MXPA05011488A - Polipeptidos de enlace de antigeno de cadena simple para conjugacion de polimero. - Google Patents

Polipeptidos de enlace de antigeno de cadena simple para conjugacion de polimero.

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Abstract

La presente invencion se refiere a polipeptidos de enlace de antigenos de cadena simple monovalentes y multivalentes con modificaciones especificas de sitio. Los polipeptidos proporcionados tienen la capacidad de ser enlazados o conjugados en forma covalente a oxidos de polialquileno en los sitios modificados. Los conjugados resultantes retienen las propiedades de enlace de antigeno y exhiben tiempo en circulacion prolongado y antigenicidad reducida con relacion a los polipeptidos de enlace de antigenos de cadena simple no conjugados. Tambien se proporcionan metodos y composiciones para elaborar y utilizar los polipeptidos de enlace de antigenos de cadena simple con modificaciones especificas de sitio.

Description

POLIPÉPTIDOS DE ENLACE DE ANTÍGENO DE CADENA SIMPLE PARA CONJUGACIÓN DE POLÍMERO Campo del Invento La presente invención se refiere a polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple monovalentes y multivalentes con modificaciones específicas de sitio que facilita el enlace covalente específico del sitio de polímeros a los polipéptidos de la presente invención. La presente invención proporciona dichos polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple, vectores y células huésped modificadas que codifican los mismos, así como a métodos para elaborar y utilizar los polipéptidos. La presente invención también proporciona conjugados de los polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple modificados con polímeros, tales como óxido de polialquileno ("PAO"), para proporcionar pro-fármacos nuevos y mejorados y a métodos para elaborar y utilizar estos conjugados. Antecedentes del Invento Los anticuerpos que ocurren naturalmente son inmunoglobulinas producidas por el sistema inmune de vertebrados, incluyendo mamíferos, en respuesta a la presencia de una o más substancias específicas, es decir, antígenos, cuando éstas son reconocidas como externas por las células inmunes del animal. En humanos, existen cinco clases de anticuerpos que tienen la capacidad de reconocer en forma selectiva y enlazar en forma preferencial a los antígenos específicos. Cada clase de anticuerpo tiene la misma estructura básica o múltiplos de dicha estructura. La unidad básica consiste en dos polipéptidos idénticos denominados de cadenas pesadas o cadenas H (peso molecular en IgG de aproximadamente 50,000 daltons cada uno) y dos polipéptidos idénticos denominados de cadena ligera o cadena L (peso molecular aproximadamente 25,000 daltons cada uno). Cada una de las cinco clases de anticuerpos tiene un grupo de cadenas ligeras similares y un grupo de cadenas pesadas distintas. Una cadena ligera está compuesta de un dominio variable y un dominio constante, en tanto que una cadena pesada está compuesta de un dominio variable y tres o más dominios constantes. Los dominios variables determinan la especificidad de la inmunoglobulina, las regiones constantes tienen otras funciones. Ampliamente los pares de cadenas de polipéptidos ligeros y pesados adecuados están asociados en anticuerpos naturales, y en otros tipos de anticuerpos, para formar sitios de enlace de antígenos. Cada cadena ligera y pesada individual se dobla en regiones de aproximadamente 110 aminoácidos, asumiendo una conformación tridimensional conservada. La cadena ligera comprende una región variable (VL) y una región constante (CL), en tanto que la cadena pesada comprende una región variable (VH) y tres regiones constantes (CHi , CH2 y CH3)- Los pares de regiones se asocian para formar estructuras independientes. En particular, las regiones variables de cadena ligera y pesada se asocian para formar un área "Fv" la cual contiene el sitio de enlace de antígenos. Las regiones constantes no son necesarias para el enlace de antígenos, y en algunos casos, se pueden separar de la molécula de anticuerpo mediante proteolisis, producción de regiones variables biológicamente activas (es decir, de enlace) compuestas de la mitad de una cadena ligera y un cuarto de una cadena pesada. Además, todos los anticuerpos de una cierta clase y sus fragmentos Fab (es decir fragmentos compuestos de VL, CL, VH, y CHi ) cuyas estructuras han sido determinadas mediante cristalografía de rayos x, muestran estructuras de región variable similares a pesar de las grandes diferencias en la secuencia de segmentos hipervariables, incluso cuando proceden de diferentes especies animales. La región variable de inmunoglobulina parece ser tolerante a mutaciones en los lazos de enlace del antígeno. Por consiguiente, diferente en las regiones hipervariables, la mayoría de las regiones denominadas "variables" de los anticuerpos, las cuales se definen tanto mediante cadenas pesadas como ligeras, son de hecho, muy constantes en su arreglo tridimensional. Ver por ejemplo la publicación de Huber, R., Science 233:702-703 (1986), incorporada a la presente invención, como referencia. Los anticuerpos naturales son naturalmente heterogéneos, enlazan a muchos diferentes epítopes o partes de un antígeno externo. En contraste, los anticuerpos monoclonales ("MAbs") son anticuerpos que son homogéneos en su afinidad de enlace. Los MAbs han mostrado ser útiles tanto como agentes de diagnóstico como agentes terapéuticos. Los MAbs se producen en forma rutinaria mediante procedimientos establecidos, por ejemplo, a partir de hibridomas generados mediante fusión de células linfoides de ratón con una línea celular de mieloma de ratón adecuada, así como mediante técnicas recombinantes más avanzadas. Incluso se forman proteínas o polipéptidos tipo anticuerpo más pequeñas de sitios de enlace de antígeno con una mínima estructura adicional. Estas son conocidas en la técnica como proteínas o polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple ("SCAs") o fragmentos variables de cadena simple de anticuerpos ("sFv"). Éstos pueden incorporar un polipéptido de enlace para puentear las regiones variables individuales, VL y VH, en una sola cadena de polipéptido. Una descripción de la teoría y producción de las proteínas de enlace-antígeno de cadena simple se encuentra en la publicación de Ladner y asociados , las Patentes Norteamericanas Nos. 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030 y 5,518,889, y en la publicación de Huston y asociados, Patente Norteamericana No. 5,091,513 ("sitios de enlace de anticuerpos biosintéticos" (BABS)), cuyas descripciones están incorporadas a la presente invención como referencia. Las proteínas de enlace de antígenos de cadena simple producidas bajo los procesos mencionados en las patentes anteriores, tienen especificidad y afinidad de enlace substancialmente similar a la del fragmento Fab correspondiente. Ampliamente, los pares de cadenas pesadas y ligeras adecuadas pueden asociarse para formar sitios de enlace de antígenos. Cada cadena ligera y pesada individual se dobla en regiones de aproximadamente 110 aminoácidos, asumiendo una conformación tridimensional conservada. La cadena ligera comprende una región variable (VL) y una reglón constante (CL), en tanto que la cadena pesada comprende una región variable (VH)) y tres regiones constantes (CHi , CH2 y CH3). Los pares de regiones se asocian para formar estructuras independientes. En particular, las regiones variables de cadena ligera y pesada se asocian para formar un área "Fv" la cual contiene el sitio de enlace de antígenos. Las regiones constantes no son necesarias para el enlace de antígenos y en algunos casos, pueden ser separadas de la molécula de anticuerpo mediante proteolisis, produciendo regiones variables biológicamente activas (por ejemplo, de enlace) compuestas de la mitad de una cadena ligera y un cuarto de una cadena pesada. Además, la cristalografía de rayos x ha confirmado que todos los anticuerpos de una clase en particular, y sus fragmentos Fab (es decir fragmentos compuestos de VL, CL, VH, y CH-I) muestran una estructura de región variable similar, aunque grandes diferencias en la secuencia de sus segmentos hipervariables respectivos. Esto también se observa en comparaciones de anticuerpos derivados de diferentes especies animales respectivas. La región variable de inmunoglobulina parece ser tolerante a mutaciones en los lazos de enlace de antígeno. Por consiguiente, diferentes en las regiones hipervariables, la mayoría de las regiones de anticuerpos denominadas "variables" las cuales se definen tanto mediante cadenas pesadas como cadenas ligeras, son de hecho, muy constantes en su arreglo tridimensional. Ver por ejemplo la publicación de Huber, R., Science 233:702-703 (1986), incorporada a la presente invención, como referencia. Las propiedades ¡n vivo de los polipéptidos SCA son diferentes a las de los MAbs y fragmentos de anticuerpos más convencionales, más grandes. Su tamaño pequeño permite a los SACs ser despejados en forma más rápida de la sangre, y penetrar más rápidamente en los tejidos (Milenic, D. E. y asociados, Cáncer Research 51:6363-6371 (1991); Colcher y asociados, J. Nati. Cáncer Inst. 82:1191 (1990); Yokota y asociados, Cáncer Research 52:3402 (1992)). Además, los polipéptidos SCA no se retienen en tejidos tales como el hígado y ríñones, debido a la ausencia de una región constante que normalmente se encuentra en moléculas de anticuerpo. Por lo tanto, los polipéptidos SCA, tienen aplicaciones en diagnóstico y terapia de cáncer, en donde es conveniente la penetración y despeje rápido en el tejido. Las proteínas de enlace de antígeno sintéticas también se describen en la publicación de Huston y asociados, en la Patente Norteamericana No. 5,091,513, incorporada a la presente invención como referencia. Las proteínas descritas están caracterizadas por una o más secuencias de aminoácidos que constituyen una región que se comporta como un sitio de enlace de anticuerpo biosintético (BABS). Los sitios comprenden, (1) regiones VH y VL sintéticas enlazadas con disulfuro o asociadas en forma no covalente, (2) cadenas simples VH- -VL o VL- -VH, en donde VH y VL se adhieren a un enlazador de polipéptido, o (3) dominio VH o VL individuales. Los dominios de enlace comprenden regiones de determinación de complementaridad (CDRs) enlazadas a regiones de estructura (FRs) las cuales se pueden derivar de inmunoglobulinas separadas. Se debe observar que las proteínas de Huston y asociados, incluyen una proteína caracterizada por tener una cadena pesada inicial es decir, el dominio de VL-en lazador péptido-VH Se conocen las proteínas de enlace de antígeno multivalente. Tal como se describe en la presente invención, una proteína de enlace de antígeno multivalente incluye dos o más moléculas de proteína de cadena simple. Éstas se pueden asociar o enlazar mediante enlace covalente o no covalente. La actividad de enlace de antígeno mejorada, el enlace multi y di- específico, y otros usos novedosos de las proteínas de enlace de antígeno multivalentes, han sido demostradas en la actualidad. Ver por ejemplo la publicación de Whitlow, M. y asociados, Protein Enanq. 7/1017-1026 (1994); Hoogenboom, H. R., Nature Biotech. 1_5:125-126 (1997); y publicación WO 93/11161 y Patentes Norteamericanas de co-propiedad Nos. 5,869,620, 6,025,165, 6,027,725, 6,103,889, 6,121,424 y 6,515,110, incorporadas todas a la presente invención como referencia.
Aunque los polipéptidos, tales como los polipéptidos de cadena simple descritos anteriormente y proteínas de fusión de los mismos, no han estado asociadas con una antigenecidad significativa en mamíferos, ha sido deseable prolongar la vida en la circulación e incluso reducir en forma adicional la posibilidad de una respuesta antigénica.
Una forma de mejorar la vida en circulación y reducir la antigenecidad de las proteínas y polipéptidos, ha sido conjugarlas a polímeros, tal como óxidos de polialquileno. Sin embargo, el tamaño relativamente pequeño de los polipéptidos y su delicada relación de estructura/actividad, han hecho difícil e impredecible la modificación del polietilénglicol . Para llevar a cabo una adhesión covalente de óxidos de polialquileno a una proteína, los grupos de extremo de hidroxilo del polímero deben ser convertidos primero a grupos funcionales reactivos. Este proceso es referido con frecuencia como una "activación" y el producto se denomina "PEG activado" u óxido de polialquileno activado. Por ejemplo, el poli(etilénglicol) de metoxi (mPEG), tapado en un extremo con un grupo funcional, reactivo para aminas en una molécula de proteína, se utiliza en la mayoría de los casos. Se han introducido un número de polímeros activados, tales como derivados de succinato de succinimidilo de PEG ("SS-PEG"), (Abuchowski y asociados, Cáncer Biochem. Biophvs. 7_'.175-186 (1984)). SS-PEG reacciona rápidamente con proteínas (30 minutos) bajo condiciones moderadas que producen conjugados extensamente modificados aún activos. Zalipsky, en la Patente Norteamericana No. 5,122,614, describe carbonato de poli(etilónglicol)-N-succinimida y su preparación. Esta forma de polímero se dice que reacciona rápidamente con los grupos amino de las proteínas, así como péptidos de bajo peso molecular y otros materiales que contienen grupos amino libres. También son conocidos otros enlaces entre los grupos amino de la proteína y el PEG, tal como ligaduras de uretano (Veronese y asociados, Appl. Biochem. Biotechnol. 11:141-152 (1985)), ligaduras de carbamato (Beauchamp y asociados, Analvt. Biochem. 131 :25-33 (1983)), y otros. Sin embargo, a pesar de estos y otros métodos, con frecuencia se ha descubierto que los conjugados resultantes carecen de suficiente actividad retenida. Por ejemplo, Benhar y asociados (Bioconiugate Chem. 5_:321-326 (1994)) observó que la PEGilación de una inmunotoxina de cadena simple recombinante dio como resultado la pérdida de inmuno-reactividad dirigida en forma específica de la inmunotoxina. La pérdida de actividad de la inmunotoxina fue el resultado de la conjugación PEG en dos residuos de üsina dentro de la región de combinación de anticuerpos de la inmunotoxina. Para superar este problema, Benhar y asociados reemplazó estos dos residuos de lisina con residuos de arginina y tuvieron la capacidad de obtener una inmunotoxina activa que fue tres veces más resistente a la activación mediante derivación. Otra sugerencia para superar estos problemas descritos anteriormente, es utilizar polímeros de peso molecular más alto y más largos. Sin embargo estos materiales don difíciles de preparar y costosos en su uso. Además, proporcionan poca mejoría con respecto a polímeros más fácilmente disponibles. Otra alternativa sugerida es adherir dos hebras de polímero a través de un anillo de triacina a grupos amino de una proteína. Ver, por ejemplo, la publicación de Enzvme 26:49-53 (1981) y Proc. Soc. Exper. Biol. Med.. 188:364-369 (1988). Sin embargo, la triacina es una substancia tóxica que es difícil de reducir a niveles aceptables después de la conjugación. Una revisión de la estructura tridimensional de una proteína SCA revela que el término-C y la región enlazadora se eliminan mayormente del sitio de enlace de antígenos y por consiguiente deben ser sitios para la conjugación de polímeros, en donde el polímero adherido no bloquea o interrumpe en forma estérica la conformación del sitio de enlace de antígenos o la arquitectura Fv circundante (Wang M., y asociados, 1998 Protein Enana 11:1277-1283) dentro del contexto de colocar sitios para el enlace de polímeros a residuos insertados que están glucocilados, in vivo, durante la producción de dichas proteínas. Los esfuerzos para colocar los residuos de aminoácido dentro de la estructura SCA para una conjugación de polímero más efectiva, se han descrito a través de los siguientes documentos de co-propiedad de la presente solicitud de patente, los cuales todos están incorporados a la presente invención como referencia: Patentes Norteamericanas Series Nos. 09/791,578 y 09/791,540 ambas presentadas el 26 de febrero del 2001, las cuales describen residuos Cys y oligo Lys colocados en forma selectiva. Las Patentes Norteamericanas de co-propiedad Series Nos. 09/956,087 y 09/956,086, ambas presentadas en septiembre 20 del 2001, describen ASN tándem y de triplete, y sitios relacionados en un SCA para una glucocilación colocada en forma selectiva para los polímeros que son conjugados en forma selectiva. Sin embargo, existen todavía necesidades en la técnica de opciones y mejorías adicionales en la posición de conjugación de los polímeros para las proteínas SCA, así como opciones y mejorías adicionales en la química de conjugación, que permitan que se retenga la actividad de enlace y especificidad del polipéptido, junto con todos los beneficios de las conjugaciones de polímero. Sumario del Invento Con el objeto de dirigirse a estas necesidades que aún permanecen, la presente invención proporciona un polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple, que enlaza a TNFa (SCA) con la capacidad de conjugación específica al sitio de un polímero de óxido de polialquileno que comprende, un primer polipéptido que comprende una parte de enlace de antígenos de una región variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo; un segundo polipéptido que comprende una parte de enlace de antígenos de una región variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo; un enlazador de péptidos que enlaza al primero y segundo polipéptidos, en donde el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple tiene el menos un residuo Cys el cual tiene la capacidad de ser conjugado a un polímero de óxido de polietileno, y tiene al menos un sitio de enlace de antígenos. El residuo Cys se localiza preferentemente en una o más de las siguientes posiciones: en el término-C de la región variable de cadena pesada o cadena ligera; en el término-N de la región variable de cadena pesada o cadena ligera; cualquier posición de aminoácidos del enlazador de péptido; tanto el término-N como el término-C; posición 2 del enlazador; posición 5 del enlazador; tanto la posición 2 del enlazador como el término-C; y combinaciones de los mismos. Preferentemente, el SCA de enlace a TNFa enlaza a TNFa. Las posiciones Cys más preferidas incluyen, por ejemplo posición 2 del enlazador, el término-C y combinaciones de los mismos. El término-C es preferentemente un término-C que ocurre naturalmente, aunque también puede incluir cualquier modificación conocida del mismo. El SCA de la presente invención, se forma opcionalmente de regiones variables de cadenas ligeras y/o pesadas de un anticuerpo de interés, preferentemente, por ejemplo un anticuerpo anti-TNFa. La presente invención también proporciona conjugados que comprenden los polipéptidos o proteínas de enlace de antígenos de cadena simple de la presente invención, en donde los conjugados incluyen polímeros substancialmente no-antigénicos, por ejemplo, un polímero de óxido de polialquileno. El óxido de polialquileno es preferentemente un polietilénglicol o polímero "PEG". El óxido de polialquileno tiene cualquier rango de tamaño adecuado, aunque preferentemente fluctúa en tamaño desde aproximadamente 5,000 hasta aproximadamente 40,000 Daltons. Preferentemente el polímero de óxido de polialquileno está enlazado en forma covalente al polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple en un residuo Cis. Preferentemente, el óxido de polialquileno está enlazado al polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple en un residuo Cis a través de un enlazador, tal cómo por ejemplo, un enlazador de maleimida, vinisulfona, t i o 1 , disulfuro de ortopiridilo y/o un enlazador de yodo acetamida. El más preferido es el enlazador de maleimida. En las modalidades de polímero conjugado de la presente invención, el óxido de polialquileno está opcionalmente conjugado con al menos dos polipeptidos de enlace de antígeno de cadena simple, en donde cada polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple es el mismo o diferente. Opcionalmente, el conjugado, por ejemplo, ya sea el PAO o el SCA, o ambos, se enlazan o conjugan en forma adicional para una porción funcional adicional, por ejemplo, una etiqueta o marca detectable. La presente invención también proporciona nucleótidos que codifican los polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple, vectores de expresión que se pueden replicar que comprenden los polinucleótidos, y células huésped adecuadas para expresar las mismas. Las proteínas SCA de la presente invención se producen a través de cualquier proceso o método conocido en la técnica adecuado, aunque preferentemente se producen, tal, como se ejemplifica en la presente invención, cultivando una célula huésped que comprende un vector de expresión de codificación SCA y recolectando el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple expresado por la célula huésped. La presente invención proporciona además una proteína que comprende dos o más polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple con la capacidad de conjugación especifica del sitio en la forma de una proteína de enlace de antígenos multivalente en la forma de dímeros, trímeros, tetrámeros y similares. La proteína multivalente de la presente Invención se prepara a través de métodos conocidos en la técnica en donde cada SCA se enlaza a través de enlazadores covalentes o no covalentes, por ejemplo, enlazadores de péptidos, enlazadores de disulfuro y similares. En una opción alternativa, la proteína se ensambla con enlazadores no covalentes reduciendo y redoblando los polipéptidos SCA constituyentes. En la ultima opción, es particularmente preferido que el enlazador de péptido de las proteínas o péptidos de enlace de antígeno de cadena simple constituyentes fluctúen en tamaño de 2 a 18 residuos. La presente invención proporciona además una proteína multivalente que tiene los residuos Cis particulares en uno o más de los polipéptidos SCA constituyentes, esto es codificados como una proteína multivalente, simple. Un polinucleótido que codifica dicha proteína multivalente de cadena simple también esta contemplado como parte de la presente invención. También se proporcionan métodos para utilizar los SCAs y conjugados de polímero de la presente invención. Simplemente a manera de ejemplo, uno de dichos métodos incluye los pasos de: contactar una muestra de la que se sospecha contiene TNFa con un reactivo que comprende un polipéptido o proteína multivalente de enlace de antígenos de cadena simple de acuerdo con la presente invención, y detectar si el polipéptido o proteína multivalente de enlace de antígeno de cadena simple de acuerdo con la presente invención, se ha enlazado al TNFa. En forma conveniente el polipéptido o proteína multivalente de acuerdo con la presente invención, se conjuga para un polímero de óxido de polialquileno. Para todos los métodos anteriores, el conjugado, ya sea el SCA o el polímero, se ancla opcionalmente a un substrato sólido. También se proporcionan métodos para tratar- o diagnosticar una enfermedad o padecimiento en un mamífero, por ejemplo, un humano, en donde los métodos comprenden administrar una cantidad efectiva del polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple que enlaza a TNFa de la presente invención, en donde el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple enlaza a TNFa y se administra en una cantidad efectiva para inhibir la toxicidad relacionada con TNFa. El polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple de la presente invención y/o los conjugados de polímero del mismo, se administran en cantidades que fluctúan desde aproximadamente 10pg/kg hasta aproximadamente 4,000 g/kg, y más preferentemente en cantidades que fluctúan desde aproximadamente 20pg/kg hasta aproximadamente 800pg/kg, incluso más preferente desde aproximadamente 20 g/kg hasta aproximadamente 400pg/kg, a través de cualquier ruta sistémica conocida en la técnica, en donde la dosis se repite según sea necesario para efectuar una respuesta clínica. También se contempla la administración mediante perfusión en las cadenas corporales, mediante inhalación o rutas intranasales, junto con la administración tópica, con el objeto de tratamiento sistémico, así como más condiciones localizadas que se benefician de los polipéptidos anti-TNFa, proteínas y compuestos conjugados por polímeros de la presente invención. Dichas condiciones incluyen, por ejemplo, síndromes de choque tóxico, y cualesquiera otros procesos inflamatorios conocidos en la técnica que responden a un tratamiento anti-TNFa. Breve Descripción de las Figuras La figura 1A, ilustra la secuencia de la molécula de ADN que codifica SCA 2-7-SC-1 (SEQ ID NO:1) que tiene la construcción VL-2 8-VH-his6 y muteína no Cis y la proteína expresada (SEQ ID NO:10). La figura 1B, ilustra la secuencia de la molécula de ADN que codifica 2-7-SC-2 (SEQ ID NO:2) que tiene la construcción VL-218-VH-his6 y que codifica un SCA con un Cis de término-C y la proteína expresada (SEQ ID NO: 11).
