CN1780641A - 用于聚合物结合的单链抗原结合多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有位点特异性修饰的单价和多价单链抗原结合多肽。所提供的多肽可在所述修饰位点共价连接或结合于聚环氧烷。所得的结合物保留了抗原结合性质并呈现出延长的循环时间以及降低的相对于未结合单链抗原结合多肽的抗原性。本发明还提供了制备和使用具有位点特异性修饰的单链抗原结合多肽的方法和组合物。

Description

用于聚合物结合的单链抗原结合多肽
发明领域
本发明涉及具有位点特异性修饰促进聚合物与本发明多肽位点特异性共价连接的单价和多价单链抗原结合多肽。本发明提供了这种修饰的单链抗原结合多肽、载体和其编码宿主细胞，以及制造和使用所述多肽的方法。本发明还提供了修饰的单链抗原结合多肽与诸如聚环氧烷(“PAO”)的聚合物的结合物以提供新的和改进的原药，以及制造和使用这些结合物的方法。
相关技术的描述
自然产生的抗体是由脊椎动物，包括哺乳动物，针对一或多种特异性物质，即抗原，作为外源物质被所述动物的免疫细胞识别时由免疫系统所产生的免疫球蛋白。在人类中，有五族具有选择性识别和优先与特异抗原结合能力的抗体。每一抗体族都具有相同的基本结构或多个这样的结构。其基本单位由两条完全一致称为重链或H链(在IgG中每一条的分子量大约为50,000道尔顿)的多肽以及两条完全一致称为轻链或L链(在IgG中每一条的分子量大约为25,000道尔顿)的多肽组成。所述五族抗体中的每一族都具有一组相似的轻链以及一组不同的重链。轻链由一个可变结构域和一个恒定结构域组成，而重链由一个可变结构域和三个或更多恒定结构域组成。可变结构域决定了所述免疫球蛋白的特异性，恒定结构域则具有其他功能。
广泛地说，成对的合适多肽轻链和多肽重链在天然抗体以及其他形式的抗体中结合，从而生成抗原结合位点。每一单独的轻链和重链都折叠成大约110个氨基酸的区域，呈现保守的三位构象。轻链包括1个可变区(VL)和一个恒定区(CL)，而重链包括一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3)。成对的区连在一起形成离散的结构。尤其是轻链和重链的可变区相连形成了包含抗原结合位点的“Fv”区域。对抗原结合来说恒定区不是必需的，在一些情况下可将其通过蛋白水解与抗体分子分离下来，从而生成由一半轻链和四分之一重链构成的生物活性(即结合)的可变区。
此外，甚至当来源于不同的动物种类时，尽管其高变片段的序列差异极大，其结构由x-射线晶体分析法测定的某一族的所有抗体及其Fab片段(即由VL、CL、VH和CH1构成的片段)依然表现出相似的可变区结构。免疫球蛋白可变区似乎可以容忍在抗原结合环中的突变。所以，除了在高变区中，由两条重链和轻链限定的大多数抗体的所谓“可变”区实际上在其三维排布上都是相当恒定的。例如，参见，Huber，R.，Science 233：702-703(1986)，在此将其引用作为参考。
通常，天然抗体是异源的，与外源抗原的多个不同表位或部分结合。相比较而言，单克隆抗体(“Mabs”)是在结合亲和性上同源的抗体。MAb在诊断和治疗制剂中都表现得非常有用。MAb是通过已有方法，如通过将小鼠淋巴细胞与合适的小鼠骨髓瘤细胞系融合以及通过更先进的重组技术产生的杂交瘤常规生产的。
更小的抗体-类蛋白或多肽是由具有最小附加结构的抗原结合位点形成的。这是单链抗原结合蛋白或多肽(“SCAs”)或抗体单链可变片段(“sFv”)的现有技术。这些可能包括将单独的可变区，VL和VH，桥连形成一条多肽单链的连接物多肽。
对这一理论的描述和单链抗原结合蛋白的制备可参见Ladner等人的4,946,778、5,260,203、5,455,030和5,518,889美国专利，和Huston等人的5,091,513(″biosynthetic antibody binding sites″(BABS))美国专利中，其公开内容在此全部引用作为参考。在上述专利叙述的方法中生产的单链抗原结合蛋白具有与其对应的Fab片段基本相似的结合特异性和亲和性。
广泛地说，成对的合适轻链和重链可以结合形成抗原结合位点。每一个单独的轻链和重链都折叠成为大约110氨基酸的区域，呈现出保守的三维构象。轻链包括1个可变区(VL)和一个恒定区(CL)，而重链包括一个可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3)。成对的区相结合就形成了离散的结构。尤其是轻链和重链的可变区相连形成了包含抗原结合位点的“Fv”区域。对抗原结合来说恒定区不是必需的，在一些情况下可将其通过蛋白水解与抗体分子分离，从而生成由一半轻链和四分之一重链构成的生物活性(即结合)可变区。
此外，x-射线晶体分析法确认了某一族的所有抗体及其Fab片段(即由VL、CL、VH和CH1构成的片段)都表现出相似的可变区结构，但在其不同的高变区片段上的序列则相差甚远。在对来自不同动物种类抗体的比较也观察到了这一现象。免疫球蛋白可变区似乎可以容忍在抗原结合环中的突变。所以，除了在高变区中，由两条重链和轻链限定的大多数抗体的所谓“可变”区实际上在其三维排布上都是相当恒定的。例如，参见，Huber，R.，Science 233：702-703(1986)，在此将其引用作为参考。
SCA多肽与那些MAb和更大更保守的抗体片段的体内性质有所不同。它们的小大小使得SCA可以更快速地从血液中清除，并更快速地渗透入组织中(Milenic，D.E.等，Cancer Research 51：6363-6371(1991)；Colcher等，J.Natl.Cancer Inst.82：1191(1990)；Yokota等，Cancer Research 52：3402(1992))。此外，由于缺少通常存在于抗体分子中的恒定区，SCA多肽不会在诸如肝和肾的组织中滞留。所以，SCA多肽已被应用于以快速组织渗透和清除为优势的癌症诊断和治疗中。
在Huston等人的美国专利5,091,513中，对合成抗原结合蛋白进行了描述，在此引用作为参考。所述蛋白的特征在于一或多个氨基酸序列组成的区域可作为生物合成抗体结合位点(BABS)。所述位点包括(1)非共价连接或二硫键键合的合成VH和VL区，(2)VH-VL或VL-VH单链，其中所述VH和VL与多肽连接物连接，或(3)单独的VH或VL结构域。所述结合结构域包括与构架区连接的来自单独免疫球蛋白的互补决定区(CDRs)。应该注意到，Huston等人所描述的蛋白具有起始重链，即VH-肽连接物-VL结构域的特点。
多价抗原结合蛋白是公知的。如此所述，多价抗原结合蛋白包括二或更多个单链蛋白分子。其可通过共价或非共价结合或连接。现已证明了多价抗原结合蛋白具有增强的抗原结合活性、二种或更多特异性结合以及其他新用途。参见，Whitlow，M.，等，Protein Engane.7：1017-1026(1994)；Hoogenboom，H.R.，Nature Biotech.15：125-126(1997)；以及WO 93/11161，和编号为5,869,620、6,025,165、6,027,725、6,103,889、6,121,424和6,515,110、公有的美国专利，在此将其全部引用作为参考。
尽管诸如上述单链多肽的多肽及其融合蛋白在哺乳动物中并不与显著的抗原性相关，依然期望能延长其循环寿命甚至进一步降低抗原反应的可能性。
一种延长循环寿命以及降低蛋白和多肽抗原性的方法是将其与诸如聚环氧烷的聚合物结合。然而，所述多肽相对较小的大小及其精细的结构/活性关系，使得对聚环氧烷的修饰十分困难且难以预料。
为了有效地将聚环氧烷共价连接于蛋白，所述聚合物的末端羟基基团首先要转化成具有反应活性的官能团。这一过程被频繁地称为“活化”，且所述产物被称为“活化PEG”或活化的聚环氧烷。例如，在大多数情况下使用的是与蛋白分子的氨反应、在其末端具有一个官能团的甲氧基聚(乙二醇)(mPEG)。
还介绍了许多诸如PEG的琥珀酰亚胺琥珀酸酯衍生物(SS-PEG)的活化聚合物(Abuchowski等，Cancer Biochem.Biophys.7：175-186(1984))。SS-PEG与蛋白(30分钟)在温和条件下快速反应，生成更加活化的修饰结合物。在Zalipsky等人编号为5,122,614的美国专利中公开了聚(乙二醇)-N-琥珀酰亚胺碳酸酯及其制备。这种形式的聚合物可以方便地与蛋白以及低分子量多肽和其他含有游离氨基基团材料的氨基基团反应。其他蛋白的氨基基团与和PEG之间的连接也是公知的尿烷连接(Veronese等，Appl.Biochem.Bioteclu-iol.11：141-152(1985))、氨基甲酸酯连接(Beauchamp et aL，Anal.Biochem.131：25-33(1983))或其他连接。
然而，尽管有这些或其他方法，还是经常发现所得到的结合物缺乏足够的滞留活性。例如，Benhar等人(Biocomueate Chem.5：321-326(1994))观察到重组单链免疫毒素的PEG化导致了所述免疫毒素特异性靶免疫活性的丧失。所述免疫毒性活性的丧失是在所述免疫毒素抗体结合区内的两个赖氨酸残基上PEG结合连接的结果。为克服这一问题，Benhar等人用精氨酸残基替换了这两个赖氨酸残基，并能获得具有3倍于对抗衍生造成失活的活化免疫毒素。
上述讨论的对克服这些问题的其他建议是使用更长、更高分子量的聚合物。然而，这些材料难于制备且是用起来很昂贵。此外，它们对更容易获得的聚合物几乎没有改进。另一种选择建议是通过三嗪环将聚合物的两条链与蛋白的氨基连接。参见例如，Enzyme 26：49-53(1981)and Proc.Soc.Exper.Biol.Med.，188：364-369(1988)。然而，三嗪是毒性物质，且在结合连接后很难降低至可接受的水平。
对SCA蛋白的三维结构的测定表明，C-末端和所述连接区域离抗原结合位点最远，所以有可能是适于聚合物结合的位点，其中所结合的聚合物不会对抗原结合位点或周围Fv架构在聚合物与这些蛋白的生成中体内糖基化的插入残基的连接的放置位点的构象造成空间位阻或破坏(Wang M.，等，1998 Protein Engng 11：1277-1283)。
在以下本专利申请的共有专利中，对在SCA结构内放置氨基酸残基从而获得更有效聚合物结合的努力进行了描述，在此将其全部引用作为参考，申请日都是2001年2月26日编号为09/791,578和09/791,540的美国申请中描述了选择性放置的半胱氨酸和寡聚赖氨酸残基。
共有申请日都是2001年9月20日编号为09/956,087和09/956,086的美国申请中描述了适于聚合物被选择性结合连接的选择性放置糖基化的SCA中的串联和三连ASN和相关位点。然而，本方法还亟待对聚合物与SCA蛋白的位置结合进行深入优化和改进，以及在允许所述多肽得以滞留的结合活性与特异性，和聚合物结合的所有益处等方面进行深入优化和改进。
发明概述
为了满足这些长久以来的需要，本发明提供了能与聚环氧烷聚合物位点特异性结合的TNF-α-结合、单链抗原结合多肽(“SCA”)，其包括：
包含抗体重链或轻链可变区的抗原结合部分的第一多肽；
包含抗体重链或轻链可变区抗原结合部分的第二多肽；
将所述第一多肽和第二多肽连接的肽连接物，
其中，所述单链抗原结合多肽具有至少一个能与聚环氧烷聚合物结合的Cys残基并具有至少一个抗原结合位点。所述Cys残基优选位于一或多个以下位置：
所述重链或轻链可变区的C-末端；
所述重链或轻链可变区的N-末端；
所述多肽连接物的任意氨基酸位置；
所述N-末端和C-末端；
所述连接物的第2位；
所述连接物的第5位；
所述连接物的第2位和所述C-末端；以及
以上的组合。
优选地，Cys位置包括，例如，所述连接物的第2位、所述C-末端及其组合。所述C-末端优选为天然存在的C-末端，但也可包括任意公知技术的修饰。
本发明的SCA任选地由来自目的抗体优选为例如，抗-TNFα抗体的轻链和/或重链的可变区形成。
本发明还提供了包含本发明单链抗原结合多肽或蛋白的结合物，其中所述结合物包括基本上无抗原性的聚合物，如，聚环氧烷聚合物。所述聚环氧烷优选为聚乙二醇或“PEG”聚合物。
所述聚环氧烷可为任意的合适大小范围，优选范围从5,000到40,000道尔顿。
优选地，所述聚环氧烷聚合物与所述单链抗原结合多肽在Cys残基共价连接。
优选地，所述聚环氧烷与所述单链抗原结合多肽在Cys残基通过诸如马来酰亚胺、乙烯砜、硫醇、邻吡啶基二硫化物和/或碘乙酰胺连接物的连接物连接。最优选为马来酰亚胺连接物。
在本发明的聚合物结合的实施方案中，所述聚环氧烷任选地与至少两条单链抗原结合多肽结合，其中每一条单链抗原结合多肽是相同或不同的。
所述结合物任选地，例如PAO或SCA或两者，进一步与其它的功能部分，如，可检测的标签或标记相连或结合。
本发明还提供了编码所述单链抗原结合多肽的多核苷酸，含有多核苷酸以及适于宿主细胞表达的复制表达载体。
本发明的SCA蛋白是通过任意合适的、公知技术的过程或方法生产的，但优选是通过在此示例的、通过培养含有SCA编码表达载体的宿主细胞以及收集所述宿主细胞表达的单链抗原结合多肽产生的。
本发明还提供了能以二聚体、三聚体、四聚体等形式作为多价抗原结合蛋白能位点特异性结合的包含两个或更多个单链抗原结合多肽的蛋白。
本发明的多价蛋白是通过公知方法制备的，其中每一种SCA都是通过共价或非共价连接物，如，肽连接物、二硫连接物等连接的。在选择性的情况下，所述蛋白是通过将组分SCA多肽进行还原和折叠以非共价连接物进行装配的。在后者中，特别优选的是，所述组分单链抗原结合蛋白或多肽的所述肽连接物的范围在2到18个残基之间。
本发明还提供了在编码为单价、多价蛋白的一或多种所述组分SCA多肽中具有特定Cys残基的多价蛋白。编码这种单链多价蛋白的多核苷酸也是本发明的一部分。
还提供了使用本发明SCA和聚合物结合物的方法。通过实例简单说明，这样的方法包括以下步骤：
将怀疑含有TNF-α的样品与含有本发明的单链抗原结合多肽或多价蛋白的试剂相接触，并测定本发明的单链抗原结合多肽或多价蛋白是否与所述TNF-α相结合。优点在于，依照本发明的多肽或多价蛋白与聚环氧烷聚合物结合。
对所有上述方法而言，所述结合物，所述SCA或所述聚合物都任意地锚定于固体基质上。
还提供了对动物，如，人的疾病或病症进行治疗或检测的方法，包括用有效量的本发明所述的TNF-α结合单链抗原结合多肽进行给药，其中所述单链抗原结合多肽与TNF-α结合并以有效量给药从而抑制TNF-α的相关毒性。以从约10μg/kg到约4,000μg/kg，更优选为从约20μg/kg到约800μg/kg，更优选为从约20μg/kg到约400μg/kg，通过任意公知的系统方式，对本发明的单链抗原结合多肽和/或其聚合物结合物进行给药，其中根据需要的临床反应，可以重复所述给药。通过向体腔灌注、吸入或鼻内方式，以及局部给药的给药，也可预期系统性的治疗，以及得益于本发明的抗TNF-α多肽、蛋白和聚合物结合的化合物的更局部条件的治疗。这些条件包括，如，中毒性休克综合症，以及任意其他公知的针对抗TNF-α治疗的炎性过程。
附图说明
图1A所示为编码具有VL-218-VH-his6结构以及无Cys突变蛋白的SCA 2-7-SC-1(SEQ ID NO：1)DNA分子序列，以及表达的蛋白(SEQID NO：10)。
图1B所示为编码具有VL-218-VH-his6结构以及编码具有C-末端Cys SCA的2-7-SC-2(SEQ ID NO：2)DNA分子序列，以及表达的蛋白(SEQ ID NO：11)。
图1C所示为编码具有VL-(GGGGS)3-VH-his6结构以及编码具有C-末端Cys的SCA的2-7-SC-3(SEQ ID NO：3)DNA分子序列，以及表达的蛋白(SEQ ID NO：12)。
图1D所示为编码具有VL-218-VH结构以及编码具有C-末端Cys的SCA的2-7-SC-4(SEQ ID NO：4)DNA分子序列，以及表达的蛋白(SEQ ID NO：13)。
图1E所示为编码具有VL-218-VH-his6结构以及编码在连接物第2位具有Cys的SCA的2-7-SC-5(SEQ ID NO：5)DNA分子序列，以及表达的蛋白(SEQ ID NO：14)。
图1F所示为编码具有VL-218-VH-his6结构以及编码在连接物第2位具有Cys和在C-末端具有Cys的SCA的2-7-SC-6(SEQ ID NO：6)DNA分子序列，以及表达的蛋白(SEQ ID NO：15)。
图1G所示为编码具有VL-(GGGGS)3-VH-his6结构以及编码在连接物第5位具有Cys的SCA的2-7-SC-7(SEQ ID NO：7)DNA分子序列，以及表达的蛋白(SEQ ID NO：16)。
图1H所示为编码具有VL-218-VH-his6结构以及编码在C-末端和N-末端具有Cys的SCA的2-7-SC-8(SEQ ID NO：8)DNA分子序列，以及表达的蛋白(SEQ ID NO：17)。
图1I所示为编码具有结构VL-GGGGS-VH-his6以及编码无游离Cys的SCA的2-7-SC-9(SEQ ID NO：9)DNA分子序列，以及表达的蛋白(SEQ ID NO：18)。
图2A所示为克隆2-7-SC-2 SCA的表达。SCA蛋白的表达是用1％甲醇或MeOH在Pichia培养物中诱导的。27kDa用箭头(“  ”)标出。
图2B所示为克隆2-7-SC-2的表达和纯化数据，包括对所述组分进行考马斯亮兰染色的SDS-PAGE凝胶分析，以及每一步的产率。在所述染色的凝胶中，可见少量达约54kDa的二硫键连接的二聚体。图解：STD，Mark12蛋白分子量标准；SUP，发酵收集的上清液；DIA，完全过滤的上清液；DEAE，第1次DEAE层析的流程；Ni++，镍亲和层析后的洗脱样品；DEAE，第2次DEAE层析。
在约27kDa可见峰值，由“＞”鉴定。
图3A所示为mPEG-MAL的结构。
图3B所示为mPEG2(MAL)的结构。
图3C所示为mPEG(MAL)2的结构。
图3D所示为mPEG2(MAL)2的结构。
图3E所示为活化mPEG-MAL与巯基-SCA的反应。
图3F所示为乙烯砜活化的PEG。
图4所示为吸光度对应于200-400nm之间波长的光谱图。曲线A是半胱氨酸；曲线B是反应后mPEG-MAL(1mM)+半胱氨酸(3mM)；曲线C是PEG-MAL 1mM。
图5A所示为通过亮兰染色显影对2-7-SC-5和2-7-SC-5结合物进行的SDS-PAGE分析。泳道1提供的是MARK12(Invitrogen)蛋白分子量标准，泳道2是非结合的2-7-SC-5 SCA，泳道3是PEG(20K)2-7-SC-5SCA并且泳道4是PEG(40K)2-7-SC-5 SCA。
图5B所示为通过碘液染色显影对2-7-SC-5和2-7-SC-5结合物进行的SDS-PAGE分析。泳道1提供的是MARK12蛋白分子量标准，泳道2是非结合的2-7-SC-5 SCA，泳道3是PEG(20K)2-7-SC-5 SCA，泳道4是PEG(40K)2-7-SC-5 SCA。
图6A所示为在2-7-SC-2 SCA存在时，生物素酰化的TNFα与细胞受体结合的流式细胞计数分析。曲线1代表没有荧光标记的细胞数量，曲线2代表与生物素-TNFα然后与链霉亲和素-PE结合之后的细胞数量，曲线3代表用SCA、生物素-TNFα预孵育后用链霉亲和素-PE处理的细胞数量。
图6B所示为2-7-SC-2 PEG(20K)SCA存在时，生物素酰化的TNFα与细胞受体结合的流式细胞计数分析。曲线1代表没有荧光标记的细胞数量，曲线2代表与生物素-TNFα然后与链霉亲和素-PE结合之后的细胞数量，曲线3代表用SCA、生物素-TNFα预孵育后用链霉亲和素-PE处理的细胞数量。
图6C所示为2-7-SC-2 PEG(40K)SCA存在时，生物素酰化的TNFα与细胞受体结合的流式细胞计数分析。曲线1代表没有荧光标记的细胞数量，曲线2代表与生物素-TNFα然后与链霉亲和素-PE结合之后的细胞数量，曲线3代表用PEG-SCA、TNFα预孵育后用链霉亲和素-PE处理的细胞数量。
图7所示为D2E7 2-7-SC-2 SCA蛋白和PEG-SCA衍生物的Western印迹分析。第一检测抗体是用所述纯化的重组SCA蛋白免疫兔子得到的抗-2-7-SC-1 SCA兔抗血清。泳道1和7为分子量标记(250，148，98，64，50，36，22，16，6和4kDa)；泳道2为2-7-SC-2 SCA蛋白；泳道3为乙基-2-7-SC-2；泳道4为PEG(5kDa)-2-7-SC-2；泳道5为PEG(20kDa)-2-7-SC-2；泳道6为PEG(40kDa)-2-7-SC-2。
图8所示为确认这一抗-D2E7抗血清与所述重组SCA蛋白和PEG-SCA结合物反应活性的D2E7 2-7-SC-2和PEG化形式条带的扫描影像的强度。条带A是2-7-SC-2，条带B是2-7-SC-5，条带C是PEG(20k)-2-7-SC-2，条带D是PEG(20k)-2-7-SC-5，条带E是PEG(40k)-2-7-SC-2，条带F是PEG(40k)-2-7-SC-5。
图9所示为用于所述药物动力学研究的一组代表性样品的SDS-PAGE分析。在考马斯亮兰染色的凝胶上对2-7-SC-2 SCA蛋白和2-7-SC-2 PEG-SCA结合物进行检测。在所述左边的凝胶上，上样的样品是非还原的。在右边的凝胶上，上样的样品是用在上样前用3mM β-巯基乙醇在85℃加热2分钟进行还原的。每一泳道大约上样10mg蛋白。图解：MM-分子量标准；泳道1是2-7-SC-2 SCA；泳道2是用N-乙基马来酰亚胺修饰的2-7-SC-2 SCA；泳道3是2-7-SC-2 SCA-PEG(40kDa)；泳道4是2-7-SC-2 SCA-PEG(20kDa)。
本发明的详细描述
因此，本发明提供了改进的抗-TNF-α单链抗原结合多肽和/或由具有选中的工程化官能团有助于与聚合物，如，基本无抗原性的聚合物进行位点直接结合的这种多肽构成的多价蛋白。还提供了本发明的多肽与聚合物的结合物，及其制备和使用方法。
本发明广泛地涉及单链抗原结合蛋白(“SCA”)或抗体的单链可变片段(“sFv”)当与合适的聚环氧烷聚合物在SCA多肽的特意位置结合时，具有增强的性质这一发现。本发明中的SCA被工程化在这些特异位置包括有适于选择性聚合物结合的官能团。聚合物结合的益处广泛地包括在体内抗原性的显著降低，以及在对动物或人类患者给药后延长的循环半衰期。本发明的SCA是如何提供了结合物所希望性质，与任意理论或假说无关，我们相信，通过在所述多肽链或链的选定位置对所述结合位点进行工程化，将避免或降低由于所述结合聚合物的存在引起的对抗原结合功能和链三维结构的干扰。
为了更好的对本发明进行说明，对以下术语进行定义。术语“单链抗原结合分子(“SCA”)”或“单链Fv”(sFv)在这里可以相互换用，除非特别指明。术语“蛋白”和“多肽”也可以相互换用，除非特别指明。广泛地说，SCA是通过结构进行定义的，包括与抗体VL(或VH)所述可变区的第二多肽的结合部分连接抗体VL(或VH)可变区的第一多肽的结合部分，所述两条多肽通过肽连接物将所述第一和第二多肽连成一条多肽单链，使得第一多肽为所述连接物的N-末端而第二多肽为第一多肽和连接物的C末端。
SCA从而包括了一对通过多肽连接物连接的可变区。所述区域可以连接形成功能性的抗原结合位点，如在所述区域包含有适当配对的互补决定区的一对轻链可变区和一对重链可变区的这种情况。在这种情况下，所述单链蛋白广泛地是指“单链抗原结合蛋白”或“单链抗原结合分子”或“单链抗原结合多肽”。如上所定义的，所述SCA任选地为“单价”或“多价”的。单价SCA被工程化成仅包括抗原结合位点，即通过多肽连接物连接一对可变区从而形成所述抗原结合位点。多价SCA是工程化成包括两个或更多抗原结合位点的抗原结合蛋白，即通过肽连接物连接的两或更多对可变区，包括含有如上所述两或更多单链抗原结合多肽的SCA。所述组分SCA部分是通过公知方法进行连接的。
在一个实施方案中，如本发明所述的多价结合蛋白包括为保持完整功能作为抗原结合蛋白的非共价连接的二或更多SCA。在另一实施方案中，多价结合蛋白包括通过共价连接，如，通过若干公知的多肽或非肽连接物化学方法连接的二或更多SCA。此外，如多个SCA形成的多价结合蛋白，可以一条肽链、类似于单价SCA进行表达及人工合成，而不是两或更多相同或不同重复的SCA结构域。
SCA的合成是将所述VL作为N-末端，然后是所述连接物和VH(VL-连接物-VH结构)。在另一实施方案中，SCA是通过将所述VH作为N-末端结构域，然后是连接物和VL(VH-连接物-VL结构)进行合成的。优选实施方案在N-末端包括VL(参见，Anand，N.N.，等，J.Biol.Chem.266：21874-21879(1991))。任选地，可以采用多种连接物。
对单链抗原结合蛋白的理论和生产描述可见于Lader等人编号为4,946,778、5,260,203、5,455,030和5,518,889，和Huston等人编号为5,091,513(″biosynthetic antibody binding sites″(BABS))的美国专利，在此将其全部引用作为参考。基于上述专利下生产的SCAs具有与其对应的Fab片段基本相似的结合特异性和亲和性。
可变结构域(Fv)
本发明的SCA是采用选自、衍生自或对任意所需天然或人工抗体进行修饰的可变结构域(Fv)进行构建的。在另一优选实施方案中，用于本发明的Fv是，从设置为置换文库的Fv的文库通过对所需结合靶进行筛选得到的。简单举例来说，通过该方法应用大量的MAb来获得Fv结构域，并预期从这些中的任意部分都可以获得Fv结构域，并应用于本发明的SCA中。简单举例且不限于此，下述MAB可用来提供Fv结构域：
