JP5210156B2 - 炎症性疾患の検出並びに炎症性疾患の予防又は治療用組成物 - Google Patents
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Description
本発明は炎症性サイトカインの産生抑制や炎症モデル動物における生存率の向上をもたらすRANKLにより敗血症、アレルギー、自己免疫疾患などの炎症性疾患を診断し、又は抑制する方法に関する。
近年、外科領域中でも侵襲の大きな手術での周術期や感染症などの救急疾患の急性期では、過剰に産生された液性因子が病態形成に重要な役割を果たしていることが分かっている。これら侵襲下において日々刻々と変化する病態を早期から把握し、臨床に応用するには様々な液性因子の測定が大変重要である。敗血症から複数臓器機能が障害される多臓器不全（multiple organ dysfunction syndrome: MODS）へ至る過程における各種液性因子に関する研究は、分子生物学的手法の開発と相まって飛躍的に進歩した。最近の多臓器不全の研究は細胞レベルの障害機構と微小環境や液性因子を解析して病態に迫るという研究アプローチに移行してきている。すなわち、敗血症による多臓器不全など、その原因は違っても、発生機序や病態は極めて類似しているという認識のもとに、最近では多臓器不全に至る前のもっと早期の段階でかかる病態への移行に関与する因子を制御することが重要視され、現在では臨床家・研究者の目は多臓器不全そのものの治療よりも、その前段階における敗血症の病態解明とそれへの有効な対応策の確立に向けられているといえる。
このような液性因子は炎症マーカーとして有用であるが、具体的にはこれまでCRP(C-reactive protein), TNF-α, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, MIP-1, HMGB-1, MIF, C5a, calcitoninなどが知られている（Marshallら、Crit Care Med 31: 1560, 2003）。CRPは血小板数などと組み合わせて重度の敗血症の予後を評価するのに用いた報告（Asayamaら、Keio J Med 47: 19 1998）はあるが、敗血症と外傷との比較で有意差を認めないという報告（遠藤ら、感染症誌 73: 197 1999）もあり、評価が定まっていない。TNF-αやIL-6についても同様に敗血症と外傷との比較で有意差を認めないという報告（遠藤ら、感染症誌 73: 197 1999）がある一方で、IL-6を敗血症の予後マーカーとして用いている報告（Reinhartら、Crit Care Med 29: 765, 2001）もあり、評価は一定しない。また、IL-10が有効であるという報告（Onoら、Am J Surg 188: 150, 2004）はあるが、まだ十分に検証されているとは言えない。急性呼吸窮迫症候群(ARSD)や気管支喘息などにおいてMIFの関与が報告（Donnellyら、Nat Med 3: 320, 1997; Rossiら、J Clin Invest 101: 2869, 1998）されているが、マーカーとなりうるかどうかは不明である。以上述べた液性因子も敗血症の原因なのか、その結果として産生されてくるのかも明らかになっていない。
炎症反応は侵襲により生体に生じる損傷の拡大を制限し修復する生体反応であり、すべての侵害侵襲に対して非特異的反応として発来する。その本態は神経内分泌反応、免疫炎症反応、凝固線溶反応が密接に関連して生じる生理的生体反応である。局所的には発赤、腫脹、疼痛、熱感、として発現し、侵襲が大きい場合には発熱、瀕脈、瀕呼吸、白血球増加を伴う全身性反応を生じる。これが全身性炎症反応症候群（systemic inflammatory response syndrome: SIRS）であり、外傷、熱傷、膵炎、侵襲の強い術後など感染を伴わない様々な原因によるものと、細菌、真菌、寄生虫、ウイルスなどによる感染を伴うものがある。特に感染に起因するSIRSを敗血症（sepsis）という。
炎症反応は血管拡張、血管透過性亢進、白血球・血管内皮細胞活性化などにより成立する。これらの反応は侵襲に伴い非特異的に産生される補体、アミン、キニン、プロスタノイド、サイトカイン、トロンビンにより引き起こされる。局所的侵害刺激には局所炎症反応が惹起されるが、生体侵襲が大きい場合には、これらの炎症メディエーター（特にサイトカインとトロンビン）の全身逸脱が起こり、全身性の血管拡張、透過性亢進、白血球・血管内皮細胞活性化がみられる。炎症反応は侵害刺激受容、反応、修復の過程をとるが、全身性炎症反応が持続する場合には修復過程に至らず生体の恒常性が破綻する。このような場合、多臓器不全を惹起して生体を死に導くことが知られている。
侵襲に対して生体は防御のため神経・内分泌・免疫系の３系が相互に密接に作用しながら反応する。侵襲に伴い、神経・内分泌系は活性化され、エネルギー代謝の亢進、糖新生、心拍出量の増加などをもたらし、全身の炎症反応像を形成するが、一方でコルチゾールは免疫系を抑制し、またカテコールアミンは免疫細胞であるNK細胞やキラーT細胞の活性を抑制することも知られている。細菌感染や組織障害の発生により補体系や血液凝固系が活性化され、これに伴い血管内皮細胞の活性化や貪食系の細胞である単球、マクロファージ、好中球が遊走し、障害部位でのTNF-αやIL-1を中心とする炎症性サイトカインが遊離される。これら炎症性サイトカインの遊離に伴い、プロテアーゼや活性酸素、血小板活性化因子なども遊離されSIRSの病態を形成していく。したがって、SIRSは高サイトカイン血症によってもたらされた病態とも考えることができる(Riedemannら、Nat Med 9: 517, 2003)。
米国において年間約７５万人が敗血症に罹患し、２１万人以上がそのために命を失っていると報告されている(Wheelerら、N Engl J Med 340: 207, 1999；Severanskyら、Sepsis 3: 11, 1999；Hotchkissら、N Engl J Med 348: 138, 2003)。さらに敗血症の処置はICU入院期間の延長や資源使用増加により、重大な経済的影響をもたらす。しかし、この高炎症性サイトカイン血症とも呼べる敗血症に対しての治療法確立が緊急課題として、世界中で試みられてきたにもかかわらず、敗血症の致死率の改善が得られる治療法はないのが現状である(Vincentら、Clin Infect Dis 34: 1084, 2002)。最近になり、治療法として活性型プロテインC(activated protein C: APC)投与により、有意に重症敗血症の予後の改善が得られるという報告がなされた(Bernardら、N Engl J Med 344: 699, 2001)。米国Food and Drug Administration (FDA)により重症敗血症に対する治療薬として初めて認可されることとなった。しかしながら、その有効性はわずか６−７％程度の救命率の上昇といった程度のものであり、いまだ敗血症は非常に致死性の高い、極めて治癒困難な病的状態であると考えられている。また、活性型プロテインCは凝固抑制機能のみならず、線溶機能を活性化し、血栓形成や炎症を阻害する内因性タンパク質であり(DePaloら、Advances in Sepsis 1: 114, 2001)、対症療法的な作用であるだけでなく、その性質から出血リスクの増大が予想されている。特に、頭蓋内出血は重大な有害事象であり、投与に当たっては禁忌条件を遵守するなどの十分な注意が必要である。この他に試みられてきたものとして以下に示す。
（１） 大量ステロイド：内毒素血症や菌血症動物における前処理としての適応成功に基づき、早期臨床試験において敗血症性ショック患者における大量ステロイド投与の効果を検討したが、大規模二重盲検試験では、敗血症性ショックの発症初期に投与した場合でも有益性は報告されていない（Meduriら、Sepsis 3: 21, 1999；Bernardら、N Engl J Med 317: 1565, 1987；Boneら、Chest 92: 1032, 1987）。
（２）抗内毒素抗体：特異的抗内毒素抗体治療、例えば加熱殺菌E. coli J5に対するポリクローナルヒト免疫グロブリンG、内毒素のlipid Aに対するネズミ(E5)およびヒト化(HA1A)モノクローナル抗体が、重度のグラム陰性菌感染症患者を対象として検討された（Llewelynら、Sepsis 3: 39, 1999）が、大規模試験では有益性は認められなかった。
（３）抗TNF治療：抗TNF治療とは抗TNFモノクローナル抗体と可溶性TNF受容体による炎症性サイトカインの一つであるTNF-αを標的にした中和療法のことを言う。TNF-αの作用を抑制することで多くの敗血症モデルで生存を改善するとの報告があった（Traceyら、Nature 330: 662, 1987；Penningtonら、Clin Infect Dis 17(Suppl 2): S515, 1993）が、その後複数の第II相、第III相臨床試験が行われたにも関わらず、抗TNF治療でTNF-αの作用を抑制すると生存率が改善するという報告はない（Abrahamら、JAMA 273: 934, 1995；Reinhartら、Crit Care Med 24: 733, 1996；Severanskyら、Sepsis 3: 11, 1999；Reinhartら、Crit Care Med 29: S121, 2001）。