La figura 1C, ilustra la secuencia de la molécula de ADN que codifica 2-7-SC 3 (SEQ ID NO:3) que tiene la construcción VH-(GGGGS)3-VL-his6 y que codifica un SCA con un Cis de término-C y la proteína expresada (SEQ ID NO:12). La figura 1D, ilustra la secuencia de la molécula de ADN que codifica 2-7-SC-4 (SEQ ID NO:4) que tiene la construcción VL-218-VH y que codifica un SCA con un Cis de término-C y la proteína expresada (SEQ IN NO:13). La figura 1E, ilustra la secuencia de la molécula de ADN que codifica 2-7-SC-5 (SEQ ID NO:5) que tiene la construcción VL-218-VH-his6 y que codifica un SCA con un Cis en una posición enlazadora 2, y la proteína expresada (SEQ ID NO:14). La figura 1F, ilustra la secuencia de la molécula de ADN que codifica 2-7-SC-6 (SEQ ID NO:6) que tiene la construcción VL-218-VH-his6 y que codifica un SCA con un Cis en la posición enlazadora 2 y un Cis en el término-C y la proteína expresada (SEQ ID NO:15). La figura 1G, ¡lustra la secuencia de la molécula de ADN que codifica 2-7-SC-7 (SEQ ID NO:7) que tiene la construcción VH-(GGGGS)3-VL-hiss y que codifica un SCA con un Cis en la posición enlazadora 5 y la proteína expresada (SEQ ID NO:16). La figura 1H, ilustra la secuencia de la molécula de ADN que codifica 2-7-SC-7 (SEQ ID NO:7) que tiene la construcción VL-218-VH-his6 y que codifica un SCA con un Cis tanto en el término-N cómo en el término-C, y la proteína expresada(SEQ ID NO: 17). La figura 1-1, ilustra la secuencia de la molécula de ADN que codifica 2-7-SC-9 (SEQ ID NO: 9) que tiene la construcción VH-(GGGGS)3-VL-hiS6 y que codifica un SCA sin Cis libre, y la proteína expresada (SEQ ID NO:18). La figura 2A, ilustra le expresión del clon 2-7-SC-2 SCA. La expresión de la proteína SCA se induce a través del 1% de metanol o MeOH en cultivo pichia. 27 kDa se marca a través de la flecha ("— "). La figura 2B, ilustra los datos de expresión y purificación del clon 2-7-SC-2, incluyendo el análisis del gel SDS-PAGE mediante manchado Azul Coomassie de las fracciones, y el rendimiento en cada paso. Es visible una pequeña cantidad del dímero enlazado mediante disulfuro -54 kDa en el gel manchado. Leyenda: STD, estándares de peso molecular de proteína Marca 12; SUP, sobrenadante de cosecha de fermentación; DIA, sobrenadante diafiltrado; DEAE, primer cromatografía de flujo de DEAE; Ni + + , muestra eluída después de cromatografía por afinidad de níquel; DEAE, segunda cromatografía DEAE. Los picos son visibles en aproximadamente 27 kDa, identificados mediante la zanahoria ">". La figura 3A, ilustra la estructura de mPEG-MAL. La figura 3B, ilustra la estructura de mPEG2(MAL). La figura 3C, ilustra la estructura de mPEG( AL)2 La figura 3D, ilustra la estructura de m PEG2(M AL)2. La figura 3E, ilustra la reacción del PEG-MAL activado con un tiol-SCA. La figura 3F, ilustra un PEG activo de vinilsulfona. La figura 4, es un trazo de espectrografía de absorbancia versus longitud de onda entre 200 y 400 nm. La curva A es cisteina 3mM; la curva B es PEG-MAL (1Mm) + cisteína (3Mm) post-reacción ; y la curva C es PEG- AL (1mM). La figura 5A, ilustra un análisis de conjugados 2-7-SC-5 y 2-7-SC-5 con visualizacion mediante manchado con azul brillante. La columna 1 proporciona los estándares de tamaño de proteína de Marca 12 (Invitrogen) la columna 2 es SCA 2-7-SC-5 no conjugado, la columna 3 es SCA PEG(20K)2-7-SC-5 y la columna 4 es SCA PEG (40K)2-7-SC-5. La figura 5B, ilustra un análisis SDS-PAGE de conjugados 2-7-SC-5 y 2-7-SC-5 con visualizacion mediante manchado con yodo. La columna 1 proporciona estándares de tamaño de proteína MARK 12, la columna 2 es SCA 2-7-SC-5 no conjugado, la columna 3 es SCA PEG(20K) 2-7-SC-5 y la columna 4 es SCA PEG (40K)2-7-SC-5. La figura 6A, ilustra análisis de citometría de flujo del enlace de TNFa biotinilado al receptor de la célula en la presencia de SCA 2-7-SC-2. La curva 1 representa la población celular sin etiquetación con fluorescencia, la curva 2 representa la población celular después de enlazar a TNFa-biotini y posteriormente estreptavidina-PE, la curva 3 representa la población celular preincubada con SCA, biotin-TNFa, y posteriormente estreptavidina-PE.. La figura 6B, ilustra el análisis de citometría de flujo del enlace de TNFa biotinilado para el receptor de la célula en la presencia de SCA 2-7-SC-2PEG(20K).l_a curva 1 representa la población celular sin etiquetación de fluorescencia, la curva 2 representa la población celular después de enlazar a biotina-TNFa y posteriormente a estreptavidina-PE, la curva 3 representa la población celular preincubada con PEG-SCA, biotina TNFa y posteriormente a estreptavidina-PE. La figura 6C, ilustra el análisis de citometría de flujo del enlace de TNFa biotinilado al receptor de la célula en la presencia de SCA 2-7-SC-2 PEG(40K). La curva 1 representa la población celular sin etiquetación con fluorescencia, la curva 2 representa la población celular después del enlace a biotina-TNFa y posteriormente estreptavidina-PE, la curva 3 representa la población celular preincubada con PEG-SCA, TNFa y posteriormente a estreptavidina-PE . La figura 7, muestra un análisis de manchado Western de la proteína SCA D2E7 2-7-SC-2 y los derivados PEG-SCA. El anticuerpo de detección primaria fue anti-suero de conejo SCA de 2-7-SC-1 preparado de conejos inmunizados con la proteína SCA recombinante purificada. La columna 1 y 7, marcadores de peso molecular (250, 148, 98, 64, 50, 36, 22, 16, 6 y 4 kDa); columna 2, proteína SCA2-7-SC-2; columna 3, etil 2-7-SC-2, columna 4, PEG (5 kDa)-2-7-SC-2; columna 5, PEG (20 kDa)-2-7-SC-2; columna 6, PEG (40 kDa)-2-7-SC-2. La figura 8, muestra la intensidad de imagen explorada de las bandas D2E7 2-7-SC-2 y de las formas PEGiladas que confirman la reactividad de este anti-suero anti-D2E7 con las proteínas SCA recombinantes y conjugados PEG-SCA. La Banda A es 2-7-SC-2, la Banda B es 2-7-SC-5, la Banda C es PEG(20k)-2-7-SC-2, la Banda D es PEG(20K)-2-7-SC-5, la Banda E es PEG(40k)-2-7-SC-2, la Banda F es PEG(40k)-2-7-SC-5. La figura 9, muestra el análisis SDS-PAGE de un grupo representativo de muestras de los estudios farmacocinéticos. Se revisaron las proteínas SCA 2-7-SC-2 y los conjugados 2-7-SC-2 PEG-SCA en geles manchados con azul Coomassie. En el gel del lado izquierdo, las muestras cargadas fueron no reducidas. En el gel del lado derecho las muestras fueron reducidas con 3 mM de beta-mercaptoetanol calentadas a una temperatura de 85°C durante 2 minutos antes de la carga. Se cargaron aproximadamente 10 microgramos de proteína para cada columna. Leyenda: M M-estándares de peso molecular, columna 1, SCA 2-7-SC-2, columna 2, SCA 2-7-SC-2 modificado con N-etilmaleimida; columna 3, SCA-PEG(40kDa) 2-7-SC-2; columna 4, SCA-PEG (20kDa) 7-SC-2.
Descripción Detallada del Invento De acuerdo con la presente invención se proporcionan polipéptidos y/o proteínas multivalentes de enlace de antígenos de cadena simple anti-TNFa mejorados comprendidos de dichos polipéptidos, con grupos funcionales construidos seleccionados para facilitar la conjugación dirigida al sitio para polímeros, por ejemplo, polímeros substancialmente no antigénicos. También se proporcionan conjugados de los polipéptidos de la presente invención, con polímeros, así como métodos para elaborar y utilizar los mismos. La presente invención se relaciona ampliamente con el descubrimiento de que las proteínas de enlace de antígenos de cadena simple ("SCA") o fragmentos de anticuerpos variables de cadena simple ("sFv"), tienen propiedades mejoradas cuando se conjugan con polímeros de óxido de polialquileno adecuados en ubicaciones específicas en el polipéptido SCA. Los SCAs de la presente invención están construidos para incluir grupos funcionales para conjugación de polímeros selectiva en dichas ubicaciones específicas. Los beneficios de la conjugación de polímeros incluyen ampliamente antigenicidad substancialmente reducida in vivo, y vida promedio en la circulación incrementada después de la administración a un paciente animal o humano. Sin pretender limitarse a alguna teoría o hipótesis con respecto a cómo los SCAs de la presente invención proporcionan conjugados con propiedades deseables, se considera que, al construir los sitios de enlace en ubicaciones seleccionadas en la cadena o cadenas de polipéptido, se puede evitar o minimizar la interferencia con función de enlace de antígenos y estructura terciaria de cadena a través de la presencia del polímero(s) conjugado. Con el objeto de apreciar de mejor manera el alcance de la presente invención, se definen los siguientes términos. El término "molécula de enlace de antígeno de cadena simple" ("SCA") o "Fv de cadena simple" (sFv) se utilizan de manera intercambiable en la presente invención, a menos que se especifique lo contrario. Los términos, "proteína" y "polipéptido" también se pueden utilizar de manera intercambiable a menos que se especifique lo contrario. Ampliamente, un SCA se define estructuralmente como que comprende la parte de enlace de un primer polipéptido de la región variable de un V|_ de anticuerpo (o VH) asociado con la parte de enlace de un segundo polipéptido de la región variable de un VH de anticuerpo (o VL), estando unidos los dos polipéptidos a través de un enlazador de péptido que enlaza el primero y segundo polipéptidos en una sola cadena de polipéptido, de modo que el primer polipéptido tenga terminal-N con el enlazador y el segundo polipéptido tenga term¡nal-C con el primer polipéptido y enlazador. El SCA comprende por lo tanto un par de regiones variables conectadas a través de un enlazador de polipéptido. Las regiones pueden estar asociadas para formar un sitio de enlace de antígenos funcional, como en el caso en donde el par de regiones variables de cadena ligera y cadena pesada con regiones de determinación de complementariedad emparejados de manera adecuada (CDRs). En este caso, la proteína de cadena simple es ampliamente referida como una "proteína de enlace de antígeno de cadena simple" o "molécula de enlace de antígenos de cadena simple" o "polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple". Tal como se definió anteriormente, los SCAs son opcionalmente "monovalentes" o "multivalentes". Los SCAs monovalentes están construidos para incluir un solo sitio de enlace de antígeno, es decir, un solo par de regiones variables conectadas a través de un enlazador de polipéptido que se asocia para formar el sitio de enlace de antígeno. Los SCAs multivalentes son proteínas de enlace de antígeno construidas para incluir dos o más sitios de enlace de antígeno, es decir, dos o más pares de regiones variables conectadas a través de un enlazador de polipéptido, incluyendo SCAs que incluyen dos o más polipéptidos de enlace de antígeno de cadena simple tal cómo se describió anteriormente. Las porciones SCA constituyentes son asociadas a través de cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad, las proteínas de enlace multivalente de acuerdo con la presente invención incluyen dos o más SCAs que están asociadas en forma no covalente para permanecer completamente funcionales como proteínas de enlace de antígeno. En otra modalidad, las proteínas de enlace multivalente incluyen dos o más SCAs que están asociados mediante enlace covalente, por ejemplo, a través de una de diversas químicas de enlace con péptido y sin péptido conocidas en la técnica. Además, las proteínas de enlace multivalente, por ejemplo, formadas de SCAs plural pueden expresarse o construirse en forma sintética como una cadena de péptidos simple, en forma análoga a un SCA monovalente aunque con dos o más dominios SCA repetidos, que son los mismos o diferentes. Los SCAs se construyen de modo que el VL sea el dominio de terminal-N seguido del enlazador y VH (construcción de VL-enlazador -VH). En una modalidad alternativa, los SCAs se construyen de modo que VH sea el dominio de terminal-N seguido del enlazador y VL (construcción VH-enlazador -VL). La modalidad preferida contiene VL en el dominio de terminal-N (ver la publicación de Anand, N.N., y asociados, J. Biol. Chem. 266:21874-21879 (1991)). Opcionalmente se emplean enlazadores múltiples . Una descripción de la teoría y producción de proteínas de enlace de antígenos de cadena simple se encuentra en la publicación de Ladner y asociados, Patentes Norteamericanas Nos 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030 y 5,518,889, y en la publicación de Houston y asociados, Patente Norteamericana No 5,091,513 ("sitios de enlace de anticuerpo biosintetico" (BABS)), incorporadas todas a la presente invención como referencia. Los SCAs producidos de acuerdo con las patentes anteriores, tienen especificidad de enlace y afinidad substancialmente similar a las del fragmento Fab correspondiente. Dominios Variables (Fv) Los SCAs de la presente invención se construyen con dominios variables (" Fv" ) que se seleccionan, derivan o modelan a partir de cualquier anticuerpo natural o artificial deseable. En otra modalidad preferida, Fv para utilizarse en la presente invención, se obtienen de bibliotecas de Fvs configuradas como bibliotecas de permuta, clasificadas contra un objetivo (s) de enlace deseado. Simplemente a manera de ejemplo, se han empleado grandes cantidades de MAbs en la técnica para obtener dominios Fv y se contempla que se pueden obtener dominios Fv, y se emplean en los SCAs de la presente invención, a partir de cualesquiera de estos. Simplemente a manera de ejemplo, y sin limitación, los siguientes MAbs se emplean para proporcionar dominios Fv: 26-10, MOPC 315, 741F8, 520C9, McPC 603, D1.3, phOx de múrido, phOx de humano, RFL3.8 sTCR, 1A6, Sel55-4, 18-2-3, 4-4-20, 7A4-1, B6.2, CC49, 3C2, 2c, MA-15C5/K 2G0, Ox, etc. (ver la publicación de Houston, J. S. y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. (EU A) 85:5879-5883 (1988); Houston, J. S. y asociados., SIM News 38(4) (Supp.):1_i (1988); McCartney, J. y asociados., ICSU Short Reports 1_0.:114 (1990); McCartney, J. E. y asociados, resultados no publicados(1990); Nedelman, M. A. y asociados., J. Nuclear Med. 32 (Supp.):1005 (1991); Houston, J. S. y asociados., In: Molecular Design and Modelina: Concepts and Applications, Part B, editado por J. J. Langone, Methods in Enzvmoloav 203:46-88 (1991); Houston, J. S. y asociados., In: Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncoloqy. Epenetos, A. A. (Ed). London, Chapman & Hall (1993); Bird, R. E. Y asociados., Science 242:423-426 (1988); Bedzyk.W. D. y asociados J. Biol. Chem. 265:186 5-18620 (1990); Colcher, D. y asociados., J. Nat. Cáncer Inst. 82:1191-1197 (1990); Gibbs, R. A. y asociados., Proc. Nati. Acad. Sci. (EU A) 88_:4001-4004 (1991); Milenio, D. E. y asociados Cáncer Research 51:6363-6371 (1991); Pantoliano, M. W. y asociados., Bíochemistrv 30.: 10 7-10125 (1991); Chaudhary, V. K. y asociados., Nature 339:394-397 (1989); Chaudhary, V.K. y asociados., Proc. Nati, Acad. Sci. (EUA) 8_7:1066-1070 (1990); Batra, J. K. y asociados., Biochem. Biophvs. Res. Comm. 171:1-6 (1990); Batra, J. K. y asociados., J. Biol. 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Chem. 266:19717-19724 (1991); Anand, N. N. y asociados., J. Biol. Chem. 266:21874-21879 (1991); Fuchs, P. y asociados., Bio/Technol. 9:1369-1372 (1991); Breitling, F. y asociados., Gene 104: 104-153 (1991); Seehaus, T. y asociados., Gene 114:235-237 (1992); Takkinen, K. y asociados., Protein Enanq. 4:837-841 (1991); Dreher, M. L. y asociados., J. Immunol. Methods 139: 97-205 (1991); Mottez, E. y asociados., Eur. J. Immunol. 21 :467-471 (1991); Traunecker, A. y asociados., Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA) 8_8:8646-8650 (1991); Traunecker, A. y asociados., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); Hoo, W. F. S. y asociados., Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA) 89_:4759-4763 (1993)). En donde todas las publicaciones anteriores están incorporadas a la presente invención como referencia. En particular, el MAb anti-TNFa descrito como D2E7 en la Patente Norteamericana No. 6,258,562, y el MAb anti-erbB-2 (HERCEPTIN™) descrito por Cárter P y asociados, 1992, Proc Nati Acad Sci (EUA) 89: 4285-4289 sirvieron como modelos de ejemplo, para construir SCAs y conjugados de óxido de polialquileno-SCA de acuerdo con la presente invención. D2E7 esta comercialmente disponible como Humira® (Abbott Immunology, Abbott Park, Illinois). Además el MAb CC49 fue desarrollado por el grupo del Dr Jeffrey Schlom's, Laboratory of Tumor Immunology and Biology, National Cáncer Institute. Enlaza específicamente al antígeno de tumor pan-carcinoma TAG-72. Ver la publicación de Muraro, R. y asociados., Cáncer Research 48: 4588-4596 (1988). El SCA CC-49 anti-TAG-72 descrito por Filpula y asociados 1996 (Antibody Engineering: A Practica! Approach, Oxford University Press, pp 253-268), también fue preparado como un SCA modificado por Cis y como un conjugado de ejemplo de acuerdo con la presente invención. Todas las menciones anteriores están incorporadas a la presente invención como referencia. Enlazadores de Péptido Los SCAs de acuerdo con la presente invención incluyen enlazadores de péptido designados para abarcar el término-C de VL, o el sitio vecino del mismo, y el término-N de VH o el sitio vecino del mismo, o para enlazar al término-C de VH y al término-N de VL. Los expertos en la técnica apreciaran que la longitud de enlace depende de la naturaleza de los polipéptidos que serán enlazados y de la actividad deseada del polipéptido de fusión enlazada que resulta del enlace. Generalmente, el enlazador debe ser lo suficientemente largo para permitir que el polipéptido de fusión enlazado resultante se doble adecuadamente en una conformación que proporcione la actividad biológica deseada, es decir, enlace de antígenos. En cada caso en particular, la longitud preferida dependerá de la naturaleza de los polipéptidos que serán enlazados y la actividad deseada del polipéptido de fusión enlazada que resulta del enlace. Cuando está disponible una información de conformación, como en el caso de polipéptidos SCA que se describen más adelante, se puede estimar la longitud de enlace adecuada mediante la consideración de la conformación tridimensional de los polipéptidos substitutos y la conformación deseada ante ,el polipéptido de fusión enlazado resultante. Cuando no está disponible la información, la longitud enlazadora adecuada puede ser determinada en forma empírica probando una serie de polipéptidos de fusión enlazada con enlazadores de diversas longitudes para la actividad biológica deseada. Tales enlazadores se describen con detalle en la publicación WO 94/12520, incorporada a la presente invención como referencia. Los enlazadores de péptido utilizados para construir polipéptidos SCA fluctúan generalmente en tamaño desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 50 residuos de aminoácido de longitud y preferentemente, desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 residuos. En otras ciertas modalidades, los enlazadores fluctúan en tamaño desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 30 residuos. En ciertas modalidades más preferidas, particularmente modalidades relacionadas con enlazadores multivalentes que comprenden 2 o más polipéptidos SCA asociados en forma no covalente, se prefiere que el enlazador fluctúe en tamaño desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 20 residuos de aminoácido. Más preferentemente, dichos enlazadores son ricos en cerina o ricos en glicina. Los enlazadores se diseñan para ser flexibles, y se recomienda que se utilice una secuencia subyacente de los residuos Gly y Ser alternativos. Para mejorar la solubilidad del enlazador y la proteína Fv de cadena simple asociada con el mismo, se pueden incluir tres residuos cargados, dos residuos de licina cargados en forma positiva (K) y un residuo de ácido glutámico cargado en forma negativa (E). Preferentemente, se coloca un residuo de licina cerca del término-N de VH , para reemplazar la carga positiva perdida cuando se forma el enlace de péptido del enlazador y el VH. Dichos enlazadores se describen con detalle a través de la Patente Norteamericana de co-propiedad No. 5,856,456, incorporada a la presente invención como referencia ver también la publicación de Whitlow.M., y asociados., Protein Enqnq 7:1017-1026 (1994), incorporada a la presente invención cómo referencia. Para proteínas de enlace de antígenos multivalente de acuerdo con la presente invención, la asociación covalente o no covalente de dos o más polipéptidos SCA es preferida por su formación. Aunque se pueden producir SCAs multivalentes de SCA con enlazadores tan largos como de 25 residuos, tienden a ser inestables. Hollinger, P., y asociados., Proc. Nati. Acad. Sci (EUA) 90:6444-6448 (1993), ha demostrado recientemente que los enlazadores de 0 a 15 residuos de longitud facilitan la formación de Fvs divalentes. Ver la publicación de Whitlow, M., y asociados., Protein Enana 7:1017-1026 (1994); Hoogenboom, H. R., Nature Biotech. 15.:125-126 (1997); y la publicación WO 93/11161, incorporada a la presente invención como referencia. Identificación y Síntesis de Secuencias de PEGilación Específicas del Sitio La presente invención proporciona porciones funcionales de t i o 1 , por ejemplo, un residuo de aminoácido que contiene t i o I localizado en sitios específicos en las regiones VL y VH adyacentes al término-C del polipéptido (VL,VH o un sitio vecino del mismo ), el término-N del polipéptido (VL, VH o sitio vecino del mismo), la región enlazadora entre la primera y segunda regiones del polipéptido o en una combinación de estas regiones. En la presente invención, se prefiere que los sitios específicos para la conjugación de polímeros se localice en el enlazador de polipéptido, el término-C o adyacente al término-C del SCA, y preferentemente, en el segundo residuo del enlazador.