26-10，MOPC 315，741F8，520C9，McPC 603，D1.3，鼠phOx，人phOx，RFL3.8 sTCR，1A6，Sel55-4，18-2-3，4-4-20，7A4-1，B6.2，CC49，3C2，2c，MA-15C5/K12G0，Ox，等(参见，Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：5879-5883(1988)；Huston，J.S.等，SIM News384(Supp.)：11(1988)；McCartney，J.等，ICSU Short Reports 10：114(1990)；McCartney，J.E.等，unpublished results(1990)；Nedelman，M.A.等，J.Nuclear Med.32(Supp.)：1005(1991)；Huston，J.S.等，In：MolecularDesign and Modeling：Concepts and Applications，Part B，edited byJ.J.Langone，Methods in Enzymolo 203：46-88(1991)；Huston，J.S.等，In：Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in ClinicalOncology，Epenetos，A.A.(Ed.)，London，Chapman & Hall(1993)；Bird，R.E.等，Science 242：423-426(1988)；Bedzyk，W.D.等，J.Biol.Chem.265：18615-18620(1990)；Colcher，D.等，J.Nat.Cancer Inst.82：1191-1197(1990)；Gibbs，R.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：4001-4004(1991)；Milenic，D.E.等，Cancer Research 51：6363-6371(1991)；Pantoliano，M.W.等，Biochemistrv 30：10117-10125(1991)；Chaudhary，V.K.等，Nature 339：394-397(1989)；Chaudhary，V.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87：1066-1070(1990)；Batra，J.K.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.171：1-6(1990)；Batra，J.K etal.，J.Biol.Chem.265：15198-15202(1990)；Chaudhary，V.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87：9491-9494(1990)；Batra，J.K.等，Mol.Cell.Biol.11：2200-2205(1991)；Brinkmann，U.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：8616-8620(1991)；Seetharam，S.等，J.Biol.Chem.266：17376-17381(1991)；Brinkmann，U.et aL，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：3075-3079(1992)；Glockshuber，R.等，Biochemistry 29：1362-1367(1990)；Skerra，A.等，Bio/Technol.9：273-278(1991)；Pack，P.等，Biochemistry31：1579-1534(1992)；Clackson，T.等，Nature 352：624-628(1991)；Marks，J.D.等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Iverson，B.L.等，Science 249：659-662(1990)；Roberts，V.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)87：6654-6658(1990)；Condra，J.H.等，J.Biol.Chem.265：2292-2295(1990)；Laroche，Y.等，J.Biol.Chem.266：16343-16349(1991)；Holvoet，P.等，J.Biol.Chem.266：19717-19724(1991)；Anand，N.N.等，J.Biol.Chem.266：21874-21879(1991)；Fuchs，P.etal.，Bio/Technol.9：1369-1372(1991)；Breitling，F.等，Gene104：104-153(1991)；Seehaus，T.等，Gene 114：235-237(1992)；Taldcinen，K.等，Protein Engng.4：837-841(1991)；Dreher，M.L.等，J.Immunol.Methods 139：197-205(1991)；Mottez，E.等，Eur.J.Immunol.21：467-471(1991)；Traunecker，A.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：8646-8650(1991)；Traunecker，A.等，EMBOJ.10：3655-3659(1991)；Hoo，W.F.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)89：4759-4763(1993))。以上所有文献都被引入作为参考。
基于本发明，在编号为6,258,562的美国专利描述为D2E7的抗-TNFα MAb和由Carter P等人在1992，Proc Natl Acad Sci(USA)89：4285-4289中描述的抗-erbB-2 MAb(HERCEPTINTM)，尤其可作为对SCA和SCA-聚环氧烷结合物进行工程化的典范。D2E7可作为Humira(Abbott Immunology，Abbott Park，Illinois)商业获得。此外，CC49是由Dr.Jeffrey Schlom′s group，Laboratory of Tumor Immunologyand Biology，National Cancer Institute发展的。它与泛-癌肿瘤抗原TAG-72特异性结合。参见Muraro，R.等，Cancer Research 48：4588-4596(1988)。在Filpula等1996(Antibody Engineering：A PracticalApproach，，Oxford University Press，pp 253-268)中描述的抗-TAG-72CC-49 SCA也可以作为Cys修饰的SCA进行制备，并作为本发明的范例结合物。上述所有引用都被引入作为参考。
肽连接物
本发明的SCA包括设计成跨越VL的C-末端、或其邻近位点、VH的N-末端、或其邻近位点，或将VH的C-末端和VL的N-末端进行连接的肽连接物。
本领域的普通技术人员应该理解，连接物的长度依赖于拟连接多肽的性质以及由该连接导致的连接融合多肽的预期活性。通常，连接物应该足够长以允许所产生的连接的融合多肽能适当地折叠成提供预期生物学活性，如抗原结合活性的构象。在每个特别的情况下，优选的长度依赖于拟连接多肽的性质以及由该连接导致的所述连接融合多肽的预期活性。
当可获得构象信息时，如以下所讨论的SCA多肽的情况，合适的连接物长度可以通过对组成多肽的3维构象以及所产生的连接的融合多肽的预期构象进行考虑来估计。当不能获得这些信息时，连接物的长度是通过对具有所需生物学活性不同长度连接物的一些列连接融合多肽进行经验性确定的。这些连接物在WO 94/12520中有详细描述，在此引用作为参考。
用于构建SCA多肽的肽连接物的长度通常在约2到约50氨基酸残基之间，优选地从约2到约10个残基。在其他实施方案中，所述连接物的大小是从约10到约30个残基。在某些更优选的实施方案中，尤其是涉及含有二或更多非共价相连的SCA多肽的多价连接物的实施方案中，优选地所述连接物大小是从约2到约20个残基。更优选地，这些连接物富含丝氨酸或富含氨基乙酸。
所述连接物被设计成挠性的，并推荐使用具有下划线的Gly和Ser残基的序列。为了增强所述连接物和与其相连的单链Fv蛋白的溶解性，可以包括三个荷电的残基，两个为荷正电的赖氨酸残基(K)，一个荷负电的谷氨酸残基(E)。优选地，在靠近VH的N-末端的位置放置一个赖氨酸残基，从而在形成所述连接物和所述VH之间的肽键时补充正电荷损失。这种连接物在共有的编号为5,856,456的美国专利中有详细说明，在此引用作为参考。还可以参见Whitlow，M.，等，ProteinEngng.7：1017-1026(1994)，在此引用作为参考。
对本发明的多价抗原结合蛋白而言，二或更多SCA多肽的共价或非共价相连对它的形成是优选的。虽然多价SCA可以从具有长达25个残基的连接物的SCA进行制备，但它们趋向于不稳定。Holliger，P等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90：6444-6448(1993)近来证明了长度为0-15残基的连接物有助于二价Fvs的形成。参见Whitlow，M.，等，Protein Ensns 7：1017-1026(1994)；Hoogenboom，H.R.，NatureBiotech.15：125-126(1997)；以及WO 93/11161。在此引用作为参考。
位点特异性PEG化序列的鉴定与合成
本发明提供了位于VL和VH区、邻近所述多肽的C-末端(VL、VH或其邻近位点)、所述多肽的N-末端(VL、VH或其邻近位点)、在第一和第二多肽区之间的所述连接物区，或这些区域的组合中的特异位点的巯基官能部分，例如含有巯基的氨基酸残基。在本发明中，聚合物结合的特异位点优选地位于所述多肽连接物、所述SCA的C-末端或邻近C-末端和优选连接物的第2残基上。
含有巯基的官能团可以是本领域公知的，包括天然氨基酸残基，和/或非天然产生的氨基酸残基，以及上述氨基酸残基的含巯基官能化衍生物。在一个优选实施方案中，所述巯基功能部分是半胱氨酸残基。这一方案是优选的，因为SCA蛋白通常具有两个深埋的二硫键(PadlanEA，1994，Antibody-Antigen Complexes，R.G.Landes Company，Austin)但却没有游离半胱氨酸。所以，只有所述工程化的Cys巯基可以与选择与巯基反应的活化聚合物结合。
用于向多个不同位置引入Cys位点的特别核酸序列依赖于所述天然存在的核酸序列。最优选的位点是那些以最小数量的改变来引入所述Cys插入同时满足上述空间需要的位点。当然，基于所述遗传密码子的冗余，一个特定的氨基酸可以由多个核苷酸序列编码。
可以采用适于定点突变的任意公知方法来改变所述天然蛋白的序列从而引入所述Cys残基。突变蛋白基因被放置在诸如细菌细胞、酵母或其它真菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞的表达系统中。通过标准方法对所述突变蛋白进行纯化从而回收蛋白。
优选地，表达SCA突变蛋白的核酸分子是通过寡核苷酸指导的突变产生的。这些产生所述位点特异性Cys突变蛋白的方法，以及克隆DNA突变的相关技术都是本领域公知的。参见，Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)；Ausubel etal.(eds.)，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，JohnWiley and Sons(1987)，在此引用作为参考。
宿主和载体
在对目的SCA的核酸序列进行突变在所需位点提供了Cys残基之后，将所述突变的核酸优选地插入合适的克隆载体中，在那里编码所述SCA的核酸可操作的连接于控制转录表达的调节序列。为了从所需宿主细胞系统中优化SCA的生产，这些是优选地来自于公知技术的技术。
SCA是公知地可通过原核或真核宿主细胞表达和生产的，虽然出于多种目的真核宿主细胞是优选的。优选地原核宿主包括但不限于诸如芽孢杆菌，、链霉菌、链球菌和/或大肠杆菌。优选的真核宿主细胞包括酵母或其它真菌细胞、昆虫细胞和/或哺乳动物细胞。优选的这些还包括人类或灵长类细胞，表现为体内或在组织培养中。更优选地，本发明的SCA指通过转化诸如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)的酵母生产的。可任意地选择表达系统从而在宿主细胞中提供瞬时表达、或整合入所述宿主细胞基因组从而创建转化细胞系。
使用标准蛋白纯化方法来对这些突变蛋白进行纯化。对所述天然蛋白纯化方案来说只需要进行微小的修改。例如，对单价、多价以及融合形式的蛋白尤其是SCA多肽的载体宿主、生产方法、分离和纯化的选择，都详细地在共有的编号为4,946,778和6,323,322的美国专利中有描述，在此引用作为参考。
在一个优选实施方案中，编码目的SCA的核酸分子和选择标记或作为单独载体或作为共-引入载体被整合入宿主细胞染色体中。所述标记可以与宿主的营养缺陷型(诸如his4、leu2或ura3的酵母常见营养缺陷型标记)，杀生物剂，如，抗生素，或对诸如铜的重金属的抗性等作用的互补。所述选择性标记基因可以直接连接于SCA DNA序列来进行表达，或者通过共转染引入所述的相同细胞中。通过在给定系统中所述标记的存活或其它效果对稳定整合有所述引入核酸的细胞进行筛选。
在另一实施方案中，所述目的SCA是通过在所述受体宿主细胞中能自我复制的合适质粒载体编码的。出于这一目的可以采用任意公知的多种载体。选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括：将包含载体的受体细胞从没有包含载体的受体细胞中识别和筛选出来的容易程度；在特定宿主中所需所述载体的拷贝数；是否可以在不同物种的宿主细胞之间进行所述载体的“穿梭”。
可以采用任意系列的酵母载体系统。这种表达载体的范例包括酵母2-微米循环，表达质粒YEP13、YCP和YRP等，或其衍生物。这些质粒是本领域公知的(Botstein等，Miami Wntr.Sump.19：265-274(1982)；Broach，J.R.，In：The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces：Life Cycle and Inheritance，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，p.445-470(1981)；Broach，J.R.，Cell28：203-204(1982)).115。
对哺乳动物宿主而言，有几种公知的载体系统是可获得的。一类是来源于诸如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或SV40病毒的动物病毒利用DNA元件提供染色体外自我复制质粒的载体；另一类是依赖于将所述所需基因序列整合入所述宿主染色体的载体。稳定地将引入DNA整合入其染色体的细胞是通过标记筛选的，如上所述。为了mRNA的最合适成，也会需要其它的元件。这些元件可以包括剪接信号，以及转录启动子、增强子以及终止信号。包括这些元件的cDNA表达载体如Okayama，H.，Mol.Cell.Biol.3：280(1983)以及其它公知技术所述。
用于细菌中的优选载体包括来自Qiagen的pQE70，pQE60和pQE-9，；来自Stratagene的pBS载体，Phagescript载体，Bluescript载体，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A；以及来自Pharmacia的ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5。优选的真核载体为来自Stratagene的pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1和pSG；以及来自Pharmacia的pSVK3，pBPV，pMSG和pSVL。Pichia中的优选载体有pHIL-S 1(Invitrogen Corp.)和pPIC9(Invitrogen Corp)。其它合适的载体对本领域的技术人员来说是很容易明白的。
一旦含有构建体的载体或DNA序列被制备好以用于表达，DNA构建体就可以引入或转化入合适的宿主。可以采用诸如转化、转染、原生质融合、磷酸钙沉淀、电穿孔或其它现有技术等多种技术。在细胞用重组DNA(或RNA)分子进行转化之后，将所述细胞生长于培养基中并筛选适当的活性。所述序列的表达导致了适于与本发明PEG结合的突变SCA的生产。
SCA蛋白的生产与纯化
本发明中的单价或多价抗原结合蛋白可以通过合适的公知方法进行生产。广泛地说，所述方法包括制备合适的表达载体、在兼容的宿主细胞中表达所述载体、培养所述宿主细胞以及回收所需蛋白。
为了在不能将重组蛋白分泌到培养基的原核细胞或其它培养细胞中进行表达，回收来自于所收获的细胞。将所收获的细胞材料用于细胞裂解并洗涤，将所形成的包含体在兼容的变性溶剂中溶解，在有效提供重折叠成有功能结合蛋白的条件下进行稀释从而进行重折叠，以及两步离子交换HPLC层析。优选的原核表达系统包括大肠杆菌(E.coli)，参见编号为4,946,778、5,260,203、5,455,030、5,518,889和5,534,621的美国专利以及Bird等，Science 242：423(1988)，在此引用作为参考。
所述示范性SCA蛋白表达的起始工作采用的是来自Xoma公司(araB启动子以及pelB信号)的大肠杆菌表达系统。所述SCA成功表达。然而，在Xoma Corporation系统中表达的所述蛋白在所述胞外质中保留了与细胞的结合，并且需要其它的纯化步骤。
更优选的表达系统采用的是真核宿主细胞以及具有分泌信号序列的表达载体。这一优选实施方案避免了从E.coli宿主中回收所表达的作为不溶包含体的SCA。
如有需要还可以进行糖基化。许多重组DNA策略都是采用强启动序列以及在酵母中生产所需蛋白的高拷贝数质粒。酵母可以识别克隆哺乳动物基因产物上的引导肽以及分泌含有引导肽(即前肽)的肽。
基于这一原因，此述示范性的SCA蛋白都是从所述巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中分泌表达的，并从溶液中回收。
具有D2E7 MAb可变结构域的SCA蛋白
在特定的优选实施方案中，按照本发明的SCA是通过采用所述D2E7 MAb的可变结构域开发而来的。所述D2E7 MAb是由CambridgeAntibody Technology and BASF Corporation开发得到的。它特异性地与人细胞因子、肿瘤坏死因子α(TNF-α)结合，在编号为6,09,0382和6,258,562的美国专利中对所述MAb有详细的描述，在此引用作为参考。这一抗体的选定结构域可以作为制备在特异位置的各条多肽序列上整合有一或多Cys残基的多种示范性SCA分子的模型。
简而言之，整个合成基因是使用14条长度从20-102碱基的重叠合成寡核苷酸通过聚合酶链反应(PCR)构建的。寡核苷酸指导的突变被进一步用于构建所述原始序列的其它变异体。由所得载体编码的SCA包含通过肽连接物连接的D2E7 MAb的全部可变轻链(VL)和可变重链(VH)片段。示范性的连接物是指定为“218-连接物”的18残基的连接物以及15残基的连接物。
对所述18氨基酸的“218-连接物”的描述见于Filpula等，1996，Antibody Engineering：A Practical Approach，1996，Oxford UniversityPress，pp 253-268)。对15氨基酸长度(GGGGS)3连接物(SEQ ID NO：42)的描述见于Huston等，1988，Proc Natl Acad Sci(USA)85：5879-5883。在一些情况中，包括了C-末端的6-组氨酸标签(his6)(SEQ IDNO：43)以简化通过金属固定化金属离子亲和层析(IMAC)进行的纯化。将所述完整基因克隆到大肠杆菌质粒从而在AppliedBiosystems(Foster City，California)(原先由ABI/Perkin-Elmer生产)的ABI PRISM310 Genetic Analyzer上进行DNA序列确认。游离半胱氨酸的结构域取向、连接物和放置总结于下表1。
表1：具有D2E7 Fv的SCA克隆
  SCA克隆编号   SEQ ID No   设计   游离Cys的位置   附图
  2-7-SC-12-7-SC-22-7-SC-32-7-SC-42-7-SC-52-7-SC-62-7-SC-72-7-SC-82-7-SC-9   SEQ ID NO：1SEQ ID NO：2SEQ ID NO：3SEQ ID NO：4SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6SEQ ID NO：7SEQ ID NO：8SEQ ID NO：9   VL-218-VH-his6VL-218-VH-his6VH-(GGGGS)3-VL-his6VL-218-VHVL-218-VH-his6VL-218-VH-his6VL-(GGGGS)3-VH-his6VL-218-VH-his6VL-GGGGS-VH-his6   无              1AC-末端          1BC-末端          1CC-末端          1D连接物第2位     1E连接物第2位和   1FC-末端连接物第5位     1GC-末端和N-末端  1H无              1-I
如上表1所总结的，图1A、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H和1I代表了上述9种基因的DNA和编码的多肽序列。
SCA蛋白的重组表达和纯化
如上所述，将巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)用于如上所述SCA变异体蛋白的生产。将来自于所述酵母α-接合因子的信号序列直接插入每一种这些SCA蛋白的成熟编码序列之前。这一信号肽的氨基酸序列是Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala SerSer Ala Leu Ala^Ala(SEQ ID NO：36)，其中″^″代表剪切位点。所述信号的第20个氨基酸(^后面的丙氨酸)也包括在这些构建体中。所以，在每一个示范性的SCA中，成熟SCA蛋白的氨基末端含有这一丙氨酸，后面都分别连接有如图2A-2H(SEQ ID NOS.1-9)所示的完整氨基酸序列，如表1所示。N-末端蛋白质序列分析确认了这些序列是正确加工的。这些表达所述D2E7 SCA的突变基因在EcoRI位点被各自连接入Pichia转移质粒pHIL-D2(Invitrogen Corp.)并被转化入巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)宿主GS-115中。
这一过程的详细流程来自于Invitrogen Corpration的Pichia表达试剂盒操作手册Cat.No.X1710-01(1994)，在此将其引用作为参考。表达的初始检测是通过考马斯亮兰对SDS-PAGE进行染色完成的。每种SCA蛋白的Pichia表达菌株克隆数对应于上表1中的2-7-SC数量。
SCA蛋白(约27kDa)在重组Pichia中以高水平进行表达和分泌(约20-100mg/L)。在缺乏还原剂的条件下进行的SDS-PAGE分析证明了单体和通过两个单体之间一个二硫键交联形成的二聚体的存在。制备了针对纯化2-7-SC-1 SCA蛋白的兔抗血清。采用这一制剂的Western分析证实了所表达SCA蛋白的一致性。
例如，图8所示为确认这一抗-D2E7抗血清与重组SCA蛋白和PEG-SCA结合物反应活性的D2E7 2-7-SC-2和PEG化形式的Western印迹分析结果。采用了抗-218-连接物抗体。在4-20％非还原的SDS-PAGE凝胶上对1μg的每一种样品进行分析。第一抗体和第二抗体分别是在兔子中产生的抗-218-连接物抗体和山羊抗兔抗体偶联的辣根过氧化物酶。所述酶底物是来自于Moss，In.的TMBM过氧化物酶底物。D2E7 2-7-SC-2在C-末端具有PEG，而2-7-SC-5在218连接物上具有PEG。条带A是2-7-SC-2，条带B是2-7-SC-5，条带C是PEG(20k)-2-7-SC-2，条带D是PEG(20k)-2-7-SC-5，条带E是PEG(40k)-2-7-SC-2，条带F是PEG(40k)-2-7-SC-5。
从巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)上清液中纯化SCA蛋白，通过2或3种简单的柱层析使其纯度高于95％。对具有his6标签(SEQ IDNO：43)的SCA蛋白而言，将透析的发酵培养基彻底过滤并流过DEAE柱，然后结合于IMAC镍亲和柱(QIAGEN)。用咪唑对所结合的SCA进行洗脱，然后在流过另一个DEAE阴离子交换柱。将所述流程液彻底过滤从而对所述SCA蛋白进行浓缩和进一步表征。对缺乏所述his6标签(SEQ ID NO：43)的SCA蛋白而言，可以用来自PierceBiotechnology，Inc(Rockford，Illinois)的蛋白L-琼脂糖柱以低pH洗脱纯化；或通过来自Amersham Pharmacia(Piscataway，NJ)的HS阳离子交换层析进行捕获，然后通过盐梯度洗脱和彻底过滤进行纯化。HS层析是优选方法。
图2A和2B所示为克隆2-7-SC-2表达和纯化的代表性数据，包括对所述级分进行考马斯亮兰染色的SDS-PAGE凝胶分析，以及每一步的产率。在所述染色的凝胶中，可见少量达约54kDa的二硫键连接的二聚体。
巯基特异性活化聚合物
优选地，本发明的SCA与巯基特异性活化的聚合物相连。具体地，应用于本发明中的所述活化聚合物优选地在至少其的一个末端含有一个巯基或巯基选择性末端连接基团。在本发明的实践中，很容易采用与游离巯基具有反应性的诸如聚环氧烷(PAO)聚合物的若干公知活化聚合物。具有反应活性基团的例子包括马来酰亚胺、乙烯砜、硫醇、邻吡啶基二硫化物和碘乙酰胺，从所述马来酰亚胺基团具有对巯基以及在温和条件下发生结合反应的极高特异性来看，更优选地是马来酰亚胺活化的聚乙二醇(PEG-mal’s)。参见，例如，共有的编号为5,730,990的美国专利，在此引用作为参考。其它的巯基选择性活化PEG-聚合物可来自Nektar Therapeutics(formerly ShearwaterCorporation)，参见2001 Shearwater Corporation Catalog，在此引用作为参考。还可以参见Goodson，R.J.& Katre，N.V.1990，Bio/Technology8：343；Kogan，T.P.1992，Synthetic Comm.22，2417，在此引用作为参考。
例如，在此以与本发明的SCAs结合的直链聚合物mPEG-MAL(5kDa)(例如Shearwater Cat.No.2D3XOT01)和mPEG-MAL(20kDa)，以及支链聚合物mPEG2-MAL(40kDa)(例如Shearwater Cat.No.2D2MOH01)作为示例。这些马来酰亚胺-PEG聚合物的结构以及所述结合的化学性质由图3A-图3E所示以便参考。图3F所示为mPEG-乙烯砜。如图3E所示，多种马来酰亚胺-活化的聚合物很容易与游离的巯基反应。在图3E中，“SCA”是含有至少一个游离巯基(S-H)如本发明所述的蛋白。参见下表2。
表2
  附图编号   描述   Nektar/Shearwater Cat.Nos.
