CN1816338A - 罗可嘌呤用于治疗淋巴细胞白血病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及罗可嘌呤或其可药用盐在制备用于治疗慢性淋巴细胞白血病的药物中的用途。

Description

罗可嘌呤用于治疗淋巴细胞白血病的用途

本发明涉及化合物2-[(1-乙基-2-羟乙基)氨基]-6-苄胺-9-异丙基嘌呤(罗可嘌呤，Roscovitine)和其可药用盐的治疗用途。

发明背景

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是在细胞周期中起重要调节作用的丝氨酸/苏氨酸激酶。CDKs通过DNA复制和细胞分裂的相关的多种蛋白质的磷酸化调节细胞周期进程，所述蛋白包括转录因子和肿瘤抑制蛋白⁵。一些CDKs也通过它们与RNA聚合酶II(pol II)的大亚基的羧基末端区域(CTD)的磷酸化相关在RNA合成的调节中起作用。因此CDKs成为有吸引力的治疗靶并不奇怪。因此，能通过竞争它们的ATP结合位点干扰CDKs的活性的多种新药物目前正在进行临床试验⁶。

现有技术已经描述了能通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶调节细胞周期的几个化合物。这些化合物包括丁内酯、flavopiridol和2-(2-羟乙基氨基)-6-苄基氨基-9-甲基嘌呤(奥罗莫星)。奥罗莫星和相关的化合物已经被证明是cdc2的抑制剂。Cdc2(亦称Cdk1)是与细胞周期调节相关的细胞周期蛋白依赖性激酶的催化亚基。

这些激酶包括至少两个亚基，即催化亚基(其中cdc2是原型)和调节亚基(细胞周期蛋白)。通过与下述细胞周期蛋白家族的成员短时间的结合调节Cdks：细胞周期蛋白A(cdc2、CDK2)、细胞周期蛋白B1-B3(cdc2)、细胞周期蛋白C(CDK8)、细胞周期蛋白D1-D3(CDK2-CDK4-CDK5-CDK6)、细胞周期蛋白E(CDK2)、细胞周期蛋白H(CDK7)。

这些复合物中的每一个与细胞周期的阶段有关。CDK活性被翻译后修饰、与其它的蛋白质短时间的结合和它们的细胞内定位修饰调节。CDK调节物包括活化剂(细胞周期蛋白、CDK7/细胞周期蛋白H、cdc25磷酸酶)、p⁹CKS和p¹⁵CDK-BP亚基以及抑制蛋白(p¹⁶ INK4A、p¹⁵ INK4B、p²¹ Cip1、p18、p²⁷ Kip1)。

目前有相当多的文献支持CDKs及其调节蛋白在人肿瘤发展过程中起重要作用的假设。因此，在许多的肿瘤中已经观察到细胞周期蛋白依赖性激酶的暂时的异常表达和蛋白抑制剂的主要失调(突变、缺失)。

罗可嘌呤已经证明是有效的细胞周期蛋白依赖性激酶，尤其是CDK2的抑制剂。CDK抑制剂被认为是阻滞细胞从细胞周期的G1/S和G2/M期的传代。最近，罗可嘌呤的纯化的R-对映异构体，CYC202(R-罗可嘌呤)在多种的肿瘤细胞中表现为凋亡的有效的诱导剂⁷并已经在临床试验中治疗乳癌和非小细胞肺癌⁶。罗可嘌呤也已经显示成视网膜母细胞瘤磷酸化作用的抑制剂并因此提示对Rb阳性的肿瘤更有效。

目前观察到罗可嘌呤在一些至今尤其难以治疗的增生疾病治疗中具有治疗的应用。

发明内容

本发明的第一方面涉及罗可嘌呤或其可药用盐在制备用于治疗慢性淋巴细胞白血病药物中的用途。

本发明的第二方面涉及治疗患有慢性淋巴细胞白血病患者的方法，该方法包括给药治疗有效量的罗可嘌呤或其药学上有效的盐。

本发明的第三方面涉及在慢性淋巴细胞白血病细胞中下调抗凋亡基因表达的方法，该方法包括使细胞接触罗可嘌呤或其可药用盐。

本发明的第四方面涉及治疗患者的慢性淋巴细胞白血病的方法，该方法包括以足够下调患者中抗凋亡基因的表达的量给药罗可嘌呤或其可药用盐于患者。

本发明的第五方面涉及下调慢性淋巴细胞白血病细胞中DNA修复基因的表达的方法，该方法包括使细胞接触罗可嘌呤或其可药用盐。

本发明的第六方面涉及治疗患者中慢性淋巴细胞白血病的方法，该方法包括以足够下调患者的DNA修复基因的表达的量给药罗可嘌呤或其可药用盐于患者。

本发明的第七方面涉及下调慢性淋巴细胞白血病细胞中与转录调节相关的基因的表达的方法，该方法包括使细胞接触罗可嘌呤或其可药用盐。

本发明的第八方面涉及治疗患者中慢性淋巴细胞白血病的方法，该方法包括以足够下调患者的与转录调节相关的基因的表达的量给药罗可嘌呤或其可药用盐于患者。

本发明的第九方面涉及用于慢性淋巴细胞白血病治疗的药物组合物，该组合物包括(i)罗可嘌呤或其可药用盐；和任选(ii)可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

发明详述

如上所述，本发明涉及罗可嘌呤在慢性淋巴细胞白血病(CLL)的治疗中的用途。

罗可嘌呤(Roscovitine)或2-[(1-乙基-2-羟乙基)氨基]-6-苄胺-9-异丙基嘌呤，也被描述为2-(1-D，L-羟甲基丙基氨基)-6-苄胺-9-异丙基-嘌呤。如在此所用，术语“罗可嘌呤”包括已拆分的R和S对映异构体、其混合物及其消旋体。

如在此所用，术语“CYC202”指罗可嘌呤的R对映异构体，即2-(1-R-羟基甲基丙基氨基)-6-苄基氨基-9-异丙基嘌呤，结构显示如下。

罗可嘌呤的体内活性如下：

激酶	IC50(μM)
		Cdk1/细胞周期蛋白B	2.7
Cdk2/细胞周期蛋白A	0.7
		Cdk2/细胞周期蛋白E	0.1
Cdk7/细胞周期蛋白H	0.5
		Cdk9/细胞周期蛋白T1	0.8
Cdk4/细胞周期蛋白D1	14.2
		ERK-2	1.2
PKA	＞50
		PKC	＞50

尽管在本领域中已知罗可嘌呤作为抗增殖剂的用途，但至今没有提示它可能在CLL的治疗中有效，已知CLL尤其难以治疗并且常常耐受常规治疗。

治疗活性

对于本发明的所有的实施方案，优选罗可嘌呤为R对映异构体的形式，即2-(1-R-羟基甲基丙基氨基)-6-苄基氨基-9-异丙基-嘌呤，以下简称“CYC202”。

慢性淋巴细胞白血病(CLL)

慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一组不同种类的疾病，特征在于B细胞和T细胞不同的成熟状态，其与病症侵占性相关。该病症特征在于免疫不成熟的和功能不全的小淋巴细胞的克隆增殖。CLL通常区分为单独的种类，包括典型的和混合型的B细胞慢性淋巴细胞白血病、B细胞和T细胞幼稚淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和多毛细胞变体、循环绒毛淋巴细胞的脾淋巴瘤(splenic lymphoma with circulating villous lymphocytes)、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T-细胞白血病/淋巴瘤综合症和B细胞和T细胞类型的恶性淋巴瘤的白血病阶段。

CLL的治疗通常是个体化的。对具有无痛性疾病的年长的患者不需要特别疗法。然而，患有更晚期疾病或患有更快速病程的疾病其它的患者可能有小于两年的半数存活期。因此，应该寻求一些治疗。大部分患者具有居中的预后，并且尽管他们几年不治疗改善相当好，最终他们将需要某种治疗形式。

至今，CLL的典型的治疗包括化疗剂苯丁酸氮芥的给药。联合化疗通常仅用于晚期病例。放疗已经有效地使用，尤其如果出现脾的扩大并且较年轻的患者的骨髓移植已经成功[Foon等，Leukemia 6(Supp.4)：26-32，1992]。美国专利5,455,280提出使用治疗有效量的β-胡萝卜素治疗CLL的方法。近年来，核苷氟达拉滨、氟代腺嘌呤类似物及2-氯脱氧腺苷、脱氧腺苷类似物已经被发现是有效的。两种类似物都抗脱氨基作用[Keating等，Leukemia 6(Supp.4)：140-141，1992]。所有这些治疗集中在恶性细胞的消除(在移植情况下，置换)。然而，CLL仍然是尤其难以治疗的病症。

B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)

在一种最优方案中，本发明涉及罗可嘌呤或其可药用盐在治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病中的用途。

B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)在西方世界是最常见的白血病并且至今是不可治愈的。病程是易变的，在常见的DNA损伤-应答途径中起作用的ATM或者TP53基因的突变导致一部分B-CLL肿瘤具有不良的临床后果。

B-CLL特征在于B-淋巴细胞增殖和蓄积，该B-淋巴细胞呈现形态学上成熟但生物学上不成熟。BCLL是典型地无痛的肿瘤并且可预期存活多年。B-CLL典型地发生在年龄超过50岁的人。在西方国家该病症占白血病的30％，仅在美国每年有10,000例被诊断的新病例。

B-CLL细胞的特征表型包括该疾病的特征标记物CD5的表达，以及至少一个其它的B-cell标记物(CD19、CD20或CD23)和表面免疫球蛋白的低表达1，其在器官上的浸润导致淋巴结肿大和肝脾肿大。在该疾病的晚期，异常淋巴细胞的骨髓占位导致骨髓衰竭，导致贫血和血小板减少。

