KR20060006942A - 고분자 접합용 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드 - Google Patents

고분자 접합용 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일과 다중 결합가를 가지며 자리 특이적으로 변형된 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드에 관련된 것이다. 본 출원에서 제공하는 폴리펩티드들은 그 변형된 자리에서 산화 폴리알킬렌에 공유결합으로 연결되거나 접합될 수 있다. 이러한 접합물 항원에 결합하는 성질을 유지하며, 비접합 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드에 비하여 더 긴 순환 시간과 줄어든 항원성을 나타낸다. 본 출원은 또한 자리 특이적으로 변형된 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드를 제조하고 사용하기 위한 방법과 조성물도 제공한다.
단일 사슬 항체, 접합물, 폴리알킬렌, SCA

Description

고분자 접합용 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드{Single chain antigen-binding polypeptides for polymer conjugation}
본 발명은 고분자에 공유결합을 통하여 자리 특이적으로 연결되는 것을 용이하게 하는 단일과 다중 결합가의 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 그러한 변형된 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드, 이들을 암호화하는 벡터와 숙주세포를 그 폴리펩티드의 제조·사용 방법과 함께 제공한다. 본 발명은 또한 상기 변형된 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드와 산화 폴리알킬렌(PAO) 등의 고분자 사이의 접합물을 제공하여 새롭고 개선된 전구약물(前驅藥物, prodrug)과 이 접합물의 제조·사용 방법을 마련한다.
자연에 존재하는 항체들은 포유동물을 포함하는 척추동물의 면역계에서 생산한 면역 글로불린으로서, 하나나 여러 종류의 특정 물질, 즉 항원들을 면역계가 이질적인 것으로 인식하였을 때 그 대응반응으로서 생산된다. 사람에게는 특정한 항원을 선택적으로 인식하고 그에 우선적으로 결합할 수 있는 항체의 종류(class)가 다섯 가지 존재한다. 각 항체 종류는 동일한 기본 구조를 가지거나, 기본 구조의 배수체를 가진다. 항체의 기본 단위는 중(重)사슬 또는 H 사슬로 불리는 두 개의 동일한 폴리펩티드(IgG에서는 그 분자량이 각각 약 50,000돌턴)와 경(輕)사슬 또는 L 사슬로 불리는 두 개의 동일한 폴리펩티드(분자량이 각각 약 25,000돌턴)로 이루어진다. 경사슬은 하나의 가변 영역(variable domain)과 불변(constant) 영역으로 이루어지는데 반해, 중사슬은 한 가변 영역과 세 개 혹은 더 많은 불변 영역으로 이루어진다. 가변 영역은 면역 글로불린의 특이성을 결정하며, 불변 영역은 다른 기능을 가진다.
대개 적당한 경사슬과 중사슬이 회합(會合, association)한 쌍이 천연 항체와 다른 유형의 항체에서 항원 결합 부위를 이룬다. 각 경사슬과 중사슬은 대략 110 개의 아미노산을 가지는 부위로 접혀서(folded), 보존된 3차원 형태(conformation)를 갖추게 된다. 경사슬은 하나의 가변 부위(VL)와 한 불변 부위(CL)로 이루어지는 반면, 중사슬은 한 가변 부위(VH)와 세 불변 부위(CH1, CH2, CH3)로 이루어진다. 이 부위들이 이루는 쌍이 별도의 구조를 이룬다. 특히 경사슬과 중사슬 가변 부위가 모여 형성하는 Fv 부위는 항원 결합 자리를 가지고 있다. 불변 부위는 항원 결합에 필요하지 않으며 어떤 때에는 가수분해를 통하여 항체 분자로부터 떼어낼 수 있는데, 이때 경사슬의 절반과 중사슬의 4분의 1로 이루어진, 생체 활성(즉 결합하는)의 가변 부위를 낳게 된다.
게다가 특정 종류의 모든 항체와 그 Fab 조각(즉 VL, CL, VH와 CH로 이루어진 조각)에서 가변 영역의 구조는 서로 다른 동물 종에서 비롯된 경우에서도 X선 회절법으로 밝힌 결과 다변이 분절(多變異分節, hypervariable segment)의 큰 차이에도 불구하고 서로 유사하다는 것이 드러났다. 면역 글로불린 가변 분위는 항원 결합 고리(loop)에서 일어나는 돌연변이를 허용하는 듯 보인다. 따라서 경사슬과 중사슬 모두에 의하여 정해지는 대부분의 이른바 항체 "가변" 부위는 실제적으로 다변이 부위를 제외하고는 3차원 배열에 있어서 거의 일정하다. 그 예로서, 본 명세서에서 인용하고 있는 R. Huber의 1986년 사이언스誌 233권 702~703쪽을 보라.
천연 항체는 비균질적이고 다양한 항원 결정기(決定基, epitope) 또는 이질적 항원의 일부에 결합하는 것이 전형적인 경우이다. 반면에 단일 클론 항체(MAb)는 결합 친화도에 있어서 균질적이다. 단일 클론 항체는 진단과 치료용 모두에서 유용함이 밝혀졌으며 확립된 방식, 예를 들어 마우스 림프구와 적절한 마우스 골수종 세포를 융합시킨 하이브리도마 뿐만 아니라 보다 발전된 재조합 기술에 의하여서도 통상적으로 제조되고 있다.
항체보다 더 작은 항체와 유사한 단백질이나 폴리펩티드조차 최소한의 추가된 구조를 가지고 항원 결합 자리를 형성한다. 관련 업계에서 이들은 단일 사슬 항원결합성 단백질 또는 폴리펩티드(SCA, single chain antigen-binding proteins 또는 polypeptides) 단일 사슬 항체 가변 조각(single chain variable fragments of antibodies, sFv)으로 알려져 있다. 이들은 낱낱의 가변 부위 VL과 VH를 이어주어 하나의 폴리펩티드 사슬로 만드는 연결부(linker) 폴리펩티드를 포함할 수도 있다.
단일 사슬 항원결합성(SCA) 단백질의 제조와 그 이론에 관한 기술은 Ladner 외 미국 특허 4,946,778호, 5,260,203호, 5,455,030호와 5,518,889호 그리고 Huston 외 미국 특허 5,091,513(생합성 항체 결합 자리(BABS))호에 있는데, 이들의 개시 내용은 본 명세서에 모두 참고문헌으로 포함되어 있다. 위 특허에 기재된 과정을 거쳐 생산된 단일 사슬 항원결합성 단백질은 상응하는 Fab 조각과 실질적으로 비슷한 결합 특이성과 친화도를 가지고 있다.
대개 적당한 경사슬과 중사슬이 모여 짝을 이룬 것들이 항원 결합 부위를 형성한다. 각 경사슬과 중사슬은 대략 110 개의 아미노산을 가지는 부위로 접혀서, 보존된 3차원 형태를 갖추게 된다. 경사슬은 하나의 가변 부위(VL)와 한 불변 부위(CL)로 이루어지는 반면, 중사슬은 한 가변 부위(VH)와 세 불변 부위(CH1, CH2, CH3)로 이루어진다. 이 부위들이 이루는 쌍이 별도의 구조를 이룬다. 특히 경사슬과 중사슬 가변 부위가 모여 형성하는 Fv 부위는 항원 결합 자리를 가지고 있다. 불변 부위는 항원 결합에 필요하지 않으며 어떤 때에는 가수분해를 통하여 항체 분자로부터 떼어낼 수 있는데, 이 때 경사슬의 절반과 중사슬의 4분의 1로 이루어진, 생체 활성(즉 결합하는)의 가변 부위를 낳게 된다.
게다가 특정 종류의 모든 항체와 그 Fab 조각(즉 VL, CL, VH와 CH로 이루어진 조각)에서 가변 영역의 구조는 서로 다른 동물 종에서 비롯된 경우에서도 X선 회절법으로 밝힌 결과 다변이 분절의 큰 차이에도 불구하고 서로 유사하다는 것이 드러났다. 면역 글로불린 가변 분위는 항원 결합 고리에서 일어나는 돌연변이를 허용하는 듯 보인다. 따라서 경사슬과 중사슬 모두에 의하여 정해지는 대부분의 이른바 항체 "가변" 부위는 실제적으로 다변이 부위를 제외하고는 3차원 배열에 있어서 거의 일정하다. 그 예로서, 본 명세서에서 인용하고 있는 R. Huber의 1986년 사이언스誌 233권 702~703쪽을 보라.
SCA 폴리펩티드의 생체 내(in vivo) 특성은 단일 클론 항체 그리고 더 크고 더 통상적인 항체 조각과는 다르다. SCA 폴리펩티드는 그 크기가 작기 때문에 피속에서 더 빨리 청소(clearance)되며, 조직 내로 더 빠르게 침투한다(Milenic, D. E. 외, Cancer Research, 51:pp6363~6371(1991); Colcher 외 J. Natl . Cancer Inst ., 82: 1191(1990); Yokota 외, Cancer Research, 52: 3402(1992)). 나아가 SCA 폴리펩티드는 항체 분자에 정상적으로 존재하는 불변 부위가 없기 때문에 간과 콩팥과 같은 조직에 잔류하지 않는다. 따라서 SCA 폴리펩티드는 신속한 조직내 침투와 혈액 내 청소가 이점이 되는 암진단과 치료에 응용될 수 있다.
합성 항원결합성 단백질은 본 명세서에서 인용하는 Huston 외 미국 특허 5,091,513호에 기재되어 있다. 기재된 단백질들의 특성은 생합성 항체 결합 자리(BABS, biosynthetic antibody binding site)로 작용하는 부위를 형성하는 아미노산 서열이 적어도 하나 포함되어 있다는 것이다. 이 결합 자리는 (1) 공유결합이 아닌 방식이거나 이황화 결합으로 회합한 합성 VH와 VL 부위, (2)VH와 VL이 폴리펩티드 연결부에 이어진 VH-VL 또는 VL-VH 의 단일 사슬, (3)개별 VH 또는 VL 영역(domain)으로 구성된다. 결합 영역은 골격 부위(framework region)에 연결된 상보성 결정 부위(CDR, complementarity determining region)를 갖추고 있는데, 이들은 그 근원이 서로 다른 면역 글로불린에서 비롯되어도 무방하다. Huston 외 특허의 단백질들에는 앞머리(initial) 중사슬, 즉 VH-펩티드 연결부-VL 영역이라는 특성을 가지는 단백질이 포함된다는 점은 주목할 만하다.
다중 결합가 항원결합성 단백질들은 알려져 있다. 본 명세서에서 기술된 바처럼 다가 항원결합성 단백질에는 두 개 이상의 단일 사슬 단백질 분자들을 포함한다. 이들은 공유결합이나 비공유결합에 의하여 연결되거나 회합할 수 있다. 향상된 항원결합 활성, 이가와 다가 특이적 결합, 그리고 다가 항원결합성 단백질의 다 른 새로운 용도에 대해서는 이미 공지된 바 있다. 예를 들어 본 명세서 참고 문헌에 모두 포함된 Whitlow, M. 외, Protein Engng, 7:pp1017~1026(1994); Hoogenboom, H. R. 외 Nature. Biotech., 15:pp125~126(1997); 그리고 WO 93/11161과 공유 미국 특허 5,869,620호, 6,025,165호, 6,027,725호, 6,103,889호, 6,121,424호, 6,515,110호를 참조하라
위에서 언급한 단일 사슬 폴리펩티드와 같은 펩티드들과 그 융합 단백질들은 비록 포유동물에서 의미 있는 항원성을 가지는 것으로 드러나지는 않았으나 순환 수명을 늘리고 항원 반응의 가능성을 더한층 줄이는 것이 바람직하다고 업계에서 판단하여 왔다. 단백질의 순환 수명을 늘리고 항원성을 줄이는 한 가지 방법은 그들을 산화 폴리알킬렌(polyalkylene oxide) 등의 고분자에 접합(conjugation)시키는 것이다. 그러나 폴리펩티드의 상대적으로 작은 크기와 그들의 섬세한 구조 대 활성 연관성 때문에 폴리에틸렌 글리콜 변형(modification)은 까다롭고 예측 불가능하였다.
산화 폴리알킬렌을 단백질에 공유결합시키기 위해서 고분자의 수산화기 말단은 먼저 반응성 있는 작용기로 변환되어야 한다. 이 과정을 종종 "활성화"라고 일컬으며, 그 생성물은 "활성화 PEG" 또는 활성화 산화 폴리알킬렌이라고 한다. 예를 들어 대부분의 경우, 한쪽 끝이 작용기로 끝나고 단백질 분자에 있는 아민 기에 대한 반응성이 있는 메톡시폴리(에틸렌 글리콜)(mPEG)을 사용한다.
Succinimidyl succinate PEG 유도체("SS-PEG")와 같은 몇 가지 활성화 고분자(Abuchowski 외, Cancer Biochem. Biophys., 7:pp175~186(1984))가 단백질에 도입된 바 있다. SS-PEG는 상온·상압하에서 단백질과 신속하게(30 분)반응하여 활성이 있지만 광범위하게 변형된 접합물을 생성한다. Zalipsky의 미국 특허 5,122,614호는 폴리(에틸렌 글리콜)-N-탄산 숙신이미드(succinimide carbonate)와 그 제조법에 대하여 개시한다. 이러한 형태의 고분자는 단백질 아미노산기들과 저분자량 펩티드, 그리고 유리된 아미노기를 포함하는 다른 재료와 쉽게 반응하는 것으로 알려져 있다. 단백질 아미노기와 PEG 사이를 잇는 다른 연결부로 우레탄(Verones 외, Appl. Biochem. Biotechnol., 11:pp141~152(1985)), 카르바민산염(carbamate, Beauchamp 외, Analyt. Biochem., 131:pp25~33(1983))와 기타 연결부가 알려져 있다.
그러나 위 방법과 그 밖의 방법에도 불구하고 생성되는 접합물은 그 활성을 충분히 유지하지 못한다는 사실이 종종 밝혀졌다. 예를 들어 Beauchamp 외 연구(Bioconjugate Chem., 5:pp321~326(1994))에서 재조합 단일 사슬 면역 독소를 PEG화 처리하면 면역 독소의 특이적 대상에 대한 면역 반응성을 잃게 됨을 관찰되었다. 면역 독소의 활성 상실은 면역 독소 항체 결착(結着 antibody-combining) 자리에 위치하는 두 라이신 잔기(殘其, residue)가 PEG 접합된 결과이다. 이 문제를 극복하기 위하여, Benhar 등은 이들 두 라이신 잔기를 아르기닌 잔기로 바꾼 결과, 유도체화 반응에 대한 저항성이 종전보다 3배 더 큰 활성 면역 독소를 얻을 수 있었다.
이 문제를 극복하는 다른 방법은 더 길고 더 분자량이 큰 고분자를 사용하는 것이다. 이러한 재료는 그러나 제조하기에 까다롭고 사용하기에 고가이다. 더우기 이들 재료는 쉽게 얻을 수 있는 고분자에 비하여 거의 개선된 효과를 가져오지 않는다. 또 다른 방법으로 제안되는 것이 두 가닥의 고분자를 트리아진(triazine) 고리를 통하여 단백질 아미노 기에 붙이는 것이다. 예를 들어 Enzyme, 26: pp49~53(1981)과 Proc . Soc . Exper . Biol . Med ., 188:pp364~369(1988)를 참조하라. 그러나 트리아진은 독성 물질로서 접합 후 허용량 수준으로 감소시키는 것이 까다롭다.
SCA 단백질의 3차원 구조를 검토하면, C-말단과 연결부가 항원결합 자리로부터 가장 떨어져 있다. 이 단백질이 생성 시 생체 내 글리코실화를 거칠 위치로 아미노산 잔기를 삽입하여 고분자와 연결시키기 위한 자리를 잡는 맥락에서 볼 때는 이들 위치가 따라서 이접합용 고분자가 항원결합 자리나 인근 FV 구조의 형태를 뒤틀거나 입체적으로 가로막지 않을 수 있는 곳(Wang, M. 외, Protein Engng ., 11:pp1279~1283(1998))임을 깨닫게 된다.
더 효과적인 고분자 접합을 위하여 SCA 구조 내 아미노산의 위치를 잡아주는 시도에 관해서는 본 특허 출원의 모체가 된 다음 공유 특허출원에서 기재하고 있는데, 이들은 모두 참고문헌에 포함되어 있다. 2001년 2월 26일에 출원된 미국 특허 일련번호 09/791,578호와 09/791,540호 출원에서 선택적으로 위치시킨 시스테인 올리고 라이신 잔기에 대하여 기술하고 있다.
2001년 9월 20일자 공동 출원인 미국 09/956,087호와 09/956,086호는 SCA 단백질 내에서 고분자가 선택적으로 접합될 자리로서, 글리코실화를 위하여 선택적으로 위치시킨 직렬연결과 삼중연결 아스파라긴 및 관련 자리들에 대하여 기술하고 있다. 그러나 관련 기술 분야에서 고분자를 SCA 단백질 자리에 접합하는 데에 있어서 문제를 개선하고 더 많은 선택사양을 제공하는 것 뿐 아니라 상기 단백질의 결합 활성과 특이성을 지키면서 고분자 접합의 모든 장점을 유지하게 하는 그러한 접합 화학 반응에 있어서도 개선점과 선택 사양을 제공하여야 할 필요가 여전히 남아 있다.
오랫동안 있어 온 이러한 필요를 충족하기 위하여 본 발명은 TNF-α에 결합하고 산화 폴리알킬렌 고분자에 자리 특이적으로 접합할 수 있는 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드(SCA)를 제공하는데, 이 폴리펩티드는
항체의 중사슬이나 경사슬 가변 부위의 항원 결합 부위를 갖춘 제1 폴리펩티드,
항체의 중사슬이나 경사슬 가변 부위의 항원 결합부위를 갖춘 제2 폴리펩티드 및
제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 연결하여 주는 펩티드 연결부(linker)를 갖추고 있다. 또한 이 폴리렙티드에는 산화 폴리알킬렌 고분자에 접합할 수 있는 적어도 하나의 시스테인 잔기와 적어도 하나의 항원 결합 자리가 존재하는데, 상기 시스테인 잔기는
ㄱ)중사슬이나 경사슬의 가변 부위 C-말단,
ㄴ)중사슬이나 경사슬의 가변 부위 N-말단,
ㄷ)상기 펩티드 연결부의 모든 아미노산 위치,
ㄹ)N-과 C- 양 말단,
ㅁ)상기 연결부의 둘째 위치.
ㅂ)연결부의 둘째 위치와 C-말단 양쪽 및,
ㅅ)이들을 조합한 위치 중 한 군데 또는 여러 군데에 자리잡는 것이 바람직하다. 이 중 더욱 바람직한 시스테인 위치에는 연결부의 둘째 위치, C-말단과 그 조합이 포함된다. 상기 C-말단은 자연적으로 존재하는 C-말단인 것이 바람직하지만, 그에 대한 모든 알려진 변형도 포함될 수 있다.
본 발명의 SCA는 관심 대상인 항체, 예를 들어 항TNF-α 항체가 바람직한데, 그 경사슬 및/또는 중사슬 가변부위로부터 이루어지는 경우도 가능한 예이다. 본 발명은 상기 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드나 단백질 접합물을 제공하는데, 그 접합물에는 실질적으로 항원성이 없는 산화 폴리알킬렌 등의 고분자가 포함된다. 상기 산화 폴리알킬렌은 폴리에틸렌 글리콜 또는 “PEG" 고분자인 것이 바람직하다.
이 산화 폴리알킬렌은 어느 크기라도 적당하지만, 바람직하게는 약 5,000에서 40,000돌턴인 것이 좋다. 이 산화 폴리알킬렌은 상기 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드의 시스테인 잔기에 공유결합으로 연결된 것이 바람직하다.
이 산화 폴리알킬렌은 상기 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드의 시스테인 잔기와 말레이미드, 비닐술폰, 티올, 이황화 오르토피리딘 및/또는 요오드화아세트아미드 연결부와 같은 연결부를 통하여 이어지는 것이 바람직한데, 그 중 말레이미드 연결부가 가장 바람직하다.
본 발명의 고분자 접합 실시예에서 그 산화 폴리알킬렌은 적어도 둘 이상의 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드에 접합되는 구성도 가능한데, 이때 각 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드는 같거나 다를 수 있다. 또한 한편으로 상기 접합물, 예를 들어 산화 폴리알킬렌이나 SCA 혹은 양쪽 모두는 추가적 기능 부위, 예를 들어 감지가능한 표지에 접합되거나 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴 클레오티드와 그로 이루어진 복제 가능한 발현 벡터 그리고 이 발현에 적합한 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 SCA 단백질은 어떠한 적합한 선행 기술 방법이나 과정을 통하여 생산되어도 무방하나, 여기에 예시한 대로 SCA 암호화 발현 벡터를 갖춘 숙주 세포를 배양하고 이어서 숙주 세포가 발현한 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드를 수집하는 방법으로 생산하는 것이 바람직하다.
본 발명은 나아가 이량체, 삼량체, 사량체 등과 같은 형태로 다중 결합가 항원결합성 단백질로서 자리 특이적 접합을 할 수 있는 둘 이상의 상기 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드로 구성된 단백질을 마련한다.
본 발명의 다중 결합가 단백질은 각 SCA 단백질이 공유 또는 비공유결합 연결부, 예를 들어 펩티드, 이황화결합과 기타 연결부로 연결되는 방식의 선행 기술에 따라 만들 수 있다. 이와 관련 가능한 대안으로서 상기 단백질은 각 구성 SCA 폴리펩티드를 환원시키고 재접힘시킴으로써 비공유결합 연결부의 방식으로 회합시킬 수 있다. 이 대안에서는 각 구성 SCA 폴리펩티드의 펩티드 연결부의 잔기 수가 2에서 18개에 이르는 것이 바람직하다.
이 발명은 나아가 하나 또는 여러 개의 상기 구성 SCA 폴리펩티드에 상기 시 스테인 잔기가 놓이고 한 폴리펩티드로 암호화되는 다가(=다중 결합가) 단백질을 제공한다. 그러한 단일 사슬 다가 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 일부분으로 고려할 것이다.
본 발명의 SCA와 고분자 접합물을 사용하는 방법 역시 마련하고 있다. 단순한 사례로서 그러한 방법 중 하나를 들자면, 본 발명의 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드 또는 다가 단백질을 갖춘 시약으로 시료를 처리하는 단계와 상기 폴리펩티드 또는 다가 단백질이 TNF-α에 결합하였는지 검출하는 단계로 구성된, 시료 내 TNF-α검출 방법이 있을 수 있다. 여기서 본 발명의 폴리펩티드나 다가 단백질은 산화 폴리알킬렌 고분자에 접합된 것이 유리하다.
위에 언급한 모든 방법에서 그 접합물인 SCA 혹은 고분자는 고형 기질에 고정되는 선택 사양이 있을 수 있다.
본 출원에서는 포유동물, 예를 들어 인간의 질환이나 이상을 치료하고 예방하는 방법으로서, TNF-α에 결합하는 상기 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드를 체내 TNF-α의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 양만큼 포유동물에게 투여함으로써 TNF-α 관련 독성을 억제하는 방법 또한 제공하고 있다. 본 발명의 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드 및 또는 그 고분자 접합물의 투여량은 약 10μg/kg에서 4,000μg/kg에 이르며 더욱 바람직하게는 20μg/kg에서 800μg/kg에 이르며, 가장 바람직하게는 20μg/kg에서 400μg/kg에 이르는데, 투여 방법으로는 임상적 반응을 가져오는 데 필요한 1회 투여량을 반복하는 어떠한 선행 기술의 전신성 투여방법도 무방하다.
본 발명의 항TNF-α 폴리펩티드, 단백질과 고분자 접합 화합물을 이용하여 전신성 질환 뿐 아니라 국부적 상황을 치료하기 위하여서는, 체강(體腔 body cavity)내 관류(灌流 perfusion), 흡입 또는 비내(鼻內) 경로에 의한 투여법과 함께 국부 투여 역시 고려할 수 있다. 그러한 임상 질환으로는 항TNF-α 치료에 반응하는 독성 쇼크 증후군과 선행기술로 알려진 다른 염증 현상이 포함된다.
이에 따라 본 발명은 용이하게 고분자(예를 들어 실질적으로 항원성이 없는 고분자)에 자리 특이적으로 접합하도록 선택된 인조 작용기를 가지는, 향상된 항TNF-α 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드 및 / 또는 그러한 폴리펩티드로 이루어지는 다중 결합가 단백질을 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드와 고분자의 접합물과 그를 제조하고 사용하는 방법 역시 제공한다.
본 발명은 단일 사슬 항원결합성 단백질(SCA) 또는 단일 사슬 가변 조각 항체(“sFv”)가 그 내부의 특정 위치에서 적절한 산화 폴리알킬렌 고분자에 접합되는 경우 그 특성이 개선된다는 발견과 넓은 차원에서 연관된다. 본 발명의 SCA는 그러한 특정 위치에서 선택적으로 고분자와 접합할 수 있도록 하는 작용기를 포함하도록 가공된다. 널리 고분자 접합의 이점으로는 생체 내 항원성의 실질적인 감소, 투여시 사람이나 동물 환자내 순환 반감기의 증가를 포함한다. 본 발명의 SCA에서 비롯한 접합물이 어떻게 그 바람직한 특성을 가지는가에 대한 어떠한 이론이나 가설에 구속되기 위한 것이 아니지만, 그러한 결합 자리들을 폴리펩티드 사슬(들)상의 선택된 위치에 가공함으로써 항원 결합 작용과 사슬의 3차원 구조에 대한 접합 고분자의 간섭을 피하거나 최소화할 수 있다고 생각되고 있다.