El grupo funcional que contiene tiol puede ser cualquiera conocido en la técnica, incluyendo residuos de aminoácidos naturales, y/o residuos de aminoácidos que no ocurren naturalmente, así como que tengan derivados funcionalizados por tiol de los mismos. En una modalidad preferida, la porción funcional de tiol es un residuo de cisteina. Esto se prefiere debido a que las proteínas SCA normalmente tienen dos enlaces de disulfuro enterrados (Padlan EA, 1994, antibodv-Antigen Complexes, R. G. Landes Company, Austin), pero no cisteínas libres. Por lo tanto, únicamente los tioles Cis construidos están disponibles para conjugación con polímeros activados selectivos para reacción con tioles. La secuencia de nucleótidos particular que se utiliza para introducir un sitio Cis en las diversas posiciones, dependerá de la secuencia de nucleótidos que ocurren naturalmente. Los sitios más preferidos son aquellos en los cuáles se toma un número mínimo de cambios para crear la inserción Cis y al mismo tiempo se cumple con los requerimientos esféricos antes descritos. Por supuesto, con base en la redundancia del código genético, se puede codificar un aminoácido en particular a través de múltiples secuencias de nucleótidos. Cualquier método conocido en la técnica para mutagénesis dirigida al sitio se utiliza para cambiar la secuencia de proteína nativa a una que incorpore el residuo Cis. El gen de proteína mutante se coloca en un sistema de expresión, tal cómo células bacterianas, levadura u otras células fúngicas, células de insectos o células mamíferas. La proteína mutante se purifica posteriormente a través de métodos de estándar para recuperación de proteínas. Preferentemente, las moléculas de ácido nucleico que expresan muteínas SCA se producen mediante mutagenesis dirigida a oligonucleótidos. Dichos métodos para generar las muteínas Cis específicas de sitio y técnicas relacionadas para mutagénesis de ADN clonado, son bien conocidas en la técnica. L a publicación de Sambrook y asociados., MOLECULAR CLON I NG: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel y asociados (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. John Wiley and Sons (1987), ambas incorporadas, a la presente invención como referencia. Huéspedes y Vectores Después de montar la secuencia de nucleótidos de un SCA de interés para proporcionar un residuo Cis en el lugar deseado, el ácido nucleico mutado se inserta preferentemente en un vector de fundación adecuado, en donde el nucleótido que codifica el SCA se enlaza en forma operativa a secuencias reguladoras que controlan la expresión de trascripción. Estos se seleccionan preferentemente a través de técnicas conocidas en el arte con el objeto de optimizar la producción SCA de un sistema de célula huésped deseado. Los SCAs son conocidos por ser expresados y producidos por células huésped procarióticas o eucarióticas, aunque se prefieren muchos propósitos de células huésped eucarióticas. Los huésped procarióticos preferidos, incluyen pero no se limitan a, bacterias tales como Bacillus, Streptomyces, Streptococci , y/o Escherichia coli. Las células huésped eucarióticas preferidas, incluyen levadura u otra células fúngicas, células de insecto y/o células de mamífero. Preferentemente, estos incluyen células de humano o primate, que se encuentran ya sea in vivo, o en cultivo de tejido. Más preferentemente, los SCAs de la presente invención se producen mediante levadura transformada, tal como Pichia pastoris. Los vectores de expresión se seleccionan opcionalmente para proporcionar una expresión temporal en una célula huésped, o para integrarse en el genoma de la célula huésped para crear una línea celular transformada. Se utilizan métodos de purificación de proteína estándares para purificar estas proteínas mutantes. Se requiere únicamente una modificación menor al esquema de purificación de proteína nativo. Por ejemplo, la selección de vectores, huéspedes, métodos de producción, aislación y purificación de formas de proteínas monovalentes, multivalentes y de fusión, especialmente polipéptidos SCA, se describen profundamente por ejemplo en las Patentes Norteamericanas de co-propiedad Nos. 4,946,778 y 6,323,322 incorporadas a la presente invención como referencia. En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico que codifica un SCA de interés y un marcador de selección, se integran en un cromosoma de célula huésped, ya sea como un solo vector o como vectores introducidos en conjunto. El marcador puede complementar una auxotropía en el huésped (tal como his4, Ieu2, o ura3, los cuales son marcadores auxotróficos de levadura comunes) resistencia a biocidas, por ejemplo, antibióticos, o resistencia a metales pesados tales como cobre o similares. El gen marcador seleccionable puede ser ya sea enlazado directamente a la secuencia de ADN SCA que será expresada, o introducidos en la misma célula mediante co-transfección. Las células que tienen integradas de manera estable el ácido nucleico introducido se seleccionan a través de supervivencia u otros efectos del marcador en un sistema determinado. En otra modalidad, el SCA de interés se codifica a través de un vector de plásmido adecuado con la capacidad de réplica autónoma en la célula huésped receptora.
Cualesquiera de una amplia variedad de vectores conocidos en la técnica, pueden ser empleados para este propósito. Los factores de importancia para seleccionar un plásmido en particular o vector viral incluyen: la facilidad con la cual las células receptoras que contienen el vector pueden ser reconocidas y seleccionadas de dichas células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un huésped en particular; y si es deseable tener la capacidad de "transbordar" el vector entre células huésped de diferentes especies. Cualesquiera de una serie de sistemas de vector de levadura pueden ser utilizados. Los ejemplos de dichos vectores de expresión incluyen el círculo de levadura de 2 mieras, los plásmidos de expresión YEP13, YCP y YRP, etc., o sus derivados. Dichos plásmidos son bien conocidos en la técnica (Botstein y asociados., Miami Wntr. Svmp. 19:265-274 (1982); Broach, J.R. In: The Molecular Bioloqy of the Yeast Saccharomvces:Life Cvcle and Inheritance. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., p. 445-470 (1981). Para un huésped mamífero están disponibles varios sistemas de vector conocidos en la técnica. Una clase de vectores utiliza elementos de ADN que proporcionan plásmidos extra-cromosomales de réplica autónoma derivados de víruses animales tales como virus de papiloma de bovino, virus de polioma, adenovirus o virus SV40. Una segunda clase de vectores descansa en la integración de las secuencias de gen deseadas en el cromosoma huésped. Las células que han sido integradas en forma estable al ADN introducido en sus cromosomas, son marcadores seleccionados tal como se describió supra. Se pueden necesitar elementos adicionales para síntesis óptima del mARN. Estos elementos pueden incluir señales de división, así como promotores, aumentadores y señales de término de transcripción. Los vectores de expresión de cADN que incorporan dichos elementos, incluyen aquellos que se describen en la publicación de Okayama, H., ol.Cell.Biol. 3:280 (1983), así como otros conocidos en la técnica Entre los vectores preferidos para utilizarse en bacterias se incluyen pQE70, pQE60 y pQE-9, disponible en Qiagen; vectores pBS, vectores Phagescript, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles en Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponibles en Farmacia. Los vectores eucarióticos disponibles preferidos son pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 y pSG disponibles en Strategene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles en Pharmacia. Los vectores preferidos para expresión en Pichia son pHlL-S-1 (Invitrogen Corpo.) y pPIC9 (Invitrogen Corp.). Los expertos en la técnica podrán apreciar fácilmente otros vectores adecuados. Una vez que el vector o secuencia de ADN que contiene las construcciones se ha preparado para expresión, se pueden introducir o transformar las construcciones de ADN en un huésped adecuado. Se pueden emplear diversas técnicas, tal como transformación, transí ección , fusión de protoplasto, precipitación de fosfato de calcio, electroporacion u otras técnicas convencionales. Una vez que las células han sido transformadas con la molécula de ADN (o A N) recombinante, las células se crecen en el medio y se clasifican para las actividades adecuadas. La expresión de la secuencia da como resultado la producción del SCA mutante para conjugación PG de la presente invención. Producción y Purificación de Proteínas SCA Las proteínas de enlaces de antígenos monovalentes o multivalentes de la presente invención, pueden producirse a través de cualesquiera métodos producidos en la técnica adecuados. Ampliamente, el método incluye preparar un vector de expresión adecuado, expresar el vector en una célula huésped compatible, cultivar las células huésped y recuperar la proteína deseada. Para la expresión en células procarióticas u otras células cultivadas que no tienen la capacidad de segregar la proteína recombinante en el medio de cultivo, la recuperación es a partir de las células recolectadas. El material celular recolectado, se somete a lisis y lavado celular, solubilización de los cuerpos de inclusión formados en un solvente de desnaturalización compatible, redobles mediante dilución bajo condiciones efectivas para proporcionar el repliegue en una proteína de enlace de función, y dos pasos de cromatografía HPLC de intercambio de iones. Los sistemas de expresión procariótica preferidos, incluyen, por ejemplo, Escherichia coli ("E. coli"). Ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030, 5,518,889 Y 5,534,621, así como la publicación de Bird y asociados., Sciencie 242S:423 (1988), también incorporada a la presente invención como referencia. El trabajo inicial en cuanto a la expresión de las proteínas SCA ejemplificadas emplearon el sistema de expresión de E. coli obtenido de Xoma Corporation (promotor araB y señal pe1B). La proteína SCA se expresó en forma exitosa. Sin embargo, las proteínas expresadas mediante el sistema Xoma Corp. permanecieron asociadas a la célula en el periplasma, y podría requerirse pasos de purificación adicionales. Un sistema de expresión más preferido emplea células huésped eucarióticas y un vector de expresión con una secuencia de señal de secreción. Esta modalidad preferida evita la necesidad de recuperar el SCA expresado en la forma de cuerpos de inclusión insolubles procedentes de células huésped E. coli. Existe una cantidad de estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes y un gran número de copias de plásmido que pueden utilizarse para la producción de las proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce secuencias líder en productos de gen de mamífero clonados, y segrega péptidos que contienen secuencias líder (es decir, pre-péptidos). Por esta razón, las proteínas SCA ejemplificadas en la presente invención, se expresaron todas mediante la secreción a partir de Pichia pastoris de levadura y se recuperaron de la solución. Proteínas SCA con Dominios Variables D2E7 MAb En una modalidad particularmente preferida, las SCAs de acuerdo con la presente invención se desarrollaron empleando dominios variables de D2E7 MAb. El D2E7 MAb fue desarrollado por Cambridge Antibody Technology and BASF Corporation. Su enlace en forma específica a una citocina humana, factor alfa de necrosis de tumor (TNFa), y el MAb se describió con detalle en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,09,0382, 6,258,562, incorporadas a la presente invención como referencia. Los dominio seleccionados para este anticuerpo sirvieron como modelos para preparar un número de moléculas SCA de ejemplo que tienen uno o más residuos Cis incorporados en sus respectivas secuencias de polipéptido en ubicaciones específicas. En síntesis, se construyó un gen completamente sintético mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando 14 oligonucleótidos sintéticos de traslape largo, que fluctúan desde 20 pares base hasta 102 pares base de longitud. La mutagénesis dirigida por oligonucleótido se empleó en forma adicional para construir otras variantes de la secuencia original. Las SCAs se codificaron mediante vectores resultantes que contienen los segmentos ligeros variables (VL) y pesados variables (VH) completos del D2E7 MAb, conectados a través de un enlazador de péptido. Los enlazadores ejemplificados tuvieron un enlazador de dieciocho residuos designado como "enlazador-218", y un enlazador de 15 residuos. El "enlazador-218" de dieciocho aminoácidos ha sido descrito por Filpula y asociados, 1996, Antibodv Engineering: A Practical Approach. 1996, Oxford University Press, pp 253-268). El enlazador largo (GGGGS)3 de 15 aminoácidos (SEQ ID NO:42) ha sido descrito por Huston JS y asociados., 1988, Proc Nati Acad Sci (EUA 85:5879-5883. En algunos casos, se incluyó una marca de histidina-seis (his6) (SEQ ID NO:43) en el término-C para simplificar la purificación a través de cromatografía de afinidad-iones de metal (IMAC) inmovilizada por metal. Se clonaron los genes en un plásmido de E. coli para la confirmación de secuencia de ADN en un analizador genético ABI PRIMS®310 procedente de Applied Biosystems (Foster City, California) (el primero producido por ABI/Perkin-Elmer). Las orientaciones, enlazadores y lugar del dominio de la cisteína libre, se resumen en la tabla 1 que se encuentra a continuación. TABLA 1 : CLONES SCA CON D2E7Fv Clon Cis Libre SCA SEQ ID Nos. DISEÑO en FIGS. Nos. Posiciones 2-7-SC-1 SEQ ID N0:1 VL-218-VH-hls6 Ninguna 1A 2-7-SC-2 SEQ ID NO:2 VL-218-VH-h¡s6 Término-C 1B 2-7-SC-3 SEQ ID N0:3 VH-(GGGGS)3-Vu-his6 Término-C 1C 2-7-SC-4 SEQ ID NO:4 VL-218-VH Término-C 1D 2-7-SC-5 SEQ ID N0:5 VL-218-VH- iS6 Posición de enlazador 2 1E 2-7-SC-6 SEQ ID NO:6 VL.218-VH-h¡S6 Posición de enlazador 2 y 1F Término-C 2-7-SC-7 SEQ ID N0:7 VH-(GGGGS)3-VL-h¡se Posición de enlazador 5 1G 2-7-SC-8 SEQ ID NO:8 VL-218-VH-his6 Tanto término-N como término-C 1H 2-7-SC-9 SEQ ID NO:9 VL.GGGGS-VH-h¡s6 Ninguna 1-1 Tal como se resume en la tabla 1 anterior, las figuras 1A, 1B, 1C, 1E, 1F, 1G, 1H y 1-1 presentan el ADN y las secuencias de polipéptidos codificadas de los nueve genes anteriores. Expresión y Purificación recombinante de proteínas SCA Tal como se observó anteriormente, se empleó Pichia pastoris para la producción de las proteínas variantes SCA descritas anteriormente. La secuencia de señal de la levadura alfa que coincide con el factor, se insertó directamente al frente de la secuencia de codificación madura de cada una de estas proteínas SCA. La secuencia de aminoácido de éste péptido de señal es Met Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala " Ala (SEQ ID NO:36) en donde indica el sitio de disociación. Un 20vo aminoácido de la señal (la alanina después de ") también se incluyó en estas construcciones. Por consiguiente, el término amino de la proteína SCA madura contiene esta alanina, seguido, en cada SCA ejemplificada, de las secuencias de aminoácido completas ilustradas en las figuras 2A-2H (SEQ ID NOS. 1-9), respectivamente; tal como se enumera en la tabla 1). El análisis de secuencia de proteína de terminal-N confirmó que estas secuencias fueron procesadas en forma correcta. Los genes mutantes que expresan las SCAs D2E7 se ligaron en forma individual en el sitio EcoRI en el plásmido de transferencia Pichia pHIL-D2 (Invitrogen Corp.) y se transformaron en el huésped de Pichia pastoris de levadura GS-115.
