±3.1

Ampligen  200g/ml    59.94.6    55.7±2.1      50.8±1.7    56.5±2.0

α-IFN    100  IRU/ml    41.4±4.6    91.8±3.0        ND              ND

β-IFN    100  IRU/ml    40.9±2.3    ND              84.9±3.9        ND

RT4

0                                                            ND                  ND            108.9±5.6

7-IFN      25    IRU/ml    70.2±3.8    ND                  ND            199.1±7.1

结果用24小时处理控制生长的百分比表示。ND＝未作。上列数据进一步表明dsRNA没有诱导所研究的细胞中的IFN。

发现dsRNA可诱导人神经胶质瘤细胞中的c    AMP产生，这一作用应归因于dsRNA，而不是因为诱导了这些细胞中的任何一种INF。下表所示数据显示三种已知的代谢抑制物即H-7、HA1004和百日咳毒素可抑制或消除dsRNA的抗肿瘤作用。重新估计上列表2中所示的百分细胞生长率，目的是得到一个低百分控制生长率。单独用失配dsRNA可以降低百分控制生长率，但因存在代谢抑制物而增加细胞生长率。

下列表3中显示代谢抑制物H-7和AN1004可对抗失配dsRNA对人神经胶质瘤细胞的抗肿瘤作用，所给数据代表dsRNA浓度为0（空白或对照）、25和200μg/ml时的百分控制生长率。

表3

dsRNA（μg/ml）

0    25    200

H-7（μM）

0    66.7±12.6    48.2±5.4

5    103.3±13.6    108.3±15.5    75.2±4.5

25    87.5±6.7    89.7±11.0    72.8±7.9

HA1004（μM）

5    112.7±16.2    113.4±3.2    94.1±13.4

25    113.2±14.3    117.2±16.7    101.7±6.8

如下表所示，用百日咳毒素预处理同种人神经胶质瘤细胞，同样可抑制dsRNA诱导的抗增殖作用。表4中给出了24小时时的百分控制生长率，其中在加入dsRNA前细胞已用百日咳毒素预处理了4小时。该结果表明H-7和HA1004这两种已知的代谢抑制物对x-干扰素处理的细胞中的生长抑制影响极小，而百日咳毒素似乎具有双相作用-即在较高剂量时不改变x干扰素诱导的生长抑制作用，但较低剂量时则增强抗增殖效果。

表4

dsRNA（μg/ml）

处理    0    25    200

0 88.4±2.1^α71.7±5.7

3μg/ml    98.7±7.1    102.5±7.3    99.9±6.3

1μg/ml    94.0±5.2    93.8±7.1    93.2±5.1

0.3μg/ml    99.4±7.2    95.6±4.1    102.7±5.7

另一方面，如下表所示，在整个24小时期间x-IFN并没有增加同种细胞内的c    AMP水平。在该实验中，人神经胶质瘤细胞（A1235）与浓度为0（对照）、250和1，000IRU/ml的x-IFN接触0到24小时。

表5

IFN-x（IRU/ml）

处理时间    0    250    1000

0    ＜0.02

1分钟    ＜0.02    ＜0.02

5分钟    ＜0.02    ＜0.02

10分钟    ＜0.02    ＜0.02

30分钟    ＜0.02    ＜0.02

1小时    ＜0.02    ＜0.02

2小时    ＜0.02    ＜0.02

4小时    ＜0.02    ＜0.02

8小时    ＜0.02    ＜0.02

24小时    ＜0.02    ＜0.02

表中所列数值的单位为微微摩尔c    AMP/μg蛋白;检测极限为0.02微微摩尔c    AMP/μg蛋白。

另外，在加入抗增殖剂量的dsRNA（25和200μg/ml）后立即、30分钟（图1A）和24小时（图1B）测定腺苷酸催化酶活性（15分钟内产生的c    AMP的微微摩尔数）以进一步间接测定dsRNA处理的人神经胶质瘤细胞（A1235）的细胞内c    AMP水平。该实验中，细胞分别用浓度为25（黑三角）或200（黑方块）μg/ml的失配dsRNA处理。在适当时间（图1A：0.5-30分钟;图1B：0.5-25小时）除去培养基并在干冰上快速冷冻细胞。用Young等人（Molec，Endocrinol.，1，884-888，1987）的方法检测细胞超声处理产物中的腺苷酸环化酶活性。24小时时作细胞计数以检验抗增殖活性。

