JP2006500913A - ヒト癌胎児性抗原(cea)用の特異的抗体断片 - Google Patents
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Abstract
Description
抗体及びその特異的断片
これらの用語は、天然又は部分的に若しくは完全に合成によって生成した、抗原特異性を有する免疫グロブリン又はその一部を説明している。これらの用語はまた、抗体の結合部位又はその相同体である結合ドメインを有する任意のポリペプチド又はタンパク質にもわたる。これらは天然の方法によって、又は部分的に若しくは完全に合成によって生成することができる。抗体の例は、免疫グロブリンの様々なクラス及びサブクラス、並びにFab、scFv、Fv及び二重特異性抗体などの、1つ又は複数の抗原結合部位を含むこれらの断片である。
この用語は、全ての抗原又はその一部と特異的に相互作用する区域を含む抗体部分を説明している。抗原が大きい場合は、抗体はエピトープと呼ばれる抗原の特定の部分としか結合することができない。抗体結合部位は、1つ又は複数の抗体可変ドメインで与えることができる。好ましくは、抗原結合部位は抗体の軽鎖(VL)の可変領域(又はドメイン)及び重鎖(VH)の可変領域(又はドメイン)を含む。
抗体又はその断片が、その特異的結合対とは異なる他の分子と有意な結合を提示しない状態を言う。また、この用語は、抗原結合部位がいくつかの関連又は非関連抗原中に表れる特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合、結合部位はこのエピトープを保有するいくつかの抗原と結合することができる。
1.Mab CB/ior−CEA.1の可変ドメインのPCRによる増幅、クローニング、及び配列決定。
2.scFv及び二重特異性抗体のアセンブリ形成、大腸菌(E.coli)中での発現、及びそれらのヒトCEAの認識の実証。
3.ピキアパストリス(Pichia pastoris)中でのscFv及び二重特異性抗体の発現、並びにそれらのヒトCEAの認識の実証。
4.細菌中で産生されたscFv及び二重特異性抗体の精製。
5.タンパク質分解性消化及び質量分析による二重特異性抗体の特性決定。
6.脱グリコシル化したCEAの認識の研究。
7.正常及び腫瘍組織における免疫細胞化学的及び組織化学的調査。
8.親和定数の決定。
9.B16−CEA13細胞を接種することによって誘発させた腫瘍を有するC57Bl/6マウスにおける、125Iで標識した断片及び抗体のin vivoでの特異的認識の決定。
手順(a)RNAの精製及び可変領域の増幅
マウスハイブリドーマCB/ior−CEA.1の106個の細胞由来の全RNA(Tormo B.他、APMIS.97:1073−1080、1989)を、TriPure(商標)試薬(Boehringer−Mannheim)で抽出した。オリゴdTをプライマーとして使用して、First−Strand cDNA Synthesis for RT−PCRキット(Boehringer−Mannheim)を用いて相補的DNA(cDNA)を合成した。重鎖及び軽鎖可変ドメインの遺伝子の特異的増幅にはポリメラーゼ連鎖反応技術(PCR)を用いた。使用した合成プライマーは、Kabat E.他(米国保健社会福祉省、NIH、1991)が報告したマウスIgG及びκ鎖のコンセンサス配列に基づいて設計され、実験方法は以前に本研究室によって開発されている(Coloma、MJ他、Biotechniques 11:152−156、1991)。PCRで用いたオリゴヌクレオチドの配列を表Iに示す。
ベクターpMOS中にクローニングした軽鎖及び重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列を決定するために、製造元が推奨するオリゴヌクレオチドを使用した(Amersham Pharmacia Biotech)。塩基の配列はPharmacia(Amersham Biosciences)のALFexpress II装置及び「Thermus Sequenase 5 Cy Dye Terminatorキット」を用いた自動化方法によって作製した。プラスミドpVL2及びpVH5がそれぞれVL及びVHの配列の代表として選択された。
手順(a).可変ドメインの再増幅並びにscFv及び二重特異性抗体のアセンブリ形成
プラスミドpVH5及びpVL2中に含まれるVH及びVLドメインのscFv及び二重特異性抗体の形態のアセンブリ形成にPCRを使用した。