본 발명의 기술 범위를 좀 더 잘 이해하기 위하여 다음 용어들을 정의한다. “단일 사슬 항원결합성 분자(single-chain antigen-binding molecule, SCA)” 또는 “단일 사슬 Fv(sFv)”는 달리 명시하지 않는 한 본 명세서에서 교환하여 쓰일 수 있다. “단백질”과 “폴리펩티드”라는 용어도 달리 명시하지 않는 한, 서로 바꿔 쓸 수 있다. 널리 SCA는 항체 VL(또는 VH)의 가변 부위로 이루어지는 제1 폴리펩티드의 결합부가 항체 VH(또는 VL)의 가변 부위로 이루어지는 제2 폴리펩티드의 결합부와 양 폴리펩티드를 이어주는 펩티드 연결부에 의하여 단일 폴리펩티드 사슬로 연결되며, 상기 제1 폴리펩티드는 그 연결부에 N-말단 쪽이고 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드와 연결부에 대하여 그 C-말단쪽에 위치하는 구성을 일컫는다.
SCA는 따라서 폴리펩티드 연결부에 의하여 이어진 한 쌍의 가변 부위를 갖추고 있다. 이들 부위는 경사슬과 중사슬 가변 부위 짝이 적절한 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)과 짝을 이루는 것처럼 서로 회합할 수 있다. 이 경우 단일 사슬 단백질은 널리 “단일 사슬 항원결합성 단백질” 또는 “단일 사슬 항원결합성 분자” 또는 “단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드”로 일컫는다. 앞서 밝힌 바와 같이 SCA는 그 결합가가 "단가"이거나 "다가"일 수 있다. 단가 SCA는 오로지 한 항원결합 자리, 즉 폴리펩티드에 의하여 연결되는 한 쌍의 가변 부위들이 모여 이루는 항원결합 자리를 가지도록 가공된다. 다가 SCA는 적어도 두 항원결합 자리, 즉 둘 이상의 앞서 설명한 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드를 포함하는, 폴리펩티드 연결부로 연결된 두 쌍 이상의 가변 부위를 가지도록 가공된다. SCA 구성 단위들을 서로 모으는 데에는 어떠한 알려진 선행 기술을 써도 무방하다.
한 실시예에서 본 발명에 의한 다가 단백질들은 서로 공유결합이 아닌 방식으로 회합하여 항원결합성 단백질로 완전한 기능을 유지하는 두 개 이상의 SCA를 포함한다. 다른 실시예에서 다중 결합가 단백질들은 공유결합 연졀부, 예를 들어 선행 기술의 펩티드나 비펩티드 연결부를 통하여 회합한 둘 이상의 SCA를 포함한다. 게다가 다중 결합가 단백질, 예를 들어 여러 개의 SCA로 형성된 단백질은 단가 SCA와 유사하지만 두 개 이상의 서로 같거나 다른 SCA 영역을 가지는 단일 펩티드 사슬로서 세포 내 발현되거나 합성될 수 있다.
SCA는 VL이 N-말단 영역이고 연결부가 그 다음에 오며 VH가 그에 이어지지도록(VL-연결부-VH 구조) 짜인다. 또 다른 실시예에서는 SCA의 VH가 N-말단이고 그 다음 연결부와 VL이 차례로 따라오도록(VH-연결부-VL) 구성하게 된다. 바람직한 실시예는 VL을 N-말단 영역에 가진다(Anand, N. N. 외, J. Biol . Chem ., 266, pp 21874~21879(1991) 참조). 여러 개의 연결부를 가지도록 택할 수도 있다.
본 명세서에서 참조 문헌으로 제시하는 Ladner 외 미국 특허 4,946,778호, 5,260,203호, 5,455,030호와 5,518,889호 그리고 Huston 외 미국 특허 5,091,513(생합성 항체 결합 자리(BABS))에 단일 사슬 항원결합성 단백질의 이론과 제조에 대한 기술을 찾을 수 있다. 상기 특허에 따라 제조한 SCA는 상응하는 Fab 조각에 실질적으로 유사한 결합 특이성과 친화도를 가진다.
가변 영역( F V )
본 발명의 SCA는 원하는 모든 자연적, 인공적 항체로부터 선택·유도·모방되는 가변 영역(FV)으로 이루어진다. 다른 바람직한 실시예에서 본 발명에 쓰일 FV는 순열(permutation) 라이브러리로부터 원하는 결합 대상에 대하여 선별하여 얻는다. 선행기술상의 단순한 사례로서, 많은 수의 단일 클론 항체(MAb)가 FV영역을 얻기 위하여 사용되었으며, 이들 모두로부터 본 발명의 SCA에 쓰일 FV를 얻을 수 있다고 생각된다. 선행기술상의 단순한 사례로서 아무런 제약 없이, 다음 MAb를 사용하여 FV 영역을 얻을 수 있다.
26-10, MOPC 315, 741F8, 520C9, McPC 603, D1.3, 쥐 phOx, 사람 phOx, RFL3.8 sTCR, 1A6, Sel55-4, 18-2-3, 4-4-20, 7A4-1, B6.2, CC49, 3C2, 2c, MA-15C5/K12G0, Ox 등(Huston, J. S. 외, Proc . Natl . Acad . Sci .(USA), 85, pp 5879~5883(1988); Huston, J. S. 외, SIM News, 38(4)(supp 11),(1988); McCartney, J. 외, ICSU Short Reports, 10:114(1990); McCartney, J. E. 외, 미출간 자료(1990); Nedelman, M. A. 외, J. Nucl . Med ., 32(supp) 1005(1991), Huston, J. S. 외, Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B, J. J. Langone 편집 Methods in Enzymology , 203: pp46~88(1991); Huston, J. S. 외, Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology, Epenetons, A. A. 편집, 런던 Chapman & Hall 출판(1993); Bird, R. E. 외, Science, 242, pp 423~426(1988); Bedzyk, W. D. 외, J. Biol . Chem ., 265, pp 18165~18620(1990); Colcher, D. 외, J. Natl . Cancer Inst ., 82, pp 1191~1197(1990); Gibbs, R. A. 외, Proc . Natl . Acad . Sci .(USA), 88, pp 4001~4004(1991); Milenic, D. E. 외, Cancer Research, 51, pp 6363~6371(1991); Pantoliano, M. W. 외, Biochemistry, 30, pp 10117~10125(1991); Chaudhary, V. K. 외, Nature, 339, pp 394~397(1989); Chaudhary, V. K. 외, Proc . Natl . Acad . Sci.(USA), 87, pp 1066~1070(1990); Batra, J. K. 외, Biochem . Biophys . Res. Comm., 171 pp 1~6(1990); Batra, J. K. 외, J. Biol . Chem ., 265, pp 15198~15202(1990); Chaudhary, V. K. 외, Proc . Natl . Acad . Sci .(USA), 87, pp 9491~9494(1990); Batra, J. K. 외, Mol . Cell. Biol ., 11, pp 2200~2205(1991); Brinkmann, U. 외, Proc . Natl . Acad . Sci .(USA), 88, pp 8616~8620(1991); Seetharam, S. 외, J. Biol . Chem ., 266, pp 17376~17381(1991); Brinkmann, U. 외, Proc . Natl . Acad . Sci .(USA), 89, pp 3075~3079(1992); Glockshuber R. 외, Biochemistry, 29, pp 1362~1367(1990); Skerra, A. 외, Bio/ Technol ., 9, pp 273~278(1991): Pack, P. 외, Biochemistry, 31, pp 1579~1534(1992); Clackson, T 외, Nature, 352, pp 624~628(1991); Marks, J. D. 외, J. Mol . Biol , 222, pp 581~597(1991); Iverson, B. L. 외, Science, 249, pp 659~662(1990); Roberts, V. A. 외, Proc . Natl . Acad . Sci .(USA), 87, pp 6654~6658(1990); Condra, J. H. 외, J. Biol . Chem , 265, pp 2292~2295(1990); Laroche, Y. 외, J. Biol . Chem ., 266, pp 16343~16349(1991); Holvoet, P. 외, J. Biol . Chem ., 266, pp 19717~19724(1991); Anand, N. N. 외, J. Biol . Chem ., 266, pp 21874~21879(1991); Fuchs, P. 외, Bio/ Technol ., 9, pp 1369~1372(1991); Breitling, F. 외, Gene, 104, pp 104~153(1991); Seehaus, T. 외, Gene, 114, pp 235~237(1992); Takkinen, K. 외, Protein Engng ., 4, pp 837~841(1991); Dreher, M. L. 외, J. Immunol . Methods, 139, pp 197~205(1991); Mottez, E. 외, Eur . J. Immunol., 21, pp 467~471(1991); Traunecker, A. 외, Proc . Natl . Acad . Sci.(USA), 88, pp 8646~8650(1991); Traunecker, A. 외, EMBO J., 10, pp 3655~3659(1991); Hoo, W. F. S. 외, Proc . Natl . Acad . Sci .(USA), 89, pp 4759~4763(1993) 참조). 이 모든 인용 문헌은 본 명세서의 참고 문헌에 포함되어 있다.
특히 미국 특허 6,258,562호에서 D2E7로 기술하고 있는 항TNF-α MAb와 Carter, P. 외, Proc . Natl . Acad . Sci .(USA), 89, pp 4285~4289(1992)에서 기술하고 있는 항erbB-2 MAb(상표 HERCEPTIN)은 본 발명의 SCA와 SCA-산화 폴리알킬렌 접합물의 가공에 있어서 예시 모델이 되었다. D2E7은 등록상표 Humira(미국 일리노이주 Abbott Park소재 Abbott Immunology사)로 시판되고 있다. 또한 CC49 MAb도 美 국립 암 연구소 종양 면역 및 생물학 실험실 Jeffrey Schlom 박사 연구진에 의하여 개발되었다. CC49는 범암종 (汎癌腫 pan-carcinoma) 종양 항원 TAG-72에 특이적으로 결합한다. Muraro, R. 외, Cancer Research, 48: pp 4588~4596(1988)을 참조하라, Filpula 외 Antibody Engineering: A Practical Approach, 253~268쪽(1996년 옥스포드 대학 출판)에서 기술하고 있는 TAG-72 CC49 SCA 또한 본 발명의 예시 접합물로서 변형된 시스테인을 가지는 SCA로 제조하였다. 모든 상기 인용문헌은 본 명세서에서 참조문헌으로 포함되어 있다.
펩티드 연결부
본 발명의 SCA는 VL의 C-말단 또는 그 인근 자리로부터 VH의 N-말단 또는 그 주변 자리에 이르도록 또는 VH의 C-말단에서 VL의 N-말단에 이르도록 설계한 펩티드 연결부를 포함한다. 당업자는 연결부의 길이는 연결할 폴리펩티드들의 성질과 연결부에 의하여 생성될 융합 폴리펩티드에서 우리가 바라는 활성에 따라 결정된다는 것을 잘 이해할 것이다. 일반적으로 이 연결부는 최종 연결될 융합 폴리펩티드로 하여금 우리가 원하는 생물학적 활성, 즉 항원 결합 활성을 가지는 형태로 접힐 수 있도록 충분히 길어야 한다. 각각의 특정 사례에서 바람직한 연결부 길이는 연결할 폴리펩티드의 성질과 연결부에 의하여 생성될 융합 폴리펩티드에서 우리가 바라는 활성에 따라 결정된다.
아래에서 논하는 SCA와 같이 형태에 대한 정보를 가지고 있을 때 적절한 연결부 길이는 구성 폴리펩티드의 3차원 형태와 최종 융합 단백질의 바람직한 형태를 고려하여 어림잡을 수 있다. 그러한 정보를 가지고 있지 못한 경우, 적절한 연결부 길이는 여러 가지 길이의 연결부를 가지는 일군의 융합 폴리펩티드에 대해서 우리가 원하는 생물학적 활성을 검사하는 방식으로 실험적으로 정할 수 있다. 그러한 연결부는 본 명세서에서 참조문헌으로 포함하는 WO 94/12520에 자세히 기재되어 있다.
SCA 폴리펩티드를 구성하기 위한 펩티드 연결부의 아미노산 잔기 수는 2에서 50개에 이르고, 바람직하게는 약 2에서 10개에 이른다. 다른 어떤 실시예에서는 연결부 잔기 수가 10에서 30개에 이른다. 몇몇 더 바람직한 실시예, 특히 둘 이상의 비공유결합 방식으로 회합한 SCA 폴리펩티드를 갖춘 다중 결합 단백질에서는 연결부 잔기 수가 2에서 20개에 이른다. 더욱 바람직하게는 그러한 연결부에는 세린 또는 글리신이 풍부하다.
연결부는 유연하도록 설계되며, 글리신과 세린 잔기가 교대하는 바탕 서열을 가지는 것을 추천할 만하다. 연결부와 그에 딸린 단일 사슬 FV 단백질의 용해도를 향상시키기 위해서, 세 하전된 잔기, 두 개의 양으로 하전된 라이신(K)과 하나의 음으로 하전되 글루탐산(E) 잔기가 포함될 수 있다. 바람직하게는 이 중 한 라이신 잔기는 VH의 N-말단에 가까이 놓여서 VH와 연결부 사이의 펩티드 결합 형성시에 잃게 되는 양전하를 대신하는 것이 좋다. 그러한 연결부는 본 명세세에서 참조문헌으로 포함하고 있는 미국 공유 특허 5,856,456에서 자세하게 다루고 있다. 또한 본 명세세에서 참조문헌으로 포함시킨 Whitlow, M. 외, Protein Engng ., 7: pp 1017~1026(1994)을 참조하라.
본 발명의 다가 항원결합성 단백질을 형성하는 데는 둘 이상의 SCA 폴리펩티드들이 서로 공유 또는 비공유결합적으로 회합하는 것이 선호된다. 비록 다가 SCA를 25 개가 넘는 잔기 수를 가지는 연결부를 써서 만들 수 있지만 그들은 대체로 불안정하다. 최근 Holliger, P. 외, Proc . Natl . Acad . Sci ., 90: pp 6444~6448(1993)에서 잔기 수가 0에서 15에 이르는 연결부가 이가 FV의 형성을 촉진한다는 것을 밝혔다. 본 명세서에서 참조문헌으로 포함한 Whitlow, M. 외, Protein Engng ., 7: pp 1017~1026(1994)와 Hoogenboom, H. R. 외, Nature Biotech., 15: pp 125~126(1997)과 WO 93/11161을 참조하라.
자리 특이적으로 PEG 화된 서열의 동정과 합성
본 발명은 티올(thiol) 작용기, 즉 티올을 함유하는 아미노산 잔기로서 VL과 VH의 특정 위치, 폴리펩티드의 C-말단(VL, VH 또는 인근 자리), 폴리펩티드의 N-말단(VL, VH 또는 인근 자리), 제1과 제2 폴리펩티드 부위의 연결부 또는 이들 위치를 조합한 곳에 자리잡은 것을 제공한다. 본 발명에서 고분자 접합을 위한 특정 자리는 폴리펩티드 연결부, SCA C-말단이나 그 인근 그리고 바람직하게는 연결부의 둘째 위치에 자리잡을 수 있다.
상기 티올 함유 작용기는 자연 아미노산 및/또는 비자연적 아미노산과 그들에 티올 작용기를 부가한 것을 포함하는 기존 선행기술 어떤 것이라도 무방하다. 바람직한 실시예에서 상기 티올 작용기는 시스테인 잔기이다. 이는 SCA 단백질이 보통 내포(內包 buried)된 두 개의 이황화결합을 가지고 있지만 유리(遊離 free)된 시스테인이 전혀 없기 때문에 바람직하다(Padlan EA, 1994, Antibody-Antigen Complexes, R. G. Landes Company, Austin). 따라서 티올에 선택적으로 반응하는 활성화 고분자와 접합하는 것은 오직 가공한 시스테인 티올 뿐이다.
여러 위치에 시스테인 자리를 도입하는데 쓰일 특정한 뉴클레오티드 서열은 자연 뉴클레오티드 서열에 따라 정해진다. 가장 바람직한 자리는 앞서 설명한 입체적(steric) 요건을 만족하면서 시스테인 삽입 자리를 만드는데 필요한 변화를 최소한으로 줄일 수 있는 곳이다. 물론 유전 부호의 중복성 때문에 어떤 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 여러 개가 있을 수 있다.
특정 위치 돌연변이화를 위한 어떠한 선행기술도 자연 단백질 서열을 상기 시스테인 포함 서열로 바꾸는 데 쓰일 수 있다. 그 돌연변이 단백질 유전자는 세균 세포, 효모 세포 또는 다른 곰팡이 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포와 같은 발현 시스템에 도입된다. 이 돌연변이 단백질은 이제 단백질을 얻기 위한 표준적인 방법에 따라 정제된다.
바람직하게는 SCA 뮤테인(mutein)을 발현하는 핵산 분자를 올리고뉴클레오티드 특정 위치 돌연변이화 방법을 써서 제조한다. 특정 자리 시스테인 뮤테인을 제조하기 위한 그러한 방법과 클론된 DNA의 돌연변이화를 위한 관련 기술은 선행기술로 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 참조문헌으로 삼고 있는 뉴욕주 Cold Spring Harbor 소재 Cold Spring Harbor 실험실 발간(1989) Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual과 John Wiley&Sons 발간(1987) Ausubel 외 편집, Curren Protocols in Molecular Biology를 보라.
숙주 세포와 벡터
관심 대상인 SCA의 뉴클레오티드 서열을 돌연변이화하여 원하는 위치에 시스테인 잔기를 도입하였을 때, 그 돌연변이된 핵산은 적절한 벡터에 삽입되는 것이 바람직한데, 이때 SCA를 암호화하는 뉴클레오티드는 전사 발현을 그에 딸린 조절 서열의 작용에 의하여 제어받는다. 이에 관한 방법은 원하는 숙주 세포에서 SCA의 생산을 최적화하기 위한 선행기술로부터 선택하는 것이 바람직하다.
비록 많은 진핵 숙주 세포가 바람직하지만, SCA는 진핵이나 원핵 숙주 세포로부터 발현되고 생산된다는 것이 알려져 있다. 바람직한 원핵 숙주 세포에는 바실러스(Bacillus), 방선균(Streptomyces), 연쇄상구균(Streptococcus) 및/또는 대장균이 속하지만 이에 국한되지는 않는다. 바람직한 진핵 숙주 세포에는 효모 또는 기타 곰팡이 세포, 곤충 세포 및/또는 포유류 세포가 속한다. 이 중에는 생체 내(in vivo ) 또는 조직 배양하는 사람 또는 영장류 세포도 포함되는 것이 좋다. 좀 더 바람직하게는 본 발명의 SCA는 Pichia pastoris와 같은 형질전환된 효모를 사용하여 생산할 수 있다. 선택사양으로서 숙주 세포 내에서 과도적으로 발현(transient expression)하거나 숙주 세포 유전체에 삽입하여 변형세포주(transformed cell line)을 만들기 위한 발현 벡터도 생각할 수 있다.
이 돌연변이 단백질을 정제하기 위하여 표준 단백질 정제 방법을 사용한다. 자연 단백질 정제 방법에 단지 약간만 변형을 주어도 충분하다. 예를 들어, 벡터, 숙주 세포, 생산 방법을 선택하는 일과 단가·다가·융합 형태 단백질, 특히 SCA 폴리펩티드의 단리와 정제는 예를 들어 본 명세서에서 참조문헌으로 제시하는 공유 미국 특허 4,946,778호와 6,323,322호에 자세하게 기재되어 있다.
한 바람직한 실시예에서 관심 대상인 SCA를 암호화하는 핵산 분자와 선택 표지자(selection marker)는 숙주세포 유전체에 단일 벡터나 공동으로 도입되는 복수의 벡터로서 통합된다. 이 표지자는 숙주 세포의 종속 영양성(auxotrophy)를 보완하거나(통상적인 효모 종속 영양성 표지자인 his4, leu2, ura3 등), 항생제 저항성을 주거나 구리나 그와 비슷한 중금속에 대한 내성을 부여할 수 있다. 이 선택 표지 유전자는 발현될 SCA DNA에 직접 연결되거나, 같은 세포에 공동 유전자 이입(co-transfection)을 통하여 도입할 수 있다. 도입한 핵산을 안정적으로 통합한 세포는 특정 시스템에서 상기 표지자가 부여하는 생존 또는 다른 효과를 통하여 선택할 수 있다.
또 다른 실시예에서 관심 대상 SCA는 수용 대상인 숙주 세포에서 자가 복제를 할 수 있는 적절한 플라스미드 벡터가 암호화한다. 선행기술에서 광범위하게 알려진 어떠한 벡터라도 이 용도로 사용할 수 있다. 어떤 플라스미드나 바이러스성 벡터를 선택하는 데에 있어서 중요한 점들에는 벡터를 수용한 세포들을 그렇지 않은 세포들로부터 가려내고 분리하는 것의 난이도와 특정 숙주 세포에서 바람직한 벡터의 사본 수 그리고 서로 다른 종 사이를 오가는 셔틀 벡터로서 기능하는 것이 바람직한지 여부 등이 포함된다.
효모 벡터 시스템 가운데 어느 계열이라도 사용할 수 있다. 이러한 발현 벡터의 예에는 효모 2 마이크론 원, 발현 플라스미드 YEP13, YCP와 YRP 등과 그들의 유도체가 포함된다. 이러한 플라스미드는 당업자에게 잘 알려져 있다(Botstein 외, Miami Wntr . Symp ., 19: pp265~274(1982); Broach, J. R., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces : Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., pp 445~470(1981); Broach, J. R., Cell, 28: pp203~204(1982)).
포유류 숙주 세포에는 몇 가지 선행 기술 벡터 시스템이 있다. 한 종류의 벡터는 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 얻은, 염색체 외 플라스미드의 형태로 자가 복제할 수 있는 DNA 요소를 사용한다. 두 번째 종류의 벡터는 원하는 유전자 서열이 숙주의 염색체에 통합되는 것에 의존한다. 도입된 DNA를 안정적으로 그 염색체에 통합한 세포는 앞서 설명한 방식에 따라 표지 선택된다. 최적의 mRNA 합성을 위하여 유전자가 추가적으로 더 필요할 수도 있다. 이들 유전자에는 짜깁기(splicing) 신호와 전사 프로모터, 전사 증강자(增强子 enhancer) 그리고 종료 신호가 포함된다. 그와 같은 유전자를 포함하는 cDNA 발현 벡터들은 선행 기술로서 잘 알려진 Okayama, H. 외, Mol . Cell. Biol ., 3: 280(1983)과 그 밖의 문헌에 기재되어 있다.
세균에서 사용하는 데 바람직한 벡터에는 Qiagen社에서 구할 수 있는 pQE70, pQE60, pQE-9, Stratagene社에서 구할 수 있는 pBS 벡터, Phagescript 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, Pharmacia에서 구할 수 있는 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5가 있다. 진핵세포용 벡터로 바람직한 것들은 Stratagene에서 구할 수 있는 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG와 Pharmacia에서 구할 수 있는 pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL이 있다. Pichia 효모에서 발현시키는 용도로는 pHIL-S1와 pPIC9(모두 Invitrogen社) 벡터가 있다. 당업자에게는 다른 적절한 벡터를 찾는 일도 자명할 것이다.
상기 구성을 담지하는 벡터 또는 DNA 서열을 발현 용도로 마련한 뒤에는 그 해당 DNA를 적절한 숙주 세포에 도입하거나, 그 숙주 세포를 형질전환할 수 있다. 형질전환, 유전자 이입, 원형질체 융합(protoplast fusion), 인산칼슘 침전법, 전기 천공법이나 다른 통상적인 기술과 같은 다양한 방법을 이에 사용할 수 있다. 숙주 세포를 재조합 DNA(또는 RNA)로 형질전환한 뒤는 그 세포를 배양하고 적절한 활성을 좇아 선별한다. 해당 서열을 발현하면 본 발명의 PEG 접합물을 위한 돌연변이 SCA을 제조할 수 있다.
SCA 단백질의 제조와 정제
본 발명의 단가 또는 다가 항원결합성 단백질은 적절한 어떠한 선행 기술 제법으로도 만들 수 있다. 널리 이 제법에는 적절한 발현 벡터를 마련하고, 그 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시킨 뒤, 그 숙주 세포를 배양하고 원하는 단백질을 회수하는 것이 포함된다.
원핵세포나 재조합 단백질을 배양액으로 분비할 수 없는 세포 배양의 경우에는 수집한 세포들로부터 단백질을 얻어야 한다. 수집한 세포는 세포 용해(lysis) 처리를 받은 뒤, 세척되고 적절한 변성 용매 하에서 생성된 내포체(inclusion body)를 가용화(可溶化 solubilization) 처리를 받게 되며, 결합 기능을 가지는 단백질로서 재접힘이 일어나는 데 적절한 조건으로 희석되어 재접힘을 겪게 되고 이어서 두 단계의 이온 교환 HPLC를 거친다. 바람직한 원핵 발현 시스템에는 대장균이 포함되는데, 본 명세서에서 참조 문헌으로 삼고 있는 미국 특허 4,946,778호, 5,260,203호, 5,455,030호, 5,518,889호, 5,534,621호와 Bird 외, Science, 242: 423(1988)를 참조하라.
예시 SCA 단백질의 발현을 위한 초기 작업은 Xoma社에서 대장균 발현 시스템(araB 프로모터와 pelB 신호)을 사용하였다. 이 SCA 단백질은 성공적으로 발현되었다. 그러나 Xoma社의 시스템을 사용하여 발현된 단백질은 세포 주강(周腔 periplasm)에 머물렀기 때문에 추가적인 정제 단계를 요했을 것이다.
