JP2004526748A - Rankリガンド融合タンパク質を使用する骨形成の刺激 - Google Patents
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Abstract
骨形成を増強する方法であって、以下の有効量を投与する工程を包含する:1)RANKL、RANKL融合タンパク質、またはそのアナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの1以上のオリゴマー複合体、2)骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の1以上の細胞内タンパク質の活性を増強し得る骨形成性化合物であって、ここで、該活性は、骨形成を示す、化合物、あるいは3)骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の1以上のホスファターゼを不活化し得る骨形成性化合物であって、ここで、該不活化は、骨形成を示す、化合物。この方法をまた用いて、本明細書中に開示されるオリゴマー複合体または骨形成性化合物を含む薬学的組成物を患者に投与することによって、骨量の損失によって少なくとも部分的に現れる疾患または状態を処置し得る。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は米国国立衛生研究所助成金AR32788、AR46123およびDE05413のもとに一部、政府の援助を受けて行われた。政府は本発明の一定の権利を有する。
【0002】
本出願は2001年3月22日、2001年8月9日、2001年10月12日、2001年10月12日、および2001年10月15日に出願されたそれぞれ米国仮特許出願番号60/277,855、60/311,163、60/329,231、60/328,876、および60/329,393の利益を主張する。これらすべては本明細書中に参考として援用される。
【0003】
(発明の分野)
本発明は、1)骨芽細胞または骨芽細胞前駆体における細胞内タンパク質の活性(この活性は骨形成の指標である)を増強する、あるいは2)骨芽細胞または骨芽細胞前駆体におけるホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力を有するRANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物または骨形成性の化合物のうちの1以上のオリゴマー複合体を有効量投与することにより骨形成を増強する方法に関する。
【0004】
本発明はさらに骨の喪失または骨粗鬆症のような疾患によって生じる骨形成の減退の処置、予防または阻害に関する。さらには本明細書中に記載されるオリゴマー複合体または骨形成性化合物の投与による骨形成の増強により、骨折の修復の増強および整形外科的移植片または骨の融合部位への骨の内部成長の増強に関する。
【0005】
本発明はさらに骨形成を刺激するための組成物を提供する。
【背景技術】
【0006】
骨の喪失または薄片化が現れる種々の状態および疾患は重大かつ増大しつづけている健康問題である。骨粗鬆症のみについて、アメリカ人3千万人と世界の1億人ほど多くの人がリスクをかかえていると換算されている。Mundyら、Science,286:1946−1949(1999)。骨の減少をともなうことが既知の他の病状には若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチによる骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、転移性の骨疾患、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、加齢による骨の喪失、およびその他の骨減少症が含まれる。さらに新たな骨形成は多様な状況において必要である。例えば、骨の修復の増強または骨折のための置換、骨欠損、形成外科手術、歯およびその他の移植ならびに同様の状況などである。
【0007】
骨は結合組織の高密度な特殊化した形態である。骨マトリックスはその表面または近くに存在する骨芽細胞により形成される。骨は破骨細胞(マクロファージの一つの型)として知られる別の細胞に再吸収(侵食)される。これらの細胞は酸(骨の鉱質を溶解)とヒドロラーゼ(骨の有機成分を消化)を分泌する。故に骨形成と再構築は骨芽細胞および破骨細胞による生成活性と侵食活性との間の持続的な相互関係を伴う動的過程である。Albertsら、Molecular Biology of the Cell,Garland Publishing,N.Y.(第3版 1994),1182−1186頁。
【0008】
骨の喪失の治療の現在の様式は、骨形成の増強よりむしろ骨吸収過程を阻害するという点で主として抗吸収剤に対するものである。薬剤が骨吸収を阻害する能力により、骨粗鬆症の治療に使用または示唆されている薬剤には、エストロゲン、選択的エストロゲンレセプター調節因子(SERM)、カルシウム、カルシトリオール、カルシトニン(Sambook,P.ら,N.Engl.J.Med.328:1747−1753)、アレンドロネート(alendronate)(Saag,K.ら,N.Engl.J.Med.339:292−299)およびその他のビスホスホネートがある。Luckmanら、J.Bone Min.Res.13,581(1998)。しかしながら抗吸収剤は、結果として頻繁に骨の喪失に関与する骨形成速度を補正できず、骨吸収/再構築の阻害または他の好ましくない副作用に対する抗骨吸収剤の影響に関連する望まない効果を有し得る。
【0009】
骨細胞生物学の分野における重要な発展はストローマ細胞、骨芽細胞、活性化型Tリンパ球、および乳腺上皮細胞で発現しているRANKリガンド(RANKL、あるいはオステオプロテゲリンリガンド(OPGL)、TNF関連活性化誘導サイトカイン(TNF−related activation induced cytokine)(TRANCE)、破骨細胞分化因子(osteoclast differentiationfactor)(ODF)としても知られる)は、マクロファージの破骨細胞への分化に不可欠な独特の分子であるという近年の発見である。Lacey,ら,Cell 93:165−176(1998)(Osteoprotegerin Ligand is a Cytokine that Regulates Osteoclast Differentiation and Activation)。RANKLの細胞表面レセプターはRANK、すなわちReceptor Activator of Nuclear Factor(NF)−κBである。RANKLは約50アミノ酸未満の細胞内ドメイン、約21アミノ酸の膜貫通ドメイン、および約240から250アミノ酸の細胞外ドメインを有する2型膜貫通タンパク質である。RANKLは天然には膜貫通型および可溶性型として存在している。少なくともマウス型、ラット型、およびヒト型のRANKLとその改変型の推定アミノ酸配列が公知である。Andersonら、米国特許第6,017,729号,Boyle,米国特許第5,843,678号およびXu J.ら、J.Bone Min.Res.(2000/15:2178)(参考として本明細書中に援用される)を参照のこと。RANKL(OPGL)は骨吸収の強力なインデューサーとして、および破骨細胞発生のポジティブな調節因子として同定されている。Lacey等(前出)。
【0010】
破骨細胞の分化と活性化を担う因子としての役割に加えて、RANKLがヒト樹状細胞(DC)クラスター形成(Andersonら、(前出))および乳腺上皮発生(J.Fataら「The osteoclast differentiation factor osteoprotegerin ligand is essential for mammary gland development」,Cell,103:41−50(2000))を誘導することが報告されている。しかしながらRANKLが同化性の骨形成過程において役割を果たし得るか、または骨芽細胞の増殖もしくは骨の小結節の石灰化を刺激する方法に用いることができることは以前には知られておらず、予測もされていなかった。
【0011】
従って、破骨細胞と治療目的の破骨細胞の操作について多くの発見が成されたにもかかわらず、骨芽細胞と骨形成に関しては多くは知られていない。故に、一般的に、同化過程を刺激することにより、協調的な吸収より強い程度にまで、骨形成の増強および骨の喪失の予防、もしくは阻害のための方法が求められる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0012】
(発明の要旨)
従って、骨芽細胞の活性の増強、骨芽細胞表現型への骨芽細胞前駆体の傾倒(commitment)、およびインビボでの骨マトリックスの沈着を含む骨形成を刺激する方法と組成物の提供が本発明の目的である。故に、本方法は、骨形成の増強のため、ならびに骨吸収過程が影響を受けることがあろうとなかろうと、骨形成を増強することにより疾患および骨を喪失する状態の処置のため骨形成の増強に提供される。
【0013】
要約すると、本発明は骨形成を増強する方法に関する。本方法は、1)RANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの1以上のオリゴマー複合体、2)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性(この活性は骨形成の指標である)を増強する能力がある骨形成性の化合物、または3)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体のホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力がある骨形成性の化合物を有効量投与することを必要とする。
【0014】
疾患あるいは少なくとも部分的に骨量の喪失により現れる状態の処置方法も提供する。本方法は、骨形成を増強するために有効量のRANKL融合タンパク質もしくはアナログ、誘導体またはその模倣物を含む薬学的組成物の投与を含む。別の実施形態において、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性(この活性は骨形成の指標である)を増強する能力がある骨形成性の化合物を含む薬学的組成物を使用し得る。さらなる実施形態において、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体のホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力のある骨形成性の化合物を含む薬学的組成物を使用し得る。それにより、骨量の喪失を予防、阻害あるいは緩和することができる。
【0015】
別の局面において、出願人は、骨形成を刺激するための組成物を提供している。組成物は、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤の中に有効量のRANKL融合タンパク質、オリゴマー複合体、もしくはアナログ、誘導体またはその模倣物を含む。さらに、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤の中に有効量の骨形成性の化合物を含む組成物を提供する。ここで、骨形成性の化合物は、1)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性(この活性は骨形成の指標である)を増強する能力があるか、または2)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体のホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力がある。
【0016】
一つの実施形態として、細胞内タンパク質はIKB−αおよびにIKB−βから選択される。好ましい実施形態では、長期化した活性を示す細胞内タンパク質は細胞内キナーゼを含み、ERK1/2、IKK、PI3キナーゼ、Akt、JNK、およびp38のようなキナーゼがより好ましい。より好ましい実施形態では、キナーゼはERK1/2である。
【0017】
別の好ましい実施形態では、1以上の細胞内タンパク質の活性が前述したタンパク質のリン酸化を構成する。詳細には、リン酸化を受けるタンパク質はERK1/2、IKK、PI3キナーゼ、Akt、JNKおよびp38を含む。より好ましくは、リン酸化をうけるキナーゼはERK1/2である。
【0018】
別の局面において、1以上の細胞内タンパク質の活性は、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体と共に骨形成性化合物をインキュベート後、少なくとも約15分から30分で検出することができる。好ましくは、活性は40分間で検出でき、前述のインキュベート後、少なくとも60分間で検出できる。
【0019】
別の実施形態では、本発明の方法と組成物において骨芽細胞および骨芽細胞前駆体の1以上のホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力がある骨形成性の化合物を使用し得る。好ましくは、前述のホスファターゼは、ERK1、ERK2、IKK、PI3キナーゼ、Akt、JNKおよびp38に特異的なホスファターゼからなる群から選択され、より好ましくは、このホスファターゼは、ERK1/2に特異的なホスファターゼである。別の好ましい実施形態では、不活性化はホスファターゼのリン酸化を含む。
【0020】
本明細書中に記載された方法と組成物に用いられる好ましいオリゴマー複合体はGST−RANKL、AP−RANKL、ロイシンジッパー−RANKLおよびTALL−1の「フラップ(flap)」ドメインを含むRANKL誘導体のオリゴマー複合体を含む。
【0021】
他の目的および特徴は、一部は明白であり、一部は本明細書中下記に示す。
【0022】
(略語と定義)
本発明の理解を容易にするため、多くの用語を以下に定義する。
【0023】
「MAPキナーゼ」もしくは「MAPK」は、本明細書中で交換可能に用いられており、マイトジェン活性化プロテインキナーゼの略語である。
【0024】
「ERK1/2」は、ERK1およびERK2を表し、それぞれ細胞外シグナル調節キナーゼ(extracellular single−regulated kinase)1および細胞外シグナル調節キナーゼ2に対する略語である。
【0025】
JNKは、c−jun N末端キナーゼの略語である。
【0026】
p38は、38kDaのキナーゼであり、キナーゼのMAPKファミリーのメンバーである。
【0027】
Aktは、Aktセリントレオニンキナーゼである。
【0028】
「IKB」は、IκBタンパク質の略語である。従って、IKB−αはIκBαであり、IKB−βはIκBβである。
【0029】
「IKK」は、IκB(IKB)キナーゼに対する略語である。
【0030】
「RSK」は、p90リボソーマルS6プロテインキナーゼに対する略語である。
【0031】
「RANKL」もしくは「RANKリガンド」は、本明細書中に交換可能に用いられており、RANK(Receptor Activator of NFκB)のリガンドを示す。
【0032】
「AP」は、アルカリホスファターゼに対する略語である。
【0033】
「GST」は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼに対する略語である。
【0034】
「HPRT」は、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼに対する略語である。
【0035】
「Cbfa1」は、コア結合因子1(core binding factor 1)に対する略語である。
【0036】
「LacZ」は、β−ガラクトシダーゼに対する略語である。
【0037】
「骨形成能」もしくは「骨形成活性」は、本明細書中に交換可能に用いられており、骨形成アッセイで測定されるような骨形成を増強する能力がある任意の化合物を指す。
【0038】
「BrdU」は、5−ブロモ−2’−デオキシウリジンに対する略語である。
【0039】
「TALL−1」は、「TNFおよびAPOLに関連する白血球発現リガンド1(TNF−and APOL−ralated leukocyte expressed ligand 1)」タンパク質に対する略語である。
【0040】
用語「有効量」は、統計的に有意な効果をもたらす問題の物質の量を意味する。例えば、治療に用いる「有効量」は、骨折の修復の治癒速度の臨床的に有意な増加、骨粗鬆症における骨の喪失の逆転もしくは阻害、骨粗鬆症の発症の予防もしくは遅延、骨折の癒着不能および骨延長法(distruction osteogenesis)における骨形成の刺激および/もしくは増強、プロテーゼデバイス内への骨の成長の増加および/または加速、歯の欠損の修復もしくは予防、または本明細書上記で考察されているものを含む(限定されるものでない)他の骨の喪失状態、疾患もしくは欠損の処置または阻害をもたらすために求められる、本明細書中に記載された活性化合物を含む組成物の量である。このような有効量は慣用的な至適化方法を用いて決定され、処置される特定の症状、患者の状態、投与の経路、製剤形態および開業医の判断なたびに当業者に明白である他の要因に依存する。本発明の化合物に要求される投薬量(例えば、骨形成の増加が望まれる骨粗鬆症において)は、処置群とコントロール群の間で統計的に有意な骨量の差異を引き起こす投薬量として明示される。この骨量の差異は、例えば、少なくとも1−2%、もしくは処置群における臨床的に有意な骨量の増加として見られ得る。治癒における臨床的に有意な増加の他の測定法としては、例えば、I型コラーゲンのN末端プロペプチドに対するアッセイ、破壊強度と張力、破壊強度とねじれ、4点屈曲(4−point bending)、骨の生検において増加した結合性についての試験および当業者に周知の他の生体力学の検定法が挙げられ得る。処置レジメンの一般的な方針は、目的の疾患の動物モデルにおいて実施される実験から得られる。
【0041】
本明細書中に用いられている様に、「処置」は、予防法と治療法両方を含む。故に、被験体を処置するにあたって、本発明の化合物は、既に骨量の喪失に苦しんでいる被験者に、もしくはその様な状態の発症を予防または阻害するために投与され得る。
【0042】
(発明の詳細な説明)
本発明に従って、本出願人は、RANKL融合タンパク質のオリゴマー複合体、特にGST−RANKLのオリゴマー、もしくはその改変体、アナログ、誘導体および模倣物が、活性化骨芽細胞数の純増加を刺激し、骨形成の同化過程を促進するような量および方法で投与できることを開示している。このような発見は、骨の置換もしくは修復を容易にするのに有用な方法のため、ならびに骨形成の同化過程を刺激することにより骨量の喪失を伴う疾患もしくは状態の処置のための基礎を提供する。
【0043】
下記の詳細な説明は、本発明を実施するにあたり、当業者を補助するため提供される。そうであっても、この詳細な説明は、本発明の開示の精神もしくは範囲から逸脱することなく、本明細書中で考察される実施形態における修飾および改変が、通常の技術を持つ当業者により成され得るので、過剰に本発明を制限するよう構成されるべきではない。
【0044】
本出願において引用された全ての刊行物、特許、特許出願、データベース、および本明細書中に引用された他の参考文献は、それぞれ個別の刊行物、特許、特許出願、データベースもしくは他の参考文献が明確に、および個別に参考として援用されるように、その全体が本明細書に参考として援用される。
【0045】
RANKL、そのフラグメント、改変体、アナログ、模倣物、融合産物および前記の化合物のオリゴマー複合体(本明細書中で教示されるように、オリゴマー複合体は骨形成を増強する能力を持つ)の選択および/もしくは合成は、当業者の能力内であり、本発明の範囲内であることが意図される。例えば、Boyle(前出)は、RANKL(「オステオプロテゲリン結合タンパク質」と呼ばれる)の多様な形態の合成の詳細な考察を提供しており、例えば、マウス型およびヒト型改変型、RANKLの組換え型、RANKLフラグメント、RANKLのアナログ、模倣物および誘導体、ならびにその融合タンパク質を開示している。(グリコシル化タンパク質のような)翻訳後修飾をうけたRANKLの誘導体もしくはアナログ、ならびに高ストリンジェンシーの条件下でRANKL cDNAのポリペプチドコード領域の一部もしくは全部にハイブリダイズことが示された核酸によりコードされるポリペプチドは、本発明の範囲に含まれる。BoyleおよびAndersonら(前出)を参照のこと。マウス型RANKL核酸およびアミノ酸配列は、本明細書中において、それぞれ配列番号1および配列番号2として提供されている(図1参照)。しかしながら、他の生物種由来のRANKL配列が、同定され、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で入手可能である。例えば、ヒト型RANKL核酸およびアミノ酸配列は、次の登録番号AF019047およびAAB86811に該当する。例えば、ラット型RANKL核酸およびアミノ酸配列は、次の登録番号NM_057149およびNP_476490に該当する。従って、任意のRANKL分子が本発明の方法において使用され得、それ故、これらは本発明の範囲内であることが意図される。
【0046】
RANKLおよび関連分子は、当該分野において周知の手順を用いて、コードしている核酸配列を含む適切な発現ベクターにおいて、本発明のペプチドをコードする核酸分子を使用することによって、合成することが出来る。そのようなDNA分子は、調製され、次に、例えば、自動DNA配列解析および遺伝コードの周知のコドン−アミノ酸の関係を用いて解析され得る。そのようなDNA分子は、オリゴヌクレオチドプローブおよび従来のハイブリダイゼーション方法論を用いて、ゲノムDNAもしくはcDNAとしても獲得され得る。そのようなDNA分子は、細菌(例えば、Esherichia coli)、酵母細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞株のような適切な宿主におけるDNAの発現とポリペプチドの産生に適合した発現ベクター(プラスミドを含む)に組み込まれ得る。例えば、実施例1および実施例25を参照のこと。融合タンパク質を含む、このような組換えタンパク質の産生方法は、当該分野において周知であり、本明細書中に参考として援用されるSambrookら、Molecular Cloning,第2版.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 および Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,第3版.,Wiley and Sons,1995、ならびに改定版、の様な標準的な分子生物学の参考文献に見出され得る。
【0047】
さらに、ポリペプチドの活性を完全に失うことなく、特定の改変が成されることが公知である。改変としては、アミノ酸の除去、置換および付加が挙げられる。他の改変を含むポリペプチドは、当業者により合成され得る。故に、ポリペプチドの有効性は、アミノ酸配列もしくは構造の多様な変更を介して改変され得る。
【0048】
さらに、前述のアナログもしくは模倣物は、可溶性、安全性もしくは有効性のような特性を改良するため、当該分野で公知の方法を用いて改変され得ることが理解されるべきである。これらの好ましい化合物の必須の特性は、本明細書中に記載された出願人らの方法に従って使用された場合、骨形成を刺激する能力である。
【0049】
出願人らは、GST−RANKLのオリゴマーの投与が骨形成の同化過程の促進を起こすことを開示した。実施例1および図2で示すように、サイズ排除クロマトグラフィーは、RANKL融合タンパク質が生理的条件下でオリゴマー複合体として存在し得ることを示す。GST−RANKLのオリゴマーは、RANKLおよびGSTのそれぞれ二量体化および三量体化する傾向の結果として、形成されると考えられている。従って、GST以外の他の融合パートナーが、RANKL含有オリゴマー複合体形成に使用され得る。好ましい融合パートナーとして、アルカリホスファターゼ、ロイシンジッパーが挙げられるが、オリゴマー構造を形成する傾向を持つ他の任意のタンパク質も本発明の範囲内であることが意図される。好ましい実施形態において、RANKL融合パートナーは、RANKLのN末端に付加される。オリゴマー複合体を形成するため用いられるGST−RANKLの形成は、実施例1およびに実施例25に記載される。さらに、周知の技術により、RANKLオリゴマーの他の形態を作製することは、当業者の能力内である。例えば、当業者は、自己会合および/もしくは高次の複合体を形成する内在性の傾向を有する別のタンパク質あるいはポリペプチドを用いて、RANKLオリゴマーを構築し得る。当業者は、化学修飾により、もしくは多コピーが連結したRANKLのポリマー型(例えば、真珠の鎖に似ている)を合成することによりその様なオリゴマーを作製し得る。そのような別の実施形態もまた、本発明の範囲内である。
【0050】
アルカリホスファターゼ(AP)は、GSTと同様に、二量体化する傾向を有する。APは、全ての生物に共通する酵素の大きなファミリーを構成する。ヒトは、APの4つのアイソフォームを持ち、それらの3つは組織特異的であり、1つは非特異的で、骨、肝臓および腎臓に見られ得る。これらの3つの組織特異的APは、胎盤AP(PLAP)、生殖細胞AP(GCAP)、および腸APを含む。アミノ末端AP−RANKLの構築は、GST−RANKL融合タンパク質の構築と同様に実施され得る。使用され得るアルカリホスファターゼの例は、登録番号AAA51710、AAA51707、AAC97139、AAL17657、P24823、およびAAA37531に対応する、ヒト型胎盤AP−1、ヒト型胎盤AP−2、ヒト型胎盤AP前駆体、マウス型分泌型AP、マウス型胚AP前駆体、およびマウス型胚APを含むが、それらに限定されない。一つの好ましい実施形態において、ヒト型胎盤アルカリホスファターゼが使用されるが、ヒトかまたはMus musculusのような他の哺乳類種から単離された他のAPが、使用され得る。多くの異なるアルカリホスファターゼの使用は、全てのAPの二量体化する能力のため、可能であると考えられる。要約すると、所望のAPのアイソフォームをコードするcDNAは、cDNAライブラリーから単離され得、結果として生じるDNA配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクター(例えば、pcDNA3.1)中のRANKL cDNAの上流(アミノ末端)でスプライスされ得る。AP−RANKLを含むヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、当該分野において周知である任意の形質移入もしくは形質導入技術により、目的の宿主細胞に導入できる。実施例17も参照のこと。
【0051】
あるいは、RANKL融合タンパク質は、ロイシンジッパードメインの様な、オリゴマー化する能力を有するペプチドを含み得る。ロイシンジッパーは、いくつかのDNA結合タンパク質で最初に発見された。(Landschultzら、Science 240:1759,1988)。ロイシンジッパードメインは、これら(および他の)タンパク質中に存在する保存されたペプチドドメインを称するために使用される用語であり、タンパク質二量体化の原因となる。ロイシンジッパードメインは、、他のアミノ酸間に散在する4個もしくは5個のロイシン残基を有する反復性の7価リピート(heptad repeat)を含む。ロイシンジッパードメインの例は、酵母の転写因子GCN4およびラットの肝臓に見られる熱安定DNA結合タンパク質(C/EBP;Landschulzら、Science 243:1681,1989)に見られるものである。
【0052】
ロイシンジッパードメインは、短く平行なコイルドコイルとして折り畳まれることが公知である。(O’Sheaら、Science 254:539;1991)。一般的な平行コイルドコイルの構造は、1953年にCrickにより提案された「ノブズ−イントゥ−ホールズ(knobs−into−holes)」パッキング(Acta Crystallogr.6:689)で良く特徴づけられている。ロイシンジッパードメインにより形成された二量体は、McLachlanおよびStewart(J.Mol.Biol.98:293;1975)の概念に従い、(abcdefg)nで示される7価リピートにより安定化される(残基aおよびdは、一般的に疎水性残基であり、dがロイシンにあたり、螺旋の同じ面に並ぶ)。逆の電荷を有する残基は、通常gおよびe位に存在する。故に、平行コイルドコイルは、二つの螺旋状のロイシンジッパードメインから形成され、第1の螺旋の疎水性側鎖により形成される「ノブ」は、第2の螺旋の側鎖の間に形成される「ホール」に充填される。
【0053】
いくつかの研究は、保存的なアミノ酸は、二量体化する能力の最小の減少で個々のロイシン残基と置き換えられ得るが、多重の置換は、通常この能力の欠損を生じることを示している。(Landschulzら、Science 243:1681,1989;TurnerおよびTjian,Science 243:1689,1989;Huら、Science 250:1400,1990)。van Heekerenらは、多くの異なるアミノ残基がGCN4のロイシンジッパードメインのロイシン残基と置換され得ることを報告し、さらに、2つのロイシンの置換を含む数個ののGCN4タンパク質は弱く活性を有することを見出した。(Nucl.Acids Res.20:3721.1992)。
【0054】
GCN4のロイシンジッパードメインに相当する合成ペプチドのaおよびd残基におけるアミノ酸置換は、ロイシンジッパードメインのオリゴマー化の性質を変化させることがわかっている。(Alber,Sixth Symposium of the Protein Society,San Diego,Calif.)。全てのa位の残基がイソロイシンに変更される場合、ロイシンジッパーはなおも、平行な二量体を形成する。この置換に加え、全てのd位のロイシン残基もまたイソロイシンに変更される場合、結果として生じたペプチドは、溶液中で三量体化した平行コイルドコイルを自発的に形成する。全てのd位のアミノ酸をイソロイシンへ、a位のアミノ酸をロイシンへの置換により、四量体化したペプチドを生じる。これらの置換を含むペプチドもまた、ロイシンジッパードメインと呼ばれる。しかしながら、好ましい実施形態において、タンパク質を二量体化し得るロイシンジッパーが、RANKL融合パートナーとして用いられる事が、指摘されるべきである。RANKL−ロイシンジッパー融合タンパク質の構築は、GST−RANKLおよびAP−RANKLと同じ方法で実施され得る。実施例18を参照のこと。細菌に加え、哺乳動物細胞株および昆虫細胞のような他の適切な発現システムも使用され得る。当業者は、ロイシンジッパー−RANKL融合タンパク質を発現するため必要な修正を容易に行い得る。
【0055】
別の実施形態として、RANKL誘導体は、オリゴマー複合体を形成するため、使用され得る。最近、新たに見出されたTNFリガンドファミリーのメンバー、TALL−1(BAFF、THANK、BLyS、およびzTNF4としても知られる)が生理的条件下でオリゴマー形成する能力を有する事が発見された。(Liuら、Cell,108:383−394,2002)。Liuらは「フラップ(flap)」領域(フラップを形成し、フラップを分子から拡がらせるループの長さによりそう名づけられた)が、三量体−三量体相互作用およびその後のクラスター形成を媒介することを示している。このフラップ領域は、TNFファミリーのメンバーのなかで、TALL−1に固有であり、これまでに発見されている他のTNFファミリータンパク質のどのDEループよりも長い表面DEループ(TALL−1のD鎖およびE鎖を連結するループ)により作られる。オリゴマー化は、長いDEループと周囲のTALL−1分子の非共有結合性の相互作用を介して起こり、その結果、大きなクラスターの形成を生じると考えられる。RANKLおよびTALL−1は共にTNFリガンドファミリーのメンバーであり、同様のβ鎖コア構造を有するので、本発明に従い、RANKLは、生理的条件下で自発的にオリゴマー形成する変異型RANKL分子を作るように変異される。一つの実施形態において、RANKLの改変は、そのDEループ(アミノ酸配列SIKIPを含むアミノ酸245〜249)がTALL−1のDEループ(アミノ酸配列KVHVFGDEL)で置換されるように設計される。実施例19を参照のこと。さらにTALL−1のオリゴマー化ドメインを反復発生させるため、RANKL分子全体にわたって、次のアミノ酸置換が成され得る:168T→I、187Y→L、194K→F、212F→Y、252H→V、279F→I、および283R→E。実施例20を参照のこと。変異は、PCRで駆動させる部位特異的変異誘発により(例えば、QuickChange Multi−Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社から入手可能)を用いて)RANKLに導入され得る。そのような改変RANKLのオリゴマー化能を測定するため、サイズ排除クロマトグラフィーのような、GST−RANKLを調べるものと同じアッセイを用いることができる。当業者は、過度の実験なく、前述の変異を作製し、変異を導入されたRANKLの構造と機能とを試験することができる。