（４）IL-1受容体拮抗薬(IL-1Ra)：IL-1も炎症性サイトカインの一つであるが、敗血症の多くの病態を惹起することが知られている（Ohlssonら、Nature 348: 550 1990）。これらの影響は天然のIL-1受容体拮抗物質であるIL-1Raにより抑制することができるが、重度敗血症患者を対象として施行された試験３件（二重盲検試験２件）では、治療群とプラセボ群に生存率の差がないことが示された（Fisherら、JAMA 271: 1836, 1994；Opalら、Crit Care Med 25: 1115, 1997；Severanskyら、Sepsis 3: 11, 1999）。
（５）PAF受容体拮抗薬(PAFra)：血小板凝集因子(PAF)は敗血症中のサイトカイン放出に関与するリン脂質であるが、２件の二重盲検試験はPAF受容体拮抗薬(BN52021)が生存を有意に改善しないことを示した（Dhainautら、Crit Care Med 22: 1720, 1994；Dhainautら、Crit Care Med 26: 1963, 1998；Severanskyら、Sepsis 3: 11, 1999）。最近、他の化合物(BB-882)を用いた第II相臨床試験において、重度敗血症患者の生存を有意に改善しないことが再度示された。
（６）非ステロイド性抗炎症薬：抗プロスタグランジン薬イブプロフェンは二重盲検試験３件で検討されたが、いずれの場合もイブプロフェンの有用性は示されなかった（Bernardら、N Engl J Med 336: 912 1997；Severanskyら、Sepsis 3: 11, 1999）。
（７）ブラジキニン拮抗薬：ブラジキニンは敗血症におけるサイトカイン放出と血管の変化に関与する生物活性ペプチドであるが、２件の二重盲検試験ではブラジキニン拮抗薬による死亡率改善はみられなかった（Feinら、JAMA 277: 482 1997；Severanskyら、Sepsis 3: 11, 1999）。
以上のように敗血症は種々の治療法の進歩にもかかわらず、依然として発症率の抑制が認められず、死亡者数の減少が得られない疾患である。敗血症に対する予防法や治療法の新規開発が求められている。
RANKのリガンドであるRANKLは破骨細胞分化誘導因子であり、これまでにマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）との共存下でマクロファージ系の前駆細胞から破骨細胞を誘導することが知られている（非特許文献１および２を参照）。すなわち、RANKLは骨芽細胞により産生され、マクロファージ系前駆細胞上のRANKに結合し破骨細胞に誘導する。また、この際RANKと構造が類似しているOPG (osteoprotegerin)がデコイ（おとり）レセプターとしてRANKLの作用を抑制する。このように、RANKL及びOPGの量のバランスにより骨代謝が制御されている。RANKLは膜結合タンパク質であるが、その一部は可溶型として血液中に存在する。可溶型RANKL(sRANKL)濃度の変動が認められる骨代謝疾患もいくつか報告されており、骨代謝マーカーとしての有用性が指摘され、医療応用が検討されている(非特許文献３ならびに特許文献１〜３を参照)。また、 OPGとの濃度比すなわち可溶型RANKL/OPGの比によって議論されることもしばしばである。このように従来RANKLは、骨代謝系における役割は知られていたが、自然免疫系における機能は明らかでなく、血中に存在する可溶型RANKLの生物学的な意味もはっきりしていなかった。
特表2004-526748号公報
特表2002-509430号公報
国際公開第WO98/46644号パンフレット
Yasudaら、Proc Natl Acad Sci USA 95: 3597, 1998
Laceyら、Cell 93: 165, 1998
Rogersら、 J Clin Endoceinol Metab 90 : 6323, 2005
本発明はRANKLを用いた感染症、アレルギー、自己免疫疾患などの炎症性疾患による症状の予防又は治療の方法及び予防又は治療用組成物の提供を目的とする。特に、これらの炎症性疾患による致死の予防及び治療を目的とする。また、本発明は炎症性疾患における炎症の度合いや致死などのリスクの予測を調べるマーカーとして血液中、滑液中など体内に存在する膜型及び可溶型RANKL及びOPGの濃度などを測定する方法並びに試薬の提供を目的とする。
上記のように、骨代謝におけるRANKLの役割は知られていたが、自然免疫系における機能は明らかになっておらず、血中に存在するRANKLの生物学的な意味もはっきりしていなかった。
本発明者らは、RANKLが自然免疫系に関与し、自然免疫を制御している可能性を考え、可溶型RANKLのマクロファージに対する作用について検討を行った。その結果、感染による炎症性サイトカイン産生が種々のマクロファージにおいて可溶型RANKLの効果で抑制されていることを見出した。また、血中可溶型RANKL濃度は感染後数時間の間に速やかに低下し、一方、OPG濃度は上昇することから、可溶型RANKL若しくはOPG単独で、又は可溶型RANKLとOPGを組合せることにより鋭敏な感染の新規マーカーとなり得ることを見出した。また、薬剤による敗血症ショックの予防が可溶型RANKLの投与により可能になること、可溶型RANKLを炎症予防剤、又は抗炎症剤として用い得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
[１] 生体試料中のRANKL及び／又はOPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法。
[２] 生体試料中のRANKLをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であって、生体試料中の可溶型RANKL濃度が正常人に比べて低下した場合に、炎症性疾患に罹患していると判定する、[１]の炎症性疾患を検出する方法。
[３] 生体試料中のOPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であって、生体試料中のOPG濃度が正常人に比べて上昇した場合に、炎症性疾患に罹患していると判定する、[１]の炎症性疾患を検出する方法。
[４] 生体試料中のRANKL及びOPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であって、生体試料中の可溶型RANKL/OPG濃度比が正常人に比べて低下した場合に、炎症性疾患に罹患していると判定する、[１]の炎症性疾患を検出する方法。
[５] 生体試料中のRANKLをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であって、生体試料中の細胞上に存在する膜型RANKLをフローサイトメトリー法により測定することを含む、[１]の炎症性疾患を検出する方法。
[６] 生体試料中のRANKL及びOPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出する方法であって、生体試料中の細胞上に存在する膜型RANKLをフローサイトメトリー法により測定し、膜型RANKL測定量/OPG濃度比が正常人に比べて低下した場合に、炎症性疾患に罹患していると判定する、[１]の炎症性疾患を検出する方法。
[７] 生体試料中の細胞が末梢血細胞である[５]又は[６]の炎症性疾患を検出する方法。
[８] 炎症性疾患が、感染症、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患である[１]〜[７]のいずれかの炎症性疾患を検出する方法。
[９] 炎症性疾患が、敗血症である[８]の炎症性疾患を検出する方法。
[１０] 抗RANKL抗体及び／又は抗OPG抗体を含む、RANKL及び／又はOPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[１１] 抗RANKL抗体及び抗OPG抗体を含む、RANKL及び／又はOPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[１２] 炎症性疾患が、感染症、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患である[１０]又は[１１]に記載の炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[１３] 炎症性疾患が、敗血症である[１２]の炎症性疾患を検出するための検出試薬。
[１４] RANKL及び／又はM-CSFを有効成分として含む、炎症性疾患の予防または治療用組成物。
[１５] RANKL及びM-CSFを有効成分として含む、[１４]の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
[１６] 炎症性疾患の予防又は治療用組成物が配合剤である、[１５]の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
[１７] 炎症性疾患の予防又は治療用組成物がRANKLを含む薬剤とM-CSFを含む薬剤とからなるキットである、[１５]の炎症性疾患の予防または治療用組成物。