Los protocolos detallados para estos procedimientos se presentan en el Manual de Instrucción de Equipo de Expresión Pichia No. de Catálogo X1710-01 (1994) de Invitrogen Corporation, incorporado a la presente invención como referencia. Se realizó la evaluación inicial de la expresión mediante manchado azul Coomassie de geles SDS-PAGE. El número de clones de las cepas de expresión Pichia de cada proteína SCA, corresponde a los números 2-7-SC en la tabla 1, anterior. Las proteínas SCA, (-27 kDa) expresaron y segregaron en altos niveles en Pichia recombinante (aproximadamente 20-100 mg/L). El análisis en geles SDS-PAGE en la ausencia de reductor, demostró la presencia esperada tanto de monómeros como de dímeros formados a través de una sola reticulación de disulfuro de dos monómeros. Se preparó antisuero de conejo versus la proteína SCA 2-7-SC-1 purificada. El análisis Western con este reactivo, verificó la identidad de las proteínas SCA expresadas. Por ejemplo, la figura 8 muestra un análisis de manchado Western representativo de D2E7 2-7-SC-2 y formas PEGiladas que confirman la reactividad de este antisuero anti-D2E7 con las proteínas SCA recombinantes y conjugados PEG-SCA. Se empleó el anticuerpo anti-enlazador-218. Se analizó 1 µg de cada muestra en de 4 a 20% de gel SDS-PAGE sin reducción. Los anticuerpos primarios y secundarios son anticuerpos anti-enlazador- 18 que surge en ratones y la peroxidasa de rábano conjugada por anticuerpo anti-ratón de cabra, respectivamente. El sustrato de enzimas fue el sustrato de peroxidasa TMBM de Moss, In. D2E7 2-7-SC-2 tiene PEG en el término-c y 2-7-SC-5 tiene PEG en el enlazador 218. La banda A es 2-7-SC-2, la Banda B es 2-7-SC-5, la Banda C es P EG (20k)-2-7-SC-2, la Banda D es PEG(20k)-2-7-SC-5, la Banda E es PEG(40k)-2-7-SC-2, la Banda F es PEG(40k)-2-7-SC-5. Las proteínas SCA se purificaron a partir de sobrenadantes de Pichia pastoris con una pureza mayor al 95% a través de dos o tres protocolos de cromatografía simples. Para las proteínas SCA que contienen una marca his6 (SEQ ID NO:43), se diafiltró el medio de fermentación dializado y se pasó a través de una columna DEAE, posteriormente se enlazó a un columna de afinidad de níquel IMAC (QUIAGEN). La proteína SCA enlazada se eluyó con imidazole; posteriormente fluyó a través de una segunda columna de intercambio de aniones DEAE. El flujo de diafiltró para la concentración de la proteína SCA y se caracterizó en forma adicional. Las proteínas SCA que carecen de la marca his6 (SEQ ID NO: 43), la proteína SCA fue ya sea purificada en una columna de agarosa-L de proteína con una elusión con pH bajo, obtenida de Pierce Biotechnology, Inc (Rockford, Illinois), y se capturó en cromatografía de intercambio de cationes HS, obtenido en Amersham Pharmacia (Piscataway, NJ), seguido de elución de gradiente de sal y diafiltración . La cromatografía HS fue el método preferido. Las figuras 2A y 2B muestran los datos de expresión y purificación representativos del clon 2-7-SC-2, incluyendo el análisis de gel SDP-PAGE mediante manchado azul Coomassie de las fracciones, y la producción en cada paso. Se puede observar una pequeña cantidad de dímero enlazado por disulfuro de -54 kDa en el gel manchado. Polímeros Activados Específicos de Tiol Preferentemente, las SCAs inventivas se enlazan a polímeros activados específicos de tiol. Específicamente, los polímeros activados empleados preferentemente en la presente invención, son aquellos que tienen un grupo de enlace de terminal selectiva de sulfhidrilo o tiol en al menos una terminal de los mismos. Algunos polímeros activados conocidos en la técnica, por ejemplo, polímeros de óxido de alquileno (PAO) reaccionan con tioles libres, se emplean fácilmente en la práctica de la presente invención. Los ejemplos de grupos reactivos incluyen maleimida, viniisulfona, tiol, disulfuro de ortopiridilo y yodoacetamida, siendo los más preferidos los polietilénglicoles activados por maleimida (PEG-mal's), en virtud de que el grupo maleimida es altamente específico para tioles y la reacción de conjugación tiene lugar bajo condiciones moderadas. Ver también por ejemplo la Patente Norteamericana de copropiedad No. 5,730,990 incorporada a la presente invención como referencia. También están disponibles polímeros-PEG activados selectivos de sulfh idrilo en Néctar Therapeutics (el primero en Shearwater Corporation) tal como se ilustra en el Catálogo Shearwater Corporation 2001 Ver también la publicación de Goodson, R.J. & Katre, N.V. 1990, Bio/Technoloav 8: 343; Kogan, T.P. 1992, Svnthetic Comm . 22, 2417, incorporado a la presente invención como referencia. Por ejemplo, los polímeros lineales mPEG-MAL (kDa) (por ejemplo, Catálogo Shearwater No. 2D3X0T01) y mPEG-MAL (20 kDa), así como el polímero ramificado mPEG2-MAL (40 kDa) (por ejemplo, Catálogo Shearwater No. 2D2M0H01) conjugados para las SCAs de la presente invención, son un ejemplo en la presente invención. Las estructuras de estos polímeros PEG-maleimida y la química de conjugación se muestran por conveniencia en las figuras de la 3A a la 3E. La figura 3F ilustra mPEG-vinilsulfona. Los diversos polímeros activados por maleimida reaccionan fácilmente con tioles libres, tal como se ilustra en la figura 3E. En la figura 3E "SCAs" es una proteína de acuerdo con la presente invención que tiene al menos un tiol libre (S-H). Ver tabla 2 que se encuentra a continuación.
TABLA 2 Nos. Figura Descripción Catálogos Nektar/ Shearwater Cat. Nos. FIG.3A peg-mal 2D2M0H01, 2D2M0P01 FIG.3B mPEG2(MAL) 2D3X0T01 FIG.3C mPEG( AL)2 2D2D0H0F, 2D2D0P0F Catálogo página 10 FIG.3F mPEG Vinilsulfona Las plataformas poliméricas adicionales que pueden incluir los enlazadores específicos de sulfhidrilo, incluyen aquellos que se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,643,575, 5,919,455, 6,113,906 (U-PEG's), 6,153,655 y 6,395,266 (PEG's ramificados en forma terminal), 6,251,382 (poliPEG's) y USSN 10/218,167 (bacines), etc. Ver también el catálogo de Shearwater Polymers, Inc. "Polyethylene Glycol and Derivatives 2001". La descripción de cada uno de los anteriores está incorporada a la presente invención como referencia. Tal como se mencionó anteriormente, la parte de polímero del conjugado es preferentemente un óxido de polialquileno. Más preferentemente, la parte de polímero es un polietilénglicol que es sustancialmente no antigénico. Aunque los PAO's y PEG's pueden variar sustancialmente en el peso molecular promedio, los que se incluyen en las composiciones de la presente invención tienen independientemente un peso molecular promedio desde aproximadamente 2,000 Da hasta aproximadamente 136,000 Da en los aspectos más preferidos de la presente invención. Más preferentemente, el polímero tiene un peso molecular promedio desde aproximadamente 3,000 Da hasta aproximadamente 100,000 Da. Más preferentemente, la parte de polímero tiene un peso molecular promedio desde aproximadamente 5,000 Da hasta aproximadamente 40,000 Da. Las sustancias poliméricas aquí incluidas son preferentemente solubles en agua a temperatura ambiente. Una lista no limitativa de dichos polímeros incluye homopolímeros de óxido de polialquileno tales como polietilénglicol (PEG), o polipropilénglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloques de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque. La confirmación de la reactividad específica de los polímeros de maleimida con cisteína libre pero sin Usina o histidina, se logró mediante la reacción de las maleimidas con estos aminoácidos libres respectivos. La figura 4, confirma la reactividad de cisteína con PEG-MAL activado. La absorbancia de cisteína, tal como una solución 3mM se muestra como la curva A. La curva de absorbencia para PEG-MAL activado en una concentración de 1mM, se muestra como la curva C y se caracteriza por un amplio pico de absorbancia centrado en 300 nm. La curva de absorbancia B se tomó de una solución que combina cisteína y PEG-MAL activado en una proporción de 1:3 (1 m PEG-MAL y 3 mM cisteína, 100 mM fosfato de sodio, pH 6.0, 1 mM EDTA, 25°C). No se encuentra una curva con un desplazamiento hacia la derecha, sino el pico ancho de 300 nM característico de PEG-MAL, lo que confirma la reactividad de cisteína con PEG-MAL activado. Las curvas de absorbancia análoga para histidina o lisina (no mostradas), confirman que estos residuos no son altamente reactivos bajo las condiciones empleadas. Conjugados Marcados o Etiquetados Al momento de producir un SCAs conjugadas con óxido de polialquileno de acuerdo con la presente invención, los conjugados se modifican opcionalmente de manera adicional enlazando o conjugando un agente de diagnóstico o terapéutico al conjugado de polímero-SCA. El método general para preparar un conjugado de anticuerpo de acuerdo con la presente invención, se describe en la publicación de Shih, L.B. y asociados., Cáncer Res. 51 : 4192 (1991); Shih, L.B., y D.M. Goldenberg, Cáncer Immunol. Immunother. 31:197 (1990); Shih, L. B. y asociados., Intl. J.
Cáncer 4.6:1101 (1990); Shih, L.B. y asociados., Intl. J. Cáncer 41 :832 (1988), las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia. El método indirecto comprende hacer reaccionar un anticuerpo (o SCA), cuyo óxido de polialquileno tiene un grupo funcional, con un polímero transportador cargado con uno o una pluralidad de molécula bioactivas, tales como, péptidos, lípidos, ácidos nucleicos (por ejemplo, complejos de fosfato-lisina), fármaco, toxina, quelador, moléculas etiquetadas detectables o con adición de boro. En ciertas modalidades alternativas, el SCA conjugado con óxido de polialquileno se conjuga directamente o se enlaza a un agente de diagnóstico o terapéutico. El procedimiento general es análogo al método de conjugación indirecto excepto que un agente de diagnóstico o terapéutico se adhiere directamente a un componente sFv oxidado. Ver la publicación de Hansen y asociados., Patente Norteamericana No. 5,443,953, incorporada a la presente invención como referencia. Composiciones Farmacéuticas y Administración de Conjugados SCA y/o Polímero-SCA. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención, pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un conjugado SCA y/o polímero-SCA de la presente invención.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva en dosis, y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado SCA y/o polímero-SCA puede variar de acuerdo con factores tales como estado de la enfermedad, edad, seco y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o parte del anticuerpo para elicitar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o parte de anticuerpo vale más que los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, ya que se utiliza una dosis profiláctica en sujetos antes de, o en una etapa anterior a la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor a la cantidad terapéuticamente efectiva. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas durante un tiempo o la dosis puede ser reducida o incrementada en forma proporcional tal como lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en formas de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación tal como se utiliza en la presente invención se refiere a unidades físicamente independientes adaptadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que serán tratados. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas de unidad de dosificación de la presente invención, están dictadas por, y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se logrará, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de elaboración de compuestos, tal como un compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Un rango no limitativo de ejemplo para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un conjugado de SCA y/o polímero-SCA de la presente invención es de 0.1-20 mg/kg, más preferentemente de 1-10 mg/kg. Se deberá observar que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y severidad de la condición que será aliviada.
Quedará entendido adicionalmente que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo a la necesidad individual y juicio profesional de quien administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los rangos de dosificación aquí establecidos son únicamente de ejemplo y no pretenden limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada. Composiciones Farmacéuticas En una modalidad adicional preferida, las SCAs de la presente invención, se emplean para tratar y/o diagnosticar condiciones relacionadas con la especificidad de enlace de una proteína SCA en particular de interés. Por lo tanto, se administra un conjugado de SCA y/o polímero-SCA a través de métodos conocidos en la técnica, a un animal o persona que tiene una enfermedad o padecimiento para la cual las proteínas de enlace del SCA administrados son útiles para tratar o diagnosticar dicha enfermedad o padecimiento. Preferentemente, el SCA está conjugado por polímero de acuerdo con la presente invención. Las SCAs y las SCAs conjugadas de la presente invención, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto, por ejemplo, un animal o persona que necesita de dicha administración. Normalmente, la composición farmacéutica comprende un polipéptido SCA que tiene al menos un tipo de especificidad de enlace, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antimicrobianos, por ejemplo, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y similares, que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina regulada por fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes de humectación o emulsificación, conservadores o reguladores, que aumentan la vida en anaquel o la efectividad del anticuerpo o parte de anticuerpo. Las composiciones de la presente invención se preparan opcionalmente en una variedad de formas. Estas incluyen por ejemplo, formas de dosificación líquida, semi-sólida y sólida tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pastillas, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración proyectado y aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las que se utilizan para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una modalidad preferida, el conjugado SCA y/o polímero-SCA se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad preferida el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea. La administración vía inhalación, tal como un rociador, aerosol o nebulizador también se contempla cuando sea conveniente dicha ruta, por ejemplo para absorción sistémica y/o acción local dentro del sistema respiratorio. Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada en la forma de una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (por ejemplo, anticuerpo o parte de anticuerpo) en la cantidad requerida en un solvente adecuado con una o una combinación de los ingredientes descritos anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los que se describieron anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación requeridos son secados al vacío y secados por congelación que produce un polvo del ingrediente activo además de cualquier ingrediente adicional deseado procedente de una solución filtrada previamente estéril del mismo. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y a través del uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Los conjugados de SCAs y/o polímero-SCA de la presente invención, pueden administrarse a través de una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta/modo de administración es inyección intravenosa o infusión. Tal como lo apreciarán los expertos en la técnica, la ruta y/o modo de aplicación variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, los conjugados SCAs y/o polímero-SCA de la presente invención pueden ser administrados en forma oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Los conjugados SCAs y/o polímero-SCA (y otros ingredientes, si se desea) se guardan opcionalmente en una cápsula de gelatina con cubierta dura o suave, se comprime en tabletas o se incorporan directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica, los compuestos pueden ser incorporados con excipientes y utilizarse en la forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar los conjugados SCAs y/o polímeros-SCA de la presente invención a través de administración diferente a la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o administrar el compuesto junto con un material para evitar su desactivación. Los compuestos activos suplementarios también pueden ser incorporados en las composiciones farmacéuticas. En ciertas modalidades, un conjugado de SCAs y/o un polímero-SCA de la presente invención se formula en conjunto y/o se administra en conjunto con uno o más agentes terapéuticos adicionales que proporcionarán una actividad aditiva, sinérgica o terapéutica o de diagnóstico suplementaria para una enfermedad o padecimientos Administración de Conjugados SCAs y/o Polímero-SCA Anti-hTNFa Por ejemplo, los conjugados SCAs y/o Polímero-SCA Anti-hTNFa de la presente invención, pueden ser formulados en conjunto y/o administrados en conjunto con uno o más anticuerpos adicionales o SCAs que enlazan a otros objetivos (por ejemplo, que enlazan a otras citocinas o que enlazan a otras moléculas de la superficie celular) una o más citocinas, receptores hTNFa solubles (ver por ejemplo la Publicación PCT No. WO 94/06476) y/o uno o más agentes químicos que inhiben la producción o actividad de hTNFa (tal como derivados de ciclohexano-ilidina tal como se describe en la Publicación PCT No. WO 93119751 ). Además, se pueden utilizar uno o más conjugados SCAs y/o Polímero-SCA de la presente invención en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Dichas terapias de combinación pueden utilizar de manera conveniente dosis inferiores de los agentes terapéuticos administrados en forma individual. Indicaciones de Anti-TNFa-SCAs y Agentes Preferidos Administrados en Conjunto Simplemente a manera de ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 6,258,562 y 6,090,382, incorporadas a la presente invención como referencia, proporcionan una lista exhaustiva de enfermedades y padecimientos para las cuales TNFa es transmisor o co-transmisor de aspectos primarios u otros aspectos de procesos de la enfermedad. Los agentes conocidos en la técnica para tratar o aliviar dichas enfermedades o padecimientos se contemplan para ser formulados en conjunto o administrados en conjunto con las modalidades de anti-TNFa de los SCAs y/o SCAs conjugados por polímero de la presente invención. En síntesis, la lista de enfermedades y padecimientos transmitidos por, o relacionados con las acciones de TNFa, y por consiguiente tratados racionalmente a través de un enlazador TNFa, opcionalmente en combinación con otros terapéuticos conocidos en la técnica, se manifiesta en la Patente Norteamericana No. 6,258,562 para incluir por ejemplo, sepsis enfermedades autoinmunes, enfermedades infecciosas, transplante/rechazo, malignidades, padecimientos pulmonares e intestinales. Estas indicaciones, y cuando se aplicable, los agentes que opcionalmente se formulan en conjunto para tratar dichas indicaciones con SCAs anti-TNFa son como se indica a continuación. Sepsis Las condiciones tratables asociadas con sepsis incluyen síndrome de choque séptico transmitido por TNFa e hipotensión asociada, supresión al miocardio, síndrome de filtración vascular, necrosis de órganos, estimulación de liberación de transmisores tóxicos, y administración de la cascada de coagulación, choque endotóxico, sepsis gram negativa y síndrome de choque tóxico. Enfermedades Autoinmunes Las condiciones tratables asociadas con enfermedades auto inmunes incluyen, inflamación de tejido y destrucción de articulaciones en artritis reumatoide, muerte de células de isleta y resistencia a insulina en diabetes, citotoxicidad a oligodendrocitos e inducción de placas inflamatorias en esclerosis múltiple. Los agentes contemplados para ser formulados en conjunto y administrados en conjunto con los SCAs anti-TNFa de la presente invención y/o SCAs conjugados por polímero incluyen cualesquiera agentes conocidos en la técnica disponibles para tratar dichas enfermedades autoinmunes que incluyen por ejemplo, glucocorticoesteroides, fármacos anti-inflamatorios no esferoidales (NSAIDs), fármacos anti-inflamatorios supresores de citocina (CSAIDs); CDP-57111 BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNFa humanizado; Calltech/Bayer); cA2 (anticuerpo anti-TNFa quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-lgG (proteína de fusión receptor-lgG; 75 kD; Immunex; ver por ejemplo, Artritis & Rheumatism (1994) Vol. 37. S295; »L_ Invest Med. (1996) Vol. 44 235A); 55 kdTNFR-lgG (proteína de fusión IgG TNF 55kD; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.I/SB 210396 (anticuerpo anti-CD4 primatizado sin depleción; IDEC/SmithKIine, por nombrar solo algunos. Enfermedades Infecciosas Las condiciones tratables asociadas con enfermedades infecciosas incluyen inflamación de cerebro transmitida por TNFa, trombosis capilar e infarto en malaria, infarto venoso en meningitis, caquexia secundaria a la invención, por ejemplo invención de virus de VIH, estimulación de proliferación viral y lesión a sistema nervioso central en infección VIH, fiebre y mialgias debido a infecciones tales como influenza). Los agentes contemplados para ser formulados en conjunto o administrados en conjunto con los SCAs y/o SCAs conjugados por polímero anti-TNFa de la presente invención incluyen cualesquiera agentes antiinfección conocidos en la técnica, por ejemplo, antibióticos, anti-bacterianos, antivirales y similares, así como fármacos anti-inflamatorios no esferoidales ("NSAIDs") y/o anticuerpos ó SCAs que enlazan al agente inefectivo y/o sus toxinas o componentes esenciales. Las condiciones tratables con transplante asociadas con medicina de transplante, rechazo de transplante o efectos secundarios de los agentes de inmunosupresión requeridos incluyen rechazo a aloinjerto transmitido por TNFa y enfermedad de injerto versus receptor (GVHD), por nombrar solo algunos efectos relacionados con el transplante. Los agentes contemplados para ser formulados en conjunto o administrados en conjunto con los SCAs conjugados con polímero y/o SCAs anti-TNFa de la presente invención incluyen, por ejemplo, glucocorticoesteroides, ciclosporina A, FK506 y/o OKT3, para inhibir reacciones inducidas por OKT3, así como en combinación con enlazados dirigidos a receptores de célula inmune tales como anticuerpos o SCAs que enlazan a CD25 (receptor-a IL-2), CD1 1a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1) y/o CD86 (B7-2). Malignidades, Las condiciones tratables asociadas con malignidades incluyen caquexia transmitida por TNFa, crecimiento de tumor, potencial de metástasis y citotoxicidad en malignidades. Los agentes contemplados para ser formulados en conjunto o administrados en conjunto con los SCAs conjugados por polímero y/o SCAs anti-TNFa de la presente invención incluyen cualesquiera agentes antitumor o anticáncer conocidos en la técnica.