  图3A图3B图3C图3D图3F   mPEG-MALmPEG2(MAL)mPEG(MAL)2mPEG2(MAL)2mPEG乙烯砜   2D2M0H012D2M0P012D3X0T012D2D0H0F2D2D0P0F目录第10页
其它的可以包括巯基特异性连接物的聚合平台包括在共转让的编号为5,643,575、5,919,455、6,113,906(U-PEG′s)、6,153,655和6,395,266(末端分支PEG′s)、6,251,382(聚PEG′s)的美国专利和USSN10/218,167(N-二(羟乙基)甘氨酸)等公开的。也参见Shearwater Polymers，Inc.catalog″Polyethylene Glycol and Derivatives 2001″，上述每一个公开的内容都被引用作为参考。
如上所述，所述结合物的聚合物部分优选为聚环氧烷。更优选地，所述聚合物部分是基本无抗原性的聚乙二醇。尽管PAO’s和PEG’s在重量平均分子量上相差很大，那些包括在本发明中组合物中的成分在本发明的大多数情况下单独具有的重量平均分子量从2,000Da到136,000Da。更优选地，所述聚合物的重量平均分子量从约3,000Da到约100,000Da。最优选地，聚合物部分的重量平均分子量从约5,000Da到约40,000Da。
在此包括的聚合物质优选为在室温下是可溶性的。这种聚合物的非限制性例子包括诸如聚乙二醇或聚丙二醇的聚环氧烷同聚物，聚氧乙烯化的多元醇，其共聚物以及其嵌段共聚物，所述嵌段共聚物的水溶性依然保留。对具有游离半胱氨酸而不是赖氨酸或组氨酸的所述马来酰亚胺聚合物特异反应性的确认是通过将所述马来酰亚胺分别与这些游离氨基酸进行反应实现的。
图4确认了具有活化PEG-MAL半胱氨酸的反应活性。以3mM溶液，对半胱氨酸的吸光度如曲线A所示。浓度为1mM时，对活化PEG-MAL的吸光度如曲线C所示，且通过以300nm为中心的宽吸收峰进行表征。吸收曲线B来自1∶3的比率(1mM PEG-MAL和3mM半胱氨酸，100mM磷酸钠，pH 6.0，1mM EDTA，25℃)半胱氨酸和活化PEG-MAL组合溶液。曲线B的轨迹与曲线A类似，只是平移到了右侧，而PEG-MAL特征性300nm宽峰并不存在，确认了活化PEG与半胱氨酸的反应性(未显示)。对于组氨酸或赖氨酸(未显示)的类似吸光度曲线证实了这些残基在所述操作条件下并不具有较高的反应活性。
标记或标签的结合物
根据本发明生产聚环氧烷结合的SCA后，可以通过向所述SCA-聚合物结合物连接或结合诊断或治疗制剂从而对所述结合物进行任选的深入修饰。基于本发明的抗体结合物的普通制备方法可见于Shih，L.B.，等，Cancer Res.51：4192(1991)；Shih，L.B.，and D.M.Goldenberg，Cancer Immunol.Immunother.31：197(1990)；Shih，L.B.，等，Intl.J.Cancer46：1101(1990)；Shih，L.B.，etal.，Intl.J.Cancer 41：832(1988)，在此全部引用作为参考。该间接方法涉及抗体(或SCA)与具有装载有一或多个诸如肽、脂类、核酸(即磷酸赖氨酸复合物)、药物、毒素、螯合剂、硼附加物或可检测标记分子的生物活性分子的载体聚合物的反应，所述抗体的聚环氧烷含有一个官能团。
在某些替换的实施方案中，结合SCA的聚环氧烷被直接结合或连接于诊断或治疗制剂。普通的过程与间接的结合方法相类似，除了诊断或治疗制剂直接连接于氧化的sFv组分。参见编号为5,443,953的美国专利，在此引入作为参考。
药物组合物以及所述SCA和/或SCA聚合物结合物的给药
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明SCA和/或SCA聚合物结合物。“治疗有效量”是指要达到所需治疗效果、所需的剂量和时间段的有效量。SCA和/或SCA聚合物结合物的治疗有效量可根据诸如疾病状态、年龄、性别以及个体体重、以及在所述个体中引起所需反应的抗体或抗体部分的能力的因素进行变化。有效治疗量也可以是抗体或抗体部分的毒性或有害效果高于所述治疗效果的任意剂量。“预防有效量”是指要达到所需治疗效果、所需的剂量和时间段的有效量。通常，因为预防剂量使用在疾病之前或疾病早期的受试者，所以所述预防有效量会小于所述治疗有效量。
可以对剂量方案进行调节从而提供最适的所需反应(例如，治疗或预防反应)。例如，可以进行单次大药丸给药，若干分割的剂量可以随时间进行给药，或所述剂量可以通过所述治疗情况的紧急程度进行成比例的降低或升高。特别优选配制单位剂量形式的肠胃外组合物为了药剂给药和均一性的方便。在此使用的单位剂量形式是指适于对所要治疗的所述哺乳动物对象，作为单次剂量的生理不连续单位；每单位都包含经过计算为了与所述必要的制药载体一起产生所需的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明所述单位剂量形式的说明是通过且直接依赖于(a)活性化和物的独特性质以及要达到的特定治疗或预防效果来，以及(b)与对于治疗个体过敏的活性化合物的化合相关工艺的限制进行说明的。
本发明中SCA和/或SCA聚合物结合物的示范性、非限制性的治疗或预防有效量是0.1-20mg/kg，更优选为1-10mg/kg。需要注意到剂量值可以随需要进行缓解病症的种类和严重程度进行变化。还应该理解对于特定的个体而言，具体的剂量方案可以根据个体的需要以及通过对施用或监控施用所述组合物的人的职业判断随时间进行调节，在此设定的剂量范围只是示范性地，而不应被认为是对所述权利要求组合物的范围和实践进行限制。
药物组合物
在另一优选实施方案中，本发明的所述SCA被用于对涉及感兴趣的特定SCA蛋白结合特异性的病症进行治疗和/或诊断。所以，通过共知的方法，向具有这些疾病或病症的动物和人进行SCA和/或SCA聚合物结合物给药，所给药SCA的结合性质对这些疾病或病症有治疗或诊断作用。优选地，所述SCA是基于本发明的聚合物结合的。
本发明的SCA和结合SCA可被包含在适于对患者，如，需要此种给药的动物或人进行给药的药物组合物中。通常，所述药物组合物包含具有至少一种结合特异性的SCA多肽以及药物可接受的载体。
术语“药物可接受的载体”包括任意以及所有生理学兼容的溶剂、分散介质、敷料、抗微生物剂、如抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。药物可接受的载体的例子包括一或多种水、盐水、磷酸缓冲液、葡聚糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，可优选地在组合物中包括等渗剂，例如，糖，多元醇诸如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。药物可接受的载体还包括能提高所述抗体或抗体部分半衰期或有效性的诸如湿润或乳化剂，防腐剂或缓冲液的助剂。
本发明的组合物可任意地制备成多种剂型。包括，例如，液体，半固体或固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射或不溶解的溶液)、分散液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选剂型依赖于进行给药和治疗应用的方式。通常的优选组合物是可注射或难溶溶液的形式，诸如与采用其他抗体对人进行被动免疫的剂型相似的组合物。优选给药方式是肠胃外的(例如，静脉、皮下、腹腔、肌肉)。
在一个优选实施方案中，所述SCA和/或SCA-聚合物结合物是通过静脉灌注或注射给药的。在另一优选的实施方案中，抗体是通过肌内或皮下注射给药的。通过吸入给药，如喷剂、气雾剂或喷雾也是所预期的，并且这一方式对于在所述呼吸系统内的系统吸收和/或局部作用是有利的。
药物组合物在制造和储存条件下通常必须是无菌和稳定的。组合物可以配制成溶液，微乳剂、分散剂、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。无菌的可注射性溶液可通过将所述活性化合物(即抗体或抗体部分)以需要的量与合适的具有上述列举多种组分中的一种或其组合物的溶剂合并，如有需要，随后进行过滤灭菌。
一般地，分散剂是通过将所述活性化合物与含有基本分散介质以及所需的来自于以上列举其他组分的无菌媒介无合并来制备的。在为了制备无菌可注射溶液的无菌粉剂情况下，优选的制备方法是可以产生所述活性组分以及来自其预先无菌过滤溶液的任意其它所需组分的真空干燥和冷冻干燥。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的敷料，通过保持所述分散剂的所需颗粒大小以及通过使用表面活性剂，使溶液保持适当的流动性。可注射性组合物吸收的延长可通过将例如单硬脂酸盐和明胶的延迟吸收的制剂包括在组合物中来实现。
本发明的SCA和/或SCA聚合物结合物可通过多种公知的方法进行给药，虽然对许多治疗应用而言，给药的优选途径/方式是静脉注射或灌注。正如会被本领域的技术人员所认识到的一样，所述给药途径和/或方法将于依赖于所需要的结果。
在某个实施方案中，本发明的SCA和/或SCA聚合物结合物可以例如，和惰性稀释剂或可吸收的可食性载体一起口服给药。SCA和/或SCA聚合物结合物(和其他成分，如果需要的话)被任选包含在硬或软壳的胶囊中，压缩成片剂，或直接合并于所述患者的膳食中。对口服治疗性给药而言，所述化合物可以与赋型剂合并，并以可吸收的片剂，含片，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮剂，糖浆，干糊片等进行使用。为了采用除肠胃外给药的其他方式对本发明的SCA和/或SCA聚合物结合物进行给药，有必要将所述化合物或共-给药的化合物用某种材料包被以防止其失活。
辅助性的活性化合物也可以与所述药物组合物合并。在某些实施方案中，本发明的SCA和/或SCA聚合物结合物与一或多种能为疾病或病症提供加强、协同或辅助治疗或诊断活性的其它治疗制剂共配制和/或共给药。
抗-hTNF-αSCA和/或SCA聚合物结合物的给药
例如，本发明的抗-hTNF-αSCA和/或SCA聚合物结合物可以与一或多种与其它靶(例如，与其它细胞因子或细胞表面分子结合)结合的其它抗体或SCA，一或多种细胞因子、可溶的hTNF-α受体(参见，例如公开号为WO94/06476的PCT申请)，和/或一或多种抑制hTNF-α产生或活性的化学制剂(诸如在公开号为WO93119751的PCT申请中公开的环己烷亚基-衍生物)共配制和/或共给药。此外，本发明的一或多种SCA和/或SCA聚合物结合物可与二或更多种前述的治疗制剂组合使用。这种组合治疗可以方便地使用低剂量的单独给药治疗制剂。适于抗-TNF-αSCA和优选共给药制剂的适应症
简单举例来说，在此引用作为参考的编号为6,258,562和6,090,382的美国专利提供了TNFα作为主要或其他种类疾病过程的介导物或共介导物的疾病或病症的详细例子。可以预期治疗或减轻这些疾病或病症的公知制剂会与本发明SCA和/或聚合物结合的SCA的抗TNFα实施方案进行共配制或共给药。简而言之，通过或由TNFα活性介导或与其相关，以及任选与其它公知的制剂组合，通过TNFα粘合剂进行合理治疗的疾病和病症的例子，都在编号为6,258,562的美国专利中进行了记载，包括，例如，败血病，自身免疫疾病，传染性疾病，移植/排斥，恶性肿瘤，肺和肠的病症。
这些适应症，以及当适用时，可任选与抗-TNF-αSCA共配制对这些适应症进行治疗的制剂如下。
败血病
与败血病相关的可治疗病症包括TNF-α介导的败血性休克综合症以及相关的低血压、心肌抑制、血管渗漏综合症、器官坏疽、刺激毒性二级介导物的释放刺激和凝血级联的活化、内毒素休克、格兰氏阴性败血病以及毒性休克综合症。
自身免疫疾病
与自身免疫疾病相关的可治疗病症包括，风湿性关节炎中的组织炎症和关节破坏、糖尿病中胰岛细胞的死亡和胰岛素耐性、多发性硬化中对少突细胞的细胞毒性以及炎性斑块的诱导。拟与本发明的抗-TNFα SCA和/或聚合物结合的SCA共配制或共给药的制剂包括，例如，糖皮质类固醇，非类固醇抗炎药(NSAIDs)；细胞因子抑制性抗炎药(CSAIDs)；CDP-57111BAY-10-3356(人源化抗-TNFα抗体；Celltech/Bayer)；cA2(嵌合抗-TNFα抗体；Centocor)；75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白；Immunex；参见，例如，Arthritis &Rheumatism(1994)Vol.37.S295；J.Invest Med.(1996)Vol.44 235A)；55kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffinann-LaRoche)；IDEC-CE9.I/SB 210396(非-耗尽性原始抗CD4 antibody；IDEC/SmithKline仅列举几个的治疗这种自身免疫性疾病的任意已知药剂。
传染性疾病
与传染性疾病相关的可治疗病症包括TNFα介导的脑炎，疟疾中的毛细血栓和梗死，脑膜炎中的静脉栓塞，次于感染，例如HIV病毒感染的恶病质，HIV感染中病毒增值的刺激和中枢神经系统损伤，由于诸如流感传染的发烧和肌肉疼痛。拟与本发明的抗-TNFα SCA和/或聚合物结合的SCA共配制或共给药的制剂包括任意公知的抗感染剂，例如，抗生素、抗菌药、抗病毒药等，以及非类固醇抗炎药(″NSAIDs″)和/或与传染介质和/或其毒素或关键成分结合的抗体或SCA。
移植
与移植药物，移植物排斥或所需免疫抑制副作用相关的可治疗病症包括TNF-α介导的同种移植排斥和移植物抗宿主病(GVHD)，仅列举几个移植相关效果。拟与本发明的抗-TNFα SCA和/或聚合物结合的SCA共配制或共给药的制剂包括，例如，为抑制OKT3-诱导反应的糖皮质类固醇，环孢菌素A，FK506和/或OKT3，以及与针对诸如结合于CD25(IL-2受体α)，CD11a(LFA-1)，CD54(ICAM-1)，CD4，CD45，CD28/CTLA4，CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)的抗体或SCA的免疫细胞受体的粘合剂组合进行。
恶性肿瘤
与恶性肿瘤相关的可治疗病症包括TNFα介导的恶病质、肿瘤生长、恶性肿瘤中的转移性潜力和细胞毒性。拟与本发明的抗-TNFα SCA和/或聚合物结合的SCA共配制或共给药的制剂包括任意公知的抗肿瘤和抗癌制剂。
肺部的病症
与肺部的病症相关的可治疗病症包括成人呼吸窘迫综合征、体克肺、慢性肺炎、肺结节病、肺纤维化和硅肺病。对肺部的病症而言，本发明的抗-TNFα SCA和/或聚合物结合的SCA可任选通过口服或鼻喷雾进行给药或配制成通过任意标准吸入系统给药的气雾剂。这样的制剂可以与其它适于治疗这些肺部疾病或病症的制剂，或协助所述SCA制剂进入支气管的制剂进行共给药或在不同的时间给药。
肠部的病症
与肠部的病症相关的可治疗病症包括肠炎综合症，例如，克罗恩病和/或溃疡性结肠炎。拟与本发明抗-TNFα SCA和/或聚合物结合的SCA共配制或共给药的制剂包括budenoside；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素；柳氮柳氮磺胺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；咪唑硫嘌呤；甲硝唑；脂肪氧化酶抑制剂；美沙拉嗪(mesalamine)；奥柳氮(Olsalazine)；巴柳氮；抗氧化剂；凝血噁烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β MAbs；抗-IL-6 MAbs；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；嘧啶-咪唑化合物；CDP-571/BAY-10-3356(人源化抗-TNFα抗体；Celltech/Bayer)；cA2(嵌合抗-TNFα抗体；Centocor)；75kdTNFR-IgG(75kD TNF受体IgG融合蛋白；Immunex；55 kdTNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)；白介素-10(SCH 52000；Schering Plough)；IL4；IL-10和/或IL4激动剂(例如，激动剂抗体)；白介素-11；葡萄糖苷酸或葡聚糖结合原药的氢化泼尼松，地塞米松或budesonide；ICAM-1反义硫代磷酸酯脱氧核苷酸(ISIS2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性的补体受体1(TP10；T CellSciences，Inc.)；缓释美沙拉嗪(mesalamine)；氨甲蝶呤；血小板活化因子(PAF)的拮抗剂；环丙沙星；和利多卡因。
诊断和分析方法：抗-TNFαSCA或SCA结合物
本发明的抗-TNFαSCA和/或SCA聚合物结合物可用来在诸如包括血清或血浆或其他临床标本的生物样品的感兴趣样品中，使用现有免疫分析对hTNFα进行测定。这些方法包括酶联免疫吸附剂分析(ELISA)，放射免疫分析(RIA)或组织免疫组织化学。
本发明提供了在生物样品中测定hTNFα的方法，包括将生物样品与本发明的抗体或抗体部分相接触，以及测定结合于hTNFα或未结合于SCA和/或SCA聚合物结合物的抗体(或抗体部分)，从而在所述生物样品中测定hTNFα。所述SCA用可检测性的物质直接或间接标记从而促进对结合或未结合抗体的检测。合适的可检测物质包括各种酶，辅基，荧光物质，发光物质和放射性物质。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的例子包括伞形酮，荧光素，荧光素异硫氰酸酯，若丹明，二氯三嗪胺荧光素，丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；以及合适的放射性材料例子包括125I，131I，35S或3H。
在任意实施方案中，本发明的SCA是没有标记的，但hTNFα是通过竞争性免疫分析在生物流体中进行分析的，其中rhTNFα标准是用可检测的物质以及未标记的抗-hTNFα SCA和/或SCA-聚合物结合物进行标记的。在这一分析中，所述生物样品，所述将标记的rhTNFα标准和抗-hTNFα SCA和/或SCA-聚合物结合物组合，并且对结合于未标记SCA和/或SCA-聚合物结合物的标记的rhTNFα标准的量进行测定。在所述生物样品中hTNFα的量与结合于所述抗-hTNFα SCA和/或SCA-聚合物结合物的标记的rhTNFα标准的量成反比。
编号为6,258,562和6,090,382的美国专利指出，D2E7 MAb可用于对人类以外的其他物种的TNF-α，尤其是来自于灵长类(例如，黑猩猩、狒狒、狨、猕猴和恒河猴)，猪和小鼠的TNF-α进行测定，可以预期本发明的抗TNFα SCA和/或SCA-聚合物结合物可以简便的用于这一目。
实施例
以下实施例为本发明提供了更深入的说明而并非意味着以任何方式对本发明的有效范围进行限制。
实施例1
含有至少一个自由巯基的SCA蛋白的设计
基于D2E7 MAb的可变区设计了九种SCA多肽。除非另有指明，术语“D2E7 SCA”在这是指如此述范例的用D2E7可变区所产生的任一SCA。每一种的构建如下所述。
如上所述，整个合成基因是通过使用长度范围从20-102碱基的14条的长重叠的合成寡核苷酸，进行聚合酶链反应(PCR)来构建的。进一步利用寡核苷酸指导的突变来构建原始序列的其它变异体。所表达的SCA蛋白包含通过肽连接物连接的D2E7 MAb的完整可变轻片段(VL)和可变重片段(VH)。使用了两种连接物。
连接物“218”是Filpula等人在1996年描述的(AntibodyEngineering：A Practical Approach，Oxford University Press，pp 253-268)具有十八个氨基酸残基的218-连接物。
″(GGGGS)3连接物″(SEQ ID NO：42)是Huston JS等人在1988年描述的15个氨基酸残基的连接物，Proc Natl Acad Sci(USA)85：5879-5883。如上表1中所提到的一些例子中，C-末端的6-组氨酸标签(his6)(SEQ ID NO：43)被包括在内以通过金属固定化的金属离子亲和色谱(“IMAC”)来简化纯化过程。
将完整的基因克隆到E.coli质粒上以在Applied Biosystems公司(Foster City，California)(之前由ABI/Perkin-Elmer生产)的ABI PRISM310 Genetic Analyzer上进行序列确认。在之前的表1中总结了在D2E7MAb上每一种SCA模式中自由半胱氨酸的结构域取向、连接物和排布(克隆序号从2-7-SC-1到9)。
表达克隆序号从2-7-SC-1到9中的每一种的核酸链是通过如下制备的。
