ITPZ20130002A1 - Metodo e apparato, o kit, per la diagnosi e/o il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale - Google Patents

Metodo e apparato, o kit, per la diagnosi e/o il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale

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ITPZ20130002A1
ITPZ20130002A1 IT000002A ITPZ20130002A ITPZ20130002A1 IT PZ20130002 A1 ITPZ20130002 A1 IT PZ20130002A1 IT 000002 A IT000002 A IT 000002A IT PZ20130002 A ITPZ20130002 A IT PZ20130002A IT PZ20130002 A1 ITPZ20130002 A1 IT PZ20130002A1
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citrate lyase
atp citrate
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Uni Degli Studi Della Basil Icata
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Description

"METODO E APPARATO, O KIT, PER LA DIAGNOSI E/O IL MONITORAGGIO DI PROCESSI INFIAMMATORI DEL CORPO UMANO OD ANIMALE"
CAMPO DI APPLICAZIONE
II presente trovato si riferisce ad un metodo e apparato, o kit, per la diagnosi e/o il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale, in particolare in uno o più campioni di sangue intero, tipicamente sangue periferico, prelevati da un paziente.
STATO DELLA TECNICA
E’ noto che la risposta infiammatoria nel corpo umano od animale à ̈ una complessa cascata di eventi indotta da infezioni o danni ai tessuti ed à ̈ associata a numerose patologie croniche e/o degenerative (M.Y. Donath, S.E. Shoelson, Nat Rev Immunol 11 (2011) 98-107 and H. Jaeschke, J. Gastroenterol Hepatol Suppl 1 (2011) 173-179). Per questo può essere desiderabile diagnosticare precocemente uno stato infiammatorio e monitorare nel tempo l’infiammazione per esempio durante un trattamento farmacologico.
E’ noto che un marker dello stato infiammatorio à ̈ la velocità di eritrosedimentazione dei globuli rossi (ESR o VES), tuttavia la ESR varia lentamente.
Un altro marker noto à ̈ la proteina C reattiva (CRP), la quale à ̈ un marcatore di infiammazione più precoce, e quindi preferibile, rispetto a ESR. La CRP à ̈ prodotta principalmente dal fegato in seguito ad un processo infiammatorio e si trova nel plasma dopo 4-6h dall’inizio dell’evento che scatena l’infiammazione (Wen D, Zhou XL, et al. Clin Chim Acta 413 (2012) 198-202) o dopo 9 ore dall’induzione con lipopolisaccaridi.
Tuttavia non sempre la proteina C reattiva può dare indicazioni sull’infiammazione. Infatti, nel rischio di patologie cardiovascolari, patologie strettamente associate a processi infiammatori, la CRP spesso non à ̈ un valido predittore (Wen D, Zhou XL, et al. Clin Chim Acta 413 (2012) 198-202).
In sintesi, i marker infiammatori comunemente usati e cioà ̈ ESR e CRP presentano delle limitazioni:
- la ESR subisce variazioni nel tempo molto lentamente;
- la CRP à ̈ precoce rispetto alla ESR ma comincia ad aumentare dopo 4-6 o anche 10 ore, a seconda dell’induttore dell’infiammazione. Questo perché la CRP non viene prodotta direttamente dalle cellule del sistema immunitario ma dal fegato e poi secreta nel plasma. Inoltre, la CRP non risulta essere predittiva di tutte le patologie infiammatorie. Infatti molte patologie cardiocircolatorie, pur avendo una forte componente infiammatoria, non possono essere diagnosticate e monitorate mediante la misurazione di CRP.
Quindi, individuare nuovi marker del infiammazione e soprattutto marker precoci può sicuramente migliorare la diagnosi e il monitoraggio delle numerose patologie infiammatorie, in termini di affidabilità e di rapidità.
Scopo del presente trovato à ̈ pertanto quello di soddisfare un’esigenza sentita di individuare nuovi target del processo infiammatorio.