[１８] RANKL及び／又はM-CSFが手術の前に投与されることを特徴とし、手術後の炎症性疾患を予防する、[１５]〜[１７]のいずれかの炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
[１９] 炎症性疾患が感染症、アレルギー性疾患又は自己免疫疾患である[１５]〜[１８]のいずれかの炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
[２０] 炎症性疾患が、敗血症である[１９]の炎症性疾患の予防又は治療用組成物。
[２１] RANKL及び／又はM-CSFを有効成分として含む、免疫抑制剤。
[２２] RANKL及びM-CSFを有効成分として含む、[２１]の免疫抑制剤。
[２３] 免疫抑制剤が配合剤である、[２２]の免疫抑制剤。
[２４] 免疫抑制剤がRANKLを含む薬剤とM-CSFを含む薬剤とからなるキットである、[２３]の免疫抑制剤。
感染症等の炎症性疾患に罹患した場合、RANKLの発現が低下し、かつOPGの発現が亢進する。従って、RANKL又はOPGの量を測定することにより炎症性疾患の検出・診断を行うことができる。特にRANKL/OPG量比を指標にした場合に、高精度で検出・診断を行うことができる。
さらに、RANKL及び／又はM-CSFは種々のマクロファージに対して炎症性サイトカインの産生を抑制する作用を有する。また、RANKL及び／又はM-CSFは炎症性疾患を予防又は治療することができる。
RANKL（Receptor activator of NF-κB ligand）は、TNFスーパーファミリーのメンバーであるRANK（NF-κBの受容体アクティベーター）のリガンドであり、細胞内ドメイン（RANKのN末端から第１番目から48番目のアミノ酸からなるドメイン）、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する２型貫通タンパク質である（特表2002-509430号公報、国際公開第WO98/46644号パンフレット）。細胞外ドメイン中、N末端から第152番目以降のアミノ酸からなるドメインは、TNFリガンドファミリー相同性ドメインである。
OPG(osteoprotegerin)は、RANKと類似した構造を有し、RANKLに結合し得る。
被験体が炎症性疾患に罹患すると、RANKLの発現が低下し、OPGの発現が亢進し、血液中の可溶型RANKL濃度が低下し、OPG濃度が上昇する。
本発明の方法は、被験体から採取した生体試料中のRANKL及び／又はOPGを測定し、RANKL及び／又はOPGをマーカーとして用いて炎症性疾患を検出する方法である。本発明の方法において測定するRANKLは、血液等の体液である生体試料中に分泌される可溶型RANKL(sRANKL)及び末梢血中などの細胞上に存在する膜型RANKLである。
生体試料としては、血液、血漿、血清、涙、尿、羊水、滑膜液、髄液、細胞抽出液、組織抽出液、細胞、組織などの生体試料が挙げられる。炎症性疾患は全身にその影響が発現する場合が多いので、上記生体試料のなかでも血液、血漿、血清が好ましい。
本発明の方法において、炎症性疾患とは、炎症症状を呈する疾患の総称であり、感染症、アレルギー疾患、自己免疫疾患等が含まれる。例えば、重症の外傷、熱傷、手術侵襲、急性膵炎、腹膜炎、悪性腫瘍、急性腹症（急激な腹痛を主症状とする腹部疾患にして、早急に手術を行う必要がある疾患）、感染症（特に、セラチア、緑膿菌、アシネトバクター、サイトロバクター、エンテロバクター等のグラム陰性菌による院内感染症）、敗血症などのICUでの治療を必要とする重症急性疾患（いわゆるSIRS）などが挙げられる。また、接触過敏症、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、喘息等のアレルギー疾患も対象となる。また、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、光過敏性皮膚炎、手と足の慢性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、全身性剥脱性皮膚炎、うっ血性皮膚炎、局所性擦過皮膚炎、薬物性皮膚炎又は乾癬等の炎症性皮膚疾患も含む。さらに、関節リウマチ、強皮症、皮膚筋炎、自己免疫性血管炎、混合性結合組織病、全身性エリトマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、ヒトアジュバント病などの自己免疫疾患も対象となる。
本発明の方法により、被験体が上記の炎症性疾患に罹患しているか否かを検出・診断することができる。また、上記の炎症性疾患の重症度を評価・判定することができる。特に、敗血症の重症度を評価・判定することができる。
RANKL及び／又はOPGを測定する方法は限定されず、例えばウエスタンブロッティング、EIA、RIA、凝集法、イムノクロマトグラフィー、フローサイトメトリー法等の抗RANKL抗体及び／又は抗OPG抗体を用いた免疫測定法により測定することができる。末梢血等の細胞上の膜結合型RANKLを測定する場合は、フローサイトメトリー法により、細胞上の結合RANKLレベル（RANKL量）を測定すればよい。フローサイトメトリーによる測定は、市販のFACS等のフローサイトメーターを用いて行うことができる。抗RANKL抗体及び／又は抗OPG抗体は公知の方法で作製することができる。抗体を用いて測定を行う場合は、用いる抗体を適宜アルカリフォスファターゼ等の酵素や蛍光色素で標識すればよい。なお、本発明においては可溶型RANKL及び膜型RANKLの細胞外ドメインが測定対象となるので、抗RANKL抗体も可溶型RANKL及び膜型RANKLの細胞外ドメインを認識し、結合する抗体が好ましい。可溶型RANKLは、細胞内ドメインを含まないので、本発明の方法で用いる抗RANKL抗体は、RANKLの細胞内ドメイン以外の細胞外ドメイン、好ましくはTNFリガンドファミリー相同性ドメインに存在するエピトープを認識し得る抗体である。また、市販の抗体を用いることもできる。また、RANKL及び／又はOPGのmRNAを検出して、RANKL及び／又はOPGの発現を検出してもよい。mRNAは、ノーザンブロッティング、RT-PCR法、DNAチップ（DNAマイクロアレイ）を利用した方法等により検出することができる。この際、RANKL及び／又はOPGをコードするmRNAを特異的に測定するために、RANKL及び／又はOPGをコードするmRNAの部分配列に相補的な部分配列からなるプローブ又はプライマーを用いる。RANKL及びOPGの塩基配列は公知であり、公知の塩基配列情報に基づいて、プローブ又はプライマーを設計することができる。該プライマー又はプローブの塩基の数は５〜50、好ましくは10〜30、さらに好ましくは15〜25である。これらの方法は公知の方法で行うことができる。
被験体から採取した試料中のRANKL濃度又は量が正常人のRANKL濃度又は量に比べ有意に低い場合に、又はOPG濃度が正常人のOPG濃度に比べ有意に高い場合に、該被験体は炎症性疾患に罹患していると診断することができる。また、RANKL濃度又は量が低いほど、又はOPG濃度が高いほど、敗血症等の炎症性疾患が重症であると評価判定することができる。
また、被験体から採取した試料中の可溶型RANKLとOPGの濃度の比（可溶型RANKL濃度/OPG濃度）が正常人の比より低い場合、該被験体は炎症性疾患に罹患していると診断することができる。また、可溶型RANKLとOPGの濃度の比が小さいほど、敗血症等の炎症性疾患が重症であると評価判定することができる。
RANKL及び／又はOPGは炎症性疾患に罹患後、数時間内に発現が変化し得るので、本発明の方法によれば、炎症性疾患の初期段階で疾患の検出を行うことができる。また、時間をおいて複数回RANKL及び／又はOPGを測定することにより、より正確に検出することが可能になる。
本発明は、RANKL及び／又はOPGをマーカーとして用い炎症性疾患を検出するための試薬又はキットを包含し、該試薬又はキットは、抗RANKL抗体及び／又は抗OPG抗体を含む。ELISA等で可溶型RANKLおよびOPGを測定する場合、抗体はアルカリフォスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ等の酵素で標識すればよい。また、フローサイトメトリー法で膜結合型RANKLを測定する場合、RANKLに対する抗体は蛍光色素で標識すればよい。
本発明は、さらにRANKL及び／又はOPGからなる炎症性疾患検出のためのマーカーを包含し、さらに炎症性疾患検出のためのRANKL及び／又はOPGのマーカーとしての使用を包含する。
本発明は、さらにRANKL及び／又はM-CSFを有効成分として含む炎症性疾患の治療又は予防用組成物（抗炎症剤）又は免疫抑制剤を包含する。RANKLを単独で、又はRANKL及びM-CSFを組合せて被験体に投与した場合、被験体においてマクロファージによる炎症性サイトカインの産生が抑制され、TLR4レベルが抑制され、また被験体の抗原提示細胞における抗原提示能が抑制される。このことより、RANKL及びM-CSFは、単独で又は組合せて、炎症性疾患の治療又は予防に用いることができ、また被験体の免疫能を抑制することができる。なお、RANKLによるマクロファージのトレランスの惹起（RANKLトレランス）は破骨細胞分化に必要なc-Fos非依存的であることから、RANKLのマクロファージに対する効果は、マクロファージが破骨細胞に分化する過程における「脱マクロファージ化現象」とは異なる。