더 바람직한 발현 시스템은 진핵 세포에 분비 신호 서열을 가진 발현 벡터를 사용한다. 이 바람직한 실시예에서는 대장균에서처럼 불용성의 내포체로 발현된 SCA를 회수하는 수고를 덜게 된다. 강한 프로모터 서열과 높은 플라스미드 사본 수를 사용하여 원하는 단백질을 효모에서 생산하는 여러 가지 재조합 DNA 방법이 존재한다. 효모는 클론한 포유류 유전자 산물의 선도 서열을 인식하며, 선도서열이 있는 펩티드(즉 프레펩티드)를 분비한다. 이 때문에 본 명세서에서 예시하는 단백질은 모두 효모 Pichia pastoris에서 분비되어 발현되고 용액 상태에서 회수한다.
D2E7 MAb 가변 부위를 가지는 SCA 단백질
특히 바람직한 실시예에서 본 발명의 SCA 단백질은 D2E7 단일 클론 항체(MAb)의 가변 부위를 사용하여 개발하였다. D2E7 MAb는 Cambridge Antibody Technology와 BASF社에서 개발하였다. 이 항체는 사람 사이토킨인 종양 괴사인자 α(TNF-α)에 특이적으로 결합하며, 본 명세서에서 참조 문헌으로 삼고 있는 특허 6,090,382호와 6,258,562호에서 자세히 기술하고 있다. 이 항체에서 선택한 부위들은 해당 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 하나 또는 여러 개의 시스테인 잔기를 가지는 예시 SCA 분자들의 모델이 되었다.
간략하게 말하여, 염기 수가 20개에서 102개에 이르며 서로 중첩되는 합성 올리고뉴클레오티드 14개를 사용하여, 중합효소 연쇄반응으로 전적으로 합성된 유전자를 제조하였다. 나아가 올리고뉴클레오티드 특정 부위 돌연변이화를 사용하여 이 서열로부터 다른 변형 서열을 제조하였다. 그 결과로 얻은 벡터가 암호화하는 SCA는 D2E7 MAb의 가변 부위 경사슬 분절(segment)과 중사슬 분절을 온전한 길이로 가지고 있으며, 이 두 분절은 펩티드 연결부가 이어 준다. 예시된 연결부로는 “218-연결부”라고 명명한 잔기 수 18개의 연결부와 15개의 연결부가 있다.
잔기 수 18개의 “218-연결부”는 Filpula 외, 옥스퍼드 대학 출판 간(1996), Antibody Engineering: A Practical Approach, pp253~268에서 기술한 바 있다. 잔기 수 15개의 (GGGGS)3 연결부(서열번호 42)는 Huston, J. S. 외, Proc . Natl. Acad . Sci ., 85: pp5879~5883(1988)에서 기술한 바 있다. 몇몇 경우, 금속 고정화 금속 이온 친화 크로마토그래피(IMAC, immobilized metal ion affinity chromatography)로 정제 과정을 단순화하기 위하여 히스티딘 6개 짜리의 his6 꼬리(tag)가 C-말단에 덧붙여졌다. 완성된 유전자는 Applied Biosystems社(캘리포니아 Foster City 소재) 등록상표 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(기존에는 ABI/Perkin- Elmer社 제조)를 이용한 DNA 서열 확정을 위하여 대장균 플라스미드에 클론하였다. 단백질 영역의 선후 관계와 연결부 그리고 유리 시스테인의 위치는 아래 표 1에 정리하였다.
SCA 클론명 서열 번호 구 조 유리된 시스테인의 위치 도 번
2-7-SC-1 1 VL -218-VH-his6 없 음 1A
2-7-SC-2 2 VL-218-VH-his6 C-말단 1B
2-7-SC-3 3 VH-(GGGGS)3-VL-his6 C-말단 1C
2-7-SC-4 4 VL-218-VH C-말단 1D
2-7-SC-5 5 VL-218-VH-his6 연결부 둘째 위치 1E
2-7-SC-6 6 VL-218-VH-his6 연결부 둘째 위치와 C-말단 1F
2-7-SC-7 7 VH-(GGGGS)3-VL-his6 연결부 다섯째 위치 1G
2-7-SC-8 8 VL-218-VH-his6 N-과 C- 양쪽 말단 1H
2-7-SC-9 9 VH-GGGGS-VL-his6 없 음 1I
표 1에 정리한 바와 같이, 도 1A, 1B, 1C, 1D, 1E, 1F, 1G, 1H와 1I는 위 9개 유전자의 DNA와 그 암호화 폴리펩티드 서열을 나타낸다.
SCA 단백질의 재조합 발현과 정제
앞서 밝혔 듯이 앞에서 논한 SCA 변형 단백질의 제조에는 Pichia pastoris를 사용하였다. 효모 알파 교배인자(mating factor)의 신호 서열을 각 SCA 단백질의 성숙 부호 서열(mature coding sequence)의 앞에 삽입하였다. 이 신호 펩티드의 아미노산 서열은 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala∧Ala(서열번호 36)이며 “∧” 표시는 절단 부위를 말한다. 신호 펩티드의 20번째 아미노산(∧ 뒤의 알라닌) 역시 이 구성에 포함되었다. 따라서 성숙 SCA 단백질의 아미노 말단은 이 알라닌을 유지하고 뒤이어 각 예시 SCA에서 도 2A~2H(서열번호 1~9)에 기재된 각 아미노산 서열(표 1) 전체가 이어진다. N-말단 단백질 서열 분석으로 이 서열이 올바로 신호 절단 과정을 거쳤음을 증명하였다. D2E7 SCA를 발현하는 이들 돌연변이 유전자는 Pichia 전달(transfer) 플라스미드 pHIL-D2(Invitrogen社)의 Eco RI 자리에 연결되었고, 그 플라스미드로 효모 Pichia pastoris 숙주 세포 GS-115를 형질변환하였다.
이들 과정에 대한 자세한 프로토콜은 본 명세서에서 참조문헌으로 하고 있는 Invitrogen社 Pichia 발현 키트 설명 책자, 카탈로그 번호 X-1710-01(1994)에서 자세히 기재하고 있다. 발현에 대한 초기 단계는 SDS-PAGE 겔을 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색하여 평가하였다. 각 SCA 단백질에 대한 Pichia 발현 세포주의 클론 번호는 위 표 1의 2-7-SC 번호와 일치한다.
SCA 단백질(약 27kDa)은 재조합 Pichia에서 높은 수준(약 20~100mg/L)으로 발현되고 분비되었다. 환원제가 없는 SDS-PAGE 겔에서 단량체와 두 단량체가 이황화 결합으로 연결된 이량체의 존재가 확인되었다. 정제된 2-7-SC-1 SCA 단백질에 대한 토끼 항혈청을 제조하였다. 이 혈청을 사용하여 웨스턴 흡입법을 행한 결과 발현된 SCA 단백질의 동정을 확인할 수 있었다.
예를 들어, 도 8은 D2E7 2-7-SC-2와 그 PEG화 형태의 대표적은 웨스텁 흡입법 분석 결과를 나타내는데, 여기서 이 항D2E7 항혈청이 재조합 SCA 단백질과 PEG-SCA 접합물에 대하여 가지는 반응성을 확인하였다. 항218-연결부 항체를 사용하였다. 각 시료 1㎍을 4~20% 비환원 SDS-PAGE 겔로 분석하였다. 제1 항체와 제2 항체는 각각 토끼에서 키운 항18-연결부 항체와 염소 항토끼 항체 양고추냉이 과산화효소 접합물(horseradish peroxidase conjugate)이다. 효소의 기질은 Moss社의 TMBM 과산화효소 기질이었다. D2E7 2-7-SC-2는 C-말단에 PEG가 있고, 2-7-SC-5는 218 연결부에 PEG가 있다. 단백질띠 A는 2-7-SC-2이고, 단백질띠 B는 2-7-SC-5이고, C는 PEG(20k)-2-7-SC-2이고, D는 PEG(20k)-2-7-SC-5이며, E는 PEG(40k)-2-7-SC-2이고, 단백질띠 F는 PEG(40k)-2-7-SC-5이다.
SCA 단백질은 Pichia pastoris 상층액으로부터 두세 단계의 크로마토그래피를 거쳐 95% 이상의 순도로 정제하였다. his6 꼬리를 가진 SCA 단백질(서열번호 43)의 경우, 투석한 발효 배양액은 diafilter로 거르고나서, DEAE 컬럼을 통과시켰고, 그 다음 IMAC 니켈 친화 컬럼(Qiagen社)에 결합시켰다. 결합한 SCA 단백질은 이미다졸(imidazole)로 용리시켰다. 그 용리액은 다시 둘째 DEAE 음이온 교환 컬럼을 통과시켰다. 그 유출액은 SCA 단백질의 농축을 위해 diafilter로 걸러졌고 특성 분석이 뒤따랐다. his6 꼬리가 없는 SCA 단백질(서열번호 43)의 경우, SCA 단백질은 Pierce Biotechnology社에서 구한 단백질 L-agarose 컬럼으로 낮은 pH에서 정제되거나, Amersham Pharmacia社(뉴저지주 Piscataway)로부터 구한 HS 양이온 교환 크로마토그래피 후 이어진 염 구배(勾配 gradient)로 용리시키고 diafiter로 걸러졌다. HS 크로마토그래피 방법이 선호된다.
도 2A와 2B는 2-7-SC-2 클론의 발현과 정제 데이터를 나타내는데, 여기에는 분획을 쿠마시 블루로 염색한 SDS-PAGE 겔 분석 결과와 각 단계별 수득율이 포함된다. 약 54kDa 크기의 이황화 결합 연결 이량체 소량을 염색한 겔에서 관측할 수 있다.
티올 -특이적 활성화 고분자
본 발명의 SCA는 티올-특이적 활성화 고분자에 연결되는 것이 바람직하다. 구체적으로 본 발명에 사용되는 활성화 고분자는 최소한 한 개 이상의 말단에 황화수소기 또는 티올기 선택적 말단 연결기를 이용하는 것이 바람직하다. 몇 가지 선행기술상의 고분자, 예를 들어 유리된 티올과 반응하는 산화 폴리알킬렌(polyalkylene oxide, PAO) 고분자는 쉽게 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 반응성 작용기들의 예로는 말레이미드(maleimide), 비닐술폰(vinlysulfone), 티올(thiol), 이황화 오르토피리딘(orthopyridyl disulfide), 요오드화아세트아미드(iodoacetamide)를 들 수 있는데, 말레이미드기가 티올에 대하여 고도로 특이적이고 접합 반응이 상온, 상압에서 일어난다는 점에서 말레이미드 활성화 폴리에틸렌 글리콜(PEG-mal, polyethylene glycol)이 더 선호된다. 또한 본 명세서의 참조 문헌인 공유 미국 특허 5,730,990호를 보라. 황화수소기에 선택적인 활성화 PEG-고분자를 더 구하자면 본 명세서에서 참조문헌으로 포함한 2001년 Shearwater社 카탈로그에 도시된 Nektar Therapeutics社(기존 Shearwater社)에서 구할 수 있다. 또한 본 명세서에서 참조문헌으로 삼고 있는 Goodson, R. J.와 Katre, N. V.의 Bio/Technology, 8:343(1990)과 Kogan, T. P.의 Synthetic Comm ., 22: 2417을 보라.
선형 고분자로 mPEG-MAL(5 kDa, 예를 들어 Shearwater 카탈로그 번호 2D3X0T01)과 mPEG-MAL(20 kDa), 가지 친 고분자로 mPEG2-MAL(40 kDa, 예를 들어 Shearwater 카탈로그 번호 2D2M0H01) 등이 본 발명의 SCA와 접합물을 이루는 것이 본 명세서에 사례로 소개되어 있다. 이 말레이미드-PEG 고분자의 구조와 접합 화학은 편의상 도 3A~3E에서 mPEG-비닐술폰에 대하여 도시하고 있다. 다양한 말레이미드 활성화 고분자는 도 3E에서 나타낸 것처럼 유리된 티올과 쉽게 반응한다. 도 3E에서 "SCA"는 적어도 한 유리된 티올기를 가지는 본 발명의 단백질이다. 아래 표 2를 참조하라.
도 번 설 명 Nektar/Shearwater 카탈로그 번호
3A mPEG-MAL 2D2M0H01, 2D2M0P01
3B mPEG2MAL 2D3X0T01
3C mPEG(MAL)2 2D2D0H0F, 2D2D0P0F
3D mPEG2(MAL)2 카탈로그 10쪽
3F mPEG 비닐술폰
황화수소기 특이적 연결부가 속하는 다른 고분자 사용 접합물로 공중에게 양도된 미국 특허 5,643,575호, 5,919,455호, 6,113,906호(U-PEG), 6,153,655호, 6,395,266호(말단에서 가지침이 있는 PEG), 6,251,382호(polyPEG)에서 개시된 것과 USSN 10/218,167호(bicines)를 들 수 있다. Shearwater Polymers社 카탈로그 “Polyethylene Glycol and Derivatives 2001" 또한 참조하라. 상기 각 공지발명은 본 명세서에서 참조문헌으로 포함하고 있다.
앞서 밝힌 대로, 접합물의 고분자 부분은 산화 폴리알킬렌인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 상기 고분자 부분은 실질적으로 비항원성인 폴리에틸렌 글리콜인 것이 좋다. 비록 PAO와 PEG의 그 무게 평균 분자량이 크게 변화할 수 있지만, 본 발명에 포함된 조성물은 대부분의 경우에 고분자 부분만 2,000에서 136,000 Da의 무게 평균 분자량을 가진다 . 더 바람직한 것은 상기 고분자가 무게 평균 분자량으로 3,000에서 100,000 Da에 이르는 것이다 . 가장 바람직하게는 상기 고분자 부분은 무게 평균 분자량이 약 5,000에서 40,000 Da에 이른다.
본 명세서에서 다루는 고분자 물질은 실온에서 수용성인 것이 바람직하다. 그러한 고분자의 명단으로서 몇 가지만 들자면 폴리에틸렌 글리콜이나 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 동종중합체(homopolymer), 폴리옥시에틸렌화 폴리올(polyoxyethylenated polyol), 그들의 공중합체 외에 블록 공중합체의 수용성이 유지된다는 전제하에 그들의 블록 공중합체를 들 수 있다. 라이신이나 히스티딘이 아닌 유리된 시스테인과 말레이미드 고분자 사이의 특이적 반응성은 말레이미드를 이들 각 아미노산과 반응시켜 확인하였다.
도 4는 활성화 PEG-MAL과 시스테인의 반응성을 확인한다. 3mM 용액으로서의 시스테인 흡광도는 곡선 A로 나타내었다. 1mM 용액에서의 활성화 PEG-MAL의 흡광도 곡선은 곡선 C이며 300nm 부근의 넓은 흡광 봉우리가 그 특징이다. 흡광도 곡선 B는 시스테인 용액과 PEG-MAL 용액을 1:3으로(1mM PEG-MAL과 3mM 시스테인, 100mM 인산나트륨, pH 6.0, 1mM EDTA, 25℃) 혼합하여 얻은 것이다. 곡선 B는 우측으로 쏠린 채로 곡선 A를 따라가지만, 특징적인 300nm의 넓은 PEG-MAL 봉우리는 가지고 있지 않아서 시스테인과 활성화 PEG-MAL 사이의 반응성을 증명한다. 히스티딘과 라이신에 대하여 비슷한 흡광도 곡선을 비교하면(데이터 미기재), 본 발명의 조건 하에서 이들 아미노산은 그다지 반응성이 높지 않음을 알 수 있다.
표지 달린(labeled or tagged) 접합물
본 명세서에 의하여 SCA에 접합한 산화 폴리알킬렌을 제조하고 나서 그 접합물은 추가적으로 진단용 시약이나 치료용 시약에 접합되거나 연결될 수도 있다. 본 발명의 항체 접합물을 제조하는 일반적인 방법은 본 발명의 참조문헌인 Shih, L. B. 외, Cancer Res., 51: 4192(1991)과 Shih, L. B.와 Goldenberg, D. M.의 Cancer Immunol . Immunother ., 31: 197(1990)와 Shih, L. B.외, Intl . J. Cancer, 46: 1101(1990)와 Shih, L. B. 외, Intl . J. Cancer, 41:832(1988)에서 기술하고 있다. 이러한 간접적 방법은 산화 폴리알킬렌 부분에 작용기를 가진 항체(또는 SCA)에 하나 또는 여러 개의 생활성 분자를 지닌 담지체 고분자를 반응시키는 것을 요체로 하는데, 이러한 생활성 분자에는 펩티드, 지질, 핵산(즉 인산-라이신 복합체), 약물, 독소, 킬레이트제, 붕소 가수(假睡 addend) 또는 감지가능한 표지 분자 등이 있다.
몇몇 대안적 실시예에서는 SCA 접합 산화 폴리알킬렌은 진단용 또는 치료용 제제에 직접 연결되거나 접합된다. 여기서 일반적인 방법은 상기 간접 접합 방식과 유사하나, 진단용 또는 치료용 제제가 산화된 sFV 부분에 직접 붙어 있다는 점이 다르다. 본 명세서의 참조문헌인 Hansen 외 미국 특허 5,443,953호를 보라.
약학적 조성물과 SCA 및/또는 SCA -고분자 접합물의 투여
본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물을 "치료에 효과적인 양"이나 "예방에 적합한 양"으로 포함할 수 있다. "치료에 적합한 양"이란 원하는 치료 효과를 얻기 위하여 필요한 효과적인 양을 1회 복약량으로 적절한 기간 동안 투여하는 것을 말한다. 치료에 효과적인 SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물의 양은 질환의 상태, 연령, 성별, 환자의 몸무게, 항체 또는 항체 부위가 환자 몸에 원하는 반응을 가져올 수 있는 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료에 적합한 양은 또한 항체 또는 항체 부분에 의한 독성이나 해로운 효과가 치료 효과에 비해 훨씬 적은 양을 말한다. “예방에 적합한 양”이란 예방 효과를 얻기 위하여 필요한 효과적인 양을 1회 복약량으로 적절한 기간 동안 투여하는 것을 말한다. 예방 복약량은 발병 전이나 질병의 초기 단계인 환자에 대하여 사용하므로 전형적인 예방에 효과적인 양은 치료에 효과적인 양보다 더 적다.
복약 방식은 바라는 효과(즉 예방이나 치료 효과)를 최적으로 맞추기 위하여 바뀔 수 있다. 예를 들어 환괴(丸塊, bolus)를 하나 투약할 수도 있고, 여러 차례에 걸쳐 복약량을 나눌 수도 있으며 치료의 경과에서 필요한 바에 따라 복약량을 비례하여 늘리거나 줄일 수 도 있다. 약학적 조성물은 전형적으로 적어도 하나의 결합 특이성이 있는 SCA 폴리펩티드와 약학적으로 허용되는 담지체를 갖추고 있다.
“약학적으로 허용되는 담지체”란 용어에는 생리학적으로 적합한 모든 용매, 분산매, 코팅, 항미생물제, 즉 항생제와 항진균제, 등장액(等張液 isotonic)과 흡수 지연제가 포함된다. 약학적으로 합당한 담지체에는 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 포도당, 글리세롤, 에탄올 등이 포함되며 이들의 조합도 무방하다. 많은 경우에 당류나 만니톨, 소르비톨, 폴리알콜류와 같은 등장액이나 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다. 약학적으로 적절한 담지체에는 나아가 해당 항체나 항체 부위의 보존 기간과 효능을 향상시키는 습윤제 또는 유화제, 방부제 또는 완충액과 같은 보조 물질이 포함될 수도 있다.
더 나아가 본 발명의 조성물은 다양한 형태로 마련할 수 있다. 그 보기로는 액체 용액(예를 들어 주사제와 침제 용액) , 분산액과 현탁액, 정제(錠劑), 환제(丸劑, pill), 분말, 리포좀과 좌약 등의 액체, 반고체와 고체 투약형을 들 수 있다. 이 중 바람직한 형태는 의도한 투약과 치료 방식에 좌우된다. 전형적인 모범 조성물은 주사제액이나 침제액의 형태로서, 이는 다른 항체를 사용하여 사람의 수동 면역을 일으키는데 쓰이는 것들과 비슷하다. 투여 방식 중 바람직한 것으로는 비경구 방식(예를 들어 정맥, 피하, 복강, 근육 내 투약)이 있다.
바람직한 실시예에서는 SCA나 SCA-고분자 접합물을 정맥 하 침제나 주사로 투여한다. 다른 모범 실시예에서는 상기 항체를 근육이나 피하 주사로 투여한다. 분무, 에어로졸 또는 안개 등을 통한 흡입 투여도 그러한 방식이 유리한 경우, 예를 들어 호흡기에 대한 전신적 흡수 및/또는 국부적 작용인 경우에는 고려할 수 있다.
치료용 조성물은 전형적으로 무균성이고 제조와 보관 조건에서 안정적이어야 한다. 조성물은 액상, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 약물 농도로 높이는데 적절한, 질서 구조로 구성할 수 있다. 무균성 주사액은 활성 화합물(즉 항체나 항체 부위)을 필요한 양만큼 적당한 용매에 필요한 경우는 앞서 열거한 한 성분이나 그 조합을 첨가하여 혼합한 뒤 무균 여과하여 제조할 수 있다.
일반적으로 분산액은 활성 화합물을 분산매와 앞서 열거한 필요한 다른 성분을 지니는 무균성 부형제(賦形劑, vehicle)와 혼합함으로써 제조한다. 무균성 주사액을 제조하기 위한 무균 분말의 경우에는, 그 활성 성분과, 앞서 무균 여과한 용액에 추가된 희망 성분 중 어떠한 것이라도 같이 포함하는 분말을 얻을 수 있는 진공 건조와 동결 건조법이 바람직한 제조 방식이다. 용액의 유동성은 레시틴과 같은 코팅을 사용하거나, 분산질의 경우 입자의 크기를 필요한 수준으로 유지하거나, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 수준으로 유지할 수 있다. 주사용 조성물의 장기적인 흡수는 그 조성물에 흡수 지연제, 예를 들어 모노스테아르산 염과 젤라틴을 포함시킴으로써 이룰 수 있다.
본 발명의 SCA 및/또는SCA-고분자 접합물은 비록 많은 경우 정맥주사나 침제가 바람직한 방법이긴 하지만 다양한 선행기술상의 방법으로 투여할 수 있으며, 당업자에게 자명한 사실이겠지만, 투약 방식이나 경로는 원하는 결과에 따라 달라진다.
어떤 실시예에서는 본 발명 SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물은 경구 투여, 예를 들어 비활성 희석액이나 동화성(assimilable) 식용 담지체를 통하여 할 수 있다. 상기 SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물(그리고 원할 경우 다른 성분들)은 경질이나 연질 젤라틴 캡슐에 담겨, 정제로 압축되거나 환자의 식사에 직접 포함될 수도 있다. 치료용 경구 투약의 경우 상기 화합물은 보형제(補形劑, excipient)가 덧붙여져서 내복용 정제, 구강정(buccal tablet), 트로키제, 캡슐, 엘릭시르(elixir) 제제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등으로 사용될 수 있다. 본 발명의 SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물을 비경구 투여 이외의 방식으로 투여하고자 할 때에는 상기 화합물을 코팅하거나 그 화합물의 불활성화를 막기 위한 다른 화합물과 함께 투여할 필요가 있을 수도 있다.
상기 약학적 조성물에 보조 활성 성분이 포함될 수도 있다. 어떤 실시예에서는 발명의 SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물을 하나 또는 여러 치료용 제제와 함께 조성하거나 같이 투여하여 부가적이거나 상승적인 효과 또는 질병이나 장애에 대한 보조적 치료 혹은 진단 활성을 얻을 수 있다.
항 hTNF -α SCA 및/또는 SCA -고분자 접합물의 투여
예를 들어 본 발명의 항hTNF-α SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물은 다른 목표물에 결합하는 SCA(예를 들어 다른 사이토킨이나 세포 표면 분자를 결합하는 것), 하나나 여러 사이토킨, 가용성 hTNF-α 수용체(예를 들어 PCT 간행물 번호 WO 94/06476 참조) 및/또는 hTNF-α의 활성이나 제조를 억제하는 한 가지 또는 여러 가지 화학 제제(PCT 간행물 번호 WO 93119751에 기재된 사이클로헥산-일리덴(cyclohexane-ylidene) 유도체)와 함께 조성되거나 공동 투여될 수 있다. 게다가 한 개 혹은 여러 개의 본 발명의 항hTNF-α SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물을 적어도 두 개의 상기 치료용 제제와 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 복합 요법은 투여되는 낱낱의 치료제의 양을 줄일 수 있는 이점을 가질 수 있다.
항 hTNF -α SCA 의 적용(適用, indication)과 바람직한 공동 투여제
단순한 사례를 들자면, 본 명세서의 참조 문헌인 미국 특허 6,258,562호와 6,090,382호는 TNF-α가 질환 발생 과정에서 그 주된 측면이나 보조 측면을 중개하거나 공동 중개하는 질환을 총망라하는 리스트를 제공한다. 그러한 질환과 장애를 치료하거나 증상을 완화하는 선행기술상의 약제를 본 발명의 SCA 및/또는 고분자 접합 SCA의 TNF-α 실시예와 함께 조성하거나 공동 투여하는 것도 생각할 수 있다. 간략히 말하자면 TNF-α의 작용에 의하여 중개되거나 그 작용에 관련되며 따라서 TNF-α 결합물질에 의한 치료요법이 합리적인 질환, 거기에 다른 선행기술 치료제를 병행할 수도 있는 그런 질환에 대해서 미국 특허 6,258,562는 예를 들어 패혈증, 자가면역 질환, 감염성 질환, 장기 이식/거부반응, 악성 종양, 폐질환과 장관질환을 포함하고 있다. 이들 SCF 적용 분야에 대해서 항TNF-α를 사용한 치료와 관련 있는 경우 그와 함께 조성할 수 있는 추가적인 약제에 대하여 아래 기술한다.