ScFv.−リンカーL1:EGKSSGSGSESKVD(配列番号5)
二重特異性抗体.−リンカーL2:GGGGS(配列番号6)
1.一価scFvに複製起点を与えるドメイン。反応1:プラスミドpVH5を鋳型として使用し、オリゴヌクレオチド5及び6(表III)を用いる。反応2:プラスミドpVL2を使用し、オリゴヌクレオチド7及び8(表III)を用いる。
2.二重特異性抗体に複製起点を与えるドメイン。反応3:プラスミドpVH5を使用し、オリゴヌクレオチド5及び9(表III)を用いる。反応4:プラスミドpVL2を鋳型として使用し、オリゴヌクレオチド8及び10(表III)を用いる。
ベクターpJG−1mとは、大腸菌(E.coli)のペリプラズム中での抗体断片の発現のために設計されたプラスミドである(図1)。主要素として、これは、LacZプロモーター、シグナルペプチド、遺伝子断片を挿入するための制限部位ApaL I及びNot I、c−mycペプチド及び6個のヒスチジンをコードしている配列を有する。この最後の要素は、固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによる発現産物の精製用のタグとして使用する(IMAC;Porath J、Prot.Expr.Purif. 3:263−281、1992)。当該のscFvをベクター内にクローニングするためのクローニング用制限部位の塩基配列、及びscFvに付加されるC末端アミノ酸の配列を図1に示す(配列番号13)。
オリゴ11.(配列番号14)
5’...GTTGTTCCTTTCTATTCTCAC...3’
オリゴ12.(配列番号15)
5’...CTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC...3’
コンピテント大腸菌(E.coli)細胞TG1を、どちらの抗体断片の情報も含むプラスミドpJG1m−25及びpJG1m−18でそれぞれ独立して形質転換させた。この株では、異種タンパク質のペリプラズムにおける発現、又は培地へのその分泌が可能になる。
ELISA試験は、ポリビニル製プレート(Costar、96ウェルのビニル製アッセイプレート)をヒトCEA(Calbochem 219369)で、1μg/mLの濃度でコーティングすることによって作製した。プレートを脱脂乳でブロッキングした後、2つの構築体に対応する細菌ペリプラズム試料をPBS−2%脱脂乳中の1:5、1:10、及び1:20の希釈率で加え、室温で2時間インキュベートした。
全て培養中にCEAを発現するヒト腫瘍細胞系LoVo(ATCC CCL−229)、AsPC−1(ATCC CRL−1682)、及びLS 174T(ATCC CL−188)を96ウェルのポリスチレン製プレート(Costar)に播種した。コンフルエントな状態に達した後、ウェルをPBSで2回洗浄し、排水し、空気乾燥させた。その後、冷アセトン−メタノールの1:1(v:v)混合物を3分間用いることによって細胞をプラスチックに固定した。残渣を排除するために蒸留水で数回洗浄した後、プレートを、2つの構築体に対応する細菌ペリプラズム試料をPBS−2%脱脂乳中の1:2、1:8、及び1:16の希釈率で加えて室温で2時間インキュベートするELISAにおける固相として使用した。数回洗浄した後、断片のCEAとの結合を検出するために、Mab 9E10(1μg/mL)を使用し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ(Sigma)とコンジュゲートした抗マウスIgG抗体を使用した。数回洗浄した後、反応を展開させるために色素原OPD(Sigma)及び基質としてH2O2を使用し、492nmで反応物の定量的評価を行うためにLabSystems Multiskan MS読取器を使用した。読取ステップでは上清を新しいプレートに移した。アッセイではMab CB/ior−CEA.1を陽性対照として使用した。挿入物を有さないベクターpJG−1mで形質転換させた細胞TG1に対応するペリプラズム分画、及び非関連のMabを陰性対照として使用した。CEAを発現しないヒト細胞HEK 293(ATCC CRL−1573)を含むプレートも陰性対照として使用した。陽性の判定基準は前の手順で記載したELISAで用いたものと類似していた。
手順(a)scFv及び二重特異性抗体の再増幅及びベクターpPS7中でのクローニング