Padecimientos pulmonares Las condiciones tratables asociadas con padecimientos pulmonares incluyen síndrome de distensión respiratoria de adulto, choque de pulmón, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, sarcoidosis pulmonar, fibrosis y silicosis pulmonar. Para padecimientos pulmonares, los SCAs conjugados por polímero y/o SCAs anti-TNFa de la presente invención se administran opcionalmente mediante administración oral o con rocío nasal, o se formulan para administración en la forma de un aerosol, a través de cualquier sistema de inhalación estándar. Dichas formulaciones pueden ser administradas en conjunto o administradas en veces alternativas con otros agentes adecuados para tratar dicha enfermedad o padecimiento pulmonar, o un agente que facilite el acceso bronquial para la formulación SCA. Padecimientos Intestinales Las condiciones que se pueden tratar asociadas con padecimientos intestinales incluyen el rango de padecimientos de intestino inflamatorio, por ejemplo, enfermedad de Crohn y/o colitis ulcerativa. Los agentes contemplados para ser administrados en conjunto o formulados en conjunto con los SCAs conjugados por polímero y/o SCAs anti-TNFa de la presente invención incluyen, budenosida; factor de crecimiento epidérmico; corticoesteroides; ciclosporina, sulfasalazina; aminosalicilatos; 6-mercaptopurina; azatioprina; metronidazol; inhibidores de lipoxigenasa; masalamina; olsalazina; balsalazida; antioxidantes; inhibidores de tromboxano; antagonistas de receptor IL-1; MAbs a nti- 1 L- 1 ß ; MAbs anti-IL-6; factores de crecimiento; inhibidores de elastasa; compuestos de piridinilo-imidazol; CDP-571/BAY-10-3356 (anticuerpo anti-TNFa humanizado); Celltech/Bayer); cA2 (anticuerpo anti-TNFa quimérico; Centocor); 75 kd TNFR-lgG (proteína de fusión de receptor IgG TNF 75 kD; Immunex); 55 kd TNFR-lgG (proteína de fusión de receptor IgG TNF 55 kD; Hoffmann-LaRoche); interleucina-10 (SCH-52000; Scherin-Plough); IL-4; agonistas IL-10 y/O IL-4 (por ejemplo anticuerpos agonistas); interleucina-11 ; profármacos conjugados por glucuronida o dextrano de prednisolona, dexametasona o budesonida; oligodesoxinucleótidos de fosforotioato antisentido ICA -1 (ISIS 2302; I sis Pharmaceuticals, Inc.); receptor de complemento soluble 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); mesalazina de liberación lenta; metotrexato; antagonistas de Platelet Activating Factor (PAF); ciprofloxacina; y lignocaína. Métodos de diágnóstico y de ensayo: conjugados-SCA ó SCA-anti-TNFa Los conjugados SCAs conjugados por polímero y/o SCAs anti-TNFa de la presente invención pueden utilizarse para detectar hTNFa en muestras de interés, tal como en una muestra biológica, incluyendo suero o plasma u otros especímenes clínicos utilizando un inmunoensayo convencional. Estos incluyen ensayos ¡nmunoabsorbentes enlazados por enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejido. La presente invención proporciona un método para detectar hTNFa en una muestra biológica que comprende contactar una muestra biológica con un anticuerpo, o parte de anticuerpo, de la presente invención y detectar ya sea el anticuerpo (o parte de anticuerpo) enlazado a hTNFa o conjugados de polímero-SCA y/o SCA no enlazados, para detectar de esta forma hTNFa en la muestra biológica. El SCA se marca directa o indirectamente con una substancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo enlazado no enlazado. Las substancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes y materiales radioactivos. Los ejemplos de enzimas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluorescencia, isotiocianato fluorescente, rodamina, fluorescencia de diclorotriacinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluyen luminol; y los ejemplos de material radioactivo adecuados incluyen 125l, 13 1 , 35S, ó 3H. En una modalidad opcional, los SCAs de la presente invención no se marcan, aunque se ensaya hTNFa en fluidos biológicos a través de inmunoensayo de competición, en donde se etiquetan los estándares rhTNFa con una substancia detectable, y un conjugado de polímero-SCA y/o SCA anti-hTNFa no etiquetado. En este ensayo, se determinan la muestra biológica, los estándares rhTNFa etiquetados y el conjugado de polímero-SCA y/o SCA anti-hTNFa se combinan y la cantidad de estándar rhTNFa etiquetado enlazado al conjugado de polímero-SCA y/o SCA no etiquetado. La cantidad de hTNFa en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de rhTFNa estándar etiquetado enlazado al conjunto de polímero-SCA y/o SCA anti-hTNFa. Las Patentes Norteamericanas Nos. 6,258,562 y 6,090,382 indican que el D2E7 MAb puede utilizarse también para detectar TNFas de especies diferentes a humanos, en particular TNFas de primates (por ejemplo, chimpancé, babuino, mono tití, cinomolgus y resus), cerdo y ratón, se contempla que también se pueden utilizar fácilmente para dicho propósito los conjugados de polímero-SCA y/o SCA anti-TNFa. EJEMPLOS Los ejemplos que se encuentran a continuación sirven para proporcionar una apreciación adicional de la presente invención, aunque no significa en ninguna forma que restringen el alcance efectivo de la presente invención. EJEMPLO 1 DISEÑO DE PROTEÍNAS SCA CON AL MENOS UN TIOL LIBRE Se diseñaron nueve polipéptidos SCA con base en los dominios variables del D2E7 MAb. El uso del término "D2E7 SCA", de la presente invención se refiere a cualquier SCA producido con los dominios variables D2E7 tal como se ejemplifica en la presente invención, a menos que se indique lo contrario. Cada construcción fue como se indica a continuación. Tal como se observó anteriormente, se construyó un gen completamente sintético mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando 14 oligonucleótidos sintéticos de traslape largos, que fluctúan de 20 bases a 102 bases de longitud. La mutagénesis dirigida al oligonucleótido se emplea en forma adicional para construir otras variantes de la secuencia original. Las proteínas SCA expresadas contienen los segmentos completos ligeros variables (VL) y pesados variables (VH) del D2E7 MAb, conectados a través de un enlazador de péptido. Se emplearon dos enlazadores. El enlazador "218" es un residuo de 18 aminoácidos enlazador-218 descritos por Filpula y Asociados, 1996 (Antibodv Engineerina: A Practical Approach. Oxford University Press, página 253-268). El "enlazador (GGGGS)3" (SEQ ID NO:42) es un enlazador de residuos de 15 aminoácidos descritos por Huston JS y Asociados, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. ÍEUA) 85:5879-5883. En algunos casos, tal como se observa en la tabla 1 anterior, se incluyó una marca de 6-histidina h¡s6) (SEQ ID NO:43) en el término-C para simplificar la purificación a través de cromatografía de afinidad de iones de metal inmovilizado por metal ("IMAC"). Los genes completos se clonaron en un plásmido E. coli para la confirmación de secuencia de ADN en un analizador genético ABI PRISM® 310 Genetic Analyzer de Applied Biosystems (Foster City, California) (el primero producido por ABI/Perkin-Elmer). Las orientaciones del dominio, los enlazadores y colocación de la cisteína libre en cada SCA respectivo modelado en D2E7 MAb, se resumen en la tabla 1 anterior (números de clon 2-7-SC-1 al -9). Las cadenas de ácido nucleico que expresan cada uno de los números de clon 2-7-SC-1 al -9 se prepararon como se indica a continuación. Método de clonación y expresión de D2E7 SCA La versión VL-VH sintética del D2E7 SCA se construyó a través de dos vueltas de PCR utilizando 6 oligonucleótidos de traslape como plantillas para la cadena VL y 6 oligonucleótidos de traslape como plantillas para la cadena VH. La cadena VL y la cadena VH del gen D2E7 SCA se enlazaron con un enlazador 218. El término-C de la proteína codificada estuvo seguido de seis histidinas tándem para los propósitos de purificación IMAC. Se designaron seis oligonucleótidos del extremo 5' a 3' para VL como se indica a continuación: VL1: GACATCCAGATG ACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCT GTAGGGGAC (SEQ ID NO:19) VL2: GCATCTGTAGGGGACAG AGTCACCATCACTTGTCGGGCAAG TCAGGG CATCAGAAATTACTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACC AGGGAAAGCCCCT (SEQ ID NO:20) VL3: CCCTG ATTGCAAAGTGGATGCAGC ATAG ATCAGGAGCTTAG GGGCTTTCCCTGG (SEQ ID NO:45) VL4: TCCACTTTGCAATCAGGGGTCCCATCTCGGTTCAGTGGCAGT GGATCTGGGACAGATTTC (SEQ ID N0:21) VL5: TCTGGG ACAG ATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTACAGCCT GAAGATGTTGCAACTTATTACTGTCAAAGGTATAACCGTGCA CCGTATACTTTTGGCCAG (SEQ ID NO:22) VL6: ACCACTCCCGGGTTTGCCGCTACCACTAGTAG AGCCTTTGAT TTCCACCTTGGTCCCCTGGCCAAAAGTATA (SEQ ID NO:23). Entre ellos, VL1, 2, 4, y 5 fueron ol ¡gonucleótidos delanteros (sentido) y VL3 y 6 fueron oligonucleótidos inverso. Se designaron seis oligonucleótidos del extremo 5' al 3' para VH como se indica a continuación: VH 1 :GGCAAACCCGGGAGTGGTG AAGGTAGCACTAAAG GTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGA (SEQ ID NO:24).
VH2:GTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCCGGCA GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCGGCCTCTGG ATTCACCTTTG ATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGG (SEQ ID NO:25) VH3: CCAAGTGATAGCTGAGACCCATTCCAGGCCCTTCC CTGGAGCTTGCCGGACCCAGTGCAT (SEQ ID NO:26) VH4:TCAGCTATCACTTGG AATAGTGGTCACATAG ACTAT GCGG ACTCTGTGG AGGGCCGATTC (SEQ ID NO:27) VH5:GTGGAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGC CAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGA GGATACGGCCGTATATTACTGTGCG (SEQ ID NO:28) VH6: AGACGAGACGGTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAA TAGTCAAGGGAGGACGCGGTGCTAAGGTACG AGACTTTCGC ACAGTAATATAC (SEQ ID NO:29). Entre ellos, VH1, 2, 4, y 5 fueron oligonucleótidos delanteros y VH3 y 6 fueron oligonucleótidos inversos. Todos los oligonucleótidos diseñados para VL y VH sintético de D2E7 SCA, se sintetizaron a través de MWG Biotech, Inc. El VL del gen D2E7 SCA fue ensamblado en una primera vuelta de PCR, utilizando 2 mM Tris (pH 8.4), 5 mM KCI, 7.5 mM MgCI2, 1.5 mM dNTP, 2 unidades de polimerasa Tag Platinum (I nvitrogen), oligonucleótidos VL1, 2, 3, 4, 5 y 6 (1 pmol cada uno) en la forma de plantillas, 5'-TGGCG AGCTCTGACATCCAGATGACCCAGTCT (SEQ ID NO:30) (50 pmol) como el cebador delantero, y 5'-ACCACTCCCGGGTTTGCCGCTACCACTAGTAGA (SEQ ID NO:31) (50 pmol) como el cebador inverso. El PCR se llevó a cabo durante 30 ciclos a una temperatura de 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 70°C durante 60 segundos, seguido de 72°C durante 10 minutos. El VH del gen D2E7 SCA fue ensamblado en un PCR de primera vuelta, utilizando 2 mM Tris (pH 8.4), 5 mM KCI, 7.5 mM MgCI2, 1.5 mM dNTP, 2 unidades de polimerasa Tag Platinum (I nvitrogen), oligonucleótidos VH1, 2, 3, 4, 5, y 6 (1 pmol cada uno) en la forma de plantillas, 5'-GGCAAACCCGGGAGTGGTGA (SEQ ID NO:32) (50 pmol) como el cebador delantero, y 'GCCACTCGAGCTATTAGTGATGGTGATGGTGGTGAG ACG A GACGGTGACCAG (SEQ ID NO:33) como el cebador inverso (50 pmol). El PCR se llevó a cabo durante 30 ciclos a una temperatura de 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos, seguido de 72°C durante 10 minutos. La construcción genética de los genes D2E7 SCA variantes que codifican las proteínas SCA variantes de la tabla 1, se logró a través de mutagénesis dirigida al sitio. Por ejemplo, 2-7-SC-5 es un muíante de D2E7 SCA (2-7-SC-1) con un cambio de aminoácidos de serina a cisteína en el residuo 109 en el enlazador 218. Este gen fue creado por dos vueltas de PCR utilizando ADN 2-7-SC-1 como una plantilla y 4 oligonucleótidos como cebadores. Los cebadores para la construcción del clon 2-7-SC-8 fueron designados como se indica a continuación: Cebador delantero 1: CTCGAATTCACCATGAG ATTTCCTTC (SEQ ID NO:37) Cebador delantero 2: AAGGTGGAAATCAAAGGCTGTACTAGTGGTAGCGGCAA ACCC (SEQ ID NO:38) Cebador inverso 1: GGGTTTGCCGCTACCACTAGTACAGCCTTTG ATTTCCA CCTT (SEQ ID NO:39) Cebador inverso 2: CGAG AATTCTCATTAATTGCGC AGGTAGCC (SEQ ID NO:40). Se amplificaron por separado dos fragmentos en la primera vuelta de PCR a través de dos combinaciones de cebador (cebador delantero 1 y cebador inverso 1, y cebador delantero 2 y cebador inverso 2, 50 pmol cada uno), utilizando 2 mM Tris (pH 8.4), 5 mM KCI, 7.5 mM MgCI2, 1.5 mM dNTP, 2 unidades de polimerasa Tag Platinum (I nvitrogen), y ADN 2-7-SC-8 (10 ng) como plantilla. La variante del gen D2E7 SCA de 2-7-SC-8 se completó mediante extensión híbrida en la segunda vuelta de PCR, utilizando el cebador delantero 1 y cebador inverso 2 (50 pmol cada uno), 2 mM Tris (pH 8.4), 5 mM KCI, 7.5 mM MgCI2, 1.5 mM dNTP, 2 unidades de polimerasa Tag Platinum (I nvitrogen), y los dos fragmentos (10 ng cada uno) de la primera vuelta de PCR como plantillas. El producto PCR completo del gen 2-7-SC-8 SCA con cisteína en el residuo 109, fue clonado en el pHiD2 de vector y utilizado para transformar la cepa Pichla GS115 tal como se describirá más adelante. Los genes restantes de la tabla 1, fueron generados mediante pasos similares de mutagénesis dirigidos al sitio. Para el gen 2-7-SC-2 (SEQ ID NO:2), el cebador de oligonucleótido inverso PCR codificó el TGC de codón de cisteína después de seis codones de histidina terminal-C. Para el gen 2-7-SC-3 (SEQ ID NO:3), el cebador de oligonucleótido inverso PCR codificó el TGC de codón de cisteína después de seis codones de histidina de terminal-C. Para el gen 2-7-SC-4 (SEQ ID NO:4), el cebador de oligonucleótido inverso PCR codificó directamente TGC de codón de cisteína después del codón de serina VH de terminal-C. Para el gen 2-7-SC-6 (SEQ ID NO:6), el cebador de oligonucleótido central codificó el TGC de codón de cisteína en la posición 2 del enlazador 218, y el cebador inverso de terminal-C codificó el TGC de codón de cisteína después de seis codones de histidina de terminal-C. Para el gen 2-7-SC-7 (SEQ ID NO:7), el cebador de oligonucleótido central codificó los TGC de codón de cisteína en los nucleótidos 376-378 (FIG.1G), correspondiendo a la posición 5 del residuo del enlazador (GGGGS)3 (SEQ ID NO:42). Para el gen 2-7-SC-8 (SEQ ID NO:8), el cebador de oligonucleótidos delantero PCR codificó el TGC de codón de cisteína antes que el Asp de aminoácido VL de terminal N y el cebador de oligonucleótido inverso PCR codificó el TGC de codón de cisteína después de seis codones de histidina de terminal-C. Para el gen 2-7-SC-9 (SEQ ID NO:9), un enlazador de 5 codones que codifica GGGGS (SEQ ID NO:44) reemplazó el enlazador-218 de 18 codones. Para ensamblar el gen D2E7 SCA y la expresión de D2E7 SCA en Pichia, se agregó una secuencia de señal al extremo 5' del gen D2E7 SCA en una segunda vuelta de PCR, utilizando 2 mM Tris (pH 8.4), 5 mM KCI, 7.5 mM MgCI2, 1.5 mM dNTP, 2 unidades de polimerasa Tag Platinum (Invitrogen), primera vuelta de productos PCR de VL y VH del gen D2E7 SCA del gen (uno Ing cada uno) en la forma de plantillas, 5'CCTCGGAATTCACCATG AG ATTTCCTTCAATTTTTACTGCT GTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTGACATCCAG ATGACCCAG (SEQ ID NO:34) (50 pmol) como el cebador delantero, y 5'- CGCGGAATTCTATTAGTGATGGAGATGGAGGAG AGACGAGA CGGTGACCAG (SEQ ID NO:35) (50 pmol) como el cebador inverso. El PCR se llevó a cabo durante 30 ciclos a una temperatura de 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos, seguido de 72°C durante 10 minutos. El producto del gen de la segunda vuelta de D2E7 SCA ensamblado con PCR con la secuencia de señal del extremo 5', se purificó mediante 1% de gel de agarosa, se digirió mediante EcoR1 a una temperatura de 37°C durante 60 minutos y se ligó en el sitio EcoR1 del vector pHilD2 (Invitrogen) utilizando ligasa de ADN T4 a una temperatura de 12°C durante 60 minutos. Se transformaron 100 µ? de células competentes DH5a (Invitrogen) mediante el producto de reacción de la ligadura y se incubó en hielo durante 20 minutos a una temperatura de 42°C durante 45 segundos, posteriormente se agregaron 1 mi de medio S.O.C. y se incubó a una temperatura de 37°C durante 50 minutos con agitación a 250 rpm. Se dispersaron 0.1 mi de la mezcla de transformación en placas de ampicilina LB (10 mg/l) y se incubaron a una temperatura de 37°C durante 16 horas. Se crecieron varios clones DH5a transformados con plásmido pHilD2-D2E7 SCA en las placas de ampicilina LB (10 mg/l) en 2 mi de medio LB a una temperatura de 37°C durante 16 horas. Se prepararon mini-preparaciones de plásmido de D2E7SCA de cada clon. Se confirmó la secuencia de ADN del plásmido pHilD2-D2E7SCA utilizando un equipo de secuenciación de ADN de ciclo de terminador BigDye (Applied Biosystem) mediante analizador genético AB1 Prism. Cada uno de los clones SCA variantes que se describen en la tabla 1, fue generado a través de los siguientes procedimientos. Para transformación Pichia, se digirió el plásmido pHilD2-D2E7SCA con SaM a una temperatura de 37°C durante 60 minutos y se resuspendió en 10 µ? de agua destilada después de la extracción de fenol y precipitación de etanol. Se crecieron las células Pichia GS115 en 50 mi de medio YPD a una temperatura de 30°C durante 16 horas con agitación a 250 rpm (OD6oo = 1 -2), se lavaron en agua destilada enfriada con hielo tres veces y una vez en 1 M de sorbitol y finalmente se resuspendió en 0.1 mi de 1 M sorbitol. Se mezclaron las células Pichia GS 15 preparadas con 10 pg de plásmido pHilD2-D2E7SCA digerido con SaM en una cubeta de electroporacion de 0.1 cm enfriada con hielo y se pulsó bajo las condiciones de 800V, 10pF y 129 mediante manipulador electrocel ular (BTX). Después de la pulsación, se agregaron 1ml de 1M sorbitol enfriado con hielo en la cubeta de electroporacion. Todo el contenido se transfirió a un tubo de 15 mi y se incubó a una temperatura de 30°C durante 1 hora. Se dispersaron 0.2 mi de la mezcla de transformación en placas de medio RBD y se incubaron a una temperatura de 30°C durante 4 días. Varios clones Pichia transformados con plásmido pHilD2-D2E7SCA procedentes de las placas RBD, fueron inoculados en 25 mi de medio BMGY en frascos de 500 mi y se incubaron a una temperatura de 30°C con agitación a una temperatura de 250 rpm durante dos días. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación a 3000 rpm a temperatura ambiente, resuspendidas en 5 mi de medio BMMY en frascos de 50 mi para Inducir la expresión y se incubaron a una temperatura de 30°C con agitación durante otros dos días. Se transfirió una muestra de 1 mi de cada cultivo en tubos de microcentrifugación y se centrifugaron a 14,000 rpm durante 2 minutos a temperatura ambiente. Se analizaron 40 µ? de muestra del sobrenadante de cada cultivo mediante SDS-PAGE manchado con azul Coomassie y machado Western. EJEMPLO 2 EXPRESIÓN RECOMB1NANTE Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS SCA Las proteínas SCA descritas en el ejemplo 1 (números de clon 2-7-SC-1 al -9) se produjeron todas mediante expresión y segregación a partir de Pichia pastoris de levadura. La secuencia de señal de secreción del factor de coincidencia de alfa de levadura se insertó directamente al frente de la secuencia de codificación madura para cada una de estas proteínas SCA. La secuencia de aminoácidos de este péptido de señal es Met Arg Phe Pro Ser lie Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu AlaAAla (SEQ ID NO:36), en donde ? indica el sitio de disociación. También se incluyó el 20° aminoácido de la señal (la alanina después de ?) en nuestras construcciones. Posteriormente, el término amino de cada proteína SCA madura respectiva contiene esta alanina seguida de secuencias de aminoácidos completas registradas en FIGS 1A-1F. El análisis de secuencia de proteína de terminal-N confirmó estas secuencias procesadas correctamente. Estos genes SCA mutantes fueron ligados individualmente en el sitio EcoR1 en pHIL-2 de plásmido de transferencia Pichia (Invitrogen Corp.) y transformadas en GS-115 de huésped de Pichia pastoris de levadura. Los protocolos detallados para estos procedimientos se presentan en el manual de instrucción del catálogo del equipo de expresión Pichia No. X1710-01 (1994) de Invitrogen Corporation, incorporado a la presente invención como referencia. La evaluación de expresión inicial se realizó mediante manchado Azul Coomassie de geles SDS-PAGE. Fermentación Pichia de clones D2E7 SCA Todos los clones de expresión de TNFa SCA D2E7, incluyendo los clones 2-7-SC-2, 2-7-SC-3, 2-7-SC-4, 2-7-SC-5, y 2-7-SC-7, se generaron en Pichia pastoris, una levadura metilotróf ica , y las proteínas se segregaron en medio de crecimiento. La fermentación de alta densidad de las variantes D2E7 SCA, se llevó a cabo en medio BMGY, el medio basal suplementado con YNB y Biotina (ver Composición del Medio) utilizando termentadores de control de alimentación automática (Modelos: BioFlow 3000 y BioFlow IV; New Brunswick Scientific, Co., Edison, NJ, EUA), en BMGY durante 16 a 20 horas, (c) crecimiento de fase en glicerol (50%) durante 4 horas, y (d) inducción de variantes D2E7 con metanol durante 45 horas. La alimentación de cada componente fue optimizada con respecto al nivel de oxígeno disuelto el cual se ajustó a 30°C. La temperatura de crecimiento se ajustó a 29°C y el pH se mantuvo a 6.0 utilizando hidróxido de amonio y ácido fosfórico durante la corrida. Se monitorearon diferentes parámetros durante un período de fermentación de 68 horas, en donde los valores OD60o del cultivo de crecimiento alcanzaron de 0.5 a 125 al final de la fase (b), de 125 a 200 al final de la fase de alimentación con glicerol (fase c) y finalmente, de 200 a 300 al final de la fase de inducción (fase d). En promedio, la expresión de las variantes D2E7 en los sobrenadantes de fermentación fue de entre 50 y 100 mg L. 2-7-SC-2, la variante VL-VH con una cisteína libre construida en la terminal carboxiio seguido de una cola de histidina, se encontró como el clon más robusto que se desempeñó bien con una excelente capacidad de reproducción durante la fermentación. Descripción de suministros BMGY (por ? extracto de levadura: peptona: glicerol: regulador de fosfato: (1M, pH 6.0) TNB: biotina: F T30 (Breox): Inductor metanol Oxígeno oxígeno comprimido. Las proteínas SCA del ejemplo 1 fueron purificadas a partir de sobrenadantes Pichia pastoris con una pureza mayor a 95% mediante dos o tres protocolos simples de cromatografía de columna. Purificación de proteínas de los clones 2-7-SC-2, 2-7-SC-3, 2-7-SC-5, 2-7-SC-7, D2E7 SCAs con marca de histidina. Las variantes D2E7, 2-7-SC-2, SCA2-7-SC-3, SCA2-7-SC-4, SCA2-7-SC-5, y 2-7-SC-7 se purificaron a partir del sobrenadante de fermentación utilizando una combinación de cromatografía de columna de intercambio de iones y de afinidad. El sobrenadante se diafiltró en forma extensa para concentrar la muestra y al mismo tiempo intercambiar el medio agotado con regulador C que contiene Tris 20 a un pH de 7.4 y 50 mM de NaCI. Posteriormente la muestra intercambiada con regulador se sometió a cromatografía de columna DEAE (Cat. #17-0709-01; Amersham BioSciences, Piscataway; NJ). D2E7 SCAs no se enlazó a la columna DEAE bajo las condiciones especificadas. El flujo a través de la columna DEAE se dializó contra regulador A que contiene Tris 50 mM a un pH de 8.0 y 0.3 M NaCI y se aplicó a resina Ni-NTA (Qiagen, Inc., Valencia, CA) equilibrada previamente con el mismo regulador. Se interrumpió el enlace no específico utilizando estricto con regulador B que contiene 10% de gliceroi en el regulador A seguido de la eliminación del gliceroi a través del regulador A. Las interacciones de baja afinidad adicionales se lavaron pasando tres volúmenes de columna de 60 a 100 mM de imidazol (100 mM únicamente para 2-7-SC-2). Finalmente, el SCA enlazado fue eluido de la columna Ni-NTA con de 3 a 5 volúmenes de columna de 250 mM de imidazol. Tanto para el lavado como para la elución, se preparó el imidazol en el regulador A. Se reunieron las fracciones pico y se dializaron en forma extensa contra el regulador C, el regulador-DEAE. La muestra dializada se aclaró mediante centrifugación de alta velocidad y se pasó a través de una columna DEAE como el paso final de la purificación. La concentración de proteína de la muestra purificada se determinó posteriormente mediante UV2so y mediante el método BCA antes de almacenar a una temperatura de -20°C para un uso futuro. Purificación de proteínas 2-7-SC-4 D2E7 SCA sin marca de histidina. La proteína L enlaza fuertemente a los dominios VL de muchas especies diferentes. El enlace es extremadamente específico de la especie, y también específico del subtipo. El dominio Vu de 2-7-SC-4 podría ser reconocido por la proteína L y tomando ventaja de esta especificidad de interacción, hemos purificado 2-7-SC-4 en un solo paso directamente de las muestras diafiltradas. La elución de pH bajo de 2-7-SC-4 de la columna de proteína L (Cat. #CLBL 201-5, CBD Technologies Ltd., Buffalo, NY) no afectó la integridad estructural o funcional del SCA. En síntesis, se diafiltró sobrenadante de fermentación y se intercambió con PBS para cargar la muestra en la columna. Se lavaron proteínas enlazadas en forma no específica, con un gran volumen de PBS después de la carga. La proteína SCA fue eluida de la columna con regulador de glicina (10 mM) a un pH de 2.0 y recolectada inmediatamente en 3 M Tris para neutralizar la solución. Las fracciones se analizaron en SDS-PAGE, las fracciones positivas fueron reunidas y dializadas contra PBS. La proteína SCA fue aclarada mediante centrifugación a alta velocidad después de la diálisis, se determinó la concentración de proteína y se almacenó a una temperatura de menos 20°C para un uso futuro. Como alternativa, también se utilizaron en forma efectiva en la purificación de SCA métodos menos preferidos como HS (POROS 50 HS, código: 1-3359-07; Applied BioSciences, Foster City, CA) ó Q-sepharose FF (cat. #17-0510-01, Amersham BioSciences, Piscataway, NJ).