패혈증
패혈증에 관련된 치료 가능한 상태에는 TNF-α 중개 패혈성 쇼크 증후군(septic shock syndrome)과 그에 관련된 저혈압, 심근 억제(myocaridal suppresion), 맥관 누출 증후군(vascular leakage syndrome), 장기 괴사, 혈액 응고 다단계 과정의 활성화와 2차 독성 중개자의 방출 촉진, 내독소 쇼크(endotoxic shock), 그램 음성 패혈증과 독성 쇼크 증후군이 포함된다.
자가면역 질환
자가면역 관련 치료 가능한 상태로는 류마티스성 관절염에 의한 조직 염증과 관절 파괴, 당뇨병에서의 랑게르한스 섬세포 사멸과 인슐린 저항성, 희돌기교세포(稀突起膠細胞, oligodendrocyte)에 대한 세포독성과 다발성경화증(multiple sclerosis)에서의 염증성 플라크 유발이 포함된다. 본 발명의 항TNF-α SCA 및/또는 고분자 접합 SCA와 공동 조성하거나 투여하는 것을 고려해 볼 수 있는 약제에는 그러한 자가면역 질환을 치료할 수 있는 선행기술상의 어떠한 약제라도 포함되는데, 당질 코르티코이드계 스테로이드, 비스테이로드성 소염제(NSAID), 사이토킨 억제 소염제(CSAID), CDP-57111BAY-10-3356(인간화된 항TNF-α 항체, Celltech/Bayer社), cA2(항TNF-α 항체 키메라, Centocor社), 75kdTNFR-IgG(75 kDa TNF 수용체-IgG 융합 단백질, Immunex社, Arthritis & Rheumatism, vol. 37, S295(1994)와 J. Invest. Med ., vol. 44, 235A(1996) 참조), 55kdTNFR-IgG(55 kDa TNF 수용체-IgG 융합 단백질, Hoffmann-LaRoche社), IDEC-CE9.I/SB 210396(영장류화 비고갈성(non-depleting) 항CD4 항체, IDEC/SmithKline社) 등을 들 수 있다.
감염성 질환
감염성 질환에 연관된 치료 가능 상태에는 TNF-α 매개성 뇌염증, 말라리아의 모세혈관 혈전증과 경색증, 뇌막염의 정맥 경색, 감염시, 예를 들어 HIV 감염에 보조적으로 수반하는 악액질(惡液質, cachexia), HIV 감염시 바이러스 증식과 중추 신경계 손상의 촉진 증상, 인플루엔자와 같은 감염에 의한 발열과 근육통이 포함된다. 본 발명의 항TNF-α SCA 및/또는 고분자 접합 SCA와 공동 조성되거나 투여할 수 있는 제제로서는 예를 들어 항생제, 항균제, 항바이러스제 등 뿐만 아니라 비스테로이드성 소염제(NSAID) 및/또는 감염인자나 감염인자의 독소 또는 필수 부분에 결합하는 항체 혹은 SCA를 포함하는 어떠한 선행기술상의 항감염 제제라도 고려할 수 있다.
장기 이식
장기 이식과 그 거부 반응 또는 면역 억제제에 의한 부작용과 관련된 치료 가능한 상태에는 TNF-α 매개성 동종이식 거부 반응과 이식편대숙주 질환(移植片對宿主, graft versus host disease)와 같은 몇몇 장기 이식 관련 증상이 있다. 본 발명의 항TNF-α SCA 및/또는 고분자 접합 SCA와 공동 조성되거나 투여할 수 있는 치료제로 당질 코르티코이드계 스테로이드, OKT3 유발성 반응을 억제하기 위한 사이클로스포린 A, FK506 및/또는 OKT3와 항체나 SCA와 같이 면역 세포 수용체에 결합하는 물질을 들 수 있는데, 이러한 물질의 결합 목표로는 CD25(IL-2 수용체-α), CD111a(LFA-1), CD54(ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80(B7-1) 및/또는 CD86(B7-2) 등이 있다.
악성 종양
악성 종양 관련 치료가능한 질환으로는 TNF-α 매개 악액질, 종양 생장,악성 종양의 전이 가능성고 세포 독성 등이 포함된다. 본 발명의 항TNF-α SCA 및/또는 고분자 접합 SCA와 공동 조성되거나 투여할 수 있는 치료제로 모든 선행기술상의 항암제나 항종양제를 고려할 수 있다.
폐 질환
폐 질환 관련 치료가능한 상태로는 성인 호흡 곤란 증후군, 쇼크성 폐(shock lung), 만성 폐염증질환, 폐 사르코이드증(pulmonary sarcoidosis), 규폐증이 포함된다. 폐질환에는 본 발명의 항TNF-α SCA 및/또는 고분자 접합 SCA가 모든 표준적인 흡입 시스템을 통하여 경구, 비강 스프레이 또는 에어로졸 조성에 의하여 투여하기로 선택할 수도 있다. 그러한 조성물은 상기 폐질환이나 장애를 치료하는 데 적절한 다른 약제나 SCA 조성물의 기관지 접근을 촉진하는 제제와 함께 조성하거나 투여할 수 있다.
장관 질환
장관 질환 관련 치료가능한 상태에는 염증성 장관 질환, 예를 들어 Crohn 병과 또는 궤양성대장염이 널리 포함된다. 본 발명의 항TNF-α SCA 및/또는 고분자 접합 SCA와 공동 조성되거나 투여할 수 있는 치료제로 부데노사이드(budenoside), 표피 성장인자(epidermal growth factor), 코르티코이드계 스테로이드, 사이클로스포린, 설파살라진(sulfasalazine), 아미노살리실산(aminosalicylate), 6-메르캅토퓨린(6-mercaptopurine), 아자티오프린(azathioprine), 메트로니다졸(metronidazole), 리포옥시제나아제(lipooxygenase) 억제제, 메살라민(mesalamine), 올살라진(olsalazine), 발살라자이드(balsalazide), 항산화제, 트롬복산(thromboxane) 억제제, IL-1 수용체 길항제, 항IL-1β 단일클론 항체, 항IL-6 단일클론 항체, 성장 인자, 엘라스타아제(elastase) 억제제, 피리딘화이미다졸(pyridinyl imidazole)화합물, CDP-571/BAY-10-3356(인간화도니 항TNF-α 항체, Centocor社), 75kdTNfR-IgG(75 kDa TNF 수용체-IgG 융합 단백질, Immunex社), 55kdTNfR-IgG(55 kDa TNF 수용체-IgG 융합 단백질, Hoffmann-LaRoche社), 인터루킨-10(SCH 52000, Schering Plough社), IL4, Il-10 및/또는 IL4 작용제(agonist), 인터루킨-11, 글루쿠로니드(glucuronide) 혹은 덱스트란 접합 프레드니솔론(prednisolon) 전구약물, 덱사메타손 또는 부데소나이드, ICAM-1 안티센스 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 올리고디옥시뉴클레오티드(ISIS 2302, Isis Pharmaceuticals社), 가용성 보체 수용체 1(TP10, T Cell Sciences社), 서방성 메살라진, 메토트렉세이트(methotrexate), 혈소판 활성 이자(PAF) 길항제, 시프로플록사신(ciprofloxacin)과 리그노케인(lignocaine)이 포함된다.
진단과 분석 방법 : 항 TNF -α SCA 또는 SCA 접합물
본 발명의 항TNF-α SCA 및/또는 고분자 접합 SCA를 가지고 통상적인 면역 검사로 관심 대상 시료, 예를 혈청 또는 혈장 또는 다른 임상 시료를 포함하는 생물학적 시료에서 사람 TNF-α의 존재를 검출할 수 있다. 이들 면역 검사법에는 효소연관 면역 흡착법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)와 방사 면역검사법 또는 조직 면역조직화학 검사법이 포함된다.
본 발명은 본 발명의 항체나 항체 부위로 생물학적 시료를 처리하는 단계와 hTNF-α에 결합한 항체(또는 항체 부위)를 검출하거나 미결합 SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물을 검출하여 시료 내 TNF-α의 존재를 검출하는 단계ㄹ를 갖춘 시료 내 TNF-α 검출방법을 제공한다. 상기 SCA는 결합하거나 미결합한 항체의 검출을 용이하게 하기 위하여 감지가능한 물질로 직접적으로 또는 간접적으로 표지된다. 적절한 감지가능 물질로는 다양한 효소, 보결족, 형광 물질, 발광 물질과 방사성 물질이 포함된다. 적절한 효소의 예로는 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase), 알칼리성 인산 가수분해 효소, β-갈락토오스 가수분해 효소, 아세틸콜린 분해효소가 있고, 적절한 보결족의 예로는 스트렙트아비딘/바이오틴과 아비딘/바이오틴이 있으며, 적절한 형광 물질의 예로는 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레사인(fluorescein), 이소티오시안화 플루오레사인(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 디클로로트리아진일아민 플루오레사인(dichlorotriazinylamine fluorescein), 염화 단실(dansyl chloride) 또는 피코에리드린(phycoerythrin)을 들 수 있고, 발광 물질의 예로는 루미놀(luminol)이 있고, 적절한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S 또는 3H가 포함된다.
추가적 실시예에서, 본 발명의 SCA는 표지되지 않지만 생물학적 유체 속의 hTNF-α는 경합 면역 분석법으로 분석하게 되는데, 여기서 재조합 hTNF-α 표준은 감지가능한 물질과 그에 이어 표지 없는 항hTNF-α SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물로 표지된다. 이 분석법에서 생물학적 시료와 표지된 재조합 hTNF-α 표준과 항hTNF-α SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물은 혼합된 뒤 미표지 SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물에 결합한 표지된 재조합 hTNF-α의 양을 결정하게 된다.
미국 특허 6,258,562호와 6,090,382호는 D2E7 MAb를 또한 사람이 아닌 종, 특히 영장류(예를 들어 침팬지, 비비, 명주 원숭이, 시노몰거스(cynomolgus) 원숭이와 레수스(rhesus) 원숭이), 돼지, 쥐에서 기원한 TNF-α를 검출하는데 사용할 수 있음을 지적하고 있다. 본 발명의 항TNF-α SCA 및/또는 SCA-고분자 접합물도 그 용도로 쉽게 사용할 수 있음을 고려할 수 있다.
도 1A는 VL-218-VH-his6 구조를 가지고 시스테인 뮤테인(mutein)이 있지 않은 SCA 2-7-SC-1의 단백질 서열(서열번호 10)과 그를 암호화하는 DNA 분자(서열번호 1)를 도시한다.
도 1B는 VL-218-VH-his6 구조를 가지고 C-말단에 시스테인이 있는 SCA 2-7-SC-2의 단백질 서열(서열번호 11)과 그를 암호화하는 DNA 분자(서열번호 2)를 도시한다.
도 1C는 VH-(GGGGS)3-VL-his6 구조를 가지고 C-말단에 시스테인이 있는 SCA 2-7-SC-3의 단백질 서열(서열번호 12)과 그를 암호화하는 DNA 분자(서열번호 3)를 도시한다.
도 1D는 VL-218-VH 구조를 가지고 C-말단에 시스테인이 있는 SCA 2-7-SC-4의 단백질 서열(서열번호 13)과 그를 암호화하는 DNA 분자(서열번호 4)를 도시한다.
도 1E는 VL-218-VH-his6 구조를 가지고 연결부의 둘째 위치에 시스테인이 있는 SCA 2-7-SC-5의 단백질 서열(서열번호 14)과 그를 암호화하는 DNA 분자(서열번호 5)를 도시한다.
도 1F는 VL-218-VH-his6 구조를 가지고 연결부 둘째 위치와 C-말단에 시스테인이 있는 SCA 2-7-SC-6의 단백질 서열(서열번호 15)과 그를 암호화하는 DNA 분자(서열번호 6)를 도시한다.
도 1G는 VH-(GGGGS)3-VL-his6 구조를 가지고 연결부 다섯째 위치에 시스테인이 있는 SCA 2-7-SC-7의 단백질 서열(서열번호 16)과 그를 암호화하는 DNA 분자(서열번호 7)를 도시한다.
도 1H는 VL-218-VH-his6 구조를 가지고 N-말단과 C-말단에 시스테인이 있는 SCA 2-7-SC-8의 단백질 서열(서열번호 17)과 그를 암호화하는 DNA 분자(서열번호 8)를 도시한다.
도 1I는 VL-GGGGS-VH-his6 구조를 가지고 유리된(free) 시스테인이 없는 SCA 2-7-SC-9의 단백질 서열(서열번호 18)과 그를 암호화하는 DNA 분자(서열번호 9)를 도시한다.
도 2A는 2-7-SC-2 SCA의 발현을 도시한다. 이 SCA 단백질은 Pichia 배양액에 1% 메탄올을 가하여 그 발현을 유도한다. 27kDa의 위치에 화살표("→")가 표시되어 있다.
도 2B는 2-7-SC-2 클론의 발현과 정제 데이터를 도시하고 있는데, 이에는 그 분획을 쿠마시 블루 염색한 SDS-PAGE 분석 결과와 각 단계별 수율이 포함된다. 대략 54 kDa인 이황화결합 연결 이량체 소량을 염색된 겔에서 볼 수 있다. (설명 부분) 표준: 단백질 분자량 표준 Mark12, 상층액: 발효액을 수집한 것의 상층액, Diafilter: Diafilter로 거른 상층액, DEAE: 첫번째 DEAE 크로마토그래피 유출액(flow-through), Ni2 +:니켈 친화 크로마토그래피 후 용리된 시료, DEAE: 두번째 DEAE 크로마토그래피.
27 kDa에서 봉우리(peak)가 관측되며 이는 부등호“>”로 표시되어 있다.
도 3A는 mPEG-MAL의 구조를 도시한다.
도 3B는 mPEG2(MAL)의 구조를 도시한다.
도 3C는 mPEG(MAL)2의 구조를 도시한다.
도 3D는 mPEG2(MAL)2의 구조를 도시한다.
도 3E는 활성화 PEG-MAL과 티올-SCA 사이의 반응을 나타낸다.
도 3F는 비닐술폰 활성 PEG를 나타낸다.
도 4는 200nm에서 400nm의 구간에서 파장 대 흡광도의 분광 도표를 나타낸다. A곡선은 3mM 시스테인, B곡선은 1mM PEG-MAL + 3mM 시스테인 반응 후, C곡선은 1mM PEG-MAL.
도 5A는 2-7-SC-5와 2-7-SC-5 접합물의 SDS-PAGE 분석 결과를 브릴리언트 블루 염색으로 시각화한 것이다. 1레인은 Mark 12 단백질 분자량 표준(Invitrogen社), 2레인은 비접합 2-7-SC-5 SCA, 3레인은 PEG(20K)2-7-SC-5 SCA, 4레인은 PEG(40K)2-7-SC-5 SCA이다.
도 5B는 2-7-SC-5와 2-7-SC-5 접합물의 SDS-PAGE 분석 결과를 요오드 염색으로 시각화한 것이다. 1레인은 Mark 12 단백질 분자량 표준, 2레인은 비접합 2-7-SC-5 SCA, 3레인은 PEG(20K)2-7-SC-5 SCA, 4레인은 PEG(40K)2-7-SC-5 SCA이다.
도 6A는 2-7-SC-2 SCA의 존재하에 바이오틴화 TNF-α의 세포 수용체에 대한 결합을 유동세포 분석한 결과이다. 곡선 1은 형광 표지 없는 세포 집단을, 곡선 2는 바이오틴-TNF-α에 그리고 그 후 스트렙트아비딘-PE에 결합처리 후 세포 집단을, 곡선 3은 SCA, 바이오틴-TNF-α 그리고 이어서 스트렙트아비딘-PE와 전항온처리(前恒溫, preincubation)한 세포 집단을 나타낸다.
도 6B는 2-7-SC-2 PEG(20K) SCA의 존재하에 바이오틴화 TNF-α의 세포 수용체 결합에 대한 유동세포 분석 결과이다. 곡선 1은 형광 표지 없는 세포 집단을, 곡선 2는 바이오틴-TNF-α에 그리고 그 후 스트렙트아비딘-PE에 결합처리 후 세포 집단을, 곡선 3은 PEG-SCA, 바이오틴-TNF-α 그리고 이어서 스트렙트아비딘-PE와 전항온처리(前恒溫, preincubation)한 세포 집단을 나타낸다.
도 6C는 2-7-SC-2 PEG(40K) SCA의 존재하에 바이오틴화 TNF-α의 세포 수용체에 대한 결합을 유동세포 분석한 결과이다. 곡선 1은 형광 표지 없는 세포 집단을, 곡선 2는 바이오틴-TNF-α에 그리고 그 후 스트렙트아비딘-PE에 결합처리 후 세포 집단을, 곡선 3은 PEG-SCA, 바이오틴-TNF-α 그리고 이어서 스트렙트아비딘-PE와 전항온처리(前恒溫, preincubation)한 세포 집단을 나타낸다.
도 7은 D2E7 2-7-SC-2 SCA 단백질과 PEG-SCA 유도체의 웨스턴 흡입법 분석결과를 나타낸 것이다. 제1검출 항체는 정제된 재조합 SCA 단백질을 접종한 토끼로부터 마련한 항2-7-SC-1 SCA 토끼 항혈청이었다. 1레인과 7레인: 분자량 표지자(250, 148, 98, 64, 50, 36, 22, 16, 6 및 4 kDa), 2레인: 2-7-SC-2 SCA 단백질, 3레인: 에틸-2-7-SC-2, 4레인: PEG(5 kDa)-2-7-SC-2, 5레인: PEG(20 kDa)-2-7-SC-2, 6레 인: PEG(40 kDa)-2-7-SC-2.
도 8은 D2E7 2-7-SC-2와 그 PEG화 형태들의 단백질띠에 대하여 스캔한 영상의 강도를 나타낸 그래프로서, 항D2E7 항혈청의 조합 SCA 단백질과 PEG-SCA 접합물에 대한 반응성을 증명한다. 단백질띠 A는 2-7-SC-2이고, 단백질띠 B는 2-7-SC-5이며, 단백질띠 C는 PEG(20k)-2-7-SC-2이고, 단백질띠 D는 PEG(20k)-2-7-SC-5이며, 단백질띠 E는 PEG(40k)-2-7-SC-2이고, 단백질띠 F는 PEG(40k)-2-7-SC-5이다.
도 9는 약동학적 연구를 위한 시료 중 대표군에 대하여 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 것이다. 2-7-SC-2 SCA 단백질과 2-7-SC-2 PEG-SCA 접합물을 쿠마시 블루 염색 겔상에서 검사하였다. 오른쪽 겔에서 가한 시료는 3mM β-메르캅토에탄올로 환원된 뒤, 겔에 가하기 전 2분 동안 85℃로 가열되었다. 각 레인마다 약 10㎍의 단백질을 가하였다. (설명부분) MM: 분자량 표준, 1레인: 2-7-SC-2 SCA, 2레인:N-에틸말레이미드로 변형시킨 2-7-SC-2 SCA, 3레인: 2-7-SC-2 SCA-PEG(40 kDa), 4레인: 2-7-SC-2 SCA-PEG(20 kDa).
이하 실시예는 본 발명의 이해를 더욱 깊이 하기 위함이며 본 발명의 실질적 이 범위를 어떠한 형태로도 국한하기 위함이 아니다.
< 실시예 1>적어도 한 유리된 티올기를 가지는 SCA 단백질의 설계
D2E7 MAb의 가변 영역에 바탕하여 9 개의 SCA 폴리펩티드를 설계하였다. “D2E7 SCA”라는 용어는 달리 지적하지 않는 한 여기서 이하 나타낸 것처럼 D2E7 가변 영역을 가지고 제조한 모든 SCA를 일컫는다. 각 단백질은 다름과 같이 만들어졌다.
앞서 밝힌 바와 같이 염기 수가 20개에서 102개에 이르며 서로 중첩되는 합성 올리고뉴클레오티드 14개를 사용하여, 중합효소 연쇄반응으로 전적으로 합성된 유전자를 제조하였다. 이 유전자에 올리고뉴클레오티드 특정 부위 돌연변이화를 사용하여 다른 유도체들을 제조하였다. 발현된 SCA 단백질은 D2E7 MAb 경사슬과 중사슬의 분절을 완전한 길이로 갖추고 있는데, 이들은 펩티드 연결부로 이어져 있다. 두 종류의 연결부를 사용하였다.
“218” 연결부는 Filpula 외, Antibody Engineering: A Practical Approach, pp253~268 옥스포드 대학 출판부(1996)에서 기술한 아미노산 잔기 수 18개의 218-연결부이다. (GGGGS)3 연결부(서열번호 42)는 잔기 수 15개인 연결부로서 Huston, J. S. 외, Proc . Natl . Acad . Sci ., 85: pp5879~5883(1988)에 기재되어 있다. 몇몇 경우 앞서 표 1에서 나타낸 바와 같이 히스티딘 6 잔기의 꼬리(his6, 서열번호 43)가 C-말단에 설치하여 금속 고정 금속 이온 친화 크로마토그래피(IMAC)에 의하여 손쉽게 정제할 수 있도록 하였다.
완성된 유전자는 대장균 플라스미드에 클론하여 Applied Biosystems社(캘리포니아주 Foster City) ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer(기존 ABI/Perkin-Elmer 제품)로 그 서열을 확인하였다. 각 영역의 선후관계, 연결부, D2E7 MAb에 바탕을 둔 각 SCA의 유리 시스테인 위치는 앞서 표 1에 나타내었다(클론 번호 2-7-SC-1에서 9).
2-7-SC-1에서 2-7-SC-9에 이르는 각 클론의 해당 핵산 사슬은 아래와 같이 마련하였다.
D2E7 SCA의 클로닝과 발현 방법
D2E7 SCA 유전자의 VL-VH 합성판은 서로 겹치는 6개의 올리고뉴클레오티드를 VL용 주형으로, 또 다른 6개의 서로 겹치는 올리고뉴클레오티드를 VH용 주형으로사용하는 두 단계의 PCR를 거쳐 제조하였다. D2H7 SCA 유전자의 VL 사슬과 VH 사슬은 218 연결부로 연결하였다. 상기와 같이 암호화된 단백질의 C-말단은 IMAC 정제법 을 위한 6 개의 직렬 히스티딘이 그 뒤를 이었다.
VL에 대한 6개의 올리고뉴클레오티드 5’에서 3’의 서열은 아래와 같다.
VL1:
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGGGAC(서열번호 19)
VL2:
GCATCTGTAGGGGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCAAGTCAGGGCATCAGAAATTACTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCT(서열번호 20)
VL3:
CCCTGATTGCAAAGTGGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGGGGCTTTCCCTGG(서열번호 45)
VL4:
TCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC
(서열번호 21)
VL5:
TCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAGGTATAACCGTGCACCGTATACTTTTGGCCAG(서열번호 22)
VL6:
ACCACTCCCGGGTTTGCCGCTACCACTAGTAGAGCCTTTGATTTCCACCTTGGTCCCCTGGCCAAAAGTATA(서열 번호 23)
이 중에서 VL1,2,4,5는 정방향(센스) 올리고뉴클레오티드며 VL3과 6은 역방향 올리고뉴클레오티드이다.
VH에 대한 6개의 올리고뉴클레오티드 5’에서 3’의 서열은 아래와 같다.
VH1:
GGCAAACCCGGGAGTGGTGAAGGTAGCACTAAAGGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA
(서열번호 24)
VH2:
GTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCCGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGG(서열번호 25)
VH3:
CCAAGTGATAGCTGAGACCCATTCCAGGCCCTTCCCTGGAGCTTGCCGGACCCAGTGCAT
(서열번호 26)
VH4:
TCAGCTATCACTTGGAATAGTGGTCACATAGACTATGCGGACTCTGTGGAGGGCCGATTC
(서열번호 27)
VH5:
GTGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGATACGGCCGTATATTACTGTGCG(서열번호 28)
VH6:
AGACGAGACGGTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAATAGTCAAGGGAGGACGCGGTGCTAAGGTACGAGACTTTCGCACAGTAATATAC(서열번호 29)
이 중에서 VH1,2,4,5는 정방향 올리고뉴클레오티드이고 VH3과 6은 역방향 올리고뉴클레오티드이다. D2E7 SCA의 합성 VL과 VH 올리고뉴클레오티드는 MWG Biotech社에서 합성하였다.
D2E7 SCA 유전자의 VL은 첫 단계의 PCR에서 합성하였는데, 2mM Tris(pH 8.4), 5mM KCl, 7.5mM MgCl2, 1.5mM dNTP, Platinum Tag 중합효소(Invitrogen社) 2단위, 주형으로서 올리고뉴클레오티드 VL1, 2, 3, 4, 5, 6(각 1pmol)을, 정방향 프라이머로 5’TGGCGAGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCT 3'(서열번호 30, 50pmol)을, 역방향 프라이머로 5’ ACCACTCCCGGGTTTGCCGCTACCACTAGTAGA 3'(서열번호 31, 50pmol)을 사용하였다. PCR은 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 그리고 72℃에서 60초로 30회를 실시한 뒤, 이어서 72℃에서 10분 동안 처리하였다.