構築体pJG1−25及びpJG1−18をそれぞれ鋳型として使用し、またピキアパストリス(Pichia pastoris)発現ベクターpPS7中にクローニングすることを目的として遺伝子の5’及び3’末端にNcoIを付加するように設計されたオリゴヌクレオチド(オリゴ13及び14;表V)を使用して、scFv及び二重特異性抗体をコードしている遺伝子をPCRで増幅した。増幅手順は既に記載した手順に類似している。プラスミドpPS7とは、アルコールオキシダーゼ(AOX.1)酵素のプロモーターに対応する1.15Kbの断片、次いでサッカラマイセスセレビセイ(Saccharamyces cerevisae)のスクロースインベルターゼ(sucII)の分泌シグナルをコードしている遺伝子、唯一のNcoIクローニング部位、転写の完了を保証するための酵素グリセルアルデヒド3−リン酸デヒドロゲナーゼ(Gapt)の960bpの断片、及び選択マーカーとしてサッカラマイセスセレビセイ(Saccharamyces cerevisae)のHIS3遺伝子を含む、組込みベクターである。更に、このベクターはAOX.1遺伝子の3’配列に対応する2.1kbの断片も含む。これらの要素すべてがベクターpUC18中に挿入される(Herrera Martinez LS他、EP0438200A1号)。
抗体断片の発現の研究は、選択的MD培地(窒素酵母ベース、ビオチン、デキストロース)を含むプレート中で増殖させた原栄養コロニーHis+から出発して行った。選択したコロニーを50mLチューブ中の10mLの富化BMGY緩衝培地(酵母抽出物、ペプトン、リン酸カリウム、窒素酵母ベース、ビオチン、及びグリセロール)に接種し、150rpmで回転しながら28℃の場所に置いた。培養物をSPECTRONIC GENESIS2装置で測定して2単位のOD600nmに達したら、これを2000rpmで10分間遠心分離した。細胞ペレットを、グリセロールの代わりにメタノールを唯一の炭素原として含む10mLの富化培地(BMMY)に懸濁させた。この時点以降96時間の間に目的のタンパク質が誘発され、毎日純粋なメタノールを培養物中の最終濃度が1%になるまで加えた。陰性対照としては、挿入物を有さないベクターで形質転換させたMP36his3株を使用した。
大腸菌(E.coli)由来の材料について既に記載した試験と非常に類似したELISA試験を、類似の固相、試薬及びコーティング、インキュベート、展開、並びに陽性対照の条件を用いて行った。誘発された組換え株の代謝培養物の試料をPBS−1%のミルクで希釈し、1ウェル当たり100μLの割合で加え、室温で2時間インキュベートした。陰性対照として、MP36his3株に対応する代謝培地、及び非関連のMabを使用した。吸光度が陰性対照で生じるよりも少なくとも4倍高い場合に値が陽性であるとみなされた。
大腸菌(E.coli)由来の材料について既に記載した試験と非常に類似したELISA試験を、類似の固相、試薬及びコーティング、インキュベート、展開、並びに陽性対照の条件を用いて行った。誘発された組換え株の代謝培養物の試料をPBS−2%のミルクで希釈し、固定したLoVo、AsPC−1、及びLS 174T細胞を含むプレートに加え、穏やかに攪拌しながら室温で2時間インキュベートした。この試験では、Mab CB/ior−CEA.1を陽性対照として使用した。挿入物を有さないベクターpPS7で形質転換させた株MP36hisの代謝された誘導期の培養物、及び非関連のMabを陰性対照として使用した。また、陰性対照として、ヒトHEK293細胞を含むプレートも使用した。
手順(a)固定イオン金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)及びイオン交換を用いた、scFv及び二重特異性抗体断片の精製
組換えタンパク質中にベクターpJG−1mから供与される6個のヒスチジンのドメインが存在することを精製に使用した。これらの配列はタンパク質に、様々なクロマトグラフィー用支持体にキレート化されることができる金属イオン(例えばZn+2、Cu+2、Ni+2)に対する非常に高い親和性を与え、これにより簡単且つ再現性のある精製が可能となる。
以前の手順に記載したように精製したscFv及び二重特異性抗体を、試料の均一性及び多量体の存在を決定するために分子篩クロマトグラフィーを用いて調査した。これにはSuperdex200(Pharmacia)及びHPLC装置中の従来のゲル濾過プロセスを使用した。scFvが単量体と一致する約27kDaの主要なピーク中に濃縮されていることが決定された。二重特異性抗体は主に約45kDaの大きさで表れ、これは二量体と一致している。