D2E7 SCA的克隆和表达方法
使用六条重叠的寡核苷酸作为所述VL链的模板，和使用六条重叠的寡核苷酸作为VH链的模板，通过两轮PCR构建了D2E7 SCA基因的合成VL-VH版本。D2E7 SCA基因的VL链和VH链与218连接物相连。所述编码蛋白的C-末端后面接了为IMAC纯化目的的6个串联重复的组氨酸。
用于VL的从5’到3’末端的六条寡核苷酸设计如下：
VL1：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGAC(SEQ ID NO：19)
VL2：
GCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCAAGTCAGGGCATCAGAAATTACTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCT(SEQ ID NO：20)
VL3：
CCCTGATTGCAAAGTGGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTT CCCTGG(SEQ ID NO：45)
VL4：
TCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGAT CTGGGACAGATTTC(SEQ ID NO：21)
VL5：
TCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAGGTATAACCGTGCACCGTATACTTTTGGCCAG(SEQ ID NO：22)
VL6：
ACCACTCCCGGGTTTGCCGCTACCACTAGTAGAGCCTTTGATTTCC ACCTTGGTCCCCTGGCCAAAAGTATA(SEQ ID NO：23)。
在这之中，VL1、2、4和5是正向(有意)寡核苷酸，VL3和6是反向寡核苷酸。
用于VH的六条从5’到3’末端的寡核苷酸设计如下：
VH1：GGCAAACCCGGGAGTGGTGAAGGTAGCACTAAAGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA(SEQ ID NO：24)
VH2：
GTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCCGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGG(SEQ ID NO：25)
VH3：
CCAAGTGATAGCTGAGACCCATTCCAGGCCCTTCCCTGGAGCTTGCCGGACCCAGTGCAT(SEQ ID NO：26)
VH4：
TCAGCTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCCGATTC(SEQ ID NO：27)
VH5：
GTGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGATACGGCCGTATATTACTGTGCG(SEQ ID NO：28)
VH6：
AGACGAGACGGTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAATAGTCAAGGGAGGACGCGGTGCTAAGGTACGAGACTTTCGCACAGTAATATAC(SEQ ID NO：29)。
在这之中，VH1、2、4和5是正向寡核苷酸，VH3和6是反向寡核苷酸。所设计的全部用于D2E7SCA合成VL和VH的寡核苷酸都是由MWG Biotech，Inc公司合成的。
使用2mM Tris(pH8.4)、5mM KCl、7.5mM MgCl2、1.5mM dNTP、2单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)、寡核苷酸VL1、2、3、4、5和6(每种1pmol)作为模板、5′TGGCGAGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCT(SEQ ID NO：30)(50pmol)作为正向引物以及5′ACCACTCCCGGGTTTGCCGCTACCACTAGTAGA(SEQ ID NO：31)(50pmol)作为反向引物，在第一轮PCR中完成了对D2E7 SCA基因VL的组装。
PCR运行的条件为94℃、30秒，56℃、30秒以及72℃、60秒，30个循环；随后是72℃、10分钟。
使用2mM Tris(pH8.4)、5mM KCl、7.5mM MgCl2、1.5mM dNTP、2单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)、寡核苷酸VH1、2、3、4、5和6(每种1pmol)作为模板、5′GGCAAACCCGGGAGTGGTGA(SEQ IDNO：32)(50pmol)作为正向引物以及5′GCCACTCGAGCTATTAGTGATGGTGATGGTGGTGAGACGAGACGGTGACCAG(SEQ ID NO：33)(50pmol)作为反向引物，在第一轮PCR中完成了对D2E7 SCA基因VH的组装。PCR运行的条件为94℃、30秒，56℃、30秒以及72℃、60秒，30个循环；随后是72℃、10分钟。
编码如表1所示突变体SCA蛋白的不同D2E7SCA基因的遗传构建是通过定点突变完成的。例如，2-7-SC-5是D2E7SCA(2-7-SC-1)的一个突变体，在所述218连接物上残基109位上的氨基酸从丝氨酸变为半胱氨酸。该基因是采用2-7-SC-1 DNA作为模板和4条寡核苷酸作为引物通过两轮PCR完成的。
用于克隆2-7-SC-8构建体的引物设计如下：
正向引物1：CTCGAATTCACCATGAGATTTCCTTC(SEQ IDNO：37)，
正同引物2：
AAGGTGGAAATCAAAGGCTGTACTAGTGGTAGCGGCAAACCC(SEQ ID NO：38)
反向引物1：
GGGTTTGCCGCTACCACTAGTACAGCCTTTGATTTCCACCTT(SEQID NO：39)
反向引物2：CGAGAATTCTCATTAATTGCGCAGGTAGCC(SEQID NO：40)
使用2mM Tris(pH8.4)、5mM KCl、7.5mM MgCl2、1.5mM dNTP、2单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)、以2-7-SC-8 DNA(10ng)作为模板，使用两种引物组合(正向引物1和反向引物1，正向引物2和反向引物2，每种50pmol)在第一轮PCR中分别扩增得到了两个片段。使用正向引物1和反向引物2(每一种50pmol)、2mM Tris(pH8.4)、5mMKCl、7.5mM MgCl2、1.5mM dNTP、2单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)、以及来自第一轮PCR的两个片段(每种10ng)作为模板，在第二轮PCR中通过杂和延伸得到了2-7-SC-8的D2E7 SCA基因变异体。
如下所述，将所得的半胱氨酸在残基109上的2-7-SC-8 SCA基因的完整PCR产物克隆到pHilD2载体上，并用于转化Pichia GS115菌株。
表1中剩余的基因也是通过类似的定点突变步骤生成的。对于2-7-SC-2基因(SEQ ID NO：2)来说，PCR反向寡核苷酸引物在六个C-末端的组氨酸密码子之后编码半胱氨酸的密码子TGC。对于2-7-SC-3基因(SEQ ID NO：3)来说，PCR反向寡核苷酸引物在六个C-末端的组氨酸密码子之后编码半胱氨酸的密码子TGC。对于2-7-SC-4基因(SEQID NO：4)来说，PCR反向寡核苷酸引物在六个C-末端的VH丝氨酸密码子之后编码半胱氨酸的密码子TGC。对于2-7-SC-6基因(SEQ IDNO：6)来说，中心寡核苷酸引物在218连接物的第2位编码半胱氨酸的密码子TGC，并且C-末端反向引物在六个C-末端的丝氨酸密码子之后编码半胱氨酸的密码子TGC。对于2-7-SC-7基因(SEQ ID NO：7)来说，中心的寡核苷酸引物在376-378位核苷酸(图1G)编码半胱氨酸的密码子TGC，对应于(GGGGS)3连接物(SEQ ID NO：42)上的第5位残基。
对于2-7-SC-8基因(SEQ ID NO：8)来说，PCR正向寡核苷酸引物在N-末端VL氨基酸Asp之前编码半胱氨酸的密码子TGC，且所述PCR反向寡核苷酸引物在六个C-末端的组氨酸密码子之后编码半胱氨酸的密码子TGC。对于2-7-SC-9基因(SEQ ID NO：9)来说，编码GGGGS(SEQ ID NO：44)的5密码子连接物替换了218连接物的第18个密码子。
为了完整D2E7 SCA基因的组装和D2E7 SCA在Pichia中的表达，使用2mM Tris(pH8.4)、5mM KCl、7.5mM MgCl2、1.5mM dNTP、2单位Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)、以D2E7 SCA基因VL和VH的第一轮PCR产物(每种1ng)作为模板，以5′CCTCGGAATTCACCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTGACATCCAGATGACCCAG(SEQ ID NO：34)(50pmol)作为正向引物以及
5′CGCGGAATTCTATTAGTGATGGAGATGGAGGAGAGACGAGACGGTG ACCAG(SEQ ID NO：35)(50pmol)作为反向引物，在第二轮PCR中在D2E7SCA基因的5’末端加入一段信号序列。
PCR运行的条件为94℃、30秒，56℃、30秒以及72℃、60秒，30个循环；随后是72℃、10分钟。
用1％琼脂糖凝胶对具有5’末端信号序列的第二轮PCR-组装的D2E7SCA基因产物进行纯化，用EcoRI在37℃消化60分钟并使用T4DNA连接酶与pHilD2(Invitrogen)载体的EcoRI位点在12℃连接60分钟。通过连接产物转化100μl的DH5α感受态细胞(Invitrogen)、冰浴30分钟、42℃保持45秒，然后加入1ml S.O.C培养基并在37℃、250rpm培养50分钟。将0.1ml所述转化混合物涂布于LB氨苄青霉素(10mg/L)平板并于37℃培养16小时。
数个LB氨苄青霉素(10mg/L)平板上的pHilD2-D2E7SCA质粒转化的DH5α克隆在2ml LB培养基中37℃培养16小时。从每一克隆制备D2E7SCA质粒微量制剂。使用BigDye终止子循环DNA测序试剂盒(Applied Biosystem)、通过ABI Prism 310遗传分析仪对pHilD2-D2E7SCA质粒进行序列测定。
通过下述步骤生成的每一突变SCA克隆如表1所列示。对Pichia转化而言，pHilD2-D2E7SCA质粒在37℃用Sal1消化60分钟，在酚抽提和乙醇沉淀之后用10μl蒸馏水重悬。Pichia GS115细胞在50ml的YPD培养基中于30℃、250rpm振荡培养16小时(OD600＝1.2)，用冰浴冷的蒸馏水洗三次并用1M山梨醇洗一次，最后重悬于0.1ml的1M山梨醇中。
将所制备的Pichia GS115细胞与10μg pHilD2-D2E7SCA质粒在冰冷却的0.1cm电穿孔杯中混合并在800V、10μF和129条件下由电细胞操作器(BTX)进行脉冲。脉冲后，将1ml冰冷却的1M山梨醇加入到电穿孔杯中。
将全部物质转移至一15ml管中并在37℃培养1小时。将0.2ml所述转化混合物涂布于RDB培养基平板上并在30℃培养4天。
将数个来自于RDB平板的pHilD2-D2E7SCA质粒转化的Pichia克隆接种于500ml烧瓶中的25ml BMGY培养基中并在30℃、250rpm振荡培养2天。在室温、以3,000rpm离心收获所述细胞，重悬于50ml烧瓶中的5ml BMMY培养基中并在30℃再振荡培养2天。
将来自每种培养物的1ml样品转移至微型离心管中并在室温以14,000rpm离心2分钟。采用考马斯亮兰染色的SDS-PAGE以及WesternBlot对取自每种培养物上清液中的40μl样品进行分析。
实施例2
SCA蛋白的重组表达和纯化
如实施例1所述的SCA蛋白(克隆序号2-7-SC-1到9)全都是通过巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)表达和分泌生产的。对每种这些SCA蛋白来说，源于酵母α结合因子的分泌信号序列被直接插入在所述成熟编码序列的前面。
这一信号肽的氨基酸序列是Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr AlaVal Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala^Ala(SEQ ID NO：36)，其中^是指剪切位点。在我们的构建中，还包括了信号(^之后的丙氨酸)的第20个氨基酸。所以，每个成熟SCA蛋白的氨基末端含有这一丙氨酸，后面都连接有记录于表1A-1F中的完整氨基酸序列。N-末端蛋白质序列分析确认了这些正确加工的序列。这些突变的SCA基因在EcoRI位点被各自连接入Pichia转移质粒pHIL-D2(Invitrogen Corp.)并被转化入巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)宿主GS-115中。这一过程的详细流程来自于Invitrogen Corpration的Pichia表达试剂盒操作手册Cat.No.X1710-01(1994)，在此将其引用作为参考。表达的初始检测是通过考马斯亮兰对SDS-PAGE进行染色完成的。
D2E7 SCA克隆的Pichia发酵
所有抗-TNFα SCA D2E7的表达克隆，包括克隆2-7-SC-2、克隆2-7-SC-3、克隆2-7-SC-4、克隆2-7-SC-5和克隆2-7-SC-7都是在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、一种甲基营养(methylotrophic)酵母中产生的，且蛋白质都分泌到培养基中。D2E7 SCA变异体的高密度发酵是在添加有YNB和生物素(参见培养基组成)的基础培养基BMGY培养基中，使用自动给料控制发酵罐(Models：BioFlow 3000 andBioFlow IV；New Brunswick Scientific，Co，Edison，NJ，USA)，在BMGY中16-20小时，(c)在甘油(50％)的生长期中4小时，(d)用甲醇对D2E7变异体诱导45小时进行的。对每一种成份给料的优化都要考虑到设置为30％的溶氧水平。在运行过程中使用氢氧化铵和磷酸将生长温度设定在29℃并将pH值保持在6.0。在68小时的发酵阶段对不同的参数进行监控，其中所述生长培养物的OD600值在所述(b)期末端从0.5达到了125、在所述甘油给料期(c期)末端从125达到200了并且最终在诱导期(d期)末端从200达到了300。
平均而言，在所述发酵上清液中D2E7变异体的表达在50-100mg/L之间。在羧基末端具有一个自由半胱氨酸在其后有一个组氨酸尾巴的VL-VH变异体2-7-SC-2，被认为是在发酵中重复性极好，表现优良的活性最强的克隆。
供料的描述
BMGY(每升)
酵母提取物：
蛋白胨：
甘油：
磷酸缓冲液：
(1M，pH6.0)
YNB：
生物素：
FMT30(Breox)：
诱导物
甲醇
氧气
压缩氧气
实施例1中所述的SCA蛋白从巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)上清液通过两种或三个柱层析流程纯化到95％以上纯度的。
对来自克隆2-7-SC-2、2-7-SC-3、2-7-SC-5、2-7-SC-7的具有组氨酸标签的D2E7 SCA蛋白的纯化
D2E7变异体，2-7-SC-2、SCA2-7-SC-3、SCA2-7-SC-4、SCA2-7-SC-5和2-7-SC-7是采用离子交换和亲和柱层析的组合从发酵上清液中纯化得到的。当所述耗尽的培养基与含有20mM pH7.4的Tris和50mM NaCl的缓冲液C交换时，所述上清液被彻底地完全过滤以浓缩样品。所述缓冲交换后的样品随后被用于DEAE柱层析(Cat# 17-0709-01；Amersham BioSciences，Piscataway，NJ)。在所述特定条件下，D2E7SCA并不会与DEAE柱相结合。用含有50mM pH8.0的Tris和0.3MNaCl的缓冲液A对流过所述DEAE柱的液流进行透析，并应用于以相同缓冲液预先平衡的Ni-NTA树脂(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)。采用在缓冲液A中含有10％甘油的缓冲液B的严谨洗涤，然后用缓冲液A去除甘油来破坏非特异性结合。更低亲和性的互作是通过流过3倍柱体积的60-100mM咪唑(只有对2-7-SC-2用100mM)来洗掉的。最终采用3-5倍柱体积的250mM咪唑将所结合的SCA从所述Ni-NTA柱子上洗脱下来。对洗涤和洗脱而言，咪唑都是在缓冲液A中制备的。
将峰部分合并并用缓冲液C、所述的DEAE缓冲液进行彻底透析。所述透析的样品用高速离心进行澄清并通过作为纯化的最后步骤的DEAE柱子。随后，在储存于-20℃用于以后使用之前，通过UV280和BCA方法对所述纯化样品的蛋白浓度进行测定。
对不具有组氨酸标签的2-7-SC-4 D2E7 SCA蛋白的纯化
蛋白L与许多不同物种的VL结构域紧密结合。所述结合是极端物种特异性的，同样也是亚型特异性的。2-7-SC-4的VL结构域可被蛋白L所识别，利用这一互作特异性的优点，我们直接从所述完全过滤的样品中一步纯化了2-7-SC-4。来自于蛋白L柱(Cat# CLBL 201-5，CBD Technologies Ltd，Buffalo，NY)的2-7-SC-4低pH洗脱并不会影响所述SCA的结构或功能的完整性。简而言之，为了将所述样品上样至所述柱子上，将发酵上清液彻底过滤并用PBS交换。上样后，用大体积PBS将非特异性结合的蛋白洗掉。
用pH2.0的甘氨酸缓冲液(10mM)将所述SCA蛋白从所述柱子中洗脱出来并立即收集在3M的Tris中以中和所述溶液。将各个级分在SDS-PAGE上进行分析，将阳性部分合并并用PBS进行透析。透析后通过高速离心对所述SCA蛋白进行澄清，对蛋白浓度进行测定并保存在-20℃以为将来使用。
类似的较不优选的方法，例如HS(POROS 50 HS，code：1-3359-07；Applied BioSciences，Foster City，CA)也可在SCA的纯化中有效使用。
下表所示为通过不同柱子对2-7-SC-2 D2E7变异体的纯化、每步纯化后的产率百分数以及每种变异体的纯化质量。
表3
纯化
2-7-SC-2(VL-VH、218连接物、C-CYS、组氨酸标签)
  样品   SCA的浓度(mg/ml)   总SCA(mg)   产率(％)
  发酵上清液   0.07   250   100
  完全过滤的样品   0.38   230   92
  流过的DEAE-液流   0.13   210   84
  Ni-柱纯化的   5.0   200   80
  DEAE-纯化的   2.13   190   76
  缓冲液交换的   2.7   186   74
图2A和图2B所示为对来自2-7-SC-2 SCA蛋白每步纯化步骤样品的代表性SDS PAGE分析。采用考马斯亮兰对所述凝胶染色。由凝胶密度计量学扫描估计的最终所述样品的纯度约为95％。在染色的所述凝胶中，可见少量54kDa二硫键连接的二聚体。
实施例3
聚乙二醇的马来酰亚胺衍生物的稳定性和反应性
马来酰亚胺与氨基酸残基的反应性
对具有游离半胱氨酸，而不是赖氨酸或组氨酸的马来酰亚胺聚合物特异反应性的确认，是通过将这些化合物和这些分别的游离氨基酸进行反应来完成的。如图4A-4C所示，在所采用的标准反应条件下，半胱氨酸，而不是组氨酸或赖氨酸(未显示)与PEG-马来酰亚胺具有极高的反应性。
活性马来酰亚胺基团的分析以及稳定性
官能团分析是通过两步进行的，如下所述。
将MAL-PEG与半胱氨酸反应，并在反应后通过用5，5’-二硫-二(2-硝基安息香酸)(“DTNB”)滴定对残留未反应的半胱氨酸进行测定。对活性MAL-PEG的测定是以1∶3的摩尔反应比(MAL-PEG：半胱氨酸)在50mM磷酸钠，pH6以及1mM EDTA中进行的。
所述反应是如下进行的。
向1mM的PEG溶液中加入1/40体积溶于H2O的半胱氨酸直至终浓度为3mM。将所述混合物在25℃黑暗中孵育10分钟，然后进行DTNB滴定。在DTNB滴定过程中，向100mM磷酸钠、pH7.3和1mMEDTA的0.2-0.3mM DTNB中加入1/50体积含有半胱氨酸以及Cys-MAL-PEG混合物的反应混合物。