本発明の予防又は治療用組成物が対象とする炎症性疾患とは、炎症症状を呈する疾患の総称であり、感染症、アレルギー疾患、自己免疫疾患等が含まれる。例えば、重症の外傷、熱傷、手術侵襲、急性膵炎、腹膜炎、悪性腫瘍、急性腹症（急激な腹痛を主症状とする腹部疾患にして、早急に手術を行う必要がある疾患）、感染症（特に、グラム陰性菌による院内感染症）、敗血症などのICUでの治療を必要とする重症急性疾患（いわゆるSIRS）などが挙げられる。また、接触過敏症、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、喘息等のアレルギー疾患も対象となる。また、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、光過敏性皮膚炎、手と足の慢性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、全身性剥脱性皮膚炎、うっ血性皮膚炎、局所性擦過皮膚炎、薬物性皮膚炎又は乾癬等の炎症性皮膚疾患も含む。さらに、関節リウマチ、強皮症、皮膚筋炎、自己免疫性血管炎、混合性結合組織病、全身性エリトマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病、クローン病、ヒトアジュバント病などの自己免疫疾患も対象となる。
本発明の治療用組成物又は免疫抑制剤に用い得るRANKLとして、RANKL、可溶型RANKL、可溶型RANKL誘導体、可溶型RANKLアナログ、可溶型RANKL融合タンパク質、又は可溶型RANKL模倣物が挙げられる。ヒト由来のRANKLの全長塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。可溶型RANKL誘導体又は可溶型RANKLアナログは、RANKLのトランケート体等、RANKLのアミノ酸配列の一部配列からなるタンパク質であって、RANKLの活性を有するタンパク質を含む。可溶型RANKL誘導体は、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列において、第152番目のアミノ酸から始まるTNFリガンドファミリー相同ドメインを含む。可溶型RANKL誘導体として、例えば、第127番目のアミノ酸から第317番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、第140番目のアミノ酸から第317番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は第159番目のアミノ酸から第317番目のアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。さらに、可溶型RANKL誘導体又は可溶型RANKLアナログは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつRANKLの活性を有するタンパク質、あるいは上記のRANKLのアミノ酸配列の部分配列からなるタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつRANKLの活性を有するタンパク質を含む。ここで、１又は数個とは１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１若しくは２個である。可溶型RANKL融合タンパク質とは、可溶型RANKLタンパク質、可溶型RANKL誘導体又は可溶型RANKLアナログに他のタンパク質が融合した融合タンパク質をいう。他のタンパク質としては例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）が挙げられる。配列番号３及び４に、RANKLのアミノ酸配列中第127番目のアミノ酸から第317番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にGSTが融合したタンパク質をコードするDNAの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号５及び６に、RANKLのアミノ酸配列中第140番目のアミノ酸から第317番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にGSTが融合したタンパク質をコードするDNAの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。また、配列番号７及び８に、RANKLのアミノ酸配列中第159番目のアミノ酸から第317番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にGSTが融合したタンパク質をコードするDNAの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。可溶型RANKL模倣物は、RANKLの立体構造に類似した構造を有する化合物であって、RANKLの活性を有する化合物をいう。RANKL、可溶型RANKL、可溶型RANKL誘導体、可溶型RANKLアナログ及び可溶型RANKL融合タンパク質は遺伝子工学的手法により組換えタンパク質として作製することができる。
本発明の予防若しくは治療用組成物又は免疫抑制剤に用いるM-CSFとして、RANKLと同様に、M-CSF、M-CSF誘導体、M-CSFアナログ、M-CSF融合タンパク質、又はM-CSF模倣物が挙げられる。M-CSF、M-CSF誘導体、M-CSFアナログ及びM-CSF融合タンパク質は、遺伝子工学的手法により組換えタンパク質として作製することができる。また、市販のM-CSF製剤を用いることもできる。このようなM-CSFとして、例えばロイコプロール（登録商標、一般名：ミリモスチム）等が挙げられる。
炎症性疾患の予防若しくは治療又は免疫抑制のためには、RANKLを単独で被験体に投与してもよいし、M-CSFを単独で投与してもよい。好ましくは、RANKLとM-CSFの両方を投与する。両方を投与する場合、両者を混合物、すなわち配合剤として同時に投与することができる。また、RANKLを含む組成物とM-CSFを含む組成物を別々に製剤化し、用時に両方の製剤を混合して投与することもできる。さらに、それぞれの製剤を別々に順に投与してもよい。好ましくは、RANKL及びM-CSFを同時に投与する。本発明の予防若しくは治療用組成物又は免疫抑制剤はRANKL及びM-CSFを別々に投与するための、RANKLを含む薬剤とM-CSFを含む薬剤とからなるキットでもある。
また、本発明の炎症性疾患の予防又は治療用組成物は、治療用として用いる場合には、炎症性疾患に罹患している患者に投与すればよい。また、予防用として用いる場合には、炎症性疾患に罹患するおそれのある患者に投与すればよい。例えば、重症感染症に罹患し、敗血症やSIRSのおそれのある患者に投与すればよい。また、手術後の感染を予防するために、侵襲的な手術前に本発明の組成物を前投与してもよい。本発明の、RANKL及び／又はM-CSFを有効成分として含む免疫抑制剤は、組織や臓器を患者に移植する際に、患者に投与すればよい。本発明の免疫抑制剤は、細胞あるいは臓器・組織移植に伴う移植片拒絶、移植片対宿主病を抑制することができる。
本発明の炎症性疾患の予防若しくは治療用組成物又は免疫抑制剤は、種々の形態で投与することができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬、スプレー剤、点眼剤、経鼻投与剤、貼付剤などによる非経口投与を挙げることができる。
本発明の炎症性疾患の予防若しくは治療用組成物又は免疫抑制剤は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、経口投与では、1日約0.001mg〜1000mgであり、１回又は数回に分けて投与すればよい。また、非経口投与では、１回あたり、0.001mg〜1000mgを静脈注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射、座薬、点眼などによって投与すればよい。RANKLとM-CSFを併用する場合、その投与量の比に限定はなく、同量を投与してもよいし、可溶型RANKL又はM-CSFを多く投与してもよい。
本発明はさらに、可溶型RANKL及び／又はM-CSFを予防又は治療を必要とする患者に投与することを含む、感染症疾患の予防若しくは治療方法、又は免疫抑制方法を包含する。
本発明はさらに、可溶型RANKL及び／又はM-CSFの感染症疾患の予防若しくは治療用組成物の製造への使用、又は免疫抑制剤の製造への使用をも包含する。
本発明はさらに、感染症疾患の治療のために用いられる可溶型RANKL及び／若しくはM-CSF、又は免疫抑制のために用いられる可溶型RANKL及び／若しくはM-CSFを包含する。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
本実施例において以下の材料と方法を用いた。
マウス
6〜10週齢のC57BL/6Jマウスはオリエンタル酵母工業より購入した。C57BL/6JバックグラウンドのOPGホモ欠損マウスとコントロールのヘテロマウスは日本クレアより購入した。C57BL/6JバックグラウンドのRANKL欠損マウス、TLR4欠損マウスは病原性微生物を除去した(SPF)環境下で繁殖・飼育した。RANKL欠損マウスには粉エサを与えた。全ての実験は慶應義塾大学医学部若しくはオリエンタル酵母工業の動物実験ガイドラインに従って行った。