精製した二重特異性抗体を終夜4℃で、2mol/Lの濃度の尿素を含み1%NH4HCO3を含むpH=8.3の緩衝溶液に対して透析した。透析したタンパク質を酵素:基質比1:50の配列決定グレードのトリプシン(Promega)で、37℃で4時間消化した。等体積の1%トリフルオロ酢酸水溶液で酸性にすることによってタンパク質分解性消化を停止させ、質量分析装置に連結した液体クロマトグラフィー(LC−MS)で分析するまで−20℃で保存した。
ヒトCEA(Calbochem)をN−グリコシル化に特異的なエンドグリコシダーゼPNGasa F(New England Biolabs)で酵素的に脱グリコシル化した。CEAを20mMのリン酸緩衝液、pH7.8に溶かし、SDS及び2−メルカプトエタノールを用いて100℃、5分間で変性させた。その後、NP−40及び1μLのPNGasa Fを37℃で2時間加えた。対照及び脱グリコシル化した試料をクマシーブルー染色でSDS−PAGE分析した結果、エンドグリコシダーゼで消化した後に分子量が顕著に減少していた(50%近く)。(a)Mab CB/ior−CEA.1、(b)精製した二価scFv(二重特異性抗体)又は(c)マウスで得られた抗ヒトCEA抗清を一次抗体として使用し、次いで(a)及び(b)には西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたMab CB/ior−CEA.1のFabに対するポリクローナル抗体、(c)には西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスIgG抗体を使用して、ウエスタンブロットを行った。移動及び展開は、本発明中でウエスタンブロットについて既に言及したものと類似していた。Mab CB/ior−CEA.1及び二重特異性抗体は脱グリコシル化されていない抗原しか認識しなかった。ポリクローナル抗血清は脱グリコシル化の前及び後のCEAを認識した。
組織の調査は検屍材料由来の正常及び腫瘍組織アーカイブから選択した試料で行った。Mab CB/ior−CEA.1について以前に記載されている認識を確認するために(Tormo B他、APMIS 97:1073−1080、1989)組織の最小限のパネルを使用した。試料には、肺、皮膚、乳房、子宮頚部、食道及び腎臓の癌腫、結腸、前立腺、膵臓、胆嚢、小腸及び胃の腺癌、神経、造血及び肉腫起源の腫瘍、正常な結腸粘膜、並びに肝臓、腎臓、肺、精巣、脾臓及び膵臓などの正常な組織や血液細胞も含まれていた。
(a)20μg/mLの濃度のMab CB/ior−CEA.1(陽性対照)
(b)50μg/mLの濃度の、実施例4、手順(a)に記載した大腸菌(E.coli)の精製したscFv
(c)50μg/mLの濃度の、実施例4、手順(a)に記載した大腸菌(E.coli)の精製した二重特異性抗体
(d)50及び100μg/mLの濃度の、これらの実施例中で「F3」と呼ぶ以前に得られた精製したscFv(Ayala他、Biotechniques 13:790−799、1992;Perez L他、Applied Biochem.Biotechnol. 24:79−82、1996)。
注記:表中の数字は、陽性染色の事例/調査した全事例の数を表す。括弧がない場合は、陽性の染色強度は2+〜3+であった。Ca:癌腫、ADC:腺癌、HDG:ホジキン、BD:良好に分化、MD:中程度に分化、PD:不十分に分化。(*):標識化が管腔分泌産物及び一部の腺の尖端域に制限されていると考えられる;(a):陽性の事例は1+と分類できる染色を示した、(b)1+と分類できる強度のリンパ球及び好酸球の認識、(c)6つの陽性事例のうち2つが1+と分類できる強度の染色を示した。
親和定数の決定では、質量作用の法則に基づいた非競合的ELISA法(Beatty JD他、J.Immunol Meth. 100:173−184、1987)を用いた。親和定数Kaffは[AgAb]/[Ag][Ab]に等しく、ここで、AgAbは抗原−抗体複合体のL/mol(M−1)であり、[Ag]は遊離抗原の濃度であり(mol)、[Ab]は遊離抗体の濃度である(mol)。
抗体断片のin vivoでの特異的認識を決定するために、ロドゲン(lodogen)法を使用して(Fraker PJ、Speck JC Jr. Biochem Biophys Res Comm 80:849−857、1978)、以下の分子を125I(Amersham、UK)で標識した:
(a)大腸菌(E.coli)から精製したscFv、(特異的活性1.1MBq/5μg)
(b)大腸菌(E.coli)から精製した二重特異性抗体、(特異的活性:1.2MBq/5μg)