Altro scopo à ̈ quello di prevedere un metodo e apparato, o kit, per la diagnosi di processi infiammatori del corpo umano od animale.
Ulteriore scopo à ̈ quello di prevedere un metodo e apparato, o kit, per il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale.
Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovaio.
Salvo che siano definiti altrimenti, tutti i termini tecnici e scientifici utilizzati qui e di seguito hanno lo stesso significato comunemente inteso da una persona di ordinaria esperienza nel campo della tecnica cui appartiene il presente trovato. Anche se metodi e materiali simili o equivalenti a quelli qui descritti possono essere utilizzati nella prafica o nelle prove di verifica del presente trovato, di seguito sono descritti, a titolo di esempio, i metodi e i materiali. In caso di conflitto prevale la presente domanda, incluse le definizioni. I materiali, metodi ed esempi hanno carattere puramente illustrativo e non devono essere intesi in modo limitativo.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO
Il presente trovato à ̈ espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti, mentre le relative rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del presente trovato o varianti dell’idea di soluzione principale.
La Richiedente, in modo del tutto inedito e non prevedibile dallo stato della tecnica, ha riscontrato sperimentalmente la sovraespressione genica di ATP citrato liasi (ACLY) nei processi infiammatori nel corpo umano od animale.
In particolare, la Richiedente ha evidenziato le variazioni nei livelli di espressione genica di ACLY in risposta a diversi stimoli infiammatori.
La Richiedente, quindi, propone ATP citrato liasi come nuovo target del processo infiammatorio, cioà ̈ del pathway dell’ infiammazione.
Tale riscontro sperimentale ha, dunque, portato la Richiedente a prevedere l’uso di inibitori di ATP citrato liasi per il trattamento terapeutico di processi infiammatori nel corpo umano od animale.
Forme di realizzazione, in particolare, possono essere relative all’uso di inibitori di ATP citrato liasi per la produzione di un medicamento o farmaco per l’uso nel trattamento terapeutico di processi infiammatori nel corpo umano od animale.
Ancora, ulteriori forme di realizzazione qui descritte sono relative ad inibitori di ATP citrato liasi per l’uso nel trattamento terapeutico di processi infiammatori nel corpo umano od animale.
In forme di realizzazione, uno o più inibitori di ATP citrato liasi sono scelti da un gruppo includente acido idrossicitrico, o suoi sali, e radicicol.
Inoltre, la Richiedente prevede forme di realizzazione qui descritte le quali sono relative ad un metodo per la diagnosi di processi infiammatori del corpo umano od animale che supera i limiti della tecnica nota ed elimina i difetti in essa presenti. Il metodo include la rilevazione di un’espressione genica di ATP citrato liasi, in particolare in un campione di sangue intero. Il metodo diagnostico del presente trovato non à ̈ praticato sul corpo umano od animale. In forme di realizzazione, il metodo del presente trovato à ̈ praticato su un campione di sangue intero, tipicamente un campione di sangue intero periferico.
Forme di realizzazione qui descritte sono relative anche ad un metodo per il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale che include rilevazioni sequenziali nel tempo dell’espressione genica di ATP citrato liasi e può includere il confronto tra i livelli di espressione genica di volta in volta rilevati. Sulla base di tale confronto à ̈ possibile, ad esempio, valutare l’andamento o l’evoluzione nel tempo del processo infiammatorio, effettuare o modificare una diagnosi o prognosi, predisporre o modificare un trattamento terapeutico o farmacologico.
In forme di realizzazione, la rilevazione dell’espressione genica di ATP citrato liasi viene effettuata in uno o più campioni di sangue intero che sono stati prelevati, ad esempio con cadenza temporale definita, da un paziente.
In forme di realizzazione, un metodo per la diagnosi o per il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale può includere la valutazione se l’espressione genica rilevata à ̈ una sovraespressione genica di ATP citrato liasi rispetto a valori standard e la correlazione dei livelli di espressione genica individuati con livelli predeterminati di infiammazione.