CLL的B细胞具有小鼠红细胞的受体，一种不成熟的B细胞的标记物。在有抑制性T细胞数增加的病症中已经报道了增加的T细胞数。典型地，辅助/抑制性T细胞的比例的转化导致增加的抑制性T细胞和减少的辅助性T细胞。自然杀伤细胞的绝对数也可被增加。除了提供患有B-CLL的患者的临床资料外，染色体分析提供关于全部存活者的预后信息。

疾病的临床病程显著地变化，一些患者在持续期保持稳定的状态而在其他患者进展更加迅速。用于B-CLL的标准疗法包括苯丁酸氮芥以及近来的嘌呤类似物氟达拉滨。然而，在给与氟达拉滨后，观察不到全体存活的明显增加，并几乎在所有的氟达拉滨治疗的患者上最终发生复发2。

在本发明的优选方案中，罗可嘌呤对B-CLL细胞的选择性细胞毒效应超过正常淋巴细胞。

本申请人的研究已揭示用同样浓度的CYC202处理的正常的淋巴细胞也对药物的细胞毒效应敏感。然而，这些细胞显示时间上亦被延迟的更低的细胞毒的应答。因此，与正常B细胞相比，CYC202显示对B CLL细胞的选择性细胞毒性。假设在与CYC202培养最少6小时的后能诱导B-CLL细胞的凋亡，体内给药CYC202的剂量和间隔处理还可区别B-CLL细胞和正常淋巴细胞间的应答。实际上，支持该意见，CYC202的低毒性已经在临床中已经被报道7。

T细胞慢性淋巴细胞白血病

在另一个优选方案中，发明涉及罗可嘌呤或其可药用盐在T细胞慢性淋巴细胞白血病的治疗中的用途。

T细胞慢性淋巴细胞白血病(T-CLL)包括CLL的所有病例的小于5％并由两种实体组成。一种具有免疫表型CD3+、CD4-、CD8+、HNK-1T并被称为大颗粒状淋巴细胞增生。T-CLL的第二种形式具有表型CD3+、CD4+、CD8-[Pathology，第二版，Emanual Rubin，John L.Farber，p1067]。

在大颗粒淋巴细胞增生中，赘生性细胞是大的并具有适量的含有丰富的嗜苯胺蓝性的颗粒的细胞质。这些淋巴细胞被认为与自然杀伤(NK)细胞群相关。在85％的病例中，大颗粒的淋巴细胞增生是无痛和慢性的病症，而小的未成熟的则具有侵占性的临床病症。疾病的表征为持续增加循环大颗粒淋巴细胞、脾大和中性白细胞减少(继发反复感染)并经常地与风湿性关节炎有关。

CD4+T-CLL常见于年轻的成年人，并且特征在于显著地提高的外周血液淋巴细胞计数。尽管核轮廓有时是不规则的或脑回状的，肿瘤的辅助T细胞形态上与B-CLL淋巴细胞不能区别。皮肤累及是常见的(皮肤趋向性(dermato tropism))，并且通常有突出的肝脾肿大。骨髓和中枢神经系统的浸润是特征要素。CD4+T-CLL是侵占性的，并且平均存活仅仅1年。

幼稚淋巴细胞白血病

在另一个优选实施方案中，本发明涉及罗可嘌呤或其可药用盐在治疗幼稚淋巴细胞白血病中的用途。

在80％的病例中，幼稚淋巴细胞白血病是B-CLL的特殊的变异体并且在20％的病例中是T-CLL的变异体。肿瘤的B幼稚淋巴细胞比B-CLL细胞表达更丰富的表面膜免疫球蛋白并且似乎是免疫不成熟的。幼稚淋巴细胞白血病的临床表征是粗大的脾和白细胞计数的显著升高(大于50％幼稚淋巴细胞)。

淋巴结病在B细胞幼稚淋巴细胞白血病中是不显著的，而常常在T细胞变种中观察到中度淋巴结病。幼稚淋巴细胞白血病在年长男性中最常见(4∶1男性优势)。它是侵占性的疾病，平均存活2至3年[Pathology，第二版，Emanual Rubin，John L Farber，p1067]。

T细胞幼稚淋巴细胞白血病(T-PLL)

在一个优选实施方案中，本发明涉及罗可嘌呤或其可药用盐在治疗T细胞幼稚淋巴细胞白血病(T-PLL)中的用途。

T-PLL是影响成熟T细胞的罕见的慢性的淋巴增生的病症。该疾病发生在老年，典型地在七十或八十岁并且具有轻微的男性优势。尽管患者显示如B-PLL的类似的最初症状，T-PLL目前被认为是有不同的临床的和实验室特征的自成一类的恶性肿瘤，表征为起病隐袭并且结果不良。T-PLL仅为成熟B和T细胞白血病的3％，但是约为幼稚淋巴细胞白血病的20％。在20％的T-PLL的病例中细胞是小的且有不显著的核，其仅通过电子显微镜确定。这些病例已经被认为是T-PLL小细胞变种。

T-幼稚淋巴细胞具有成熟胸腺后(post thymic)淋巴细胞的表型：CDla-、末端脱氧核苷酸转移酶-TdT-、CD2+、CD3+、CD5+、CD7+。关于CD4和CDS表达，最常见的表型是CD4+/CD8-。在25％的病例中发现CD4和CD8(双阳性表型)的共表达。

该疾病是侵占性的并且进展迅速。临床实验表明在T-PLL治疗中的有效治疗剂的数目是有限的。存活率从7个月(对于未经治疗患者)到17.5个月(适应治疗患者)不等。至今，治疗集中于如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、多柔比星和长春新碱的药剂的给药，其引起部分的成功。尽管用2-脱氧柯福霉素和和CD52抗体(campath-1H)已经观察一些成功，该治疗仍是临床问题并且有待发现更有效治疗方法。

CDK的抑制

在一个优选方案中，以足够抑制至少一种CDK酶的量给药罗可嘌呤。

优选地，CDK酶选自CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和CDK9。

在一个尤其优选的实施方案中，CDK酶是CDK2。

在另一个尤其优选的实施方案中，CDK酶选自CDK7和CDK9。

ATM突变型和TP53突变型肿瘤

先前的研究表明由于p53途径的缺陷，高达30％的B-CLL肿瘤具有不良的临床的结果，该p53途径涉及由于ATM基因或者TP53基因突变导致的DNA损伤后凋亡的诱导^3，4，22。这种突变显著地导致耐药性，因为最常见的抗癌治疗通过p53依赖性凋亡通路的活化发挥它们的效应^3，4，22。因此，对能绕过该关键的遗传缺陷的治疗明显感兴趣，即迫切需要抗ATM和TP53突变型的B-CLL肿瘤的新的治疗。

在本发明的一个优选的实施方案中，慢性淋巴细胞白血病与ATM突变型相关。

更优选地，慢性淋巴细胞白血病是与突变型ATM相关的B-CLL。

在本发明的另一个优选的方案中，慢性淋巴细胞白血病与突变型TP53相关。

更优选地，慢性淋巴细胞白血病是与突变型TP53相关的B-CLL。

本申请人的研究探讨了CYC202抗包括ATM和TP53突变型肿瘤亚型的总26个B-CLLs的体内活性。结果与电离辐照(IR)和氟达拉滨诱导的细胞毒活性具有可比性。

将B-CLL细胞用5μg/ml以及以上浓度的CYC202处理并且不管ATM或TP53基因的状态如何，在处理的24小时内显示高水平的凋亡。因此，令人惊讶地，ATM突变型、TP53和野生型B-CLL肿瘤对CYC202的应答是相当的。

这与氟达拉滨的处理相反，其中应答被延迟并且显著地下降，并且包括一部分似乎非应答的ATM突变型肿瘤，即提示显著地体内抗氟达拉滨诱导的凋亡。结果也与IR诱导的凋亡相反，其中ATM和TP53突变型都显示明显的细胞的杀伤缺陷⁸。因此CYC202在24小时内外在B CLL肿瘤细胞样品中能有效地诱导凋亡，不管p53途径是否完整。

作用方式

在本发明的一个优选实施方案中，罗可嘌呤下调抗凋亡基因的表达。

优选地，抗凋亡基因包括至少一种选自Mcl-1、Bcl-2和Mad3的基因。

在另一个本发明的优选方案中，罗可嘌呤下调DNA修复基因的表达。

优选地，DNA修复基因包括PCNA或XPA。

在本发明的另一个优选实施方案中，罗可嘌呤下调与转录调节相关的基因的表达。

优选地，与转录调节相关的基因包括至少一个选自Pol II、eIF-2，4e和E2F的基因。

在本发明的一个具体优选实施方案中，罗可嘌呤或其可药用盐的量足够下调Mcl-1表达。

本发明的一个方面涉及在B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞中下调Mcl-1基因表达的方法，所述方法包括用罗可嘌呤或其可药用盐接触所述细胞。

本发明的另一个方面涉及治疗对象的B细胞慢性淋巴细胞白血病的方法，所述方法包括以足够下调所述对象的Mcl-1的表达的量给药罗可嘌呤或其可药用盐至所述患者。

本发明的另一个方面涉及罗可嘌呤或其可药用盐在制备用于的治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的药物中的用途，其中罗可嘌呤或其可药用盐的量足够下调所述患者的Mcl-1的表达。

本申请人的研究证明在至少24小时，CYC202在B-CLL细胞上效应优于氟达拉滨诱导的效应并且是更显著的。氟达拉滨被认为通过DNA损伤诱导p53的上调并活化p53的途径诱导细胞死亡。然而，在本研究中p53突变B-CLL肿瘤体外对氟达拉滨敏感的事实支持氟达拉滨能显示非p53依赖的杀伤(killing)的观点。实际上，Pettitt等¹⁵报告了在有p53功能障碍的B-CLLs中对氟达拉滨的应答。此外，可能一些氟达拉滨作用机理是ATM依赖性的，因为发现体外耐氟达拉滨的6种肿瘤中的4种在是ATM突变型。与此相反，CYC202显示对ATM和TP53突变型B-CLL肿瘤都有强大的杀伤效应，意味杀伤机制不依赖ATM和p53功能。