(c)Mab CB/ior−CEA.1、(特異的活性:1.8MBq/5μg)
(d)精製したScFv F3(Ayala他、Biotechniques 13:790−799、1992;Perez L他、Applied Biochem.Biotechnol.24:79−82、1996)(特異的活性:1.0MBq/5μg)
Claims (14)
- Mab CB/ior−CEA.1を産生するハイブリドーマから抽出したRNAから得た単量体scFv型の抗体断片であって、可溶性の形態であるか、固体表面上に吸着されているか、又は細胞中に存在するヒト癌胎児性抗原(CEA)に特異的であり、並びに、(5.0±0.4)×109L mol−1のCEAに対する親和定数、及びそのグリコシル化の保存に依存的なこのような抗原の認識を示す、抗体断片。
- アミノ酸配列が配列番号16に示すものである、請求項1記載の単量体scFv型の抗体断片。
- Mab CB/ior−CEA.1を産生するハイブリドーマから抽出したRNAから得た二価(二重特異性抗体)scFv型の抗体断片であって、可溶性の形態であるか、固体表面上に吸着されているか、又は細胞中に存在するヒト癌胎児性抗原(CEA)に特異的であり、並びに、(2.8±0.3)×1010L mol−1のCEAに対する親和定数、及びそのグリコシル化の保存に依存的なこのような抗原の認識を示す、抗体断片。
- アミノ酸配列が配列番号17に示すものである、請求項3記載の二価(二重特異性抗体)scFv型の抗体断片。
- ヒトCEAを発現する腫瘍細胞の同定に使用する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗体断片。
- Fab断片及び他のscFv変異体、二重特異的抗体の形態で人為的に連結されているか、又は生物学的若しくは生化学的に活性のあるドメインと融合している、配列番号16及び配列番号17に報告されている可変ドメインVH及びVLのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ヒトCEAに特異的な組換え又は合成組換え抗体。
- 組換え細菌又は酵母、昆虫若しくは哺乳動物の形質移入細胞、又は遺伝子改変した生物中で産生される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体断片。
- 放射性若しくは他の方法で検出可能な標識、又は抗腫瘍の潜在性を有する化学的若しくは生物学的物質を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の抗体断片。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体断片を含む、CEAを発現するヒト腫瘍を治療するための、医薬組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体断片を含む、画像化技術を使用してCEAを発現するヒト腫瘍をイン・ビボ(in vivo)で放射性により位置決定するための、医薬組成物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体断片を含む、細胞に連結している又は連結していないヒトCEAを検出するための、イン・ビトロ(in vitro)又はエクス・ビボ(ex vivo)診断用の試薬。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体断片を発現する細胞であって、組換えDNAによる遺伝子操作によって得られ、及び、細胞は、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞又は植物細胞である、細胞。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体断片を発現する多細胞生物であって、組換えDNAによる遺伝子操作によって得られ、及び、生物は、トランスジェニック動物又はトランスジェニック植物である、多細胞生物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の抗体断片をコードしているベクターであって、組換えDNAの遺伝子操作によって得られ、及び、ベクターは、プラスミド、又は宿主細胞内に組み込まれることが可能な配列である、ベクター。
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