6〜10週齢のC57BL/6Jマウスはオリエンタル酵母工業より購入した。C57BL/6JバックグラウンドのOPGホモ欠損マウスとコントロールのヘテロマウスは日本クレアより購入した。C57BL/6JバックグラウンドのRANKL欠損マウス、TLR4欠損マウスは病原性微生物を除去した(SPF)環境下で繁殖・飼育した。RANKL欠損マウスには粉エサを与えた。全ての実験は慶應義塾大学医学部若しくはオリエンタル酵母工業の動物実験ガイドラインに従って行った。
M-CSF依存性マクロファージ
M-CSF依存性骨髄由来マクロファージ(MDBMs)を作るために、まず大腿骨と脛骨を10％ウシ胎児血清(FCS)と抗生物質の入ったダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で洗浄し、骨髄細胞を採取した。セルストレーナーにかけた後、骨髄細胞を一晩培養してから非接着細胞を回収した。回収した非接着細胞は10ng/ml M-CSF存在下で３〜４日培養し、ウェルに接着した細胞をセルスクレーパーで採集、M-CSF依存性骨髄由来マクロファージとして24穴プレート(ファルコン)に１×105/ウェルの密度でまいた。M-CSF依存性脾臓由来マクロファージ(MDSMs)は脾臓細胞より上記と同様の方法で作った。全てのマクロファージは全実験中を通して10ng/ml M-CSF存在下で培養した。
M-CSF依存性骨髄由来マクロファージ(MDBMs)を作るために、まず大腿骨と脛骨を10％ウシ胎児血清(FCS)と抗生物質の入ったダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で洗浄し、骨髄細胞を採取した。セルストレーナーにかけた後、骨髄細胞を一晩培養してから非接着細胞を回収した。回収した非接着細胞は10ng/ml M-CSF存在下で３〜４日培養し、ウェルに接着した細胞をセルスクレーパーで採集、M-CSF依存性骨髄由来マクロファージとして24穴プレート(ファルコン)に１×105/ウェルの密度でまいた。M-CSF依存性脾臓由来マクロファージ(MDSMs)は脾臓細胞より上記と同様の方法で作った。全てのマクロファージは全実験中を通して10ng/ml M-CSF存在下で培養した。
腹腔マクロファージ
腹腔細胞は完全培地(10％FCSと抗生物質の入ったDMEM)で腹腔を洗浄することで採取した。採集された細胞は24穴プレート(ファルコン)に１×105/ウェルの密度でまいた。６時間の培養の後、非接着細胞を除くためにPBS洗浄を行い、新しい培地に交換した。こうして得られた接着細胞を腹腔マクロファージとして使用した。
腹腔細胞は完全培地(10％FCSと抗生物質の入ったDMEM)で腹腔を洗浄することで採取した。採集された細胞は24穴プレート(ファルコン)に１×105/ウェルの密度でまいた。６時間の培養の後、非接着細胞を除くためにPBS洗浄を行い、新しい培地に交換した。こうして得られた接着細胞を腹腔マクロファージとして使用した。
in vitro トレランス実験
マクロファージの前処理は異なる濃度の可溶型RANKL(<0.10エンドトキシン単位/mg, R&D)又はLPS(リポ多糖やエンドトキシンとも呼ばれる、本実施例で使用したのはS.Minnesota Re595, Sigma)で所定の時間行った。培養細胞はその後リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で二度洗浄し、LPS、Salmonella munchen由来のflagellin(Calbiochem)、CpGオリゴヌクレオチド(5’-TCCATgACgTTCCTgATgCT-3’；配列番号12)、コントロールGpCオリゴヌクレオチド(5’-TCCATgAgCTTCCTgATgCT-3’、Proligo；配列番号13)で本文中に記載されているように刺激した。いくつかの実験においては、500U/ml GM-CSF(Pepro Tec)をLPSで刺激する３時間前に加えた。
マクロファージの前処理は異なる濃度の可溶型RANKL(<0.10エンドトキシン単位/mg, R&D)又はLPS(リポ多糖やエンドトキシンとも呼ばれる、本実施例で使用したのはS.Minnesota Re595, Sigma)で所定の時間行った。培養細胞はその後リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で二度洗浄し、LPS、Salmonella munchen由来のflagellin(Calbiochem)、CpGオリゴヌクレオチド(5’-TCCATgACgTTCCTgATgCT-3’；配列番号12)、コントロールGpCオリゴヌクレオチド(5’-TCCATgAgCTTCCTgATgCT-3’、Proligo；配列番号13)で本文中に記載されているように刺激した。いくつかの実験においては、500U/ml GM-CSF(Pepro Tec)をLPSで刺激する３時間前に加えた。
マウスへのLPS投与
LPS(S.Minnesota Re595, Sigma)は腹腔へ投与した。図２３の実施例ではLPS(E. coli O55:B5, Sigma)を用いた。血液は心臓採血によって一定時間後採集し、凝固のため一時間放置後15000rpm、24℃で20分遠心した。血清はサイトカイン定量まで-80℃で保管した。
LPS(S.Minnesota Re595, Sigma)は腹腔へ投与した。図２３の実施例ではLPS(E. coli O55:B5, Sigma)を用いた。血液は心臓採血によって一定時間後採集し、凝固のため一時間放置後15000rpm、24℃で20分遠心した。血清はサイトカイン定量まで-80℃で保管した。
使用細菌の系統と感染実験
感染実験のために、Salmonella enterica serovar Typhimurium χ3306株(以下サルモネラ)を一晩Luria-Bartani培地(LB培地)で静置培養したものを希釈して振とうした後、対数増殖期にある菌を遠心することで回収した。サルモネラはPBSで洗浄した後Hanks塩類液で希釈し、多重感染度(MOI)10でマクロファージに感染させた。37℃で１時間培養してからマクロファージをPBSで洗浄し、細胞外のサルモネラを除去した後、25μg/mlのゲンタマイシンを含む完全培地で培養した。３時間後、培養上清をサイトカイン定量のために回収した。サルモネラの経口感染の際には、感染12時間前からマウスにエサと水は与えず、その後3.3×107 CFU/g体重のサルモネラを経口投与した。血液は４日後に心臓採血にて回収した。
感染実験のために、Salmonella enterica serovar Typhimurium χ3306株(以下サルモネラ)を一晩Luria-Bartani培地(LB培地)で静置培養したものを希釈して振とうした後、対数増殖期にある菌を遠心することで回収した。サルモネラはPBSで洗浄した後Hanks塩類液で希釈し、多重感染度(MOI)10でマクロファージに感染させた。37℃で１時間培養してからマクロファージをPBSで洗浄し、細胞外のサルモネラを除去した後、25μg/mlのゲンタマイシンを含む完全培地で培養した。３時間後、培養上清をサイトカイン定量のために回収した。サルモネラの経口感染の際には、感染12時間前からマウスにエサと水は与えず、その後3.3×107 CFU/g体重のサルモネラを経口投与した。血液は４日後に心臓採血にて回収した。
酵素免疫測定法(ELISA法)
TNF-α、IL-6、IL-12 (p40)のマクロファージ培養上清中濃度はELISAセット(BD PharMingen)を用いて定量した。マウス血清中の可溶型RANKL及びOPGの濃度はELISAキット(R&D)を用いて定量した。
TNF-α、IL-6、IL-12 (p40)のマクロファージ培養上清中濃度はELISAセット(BD PharMingen)を用いて定量した。マウス血清中の可溶型RANKL及びOPGの濃度はELISAキット(R&D)を用いて定量した。
PT-PCRによる解析
mRNAはマクロファージを回収しIsogen(Nippon gene)中で均質化し調製した。cDNAはEnhanced Avian HS RT-PCR kit(Sigma-Aldrich)を用いて合成した。定量PCRはABI PRISM 7000装置TaqMan Assay-on-demand(Applied Biosystems)のIL-6、TNF-α、IL-12 (p40)、Gapdhプライマーを使って行った。
mRNAはマクロファージを回収しIsogen(Nippon gene)中で均質化し調製した。cDNAはEnhanced Avian HS RT-PCR kit(Sigma-Aldrich)を用いて合成した。定量PCRはABI PRISM 7000装置TaqMan Assay-on-demand(Applied Biosystems)のIL-6、TNF-α、IL-12 (p40)、Gapdhプライマーを使って行った。
統計処理
データは平均±標準偏差で表現した。図２３に結果を示す実施例を除く全てのデータはStudent’s t-testを用いて有意差検定を行った。図２３に結果を示す実施例のみgeneralized Wilcoxon testを用いて有意差検定を行った。