以前已经发现CYC202对CDK2-细胞周期蛋白E显示有效的抑制效果，该蛋白是细胞传代至S期所需的⁷。然而，B-CLL细胞的基本上非循环性质明显提示该药物活性的另外的机理。本申请人的研究发现应答于CYC202的处理多种基因下调，所述基因包括转录和翻译调节相关基因(RNA pol II、RNA pol III)、抗凋亡蛋白(Mcl-1、Bcl-2)以及DNA修复蛋白(XPA)。因此，转录的下调形成CYC202杀伤B-CLL的可能机制。

在转绿期间，PTEF-b(CDK9/细胞周期蛋白T1)和TFIIH(CDK7/细胞周期蛋白H)在包括丝氨酸2的特异的目标残基上¹⁶磷酸化RNA聚合酶II的碳末端域(CTD)，并且该磷酸化作用发生在开始转录延伸前¹⁷。已经提示抑制CDK9和CDK7激酶以及RNA pol II CTD的磷酸化作用的药物充当转录阻抑物¹⁸。和CYC202的作为转录阻遏物的作用一致，在该药物处理的B-CLL细胞中观察到RNA pol II的丝氨酸2磷酸化作用的迅速减少。此外，发现该修饰与所有转录下调一起先于所有B-CLL肿瘤细胞中凋亡的诱导。

CYC202介导的减少的转录的一个结果包括Bcl-2家族成员即Mcl-1的下调。本申请人的研究发现Mcl-1而不是Bcl-2蛋白的水平降低与CYC202处理后凋亡的启动一致。此外，CYC202-诱导的Mcl-1的消失刚好在胱冬酶-3和-7活化之前，提示Mcl-1下调可能为在B-CLL细胞经线粒体途径诱导凋亡的重要事件。因此，联系在一起，B-CLL细胞用CYC202培养后的事件的可能顺序可包括：a)通过下调RNA pol II磷酸化作用和转录调节基因的转录抑制，b)短寿命蛋白如Mcl-1和或者其它的前存活因子(pro-survivalfactor)的消失，c)线粒体的活化和细胞色素C释放，d)效应器胱冬酶的活化和凋亡的启动。

总之，以前已经表明ATM和TP53-突变的B-CLL肿瘤与通常比较不良的预后以及体外DNA损伤诱导的凋亡缺乏有关，后者在TP53突变型肿瘤的情况下，似乎是凋亡信号的减少以及损伤诱导的前存活应答增加二者的结果⁸。此处描述的本研究表明CYC202是包括有ATM或TP53突变型的B-CLL细胞中有效的凋亡诱导剂，并作为转录的阻遏物和存活信号。此外，B-CLL细胞上的全基因表达分析显示转录和翻译调节和凋亡抑制以及DNA修复的相关基因显著的下调。此外，在诱导凋亡以前，CYC202在RNA和蛋白水平上都导致RNA聚合酶II磷酸化作用的抑制并导致前存活因子Mcl-1的迅速消失。

因此能推断CYC202是B-CLL细胞的有效的凋亡诱导剂，无论p53途径的功能状态如何。由此，并根据它的低毒性，其可用作有效的治疗剂以改善耐药B-CLLs的结果并在治疗进攻性的肿瘤中提供显著的改善。

药物组合物

尽管罗可嘌呤(或其可药用盐、酯或可药用的溶剂合物)能单独给药，对于人治疗通常将其与药物载体、赋形剂或稀释剂混合给药。

因此，本发明的优选实施方案涉及罗可嘌呤与可药用的赋形剂、稀释剂或载体结合给药。

用于多种不同形式的此处描述的药物组合物的这种适合的赋形剂的实施例可见“Handbook of Pharmaceutical Excipients”，第二版，(1994)，由Wade和PJ Weller编辑。

用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域中众所周知，例如描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑，1985)。适合的载体的实例包括乳糖、淀粉、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、甘露醇、山梨醇等等。适合的稀释剂的实施例包括乙醇、甘油和水。

药物载体、赋形剂或稀释剂的选择能根据预定给药途径和标准药物实践选择。药物组合物可包括如载体、赋形剂或稀释剂任何适合的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂或增溶剂作为载体、赋形剂或稀释剂，或作为其补充。

适合的粘合剂的实例包括淀粉、明胶、天然糖如葡萄糖、无水的乳糖、自流乳糖(free-flow lactose)、β-乳糖、玉米甜味剂、天然的和合成的树胶，如阿拉伯胶、黄耆胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素和聚乙二醇。

适合的润滑剂的实例包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、醋酸钠、氯化钠等等。

在药物组合物中可提供防腐剂、稳定剂、着色剂和甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对-羟基苯甲酸酯。抗氧化剂和悬浮剂也可使用。

盐/酯

本发明的药剂可以盐或酯尤其是药物可接受的盐或酯的形式提供。

本发明药剂的药物可接受盐包括它们合适的酸加成盐或碱加成盐。合适药物盐的综述可见Berge等人的J.Pharm Sci， 66，1-19(1977)。盐为与例如以下酸形成的盐：强无机酸，如矿物酸，例如硫酸、磷酸或氢卤酸；强有机羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至4个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸(tetraphthalic)；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C₁-C₄)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。

取决于被酯化的官能团，使用有机酸或醇/氢氧化物形成酯。有机酸包括羧酸，如未取代或取代(如被卤代)的1至12个碳原子的链烷羧酸，例如乙酸；饱和或不饱和的二元羧酸，例如草酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸或四邻苯二甲酸；羟基羧酸，例如抗坏血酸、羟基乙酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或柠檬酸；氨基酸，例如天冬氨酸或谷氨酸；苯甲酸；或与有机磺酸，如未取代或取代(如被卤代)的(C₁-C₄)烷基磺酸或芳基磺酸，如甲磺酸或对甲苯磺酸。合适的氢氧化物包括无机氢氧化物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝。醇包括未取代或取代(如被卤代)的1至12个碳原子的链烷醇。

对映异构体/互变异构体

本发明还适当地包括药剂的全部对映异构体和互变异构体。本领域的技术人员能认识到具有光学性质(一个或多个手性碳原子)或互变异构特征的化合物。可通过本领域中已知的方法分离/制备相应的对映异构体和/或互变异构体。

立体异构体和几何异构体

本发明的活性成分可以立体异构体和/或几何异构体的形式存在，例如其可具有一个或多个不对称和/或几何中心，并因此可以二种或多种立体异构和/或几何形式存在。本发明包括该活性成分所有的单独立体异构体和几何异构体及其混合物的使用。权利要求中使用的术语包括这些形式，只要所述形式保留适当的功能活性(但不必到相同程度)。

本发明还包括活性成分或其药物可接受盐的所有合适的同位素变体。本发明药剂或其药物可接受盐的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量与自然界中通常发现的原子质量不同的原子取代的物质。可被掺入到药剂和其药物可接受盐的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别如²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。本发明的活性成分和其药物可接受盐的一些同位素变体，例如结合放射性同位素如³H或¹⁴C的那些化合物，在药物和/或底物组织分布研究中是有用的。含氚的即³H和碳-14即¹⁴C同位素因其容易制备和可检测性而特别优选。此外，用同位素如氘即²H的取代可因较大的代谢稳定性而提供特定的治疗益处，例如体内半衰期增加或剂量要求降低，并因此可在一些情况下被优选。通常可使用合适试剂的适当同位素变体通过常规过程制备本发明药剂和其药物可接受盐的同位素变体。

溶剂合物

本发明还包括本发明药剂的溶剂合物形式。权利要求中使用的术语包括这些形式。

多晶型物

本发明还涉及各种结晶形式、多晶型形式和无水/水合形式的本发明的药剂。众所周知，在药物工业中可通过稍微改变这种化合物合成制备中所用溶剂的纯化方法和或分离形式来分离得到化合物的任意这类形式。

前药

本发明还包括前体药物形式的本发明的药剂。这种前体药物通常为一个或多个适当基团已被修饰以使在对人或哺乳动物对象给药后所述的修饰可被逆转的化合物。虽然为了实现体内逆转可与这种前体药物一起给药第二种药剂，但通常通过在这类对象中天然存在的酶实现这种逆转。这类修饰的例子包括酯(例如上述那些中的任一种)，其中可通过酯酶等进行逆转。其它这类系统为本领域中那些技术人员所熟知。

给药

可使本发明的药物组合物适于口服、直肠、阴道、肠胃外、肌内、腹膜内、动脉内、鞘内、支气管内、皮下、皮内、静脉内、膀胱内、鼻、口腔或舌下给药途径。

对于口服给药，特别利用压缩片剂、药丸、片剂、凝胶(gellules)、滴剂和胶囊。优选地，这些组合物每剂包含1-2000mg和更优选50-1000mg的有效成分。

其它的给药形式包括溶液或乳剂，其可静脉注射、动脉内注射、鞘内注射、皮下注射、真皮内注射、腹膜内注射或肌内注射，并且其从无菌的或灭菌溶液制备。本发明的药物组合物也可以以栓剂、阴道栓、混悬液、乳剂、洗剂、软膏、乳膏剂、凝胶剂、喷雾、溶液或散粉剂(dusting powders)的形式。

透皮吸收给药的可选择的装置是通过使用皮肤贴剂。例如，活性成分能被包含进由聚乙二醇或液体石蜡的含水乳化液组成的乳膏剂。活性成分也能以1-10％重量的浓度被包含到由白蜡或白色软石蜡基质与需要的这种稳定剂和防腐剂组成的软膏中。