直接测定dsRNA处理的人神经胶质瘤细胞（A1235）中诱导产生的c    AMP量（每微克蛋白中c    AMP微微摩尔数），结果示于图2A（30分钟）和图2B（24小时）中。实验中使用了25（三角）或200（黑方块）μg/ml失配dsRNA处理A1235细胞。在适当时间点上除去培养基并将细胞内c    AMP溶解于0.1N    HCl中。使用Reisine等人（J.Cell.Biol.，102，1630-1637，1986）所述的RIA法测定c    AMP水平。对照细胞和用1μg/mldsRNA处理的细胞中的c    AMP水平低于检测限。24小时进行细胞计数以检验抗增殖活性。

从这四个图中可以看出，与dsRNA只接触30秒c    AMP即有明显增加，且一直维持到30分钟时（图1A和图2A）。过24小时检测仍可显示出dsRNA的作用（图1B和图2B）。

这些研究进一步证明c    AMP水平增加与dsRNA有直接关系，因为dsRNA并不能诱导所用细胞中的IFN。在开始处理后30分钟之内，抗增殖剂量的dsRNA诱导了腺苷酸环化酶活性。相似地，细胞内c    AMP水平亦在30秒内以一种抗增殖剂量依赖方式增加。用百日咳毒素（也是一种细胞内c    AMP抑制物）预处理细胞后作dsRNA处理，结果抑制了dsRNA诱导的生长抑制作用。相反地，抗增殖剂量的天然人x-干扰素处理长达24小时也没有增加细胞内c    AMP水平。另外，H-7和HA1004（均为已知的代谢抑制物）对x干扰素处理的细胞中的生长抑制作用影响很小，而百日咳毒素则如上面所述似乎具有双相作用。

在IFN诱导的抗增殖作用中有关c    AMP系统的研究（Panniers等，J.Cell    Sci.，48∶259，1981;Banerjee等，Virology，129∶230，1983;Ebsworth等，J.Cell    Physiol.，120∶146，1984）中，研究者发现c    AMP与抗增殖状态的程度没有关联。据我所知，在提出本发明之前尚没有研究过有关dsRNA在同一系统中的作用。这些研究均支持这样的结论：即（a）dsRNA和淋巴激活素（其中IFN为原型的）具有不同的作用机制，而且（b）dsRNA诱导的抗增殖作用与c    AMP系统有关（而与淋巴激活素无关）。

实际上c    AMP是普遍存在的，即如果不是所有的也是绝大多数细胞都具有在适当刺激下合成c    AMP的遗传信息，这些实验表明在对异常人细胞进行生长调节中使用失配dsRNA具有广泛的基础，而且这些异常人细胞对单独使用IFN或其他淋巴激活素是有相对或绝对抗性的。这些结果进一步提示，失配dsRNA是通过两个连续的机制起作用的，即首先是由c    AMP激酶介导的，然后有蛋白激酶C参与调节。