Livelli di sovraespressione genica di ATP citrato liasi non nella norma correlano dunque con possibili stati infiammatori e possono quindi essere considerati come indice di probabili stati infiammatori presenti nel campione di sangue intero prelevato dal paziente. Ciò può fornire, in tempi rapidi ed in modo affidabile, un’indicazione su eventuali ulteriori diagnosi più approfondite o mirate oppure su terapie farmacologiche da seguire.
Ulteriori forme di realizzazione qui descritte sono relative ad un apparato, o kit, per la diagnosi di processi infiammatori del corpo umano od animale che include uno o più mezzi di rilevazione di un’espressione genica di ATP citrato liasi per la valutazione se l’espressione genica rilevata à ̈ una sovraespressione genica di ATP citrato liasi rispetto a valori standard e la correlazione dei livelli di espressione genica individuati con livelli predeterminati di infiammazione, per fornire, in base alla correlazione effettuata, un’indicazione su eventuali ulteriori diagnosi più approfondite o mirate oppure su terapie da seguire.
Ulteriori forme di realizzazione qui descritte sono relative ad un apparato, o kit, per il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale che include uno o più mezzi di rilevazione utilizzabili per rilevazioni sequenziali nel tempo dell’espressione genica di ATP citrato liasi ai fini del confronto tra i livelli di espressione genica di volta in volta rilevati.
DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE
L’ATP citrato Liasi (nella presente trattazione indicata anche con l’acronimo ACLY) à ̈ un enzima citosolico che catalizza la scissione del citrato in ossalacetato e Acetil-CoA [Kornacker, M.S. et al. Biochem. J. (1965) 95: 832-837], Distribuito in vari tessuti umani, à ̈ noto il suo ruolo fondamentale nella lipogenesi epatica e nel metabolismo della secrezione pancreatica dell’insulina [Shimano H et al. J Biol Chem. (1999) 274: 35832-35839; Guay C et al. J Biol Chem. 2007 282: 35657-35665 ], ma non à ̈ mai stato evidenziato il suo coinvolgimento nei meccanismi cellulari del sistema immunitario. L’attività biologica dell’enzima ACLY à ̈ stata finora studiata solo a livello epatico e del pancreas endocrino (Claudiane Guay et al. JBC (2007) 282, 35657-35665 and Iichiro Shimomura et al. JBC (1998) 273, 35299-35306) e mai associata al pathway infiammatorio.
La Richiedente ha trovato che l’espressione genica di ACLY aumenta durante il processo infiammatorio, in quanto la sua attività à ̈ essenziale per la produzione dei principali mediatori dell’infiammazione.
Tale risultanza sperimentale à ̈ alla base della previsione che ACLY possa essere un marker della presenza di processi infiammatori, così come del monitoraggio di patologie infiammatorie croniche.
A questo proposito l’espressione genica di ACLY nei macrofagi à ̈ estremamente elevata anche rispetto a cellule epatiche, dove finora si pensava svolgesse la sua principale funzione nella biosintesi degli acidi grassi. Inoltre la sovraespressione genica di ACLY à ̈ molto rapida: dopo 1 ora dalla stimolazione con TNFa, IFNy, TNFa IFNy e dopo 16 ore dall’aggiunta di lipopolisaccaride (LPS).
Di conseguenza, forme di realizzazione qui descritte propongono anche metodi e apparanti, o kit, per la diagnosi e il monitoraggio di processi infiammatori, ovvero di processi infiammatori nel corpo umano od animale.
Forme di realizzazione prevedono un metodo per la diagnosi di processi infiammatori del corpo umano od animale che supera i limiti della tecnica nota ed elimina i difetti in essa presenti.