【0056】
出願人らにより教示されているように、ヒトおよびに動物の患者での骨形成の促進における本発明のオリゴマー性RANKL複合体の有効性を測定するため、インビトロもしくはインビボアッセイが使用され得る。インビトロ結合アッセイのために、骨芽細胞様細胞は、使用され得る。適切な骨芽細胞様細胞には、初代骨髄ストローマ細胞、初代骨芽細胞、ST−2細胞、C1細胞、ROS細胞、およびMC3T3−E1細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞株の多くは、American Type Culture Collection,Rockville,Md.より入手可能であり、標準の特定の増殖培地中で維持できる。インビトロ機能アッセイのために、オリゴマー複合体は、一定範囲の濃度の化合物と共に細胞を培養すること、および骨芽細胞の活性化、骨マトリックスの沈着、頭蓋冠の厚さおよび骨の小結節の形成のような骨形成のマーカーもしくは指標を評価することにより、検定できる。下記の実施例2を参照のこと。加えて、骨芽細胞の増殖、I型コラーゲンの発現および/もしくはCbfa1の発現は、骨形成の評価に使用され得る。下記の実施例14を参照のこと。
【0057】
さらに、化合物での骨芽細胞の処理の一般的なプロトコルは、当該分野で十分に確立されている。例として、Wyattら,BMC Cell Biology,2:14,2001を参照のこと。この文献において選択された細胞株は、MC3T3−E1であり、この細胞株は、骨芽細胞の分化および成熟のインビトロモデルとして用いられている。細胞の処理は、この場合ではBMP−2を用い、下記の方法で実施された。細胞は、5%ウシ胎仔血清、26mM NaHCO3、2mM グルタミン、100u/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを補充したα−MEM培地中で、25cm2のプラスチック培養フラスコにおいて5000/cm2でプレーティングされ、加湿された5%CO2/95%大気、37℃において増殖された。細胞は、PBS中で0.002%プロナーゼEを含むPBSで剥がされた後、3日から4日おきに継代された。処理群の細胞は、24時間増殖され、次いで、4mM HClおよび0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSに溶解したBMP−2(50ng/ml)と共に、37℃にて、24時間および48時間、インキュベートされた。コントロール群は、等量のビヒクルのみで処理された。
【0058】
GST−RANKLのようなオリゴマーでの骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の処理の例示的な条件は、下記に記載される。骨芽細胞前駆体は、ビヒクル、GST(ネガティブコントロール)、もしくは漸増濃度の精製されたオリゴマーGST−RANKL(例えば、1ng/mlから100ng/mlの範囲にわたる濃度)の存在下でインキュベートされる。骨形成促進タンパク質(Bone morphogenetic protein(BMP))−2は、ポジティブコントロールとして投与される。試験組成物は、培養開始時のみ12時間、もしくは開始時に1回と3日後に1回(これもまた12時間)、投与される。用いられる条件は、使用される細胞株および化合物、それらのそれぞれの量、ならびにプレーティングする条件および培地の組成のようなさらなる要因により変動することに留意すべきである。そのような調整は、当業者により容易に決定される。
【0059】
さらに、出願人らの方法に従い、骨形成を増強するオリゴマーRANKL組成物は、種種の動物モデルにおいて評価され得る。実施例3〜実施例6および下記の記述を参照のこと。
【0060】
一般に使用されるアッセイは、新生マウス頭蓋冠アッセイである。要約すると、出生後4日目に、ICR Swiss whiteマウスの新生仔の前頭および頭頂骨は、微小切開により取り出され、矢状縫合に沿って分割される。次いで、骨は、指定の培地中でインキュベートされる。その培地は、試験化合物もしくはコントロール化合物のどちらかを含む。インキュベーション後、骨は培地から取り出され、10%緩衝ホルマリン中で24時間〜48時間固定され、14%EDTA中で1週間脱灰され、段階的なアルコールで処理され、そしてパラフィンワックスに包埋される。頭蓋冠の3ミクロンの切片が調製され、骨形成もしくは骨吸収の組織形態計測解析を用いて評価される。骨の変化は、200ミクロン隔てて切られた切片において測定される。骨芽細胞および破骨細胞は、それらの異なる形態により識別される。
【0061】
このアッセイに加えて、マウス頭蓋冠の骨の成長における化合物の効果は、インビボにおいても試験され得る。このスクリーニングアッセイの一例において、4週齢〜6週齢の雄のICR Swiss whiteマウスが使用され、一群あたり4匹〜5匹のマウスが使用される。要約すると、試験化合物もしくは適切なコントロールは、正常マウスの右側頭蓋冠上の皮下組織に注入される。マウスは、14日目に屠殺され、骨の成長は、組織形態学計測の方法により、測定される。骨の試料は、隣接する組織を取り除かれ、10%緩衝ホルマリン中で24時間〜48時間固定され、14%EDTA中で1週間〜3週間脱灰され、段階的なアルコールで処理され、パラフィンワックスに包埋される。頭蓋冠の3ミクロン〜5ミクロンの切片が調製され、代表的な切片は、骨形成および骨吸収の効果の組織形態計測の評価のため、選択される。切片は、顕微鏡像をデジタル化したプレート上に直接、記録するため、カメラルシーダ部品(camera lucida attachment)を使用して、測定される。骨の変化は、頭蓋冠の注入した側および注入しなかった側の両方において、200ミクロン隔てて切られた切片の4箇所の隣接した1×1mm領域で測定される。新しい骨は、その特徴的な色の特性によって識別され、破骨細胞と骨芽細胞とは、それらの異なる形態により、識別される。組織形態計測のソフトウェア(OsteoMeasure,Osteometrix,Inc.,Atlanta)は、細胞数を決定し、そして面積もしくは境界線を測定するためにデジタル化入力を処理するために使用され得る。
【0062】
さらなるインビボアッセイは、インタクトな動物での投薬アッセイ、急性卵巣摘出(ovariectomized:OVX)(予防モデル)動物での投薬アッセイ、および慢性OVX動物(処置モデル)での投薬アッセイを含む。インタクトな動物での原型的な投薬は、例えば、皮下、腹腔内、経上皮、もしくは静脈内投与により実施され得、そして注射、もしくは他の送達技術により実施され得る。試験化合物の投与の期間は、変動し得る(例えば、28日間ならびに35日間が適切であり得る)。例として、下記に記載のあるように、インビボ経上皮もしくは皮下投与アッセイが実施され得る。
【0063】
代表的な研究では、70匹の3ヶ月齢、雌Sprague−Dawleyラットが、体重を揃えられ、各群10匹の動物として7群に分けられる。これは、実験開始時に屠殺される動物のベースラインコントロール群、ビヒクルのみを投与されるコントロール群、PBSで処置されるコントロール群、および骨の成長を増強することが公知の化合物を投与されるポジティブ群を含む。3種の投薬量の試験化合物は、残りの群に投与される。試験化合物、PBS、およびビヒクルは、35日間、1日1回、皮下に投与される。全ての動物は、屠殺される9日前および屠殺される2日前に、(新たに形成された骨の適切な標識を確保するため)カルセインを注入される。体重は、週ごとに測定される。35日間の最後に、動物は、体重を測られ、眼窩もしくは心臓の穿刺により、採決される。血清カルシウム、リン酸、オステオカルシン、およびCBCが、測定される。末梢骨用定量的コンピューター断層撮影法(peripheral quantitative computed tomography:pQCT;Ferretti,J,Bone,17:353S−364S,1995)、二重エネルギーX線吸収法(dual energy X−ray absorptiometry:DEXA;Laval−Jeantet A.ら、Calcif Tissue Intl,56:14−18,1995,およびCasez J.ら、Bone and Mineral,26:61−68,1994)および/もしくは組織形態計測により実施されるような評価のために、脚の骨(大腿骨および脛骨)ならびに腰椎の両方は、取り出され、付着している軟組織を取り除かれ、70%エタノール中もしくは10%ホルマリン中に保存される。骨の再構築における試験化合物の効果は、このようにして評価され得る。
【0064】
試験化合物は、急性の卵巣摘出動物においてもアッセイされ得る。そのようなアッセイは、コントロールとしてエストロゲン処置群も含み得る。これらの動物の試験の例は、下記に簡単に記載される。
【0065】
代表的な研究では、80匹の3ヶ月齢、雌Sprague−Dawleyラットが、体重を揃えられ、各群10匹の動物として8群に分けられる。これは、実験開始時に屠殺される動物のベースラインコントロール群、3種のコントロール群(偽OVXおよびビヒクルのみ、OVXおよびビヒクルのみ、ならびにOVXおよびPBSのみ)、骨量を増強することが公知の化合物を投与されるコントロールOVX群を含む。3種の投薬量の試験化合物は、OVX動物の残りの群に投与される。
【0066】
卵巣摘出は、摂食亢進を引き起こすので、35日間の研究を通して、全てのOVX動物は、偽OVX動物と同時飼育される。試験化合物、ポジティブコントロール化合物、PBSもしくはビヒクルのみは、35日の間、1日1度、経上皮または皮下に投与される。代替として、試験化合物は、35日間埋め込むことができる移植可能なペレット剤として処方され得るか、もしくは、経鼻投与のように経上皮投与され得る。全ての動物は、屠殺される9日前および屠殺される2日前を含む(しかし、限定されない)実験的に決定された間隔でカルセインを注入される。体重は、週ごとに測定される。35日周期の最後に、その動物の血液および組織を、上記に記載したように処理する。
【0067】
試験化合物は、慢性のOVX動物においてもアッセイされ得る。要約すると、80匹から100匹の6ヶ月齢、雌Sprague−Dawleyラットは、実験開始時に、偽の外科手術(偽OVX)、もしくは卵巣摘出術(OVX)を施され、それと同時に、10匹の動物は、ベースラインコントロールとして供するために屠殺される。体重は、週ごとに測定される。骨を欠乏させて約6週間もしくはそれ以上後に、10匹の偽OVXおよび10匹のOVXラットは、欠乏期間のコントロールとするため、屠殺用に無作為に抽出される。残りの動物のうち、10匹の偽OVXおよび10匹のOVXラットは、プラセボ処置コントロールとして、使用される。残りの動物は、3用量〜5用量の試験化合物で35日間、処置される。本モデルにおいて、OVXラットの一群は、ポジティブコントロールとして、PTHのような公知の同化作用性の薬剤で処置され得る(Kimmelら、Endocrinology,132:1577−1584,1993)。実験の最後で、動物は屠殺され、大腿骨、脛骨、および第1腰椎〜第4腰椎は切除され、集められる。近位の左および右脛骨は、pQCT測定、海綿骨質密度(cancellous bone mineral density:BMD)、および組織像に用いられ、一方、それぞれの脛骨の骨幹中部(midshaft)は、皮質のBMDもしくは組織像に用いられる。大腿骨は、生体力学の試験をする前に、骨幹中部のpQCTスキャンのため調製される。腰椎(lumbar vertebrae:LV)に関しては、LV2は、BMDのため処理され(pQCTも実施され得る)、LV3は、脱灰していない骨の組織像のため調製され、ならびにLV4は、力学試験のため処理される。
【0068】
さらなる実施形態において、出願人は、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体において、オリゴマーRANKLとそのレセプターRANKの間の相互作用が、細胞内タンパク質の延長した細胞内活性を生ずることを発見している。マウス骨芽細胞は、インビトロでGST−RANKLで処理された場合、NFκBおよびERK細胞内シグナル経路の活性化で特徴付けられるような活性化を示した。出願人により言及されているように、細胞内タンパク質活性、特にERK活性の時間経過は、細胞表面にRANKも発現している破骨細胞前駆体の時間経過とは異なっている。破骨細胞前駆体において、ERK活性は、RANK/GST−RANKL相互作用の5分〜10分後に最高に達し、15分〜30分後に基底レベルに戻る。対照的に、骨芽細胞のERK活性は、同じ相互作用の10分後に最高に達し、60分後でもまだ基底レベルより高い。時間経過の延長化は、骨芽細胞前駆体において、さらに顕著であり、ここで、示されたERK活性は、RANK/オリゴマーGST−RANKL相互作用の60分後でも最高に達していなかった。異なるERK活性の時間経過に加え、骨芽細胞および骨芽細胞前駆体は、IKK、PI3キナーゼ、Akt、p38およびJNKのようなキナーゼの延長した活性も示す。この骨芽細胞に関連した活性は、MAPキナーゼの短命な活性および骨吸収を生じる、破骨細胞におけるGST−RANKLとRANKとの相互作用と対照をなしている。したがって、特定の学説に拘束されないが、骨芽細胞においてオリゴマーGST−RANKL刺激後に見られるキナーゼの延長した活性は、同化的な骨プロセスにおいて機能していると考えられる。
【0069】
TNFファミリーのサイトカインに誘導される細胞内シグナル伝達は、レセプター−リガンド複合体のインターナリゼーションによって、弱められることが公知である。(例えば、Higuchi,MおよびAggarwal,B.B.,J.Immunol.,152:3550−3558,1994参照のこと)。それ故、出願人は、RANKL含有オリゴマー複合体が、RANKL三量体と同様に早期のうちにインターナリゼーションされず、従ってレセプターとのより長い相互作用および延長した細胞内シグナル伝達を許容する、と考えている。図16および実施例13を参照のこと。
【0070】
従って、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体において、1以上の細胞内タンパク質の活性を増強する能力をもつ骨形成性化合物(活性が骨形成の指標になる)は、本発明の方法に使用され得る。活性化される細胞内タンパク質はキナーゼを含むが、それに限定されない。好ましくは、キナーゼは、ERK1/2、JNK、PI3キナーゼ、IKK、Akt、およびp38を含み、さらにより好ましくは、キナーゼは、ERK1/2である。他の細胞内タンパク質は、IKB−α、IKB−βを含む。
【0071】
別の好ましい実施形態において、活性は、1以上の細胞内タンパク質のリン酸化を含み、さらに好ましくは、キナーゼのリン酸化を含む。MAPキナーゼファミリーにとって、完全な活性化は、グルタミン酸残基によって隔てられたチロシン残基とトレオニン残基(TEYモチーフとして公知であり、Tはトレオニン、Eはグルタミン酸、そしてYはチロシンである)のMAPキナーゼキナーゼ(MAP kinase kinase:MKK)として公知である単一の上流のキナーゼによる二重のリン酸化を必要とする。二重のリン酸化の必要条件により、確実にMAPキナーゼがMKKの作用により特異的に活性化される。
【0072】
キナーゼがリン酸化されてるか否かを測定する技術的に利用可能などのようなアッセイも、使用され得る。好ましくは、そのようなアッセイは、ウェスタン分析法もしくはキナーゼアッセイを含む。
【0073】
ウェスタン分析法は、一般的に下記のように実施される。一旦、細胞溶解物が、調製されると、細胞内タンパク質は、SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を利用してサイズを基に分離される。分離されたタンパク質は、エレクトロブロティング法により、タンパク質が接着する適切なメンブレン(例えば、ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン)に移される。メンブレンは、非特異的なシグナルを低減するため洗浄され、その後、RANKシグナル伝達の結果としてリン酸化された特定のアミノ酸のみを認識する抗体を用いて調べられる。さらに、余分な抗体を除く洗浄の後、(メンブレン上の特異的にリン酸化されたタンパク質に結合している)一次抗体を認識し、レポーター部分を含む二次抗体がメンブレンに加えられる。二次抗体のレポーター部分と相互作用する発色試薬の添加は、バンドの可視化を起こす。
【0074】
キナーゼアッセイ(例えば、ERK1/2に対する)は、p90リボソームS6プロテインキナーゼ(RSK)のような、このキナーゼに対する公知の基質を用いて、実施できる。要約すると、例として、処理された骨芽細胞は、氷冷のPBSで(例えば3回)洗浄され、細胞溶解物を得るため、溶解緩衝液で抽出される。細胞溶解物の微小遠心の後、得られた上清は、プロテインGセファロースとともにヤギ抗RSK2抗体(1:200)と4℃で1晩、インキュベートされる。ビーズは、微量遠心により回収され、溶解緩衝液で2回、続いてキナーゼ緩衝液で洗浄される。ビーズ中のRSK2ホスホトランスフェラーゼ活性は、S6キナーゼアッセイキットおよび[γ−32P]ATPを使用して、製造元(Upstate Biotechnology,Inc)より提供されるプロトコルに従い、測定される。
【0075】
骨芽細胞の活性化を測定するために応用できる別途のアッセイは、電気泳動移動度ゲルシフトアッセイ(electrophoretic mobility gel shift assay:EMSA)である。このアッセイは、(GST−RANKLでの骨芽細胞活性化後のNFκBのような)転写因子複合体の核移行を観察する。要約すると、EMSAは、次のように実施される。処理された骨芽細胞の核は、単離され、その抽出物が作製される。その後、核タンパク質は、32Pオルトリン酸で標識された特異的なオリゴヌクレオチドプローブとともにインキュベートされる。適切な時間後、推定されるタンパク質−DNA複合体は、(SDSを含まない)PAGEゲルで分離され、そのゲルは乾燥され、X線フィルムに露光される。もし、特異的な複合体(このケースではNFκBと特異的なDNA配列の複合体)が形成されていれば、現像されたフィルム上にバンドが認められる。典型的には、適切なコントロールは、そのバンドが活性化された骨芽細胞に特異的であることを確定するため、実験試料と同時に泳動される。ウェスタン分析法、キナーゼアッセイ、およびEMSAの詳細な手順は、例としてLaiら、Journal of Biological Chemistry,276(17):14443−14450,April 27,2001参照のこと。
【0076】
骨芽細胞における活性化は、細胞をGST−RANKLのようなオリゴマーとインキュベートした後、少なくとも60分まで検出できる。骨芽細胞前駆体においては、活性化は5分から10分後に最高に達し、少なくとも60分後までの間、検出可能である。従って、1以上の細胞内タンパク質の活性は、骨形成性化合物を骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体とインキュベートした後、少なくとも約30分までに検出し得る。好ましい実施形態において、活性は、前記のインキュベーション後、少なくとも約40分で、より好ましくは、少なくとも約60分で検出される。別の好ましい実施形態において、活性が少なくとも約30分で検出される細胞内タンパク質は、キナーゼであり、より好ましくは、ERK1/2である。
【0077】
骨芽細胞を活性化および/もしくは骨芽細胞前駆体の分化を刺激する化合物が同化性の骨プロセスを増強し得ることを確認するため、そのような化合物を骨形成アッセイにおいて、試験することができ、ここでバックグラウンドの骨量における増加を上回る骨量における増加は、化合物が骨形成活性を有することを表す。本発明の潜在的な骨形成化合物をうまくスクリーニングするため用いられ得る複数の骨形成アッセがある。例えば、コラーゲンのレベルおよびアルカリホスファターゼ活性の測定に基づく骨芽細胞の分化と機能について細胞をベースとしたアッセイは、使用され得る。これらのアッセイは、当該分野で周知であり、当業者により容易に実施される。さらに、複数のインビトロおよびインビボアッセイは、上記の項に記述されている。骨芽細胞と骨芽細胞前駆体の両方とも、GST−RANKLのようなRANKLの同化型での刺激後、同じキナーゼの延長した活性を示すので、インビトロ骨形成アッセイは、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体のどちらでも実施し得る事は言及されるべきである。
【0078】
細胞内活性化アッセイおよび骨形成アッセイが化合物のライブラリーで実施される場合、骨形成性が示されている化合物を確実に同定することが必要であり得る。化合物の同一性の決定には、複数の方法がある。一つの過程は、Neogenesis社(http://www.neogenesis.com)から入手可能な質量分析装置を含む。NeogenesisのALIS(自動化リガンド同定システム(automated ligand identification system))スペクトル検索エンジンおよびデータ解析ソフトウェアは、リガンドの正確な質量に基づくリガンド構造の高度に特異的な同定を可能にする。当業者は、化合物の同一性を決定するため質量分析実験を実施し得る。
【0079】
別の実施形態において、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体における1以上のホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)し得る骨形成性化合物は、本発明の方法において使用され得る。一つの好ましい実施形態において、ホスファターゼは、p38、ERKs、JNK、IKK、およびAktを含む骨形成において関与するキナーゼを阻害する。より好ましくは、ホスファターゼは、MAPK特異的もしくはAkt特異的であり、さらに好ましくは、ホスファターゼは、ERK1/2特異的である。特定の学説に束縛されないが、この方法は、キナーゼ活性は、それの対応するホスファターゼにより厳密に調節される事実に従い、この目的に適している。ERK1/2の場合、そのホスファターゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼホスファターゼ−3(MKP−3)として公知である。このホスファターゼは、対応するキナーゼのスレオニン残基およびチロシン残基からのリン酸基の除去を担う二重特異性ホスファターゼのファミリーに属している。(Campsら、FASEB J.,14,6−16頁,1999)。ホスファターゼによるリン酸基の迅速な除去は、キナーゼの活性化は短命であり、休止細胞においてリン酸化のレベルは、低いということを確かにする。しかしながら、ホスファターゼが活性化しており、リン酸基を除去するためには、ホスファターゼもまたリン酸化を必要とする。それ故、ホスファターゼ活性の阻害は、ERK1/2活性の活性化もしくは延長を生じる。
【0080】
骨芽細胞/骨芽細胞前駆体において、ホスファターゼを不活性化する骨形成性化合物の能力を測定する一つの方法は、骨芽細胞/骨芽細胞前駆体をGST−RANKLもしくはBMP−2(骨形成促進タンパク質2)のようなこれらの細胞を活性化することで公知である物質で最初に活性化することを含む。これは、ホスファターゼの活性化を導き、その時点で、骨芽細胞/骨芽細胞前駆体は、試験化合物で処理され、細胞溶解物が得られる。ホスファターゼを脱リン酸化する(不活性化する)試験化合物の能力は、ウェスタン分析法もしくはキナーゼアッセイの実施により測定される。上記参照のこと。ホスファターゼ活性を評価するさらなる詳細は、Mudaら、J Biol Chem.,273:9323−9329,1998およびCampsら,Science 280:1262−1265,1998を参照のこと。もし、化合物がホスファターゼ阻害活性を有すると決定されれば、さらにその骨形成性活性を測定するため、骨形成アッセイの一つにおいて試験され得る。これらのアッセイも上記に記載される。
【0081】
(薬学的組成物および方法)
本発明の好ましい実施形態において、骨の喪失を予防する方法もしくは阻害する方法、または骨形成を増強する方法は、1)RANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの1以上のオリゴマー複合体、2)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性(この活性は骨形成の指標である)を増強する能力がある骨形成性の化合物、または3)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質を不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力がある骨形成性の化合物、を投与することにより提供される。本発明の骨形成組成物は、このような組成物の有効量を、それらを必要とする患者に提供することにより利用され得る。一つの好ましい実施形態において、そのような組成物は、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全症、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、歯周病、骨格への転移(skeletal metastasis)、癌、加齢による骨の喪失、骨減少症、および変質性関節疾患(degenerate joint disease)から成る群から選択される状態を処置するために使用される。
【0082】
動物被験体の処置のための使用について、本発明の化合物は、薬学もしくは獣医学の組成物として処方され得る。処置されるべき被験体、投与様式、および所望される処置のタイプ(例えば、予防(prevention)、予防(prophylaxis)、治療)に依存して;化合物は、これらのパラメータに一致する方法で処方される。そのような技術の概要は、Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition, Mack Publishing Co.,Easton,PAにおいて見出される。
【0083】
本発明のRANKL含有オリゴマーもしくは本発明の骨形成性化合物の投与は、投与の多様なパラメータ(頻度、投薬量、期間様式および投与経路を含む)を較正することにより、薬物動態学的および薬力学的に制御され得る。従って、一つの実施形態において、骨量の形成は、毎日の注射および/もしくは摂取のような非連続性の断続的な様式でRANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの1以上のオリゴマー複合体のような同化性組成物を投与することにより達成される。一般的に、本明細書中に記載されるような任意の骨形成性化合物は、同様な効果を実現するため、断続的に投与され得る。投薬量、期間および投与様式におけるバリエーションもまた、求められる活性を産生するために操作され得る。
【0084】
動物もしくはヒト被験体への投与のため、本発明の組成物の投薬量は、典型的には0.01〜100mg/kgである。しかしながら、投薬量は、疾患もしくは状態の性質、患者の状態、開業医の判断、および投与の頻度ならびに様式に高度に依存している。経口経路が採用される場合、その物質の吸収は、バイオアベイラビリティーをもたらす要因である。低い吸収は、胃−腸管内で、より高い濃度、従ってより高い投薬量を必要とする効果を持つ。
【0085】
物質の適切な投薬量は、動物モデル試験(有効用量レベル(例えば、ED50)および毒性用量レベル(例えば、TD50)ならびに致死用量レベル(例えば、LD50もしくはLD10)は、適切および受容可能な動物モデルにおいて証明される)を実施することにより適切に評価されるべきであることが、理解される。さらに、そのような動物試験において、ある物質が有効であると証明された場合、制御された臨床試験が実施されるべきである。
【0086】
一般的に、処置における使用に関し、本発明の組成物は、骨の喪失の処置のため、単独もしくは他の組成物と組み合わせて使用され得る。そのような組成物としては、ビスホスフォネートのような抗吸収剤、カルシトニン、カルシトリオ−ル、エストロゲン、SERMおよびカルシウム供給源、もしくは副甲状腺ホルモンまたはその誘導体のような補助的な骨形成性の薬剤、骨形成促進タンパク質、オステオゲニン、NaF、もしくはスタチンが挙げられる。本明細書中に参考として援用される米国特許第6,080,779号を参照のこと。投与様式に依存して、化合物は適切な組成物に処方される。
【0087】
処方物は、全身投与あるいは局所(topical)投与または局所(local)投与のために適切な様式で調製され得る。全身的な処方物としては、注射(例えば、筋肉内注射、静脈内注射もしくは皮下注射)のために設計された処方物が挙げられるが、これらに限定されないか、あるいは経皮投与、経粘膜投与または経口投与のために調製され得る。処方物は、一般的に希釈剤ならびに(ある場合においては)アジュバント、緩衝剤、防腐剤などを含む。
【0088】
経上皮投与のために、浸透される障壁に適した浸透剤が処方物中において使用される。一般的に、このような浸透剤は当該分野で公知である。経口投与のために、化合物はまた、リポソーム組成物もしくはマイクロエマルジョンとして投与され得る。適切な様式としては、当該分野において公知であるシロップ、カプセル、錠剤が挙げられる。注射のために、処方物は、溶液もしくは懸濁液として、または注射前の液体における溶液もしくは懸濁液として適切な固形物として、または乳化剤として慣習的な形状で調製される。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなどが挙げられる。そのような組成物はまた、湿潤剤もしくは乳化剤のような補助的な非毒性物質量、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレートなどのpH緩衝剤などを含み得る。
【0089】
本明細書中に記載されたRANKL含有オリゴマーおよび骨形成性化合物はまた、当業者に公知の多様な技術を用いて、患者(ヒトおよび他の脊椎動物(例えば、家畜(domestic animal)、げっ歯類、ならびに家畜(livestock))の両方)の骨形成および成長が望まれる部位に局所的に投与され得る。例えば、これらとしては、スプレー、ローション、ゲルもしくは他のビヒクル(例えば、アルコール、ポリグリコール、エステル、オイルおよびシリコーン)が挙げられ得る。このような局所的な用途としては、例えば、骨折部位、あるいは損傷した骨の修復または置換の欠損部位が挙げられる。加えて、本発明のオリゴマー複合体および骨形成性化合物は、例えば、適切なキャリア中で自家移植片、同種移植片もしくはプロテーゼと天然の骨との接合部に、移植片もしくはプロテーゼの、天然の骨への結合を補助するために、投与され得る。
【0090】
薬学的に受容可能な賦形剤としては、生理食塩水、リンゲル液、トコフェロール、リン酸溶液もしくは緩衝液、緩衝化生理食塩水、および当該分野において公知である他のキャリアが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的組成物はまた、安定剤、抗酸化剤、着色料、および希釈剤を含み得る。薬学的に受容可能なキャリアおよび添加剤は、薬学的化合物からの副作用が最小に抑えられ、化合物の能力が処置を無効にする限度まで取り消されも、もしくは阻害されるもしないように選択される。