可注射形式的每剂量可包含10-1000mg，优选10-500mg的活性成分。

组合物可以单位剂量的形式配制，即包含单位剂量的分部分，或多次或次单位(sub-unit)的单位剂量的形式。

在尤其优选的实施方案中，本发明的组合或药物组合物静脉内给药。

剂量

本领域的一般技术人员不经过过度的试验就能容易地确定给药患者即时组合物合适的剂量。典型地，医生将确定最适合于个体患者的实际剂量，并且将根据多种的因素包括活性剂的活性、代谢的稳定性和药剂的作用时间长短、年龄、体重、常规健康情况、性别、饮食、给药方式和时间、排泄率、药物联用、具体的病症的严重性和个体正接受的治疗。施用的剂量和频率典型地适合于患者的常规医学病症和引起副作用的严重程度，尤其是对造血、肝和肾系统引起的副作用。此处公开的剂量是平均病例的示范。当然能有其中较高的或较低的剂量范围是有利的个体情况，并且这在本发明的范围内。

根据需要，药剂可以以0.1～30mg/kg体重或2-20mg/kg体重的剂量给药。更优选地药剂可以以0.1～1mg/kg体重的剂量给药。

如上所述，罗可嘌呤优选以治疗有效量给药，优选以可药用量的形式。该量将为本领域技术人员所熟知。指导性地，罗可嘌呤典型地以大约0.05-5g/天的剂量经口服或静脉内给药，优选大约0.5-大约5g/天或1-大约5g/天剂量给药，并且甚至更优选大约1-大约3g/天剂量给药。罗可嘌呤优选以片剂或胶囊剂形式口服给药。罗可嘌呤的总日剂量能以单剂量给药或或被分成分剂量，一天给药2、3或4次。

联合给药

在本发明的一个优选实施方案中，罗可嘌呤与一种或多种其它的抗增殖药联合给药。在此情况下，本发明的化合物可与一种或多种其它的抗增殖药剂连续地、同时地或顺序地给药。

在本领域中已知在多种药物联合使用时更有效。尤其，为避免主要毒性、作用机制和耐药机制的重叠，联合治疗是理想的。此外，以它们的最大耐受量以在这些剂量之间的最小时间间隔内给药最多药物也是理想的。联用药物的主要优点是可通过生物化学的相互作用促进相加或可能的协同效应并也可减少耐药性的出现，耐药性将对单个药物初始治疗有其他的反应。

通过研究测试化合物联用已知的或认为在治疗具体的病症中有用的药剂的活性可得到有益的联合。该步骤也可以用来确定药剂的给药顺序，即在递送之前、同时或之后。

本发明进一步地以实施例的方式说明，并参考下列图。附图的详细说明可见实施例部分。

图1显示TPLL-1细胞(A)的CD8+/CD4+双阳性免疫表型和HLA-B27的直方图(B)。

图2显示显示比较基因组杂交(CGH)。肿瘤DNA的杂交用FITC检测并且参比DNA杂交用TRITC检测。

图3显示TPLL-1细胞中的c-myc的荧光原位杂交(FISH)分析。

图4显示通过双色FISH检测c-myc的3个拷贝。

图5表明用罗可嘌呤(CYC-202)培养5小时导致96％的TPLL-细胞凋亡，其不被佛波醇酯(10nM TPA)抑制。

图6显示用10μM罗可嘌呤培养18小时的结果。

图7显示检测TPLL-1细胞的细胞周期蛋白A、B1、D1和E表达的结果。

图8显示TPLL-1细胞中凋亡抑制因子Bcl-2的表达。

图9显示10μM罗可嘌呤对TPLL-1细胞内应激信号途径的影响。

图10显示用对于PI-3K-依赖方式的磷酸化的Akt/PKB(Ser-473)和Raf-1(Ser-338)位点的特异抗体免疫印迹的结果。

图11显示在未处理、放射或药物作用下的B-CLL肿瘤细胞随时间的存活力。a)B-CLL肿瘤对CYC202的剂量-效应，用以下活细胞百分比表示：26个不经处理的肿瘤样品的26个，26个用1μg/ml的CYC202处理的肿瘤样品中的24个，26个用2.5μg/ml的CYC202处理的肿瘤样品中的19个以及26个用5μg/ml的CYC202处理肿瘤样品中的26个。细胞存活力和凋亡通过膜联蛋白V检测来测定；b)至d)：通过基因型分类的B-CLLs：b)15个ATM野生型肿瘤样品没有处理或用5戈瑞的放射线、20μM的氟达拉滨或5μg/ml的CYC202处理。通过如a)中的膜联蛋白V检测进行细胞分析；c)7个ATM突变型的肿瘤样品；d)4个TP53-突变型肿瘤样品。细胞存活力和凋亡通过膜联蛋白V检测来测定。

图12显示：a)当暴露于5μg/ml的CYC202、20μM的氟达拉滨、5戈瑞辐照、或没有处理24小时，B-CLL细胞(所有亚型合并)存活力的百分比下降的比较；b)当暴露于5μg/ml的CYC202、20μM的氟达拉滨、5戈瑞或没有处理的B-CLL细胞亚型存活力的减少。

图13显示a)用5μg/ml的CYC202培养对正常B细胞(实线)以及B-CLL细胞(虚线)存活力的影响，在24、48和72小时用膜联蛋白V检测；和b)正常细胞以及B-CLL细胞对CYC202(5μg/ml)的体外反应。在正常外周B细胞中，存活力的丧失是不太显著的，并且与B-CLL细胞的超过80％相比，在用CYC202处理后凋亡的增加少于60％。

图14显示用5μg/ml的CYC202培养的B-CLL细胞对a)p53和p21蛋白表达和b)PARP1、胱冬酶原3(procaspase-3)和胱冬酶原7裂解的影响。ATM野生型细胞处理0、1、2、3、4、5、6和24小时，ATM突变型细胞处理0、2、10和18小时以及TP53突变型细胞处理0、2、4、6、8、10和24小时并提取蛋白并通过蛋白印迹对p53和和p21表达进行分析。肌动蛋白用作上样对照。

图15显示：a)微阵列分析显示，与相同未处理的瘤相比，用5μg/ml的CYC202处理4小时后的5个B-CLL瘤中典型的基因下调；b)在所有3种B-CLL亚型中通过蛋白印迹证实二个抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-2的表达降低；c)在培养达24小时的ATM野生型B-CLL细胞中没有Mcl-1的下调和PARP1的裂解；d)通过蛋白印迹证实B-CLL细胞中PCNA的表达降低；e)用CYC202处理前后的B-CLLs的微阵列分析。

图16显示：a)用对RNA pol II的丝氨酸2的磷酸特异抗体的蛋白印迹所示，CYC202处理后2个ATM野生型B-CLL肿瘤样品的RNA pol II的磷酸化下调；b)CYC202处理24小时后总RNA pol II蛋白水平下调。

实施例

除非另外定义，在此所用的所有技术和科学术语具有如本领域(例如，细胞培养、分子遗传学、核酸化学、杂交技术和生物化学)普通技术人员理解的相同意义。使用分子、遗传和生化法的标准技术。一般性参见，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley&Sons，Inc.；以及Guthrie等，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods inEnzymology，Vol.194，Academic Press，Inc.，(1991)，PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications(Innis，等1990.Academic Press，San Diego，Calif.)，McPherson等，PCR Volume1，Oxford University Press，(1991)，Culture ofAnimal Cells：A Manual of Basic Technique，第2版(R.1.Freshney.1987.Liss，Inc.New York，N.Y.)，以及Gene Transfer and Expression Protocols，pp.109-128，E.J.Murray编辑，The Humana PressInc.，Clifton，N.J.)。这些文献作为参考在此引入。

罗可嘌呤的制备

根据在EP0874847B(CNRS)中公开的方法制备CYC202。

实施例1

罗可嘌呤对B-CLL细胞的体外活性

进行实验以证明罗可嘌呤能克服B细胞慢性淋巴细胞白血病中的p53-依赖性凋亡途径的缺陷。B-CLL仍然是不可医治的并急迫需要有新的治疗。目前大多数抗癌治疗通过激活p53-依赖性凋亡途径发挥其作用。然而，5-10％的B-CLL瘤显示TP53基因的突变，还有20-25％在ATM基因上突变。ATM通过DNA双链断裂活化并且通过磷酸化活化p53。TP53或ATM基因突变导致损害的p53-依赖性凋亡并且与不良临床结果有关。检测了罗可嘌呤对B-CLL细胞的的体外活性。研究显示罗可嘌呤抑制细胞周期调节性CDK1和CDK2以及转录调节性CDK7和CDK9。它引起多种实体肿瘤细胞系凋亡，作为单个药剂以及与化疗联用诱导异种移植中肿瘤的衰退。癌症患者的I-II期临床研究正在进行。

8名患者为ATM突变型(7个无ATM蛋白表达，1个为残余蛋白(residualprotein))并且10名为ATM/TP53野生型。罗可嘌呤以1-25微克/ml剂量使用。膜联蛋白V分析[膜联蛋白V/碘化丙锭染色试剂盒，Becton DickinsonBiosciences，USA]显示治疗8小时内发生的凋亡的最初迹象。不管ATM的状态如何，经16小时，存活力显著降低并且处于早期凋亡的B-CLL细胞比例增加非常明显。所有患者的细胞显示活力下降至少75％。没有观察到高于5微克/ml的剂量依赖性，因为罗可嘌呤在此浓度的作用已经显著。虽然ATM突变型和野生型肿瘤对辐照应答显示出明显的差异，但他们显示对罗可嘌呤相等的应答。24小时后正常淋巴细胞对5微克/ml罗可嘌呤应答显示出延迟和降低的毒性。