B.蛋白质合成

dsRNA处理的细胞中的细胞内蛋白质改变反映了进行性分化和恶性的细胞表现型（一种非淋巴激活素性质）的丢失。按照Soslau等人（Biochemical    and    Biophysical    Research    Communications，119∶941-948，1984）所述方法研究了经dsRNA处理后的细胞正常化情况。实验中用抗增殖量的失配dsRNA（200μM/ml）或天然人x-干扰素（100μM/ml）处理人脑肿瘤细胞（A1235），72小时后显示完全不同的蛋白质合成图形。蛋白质合成是一个重要的参数，因为它既显示经处理的异常细胞趋于正常化的情况，同时指出了治疗效果产生的时间。这一研究结果以图3的线条图表示。通过检测给定数目的细胞中所有放射标记之A1235细胞的每分钟计数来估计蛋白质合成。图中分别标示了未处理的（对照，空心条）、只用浓度为100μM/mlx-IFN处理的（由右上至左下的斜线）、用浓度为200μM/ml    dsRNA处理的（垂直线）及用上述量之x-IFN和dsRNA一起处理的（由左上至右下的斜线）细胞的蛋白合成情况。于24、48和72小时后进行测定。上面的单线每条代表一个标准误差单位。

虽然在24小时与对照比较各种药剂处理的细胞均呈正常改变，但到48小时dsRNA和IFN两者处理的细胞蛋白质合成显著增加，且dsRNA刺激的蛋白质合成明显高于IFN处理的细胞。令人惊奇的是，与对照和IFN处理的细胞比较，dsRNA处理的细胞中蛋白质合成增加了3倍，且IFN处理的细胞中蛋白质合成降至对照水平。dsRNA处理的细胞中蛋白质合成持续增加显然反映了特异性蛋白质之类型的明显改变，这些蛋白质正是作为dsRNA诱导的细胞表型改变为分化更好的或正常化的细胞表型之结果而产生的。

研究用β-干扰素处理的人膀胱癌细胞中蛋白质磷酸化作用，结果表明与未处理的细胞比较其中大量蛋白质的磷酸化过程发生了显著的改变（Soslau等，Biochem.Biophy.Acta，Vol.119，p941，1984）。与之相反，我用r In·r（C_11-14，U）n所作的研究（聚丙烯酰胺凝胶结果未示出）则证明，当与干扰素处理的细胞比较时其磷酸化作用的图形出现完全不同的改变。这些资料进一步显示，就调节肿瘤细胞生长（即转化为更正常的细胞表型）的机制来说dsRNA和淋巴激活素有着分子水平的差异，而且用于调节免疫分化和免疫活性的途径也有着根本上的区别。

对于一个肿瘤学/免疫学领域内的熟练技术人员来说，其在实施本文以多种方式公开的基本发明的过程中，将会选择一种能表现给定细胞之恶变过程的特征的或表现恶变细胞复原之特征的特殊蛋白质，并从本文所述之发明的观点出发来监测所选择的一种或一组蛋白质的改变。个体因素上的差异可能影响一段时间内对失配dsRNA的净需要，但此不会损害本发明的基本实用性。应提到的是，在有异常高水平的核酸酶或磷酸二酯酶存在时，可能改变或促使临床医生去改变所用dsRNA的浓度，其可能超出实施例中提出的或凭经验给出的这些剂量范围。与临床医学的许多方面一样，作这一治疗时亦应考虑到病人间的个体差异。

蛋白质合成研究能使人们更全面地了解潜在机制;确定发生药物作用的动力学;药物作用的大小，以估计细胞正常化的数目和药物作用维持的时间，从而可确定治疗作用维持的时间，而所有这些在申请人所提到的本领域现有技术中均有预言过。

C.为肿瘤细胞中IFN抗生长活性所需要的内在dsRNA

我已检测到，肿瘤细胞只有少数产生干扰素抗生长活性，而且主要是在IFN-敏感的肿瘤细胞有以足够量预先存在的内在dsRNA时。缺乏或没有足够内在dsRNA的细胞中的抗生长活性可能被“并入”由外界给予dsRNA而产生的抗生长活性中，以造成有充足dsRNA的条件。