Il metodo include la rilevazione di un’espressione genica di ATP citrato liasi e può includere la valutazione se l’espressione genica rilevata à ̈ una sovraespressione genica di ATP citrato liasi rispetto a valori standard e la correlazione dei livelli di espressione genica individuati con livelli predeterminati di infiammazione, per fornire, in base alla correlazione effettuata, un’indicazione su eventuali ulteriori diagnosi più approfondite o mirate oppure su terapie da seguire.
Forme di realizzazione prevedono un metodo per il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale che include rilevazioni sequenziali nel tempo dell’espressione genica di ATP citrato liasi ed il confronto tra i livelli di espressione genica di volta in volta rilevati.
In forme di realizzazione, la rilevazione di un’espressione genica di ATP citrato liasi include:
- isolamento di linfomonociti da sangue periferico;
- estrazione di mRNA dai linfomonociti;
- retrotrascrizione in cDNA;
- esecuzione di Real-time PCR con il cDNA ottenuto.
In forme di realizzazione, l’isolamento di linfomonociti include:
- diluizione del sangue periferico;
- centrifugazione;
- recupero e lavaggio dei linfomonociti;
- coltura cellulare dei linfomonociti.
In forme di realizzazione, l’estrazione di mRNA prevede pellettizzazione dei linfomonociti mediante centrifugazione e successiva estrazione di mRNA.
In forme di realizzazione, la Real-Time PCR à ̈ stata effettuata mediante Taqman probes fluorescenti per la quantificazione dell’amplicone.
In forme di realizzazione, può essere prevista un’operazione di conferma della sovraespressione di ACLY mediante westen-blotting utilizzando uno specifico anticorpo per ATP citrato liasi.
Vantaggiosamente, la rilevazione di un’eventuale sovraespressione genica di ATP citrato liasi con il presente trovato richiede un tempo molto limitato, tra 5 e 7 ore, ad esempio circa 6 ore, rispetto alle metodiche note per la diagnosi ed il monitoraggio dei processi infiammatori o dei processi infiammatori. Inoltre, il presente trovato garantisce una diagnosi e monitoraggio affidabili.
Forme di realizzazione prevedono un apparato, o kit, per la diagnosi di processi infiammatori del corpo umano od animale che include mezzi di rilevazione di un’espressione genica di ATP citrato liasi, per la valutazione se l’espressione genica rilevata à ̈ una sovraespressione genica di ATP citrato liasi rispetto a valori standard e la correlazione dei livelli di espressione genica individuati con livelli predeterminati di infiammazione, per fornire, in base alla correlazione effettuata, un’indicazione su eventuali ulteriori diagnosi più approfondite o mirate oppure su terapie da seguire. Forme di realizzazione prevedono un apparato, o kit, per il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale che include uno o più mezzi di rilevazione utilizzabili per rilevazioni sequenziali nel tempo dell’espressione genica di ATP citrato liasi ai fini del confronto tra i livelli di espressione genica di volta in volta rileva ti.
In forme di realizzazione, i mezzi di rilevazione di un’espressione genica di ATP citrato liasi includono:
- mezzi per l’isolamento di linfomonociti da sangue periferico;
- mezzi per l’estrazione di mRNA dai linfomonociti;
- mezzi per la retrotrascrizione in cDNA;
- mezzi per l’esecuzione di Real-time PCR con il cDNA ottenuto.
DATI SPERIMENTALI
La Richiedente ha riscontrato sperimentalmente che l’espressione genica dell’enzima ATP citrato Liasi (ACLY) aumenta sia come mRNA che come proteina quando viene attivato il pathway infiammatorio, come discusso in relazione con i connessi dati sperimentali presentati di seguito.
I livelli di espressione genica dell’enzima ACLY sono stati valutati sia come mRNA mediante Real-time PCR che come proteina mediante westem-blotting.