残留半胱氨酸的终浓度在0.04-0.06mM之间。使用13,300M-1.cm- 1作为DTNB的消光系数，在平衡5分钟后纪录412nm的吸光度。还对MAL-PEG和β-巯基乙胺的反应进行了研究。这一反应并不是定量的，因为β-巯基乙胺是空气敏感和吸湿的。通过在240-400nm之间的UV扫描对MAL-PEG的稳定性进行监测。MAL-PEG在300nm有最大吸光值。在与半胱氨酸反应或在具有0.1N NaOH、37℃水解2小时后，所述峰会消失。
MAL-PEG的稳定性
MAL-PEG的稳定性依赖于pH、温度以及孵育时间。如果在300nm的吸光度下降小于10％则认为其是稳定的。
1mM MAL-PEG在所有被测缓冲液中(pH5，pH6，pH7磷酸缓冲液)4℃保持至少24小时的条件下是稳定的。在25℃，pH5条件下，MAL-PEG在33小时内保持稳定。所以，所述优选的PEG化条件是pH5或pH6，25℃，2小时；或4℃，24小时；或pH5，25℃，24小时。
MAL-PEG与半胱氨酸反应的特异性
不管反应的pH(5，6或7)和温度(4℃或25℃)如何，与半胱氨酸的反应都是在2分钟之内完成的。
在4℃或25℃孵育24小时的过程中，并未在pH5和pH6的缓冲液中观察到与赖氨酸(Lys∶MAL-PEG＝15∶1)的反应。然而，在pH7，25℃时，有超过10％的MAL-PEG与赖氨酸在24小时的孵育过程反应。以15∶1的摩尔比(组氨酸∶MAL-PEG)，pH5，6和7，在4℃或25℃孵育24小时的过程中，与组氨酸不会发生反应。
实施例4
SCA蛋白的PEG化
4A.材料与方法
采用HiPrep26/10和G-25 PD-10脱盐柱(Pharmacia Biotech，17-1408-01，New Jersey)以及Poros 50 Micro HS(Applied Biosystems)培养基。mPEG-马来酰亚胺化合物购自Nektar Therapeutics(San Carlos，California；原先的Shearwater Corp.)或在Enzon Pharmaceuticals，Inc.合成。
应用于本研究的PEG-MAL包括40kDa的支链PEG2，20kDa的直链PEG，5kDa的直链PEG，20kDa的二-MAL-双功能PEG以及40kDa的支链U-PEG。N-乙基马来酰亚胺和6-(Biotinamidocaproylamido)己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯购自Sigma。rProtein A Sepharose Fast Flow获自Amersham Biosciences Corp.(Piscataway，New Jersey)。UltralinkIodoacetyl获自Pierce Biotechnology，Inc(Rockford，Illinois)。DMSO获自(Minneapolis，Minnissota)。链霉亲和素-藻红蛋白获自BDSciences(San Jose，California)。96孔板购自Midwest Scientific(St.Louis，Missouri)。
链霉亲和素-过氧化物酶获自Sigma，TMB过氧化物酶底物来自Moss，Inc.(Pasadena，Maryland)。TNFα购自Chemicon(Temecula，California)。Titrisol碘溶液获自EM Science(Gibbstown，New Jersey)。
4B.D2E7 SCAs的还原
在实施例3种分离到连接物或SCAs C-末端的自由半胱氨酸残基在与MAL-PEG反应之前被还原。还原溶液中包括3mg/ml D2E7 SCA，2mM二硫苏糖醇(DTT)，2mM EDTA以及100mM磷酸钠，pH 7.8。还原在37℃进行2小时。游离的DTT在HiPrep脱盐柱上被去除得到15ml的样品，或者在PD-10上被去除得到4ml的样品。所述柱子用100mM磷酸钠、pH 6.0和2mM EDTA进行平衡。还原和脱盐后D2E7SCA的产率为85％。包括β-巯基乙胺和β-巯基乙醇的其他还原剂也可以成功的应用于修饰过程中。巯基基团的定量是如Grassetti DR等人，1967，Archives Biochem Biophys 119：41-49，以及Riddles PW等人，1979，Anal Biochem 94：75-81所述进行的，在此引用作为参考。实现了几乎每个SCA一个巯基的定量还原。
4C.SCA的PEG化和纯化方法
从实施例3种分离的SCA蛋白的PEG化是通过半胱氨酸与PEG马来酰亚胺化合物的特异性反应进行的。2-7-SC-2和2-7-SC-5被选中以进行PEG-SCA表征的深入研究。对这些SCA蛋白而言，对具有5kDa、20kDa、40kDa(支链的)以及二马来酰亚胺化合物的马来酰亚胺-PEG结合物进行了研究。SCA蛋白与N-以及马来酰亚胺的反应提供了封闭游离巯基但加成小分子物质的对照结合反应。其他D2E7 SCA蛋白由列于BIAcore分析部分选中的PEG马来酰亚胺聚合物修饰。
反应缓冲液含有1mg/ml还原的SCA，100mM磷酸钠、pH 6.0，2mM EDTA以及反应摩尔比为10∶1(PEG∶D2E7)的PEG马来酰亚胺化合物。所述反应在25℃氮气条件下进行2小时。
在SDS-PAGE上分析的结合的典型产率为80％。HS柱子被用来从天然SCA、高分子两杂质、游离PEG、副反应产物和内毒素中对PEG-SCA进行纯化。在较不优选的方法中，S和SP柱子也被成功应用。所述柱子平衡缓冲液包括10mM磷酸钠、pH 5.0，洗脱缓冲液为在10mM磷酸钠、pH 5.0中的1M NaCl组成。游离PEG存在于所述流动中。对PEG-D2E7 SCA结合物进行洗脱的顺序是，首先用较多数附着PEG的结合物进行洗脱，然后用具有附着单聚合物的结合物，最后用天然的D2E7 SCA。不同大小的D2E7 SCA结合物可用不同浓度的NaCl洗脱下来。
4D.D2E7 SCA的还原-结果概述
在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中生成和如所述进行纯化的D2E7 SCA必须要在与MAL-PEG反应之前进行还原。
以0.5mM到50mM的浓度对DTT进行检测，说明0.5mM足以将单体还原成二聚体。浓度高于10mM的DTT会产生沉淀。所用DTT的浓度越高，沉淀的D2E7 SCA的数量越大。所述沉淀可能是变性的D2E7 SCA。选择2mM DTT用于标准PEG化方法。
对2mM到10mM的β-巯基乙胺、谷胱甘肽以及半胱氨酸也进行了研究，说明高于10mM的浓度是将所述二聚体还原成单体必需的。
0.5mM的DTT，和其他10mM的还原试剂一样，足以将2-7-SC-2二聚体还原成单体。
还原后结合物的产率约为开始还原的SCA蛋白的80％。
4E.PEG化-结果概述
在pH 6.0时，对从1∶1到10∶1(MAL-PEG∶D2E7 SCA)的反应比进行了研究以获得PEG化产率。1∶4的比率是给出所述结合物高产率的最低所需条件。
还对25℃时从10分钟到24小时、4℃时18小时的反应时间进行了研究，显示反应在25℃时在10分钟内就完成了(检测到的最短时间)。
因为产率降低，所以高浓度的蛋白(例如＞1mg/ml)并不合适D2E7SCA的游离半胱氨酸残基和MAL-PEG反应。这与非特异性多PEG化的最佳方法形成对比。对0.5、1.5、2.0、2.5和3mg/ml的蛋白浓度进行了检测。0.2-1mg/ml的D2E7 SCA蛋白被作为构建所述结合物的优选浓度。
对5-8的反应pH之进行了研究。对PEG化而言，采用pH 6.0。
非结合的D2E7 SCA可被再循环用于再结合。所述二次结合反应的产率与对最初的D2E7 SCA PEG化产率相类似。
最好的结合物产率为85％。总的来说，结果说明了单PEG化的SCA蛋白可以通过使用所述指定的单游离巯基变异体SCA蛋白以强烈的结合方法得以高产率的产生。
4F.纯化-结果概述
采用聚环氧烷砜膜的超滤不能用于2-7-SC-2 SCA蛋白及其结合物的浓缩以及改变缓冲液，因为大多数所述蛋白都损失在膜上。
在诸如Centriplus、Centricon和Amicon的Millipore再生纤维素膜上，蛋白的产率为100％。
在0.2μm低蛋白结合无菌滤器上，蛋白的损失为10％。在两步纯化、两步浓缩和一步超滤之后的总产率为30-40％。
将纯化后的PEG-SCA蛋白用于SDS-PAGE分析并以考马斯亮兰染色得以显现(数据为现实)。所述分析说明在纯化的40kDa MAL-PEG和20kDa MAL-PEG反应中有痕量(～1％)未反应的SCA蛋白的残留。显示包含聚乙二醇化合物的SDS-PAGE凝胶的碘染色也说明在纯化的40kDa MAL-PEG和20kDa MAL-PEG反应中存在可检测到的痕量(＜1％)游离PEG。
40kDa MAL-PEG反应有时也表现出痕量(～1％)极高分子量的PEG杂质。在所述起始未反应的40kDa MAL-PEG聚合物中也可在极高分子量范围内检测到聚合物的存在。N-乙基马来酰亚胺还原彻底封闭了在具有单个游离半胱氨酸的SCA蛋白中二聚体的形成。
4G.通过离子交换层析去除内毒素
存在于蛋白样品中的内毒素是通过DEAE或HS柱子去除的。在pH 7-8时，内毒素结合于DEAE柱子而D2E7 SCA存在于所述流动级分中，当pH 5.0时，内毒素存在于所述流动级分中而D2E7 SCA结合于HS柱子。HS柱子用来从D2E7 SCA蛋白中去除内毒素。柱平衡缓冲也包含10mM磷酸钠、pH5.0，洗脱缓冲液包括1M NaCl以及10mM磷酸钠、pH5.0。纯化后样品中的内毒素量通常小于1EU/ml。
实施例5
SCA和PEG-SCA的分析特征
5A.蛋白浓度的测定
蛋白浓度是通过280nm的UV进行测定的。在实施例3中所得SCAs的消光系数为1.24ml/mg.cm。所述浓度还可以通过bicinchoninic酸分析(″BCA″)进行确认，这是使用以溶菌酶或Fab作为标准、从来自于Pierce Biotechnology，Inc(Rockford，Illinois)的Micro BCA ProteinAssay Reagent试剂盒获得的。BCA分析是根据制造商所推荐的主要基于Smith P.K.，et al.1985，Anal.Biochem.150，76-85的方法进行的，在此将其引用作为参考。
蛋白浓度测定结果
如上所讨论的，在UV 280nm(数据未显示)和BCA，使用溶菌酶和人Fab作为标准，在蛋白浓度测定中给出了相似的结果。
对于BCA分析，EDTA应该与DTT一起在还原后去除，因为这些试剂会影响所述分析。
所有用于动物研究的样品都通过UV对蛋白质进行了分析，并使用溶菌酶作为标准用BCA进行了确认。
5B.抗-D2E7 SCA多克隆抗体以及生物素酰化的-D2E7 SCA抗体
抗-D2E7 SCA抗体的纯化
抗-2-7-SC-1 SCA抗体是在兔子中产生，并通过蛋白A层析和D2E7 SCA结合的亲和柱层析进行纯化的。对于蛋白A纯化而言，所述抗体是用二倍体积Tris缓冲液稀释的，使得终浓度为0.1MTris-HCl、pH 8.0，0.02％ NaN3。将所稀释样品上样到2-ml蛋白A琼脂糖Sepharose柱子上，所述柱子用与针对蛋白A树脂的抗血清等体积的0.1M Tris-HCI、pH 8.0，0.02％ NaN3进行平衡。
用50mM甘氨酸，pH 3.0将抗-2-7-SC-2SCA洗脱到1/10体积的1M Tris-HCl，pH 8.0中。所述抗体浓度在280nm以消光系数0.8ml/mg.cm进行测定。D2E7 SCA结合的亲和柱是通过UltralinkIodoacetyl与2-7-SC-2 SCA蛋白的游离半胱氨酸残基偶联反应制备的。具体地，约7ml用2倍体积50mM磷酸盐，5mM EDTA，pH 7.8润洗的Ultralink Iodoacetyl树脂与约6.5ml的1.45mg/ml的2-7-SC-2SCA在25℃混合15分钟。通过在280nm对所述上清液吸光度的测量来对所述偶联反应进行监控。上清液中的蛋白浓度降低了80％。树脂用3倍体积的50mM磷酸盐，pH 7.8，5mM EDTA洗涤，然后用50mM半胱氨酸处理40分钟。将所述样品转移到所述柱子中，先用1M NaCl，50mM甘氨酸，pH 3.0然后用PBS进行洗涤。将经过蛋白A柱子纯化过的抗-2-7-SC-2 SCA抗体流过用标准PBS平衡的D2E7 SCA-偶联柱。将所述柱子用PBS洗脱至基线，并用50mM甘氨酸，pH 3.0将所述抗体洗脱至1/10体积的1M Tris-HCl，pH 8.0中。
生物素酰化的抗-D2E7 SCA抗体
样品中的甘氨酸和Tris成分是通过用50mM磷酸盐，pH 7.6，100mM NaCl平衡的PD-10脱盐住去除的。以40∶1(生物素∶抗体)的反应摩尔比向抗体溶液中加入1/10体积溶于DMSO中的活化生物素。25℃ 1小时后，用PBS(10mM磷酸钠，138mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的PD-10脱盐柱对所述生物素酰化的抗体进行纯化。
5C.Western印迹
抗D2E7SCA兔抗血清用作第一抗体，山羊抗兔HRP用作第二抗体。通过TMBM过氧化物酶底物对所述结合进行检测。兔抗血清是之前从所述合成的18残基218-连接物多肽制备的。同时还确定了与含有这种连接物的SCA蛋白的反应性。
Western印迹结果
所有来自纯化制备物在凝胶上显示出来的条带都是Western杂交阳性的。图7所示为由抗2-7-SC-1抗血清检测的D2E7 SCA和PEG-SCA化合物的Western分析的示例。第一检测抗体是用纯化的重组SCA蛋白免疫兔子制备的抗-2-7-SC-1 SCA兔抗血清。泳道1和7为分子量标记(250，148，98，64，50，36，22，16，6和4kDa)，泳道2为2-7-SC-2 SCA蛋白；泳道3为乙基-2-7-SC-2；泳道4为PEG(5kDa)-2-7-SC-2；泳道5为PEG(20kDa)-2-7-SC-2；泳道6为PEG(40kDa)-2-7-SC-2。
因为血浆中的低浓度，在动物研究中并未确定多少比例的2-7-SC-2 SCA蛋白以单体或二聚体存在。然而，由N-乙基马来酰亚胺修饰的2-7-SC-2蛋白的稍快的清除说明一些起始SCA蛋白是二聚体，并表现出由于更大质量或亲和力的更慢的消除。
5D.纯度分析
二聚体形式是通过与游离半胱氨酸残基交联产生的，因为由N-乙基马来酰亚胺修饰的2-7-SC-2 SCA蛋白在非还原SDS-PAGE上并未现示出任何的二聚体。
如碘液染色所测，纯化的PEG-SCA结合物通常基本不含游离PEG，且如SDS-PAGE所测，含有低于1％的未修饰SCA以及低于1％的高分子量分子。
5E.碘染色
将SDS-PAGE凝胶用dH2O润洗，并置于5％氯化钡溶液中。轻柔混合10分钟后，将所述凝胶用H2O润洗，并置于0.1M Titrisol碘溶液中显色。
5F.质量测定
通过基质辅助的激光解吸离子化质谱(″MALDI-TOF″；BrukerDaltronics OmniFlex NT)，使用具有类似分子量的内标在α-氰基-4-羟基cinamic acid(CHCA)基质上对SCA和PEG-SCA结合物的确切质量进行了测定。使用在50mM磷酸钠，pH 6.5和150mM NaCl中平衡的Superdex 200HR 10/30凝胶过滤柱层析[Amersham Biosciences，用制造商提供的方法]对所述SCA蛋白的表观分子量(Stoke radius)进行了估计。
此外，使用合适的蛋白和PEG-蛋白标准在4-20％的SDS-PAGE凝胶上对分子量进行了分析。通过大小排阻层析测定的所述PEG-40k-SCA的表观分子量是670kDa，或约其分子量的10倍。
2-7-SC-2的分子量测定结果：
分子量的测定结果如表4所示。
                              表4
  化合物   MALDI-TOF   SEC×103   SDS-PAGE×103
  D2E7 SCA   27,394±295   20   30
  乙基-D2E7 SCA   27,858   20   30
  PEG-5k-D2E7 SCA   33,715   36
  PEG-20k-D2E7 SCA   49,874   340   56
  PEG-40k-D2E7 SCA   73,123   670   170
PEG大小与在4-20％ SDS凝胶上蛋白大小的关系是Y＝0.00156X。
其他D2E7 SCA变异体以及PEG-SCA化合物也表现出与其分子量和聚合物大小一致可比的质量。
5G.N-末端测序和多肽作图
对2-7-SC-2和2-7-SC-5的N-末端测序确认了对信号序列的预期加工，所以所述分泌SCA蛋白的N-末端氨基酸是丙氨酸，后面是VL的第一个残基。
2-7-SC-5-40kDa PEG的多肽作图
将所述蛋白(共0.2mg)在含有1mM EDTA和5mM DTT的6M胍HCl中变性和还原。将所述溶液在37℃孵育1小时。加入烷基化试剂、碘乙酰胺至终浓度为15mM并在室温反应1小时。烷基化之后，加入β-巯基乙醇至45mM(终浓度)使过量的碘乙酰胺失活，并将所述溶液用于PD-10脱盐柱。用Centricom 10对所述烷基化的PEG-2-7-SC-5进行浓缩，然后以1∶20(w/w)的蛋白和酶的比例用TPCK-处理的胰蛋白酶水解。所述水解在37℃进行6-8小时，然后加入等量新鲜的胰蛋白酶过夜反应。所述水解蛋白溶液用Speedvac进行干燥，然后用HPLC-级的水再生。
用HPLC-级的水通过HPLC大小排阻层析(Superdex75)对所得多肽混合物进行分馏。将所述馏分手工收集并用碘液(20mM溶于5％BaCl)染色的两性离子缓冲剂SDS-PAGE进行分析。采用梯度从5-70％的乙腈(含有0.05％ TFA)的反相HPLC(Jupiter C18，2×250mm)在60分钟内对所述阳性染色组分进行进一步解析。将所述峰手工收集并用Speedvac进行干燥。将所述峰用10μl水还原，取5μl进行两性离子缓冲剂SDS-PAGE进行分析。将所述碘液染色阳性组分(仅有1种，滞留时间为40分钟)用于氨基酸测序分析(Applied Biosystems)。分析所得的序列为GTSGSGKPG(SEQ ID NO：41)，其中所述空白序列代表修饰的氨基酸，说明马来酰亚胺-PEG 40K正确地连接于半胱氨酸(从N-末端Ala 1起的第110位置)。
5H.D2E7和PEG-D2E7的稳定性-结果
D2E7 SCA和PEG-D2E7 SCA的结合物在反复冻融10次后依然表现稳定。将天然2-7-SC-2 SCA(浓度1.1mg/ml的50mM Tris/甘氨酸缓冲液，pH 7.0)的等分部分在-80℃冷冻15分钟然后在37℃溶解10分钟。将所述冻融过程进行3、5和10个循环，通过已建立的TNF-敏感的细胞拯救分析利用SDS-PAGE对所述天然SCA的稳定性进行分析。分析说明所述SCA非常稳定，并在物理性质上可以经受至少10个冻融循环而不表现出通过考马斯亮兰染色的聚丙烯酰胺凝胶测定到的任何降解(数据未显示)。5次冻融之后，2-7-SC-2(IC50：224.6nM)的生物学活性没有任何改变。
在本研究中，所有D2E7 PEG-SCA蛋白在4℃的20mM磷酸钠，pH 6.5，150mM NaCl的溶液中可以稳定保持30天。2-7-SC-2 SCA蛋白在pH 3-10，25℃条件下孵育18小时保持稳定。在25℃，20mM磷酸钠，pH7.4的条件下，NaCl的浓度直到1.2M也不会对2-7-SC-2的活性或溶解性产生任何影响。
5I.抗原性
PEG化的D2E7 SCA蛋白在与抗-D2E7 SCA多克隆抗体的结合效率方面表现出显著的下降。在用抗-218抗血清进行Western印迹分析时，PEG-SCA 2-7-SC-5与抗-218肽兔血清表现出边际反应性。
实施例6
SCA和PEG-SCA蛋白的流式细胞计数分析
2-7-SC-2、2-7-SC-3、2-7-SC-4、2-7-SC-5的细胞表面受体结合分析
将WEHI-13VAR用来进行对D2E7 SCA或PEG-D2E7 SCA存在时对TNF-α与所述细胞受体的结合分析。将所述生物素TNF-α(0.04μg)与D2E7 SCA或PEG-D2E7 SCA(1-4μg)在50μl FACS缓冲液(1％ FBS以及0.05％ NaN3的PBS)中25℃保持30分钟，然后在4℃振荡15分钟。
与此同时，将所述对照，例如生物素酰化的大豆胰蛋白酶抑制剂(0.05μg)、多克隆山羊IgG抗-人TNF-α抗体(20μg)以及CC49 SCA(4μg)也在50μl FACS缓冲液中与生物素-TNF-α(0.04μg)进行预孵育。使用冰预冷的20mM溶于PBS的EDTA在37℃处理2-3分钟将WEHI-13VAR细胞从烧瓶上脱离下来。用RPMI1640培养基将所述细胞重悬浮并以2000rpm离心5分钟沉淀。将所述细胞用培养基冲洗一次、用FACS洗涤缓冲液洗两次并用血球计数器进行计数。