D2E7 SCA 유전자의 VH는 첫 단계의 PCR에서 합성하였는데, 2mM Tris(pH 8.4), 5mM KCl, 7.5mM MgCl2, 1.5mM dNTP, Platinum Tag 중합효소(Invitrogen社) 2단위, 주형으로서 올리고뉴클레오티드 VH1, 2, 3, 4, 5, 6(각 1pmol)을, 정방향 프라이머로 5’GGCAAACCCGGGAGTGGTGA 3'(서열번호 32, 50pmol)을, 역방향 프라이머로 5’GCCACTCGAGCTATTAGTGATGGTGATGGTGGTGAGACGAGACGGTGACCAG 3'(서열번호 33, 50pmol)을 사용하였다. PCR은 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 60초로 30회를 실시한 뒤, 이어서 72℃에서 10분 동안 처리하였다.
표 1에 기재된 SCA 단백질 유도체를 암호화하는 D2E7 SCA 유전자 유도체들은 특정 부위 돌연변이화를 통하여 제조하였다. 예를 들어 2-7-SC-5는 D2E7 SCA(2-7-SC-1)의 돌연변이체로서 218 연결부의 109번 아미노산 잔기가 세린에서 시스테인으로 바뀐 것이다. 이 유전자는 2-7-SC-1 DNA를 주형으로 하고 네 개의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하는 두 단계의 PCR을 통하여 제조하였다.
2-7-SC-8 클론의 제작을 위한 프라이머는 다음과 같이 설계하였다.
정방향 프라이머 1:
CTCGAATTCACCATGAGATTTCCTTC(서열번호 37)
정방향 프라이머 2:
AAGGTGGAAATCAAAGGCTGTACTAGTGGTAGCGGCAAACCC(서열번호 38)
역방향 프라이머 1:
GGGTTTGCCGCTACCACTAGTACAGCCTTTGATTTCCACCTT(서열번호 39)
역방향 프라이머 2:
CGAGAATTCTCATTAATTGCGCAGGTAGCC(서열번호 40)
2 종류의 프라이머 조합(정방향 프라이머 1과 역방향 프라이머 1, 정방향 프라이머 2와 역방향 프라이머 2, 각 50pmol)을 가지고 두 조각을 각각 첫 단계의 PCR에서 증폭하였는데, 2mM Tris(pH 8.4), 5mM KCl, 7.5mM MgCl2, 1.5mM dNTP, Platinum Tag 중합효소(Invitrogen社) 2단위 그리고 2-7-SC-8 DNA(10㎍)을 주형으로 사용하였다. 2-7-SC-8을 위한 D2E7 SCA 유전자 유도체는 두번째 단계의 PCR에서 잡종 연장법(hybrid extension)을 사용하여 완성하였는데, 정방향 프라이머 1과 역방향 프라이머 2(각 50pmol), 2mM Tris(pH 8.4), 5mM KCl, 7.5mM MgCl2, 1.5mM dNTP, Platinum Tag 중합효소(Invitrogen社) 2단위 그리고 첫번째 단계 PCR의 두 조각(각 10㎍)을 주형으로 사용하였다.
109번 잔기에 시스테인을 가진 2-7-SC-8 유전자의 PCR 최종 산물은 벡터 pHilD2에 클로닝하여 Pichia GS115 균주를 아래 기술한 것처럼 형질전환하였다.
표 1의 나머지 유전자는 유사한 특정 부위 돌연변이화법을 사용하여 생성하 였다. 2-7-SC-2 유전자(서열번호 2)를 위해서는 C-말단의 6개 히스티딘 코돈 후 시스테인 코돈 TGC가 있는 역방향 PCR 프라이머를, 2-7-SC-3 유전자(서열번호 3)를 위해서는 C-말단의 6개 히스티딘 코돈 후 시스테인 코돈 TGC가 있는 역방향 PCR 프라이머를, 2-7-SC-4 유전자(서열번호 4)를 위해서는 VH C-말단 세린 코돈 바로 다음에 시스테인 코돈 TGC가 있는 역방향 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를, 2-7-SC-6 유전자(서열번호 6)를 위해서는 218 연결부의 둘째 위치에 시스테인 코돈 TGC가 있는 가운데 올리고뉴클레오티드 프라이머와 C-말단 히스테인 코돈 6 후에 시스테인 코돈 TGC가 있는 C-말단 역방향 프라이머를 사용하였다. 2-7-SC-7 유전자(서열번호 7)를 위해서는 (GGGGS)3 연결부의 다섯째 잔기(서열번호 42)에 해당하는 위치인 뉴클레오티드 376~578(도 1G 참조)에 시스테인 코돈 TGC이 있는 가운데 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다.
2-7-SC-8 유전자(서열번호 8)를 위해서는 VL N-말단 아미노산 아스파르트산 앞에 시스테인 코돈 TGC가 있는 PCR 정방향 올리고뉴클레오티드 프라이머와 C-말단 히스티딘 코돈 6개 이후에 시스테인 코돈 TGC가 있는 PCR 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다. 2-7-SC-9 유전자(서열번호 9)에서는 코돈 5개 짜리 GGGGS 연결부(서열번호 44)가 18잔기 218 연결부를 대체하였다.
D2E7 SCA 유전자를 온전한 형태로 갖추고 Pichia에서 D2E7 SCA를 발현하기 위하여 두번째 단계의 PCR에서 D2E7 SCA의 5’말단에 신호 서열을 첨가하였는데, 2mM Tris(pH 8.4), 5mM KCl, 7.5mM MgCl2, 1.5mM dNTP, Platinum Tag 중합효소(Invitrogen社) 2단위와 D2E7 SCA 유전자 VL과 VH에 대한 첫번째 단계 PCR 최종산물(각 1ng)을 주형으로, 정방향 프라이머로
5’CCTCGGAATTCACCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTGACATCCAGATGACCCAG 3'(서열번호 34, 50pmol)을, 역방향 프라이머로
5’CGCGGAATTCTATTAGTGATGGAGATGGAGGAGAGACGAGACGGTGACCAG 3'(서열번호 35, 50pmol)을 사용하였다. 이 PCR은 94℃에서 30초, 56℃에서 30초, 72℃에서 60초로 30회를 실시한 뒤, 72℃에서 10분 동안 처리하였다.
5’말단 신호서열이 있는 D2E7 SCA는 두번째 PCR 단계에서 조각을 모아 1% 아가로스 겔로 정제한 뒤 37℃에서 60분 동안 EcoRI으로 소화하고 나서 pHilD2(Invitrogen社) 벡터의 EcoRI 자리에 12℃에서 60분 동안 T4 DNA 연결효소로 연결하였다. DNA 연결반응 생성물을 가지고 얼음 속에서 30분, 이어서 42℃에서 45초, 그리고 1mL S.O.C. 배양액을 가하여 37℃에서 50분 동안 250rpm으로 진탕 배양하여 DH5α 적격세포(competent cell) 100μL를 형질변환하였다. 이 형질변환 혼합물 0.1mL를 LB 앰피실린(10mg/mL)판에 발라서 37℃에서 16시간 동안 배양하였다.
pHilD2-D2E7 SCA 플라스미드로 형질전환하여 LB 앰피실린(10mg/L)판에 배양한 DH5α 클론 몇 개를 37℃에서 LB 배양액 2mL로 16시간 동안 배양하였다. 각 클론의 D2E7 SCA 플라스미드를 소규모로 마련하였다. pHilD2-D2E7 SCA 플라스미드의 DNA 서열은 BigDye terminator cycle DNA sequencing kit(Applied Biosystems社)를 사용하여 ABI Prism 310 Genetic Analyzer로 확인하였다.
표 1의 각 SCA 유도체 클론은 다음 절차를 거쳐 마련하였다. Pichia 형질전환 위해서 pHilD2-D2E7 SCA 플라스미드를 SalI으로 37℃에서 60분 동안 소화한 뒤 페놀 추출과 에탄올 침전을 거쳐 10μL 증류수에 다시 현탁하였다. Pichia GS115 효모는 50mL YPD 배양액으로 30℃에서 16시간 250rpm으로 진탕 배양한 다음(OD600=1.2), 얼음에 재운 증류수로 세 번, 1M 소르비톨로 한 번 씻은 뒤 1M 소르비톨 0.1mL에 최종적으로 다시 현탁하였다.
위와 같이 마련한 Pichia GS115 세포는 SalI으로 자른 pHilD2-D2E7 SCA 플라스미드 10μg과 얼음에 재운 0.1cm 전기천공 큐벳에서 섞인 뒤 electro cell manipulator(BTX社)로 800V, 10μF, 129Ω에서 펄스를 가하였다. 펄스 후 얼음에 재운 1M 소르비톨 1mL를 전기천공 큐벳에 가하였다. 모든 내용물을 15mL 튜브로 옮긴 뒤, 1시간 동안 30℃에서 배양하였다. 형질전환 혼합물 0.2mL를 RDB 배양액판에 바르고 4일 동안 30℃에서 배양하였다.
pHilD2-D2E7 SCA 플라스미드로 형질전환하여 RDB판에서 배양한 Pichia 클론 몇 개를 500mL 플라스크 속 25mL BMGY 배양액에 접종한 뒤 30℃에서 이틀 동안 250rpm으로 진탕 배양하였다. 이 세포들을 상온에서 3,000rpm으로 원심분리하여 모은 뒤, 50mL 플라스크 속 5mL BMMY 배양액에 재현탁하여 발현을 유도하고 30℃에서 이틀 더 진탕배양하였다.
각 배양액에서 1mL 시료를 뽑아 마이크로원심분리 관에 옮긴 뒤 상온에서 14,000rpm으로 2분 동안 원심분리하였다. 각 상층액 시료 40μL를 쿠마시 블루 염색법 SDS-PAGE와 웨스턴 흡입법으로 분석하였다.
< 실시예 2> SCA 단백질의 재조합 발현과 정제
실시예 1에서 기술한 SCA 단백질들(클론 번호 2-7-SC-1에서 2-7-SC-9)은 효모 Pichia pastoris에서 발현하고 분비시켜 제조하였다. 효모 α교배 인자에서 비롯한 분비 신호 서열을 이들 SCA 단백질의 성숙 부호 서열 앞에 직접 삽입하였다.
이 신호 펩티드의 아미노산 서열은 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe 쏙 Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala∧Ala(서열번호 36)이고 “∧” 표시는 절단 자리를 나타낸다. 또하 20번째 아미노산(∧ 뒤의 알라닌)을 생성 단백질에 포함시 켰다. 따라서 각 성숙 SCA 단백질은 그 아미노 말단데 이 알라닌을 포함하고 그 다음에 도 1A에서 1F에 기록한 아미노산 서열 전부가 뒤따른다. N-말단 단백질 서열 분석 결과 이 서열이 제대로 세포 내에서 절단됨을 확인하였다. 이 돌연변이 SCA 유전자는 각각 Pichia 전달 플라스미드 pHIL-D2(Invitrogen社)의 EcoRI 자리에 연결된 다음 효모 Pichia pastoris 숙주 세포 GS-115를 형질변환시켰다. 이 과정에 고나한 자세한 프로토콜은 본 발명의 참조문헌인 Invitrogen社 카탈로그 번호 X1710-01(1994) Pichia 발현 키트 설명서에 나와 있다. 초기 단계에서 발현 여부의 평가는 SDS-PAGE 겔을 쿠마시 블루로 염색하여 시행하였다.
D2E7 SCA 클론의 Pichia 발효
2-7-SC-2, 2-7-SC-3, 2-7-SC-4, 2-7-SC-5와 2-7-SC-7을 포함하는 모든 항TNF-α SCA D2E7 발현 클론은 메틸요구성(methylotrophic) 효모인 Pichia pastoris에서 발현시켰고, 그 단백질은 배양액으로 분비시켰다. D2E7 SCA 유도체의 고농도 발효는 YNB와 바이오틴이 첨가된 기본 배양액인BMGY 배양액(배양액 조성 참조)에서 공급량 자동제어(automatic feed control) 발효기(미국 뉴저지주 Edison 소재 New Brunswick Scientific社 Bioflow 3000 모델과 BioFlow IV 모델)를 사용하여 실행하였다.
대표적인 발효 방식에는 (a) BMGY 배양액에 발현 클론을 발효 부피의 5%에서 접종하는 단계, (b) BMGY 배양액에서 16~20시간 동안 생장시키는 단계, (c) 글리세 롤(50%)에서 4시간 생장시키는 단계, (d) D2E7 유도체를 메탄올로 45시간 동안 발현 유도하는 단계가 포함된다. 각 성분의 공급은 설정된 용존 산소량 30%에 맞추어 최적화하였다. 성장 온도는 29℃에 맞췄고 pH는 가동하는 동안 수산화암모늄과 인산을 사용하여 6.0으로 유지하였다. 68시간 배양 동안 파라미터로서 성장 중인 배양액의 OD600 파라미터 관측값이 변화하였는데, 상기 (b) 성장기의 끝부분에 이르렀을 때 OD600이 0.5에서 125에 달하였고, 글리세롤 성장기((c) 단계)의 끝부분에 이르렀을 때는 125에서 200으로, 그리고 마지막으로 유도기((d) 단계)의 끝부분에서는 300에 달하였다.
D2E7 유도체가 발효 상층액에서 발현되는 비율은 평균 잡아 50에서 100mg/L였다. 카르복시 말단에 유리된 시스테인이 있고 그 뒤에 히스티딘 꼬리가 따르도록 가공한 VL-VH 유도체 2-7-SC-2가 발효시 가장 뛰어난 재현성을 가지고 발효 조건에 크게 영향을 받지 않는 우수한 클론임이 밝혀졌다.
발효 재료에 대한 기술
BMGY (L 당)
효모 추출물
펩톤
글리세롤
인산 완충액(1M, pH 6.0)
바이오틴
FMT30(Breox社)
유도제
메탄올
산소
압축 산소
단순한 크로마토그래피 프로토콜 두 세 가지를 사용하여 실시예 1의 SCA 단백질을 Pichia pastoris 상층액에서 95% 이상의 순도로 정제할 수 있었다.
히스티딘 꼬리를 가진 D2E7 SCA 클론 2-7-SC-2, 2-7-SC-3, 2-7-SC-5, 2-7-SC-7로부터의 단백질 정제
D2E7 유도체 2-7-SC-2, 2-7-SC-3, 2-7-SC-5, 2-7-SC-7emfd은 발효 상층액으로부터 이온 교환과 친화도 컬럼 크로마토그래피의 조합을 통하여 정제하였다. 상층액은 철저하게 diafilter로 걸러 시료를 농축하였으며, 농축 중 다 쓴 배양액은 pH 7.4인 20mM Tris와 50mM NaCl을 함유하는 완충용액 C로 갈아주었다. 완충용액을 교체한 시료를 DEAE 컬럼 크로마토그래피(뉴저지주 Piscataway 소재 Amersham BioSciences社 카탈로그 번호 17-0709-01)로 분리하였다. 지정 조건에서 D2E7 SCA는 DEAE 컬럼에 결합하지 않았다. 이 DEAE 컬럼 용출액(flow-through)은 pH 8.0 50 mM Tris와 0.3 M NaCl을 함유하는 완충용액 A로 투석한 뒤 미리 같은 완충용액으로 평형에 이른 Ni-NTA 수지(캘리포니아주 Valencia 소재 Qiagen社)에 가하였다. 비특이적 결합을 분쇄하기 위하여 완충용액 A에 10% 글리세롤을 가한 완충용액 B로 세척한 뒤 다시 완충용액 A로 글리세롤을 제거하는 엄격한 조건(stringent)을 부과하였다. 남아 있는 저친화도 상호작용은 컬럼 부피 3배의 60~100 mM 이미다졸(2-7-SC-2에만 100 mM)로 세척하여 분쇄하엿다. 마지막으로 Ni-NTA 컬럼에 결합한 SCA는 컬럼 부피 3~5배의 250 mM 이미다졸을 가하여 용리하였다. 세척과 용리 양쪽 용도의 이미다졸은 완충용액 A에 제조하였다.
크로마토그래피 봉우리의 분획을 모아 DEAE 완충액인 완충용액 C로 투석하였다. 투석한 시료는 고속 원심분리로 맑게 한 뒤, 정제의 마지막 단계로서 DEAE 컬럼에 통과시켰다. 정제된 시료 단백질 농도는 280nm의 자외선 분광법과 BCA법으로 결정하였고, 이후 사용을 위하여 시료를 -20℃에 저장하였다.
히스티딘 꼬리가 없는 2-7-SC-4 D2E7 SCA 단백질의 정제
단백질 L은 다양한 종의 VL 영역에 세게 결합한다. 이 결합은 극도로 종 특이적이며 아형(亞型, subtype) 특이적이다. 2-7-SC-4의 VL 영역은 단백질 L이 인식 할 수 있기 때문에, 이 점을 특이적 상호작용을 이용하여 본 발명자들은 diafilter로 거른 시료로부터 2-7-SC-4를 단일 단계로 정제하였다. 단백질 L 컬럼(뉴욕 주 Buffalo 소재, CBD Technologies社 카탈로그 번호 CLBL 201-5)에서 낮은 pH로 2-7-SC-4를 용리하더라도 SCA의 구조적, 기능적 성질이 훼손되지 않았다. 간략히 정리하여 발효액 상층액을 diafilter로 거른 뒤 컬럼에 가하기 위하여 PBS로 이온 교환하였다. 비특이적으로 결합한 단백질은 컬럼에 가한 뒤 다량의 PBS로 씻어 없앴다.
SCA 단백질은 pH 2.0의 글리신 완충용액(10 mM)을 사용하여 컬럼에서 용리하였고 곧바로 3M Tris로 중화하여 수집하였다. 그 분획들은 SDS-PAGE로 분석하여 양성인 분획들을 모은 뒤 PBS로 투석하였다. 투석 후 이 SCA 단백질을 고속 원심분리로 맑게 한 뒤 그 농도를 측정하고 나중에 쓸 때를 위하여 -20℃에 저장하였다.
분리법 중 HS(POROS 50 HS, 캘리포니아주 Foster City 소재, Applied Biosystems社 코드 번호 1-3359-07), Q-sepharose FF(뉴저지주 Piscataway 소재, Amersham BioSciences社 카탈로그 번호 17-0510-01)와 같이 덜 선호되는 대안을 사용하여도 SCA를 효과적으로 분리할 수 있다.
다음 표는 2-7-SC-2의 유도체를 다양한 컬럼으로 분리한 결과를 나타내는데, 각 유도체에 대하여 각 분리 단계별 수득률과 분리의 질을 나타낸다.
2-7-SC-2(VL-VH, 218 연결부, C-Cys, His 꼬리)의 정제
시 료 SCA 농도(mg/mL) 총 SCA(mg) 수득률(%)
발효 상층액 0.07 250 100
diafilter 여과액 0.38 230 92
DEAE 용출액 0.13 210 84
Ni-컬럼 정제액 5.0 200 80
DEAE 정제액 2.13 190 76
완충액 이온교환 2.7 186 74
도 2A와 2B는 2-7-SC-2 SCA 단백질의 각 정제 단계에서 시료를 SDS-PAGE 분석한 대표적 결과를 나타낸다. 상기 겔은 쿠마시 블루로 염색하였다. 최종 시료의 순도는 스캔한 겔의 음영계측법(densitometry)으로부터 95% 순도로 추정하였다. 염색한 겔에서 소량의 54 kDa 이황화결합 연결 이량체를 관측할 수 있었다.
< 실시예 3> 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 유도체의 안정성과 반응성
아미노산 잔기에 대한 말레이미드 반응성
라이신이나 히스티딘이 아닌 유리된 시스테인에 대한 말레이미드 고분자의 특이적 반응성은 이들 화합물을 각 유리된 아미노산과 반응시켜 검증하였다. 도 4A~4C에 보인 바와 같이, 히스티딘이나 라이신(데이터 미기재)이 아닌 시스테인은 PEG-말레이미드 고분자에 대하여 표준 반응 조건하에서 높은 반응성을 가진다.
활성화 말레이미드기의 분석과 안정성
작용기 분석은 다음 두 단계에 걸쳐 이루어졌다. MAL-PEG과 시스테인을 반응시키고 반응 종료 후 남아 있는 미반응 시스테인의 양을 5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)(DTNB)로 적정한다. 활성 MAL-PEG의 양은 MAL-PEG:시스테인을 1:3의 몰 비로 하여 50 mM 인산나트륨 pH 6.0, 1 mM EDTA 하에서 반응시켜 측정하였다. 이 반응의 조건은 다음과 같다. 1 mM PEG 용액에 그 부피의 1/40 부피의 시스테인 수용액을 첨가하여 최종 농도를 3 mM로 하였다. 이 혼합물을 10분 동안 어두운 곳에서 25 ℃로 배양하였다. DTNB 적정에서 시스테인이 들어 있는 상기 혼합물과 Cys-MAL_PEG 혼합물을 1/50부피로 0.2~0.3 mM DTNB(100 mM 인산나트륨 pH 7.3, 1 mM EDTA)에 첨가하였다.
남은 시스테인의 최종 농도는 0.04~0.06 mM이었다. 412 nm에서의 흡광도는 13,300M-1cm-1를 DTNB의 흡광도 계수로 사용하여 25℃에서 평형에 이른 후 5분 뒤에 측정하였다. MAL-PEG와 β-메르캅토에틸아민의 반응 또한 조사하였다. 이 반응은 β-메르캅토에틸아민이 공기에 민감하고 흡습성이 있기 때문에 정량적이지 못하다. MAL-PEG의 안정성은 240 에서 400 nm 구간의 자외선을 주사하여 관측하였다. MAL-PEG는 300 nm에서 최대 흡광도를 기록하였다. 이 봉우리는 시스테인과 반응하거나 37℃에서 2시간 동안 0.1N NaOH로 처리하면 사라졌다.
MAL -PEG의 안정성
MAL-PEG의 안정성은 pH, 온도와 배양 시간에 달려 있다. 300 nm에서의 흡광도가 10% 이상 떨어지지 않으면 안정성이 있다고 판단하였다.
1mM MAL-PEG는 검사한 모든 완충 용액(pH 5, pH 6, pH 7인 인산 완충액)에서 4℃일 때 최소한 24시간 동안 안정성이 있었다. 25℃, pH 5.0에서는 MAL-PEG가 33 시간 동안 안정적이었다. 따라서 바람직한 PEG화 반응 조건은 pH 5 또는 pH 6에서 25℃로는 2시간, 혹은 4℃에서는 24시간이고 pH 5와 25℃에서는 24시간이다.
시스테인과 MAL -PEG 사이 반응의 특이성
시스테인과의 반응은 반응 pH(5,6,7)와 온도(4℃ 또는 25℃)에 상관 없이 2분 내에 완료되었다. 라이신과의 반응(Lys:MAl-PEG=15:1)은 4℃ 혹은 25℃에서 24시간 배양하였을 때 pH 5와 pH 6 완충용액에서는 관측되지 않았다. 그러나 pH 7, 25℃에서는 10% 이상의 MAL-PEG가 24 시간 배양 동안 라이신과 반응하였다. 히스티딘과는 몰 비 15:1(히스티딘:MAL-PEG)에서 pH 5, 6,7로 4℃ 혹은 25℃에서 24 시간 배양 시 반응이 일어나지 않았다.
< 실시예 4> SCA 단백질의 PEG화 반응
4A. 재료와 방법
HiPrep® 26/10과 G-25 PD-10 제염 컬럼(뉴저지주 Pharmacia Biotech社 17-1408-01) 및 Poros 50 Micron HS 배양액(Applied Biosystems社)을 사용하였다. mPEG-말레이미드 화합물은 Nektar Therapeutics社(기존 Shearwater社, 캘리포니아주 San Carlos 소재)에서 구입하거나 Enzon Pharmaceuticals社에서 합성하였다.
본 발명에 사용된 PEG-MAL 고분자에는 40 kDa 가지쳐진(branched) PEG2, 20 kDa 선형 PEG, 5 kDa 선형 PEG, 20 kDa bis-MAL 이중 작용기 PEG와 40 kDa 가지쳐진 U-PEG가 포함된다. N-에틸말레이미드와 6-(biotinamidocaproylamido) caproic acid N-hydroxysuccinimide ester는 Sigma社에서 구입하였다. rProtein A Sepharose Fast Flow는 Amersham Biosciences社(뉴저지주 Piscataway)에서 구입하였다. Ultralink Iodoacetyl®은 Pierce Biotechnology社(일리노이주 Rockford)에서 구입하였다. 스트렙트아비딘-피코에리드린은 BD Sciences社(캘리포니아주 San Jose)에서 구입하였따. 96공 미량역가판(microtiter plate)은 Midwest Scientific社(미주리주 St. Louis)에서 구입하였다.
스트렙트아비딘-과산화효소(peroxidase)는 Sigma社, TMB 과산화효소 기질은 Moss社(메릴랜드주 Pasadena)에서 구입하였다. TNF-α는 Chemicon社(캘리포니아주 Temecula)에서 구입하였다. Titrisol® 요오드 용액은 EM Science社(뉴저지주 Gibbstown)에서 구입하였다.
4B. D2E7 SCA 의 환원
실시예 3에서 단리한 SCA의 C-말단이나 연결부에 있는 유리 시스테인 잔기를 MAL-PEG와 반응시키기 전에 환원하였다. 환원 용액은 3 mg/mL D2E7 SCA, 2 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT), 2 mM EDTA와 100 mM 인산나트륨 pH 7.8을 함유하였다. 환원 반응은 37℃에서 두 시간 동안 진행하였다. 유리된 DTT는 15mL 시료의 경우는 HiPrep® 제염 컬럼, 4 mL 시료는 PD-10으로 제거하였다. 환원과 제염 후 D2E7 SCA의 회수율은 85%였다. β-메르캅토에탄올과 β-메르캅토메탄올을 포함한 다른 환원제도 변형된 실험절차에서 SCA를 성공적으로 환원시켰다. 황화수소기는 본 명세서의 참조문헌인 Grassetti, D.R. 외, Archives Biochem . Biophys ., 119, pp41~49(1967)와 Riddles, P. W. 외, Anal. Biochem ., 94: pp75~81(1979)에 기재된 방법대로 정량하였다. SCA 당 한 티올기가 거의 정량적인 수준으로 환원되었다.