为研究罗可嘌呤的作用机制，对几个凋亡相关蛋白进行蛋白质印迹分析[Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.以及Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，John Wiley&Sons，Inc.]。在用5微克/ml的罗可嘌呤治疗细胞后，抗凋亡蛋白Mcl-1下调[J.Biol.Chem.，274：1801-1813，1999；J.Cell Biol.，128(6)：1173-1187，1995；Proc.Nat.Acad.Sci.USA，90：3516-3520，1993]。凋亡标示物PARP的断裂在治疗2小时后出现[FASEB Journal 10：587-597，1996；Science，267：1456-1462，1995；Biochim.Biophys.Acta，950：147-160，1988；J.Biol.Chem，271(9)：4961-4965，1996；Nature，371：346-347，1994]。有趣地，PUMA，p53-依赖的前凋亡蛋白表达也下调[Mol Cell.2001 Mar；7(3)：673-82]。我们推断罗可嘌呤是有效的B-CLL细胞凋亡诱导物，不论p53途径的功能状态如何。

更详细研究在以下实施例2中阐述。

实施例2

材料和方法

B-CLL患者

样品取自52到93岁年龄范围的患者。2个患者诊断为Ao阶段，8个患者具有A阶段、5个在B阶段和2个在B/C阶段，而确认10个患者在疾病的C阶段。所有患者以前的和当前的治疗以及ATM/TP53突变状态和对氟达拉滨和CYC202的应答一起显示在表2中。

B-CLL细胞

测试了26个B-CLL患者样品的ATM或TP53状态。7个肿瘤是ATM突变型(6个没有ATM蛋白表达，1个为残留ATM蛋白)，15个肿瘤为ATM/TPS3野生型，并且4个肿瘤为突变型TP53⁸。单核细胞通过得自B-CLL患者的全血梯度离心分离，并且在90％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亚砜(DMSO)中以存活的状态冻存。进行实验的时候，将细胞解冻，用预温的含有1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，Gillingham，UK)和谷氨酰胺的RPMI洗涤，并以每毫升1×10⁶细胞的密度培养至少3小时。体外敏感性试验中，将细胞以每毫升大约1×10⁶细胞用RPMI-1％BSA/谷氨酰胺铺在24孔培养板上。

正常B细胞的分离

通过如上所述的梯度离心从正常供体得到单核细胞(MNCs)。将全血与RosetteSep B细胞富集抗体混合物(StemCell Technologies，London，UK)混合，在室温下培养20分钟，用1∶1的PBS-2％FBS稀释，用淋巴细胞分离剂分层并离心。将B细胞洗涤、计数并铺到用于实验的培养板上。

体外诱导凋亡

药物

将CYC202在DMSO中重悬、过滤灭菌并分成几份冻存在-20℃。进行实验的时候，将等分解冻，用培养基进行1∶10稀释并加到孔中。将氟达拉滨重悬在无菌水中并保持在4℃。对于敏感性试验，各肿瘤样品被分成二个等分部分，一半用5戈瑞照射并用不含任何药物、二个药物分别各自和一起联用培养(所有样品使用的浓度是20μM氟达拉滨和5、10和25μg/mlCYC202)，而第二等分部分不照射但同样用药物以及不用药物处理。对于洗涤实验，将细胞在有CYC202的情况下培养不同的持续时间，然后洗涤，用新鲜的培养基重新铺板并在24和48小时测定细胞活力。

辐照

将肿瘤样品重悬在RPMI-1％BSA中并用5戈瑞(Gy)照射，使用发射γ型射线的Precisa 217放射源(Pantatron Ltd，Gosport，Hampshire，UK)。

凋亡分析

膜联蛋白V凋亡试剂盒(BD Pharmingen，Oxford，UK)用来测定细胞群的凋亡。将细胞如上述“B-CLL细胞”所述铺到培养板上。将B-CLL和对照细胞用药物处理0、4、8、16、24、48、72和96小时然后收集并用冷PBS洗涤。将细胞沉淀重悬，并将厂家提供的100μl的1×缓冲液加到各管中。除对照外，然后将5μl的膜联蛋白V和5μl的碘化丙锭(PI)加到所有管中。轻轻混合后，在加入500μl的1x缓冲液以前，将管在黑暗中保持15-45分钟并用Coulter Epics XL-MCL流式细胞器(Beckman Coulter，CA，USA)分析。

蛋白质印迹

将细胞用RPMI-1％ BSA+谷氨酰胺铺到非组织培养处理的6孔板上，并恢复培养至少3小时然后加入CYC202。加入CYC202(或DMSO作为对照)后，将培养板轻轻振摇并放回到培养箱中。在标示的时间点，将细胞收集，用冷PBS冲洗并将细胞沉淀在液氮中快速冻存并储存在-80℃。将解冻的细胞沉淀用100～150μl的含有蛋白酶抑制剂(DTT、V04、NaF、AEBSF、抑肽酶、亮肽素和胃酶抑素)的TGN缓冲液(50mM HCl、150mM NaCl、10％甘油、1％Tween-20、0.2％NP 40和50mMβ-甘油磷酸)在冰上裂解30分钟。将裂解物在4℃在15,000rpm离心20分钟，收集上清液并分批地快速冻存。使用Bradford试剂(Bio Rad，HemelHempstead，UK)测定每种样品的蛋白含量。将等量的蛋白在8、10或12％的丙烯酰胺凝胶上电泳并进行标准蛋白印迹操作。Mcl-1和XPA的第一抗体购自BD Pharmingen(Oxford，UK)，Bcl-2、PARP n20和Mad3购自Santa Cruz(Autogen Bioclear，Calne，UK)并且肌动蛋白购自Sigma Aldrich(Dorset，UK)。抗RNA pol II和抗RNA pol II丝氨酸2购自Covance Research Products(Cambridge Bioscience Ltd，Cambridge，UK)。第二抗体抗小鼠IgG过氧化物酶结合物和抗山羊IgG偶联过氧化物酶购自Sigma-Aldrich。抗兔HRP购自DAKO(Ely，UK)。固定化抗原使用ECL蛋白质印迹检测系统(Amersham Biosciences，Chalfont St Giles，UK)以及X光胶片曝光(HyperfilmM，Amersham Biosciences)检测。

流式细胞测定

CD5-PE(T1-RD1)和CD19-FITC(B4-FITC)抗体购自Coulter Clone(HighWycombe，UK)。进行染色的时候，在室温下，将细胞在含有10％FBS的PBS中孵育20分钟，然后洗涤、重悬在PBS-10％FBS中并在室温下避光染色30分钟。孵育后，将细胞洗涤、重悬在PBS-1％FBS中并通过使用CoulterEpics XL-MCL流式细胞仪进行流式细胞测定分析。

微阵列分析

在用5μg/ml CYC202孵育前和孵育4小时后，将5个B-CLL肿瘤样品，即2个ATM突变型和3个ATM/TP53野生型进行微阵列分析。再延长孵育20小时后，将各样品的一份染色以测定CD5和CD19，并且另一份使用膜联蛋白V染色外测定凋亡。对于微阵列分析，如前所述进行总RNA提取、合成cDNA第一和第二链、体外转录和芯片杂交⁸。孵育后，将芯片洗涤并用链亲和素-藻红蛋白标记并通过第二轮染色将结果信号放大。使用流控技术工作站(Affymetrix，High Wycombe)进行洗涤和染色步骤。用共聚焦氩离子激光器(Agilent Technologies，CA，USA)扫描芯片。

数据采集、归一化、过滤和统计分析

使用Affymetrix Microarray Suite 5.0软件得到所有10个杂交的表达值。使用MAS5.0报告文件和Genespring 5.1(Silicon Genetics，San Carlos，USA)评价数据质量。为了用GeneSpring 5.1软件分析，对于各阵列，将原始数据从MAS5.0输出并将值相对于中位信号进行标准化。为了以药物应答为根据作比较，将未处理的样品的基因表达平均水平作了另外的归一化。U95Av2基因芯片含有12,627种转录物包括对照细菌基因。为设计一系列信息基因，用Genespring 5.1产生试验性的解释以比较接触CYC202前后的肿瘤。在任何情况下，使用基于重复实验的总体误差模型测定差异。在5个B-CLL平行检测中至少3个样品中，将信号强度不显著超出背景值的基因和表达没有达到可信的检测的临界值的基因排除(根据Affymetrix MAS5.0检测概率值p≤0.1)。最终，表达水平对药物的应答变化不超过1.5倍的基因也被排除。剩余的基因被认为是提供信息的，并使用由平行测定获得的方差统计的总体误差模型，进行两种情况(未处理的和处理的细胞)的参数(Welch)t检验。最后，为减少假差别基因表达的发现，使用Benjamini-Hochberg多重检测校正过滤。

作为可选择的方法，微阵列芯片的扫描图像使用探针水平分位数归一化(quantile normalization)进行分析⁹。随后，使用Bioconductor方法的Affymetrix package(http：//www.biocondutor.org)在原始CEL文件上进行强大的多-阵列分析。差异表达探针组用SAM^11，12识别。最后，使用DNA-芯片分析器和默认设置(dChip；Wong Lab，Dept ofBiostatistics，Harvard School ofPublic Health，Dept.of Biostatistical Science，Dana-Farber Cancer Institute；http：//www.dchip.org)进行基因的分级聚类(hierarchical clustering)。两种方法识别的CYC202应答的基因被进一步考虑。另外，为了识别CYC202-特异的前凋亡应答，CYC202-应答基因的列表与得自同样的肿瘤样品的IR-应答的基因进行比较⁸。