以2×106细胞/ml的终浓度将所述细胞悬浮于FACS缓冲液中。所有用于细胞的amber eppendorf管都用FACS缓冲液在4℃封闭至少1小时。为了研究放线菌素D和Fc封闭试剂(BD Biosciences)对TNF-α与细胞受体结合的效果，将所述细胞(105)与0.05μg放线菌素D/1×106细胞或1μg Fc封闭试剂/1×106细胞在50μl FACS缓冲液中4℃预孵育15-30分钟。向50μl TNF-α和PEG-D2E7 SCA的混合物中加入50μl 1×105的WEHI-13VAR细胞。在黑暗中4℃孵育60分钟后，将所述细胞离心沉淀并重悬于80μl冷的FACS缓冲液。加入10μl链霉亲和素-藻红蛋白。将所述混合物在黑暗中4℃孵育30分钟。将所述细胞用1ml冷的FACS缓冲液洗两次并重悬于0.3mlFACS洗涤缓冲液以进行分析。
流式细胞计数分析
当作为阴性对照时，生物素酰化的大豆胰蛋白酶抑制物、多克隆山羊抗-人干扰素-αIgG以及CC49 SCA(Enzon)都不具有结合性。所述细胞与Fc封闭试剂(BD Biosciences)和放线菌素D的预孵育对TNF-α的结合没有影响。当摩尔比高于16∶1(D2E7 SCA∶TNF-α)时，PEG-D2E72-7-SC-2 SCA结合物(乙基-，5k，20k或40k PEG)完全消除了TNF-α对所述细胞的结合。
与相同的D2E7 SCA对TNF-α的比例，天然D2E7 SCA也降低了TNF-α对所述细胞的结合，但不是全部。所以，在这一分析中，所述D2E7的PEG-SCA形式比天然SCA蛋白更具有活性。
图6A、6B和6C所示为在在防止生物素标记的TNF-α与其在WEHI-13VAR细胞上的受体结合能力的流式细胞计数分析中，2-7-SC-2SCA和PEG-SCA化合物的代表性数据。这些数据说明，在基于细胞的系统中，所述抗-TNF-αPEG-SCA化合物对该细胞因子与其受体结合的封闭中具有极高的活性。
在2-7-SC-2或PEG-2-7-SC-2存在时TNF-α与细胞受体结合的流式细胞计数分析。1、无荧光标记的细胞数量；2、与生物素TNF-α-结合以及与链霉亲和素-藻红蛋白结合后的细胞数量；3、2-7-SC-2(图6A)、PEG(20k)-2-7-SC-2(图6B)以及PEG(40k)-2-7-SC-2(图6C)对TNF-α结合细胞受体的影响。2-7-SC-2或PEG-2-7-SC-2与TNF-α的摩尔比为16∶1。向低荧光强度的迁移说明TNF-α与所述细胞结合的降低。
实施例7
BIACORE分析
重组hTNF-α与D2E7 SCA和PEG-SCA相互作用的动力学分析
使用BiaCore X仪器(BiaCore，Inc.；Piscataway，New Jersey)通过表面等离子体激光共振技术(SPR)对TNF-α与D2E7 SCA变异体及其PEG化形式之间的相互作用进行分析。通过pH 5.0的10μg/ml溶液(醋酸盐缓冲液，BiaCore，Catt# BR-1003-51)将纯度＞97％的重组人TNF-α(Pierce；Rockford，IL)固定化于CM5芯片(BiaCore，Cat# BR-1000-14)上。用pH 4.5的乙酸缓冲液(BiaCore，Cat# BR-1003-50)将所述固定化表面洗涤三次，并用于6次对500nM天然SCA的配基稳定性分析。
将D2E7 SCA和作为还原缓冲液pH 4.5的乙酸盐作为被分析物。在所述稳定TNF-α结合的表面，对不同浓度的SCAs或PEG-SCAs进行了结合(3分钟)与解离(2分钟或5分钟)的检测，并采用BiaEvaluation软件(3.0版)对数据进行动力学参数(例如：kon，koff，KA，以及KD值)分析。在本操作过程中，采用HBS-N(BiaCore，Cat t# BR-1003-69)作为运行缓冲液。
固定化rhTNF-α与D2E7 SCA和PEG-SCA之间相互作用的动力学分析
方法
TNF-α
来源：Pierce，重组形式，cat# RTNFA50
MW：17.4kD，157aa
纯度：＞97％
还原：在蒸馏水”DW”中达到100μg/ml浓度。在所述制备过程中没有添加剂。
储存：保存于-70℃。
D2E7SCA：Clone 2-7-SC-2
Source：Enzon Pharmaceuticals，Inc.，重组形式，在Pichia中表达
MW：27kD，具有218个连接物
纯度：＞90％
还原：溶于10mM磷酸盐缓冲液，pH 7.0，以及150mM NaCl
储存：保存于4℃。
固定化：使用新的CM5芯片
TNF浓度：10μg/ml，直接从溶于pH 5.0的醋酸盐缓冲液的储存液中稀释
流速：5.0μl/分钟
通道：FC1-2，与NHS/EDC混合物以1∶1活化3.0分钟
通道：FC2，手工注射15μl TNF，10μg/ml
(为了达到较低的RUs则注射量较少)
通道：FC1-2，与pH 8.5的1M乙醇胺活化3分钟
通道：FC1-2，手工注射25μl BSA，1μg/ml在HBS-N缓冲液中
通道：FC1-2，以100μl/min的速度进行pH 4.5的10mM乙酸盐注射1分钟，以清洁所述喷射接口
最终RU值(反应单位)为199。
所述CM5芯片用HBSN缓冲液洗涤，并用500nM 2-7-SC-2至少检测6次稳定性。随后将所述CM5芯片用于动力学分析。
D2E7 2-7-SC-2的动力学分析
2-7-SC-2的浓度：在注射前立即稀释于HBS-N中
2.98μg/ml(1080nM)
1.49μg/ml(540nM)
0.745ug/ml(270nM)
0.3725μg/ml(135nM)
0.186μg/ml(67.5nM)
93ng/ml(33.75nM)
46.5ng/ml(16.875nM)
23.28ng/ml(8.4375nM)
0μg/ml(0nM)
流速：25μl/min(注意：30μl/min的流速与20和25μl/min所产生的结合类似)
结合时间：3分钟
解离时间：2分钟和5分钟
还原缓冲液：10mM乙酸盐，pH 4.5
还原以两步进行，以100μl/min用100μl/洗1分钟作为第一次洗涤，根据第一次洗涤后留在所述芯片上的RU，以100μl/min用40 80μl洗涤第二次。
数据分析
使用1∶1适于或不适于分子量转移限制的结合对所述生物分子结合反应的结合与解离动力学曲线进行分析。并没有获得任何包括质量转移参数的动力学限制显著的改进，说明在本实验中质量转移现象并不常见。
为了这一目的制备了2-7-SC-4和PEG-40k-2-7-SC-4。FACS的结果独立地说明，无论是否具有所述SCA组氨酸-标签部分，D2E7/PEG-D2E7 SCA与TNF-α之间的结合都没有区别。
Biacore和细胞拯救的实验结果也验证了所述组氨酸-标签部分并不负责所述抗原和SCA的结合事件。
通过在CM5芯片上固定化TNF-α以及允许不同浓度的天然和PEG化的2-7-SC-2流过所述结合配基对直接结合动力学进行了测定。下表5提供了不同形式的2-7-SC-2 SCAs的ka(kon)，kd(koff)，KA，以及KD值。
2-7-SC-2 SCA化合物的动力学参数
                           表5
  2-7-SC-2形式   ka(M-1s-1)   kd(s-1)   KA(M-1)   KD(M)
  2-7-SC-2天然的   3.28e5   3.92e-4   8.36e8   1.2e-9
  2-7-SC-2-NE-mal   1.47e5   7.87e-5   1.86e9   5.37e-10
  2-7-SC-2-5K-PEG   4.96e4   3.01e-4   1.65e8   6.06e-9
  2-7-SC-2-20K-PEG   1.6e3   4.18e-4   3.83e6   2.61e-7
  2-7-SC-2-40K-PEG   4.47e3   6.78e-4   6.59e6   1.52e-7
上表5验证了所述PEG化的SCA蛋白对其配基保持了较高的亲和性。然而，不同PEG-SCA指定的分子在on-rate在off-rate表现出了差异。特别的，当与所述母体SCA比较时，2-7-SC-2的40kDa-PEG形式显著的降低了on-rate，但却维持了off-rate。根据所述较大和挠性的PEG聚合物，反映出在所述BIACore芯片上人工结合环境中的空间位阻效应。相比而言，在本研究中其他地方描述的所述基于细胞的分析说明了对所述天然和40kDa PEG化SCA蛋白的相似结合活性。
PEG化导致on-rate和off-rate变化的特异趋势反映出根据所述结合蛋白聚合物的化合物特异性构象或排布。下述对其它PEG-SCA化合物的进一步研究也突出了这一可能性。2-7-SC-4-40kDa-PEG数据说明直接在C-末端替换的PEG聚合物相当程度地改善了off-rate。采用在本研究中公开的SCA半胱氨酸替换和PEG聚合物质量的规定参数，可以允许对任何个体PEG-SCA蛋白结合物的结合与活力性质进行优化。
2-7-SC-5和2-7-SC-7对rhTNF的结合动力学
通过在CM5芯片上固定化TNF-α以及允许不同浓度的天然和PEG化的2-7-SC-5和2-7-SC-7流过所述结合配基对直接结合动力学进行了测定。下表提供了不同形式2-7-SC-5和2-7-SC-7的ka，kd，KA，以及KD值。
表6
2-7-SC-5 SCA化合物的动力学参数
  2-7-SC-5形式   Ka(M-1s-1)   kd(s-1)   KA(M-1)   KD(M)
  2-7-SC-5天然的   1.73e5   3.92e-5   1.55e10   6.44e-11
  2-7-SC-5-40K-PEG   2.04e3   2.23e-6   9.18e8   1.09e-9
表7A
2-7-SC-7的动力学参数
  形式   Ka(M-1s-1)   kd(s-1)   KA(M-1)   KD(M)
  2-7-SC-7天然的   3.51e4   2.96e-6   1.19e10   8.43e-11
表7B
2-7-SC-7的动力学参数
  2-7-SC-5形式   ka(M-1s-1)   kd(s-1)   KA(M-1)   KD(M)
  2-7-SC-7-20K-PEG   4.37e4   2.89e-4   1.51e8   6.61e-9
通过在CM5芯片上固定化TNF-α以及允许不同浓度的天然和PEG化的2-7-SC-3/2-7-SC-7流过所述结合配基对直接结合动力学进行了测定。下表提供了不同形式2-7-SC-3和2-7-SC-7的ka，kd，KA，以及KD值。
表8A
2-7-SC-3 SCA以及结合物的动力学参数
  2-7-SC-3形式   ka(M-1s-1)   kd(s-1)   KA(M-1)   KD(M)
  2-7-SC-3天然的   4.64e4   4.16e-4   1.1e8   9.05e-9
  2-7-SC-3-20K-PEG   1.02e4   2.5e-4   4.07e7   2.45e-8
  2-7-SC-3-40K-PEG   4.14e3   4.04e-4   1.03e7   9.74e-8
表8B
2-7-SC-4 SCA以及结合物的动力学参数
  Kon(1/Ms)   Koff(1/s)   KA(1/M)   KD(M)
  2-7-SC-4天然的   2.72e5   4.95e-4   5.49e8   1.82e-9
  2-7-SC-4-40K-PEG   1.12e4   4.04e-6   2.78e9   3.6e-10
实施例8
对TNF-α细胞毒性中和的分析
对TNF-α细胞毒性中和基于细胞的分析是如下进行的。
在放线菌素D存在时，WEHI-13VAR细胞(来自于American TypeCulture collection，ATCC No.CRL-2148)对TNF-α更具有敏感性，并将其应用于本研究。
将WEHI-13VAR细胞以每孔10,000细胞的密度接种于96-孔板中，在5％CO2的湿润培养箱中37℃孵育过夜。以从10μg/ml到2.5ng/ml稀释于培养基中的系列稀释浓度范围的D2E7 SCA蛋白及其PEG化形式加入到培养有所述细胞的96-孔板中。
加入D2E7 SCA化合物之后，立即以1.0ng/ml的浓度向每一个小孔中加入rhTNF-α(Pierce)。允许所述细胞生长24小时，并根据制造商指导加入15μl MTT(Cat # G4000，Promega Corporation[Madison，Wisconsin])(3-(4，5，二甲基-噻唑-2-基)2，5-二苯基四唑溴)染色试剂对细胞活力进行测定。所述细胞拯救的分析是通过在TNF-α存在时将D2E7处理细胞与未处理细胞的的活力进行比较进行的。
对照小孔由未处理细胞和单独用TNF-α处理的细胞构成。对照小孔中的所述细胞表现出活力的完全丧失。所述试验小孔中存活细胞(或挽救细胞)的比例是通过对D2E7浓度的对数作图得到的，并对每一组数据都进行了IC50值的测定。每一个值都来自于一式三份试验的组。
D2E7 SCA蛋白对TNF-α致死性的细胞拯救
诸如在下文表9A、9B和9C中所列示的抗TNF-αSCA蛋白、保护细胞免受TNF-α副作用的能力，是通过采用TNF-α敏感细胞系，并将所述细胞与TNF-α、与或不与SCA蛋白2-7-SC-2相接触来确认的。结果与用实施例1中制备的其他SCA蛋白进行的其它检测相一致。
材料与方法
细胞系：WEHI-13VAR细胞；ATCC# CRL-2148，小鼠细胞系
扩增：具有2mM G-谷氨酰胺，1.5g/L碳酸氢钠，4.5g/L葡萄糖，10mM HEPES以及1.0mM丙酮酸钠和10％ FBS的RPMI 1640培养基。
冻存培养基：95％培养基以及5％DMSO。
分析方法
将WEHI-13VAR细胞用胰蛋白酶消化，并以每孔10,000细胞的密度接种于完全RPMI-1640培养基的96-孔板中中，并允许在5％CO2的湿润培养箱中37℃孵育12小时。
用PBS洗涤细胞并向每一个小孔中加入新鲜培养基。向包括下文表9A、9B和9C中所列示的小孔中加入不同的D2E7 SCA变异体及其PEG化形式。将SCAs顺序从10μg/ml稀释到2.5ng/ml(在完全RPMI-1640培养基中稀释)。所述对照小孔中不加入D2E7。
加入所述D2E7化合物之后，立即向每一个小孔中加入重组hTNF-α(以1.0ng/ml稀释于RPMI培养基中，而不是完全培养基)。所述未处理的对照小孔中不加入TNF-α。
细胞在5％CO2的湿润培养箱中37℃孵育24小时。
在所述孵育的末期，向每一个小孔中加入15μl MTT(Cat # G4000，Promega Corporation)染色试剂，并在向每一个小孔加入终止缓冲液之前，37℃孵育4小时。将每个小孔中的成分彻底混合，允许晶体在室温溶解过夜。
在96-孔板读数器中(Molecular Devices)在570nm和630nm对所述板进行读数，以吸收单位的差异(细胞活性的度量)对用于挽救所述细胞对于TNF-α细胞毒性的D2E7化合物的浓度进行作图。
使用log[D2E7]作为X-轴、挽救的％百分比作为Y-轴参数，对每一组活力图中50％细胞被挽救时的D2E7 SCA蛋白浓度进行测定。
Mal-PEG(20kDa)聚合物在25℃，50mM磷酸钠，pH 7.0，1mMEDTA中的稳定性是通过从220nm到400nm进行0,2 4,22以及33小时的UV扫描测定的。25℃，33小时后，加入3mM半胱氨酸，孵育5分钟后对所述混合物进行扫描。定量测定300nm处不同峰的时间依赖的转化。
注意：WEHI-13VAR细胞对TNF-α和淋巴毒素比对L929(ATCCCCL-1)更敏感。在缺乏放线菌素D的时候，这些细胞在30天之内丧失对TNF的敏感性。而且，放线菌素D的加入对D2E7化合物对细胞的拯救而言是决定性的。
对2-7-SC-2，2-7-SC-2-NE-马来酰亚胺，5K，20K，和40K PEG化的2-7-SC-2s将细胞从TNF-介导的杀伤中挽救的能力进行了分析。表9A提供了每种2-7-SC-2的IC50值(用1.0ng/ml TNF从杀伤中挽救50％WEHI-13VAR细胞)。
表9A：2-7-SC-2 SCA化合物的细胞拯救
  2-7-SC-2形式   IC50值
  2-7-SC-2天然的   3.05×10-9M
  2-7-SC-2-NE-马来酰亚胺   3.71×10-9M
  2-7-SC-2-5K-PEG   4.27×10-9M
  2-7-SC-2-20K-PEG   3.52×10-9M
  2-7-SC-2-40K-PEG   11.09×10-9M
表9B：2-7-SC-4 SCA化合物的细胞拯救
  2-7-SC-4形式   IC50值
  2-7-SC-4天然的   7.18×10-9M
  2-7-SC-4-40K-PEG   4.64×10-9M
表9B：2-7-SC-5 SCA化合物的细胞拯救
  2-7-SC-5形式   IC50值
  2-7-SC-5天然的   4.18×10-9M
  2-7-SC-5-40K-PEG   6.91×10-9M
这些数据确认了在这种基于细胞的分析中，所述D2E7 SCA的指定PEG化形式在与所述细胞因子TNF-α的结合以及中和中表现出了相似的生物活性。所述PEG-SCA化合物因此可以在这些细胞中有效地中和这种细胞因子并防止其与TNF-α受体在这些细胞上的结合。
实施例9
D2E7 SCA和PEG-SCAs的药物动力学
研究方案：ICR小鼠中SCA和PEG-SCA结合物的药物动力学
研究目的
本研究旨在ICR小鼠中检测SCA D2E7(2-7-SC-2和2-7-SC-5)以及包括PEG(5kd)，PEG(20kd)和PEG(43kd)结合物的PEG化形式的血浆药物动力学。
检测物品(给药前保存于-20℃)
D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)(100％活性w/w)
PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)(57.4％活性w/w)
PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)(38.6％活性w/w)
检测系统
物种：ICR(Sprague Dawley Harlan)小鼠
年龄：7-8周
性别：雌性
重量：起始重量范围：大约25g
动物管理
小鼠被以每笼5只饲养于University of Medicine and Dentistry ofNew Jersey(″UMDNJ″)动物园的饲养盒中。笼子的大小与国家研究委员会的″实验室动物资源研究所实验室动物照料和使用指导″一致。每周对废物进行至少两次清除。笼子用笼卡清楚地标明研究内容、检测物品、动物数量、性别以及剂量水平。在开始研究之前将动物进行一周适应。
食谱
所述小鼠可获得饮用水并无限制地用商业试验鼠料进行饲喂。
样品制备
用PBS将D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)稀释到0.556mg/mL D2E7
用PBS将PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)稀释到0.503mg/mL
D2E7等价物
用PBS将PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)稀释到0.541mg/mL
D2E7等价物
磷酸盐缓冲液；含140mM NaCl的10mM磷酸钠，pH 6.5
给药位置
以单剂量(第1天)i.v.通过尾静脉用D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)，PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)，以及PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)结合物进行给药。
实验设计
根据下表10的安排对54只小鼠进行分配、给药以及采血。
                                表10
  组   处理   N   剂量(mg/kg)   D2E7剂量*(mg/kg)   注射                                      采血时间(小时)   体积§(μl)
  1   20kd PEG-2-7-SC-5   3   7.0   4   iv   0.03   24   100/1000
  2   20kd PEG-2-7-SC-5   3   7.0   4   iv   0.25   48   100/1000