4C. SCA 의 PEG화와 정제
방법
실시예 3에서 단리한 SCA 단백질은 PEG 말레이미드 화합물과 시스테인 특이적 반응을 거쳐 PEG화하였다. 2-7-SC-2와 2-7-SC-5는 PEG-SCA의 특성 분석을 위한 광범위하게 연구하기 위하여 선택하였다. 이들 SCA 단백질에 있어서, 5 kDa, 20 kDa, 40 kDa(가지쳐진) 말레이미드-PEG 접합물과 비스-말레이미드 화합물을 검사하였다. SCA 단백질과 N-에틸말레이미드와의 반응은 유리 티올을 봉쇄하면서도 분자량을 거의 추가하지 않는 대조군 접합 반응의 구실을 한다. 다른 D2E7 SCA 단백질은 BIAcore 분석란에 기재한 PEG-말레이미드 고분자 중에서 선택한 것으로 변형하였다.
상기 반응 완충액은 1 mg/mL 환원된 SCA, 100 mM 인산나트륨 pH 6.0, 2 mM EDTA, PEG 말레이미드 화합물을 포함하였고, 반응 몰 비율은 10:1(PEG:D2E7)이었다. 이 반응은 질소하에서 25℃로 2시간 동안 진행되었다. SDS-PAGE로 분석한 전형적인 접합 반응 수율은 80%였다. 자연 SCA, 고분자량 불순물, 유리 PEG, 부반응 생성물과 내독소(endotoxin)로부터 PEG-SCA를 분리해내는 데에는 HS 컬럼을 사용하였다. 선호도가 떨어지는 다른 방법에서는 S와 SP 컬럼을 성공적으로 사용하였다. 컬럼 평형화 완충액에는 10 mM 인산나트륨, pH 5.0이 함유되어 있고, 용리 완충액 속에는 1M NaCl이 10 mM 인산나트륨 pH 5.0에 들어 있다. 유리된 PEG는 용출액에 들어 있었다. PEG-D2E7 SCA 접합물은 차례대로 용리되었는데, 붙은 PEG의 수가 많은 것부터 용리되었고 다음에 한 고분자가 접합한 접합물이, 마지막으로 자연 D2E7 SCA가 용리되었다. 따라서 다른 NaCl 농도에서는 크기가 다른 PEG-D2E7 접합물이 용리된다.
4D. D2E7 SCA 환원 결과 정리
Pichia pastoris에서 제조하고 앞서 기술한대로 정제한 D2E7 SCA은 MAL-PEG와 반응시키기 전에 환원되어야 한다.
0.5 mM에서 50 mM 농도의 DTT를 시험하였다. 이량체를 단량체로 환원하는데 0.5 mM이면 충분함을 보였다. 10 mM보다 높은 농도의 DTT를 사용하면 침전이 생겼다. 사용한 DTT 농도가 높을수록, D2E7 SCA 침전의 양도 늘어났다. 이 침전은 아마 변성된 D2E7 SCA일 것이다. 2 mM DTT를 PEG화 반응 프로토콜의 표준으로 채택하였다.
β-메르캅토에틸아민, 글루타티온, 2 mM에서 10 mM에 이르는 시스테인 역시 조사하였다. 조사 결과 이량체를 단량체로 환원하려면 10 mM보다 더 높은 농도를 써야 했다.
2-7-SC-2 이량체를 단량체로 환원하는 데, DTT 0.5 mM은 충분하였고, 다른 환원제는 10 mM이면 충분하였다. 환원 후 접합물의 수득률은 약 환원 전 SCA의 80% 정도였다.
4E. PEG화 결과 정리
pH 6.0에서 PEG화할 때의 수득율을 1:1에서 10:1에 이르는 반응 비율(MAL-PEG:D2E7 SCA)에 걸쳐 조사하였다. 높은 수득율로 접합물을 얻기 위하여 최소 1:4 이상이 필요하였다.
25℃에서 10분에서 24시간에 이르는 반응 시간을 두고 조사하였다. 조사 결과, 반응은 10분만에 완료되었다.(조사한 가장 짧은 시간)
가장 높은 단백질 농도(예를 들어 1mg/mL 초과)는 수득율이 떨어지늠로 D2E7 SCA의 유리된 시스테인과 MAL-PEG의 반응에 바람직하지 않다. 이는 비특이적 다중 PEG화를 위한 최적 방법과 대조된다. 단백질 농도를 0.5, 1.5, 2.0, 2.5, 3 mg/mL로 하여 시험하였다. D2E7 SCA 단백질 농도가 0.2~1 mg/mL 일 때 이 접합물을 제조하는데 바람직하였다.
pH 5~8 영역을 조사하였다. PEG화에는 pH 6.0을 사용하였다.
비접합 D2E7 SCA는 재접합을 위하여 재수거할 수 있다. 두 번째 접합 반응의 수득율은 D2E7 SCA 초기 PEG화와 비슷하였다. 가장 높은 접합 수율은 85%였다. 전체적으로 실험 결과는 SCA 단백질의 단일유리 티올 유도체를 사용하여 단일 PEG화 SCA 단백질을 높은 수득율로 반응 조건에 크게 좌우되지 않고 얻을 수 있음을 나타낸다.
4F. 정제 결과 정리
2-7-SC-2 SCA 단백질과 그 접합물을 농축하고 완충액을 교환하기 위하여 폴리에테르술폰(polyethersulfone) 막을 사용한 초여과법(ultrafiltration)은 사용할 수 없는데 이는 대부분의 단백질이 막에 걸려 없어지기 때문이다. Centriplus, Centricon, Amicon 등 Millipore社 재생 셀룰로오스 막에서는 단백질을 100% 회수할 수 있었다. 0.2 ㎛ 10% 단백질 결합 저하(low protein binding) 무균 여과기에서는 단백질이 10% 손실되었다. 두 단계의 정제와 두 단계의 농축 그리고 한 단계의 여과 후 후 총수득율은 30~40%였다.
정제된 PEG-SCA 단백질은 SDS-PAGE로 분석하였고 쿠마시 블루 염색으로 시각화하였다(데이터 미기재). 분석 결과 미량(약 1%)의 미반응 SCA 단백질이 정제한 40 kDa MAL-PEG와 20 kDa MAL-PEG 반응 생성물에 남아 있음이 나타났다. 폴리에틸렌 글리콜 함유 분자를 표시하는 SDS-PAGE 겔의 요오드 염색에서도 미량(1% 미만)의 유리된 PEG를 40 kDa MAL-PEG와 20 kDa MAL-PEG 반응 생성물에서 검출할 수 있었다.
40 kDa MAL-PEG 반응은 때때로 미량(약 1%)의 고분자량 PEG 불순물을 나타내었다. 아주 높은 분자량의 영역에 있는 고분자도 미반응 40 kDa MAL-PEG 고분자의 반응 혼합물에서 검출되었다. N-에틸말레이미드 환원 반응은 하나의 유리 시스테인이 있는 SCA 단백질에서 이량체의 형성을 완전히 봉쇄한다.
4G. 이온 교환 크로마토그래피에 의한 내독소 제거
단백질 시료 속 내독소를 DEAE 또는 HS 컬럼을 사용하여 제거하였다. pH 7~8에서 내독소는 DEAE 컬럼에 결합하였는데 반해, D2E7 SCA는 용출액 분획 속에 존재하였고, pH 5.0에서는 내독소가 용출액 분획에 존재하였고, D2E7 SCA는 HS 컬럼에 결합하였다. HS 컬럼을 사용하여 D2E7 SCA 단백질 속 내독소를 제거하였다. 컬럼 평형화 완충액에는 10 mM 인산나트륨 pH 5.0이 들어 있었고, 용리 완충액에는 1 M NaCl과 10 mM 인산나트륨 pH 5.0이 들어 있었다. 정제된 시료 속 내독소의 전형적인 양은 1 EU/mL 이하였다.
< 실시예 5> SCA 와 PEG- SCA 의 분석과 특성 파악
5A. 단백질 농도 측정
단백질 농도는 280nm에서 자외선으로 측정하였다. 실시예 3에서 얻은 SCA의 흡광도 계수는 1.24 mLmg-1cm- 1 였다. 이 농도값은 Pierce Biotechnology社(일리노이주 Rockford)의 Micro BCA 단백질 분석 시약 키트와 리소자임이나 Fab를 표준으로 사용하여 얻은 바이신초닌산(bicinchoninic acid, BCA) 분석법을 통하여서도 확인하였다. BCA 분석은 제조 회사가 추천한대로 실행하였고, 실질적으로는 본 명세서 참조문헌인 Smith, P. K. 외, Anal. Biochem ., 150" pp76~85(1985)에서 기재한 방법으로 분석하였다.
단백질 농도 측정 결과
앞서 설명한 바 있는 280nm에서의 자외선 분석과 리소자임과 사람 Fab를 표준 물질로 삼은 BCA 분석 결과 단백질 농도 측정값이 비슷하였다. BCA 분석에서 EDTA는 환원 후 DTT와 함께 제거하여야 하는데, 이들 시약이 분석을 방해하기 때문이다. 동물 연구용의 모든 시료는 자외선을 사용하여 단백질량을 분석하였고, 리소자임을 표준으로 사용하는 BCA법으로 결과를 확인하였다.
5B. 항 D2E7 SCA 다클론 항체와 바이오틴화 항 D2E7 SCA 항체
항D2E7 SCA 항체의 정제
항 2-7-SC-1 SCA 항체는 토끼에서 배양하였고 단백질 A 크로마토그래피와 D2E7 SCA 접합 친화 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질 A 컬럼 크로마토그래피에서 항체는 2 부피의 Tris 완충액으로 희석하여 최종 농도를 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0, 0.02% NaN3으로 하였다.
항2-7-SC-2 SCA는 50 mM 글리신, pH 3.0에서 1/10 부피 1M Tris-HCl, pH 8.0으로 용리하였다. 항체 농도는 280nm에서 흡광도 계수 0.8mLmg-1cm-1로 측정하였다. D2E7 SCA 접합 친화도 컬럼은 Ultralink Iodoacetyl과 2-7-SC-2 SCA 단백질의 유리 시스테인 잔기의 결합 반응으로 마련하였다. 구체적으로 2 부피의 50 mM 인산염, 5 mM EDTA, pH 7.8로 세척한 Ultralink Iodoacetyl 수지 약 7 mL를 1.45 mg/mL 2-7-SC-2 SCA 약 6.5 mL와 25℃에서 15분 동안 혼합하였다. 이 결합 반응은 상층액의 흡광도를 280nm에서 측정하여 관찰하였다. 상층액의 단백질 농도는 80%가 줄어들었다. 이 수지는 3 부피의 50 mM 인산염, pH 7.8, 5 mM EDTA로 세척한 뒤 50 mM 시스테인으로 40분 동안 처리하였다. 이 시료를 그 다음 컬럼으로 옮긴 뒤 1M NaCl, 50 mM 글리신, pH 3.0으로 세척하고 이어서 PBS로 세척하였다. 단백질 A 컬럼으로부터 정제한 항2-7-SC-2 SCA 항체는 표준적인 PBS로 평형화한 D2E7 SCA 접합 친화도 컬럼을 통과하도록 하였다. 이 컬럼에서 PBS 기저선(baseline)을 좇아 항체를 50 mM 글리신, pH 3.0에서 1/10 부피 1M Tris-HCl, pH 8.0으로 용리하였다.
바이오틴화 항D2E7 SCA 항체
시료의 글리신과 Tris 성분은 PD-10 제염 컬럼으로 제거하였는데, 이 컬럼은 50 mM 인산염, pH 7.6, 100 mM NaCl로 평형화하였다. 이 항체 용액에 1/10 부피의 활성 바이오틴 DMSO 용액을 반응 몰 비 40:1(바이오틴:항체)로 가하였다. 25℃에서 1시간 뒤 그 바이오틴화된 항체를 PD-10 제염 컬럼으로 정제하였는데, 이 컬럼은 PBS(10 mM 인산나트륨, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4)로 평형화하였다.
5C. 웨스턴 흡입법
토끼 항D2E7 SCA 항혈청을 1차 항체로, 염소 항토끼 HRP를 2차 항체로 사용하였다. 결합 여부는 TMBM 과산화효소 기질로 측정하였다. 토끼 항혈청도 이전에 합성 18 잔기 218 연결부 펩티드에 대하여 제조한 바 있다. 이 연결부를 가지는 SCA 단백질의 반응성도 확인하였다.
웨스턴 흡입 결과
정제한 시료를 전기영동한 겔 상의 모든 단백질띠는 웨스턴 흡입법에 대하여 양성이었다. 도 7은 D2E7 SCA와 PEG-SCA 화합물에 대하여 항2-7-SC-1 항혈청으로 검출한 웨스턴 흡입 실험의 한 사례를 보여 준다. 1차 검출 항체는 토끼 항2-7-SC-1 SCA 항혈청이었는데, 이는 정제한 재조합 SCA 단백질에 대하여 면역 접종한 토끼에서 마련하였다. 1레인과 7레인은 분자량 표지자(250, 148, 98, 64, 50, 36, 22, 16, 6, 4 kDa), 2레인은 2-7-SC-2 SCA 단백질, 3레인은 에틸-2-7-SC-2. 4레인은 PEG(5 kDa)-2-7-SC-2, 5레인은 PEG(20 kDa)-2-7-SC-2, 6레인은 PEG(40 kDa)-2-7-SC-2이다.
이 동물 실험에서 2-7-SC-2 SCA 단백질 중 얼마만큼이 단량체와 이량체로 존재하는지는 밝히지 못하였는데, 이는 혈장 내 농도가 낮았기 때문이다. 그러나 N-에틸말레이미드로 변형한 2-7-SC-2 단백질이 혈액 내에서 약간 더 빨리 청소되었는 바, 이는 처음 SCA 단백질 중 일부는 이량체로서 큰 분자량이나 결합력 때문에 더 천천히 청소됨을 시사한다.
5D. 순도 분석
N-에틸말레이미드로 변형한 2-7-SC-2 SCA가 비환원성 SDS-PAGE에서 이량체를 형성하지 않았기 때문에 이량체 형은 유리 시스테인 잔기를 교차 결합시켜 제조한다.
정제된 PEG-SCA 접합물에 있어서 요오드 염색으로 검출하는 유리 PEG가 실질적으로 부재하고, 비변형 SCA는 1% 미만, SDS-PAGE로 검출하는 고 분자량 분자는 1% 미만인 것이 전형적이었다.
5E. 요오드 염색
SDS-PAGE 겔은 증류수로 세척한 뒤 5% 염화바륨 용액 속에 놓았다. 10분 동안 부드럽게 섞어준 뒤, 이 겔을 물로 세척하고 0.1M Titrisol® 요오드 용액 속에 담아 발색시켰다.
5F. 질량 측정
SCA와 PEG-SCA 접합물의 정확한 질량은 유사한 분자량의 내부 표준 물질을 사용하여 α-cyano-4-hydroxy cinamic acid(CHCA) 매트릭스에서 매트릭스 지원 레이저 탈착 비행시간 질량분석법(matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF, Bruker Daltronics OmniFlex NT)으로 측정하였다. SCA 단백질의 겉보기 분자량(Stoke 반지름)은 Superdex 200 HR 10/30 겔 여과 컬럼 크로마토그래피(Amersham BioSciences社, 제조사의 설명을 따름)를 이용하였는데, 이 컬럼은 50 mM 인산나트륨, pH 6.5와 150 mM NaCl으로 평형화였다.
추가적으로 분자량을 4~20% SDS-PAGE 겔에서 적절한 단백질과 PEG-단백질 표준 물질을 사용하여 분석하였다. PEG(40 kDa)-SCA의 겉보기 분자량은, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 측정한 결과, 670 kDa 혹은 그 분자량의 10배였다.
2-7-SC-2의 분자량 측정 결과
분자량 측정 결과는 표 4에 나타내었다.
화합물 MALDI-TOF(Da) 크기별 배제 크로마토그래피 SDS-PAGE
D2E7 SCA 27,394±295 Da 20 kDa 30 kDa
에틸-D2E7 SCA 27,858 Da 20 kDa 30 kDa
PEG-5k-D2E7 SCA 33,715 Da ― 36 kDa
PEG-20k-D2E7 SCA 49,874 Da 340 kDa 56 kDa
PEG-40k-D2E7 SCA 73,123 Da 670 kDa 170 kDa
4~20% SDS 겔상에서 PEG의 겉보기 분자량(Y, kDa 단위)과 실제 단백질 크기(X,Da)의 상관 관계는 Y=0.00156X였다. 다른 D2E7 SCA 유도체와 PEG-SCA 화합물은 그들의 분자량과 고분자 크기에 부합하는 서로 비슷한 질량을 나타내었다.
5G. N-말단 서열 분석과 펩티드 지도 작성
2-7-SC-2와 2-7-SC-5의 N-말단 서열 분석 결과 서열 신호가 예상대로 처리되어 분비되는 SCA 단백질이 N-말단 아미노산이 알라닌이며 그 다음 VL의 첫 잔기가 이어진다는 것을 확인하였다.
2-7-SC-5 40 kDa PEG의 펩티드 지도 작성
이 단백질(총 0.2mg)을 6M 구아니딘 HCl, 1mM EDTA, 5mM DTT용액으로 변성시키고 환원하였다. 이 용액으로 37℃에서 1시간 배양하였다. 알킬화제인 요오드화아세트아미드를 가하여 최종 농도를 15 mM로 하였고 반응을 상온에서 1시간 동안 지속하였다. 알킬화 이후 과량의 요오드화아세트아미드는 β-메르캅토에탄올을 최종 농도 45 mM로 가하여 활성을 제거한 뒤 용액을 PD10 제염 컬럼에 가하였다. 알킬화 2-7-SC-5를 Centricon 10으로 농축하고 TPCK-처리 트립신으로 효소 대 단백질 비율 1:20(w/w)에서 가수분해하였다. 이 가수분해는 6~8시간 동안 37℃에서 진행되었고 같은 양의 트립신을 철야반응용으로 첨가하였다. 가수분해된 단백질 용액을 Speedvac으로 건조한 뒤 HPLC 등급수로 재현탁하였다.
이렇게 하여 얻은 펩티드 혼합물을 HPLC 등급수를 사용하여 HPLC 크기별 배제 크로마토그래피(Superdex 75)로 분획하였다. 분획을 수작업으로 모은 뒤 요오드 용액(5% BaCl용액에서 20mM)으로 염색한 Tricine SDS-PAGE를 이용하여 분석하였다. 양성으로 염색된 분획에 대해서는 역상 HPLC(Jupiter C18, 2×250mm) 분석하였는데, 아세토니트릴(0.05% TFA 포함) 구배를 60분 동안 5~70%로 변화시켰다. 봉우리에 해당하는 분획을 수작업으로 모은 뒤 Speedvac으로 건조하였다. 건조한 분획을 10μL 물로 재현탁한 뒤 5μL를 취하여 Tricine SDS-PAGE 분석하였다. 양성으로 요오드 염색된 분획(하나뿐이었고, 머무름 시간이 약 40분)을 아미노산 서열 분석기(Applied Biosystems社)로 분석하였다. 분석결과 그 서열은 G□TSGSGKPG(서열번호 41)였는데, □은 변형된 아미노산을 나타내며, 이것은 말레이미드-PEG 40K가 정확하게 시스테인(N-말단 알라닌1부터 시작하여 110번)에 접합함을 가리킨다.
5H. D2E7 과 PEG- D2E7 의 안정성 측정 결과
D2E7 SCA와 PEG-D2E7 SCA 접합물은 냉동-해동 순환을 10차례 반복에도 안정적임을 증명하였다. 비접합 2-7-SC-2 SCA(pH 7.0인 50 mM Tris/글리신 완충용액 속 1.1 mg/mL) 일부를 취하여 -80℃에서 15분 동안 냉동한 뒤 37℃에서 10분 동안 해동하였다. 냉동-해동 순환을 3, 5, 10 차례 반복한 뒤 비접합 SCA의 안정도를 SDS-PAGE로 분석하고 TNF-감수성 세포 구조(cell rescue) 검사법으로 확인하였다. 상기 SCA는 큰 안정성을 가지며 아무런 손상 없이 최소한 10 차례의 냉동-해동 순환에도 물리적으로 견디어 낼 수 있다는 것을 쿠마시 블루로 염색한 폴리아크릴아미드 겔에서 판명하였다(데이터 미기재). 5회의 냉동-해동 순환에도 2-7-SC-2(IC50:224.6 nM)의 생물학적 활성에는 변화가 없었다.
본 출원인이 연구한 모든 D2E7 PEG-SCA 단백질은 4℃의 20 mM 인산나트륨, pH 6.5, 150 mM NaCl에서 30일간 안정적이었다. 2-7-SC-2 SCA 단백질은 pH 3~10, 25℃에서 18 시간 배양에도 안정적이었다. 20 mM 인산나트륨, pH 7.4, 25℃에서 NaCl 농도를 1.2M까지 올려도 2-7-SC-2의 활성이나 용해도에는 어떠한 효과도 발생하지 않았다.
5I. 항원성
PEG화 D2E7 SCA 단백질은 항D2E7 SCA 다클론 항체에 대항여 뚜렷하게 줄어든 결합력을 나타낸다. 항218 항혈청을 사용하여 웨스턴 흡입 분석한 결과, PEG-SCA 2-7-SC-5는 토끼 항218펩티드 혈청에 대하여 반응성은 최저한계치 수준이었다.
< 실시예 6> SCA 와 PEG- SCA 단백질의 유동 세포 분석
2-7-SC-2, 2-7-SC-3, 2-7-SC-4, 2-7-SC-5와 세포 수용체의 결합 분석
WEHI-13VAR 세포주를 사용하여 D2E7 SCA 또는 PEG D2E7 SCA의 존재하에 TNF-α가 그 세포 수용체에 결합하는 것을 분석하였다. 바이오틴 TNF-α(0.04μg)과 D2E7 SCA 또는 PEG-D2E7 SCA(1~4 μg)를 50 μL FACS 완충액(PBS에 1% FBS과 0.05% NaN3)에서 25℃로 30분 동안 전배양(pre-incubation)처리한 뒤, 4℃에서 15분 동안 흔들어 주었다.
같은 시간에 바이오틴화 대두트립신억제제(soybean trypsin inhibitor, 0.05μg), 염소 IgG 항사람TNF-α 항체(20μg)과 CC49 SCA(4 μg)등의 대조군 역시 바이오틴 TNF-α(0.04μg)와 50μL FACS 완충액에서 전배양처리하였다. WEHI-13VAR 세포는 플라스크로부터 20 mM EDTA를 함유하는 얼음에 재운 PBS로 떼어냈다. 세포는 RPMI 1640 배양액에 재현탁한 다음 2000rpm으로 5분 동안 가라앉혔다. 이 세포를 다시 한 번 배양액으로 세척하고 FACS 세척 완충액으로 두 번 씻은 뒤 혈구계(hemacytometer)로 수를 세었다. 이 세포를 FACS 완충액에 현탁하여 최종 농도를 mL당 2×106 세포로 맞추었다. 세포를 담을 연갈색(amber) Eppendorf 튜브는 모두 FACS 완충액으로 4℃에서 최소한 1시간 동안 봉쇄(blocking) 처리하였다. 악티노마이신 D와 Fc 봉쇄 시약(BD Biosciences社)가 효과적으로 TNF-α의 세포 수용체 결합 과정에 작용할 수 있도록 세포(105)를 악티노마이신 0.05μg 당 106 세포의 비율로 혹은 Fc 1μg 당 106 세포의 비율로 50μL FACS 완충액에서 4℃로 15~30분 동안 전배양하였다. TNF-α와 PEG-D2E7 SCA 혼합물 50μL에 1×105 WEHI-13VAR 세포를 첨가하였다. 4℃에서 60분 동안 암배양(暗培養)한 뒤, 세포를 원심분리로 가라앉히고 80μL의 찬 FACS 완충액에 재현탁하였다. 스트렙트아비딘-피코에리드린 10 μL도 가하여 주었다. 이 혼합물을 4℃에서 30분 동안 암배양하였다. 그 세포를 찬 FACS 완충액 1mL로 두 번 세척한 다음 0.3mL FACS 세척 완충액에 재현탁하여 분석하였다.
유동 세포 분석 결과
바이오틴화 대두트립신억제제, 염소 항사람인터페론-α 다클론 IgG와 CC49 SCA(Enzon社)는 결합이 관측되지 않았으므로 음성 대조군으로 삼았다. Fc 봉쇄 시약(BD Biosciences社)과 악티노마이신 D으로 세포를 전배양하여도 TNF-α 결합에는 아무런 영향을 미치지 않았다. PEG-D2E7 2-7-SC-2 SCA 접합물(에틸-, 5k, 20k 또는 40k PEG)은 16:1(D2E7 SCA:TNF-α)보다 높은 몰 비율에서 TNF-α가 세포 수용체에 결합하는 것을 철저하게 막았다.
D2E7 SCA와 TNF-α 사이 같은 몰 비율에서 비접합 D2E7 SCA 역시 TNF-α가 세포에 결합하는 것을 감소시켰으나, 완전히 없애지는 못하였다. 그러므로 이 분석 실험에서 D2E7을 PEG로 접합한 SCA들은 비접합 SCA 단백질보다 더 효과가 컸다.