データは平均±標準偏差で表現した。図２３に結果を示す実施例を除く全てのデータはStudent’s t-testを用いて有意差検定を行った。図２３に結果を示す実施例のみgeneralized Wilcoxon testを用いて有意差検定を行った。
以下の結果が得られた。
（１）菌体構成成分によるマクロファージ刺激に対するRANKLによるトレランスの惹起
まず可溶型RANKLあるいはLPSでM-CSF依存性骨髄由来マクロファージ(MDBMs)を刺激して炎症性サイトカイン産生を定量した(図１A〜C)。図１A〜Cは、可溶型RANKLによるサイトカイン産生誘導の欠如を示す。MDBMsを図中に示した濃度のLPS又は可溶型RANKLで24時間刺激した。培養上清中の炎症性サイトカインのタンパク濃度はELISA法によって定量した。図中のバーは平均±標準偏差を示す(n=3、培養ウェル)。図１A〜Cに示すように、LPSが有意にTNF-α、IL-6、IL-12 p40といったサイトカインの産生を誘導するのに対し、可溶型RANKLは100ng/mlという高濃度であってもサイトカイン産生は検出されないことが明らかとなった。それゆえ、LPSとは異なり可溶型RANKLは炎症性サイトカインを誘導しない。
まず可溶型RANKLあるいはLPSでM-CSF依存性骨髄由来マクロファージ(MDBMs)を刺激して炎症性サイトカイン産生を定量した(図１A〜C)。図１A〜Cは、可溶型RANKLによるサイトカイン産生誘導の欠如を示す。MDBMsを図中に示した濃度のLPS又は可溶型RANKLで24時間刺激した。培養上清中の炎症性サイトカインのタンパク濃度はELISA法によって定量した。図中のバーは平均±標準偏差を示す(n=3、培養ウェル)。図１A〜Cに示すように、LPSが有意にTNF-α、IL-6、IL-12 p40といったサイトカインの産生を誘導するのに対し、可溶型RANKLは100ng/mlという高濃度であってもサイトカイン産生は検出されないことが明らかとなった。それゆえ、LPSとは異なり可溶型RANKLは炎症性サイトカインを誘導しない。
次にMDBMsを段階的に濃度を上昇させた可溶型RANKLで24時間前処理し、その後LPSで６時間刺激した。上清中のTNF-α、IL-6及びIL-12 (p40)の濃度はELISA法によって定量した。その結果、可溶型RANKLの前処理は、続くLPS刺激によるこれらサイトカインの産生を可溶型RANKL濃度依存的に抑制することが明らかとなった(図２A〜C)。図２A〜Cは、各炎症性サイトカインのタンパク濃度を示し、マクロファージにおけるRANKL誘導性トレランスが惹起されたことを示す。MDBMsは可溶型RANKLで24時間前処理し(1゜)、その後100ng/mlのLPSで６時間刺激した(2゜)。図２A〜Cに示すように、こうした誘導性トレランスは可溶型RANKLが１ng/mlという低濃度の時にも観察された。
またLPS刺激後から６時間までのTNF-α、IL-6及びIL-12 (p40)のmRNAレベルも経時的に定量した。可溶型RANKL前処理をしないマクロファージと比較して、可溶型RANKL前処理をしたマクロファージでは、LPS刺激に対するこれらサイトカインmRNAの誘導は有意に抑制されていた(図３A〜C)。図３A〜Cは、各炎症性サイトカインのmRNAレベルを示し、マクロファージにおけるRANKL誘導性トレランスが惹起されたことを示す。MDBMsは培地単独(白ダイヤモンド)又は10ng/mlの可溶型RANKL(黒ダイヤモンド)で24時間前処理し、その後100ng/mlのLPSで６時間刺激した。細胞は図中に記載の各時間に回収し、サイトカインmRNAレベルを定量PCRによって測定した。値はGapdhで標準化した。
次に、可溶型RANKL前処理の時間を24時間、12時間、6時間と短縮した。MDBMsを１ng/mlの可溶型RANKLで図４中に記載の時間だけ前処理し(1゜)、その後LPSで刺激した(2゜)。その結果、前処理が６時間という短時間でも有意にLPS刺激によるTNF-α産生誘導が抑制されることが明らかとなった(図４)。
RANKL誘導性トレランスがMDBMs以外のマクロファージでも生じるかどうかを検討するために、次に腹腔マクロファージ(PMs)、M-CSF依存性脾臓由来マクロファージ(MDSMs)を利用して実験を行った。腹腔マクロファージ(PMs)とM-CSF依存性脾臓由来マクロファージ(MDSMs)を50ng/mlの可溶型RANKLで24時間前処理し(1゜)、その後LPSで刺激した(2゜)。その結果、これらのマクロファージにおいてもLPS刺激に対するTNF-αの産生誘導は可溶型RANKLの前処理によって抑制された(図５)。
最後に、MDBMsを可溶型RANKLで24時間前処理後にflagellin、CpGオリゴヌクレオチド、サルモネラで刺激した。MDBMsを10ng/mlの可溶型RANKLで24時間前処理し(1゜)、その後１×10-11 Mのflagellinか３nMのCpG DNAで６時間、あるいはサルモネラで３時間刺激した(2゜)。培養上清中のサイトカインはELISA法で定量した。その結果可溶型RANKLの前処理はこうした細菌菌体成分やサルモネラ刺激に対するTNF-αの産生誘導を抑制することが明らかとなった（図６A〜C)。図中のバーは平均±標準偏差を示す(n=3、培養ウェル)。*, P<0.05; **, P<0.01白柱との比較を示す。これらの結果は可溶型RANKLがLPSや他の細菌菌体成分に対するマクロファージの応答性を低下させることを意味している。
（２）可溶型RANKL除去及びGM-CSF処理によるRANKL誘導性トレランスの緩和
RANKL誘導性トレランスが可逆的かどうかを調べるために、MDBMsを可溶型RANKLで24時間処理した後に可溶型RANKLの入っていない培地でさらに24時間培養した。MDBMsを培地単独(Med)又は10ng/mlの可溶型RANKLで24時間処理し(Day 1)、続いて培地単独(Med)又は10ng/mlの可溶型RANKLでさらに24時間処理(Day 2)した後、100ng/mlのLPSで６時間刺激した。培養上清(n=３)はELISA法によるサイトカイン濃度測定のために回収した。対照群と比較して、TNF-α、IL-6及びIL-12 (p40)の産生は十分に、或いは少なくとも部分的に回復しており、RANKL誘導性トレランスは可逆的であることが示された(図７A〜C)。図中のバーは平均±標準偏差を示す。*, P<0.01黒柱との比較を示す。
RANKL誘導性トレランスが可逆的かどうかを調べるために、MDBMsを可溶型RANKLで24時間処理した後に可溶型RANKLの入っていない培地でさらに24時間培養した。MDBMsを培地単独(Med)又は10ng/mlの可溶型RANKLで24時間処理し(Day 1)、続いて培地単独(Med)又は10ng/mlの可溶型RANKLでさらに24時間処理(Day 2)した後、100ng/mlのLPSで６時間刺激した。培養上清(n=３)はELISA法によるサイトカイン濃度測定のために回収した。対照群と比較して、TNF-α、IL-6及びIL-12 (p40)の産生は十分に、或いは少なくとも部分的に回復しており、RANKL誘導性トレランスは可逆的であることが示された(図７A〜C)。図中のバーは平均±標準偏差を示す。*, P<0.01黒柱との比較を示す。
GM-CSFはRANKL/RANKのシグナリングを阻害することが知られているため、次にGM-CSFのRANKL誘導性トレランスに与える影響を調べた。MDSMsを可溶型RANKLで24時間前処理したあと、可溶型RANKLを含まないGM-CSF入り培地で３時間処理した。その後細胞をLPSで刺激し、TNF-α濃度を定量した。具体的には、MDBMsを10ng/mlの可溶型RANKLで24時間処理し(1゜)、その後500U/mlのGM-CSFで３時間刺激(2゜)した後、100ng/mlのLPSで６時間刺激した(3゜)。結果を図８に示す。培養上清中のTNF-α濃度(n=３)はELISA法で定量した。図中のバーは平均±標準偏差を示す。*, P<0.01。データは３回の実験のうち代表的なものを示した。図８に示すように、GM-CSF自体はTNF-αの産生を誘導しないにもかかわらず、短時間のGM-CSFの処理は可溶型RANKL前処理マクロファージのTNF-α産生を顕著に上昇させた。こうした結果は、GM-CSFがRANKL誘導性トレランスを緩和させることを意味している(図８)。以上より、本実施例は可溶型RANKL除去と同様、GM-CSFによる短時間処理がLPSに対するマクロファージの応答性を回復させることが判明した。
（３）血清中可溶型RANKL及びOPGレベルのLPS投与や細菌感染による動的変動
血清中の生理的及び病理的可溶型RANKL濃度を比較するために、LPSをマウス腹腔内に注入して血清中の可溶型RANKLとOPG濃度を定量した。C57BL/6J mice (n=24)の腹腔にLPSを注入した(1μg/g体重)。血液は図９に記載した時間の後に回収した(n=３ マウス/各点)。血清中の可溶型RANKLとOPGの濃度はELISA法によって定量した。LPS注入前の血清中可溶型RANKL濃度は約150pg/ml、OPG濃度は約2000pg/mlであった。結果を図９A及びBに示す。図中のバーは平均±標準偏差を示す。*, P<0.05; **, P<0.01 0hとの比較を示す。驚くべきことに、可溶型RANKL濃度はLPS注入後６時間以降で劇的に低下し、一方OPGの濃度は６時間以降で上昇した。さらに、C57BL/6Jマウス(n=６)に3.3×107 CFU/g体重のサルモネラを経口感染させた(感染)。対照マウスにはPBSを飲ませた(コントロール)。４日後、血液を採集して血清中の可溶型RANKL及びOPGの濃度をELISA法で測定した。結果を図１０A及びBに示す。図に示すように、血清中可溶型RANKLの低下とOPGの上昇はサルモネラ経口感染後４日目にも観察された。図中のバーは平均±標準偏差を示す(n=3)。*, P<0.05; **, P<0.01。これらの結果は、血清中の可溶型RANKL及びOPGレベルがLPSや細菌感染に対して動的に制御されていることを示している。