【0091】
下記の実施例は、本発明を例証するが、例証されるように本発明の多様な局面を限定するように挙げられていない。
【実施例】
【0092】
(実施例1)
(GST−RANKL融合タンパク質としてのRANKLの発現)
マウス型RANKL残基158〜316をコードするcDNAを、SalIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼを用いて、pGEX−4T−1(Amersham;GenBank登録番号U13853−http://ncbi.nlm.nih.govにあるNational Library of Medicineリストの核酸の欄を参照のこと)のグルタチオン S−トランスフェラーゼの下流にクローニングした。BL21(DE3)Escherischia coli(Invitrogen)におけるIPTG(0.05mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl pH8.0、および1mM EDTAを含む溶解緩衝液の中で粉砕した。溶解物を、GST−RANKL融合タンパク質のアフィニティー精製のために、グルタチオンセファロース(Amersham)とともにインキュベートし、続いて150mM NaCl、および20mM Tris−HCl(pH8.0)を含む緩衝液で過剰に洗浄した。アフィニティーカラムからの競合溶出(10mM 還元グルタチオン)の後、単離されたタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、0〜500mM NaClの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびpHに対し透析した。次いで、精製したGST−RANKLを、リムルス変形細胞溶解物試験(limulus amoebocyte lysate assay)により、エンドトキシン汚染についてアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量した。
【0093】
サイズ排除クロマトグラフィーにより示されるように、生理的環境を模した条件下で、GST−RANKLは、大きなオリゴマー複合体を形成する。図2を参照のこと。図2の曲線下の面積により測定されるように、タンパク質の大部分は、GST−RANKLのオリゴマー複合体として存在する。
【0094】
(実施例2)
(全頭蓋冠器官培養物における骨形成のエキソビボ刺激)
骨形成についてのアッセイを、本明細書中に参考として援用される米国特許第6,080,779号 カラム10,II.29−55に記載されるように実施した。新生仔のマウス頭蓋冠を、ビヒクル、GST(ネガティブコントロール)、もしくは実施例1に概要を述べたようにして得られた、精製された漸増濃度のGST−RANKLの存在下で、器官培養した。骨形成促進タンパク質(BMP)−2を、ポジティブコントロールとして投与した。試験組成物を、培養開始時のみ、12時間(1×)、もしくは開始時に1回と3日後にもう1回、12時間の持続時間で(2×)、投与した。7日後、頭蓋冠の厚さを、組織形態計測学的に決定し、骨形成を評価するために、多様なコントロール群および実験群と比較した。要約すると、頭蓋冠の骨を、インキュベーション培地から取り出し、10%中性緩衝ホルマリン中で12時間固定し、14%EDTAで3日間脱灰し、段階的にアルコールで脱水し、組織学的な切片作製のためにパラフィンに包埋した。頭蓋冠を、矢状縫合に垂直に、頭頂骨の中心部を通って、冠状に切断した。匹敵する解剖学的位置の代表的な冠状切片を、頭蓋冠の厚さの組織形態計測学的評価に供した(OsteoMeasure,Osteometrics Inc.,Atlanta,GA)。図3を参照のこと。GST−RANKLは、1回もしくは2回投与された場合、頭蓋冠の厚さに用量依存的な増加を誘導した。図4を参照のこと。試験した最高の用量(100ng/ml)において、頭蓋冠の厚さは2倍になった。
【0095】
(実施例3)
(マウスにおける骨形成のインビボ刺激)
マウスC3H/HeN(Harlan,Indianapolis,IN)に、100マイクログラムのGST(コントロール)もしくは100マイクログラムの実施例1において得られたようなGST−RANKLを1日1回、9日間、皮下に投与した。脛骨の組織学的試験は、コントロールマウスと比較して、GST−RANKL処置マウスにおいて、著しい骨量の増加および活性化骨芽細胞の数の正味の増加を明らかにした。それぞれ低倍率および高倍率で撮影された図5(a)、図5(b)を参照のこと。これらの図は、GSTを与えられたコントロール動物と比較して、皮質の厚さの顕著な増加および初期の海綿質(spongiosa)の小柱構造物の増加を明らかにした。
【0096】
GST投与マウスもしくはGST−RANKL投与マウスの二重エネルギーX線吸収(DEXA)解析もまた、標準的な手順で実施した。結果(図5(c)を参照のこと)は、コントロールに比べ、GST−RANKLの骨塩密度の有意な増加を示す。
【0097】
(実施例4)
(骨芽細胞のインビボ活性化)
マウスC3H/HeN(Harlan,Indianapolis,IN)に、実施例3において示された手順に従い、GST(コントロール)もしくはGST−RANKLを投与した。脛骨の高倍率での組織学的試験は、コントロールマウスと比べ、GST−RANKL処置マウスにおいて骨芽細胞の顕著な活性化を明らかにした。休止した骨芽細胞は、コントロール動物において薄い骨表面細胞として明白である一方、活性化された骨芽細胞は、GST−RANKL処置マウスにおいて、骨表面に沿った膨らんだ立方体の細胞として明白である。図6を参照のこと。
【0098】
GSTコントロールと対比した、GST−RANKLのインビボ投与中の骨形成の速度の測定を、鉱質化している骨マトリックスに2種の蛍光標識を取り込ませるため、安楽死の7日前および2日前の2%NaHCO3中の20mg/kgカルセインの腹腔内投与により達成した。切開の後、頭蓋冠を、70%エタノールで固定し、組織切片を切るため、ポリメチルメタクリレートに包埋した。冠状縫合とラムダ縫合と間の中間で撮った頭頂骨の冠状切片の顕微鏡写真は、図9に示されており、頭蓋冠の外表面が図の上側に、内表面が下側に向いている。5日間に合成された骨の量は、2セットの平行な蛍光バンド内に取り囲まれた量である。GSTのみを受けたコントロール動物における骨形成の強度は、明瞭に分離した二重の標識を産生するには不十分であるが、GST−RANKL処置動物においては、第1の標識と第2の標識との間の5日間に、骨の明確な沈積が存在する。
【0099】
(実施例5)
(GST−RANKLの投与は、実質的に破骨細胞形成に影響することなく骨芽細胞の増殖を刺激する)
精製されたGST−RANKL融合産物を、マウスC3H/HeN(Harlan,Indianapolis,IN)に、5μg/kg、50μg/kg、500μg/kg、1,500μg/kg、5,000μg/kgの漸増投薬量で、1日1回、7日間、皮下に投与した。RANKLの最高の投薬量に相当するモル数のGSTは、ネガティブコントロールとして働いた。マウスを屠殺し、長い骨を固定し、脱灰し、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(tartrate resistant acid phophatase:TRAP)活性について染色した。TRAP活性は、骨に関する破骨細胞の特異的表現型マーカーである。海綿質表面1mmあたりの活性化骨芽細胞および破骨細胞の数を、組織形態計測学的に定量した。図7に見られるように、間欠性の様式(すなわち毎日の注射による)で投与されたGST−RANKLは、活性化骨芽細胞における用量依存的な増加を生じたが、破骨細胞の数には生じなかった。GSTは、骨芽細胞もしくは破骨細胞のどちらにおいても顕著な影響を有さなかった。
【0100】
(実施例6)
(エキソビボ骨小節形成により証明されるような骨芽細胞前駆体の分化の増強)
実施例3において考察されたようなGST−RANKL(100μg)処置マウスおよびGST処置マウス由来の同数の骨髄細胞を、骨を形成し得る骨芽細胞および関係する前駆体の数が増えているかどうか決定するため、28日間、骨芽細胞形成条件に置いた。28日後、細胞を、鉱質化骨小節を同定するために、アリザリンレッドで、そしてコロニー形成単位を同定するために、ヘマトキシリンで染色した。
【0101】
GST−RANKL処置マウスに由来する骨髄細胞は、GSTを投与された対応物より、実質的により鉱質化した骨小節を産生した(図8を参照のこと)。
【0102】
(実施例7)
(マウス破骨細胞前駆体において、GST−RANKLは、迅速にMAPキナーゼを活性化する)
野生型C57BL/6マウスを、Harlan Industries(Indianapolis,IN)より購入した。破骨細胞前駆体の単離のために、骨髄マクロファージ(BMM)を、4週齢〜6週齢のマウスの全骨髄から単離し、組織培養ディッシュ中で37℃、5%CO2でインキュベートした。24時間の培養後、非接着細胞を回収し、Ficoll Hypaque勾配で層状にし、勾配の界面の細胞を回収した。細胞を37℃、5%CO2で、10%の熱不活化ウシ胎仔血清を補ったα−最小必須培地中で、組換え型マウスM−CSF(10ng/ml)の存在下、65,000/cm2で再プレートした。4日目もしくは5日目に、細胞をGST−RANKLで処理した。Aktの活性を扱う実験において、細胞をGST−RANKL刺激前の24時間、血清およびM−CSFを含まない培地で培養した。
【0103】
破骨細胞前駆体のイムノブロッティング(ウェスタンブロッティング)を、下記の指示に従って実施した。サイトカイン処理のBMMの単層もしくはコントロールのBMMの単層を氷冷PBSで2回、洗浄した。細胞を、20mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X−100、2.5mM ピロリン酸(pyrophoshate)ナトリウム、1mM β−グリセロリン酸、1mM Na3PO4、1mM NaF、および1×プロテアーゼインヒビターカクテルを含む緩衝液中で溶解した。細胞溶解物50μgをSDSサンプル緩衝液(0.5M Tris−HCl(pH6.8)、10%w/v SDS、10%グリセロール、0.05%w/vブロモフェノールブルー)存在下で5分間煮沸し、8%ゲルを用いて、SDS−PAGEで分離した。タンパク質を、半乾燥ブロッター(Bio−Rad,Richmond,CA)を用いてニトロセルロースメンブレンに移し、非特異的な結合を低減するため、ブロッキング溶液(0.1% Tween20を含むトリス緩衝化生理食塩水中、5%脱脂粉乳)中で1時間インキュベートした。次いで、メンブレンを4℃で1晩、1次抗体に曝し、3回洗浄し、1時間、ヤギ抗マウスIgGもしくは抗ラビットIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体と共にインキュベートした。メンブレンを、頻繁に洗浄し、製造元(Amersham)の指示に従い、増強化学発光検出(enhanced chemiluminiscence detection)アッセイを実施した。
【0104】
イムノブロッティングアッセイの結果を図10に示す。この図から見出されるように、JNK、p38、およびERKの総細胞量は、このアッセイのどの時点においても有意には変わらなかった。ERKおよびp38のリン酸化(活性化)は、GST−RANKL刺激の5分後に検出され、RANK/GST−RANKL相互作用の10分後、最高に達し、そして相互作用の30分後には検出されなかった。JNKは、GST−RANKL刺激の15分後にリン酸化されたが、このタンパク質は迅速に脱リン酸化され、その結果、GST−RANKL刺激後30分までに、JNKのリン酸化形態は検出されなかった。データは、GST−RANKL刺激後のマウス破骨細胞前駆体におけるERK、JNK、およびp38の一過性で短命な活性を示した。
【0105】
(実施例8)
(マウス破骨細胞前駆体において、GST−RANKLは、迅速にAktを活性化する)
破骨細胞前駆体を、実施例7に記載されたように単離、維持、および操作した。イムノブロッティングのプロトコルもまた、1次抗体がホスホ−Akt(Cell Signaling社より入手した)に特異的であることを除き、実施例7と同様であった。
【0106】
図11は、GST−RANKL刺激の時点で、検出可能なAktのリン酸化が存在したことを示し、このことは、このタンパク質の迅速な活性化を示している。Aktは、PI3キナーゼの基質であり、活性化状態にあるAktは、抗アポトーシスシグナル伝達に関与する。Akt活性は、経時的に増加した。すなわち、破骨細胞前駆体においてリン酸化Akt分子の数は、経時的に増加した。従って、Aktの活性は、GST−RANKL刺激の0分後より5分後において強く、15分後に最高に達した。
【0107】
(実施例9)
(GST−RANKLに誘導されたMAPキナーゼの活性は、マウス骨芽細胞において延長される)
初代骨芽細胞を、連続的な酵素消化により新生仔マウス頭蓋冠から単離した。要約すると、頭蓋冠を刻み、カルシウムおよびマグネシウム不含のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に0.1%コラゲナーゼ、0.05%トリプシン、および4mM NA2EDTAを含む酵素溶液中で穏やかに振とうしながら、室温で20分間、インキュベートした。この手順を、計6の消化物を得るため、繰り返した。最後の4〜6の消化物から単離した細胞を、15%FBS、50μMアスコルビン酸、および10mM β−グリセロリン酸を含むMEM中で培養した。細胞を、6%CO2を含む加湿雰囲気中で、37℃で維持し、培地およびサイトカインを毎日、置換した。
【0108】
示された時間および投薬量でのサイトカイン処理の後、細胞を、使用直前に1mM Na3PO4、1mM NaF、および1×プロテアーゼインヒビターカクテルを加えたRIPA緩衝液(10mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1%Nonidet P−40、0.2%デオキシコール酸ナトリウム、および1mM EDTAを含む)中で溶解した。タンパク質濃度を、Micro BCA Protein Assay(Pierce)により、定量および標準化した。溶解物を、Laemmli緩衝液中で加熱により変性し、SDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロース上に移した。全体およびリン酸化されたERK、JNK、p38、Akt、およびIkBαのレベルを、製造元が確立したプロトコルに従い、通常の化学発光検出を用いて、1次抗体および2次抗体を使用して決定した。メンブレンを、ハイブリダイゼイションの間に、10μM β−メルカプトエタノールおよび2%SDSを含むPBS中で剥がした。
【0109】
GST−RANKLもしくは等モルのRANKL刺激後のMAPキナーゼの活性を測定するイムノブロットアッセイの結果を、図12に示す。GST−RANKL刺激を実施例7に記載されるように実施した。リン酸化を測定したキナーゼとしては、ERK、JNK、p38、およびAktが挙げられる。さらに、破骨細胞前駆体に見られるように、全タンパク質の量は、細胞において、どの時点においても有意に変化しなかった。しかし、試験したキナーゼの全ては、骨芽細胞において、延長した活性を示した。両方のERKは、GST−RANKL刺激後、5分までに活性化され、そしてそれらの活性は、刺激後、60分において、検出可能であった。JNK、p38、およびAktの活性は、GST−RANKL刺激の時点で検出可能であり、そして刺激後、少なくとも60分までの間、検出可能であった。加えて、IkBαのリン酸化は、刺激の10分後に検出され、そしてアッセイの終わりまで(60分間)、増加した。このことはNFkBの核への増加した移行を示す。このデータは、MAPキナーゼ活性のパターンが、破骨細胞における同じキナーゼの活性と異なることを示唆している。骨芽細胞において観察される延長した活性は、加速した同化性の骨プロセスにおいて役割を果たしているようである。加えて、RANKL処理は、GST−RANKLに見られるような、キナーゼの延長した活性を誘導できなかった。
【0110】
(実施例10)
(マウス骨芽細胞前駆体において、GST−RANKLが誘導したERK1/2活性は、延長される)
実施例9に示された手順に従い、骨芽細胞前駆体を、単離し、そしてそれを維持した。イムノブロティングを、実施例9のイムノブロティングと同様の方法で実施した。
【0111】
図13に示されるように、骨芽細胞前駆体のERK活性は、延長され、そしてそれは、経時的に増加した。骨芽細胞において、この活性は延長されたが、長期にわたり有意に変化しなかった。一方、骨芽細胞前駆体のERK活性は、最初、GST−RANKL刺激の10分後に検出され、そして活性化の60分後まで(アッセイが実施された時間の長さ)増加した。
【0112】
(実施例11)
(骨芽細胞におけるGST−RANKL曝露後のAP活性)
初代頭蓋冠骨芽細胞を、15%FBS、50μMアスコルビン酸、および10mM β−グリセロリン酸を含むMEM中で培養した。細胞を、培地およびサイトカインを毎日交換しながら、37℃で維持した。、骨芽細胞の分化および機能の直接の指標である骨芽細胞アルカリホスファターゼ(AP)活性を、発色基質(5.5mM p−ニトロフェニルリン酸)の添加により定量した。次いで、細胞を、異なるレジメンで投与されたGST−RANKLに曝露した。50ng/mlGST−RANKLへのパルス状の曝露を、48時間の処置時間枠あたり1時間、3時間、6時間、8時間、もしくは24時間の全曝露として与えた。4回のこのような48時間処理の後、AP活性を定量し(±S.D.)、全タンパク質レベルに対して標準化した。
【0113】
図14から理解され得るように、GST−RANKL曝露を、48時間ごとに1回、8時間の処理時間枠に対して与えた場合、最大の同化効果を観察した。従って、GST−RANKLを、断続的な様式で投与した時に、GST−RANKLは、AP活性における増加を誘導した。
【0114】
(実施例12)
(GST−RANKLのオリゴマー化)
GST−RANKLを、そのGST融合パートナーから切断されたRANKLフラグメントを単離するために、タンパク質分解に供した。要約すると、GST−RANKLを14型ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)と共に、50mM Tris−HCl(pH7.0)、150mM NaCl、10mM EDTA、および1mM DTT中で4℃で4時間インキュベートした。非切断の融合タンパク質およびGSTタグ化プロテアーゼを、グルタチオン親和性マトリックスを通すことのより除去した。全ての精製された組換えタンパク質を、リムルス変形細胞溶解物試験(limulus amoebocyte lysate assay)(Bio Whittaker)により、エンドトキシン汚染についてアッセイし、そして同一性を確認するために、質量分析により解析した。GST−RANKLおよび切断されたRANKLの両方を、生理的な塩およびpHに対して透析し、そしてAKTA explorer chromatography system(Amersham Pharmacia)を用いたSuperose−6 26/60でのゲル濾過により、分画した。溶出容量を、以下の標準物質:リボヌクレア−ゼA(13,700)、キモトリプシノーゲンA(25,000)、卵白アルブミン(43,000)、ウシ血清アルブミン(67,000)、アルドラーゼ(158,000)、カタラーゼ(232,000)、フェリチン(440,000)、サイログロブリン(669,000)、およびブルーデキストラン2000(2,000,000)を用いて分子量に対して較正した。異なる溶出容量に由来するタンパク質を含有するフラクションを、モノクローナル抗GST一次抗体を用いて、ウェスタン分析に供した。図15(a)が示すように、切断されたRANKLは、単一の三量体種(1n)として移動した一方で、GST−RANKLは、非共有結合的に会合した単一の三量体(1n)および動的平衡下にあるオリゴマー(2〜100n)の多分散系混合物として移動した。結晶学的な証拠は、GSTが、二量体化する本質的な傾向を持つ一方で、RANKLは、自発的に三量体化することを立証している。従って、3RANKL分子および3GST分子から構成される単一のGST−RANKL三量体は、隣接したGSTと結合していない遊離GSTを包含し、オリゴマー化する傾向を生じる3:2の化学量論を生じる。GST−RANKL三量体のGSTが、隣接するGST−RANKL三量体由来のGSTと共に二量体を形成する場合、高次の、枝分かれしたオリゴマーが形成する(図15(b)を参照のこと)。
【0115】
(実施例13)
(GST−RANKLのインターナリゼーション)
初代マウス骨芽細胞を、10%ウシ胎仔血清を含むα−MEM中で維持し、そして分化のために15%FBS、50μMアスコルビン酸、および10mM β−グリセロリン酸を含むMEM中で培養した。細胞を、6%CO2を含む加湿雰囲気中で、37℃で維持し、毎日、培地およびサイトカインを交換した。初代マウス骨芽細胞を、10%ウシ胎仔血清を含むα−MEM中で、カバースリップ上で培養し、示された時間、GST−RANKLもしくは切断されたRANKLで処理した。リン脂質膜染色のため、細胞をVybrant DiI lipophilic carbocyanine membrane fluorescent stain(Molecular Probes)と共に、20分間インキュベートした。細胞を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.1%TritonX−100で、透過化処理し、PBS中1%BSA/0.2%脱脂粉乳でブロッキングし、ポリクローナル抗RANK抗体でRANKを染色した。連続した光学切片を、Radiance2100レーザー走査共焦点顕微鏡(BioRad)を用いて得た。顕微鏡の設定を、アイソタイプIgコントロールで染色した細胞を用いて、黒レベル値に対して較正した。GST−RANKLを、実施例12に記載されるように切断した。
【0116】
培養中の初代骨芽細胞を、5nMの切断RANKLもしくはGST−RANKLに曝露した。示された時間において、細胞表面を、脂肪親和性の蛍光色素で染色し、そしてRANKを抗RANK抗体で染色した。共焦点顕微鏡を、RANK(緑色蛍光)および細胞表面(赤色蛍光)を局在化するために使用した。重ねた画像において、RANKおよび細胞表面の共局在が黄色(緑色および赤色蛍光のオーバーラップ)に見える。GST−RANKL:RANK複合体は、細胞表面に少なくとも1時間留まった。このことは、延長した細胞内RANKシグナル伝達に対応している。対照的に、切断RANKL−RANK複合体は、1時間以内に完全にインターナリゼーションされた。このことは、その時点での切断されたRANKLが誘導したRANKシグナル伝達の欠如と相関している。結果を、図16に示す。
【0117】
(実施例14)
(GST−RANKLに応答したI型コラーゲンおよびCbfa1の発現)
インビボ実験において、マウスに、皮下注射により5μg/kgGST−RANKLもしくは(コントロールとして)GST単独を投与し、そして1時間後に安楽死させた。インビトロ実験において、初代骨芽細胞を、100ng/mlGST−RANKLもしくは(コントロールとして)GST単独に曝露した。RNAを、RNeasy Total RNA System(Qiagen)で単離し、そしてゲノムDNAを除去するため、デオキシリボヌクレア−ゼで消化した。続いて、メッセンジャーRNAを、Oligotex mRNA Purification System(Quiagen)を使用して総RNAより単離し、Platinum Quantitative RT−PCR Thermoscript One−Step System(Life Technologies)で解析した。要約すると、1μgのmRNAを、エキソン−イントロン境界にまたがるように設計したマウス遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー:Cbfa1 センス 5’−CCGCACGACAACCGCACCAT−3’(配列番号3)、Cbfa1 アンチセンス 5’−CGCTCCGGCCCACAAATCTC−3’(配列番号4)、およびコラーゲンI型α1鎖 センス 5’−TCTCCACTCTTCTAGTTCCT−3’(配列番号5)ならびにコラーゲンI型α1鎖 アンチセンス 5’−TTGGGTCATTTCCACATGC−3’(配列番号6)を用いてcDNAに逆転写した。逆転写を、60℃で30分間実施し、続いて95℃で5分間変性した。すぐにタッチダウンPCR増幅を続けた。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)の発現レベルを、コントロールとして同時に評価した。反応産物を、2%アガロースで電気泳動により分画し、そして結果をアッセイの直線範囲から表した。
【0118】
骨芽細胞により合成されたI型コラーゲンは、骨の主要な有機構成成分である。図17に示されるように、初代骨芽細胞は、培養中に分化するにつれて、コラーゲンの発現を徐々に上方制御する。断続的なGST−RANKL曝露は、この過程を加速し、それへの最初の曝露の12時間以内に、強いコラーゲンの発現を誘導する。Cbfa1は、骨芽細胞形成のための主要な転写因子であり、そしてマウスにおいて、その欠乏は、骨芽細胞および骨形成の完全な欠如を生じる(例えば、Ottoら、Cell 89,765−771頁,1997,およびKomoriら、Cell 89,755−764頁,1997を参照のこと)。図18に示されるように、Cbfa1の発現は、骨髄において、GST単独を受けたコントロールマウスの発現に対して、GST−RANKLの全身投与の1時間以内に増強される。
【0119】
(実施例15)
(GST−RANKLは、骨芽細胞の増殖を刺激する)
インビトロでの骨芽細胞の増殖速度を、DNAへの5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)の取り込みにより評価した。要約すると、細胞を、10μM BrdUの存在下で、48時間、100ng/mlGST−RANKLもしくはコントロールとしてモル等量のGST単独の存在下または非存在下で培養した。BrdUの取り込みをペルオキシダ−ゼ標識化抗BrdU抗体を用いて、ELISA(Amersham Pharmacia Biotech)で定量した。分光光度測定は、発色基質3,3’−5,5’−テトラメチルベンジジンを加えた後、450nmで実施した。
【0120】
図19に示されるように、GST−RANKL処理は、骨芽細胞の増殖速度を48時間のアッセイ期間の間に4倍にまで増強した。
【0121】
(実施例16)
(ERK活性化は、GST−RANKLの同化効果に関与している)
本実験において使用されるキナーゼ欠損ERK1cDNA(Robbinsら,J.Biol.Chem.,268,5097−5106頁,1993を参照のこと)は、211位および212位のアデニン(alanine)ヌクレオチドをそれぞれシトシンおよびグアニンに変異させた結果であり、リジン71のアルギニンでの置換(Erk1 K71R)を生じた。ERK1 K71Rは、ドミナントネガティブ様式で、ERK1活性およびERK2活性の両方の阻害に機能する(Liら,Immunol.,96,524−528頁,1999を参照のこと)。ERK1 K71RcDNAを、前述のようにSFGレトロウィルスベクターのNcoIおよびBamHI制限エンドヌクレアーゼサイトにクローニングした(Oryら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,11400−11406頁,1996を参照のこと)。水泡性口内炎ウィルス(VSV)−G糖タンパク質でシュードタイプ化されたレトロウィルス粒子の産生のため、SFG−ERK1 K71Rレトロウィルスベクターを、テトラサイクリン制御下で、Mul V gag−polおよびVSV−G糖タンパク質を発現する293GPGパッケージング細胞株にトランスフェクトした。テトラサイクリンを中止した後、3日目から7日目に馴化培地を回収し、そして5×106コロニー形成単位/ml以上のウィルス力価を含有することを見出した。形質導入の前に、培地を、0.45μmメンブレンを通して濾過し、そして臭化ヘキサジメトリン(ポリブレン)を、8μg/mlの濃度になるように添加した。ネガティブコントロールとして、LacZcDNAをもつレトロウィルスを同じ方法で産生した。VSV−シュードタイプ化レトロウィルスの形質導入は、骨芽細胞の分化もしくは機能に影響を及ぼさないことが示されている(Kalajzicら,Virology,284,37−45頁,2001およびLiuら,Bone 29,331−335頁,2001を参照のこと)。レトロウィルスの形質導入のため、初代骨芽細胞を、150mm培養ディッシュに1mm2あたり60個の細胞の密度で培養し、5×106コロニー形成単位/ml以上を含有する25mlの馴化培地に、24時間、曝露した。LacZレトロウィルスで形質転換された骨芽細胞のX−gal染色により証明した場合、形質転換効率は、90%を越えた。
【0122】
図20(a)に示されるように、ドミナントネガティブERKを形質導入された骨芽細胞は、RSK(GST−RANKL処理に応答する公知下流のERK基質)をリン酸化できなかった。さらに、図20(b)は、ドミナントネガティブERKを形質導入された骨芽細胞は、GST−RANKLに応答したI型コラーゲンの発現の上方制御ができないことを示している。
【0123】
(実施例17)
(AP−RANKL融合タンパク質としてのRANKLの発現)
マウス型RANKL残基158〜316をコードするcDNAを、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切なベクターにクローニングする。ヒト型アルカリホスファターゼ1をコードするcDNAを、cDNAライブラリーから単離し、結果として生じるDNA配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な哺乳動物発現ベクター(例えば、pcDNA3.1)中のRANKL cDNAの上流(アミノ末端)に挿入する。生じたベクターを、標準的な方法により、(例えばCHOのような)哺乳動物細胞株に形質導入する。精製したAP−RANKLを、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。ヒト型AP1は、分泌型タンパク質であり、結果として、AP融合タンパク質は培地中に分泌される。AP−RANKLがインビトロで哺乳動物細胞株により発現され、分泌されるための充分な時間の後、AP−RANKLを単離するため、培地をアフィニティー精製する。AP−RANKL融合タンパク質の実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成するAP−RANKLの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【0124】
(実施例18)
(GCN4−RANKL融合タンパク質としてのRANKLの発現)
マウス型RANKL残基158〜316をコードするcDNAを、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切なベクターにクローニングする。GCN4ペプチドをコードするDNA配列を、結果として生じるDNA配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクター(例えば、pGEX−6P−1(登録番号U78872))中のRANKL cDNAの上流(アミノ末端)に挿入する。BL21(DE3)Escherischia coli(Invitrogen)におけるIPTG(0.05mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl pH8.0、および1mM EDTAを含む溶解緩衝液の中で粉砕する。GCN4−RANKL融合タンパク質の単離のため、溶解物を、アフィニティー精製する。その後、単離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、0〜500mM NaClの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびpHに対し透析する。その後、精製したGCN4−RANKLを、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。