Per valutare le variazioni di espressione genica di ACLY in colture cellulari di macrofagi di ratto e umani trattati con LPS, TNFα, IFNy, TNFα IFNy, à ̈ stato effettuato un time-couse dei livelli di mRNA che ha rivelato la massima attivazione di ACLY dopo 1 ora dall’aggiunta di TNFa, IFNy, TNFa IFNy e dopo 16 ore dall’aggiunta di LPS, si veda Figura 1 e Figura 2, in cui tutti i dati riportati nei grafici si riferiscono alle colture di macrofagi umani. Risultati simili sono stati ottenuti per tutte le linee cellulari utilizzate e cioà ̈ sia linfomonociti isolati da sangue periferico sia colture di macrofagi umani e di ratto.
CELLULE UTILIZZATE
Per questi studi sono state utilizzate cellule umane U937, una linea di cellule macrofagi-simile ampiamente utilizzata nello studio dell’infiammazione e che può essere stimolata con lipopolisaccaride (LPS) o con altre molecole per riprodurre la stessa risposta infiammatoria dei macrofagi attivati, linfomonociti isolati da sangue periferico umano e macrofagi di ratto.
ISOLAMENTO DEI LINFOMONOCITI DA SANGUE PERIFERICO UMANO
Sono stati utilizzati 5 campioni di sangue periferico umano fomiti da un centro trasfusionale.
Per separare i monociti dalle altre cellule, il sangue à ̈ stato diluito nel rapporto di 1:2 con Hank’s Balanced Salt Solution IX (HBSS) (Gibco, Invitrogen, Italy), stratificato su Ficoll Histopaque (Sigma Aldrich, Milano, Italy) e successivamente centrifugato a 2600 rpm, a temperatura ambiente, per 15 minuti. L’anello di linfomonociti ottenuto all’interfaccia tra lo strato di HBSS e lo strato di Ficoll, à ̈ stato recuperato e lavato 2 volte in RPMI-1640 completo a 2000 rpm per 10 minuti. Per mezzo del trypan blue à ̈ stata valutata la vitalità cellulare e pertanto le cellule sono state seminate in numero opportuno, in fiasche da 25cm<2>(Falcon) e riposte in incubatore a 37°C in atmosfera al 5% di C02 per 24h.
COLTURE CELLULARI E TRATTAMENTI
Le colture cellulari di macrofagi umani, linfomonociti isolati da sangue periferico umano e macrofagi di ratto sono state allestite in RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) supplementato con 10% (v/v) siero fetale bovino, 2 mM L-glutammina, 100 U penicillina e 100 Î1⁄4g/ml streptomicina in incubatori a C02 (5%) alla temperatura controllata di 37 °C. I macrofagi di ratto sono cellule già differenziate, quindi, 24h dopo la semina sono state trattate con i diversi induttori dell’infiammazione: LPS (200ng/ml), TNFα (5ng/ml), IFNy (10ng/ml), TNFα IFNy (5ng/ml 10ng/ml). Le cellule umane invece sono monociti che dopo la semina sono state differenziate in macrofagi mediante 10ng/ml di PMA (forbolo-miristato-acetato) per 24h. Il differenziamento comporta l’adesione cellulare. Solo dopo il differenziamento cellulare, i macrofagi sono stati trattati con i diversi induttori dell’infiammazione: LPS (200ng/ml), TNFα (5ng/ml), IFNy (10ng/ml), TNFα IFNy (5ng/ml 10ng/ml).
ESTRAZIONE DI RNA, RETROTRASCRIZIONE E REAL- TIME PCR
Per gli esperimenti di Real-Time PCR, circa 3x10<6>cellule per campione, ottenute dalle colture cellulari come sopra descritto, sono state lavate con PBS (Tampone fosfato salino) e staccate con tripsina-EDTA.
Il pellet à ̈ stato ottenuto centrifugando 5 min 4°C 4000 rpm ed utilizzato per estrarre l’RNA (GenEluteâ„¢ Mammalian Total RNA Miniprep, SIGMA). Circa 1Î1⁄4g di RNA estratto da ciascun campione cellulare à ̈ stato retrotrascritto in cDNA (GeneAmp RNA PCR core kit, Applied Biosystem).