도 6A, 6B와 6C는 바이오틴 표지 TNF-α가 WEHI-13VAR 세포상에 있는 그 수용체에 대하여 결합하는 것을 2-7-SC-2 SCA와 PEG-SCA 화합물이 방지하는 능력에 대하여 유동 세포 분석한 대표적인 데이터를 도시하고 있다. 항TNF-α PEG-SCA 화합물이 세포에 바탕한 시스템에서 이 사이토킨이 그 수용체에 결합하는 것을 막는 고도의 활성을 가진다는 점을 이 데이터가 가리키고 있다.
2-7-SC-2 또는 PEG 2-7-SC-2 존재하에서 TNF-α의 세포 수용체결합에 대한 유동 세포 분석
1: 형광 표지하지 않은 세포 집단,
2: 바이오틴 TNF-α와 그리고 이어서 스트렙트아비딘-피코에리드린에 결합한 후의 세포 집단
3: TNF-α의 세포 수용체 결합에 2-7-SC-2(도 6A), PEG(20k)-2-7-SC-2(도 6B), PEG(40k)-2-7-SC-2(도 6C)가 미치는 영향.
2-7-SC-2 또는 PEG-2-7-SC-2의 TNF-α에 대한 몰 비율은 16:1이다. 형광 강도가 낮은 방향으로의 전이는 TNF-α의 세포에 대한 결합이 줄었들었음을 가리킨다.
< 실시예 7> BiaCore 분석
재조합 사람 TNF -α와 D2E7 SCA 및 PEG- SCA 의 상호작용에 관한 반응속도론적 분석
TNF-α와 D2E7 SCA 유도체 및 그 PEG화된 형태 사이의 상호작용을 BiaCore X 장치(뉴저지주 Piscataway 소재 BiaCore社)를 이용하여 표면 플라즈몬 공명법(SPR)으로 분석하였다. 순도 97% 이상의 재조합 사람 TNF-α(일리노이주 Rockford의 Pierce社)는 CM5 칩(BiaCore社 카탈로그 번호 BR-1000-14)에 pH 5.0인 10μg/mL 용액(BiaCore社 카탈로그 번호 BR-1003-51 아세트산염 완충액)으로 고정되었다. 고정된 표면을 pH 4.5 아세트산염 완충액(BiaCore社 BR-1003-50)으로 세 번 세척한 뒤 500nM 비접합 SCA의 리간드 안정성 분석을 6회 실시하였다.
pH 4.5 아세트산염을 재생(regeneration) 완충액으로 하여 D2E7 SCA를 분석 대상 물질로 삼았다. TNF-α가 안정적으로 결합한 표면에서 다양한 농도의 SCA 또는 PEG-SCA에 대하여 회합(3분)과 해리(2분 또는 5분) 실험을 하였고, BiaEvaluation 소프트웨어(3.0판)를 사용하여 그 데이터로부터 속도론적 파라미터들(예를 들어 kon, koff, KA와 KD)을 분석하였다. HBS-N(BiaCore社 카탈로그 번호 BR-1003-69)을 이 프로토콜의 가동(running) 완충액으로 사용하였다.
고정 rhTNF -α와 D2E7 SCA 또는 PEG- SCA 의 상호 작용에 대한 반응속도론적 분석
실험방법
TNF -α
출 처 : 재조합 형태, Pierce社 카탈로그 번호 RTNFA 50
분자량 : 17.4 kDa, 아미노산 157개
순 도 : 97% 이상
재구성 : 증류수에 농도를 100μg/mL로 재구성(reconstitution).
제조시 첨가제 없음.
저 장 : -70℃에 저장
D2E7 SCA : 2-7-SC-2 클론
출 처 : 재조합 형태, Pichia에서 발현, Enzon Pharmaceuticals社
분자량 : 27kDa, 218 연결부 가짐.
순 도 : 90% 이상
재구성 : 150 mM NaCl, 10mM 인산 완충액, pH 7.0
저 장 : 4.0℃에서 저장
새 CM5 칩을 사용하는 고정화
TNF 농도: pH 5.0 아세트산염 저장용액으로부터 직접 희석하여 10μg/mL로
맞춤.
유 속 : 5.0μL/분
채 널 : FC1-2, 1:1 NHS/EDS 혼합물로 3분 동안 활성화
채 널 : FC2, 10μg/mL TNF 15μL를 수동 투입(injection)
(낮은 RU(Response Unit)값을 위해서는 더 적은 양 투입)
채 널 : FC1-2, 1M 에탄올아민, pH 8.5로 3분 동안 불활성화
채 널 : FC1-2, HBS-N 완충액 속 1μg/mL BSA 25μL를 수동 투입
채 널 : FC1-2, 10 mM 아세트산염, pH 4.5를 100μL/분으로 1분 간 투입
하여 투입(injection) 포트를 청소.
최종 RU값은 99였다. CM5칩은 HBSN 완충액으로 세척하였고, 500 nM 2-7-SC-2를 대상으로 안정성 검사를 적어도 6회 이상 실시하였다. 그 CM5칩을 속도론 분석에 사용하였다.
D2E7 2-7-SC-2의 속도론적 분석
2-7-SC-2 농도 : 투입 직전 HBS-N으로 희석.
2.98μg/mL(1080 nM)
1.49μg/mL(540nM)
0.745μg/mL(270nM)
0.3725μg/mL(135nM)
0.186μg/mL(67.5nM)
93ng/mL(33.75nM)
46.5ng/mL(16.875nM)
23.28ng/mL(8.4375nM)
0 μg/mL(0 nM)
유 속 : 25μL/분 (30μL/분으로 하여도 20μL/분이나 25μL/분인
경우와 유사한 결합)
회합 시간 : 3 분
해리 시간 : 2분과 5분
재생 완충액 : 10 mM 아세트산염, pH 4.5
재생은 100μL/분에서 하는 100μL 세척의 제1세척 단계와 제1세척 후 칩의 잔류 RU값에 따라 40 또는 80μL로 같은 유속에서 행하는 제2세척의 두 단계로 이루어졌다.
데이터 분석
이분자 결합 반응에서 물질 이동에 제약을 두거나 제약 없이 회합과 해리의 속도 곡선을 1:1 결합 모형으로 맞추어 분석하였다. 물질 이동 파라미터를 추가하여도 속도론적 특성이 의미 있게 나아지지 않아서, 물질 이동 현상은 본 실험에서 주요한 것이 아님을 나타내었다.
2-7-SC-4와 PEG-40k-2-7-SC-4를 이 실험을 위하여 준비하였다. 별도의 FACS 분석 결과 SCA 히스티딘 꼬리의 존부와 무관하게 TNF-α에 대한 결합에는 D2E7 SCA와 PEG-D2E7 SCA의 차이가 없다고 나타났다. BiaCore와 세포 구조 실험 결과 역시 이 히스티딘 꼬리가 항원과 SCA의 결합 과정에 히스티딘 꼬리가 기여하지 않음이 밝혀졌다.
직접 결합 실험은 TNF-α를 CM5칩에 고정한 뒤 비접합형과 PEG 접합형 2-7-SC-2의 농도를 바꿔 가며 고정된 리간드 위로 흘려 특정하였다. 아래 표 5는 다양한 형태의 2-7-SC-2 SCA에 대하여 ka(kon), kd(koff),와 KD 값을 보여 준다.
2-7-SC-2 SCA 화합물의 속도론적 파라미터들
2-7-SC-2 형태 k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K A (M -1 ) K D (M)
2-7-SC-2 비접합 3.28×105 3.92×10-4 8.36×108 1.2×10-9
2-7-SC-2-NE-mal 1.47×105 7.87×10-5 1.86×109 5.37×10-10
2-7-SC-2-5k-PEG 4.96×104 3.01×10-4 1.65×108 6.06×10-9
2-7-SC-2-20k-PEG 1.6×103 4.18×10-4 3.83×106 2.61×10-7
2-7-SC-2-40k-PEG 4.47×103 6.78×10-4 6.59×106 1.52×10-7
위 표 5는 PEG화 SCA 단백질이 리간드에 대하여 높은 결합력을 유지한다는 것을 확인한다. 그러나 서로 다른 PEG-SCA 설계 분자들은 결합 속도와 해리 속도에서 차이를 나타낸다. 특히 40 kDa PEG 접합 2-7-SC-2는 그 모체 SCA와 비교하였을 때 결합 속도가 현저하게 줄었지만, 해리 속도는 유지한다. 이는 BiaCore 칩 상의 인조 결합 환경에서 크고 유연한 PEG 고분자에 의하여 발생하는 입체 장애를 반영하고 있는 것일 수 있다. 대조적으로 다른 곳에서 논하고 있는 세포에 바탕한 분석법에서는 비접합형과 40 kDa PEG 접합형 SCA 단백질이 비슷한 결합 능력을 나타낸다.
PEG화 반응이 결합 속도와 해리 속도에 끼치는 영향에 관한 자세한 추세를 들여다보면 각 화합물별로 접합 단백질에 대하여 그 고분자 부분이 가지는 형태 또는 배열이 드러날 수 있다. 아래 기재하는 다른 PEG-SCA 화합물에 대한 추가 실험 자료는 이러한 가능성을 강조한다. 2-7-SC-4 40 kDa-PEG에 대한 데이터는 PEG 고분자를 C-말단에 직접 위치시키면 해리 속도가 현저하게 개선된다는 것을 보여 준다. 본 명세서에서 개시한바, SCA의 시스테인 위치와 PEG 고분자 분자량을 규정하는 파라미터를 사용하는 전략에 의하여 어떠한 개별 PEG-SCA 단백질 접합물에 대해서도 그 결합과 활성을 최적화하는 것이 가능해질 수도 있다.
2-7-SC-5와 2-7-SC-7의 rhTNF 에 대한 결합 속도론
직접 결합 반응속도론(direct binding kinetics) 연구는 TNF-α를 CM5칩에 고정시키고 농도를 바꿔 가며 비접합형과 PEG화 형태의 2-7-SC-5와 2-7-SC-7을 고정된 리간드 위로 흘려 보내면서 측정하였다. 2-7-SC-5와 2-7-SC-7의 다양한 형태에 관한 ka, kd, KA와 KD의 값을 아래 표에 정리하였다.
2-7-SC-5 화합물의 속도론 파라미터들
2-7-SC-5 형태 k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K A (M -1 ) K D (M)
비접합 2-7-SC-5 1.73×105 1.12×10-5 1.55×1010 6.44×10-11
2-7-SC-5-40k-PEG 2.04×103 2.23×10-6 9.18×108 1.09×10-9
형 태 k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K A (M -1 ) K D (M)
비접합 2-7-SC-7 3.51×104 2.96×10-5 1.19×1010 8.43×10-11
형 태 k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K A (M -1 ) K D (M)
2-7-SC-7-20k-PEG 4.37×104 2.89×10-4 1.51×108 6.61×10-9
직접 결합 반응속도론(direct binding kinetics) 연구는 TNF-α를 CM5칩에 고정시키고 농도를 바꿔 가며 비접합형과 PEG화 형태의 2-7-SC-3과 2-7-SC-7을 고정된 리간드 위로 흘려 보내면서 측정하였다. 2-7-SC-3과 2-7-SC-7의 다양한 형태에 관한 ka, kd, KA와 KD의 값을 아래 표에 정리하였다.
2-7-SC-3 SCA와 그 접합물의 속도론 파라미터
2-7-SC-3 형태 k a (M -1 s -1 ) k d (s -1 ) K A (M -1 ) K D (M)
비접합 2-7-SC-3 4.49×104 4.16×10-4 1.1×108 9.05×10-9
2-7-SC-3-20k-PEG 1.02×104 2.5×10-4 4.07×107 2.45×10-8
2-7-SC-3-40k-PEG 4.14×103 4.04×10-4 1.03×107 9.74×10-8
2-7-SC-4와 그 접합물의 속도론 파라미터
2-7-SC-4 형태 k on (M -1 s -1 ) k off (s -1 ) K A (M -1 ) K D (M)
비접합 2-7-SC-4 2.72×105 4.95×10-4 5.49×108 1.82×10-9
2-7-SC-4-40k-PEG 1.12×104 4.04×10-6 2.7×108 3.6×10-10
직접 결합 반응속도론 연구는 TNF-α를 CM5칩에 고정시키고 농도를 바꿔 가며 비접합형과 PEG화 형태의 2-7-SC-3과 2-7-SC-7을 고정된 리간드 위로 흘려 보내면서 측정하였다. 2-7-SC-5와 2-7-SC-7의 다양한 형태에 관한 ka, kd, KA와 KD의 값을 아래 표에 정리하였다.
< 실시예 8> TNF -α 세포 독성 제거의 분석법
다음과 같이 TNF-α에 의한 세포 독성 제거에 대하여 세포 방식으로 분석하였다. WEHI-13VAR 세포(미국 ATCC로부터 입수, ATCC 번호 CRL-2148)은 악티노마이신 D 존재하에서 TNF-α에 대한 감수성이 더 크기 때문에 악티노마이신 D를 분석법에 사용하였다.
WEHI-13VAR 세포를 96공 미량역가판에 공당 10,000세포의 비율로 파종한 뒤 5% CO2 가습 배양기에서 37℃로 밤새 배양하였다. D2E7 SCA 단백질과 그 PEG 접합물을 96공 역가판에 파종한 세포에 10μg/mL에서 2.5ng/mL 이르는 농도로 배양액에 연속 희석하여 가하였다. D2E7 SCA 화합물의 첨가 직후에 rhTNF-α(Pierce社)를 각 공에 1.0ng/mL의 농도로 가하였다. 그 세포를 24시간 동안 생장하도록 방치한 다음 MTT 색소 시약(위스콘신주 Madison 소재 Promega社 카탈로그 번호 G4000) [3-(4,5,-dimethylthiazol-2yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide] 15μL를 제조회사의 설명대로 가하여 세포 생존률을 측정하였다. 세포 구조 분석은 TNF-α 존재하에 D2E7로 처리한 세포와 미처리 세포의 생존률을 비교하여 이루어졌다.
대조군 공에는 미처리 세포와 TNF-α만으로 처리한 세포가 놓였다. 대조군 공 속 세포들은 전혀 생존하지 못하였다. 실험군 공 속 생존 세포의 퍼센트값(또는 구조된 세포)을 D2E7 농도의 로그값에 대응시켜 그래프를 그려 각 데이터 집합의 IC50을 구하였다. 각 실험치는 3중 반복으로 얻었다.
D2E7 SCA 단백질에 의한 TNF -α 독성으로부터의 세포 구조
2-7-SC-2 SCA 단백질의 존재나 부존재하에서 TNF-α 감수성 세포주와 그 세포주를 TNF-α와 접촉시킴으로써 아래 표 9A, 9B와 9C에 보인 것과 같이 TNF-α의 부정적인 효과로부터 세포를 보호하는 항TNF-α SCA 단백질의 능력을 확인하였다. 그 결과는 실시예 에서 제조한 다른 SCA 단백질에 대하여 행한 추가 실험의 결과와 부합하였다.
재료와 방법
세포주 : WEHI-13VAR 마우스 세포주, ATCC 번호 CRL-2148
전 파 : 2mM G-글루타민, 1.5 g/L 탄산수소나트륨, 4.5 g/L
포도당, 10 mM HEPES, 1.0 mM 피루브산나트륨과 10%
FBS가 든 RPMI 1640 배양액‘
냉동 배양액 : 95% 배양액에 5% DMSO
분석 방법
WEHI-13VAR 세포는 트립신 처리를 거친 뒤, 96공 미량역가판의 공당 10,000세포의 비율로 완전한 RPMI-1640 배양액에 파종되었고 12시간 동안 5% CO2 가습 배양기 속에서 배양하여 세포가 자리잡도록 하였다.
이 세포를 PBS로 씻은 뒤 새 배양액을 가하였다. 각 공에 서로 다른 D2E7 SCA 유도체와 그 PEG 접합물을 가하였고 이 중에는 아래 표 9A, 9B, 9C에 기재된 것들도 포함된다. 이 SCA는 10㎍/mL에서 2.5ng/mL로 연속 희석하였다(완전 RPMI 배양액으로 희석). 대조군 세포들에게는 D2E7 SCA를 가하지 않았다.
D2E7 화합물을 가한 직후 재조합 사람TNF-α(완전하지 않은 RPMI 배양액으로 희석, 1.0ng/mL)를 각 공에 가하였다. 대조군 세포에는 TNF-α를 가하지 않았다.
세포는 24시간 동안 가습 배양기에서 37℃로 5% CO2 배양하였다. 배양 기간의 끝에 MTT 색소 시약(Promega社 카탈로그 번호 G4000) 15μL를 각 공에 가하고 정지 용액(stop solution)을 가하기 전까지 미량역가판을 4시간 동안 37℃에서 배양하였다. 각 공의 내용물을 철저히 섞어준 뒤, 상온에서 밤새 동안 결정이 용해되도록 방치하였다.
미량 역가판은 96-well plate reader(Molecular Devices社)을 이용하여 570nm와 630nm에서 흡광도를 측정한 뒤 그 흡광도 차이(세포 생존률의 지표)를 TNF-α의 독성으로부터 세포를 구조하는데 쓰인 D2E7 화합물의 농도에 대응하여 그래프를 작성하였다. 생존률 곡선의 X축을 log[D2E7]으로, Y축을 구조된 세포의 %비율로 삼아 세포 중 50%가 구조되는 D2E7 SCA 단백질의 농도를 각 실험 데이터 집합마다 결정하였다.
25℃, 50 mM 인산나트륨 pH 7.0, 1mM EDTA에서 Mal-PEG(20 kDa) 고분자의 안정성을 220 nm에서 400nm에 이르는 자외선 흡광도 스캔으로 0, 2, 4, 22, 33시간 동안 조사하였다. 25℃에서 33시간이 지나자, 3 mM 시스테인을 가하였고 그 혼합물을 5분 동안 배양 후 스캔하였다. 다른 봉우리와 구별되는 300nm 봉우리가 시간이 지남에 따라 전환하는 모습을 정량화하였다.
(주: WEHI-13VAR 세포는 TNF-α와 림프구독소(lymphotoxin)에 대한 감수성이 L929(ATCC CCL-1)보다 더 크다. 악티노마이신 D의 부재하에 이 세포들은 TNF에 대한 감수성을 30일 안에 잃어버린다. 또한 악티노마이신 D를 첨가하면 D2E7 화합물에 의한 세포 구조에 훼손한다는 것을 발견하였다.)
비접합 2-7-SC-2, 2-7-SC-2-NE-말레이미드와 5k, 20k, 40k PEG화 2-7-SC-2가 TNF-α 매개 세포 사멸로부터 세포를 구조하는 능력을 분석하였다. 표 9A는 각 2-7-SC-2 유도체의 IC50 값(1.0ng/mL TNF로부터 WEHI-13VAR 세포 50%를 구조)을 제공한다.
2-7-SC-2 SCA 화합물의 세포 구조
2-7-SC-2 형 태 IC50 값
비접합 2-7-SC-2 3.05×10-9M
2-7-SC-2-NE-말레이미드 3.71×10-9M
2-7-SC-2-5k-PEG 4.27×10-9M
2-7-SC-2-20k-PEG 3.52×10-9M
2-7-SC-2-40k-PEG 11.09×10-9M
2-7-SC-4 SCA 화합물의 세포 구조
2-7-SC-4 형 태 IC50 값
비접합 2-7-SC-4 7.18×10-9M
2-7-SC-4-40k-PEG 4.64×10-9M
2-7-SC-5 SCA 화합물의 세포 구조
2-7-SC-5 형 태 IC50 값
비접합 2-7-SC-5 4.18×10-9M
2-7-SC-5-40k-PEG 6.91×10-9M
이 데이터는 설계된 D2E7 SCA PEG 접합물들이 이 세포 방식 분석법에서 사이토킨 TNF-α에 결합하고 그 독성을 제거하는 데에 서로 비슷한 생활성을 나타낸다는 점을 확인한다. PEG-SCA 화합물은 따라서 이 사이토킨의 독성을 효과적으로 없앨 수 있으며, 이 세포 표면 TNF-α 수용체에 대한 결합을 억제할 수 있다.
< 실시예 9> D2E7 SCA 와 PEG- SCA 의 약동학
연구 프로토콜 : ICR(Institute of Cancer Research) 마우스 속 SCA와 PEG-SCA 접합물의 약동학
연구 목적
이 연구는 D2E7 SCA(2-7-SC-2와 2-7-SC-5)와 PEG(5kDa), PEG(20 kDa), PEG(43 kDa) 접합물을 포함하는 그 PEG화 접합물의 ICR 마우스 혈장 내 약동학적 거동을 조사하기 위하여 설계되었다.
시험 대상(투여 전 -20℃에서 보관)
D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) (100% 활성 w/w)
PEG(20kDa)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) (57.4% 활성 w/w)
PEG(43kDa)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) (38.6% 활성 w/w)
시험 시스템
생물종: ICR(Sprague Dawley Harlan社) 마우스
연령 : 7~8 주
성별 : 암컷
몸무게: 초기 단계의 몸무게, 약 25g
동물 관리
마우스는 우리 당 5마리씩 미국 뉴저지 의학치의학대(UMDNJ) 동물 사육장(vivarium)의 사육 상자(breeder box)에서 키웠다. 우리의 크기는 미국 국립 연구위원회 “실험용 동물 자원 연구소 실험용 동물의 관리 사용 지침”에 따랐다. 폐기물은 적어도 주당 2회 이상 제거해 주었다. 우리는 연구명, 시험 대상, 동물 수, 성별과 투여량을 명시한 우리 카드로 표시하였다. 동물들은 연구를 시작하기 전 1주일 동안 적응 기간을 두었다.
사료
마우스는 수돗물을 마실 수 있었고 시판 실험동물 사료를 자유로이 먹을 수 있게 하였다.
시료 준비
D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5)는 PBS로 0.556mg/mL D2E7까지 희석하였다.
PEG(20 kDa)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5)는 PBS로 0.503mg/mL까지 희석하였다. PEG(43 kDa)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5)는 PBS로 0.541mg/mL까지 희석하였다.
인산 완충 식염수(PBS) : 140 mM NaCl을 함유한 10 mM 인산나트륨, pH 6.5
투여 부위
D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5), PEG(20 kDa)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5)와 PEG(43 kDa)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) 접합물은 꼬리 정맥을 통한 정맥 주사 1회 분량(제1일)으로 투여하였다.
실험 설계
54 마리의 마우스를 아래 표 10의 실험안에 따라 할당하여 약물 투여하고, 혈액을 채취하였다.
Figure 112005060579310-PCT00001
투약하지 않은 마우스 두 마리는 심장을 뚫어(cardiac puncture) EDTA를 담은 튜브에 미투약 혈장을 채취하였다. 마우스에 정맥 주사로 마리당 200μL의 D2E7(2-7-SC-5), 180μL의 PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-5) 그리고 190μL의 PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-5) 접합물을 주사하였다. 0.09% 아버틴(avertin)으로 마우스를 안정시킨 뒤, 안와후동(眼窩後洞 retro-orbital sinus)을 통하여 EDTA를 담은 튜브에 마우스 혈액을 채취하였다. 2분, 15분, 30분과 1시간째에 마우스로부터 혈액 100μL를 채취하였고, 3시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간과 96시간째 심장를 뚫어 혈액 약 1000μL를 최종적으로 채취하였다. 혈액을 원심분리하여 혈장을 수집한 뒤 즉시 드라이아이스를 이용하여 -80℃로 냉동하였다.
이 얼린 혈장 시료를 녹인 뒤 D2E7 화합물의 농도를 ELISA로 측정하였다. WinNonlin 소프트웨어를 사용하여 D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5), PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5)와 PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5)의 약동학 파라미터를 정하기 위한 데이터 모델링을 실시하였다.
임상 조사
마우스는 도착시에 육안으로 검사하였다. 조사가 과도하게 길어지는 것을 피하기 위하여 자세한 신체 검사로 임상적 기형을 찾는 작업은 육안 평가에서 필요하다고 판단하였을 때에만 행하였다. 마우스는 시험 대상 SCA를 주입한 후부터 매일 한 차례 생존 여부와 투약에 대한 반응을 육안으로 검사하였으며, 사망이나 임상적인 징후는 모두 기록하였다. 사정에 따라 검사를 더 자주 하기도 하였다.
동물 관리 규정 : 이 연구는 동물 복지를 위한 현행 지침(미국 국립보건원 간행물 86-23, 1985) 규정을 준수하였다.
마우스 속 D2E7 - SCA 와 PEG- D2E7 SCA 접합물의 약동학:
D2E7 SCA 와 PEG- SCA 에 대한 효소연관 면역 흡착 분석(ELISA)
시료 준비
검사한 SCA의 선형 영역은 0.2 ng/mL와 30 ng/mL 사이였다. ng/mL 농도의 단백질과 선형 범위내의 광학 측정값을 분석에 사용하였다.
SCA 또는 PEG-SCA 표준은 분석할 혈장 시료와 비슷한 비율로 하여 혈장으로 희석하거나, 희석 완충액(0.1% BSA와 0.05% Tween-20를 함유하는 pH 7.4 PBS)에 직접 희석하였다. 이 과정을 간단히 하기 위하여 SCA 표준을 혈장 시료 분석 전에 희석 완충액으로 희석하였다. 정맥투여 또는 피하투여시 1회 분량은 4.5 mg/kg이었다. 정맥 주사시 혈장 시료의 희석률은 0.03~3 시간짜리 시료의 경우 500이었고, 6~96시간짜리 SCA 시료의 경우 10이었으며, PEG-5k-SCA 시료의 경우는 0.03~24시간에 500, 6~96시간에 10이었고, PEG-20k-SCA 시료의 경우 0.033~6시간에 800, 24~96시가에 100이었으며 PEG-40k-SCA 시료의 경우는 모두 800이었다. 피하 투여한 혈장 시료의 희석률은 모든 SCA 시료의 경우 200이었고, 모든 PEG(20k)-SCA 시료의 경우 300이었다.