结果

CYC202是B-CLL肿瘤中是有效的体外凋亡诱导剂

为了建立对于诱导B-CLL细胞中的毒性最佳的CYC202剂量和培养时间，典型的B-CLL肿瘤样品(1个ATM野生型和1个ATM突变型)开始接受增加的CYC202剂量并评价培养4、8、16、24、48和72小时的凋亡情形。如图11a显示，1μg/ml的处理对任何样品中的细胞存活力或凋亡的诱导作用几乎没有影响，而2.5μg/ml影响一些但不是所有的B-CLL样品(图a)。然而，用5μg/mlCYC202处理24小时内，B-CLL的存活力显著丧失，48小时的处理导致大部分的细胞凋亡。几乎没有观察到高于5μg/ml浓度的剂量-依赖性(结果没有显示)。也发现在用5μg/ml的CYC202处理4和8小时之间可检测到初步的凋亡迹象，而通过16小时该初步的效应更加明显并且活细胞的比例大大地减少了(数据未显示)。

为确定，用CYC202处理不同时间的B-CLL细胞如果在暴露于药物后放置在无药物培养基中恢复是否能避免药物的作用，进行了洗涤实验。将3个肿瘤细胞样品用5μg/ml的CYC202处理30分钟、1、2、3、4、6和8小时。然后将药物洗去并再将细胞孵育24小时。然后通过膜联蛋白V/PI染色检测培养物的存活力。暴露于CYC202小于6小时并随后恢复培养不诱导可测量的细胞毒性作用，但暴露时间为6小时和更长，不论暴露于药物后的恢复期如何，可见存活力大的下降。这些结果与处理至少8小时的B-CLL培养物中用膜联蛋白V测定的早期凋亡细胞的形态表现是一致的，并且表明曝露于药物的最小时间为不可逆导致细胞凋亡的方法所必需。B-CLL样品(15个ATM野生型肿瘤、7个ATM突变型肿瘤和4个TP53突变型肿瘤)也在用CYC202培养24、48和72小时后通过膜联蛋白V测定，并且与通过电离辐照和氟达拉滨杀伤同样肿瘤的结果相比较。这些比较结果如图11b(ATM野生型肿瘤)、图11c(ATM突变型肿瘤)和图11d(TP53突变型肿瘤)所示。

在26个B-CLLs当中，观察到用5μg/ml的CYC202处理后的存活力平均下降83.6％(53～97％+/-10.1％，图12a)，而未经处理的B-CLL细胞显示存活力仅仅下降8.0％+/-8.5％。当B-CLLs按基因型分类，15个ATM野生型肿瘤显示存活力平均下降83.5％+/-11.7％(图12b)，而ATM突变型肿瘤和TP53突变型肿瘤分别地显示存活力丧失83.9％+/-7.4％(图12b)和85.8％+/-9.7％(图12b)。因此，3种基因型对5μg/ml的CYC202都不具有抗性并且所有3组都显示了对药物类似的应答。

显著地，当与5μg/ml的CYC202相比时，无论哪种亚型，用20μM氟达拉滨处理的细胞显示存活力丧失的减少和凋亡增加的降低(图11b、11c和11d)。该差异在ATM突变型和TP53突变型亚型中最明显，其中在细胞中处理的第一个24小时内没有观察到高于自发凋亡水平的存活力丧失的增加(图11c和11d)。对于所有肿瘤基因型的组合，在处理24小时后，氟达拉滨诱导的存活力总体下降13.3％+/-12.1％(图12a)。对于单独的ATM野生型肿瘤，在同样的时间点存活力下降14.9％+/-12.7％(图12b)，与ATM突变型肿瘤的7.9％+/-7.2％(图12b)和4个TP53突变型肿瘤的16.7％+/-16.0％(图12b)相比。甚至在氟达拉滨处理48小时后，存活力的下降显著地低于用CYC202培养24小时的数值。总之，可以看出经过同样的处理期，氟达拉滨诱导凋亡比CYC202诱导的凋亡低得多(如下列表1概括)。有趣地，6/23的肿瘤体外抗氟达拉滨并且67％(4/6)是ATM突变型。在氟达拉滨敏感的肿瘤样品中，13个为ATM野生型并且3个(19％)是ATM突变型。值得注意地，尽管对于药物的应答慢于野生型肿瘤，4个突变型TP53肿瘤样品无一显示体外抗氟达拉滨(概括在表2中)。

总之，CYC202，而不是氟达拉滨，在包括显示放射诱导凋亡缺陷的所有B-CLL样品中能诱导高水平的凋亡。因此，不论ATM/TPS3基因的状态如何，CYC202体外杀伤B-CLL细胞比氟达拉滨更加有效。

与CYC202的效应相反，并且与先前的观察一致，在IR处理24小时后，野生型、ATM突变型和TP53突变型肿瘤显示很少或几乎没有凋亡(图11c、11d和12b)。暴露于IR中72小时后，IR诱导凋亡变得明显，但仅仅在有ATM/TPS3野生型序列的肿瘤中。

为了分析3种处理形式间凋亡诱导的协同效应，26个肿瘤样品中的25个接受包括IR加氟达拉滨、IR加cyc202或氟达拉滨加cyc202的联合处理。一个肿瘤用组合药物处理，但没有辐照法。与用氟达拉滨和IR的杀伤的不同的机制一致，在用氟达拉滨处理24小时的20/25肿瘤中观察到对放射增加的应答率。相反，CYC202处理的样品的辐照不增加细胞毒性，提示该药物作为单一药剂在B-CLL杀伤中极大的效力。同样地，向CYC202处理的培养物中加入氟达拉滨显示凋亡没有超过用CYC202单独诱导的杀伤水平。因此，可能氟达拉滨的效应被CYC202的更大的细胞毒性掩盖(尤其在较早的时间点)。

CYC202对正常B淋巴细胞的凋亡诱导的效应

为了确定CYC202治疗在非白血病性B淋巴细胞上的效应，从5个对照个体分离细胞并用1～20μg/ml浓度的药物处理。与CYC202在B-CLL细胞上的效应相反，正常B细胞对5μg/ml的CYC202显示出延迟的和降低的毒性。对照个体的未经处理的B细胞显示24小时存活力平均下降4.4％(+/-1.9％)，而用5μg/ml的CYC202处理相同时间的B细胞的存活力下降31.4％+/-17.1％。这与用5μg/ml的CYC202处理B-CLL肿瘤24小时存活力更多地下降83.6％+/-10.1％(图13)进行比较。在48小时，未处理的B细胞存活力下降了26.5％+/-19.3％，用CYC202处理的B细胞下降了47.4％+/-17.2％，并且B-CLL肿瘤下降88.3+/-8.1％。CYC202对正常B细胞的细胞毒性仅仅达到使用20μg/ml时B-CLLs中观察到的相应的水平。因此，从我们的数据数据看来在5μg/ml浓度的CYC202显示对于B-CLL细胞显著程度的选择性细胞毒性。

CYC202杀伤B-CLL的机制

a)CYC202对凋亡途径以及效应器胱冬酶的作用

B-CLL是慢循环(slowly-cycling)淋巴样肿瘤细胞。在用CYC202培养24小时，当有效杀死包括那些带有缺陷p53通路的所有B-CLL肿瘤的情况下，可以合理地推断出CYC202杀死B-CLL的原因涉及与细胞周期抑制或p53-依赖性转录的活化不一样的机制。实际上，蛋白印迹显示用CYC202培养后没有p53活化(图14a)。尽管ATM野生型B-CLL中用CYC202处理的3和6小时之间的p53水平有一些增加，没有p53应答蛋白p21上调的证据(图14a)。同样地并且也象期望的那样，在用ATM或TP53突变型的肿瘤中，也没有证据表明CYC202诱导的p53上调，p21也没有。即使有的话，这两种肿瘤都显示p53蛋白水平随时间的减少，用CYC202培养18-24小时后其变得几乎不可检测(图14a)。

分析了下游的凋亡通路活化。与凋亡的诱导一致，PARP1，即活化效应器胱冬酶-3降解的靶标，用CYC202处理6～24小时，在所有3种B-CLL亚型的典型肿瘤中而被切割(图14b)。此外，在所有3种B-CLL亚型中，通过胱冬酶原-3(procaspase-3)的切割和活化的(切割的)胱冬酶-3的伴随出现确定直接的胱冬酶-3活化，而胱冬酶原-7的切割和消失表明胱冬酶-7的活化(图14b)。可以推断出CYC202诱导的杀伤包括p53凋亡通路下游的活化。

b)CYC202对转录的影响

为了研究在B-CLL细胞中CYC202对转录的影响，5个代表样品(3个ATM/TP53野生型和2个突变型ATM)在暴露于5μg/ml的CYC202之前和4小时后，使用U95A Affymetrix微阵列芯片进行全基因表达谱分析。如材料和方法所述富集细胞并进行微阵列分析。在用CYC202培养24小时后一部分处理的细胞也用膜联蛋白V测定分析以证实在所有肿瘤已经诱导了凋亡。CYC202处理的样品的基因表达的结果与相应未处理的样品的基态基因表达比较。经过滤除非信息基因和包括多重检测校正的统计测试后，我们确定暴露于CYC202后下调超过1.5倍的547种基因和上调超过1.5倍的135种基因。虽然上调的基因针对多样的细胞信号，但下调的基因则清楚地包含了能解释CYC202在B-CLL中的前凋亡活性的几个细胞通路。首先，转录和翻译启动相关蛋白的编码基因谱，例如TFIIB、TFIID、TFIIS、TFIIEβ、RNA聚合酶II和III、延伸起始因子eiF-2α、γ和eiF-4，在暴露于CYC202后明显下调(图15a)。此外，具有支持细胞的存活的抗凋亡特性的基因如Mcl-1、Bcl-2(图15a)、Mad3、NFκB亚基、热休克蛋白家族的几个成员、干扰素细胞因子和受体的家族也应答CYC202而下调。最终，许多修复基因包括PCNA、XP-C和ERCC4的表达，在暴露于药物4小时后下降(图15a)。其它的重要的下调通路包括MAP激酶及它们下游的效应器。