【0125】
GCN4−RANKL融合タンパク質の実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成するGCN4−RANKLの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【0126】
(実施例19)
(TALL−1フラップ領域を含むRANKL誘導体の発現)
残基158〜316を含むマウス型RANKLを、そのDEループ(アミノ酸配列SIKIPを含むアミノ酸245−249)がTALL−1のDEループ(アミノ酸KVHVFGDEL)で置換されるように変異する。QuickChange Multi−Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社から入手可能)を用いて、PCRで駆動させる部位特異的変異誘発により、変異をRANKL中に導入し得る。変異型RANKLを、結果として生じるDNA配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切なベクター(例えば、pGEX−6P−1(登録番号U78872))にクローニングする。BL21(DE3)Escherischia coli(Invitrogen)におけるIPTG(0.05mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl pH8.0、および1mM EDTAを含む溶解緩衝液の中で粉砕する。変異型RANKLタンパク質のアフィニティー精製のため、溶解物を、グルタチオンセファロース(Amersham)と共にインキュベートし、続いて150mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8.0)を含む緩衝液で過剰に洗浄する。次いで、アフィニティーカラムからの競合溶出(10mM 還元グルタチオン)の後、単離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、0〜500mM NaClの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびpHに対し透析する。その後、精製したRANKL誘導体を、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。
【0127】
変異型RANKLの実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成する変異型RANKLの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【0128】
(実施例20)
(TALL−1フラップ領域およびさらなるアミノ酸変化を含むRANKL誘導体の発現)
残基158〜316を含むマウス型RANKLを、そのDEループ(アミノ酸配列SIKIPを含むアミノ酸245〜249)がTALL−1のDEループ(アミノ酸配列KVHVFGDEL)で置換されるように変異する。TALL−1構造との類似性を増すため、RANKL分子全体にわたって、次のアミノ酸変化を実施する:168T→I、187Y→L、194K→F、212F→Y、252H→V、279F→I、および283R→E。QuickChange Multi−Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社から入手可能)を用いて、PCRで駆動させる部位特異的変異誘発により、変異をRANKL中に導入し得る。変異型RANKLを、生じるDNA配列がインフレームであり、かつ介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクター(例えば、pGEX−6P−1)にクローニングする。BL21(DE3)Escherischia coli(Invitrogen)におけるIPTG(0.05mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl pH8.0、および1mM EDTAを含む溶解緩衝液の中で粉砕する。変異型RANKLタンパク質のアフィニティー精製のため、溶解物を、グルタチオンセファロース(Amersham)とともにインキュベートし、続いて150mM NaClおよび20mM Tris−HCl(pH8.0)を含む緩衝液で過剰に洗浄する。アフィニティーカラムからの競合溶出(10mM 還元グルタチオン)の後、単離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、0〜500mM NaClの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびpHに対し透析する。その後、精製したRANKL誘導体を、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。変異型RANKLの実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成する変異型RANKLの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【0129】
(実施例21)
(全頭蓋冠器官培養物における骨形成のエキソビボ刺激)
骨形成のアッセイを、本明細書中に参考として援用される米国特許第6,080,779号 カラム10,II.29−55に記載されるように実施する。新生仔マウスの頭蓋冠を、ビヒクル、AP(ネガティブコントロール)、または漸増濃度の精製したオリゴマーAP−RANKLの存在下で、器官培養する。骨形成促進タンパク質(BMP)−2を、ポジティブコントロールとして投与する。試験組成物を、培養開始時のみ、12時間(1×)、もしくは開始時に1回と3日後に再度1回、12時間の持続時間で(2×)、投与する。7日後、頭蓋冠の厚さを、組織形態計測学的に決定し、骨形成を評価するために、多様なコントロール群および実験群と比較する。
【0130】
(実施例22)
(マウスにおける骨形成のインビボ刺激)
マウスC3H/HeN(Harlan,Indianapolis,IN)に、100マイクログラムのAP(コントロール)もしくは100マイクログラムのAP−RANKLを、1日1回、9日間、皮下に投与する。その後、コントロールマウスと比較したAP−RANKL処置マウスでの骨量の増加および活性化骨芽細胞の数の正味の増加を評価するために、脛骨の組織学的試験を実施する。
【0131】
AP処置マウスと比較したAP−RANKL処置マウスでの骨鉱質密度の変化を評価するために、AP投与マウスもしくはAP−RANKL投与マウスの二重エネルギーX線吸収(DEXA)解析もまた、通常の手順で実施する。
【0132】
(実施例23)
(全頭蓋冠器官培養物における骨形成のエキソビボ刺激)
骨形成のアッセイを、本明細書中に参考として援用される米国特許第6,080,779号 カラム10,II.29−55に記載されるように実施する。新生仔マウスの頭蓋冠を、ビヒクル、GCN4(ネガティブコントロール)、もしくは漸増濃度の精製したGCN4−RANKLの存在下で、器官培養する。骨形成促進タンパク質(BMP)−2を、ポジティブコントロールとして投与する。試験組成物を、培養開始時のみ、12時間(1×)、もしくは開始時に1回と3日後に再度1回、12時間の持続時間で(2×)、投与する。7日後、頭蓋冠の厚さを、組織形態計測学的に決定し、骨形成を評価するため、多様なコントロール群および実験群と比較する。
【0133】
(実施例24)
(マウスにおける骨形成のインビボ刺激)
マウスC3H/HeN(Harlan,Indianapolis,IN)に、100マイクログラムのGCN4(コントロール)もしくは100マイクログラムのGCN4−RANKLを1日1回、9日間、皮下投与する。その後、コントロールマウスと比較したGCN4−RANKL処置マウスでの骨量の増加および活性化骨芽細胞の数の正味の増加を評価するために、脛骨の組織学的試験を実施する。
【0134】
GCN4処置マウスと比較したGCN4−RANKL処置マウスでの骨鉱質密度の変化を評価するために、GCN4投与マウスもしくはGCN4−RANKL投与マウスの二重エネルギーX線吸収(DEXA)解析もまた、通常の手順で実施する。
【0135】
(実施例25)
(GST−RANKL融合タンパク質としてのRANKLの発現)
マウス型RANKL残基158〜316をコードするcDNAを、SalI制限エンドヌクレアーゼおよびNotI制限エンドヌクレアーゼを用いて、pGEX−6p−1(Amersham;GenBank登録番号U78872−http://ncbi.nlm.nih.govにある米国国立医学図書館リストの核酸の欄を参照のこと)のグルタチオン S−トランスフェラーゼの下流にクローニングした。BL21(DE3)Escherischia coli(Invitrogen)におけるIPTG(0.05mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl pH8.0、および1mM EDTAを含む溶解緩衝液の中で粉砕した。GST−RANKL融合タンパク質のアフィニティー精製のために、溶解物を、グルタチオンセファロース(Amersham)と共にインキュベートし、続いて150mM NaClおよび20mM Tris−HCl(pH8.0)を含む緩衝液で過剰に洗浄した。アフィニティーカラムからの競合溶出(10mM 還元グルタチオン)の後、単離したタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに供し、0〜500mM NaClの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびpHに対し透析した。精製したGST−RANKLを、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量した。
【0136】
サイズ排除クロマトグラフィーで示されるように(データは示さず)、生理的環境を模した条件下で、GST−RANKLは、大きなオリゴマー複合体を形成した。タンパク質の大部分は、GST−RANKLのオリゴマー複合体として存在した(データは示さず)。
【0137】
(実施例26)
20匹の6週齢C57BL/6マウスを、無作為に2実験群に割り当てた。群1のマウス(10匹)には、右大腿骨の髄内の腔に100μgGST−RANKLを注射した。群2のマウス(10匹)には、右大腿骨の髄内の腔にGSTビヒクルの等モル量を注射した。
【0138】
マウスを、ケタミン/キシラジンカクテル(100mg/kgケタミンおよび10mg/kgキシラジンIP)で麻酔し、左側の横臥位で置いた。右大腿骨の大転子および右大腿骨外側顆を、特定した。髄内注入部位は、これらのランドマークの間に、等距離であった。ツベルクリンシリンジに29ゲージの針を付けて、注射を行った。9日目、マウスを、ケタミン/キシラジンカクテル(100mg/kgケタミンおよび10mg/kgキシラジンIP)で再麻酔し、それぞれの動物において、二重エネルギーX線吸収(DEXA,Piximus)解析を実施した。DEXA解析の後、直ぐに単純X線写真を撮影した(Faxitron,KV 0.15,時間=20sec)。動物は、CO2窒息により屠殺し、両方の大腿骨は、組織学的な解析のため、回収した。大腿骨は、10%緩衝ホルマリン中で48時間、固定し、1週間、脱灰した。DEXA解析は、GST−RANKL処置群とコントロール群との間で総骨鉱質密度(TBMD)に有意な差を示した(表1を参照のこと)。右および左の大腿骨の骨鉱質密度の比較では、GST−RANKLもしくはコントロール群のどちらにおいても有意な差は見られなかった(表2を参照のこと)。両群の単純X線写真の比較では、骨格の密度に有意な差は見られなかった。
【0139】
(表1.群ごとのBMD)
平均値および標準偏差を報告する。P値は、群間の有意差を検定する。それらは、対応のないt検定に基づいている。
【0140】
【表1】
(表2.片側ごとの大腿骨のBMD)
平均値および標準偏差を、それぞれの群で、右および左の大腿骨に対して報告する。P値は、右および左側の間の有意差を検定する。それらは、対応のあるt検定に基づいている。
【表2】
本発明の他の特徴、目的、利点は、当業者に明らかである。本明細書中に表される説明および図解は、本発明、その原理、およびその実用的な用途を他の当業者に周知させることを意図する。当業者は、特定の用途の要求に最適であるように、多くの形式で本発明を採用および適用し得る。従って、示されたような本発明の特定の実施形態は、網羅することも、本発明を制限することも意図しない。
【図面の簡単な説明】
【0141】
【図1】図1は、下記、実施例1と実施例25で考察した、GST−RANKL融合タンパク質を作成するため用いられるRANKLのマウスcDNAおよびタンパク質の構造および配列である。
【図2】図2は、生理的環境を模した条件下でのGST−RANKL融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。図1を参照のこと。
【図3】図3は、実施例2で考察した、全頭蓋冠器官培養物におけるエキソビボでの骨形成のGST−RANKL刺激の組織像である。矢印は頭頂骨の厚さを示す。
【図4】図4は、実施例2で考察した、インビトロでの骨形成のGST−RANKL刺激による用量依存的な頭蓋冠の厚さの増加をグラフで示す。白棒は1用量のGST−RANKLへの曝露、一方、黒棒は2用量のGST−RANKLへの曝露を示す。
【図5A】図5(a)は、実施例3で考察した、マウスにおけるインビボでの骨形成のGST−RANKL刺激の組織像を低倍率で示す。
【図5B】図5(b)は、実施例3で考察した、マウスにおけるインビボでの骨形成のGST−RANKL刺激の組織像を高倍率で示す。
【図5C】図5(c)は、実施例3で考察した、インビボにてGST−RANKLもしくはコントロールビヒクルを投与した動物の骨鉱質密度を比較した脛骨の骨幹端の二重エネルギーX線吸収(dual energy X−ray absorptiometry:DEXA)解析を示す。スケールバー=1mm。
【図6】図6は、マウス脛骨の高倍率の組織像であり、実施例4で考察した、GST−RANKLを投与した動物の骨芽細胞のインビボにおける活性化を示す。左のパネルの矢印は活性化された骨芽細胞を示し、右のパネルの矢印は扁平な骨表面細胞を示す。
【図7】図7は、実施例5で考察した、動物へのGST−RANKLの制御された投与の効果をグラフで表しており、破骨細胞と活性化骨芽細胞の細胞数を図示する。白棒は破骨細胞数を、黒棒は活性化骨芽細胞数を示す。
【図8】図8は、実施例6で考察した、エキソビボで培養された骨髄細胞における鉱化骨小結節(mineralized bone nodule)形成のGST−RANKL刺激の組織像である。赤い組織化学反応産物は骨芽細胞の鉱化コロニー形成ユニットを示す。
【図9】図9は、実施例4で考察した、インビボでの鉱化骨への二重蛍光色素標識の取り込みを表す。MARは硬質の付加(mineral apposition)、 BFRは骨形成、 (ex)および(en)は、それぞれ頭蓋冠の頭蓋外(exocranial)、 頭蓋内(endocranial)表面を示す。
【図10】図10は、マウスの破骨細胞前駆体におけるGST−RANKLでの細胞処理後のMAPK経路のメンバーの迅速な活性化を表すウェスタン分析像である。活性は、GST−RANKL/RANK相互作用時(0分)および相互作用の後、5分後、15分後、30分後に測定された。上から二段目、四段目、六段目のパネルは、それぞれJNK、p38、およびERKの総レベルを示す。一段目、三段目、五段目のパネルはそれぞれリン酸化(活性化)型のJNK、p38、およびERKを示す。
【図11】図11は、マウスの破骨細胞前駆体におけるGST−RANKLでの細胞処理後のAkt活性を表すウェスタン分析像である。活性化は、GST−RANKL/RANK相互作用時および相互作用の5分後、ならびに15分後に測定された。下段のパネルは、指定の時点の全Aktレベルを示し、上段のパネルはAktのリン酸化型を示す。
【図12】図12は、RANKL単独での処理と比較した、GST−RANKLでの細胞処理後の、マウス骨芽細胞のMAPK経路のキナーゼの延長した活性を示すウェスタン分析像である。リン酸化が測定された時点は、0分(細胞のGST−RANKLもしくはRANKL刺激時)およびGST−RANKL/RANKもしくはRANKL/RANKの結合が起こってから、5分後、10分後、20分後、30分後並びに60分後である。活性が測定されたキナーゼは、ERK、JNK、p38、およびAktを含む。pERKはリン酸化ERK、ERKはERKタンパク質全量、pJNKはリン酸化JNK、JNKはJNKタンパク質全量、pp38はリン酸化p38、p38はp38タンパク質全量、pAktはリン酸化Akt、AktはAktタンパク質全量を表す。上から一段目のパネルはp−IkBαであり、p−IkBαは、リン酸化IkBαを表し、IkBαはIkBαタンパク質全量を表す。
【図13】図13は、GST−RANKLでの細胞処理後の、マウス骨芽細胞前駆体におけるERK1/2の延長した活性を示すウェスタン分析像である。ERK1/2活性を測定した時点は、GST−RANKL/RANKの結合が起こって0分後、5分後、10分後、20分後、30分後、および60分後である。pERKはリン酸化ERK、ERKはERKタンパク質全量を表す。
【図14】図14は、GST−RANKL曝露後のアルカリホスファターゼ(AP)活性をグラフで表す。
【図15A】図15Aは、オリゴマー複合体としてのGST−RANKLを示す一方、切断された(GSTが除かれた)RANKLはオリゴマー形態中に存在しない。(a)は、切断されたRANKLが単一の三量体種(1n)として移動し、一方、GST−RANKLは、非共有結合性に結合した単一の三量体(1n)および動的平衡下にあるオリゴマー(2−100n)ユニットの多分散系混合物として存在することを示す。
【図15B】図15Bは、オリゴマー複合体としてのGST−RANKLを示す一方、切断された(GSTが除かれた)RANKLはオリゴマー形態中に存在しない。(b)は考え得るオリゴマー構造を表す。
【図16】図16は、GST−RANKL/RANK複合体が少なくとも1時間、細胞表面に留まることに対し、切断されたRANKL/RANK複合体は迅速にインターナリゼーションされることを示す共焦点顕微鏡像である。重ねた画像において、RANK(緑色蛍光)と細胞表面(赤色蛍光)の共局在が黄色に見える。
【図17】図17は、GST−RANKL処理に応答したI型コラーゲンの発現を示すアガロースゲル像である。「+」は初代骨芽細胞にGST−RANCLで処理した事を示し、「−」は同処理をしていないことを示す。骨芽細胞は、それぞれ連続した48時間の処理時間の最初の1時間、2時間、4時間もしくは6時間、GST−RANKLに曝露された。8−48時間の間に回収された全ての培養細胞はGST−RANKLに6時間、曝露された。βアクチンの発現は、実験のコントロールとして用いている。
【図18】図18は、GST−RANKLもしくはGST単独(「コントロール」と記す)で処理されたマウスの骨髄におけるCbfa1の発現を示すアガロースゲル像である。下段のパネルはコントロール実験であり、HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ)の発現を示している。
【図19】図19は、GST−RANKL処理に応答した、BrdU(5−ブロモ−2’−デオキシウリジン)の取り込みにより測定された骨芽細胞の増殖のグラフを示す。
【図20A】図20(a)は、ドミナントネガティブERKを形質導入した骨芽細胞が、RSKとして知られるERKの基質をリン酸化できないことを示すウェスタン分析像である。DN−ERKは、ドミナントネガティブERKを示す。LacZはβ−ガラクトシダーゼを示す。
【図20B】図20(b)は、ドミナントネガティブERKを形質導入した骨芽細胞が、GST−RANKLに応答したI型コラーゲンの発現を上方制御することができないことを示すアガロースゲル像である。
【0001】
本発明は米国国立衛生研究所助成金AR32788、AR46123およびDE05413のもとに一部、政府の援助を受けて行われた。政府は本発明の一定の権利を有する。
【0002】
本出願は2001年3月22日、2001年8月9日、2001年10月12日、2001年10月12日、および2001年10月15日に出願されたそれぞれ米国仮特許出願番号60/277,855、60/311,163、60/329,231、60/328,876、および60/329,393の利益を主張する。これらすべては本明細書中に参考として援用される。
【0003】
(発明の分野)
本発明は、1)骨芽細胞または骨芽細胞前駆体における細胞内タンパク質の活性(この活性は骨形成の指標である)を増強する、あるいは2)骨芽細胞または骨芽細胞前駆体におけるホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力を有するRANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物または骨形成性の化合物のうちの1以上のオリゴマー複合体を有効量投与することにより骨形成を増強する方法に関する。
【0004】
本発明はさらに骨の喪失または骨粗鬆症のような疾患によって生じる骨形成の減退の処置、予防または阻害に関する。さらには本明細書中に記載されるオリゴマー複合体または骨形成性化合物の投与による骨形成の増強により、骨折の修復の増強および整形外科的移植片または骨の融合部位への骨の内部成長の増強に関する。
【0005】
本発明はさらに骨形成を刺激するための組成物を提供する。
【背景技術】
【0006】
骨の喪失または薄片化が現れる種々の状態および疾患は重大かつ増大しつづけている健康問題である。骨粗鬆症のみについて、アメリカ人3千万人と世界の1億人ほど多くの人がリスクをかかえていると換算されている。Mundyら、Science,286:1946−1949(1999)。骨の減少をともなうことが既知の他の病状には若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、関節リウマチによる骨の低下、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、転移性の骨疾患、歯周の骨の喪失、癌による骨の喪失、加齢による骨の喪失、およびその他の骨減少症が含まれる。さらに新たな骨形成は多様な状況において必要である。例えば、骨の修復の増強または骨折のための置換、骨欠損、形成外科手術、歯およびその他の移植ならびに同様の状況などである。
【0007】
骨は結合組織の高密度な特殊化した形態である。骨マトリックスはその表面または近くに存在する骨芽細胞により形成される。骨は破骨細胞(マクロファージの一つの型)として知られる別の細胞に再吸収(侵食)される。これらの細胞は酸(骨の鉱質を溶解)とヒドロラーゼ(骨の有機成分を消化)を分泌する。故に骨形成と再構築は骨芽細胞および破骨細胞による生成活性と侵食活性との間の持続的な相互関係を伴う動的過程である。Albertsら、Molecular Biology of the Cell,Garland Publishing,N.Y.(第3版 1994),1182−1186頁。
【0008】
骨の喪失の治療の現在の様式は、骨形成の増強よりむしろ骨吸収過程を阻害するという点で主として抗吸収剤に対するものである。薬剤が骨吸収を阻害する能力により、骨粗鬆症の治療に使用または示唆されている薬剤には、エストロゲン、選択的エストロゲンレセプター調節因子(SERM)、カルシウム、カルシトリオール、カルシトニン(Sambook,P.ら,N.Engl.J.Med.328:1747−1753)、アレンドロネート(alendronate)(Saag,K.ら,N.Engl.J.Med.339:292−299)およびその他のビスホスホネートがある。Luckmanら、J.Bone Min.Res.13,581(1998)。しかしながら抗吸収剤は、結果として頻繁に骨の喪失に関与する骨形成速度を補正できず、骨吸収/再構築の阻害または他の好ましくない副作用に対する抗骨吸収剤の影響に関連する望まない効果を有し得る。
【0009】
骨細胞生物学の分野における重要な発展はストローマ細胞、骨芽細胞、活性化型Tリンパ球、および乳腺上皮細胞で発現しているRANKリガンド(RANKL、あるいはオステオプロテゲリンリガンド(OPGL)、TNF関連活性化誘導サイトカイン(TNF−related activation induced cytokine)(TRANCE)、破骨細胞分化因子(osteoclast differentiationfactor)(ODF)としても知られる)は、マクロファージの破骨細胞への分化に不可欠な独特の分子であるという近年の発見である。Lacey,ら,Cell 93:165−176(1998)(Osteoprotegerin Ligand is a Cytokine that Regulates Osteoclast Differentiation and Activation)。RANKLの細胞表面レセプターはRANK、すなわちReceptor Activator of Nuclear Factor(NF)−κBである。RANKLは約50アミノ酸未満の細胞内ドメイン、約21アミノ酸の膜貫通ドメイン、および約240から250アミノ酸の細胞外ドメインを有する2型膜貫通タンパク質である。RANKLは天然には膜貫通型および可溶性型として存在している。少なくともマウス型、ラット型、およびヒト型のRANKLとその改変型の推定アミノ酸配列が公知である。Andersonら、米国特許第6,017,729号,Boyle,米国特許第5,843,678号およびXu J.ら、J.Bone Min.Res.(2000/15:2178)(参考として本明細書中に援用される)を参照のこと。RANKL(OPGL)は骨吸収の強力なインデューサーとして、および破骨細胞発生のポジティブな調節因子として同定されている。Lacey等(前出)。
【0010】
破骨細胞の分化と活性化を担う因子としての役割に加えて、RANKLがヒト樹状細胞(DC)クラスター形成(Andersonら、(前出))および乳腺上皮発生(J.Fataら「The osteoclast differentiation factor osteoprotegerin ligand is essential for mammary gland development」,Cell,103:41−50(2000))を誘導することが報告されている。しかしながらRANKLが同化性の骨形成過程において役割を果たし得るか、または骨芽細胞の増殖もしくは骨の小結節の石灰化を刺激する方法に用いることができることは以前には知られておらず、予測もされていなかった。
【0011】
従って、破骨細胞と治療目的の破骨細胞の操作について多くの発見が成されたにもかかわらず、骨芽細胞と骨形成に関しては多くは知られていない。故に、一般的に、同化過程を刺激することにより、協調的な吸収より強い程度にまで、骨形成の増強および骨の喪失の予防、もしくは阻害のための方法が求められる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【0012】
(発明の要旨)
従って、骨芽細胞の活性の増強、骨芽細胞表現型への骨芽細胞前駆体の傾倒(commitment)、およびインビボでの骨マトリックスの沈着を含む骨形成を刺激する方法と組成物の提供が本発明の目的である。故に、本方法は、骨形成の増強のため、ならびに骨吸収過程が影響を受けることがあろうとなかろうと、骨形成を増強することにより疾患および骨を喪失する状態の処置のため骨形成の増強に提供される。
【0013】
要約すると、本発明は骨形成を増強する方法に関する。本方法は、1)RANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの1以上のオリゴマー複合体、2)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性(この活性は骨形成の指標である)を増強する能力がある骨形成性の化合物、または3)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体のホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力がある骨形成性の化合物を有効量投与することを必要とする。
【0014】
疾患あるいは少なくとも部分的に骨量の喪失により現れる状態の処置方法も提供する。本方法は、骨形成を増強するために有効量のRANKL融合タンパク質もしくはアナログ、誘導体またはその模倣物を含む薬学的組成物の投与を含む。別の実施形態において、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性(この活性は骨形成の指標である)を増強する能力がある骨形成性の化合物を含む薬学的組成物を使用し得る。さらなる実施形態において、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体のホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力のある骨形成性の化合物を含む薬学的組成物を使用し得る。それにより、骨量の喪失を予防、阻害あるいは緩和することができる。
【0015】
別の局面において、出願人は、骨形成を刺激するための組成物を提供している。組成物は、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤の中に有効量のRANKL融合タンパク質、オリゴマー複合体、もしくはアナログ、誘導体またはその模倣物を含む。さらに、薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤の中に有効量の骨形成性の化合物を含む組成物を提供する。ここで、骨形成性の化合物は、1)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性(この活性は骨形成の指標である)を増強する能力があるか、または2)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体のホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力がある。
【0016】
一つの実施形態として、細胞内タンパク質はIKB−αおよびにIKB−βから選択される。好ましい実施形態では、長期化した活性を示す細胞内タンパク質は細胞内キナーゼを含み、ERK1/2、IKK、PI3キナーゼ、Akt、JNK、およびp38のようなキナーゼがより好ましい。より好ましい実施形態では、キナーゼはERK1/2である。
【0017】
別の好ましい実施形態では、1以上の細胞内タンパク質の活性が前述したタンパク質のリン酸化を構成する。詳細には、リン酸化を受けるタンパク質はERK1/2、IKK、PI3キナーゼ、Akt、JNKおよびp38を含む。より好ましくは、リン酸化をうけるキナーゼはERK1/2である。
【0018】
別の局面において、1以上の細胞内タンパク質の活性は、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体と共に骨形成性化合物をインキュベート後、少なくとも約15分から30分で検出することができる。好ましくは、活性は40分間で検出でき、前述のインキュベート後、少なくとも60分間で検出できる。
【0019】
別の実施形態では、本発明の方法と組成物において骨芽細胞および骨芽細胞前駆体の1以上のホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力がある骨形成性の化合物を使用し得る。好ましくは、前述のホスファターゼは、ERK1、ERK2、IKK、PI3キナーゼ、Akt、JNKおよびp38に特異的なホスファターゼからなる群から選択され、より好ましくは、このホスファターゼは、ERK1/2に特異的なホスファターゼである。別の好ましい実施形態では、不活性化はホスファターゼのリン酸化を含む。