  3   20kd PEG-2-7-SC-5   3   7.0   4   iv   0.5   72   100/1000
  4   20kd PEG-2-7-SC-5   3   7.0   4   iv   1   96   100/1000
  5   20kd PEG-2-7-SC-5   3   7.0   4   iv   3   1000
  6   20kd PEG-2-7-SC-5   3   7.0   4   iv   6   1000
  7   2-7-SC-5   3   4.0   4   iv   0.03   24   100/1000
  8   2-7-SC-5   3   4.0   4   iv   0.25   48   100/1000
  9   2-7-SC-5   3   4.0   4   iv   0.5   72   100/1000
  10   2-7-SC-5   3   4.0   4   iv   1   96   100/1000
  11   2-7-SC-5   3   4.0   4   iv   3   1000
  12   2-7-SC-5   3   4.0   4   iv   6   1000
  7   43kd PEG-2-7-SC-5   3   10.4   4   iv   0.03   24   100/1000
  8   43kd PEG-2-7-SC-5   3   10.4   4   iv   0.25   48   100/1000
  9   43kd PEG-2-7-SC-5   3   10.4   4   iv   0.5   72   100/1000
  10   43kd PEG-2-7-SC-5   3   10.4   4   iv   1   96   100/1000
  11   43kd PEG-2-7-SC-5   3   10.4   4   iv   3   1000
  12   43kd PEG-2-7-SC-5   3   10.4   4   iv   6   1000
*D2E7等价物§重复采血约为1000μl
对2只未处理的小鼠进行采用心脏穿刺采血，放入含有EDTA的管中以收集未处理的对照血浆。
以每只200μl D2E7(2-7-SC-5)、每只180μl PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-5)和每只190μl PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-5)结合物对小鼠进行静脉注射。用0.09％的阿佛丁进行镇静之后，对小鼠进行通过后眼眶窦房结采血，放入含有EDTA的管中。在2、15、30分钟和1小时对小鼠采血100μl，在3、6、24、48、72和96小时对小鼠进行定期心脏穿刺采血约1000μl。在对血液进行离心后收集血浆并立即在干冰上冻存于-80℃。
将所述血浆样品溶解并通过ELISA测定D2E7化合物的浓度。使用WinNonlin软件对所述数据进行建模以测定D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)、PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)以及PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-2，2-7-SC-5)的药物动力学参数。
临床检测：所述小鼠在到达时进行目测。为了避免过多的操作，只有当有必要与目测一致时，才对临床异常的征兆进行详细地体检。在所述检测物质灌注之后，每天对所述小鼠目测一次以检测对所述处理的死亡率和反应征兆。纪录任何的死亡和临床征兆。如果情况需要时则进行更频繁的检测。
动物饲养规定：本研究是在符合现行动物福利指导下进行的(NIHPublication 86-23，1985)。
D2E7 SCA和PEG-D2E7 SCA结合物在小鼠中的药物动力学：D2E7 SCA和PEG-SCA的酶联免疫吸附剂分析(ELISA)
样品制备SCA检测的线性范围在0.2ng/ml和30ng/ml之间。使用ng/ml蛋白酶度以及在所述线性范围内的光读数进行分析。
在血浆中，标准SCA或PEG-SCA被稀释到进行血浆样品分析的相似稀释因数，或直接稀释于稀释缓冲液中(0.1％ BSA以及0.05％Tween-20的PBS溶液，pH 7.4)。为了简化这一程序，将所述标准稀释于稀释缓冲液中以进行血浆样品分析。i.v.或s.c.给药的剂量是4.5mg/kg。对0.03-3小时血浆样品的i.v.给药的稀释因数是500，对SCA的6-96小时样品是10，对0.03-24小时样品是500，对4-96小时的PEG-5k-SCA样品是10，对0.033-6小时样品是800，对24-96小时的PEG-20k-SCA样品是100，对所有的PEG-40k-SCA样品是800。对所有的SCA样品的s.c.给药血浆样品稀释因数是200，对所有PEG(20k)-SCA样品时300。
ELISA程序使用夹心ELISA对SCA和PEG-SCA结合物的血浆浓度进行测定。依照通过所述抗体检测的规定组合物对所述样品进行测定。所述捕获抗体是通过蛋白A和D2E7-偶联亲和柱纯化的多克隆抗D2E7抗体。为了与TNFα结合，将所述板用TNFα包被。第一抗体和第二抗体分别是生物素酰化的抗D2E7抗体和链霉亲和素-过氧化物酶。将Maxisorp板用400ng/孔抗D2E7抗体或TNFα的50μl 50mM碳酸钠溶液于25℃包被过夜。同时，为了样品稀释，将具有最低蛋白吸收的Nunc微孔板或任意常规96-孔板用封闭缓冲液(1％ BSA，5％蔗糖以及0.05％ NaN3在PBS中，pH 7.4)在4℃封闭过夜。第二天，用吸取器将包被溶液和封闭溶液从ELISA和Nunc板中去除。用封闭缓冲液(250μl/孔)在25℃对ELISA板至少封闭1小时，并用洗涤缓冲液(具有0.05％ Tween-20的PBS，pH 7.4)对所述Nunc板洗涤三次，或在25℃空气干燥并保存于4℃以进行深入分析。在去除封闭溶液后，将所述ELISA板用洗涤缓冲液洗三次并在25℃空气干燥，封保存于4℃以进行深入分析。以1∶2的连续方式对所述血浆样品从所述Nunc板的顶部到底部，以每孔剩余120μl进行稀释。在用稀释缓冲液进行预稀释之后，将100μl所述样品转移至ELISA板并在4℃孵育过夜。将所述样品溶液去除后，用洗涤缓冲液将所述板洗三次，然后向每一个孔中加入溶于50μl稀释缓冲液的20ng生物素抗D2E7抗体。将所述样品在25℃孵育2小时。去除第一抗体之后，以1∶16000的稀释加入100μl链霉亲和素-过氧化物酶，并用洗涤缓冲液将所述板洗四次。将所述板在25℃孵育1小时。将所述溶液去除并用缓冲液将所述板洗三次。在加入100μl TMBE底物后显色10-20分钟，并加入50μl 1M H2SO4进行终止。纪录450nm处的吸光度。
数据获取及分析数据是在Molecular Devices微孔板读数器上获得和分析的。通过在450nm末端的光密度对所述标准的浓度进行作图以及通过绘制具有相关系数为0.99或更好的最适曲线从而得到标准曲线。在包括了所述稀释因数之后，通过所述标准曲线可以计算出所有的未知样品浓度。对具有合适光密度的所有数据点的最靠近数字进行平均以得到所述结果。
D2E7 SCA和PEG-D2E7 SCA结合物在小鼠中的药物动力学
对所有2-7-SC-2系列(2-7-SC-2，乙基-2-7-SC-2，PEG-5k-2-7-SC-2，PEG-20k-2-7-SC-2，PEG-40k-2-7-SC-2)的PK参数进行了测定。测定了2-7-SC-5，PEG-20k-2-7-SC-5，和PEG-40k-2-7-SC-5的PK参数。还测定了通过s.c.注射的2-7-SC-2和PEG-20k-2-7-SC-2的PK参数。
从预实验中可以观察到，使用抗218连接物具有较低的2-7-SC-2检测敏感性(50ng/ml)。当与未修饰SCA蛋白进行比较时，可以观察到在小鼠中40kDa PEG-SCA化合物(2-7-SC-2，2-7-SC-5)大约100倍的循环半衰期的延长。
下表11所述为通过静脉注射(IV)或皮下注射(SC)进行2-7-SC-2，PEG-2-7-SC-2，2-7-SC-5，PEG-2-7-SC-5给药测定的药物动力学参数。
表11
D2E7 SCA和PEG-SCA在小鼠中的药物动力学参数1
  SCA/PEG   Rte   t1/2(小时)   t1/2(小时)   MRT(小时)   AUC小时.μg/ml   CL ml/小时/kg   Vss ml/kg   Cmax μg/ml
  2-7-SC2   i.v.   0.15±0.03   0.70±0.20   0.37±0.23   11.3±1.4   387±49   280±57   53.8±3.8
  乙基-2-7-SC2   i.v.   0.08±0.00   0.7±00   0.44±0.02   4.2±0.1   1035±12   450±20   36.5±0.1
  PEG(5k)-2-7-SC-22   i.v.   2.57±0.87   6.74±5.19   8.21±6.23   338±80   10.5±2.6   84.1±33.7   104±6
  PEG(20k)-2-7-SC-23   i.v.   4.38±1.76   27.2±49.0   19.9±34.1   347±138   12.6±5.0   250±346   54.9±1.4
  PEG(40k)-2-7-SC-2   i.v.   21.62±2.64   28.3±4.1   40.6±5.8   3463±387   1.26±0.14   51.3±3.2   111±5
  2-7-SC-5   i.v.   0.23＝0.01   1.34±0.13   1.51±0.16   19.1±1.0   203±10   308±18   57.8±0.9
  PEG(20k)-2-7-SC-52   i.v.   3.57±0.97   7.00±2.64   9,79±3.66   449.5±115.1   8.91±1.46   81.0±10.3   88.2±10.8
  PEG(40k)-2-7-SC-5   i.v.   20.7±3.8   30.7±14.0   41.2±15.3   2624±466   1.36±0.24   56.0±13.5   88.0±3.6
  2-7-SC-2   s.c.   1.4±30.23   22.4±5.0   178±39   4.11±0.44
  PEG(20k)-2-7-SC-2   s.c.   26.0±3.0   1925±115   2.08±0.12   39.0±1.8
1静脉(i.v.)的药物动力学参数是通过使用两段，i.v.单次推注，无滞后时间，第1级消除模型测定的。sc的药物动力学参数是通过使用一段，第一级输入，第1级消除模型测定的。
2所述数据是两次计算机建模分析的平均值，并取最高标准离差。
3标准离差的最高数。
这些结果证明PEG化SCA蛋白的循环寿命可以设计来覆盖治疗有用药物动力学的范围。在所述40kDa PEG结合的SCA中血清半衰期的两相-log延长将这些化合物放置于完整单克隆抗体的药物动力学范围内。所述PEG聚合物在远离所述抗原结合位点的唯一位点的特异性结合使得不仅可以制造活性抗原结合蛋白，相对于使用随机胺化学的PEG化SCA蛋白的相当异源性，还可以产生与其组成相对同源的产物。在本研究中，当与20kDa PEG化SCA蛋白比较时，40kDa PEG化SCA蛋白的循环寿命是有些惊人的。基于随机PEG化SCA蛋白的结果，我们并未预计到这一情况，因为所述12kDa PEG表现出可比较的循环寿命，有关于约20kDa PEG药物动力学平台的证据。
尽管没有任何理论或假说与如何对所述发明进行操作有关，依然认为支链结构对所述40kDa PEG化SCA化合物大大延长的循环寿命有贡献。特别的兴趣就是在皮下注射中使用PEG-SCA(20kDa PEG)的成功。这种给药方法提供了比静脉给药显著更好的AUC值。皮下方式可能最终是PEG-SCA治疗制剂的优选。PEG与SCA的连接物连接证明是成功的，比优于动物研究中C-末端的PEG连接。有可能所述PEG的连接物连接也对SCA稳定性的提高和抗原性和/或蛋白质水解的降低有贡献。
实施例10
由双-马来酰亚胺-PEG获得的二聚体D2E7 PEG-SCA蛋白
为了产生每个聚合物含有两个SCA蛋白的二价PEG-SCA化合物，使用了双-马来酰亚胺-PEG聚合物。其在所述聚合物的两个末端都含有活化的马来酰亚胺基团。SDS PAGE分析证明了所述SCA-PEG-SCA化合物可以通过使用本发明公开的方法进行合成。反应pH和反应摩尔比的影响分别如表12和表13所示。
反应摩尔比对双-和单-D2E7 SCA-形成的影响
表12
  双-mal-PEG∶D2E7-2-7-SC-2   0.165∶1   0.335∶1   1∶1
  双-D2E7 SCA-PEG结合物(％)   20.7   21.5   17.6
  单-D2E7 SCA-PEG结合物(％)   9.4   21.3   26.0
  双-以及单-D2E7 SCA-PEG结合物(％)   30.1   42.8   43.6
所述数据是通过在4-20％SDS-PAGE凝胶进行凝胶分析得到的。将双-mal-PEG(20k)溶于pH6的100mM磷酸钠使浓度达到3.7mg/ml。然后向1mg/ml D2E7 2-7-SC-2在100mM磷酸钠，pH 6和1mM EDTA中，以所给出的反应摩尔比加入1/30到1/10体积的D2E7 2-7-SC-2。反应在25℃、氮气条件下进行1.5小时。
反应pH对双-和单-D2E7 SCA-PEG(20k)形成的影响
表13
  pH   5.0   5.5   6.0   6.5   7.0   7.5
  双-D2E7 2-7-SC-2-PEG(％)   17.6   19.0   28.2   34.0   37.7   38.4
  单-D2E7 2-7-SC-2-PEG(％)   21.4   23.9   13.7   18.2   14.5   16.4
  双-以及单-D2E7 2-7-SC-2-PEG(％)   39.0   42.9   41.9   52.1   52.1   54.9
如所给出的pH值，所述反应包括在100mM磷酸钠中以0.165∶1反应摩尔比(bis-mal-PEG∶2-7-SC-2)的1mg/ml D2E7 2-7-SC-2以及0.12mg/ml bis-mal-PEG化合物。所述反应在25℃，氮气条件下进行2小时。在4-20％SDS-PAGE凝胶上对所述样品进行分析，并将每种化合物对应的条带进行定量分析。高分子量杂质少于1％且2-7-SC-2的二聚体少于5％。
实施例11
小鼠中抗TNFα活性的确认
本实施例确认了如Galanos等人在1979，Proc.Nat′l AcadSci(USA)76：5939-5943中描述的，PEG化抗肿瘤坏死因子α单链抗体(Peg-抗-TNF-αSCA)、天然抗TNF-αSCA以及Humira(完整D2E7)抗TNF-α抗体在中和基于TNF-α攻击在标准动物模型中激起的所述炎症级联(预防)中的效率，在此将其引入作为参考。
简而言之，通过腹膜方式(i.p.)将TNF-α注射给D-半乳糖胺(NGal)致敏的小鼠从而在C57/BL6小鼠中诱导内毒素。简而言之，在对所述小鼠进行重组人TNF-α(1.0pg/动物)和D-半乳糖胺(20mg/动物)攻击前30分钟，以不同剂量的天然SCA，PEG-SCA和Humira对C57/BL6小鼠进行i.p.注射。对存活的小鼠在24后进行麻醉。
NGal和TNF的共同注射几乎在所有动物中导致了24小时内的致死性。在进行1mg TNF和20mg NGal的腹膜(″IP″)给药之前30分钟，进行了不同剂量D2E7 MAb(Humira)TNF-中和Mab或所述20或40kDa PEG-SCA的给药。在可比较的剂量上，用E2E7 MAb和PEG-SCA化合物同时处理的小鼠表现具有比较高的存活率。
材料与方法
检测动物是7-8周龄、起始体重大约为25g的雌性C57B1/6(SpragueDawley Harlan)小鼠。所述小鼠可获得饮用水并无限制地用商业试验鼠料进行饲喂。用于对TNF-α的攻击具有保护性质检测试剂是如以上描述制备的2-7-SC-5天然SCA；2-7-SC-5-20K-PEG-SCA；2-7-SC-5-43K-PEG-SCA，以及完整的d2E7 MAb(Humira，获自AbbottImmunology，Abbott Park，Illinois)。对照是磷酸缓冲溶液(″PBS″)。所述制剂是通过单次腹膜(″IP″)注射进行给药的。
基于如下实验方法，对126只小鼠进行了分配。
                           表14第1部分
  组   处理   刺激物   N   剂量(μg/小鼠溶于100μl PBS)
  1   PBS   TNF-α   7   -----*
  2   PBS   TNF-α和D-半乳糖胺   7   -----*
  3   SCA-1.7   TNF-α和D-半乳糖胺   7   1.7
  4   SCA-0.85   TNF-α和D-半乳糖胺   7   0.85
  5   SCA-0.42   TNF-α和D-半乳糖胺   7   0.42
  6   SCA-0.21   TNF-α和D-半乳糖胺   7   0.21
  7   Humira-5   TNF-α和D-半乳糖胺   7   5
  8   Humira-2.5   TNF-α和D-半乳糖胺   7   2.5
  9   Humira-1.25   TNF-α和D-半乳糖胺   7   1.25
  10   Humira-0.625   TNF-α和D-半乳糖胺   7   0.625
*接受PBS处理的小鼠将以100μl体积i.p给药.
                            表14第2部分
  组   处理   刺激物   N   剂量(μg/小鼠溶于100μlPBS)
  11   20k Peg-SCA-1.7   TNF-α   7   1.7
  12   20k Peg-SCA-0.85   TNF-α和D-半乳糖胺   7   0.85
  13   20k Peg-SCA-0.42   TNF-α和D-半乳糖胺   7   0.42
  14   20k Peg-SCA-0.21   TNF-α和D-半乳糖胺   7   0.21
  15   43k Peg-SCA-1.7   TNF-α和D-半乳糖胺   7   1.7
  16   43k Peg-SCA-0.85   TNF-α和D-半乳糖胺   7   0.85
  17   43k Peg-SCA-0.42   TNF-α和D-半乳糖胺   7   0.42
  18   43k Peg-SCA-0.21   TNF-α和D-半乳糖胺   7   0.21
在至少一周的适应之后，以上述的具体处理对小鼠进行i.p.注射。在这次注射后30分钟(t＝0)，如上所述的刺激物i.p.攻击小鼠。(小鼠接受1.0μg/小鼠的溶于50μl PBS中的重组TNF-α和/或20mg/小鼠的溶于200μl PBS中的D-半乳糖胺)
然后使用相同的流程，但以更高剂量的检测化合物：每只小鼠0.125μg、0.625μg、2.5μg和10.0μg分别用2-7-SC-5-20K-PEG-SCA以及2-7-SC-5-40K-PEG-SCA来重复所述实验。对20μg的非结合2-7-SC-5SCA进行检测，并以0.625μg/小鼠对完整的D2E5(Humira)进行检测。
结果
以存活％数据对化合物的剂量(数据未显示)进行作图。所述化合物剂量提供了70％对TNF-α刺激小鼠的保护被认为是效力比较的基线。同等剂量(0.625μg/动物)的Humira以及20k-和40kDa-PEG-SCAs保护小鼠免于TNF-诱导的致死。然而，要在这些小鼠中达到类似的保护水平，需要更高剂量的天然、非结合SCA(20pg/动物或大约800μg/kg)。在摩尔水平来看，所得的数据证明了要达到与全长抗体类似的同等存活，需要约3倍的过量的20k-或40kDa-PEG-SCA。从另一方面来看，要获得对于TNF诱导致死性类似的保护水平，需要100倍摩尔的过量天然SCA。这些数据说明通过PEG对D2E7 SCA的修饰，通过增加蛋白在血浆中的循环半衰期，提供了优于天然蛋白的显著优势。
因为所述检测动物的平均重量约为25g，所以0.625μg/动物对应于约25μg/kg的剂量，10μg/动物对应于约400μg/kg的剂量。
序列表
<110>安龙制药公司(ENZON PHARMACEUTICALS，INC.)