La siguiente tabla muestra la purificación de variantes 2-7-SC-2 D2E7 a través de diversas columnas, los porcentajes de producción después de cada paso de purificación y la calidad de purificación de cada variante. TABLA 3 PURIFICACIÓN 2-7-SC-2 (VL-VH, ENLAZADOR-218, C-CYS, HIS-MARCA) Las figuras 2A y 2B presentan análisis SDS-PAGE representativo de muestras de cada paso de purificación de la proteína 2-7-SC-2 SCA. El gel se manchó con azul Commassie. La pureza de la muestra al final se estimó en un 95% a partir de exploración de densitometría de gel. Quedó visible una pequeña cantidad de dímero enlazado con disulfuro de 54 kDa en el gel manchado. EJEMPLO 3 ESTABILIDAD Y REACTIVIDAD DE DERIVADOS DE MALEIMIDA DE POLI ETILENGLI COL Reactividad de maleimida con residuos de aminoácido Se llevó a cabo la confirmación de la reactividad específica de los polímeros de maleimida con cisteína libre, pero no con lisina o histidina, mediante la reacción de estos compuestos con estos aminoácidos libres respectivos. Tal como se muestra en las figuras 4A a 4C, la cisteína, pero no la histidina o lisina (no mostradas), es altamente reactiva con las maleimidas-PEG bajo las condiciones de reacción estándar empleadas. Análisis y estabilidad del grupo de maleimida activo. Se llevó a cabo un análisis de grupo funcional en dos pasos como se indica a continuación. Reacción de MAL-PEG con cisteína y determinación de la cisteína no reactivada restante después de la reacción mediante titulación con 5,5'-ditio-bis-(2-ácido nitrobenzoico) ("DTNB"). Determinación de MAL-PEG activo se llevó a cabo en una proporción molar de reacción de 1:3 (MAL-PEG:Cisteína) en 50 mM de fosfato de sodio, pH 6 y 1 mM de EDTA. La reacción se llevó a cabo como se indica a continuación . Se agregó 1/40 de volumen de cisteína en H20 a 1 mM de solución PEG a una concentración final de 3 mM. La mezcla se incubó a una temperatura de 25°C en la obscuridad durante 10 minutos, seguido de titulación de DTNB. La titulación de DTNB, un volumen de 1/50 de la mezcla de reacción que contiene la cisteína y la mezcla Cys-MAL-PEG, se agregó a 0.2-0.3 mM DTNB en 100 mM de fosfato de sodio, pH 7.3 y 1 mM EDTA. La concentración final de la cisteína restante fue de entre 0.04-0.06 mM. La absorbancia a 412 nm se registró después de 5 minutos de equilibrio a una temperatura de 25°C utilizando 13,300 M"1-cm"1 en la forma de un coeficiente de extensión de DTNB. La reacción de MAL-PEG con beta-mercaptoetilamina también fue investigada. Esta reacción no es cuantitativa debido a que la beta-mercaptoetilamina es sensible al aire e higroscópica. La estabilidad de MAL-PEG se monitoreó a través de una exploración UV entre 240 y 400 nm. MAL-PEG tuvo una absorbancia máxima de 300 nm. El pico desapareció después de hacerse reactivar con cisteína o hidrolizando en la presencia de 0.1 N NaOH a una temperatura de 37°C durante 2 horas. Estabilidad de MAL-PEG. La estabilidad de MAL-PEG depende del pH, temperatura y tiempo de incubación. Se consideró estable si hubo menos de! 10% de disminución en la absorbancia a 300 nm. 1 mM MAL-PEG es estable a una temperatura de 4°C durante al menos 24 horas en todos los reguladores probados (pH 5, pH 6, y pH 7 reguladores de fosfato). A una temperatura de 25°C y a un pH de 5.0, MAL-PEG es estable durante 33 horas. Por consiguiente, las condiciones de PEGilación preferidas son pH 5 ó pH 6 a una temperatura de 25°C durante 2 horas; o a una temperatura de 4°C durante 24 horas; o pH 5, temperatura de 25°C durante 24 horas. Especificidad de reacción MAL-PEG con cisteína. La reacción con cisteína se completó en menos de 2 minutos sin importar la reacción del pH (5, 6, ó 7) y la temperatura (4°C ó 25°C). La reacción con lisina (Lys: MAL-PEG = 15:1) no se observó con reguladores de pH 5 y pH 6 durante 24 horas de incubación a una temperatura de 4°C ó de 25°C. Sin embargo, con un pH de 7 a una temperatura de 25°C, más del 10% de MAL-PEG se hizo reaccionar con lisina durante 24 horas de incubación. No hubo reacción con histidina en una proporción molar de 15:1 (Histidina: MAL-PEG) pH 5, 6, y 7 durante 24 horas de incubación a una temperatura de 4°C ó 25°C.
EJEMPLO 4 PEGILACIÓN DE PROTEÍNAS SCA 4A. Materiales y Métodos Se utilizaron columnas de extracción de sal HiPrep® 26/10 y G-25 PD-10 (Pharmacia Biotech, 17-1408-01, Nueva Jersey) y medio Poros 50 Micron HS (Applied Biosystems). Se contaron compuestos mPEG-maleimida en Nektar Therapeutics (San Carlos, California; anteriormente Shearwater Corp.) o se sintetizaron en Enzon Pharmaceuticals, Inc. Los polímeros PEG-MAL empleados en este estudio incluyeron el PEG2 ramificado de 40 kDa, PEG lineal de 20 kDa, PEG lineal de 5 kDa, PEG bifuncional MAL-bis de 20 kDa, y U-PEG ramificado de 40 kDa. Se compraron en Sigma, N-etilmaleimida y el éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 6-(biotinamidocaproilamido)caproico. Se obtuvo el Flujo Rápido de Sepharose A de proteína-r en Amersham Biosciences Corp. (Piscataway, Nueva Jersey). Se obtuvo Ultralink lodoacetyl® de Pierce Biotechnology , Inc. (Rockford, Illinois). DMSO, (Minneapolis, Minnessota). Se obtuvo estreptavidina-picoeritrina en BD Sciences (San José, California). Las placas de microtitulación de 96 depósitos se compraron en Midwest Scientific (St. Louis, Missouri). La estreptavidina-peroxidasa fue de Sigma y el substrato de peroxidasa TMB fue de Moss, Inc. (Pasadena, Maryland). El TNFa se compró en Chemicon (Temecula, California). La solución de yodo de Tritisol® se obtuvo en EM Science (Gibbstown, Nueva Jersey). 4B. Reducción de D2E7 SCAs El residuo de cisteína libre en el término-C o enlazador de los SCAs aislados en el ejemplo 3, se redujo antes de la reacción con MAL-PEG. La solución de reacción contuvo 3 mg/ml D2E7 SCA, 2 mM de ditiotreitol (DTT), 2 mM EDTA, y 100 mM de fosfato de sodio, pH 7.8. Se llevó a cabo la reducción a una temperatura de 37°C durante 2 horas. Se eliminó el DTT libre en una columna de extracción de sal HiPrep® para muestras de 15 mi ó PD-10 para una muestra de 4 mi. La columna se equilibró con 100 mM de fosfato de sodio, pH 6.0, 2 mM EDTA. La recuperación de D2E7 SCA después de la reducción y extracción de sal fue del 85%. Otros reductores, incluyendo beta-mercaptoetilamina y beta-mercaptoetanol, también se utilizaron en forma exitosa en los procedimientos modificados. La cuantificación de grupo de sulfhidrilo se llevó a cabo tal como se describe en la Publicación de Grassetti DR y Asociados, 1967, Archives Biochem Biophvs 119:41-49, y Riddles PW y Asociados, 1979, Anal. Biochem. 94.:75-81, incorporada a la presente invención como referencia. Se logró la reducción casi cuantitativa de un tiol por SCA. 4C. PEGilación y purificación de métodos de SCA Métodos Las proteínas SCA aisladas en el ejemplo 3, fueron PEGiladas a través de reacciones específicas de cisteína con compuestos de maleimida PEG. Se eligieron 2-7-SC-2 y 2-7-SC-5 para estudios de caracterización PEG-SCA. Para estas proteínas SCA, se revisaron los conjugados de maleimida-PEG con 5 kDa, 40 kDa (ramificados) y compuestos bis-maleimida. La reacción de las proteínas SCA con N-etilmaleimida proporcionó una reacción de conjugación de control que bloquea el tiol libre pero agrega una mínima masa molecular. Se modificaron otras proteínas D2E7 SCA con polímeros-PEG-maleimida seleccionados tal como se describe en la sección en el análisis BIAcore. El regulador de reacción contuvo 1 mg/ml de SCA reducido, 100 mM de fosfato de sodio pH 6.0, 2 mM EDTA, y el compuesto de maleimida-PEG a una proporción molar de reacción de 10:1 (PEG-D2E7). La reacción se llevó a cabo a una temperatura de 25°C bajo nitrógeno durante 2 horas. La producción típica de los conjugados analizados en SDS-PAGE fue del 80%. Se utilizó una columna HS para purificación de PEG-SCA a partir de SCA nativo, impurezas de alto peso molecular, PEG libre, productos de reacción secundarios y endotoxina. En métodos menos preferidos, también se utilizaron en forma exitosa las columnas S y SP. El regulador de equilibrio de columna contuvo 10 mM de fosfato de sodio, pH 5.0, y el regulador de elución se elaboró de 1M NaCI en 10 mM de fosfato de sodio, pH 5.0. El PEG libre estuvo en el flujo. Los conjugados PEG-D2E7 SCA se eluyeron en forma de secuencias con conjugados con números mayores de PEG adherido eluyendo primero, seguido de conjugados con un solo polímero adherido, y finalmente, D2E7 SCA nativo. Los conjugados PEG-D2E7 de diferentes tamaños se eluyeron por consiguiente en diferentes concentraciones de NaCI. 4D. Reducción de D2E7 SCA - Sumario de resultados. D2E7 SCA se produjo en Pichia pastoris y se purificó tal como se describió que se tenía que reducir antes de una reacción con MAL-PEG. DTT en la concentración de 0.5 mM a 50 mM fue probado. Se mostró que 0.5 mM fue suficiente para reducir el monómero a dímero. El DTT en una mayor concentración a 10 mM, generó cierto precipitado. Entre mayor fue la concentración de DTT utilizada, mayor fue la cantidad de D2E7 SCA precipitado. El precipitado debe ser D2E7 SCA desnaturalizado. Se eligieron 2 mM DTT para protocolos de PEGilación estándar. También se investigaron la beta-mercaptoetilamina, glutationa y cisteína de 2 mM a 10 mM. Se demostró que a una concentración mayor a 10 mM, se requería reducir el dímero a monómero. El DTT a 0.5 mM fue tan eficiente como los otros reactivos de reducción a 10 mM, en la reducción del 2-7-SC-2 de dímero a monómero. Las producciones de conjugado después de la reducción fueron aproximadamente el 80% de la proteína SCA reducida de partida. 4E. PEGMación - Sumario de resultados Las proporciones de reacción que fluctúan de 1:1 a :1 (MAL-PEG:D2E7 SCA) fueron investigadas para producción de PEGilación en un pH de 6.0. Una proporción de 1:4 fue la mínima requerida para producir una alta producción del conjugado. Los tiempos de reacción de 10 minutos a 24 horas a una temperatura de 24°C, y 18 horas a una temperatura de 4°C fueron los estudiados. Se mostró que la reacción se completó en 10 minutos a una temperatura de 25°C (el tiempo más corto probado). La alta concentración de la proteína (por ejemplo, >1 mg/ml) no fue deseable para una reacción del residuo de cisteína libre de D2E7 SCA con MAL-PEG ya que las producciones se reducen. Esto en contraste con el método óptimo de una PEGilación múltiple no específica. Las concentraciones de proteína de 0.5, 1.5, 2.0, 2.5, y 3 mg/ml fueron probadas. La proteína D2E7 SCA de 0.2-1 mg/ml se utilizó como la concentración preferida para la construcción de los conjugados. El pH de la reacción de 5 a 8 fue investigado. Para PEGilación, se utilizó un pH de 6.0. El D2E7 SCA no conjugado podría ser reciclado para una re-conjugación. La producción de la segunda reacción de conjugación fue similar a la que se obtuvo para la PEGilación D2E7 SCA inicial. La mejor producción de conjugación fue del 85%. En general, los resultados demuestran que las proteínas SCA monoPEGiladas, pueden ser generadas con buena producción a través de métodos de conjugación robusta utilizando las proteínas SCA variantes libres de tiol simples diseñadas. 4F. Purificación - Sumario de resultados La ultrafiltración con membranas de polietersulfona no se puede utilizar para concentración y cambio de reguladores de la proteína SCA 2-7-SC-2 y sus conjugados, ya que la mayor parte de la proteína se pierde con la membrana. Hubo un 100% de recuperación de la proteína en membranas de celulosa regenerada Millipore tal como se Centriplus, Centricon, y Amicon. Hubo el 10% de pérdida de la proteína en un filtro estéril de enlace de proteínas inferior de 0.2 µ?t? . La producción total después de dos pasos de purificación, dos pasos de concentración y un paso de filtración fue de 30 a 40%. Las proteínas PEG-SCA purificadas se sometieron a análisis SDS PAGE y se visualizaron con manchado azul Coomassie (datos no mostrados). El análisis indicó que las cantidades de indicio (-1%) de la proteína SCA no reactivada permanecieron en las reacciones MAL-PEG de 40 kDa y MAL-PEG de 20 kDa. El manchado con yodo de gel SDS PAGE, lo cual señala los compuestos que contienen polietilénglicol, también reveló cantidades de indicio (<1%) de PEG libre que fueron detectables en las reacciones MAL-PEG de 40 kDa y 20 kDa. Las reacciones MAL-PEG de 40kDa algunas veces también mostraron un indicio (-1%) de impurezas PEG de peso molecular muy alto. Los polímeros en el rango de masa muy alto también fueron detectables en los polímeros MAL-PEG de 40 kDa no reactivados de partida. La reducción de N-etilmaleimida bloquea totalmente la formación de dímeros en las proteínas SCA que tienen una sola cisteína libre. 4G. Eliminación de Endotoxina Mediante Cromatografía de Intercambio de Iones. La endotoxina que se encuentra en las muestras de proteína fue eliminada mediante columnas DEAE ó HS. A un pH de 7-8 se enlazó la endotoxina a una columna DEAE en tanto que D2E7 SCA estuvo presente en la fracción de flujo, mientras que con un pH de 5.0, la endotoxina estuvo presente en el flujo a través de la fracción y D2E7 SCA enlazó a la columna HS. Se utilizó una columna HS para eliminar la endotoxina de la proteína D2E7 SCA. El regulador de equilibrio de la columna contuvo 10 mM de fosfato de sodio, pH 5.0 y el regulador de extracción contuvo 1 M NaCI y 10 mM de fosfato de sodio, pH 5.0. Los valores de endotoxina típicos en las muestras purificadas estuvieron debajo de 1 EU/ml. EJEMPLO 5 CARACTERIZACIÓN ANALÍTICA DE SCA Y PEG-SCA 5A. Determinación De Concentración de Proteína Se determinaron las concentraciones de proteína mediante UV a 280 nm. El coeficiente de extinción de las SCAs obtenido en el ejemplo 3 fue de 1.24 ml/mg.cm. La concentración también se confirmó mediante el ensayo de ácido biciconínico ("BCA"), obtenido en la forma de un equipo de Reactivo de Ensayo de Proteína Micro BCA de Pierce Biotechnology Inc (Rockford, Illinois) utilizando lisozima o Fab como estándares. El ensayo BCA se llevó a cabo tal como lo recomienda el fabricante y esencialmente de acuerdo con el método de Smith, P.K., y asociados 1985, Anal. Biochem. 150, 76-85, incorporado a la presente invención como referencia. Resultados de Determinación de Concentración de Proteína El UV a 280 nm (datos no mostrados) y BCA, tal como se describió anteriormente, utilizando lisozima y un Fab humano como estándares produjeron resultados similares en determinaciones de concentración de proteína. Para el análisis BCA, el EDTA debe ser eliminado junto con el DTT después de la reducción, ya que estos reactivos interfieren con el ensayo. Todas las muestras para estudios animales fueron analizadas con respecto al contenido de proteína mediante UV y se confirmaron mediante BCA utilizando lisozima como un estándar. 