【0020】
本明細書中に記載された方法と組成物に用いられる好ましいオリゴマー複合体はGST−RANKL、AP−RANKL、ロイシンジッパー−RANKLおよびTALL−1の「フラップ(flap)」ドメインを含むRANKL誘導体のオリゴマー複合体を含む。
【0021】
他の目的および特徴は、一部は明白であり、一部は本明細書中下記に示す。
【0022】
(略語と定義)
本発明の理解を容易にするため、多くの用語を以下に定義する。
【0023】
「MAPキナーゼ」もしくは「MAPK」は、本明細書中で交換可能に用いられており、マイトジェン活性化プロテインキナーゼの略語である。
【0024】
「ERK1/2」は、ERK1およびERK2を表し、それぞれ細胞外シグナル調節キナーゼ(extracellular single−regulated kinase)1および細胞外シグナル調節キナーゼ2に対する略語である。
【0025】
JNKは、c−jun N末端キナーゼの略語である。
【0026】
p38は、38kDaのキナーゼであり、キナーゼのMAPKファミリーのメンバーである。
【0027】
Aktは、Aktセリントレオニンキナーゼである。
【0028】
「IKB」は、IκBタンパク質の略語である。従って、IKB−αはIκBαであり、IKB−βはIκBβである。
【0029】
「IKK」は、IκB(IKB)キナーゼに対する略語である。
【0030】
「RSK」は、p90リボソーマルS6プロテインキナーゼに対する略語である。
【0031】
「RANKL」もしくは「RANKリガンド」は、本明細書中に交換可能に用いられており、RANK(Receptor Activator of NFκB)のリガンドを示す。
【0032】
「AP」は、アルカリホスファターゼに対する略語である。
【0033】
「GST」は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼに対する略語である。
【0034】
「HPRT」は、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼに対する略語である。
【0035】
「Cbfa1」は、コア結合因子1(core binding factor 1)に対する略語である。
【0036】
「LacZ」は、β−ガラクトシダーゼに対する略語である。
【0037】
「骨形成能」もしくは「骨形成活性」は、本明細書中に交換可能に用いられており、骨形成アッセイで測定されるような骨形成を増強する能力がある任意の化合物を指す。
【0038】
「BrdU」は、5−ブロモ−2’−デオキシウリジンに対する略語である。
【0039】
「TALL−1」は、「TNFおよびAPOLに関連する白血球発現リガンド1(TNF−and APOL−ralated leukocyte expressed ligand 1)」タンパク質に対する略語である。
【0040】
用語「有効量」は、統計的に有意な効果をもたらす問題の物質の量を意味する。例えば、治療に用いる「有効量」は、骨折の修復の治癒速度の臨床的に有意な増加、骨粗鬆症における骨の喪失の逆転もしくは阻害、骨粗鬆症の発症の予防もしくは遅延、骨折の癒着不能および骨延長法(distruction osteogenesis)における骨形成の刺激および/もしくは増強、プロテーゼデバイス内への骨の成長の増加および/または加速、歯の欠損の修復もしくは予防、または本明細書上記で考察されているものを含む(限定されるものでない)他の骨の喪失状態、疾患もしくは欠損の処置または阻害をもたらすために求められる、本明細書中に記載された活性化合物を含む組成物の量である。このような有効量は慣用的な至適化方法を用いて決定され、処置される特定の症状、患者の状態、投与の経路、製剤形態および開業医の判断なたびに当業者に明白である他の要因に依存する。本発明の化合物に要求される投薬量(例えば、骨形成の増加が望まれる骨粗鬆症において)は、処置群とコントロール群の間で統計的に有意な骨量の差異を引き起こす投薬量として明示される。この骨量の差異は、例えば、少なくとも1−2%、もしくは処置群における臨床的に有意な骨量の増加として見られ得る。治癒における臨床的に有意な増加の他の測定法としては、例えば、I型コラーゲンのN末端プロペプチドに対するアッセイ、破壊強度と張力、破壊強度とねじれ、4点屈曲(4−point bending)、骨の生検において増加した結合性についての試験および当業者に周知の他の生体力学の検定法が挙げられ得る。処置レジメンの一般的な方針は、目的の疾患の動物モデルにおいて実施される実験から得られる。
【0041】
本明細書中に用いられている様に、「処置」は、予防法と治療法両方を含む。故に、被験体を処置するにあたって、本発明の化合物は、既に骨量の喪失に苦しんでいる被験者に、もしくはその様な状態の発症を予防または阻害するために投与され得る。
【0042】
(発明の詳細な説明)
本発明に従って、本出願人は、RANKL融合タンパク質のオリゴマー複合体、特にGST−RANKLのオリゴマー、もしくはその改変体、アナログ、誘導体および模倣物が、活性化骨芽細胞数の純増加を刺激し、骨形成の同化過程を促進するような量および方法で投与できることを開示している。このような発見は、骨の置換もしくは修復を容易にするのに有用な方法のため、ならびに骨形成の同化過程を刺激することにより骨量の喪失を伴う疾患もしくは状態の処置のための基礎を提供する。
【0043】
下記の詳細な説明は、本発明を実施するにあたり、当業者を補助するため提供される。そうであっても、この詳細な説明は、本発明の開示の精神もしくは範囲から逸脱することなく、本明細書中で考察される実施形態における修飾および改変が、通常の技術を持つ当業者により成され得るので、過剰に本発明を制限するよう構成されるべきではない。
【0044】
本出願において引用された全ての刊行物、特許、特許出願、データベース、および本明細書中に引用された他の参考文献は、それぞれ個別の刊行物、特許、特許出願、データベースもしくは他の参考文献が明確に、および個別に参考として援用されるように、その全体が本明細書に参考として援用される。
【0045】
RANKL、そのフラグメント、改変体、アナログ、模倣物、融合産物および前記の化合物のオリゴマー複合体(本明細書中で教示されるように、オリゴマー複合体は骨形成を増強する能力を持つ)の選択および/もしくは合成は、当業者の能力内であり、本発明の範囲内であることが意図される。例えば、Boyle(前出)は、RANKL(「オステオプロテゲリン結合タンパク質」と呼ばれる)の多様な形態の合成の詳細な考察を提供しており、例えば、マウス型およびヒト型改変型、RANKLの組換え型、RANKLフラグメント、RANKLのアナログ、模倣物および誘導体、ならびにその融合タンパク質を開示している。(グリコシル化タンパク質のような)翻訳後修飾をうけたRANKLの誘導体もしくはアナログ、ならびに高ストリンジェンシーの条件下でRANKL cDNAのポリペプチドコード領域の一部もしくは全部にハイブリダイズことが示された核酸によりコードされるポリペプチドは、本発明の範囲に含まれる。BoyleおよびAndersonら(前出)を参照のこと。マウス型RANKL核酸およびアミノ酸配列は、本明細書中において、それぞれ配列番号1および配列番号2として提供されている(図1参照)。しかしながら、他の生物種由来のRANKL配列が、同定され、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/で入手可能である。例えば、ヒト型RANKL核酸およびアミノ酸配列は、次の登録番号AF019047およびAAB86811に該当する。例えば、ラット型RANKL核酸およびアミノ酸配列は、次の登録番号NM_057149およびNP_476490に該当する。従って、任意のRANKL分子が本発明の方法において使用され得、それ故、これらは本発明の範囲内であることが意図される。
【0046】
RANKLおよび関連分子は、当該分野において周知の手順を用いて、コードしている核酸配列を含む適切な発現ベクターにおいて、本発明のペプチドをコードする核酸分子を使用することによって、合成することが出来る。そのようなDNA分子は、調製され、次に、例えば、自動DNA配列解析および遺伝コードの周知のコドン−アミノ酸の関係を用いて解析され得る。そのようなDNA分子は、オリゴヌクレオチドプローブおよび従来のハイブリダイゼーション方法論を用いて、ゲノムDNAもしくはcDNAとしても獲得され得る。そのようなDNA分子は、細菌(例えば、Esherichia coli)、酵母細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞株のような適切な宿主におけるDNAの発現とポリペプチドの産生に適合した発現ベクター(プラスミドを含む)に組み込まれ得る。例えば、実施例1および実施例25を参照のこと。融合タンパク質を含む、このような組換えタンパク質の産生方法は、当該分野において周知であり、本明細書中に参考として援用されるSambrookら、Molecular Cloning,第2版.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 および Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology,第3版.,Wiley and Sons,1995、ならびに改定版、の様な標準的な分子生物学の参考文献に見出され得る。
【0047】
さらに、ポリペプチドの活性を完全に失うことなく、特定の改変が成されることが公知である。改変としては、アミノ酸の除去、置換および付加が挙げられる。他の改変を含むポリペプチドは、当業者により合成され得る。故に、ポリペプチドの有効性は、アミノ酸配列もしくは構造の多様な変更を介して改変され得る。
【0048】
さらに、前述のアナログもしくは模倣物は、可溶性、安全性もしくは有効性のような特性を改良するため、当該分野で公知の方法を用いて改変され得ることが理解されるべきである。これらの好ましい化合物の必須の特性は、本明細書中に記載された出願人らの方法に従って使用された場合、骨形成を刺激する能力である。
【0049】
出願人らは、GST−RANKLのオリゴマーの投与が骨形成の同化過程の促進を起こすことを開示した。実施例1および図2で示すように、サイズ排除クロマトグラフィーは、RANKL融合タンパク質が生理的条件下でオリゴマー複合体として存在し得ることを示す。GST−RANKLのオリゴマーは、RANKLおよびGSTのそれぞれ二量体化および三量体化する傾向の結果として、形成されると考えられている。従って、GST以外の他の融合パートナーが、RANKL含有オリゴマー複合体形成に使用され得る。好ましい融合パートナーとして、アルカリホスファターゼ、ロイシンジッパーが挙げられるが、オリゴマー構造を形成する傾向を持つ他の任意のタンパク質も本発明の範囲内であることが意図される。好ましい実施形態において、RANKL融合パートナーは、RANKLのN末端に付加される。オリゴマー複合体を形成するため用いられるGST−RANKLの形成は、実施例1およびに実施例25に記載される。さらに、周知の技術により、RANKLオリゴマーの他の形態を作製することは、当業者の能力内である。例えば、当業者は、自己会合および/もしくは高次の複合体を形成する内在性の傾向を有する別のタンパク質あるいはポリペプチドを用いて、RANKLオリゴマーを構築し得る。当業者は、化学修飾により、もしくは多コピーが連結したRANKLのポリマー型(例えば、真珠の鎖に似ている)を合成することによりその様なオリゴマーを作製し得る。そのような別の実施形態もまた、本発明の範囲内である。
【0050】
アルカリホスファターゼ(AP)は、GSTと同様に、二量体化する傾向を有する。APは、全ての生物に共通する酵素の大きなファミリーを構成する。ヒトは、APの4つのアイソフォームを持ち、それらの3つは組織特異的であり、1つは非特異的で、骨、肝臓および腎臓に見られ得る。これらの3つの組織特異的APは、胎盤AP(PLAP)、生殖細胞AP(GCAP)、および腸APを含む。アミノ末端AP−RANKLの構築は、GST−RANKL融合タンパク質の構築と同様に実施され得る。使用され得るアルカリホスファターゼの例は、登録番号AAA51710、AAA51707、AAC97139、AAL17657、P24823、およびAAA37531に対応する、ヒト型胎盤AP−1、ヒト型胎盤AP−2、ヒト型胎盤AP前駆体、マウス型分泌型AP、マウス型胚AP前駆体、およびマウス型胚APを含むが、それらに限定されない。一つの好ましい実施形態において、ヒト型胎盤アルカリホスファターゼが使用されるが、ヒトかまたはMus musculusのような他の哺乳類種から単離された他のAPが、使用され得る。多くの異なるアルカリホスファターゼの使用は、全てのAPの二量体化する能力のため、可能であると考えられる。要約すると、所望のAPのアイソフォームをコードするcDNAは、cDNAライブラリーから単離され得、結果として生じるDNA配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクター(例えば、pcDNA3.1)中のRANKL cDNAの上流(アミノ末端)でスプライスされ得る。AP−RANKLを含むヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、当該分野において周知である任意の形質移入もしくは形質導入技術により、目的の宿主細胞に導入できる。実施例17も参照のこと。
【0051】
あるいは、RANKL融合タンパク質は、ロイシンジッパードメインの様な、オリゴマー化する能力を有するペプチドを含み得る。ロイシンジッパーは、いくつかのDNA結合タンパク質で最初に発見された。(Landschultzら、Science 240:1759,1988)。ロイシンジッパードメインは、これら(および他の)タンパク質中に存在する保存されたペプチドドメインを称するために使用される用語であり、タンパク質二量体化の原因となる。ロイシンジッパードメインは、、他のアミノ酸間に散在する4個もしくは5個のロイシン残基を有する反復性の7価リピート(heptad repeat)を含む。ロイシンジッパードメインの例は、酵母の転写因子GCN4およびラットの肝臓に見られる熱安定DNA結合タンパク質(C/EBP;Landschulzら、Science 243:1681,1989)に見られるものである。
【0052】
ロイシンジッパードメインは、短く平行なコイルドコイルとして折り畳まれることが公知である。(O’Sheaら、Science 254:539;1991)。一般的な平行コイルドコイルの構造は、1953年にCrickにより提案された「ノブズ−イントゥ−ホールズ(knobs−into−holes)」パッキング(Acta Crystallogr.6:689)で良く特徴づけられている。ロイシンジッパードメインにより形成された二量体は、McLachlanおよびStewart(J.Mol.Biol.98:293;1975)の概念に従い、(abcdefg)nで示される7価リピートにより安定化される(残基aおよびdは、一般的に疎水性残基であり、dがロイシンにあたり、螺旋の同じ面に並ぶ)。逆の電荷を有する残基は、通常gおよびe位に存在する。故に、平行コイルドコイルは、二つの螺旋状のロイシンジッパードメインから形成され、第1の螺旋の疎水性側鎖により形成される「ノブ」は、第2の螺旋の側鎖の間に形成される「ホール」に充填される。
【0053】
いくつかの研究は、保存的なアミノ酸は、二量体化する能力の最小の減少で個々のロイシン残基と置き換えられ得るが、多重の置換は、通常この能力の欠損を生じることを示している。(Landschulzら、Science 243:1681,1989;TurnerおよびTjian,Science 243:1689,1989;Huら、Science 250:1400,1990)。van Heekerenらは、多くの異なるアミノ残基がGCN4のロイシンジッパードメインのロイシン残基と置換され得ることを報告し、さらに、2つのロイシンの置換を含む数個ののGCN4タンパク質は弱く活性を有することを見出した。(Nucl.Acids Res.20:3721.1992)。
【0054】
GCN4のロイシンジッパードメインに相当する合成ペプチドのaおよびd残基におけるアミノ酸置換は、ロイシンジッパードメインのオリゴマー化の性質を変化させることがわかっている。(Alber,Sixth Symposium of the Protein Society,San Diego,Calif.)。全てのa位の残基がイソロイシンに変更される場合、ロイシンジッパーはなおも、平行な二量体を形成する。この置換に加え、全てのd位のロイシン残基もまたイソロイシンに変更される場合、結果として生じたペプチドは、溶液中で三量体化した平行コイルドコイルを自発的に形成する。全てのd位のアミノ酸をイソロイシンへ、a位のアミノ酸をロイシンへの置換により、四量体化したペプチドを生じる。これらの置換を含むペプチドもまた、ロイシンジッパードメインと呼ばれる。しかしながら、好ましい実施形態において、タンパク質を二量体化し得るロイシンジッパーが、RANKL融合パートナーとして用いられる事が、指摘されるべきである。RANKL−ロイシンジッパー融合タンパク質の構築は、GST−RANKLおよびAP−RANKLと同じ方法で実施され得る。実施例18を参照のこと。細菌に加え、哺乳動物細胞株および昆虫細胞のような他の適切な発現システムも使用され得る。当業者は、ロイシンジッパー−RANKL融合タンパク質を発現するため必要な修正を容易に行い得る。
【0055】
別の実施形態として、RANKL誘導体は、オリゴマー複合体を形成するため、使用され得る。最近、新たに見出されたTNFリガンドファミリーのメンバー、TALL−1(BAFF、THANK、BLyS、およびzTNF4としても知られる)が生理的条件下でオリゴマー形成する能力を有する事が発見された。(Liuら、Cell,108:383−394,2002)。Liuらは「フラップ(flap)」領域(フラップを形成し、フラップを分子から拡がらせるループの長さによりそう名づけられた)が、三量体−三量体相互作用およびその後のクラスター形成を媒介することを示している。このフラップ領域は、TNFファミリーのメンバーのなかで、TALL−1に固有であり、これまでに発見されている他のTNFファミリータンパク質のどのDEループよりも長い表面DEループ(TALL−1のD鎖およびE鎖を連結するループ)により作られる。オリゴマー化は、長いDEループと周囲のTALL−1分子の非共有結合性の相互作用を介して起こり、その結果、大きなクラスターの形成を生じると考えられる。RANKLおよびTALL−1は共にTNFリガンドファミリーのメンバーであり、同様のβ鎖コア構造を有するので、本発明に従い、RANKLは、生理的条件下で自発的にオリゴマー形成する変異型RANKL分子を作るように変異される。一つの実施形態において、RANKLの改変は、そのDEループ(アミノ酸配列SIKIPを含むアミノ酸245〜249)がTALL−1のDEループ(アミノ酸配列KVHVFGDEL)で置換されるように設計される。実施例19を参照のこと。さらにTALL−1のオリゴマー化ドメインを反復発生させるため、RANKL分子全体にわたって、次のアミノ酸置換が成され得る:168T→I、187Y→L、194K→F、212F→Y、252H→V、279F→I、および283R→E。実施例20を参照のこと。変異は、PCRで駆動させる部位特異的変異誘発により(例えば、QuickChange Multi−Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社から入手可能)を用いて)RANKLに導入され得る。そのような改変RANKLのオリゴマー化能を測定するため、サイズ排除クロマトグラフィーのような、GST−RANKLを調べるものと同じアッセイを用いることができる。当業者は、過度の実験なく、前述の変異を作製し、変異を導入されたRANKLの構造と機能とを試験することができる。
【0056】
出願人らにより教示されているように、ヒトおよびに動物の患者での骨形成の促進における本発明のオリゴマー性RANKL複合体の有効性を測定するため、インビトロもしくはインビボアッセイが使用され得る。インビトロ結合アッセイのために、骨芽細胞様細胞は、使用され得る。適切な骨芽細胞様細胞には、初代骨髄ストローマ細胞、初代骨芽細胞、ST−2細胞、C1細胞、ROS細胞、およびMC3T3−E1細胞が含まれるが、これらに限定されない。細胞株の多くは、American Type Culture Collection,Rockville,Md.より入手可能であり、標準の特定の増殖培地中で維持できる。インビトロ機能アッセイのために、オリゴマー複合体は、一定範囲の濃度の化合物と共に細胞を培養すること、および骨芽細胞の活性化、骨マトリックスの沈着、頭蓋冠の厚さおよび骨の小結節の形成のような骨形成のマーカーもしくは指標を評価することにより、検定できる。下記の実施例2を参照のこと。加えて、骨芽細胞の増殖、I型コラーゲンの発現および/もしくはCbfa1の発現は、骨形成の評価に使用され得る。下記の実施例14を参照のこと。
【0057】
さらに、化合物での骨芽細胞の処理の一般的なプロトコルは、当該分野で十分に確立されている。例として、Wyattら,BMC Cell Biology,2:14,2001を参照のこと。この文献において選択された細胞株は、MC3T3−E1であり、この細胞株は、骨芽細胞の分化および成熟のインビトロモデルとして用いられている。細胞の処理は、この場合ではBMP−2を用い、下記の方法で実施された。細胞は、5%ウシ胎仔血清、26mM NaHCO3、2mM グルタミン、100u/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを補充したα−MEM培地中で、25cm2のプラスチック培養フラスコにおいて5000/cm2でプレーティングされ、加湿された5%CO2/95%大気、37℃において増殖された。細胞は、PBS中で0.002%プロナーゼEを含むPBSで剥がされた後、3日から4日おきに継代された。処理群の細胞は、24時間増殖され、次いで、4mM HClおよび0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBSに溶解したBMP−2(50ng/ml)と共に、37℃にて、24時間および48時間、インキュベートされた。コントロール群は、等量のビヒクルのみで処理された。
【0058】
GST−RANKLのようなオリゴマーでの骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の処理の例示的な条件は、下記に記載される。骨芽細胞前駆体は、ビヒクル、GST(ネガティブコントロール)、もしくは漸増濃度の精製されたオリゴマーGST−RANKL(例えば、1ng/mlから100ng/mlの範囲にわたる濃度)の存在下でインキュベートされる。骨形成促進タンパク質(Bone morphogenetic protein(BMP))−2は、ポジティブコントロールとして投与される。試験組成物は、培養開始時のみ12時間、もしくは開始時に1回と3日後に1回(これもまた12時間)、投与される。用いられる条件は、使用される細胞株および化合物、それらのそれぞれの量、ならびにプレーティングする条件および培地の組成のようなさらなる要因により変動することに留意すべきである。そのような調整は、当業者により容易に決定される。
【0059】
さらに、出願人らの方法に従い、骨形成を増強するオリゴマーRANKL組成物は、種種の動物モデルにおいて評価され得る。実施例3〜実施例6および下記の記述を参照のこと。
【0060】
一般に使用されるアッセイは、新生マウス頭蓋冠アッセイである。要約すると、出生後4日目に、ICR Swiss whiteマウスの新生仔の前頭および頭頂骨は、微小切開により取り出され、矢状縫合に沿って分割される。次いで、骨は、指定の培地中でインキュベートされる。その培地は、試験化合物もしくはコントロール化合物のどちらかを含む。インキュベーション後、骨は培地から取り出され、10%緩衝ホルマリン中で24時間〜48時間固定され、14%EDTA中で1週間脱灰され、段階的なアルコールで処理され、そしてパラフィンワックスに包埋される。頭蓋冠の3ミクロンの切片が調製され、骨形成もしくは骨吸収の組織形態計測解析を用いて評価される。骨の変化は、200ミクロン隔てて切られた切片において測定される。骨芽細胞および破骨細胞は、それらの異なる形態により識別される。
【0061】
このアッセイに加えて、マウス頭蓋冠の骨の成長における化合物の効果は、インビボにおいても試験され得る。このスクリーニングアッセイの一例において、4週齢〜6週齢の雄のICR Swiss whiteマウスが使用され、一群あたり4匹〜5匹のマウスが使用される。要約すると、試験化合物もしくは適切なコントロールは、正常マウスの右側頭蓋冠上の皮下組織に注入される。マウスは、14日目に屠殺され、骨の成長は、組織形態学計測の方法により、測定される。骨の試料は、隣接する組織を取り除かれ、10%緩衝ホルマリン中で24時間〜48時間固定され、14%EDTA中で1週間〜3週間脱灰され、段階的なアルコールで処理され、パラフィンワックスに包埋される。頭蓋冠の3ミクロン〜5ミクロンの切片が調製され、代表的な切片は、骨形成および骨吸収の効果の組織形態計測の評価のため、選択される。切片は、顕微鏡像をデジタル化したプレート上に直接、記録するため、カメラルシーダ部品(camera lucida attachment)を使用して、測定される。骨の変化は、頭蓋冠の注入した側および注入しなかった側の両方において、200ミクロン隔てて切られた切片の4箇所の隣接した1×1mm領域で測定される。新しい骨は、その特徴的な色の特性によって識別され、破骨細胞と骨芽細胞とは、それらの異なる形態により、識別される。組織形態計測のソフトウェア(OsteoMeasure,Osteometrix,Inc.,Atlanta)は、細胞数を決定し、そして面積もしくは境界線を測定するためにデジタル化入力を処理するために使用され得る。
【0062】
さらなるインビボアッセイは、インタクトな動物での投薬アッセイ、急性卵巣摘出(ovariectomized:OVX)(予防モデル)動物での投薬アッセイ、および慢性OVX動物(処置モデル)での投薬アッセイを含む。インタクトな動物での原型的な投薬は、例えば、皮下、腹腔内、経上皮、もしくは静脈内投与により実施され得、そして注射、もしくは他の送達技術により実施され得る。試験化合物の投与の期間は、変動し得る(例えば、28日間ならびに35日間が適切であり得る)。例として、下記に記載のあるように、インビボ経上皮もしくは皮下投与アッセイが実施され得る。
【0063】
代表的な研究では、70匹の3ヶ月齢、雌Sprague−Dawleyラットが、体重を揃えられ、各群10匹の動物として7群に分けられる。これは、実験開始時に屠殺される動物のベースラインコントロール群、ビヒクルのみを投与されるコントロール群、PBSで処置されるコントロール群、および骨の成長を増強することが公知の化合物を投与されるポジティブ群を含む。3種の投薬量の試験化合物は、残りの群に投与される。試験化合物、PBS、およびビヒクルは、35日間、1日1回、皮下に投与される。全ての動物は、屠殺される9日前および屠殺される2日前に、(新たに形成された骨の適切な標識を確保するため)カルセインを注入される。体重は、週ごとに測定される。35日間の最後に、動物は、体重を測られ、眼窩もしくは心臓の穿刺により、採決される。血清カルシウム、リン酸、オステオカルシン、およびCBCが、測定される。末梢骨用定量的コンピューター断層撮影法(peripheral quantitative computed tomography:pQCT;Ferretti,J,Bone,17:353S−364S,1995)、二重エネルギーX線吸収法(dual energy X−ray absorptiometry:DEXA;Laval−Jeantet A.ら、Calcif Tissue Intl,56:14−18,1995,およびCasez J.ら、Bone and Mineral,26:61−68,1994)および/もしくは組織形態計測により実施されるような評価のために、脚の骨(大腿骨および脛骨)ならびに腰椎の両方は、取り出され、付着している軟組織を取り除かれ、70%エタノール中もしくは10%ホルマリン中に保存される。骨の再構築における試験化合物の効果は、このようにして評価され得る。
【0064】
試験化合物は、急性の卵巣摘出動物においてもアッセイされ得る。そのようなアッセイは、コントロールとしてエストロゲン処置群も含み得る。これらの動物の試験の例は、下記に簡単に記載される。
【0065】
代表的な研究では、80匹の3ヶ月齢、雌Sprague−Dawleyラットが、体重を揃えられ、各群10匹の動物として8群に分けられる。これは、実験開始時に屠殺される動物のベースラインコントロール群、3種のコントロール群(偽OVXおよびビヒクルのみ、OVXおよびビヒクルのみ、ならびにOVXおよびPBSのみ)、骨量を増強することが公知の化合物を投与されるコントロールOVX群を含む。3種の投薬量の試験化合物は、OVX動物の残りの群に投与される。
【0066】
卵巣摘出は、摂食亢進を引き起こすので、35日間の研究を通して、全てのOVX動物は、偽OVX動物と同時飼育される。試験化合物、ポジティブコントロール化合物、PBSもしくはビヒクルのみは、35日の間、1日1度、経上皮または皮下に投与される。代替として、試験化合物は、35日間埋め込むことができる移植可能なペレット剤として処方され得るか、もしくは、経鼻投与のように経上皮投与され得る。全ての動物は、屠殺される9日前および屠殺される2日前を含む(しかし、限定されない)実験的に決定された間隔でカルセインを注入される。体重は、週ごとに測定される。35日周期の最後に、その動物の血液および組織を、上記に記載したように処理する。
【0067】
試験化合物は、慢性のOVX動物においてもアッセイされ得る。要約すると、80匹から100匹の6ヶ月齢、雌Sprague−Dawleyラットは、実験開始時に、偽の外科手術(偽OVX)、もしくは卵巣摘出術(OVX)を施され、それと同時に、10匹の動物は、ベースラインコントロールとして供するために屠殺される。体重は、週ごとに測定される。骨を欠乏させて約6週間もしくはそれ以上後に、10匹の偽OVXおよび10匹のOVXラットは、欠乏期間のコントロールとするため、屠殺用に無作為に抽出される。残りの動物のうち、10匹の偽OVXおよび10匹のOVXラットは、プラセボ処置コントロールとして、使用される。残りの動物は、3用量〜5用量の試験化合物で35日間、処置される。本モデルにおいて、OVXラットの一群は、ポジティブコントロールとして、PTHのような公知の同化作用性の薬剤で処置され得る(Kimmelら、Endocrinology,132:1577−1584,1993)。実験の最後で、動物は屠殺され、大腿骨、脛骨、および第1腰椎〜第4腰椎は切除され、集められる。近位の左および右脛骨は、pQCT測定、海綿骨質密度(cancellous bone mineral density:BMD)、および組織像に用いられ、一方、それぞれの脛骨の骨幹中部(midshaft)は、皮質のBMDもしくは組織像に用いられる。大腿骨は、生体力学の試験をする前に、骨幹中部のpQCTスキャンのため調製される。腰椎(lumbar vertebrae:LV)に関しては、LV2は、BMDのため処理され(pQCTも実施され得る)、LV3は、脱灰していない骨の組織像のため調製され、ならびにLV4は、力学試験のため処理される。
【0068】