<120>用于聚合物结合的单链抗原结合多肽(SINGLE CHAIN ANTIGEN-BINDINGPOLYPEPTIDES FOR POLYMER
     CONJUGATION)
<130>SCT054325-66
<140>10/423,847
<141>2003-04-25
<160>45
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>756
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(756)
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-1
     nucleotide sequence
<400>1
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta ggg    48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgt cgg gca agt cag ggc atc aga aat tac    96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
             20                  25                  30
tta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc   144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
tat gct gca tcc act ttg caa tca ggg gtc cca tct cgg ttc agt ggc   192
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc cta cag cct   240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat gtt gca act tat tac tgt caa agg tat aac cgt gca ccg tat    288
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
                 85                  90                  95
act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gaa atc aaa ggc tct act agt ggt    336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
            100                 105                 110
agc ggc aaa ccc ggg agt ggt gaa ggt agc act aaa ggt gag gtg cag    384
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
        115                 120                 125
ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag ccc ggc agg tcc ctg aga    432
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
    130                 135                 140
ctc tcc tgt gcg gcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac    480
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145                 150                 155                 160
tgg gtc cgg caa gct cca ggg aag ggc ctg gaa tgg gtc tca gct atc    528
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
                165                 170                 175
act tgg aat agt ggt cac ata gac tat gcg gac tct gtg gag ggc cga    576
Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg
            180                 185                 190
ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa atg    624
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
aac agt ctg aga gct gag gat acg gcc gta tat tac tgt gcg aaa gtc    672
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val
    210                 215                 220
tcg tac ctt agc acc gcg tcc tcc ctt gac tat tgg ggc caa ggt acc    720
Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
ctg gtc acc gtc tcg tct cac cac cat cac cat cac                    756
Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
                245                 250
<210>2
<211>759
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(759)
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-2
     nucleotide sequence
<400>2
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta ggg    48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgt cgg gca agt cag ggc atc aga aat tac    96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
             20                  25                  30
tta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc   144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
tat gct gca tcc act ttg caa tca ggg gtc cca tct cgg ttc agt ggc   192
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc cta cag cct   240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat gtt gca act tat tac tgt caa agg tat aac cgt gca ccg tat   288
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
                 85                  90                  95
act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gaa atc aaa ggc tct act agt ggt   336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
            100                 105                 110
agc ggc aaa ccc ggg agt ggt gaa ggt agc act aaa ggt gag gtg cag   384
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
        115                 120                 125
ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag ccc ggc agg tcc ctg aga   432
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
    130                 135                 140
ctc tcc tgt gcg gcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac   480
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145                 150                 155                 160
tgg gtc cgg caa gct cca ggg aag ggc ctg gaa tgg gtc tca gct atc   528
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
                165                 170                 175
act tgg aat agt ggt cac ata gac tat gcg gac tct gtg gag ggc cga    576
Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg
            180                 185                 190
ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa atg    624
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
aac agt ctg aga gct gag gat acg gcc gta tat tac tgt gcg aaa gtc    672
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val
    210                 215                 220
tcg tac ctt agc acc gcg tcc tcc ctt gac tat tgg ggc caa ggt acc    720
Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
ctg gtc acc gtc tcg tct cac cac cat cac cat cac tgc                759
Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Cys
                245                 250
<210>3
<211>750
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(750)
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-3
     nucleotide sequence
<400>3
gaa gtg cag ctg gtt gaa agc ggt ggc ggt ctg gtg cag ccg ggt cgt    48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
agc ctg cgt ctg tct tgt gca gcg agc ggc ttc acg ttt gat gac tat    96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
             20                  25                  30
gca atg cac tgg gtt cgt cag gcg ccg ggc aaa ggt ctg gaa tgg gtc   144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
agc gcg atc acc tgg aac agc ggt cac att gac tat gca gat tct gtt   192
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
gaa ggt cgt ttc acc atc agc cgt gac aat gct aag aac agc ctg tac    240
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
ctg caa atg aac agc ctg cgt gca gaa gac acc gct gtg tac tat tgc    288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gcg aaa gtc agc tat ctg agc acg gct agc tct ctg gac tac tgg ggt    336
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
cag ggc acg ctg gtt acc gtt agc tct ggt ggc ggt ggc agc ggt ggc    384
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
        115                 120                 125
ggt ggc tct ggt ggc ggt ggc agc gac atc cag atg acc cag tct cca    432
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
    130                 135                 140
tcc tcc ctg tct gca tct gta ggg gac aga gtc acc atc act tgt cgg    480
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145                 150                 155                 160
gca agt cag ggc atc aga aat tac tta gcc tgg tat cag caa aaa cca    528
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
                165                 170                 175
ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc tat gct gca tcc act ttg caa tca    576
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
            180                 185                 190
ggg gtc cca tct cgg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act    624
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
        195                 200                 205
ctc acc atc agc agc cta cag cct gaa gat gtt gca act tat tac tgt    672
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
caa agg tat aac cgt gca ccg tat act ttt ggc cag ggg acc aag gtg    720
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225                 230                 235                 240
gaa atc aaa cac cac cat cac cat cac tgc                            750
Glu Ile Lys His His His His His His Cys
                245                 250
<210>4
<211>741
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(741)
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-4
     nucleotide sequence
<400>4
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta ggg    48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgt cgg gca agt cag ggc atc aga aat tac    96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
             20                  25                  30
tta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc   144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
tat gct gca tcc act ttg caa tca ggg gtc cca tct cgg ttc agt ggc   192
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc cta cag cct   240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat gtt gca act tat tac tgt caa agg tat aac cgt gca ccg tat   288
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
                 85                  90                  95
act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gaa atc aaa ggc tct act agt ggt   336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
            100                 105                 110
agc ggc aaa ccc ggg agt ggt gaa ggt agc act aaa ggt gag gtg cag   384
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
        115                 120                 125
ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag ccc ggc agg tcc ctg aga   432
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
    130                 135                 140
ctc tcc tgt gcg gcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac   480
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145                 150                 155                 160
tgg gtc cgg caa gct cca ggg aag ggc ctg gaa tgg gtc tca gct atc    528
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
                165                 170                 175
act tgg aat agt ggt cac ata gac tat gcg gac tct gtg gag ggc cga    576
Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg
            180                 185                 190
ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa atg    624
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
aac agt ctg aga gct gag gat acg gcc gta tat tac tgt gcg aaa gtc    672
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val
    210                 215                 220
tcg tac ctt agc acc gcg tcc tcc ctt gac tat tgg ggc caa ggt acc    720
Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
ctg gtc acc gtc tcg tct tgc                                        741
Leu Val Thr Val Ser Ser Cys
                245
<210>5
<211>756
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(756)
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-5
     nucleotide sequence
<400>5
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta ggg    48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgt cgg gca agt cag ggc atc aga aat tac    96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
             20                  25                  30
tta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc   144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
tat gct gca tcc act ttg caa tca ggg gtc cca tct cgg ttc agt ggc    192
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc cta cag cct    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat gtt gca act tat tac tgt caa agg tat aac cgt gca ccg tat    288
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
                 85                  90                  95
act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gaa atc aaa ggc tgt act agt ggt    336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Cys Thr Ser Gly
            100                 105                 110
agc ggc aaa ccc ggg agt ggt gaa ggt agc act aaa ggt gag gtg cag    384
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
        115                 120                 125
ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag ccc ggc agg tcc ctg aga    432
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
    130                 135                 140
ctc tcc tgt gcg gcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg cac    480
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145                 150                 155                 160
tgg gtc cgg caa gct cca ggg aag ggc ctg gaa tgg gtc tca gct atc    528
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
                165                 170                 175
act tgg aat agt ggt cac ata gac tat gcg gac tct gtg gag ggc cga    576
Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg
            180                 185                 190
ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa atg    624
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
aac agt ctg aga gct gag gat acg gcc gta tat tac tgt gcg aaa gtc    672
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val
    210                 215                 220
tcg tac ctt agc acc gcg tcc tcc ctt gac tat tgg ggc caa ggt acc    720
Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
ctg gtc acc gtc tcg tct cac cac cat cac cat cac                    756
Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
                245                 250
<210>6
<211>750
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(750)
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-6
     nucleotide sequence
<400>6
gaa gtg cag ctg gtt gaa agc ggt ggc ggt ctg gtg cag ccg ggt cgt    48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
agc ctg cgt ctg tct tgt gca gcg agc ggc ttc acg ttt gat gac tat    96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
             20                  25                  30
gca atg cac tgg gtt cgt cag gcg ccg ggc aaa ggt ctg gaa tgg gtc   144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
agc gcg atc acc tgg aac agc ggt cac att gac tat gca gat tct gtt   192
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
gaa ggt cgt ttc acc atc agc cgt gac aat gct aag aac agc ctg tac   240
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
ctg caa atg aac agc ctg cgt gca gaa gac acc gct gtg tac tat tgc   288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gcg aaa gtc agc tat ctg agc acg gct agc tct ctg gac tac tgg ggt   336
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
cag ggc acg ctg gtt acc gtt agc tct ggt ggc ggt ggc tgc ggt ggc   384
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly
        115                 120                 125
ggt ggc tct ggt ggc ggt ggc agc gac atc cag atg acc cag tct cca   432
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130                     135                 140
tcc tcc ctg tct gca tct gta ggg gac aga gtc acc atc act tgt cgg    480
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145                 150                 155                 160
gca agt cag ggc atc aga aat tac tta gcc tgg tat cag caa aaa cca    528
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
                165                 170                 175
ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc tat gct gca tcc act ttg caa tca    576
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
            180                 185                 190
ggg gtc cca tct cgg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act    624
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
        195                 200                 205
ctc acc atc agc agc cta cag cct gaa gat gtt gca act tat tac tgt    672
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
caa agg tat aac cgt gca ccg tat act ttt ggc cag ggg acc aag gtg    720
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225                 230                 235                 240
gaa atc aaa cac cac cat cac cat cac tgc                            750
Glu Ile Lys His His His His His His Cys
                245                 250
<210>7
<211>747
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(747)
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-7
     nucleotide sequence
<400>7
gaa gtg cag ctg gtt gaa agc ggt ggc ggt ctg gtg cag ccg ggt cgt    48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
agc ctg cgt ctg tct tgt gca gcg agc ggc ttc acg ttt gat gac tat    96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
             20                  25                  30
gca atg cac tgg gtt cgt cag gcg ccg ggc aaa ggt ctg gaa tgg gtc    144
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
agc gcg atc acc tgg aac agc ggt cac att gac tat gca gat tct gtt    192
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
gaa ggt cgt ttc acc atc agc cgt gac aat gct aag aac agc ctg tac    240
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
ctg caa atg aac agc ctg cgt gca gaa gac acc gct gtg tac  tat tgc   288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
gcg aaa gtc agc tat ctg agc acg gct agc tct ctg gac tac tgg ggt    336
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
cag ggc acg ctg gtt acc gtt agc tct ggt ggc ggt ggc tgc ggt ggc    384
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly
        115                 120                 125
ggt ggc tct ggt ggc ggt ggc agc gac atc cag atg acc cag tct cca    432
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
    130                 135                 140
tcc tcc ctg tct gca tct gta ggg gac aga gtc acc atc act tgt cgg    480
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145                 150                 155                 160
gca agt cag ggc atc aga aat tac tta gcc tgg tat cag caa aaa cca    528
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
                165                 170                 175
ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc tat gct gca tcc act ttg caa tca    576
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
            180                 185                 190
ggg gtc cca tct cgg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act    624
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
        195                 200                 205
ctc acc atc agc agc cta cag cct gaa gat gtt gca act tat tac tgt    672
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
caa agg tat aac cgt gca ccg tat act ttt ggc cag ggg acc aag gtg   720
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225                 230                 235                 240
gaa atc aaa cac cac cat cac cat cac                               747
Glu Ile Lys His His His His His His
                245
<210>8
<211>762
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(762)
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-8
     nucleotide sequence
<400>8
tgc gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta    48
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
ggg gac aga gtc acc atc act tgt cgg gca agt cag ggc atc aga aat    96
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn
             20                  25                  30
tac tta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg   144
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
         35                  40                  45
atc tat gct gca tcc act ttg caa tca ggg gtc cca tct cgg ttc agt   192
Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
     50                  55                  60
ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc cta cag   240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
 65                  70                  75                  80
cct gaa gat gtt gca act tat tac tgt caa agg tat aac cgt gca ccg   288
Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro
                 85                  90                  95
tat act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gaa atc aaa ggc tct act agt   336
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser
            100                 105                 110
ggt agc ggc aaa ccc ggg agt ggt gaa ggt agc act aaa ggt gag gtg    384
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
        115                 120                 125
cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag ccc ggc agg tcc ctg    432
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
    130                 135                 140
aga ctc tcc tgt gcg gcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat gcc atg    480
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met
145                 150                 155                 160
cac tgg gtc cgg caa gct cca ggg aag ggc ctg gaa tgg gtc tca gct    528
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
                165                 170                 175
atc act tgg aat agt ggt cac ata gac tat gcg gac tct gtg gag ggc    576
Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly
            180                 185                 190
cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg tat ctg caa    624
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
        195                 200                 205
atg aac agt ctg aga gct gag gat acg gcc gta tat tac tgt gcg aaa    672
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
    210                 215                 220
gtc tcg tac ctt agc acc gcg tcc tcc ctt gac tat tgg ggc caa ggt    720
Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225                 230                 235                 240
acc ctg gtc acc gtc tcg tct cac cac cat cac cat cac tgc            762
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Cys
                245                 250
<210>9
<211>717
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(717)
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-9
     nucleotide sequence
<400>9
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta ggg    48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
gac aga gtc acc atc act tgt cgg gca agt cag ggc atc aga aat tac    96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
             20                  25                  30
tta gcc tgg tat cag caa aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc   144
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
tat gct gca tcc act ttg caa tca ggg gtc cca tct cgg ttc agt ggc   192
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc cta cag cct   240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
gaa gat gtt gca act tat tac tgt caa agg tat aac cgt gca ccg tat   288
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
                 85                  90                  95
act ttt ggc cag ggg acc aag gtg gaa atc aaa ggt ggc ggt ggc tct   336
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
            100                 105                 110
gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag ccc ggc agg   384
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
        115                 120                 125
tcc ctg aga ctc tcc tgt gcg gcc tct gga ttc acc ttt gat gat tat   432
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
    130                 135                 140
gcc atg cac tgg gtc cgg caa gct cca ggg aag ggc ctg gaa tgg gtc   480
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
145                 150                 155                 160
tca gct atc act tgg aat agt ggt cac ata gac tat gcg gac tct gtg   528
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
                165                 170                 175
gag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tcc ctg tat   576
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
            180                 185                 190
ctg caa atg aac agt ctg aga gct gag gat acg gcc gta tat tac tgt   624
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        195                 200                 205
gcg aaa gtc tcg tac ctt agc acc gcg tcc tcc ctt gac tat tgg ggc    672
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
    210                 215                 220
caa ggt acc ctg gtc acc gtc tcg tct cac cac cat cac cat cac        717
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
225                 230                 235
<210>10
<211>252
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-1
     protein sequence
<400>10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
            100                 105                 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
        115                 120                 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
    130                 135                 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145                 150                 155                 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
                165                 170                 175
Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg
            180                 185                 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val
    210                 215                 220
Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
                245                 250
<210>11
<211>253
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-2
     protein sequence
<400>11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
            100                 105                 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
        115                 120                 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
    130                 135                 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145                 150                 155                 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
                165                 170                 175
Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg
            180                 185                 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val
    210                 215                 220
Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Cys
                245                 250
<210>12
<211>250
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-3
     protein sequence
<400>12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
             20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
    130                 135                 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225                 230                 235                 240
Glu Ile Lys His His His His His His Cys
                245                 250
<210>13
<211>247
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-4
     protein sequence
<400>13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly
            100                 105                 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
        115                 120                 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
    130                 135                 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145                 150                 155                 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
                165                 170                 175
Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg
            180                 185                 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val
    2l0                 215                 220
Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
Leu Val Thr Val Ser Ser Cys
                245
<210>14
<211>252
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-5
     protein sequence
<400>14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Cys Thr Ser Gly
            100                 105                 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln
        115                 120                 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
    130                 135                 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His
145                 150                 155                 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile
                165                 170                 175
Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly Arg
            180                 185                 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
        195                 200                 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Val
    2l0                 215                 220
Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225                 230                 235                 240
Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
                245                 250
<210>15
<211>250
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-6
     protein sequence
<400>15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
             20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
    130                 135                 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225                 230                 235                 240
Glu Ile Lys His His His His His His Cys
                245                 250
<210>16
<211>249
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-7
     protein sequence
<400>16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
  1               5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
             20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
         35                  40                  45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
     50                  55                  60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
 65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                 85                  90                  95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
    130                 135                 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145                 150                 155                 160
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
                165                 170                 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
            180                 185                 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
        195                 200                 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
    210                 215                 220
Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225                 230                 235                 240
Glu Ile Lys His His His His His His
                245
<210>17
<211>254
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-8
     protein sequence
<400>17
Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
  1               5                  10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn
             20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
         35                  40                  45
Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
     50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
 65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro
                 85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser
            100                 105                 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
        115                 120                 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
    130                 135                 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met
145                 150                 155                 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
                165                 170                 175
Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly
            180                 185                 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
        195                 200                 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
    210                 215                 220
Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
225                 230                 235                 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Cys
                245                 250
<210>18
<211>239
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic 2-7-SC-9
     protein sequence
<400>18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
             20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
         35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
 65                  70                  75                  80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
                 85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
            100                 105                 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
        115                 120                 125
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
    130                 135                 140
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
145                 150                 155                 160
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
                165                 170                 175
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
            180                 185                 190
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
        195                 200                 205
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
    210                 215                 220
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His
225                 230                 235
<210>19
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>19
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga c               51
<210>20
<211>96
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>20
gcatctgtag gggacagagt caccatcact tgtcgggcaa gtcagggcat cagaaattac      60
ttagcctggt atcagcaaaa accagggaaa gcccct                                96
<210>21
<211>60
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>21
tccactttgc aatcaggggt cccatctcgg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc      60
<210>22
<211>102
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>22
tctgggacag atttcactct caccatcagc agcctacagc ctgaagatgt tgcaacttat     60
tactgtcaaa ggtataaccg tgcaccgtat acttttggcc ag                        102
<210>23
<211>72
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>23
accactcccg ggtttgccgc  taccactagt agagcctttg atttccacct tggtcccctg     60
gccaaaagta ta                                                          72
<210>24
<211>63
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>24
ggcaaacccg ggagtggtga aggtagcact aaaggtgagg tgcagctggt ggagtctggg     60
gga                                                                   63
<210>25
<211>102
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>25
gtggagtctg ggggaggctt ggtacagccc ggcaggtccc tgagactctc ctgtgcggcc     60
tctggattca cctttgatga ttatgccatg cactgggtcc gg                        102
<210>26
<211>60
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>26
ccaagtgata gctgagaccc attccaggcc cttccctgga gcttgccgga cccagtgcat      60
<210>27
<211>60
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>27
tcagctatca cttggaatag tggtcacata gactatgcgg actctgtgga gggccgattc      60
<210>28
<211>102
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>28
gtggagggcc gattcaccat ctccagagac aacgccaaga actccctgta tctgcaaatg     60
aacagtctga gagctgagga tacggccgta tattactgtg cg                        102
<210>29
<211>87
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>29
agacgagacg gtgaccaggg taccttggcc ccaatagtca agggaggacg cggtgctaag     60
gtacgagact ttcgcacagt aatatac                                         87
<210>30
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Primer
<400>30
tggcgagctc tgacatccag atgacccagt ct                                   32
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Primer
<400>31
accactcccg ggtttgccgc taccactagt aga                                  33
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Primer
<400>32
ggcaaacccg ggagtggtga                                                 20
<210>33
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Primer
<400>33
gccactcgag ctattagtga tggtgatggt ggtgagacga gacggtgacc ag             52
<210>34
<211>92
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Primer
<400>34
cctcggaatt caccatgaga tttccttcaa tttttactgc tgttttattc gcagcatcct     60
ccgcattagc tgctgacatc cagatgaccc ag                                   92
<210>35
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Primer
<400>35
cgcggaattc tattagtgat ggagatggag gagagacgag acggtgacca g              51
<210>36
<211>20
<212>PRT
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>36
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
  1               5                  10                  15
Ala Leu Ala Ala
             20
<210>37
<211>26
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Primer
<400>37
ctcgaattca ccatgagatt tccttc                                          26
<210>38
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Primer
<400>38
aaggtggaaa tcaaaggctg tactagtggt agcggcaaac cc                        42
<210>39
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Primer
<400>39
gggtttgccg ctaccactag tacagccttt gatttccacc tt                        42
<210>40
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Primer
<400>40
cgagaattct cattaattgc gcaggtagcc                                      30
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     peptide
<400>41
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly
  1               5                  10
<210>42
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide
<400>42
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
  1               5                  10                  15
<210>43
<211>6
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：6-His tag
<400>43
His His His His His His
  1               5
<210>44
<211>5
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Linker peptide
<400>44
Gly Gly Gly Gly Ser
  1               5
<210>45
<211>54
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Description of Artificial Sequence：Synthetic
     oligonucleotide
<400>45
ccctgattgc aaagtggatg cagcatagat caggagctta ggggctttcc ctgg           54

Claims (30)

1.能够与聚环氧烷聚合物位点特异性结合的单链抗原结合多肽，其包括：
(a)含有抗体重链或轻链可变区抗原结合部分的第一多肽；
(b)包含抗体重链或轻链可变区抗原结合部分的第二多肽；
(c)连接第一多肽和第二多肽的肽连接物，其中所述单链抗原结合多肽含有至少一个能结合于聚环氧烷聚合物的Cys残基，并含有至少一个抗原结合位点，以及
其中Cys残基位于选自如下的位点：
(i)重链或轻链可变区的C-末端；
(ii)重链或轻链可变区的N-末端；
(iii)肽连接物上的任一氨基酸位点；
(iv)N-末端和C-末端；
(v)连接物的第2位；
(vi)连接物的第2位和C-末端；以及
(vii)上述组合；
并且其中的单链抗原结合多肽结合于TNF-α。
2.如权利要求1所述的单链抗原结合多肽，其中的Cys残基位于选自连接肽的第2位、C-末端及其组合的位点。
3.如权利要求1所述的单链抗原结合多肽，其中的第一多肽包括抗体轻链的可变区且所述的第二多肽包括抗体重链的可变区。
4.如权利要求1所述的单链抗原结合多肽，其中第二多肽的C-末端是天然C-末端。
5.如权利要求1所述的单链抗原结合多肽，其中的肽连接物的大小范围为从2到18个残基。
6.包括如权利要求1所述的单链抗原结合多肽以及包括聚环氧烷聚合物的结合物，其中所述聚环氧烷聚合物在Cys残基共价连接于所述单链抗原结合多肽。
7.如权利要求6所述的结合物，其中所述聚环氧烷通过选自马来酰亚胺、乙烯砜、硫醇、邻吡啶基二硫化物和碘乙酰胺连接物在Cys残基连接于所述单链抗原结合多肽。
8.如权利要求6所述的结合物，其中所述聚环氧烷通过马来酰亚胺连接物在Cys残基连接于所述单链抗原结合多肽。
9.如权利要求6所述的结合物，其中所述聚环氧烷的大小范围为从约5,000到约40,000道尔顿。
10.如权利要求6所述的结合物，其中所述聚环氧烷是聚乙醚。
11.如权利要求6所述的结合物，其中所述聚环氧烷结合于至少两个单链抗原结合多肽，且每一单链抗原结合多肽是相同或不同的。
12.如权利要求11所述的结合物，其中所述单链抗原结合多肽进一步结合于其它的功能部分。
13.如权利要求12所述的结合物，其中所述其它的功能部分是可检测的标记或标签。
14.编码如权利要求1所述单链抗原结合多肽的多核苷酸。
15.包括如权利要求14所述多核苷酸的可复制的表达载体。
16.生产单链抗原结合多肽的方法，包括步骤：
(a)培养含有如权利要求12所述表达载体的宿主细胞，以及
(b)收集由所述宿主细胞表达的单链抗原结合多肽。
17.检测样品中可疑TNF-α的方法，包括：
(a)将所述样品与包括如权利要求1所述单链抗原结合多肽的试剂接触，以及
(b)检测所述单链抗原结合多肽是否结合于所述TNF-α。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述单链抗原结合多肽通过所述单链抗原结合多肽的Cys残基共价结合于至少一个聚环氧烷聚合物。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述结合物锚定于固体基质。
20.治疗和预防动物的TNF-α相关毒性的方法，包括对所述动物进行如权利要求1所述单链抗原结合多肽的给药，其中以有效量进行所述单链抗原结合多肽的给药来抑制动物TNF-α的活性。
21.如权利要求20所述的方法，其中给药的单链抗原结合多肽通过至少一个Cys残基共价结合于至少一个聚环氧烷聚合物。
22.如权利要求20所述的方法，其中以从约10μg/kg到约4,000μg/kg范围的量进行所述单链抗原结合多肽的给药。
23.如权利要求20所述的方法，其中以从约20μg/kg到约400μg/kg范围的量进行所述单链抗原结合多肽的给药。
24.包括两个或更多如权利要求1所述单链抗原结合多肽的蛋白，其中每一单链抗原结合多肽的蛋白是相同的或不同的。
25.如权利要求24所述的蛋白，为二价、三价或四价。
26.如权利要求24所述的蛋白，其中组分单链抗原结合多肽是非共价连接的。
27.如权利要求26所述的蛋白，其中组分单链抗原结合多肽的肽连接物的大小范围为从2到18个残基。
28.如权利要求24所述的蛋白，其中组分单链抗原结合多肽是共价连接的。
29.如权利要求24所述的蛋白，被编码为单价、多价蛋白。
30.编码如权利要求29所述蛋白的多核苷酸。
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