已知干扰素可诱导双链RNA依赖性酶2′，5′-寡A合成酶，后者则被牵连于细胞的生长抑制作用。我的发现表明，双链RNA基本上是作为激活该酶的辅助因子而起作用的，此为一个不同于干扰素诱导该酶的步骤。从历史上说，这两种作用已被错误地一起分类，而导致了每种制剂（单独的或联合使用的）之潜在治疗效果的显著减小。我的研究显示dsRNA天然存在于某些病人（即患有毛状细胞白血病的病人）的外周血单核细胞（PBMC）中，但在正常人的PBMC中却没有发现之。它们在毛状细胞白血病病人体内存在，显然第一次解释了在那些单独给予干扰素的病例中的已知干扰素效能，并且为可在治疗上利用的IFN和dsRNA之间提供了另一个严格的分界。换句话说，干扰素的临床效能是由于细胞内预先存在之天然dsRNA对酶（2′，5′-寡A合成酶）的诱导作用，而外源性dsRNA在这一特殊的生长控制途径中主要是通过激活先已存在的酶而起作用的。

为了证实我的这一新假说，我由对照和r    IFN-αA处理的毛状细胞白血病（Hela）细胞中提取并在蔗糖梯度上分离了核RNA，然后检验了它们激活纯化之高分子量2′，5′寡A合成酶的能力。结果发现未处理的Hela细胞RNA的各部分均不能激活该合成酶。但IFN处理之细胞的异质性核RNA（Hn    RNA）部分则以一种剂量依赖性方式激活了这种酶。对Hn    RNA作热变性处理可消除这一激活作用。对酶促反应产物作高压液相层析（HPLC）分析，结果表明形成了有生物学活性的2′，5′A三聚体和四聚体。我还分级分离了得自毛状细胞白血病病人（该病人对IFN治疗极为敏感）的单核细胞核RNA，并证明在Hn    RNA部分中有高含量的2′，5′寡A合成酶激活dsRNA。HPLC分析显示形成了有生物学活性的2′，5′A三聚体、四聚体、五聚体和六聚体（其相对比例约为53∶15∶4∶1）。正常单核细胞核RNA未产生激活作用。这些结果表明，当天然、核RNA存在于相关细胞（肿瘤细胞或其他细胞）中时，可借助IFN参与生长调节。这一点对于“干扰素反应”是一前所未曾认识的关键性条件。据此，使我得以推断出：这些dsRNA缺乏可导致IFN无效，但又可用外源性dsRNA克服之，对此我可通过如本申请中所述的临床实验加以验证和证实。

为成功地发挥IFN活性，要求那些期望产生抗生长活性的细胞中存在稀有的dsRNA。这一点对于那些对IFN治疗有容受性/敏感性的肿瘤细胞是必要的。有些综述作者错误地将IFN和dsRNA一起分类。从这些和其他相关研究可以看出，dsRNA是为激活2′，5′寡A合成酶的辅助因子。加入外源dsRNA后，对IFN无感受性的肿瘤细胞即可变为对dsRNA治疗敏感的细胞。在对IFN处理有反应性的细胞中，据信细胞为dsRNA具有三维结构，就其相似的生物学、催化及缺乏毒性性质来说很相似于失配dsRNA，特别是r In·r（C_11-14，U）n，同时相对于细胞毒性功能其提高了免疫功能及其他数据和c AMP和肿瘤细胞参数。

首先提供有效量的外源dsRNA以诱导细胞内dsRNA的合成（后者与干扰素联合参与细胞生长调节），然后提供治疗用的IFN且必要时可继续提供dsRNA，从而使对淋巴激活素特别是IFN无反应性的细胞成为有反应性的。