さらなる実施形態において、出願人は、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体において、オリゴマーRANKLとそのレセプターRANKの間の相互作用が、細胞内タンパク質の延長した細胞内活性を生ずることを発見している。マウス骨芽細胞は、インビトロでGST−RANKLで処理された場合、NFκBおよびERK細胞内シグナル経路の活性化で特徴付けられるような活性化を示した。出願人により言及されているように、細胞内タンパク質活性、特にERK活性の時間経過は、細胞表面にRANKも発現している破骨細胞前駆体の時間経過とは異なっている。破骨細胞前駆体において、ERK活性は、RANK/GST−RANKL相互作用の5分〜10分後に最高に達し、15分〜30分後に基底レベルに戻る。対照的に、骨芽細胞のERK活性は、同じ相互作用の10分後に最高に達し、60分後でもまだ基底レベルより高い。時間経過の延長化は、骨芽細胞前駆体において、さらに顕著であり、ここで、示されたERK活性は、RANK/オリゴマーGST−RANKL相互作用の60分後でも最高に達していなかった。異なるERK活性の時間経過に加え、骨芽細胞および骨芽細胞前駆体は、IKK、PI3キナーゼ、Akt、p38およびJNKのようなキナーゼの延長した活性も示す。この骨芽細胞に関連した活性は、MAPキナーゼの短命な活性および骨吸収を生じる、破骨細胞におけるGST−RANKLとRANKとの相互作用と対照をなしている。したがって、特定の学説に拘束されないが、骨芽細胞においてオリゴマーGST−RANKL刺激後に見られるキナーゼの延長した活性は、同化的な骨プロセスにおいて機能していると考えられる。
【0069】
TNFファミリーのサイトカインに誘導される細胞内シグナル伝達は、レセプター−リガンド複合体のインターナリゼーションによって、弱められることが公知である。(例えば、Higuchi,MおよびAggarwal,B.B.,J.Immunol.,152:3550−3558,1994参照のこと)。それ故、出願人は、RANKL含有オリゴマー複合体が、RANKL三量体と同様に早期のうちにインターナリゼーションされず、従ってレセプターとのより長い相互作用および延長した細胞内シグナル伝達を許容する、と考えている。図16および実施例13を参照のこと。
【0070】
従って、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体において、1以上の細胞内タンパク質の活性を増強する能力をもつ骨形成性化合物(活性が骨形成の指標になる)は、本発明の方法に使用され得る。活性化される細胞内タンパク質はキナーゼを含むが、それに限定されない。好ましくは、キナーゼは、ERK1/2、JNK、PI3キナーゼ、IKK、Akt、およびp38を含み、さらにより好ましくは、キナーゼは、ERK1/2である。他の細胞内タンパク質は、IKB−α、IKB−βを含む。
【0071】
別の好ましい実施形態において、活性は、1以上の細胞内タンパク質のリン酸化を含み、さらに好ましくは、キナーゼのリン酸化を含む。MAPキナーゼファミリーにとって、完全な活性化は、グルタミン酸残基によって隔てられたチロシン残基とトレオニン残基(TEYモチーフとして公知であり、Tはトレオニン、Eはグルタミン酸、そしてYはチロシンである)のMAPキナーゼキナーゼ(MAP kinase kinase:MKK)として公知である単一の上流のキナーゼによる二重のリン酸化を必要とする。二重のリン酸化の必要条件により、確実にMAPキナーゼがMKKの作用により特異的に活性化される。
【0072】
キナーゼがリン酸化されてるか否かを測定する技術的に利用可能などのようなアッセイも、使用され得る。好ましくは、そのようなアッセイは、ウェスタン分析法もしくはキナーゼアッセイを含む。
【0073】
ウェスタン分析法は、一般的に下記のように実施される。一旦、細胞溶解物が、調製されると、細胞内タンパク質は、SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を利用してサイズを基に分離される。分離されたタンパク質は、エレクトロブロティング法により、タンパク質が接着する適切なメンブレン(例えば、ニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン)に移される。メンブレンは、非特異的なシグナルを低減するため洗浄され、その後、RANKシグナル伝達の結果としてリン酸化された特定のアミノ酸のみを認識する抗体を用いて調べられる。さらに、余分な抗体を除く洗浄の後、(メンブレン上の特異的にリン酸化されたタンパク質に結合している)一次抗体を認識し、レポーター部分を含む二次抗体がメンブレンに加えられる。二次抗体のレポーター部分と相互作用する発色試薬の添加は、バンドの可視化を起こす。
【0074】
キナーゼアッセイ(例えば、ERK1/2に対する)は、p90リボソームS6プロテインキナーゼ(RSK)のような、このキナーゼに対する公知の基質を用いて、実施できる。要約すると、例として、処理された骨芽細胞は、氷冷のPBSで(例えば3回)洗浄され、細胞溶解物を得るため、溶解緩衝液で抽出される。細胞溶解物の微小遠心の後、得られた上清は、プロテインGセファロースとともにヤギ抗RSK2抗体(1:200)と4℃で1晩、インキュベートされる。ビーズは、微量遠心により回収され、溶解緩衝液で2回、続いてキナーゼ緩衝液で洗浄される。ビーズ中のRSK2ホスホトランスフェラーゼ活性は、S6キナーゼアッセイキットおよび[γ−32P]ATPを使用して、製造元(Upstate Biotechnology,Inc)より提供されるプロトコルに従い、測定される。
【0075】
骨芽細胞の活性化を測定するために応用できる別途のアッセイは、電気泳動移動度ゲルシフトアッセイ(electrophoretic mobility gel shift assay:EMSA)である。このアッセイは、(GST−RANKLでの骨芽細胞活性化後のNFκBのような)転写因子複合体の核移行を観察する。要約すると、EMSAは、次のように実施される。処理された骨芽細胞の核は、単離され、その抽出物が作製される。その後、核タンパク質は、32Pオルトリン酸で標識された特異的なオリゴヌクレオチドプローブとともにインキュベートされる。適切な時間後、推定されるタンパク質−DNA複合体は、(SDSを含まない)PAGEゲルで分離され、そのゲルは乾燥され、X線フィルムに露光される。もし、特異的な複合体(このケースではNFκBと特異的なDNA配列の複合体)が形成されていれば、現像されたフィルム上にバンドが認められる。典型的には、適切なコントロールは、そのバンドが活性化された骨芽細胞に特異的であることを確定するため、実験試料と同時に泳動される。ウェスタン分析法、キナーゼアッセイ、およびEMSAの詳細な手順は、例としてLaiら、Journal of Biological Chemistry,276(17):14443−14450,April 27,2001参照のこと。
【0076】
骨芽細胞における活性化は、細胞をGST−RANKLのようなオリゴマーとインキュベートした後、少なくとも60分まで検出できる。骨芽細胞前駆体においては、活性化は5分から10分後に最高に達し、少なくとも60分後までの間、検出可能である。従って、1以上の細胞内タンパク質の活性は、骨形成性化合物を骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体とインキュベートした後、少なくとも約30分までに検出し得る。好ましい実施形態において、活性は、前記のインキュベーション後、少なくとも約40分で、より好ましくは、少なくとも約60分で検出される。別の好ましい実施形態において、活性が少なくとも約30分で検出される細胞内タンパク質は、キナーゼであり、より好ましくは、ERK1/2である。
【0077】
骨芽細胞を活性化および/もしくは骨芽細胞前駆体の分化を刺激する化合物が同化性の骨プロセスを増強し得ることを確認するため、そのような化合物を骨形成アッセイにおいて、試験することができ、ここでバックグラウンドの骨量における増加を上回る骨量における増加は、化合物が骨形成活性を有することを表す。本発明の潜在的な骨形成化合物をうまくスクリーニングするため用いられ得る複数の骨形成アッセがある。例えば、コラーゲンのレベルおよびアルカリホスファターゼ活性の測定に基づく骨芽細胞の分化と機能について細胞をベースとしたアッセイは、使用され得る。これらのアッセイは、当該分野で周知であり、当業者により容易に実施される。さらに、複数のインビトロおよびインビボアッセイは、上記の項に記述されている。骨芽細胞と骨芽細胞前駆体の両方とも、GST−RANKLのようなRANKLの同化型での刺激後、同じキナーゼの延長した活性を示すので、インビトロ骨形成アッセイは、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体のどちらでも実施し得る事は言及されるべきである。
【0078】
細胞内活性化アッセイおよび骨形成アッセイが化合物のライブラリーで実施される場合、骨形成性が示されている化合物を確実に同定することが必要であり得る。化合物の同一性の決定には、複数の方法がある。一つの過程は、Neogenesis社(http://www.neogenesis.com)から入手可能な質量分析装置を含む。NeogenesisのALIS(自動化リガンド同定システム(automated ligand identification system))スペクトル検索エンジンおよびデータ解析ソフトウェアは、リガンドの正確な質量に基づくリガンド構造の高度に特異的な同定を可能にする。当業者は、化合物の同一性を決定するため質量分析実験を実施し得る。
【0079】
別の実施形態において、骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体における1以上のホスファターゼを不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)し得る骨形成性化合物は、本発明の方法において使用され得る。一つの好ましい実施形態において、ホスファターゼは、p38、ERKs、JNK、IKK、およびAktを含む骨形成において関与するキナーゼを阻害する。より好ましくは、ホスファターゼは、MAPK特異的もしくはAkt特異的であり、さらに好ましくは、ホスファターゼは、ERK1/2特異的である。特定の学説に束縛されないが、この方法は、キナーゼ活性は、それの対応するホスファターゼにより厳密に調節される事実に従い、この目的に適している。ERK1/2の場合、そのホスファターゼは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼホスファターゼ−3(MKP−3)として公知である。このホスファターゼは、対応するキナーゼのスレオニン残基およびチロシン残基からのリン酸基の除去を担う二重特異性ホスファターゼのファミリーに属している。(Campsら、FASEB J.,14,6−16頁,1999)。ホスファターゼによるリン酸基の迅速な除去は、キナーゼの活性化は短命であり、休止細胞においてリン酸化のレベルは、低いということを確かにする。しかしながら、ホスファターゼが活性化しており、リン酸基を除去するためには、ホスファターゼもまたリン酸化を必要とする。それ故、ホスファターゼ活性の阻害は、ERK1/2活性の活性化もしくは延長を生じる。
【0080】
骨芽細胞/骨芽細胞前駆体において、ホスファターゼを不活性化する骨形成性化合物の能力を測定する一つの方法は、骨芽細胞/骨芽細胞前駆体をGST−RANKLもしくはBMP−2(骨形成促進タンパク質2)のようなこれらの細胞を活性化することで公知である物質で最初に活性化することを含む。これは、ホスファターゼの活性化を導き、その時点で、骨芽細胞/骨芽細胞前駆体は、試験化合物で処理され、細胞溶解物が得られる。ホスファターゼを脱リン酸化する(不活性化する)試験化合物の能力は、ウェスタン分析法もしくはキナーゼアッセイの実施により測定される。上記参照のこと。ホスファターゼ活性を評価するさらなる詳細は、Mudaら、J Biol Chem.,273:9323−9329,1998およびCampsら,Science 280:1262−1265,1998を参照のこと。もし、化合物がホスファターゼ阻害活性を有すると決定されれば、さらにその骨形成性活性を測定するため、骨形成アッセイの一つにおいて試験され得る。これらのアッセイも上記に記載される。
【0081】
(薬学的組成物および方法)
本発明の好ましい実施形態において、骨の喪失を予防する方法もしくは阻害する方法、または骨形成を増強する方法は、1)RANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの1以上のオリゴマー複合体、2)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質の活性(この活性は骨形成の指標である)を増強する能力がある骨形成性の化合物、または3)骨芽細胞もしくは骨芽細胞前駆体の細胞内タンパク質を不活性化(この不活性化は骨形成の指標である)する能力がある骨形成性の化合物、を投与することにより提供される。本発明の骨形成組成物は、このような組成物の有効量を、それらを必要とする患者に提供することにより利用され得る。一つの好ましい実施形態において、そのような組成物は、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全症、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、歯周病、骨格への転移(skeletal metastasis)、癌、加齢による骨の喪失、骨減少症、および変質性関節疾患(degenerate joint disease)から成る群から選択される状態を処置するために使用される。
【0082】
動物被験体の処置のための使用について、本発明の化合物は、薬学もしくは獣医学の組成物として処方され得る。処置されるべき被験体、投与様式、および所望される処置のタイプ(例えば、予防(prevention)、予防(prophylaxis)、治療)に依存して;化合物は、これらのパラメータに一致する方法で処方される。そのような技術の概要は、Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition, Mack Publishing Co.,Easton,PAにおいて見出される。
【0083】
本発明のRANKL含有オリゴマーもしくは本発明の骨形成性化合物の投与は、投与の多様なパラメータ(頻度、投薬量、期間様式および投与経路を含む)を較正することにより、薬物動態学的および薬力学的に制御され得る。従って、一つの実施形態において、骨量の形成は、毎日の注射および/もしくは摂取のような非連続性の断続的な様式でRANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体もしくは模倣物のうちの1以上のオリゴマー複合体のような同化性組成物を投与することにより達成される。一般的に、本明細書中に記載されるような任意の骨形成性化合物は、同様な効果を実現するため、断続的に投与され得る。投薬量、期間および投与様式におけるバリエーションもまた、求められる活性を産生するために操作され得る。
【0084】
動物もしくはヒト被験体への投与のため、本発明の組成物の投薬量は、典型的には0.01〜100mg/kgである。しかしながら、投薬量は、疾患もしくは状態の性質、患者の状態、開業医の判断、および投与の頻度ならびに様式に高度に依存している。経口経路が採用される場合、その物質の吸収は、バイオアベイラビリティーをもたらす要因である。低い吸収は、胃−腸管内で、より高い濃度、従ってより高い投薬量を必要とする効果を持つ。
【0085】
物質の適切な投薬量は、動物モデル試験(有効用量レベル(例えば、ED50)および毒性用量レベル(例えば、TD50)ならびに致死用量レベル(例えば、LD50もしくはLD10)は、適切および受容可能な動物モデルにおいて証明される)を実施することにより適切に評価されるべきであることが、理解される。さらに、そのような動物試験において、ある物質が有効であると証明された場合、制御された臨床試験が実施されるべきである。
【0086】
一般的に、処置における使用に関し、本発明の組成物は、骨の喪失の処置のため、単独もしくは他の組成物と組み合わせて使用され得る。そのような組成物としては、ビスホスフォネートのような抗吸収剤、カルシトニン、カルシトリオ−ル、エストロゲン、SERMおよびカルシウム供給源、もしくは副甲状腺ホルモンまたはその誘導体のような補助的な骨形成性の薬剤、骨形成促進タンパク質、オステオゲニン、NaF、もしくはスタチンが挙げられる。本明細書中に参考として援用される米国特許第6,080,779号を参照のこと。投与様式に依存して、化合物は適切な組成物に処方される。
【0087】
処方物は、全身投与あるいは局所(topical)投与または局所(local)投与のために適切な様式で調製され得る。全身的な処方物としては、注射(例えば、筋肉内注射、静脈内注射もしくは皮下注射)のために設計された処方物が挙げられるが、これらに限定されないか、あるいは経皮投与、経粘膜投与または経口投与のために調製され得る。処方物は、一般的に希釈剤ならびに(ある場合においては)アジュバント、緩衝剤、防腐剤などを含む。
【0088】
経上皮投与のために、浸透される障壁に適した浸透剤が処方物中において使用される。一般的に、このような浸透剤は当該分野で公知である。経口投与のために、化合物はまた、リポソーム組成物もしくはマイクロエマルジョンとして投与され得る。適切な様式としては、当該分野において公知であるシロップ、カプセル、錠剤が挙げられる。注射のために、処方物は、溶液もしくは懸濁液として、または注射前の液体における溶液もしくは懸濁液として適切な固形物として、または乳化剤として慣習的な形状で調製される。適切な賦形剤としては、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールなどが挙げられる。そのような組成物はまた、湿潤剤もしくは乳化剤のような補助的な非毒性物質量、例えば酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレートなどのpH緩衝剤などを含み得る。
【0089】
本明細書中に記載されたRANKL含有オリゴマーおよび骨形成性化合物はまた、当業者に公知の多様な技術を用いて、患者(ヒトおよび他の脊椎動物(例えば、家畜(domestic animal)、げっ歯類、ならびに家畜(livestock))の両方)の骨形成および成長が望まれる部位に局所的に投与され得る。例えば、これらとしては、スプレー、ローション、ゲルもしくは他のビヒクル(例えば、アルコール、ポリグリコール、エステル、オイルおよびシリコーン)が挙げられ得る。このような局所的な用途としては、例えば、骨折部位、あるいは損傷した骨の修復または置換の欠損部位が挙げられる。加えて、本発明のオリゴマー複合体および骨形成性化合物は、例えば、適切なキャリア中で自家移植片、同種移植片もしくはプロテーゼと天然の骨との接合部に、移植片もしくはプロテーゼの、天然の骨への結合を補助するために、投与され得る。
【0090】
薬学的に受容可能な賦形剤としては、生理食塩水、リンゲル液、トコフェロール、リン酸溶液もしくは緩衝液、緩衝化生理食塩水、および当該分野において公知である他のキャリアが挙げられるが、これらに限定されない。薬学的組成物はまた、安定剤、抗酸化剤、着色料、および希釈剤を含み得る。薬学的に受容可能なキャリアおよび添加剤は、薬学的化合物からの副作用が最小に抑えられ、化合物の能力が処置を無効にする限度まで取り消されも、もしくは阻害されるもしないように選択される。
【0091】
下記の実施例は、本発明を例証するが、例証されるように本発明の多様な局面を限定するように挙げられていない。
【実施例】
【0092】
(実施例1)
(GST−RANKL融合タンパク質としてのRANKLの発現)
マウス型RANKL残基158〜316をコードするcDNAを、SalIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼを用いて、pGEX−4T−1(Amersham;GenBank登録番号U13853−http://ncbi.nlm.nih.govにあるNational Library of Medicineリストの核酸の欄を参照のこと)のグルタチオン S−トランスフェラーゼの下流にクローニングした。BL21(DE3)Escherischia coli(Invitrogen)におけるIPTG(0.05mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl pH8.0、および1mM EDTAを含む溶解緩衝液の中で粉砕した。溶解物を、GST−RANKL融合タンパク質のアフィニティー精製のために、グルタチオンセファロース(Amersham)とともにインキュベートし、続いて150mM NaCl、および20mM Tris−HCl(pH8.0)を含む緩衝液で過剰に洗浄した。アフィニティーカラムからの競合溶出(10mM 還元グルタチオン)の後、単離されたタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、0〜500mM NaClの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびpHに対し透析した。次いで、精製したGST−RANKLを、リムルス変形細胞溶解物試験(limulus amoebocyte lysate assay)により、エンドトキシン汚染についてアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量した。
【0093】
サイズ排除クロマトグラフィーにより示されるように、生理的環境を模した条件下で、GST−RANKLは、大きなオリゴマー複合体を形成する。図2を参照のこと。図2の曲線下の面積により測定されるように、タンパク質の大部分は、GST−RANKLのオリゴマー複合体として存在する。
【0094】
(実施例2)
(全頭蓋冠器官培養物における骨形成のエキソビボ刺激)
骨形成についてのアッセイを、本明細書中に参考として援用される米国特許第6,080,779号 カラム10,II.29−55に記載されるように実施した。新生仔のマウス頭蓋冠を、ビヒクル、GST(ネガティブコントロール)、もしくは実施例1に概要を述べたようにして得られた、精製された漸増濃度のGST−RANKLの存在下で、器官培養した。骨形成促進タンパク質(BMP)−2を、ポジティブコントロールとして投与した。試験組成物を、培養開始時のみ、12時間(1×)、もしくは開始時に1回と3日後にもう1回、12時間の持続時間で(2×)、投与した。7日後、頭蓋冠の厚さを、組織形態計測学的に決定し、骨形成を評価するために、多様なコントロール群および実験群と比較した。要約すると、頭蓋冠の骨を、インキュベーション培地から取り出し、10%中性緩衝ホルマリン中で12時間固定し、14%EDTAで3日間脱灰し、段階的にアルコールで脱水し、組織学的な切片作製のためにパラフィンに包埋した。頭蓋冠を、矢状縫合に垂直に、頭頂骨の中心部を通って、冠状に切断した。匹敵する解剖学的位置の代表的な冠状切片を、頭蓋冠の厚さの組織形態計測学的評価に供した(OsteoMeasure,Osteometrics Inc.,Atlanta,GA)。図3を参照のこと。GST−RANKLは、1回もしくは2回投与された場合、頭蓋冠の厚さに用量依存的な増加を誘導した。図4を参照のこと。試験した最高の用量(100ng/ml)において、頭蓋冠の厚さは2倍になった。
【0095】
(実施例3)
(マウスにおける骨形成のインビボ刺激)
マウスC3H/HeN(Harlan,Indianapolis,IN)に、100マイクログラムのGST(コントロール)もしくは100マイクログラムの実施例1において得られたようなGST−RANKLを1日1回、9日間、皮下に投与した。脛骨の組織学的試験は、コントロールマウスと比較して、GST−RANKL処置マウスにおいて、著しい骨量の増加および活性化骨芽細胞の数の正味の増加を明らかにした。それぞれ低倍率および高倍率で撮影された図5(a)、図5(b)を参照のこと。これらの図は、GSTを与えられたコントロール動物と比較して、皮質の厚さの顕著な増加および初期の海綿質(spongiosa)の小柱構造物の増加を明らかにした。
【0096】
GST投与マウスもしくはGST−RANKL投与マウスの二重エネルギーX線吸収(DEXA)解析もまた、標準的な手順で実施した。結果(図5(c)を参照のこと)は、コントロールに比べ、GST−RANKLの骨塩密度の有意な増加を示す。
【0097】
(実施例4)
(骨芽細胞のインビボ活性化)
マウスC3H/HeN(Harlan,Indianapolis,IN)に、実施例3において示された手順に従い、GST(コントロール)もしくはGST−RANKLを投与した。脛骨の高倍率での組織学的試験は、コントロールマウスと比べ、GST−RANKL処置マウスにおいて骨芽細胞の顕著な活性化を明らかにした。休止した骨芽細胞は、コントロール動物において薄い骨表面細胞として明白である一方、活性化された骨芽細胞は、GST−RANKL処置マウスにおいて、骨表面に沿った膨らんだ立方体の細胞として明白である。図6を参照のこと。
【0098】
GSTコントロールと対比した、GST−RANKLのインビボ投与中の骨形成の速度の測定を、鉱質化している骨マトリックスに2種の蛍光標識を取り込ませるため、安楽死の7日前および2日前の2%NaHCO3中の20mg/kgカルセインの腹腔内投与により達成した。切開の後、頭蓋冠を、70%エタノールで固定し、組織切片を切るため、ポリメチルメタクリレートに包埋した。冠状縫合とラムダ縫合と間の中間で撮った頭頂骨の冠状切片の顕微鏡写真は、図9に示されており、頭蓋冠の外表面が図の上側に、内表面が下側に向いている。5日間に合成された骨の量は、2セットの平行な蛍光バンド内に取り囲まれた量である。GSTのみを受けたコントロール動物における骨形成の強度は、明瞭に分離した二重の標識を産生するには不十分であるが、GST−RANKL処置動物においては、第1の標識と第2の標識との間の5日間に、骨の明確な沈積が存在する。
【0099】
(実施例5)
(GST−RANKLの投与は、実質的に破骨細胞形成に影響することなく骨芽細胞の増殖を刺激する)
精製されたGST−RANKL融合産物を、マウスC3H/HeN(Harlan,Indianapolis,IN)に、5μg/kg、50μg/kg、500μg/kg、1,500μg/kg、5,000μg/kgの漸増投薬量で、1日1回、7日間、皮下に投与した。RANKLの最高の投薬量に相当するモル数のGSTは、ネガティブコントロールとして働いた。マウスを屠殺し、長い骨を固定し、脱灰し、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(tartrate resistant acid phophatase:TRAP)活性について染色した。TRAP活性は、骨に関する破骨細胞の特異的表現型マーカーである。海綿質表面1mmあたりの活性化骨芽細胞および破骨細胞の数を、組織形態計測学的に定量した。図7に見られるように、間欠性の様式(すなわち毎日の注射による)で投与されたGST−RANKLは、活性化骨芽細胞における用量依存的な増加を生じたが、破骨細胞の数には生じなかった。GSTは、骨芽細胞もしくは破骨細胞のどちらにおいても顕著な影響を有さなかった。
【0100】
(実施例6)
(エキソビボ骨小節形成により証明されるような骨芽細胞前駆体の分化の増強)
実施例3において考察されたようなGST−RANKL(100μg)処置マウスおよびGST処置マウス由来の同数の骨髄細胞を、骨を形成し得る骨芽細胞および関係する前駆体の数が増えているかどうか決定するため、28日間、骨芽細胞形成条件に置いた。28日後、細胞を、鉱質化骨小節を同定するために、アリザリンレッドで、そしてコロニー形成単位を同定するために、ヘマトキシリンで染色した。
【0101】
GST−RANKL処置マウスに由来する骨髄細胞は、GSTを投与された対応物より、実質的により鉱質化した骨小節を産生した(図8を参照のこと)。
【0102】
(実施例7)
(マウス破骨細胞前駆体において、GST−RANKLは、迅速にMAPキナーゼを活性化する)
野生型C57BL/6マウスを、Harlan Industries(Indianapolis,IN)より購入した。破骨細胞前駆体の単離のために、骨髄マクロファージ(BMM)を、4週齢〜6週齢のマウスの全骨髄から単離し、組織培養ディッシュ中で37℃、5%CO2でインキュベートした。24時間の培養後、非接着細胞を回収し、Ficoll Hypaque勾配で層状にし、勾配の界面の細胞を回収した。細胞を37℃、5%CO2で、10%の熱不活化ウシ胎仔血清を補ったα−最小必須培地中で、組換え型マウスM−CSF(10ng/ml)の存在下、65,000/cm2で再プレートした。4日目もしくは5日目に、細胞をGST−RANKLで処理した。Aktの活性を扱う実験において、細胞をGST−RANKL刺激前の24時間、血清およびM−CSFを含まない培地で培養した。
【0103】
破骨細胞前駆体のイムノブロッティング(ウェスタンブロッティング)を、下記の指示に従って実施した。サイトカイン処理のBMMの単層もしくはコントロールのBMMの単層を氷冷PBSで2回、洗浄した。細胞を、20mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X−100、2.5mM ピロリン酸(pyrophoshate)ナトリウム、1mM β−グリセロリン酸、1mM Na3PO4、1mM NaF、および1×プロテアーゼインヒビターカクテルを含む緩衝液中で溶解した。細胞溶解物50μgをSDSサンプル緩衝液(0.5M Tris−HCl(pH6.8)、10%w/v SDS、10%グリセロール、0.05%w/vブロモフェノールブルー)存在下で5分間煮沸し、8%ゲルを用いて、SDS−PAGEで分離した。タンパク質を、半乾燥ブロッター(Bio−Rad,Richmond,CA)を用いてニトロセルロースメンブレンに移し、非特異的な結合を低減するため、ブロッキング溶液(0.1% Tween20を含むトリス緩衝化生理食塩水中、5%脱脂粉乳)中で1時間インキュベートした。次いで、メンブレンを4℃で1晩、1次抗体に曝し、3回洗浄し、1時間、ヤギ抗マウスIgGもしくは抗ラビットIgG西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化二次抗体と共にインキュベートした。メンブレンを、頻繁に洗浄し、製造元(Amersham)の指示に従い、増強化学発光検出(enhanced chemiluminiscence detection)アッセイを実施した。
【0104】
イムノブロッティングアッセイの結果を図10に示す。この図から見出されるように、JNK、p38、およびERKの総細胞量は、このアッセイのどの時点においても有意には変わらなかった。ERKおよびp38のリン酸化(活性化)は、GST−RANKL刺激の5分後に検出され、RANK/GST−RANKL相互作用の10分後、最高に達し、そして相互作用の30分後には検出されなかった。JNKは、GST−RANKL刺激の15分後にリン酸化されたが、このタンパク質は迅速に脱リン酸化され、その結果、GST−RANKL刺激後30分までに、JNKのリン酸化形態は検出されなかった。データは、GST−RANKL刺激後のマウス破骨細胞前駆体におけるERK、JNK、およびp38の一過性で短命な活性を示した。
【0105】
(実施例8)
(マウス破骨細胞前駆体において、GST−RANKLは、迅速にAktを活性化する)
破骨細胞前駆体を、実施例7に記載されたように単離、維持、および操作した。イムノブロッティングのプロトコルもまた、1次抗体がホスホ−Akt(Cell Signaling社より入手した)に特異的であることを除き、実施例7と同様であった。
【0106】
図11は、GST−RANKL刺激の時点で、検出可能なAktのリン酸化が存在したことを示し、このことは、このタンパク質の迅速な活性化を示している。Aktは、PI3キナーゼの基質であり、活性化状態にあるAktは、抗アポトーシスシグナル伝達に関与する。Akt活性は、経時的に増加した。すなわち、破骨細胞前駆体においてリン酸化Akt分子の数は、経時的に増加した。従って、Aktの活性は、GST−RANKL刺激の0分後より5分後において強く、15分後に最高に達した。
【0107】
(実施例9)
(GST−RANKLに誘導されたMAPキナーゼの活性は、マウス骨芽細胞において延長される)