CYC202的转录的效应表现显著地不同于以前在同类B-CLL肿瘤中IR后观察到的那些⁸。与IR诱导信号相反并与CYC202的转录效应的p53非依赖性质一致，在ATM/P53野生型肿瘤中，p53效应基因如p21(图15a)和Puma的mRNA水平上，CYC202没有诱导显著的变化。此外，前存活因子Mcl-1(图15a)、热休克蛋白和NFκB基因的下调对于CYC202效应似乎是完全特异的，因为在野生型B-CLL肿瘤中，在IR后，没有发现这些基因上调。

蛋白质印迹用来证实对CYC202的关键效应器的差异表达。Mcl-1是调节淋巴细胞凋亡的重要的Bcl-2家族的前存活基因¹³。在ATM野生型、ATM突变型和TP53突变型肿瘤中，研究了用CYC202培养后在多个时间点Mcl-1蛋白水平的表达。对所有肿瘤亚型，在用5μg/ml的CYC202培养2小时观察到Mcl-1蛋白水平开始下降，随后用CYC202处理6小时的蛋白的显著下调和完全消失(图15b)。有趣地，另一个前存活蛋白Bcl-2的水平下降的发生比Mcl-1的慢得更多，Bcl-2的mRNA也应答CYC202而下调。不希望束缚于理论，这可能是这些蛋白的半衰期差异的反映(Mcl-1的0.5～3小时比Bcl-2的10～14小时)并提示甚至在Bcl-2蛋白存在时可发生凋亡¹⁴。

如总mRNA和蛋白合成下调的效应证明，24小时后，肌动蛋白水平以及DNA修复相关蛋白(PCNA和XP-C)的水平都降低了。相比之下，作为对照的用DMSO处理的肿瘤对Mcl-1蛋白的表达没有影响，也不诱导PARP1(图15c)的断裂，表明培养条件单独不诱导这些蛋白的下调。

为了确定CYC202总体下调转录的机制，进行研究以确定是否CYC202不仅影响RNA聚合酶II的水平并且影响RNA聚合酶II的活化。测定了总RNA pol II蛋白的水平以及RNA pol II在丝氨酸2的磷酸化，丝氨酸2是与转录的延伸期有关的位点。引人注目地，发现用CYC202处理8小时的B-CLL肿瘤样品中的磷酸化蛋白的水平显著地降低(图16a)，而RNA pol II总蛋白量不同样显著地下降(图16b)。因此结果提示CYC202下调转录可包括直接抑制细胞周期蛋白9和细胞周期蛋白7，这两种激酶是负责RNA polII蛋白的磷酸化。

实施例3

罗可嘌呤对人T-前淋巴白血病细胞的效应

临床病例研究

由于在常规血液检查中发现白细胞增多，一名66岁的妇女就诊于门诊部。外周血细胞上进行的免疫表型表明97％的单核细胞是双阳性T淋巴细胞(TcRα/β+/TcRγ/δ-、CD3+、CD8+、CD4+、CD2+、CD5+和CD7+)、部分活化的(CD25+、CD30-、CD38+、CD45RA-、CD45ROCD69-CD71-、HLA-DR-)、表达多种粘附分子(CD11a+、CD11b+、CD11c+、CD18+、CD28+、CD62L+和CD86-)和不表达CD56、CD34、CD117或B-或NK-细胞标记物。这些细胞不表达CD1a和TdT，这证实它们的成熟的胸腺后(post-thymic)的起源。T细胞受体(TcR)基因分析显示克隆的TcRγ-链重排。TcRα/β+的表面表达也被检测。细胞被分类为人白细胞抗原-B27(HLA-B27)阳性，但没有发现自身免疫病的特征。

图1显示TPLL-1细胞(A)的CD8+/CD4+双阳性免疫表型和HLA-B27的直方图(B)。在FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson，USA)上用CD4的偶联到FITC的单克隆抗体和CD8的偶联到藻红蛋白的单克隆抗体进行外周血的流式细胞分析(A)。HLA-B27直方图中的左侧箭头代表取舍点的位置(B)。相应地使用包括在HLA-B27试剂盒(Becton Dickinson Biosciensies，USA)中的校准珠粒进行仪器校准。右箭头键相应于患者的样品的中间通道值，表明HLA-B27阳性。

编码TPLL-1的细胞用Ficoll Paque密度梯度离心法分离。导致具有T-PLL的形态学变异的小细胞的超过98％的CD8+/CD4+双阳性细胞的单核细胞群。在用促分裂原(植物凝集素、美洲商陆有丝分裂原和佛波醇酯)刺激之后进行细胞遗传学研究，但没有得到细胞分裂中期(methaphases)。比较基因组杂交(CGH)分析显示在8染色体上的遗传获得量，其在TPLL的病例中是常见的(55％)。没有重排的c-myc原癌基因的3个拷贝和着丝粒(centromer)8的2个拷贝在间期核中用双色荧光原位杂交(FISH)检测。

比较基因组杂交

肿瘤DNA的杂交用FITC检测并且参比DNA杂交用TRITC检测(图2)。根据红绿荧光强度比的拷贝数的差异用ISIS，Metasystems进行定量。在6cen-q21、6q26和11q13-q23q发现遗传的缺失，而在6p21-p25、7p15-p22、8p、8q、22q13有遗传获得。这些发现与在T-PLL中显示高度基因组不稳定的先前数据一致[Soulier等，Genes Chromosomes Cancer.2001 Jul；31(3)：248-54]。

图3显示TPLL-1细胞中的c-myc的荧光原位杂交(FISH)分析。检测到3组协同定位信号而不是2组，表明存在另外的c-myc位点。或者，将标记(红色和绿色)的c-myc侧翼探针施加到FISH分离测定中。在所有细胞只识别协同定位的绿色和红色信号，代表没有基因重排的完整的c-myc位点。杂交信号在200个形态学上完好的核中计算。

图4显示c-myc的三个拷贝的检测，通过基因的双色FISH-罗丹明检测(红色)和FITC D8Z1染色体8着丝粒周围典型卫星的FITC检测(绿色)。

TPLL-1细胞用多种激酶抑制剂(包括对PKC同工型、MAPK和PI-3K选择性的)处理，但在细胞存活力上没有影响(数据未显示)。TPLL-1细胞用10μM罗可嘌呤孵育不同的时间间隔并用FACScan计数凋亡细胞百分比。

图5显示培养5小时导致96％的TPLL-1细胞凋亡，其不被佛波醇酯抑制。用罗可嘌呤培养5小时导致96％的TPLL-1细胞凋亡，其不被佛波醇酯(10nM TPA)抑制。

图6显示用10μM的罗可嘌呤培养18小时的结果。大部分细胞被裂解。少数剩余的是晚期凋亡细胞。

检测TPLL-1细胞的细胞周期蛋白A、B1、D1和E表达(图7)。只有细胞周期蛋白E表达用抗体HE12(Santa Cruz Biotechnology)通过免疫印迹检测。箭头表明MW标准蛋白(Gibco)的位置。

图8显示TPLL-1细胞凋亡抑制因子Bcl-2的表达。c-myc ASO处理和罗可嘌呤都不抑制Bcl-2表达。没有检测到前凋亡蛋白Bax的表达(数据未显示)。

第一泳道：对照

第2泳道：ASO处理18小时

第3泳道：10μM罗可嘌呤处理20分钟

第4泳道：10μM罗可嘌呤处理5小时

罗可嘌呤在TPLL-1细胞中诱导选择性凋亡。据信罗可嘌呤的作用至少有2种不同的机制。第一种为对Cdk2/CyclinE的抑制，并且第二种为对PI-3K通路的活化。进行研究以考察罗可嘌呤对TPLL-1细胞中应激信号机制和PI-3K通路的效应。

图9显示10μM罗可嘌呤对TPLL-1的细胞内应激信号通路的影响。在培养20分钟后检测到p38 S51-磷酸化作用的峰。使用Stress Signal SamplePack(BIOSOURCE Int.)进行免疫印迹。

图10显示罗可嘌呤不活化TPLL-1细胞中的PI-3K通路。结果是用通过Akt/PKB(Ser-473)和Raf1(Ser-338)的位点PI-3K-依赖方式磷酸化的特异抗体的免疫印迹。在用罗可嘌呤培养后也没有检测到在Tyr-508的PI-3K磷酸化(数据未显示)。

作为结论，罗可嘌呤诱导人CD8+/CD4+T-PLL细胞的凋亡。罗可嘌呤通过PKC-非依赖通路诱导凋亡。其效应很迅速并且对于T-PLL细胞有选择性。这些发现可能解释尽管T-PLL细胞体外不增殖，Cdk2/细胞蛋白E活性对于它们的存活力起重要的作用。通过未知机制的p38激酶活化也与罗可嘌呤诱导的凋亡有关。因此，在T-PLL治疗中罗可嘌呤提供新的治疗的方法。

没有背离本发明的范围和实质的本发明的各种修饰和变化对于本领域的技术人员是显而易见的。尽管关于具体的优选方案本发明已经说明，应当理解所述的本发明应不限于这些具体的实施方案。实际上，对于相关领域的技术人员明显的用于执行本发明的描述的方法的各种的修饰确定被本发明包含。

参考文献

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表1无处理、CYC202(5μg/ml)或氟达拉滨(20μM)对B-CLLs的影响