D.人肾肿瘤异种移植物反应

正如下述的观察所解释的，就长期存活率及作用的大小来说，人肾异种移植物对IFN和dsRNA的反应有着根本上的差异。

我使用了许多携带人肿瘤异种移植物的无胸腺小鼠这一新的动物系统，以显示对干扰素和dsRNA的意想不到而且不同的反应。例如，已证明在进行x-干扰素治疗期间人肾细胞瘤仍呈进行性生长并且没有延长存活期，而我则观察到用dsRNA治疗时肿瘤体积明显减小并且存活期明显延长。在动物长到2-4岁时自然死亡之后，尸体解剖发现95%经用dsRNA治疗过的小鼠没有组织学上可见的肿瘤。这一点是完全没有预料到的，因为淋巴激活素（如IFN）诱导的肿瘤缓解显然是短期的，而且即使几个月后也几乎找不到无肿瘤的被试动物。根据组织学标准和存活期可见具有95%的治疗率，这一观察结果是不曾预料到的。另外，在dsRNA处理小鼠可见有脾脏天然杀伤（NK）细胞活性增加，而用干扰素治疗的小鼠则未见有NK活性增加。

在两个不同的异种移植实验模型中，亦见到γ-干扰素和dsRNA之间在生长抑制作用方面的相似差异，并且我还观察到人膀胱癌RT4细胞与上述人脑神经胶质瘤A1235细胞之间显著不同。所有这些例子中，唯有经dsRNA治疗的动物中可见到令人满意的肿瘤生长抑制作用，而单用γ干扰素治疗者则只见有很小的生长抑制作用。在脾脏NK细胞活性方面亦可见有着显著差异，即用dsRNA治疗的动物NK细胞活性未见增加。

在免疫增强方面可见相似的效果，附表6中显示了用脑肿瘤所作（实验的结果。剂量为每天20，000IRU/干扰素，r In·r（C_11-14，U）n则每周2或3次（每剂200-500μg）。仔细研究血液样品（不同时间自尾静脉抽血得到），结果表明单独给予本申请所述的dsRNA，对肾、骨髓和免疫系统（这些均为进化学表达毒性的器官）功能没有任何不利影响。

下列表6中报告了用γ-IFN和/或dsRNA处理的小鼠之脾细胞的免疫细胞活性。实验中按所示比例将效应细胞（自携带人肿瘤异种移植物动物的脾脏中得到的免疫细胞）与靶细胞（本例中为人脑肿瘤或细胞）混合。效应细胞为免疫系统的免疫细胞，靶细胞是特异性肿瘤的细胞。结果以百分细胞毒性（细胞死亡）表示，以作为处理（IFN、dsRNA或两者）的结果获得较高数值（百分数）。实验组较对照组的百分毒性高，此表明改善了肿瘤细胞消除作用。

表6

效应细胞

处理    百分控制

对照

200∶1    16.3

100∶1    14.2

50∶1    7.5

γ-IFN

200∶1    6.4

100∶1    2.9

50∶1    2.8

dsRNA

200∶1    32.3

100∶1    22.8

50∶1    13.2

γ-IFN+dsRNA

200∶1    28.7

100∶1    22.8

50∶1    17.2

令人难以理解的是，γ-IFN处理比对照组（未处理）杀死的靶细胞少，而单用dsRNA处理及联合处理者则获得了最好结果。

图4中图解显示了dsRNA，特别是r In·r（C_11-14，U）n抗移植于无胸腺小鼠体内之人脑肿瘤的效力，并与γ-IFN作了比较。图中比较了以长度乘宽度计算的肿瘤的二维大小（mm²）。连接空心圈的线是对照组（未治疗）;连接空心三角的线是单用γ-IFN治疗组（P＞0.5）;连接实心方块的线是dsRNA r In·r（C_11-14，U）n治疗组（P＞0.50）。开始实验后自第10天到第31天测量肿瘤大小。与γ-IFN比较，dsRNA有效地缩减肿瘤大小，而γ-IFN治疗组只比对照组稍显效果。

E.对dsRNA治疗有反应之淋巴激活素抗性肿瘤的临床实例

建立了另一使用不同动物模型的方法学，以估计肿瘤对IFN治疗敏感抑或有抗性，并鉴定这些实例对IFN和dsRNA联合治疗可能产生的临床协同疗效。其中之一是由Hamburger和Salmon建立的人类肿瘤集落形成分析技术（Primary    Bioassay    of    Human    Tumor    Stem    Cells，Science    197∶461-463，1977），该技术能够可靠地预测病人对抗肿瘤药物的临床反应或抗性并在细胞水平上有很大准确度，对于无活性药物达到90-95%可靠性，对活性药物的可靠性为75-80%。