ELISA 실험절차
SCA와 PEG-SCA 접합물의 혈장 내 농도를 측정하기 위하여 샌드위치 효소연관 면역 흡착 분석법(ELISA)을 사용하였다. 시료는 항체가 감지하는 특정 조성을 기준으로 측정하였다. 포획(capture) 항체는 단백질 A와 D2E7 접합 친화 컬럼으로 정제한 항D2E7 다클론 항체를 사용하였다. TNF-α와의 결합을 위하여 반응판을 TNF-α으로 피복하였다. 1차와 2차 항체는 각각 바이오틴화 항D2E7 항체와 스트렙트아비딘-과산화효소였다. Maxisorp 반응판을 공당 400ng 항 D2E7 항체 또는 50 mM 탄산수소나트륨 용액 50μL에 용해한 TNF-α로 25℃에서 밤새 동안 피복하였다. 동시에 시료를 희석하는 위하여 Nunc社 microwell plate 혹은 통상적인 96공 미량 역가판으로 단백질 흡착이 최소인 것에 봉쇄 완충액(1% BSA, 5% 슈크로스, 0.05% NaN3 함유 PBS, pH 7.4)을 가하여 4℃에 밤새 동안 단백질 흡착 부위를 봉쇄하였다. 다음 날 피복 용액과 봉쇄 완충액을 각각 ELISA와 Nunc社 판으로부터 아스피레이터로 빨아들였다. 이 ELISA 판을 봉쇄 완충액으로 25℃에서 적어도 1시간 봉쇄(공당 250μL)하였고, Nunc社판은 세척 완충액(0.05% Tween-20이 있는 PBS, pH 7.4)으로 세 번 씻어서 25℃에서 공기 건조한 뒤 다음 실험 때까지 4℃에서 보존하였다. 혈장 시료는 연속적인 방식으로 Nunc社판 맨 위에서 바닥까지 1:2로 희석하였는데, 공당 120μL씩 남겼다. 희석 완충액으로 전희석(pre-dilution)한 뒤, 시료 100μL를 ELISA판으로 옮기고 4℃에서 밤새 배양하였다. 시료 용액을 제거하고 판을 세척 완충액으로 3회 세척한 다음, 바이오틴화 항D2E7 항체 20ng이 든 50μL 완충 용액을 각공에 가하였다. 이 시료를 2시간 동안 25℃에서 배양하였다. 1차 항체를 제거한 뒤 판을 세척 완충액으로 4회 씻은 다음 1:16,000으로 희석한 스트렙트아비딘-과산화효소 100μL를 가하였다. ELISA판을 1시간 동안 25℃에서 배양한 다음 2차 항체 용액을 제거하고 판을 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 발색은 TMBE 기질 100μL를 가하고 10~20분 지나서 시행하였하며, 1M 황산 50μL를 가하여 중지하였다. 450nm에서의 흡광도를 기록하였다.
데이터 수집과 분석
데이터는 Molecular Devices社 microplate reader로 수집하고 분석하였다. 표준 곡선은 종량점에서의 450nm 흡광도와 표준물질 농도 사이의 관계를 도시하고, 그로부터 상관 계수가 0.99 혹은 그 이상인 근사 곡선을 이끌어냄으로써 얻었다. 모든 미지 시료 농도는 희석률을 감안하여 표준 곡선으로부터 계산하였다. 적당한 흡광도를 가지는 모든 데이터 점에 가장 가까운 수치를 평균하여 결과를 산출하였다.
D2E7 SCA 와 PEG- D2E7 SCA 접합물의 마우스내 약동학
모든 2-7-SC-2 계열(2-7-SC-2, 에틸-2-7-SC-2, PEG-5k-2-7-SC-2, PEG-20k-2-7-SC-2, PEG-40k-2-7-SC-2)에 대한 약동학 파라미터를 결정하였다. 2-7-SC-5, PEG-20k-2-7-SC-5와 PEG-40k-2-7-SC-5에 대한 약동학 파라미터도 산출하였다. 피하주사에 의한 2-7-SC-2와 PEG-20k-2-7-SC-2의 약동학 파라미터 역시 결정하였다.
예비 실험 결과, 항218 연결부 항체를 사용하면 2-7-SC-2(50 ng/mL)의 검출 민감성이 낮아진다는 것을 관찰하였다. 40 kDa PEG-SCA 화합물(2-7-SC-2, 2-7-SC-5)은 변형 없는 SCA 단백질과 비교했을 때 마우스내 순환 반감기가 약 100배 더 길다는 것을 관찰하였다. 아래 표 11은 정맥 주사나 피하주사로 투여한 2-7-SC-2, PEG 2-7-SC-2, 2-7-SC-5, PEG 2-7-SC-5에 대하여 결정한 약동학 파라미터를 나타낸다
Figure 112005060579310-PCT00002
이 결과는 PEG화 SCA 단백질의 순환 수명이 치료에 유용한 약동학적 특성 범위에 걸쳐 있도록 설계하는 것이 가능하다는 것을 보여 준다. 40 kDa PEG 접합 SCA의 혈청 내 반감기에 대한 이중 로그 그래프를 연장하면 이 화합물들은 변형을 가하지 않은 단일 클론 항체의 약동학적 특성 범위에 떨어짐을 알 수 있다. PEG 고분자는 항원 결합 자리에서 멀리 떨어진 고유한 자리에 특이적으로 붙게 된다는 점 때문에 단지 활성인 항원결합성 단백질을 제조할 수 있을 뿐 아니라, 무작위 아민 화학 반응을 통하여 PEG화한 SCA 단백질의 상당한 이질성과는 대조적으로 그 조성이 상대적으로 균질한 제품을 만들 수 있게 된다. 본 발명의 40 kDa PEG화 SCA 단백질을 20 kDa PEG화 SCA와 비교하였을 때 나타나는 순환 수명의 커다란 차이는 어느 정도 놀라운 점이었다. 본 발명자들이 무작위 PEG화(CC49) SCA로부터 얻은 결과에서는 약동학 특성 곡선에서 약 20 kDa PEG에서 고원에 달한다는 증거가 있었고, 12 kDa PEG는 비슷한 순환 수명을 나타내었기 때문에 그 결과를 바탕으로 해서는 상기와 같은 결과를 예측할 수 없었다.
비록 이 발명이 어떻게 작용하는지를 설명하는 어떠한 이론이나 가설에 구애되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 가지친 사슬 구조가 바로 40 kDa PEG-SCA 화합물의 크게 연장된 순환 수명에 이바지한다고 믿고 있다. 특히 PEG-SCA(20 kDa PEG)를 피하주사로써 사용하는데 성공한 것이 관심을 끈다. 이 투약 방법을 사용하면 정맥주사의 경우보다 AUC 값이 현저하게 더 낫다. 궁극적으로 피하주사 방식을 PEG-SCA 치료 약제의 투여 법으로 선호하게 될 수 있다. SCA에 PEG를 연결부로 이어주는 방법은 성공적이었고 PEG를 C-말단에 접합시킨 동물 실험 결과와 비교하여도 결과가 양호하였다. 아마 PEG를 연결부로 접합시키는 것이 SCA의 안정성을 높이고 항원성을 줄이는 것에 덧붙이거나 갈음하여 단백질 파괴를 줄이는데 기여한다고 생각된다.
< 실시예 10> 비스 - 말레이미드 PEG를 통한 D2E7 SCA 단백질 이량체
한 고분자 당 두 개의 SCA 단백질을 가지는 이가의 PEG-SCA 화합물을 제조하기 위하여 비스(bis)-말레이미드-PEG 고분자를 사용하였다. 이들은 고분자의 양 말단에 활성 말레이미드기를 가지고 있다. SDS-PAGE 분석 결과는 SCA-PEG-SCA 화합물을 이 명세서에서 개시하는 방법을 사용하여 합성할 수 있음을 증명하였다. 반응 몰 비와 반응 pH의 영향은 아래 표 12와 표 13에 각각 나타내었다.
반응 몰 비가 bis-와 mono- D2E7 SCA 형성에 미치는 영향
bis- mal -PEG : D2E7 2-7-SC-2 0.165:1 0.335:1 1:1
bis-D2E7 SCA-PEG 접합물(%) 20.7 21.5 17.6
mono-D2E7 SCA-PEG 접합물(%) 9.4 21.3 26.0
bis-와 mono-D2E7 SCA-PEG 접합물(%) 30.1 42.8 43.6
4~20% SDS-PAGE 겔의 영상을 분석하여 위 데이터를 얻었다. bis-mal-PEG(20k) 는 100mM 인산나트륨, pH 6에 3.7mg/mL의 농도로 녹였다. 이를 이어서 100 mM 인산나트륨 pH 6과 1 mM EDTA에 녹은 1mg/mL D7E7 2-7-SC-2에 그 1/30에서 1/100 부피로 앞서 표시한 몰 비율에 따라 천천히 가하여 주었다. 반응은 질소하에서 25℃로 1.5시간 동안 진행되었다.
pH가 bis-와 mono- D2E7 SCA -PEG(20k)에 미치는 영향
pH 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
bis-D2E7 2-7-SC-2-PEG(%) 17.6 19.0 28.2 34.0 37.7 38.4
mono-D2E7 2-7 SC-2-PEG(%) 21.4 23.9 13.7 18.2 14.5 16.4
bis-와 mono-D2E7 2-7-SC-2-PEG(%) 39.0 42.9 41.9 52.1 52.1 54.9
이 반응에서는 1mg/mL D2E7 2-7-SC-2와 0.12ng/mL bis-mal-PEG 화합물이 반응 몰 비 0.165:1(bis-mal-PEG : 2-7-SC-2)로 100 mM 인산나트륨에 표시한 pH로 용해되어 있다. 반응은 25℃로 질소하에서 2시간 동안 진행되었디. 시료는 4~20% SDS-PAGE 겔에서 분석하여 각 화합물에 대응하는 단백질띠를 정량하였다. 고분자량 불순물은 1% 미만이었고 2-7-SC-2 이량체는 5% 미만이었다.
< 실시예11 > 마우스내 항 TNF -α 활성의 확인
이 실시예는 본 명세서의 참조문헌인 Galanos 외, Proc . Natl . Acad Sci .(USA), 76: pp5939~5943(1979)에서 기술하고 있는 바와 같이, TNG-α 촉진 염증 연쇄증폭 반응을 중화(예방)하는데 있어서 PEG화 항종양괴사인자-α 단일 사슬 항체(PEG-항TNF-α SCA), 자연 항TNF-α SCA 그리고 Humira®(비변형 D2E7) 항TNF-α가 가지는 유효성을 TNF-α를 접종한 표준 동물 모델에서 확인한다.
간략히 정리하여 D-갈락토오스아민(NGal) 민감화 처리를 한 C57/BL6 마우스에 TNF-α를 복강내로 투여하여 내독소혈증(內毒素血症, endotoxemia)를 유발하였다. 요약하자면 C57/BL6 마우스에 재조합 TNF-α(마우스 당 1.0μg)와 D-갈락토오스아민(마우스 당 20mg)의 조합 제제를 접종하기 30분 전에 마우스 복강내로 1회 투여량을 달리 한 비접합 SCA, PEG-SCA, Humira®를 주사하였다. 살아 남은 마우스는 24시간 지나서 안락사시켰다.
NGal과 TNF-α를 함께 주사하면 24시간 안에 거의 모든 쥐를 치사하였다. TNF 1μg과 NGal 20 mg을 복강내 투여하기 30분 전에 D2E7 MAb, Humira® TNF 중화 항체 또는 20 kDa 또는 40 kDa PEG-SCA 화합물을 투약양을 다양하게 바꿔 가며 투여하였다. D2E7 MAb와 PEG-SCA 화합물 모두를 투약한 마우스는 비슷한 투약량에서 비슷한 정도로 높은 생존률을 나타내었다.
실험 재료와 방법
시험 동물은 실험 개시시에 무게가 약 25g 나가는 7~8주 된 암컷 C57/BL6 마우스(Sprague Dawley Harlan社)였다. 마우스는 수돗물과 시판 실험실 사료를 마음껏 먹을 수 있도록 하였다. TNF-α 접종에 대한 보호 능력을 시험한 제제는 앞서 설명한 방법으로 제조한 2-7-SC-5 비접합 SCA, 2-7-SC-5-20k-PEG-SCA, 2-7-SC-5-43k-PEG-SCA와 변형하지 않은 D2E7 MAb(Humira®, 일리노이주 Abbott Park 소재 Abbott Immunology社)이었다. 대조군으로는 인산 완충용액(PBS)을 사용하였다. 시험 제제는 1회의 복강내 주사로 투여하였다. 아래 표에 나오는 투여 계획대로 126 마리의 마우스를 할당하였다.
실험군 시험한 치료 제제 자 극 제 마리 수 투약량*
1 PBS TNF-α 7 ―
2 PBS TNF-α와 NGal 7 ―
3 SCA-1.7 TNF-α와 NGal 7 1.7
4 SCA-0.85 TNF-α와 NGal 7 0.85
5 SCA-0.42 TNF-α와 NGal 7 0.42
6 SCA-0.21 TNF-α와 NGal 7 0.21
7 Humira-5 TNF-α와 NGal 7 5
8 Humira-2.5 TNF-α와 NGal 7 2.5
9 Humira-1.25 TNF-α와 NGal 7 1.25
10 Humira-0.625 TNF-α와 NGal 7 0.625
11 20k PEG-SCA-1.7 TNF-α와 NGal 7 1.7
12 20k PEG-SCA-0.85 TNF-α와 NGal 7 0.85
13 20k PEG-SCA-0.42 TNF-α와 NGal 7 0.42
14 20k PEG-SCA-0.21 TNF-α와 NGal 7 0.21
15 43k PEG-SCA-1.7 TNF-α와 NGal 7 1.7
16 43k PEG-SCA-0.85 TNF-α와 NGal 7 0.85
17 43k PEG-SCa-0.42 TNF-α와 NGal 7 0.42
18 43k PEG-SCA-0.21 TNF-α와 NGal 7 0.21
* 마우스 당 투여한 100 μL PBS에 포함된 μg 수. PBS만으로 처리한 마우스에게는 복강 내로 100 μL를 투여하였다.
적어도 일주일 동안 적응기를 준 뒤, 마우스에 상기 방식으로 치료제를 복강 내 주사하였다. 주사(t=0) 후 30분이 지나서 마우스에 자극제를 상기 표와 같이 접종하였다(마우스 당 50μL PBS에 포함된 TNF-α 1.0μg 및/또는 200μL PBS에 포함된 NGal 20mg을 투여하였다).
이어서 상기 실험을 같은 방식으로 반복하였는데, 시험 치료 제제의 투약량만 더 많이 바꾸었다. 2-7-SC-5-20k-PEG-SCA와 2-7-SC-5-40k-PEG-SCA 각각 마우스 당 0.125μg, 0.625μg, 2.5μg, 10.0μg을 투여하였다. 비접합 2-7-SC-5 SCA는 마우스 당 20μg을, 변형하지 않은 D2E5(Humira)는 0.625μg을 시험하였다.
실험결과
마우스의 % 생존률을 투약한 화합물양에 대응하여 도시하였다(데이터 미기재). TNF-α 접종 마우스에 대하여 적어도 70% 보호율을 제공하는 화합물 투약량을 효능 비교의 기저선으로 판단하였다. 같은 투약량(마우스 당 0.625μg)에서 Humira®와 PEG-SCA(20k-와 40kDa-PEG-SCA 모두)은 TNF-α 유도 치사로부터 마우스를 보호하였다. 그러나 변형하지 않은 SCA와 비접합 SCA(마우스 당 20μg 또는 약 800μg/kg)는 같은 정도의 마우스 보호 효과를 보이기 위하여 투약량을 더 높여야 하였다. 상기 도출된 데이터에서 몰 기준으로 약 3배 과량의 20- 또는 40kDa PEG-SCA이 전장(全長) 항체와 비슷한 생존률을 달성하기 위하여 필요하였다. 다른 한편으로, 변형하지 않은 SCA는 TNF-α 유발 치사성으로부터 비슷한 수준으로 보호하기 위하여 몰 수의 100배 과량이 필요하였다. 이들 데이터는 D2E7 SCA를 PEG로 변형하면 비변형 단백질과 비교하였을 때 혈장 내 단백질의 순환 반감기를 증가시키는 뚜렷한 장점이 있다는 것을 시사한다.
시험 동물이 평균하여 약 25g이었으므로, 마우스 당 0.625μg은 투약량 약 25μg/kg에, 마우스 당 10μg은 약 400μg/kg에 해당한다.
본 발명의 항체-고분자 접합물은 항체에 고분자를 자리 특이적으로 접합시켜 혈액 내 순환 수명을 대폭 향상시킴으로써 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 각종 질병에 대하여 예방 및 치료제제를 제공한다.
<110> ENZON PHARMACEUTICALS, INC. <120> SINGLE CHAIN ANTIGEN-BINDING POLYPEPTIDES FOR POLYMER CONJUGATION <130> 2 <140> 10/423,847 <141> 2003-04-25 <160> 45 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 2-7-SC-1 nucleotide sequence <400> 1 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcaagtca gggcatcaga aattacttag cctggtatca gcaaaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240 gaagatgttg caacttatta ctgtcaaagg tataaccgtg caccgtatac ttttggccag 300 gggaccaagg tggaaatcaa aggctctact agtggtagcg gcaaacccgg gagtggtgaa 360 ggtagcacta aaggtgaggt gcagctggtg gagtctgggg gaggcttggt acagcccggc 420 aggtccctga gactctcctg tgcggcctct ggattcacct ttgatgatta tgccatgcac 480 tgggtccggc aagctccagg gaagggcctg gaatgggtct cagctatcac ttggaatagt 540 ggtcacatag actatgcgga ctctgtggag 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95 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Cys Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg 145 150 155 160 Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 165 170 175 Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 180 185 190 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 195 200 205 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 225 230 235 240 Glu Ile Lys His His His His His His 245 <210> 17 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 2-7-SC-8 protein sequence <400> 17 Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val 115 120 125 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu 130 135 140 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met 145 150 155 160 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala 165 170 175 Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu Gly 180 185 190 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 195 200 205 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys 210 215 220 Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Cys 245 250 <210> 18 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 2-7-SC-9 protein sequence <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 115 120 125 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 130 135 140 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 145 150 155 160 Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 165 170 175 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 180 185 190 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 195 200 205 Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 210 215 220 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser His His His His His His 225 230 235 <210> 19 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 19 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga c 51 <210> 20 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 gcatctgtag gggacagagt caccatcact tgtcgggcaa gtcagggcat cagaaattac 60 ttagcctggt atcagcaaaa accagggaaa gcccct 96 <210> 21 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 21 tccactttgc aatcaggggt cccatctcgg ttcagtggca gtggatctgg 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 26 ccaagtgata gctgagaccc attccaggcc cttccctgga gcttgccgga cccagtgcat 60 60 <210> 27 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 27 tcagctatca cttggaatag tggtcacata gactatgcgg actctgtgga gggccgattc 60 60 <210> 28 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 28 gtggagggcc gattcaccat ctccagagac aacgccaaga actccctgta tctgcaaatg 60 aacagtctga gagctgagga tacggccgta tattactgtg cg 102 <210> 29 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 29 agacgagacg gtgaccaggg taccttggcc ccaatagtca agggaggacg cggtgctaag 60 gtacgagact ttcgcacagt aatatac 87 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 30 tggcgagctc tgacatccag atgacccagt ct 32 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 31 accactcccg ggtttgccgc taccactagt aga 33 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 32 ggcaaacccg ggagtggtga 20 <210> 33 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 33 gccactcgag ctattagtga tggtgatggt ggtgagacga gacggtgacc ag 52 <210> 34 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 34 cctcggaatt caccatgaga tttccttcaa tttttactgc tgttttattc gcagcatcct 60 ccgcattagc tgctgacatc cagatgaccc ag 92 <210> 35 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 35 cgcggaattc tattagtgat ggagatggag gagagacgag acggtgacca g 51 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 36 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Sequence: Linker peptide <400> 42 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 6-His tag <400> 43 His His His His His His 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Linker peptide <400> 44 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 45 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ccctgattgc aaagtggatg cagcatagat caggagctta ggggctttcc ctgg 54

Claims (30)

  1. A) 항체의 중(重)사슬이나 경(輕)사슬 가변 부위의 항원 결합 부위를 갖춘 제1 폴리펩티드,
    B) 항체의 중사슬이나 경사슬 가변 부위의 항원 결합부위를 갖춘 제2 폴리펩티드 및
    C) 상기 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드를 연결하여 주는 펩티드 연결부(linker)를 갖추고 있으며,
    산화 폴리알킬렌(polyalkylene oxide) 고분자와 접합(conjugation)할 수 있는 시스테인 잔기(殘基 residue)를 적어도 하나 가지되,
    상기 시스테인 잔기는
    i) 중사슬이나 경사슬의 가변 부위 C-말단,
    ii) 중사슬이나 경사슬의 가변 부위 N-말단,
    iii) 상기 펩티드 연결부의 모든 아미노산 위치,
    iv) N-과 C- 양 말단,
    v) 상기 연결부의 둘째 위치.
    vi) 연결부의 둘째 위치와 C-말단 양쪽 및,
    vii) 이들을 조합한 위치로 이루어진 군에서 선택된 곳에 위치하는 것을 특징으로 하며,
    TNF-α에 결합하고, 적어도 하나의 항원 결합 자리를 가지는,
    산화 폴리알킬렌 고분자에 자리 특이적(site-specific)으로 접합할 수 있는 단일 사슬 항원결합성(single chain antigen-binding) 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시스테인 잔기는 상기 연결부의 둘째 위치, C-말단 및 그들의 조합 위치로 이루어진 군에서 선택된 곳에 위치하는 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 항체 경사슬 가변부위를 갖추고 있고, 제2 폴리펩티드는 항체 중사슬 가변부위를 갖추고 있는 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드의 C-말단은 자연(native) C-말단인 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 펩티드 연결부의 잔기 수는 2에서 18개에 이르는 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드.
  6. 제1항의 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드와 그 폴리펩티드의 시스테인 잔기에 공유결합으로 연결된 산화 폴리알킬렌 고분자로 구성되는 접합물(conjugate).
  7. 제6항에 있어서, 상기 산화 폴리알킬렌은 상기 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드의 시스테인 잔기에 말레이미드(maleimide), 비닐술폰(vinylsulfone), 티올(thiol), 이황화오르토피리딘(orthopyridyl disulfide), 요오드화아세트아미드(iodoacetamide) 연결부로 이루어진 집합에서 선택되는 연결부를 통하여 연결되는 접합물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 산화 폴리알킬렌은 상기 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드의 시스테인 잔기에 말레이미드 연결부를 통하여 연결되는 접합물.
  9. 제6항에 있어서, 상기 산화 폴리알킬렌의 크기는 약 5,000에서 40,000돌턴(Dalton)에 이르는 접합물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 산화 폴리알킬렌은 산화 폴리에틸렌인 접합물.
  11. 제6항에 있어서, 상기 산화 폴리알킬렌은 적어도 두 개의 상기 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드에 접합되어 있고, 각 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드는 서로 다르거나 동일한 접합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드에 작용기 부위가 추가적으로 접합되는 접합물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 추가된 작용기 부위는 감지가능한 표지(detectable label 또는 tag)인 접합물.
  14. 제1항의 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  15. 제14항의 폴리뉴클레오티드를 갖춘 복제 가능한 발현 벡터.
  16. 가) 제15항의 발현 벡터를 갖춘 숙주세포를 배양하는 단계와
    나) 상기 숙주세포가 발현하는 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드를 수집하는 단계로 구성된 상기 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드의 제조 방법.
  17. 가) 제1항의 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드를 갖춘 시약으로 시료를 처리하는 단계와
    나) 상기 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드가 TNF-α에 결합하였는지를 검출하는 단계로 구성되는 시료 속 TNF-α의 존부(存否) 검출 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드는 그 폴리펩티드의 시스테인 잔기를 통하여 적어도 하나의 산화 폴리알킬렌 고분자와 공유결합으로 접합되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 접합물은 고형의 기질(solid substrate)에 고정되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  20. 포유동물 체내 TNF-α의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 양의 상기 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 특징으로 하는, TNF-α 관련 독성의 치료 또는 예방 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 투여하는 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 통하여 적어도 하나의 산화 폴리알킬렌 고분자에 공유결합으로 접합되는 것을 특징으로 하는 치료 또는 예방 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드의 투여량은 약
    10μg/kg에서 4,000μg/kg에 이르는 치료 또는 예방 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드의 투여량은 약
    10μg/kg에서 400μg/kg에 이르는 치료 또는 예방 방법.
  24. 각각 서로 동일하거나 다른 상기 제1항의 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드를 적어도 둘 이상 갖춘 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 결합가(結合價)가 2가(二價, bivalent), 3가 혹은 4가인 단백질.
  26. 제24항에 있어서, 상기 단백질을 구성하는 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드들은 서로 공유결합이 아닌 방식으로 회합(會合, association)하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 상기 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드의 펩티드 연결부의 잔기 수는 2에서 18개에 이르는 단백질.
  28. 제24항에 있어서, 상기 단일 사슬 항원 결합성 폴리펩티드들은 서로 공유결합으로 연결된 단백질.
  29. 제24항에 있어서, 다결합가(多結合價)를 가지는 하나의 단백질로 암호화되는 단백질.
  30. 제29항의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
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