肿瘤数	基因型	24小时后细胞存活力的降低			48小时后细胞存活力的降低
								无药物	CYC2O2	氟达拉滨	无药物	CYC2O2	氟达拉滨
		26	所有	8.0+/-8.5％	83.6+/-10.1％	13.3+/-12.1％	11.5+/-10.8％							88.3+/-8.1％	57.1+/-29.1％
15	ATM+/+1							7.7+/-7.7％	83.5+/-11.7％	14.9+/-12.7％	10.3+/-8.7％	88.3+/-9.2％	65.1+/-27.7％
		7	ATM-/-2	3.2+/-4.0％	83.6+/-7.4％	7.9+/-7.2％	5.9+/-6.1％							87.5+/-6.0％	39.6+/-25.0％
4	TP53-/-2							17.9+/-12.2％	85.8+/-9.7％	16.7+/-16.0％	26.1+/-13.7％	89.6+/-8.5％	58.1+/-23.9％

1：+/+：野生型

2：-/-：突变型

表2：B-CLL患者的基因状态、药物应答和临床数据

患者ID	ATM/TP53状态	阶段	体外对氟达拉滨的应答	体外对CYC202的应答	治疗史
						920 6TR	ATM野生型	A	耐药	敏感	B-CLL未处理
9348AA	ATM野生型	A	耐药	敏感	B-CLL未处理
						8375AE	ATM突变型	C	耐药	敏感	2001年初苯丁酸氮芥
9439MS	突变型ATM	B	耐药	敏感	B阶段疾病诊断后苯丁酸氮芥
						8944MK	突变型ATM	B	耐药	敏感	氟达拉滨x4，氟达拉滨/苯丁酸氮芥x2，死亡
9292TT	突变型ATM	C	耐药	敏感	氟达拉滨+苯丁酸氮芥x8，PR
						6692MM	突变型TP53	C	敏感	敏感	Li Fraumeni with CLL.氟达拉滨，CHOP，Campath
6032RB	突变型TP53	C	敏感	敏感	取样时治疗
						5266BP	突变型TP53	C	敏感	敏感	未处理
9283PA	突变型TP53	Ao	敏感	敏感	未处理
						MB	突变型ATM	C	敏感	敏感	取样时无处理
SS	ATM野生型	B/C	敏感	敏感	氟达拉滨(2001)
						8992JF	ATM野生型	A	敏感	敏感	未处理
8998GN	ATM野生型	B	敏感	敏感	苯丁酸氮芥x6(2000)
						9375JM	ATM野生型	B/C	敏感	敏感	未处理
8815DH	ATM野生型	C	敏感	敏感	1999年苯丁酸氮芥
						9277BL	ATM突变型	C	敏感	敏感	未处理
9355EM	ATM野生型	C	敏感	敏感
						9264JM	突变型ATM	Ao	敏感	敏感	未处理
9447TQ	ATM野生型	A	敏感	敏感	进展到A阶段后苯丁酸氮芥x2(07/02)
						8955ML	ATM野生型	A	敏感	敏感	2003年6月到2004年1月，苯丁酸氮芥
28SW	ATM野生型	B	敏感	敏感	苯丁酸氮芥×5
						102JK	ATM野生型	A	敏感	敏感	苯丁酸氮芥×4，CHOP×6
111AL	ATM野生型	A	敏感	敏感	未处理
						119BS	ATM野生型	C	敏感	敏感	苯丁酸氮芥
9236PA	ATM野生型	B	敏感	敏感	取样时，苯丁酸氮芥

表3：B-CLL患者的基因状态、药物应答和临床数据的概述

亚型	体外对CYC202的敏感性	体外对氟达拉滨的敏感性	以前的治疗	目前的治疗	临床病程的改善
						ATM/TP53野生型(n～15)ATM突变型(n＝7)TP53突变型(n＝4)	15/157/74/4	13/153/74/4	2/151/7*3/4	4/152/7*3/4？	3/151/7*3/4

^*＝耐氟达拉滨的肿瘤

Claims (51)

1.罗可嘌呤或其可药用盐在制备用于治疗慢性淋巴细胞白血病的药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中慢性淋巴细胞白血病是T细胞幼稚淋巴细胞白血病(T-PLL)。

3.根据权利要求1的用途，其中慢性淋巴性细胞性白血病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。

4.根据任一项前述权利要求的用途，其中慢性淋巴细胞白血病与突变型ATM有关。

5.根据任一项前述权利要求的用途，其中慢性淋巴细胞白血病与突变型TP53有关。

6.根据任一项前述权利要求的用途，其中罗可嘌呤下调抗凋亡基因的表达。

7.根据权利要求6的用途，其中抗凋亡基因包括至少一种选自Mcl-1、Bcl-2和Mad3的基因。

8.根据任一项前述权利要求的用途，其中罗可嘌呤下调DNA修复基因的表达。

9.根据权利要求8的用途，其中DNA修复基因包括PCNA或XPA。

10.根据任一项前述权利要求的用途，其中罗可嘌呤下调与转录调节相关的基因的表达。

11.根据权利要求10的用途，其中与转录调节相关的基因包括至少一种选自Pol II、eIF-2，4e和E2F的基因。

12.根据任一项前述权利要求的用途，其中罗可嘌呤或其可药用盐的量足够下调Mcl-1表达。

13.根据任一项前述权利要求的用途，其中罗可嘌呤与可药用的载体、稀释剂或赋形剂组合给药。

14.根据任一项前述权利要求的用途，其中罗可嘌呤与一种或多种其它的抗增殖药物联合给药。

15.根据任一项前述权利要求的用途，其中罗可嘌呤以足够抑制至少一种CDK酶的量给药。

16.根据任一项前述权利要求的用途，其中CDK酶选自CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和CDK9。

17.根据权利要求15或权利要求16的用途，其中CDK酶选自CDK1和CDK2。

18.根据权利要求15或权利要求16的用途，其中CDK酶选自CDK7和CDK9。

19.一种治疗患有慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的方法，该方法包括给药治疗有效量的罗可嘌呤或其药学上有效的盐。

20.根据权利要求19的方法，其中罗可嘌呤下调抗凋亡基因的表达。

21.根据权利要求20的方法，其中抗凋亡基因包括至少一种选自Mcl-1、Bcl-2和Mad3的基因。

22.根据权利要求19至21任一项的方法，其中罗可嘌呤下调DNA修复基因的表达。

23.根据权利要求22的方法，其中DNA修复基因包括PCNA或XPA。

24.根据权利要求19至23任一项的方法，其中罗可嘌呤下调与转录调节相关的基因的表达。

25.根据权利要求24的方法，其中与转录调节相关的基因包括至少一种选自Pol II、eIF-2，4e和E2F的基因。

26.一种下调慢性淋巴细胞白血病细胞中抗凋亡基因表达的方法，该方法包括使细胞接触罗可嘌呤或其可药用盐。

27.一种治疗患者的慢性淋巴细胞白血病的方法，该方法包括以足够下调患者的抗凋亡基因的表达的量给药罗可嘌呤或其可药用盐于患者。

28.权利要求26或27的方法，其中抗凋亡基因包括Mcl-1、Bcl-2或Mad3。

29.一种下调慢性淋巴细胞白血病细胞中DNA修复基因表达的方法，该方法包括使细胞接触罗可嘌呤或其可药用盐。

30.一种治疗患者的慢性淋巴细胞白血病的方法，该方法包括以足够下调患者中DNA修复基因的表达的量给药罗可嘌呤或其可药用盐于患者。

31.根据权利要求29或30的方法，其中DNA修复基因包括PCNA或XPA。

32.一种下调慢性淋巴细胞白血病细胞中与转录调节相关的基因表达的方法，该方法包括使细胞接触罗可嘌呤或其可药用盐。

33.一种治疗患者的慢性淋巴细胞白血病的方法，该方法包括以足够下调患者中与转录调节相关的基因的表达的量给药罗可嘌呤或其可药用盐于患者。

34.根据权利要求32或33的方法，其中与转录调节相关的基因包括至少一种选自RNAPol II、eIF-2，4e和E2F的基因。

35.根据权利要求19至34任一项的方法，其中慢性淋巴细胞白血病是T细胞幼稚淋巴细胞白血病(T-PLL)。

36.根据权利要求19至34任一项的方法，其中慢性淋巴细胞白血病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。

37.根据权利要求19至36任一项的方法，其中慢性淋巴细胞白血病与突变型ATM有关。

38.根据权利要求19至37任一项的方法，其中慢性淋巴细胞白血病与突变型TP53有关。

39.根据权利要求19至38任一项的方法，其中罗可嘌呤以足够抑制至少一种CDK酶的量给药。

40.根据权利要求39的方法，其中CDK酶选自CDK1、CDK2、CDK4、CDK7和CDK9。

41.根据权利要求39或权利要求40的方法，其中CDK酶选自CDK1和CDK2。

42.根据权利要求39或权利要求40的方法，其中CDK酶选自CDK7和CDK9。

43.根据权利要求19至42任一项的方法，其中罗可嘌呤与至少一种选自可药用的载体、稀释剂和赋形剂的添加剂组合给药。

44.根据权利要求19至43任一项的方法，其中罗可嘌呤与至少一种抗增殖药物联合给药。

45.一种用于治疗慢性淋巴细胞白血病的药物组合物，包括罗可嘌呤或其可药用盐和可药用的载体。

46.根据权利要求45的药物组合物，其中慢性淋巴细胞白血病是T细胞幼稚淋巴细胞白血病

47.根据权利要求45的药物组合物，其中慢性淋巴细胞白血病是B细胞慢性淋巴细胞白血病。

48.根据权利要求45至47的任一项的药物组合物，还包括稀释剂或赋形剂。

49.一种下调B细胞慢性淋巴细胞白血病细胞中的Mcl-1基因表达的方法，所述方法包括使所述细胞接触罗可嘌呤或其可药用盐。

50.一种治疗患者的B细胞慢性淋巴细胞白血病的方法，所述方法包括以足够下调所述患者中Mcl-1的表达的量给药罗可嘌呤或其可药用盐于患者。

51.罗可嘌呤或其可药用盐在制备用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病的药物中的用途，其中罗可嘌呤或其可药用盐的量足够下调Mcl-1的表达。

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