该集落形成检测法是依照Hamburger和Salmon所述的程序进行的。自病人体内得到新鲜的肿瘤细胞或白血病细胞并制成单细胞悬液。将根据文献和其他剂量指南计算的预定浓度的待选治疗剂加到琼脂或甲基纤维素平板上或在铺板后加到细胞上。洗涤细胞并在琼脂或甲基纤维素上铺板，然后在培养皿中37℃保温以使细胞集落生长。细胞生长一定时间后，用显微镜观察细胞集落并记录每个培养皿中的集落数目。然后更详细地研究集落的生物学和细胞组成，包括细胞形态学、胞核学、自身更新、免疫学及细胞在无胸腺小鼠（裸鼠）体内的作用。使用单克隆抗体和核酸探针分析细胞。集落生成法代表了体外肿瘤细胞化学敏感性试验的一种可靠方法。

对本发明人实验室中的几个肿瘤标本进行了集落生成试验。与各种肿瘤治疗专题论文集（Compilation    of    Phase    ⅡResults    With    Single    Antineoplastic    Agents，U.S.Department    of    Health    and    Human    Services，Public    Health    Service，National    Institutes    of    Health，Vol.4，1985）中所报导的大约100个接受poly    I·poly    C治疗的病人均未产生完全或部分的反应这一预料的结果相反，本发明人则观察到，在多种过去对多核苷酸治疗不敏感的人类实体瘤中使用失配dsRNA后，有42%产生了明显的反应。

为了进行初步的临床估计，将实验中显示肿瘤细胞克隆数目减少60%以上的肿瘤看作是对治疗敏感的。

在绝大多数例子中，均对病人同时进行了实验室和临床试验，以确定他们的肿瘤对各类型IFN和/或白细胞介素的敏感性，特别是那些参与dsRNA研究的病人，以前都用据信（根据已出版的医学资料）是有效剂量的干扰素或白细胞介素作过未成功的临床治疗。所有这些病例中，使用特定淋巴激活素的方法学在阻止肿瘤进一步生长上都是不成功的，其中大多数的免疫细胞功能没有改变，而且有许多病例较之单纯灌注特定淋巴激活素前所见到的数值实际上还降低了（恶化了）。

本发明的临床实验室工作进一步证实了发明所确立的至少三个意想不到的效果：

·当poly    I·poly    C不起作用时，选择的失配dsRNA可起作用;

·当单独使用IFN无效时，使用选择的失配dsRNA是有效的;

·当将选择的失配dsRNA与淋巴激活素一起使用时可产生协同作用。

研究了各种组织类型的人体肿瘤对失配dsRNA的相对敏感性（见下列表7）。经验表明，虽然一大类各种肿瘤特别是实体瘤对只接触淋巴激活素有抗性，但其中42%对呈现特定分子构型的dsRNA的抗增殖作用是极其敏感的。

表7

组织学类型    敏感数    抗性数    敏感百分数

子宫内膜癌    2    0    100

成神经胶质细胞瘤    4    1    80

肺癌    3    2    60

肾细胞癌    33    30    52

类癌瘤    3    3    50

前列腺癌    1    1    50

卵巢癌    4    7    36

乳腺癌    5    9    36

黑素瘤    5    9    36

结肠-直肠瘤    1    7    13

肉瘤    0    10    0

食道癌    0    2    0

间皮瘤    0    1    0

胰腺癌    0    1    0

胃癌    0    1    0

成髓细胞瘤    0    1    0

合计（146）    61    85    42%

至少有两个理由说明这一观察结果是意想不到的：一般dsRNA所表现的生物惰性以及淋巴激活素缺乏临床实用效力。

图5中图解显示了上述集落生成检测法中x-IFN、β-IFN和选择的失配dsRNA对黑素瘤细胞集落形成的影响。以控制集落的百分数对r In·r（C_11-14，U）n（μg/ml）和干扰素（IRU/ml）的剂量作图;以基线代表100%集落控制。除细胞毒性量以外，两种类型IFN均在基线以上（无控制）。