初代骨芽細胞を、連続的な酵素消化により新生仔マウス頭蓋冠から単離した。要約すると、頭蓋冠を刻み、カルシウムおよびマグネシウム不含のリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に0.1%コラゲナーゼ、0.05%トリプシン、および4mM NA2EDTAを含む酵素溶液中で穏やかに振とうしながら、室温で20分間、インキュベートした。この手順を、計6の消化物を得るため、繰り返した。最後の4〜6の消化物から単離した細胞を、15%FBS、50μMアスコルビン酸、および10mM β−グリセロリン酸を含むMEM中で培養した。細胞を、6%CO2を含む加湿雰囲気中で、37℃で維持し、培地およびサイトカインを毎日、置換した。
【0108】
示された時間および投薬量でのサイトカイン処理の後、細胞を、使用直前に1mM Na3PO4、1mM NaF、および1×プロテアーゼインヒビターカクテルを加えたRIPA緩衝液(10mM Tris−HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1%Nonidet P−40、0.2%デオキシコール酸ナトリウム、および1mM EDTAを含む)中で溶解した。タンパク質濃度を、Micro BCA Protein Assay(Pierce)により、定量および標準化した。溶解物を、Laemmli緩衝液中で加熱により変性し、SDS−PAGEにより分離し、ニトロセルロース上に移した。全体およびリン酸化されたERK、JNK、p38、Akt、およびIkBαのレベルを、製造元が確立したプロトコルに従い、通常の化学発光検出を用いて、1次抗体および2次抗体を使用して決定した。メンブレンを、ハイブリダイゼイションの間に、10μM β−メルカプトエタノールおよび2%SDSを含むPBS中で剥がした。
【0109】
GST−RANKLもしくは等モルのRANKL刺激後のMAPキナーゼの活性を測定するイムノブロットアッセイの結果を、図12に示す。GST−RANKL刺激を実施例7に記載されるように実施した。リン酸化を測定したキナーゼとしては、ERK、JNK、p38、およびAktが挙げられる。さらに、破骨細胞前駆体に見られるように、全タンパク質の量は、細胞において、どの時点においても有意に変化しなかった。しかし、試験したキナーゼの全ては、骨芽細胞において、延長した活性を示した。両方のERKは、GST−RANKL刺激後、5分までに活性化され、そしてそれらの活性は、刺激後、60分において、検出可能であった。JNK、p38、およびAktの活性は、GST−RANKL刺激の時点で検出可能であり、そして刺激後、少なくとも60分までの間、検出可能であった。加えて、IkBαのリン酸化は、刺激の10分後に検出され、そしてアッセイの終わりまで(60分間)、増加した。このことはNFkBの核への増加した移行を示す。このデータは、MAPキナーゼ活性のパターンが、破骨細胞における同じキナーゼの活性と異なることを示唆している。骨芽細胞において観察される延長した活性は、加速した同化性の骨プロセスにおいて役割を果たしているようである。加えて、RANKL処理は、GST−RANKLに見られるような、キナーゼの延長した活性を誘導できなかった。
【0110】
(実施例10)
(マウス骨芽細胞前駆体において、GST−RANKLが誘導したERK1/2活性は、延長される)
実施例9に示された手順に従い、骨芽細胞前駆体を、単離し、そしてそれを維持した。イムノブロティングを、実施例9のイムノブロティングと同様の方法で実施した。
【0111】
図13に示されるように、骨芽細胞前駆体のERK活性は、延長され、そしてそれは、経時的に増加した。骨芽細胞において、この活性は延長されたが、長期にわたり有意に変化しなかった。一方、骨芽細胞前駆体のERK活性は、最初、GST−RANKL刺激の10分後に検出され、そして活性化の60分後まで(アッセイが実施された時間の長さ)増加した。
【0112】
(実施例11)
(骨芽細胞におけるGST−RANKL曝露後のAP活性)
初代頭蓋冠骨芽細胞を、15%FBS、50μMアスコルビン酸、および10mM β−グリセロリン酸を含むMEM中で培養した。細胞を、培地およびサイトカインを毎日交換しながら、37℃で維持した。、骨芽細胞の分化および機能の直接の指標である骨芽細胞アルカリホスファターゼ(AP)活性を、発色基質(5.5mM p−ニトロフェニルリン酸)の添加により定量した。次いで、細胞を、異なるレジメンで投与されたGST−RANKLに曝露した。50ng/mlGST−RANKLへのパルス状の曝露を、48時間の処置時間枠あたり1時間、3時間、6時間、8時間、もしくは24時間の全曝露として与えた。4回のこのような48時間処理の後、AP活性を定量し(±S.D.)、全タンパク質レベルに対して標準化した。
【0113】
図14から理解され得るように、GST−RANKL曝露を、48時間ごとに1回、8時間の処理時間枠に対して与えた場合、最大の同化効果を観察した。従って、GST−RANKLを、断続的な様式で投与した時に、GST−RANKLは、AP活性における増加を誘導した。
【0114】
(実施例12)
(GST−RANKLのオリゴマー化)
GST−RANKLを、そのGST融合パートナーから切断されたRANKLフラグメントを単離するために、タンパク質分解に供した。要約すると、GST−RANKLを14型ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)と共に、50mM Tris−HCl(pH7.0)、150mM NaCl、10mM EDTA、および1mM DTT中で4℃で4時間インキュベートした。非切断の融合タンパク質およびGSTタグ化プロテアーゼを、グルタチオン親和性マトリックスを通すことのより除去した。全ての精製された組換えタンパク質を、リムルス変形細胞溶解物試験(limulus amoebocyte lysate assay)(Bio Whittaker)により、エンドトキシン汚染についてアッセイし、そして同一性を確認するために、質量分析により解析した。GST−RANKLおよび切断されたRANKLの両方を、生理的な塩およびpHに対して透析し、そしてAKTA explorer chromatography system(Amersham Pharmacia)を用いたSuperose−6 26/60でのゲル濾過により、分画した。溶出容量を、以下の標準物質:リボヌクレア−ゼA(13,700)、キモトリプシノーゲンA(25,000)、卵白アルブミン(43,000)、ウシ血清アルブミン(67,000)、アルドラーゼ(158,000)、カタラーゼ(232,000)、フェリチン(440,000)、サイログロブリン(669,000)、およびブルーデキストラン2000(2,000,000)を用いて分子量に対して較正した。異なる溶出容量に由来するタンパク質を含有するフラクションを、モノクローナル抗GST一次抗体を用いて、ウェスタン分析に供した。図15(a)が示すように、切断されたRANKLは、単一の三量体種(1n)として移動した一方で、GST−RANKLは、非共有結合的に会合した単一の三量体(1n)および動的平衡下にあるオリゴマー(2〜100n)の多分散系混合物として移動した。結晶学的な証拠は、GSTが、二量体化する本質的な傾向を持つ一方で、RANKLは、自発的に三量体化することを立証している。従って、3RANKL分子および3GST分子から構成される単一のGST−RANKL三量体は、隣接したGSTと結合していない遊離GSTを包含し、オリゴマー化する傾向を生じる3:2の化学量論を生じる。GST−RANKL三量体のGSTが、隣接するGST−RANKL三量体由来のGSTと共に二量体を形成する場合、高次の、枝分かれしたオリゴマーが形成する(図15(b)を参照のこと)。
【0115】
(実施例13)
(GST−RANKLのインターナリゼーション)
初代マウス骨芽細胞を、10%ウシ胎仔血清を含むα−MEM中で維持し、そして分化のために15%FBS、50μMアスコルビン酸、および10mM β−グリセロリン酸を含むMEM中で培養した。細胞を、6%CO2を含む加湿雰囲気中で、37℃で維持し、毎日、培地およびサイトカインを交換した。初代マウス骨芽細胞を、10%ウシ胎仔血清を含むα−MEM中で、カバースリップ上で培養し、示された時間、GST−RANKLもしくは切断されたRANKLで処理した。リン脂質膜染色のため、細胞をVybrant DiI lipophilic carbocyanine membrane fluorescent stain(Molecular Probes)と共に、20分間インキュベートした。細胞を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.1%TritonX−100で、透過化処理し、PBS中1%BSA/0.2%脱脂粉乳でブロッキングし、ポリクローナル抗RANK抗体でRANKを染色した。連続した光学切片を、Radiance2100レーザー走査共焦点顕微鏡(BioRad)を用いて得た。顕微鏡の設定を、アイソタイプIgコントロールで染色した細胞を用いて、黒レベル値に対して較正した。GST−RANKLを、実施例12に記載されるように切断した。
【0116】
培養中の初代骨芽細胞を、5nMの切断RANKLもしくはGST−RANKLに曝露した。示された時間において、細胞表面を、脂肪親和性の蛍光色素で染色し、そしてRANKを抗RANK抗体で染色した。共焦点顕微鏡を、RANK(緑色蛍光)および細胞表面(赤色蛍光)を局在化するために使用した。重ねた画像において、RANKおよび細胞表面の共局在が黄色(緑色および赤色蛍光のオーバーラップ)に見える。GST−RANKL:RANK複合体は、細胞表面に少なくとも1時間留まった。このことは、延長した細胞内RANKシグナル伝達に対応している。対照的に、切断RANKL−RANK複合体は、1時間以内に完全にインターナリゼーションされた。このことは、その時点での切断されたRANKLが誘導したRANKシグナル伝達の欠如と相関している。結果を、図16に示す。
【0117】
(実施例14)
(GST−RANKLに応答したI型コラーゲンおよびCbfa1の発現)
インビボ実験において、マウスに、皮下注射により5μg/kgGST−RANKLもしくは(コントロールとして)GST単独を投与し、そして1時間後に安楽死させた。インビトロ実験において、初代骨芽細胞を、100ng/mlGST−RANKLもしくは(コントロールとして)GST単独に曝露した。RNAを、RNeasy Total RNA System(Qiagen)で単離し、そしてゲノムDNAを除去するため、デオキシリボヌクレア−ゼで消化した。続いて、メッセンジャーRNAを、Oligotex mRNA Purification System(Quiagen)を使用して総RNAより単離し、Platinum Quantitative RT−PCR Thermoscript One−Step System(Life Technologies)で解析した。要約すると、1μgのmRNAを、エキソン−イントロン境界にまたがるように設計したマウス遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー:Cbfa1 センス 5’−CCGCACGACAACCGCACCAT−3’(配列番号3)、Cbfa1 アンチセンス 5’−CGCTCCGGCCCACAAATCTC−3’(配列番号4)、およびコラーゲンI型α1鎖 センス 5’−TCTCCACTCTTCTAGTTCCT−3’(配列番号5)ならびにコラーゲンI型α1鎖 アンチセンス 5’−TTGGGTCATTTCCACATGC−3’(配列番号6)を用いてcDNAに逆転写した。逆転写を、60℃で30分間実施し、続いて95℃で5分間変性した。すぐにタッチダウンPCR増幅を続けた。ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)の発現レベルを、コントロールとして同時に評価した。反応産物を、2%アガロースで電気泳動により分画し、そして結果をアッセイの直線範囲から表した。
【0118】
骨芽細胞により合成されたI型コラーゲンは、骨の主要な有機構成成分である。図17に示されるように、初代骨芽細胞は、培養中に分化するにつれて、コラーゲンの発現を徐々に上方制御する。断続的なGST−RANKL曝露は、この過程を加速し、それへの最初の曝露の12時間以内に、強いコラーゲンの発現を誘導する。Cbfa1は、骨芽細胞形成のための主要な転写因子であり、そしてマウスにおいて、その欠乏は、骨芽細胞および骨形成の完全な欠如を生じる(例えば、Ottoら、Cell 89,765−771頁,1997,およびKomoriら、Cell 89,755−764頁,1997を参照のこと)。図18に示されるように、Cbfa1の発現は、骨髄において、GST単独を受けたコントロールマウスの発現に対して、GST−RANKLの全身投与の1時間以内に増強される。
【0119】
(実施例15)
(GST−RANKLは、骨芽細胞の増殖を刺激する)
インビトロでの骨芽細胞の増殖速度を、DNAへの5−ブロモ−2’−デオキシウリジン(BrdU)の取り込みにより評価した。要約すると、細胞を、10μM BrdUの存在下で、48時間、100ng/mlGST−RANKLもしくはコントロールとしてモル等量のGST単独の存在下または非存在下で培養した。BrdUの取り込みをペルオキシダ−ゼ標識化抗BrdU抗体を用いて、ELISA(Amersham Pharmacia Biotech)で定量した。分光光度測定は、発色基質3,3’−5,5’−テトラメチルベンジジンを加えた後、450nmで実施した。
【0120】
図19に示されるように、GST−RANKL処理は、骨芽細胞の増殖速度を48時間のアッセイ期間の間に4倍にまで増強した。
【0121】
(実施例16)
(ERK活性化は、GST−RANKLの同化効果に関与している)
本実験において使用されるキナーゼ欠損ERK1cDNA(Robbinsら,J.Biol.Chem.,268,5097−5106頁,1993を参照のこと)は、211位および212位のアデニン(alanine)ヌクレオチドをそれぞれシトシンおよびグアニンに変異させた結果であり、リジン71のアルギニンでの置換(Erk1 K71R)を生じた。ERK1 K71Rは、ドミナントネガティブ様式で、ERK1活性およびERK2活性の両方の阻害に機能する(Liら,Immunol.,96,524−528頁,1999を参照のこと)。ERK1 K71RcDNAを、前述のようにSFGレトロウィルスベクターのNcoIおよびBamHI制限エンドヌクレアーゼサイトにクローニングした(Oryら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,11400−11406頁,1996を参照のこと)。水泡性口内炎ウィルス(VSV)−G糖タンパク質でシュードタイプ化されたレトロウィルス粒子の産生のため、SFG−ERK1 K71Rレトロウィルスベクターを、テトラサイクリン制御下で、Mul V gag−polおよびVSV−G糖タンパク質を発現する293GPGパッケージング細胞株にトランスフェクトした。テトラサイクリンを中止した後、3日目から7日目に馴化培地を回収し、そして5×106コロニー形成単位/ml以上のウィルス力価を含有することを見出した。形質導入の前に、培地を、0.45μmメンブレンを通して濾過し、そして臭化ヘキサジメトリン(ポリブレン)を、8μg/mlの濃度になるように添加した。ネガティブコントロールとして、LacZcDNAをもつレトロウィルスを同じ方法で産生した。VSV−シュードタイプ化レトロウィルスの形質導入は、骨芽細胞の分化もしくは機能に影響を及ぼさないことが示されている(Kalajzicら,Virology,284,37−45頁,2001およびLiuら,Bone 29,331−335頁,2001を参照のこと)。レトロウィルスの形質導入のため、初代骨芽細胞を、150mm培養ディッシュに1mm2あたり60個の細胞の密度で培養し、5×106コロニー形成単位/ml以上を含有する25mlの馴化培地に、24時間、曝露した。LacZレトロウィルスで形質転換された骨芽細胞のX−gal染色により証明した場合、形質転換効率は、90%を越えた。
【0122】
図20(a)に示されるように、ドミナントネガティブERKを形質導入された骨芽細胞は、RSK(GST−RANKL処理に応答する公知下流のERK基質)をリン酸化できなかった。さらに、図20(b)は、ドミナントネガティブERKを形質導入された骨芽細胞は、GST−RANKLに応答したI型コラーゲンの発現の上方制御ができないことを示している。
【0123】
(実施例17)
(AP−RANKL融合タンパク質としてのRANKLの発現)
マウス型RANKL残基158〜316をコードするcDNAを、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切なベクターにクローニングする。ヒト型アルカリホスファターゼ1をコードするcDNAを、cDNAライブラリーから単離し、結果として生じるDNA配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な哺乳動物発現ベクター(例えば、pcDNA3.1)中のRANKL cDNAの上流(アミノ末端)に挿入する。生じたベクターを、標準的な方法により、(例えばCHOのような)哺乳動物細胞株に形質導入する。精製したAP−RANKLを、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。ヒト型AP1は、分泌型タンパク質であり、結果として、AP融合タンパク質は培地中に分泌される。AP−RANKLがインビトロで哺乳動物細胞株により発現され、分泌されるための充分な時間の後、AP−RANKLを単離するため、培地をアフィニティー精製する。AP−RANKL融合タンパク質の実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成するAP−RANKLの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【0124】
(実施例18)
(GCN4−RANKL融合タンパク質としてのRANKLの発現)
マウス型RANKL残基158〜316をコードするcDNAを、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切なベクターにクローニングする。GCN4ペプチドをコードするDNA配列を、結果として生じるDNA配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクター(例えば、pGEX−6P−1(登録番号U78872))中のRANKL cDNAの上流(アミノ末端)に挿入する。BL21(DE3)Escherischia coli(Invitrogen)におけるIPTG(0.05mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl pH8.0、および1mM EDTAを含む溶解緩衝液の中で粉砕する。GCN4−RANKL融合タンパク質の単離のため、溶解物を、アフィニティー精製する。その後、単離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーにかけ、0〜500mM NaClの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびpHに対し透析する。その後、精製したGCN4−RANKLを、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。
【0125】
GCN4−RANKL融合タンパク質の実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成するGCN4−RANKLの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【0126】
(実施例19)
(TALL−1フラップ領域を含むRANKL誘導体の発現)
残基158〜316を含むマウス型RANKLを、そのDEループ(アミノ酸配列SIKIPを含むアミノ酸245−249)がTALL−1のDEループ(アミノ酸KVHVFGDEL)で置換されるように変異する。QuickChange Multi−Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社から入手可能)を用いて、PCRで駆動させる部位特異的変異誘発により、変異をRANKL中に導入し得る。変異型RANKLを、結果として生じるDNA配列がインフレームであり、介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切なベクター(例えば、pGEX−6P−1(登録番号U78872))にクローニングする。BL21(DE3)Escherischia coli(Invitrogen)におけるIPTG(0.05mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl pH8.0、および1mM EDTAを含む溶解緩衝液の中で粉砕する。変異型RANKLタンパク質のアフィニティー精製のため、溶解物を、グルタチオンセファロース(Amersham)と共にインキュベートし、続いて150mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8.0)を含む緩衝液で過剰に洗浄する。次いで、アフィニティーカラムからの競合溶出(10mM 還元グルタチオン)の後、単離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、0〜500mM NaClの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびpHに対し透析する。その後、精製したRANKL誘導体を、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。
【0127】
変異型RANKLの実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成する変異型RANKLの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【0128】
(実施例20)
(TALL−1フラップ領域およびさらなるアミノ酸変化を含むRANKL誘導体の発現)
残基158〜316を含むマウス型RANKLを、そのDEループ(アミノ酸配列SIKIPを含むアミノ酸245〜249)がTALL−1のDEループ(アミノ酸配列KVHVFGDEL)で置換されるように変異する。TALL−1構造との類似性を増すため、RANKL分子全体にわたって、次のアミノ酸変化を実施する:168T→I、187Y→L、194K→F、212F→Y、252H→V、279F→I、および283R→E。QuickChange Multi−Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社から入手可能)を用いて、PCRで駆動させる部位特異的変異誘発により、変異をRANKL中に導入し得る。変異型RANKLを、生じるDNA配列がインフレームであり、かつ介在する終止コドンを持たないように、適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、適切な発現ベクター(例えば、pGEX−6P−1)にクローニングする。BL21(DE3)Escherischia coli(Invitrogen)におけるIPTG(0.05mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl pH8.0、および1mM EDTAを含む溶解緩衝液の中で粉砕する。変異型RANKLタンパク質のアフィニティー精製のため、溶解物を、グルタチオンセファロース(Amersham)とともにインキュベートし、続いて150mM NaClおよび20mM Tris−HCl(pH8.0)を含む緩衝液で過剰に洗浄する。アフィニティーカラムからの競合溶出(10mM 還元グルタチオン)の後、単離したタンパク質を、イオン交換クロマトグラフィーに供し、0〜500mM NaClの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびpHに対し透析する。その後、精製したRANKL誘導体を、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量する。変異型RANKLの実験に基づいた質量を、質量分析により決定する。オリゴマー複合体を形成する変異型RANKLの能力を、サイズ排除クロマトグラフィーにより調べる。
【0129】
(実施例21)
(全頭蓋冠器官培養物における骨形成のエキソビボ刺激)
骨形成のアッセイを、本明細書中に参考として援用される米国特許第6,080,779号 カラム10,II.29−55に記載されるように実施する。新生仔マウスの頭蓋冠を、ビヒクル、AP(ネガティブコントロール)、または漸増濃度の精製したオリゴマーAP−RANKLの存在下で、器官培養する。骨形成促進タンパク質(BMP)−2を、ポジティブコントロールとして投与する。試験組成物を、培養開始時のみ、12時間(1×)、もしくは開始時に1回と3日後に再度1回、12時間の持続時間で(2×)、投与する。7日後、頭蓋冠の厚さを、組織形態計測学的に決定し、骨形成を評価するために、多様なコントロール群および実験群と比較する。
【0130】
(実施例22)
(マウスにおける骨形成のインビボ刺激)
マウスC3H/HeN(Harlan,Indianapolis,IN)に、100マイクログラムのAP(コントロール)もしくは100マイクログラムのAP−RANKLを、1日1回、9日間、皮下に投与する。その後、コントロールマウスと比較したAP−RANKL処置マウスでの骨量の増加および活性化骨芽細胞の数の正味の増加を評価するために、脛骨の組織学的試験を実施する。
【0131】
AP処置マウスと比較したAP−RANKL処置マウスでの骨鉱質密度の変化を評価するために、AP投与マウスもしくはAP−RANKL投与マウスの二重エネルギーX線吸収(DEXA)解析もまた、通常の手順で実施する。
【0132】
(実施例23)
(全頭蓋冠器官培養物における骨形成のエキソビボ刺激)
骨形成のアッセイを、本明細書中に参考として援用される米国特許第6,080,779号 カラム10,II.29−55に記載されるように実施する。新生仔マウスの頭蓋冠を、ビヒクル、GCN4(ネガティブコントロール)、もしくは漸増濃度の精製したGCN4−RANKLの存在下で、器官培養する。骨形成促進タンパク質(BMP)−2を、ポジティブコントロールとして投与する。試験組成物を、培養開始時のみ、12時間(1×)、もしくは開始時に1回と3日後に再度1回、12時間の持続時間で(2×)、投与する。7日後、頭蓋冠の厚さを、組織形態計測学的に決定し、骨形成を評価するため、多様なコントロール群および実験群と比較する。
【0133】
(実施例24)
(マウスにおける骨形成のインビボ刺激)
マウスC3H/HeN(Harlan,Indianapolis,IN)に、100マイクログラムのGCN4(コントロール)もしくは100マイクログラムのGCN4−RANKLを1日1回、9日間、皮下投与する。その後、コントロールマウスと比較したGCN4−RANKL処置マウスでの骨量の増加および活性化骨芽細胞の数の正味の増加を評価するために、脛骨の組織学的試験を実施する。
【0134】
GCN4処置マウスと比較したGCN4−RANKL処置マウスでの骨鉱質密度の変化を評価するために、GCN4投与マウスもしくはGCN4−RANKL投与マウスの二重エネルギーX線吸収(DEXA)解析もまた、通常の手順で実施する。
【0135】
(実施例25)
(GST−RANKL融合タンパク質としてのRANKLの発現)
マウス型RANKL残基158〜316をコードするcDNAを、SalI制限エンドヌクレアーゼおよびNotI制限エンドヌクレアーゼを用いて、pGEX−6p−1(Amersham;GenBank登録番号U78872−http://ncbi.nlm.nih.govにある米国国立医学図書館リストの核酸の欄を参照のこと)のグルタチオン S−トランスフェラーゼの下流にクローニングした。BL21(DE3)Escherischia coli(Invitrogen)におけるIPTG(0.05mM)で媒介されたタンパク質発現の誘導後、細胞を、150mM NaCl、20mM Tris−HCl pH8.0、および1mM EDTAを含む溶解緩衝液の中で粉砕した。GST−RANKL融合タンパク質のアフィニティー精製のために、溶解物を、グルタチオンセファロース(Amersham)と共にインキュベートし、続いて150mM NaClおよび20mM Tris−HCl(pH8.0)を含む緩衝液で過剰に洗浄した。アフィニティーカラムからの競合溶出(10mM 還元グルタチオン)の後、単離したタンパク質をイオン交換クロマトグラフィーに供し、0〜500mM NaClの範囲の塩勾配で溶出し、生理的な塩およびpHに対し透析した。精製したGST−RANKLを、リムルス変形細胞溶解物試験により、エンドトキシンの混入に関してアッセイし、インビトロ破骨細胞形成の読出し値により、生物活性を定量した。
【0136】
サイズ排除クロマトグラフィーで示されるように(データは示さず)、生理的環境を模した条件下で、GST−RANKLは、大きなオリゴマー複合体を形成した。タンパク質の大部分は、GST−RANKLのオリゴマー複合体として存在した(データは示さず)。
【0137】
(実施例26)
20匹の6週齢C57BL/6マウスを、無作為に2実験群に割り当てた。群1のマウス(10匹)には、右大腿骨の髄内の腔に100μgGST−RANKLを注射した。群2のマウス(10匹)には、右大腿骨の髄内の腔にGSTビヒクルの等モル量を注射した。
【0138】
マウスを、ケタミン/キシラジンカクテル(100mg/kgケタミンおよび10mg/kgキシラジンIP)で麻酔し、左側の横臥位で置いた。右大腿骨の大転子および右大腿骨外側顆を、特定した。髄内注入部位は、これらのランドマークの間に、等距離であった。ツベルクリンシリンジに29ゲージの針を付けて、注射を行った。9日目、マウスを、ケタミン/キシラジンカクテル(100mg/kgケタミンおよび10mg/kgキシラジンIP)で再麻酔し、それぞれの動物において、二重エネルギーX線吸収(DEXA,Piximus)解析を実施した。DEXA解析の後、直ぐに単純X線写真を撮影した(Faxitron,KV 0.15,時間=20sec)。動物は、CO2窒息により屠殺し、両方の大腿骨は、組織学的な解析のため、回収した。大腿骨は、10%緩衝ホルマリン中で48時間、固定し、1週間、脱灰した。DEXA解析は、GST−RANKL処置群とコントロール群との間で総骨鉱質密度(TBMD)に有意な差を示した(表1を参照のこと)。右および左の大腿骨の骨鉱質密度の比較では、GST−RANKLもしくはコントロール群のどちらにおいても有意な差は見られなかった(表2を参照のこと)。両群の単純X線写真の比較では、骨格の密度に有意な差は見られなかった。
【0139】
(表1.群ごとのBMD)
平均値および標準偏差を報告する。P値は、群間の有意差を検定する。それらは、対応のないt検定に基づいている。
【0140】
【表1】
(表2.片側ごとの大腿骨のBMD)
平均値および標準偏差を、それぞれの群で、右および左の大腿骨に対して報告する。P値は、右および左側の間の有意差を検定する。それらは、対応のあるt検定に基づいている。
【表2】
本発明の他の特徴、目的、利点は、当業者に明らかである。本明細書中に表される説明および図解は、本発明、その原理、およびその実用的な用途を他の当業者に周知させることを意図する。当業者は、特定の用途の要求に最適であるように、多くの形式で本発明を採用および適用し得る。従って、示されたような本発明の特定の実施形態は、網羅することも、本発明を制限することも意図しない。
【図面の簡単な説明】
【0141】
【図1】図1は、下記、実施例1と実施例25で考察した、GST−RANKL融合タンパク質を作成するため用いられるRANKLのマウスcDNAおよびタンパク質の構造および配列である。
【図2】図2は、生理的環境を模した条件下でのGST−RANKL融合タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーを示す。図1を参照のこと。
【図3】図3は、実施例2で考察した、全頭蓋冠器官培養物におけるエキソビボでの骨形成のGST−RANKL刺激の組織像である。矢印は頭頂骨の厚さを示す。
【図4】図4は、実施例2で考察した、インビトロでの骨形成のGST−RANKL刺激による用量依存的な頭蓋冠の厚さの増加をグラフで示す。白棒は1用量のGST−RANKLへの曝露、一方、黒棒は2用量のGST−RANKLへの曝露を示す。