Con il cDNA ottenuto à ̈ stata effettuata la Real-Time PCR mediante Taqman probes fluorescenti per la quantificazione dell’amplicone. L’efficienza della real-Time PCR mediante specifici Taqman probes à ̈ dovuta all’utilizzo di una sonda contenente due fluorocromi: FAM (6-carbossi-fluoresceina) oppure VIC come reporter fluorescente legato covalentemente all’estremità 5’ e TAMRA (6-carbossi-tetrametilrodamina) come quencher fluorescente legato covalentemente all’estremità 3’. La stretta vicinanza del reporter e del quencher previene l’emissione di fluorescenza sino a quando il probe à ̈ integro. Il taqman probe à ̈ un oligonucleotide con Tm di circa 10°C più elevato rispetto ai primers, che ibrida in maniera specifica una sequenza interna dell’amplicone in fase di annealing/extension della PCR. Durante la reazione della PCR, la DNA polimerasi estende i primers e, una volta raggiunto il probe, la sua attività 5 ’-3 ’ esonucleasica rimuove progressivamente i nucleotidi a partire dall’estremità 5’. La scissione del probe causa la separazione del reporter e del quencher, per cui, il reporter emette fluorescenza quando viene colpito da un raggio laser ad una determinata lunghezza d’onda.
Negli esperimenti di Real-time PCR à ̈ stato utilizzato un Taqman probe dell’Applied Biosystem specifico per ACLY umano o di ratto (Hs00982738 ml e Rn00566411 ml, rispettivamente). Nello stesso campione à ̈ stata anche valutata l’espressione del gene della β-actina (gene housekeeping) umana o di ratto impiegando uno specifico set di primer e probe forniti dall’ Applied Biosystem. La quantità del prodotto di amplificazione del gene della β-actina può essere impiegata per normalizzare la quantità di mRNA impiegato in ogni reazione. Le reazioni di Real-time PCR sono state condotte in ABI Prism 7000 Sequence Detector System (SDS). I dati di fluorescenza sono raccolti da un computer interfacciato con l’apparecchio e riportati in formato grafico attraverso l’impiego di un software. Con questa tecnica in un tempo brevissimo (ad esempio Ih e 48 minuti) e con estrema sensibilità rispetto agli altri metodi di quantificazione dell’mRNA si riesce a valutare la variazione di espressione genica in numerosi campioni mediante quantificazione relativa.
WESTERN-BLOTTING
La sovraespressione di ACLY à ̈ stata confermata mediante esperimenti di westemblotting utilizzando uno specifico anticorpo per la proteina ACLY (AVIVA- Biosystems). Per normalizzare gli esperimenti à ̈ stato utilizzato un anticorpo specifico per la β-actina. A tal fine circa 100.000 cellule di ogni campione cellulare sono state lisate in Sample buffer lx (60 mM Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerolo, 5% βmercaptoetanolo, 0.01% blue di bromofenolo) e utilizzate per SDS-PAGE. Dopo la corsa elettroforetica le proteine sono state trasferite su membrana di nitrocellulosa e incubate con anticorpo primario e secondario coniugato con perossidasi. L’immunodecorazione à ̈ stata valutata mediante Immobilon Western Chemiluminescent HRP (horseradish peroxidase) Substrate (Millipore).