血清中の生理的及び病理的可溶型RANKL濃度を比較するために、LPSをマウス腹腔内に注入して血清中の可溶型RANKLとOPG濃度を定量した。C57BL/6J mice (n=24)の腹腔にLPSを注入した(1μg/g体重)。血液は図９に記載した時間の後に回収した(n=３ マウス/各点)。血清中の可溶型RANKLとOPGの濃度はELISA法によって定量した。LPS注入前の血清中可溶型RANKL濃度は約150pg/ml、OPG濃度は約2000pg/mlであった。結果を図９A及びBに示す。図中のバーは平均±標準偏差を示す。*, P<0.05; **, P<0.01 0hとの比較を示す。驚くべきことに、可溶型RANKL濃度はLPS注入後６時間以降で劇的に低下し、一方OPGの濃度は６時間以降で上昇した。さらに、C57BL/6Jマウス(n=６)に3.3×107 CFU/g体重のサルモネラを経口感染させた(感染)。対照マウスにはPBSを飲ませた(コントロール)。４日後、血液を採集して血清中の可溶型RANKL及びOPGの濃度をELISA法で測定した。結果を図１０A及びBに示す。図に示すように、血清中可溶型RANKLの低下とOPGの上昇はサルモネラ経口感染後４日目にも観察された。図中のバーは平均±標準偏差を示す(n=3)。*, P<0.05; **, P<0.01。これらの結果は、血清中の可溶型RANKL及びOPGレベルがLPSや細菌感染に対して動的に制御されていることを示している。
（４）RANKL欠損マウスとOPG欠損マウスにおける異常なサイトカイン産生
生理的な血清中における可溶型RANKLの、LPS誘導性サイトカイン産生に対する影響をみるために、RANKLを欠損したTnfsf11-/-マウスを解析した。図１１A及びBに、野生型マウスとRANKL欠損マウス(Tnfsf11-/-)における血清中の可溶型RANKL及びOPGの濃度をELISA法で測定した結果を示す(n=４、各遺伝子型)。図中のバーは平均±標準偏差を示す。*, P<0.05; **, P<0.01対照との比較を示す。予想された通り、血清中の可溶型RANKLはこのマウスでは検出できなかったが、OPGは野生型マウスと比べてやや高かった。
生理的な血清中における可溶型RANKLの、LPS誘導性サイトカイン産生に対する影響をみるために、RANKLを欠損したTnfsf11-/-マウスを解析した。図１１A及びBに、野生型マウスとRANKL欠損マウス(Tnfsf11-/-)における血清中の可溶型RANKL及びOPGの濃度をELISA法で測定した結果を示す(n=４、各遺伝子型)。図中のバーは平均±標準偏差を示す。*, P<0.05; **, P<0.01対照との比較を示す。予想された通り、血清中の可溶型RANKLはこのマウスでは検出できなかったが、OPGは野生型マウスと比べてやや高かった。
さらに、腹腔内にLPS(２μg/g体重)を注入し、90分後の野生型マウスとTnfrsf11-/-マウスの血液を採取した。血清中サイトカインはELISA法で定量した。LPS注入後、TNF-αとIL-6の産生がTnfsf11-/-マウスにおいて有意に亢進していることが判明した(図１２A〜C)。図中のバーは平均±標準偏差を示す。*, P<0.05; **, P<0.01対照との比較を示す。これらの結果は、Tnfsf11-/-マウスにおいてはRANKL誘導性トレランスが欠如しており、それゆえ炎症性サイトカイン産生が亢進するであろうという予想と一致している。
さらにRANKL誘導性トレランスのマウスにおける役割を調べるために、OPGを欠損したTnfrsf11b-/-マウスを解析した。図１３A及びBに、野生型マウスとOPG欠損マウス(Tnfrsf11b-/-)における血清中の可溶型RANKL及びOPGの濃度をELISAで測定した結果を示す(n=５、各遺伝子型)。図中のバーは平均±標準偏差を示す。*, P<0.05; **, P<0.01対照との比較を示す。対照のOPGヘテロ欠損マウスと比較して、生理的な血清中可溶型RANKL濃度は約10倍Tnfrsf11b-/-マウスにおいて高かった。それゆえ、OPGを欠損したマウスは常に高濃度の可溶型RANKLにさらされているといえる。
さらに、腹腔内にLPS(２μg/g体重)を注入し、90分後の野生型マウスとTnfrsf11b-/-マウスの血液を採取し、血清中サイトカインをELISA法で定量した。結果を図１４A〜Cに示す。図中のバーは平均±標準偏差を示す。*, P<0.05; **, P<0.01対照との比較を示す。LPS注入後IL-6の産生がTnfrsf11b-/-マウスにおいて有意に低下することが判明した。こうしたことから、慢性的に高い濃度の可溶型RANKLに暴露されることによりOPG欠損マウスでは炎症性サイトカイン産生が抑制されていることがわかった。
（５）RANKL欠損マウスのLPSに対する高い感受性
RANKL欠損マウスにおける異常な炎症性サイトカイン産生の影響を解析するために、我々は高い濃度のLPSを野生型マウスとTnfsf11-/-マウスに腹腔内注入して生存率を比較した。高濃度のLPS(130μg/g体重)を生後６週間の野生型マウス(n=10)とTnfsf11-/-マウス(n=５)に腹腔内注入した後、生存曲線を描いた。その結果、注入後24時間後には90％の野生型マウス(n=10、白四角)が生存していたのに対して、全てのTnfsf11-/-マウス(n=５、黒四角)は24時間以内に死亡した(図１５)。Tnfsf11-/-マウスはLPSに対して高感受性であった。こうした結果は、生理的な血清中の可溶型RANKLがマウスをエンドトキシンショックから保護する働きがあることを示唆している。
RANKL欠損マウスにおける異常な炎症性サイトカイン産生の影響を解析するために、我々は高い濃度のLPSを野生型マウスとTnfsf11-/-マウスに腹腔内注入して生存率を比較した。高濃度のLPS(130μg/g体重)を生後６週間の野生型マウス(n=10)とTnfsf11-/-マウス(n=５)に腹腔内注入した後、生存曲線を描いた。その結果、注入後24時間後には90％の野生型マウス(n=10、白四角)が生存していたのに対して、全てのTnfsf11-/-マウス(n=５、黒四角)は24時間以内に死亡した(図１５)。Tnfsf11-/-マウスはLPSに対して高感受性であった。こうした結果は、生理的な血清中の可溶型RANKLがマウスをエンドトキシンショックから保護する働きがあることを示唆している。
（６）可溶型RANKLによるTLR4の低下
可溶型RANKLで24時間マクロファージを処理すると、TLR4のmRNAレベルは有意に抑制される。可溶型RANKL処理後LPSで刺激し、その際のTLR4 mRNAレベルを経時的に追っても、この傾向は変わらなかった(図１６A)。図中のバーは平均±標準偏差を示す。また、可溶型RANKLで24時間マクロファージを処理すると細胞表面のTLR4-MD2複合体の発現が抑制されることがフローサイトメトリー解析によって明らかとなった(図１６B）。TLR4はLPSの受容体であるため、こうしたTLR4の低下がRANKLトレランスのメカニズムの一端を担っていることが示唆された。
可溶型RANKLで24時間マクロファージを処理すると、TLR4のmRNAレベルは有意に抑制される。可溶型RANKL処理後LPSで刺激し、その際のTLR4 mRNAレベルを経時的に追っても、この傾向は変わらなかった(図１６A)。図中のバーは平均±標準偏差を示す。また、可溶型RANKLで24時間マクロファージを処理すると細胞表面のTLR4-MD2複合体の発現が抑制されることがフローサイトメトリー解析によって明らかとなった(図１６B）。TLR4はLPSの受容体であるため、こうしたTLR4の低下がRANKLトレランスのメカニズムの一端を担っていることが示唆された。
（７）可溶型RANKLによる抗原提示の抑制
マクロファージを可溶型RANKLで24時間処理すると、その表面のMHCII, CD80, CD86の発現が有意に低下することがフローサイトメトリー解析によって明らかとなった（図１７、実線が可溶型RANKL処理群、破線グレーがコントロール群）。MHCIIは外来抗原をリンパ球に対して提示するための分子であり、その際にCD80、CD86などのco-stimulatory moleculesが不可欠であるとされる。
マクロファージを可溶型RANKLで24時間処理すると、その表面のMHCII, CD80, CD86の発現が有意に低下することがフローサイトメトリー解析によって明らかとなった（図１７、実線が可溶型RANKL処理群、破線グレーがコントロール群）。MHCIIは外来抗原をリンパ球に対して提示するための分子であり、その際にCD80、CD86などのco-stimulatory moleculesが不可欠であるとされる。
従って、これらの分子の発現が低下することは、可溶型RANKLにマクロファージの抗原提示を抑制する能力があることを示唆している。