【図5A】図5(a)は、実施例3で考察した、マウスにおけるインビボでの骨形成のGST−RANKL刺激の組織像を低倍率で示す。
【図5B】図5(b)は、実施例3で考察した、マウスにおけるインビボでの骨形成のGST−RANKL刺激の組織像を高倍率で示す。
【図5C】図5(c)は、実施例3で考察した、インビボにてGST−RANKLもしくはコントロールビヒクルを投与した動物の骨鉱質密度を比較した脛骨の骨幹端の二重エネルギーX線吸収(dual energy X−ray absorptiometry:DEXA)解析を示す。スケールバー=1mm。
【図6】図6は、マウス脛骨の高倍率の組織像であり、実施例4で考察した、GST−RANKLを投与した動物の骨芽細胞のインビボにおける活性化を示す。左のパネルの矢印は活性化された骨芽細胞を示し、右のパネルの矢印は扁平な骨表面細胞を示す。
【図7】図7は、実施例5で考察した、動物へのGST−RANKLの制御された投与の効果をグラフで表しており、破骨細胞と活性化骨芽細胞の細胞数を図示する。白棒は破骨細胞数を、黒棒は活性化骨芽細胞数を示す。
【図8】図8は、実施例6で考察した、エキソビボで培養された骨髄細胞における鉱化骨小結節(mineralized bone nodule)形成のGST−RANKL刺激の組織像である。赤い組織化学反応産物は骨芽細胞の鉱化コロニー形成ユニットを示す。
【図9】図9は、実施例4で考察した、インビボでの鉱化骨への二重蛍光色素標識の取り込みを表す。MARは硬質の付加(mineral apposition)、 BFRは骨形成、 (ex)および(en)は、それぞれ頭蓋冠の頭蓋外(exocranial)、 頭蓋内(endocranial)表面を示す。
【図10】図10は、マウスの破骨細胞前駆体におけるGST−RANKLでの細胞処理後のMAPK経路のメンバーの迅速な活性化を表すウェスタン分析像である。活性は、GST−RANKL/RANK相互作用時(0分)および相互作用の後、5分後、15分後、30分後に測定された。上から二段目、四段目、六段目のパネルは、それぞれJNK、p38、およびERKの総レベルを示す。一段目、三段目、五段目のパネルはそれぞれリン酸化(活性化)型のJNK、p38、およびERKを示す。
【図11】図11は、マウスの破骨細胞前駆体におけるGST−RANKLでの細胞処理後のAkt活性を表すウェスタン分析像である。活性化は、GST−RANKL/RANK相互作用時および相互作用の5分後、ならびに15分後に測定された。下段のパネルは、指定の時点の全Aktレベルを示し、上段のパネルはAktのリン酸化型を示す。
【図12】図12は、RANKL単独での処理と比較した、GST−RANKLでの細胞処理後の、マウス骨芽細胞のMAPK経路のキナーゼの延長した活性を示すウェスタン分析像である。リン酸化が測定された時点は、0分(細胞のGST−RANKLもしくはRANKL刺激時)およびGST−RANKL/RANKもしくはRANKL/RANKの結合が起こってから、5分後、10分後、20分後、30分後並びに60分後である。活性が測定されたキナーゼは、ERK、JNK、p38、およびAktを含む。pERKはリン酸化ERK、ERKはERKタンパク質全量、pJNKはリン酸化JNK、JNKはJNKタンパク質全量、pp38はリン酸化p38、p38はp38タンパク質全量、pAktはリン酸化Akt、AktはAktタンパク質全量を表す。上から一段目のパネルはp−IkBαであり、p−IkBαは、リン酸化IkBαを表し、IkBαはIkBαタンパク質全量を表す。
【図13】図13は、GST−RANKLでの細胞処理後の、マウス骨芽細胞前駆体におけるERK1/2の延長した活性を示すウェスタン分析像である。ERK1/2活性を測定した時点は、GST−RANKL/RANKの結合が起こって0分後、5分後、10分後、20分後、30分後、および60分後である。pERKはリン酸化ERK、ERKはERKタンパク質全量を表す。
【図14】図14は、GST−RANKL曝露後のアルカリホスファターゼ(AP)活性をグラフで表す。
【図15A】図15Aは、オリゴマー複合体としてのGST−RANKLを示す一方、切断された(GSTが除かれた)RANKLはオリゴマー形態中に存在しない。(a)は、切断されたRANKLが単一の三量体種(1n)として移動し、一方、GST−RANKLは、非共有結合性に結合した単一の三量体(1n)および動的平衡下にあるオリゴマー(2−100n)ユニットの多分散系混合物として存在することを示す。
【図15B】図15Bは、オリゴマー複合体としてのGST−RANKLを示す一方、切断された(GSTが除かれた)RANKLはオリゴマー形態中に存在しない。(b)は考え得るオリゴマー構造を表す。
【図16】図16は、GST−RANKL/RANK複合体が少なくとも1時間、細胞表面に留まることに対し、切断されたRANKL/RANK複合体は迅速にインターナリゼーションされることを示す共焦点顕微鏡像である。重ねた画像において、RANK(緑色蛍光)と細胞表面(赤色蛍光)の共局在が黄色に見える。
【図17】図17は、GST−RANKL処理に応答したI型コラーゲンの発現を示すアガロースゲル像である。「+」は初代骨芽細胞にGST−RANCLで処理した事を示し、「−」は同処理をしていないことを示す。骨芽細胞は、それぞれ連続した48時間の処理時間の最初の1時間、2時間、4時間もしくは6時間、GST−RANKLに曝露された。8−48時間の間に回収された全ての培養細胞はGST−RANKLに6時間、曝露された。βアクチンの発現は、実験のコントロールとして用いている。
【図18】図18は、GST−RANKLもしくはGST単独(「コントロール」と記す)で処理されたマウスの骨髄におけるCbfa1の発現を示すアガロースゲル像である。下段のパネルはコントロール実験であり、HPRT(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ)の発現を示している。
【図19】図19は、GST−RANKL処理に応答した、BrdU(5−ブロモ−2’−デオキシウリジン)の取り込みにより測定された骨芽細胞の増殖のグラフを示す。
【図20A】図20(a)は、ドミナントネガティブERKを形質導入した骨芽細胞が、RSKとして知られるERKの基質をリン酸化できないことを示すウェスタン分析像である。DN−ERKは、ドミナントネガティブERKを示す。LacZはβ−ガラクトシダーゼを示す。
【図20B】図20(b)は、ドミナントネガティブERKを形質導入した骨芽細胞が、GST−RANKLに応答したI型コラーゲンの発現を上方制御することができないことを示すアガロースゲル像である。
Claims (152)
- 骨形成のプロセスを増強する方法であって、骨形成が所望される場合、RANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体または模倣物のうちの1以上のオリゴマー複合体の有効量を投与する工程を包含する、方法。
- 前記増強が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記プロセスが、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記所望の骨形成が、骨の骨折部位での骨形成を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記所望の骨形成が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アナログ、誘導体または模倣物が、組換えRANKLタンパク質またはそのフラグメントを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、GST−RANKLを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、AP−RANKLを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、ロイシンジッパー−RANKLを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記RANKL誘導体が、TALL−1のフラップ領域を含むRANKLタンパク質を含む、請求項1に記載の方法。
- 骨量の損失によって少なくとも部分的に現れる疾患または状態を処置する方法であって、骨形成を促進し、それによって該骨量の損失を予防、阻害または対抗するに有効な量の、RANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体または模倣物のうちの1以上のオリゴマー複合体を含む薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。
- 前記薬学的組成物が、断続的に投与される、請求項11に記載の方法。
- 前記患者が、哺乳動物である、請求項11に記載の方法。
- 前記患者が、ヒトである、請求項13に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、GST−RANKLを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、AP−RANKLを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が、ロイシンジッパー−RANKLを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記RANKL誘導体が、TALL−1のフラップ領域を含むRANKLタンパク質を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記患者への骨吸収阻害因子の同時投与をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
- 前記骨吸収阻害因子は、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、SERMおよびカルシウムからなる群より選択される、請求項19に記載の方法。
- 前記患者への1以上のさらなる骨形成因子の同時投与をさらに包含する、請求項11に記載の方法。
- 1以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項21に記載の方法。
- 前記疾患または状態が、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、歯周疾患、骨格への転移、癌、加齢性骨損失、骨減少症、および変性関節疾患からなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 骨形成のプロセスを増強する方法であって、骨形成が所望される場合、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の1以上の細胞内タンパク質の活性を増強し得る骨形成性化合物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、該活性は、骨形成を示す、方法。
- 前記増強が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記プロセスが、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記所望の骨形成が、骨の骨折部位での骨形成を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記所望の骨形成が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞内タンパク質が、キナーゼを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ERK1、ERK2、Pl3キナーゼ、IKK、Akt、JNK、およびp38からなる群より選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ERK1を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ERK2を含む、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞内タンパク質が、IKB−αおよびIKB−βから選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記増強された活性が、キナーゼのリン酸化を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記増強された活性が、ERK1、ERK2、IKK、P13キナーゼ、Akt、JNK、およびp38からなる群より選択されるキナーゼのリン酸化を含む、請求項34に記載の方法。
- 前記増強された活性が、ERK1のリン酸化を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記増強された活性が、ERK2のリン酸化を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記1以上の細胞内タンパク質の活性が、前記骨芽細胞または骨芽細胞前駆体との前記骨形成性化合物のインキュベーション後に少なくとも約30分にわたって検出される、請求項24に記載の方法。
- 前記1以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約40分にわたって検出される、請求項38に記載の方法。
- 前記1以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約60分にわたって検出される、請求項39に記載の方法。
- 前記1以上の細胞内タンパク質が、キナーゼである、請求項38に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ERK1を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ERK2を含む、請求項41に記載の方法。
- 骨量の損失によって少なくとも部分的に現れる疾患または状態を処置する方法であって、骨形成を促進し、それによって該骨量の損失を予防、阻害または対抗するに有効な量の、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の1以上の細胞内タンパク質の活性を増強し得る骨形成性化合物を含む薬学的組成物を患者に投与する工程を包含し、ここで該活性が、骨形成を示す、方法。
- 前記薬学的組成物が、断続的に投与される、請求項44に記載の方法。
- 前記患者が、哺乳動物である、請求項44に記載の方法。
- 前記患者がヒトである、請求項46に記載の方法。
- 前記患者への骨吸収阻害因子の同時投与をさらに包含する、請求項44に記載の方法。
- 前記骨吸収阻害因子が、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、SERMおよびカルシウムからなる群より選択される、請求項48に記載の方法。
- 前記患者への1以上のさらなる骨形成因子の同時投与をさらに包含する、請求項44に記載の方法。
- 1以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項50に記載の方法。
- 前記疾患または状態が、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、歯周疾患、骨格への転移、癌、加齢性骨損失、骨減少症、および変性関節疾患からなる群より選択される、請求項44に記載の方法。
- 前記細胞内タンパク質が、キナーゼを含む、請求項44に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ERK1、ERK2、Pl3キナーゼ、IKK、Akt、JNK、およびp38からなる群より選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ERK1を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ERK2を含む、請求項54に記載の方法。
- 前記細胞内タンパク質が、IKB−αおよびIKB−βから選択される、請求項44に記載の方法。
- 前記増強された活性が、キナーゼのリン酸化を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記増強された活性が、ERK1、ERK2、IKK、Pl3キナーゼ、Akt、JNK、およびp38からなる群より選択されるキナーゼのリン酸化を含む、請求項58に記載の方法。
- 前記増強された活性が、ERK1のリン酸化を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記増強された活性が、ERK2のリン酸化を含む、請求項59に記載の方法。
- 前記1以上の細胞内タンパク質の活性が、前記骨芽細胞または骨芽細胞前駆体との前記骨形成性化合物のインキュベーション後に少なくとも約30分にわたって検出される、請求項44に記載の方法。
- 前記1以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約40分にわたって検出される、請求項62に記載の方法。
- 前記1以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約60分にわたって検出される、請求項63に記載の方法
- 前記1以上の細胞内タンパク質が、キナーゼである、請求項62に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ERK1を含む、請求項65に記載の方法。
- 前記キナーゼが、ERK2を含む、請求項65に記載の方法。
- 骨形成のプロセスを増強する方法であって、骨形成が所望される場合、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の1以上のホスファターゼを不活化し得る骨形成性化合物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、該不活化は、骨形成を示す、方法。
- 前記増強が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記プロセスが、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記所望の骨形成が、骨の骨折部位での骨形成を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記所望の骨形成が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記ホスファターゼが、ERK1特異的ホスファターゼ、ERK2特異的ホスファターゼ、Pl3キナーゼ特異的ホスファターゼ、IKK特異的ホスファターゼ、Akt特異的ホスファターゼ、JNK特異的ホスファターゼ、およびp38特異的ホスファターゼからなる群より選択される、請求項68に記載の方法。
- 前記ホスファターゼが、ERK1特異的ホスファターゼを含む、請求項73に記載の方法。
- 前記ホスファターゼが、ERK2特異的ホスファターゼを含む、請求項73に記載の方法。
- 前記不活化が、ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項68に記載の方法。
- 前記不活化が、ERK1特異的ホスファターゼ、ERK2特異的ホスファターゼ、IKK特異的ホスファターゼ、Pl3キナーゼ特異的ホスファターゼ、Akt特異的ホスファターゼ、JNK特異的ホスファターゼ、およびp38特異的ホスファターゼからなる群より選択されるホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項76に記載の方法。
- 前記不活化が、ERK1特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記不活化が、ERK2特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項77に記載の方法。
- 骨量の損失によって少なくとも部分的に現れる疾患または状態を処置する方法であって、骨形成を促進し、それによって該骨量の損失を予防、阻害または対抗するに有効な量の、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の1以上ホスファターゼを不活化し得る骨形成性化合物を含む薬学的組成物を患者に投与する工程を包含し、ここで、該不活化が骨形成を示す、方法。
- 前記薬学的組成物が、断続的に投与される、請求項80に記載の方法。
- 前記患者が、哺乳動物である、請求項80に記載の方法。
- 前記患者が、ヒトである、請求項82に記載の方法。
- 前記患者への骨吸収阻害因子の同時投与をさらに包含する、請求項80に記載の方法。
- 前記骨吸収阻害因子が、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、SERMおよびカルシウムからなる群より選択される請求項84に記載の方法。
- 前記患者への1以上のさらなる骨形成因子の同時投与をさらに包含する、請求項80に記載の方法。
- 1以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項86に記載の方法
- 前記疾患または状態が、骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、骨形成不全、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、骨軟化症、骨石灰脱失症、骨溶解性骨疾患、骨壊死、パジェット病、慢性関節リウマチ、炎症性関節炎、骨髄炎、コルチコステロイド処置、歯周疾患、骨格への転移、癌、加齢性骨損失、骨減少症、および変性関節疾患からなる群より選択される、請求項80に記載の方法。
- 前記ホスファターゼが、ERK1特異的ホスファターゼ、ERK2特異的ホスファターゼ、Pl3キナーゼ特異的ホスファターゼ、IKK特異的ホスファターゼ、Akt特異的ホスファターゼ、JNK特異的ホスファターゼ、およびp38特異的ホスファターゼからなる群より選択される、請求項80に記載の方法。
- 前記ホスファターゼが、ERK1特異的ホスファターゼを含む、請求項89に記載の方法。
- 前記ホスファターゼが、ERK2特異的ホスファターゼを含む、請求項89に記載の方法。
- 前記不活化が、ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項80に記載の方法。
- 前記不活化が、ERK1特異的ホスファターゼ、ERK2特異的ホスファターゼ、IKK特異的ホスファターゼ、Pl3キナーゼ特異的ホスファターゼ、Akt特異的ホスファターゼ、JNK特異的ホスファターゼ、およびp38特異的ホスファターゼからなる群より選択されるホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項92に記載の方法
- 前記不活化が、ERK1特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項93に記載の方法。
- 前記不活化が、ERK2特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項93に記載の方法。
- 骨形成を刺激するための組成物であって、RANKL、RANKL融合タンパク質、アナログ、誘導体または模倣物のうちの1以上のオリゴマー複合体の有効量を含む、組成物。
- 薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアをさらに含む、請求項96に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項96に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項96に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、骨の骨折部位での骨形成の刺激を含む、請求項96に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成の刺激を含む、請求項96に記載の組成物。
- 前記アナログ、誘導体または模倣物が、組換えRANKLタンパク質またはそのフラグメントを含む、請求項96に記載の組成物。
- 前記融合タンパク質が、GST−RANKLを含む、請求項96に記載の組成物。
- 前記融合タンパク質が、AP−RANKLを含む、請求項96に記載の組成物。
- 前記融合タンパク質が、ロイシンジッパー−RANKLを含む、請求項96に記載の組成物。
- 前記RANKL誘導体が、TALL−1のフラップ領域を含むRANKLタンパク質を含む、請求項96に記載の組成物。
- 1以上の骨吸収阻害因子をさらに含む、請求項96に記載の組成物。
- 前記骨吸収阻害因子が、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、SERMおよびカルシウムからなる群より選択される、請求項107に記載の組成物。
- 1以上のさらなる骨形成因子をさらに含む、請求項96に記載の組成物。
- 1以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項109に記載の組成物。
- 骨形成を刺激するための組成物であって、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の1以上の細胞内タンパク質の活性を増強し得る骨形成性化合物の有効量を含み、ここで、該活性が、骨形成を示す、組成物。
- 薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアをさらに含む、請求項111に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項111に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項111に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、骨の骨折部位での骨形成の刺激を含む、請求項111に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成の刺激を含む、請求項111に記載の組成物。
- 1以上の骨吸収阻害因子をさらに含む、請求項111に記載の組成物。
- 前記骨吸収阻害因子が、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、SERMおよびカルシウムからなる群より選択される、請求項117に記載の組成物。
- 1以上のさらなる骨形成因子をさらに含む、請求項111に記載の組成物。
- 1以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項119に記載の組成物。
- 前記細胞内タンパク質が、キナーゼを含む、請求項111に記載の組成物。
- 前記キナーゼが、ERK1、ERK2、Pl3キナーゼ、IKK、Akt、JNK、およびp38からなる群より選択される、請求項121に記載の組成物。
- 前記キナーゼが、ERK1を含む、請求項122に記載の組成物。
- 前記キナーゼが、ERK2を含む、請求項122に記載の組成物。
- 前記細胞内タンパク質が、IKB−αおよびIKB−βから選択される、請求項111に記載の組成物。
- 前記増強された活性が、キナーゼのリン酸化を含む、請求項111に記載の組成物。
- 前記増強された活性が、ERK1、ERK2、IKK、Pl3キナーゼ、Akt、JNK、およびp38からなる群より選択されるキナーゼのリン酸化を含む、請求項126に記載の組成物。
- 前記増強された活性が、ERK1のリン酸化を含む、請求項127に記載の組成物。
- 前記増強された活性が、ERK2のリン酸化を含む、請求項127に記載の組成物。
- 前記1以上の細胞内タンパク質の活性が、前記骨芽細胞または骨芽細胞前駆体との前記骨形成性化合物のインキュベーション後に少なくとも約30分にわたって検出される、請求項111に記載の組成物。
- 前記1以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約40分にわたって検出される、請求項130に記載の組成物。
- 前記1以上の細胞内タンパク質の活性が、少なくとも約60分にわたって検出される、請求項131に記載の組成物。
- 前記1以上の細胞内タンパク質が、キナーゼである、請求項130に記載の組成物。
- 前記キナーゼが、ERK1を含む、請求項133に記載の組成物。
- 前記キナーゼが、ERK2を含む、請求項133に記載の組成物。
- 骨形成を刺激するための組成物であって、骨芽細胞または骨芽細胞前駆体中の1以上のホスファターゼを不活化し得る骨形成性化合物の有効量を含み、ここで、該不活性は、骨形成を示す、組成物。
- 薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアをさらに含む、請求項136に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、活性化骨芽細胞数の増加および骨芽細胞増殖の増加からなる群より選択される、請求項136に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、骨芽細胞前駆体分化の増強および骨芽細胞前駆体増殖の増強から選択される、請求項136に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、骨の骨折部位での骨形成の刺激を含む、請求項136に記載の組成物。
- 前記骨形成の刺激が、骨と同種移植片との連結部、骨と自己移植片との連結部、骨と骨プロテーゼとの連結部、または椎骨体融合部での骨形成の刺激を含む、請求項136に記載の組成物。
- 1以上の骨吸収阻害因子をさらに包含する、請求項136に記載の組成物。
- 前記骨吸収阻害因子が、ビスホスホネート、カルシトニン、カルシトリオール、エストロゲン、SERMおよびカルシウムからなる群より選択される、請求項142に記載の組成物。
- 1以上のさらなる骨形成因子をさらに含む、請求項136に記載の組成物。
- 1以上のさらなる骨形成因子が、副甲状腺ホルモンもしくはその誘導体、骨形態形成タンパク質、オステオゲニン、またはスタチンからなる群より選択される、請求項144に記載の組成物。
- 前記ホスファターゼが、ERK1特異的ホスファターゼ、ERK2特異的ホスファターゼ、Pl3キナーゼ1特異的ホスファターゼ、IKK特異的ホスファターゼ、Akt特異的ホスファターゼ、JNK特異的ホスファターゼ、およびp38特異的ホスファターゼからなる群より選択される、請求項136に記載の組成物。
- 前記ホスファターゼが、ERK1特異的ホスファターゼを含む、請求項146に記載の組成物。
- 前記ホスファターゼが、ERK2特異的ホスファターゼを含む、請求項146に記載の組成物。
- 前記不活化が、ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項136に記載の組成物。
- 前記不活化が、ERK1特異的ホスファターゼ、ERK2特異的ホスファターゼ、IKK特異的ホスファターゼ、Pl3キナーゼ特異的ホスファターゼ、Akt特異的ホスファターゼ、JNK特異的ホスファターゼ、およびp38特異的ホスファターゼからなる群より選択されるホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項149に記載の組成物。
- 前記不活化が、ERK1特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項150に記載の組成物。
- 前記不活化が、ERK2特異的ホスファターゼの脱リン酸化を含む、請求項150に記載の組成物。
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