QUANTIFICAZIONE DI NO, ROS, PGE2 IN PRESENZA DI INIBITORI DI
ACLY
Per verificare che ACLY à ̈ essenziale nel pathway infiammatorio, in colture cellulari di macrofagi di ratto e umane stimolate con LPS (200ng/ml), TNFα (5ng/ml), I-FNy (10ng/ml), TNFα IFNy (5ng/ml 10ng/ml) e trattate con inibitori di ACLY, sono stati quantificati i livelli dei seguenti mediatori dell’infiammazione: ossido nitrico (NO), specie radicaliche dell’ossigeno (ROS), prostaglandina E2 (PGE2). Sono stati testati due inibitori dell’attività di ACLY quali il radicicol e l’acido idrossicitrico o suoi sali, cioà ̈ idrossicitrato, [Ki SW, Ishigami et al. J. Biol. Chem. (2000) 275: 39231-39236 and Guay C, et al. J. Biol. Chem. (2007) 282: 35657-35665] a tempi e concentrazioni diversi. Per ogni tempo e concentrazione di inibitore à ̈ stata valutata la citotossicità mediante il saggio colorimetrico MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio). Quindi sono state scelte le concentrazioni più basse alle quali si osservava l’effetto antinfiammatorio e non vi era tossicità cellulare: 250nM per il radicicol e 500Î1⁄4Îœ per l’idrossicitrato.
La quantificazione dei ROS e dell’NO à ̈ stata valutata dopo 24h dall’aggiunta degli inibitori di ACLY.
La produzione di NO à ̈ stata determinata attraverso la misurazione dei livelli di nitriti nel sovranatante delle colture cellulari. Tale misurazione à ̈ stata eseguita inizialmente con metodo spettrofotometrico, con il reattivo di Griess. I sovranatanti delle colture cellulari, sono stati prelevati e centrifugati a 2000 rpm per 10 min.
L’assorbanza à ̈ stata determinata a 540 nm e la concentrazione dei nitriti, per estrapolazione da una curva standard di NaNO2, espressa in nmol/ml. Questo metodo si à ̈ rivelato poco sensibile per la quantificazione di NO nelle colture cellulari allestite. Quindi à ̈ stato utilizzato un probe fluorescente che ha una sensibilità 500 volte supe riore al metodo spettrofotometrico di Griess. Entrambi gli inibitori di ACLY testati hanno ridotto notevolmente i livelli di NO sia in macrofagi umani che di ratto e, anche se in misura diversa, in risposta a tutti gli induttori dell’ infiammazione testati. Come si vede in Figura 3, sia l’idrossicitrato che il radicicol, quando somministrati contemporaneamente all’induzione dell’infiammazione mediante LPS, sono in grado di riportate i livelli di NO ai valori del controllo (cellule non trattate con LPS). La misura dei ROS à ̈ stata effettuata con il metodo fluorimetrico che sfrutta la trasformazione di diclorofluoresceina diacetato (DCF-DA) in diclorofluoresceina (DCF) in presenza di ROS. La fluorescenza della DCF à ̈ stata misurata mediante un fluorimetro a una lunghezza d’onda di eccitazione di 495 nm e una di emissione di 525 nm. La produzione dei ROS dopo 24 h dall’aggiunta degli inibitori di ACLY sia in macrofagi umani che di ratto à ̈ stata molto minore rispetto alle cellule controllo. Come si vede in Figura 4, l’idrossicitrato ha ridotto la percentuale di ROS tra il 50% ed il 60% ed il radicicol ha ridotto ulteriormente la percentuale di ROS tra il 20% ed il 30%, rispetto alle cellule stimolate con LPS. Entrambi gli inibitori hanno mostrato lo stesso effetto, in risposta a tutti gli induttori dell’infiammazione testati.
La quantificazione della PGE2 secreta à ̈ stata effettuata mediante saggio ELISA condotto su piastra da 96 pozzetti. La quantità di PGE2 secreta à ̈ stata determinata mediante lettura della densità ottica a 450 nm ad un lettore di piastra. Questo ha permesso di misurare in modo quantitativo le prostaglandine secrete nel medium delle colture cellulari. Tutti i campioni sono stati riferiti ad una curva standard di PGE2. La secrezione di PGE2 à ̈ stata valutata dopo 48h dall’aggiunta degli inibitori di ACLY sia in colture di macrofagi di ratto che umani. Anche la produzione di PGE2 à ̈ stata molto minore nei campioni cellulari trattati con gli inibitori di ACLY. Come si vede in Figura 5, l’idrossicitrato ha ridotto la percentuale di PGE2 tra il 40% ed il 50% ed il radicicol ha ridotto la percentuale di ROS tra il 30% ed il 40%, rispetto alle cellule stimolate con LPS. Entrambi gli inibitori hanno mostrato lo stesso effetto e in risposta a tutti gli induttori dell’infiammazione testati.