（８）RANKLトレランスのc-Fos非依存性
破骨細胞分化におけるRANKL/RANKのシグナルが伝わるためには転写因子c-Fosが必要であり、これを欠損するマウスでは破骨細胞ができない。RANKLトレランスが生じるためにc-Fosが必要であるのか否かを調べるためc-Fos欠損マウス由来マクロファージを解析した。c-Fos欠損マウス由来マクロファージを1ng/mlのLPSで24時間前処理した後100ng/mlのLPSで刺激してLPSトレランスを見たところ、野生型と同様に生じることが明らかとなった(図１８A及びB)。また、10ng/mlの可溶型RANKLで24時間前処理した後に100ng/mlのLPSで刺激してRANKLトレランスを見たところ、やはり野生型と同様に生じることが明らかとなった(図１８C及びD)。図中のバーは平均±標準偏差を示す。こうしたことから、LPSトレランスやRANKLトレランスはc-Fos非依存的であると結論できる。すなわち、RANKLトレランスはマクロファージが多核の破骨細胞に分化する過程における、単なる「脱マクロファージ化現象」としてとらえるべきではない。
破骨細胞分化におけるRANKL/RANKのシグナルが伝わるためには転写因子c-Fosが必要であり、これを欠損するマウスでは破骨細胞ができない。RANKLトレランスが生じるためにc-Fosが必要であるのか否かを調べるためc-Fos欠損マウス由来マクロファージを解析した。c-Fos欠損マウス由来マクロファージを1ng/mlのLPSで24時間前処理した後100ng/mlのLPSで刺激してLPSトレランスを見たところ、野生型と同様に生じることが明らかとなった(図１８A及びB)。また、10ng/mlの可溶型RANKLで24時間前処理した後に100ng/mlのLPSで刺激してRANKLトレランスを見たところ、やはり野生型と同様に生じることが明らかとなった(図１８C及びD)。図中のバーは平均±標準偏差を示す。こうしたことから、LPSトレランスやRANKLトレランスはc-Fos非依存的であると結論できる。すなわち、RANKLトレランスはマクロファージが多核の破骨細胞に分化する過程における、単なる「脱マクロファージ化現象」としてとらえるべきではない。
（９）マウス急性毒性試験
マウスは、７〜８週齢C57BL/6N(雌)マウスを用いた。
マウスは、７〜８週齢C57BL/6N(雌)マウスを用いた。
LPSは、Lipopolysaccharides from Escherichia coli O55:B5 (Sigma)を用い、10mg当たり滅菌水1.0mlを加えて溶解し用いた。M-CSFは、ロイコプロール（協和発酵工業）を用い、50μg当たりPBS 1.0mlを加えて溶解して用いた。
GST-RANKLの作製
ヒト型RANKL残基140〜317をコードするcDNAにPCRにてSal I,Not Iサイトを付加し、これらのエンドヌクレアーゼを用いて、pGEX-4T-2（GE healthcare;Genbank Accession Number U13854）のGlutathione S-transferaseの下流にクローニングした。ヒト型RANKL残基140〜317をコードするcDNAの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を図１９に示す。また、RANKL遺伝子を含むベクターの制限酵素地図を図２０に示す。さらに、当該ベクターの塩基配列を図２１A及び２１Bに示す。図２１Bの塩基配列は図２１Aの塩基配列の続きである。BL21（DE3）Escherichia coli(invitrogen)におけるIPTG（終濃度：0.5mM）で媒介されたタンパク質発現の誘導後、菌体を抽出用緩衝液（50mM Tris-HCl,pH8.0,100mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT, 1%(v/v)TritonX-100）にて懸濁し、4℃で超音波破砕機を用いて破砕した。18000×g, 15minで遠心後、上清を回収しGlutathione Sepharose（登録商標）カラムにかけた。続いて洗浄用緩衝液（50mM Tris-HCl,pH 8.0,100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1%(v/v)TritonX-100）にて洗浄した。その後、Glutathione溶液（20mM還元型グルタチオン, 50mM Tris-HCl,pH8.0）で溶出した。SDS-PAGEにて精製したGST-RANKLの分子量及び純度を確認し、フィルターろ過した。分子量47.0kDa、純度95%以上であった。また,リムルス変形細胞溶解物試験（limulus amebocyte lysate assay）によりエンドトキシン濃度を測定し、1EU/μg未満であることを確認した。
ヒト型RANKL残基140〜317をコードするcDNAにPCRにてSal I,Not Iサイトを付加し、これらのエンドヌクレアーゼを用いて、pGEX-4T-2（GE healthcare;Genbank Accession Number U13854）のGlutathione S-transferaseの下流にクローニングした。ヒト型RANKL残基140〜317をコードするcDNAの塩基配列及び対応するアミノ酸配列を図１９に示す。また、RANKL遺伝子を含むベクターの制限酵素地図を図２０に示す。さらに、当該ベクターの塩基配列を図２１A及び２１Bに示す。図２１Bの塩基配列は図２１Aの塩基配列の続きである。BL21（DE3）Escherichia coli(invitrogen)におけるIPTG（終濃度：0.5mM）で媒介されたタンパク質発現の誘導後、菌体を抽出用緩衝液（50mM Tris-HCl,pH8.0,100mM NaCl,1mM EDTA,1mM DTT, 1%(v/v)TritonX-100）にて懸濁し、4℃で超音波破砕機を用いて破砕した。18000×g, 15minで遠心後、上清を回収しGlutathione Sepharose（登録商標）カラムにかけた。続いて洗浄用緩衝液（50mM Tris-HCl,pH 8.0,100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.1%(v/v)TritonX-100）にて洗浄した。その後、Glutathione溶液（20mM還元型グルタチオン, 50mM Tris-HCl,pH8.0）で溶出した。SDS-PAGEにて精製したGST-RANKLの分子量及び純度を確認し、フィルターろ過した。分子量47.0kDa、純度95%以上であった。また,リムルス変形細胞溶解物試験（limulus amebocyte lysate assay）によりエンドトキシン濃度を測定し、1EU/μg未満であることを確認した。
GST-RANKL発現ベクターの作製方法を図２２に示す。
LPS、RANKL及びM-CSF投与試験
10μg GST-RANKL、２μg M-CSF、２μg M-CSF＋10μg GST-RANKL、コントロールとしてPBSをそれぞれC57BL/6Nマウス（各群９〜10匹）に腹腔内投与し、24時間後にLPS（2.5mg/匹）を腹腔内投与した。その後の生存を144時間後まで観察した。
10μg GST-RANKL、２μg M-CSF、２μg M-CSF＋10μg GST-RANKL、コントロールとしてPBSをそれぞれC57BL/6Nマウス（各群９〜10匹）に腹腔内投与し、24時間後にLPS（2.5mg/匹）を腹腔内投与した。その後の生存を144時間後まで観察した。
結果を図２３に示す。図２３に示すように、RANKLとM-CSFを投与した場合に、生存率が有意(P<0.03)に高かった。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号３および４：GST-RANKL（aa127-317)
配列番号５および６：GST-RANKL（aa140-317)
配列番号７および８：GST-RANKL（aa159-317)
配列番号９〜１３：合成
配列番号５および６：GST-RANKL（aa140-317)
配列番号７および８：GST-RANKL（aa159-317)
配列番号９〜１３：合成
Claims (4)
- 生体試料中の可溶型RANKLをマーカーとして用いグラム陰性菌による感染症又は敗血症である炎症性疾患を検出する方法であって、生体試料中の可溶型RANKL濃度が正常人に比べて低下した場合に、炎症性疾患に罹患していると判定する、炎症性疾患を検出する方法。
- 生体試料中の可溶型RANKL及びOPGをマーカーとして用いグラム陰性菌による感染症又は敗血症である炎症性疾患を検出する方法であって、生体試料中の可溶型RANKL/OPG濃度比が正常人に比べて低下した場合に、炎症性疾患に罹患していると判定する、請求項１記載の炎症性疾患を検出する方法。
- 抗RANKL抗体を含む、RANKLをマーカーとして用い、請求項１に記載の方法により、グラム陰性菌による感染症又は敗血症である炎症性疾患を検出するための検出試薬。
- 抗RANKL抗体及び抗OPG抗体を含む、RANKL及びOPGをマーカーとして用い、請求項２に記載の方法により、グラム陰性菌による感染症又は敗血症である炎症性疾患を検出するための検出試薬。
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