5B. Anticuerpo Policlonal Anti-D2E7 SCA y Anticuerpo Anti-D2E7 SCA Biotinilado. Purificación de Anticuerpo Anti D2E7 SCA. Se dieron origen a anticuerpos Anti-2-7-SC-1 SCA en conejos y se purificaron mediante cromatografía de Proteína A y cromatografía de columna de afinidad conjugada por D2E7 SCA. Para una purificación de columna de Proteina A, el anticuerpo se diluyó con dos volúmenes de regulador Tris para elaborar una concentración final de 0.1 M Tris-HCI, pH S.0, 0.02% NaN3. Las muestras diluidas se cargaron en una columna de Sefarosa de Proteína A de 2 mi la cual se equilibró con 0.1 M Tris-HCI, pH S.O, 0.02% NaN3 en un volumen igual de antisuero para resina de proteína A. Se eluyó Anti-2-7-SC-2 SCA con 50 mM de glicina, pH 3.0 a un volumen de 1/10 de 1 M Tris-HCI, pH 8.0. La concentración se anticuerpos se determinó a 280 nm utilizando un coeficiente de extinción de 0.8 ml/mg.cm. La columna de afinidad conjugada por D2E7 SCA se preparó a través de una reacción de acoplamiento de Ultraling lodoacetil con el residuo de cisteína libre de la proteína 2-7-SC-2 SCA. Específicamente, ~7 mi de Ultraling lodoacetil se enjuagó con 2 volúmenes de 50 mM EDTA, pH 7.8, se mezcló con -6.5 mi de 1.45 mg/ml 2-7-SC-2 SCA a una temperatura de 25°C durante 15 minutos. La reacción de acoplamiento se monitoreó midiendo la absorbancia del sobrenadante a 280 nm. La concentración de proteínas en el sobrenadante se disminuyó en un 80%. La resina se lavó con 3 volúmenes de 50 mM de fosfato, pH 7.8, 5 mM de EDTA y posteriormente se trató con 50 mM de cisteína durante 40 minutos. La muestra se transfirió posteriormente a la columna y se lavó con 1 M de NaCl, 50 mM de glicina, pH 3.0, y posteriormente con PBS. El anticuerpo anti-2-7-SC-2 SCA purificado a partir de la columna de Proteína A, se pasó a través de la columna conjugada con D2E7 SCA la cual se equilibró con PBS estándar. La columna se persiguió hasta obtener una línea de base con PBS y el anticuerpo se eluyó con 50 mM de glicina, pH 3.0 hasta un volumen de 1/10 de 1 M Tris-HCI, pH 8.0. Anticuerpo Ant¡-D2E7 SCA Biotinilado Los componentes de glicina y Tris en las muestras fueron eliminados mediante una columna de extracción de sal PD-10 la cual se equilibró con 50 mM de fosfato, pH 7.6, 100 mM de NaCI. A la solución de anticuerpo se le agregó 1/10 volúmenes de Biotina activada en DMSO en una proporción molar de reacción de 40:1 (biotina.anticuerpo). Después de 1 hora a una temperatura de 25°C, se purificó el anticuerpo biotinilado en una columna de extracción de sal PD-10, la cual se equilibró con PBS (10 mM fosfato de sodio, 138 mM NaCI, 2.7 mM KCI, pH 7.4). 5C. Manchado Western Se utilizó el antisuero de conejo Anti D2E7 SCA como un anticuerpo primario y se utilizó HRP anti conejo de cabra como un anticuerpo secundario. El enlace se midió con un sustrato de peroxidasa TMBM. El antisuero de conejo también se preparó previamente contra el péptido enlazador 218 de 18 residuos sintético. También se estableció la reactividad con proteínas SCA que contienen este enlazador. Resultados de Manchado Western Todas las bandas mostradas en los geles a partir de preparaciones purificadas, fueron positivas con manchado Western. La figura 7 muestra un ejemplo de un análisis Western de compuestos D2E7 SCA y PEG SCA detectados con antisuero anti-2-7-SC-1. El anticuerpo de detección primaria fue antisuero de conejo anti-2-7-SC-1 SCA preparado a partir de'conejos inmunizados con la proteína SCA recombinante purificada. La Columna 1 y la columna 7, marcadores de peso molecular (250, 148, 98, 64, 50, 36, 22, 16, 6 y 4 kDa); columna 2 proteína 2-7-SC-2 SCA; columna 3, etil-2-7-SC-2; columna 4, PEG (5 kDa)-2-7-SC-2; columna 5, PEG (20 kDa)-2-7-SC-2 ; columna 6, PEG (40 kDa)-2-7-SC-2. No se estableció que la proporción de la proteína 2-7-SC-2- SCA existiera como un monómero y dímero en los estudios animales debido a la baja concentración en plasma. Sin embargo, el despeje ligeramente más rápido de la proteína 2-7-SC-2 con N-etilmaleimida podría sugerir que parte de la proteína SCA de partida fue dímero y exhibió menos despeje debido a una mayor masa o avidez. 5D. Análisis de Pureza. La forma de dímeros se genera reticulando los residuos de cisteína libres ya que 2-7-SC-2 SCA modificada con N-etil-maleimida no mostró dímeros en un SDS-PAGE sin reducción.
Los conjugados PEG-SCA purificados normalmente contienen PEG esencialmente no libre, tal como se detecta mediante el manchado con Yodo, menos del 1% de SCA no modificada y menos del 1% de moléculas de peso molecular alto tal como se detecta en SDS-PAGE. 5E. Manchado con Yodo Los geles SDS PAGE fueron enjuagados con dH20 y colocados en una solución de cloruro de bario al 5%. Después de 10 minutos de mezclado suave, el gel se enjuagó con H20 y posteriormente se colocó en una solución de yodo en 0.1 M Titrisol® para el desarrollo del color. 5F. Determinación de Masa. Los valores de masa exactos de los conjugados SCA y PEG-SCA se determinaron mediante espectrometría de masa de ionización de desorbción láser auxiliada por matriz ("MALDl-TOF"; Broker Daltronics OmniFlex NT) utilizando un estándar interno con peso molecular similar en la matriz de ácido-a-ciano-4-hidroxi cinámico (CHCA). Los pesos moleculares aparentes (radio Store) de las proteínas SCA fueron estimados utilizando cromatografía de columna de Filtración de Gel Superdex 200 HR 10/30 [Amersham Biosciences, a través del método del fabricante] el cual se equilibró en 50 m de fosfato de sodio; pH 6.5 y 150 mM de NaCI.
Además, se llevó a cabo un análisis de masas moleculares en geles SDS-PAGE 4-20%, utilizando estándares de proteína-PEG y proteína adecuadas. El peso molecular aparente de PEG-40k-SCA, tal como se determina mediante cromatografía de exclusión por tamaño, fue de 670 kDa, o aproximadamente 10 veces más que su masa molecular. Resultados de Determinación de Peso Molecular de 2-7-SC-2: En la tabla 4 se muestran los resultados de la determinación del peso molecular.
La correlación de tamaño PEG con respecto al tamaño de la proteína en gel SDS de 4-20% fue Y = 0.00156X. Otras variantes D2E7 SCA y compuestos PEG-SCA mostraron valores de masa comparables que están conformados con su peso molecular y tamaño de polímero. 5G. Secuenciación de Terminal-N y Mapeo de Péptido: La secuenciación de terminal-N de 2-7-SC-2 y 2-7-SC-5 confirmó el procesamiento esperado de la secuencia de señal, de modo que el aminoácido de terminal-N de las proteínas SCA segregadas es alanina, seguido del primer residuo de VL. Mapeo de Péptido en PEG 40 kDa 2-7-SC-5- La proteína (0.2 mg total) se desnaturalizó y redujo en HCI de Guanidina 6 M que contiene 1 mM de EDTA y 5 mM DTT. La solución se dejó incubar a una temperatura de 37°C durante 1 hora. Se agregó un agente de alquilación, yodoacetamida, al final de la concentración de 15 mM y la reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la alquilación, se desactivó la yodoacetamida excesiva agregando ß-mercaptoetanol a 45 mM (concentración final) y la solución se sometió a columna de extracción de sal PD10. Se concentró PEG-2-7-SC-5 alquilado con Centricom 10 y posteriormente se hidrolizó mediante tripsina tratada con TPCK con una proporción de enzimas a proteína de 1:20 (p/p). La hidrólisis se dejó de 6 a 8 horas a una temperatura de 37°C y posteriormente se agregó la misma cantidad de tripsina fresca para la reacción durante la noche. La solución de proteína hidrolizada se condujo hasta secarse mediante Speedvac y se reconstituyó en agua de grado HPLC. La mezcla de péptido resultante fue fraccionada mediante cromatografía de exclusión por tamaño HPLC (Superdex 75) con agua de grado HPLC. Las fracciones se recolectaron manualmente y se analizaron mediante SDS- PAGE de Tricina manchado con solución de yodo (20 mM en 5% BaCI). Las fracciones manchadas en forma positiva fueron resueltas en forma adicional mediante HPLC fase inversa (Júpiter C18, 2x250 mm) con el gradiente de acetonitrilo (que contiene 0.05% TFA) de 5-70% en 60 minutos. Los picos se recolectaron manualmente y se secaron en Speedvac. Los picos se reconstituyeron con 10 µ? de agua y se tomaron 5 µ? para análisis SDS-PAGE de Tricina. La fracción manchado con yodo en forma positiva (únicamente una, -40 min de tiempo de retención) se sometió a análisis de secuenciador de aminoácidos (Applied Biosystems). La secuencia obtenida del análisis fue GDTSGSGKPG (SEQ ID NO:41), en donde el cuadro en blanco representa el aminoácido modificado, lo que indica que la maleimida-PEG 40K, se adhiere en forma precisa a la cisteina (posición 110 a partir de Ala 1 de terminal-N). 5H. Estabilidad de Resultados D2E7 y PEG-D2E7 Los conjugados D2E7 SCA y PEG-D2E7 SCA mostraron ser estables después de 10 ciclos de congelación-descongelación. Las alícuotas de 2-7-SC-2 SCA nativa (concentración 1.1 mg/ml en 50 mM regulador Tris/Glicina en pH 7.0) se sometieron a congelación a una temperatura de -80°C durante 15 minutos seguido por descongelación a una temperatura de 37°C durante 10 minutos. La maniobra de congelación-descongelación se llevó a cabo durante 3, 5 y 10 ciclos y se analizó la integridad de la SCA nativa mediante SDS-PAGE y mediante el ensayo de rescate celular sensible a TNF establecido. La SCA se encontró muy estable y podría soportar físicamente al menos 10 ciclos de congelación-descongelación, sin mostrar degradación alguna, tal como se determina mediante el manchado Coomassie blue del gel de poliacrilamida (datos no mostrados). No hubo cambio en la actividad biológica de 2-7-SC-2 (IC5o: 224.6 nM) en 5 ciclos de congelación-descongelación. Todas las proteínas D2E7 PEG-SCA en este estudio se encontraron como estables durante 30 días a una temperatura de 4°C en 20 mM de fosfato de sodio, pH 6.5, 150 nM NaCI. La proteína 2-7-SC-2 SCA fue estable a un pH de 3 a 10, temperatura 25°C, 18 horas de incubación. NaCI a una concentración de hasta 1.2 M, no tuvo efecto en la actividad o solubilidad de 2-7-SC-2, en 20 mM de fosfato de sodio, pH 7.4, a una temperatura de 25°C. 51. Antigen icidad . Las proteínas D2E7 SCA PEGiladas, muestran una disminución marcada en la eficiencia de enlace a anticuerpos policlonales anti-D2E7 SCA. PEG-SCA 2-7-SC-5 es marginalmente reactiva con suero de conejo de péptido anti-218 tal como se analiza con manchados Western utilizando antisuero anti-218.
EJEMPLO 6 ANÁLISIS DE CITOM ETRÍ A DE FLUJO DE PROTEÍNAS SCA Y PEG-SCA Ensayo De Enlace de Receptor de Superficie Celular de 2-7-SC-2, 2-7-SC-3, 2-7-SC-4, 2-7-SC-5. Se utilizó la línea celular WEHI-13VAR para analizar el enlace TNF-alfa al receptor celular en la presencia de D2E7 SCA ó PEG-D2E7 SCA. La TNF-alfa de Biotina (0.04 µ9) fue incubada previamente con D2E7 SCA ó PEG-D2E7 SCA (1-4 µ9) en 50 µ? de regulador FACS (1% FBS y 0.05% NaN3 en PBS) a una temperatura de 25°C durante 30 minutos y posteriormente a una temperatura de 4°C durante 15 minutos con agitación. Al mismo tiempo, los controles, tales como el inhibidor de tripsina de fríjol soya biotinilado (0.05 9), anticuerpo TNF-alfa anti-humano IgG de cabra policlonal (20 µg), y CC49 SCA (4 µ9), también se incubaron previamente con biotina-TNF-alfa (0.04 µ9) en 50 µ? de regulador FACS. Las células WEHI-13VAR fueron desunidas del frasco utilizando 20 mM EDTA enfriado con hielo en PBS, temperatura 37°C durante de 2 a 3 minutos. Las células fueron resuspendidas en Medio RPMI 1640 y giraron a 2000 rpm durante 5 minutos. Posteriormente las células fueron lavadas una vez con medio y dos veces con regulador de lavado FACS y contadas utilizando un hemacitómetro.
Las células se suspendieron en regulador FACS hasta una concentración final de 2x106 cels/ml. Todos los tubos Eppendorf ámbar utilizados para las células, fueron bloqueados con regulador FACS durante al menos 1 hora a una temperatura de 4°C. Para el efecto del reactivo de bloque D y Fe de Actinomicina (BD Biosciences) en el enlace de TNF-alfa al receptor celular, las células (105) fueron incubadas previamente con 0.05 µg de Actinomicina D/1x106 células o 1 µ? de bloqueo Fc/1x106 células en 50 µ? de regulador FACS durante de 15 a 30 minutos a una temperatura de 4°C. A la mezcla de 50 µ? de TNF-alfa y PEG-D2E7 SCA se le agregaron 50 µ? de células 1x105 WEHI-13VAR. Después de 60 minutos de incubación a una temperatura de 4°C en la oscuridad, las células fueron giradas y resuspendidas en 80 µ? de regulador FACS frío. Se agregaron 10 µ? de Estreptavidina-Ficoeritrina. La mezcla se incubó en la oscuridad a una temperatura de 4°C durante 30 minutos. Posteriormente las células se lavaron dos veces con 1 mi de regulador FACS frío y se resuspendieron en 0.3 mi de regulador de lavado FACS para el análisis. Análisis de Citometría de Flujo-Resultados. El inhibidor de tripsina de fríjol soya biotinilado, IgG de interferón-alfa anti-humano de cabra policlonal y CC49 SCA (Enzon) no exhibieron enlace y sirvieron como controles negativos. La preincubación con reactivos de bloques Fe (BD Biosciences) y Actinomicina D para las células no tuvo efecto en el enlace TNF-alfa. Los conjugados PEG-D2E7 2-7-SC-2 SCA (etilo-, 5k, 20k, ó 40k PEG) eliminaron completamente el enlace de TNF-alfa a las células en una proporción molar mayor a 16:1 (D2E7 SCA:TNF-alfa). En las mismas proporciones molares de D2E7 SCA a TNF-alfa, D2E7 SCA nativo también redujo el enlace de TNF-alfa a las células, aunque no completamente. Por consiguiente, en este análisis, las versiones PEG-SCA del D2E7 fueron más potentes que las proteínas SCA nativas. Las figuras 6A, 6B y 6C muestran datos representativos de compuestos 2-7-SC-2 y PEG-SCA en el análisis de Citometría de flujo de la capacidad de estos compuestos para evitar que el TNF-a etiquetado con biotina enlace a su receptor en células WEHI-13VAR. Estos datos muestran que los compuestos anti-TNF-a PEG SCA son altamente activos para bloquear el enlace de esta citosina a su receptor en el sistema con base en las células. El Análisis de Citometría de Flujo del Enlace TNFa al Receptor Celular en la Presencia de 2-7-SC-2 ó PEG-2-7-SC-2.1, la población celular sin etiquetado con fluorescencia,; 2, población celular después del enlace a biotina-TNFa y posteriormente a estreptavidina-ficoeritrina; y 3, el efecto de 2-7-SC-2 (FIG. 6A), PEG(20K)-2-7-SC-2 (FIG. 6B), y P EG(40k)-2-7-SC-2 (FIG. 6C) en el enlace TNFa celular. La proporción molar de 2-7-SC-2 ó PEG-2-7-SC-2 a TNFa es de 16:1. El desplazamiento hacia la baja intensidad de fluorescencia indica un enlace reducido de TNFa a las células. EJEMPLO 7 ANÁLISIS BIACORE Análisis Cinético de la interacción de hTNF-alfa recombinante con D2E7 SCA y PEG-SCA Se analizó la interacción entre TNF-a y las variantes D2E7 SCA y sus formas PEGiladas mediante técnicas de resonancia de plasmón de superficie (SPR) utilizando un instrumento BiaCore X (BiaCore, Inc.; Piscataway, Nueva Jersey). El TNF-a humano recombinante con una pureza >97% (Pierce; Rockford, IL) se inmovilizó en un chip C 5 (BiaCore, Cat# BR-1000-14) como un 10 µ?/??? de solución con un pH de 5.0 (regulador de acetato, BiaCore, Cat# BR-1003-51). Se lavó tres veces la superficie inmovilizada con regulador de acetato, pH 4.5 (BiaCore, Cat# BR-1003-50) y se sometió a análisis de estabilidad de ligante durante 6 ciclos con 500 nM de SCA nativa. D2E7 SCA sirvió como material para análisis con acetato a un pH de 4.5 como el regulador de regeneración.