Dai dati presentati si evince che ACLY risponde a tutti gli induttori dell’infiammazione aumentando i livelli di espressione. Il ruolo di ACLY à ̈ stato confermato utilizzando inibitori dell’attività e dimostrando così che gli inibitori sono in grado di bloccare la produzione di tutte le molecole infiammatorie considerate. Inoltre i livelli di mRNA sono sempre correlati ad un effettivo aumento dei livelli di proteina ACLY.

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la diagnosi di processi infiammatori del corpo umano od animale, caratterizzato dal fatto che comprende la rilevazione di un’espressione genica di ATP citrato liasi, in particolare in un campione di sangue intero.
  2. 2. Metodo per il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale, caratterizzato dal fatto che comprende rilevazioni sequenziali nel tempo dell’espressione genica di ATP citrato liasi ed il confronto tra i livelli di espressione di volta in volta rilevati.
  3. 3. Metodo come nella rivendicazione 1 o 2, caratterizzato dal fatto che comprende: - valutare se l’espressione genica rilevata à ̈ una sovraespressione genica di ATP citrato liasi rispetto a valori standard.
  4. 4. Metodo come nella rivendicazione 1, 2 o 3, caratterizzato dal fatto che comprende: - correlare i livelli di espressione genica individuati con livelli predeterminati di infiammazione, - fornire un’indicazione su eventuali ulteriori diagnosi più approfondite o mirate oppure su terapie da seguire in base alla correlazione effettuata.
  5. 5. Metodo come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, caratterizzato dal fatto che la rilevazione di un’espressione genica di ATP citrato liasi comprende: - isolamento di linfomonociti da sangue intero periferico; - estrazione di mRNA dai linfomonociti; - retrotrascrizione in cDNA; - esecuzione di Real-time PCR con il cDNA ottenuto.
  6. 6. Apparato, o kit, per la diagnosi di processi infiammatori del corpo umano od animale, caratterizzato dal fatto che comprende uno o più mezzi di rilevazione di un’espressione genica di ATP citrato liasi, in particolare in un campione di sangue intero, per la valutazione se l’espressione genica rilevata à ̈ una sovraespressione genica di ATP citrato liasi rispetto a valori standard e la correlazione dei livelli di espressione individuati con livelli predeterminati di infiammazione.
  7. 7. Apparato, o kit, per il monitoraggio di processi infiammatori del corpo umano od animale, caratterizzato dal fatto che comprende uno o più mezzi di rilevazione utilizzabili per rilevazioni sequenziali nel tempo dell’espressione genica di ATP citrato liasi, in particolare in un campione di sangue intero, ai fini del confronto tra i livelli di espressione di volta in volta rilevati.
  8. 8. Apparato, o kit, come nella rivendicazione 6 o 7, caratterizzato dal fatto che detti mezzi di rilevazione della sovraespressione di ATP citrato liasi comprendono: - mezzi per l’isolamento di linfomonociti da sangue intero periferico; - mezzi per l’estrazione di mRNA dai linfomonociti; - mezzi per la retrotrascrizione in cDNA; - mezzi per l’esecuzione di Real-time PCR con il cDNA ottenuto.
  9. 9. Inibitori di ATP citrato liasi per l’uso nel trattamento terapeutico di processi infiammatori nel corpo umano od animale.
  10. 10. Inibitori come nella rivendicazione 9, scelti da un gruppo comprendente acido idrossicitrico, o suoi sali, e radicicol.
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