图6显示了x-IFN和r In·r（C₁₂，U）n对人肾细胞癌的协同抗增殖作用，数据同样以控制集落的百分数表示。联合使用的r In·r（C₁₂，U）n的量分别为每毫升50和100毫克。x-IFN的浓度范围为0至3000IRU/ml，此远高于正常x-IFN治疗浓度。

在出现读数后线上有一断开处（指示0 IFN没有控制集落形成作用，r In·r（C₁₂，U）n，浓度数值为50时控制率为62%，100时控制率为50%）然后是100 IRU/ml x-IFN的控制率读数。正如这一资料所显示的，单纯使用临床上可接受量的x-IFN是无效的;x-IFN的剂量在此范围以上时可见效果，但导致细胞毒性增加而不适于临床使用。这一实验结果表明，为了进行有效的治疗，必须将IFN的量降低到临床上可接受的水平，并且最好添加或改用其他抗增殖剂。

联合使用x-IFN+r In·r（C₁₂，U）n治疗而产生协同作用的特例是黑素瘤抑制率63%，乳腺癌为50%，卵巢癌为80%以及肾癌为65%。因此，根据这些图解说明可以确认（a）在对淋巴激活素产生抗性的状况下应用特定的失配dsRNA是有其临床实用性的;（b）在对单一dsRNA有抗性的病例中，审慎地联合使用淋巴激活素，对大多数病例会产生显著的治疗效果。

F.给出三个进一步肯定本发明之效果的临床病例

病人1-恶性黑素瘤

病人1，中年男性，患有对IFN和IL-2无临床反应的恶性黑素瘤。经用dsRNA（每周两次，计300mg）治疗80天后所有可测知的肿瘤（按瘤块的体积算）全部消失（图7）。自开始治疗后这一有利的反应持续近二年半。提出的维持量为50至100mg，每周两次。在根据临床反应确定使用剂量时，参考了有关实验室参数，包括2′，5′-A合成酶的相对水平及检测活性生化代谢物在dsRNA诱导的作用中的能力，如上述的环AMP水平或特殊类2′，5′-A分子的存在，后者着重说明了肿瘤抑制状态及免疫细胞分布型的改善情况。该结果也在图7中示出，其中发明人测知2′，5′-A合成酶、c    AMP和生物活性2′，5′-A寡聚物几乎同时增加，而当病人接受淋巴激活素治疗时或处于其未处理的“清洗”期间时则没有这一情况。数据点以黑圈标示的2′，5′-腺苷酸合成酶活性（pM    ATP/μg蛋白）对开始治疗前几天、开始失配dsRNA治疗后及治疗结束观察到完全反应时（实际肿瘤体积为0）的瘤块体积（数据点用黑三角标示）作图。

图8还显示了同一病人之定名为P₃A₃的寡聚体（如上面所述用高压液相层析法测定者）改变情况，结果可见直到给予失配dsRNA后也没有出现这些寡聚体，而且记录了这些寡聚体的存在与临床反应的相互关联。于使用失配dsRNA治疗前间隔25天及开始治疗后1、23和55天检测各种寡聚体。在本发明人的实验室及其他实验室中都确认2′，5′-A的低分子量寡聚体（二聚体）在抗生长（抗增殖）、抗病毒和免疫增强性质方面是表现生物惰性的。

图9中所示的相似生化现象着重说明了淋巴激活素激活之杀伤（LAK）细胞活性的长时间提高及所导致的病情稳定和/或显著的肿瘤消退，其中检测了用dsRNA治疗30个月以上后处于病情稳定状态（类癌瘤）的病人（左栏）与未接受dsRNA治疗的实体瘤病人（中间栏）及正常或对照组病人（右栏）比较其LAK活性（%特异⁵¹Cr释放数）的升高情况。这一资料可用于监测为在长期内得到有利的临床效果所需要的治疗剂相对用量，如监测即使在产生抗淋巴激活素抗性的情况下发起肿瘤控制后所需的维持治疗的用药剂量。

病人2

特别有意义的是本发明人发现联合使用dsRNA和IFN可在很大程度上减少肿瘤向骨组织扩散。例如，患有肾细胞癌并已广泛骨内转移的病人2，在接受每日剂量只有1.5m单位的x-IFN和300mg的dsRNA（每周给药两次）后即得到迅速而且长时间的反应。在慢性白血病病例中，在作相似治疗后大部分病人也表现有长时期的病情缓解，而只接受x-IFN的病人则没出现明显的临床反应。

病人3

病人3为患有IFN抗性肾肿瘤的中年男性，该病人经历了迅速发生的肿瘤缩小同时伴有2′，5′-A寡聚体分布型的移动，迅速发生的c    AMP途径每逢及免疫监视活性的急剧增加。这些重要的临床和实验室改变一直持续了大约36个月而且没出现药物相关的付作用。

在大多数有淋巴激活素抗性的肿瘤中，包括致死性和顽固性肺癌，也已获得了相似的观察结果和临床成功，图10中总结了有关数据。比较了NK细胞活性（以溶胞单位表示）并用CT扫描技术测定了纵隔肿瘤大小（mm²）。图中示出了进行失配dsRNA治疗前、治疗开始时及完成近400天治疗后的检测结果。根据所测得的肿瘤大小，证明病人对治疗产生了完全的临床反应。

Claims (10)

1、一种调节肿瘤细胞生长使之趋于正常化并失去恶性细胞表现型的方法，其包括使肿瘤细胞与外源性失配dsRNA接触，从而增加肿瘤细胞中的蛋白质合成并失去恶性细胞表现型。

2、一种使患有肿瘤且肿瘤细胞内dsRNA缺乏的病人恢复dsRNA的方法，其包括给所说的病人投用失配dsRNA，直到病人的细胞内dsRNA缺乏得以恢复或纠正。

3、根据权利要求2的方法，其中根据抗肿瘤生长活性证明在进行dsRNA治疗之前对淋巴激活素调节作用无感受性的缺乏dsRNA的细胞在经dsRNA治疗后变为对淋巴激活素调节作用有反应性的。

4、根据权利要求2或3的方法，其中估计了病人外周血单核细胞中的细胞内dsRNA缺乏。

5、根据权利要求2或3的方法，其中所给予的失配dsRNA与肿瘤细胞所缺乏的dsRNA有同样的三维空间结构。

6、一种改善干扰素在无反应或低反应性肿瘤细胞中之抗生长活性的方法，其包括下列步骤：

（1）向对干扰素无反应或只有低反应性的肿瘤细胞团块提供足够量可激活2′，5′-A合成酶的失配dsRNA，以诱导dsRNA合成，使后者与干扰素联合参与肿瘤细胞生长调节;然后

（2）投用肿瘤抑制有效量的干扰素同时可以继续投用所说的失配dsRNA。

7、根据前述权利要求中之任一项的方法，其中dsRNA是由寡聚体复合物、多聚体复合物或两者构成的，且最好由与互补的单链多聚RNA杂交的寡核苷酸所组成以形成dsRNA双螺旋。

8、根据前述权利要求中之任一项的方法，其中dsRNA包含键断裂的区域并表现有r In·r（C_11-14，U）n的有利的治疗比例特征。

9、根据前述权利要求中之任一项的方法，其中淋巴激活素是白细胞介素或干扰素。

10、根据前述权利要求中之任一项的方法，其中肿瘤细胞是肾肿瘤细胞、恶性黑素瘤细胞、慢性淋巴细胞性白血病或肺肿瘤细胞。

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