En la superficie enlazada con TNF-a estable, se revisaron diferentes concentraciones de SCAs ó PEG-SCAs con respecto a asociación (3 minutos) y disociación (2 minutos o 5 minutos)y se analizaron los datos para los parámetros cinéticos (por ejemplo valores kencendido, kapagado. KAí y KD) utilizando el software de BiaEvaluation (versión 3.0). Se utilizó HBS-N (BiaCore, Cat# BR-1003-69) como el regulador de corrida en este protocolo. Análisis Cinético de Interacción entre hTNF-alfa con D2E7 SCA y PEG-SCA. Métodos TNF-alfa Fuente: Pierce, forma recombinante, cat# RTNFA50 Mw: 17.4 k D, 157 aa Pureza: >97% Reconstitución: En agua destilada "DW" a una concentración de 100 g/ml. No se encontraron aditivos presentes en la preparación. Almacenamiento: Almacenado a una temperatura de -70 grados C. D2E7 SCA: Clon 2-7-SC-2 Fuente: Enzon Pharmaceuticals, Inc., forma recombinante expresada en Pichia MW: 27 kDa, con enlazador 218 Pureza: >90% Reconstitución: En 10 mM de regulador de fosfato, pH 7.0, con 150 mM NaCI Almacenamiento: Almacenado a 4.0 grados C Inmovilización: Utilizando Nuevo Chip CM5 Concentración TNF: 10µg/ml diluida directamente de la existencia en regulador de acetato con pH 5.0. Rango de Flujo: 5.0 µ?/min Canales: FC1-2, 30 minutos de activación con mezcla de 1:1 NHS/EDC Canal: FC2, inyección manual de 15 µ? de TNF, 10 µg/ml (se inyectará menos volumen para lograr RUs inferiores) Canales: FC1-2, 3 minutos de inactivación con 1 M de Etanolamina, pH 8.5 Canal: FC1-2, inyección manual de 25 µ? de BSA, 1 µg/ml en reguladorH BS-N Canales: FC1-2, 1 minuto de inyección de 10 mM de acetato, pH 4.5, 100 µ?/min, para despejar la puerta de inyección. RU Final (unidad de respuesta) fue de 199. El chip CM5 se lavó con regulador HBSN y se probó durante al menos 6 ciclos de estabilidad con 50 nM 2-7-SC-2. Posteriormente se utilizó el Chip CM5 para el análisis cinético. Análisis Cinético de D2E7 2-7-SC-2 Concentración de 2-7-SC-2: diluido en HBS-N inmediatamente antes de la inyección 2.98 g/ml (1080 nM) 1.49 µg/p\\ (540 nM) 0.745 µgfm\ (270 nM) 0.3725 µg/m\ (135 nM) 0.186 µ9/??? (67.5 nM) 93 ng/ml (33.75 nM) 46.5 ng/ml (16.875 nM) 23.28 ng/ml (8.4375 nM) 0 µg/ml (0 nM) Rango de Flujo: 25 µ?/min (Nota: resultaron 30 µ?/min en un enlace similar como el de 20 y 25 µ?/min) Duración de Asociación: 3 minutos Duración de Disociación: 2 minutos y 5 minutos Regulador de Regeneración: 10 mM de Acetato, pH 4.5 Se llevó a cabo la regeneración en dos pasos, 100 µ? de lavado a 100 µ?/min como el primer lavado y 40 a 80 µ? a 100 µ?/min como el segundo lavado, dependiendo de la RU que se dejó en el chip después del primer lavado. Análisis de Datos Las curvas cinéticas de asociación y disociación de la reacción de enlace biomolecular, se analizaron utilizando un enlace 1:1 ajustado con y sin limitaciones de transferencia de masa. No se lograron mejorías significativas en las cinéticas al incluir parámetros de transferencia de masa, lo que muestra que el fenómeno de transferencia de masa no fue prevalente en los experimentos. Se prepararon para este propósito 2-7-SC-4 y PEG-40k-2-7-SC-4. Los resultados FACS muestran independientemente que no hubo diferencia entre el enlace D2E7/PEG-D2E7 SCA a TNF-alfa, con y sin segmento de marca-his SCA. Los resultados de los estudios Biacore y de rescate celular también han confirmado que este segmento de marca-his no es responsable de los eventos de enlace del antígeno y SCA. Se determinaron las cinéticas de enlace directo mediante inmovilización de TNF-alfa en el Chip CM5 y se permitió que fluyeran diferentes concentraciones de versiones-PEG y nativas de 2-7-SC-2 a través del ligando enlazado. La tabla 5 que se encuentra a continuación, proporciona los valores ka (kencend¡do), kd (kapagado), KA y KD de diferentes formas de 2-7-SC-2 SCAs. Parámetros Cinéticos de Compuestos 2-7-SC-2 SCA TABLA 5 Versiones 2-7-SC-2 ka (M-y1) kd (s-1) KA (M"1) KD (M) 2-7-SC-2-natíva 3.28e6 3.92e~" 8.36e8 1.2e9 2-7-SC-2-NE-mal 1.47e5 7.87e5 1.86e9 5.37e10 2-7-SC-2-5K-PEG 4.96e4 3-Ole-4 1.65e8 6.06e"9 2-7-SC-2-20K-PEG 1.6e3 4.18e* 3.83e6 2.61 e"7 2-7-SC-2-40K-PEG 4.47e3 6.78e* 6.59e6 1.52e"7 La tabla 5 anterior, confirma que las proteínas SCA PEGiladas mantienen alta afinidad con su ligante. Sin embargo, las moléculas diseñadas PEG-SCA diferentes muestran diferencias en rangos de activación y rangos de desactivación. En particular, la versión PEG DE 40 kDa de 2-7-SC-2 ha disminuido significativamente los rangos de activación, aunque ha retenido los rangos de desactivación, cuando se comparan con el SCA de origen. Esto podría reflejar un efecto de hidranza esférica en este ambiente de enlace artificial en el chip BIACore a través de los polímeros PEG grandes y flexibles. En contraste, los ensayos a base de células descritos en este estudio, muestran una potencia de enlace similar para las proteínas SCA nativas y PEGiladas de 40 kDa. Las tendencias específicas en las perturbaciones de rango de activación y rango de desactivación mediante PEGilación podrían revelar una conformación o arreglo específico del compuesto del polímero con respecto a la proteína conjugada. Los estudios adicionales en compuestos PEG-SCA adicionales que se describen más adelante, señalan esta posibilidad. Los datos 2-7-SC-4-40 kDa-PEG indican que la colocación del polímero PEG directamente en el término-C, mejora sustancialmente los rangos de desactivación. La estrategia de utilizar los parámetros definidos de la colocación de cisteína SCA y la masa del polímero PEG, tal como se describe en este estudio, también puede permitir la optimización de las propiedades de enlace y de actividad de cualquier conjugado de proteína PEG-SCA individual. Cinéticas de Enlace de 2-7-SC-5 y 2-7-SC-7 a rhTNF Se determinaron cinéticas de enlace directas inmovilizando TNF-alfa en el Chip CM5 y permitiendo diferentes concentraciones de versiones nativas y de PEG de 2-7-SC-5 y 2-7-SC-7/para que fluyan a través del ligante enlazado. Las tablas que se encuentran a continuación proporcionan los valores ka, kd, KA, y D de diferentes formas de 2-7-SC-5 y 2-7-SC-7. TABLA 6 PARÁMETROS CINÉTICOS DE COMPUESTOS 2-7-SC-5 SCA TABLA 7A PARÁMETROS CINÉTICOS DE 2-7-SC-7 Versión ka (NlV) kd(s'1) KA (NT1) KD (M) 2-7-SC-7-nativa 3.51 e4 2.96e-6 1.19e10 8.43e-11 TABLA 7B PARÁMETROS CINÉTICOS DE 2-7-SC-7 Versión 2-7-SC-7 ka(M1s'1) kd (s1) KA (NT1) KD(M) 2-7-SC-7-20 -PEG 4.37e4 2.89e-4 1.51e8 6.61e-9 Se determinaron las cinéticas de enlace directo inmovilizando TNFa en le Chip CM5 y permitiendo que fluyeran diferentes concentraciones de versiones nativas y PEG de 2-7-SC-3/2-7-SC-7 a través del ligante enlazado. Las tablas que se encuentran a continuación proporcionan los valores ka, kd, KA y KD de diferentes formas de 2-7-SC-3 y 2-7-SC-7. TABLA 8A Parámetros Cinéticos de 2-7-SC-3 SCAs y Conjugados.
Versiones 2-7-SC-3 ka (M ) kd(s-1) KA (NT1) KD (M) 2-7-SC-3 nativa 4.64e4 4.16e 1.1 ee 9.05e9 2-7-SC-33-20K-PEG 1.02e4 2.5T4 4.07e7 2.45T"8 2-7-SC-340K-PEG 4.14e3 1.03e7 9J4"8 TABLA 8B Parámetros Cinéticos de 2-7-SC-4 SCAs y Conjugados Kencendido (1'Ms) Kapagad0 (1/s) KA KD (M) (Jim) 2-7-SC-4 nativa 2.72e5 4.95e" 5.49e8 1.82e9 2-7-SC-440 -PEG 1.12e4 4.04e"e 2.78e9 3.6e"10 EJEMPLO 8 ENSAYO PARA NEUTRALIZACIÓN DE CITOTOXIC1DAD CELULAR TNF-a El ensayo a base de células para la neutralización de citotoxicidad celular de TNF-a se llevó a cabo como se indica a continuación. Las células WEHI-13VAR obtenidas de la recolección de Cultivo Tipo Americano ATCC No. CRL-2148) son más sensibles a TNF-a en la presencia de Actinomicina D, y se emplearon en este ensayo. Las células WEHI-13VAR fueron sembradas en una placa de 96 depósito, 10,000 células por depósito, y se incubaron durante la noche a una temperatura de 37°C en un incubador humidificado con 5% de C02. Se agregaron un rango de concentraciones de proteínas D2E7 SCA y sus formas PEGiladas a las células sembradas en las placas de 96 depósitos en diluciones en serie de 10 µg ml a 2.5 ng/ml en medio de cultivo. Inmediatamente después de la adición de los compuestos se agregó rhTNF-a D2E7SCA a cada (Pierce) a cada depósito a una concentración de 1.0 ng/ml. Las células se dejaron crecer posteriormente durante 24 horas y se determinó la viabilidad celular mediante la adición de 15 µ? de reactivo de tinta MTT (Cat# G4000, Promega Corporation [Madison, Wisconsin]) (bromuro de tetrazolio 3- (4-,5-dimetiltiazol2il)2,5-d¡fen¡lo) siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis de rescate celular se llevó a cabo comparando la viabilidad de las células tratadas con D2E7 con células no tratadas en la presencia de TNF-a. Los depósitos de control consistieron de células no tratadas, y células tratadas con TNF-a solo. Las células en los depósitos de control exhibieron una perdida total de viabilidad. El porcentaje de células viables (o células rescatadas) en los depósitos de experimento, fue trazado contra el registro de concentraciones de D2E7 y se determinaron los valores IC50 de cada grupo de datos. Cada valor se derivó de un grupo experimental por triplicado. Rescate Celular Mediante Proteínas D2E7 SCA de Letalidad por TNF-Alfa. La capacidad de las proteínas anti- TNF-a SCA, tal como aquellas que se describen en las tablas 9A, 9B y 9C que se encuentran más adelante, para proteger las células de efectos negativos de TNF-a, se confirmó empleando una línea celular sensible a TNF-a, y contactando las células con TNF-a, con y sin proteína SCA 2-7-SC-2. Los resultados fueron consistentes con pruebas adicionales llevadas a cabo con otras proteínas SCA preparadas a través del ejemplo 1.
Materiales y Métodos Línea celular: células WEHI-13VAR; ATCC# CRL-2148, línea celular de ratón, Propagación: medio RPMI 1640 con 2 mM de G-glutamina, 1.5 g/L de bicarbonato de sodio, 4.5 g/L de glucosa, 10 mM HEPES, y 1.0 mM de piruvato de sodio, y 10% de FBS. Medio de Congelación: Medio de Cultivo 95% y DMSO, % Método de Ensayo Se tripsinizaron células WEHI-13VAR y se sembraron en una placa de 96 depósitos, 10,000 células/depósito en un medio RPMI- 640 y se dejaron estabilizar durante 12 horas en un incubador humidificado a una temperatura de 37°C con 5% de Co2. Las células se lavaron con PBS y se agregó medio fresco a cada depósito. Se agregaron a los depósitos Diferentes variantes D2E7 SCA y sus formas PEGiladas, incluyendo las que se describen en las Tablas 9A, 9B y 9C que se encuentran más adelante. Las SCAs fueron diluidas en series de 10 µglp\ a 2.5 ng/ml (diluidas en un medio RPMI completo). No se agregó D2E7 a las células de control. Inmediatamente después de la adición del compuesto D2E7, se agregó hTNF-alfa recombinante (1.0 ng/ml diluido en medio RPMI, medio no completo) a cada depósito. No se agregó TNF-alfa a las células de control no tratadas. Las células fueron incubadas durante 24 horas en un incubador humidificado a una temperatura de 37°C con 5% de C02. Al final del período de incubación, se agregó 15 µ? de reactivo de tinta MTT (Cat# G4000, Promega Corporation) a cada depósito y la placa se incubó durante 4 horas a una temperatura de 37°C, y antes de detener la solución se agregó a cada depósito. El contenido de cada depósito se mezcló profundamente y se dejaron solubilizar durante la noche a temperatura ambiente los cristales. La placa se leyó a 570 nm y 630 nm en un lector de placa de 96 depósitos (Molecular Devices) y se trazó la diferencia (medida de viabilidad celular) en unidades de absorbancia contra la concentración del compuesto D2E7 utilizado para rescatar las células contra citotoxicidad TNF-alfa. La concentración de la proteína D2E7 SCA en la cual se rescataron el 50% de las células se determinó para cada grupo de experimento a partir de la gráfica de viabilidad utilizando el registro [D2E7] como los parámetros del eje X y del porcentaje Rescatado como el eje Y. La estabilidad del polímero de Mal-PEG (20 kDa) a una temperatura de 25°C, 50 mM fosfato de sodio pH 7.0, 1 mM de EDTA, se investigó mediante exploración de absorbancia UV de 220 nm a 400 nm durante 0, 2, 4 ,22 y 33 horas. Después de 33 horas a una temperatura de 25°C, se agregó 3 mM de cisteína y la mezcla se exploró después de 5 minutos de incubación. Se cuantificó el tiempo dependiente de la conversión del pico distintivo a 300 nm. Nota: Las células WEHI-13VAR son más sensibles a TNF-alfa y a linfotoxina que L929 (ATCC CCL-1). En la ausencia de Actinomicina D, estás células pierden sensibilidad para TNF en 30 días. Asimismo, se encontró la adición de Actinomicina D como perjudicial para el rescate de células a través de los compuestos D2E7. Se analizaron 2-7-SC-2 2-7-SC-N E-maleimidas PEGilados, 5K, 20K, 40K con respecto a su potencia para rescatar células del exterminio transmitido por TNF. La tabla 9A proporciona los valores IC50 (para rescatar el 50% de células WEH1-13VAR del exterminio a través de 1.0 ng/ml TNF) para cada versión de 2-7-SC-2. Tabla 9A: Rescate celular mediante compuesto 2-7-SC-2 SCA: Versiones 2-7-SC-2 Valores IC50 2-7-SC-2 nativa 3.05X10-9M 2-7-SC-2-NE-maleimida 3.71X10-9 M 2-7-SC-2-5 -PEG 4.27X10-9 M 2-7-SC-2-20K-PEG 3.52X10-9M 2-7-SC-40K-PEG 11-09X10-9 M Tabla 9B: Rescate Celular mediante compuestos 2-7-SC-4 SCA: Tabla 9C: Rescate Celular mediante compuestos 2-7-SC-5 SCA: Estos datos confirman que las versiones PEGiladas de D2E7 SCA muestran bioactividad similar en el enlace y neutralización de la TNF-alfa de citocina en este ensayo a base de células. Por consiguiente, los compuestos PEG-SCA tienen la capacidad de neutralizar en forma efectiva esta citocina y evitar su enlace a los receptores TNF-alfa en estas células. EJEMPLO 9 FARMACOCINÉTICAS DE D2E7 SCA Y PEG-SCAs PROTOCOLO DE ESTUDIOS: Farmacocinéticas de Conjugados SCA y PEG-SCA en Ratones ICR.
Propósito del Estudio Este estudio se diseño para revisar las farmacocinéticas de plasma de SCA D2E7 (2-7-SC-2 y 2-7-SC-5) y las formas PEGiladas incluyendo los conjugados PEG (5kd), PEG(20kd) y PEG(43kd) en ratones ICR. Artículos de Prueba (Almacenados a una temperatura de -20°C antes de la administración) D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) (100% activo p/p) PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) (57.4% activo p/p) PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) (38.6% activo P/P) Sistema de Prueba Especies: ratones ICR (Sprague Dawley Harían) Edad: 7-8 semanas Género: Hembra Peso: Rango de Peso en el inicio: aproximadamente 25g Conservación de los Animales: Los ratones se alojaron en cantidades de 5 por jaulas en cajas de criadero en el vivario de la Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey ("UMDNJ"). Las jaulas se diseñaron de acuerdo con "La Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Recursos Animales para Laboratorio" Consejo Nacional de Investigación. Se eliminó el material de desecho como mínimo dos veces por semana. Las jaulas se etiquetaron claramente con una tarjeta en la jaula que indica el estudio, artículo de prueba, número de animal, sexo y nivel de dosis. Los animales fueron aclimatados durante una semana antes del inicio del estudio. Dieta. Los ratones tuvieron acceso a agua corriente y se alimentaron con papilla de laboratorio comercialmente disponible ad libitum. Preparación de Muestras D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) se diluyeron con PBS a 0.556 mg/mL D2E7 PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) se diluyeron con PBS a 0.503 mg/mL Equivalentes D2E7 PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) se diluyeron con PBS a 0.541 mg/mL Equivalentes D2E7 Solución Salina Regulada con Fosfato; 10 mM de fosfato de sodio, pH 6.5 que contiene NaCI. Sitio de Administración. Los conjugados D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5), PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5), y PEG(40kd)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5) fueron administrados en una sola dosis (Día 1) vía i.v. a través de la vena de la cola. Diseño Experimental Se asignaron (54) ratones, se dosificaron y se les extrajo sangre de acuerdo con el esquema de la Tabla 10 que se encuentra a continuación.
LU « oIad A dos (2) ratones no tratados se les extrajo sangre a través de una punción cardiaca en tubos que contienen EDTA para la recolección de plasma de control no tratado. Los ratones fueron inyectados en forma intravenosa con 200µ?_ por ratón de conjugado D2E7(2-7~SC-5), 180µ? por ratón de PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-5), y 190 µ? por ratón de conjugado PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-5). Después de sedarlos con 0.09% de avertina, se extrajo la sangre de los ratones a través del seno retro-orbital en frascos que contiene EDTA. A los 2 minutos, 15 minutos, 30 minutos, y 1 hora se extrajo la sangre de los ratones 100 µ?_ a las 3 hora, 6 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y 96 horas los ratones fueron desangrados en forma terminal -1,000 µ?_ mediante punción cardiaca. El plasma fue recolectado después de la centrifugación de la sangre e inmediatamente fue congelada a una temperatura de -80°C en hielo seco. Las muestras de plasma fueron descongeladas y la concentración de los compuestos D2E7 fue determinada mediante ELISA. Los datos fueron modelados utilizando el software WinNonlin para determinar los parámetros farmacocinéticos D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5), PEG(20kd)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5), y PEG(43kd)-D2E7(2-7-SC-2, 2-7-SC-5). Revisiones Clínicas: Los ratones fueron examinados visualmente cuando llegaron. Se llevó a cabo una revisión física detallada con respecto a señales de anormalidad clínica únicamente cuando fue necesaria de acuerdo con la evaluación visual, con el objeto de evitar una manipulación excesiva. Los ratones fueron revisados visualmente una vez al día después de infusión del artículo de prueba, con respecto a mortalidad y señales de reacción al tratamiento. Cualquier muerte y señales clínicas se registraron. Las revisiones más frecuentes se llevaron a cabo si así lo determinaban las circunstancias. Provisión de Cuidados para el Animal: Este estudio se llevó a cabo de acuerdo con los lineamientos actuales con respecto al cuidado animal (Publicaciones NIH 86-23, 1985) Farmacocinéticas de Conjugados D2E7 SCA y PEG-D2E7 SCA en Ratones: Ensayo Inmunoabsorbente Enlazado por Enzimas (ELISA) de D2E7 SCA y PEG-SCA Preparación de la Muestra: El rango lineal de SCA probado fue de 0.2 ng/ml y 30 ng/ml. Las concentraciones de proteína ng/ml y la lectura óptica dentro del rango lineal se utilizó para el análisis. El SCA ó PEG-SCA estándar se diluyó en plasma hasta un factor de dilución similar al de las muestras de plasma analizadas o diluidas directamente en un regulador de dilución (0.1 % BSA y 0.05% de Tween-20 en PBS, pH 7.4). Para simplificar el procedimiento, se diluyó el estándar en regulador de dilución para el análisis de muestra de plasma. La dosificación mediante administración i.v. ó s.c. 4.5 mg/kg. Los factores de dilución para las muestras de plasma mediante administración i.v., fueron 500 muestras durante 0.03-3 horas y 10 muestras de SCA durante 6-96 horas, 500 muestras durante 0.03-24 horas y 10 muestras de PEG-5k-SCA durante 4-96 horas, 800 muestras durante 0.033-6 horas y 100 muestras de PEG-20k-SCA durante 24-6 horas, y 800 para todas las muestras de PEG-40k-SCA. Los factores de dilución de las muestras de plasma mediante administración s.c, fueron 200 para todas las muestras de SCA y 300 para todas las muestras de PEG(20k)-SCA. Procedimiento ELISA. Se utilizó un ensayo ELISA de emparedado para determinar las concentraciones de plasma de los conjugados SCA y PEG-SCA. Las muestras se midieron en términos de composiciones definidas tal como se detectó mediante el anticuerpo. El anticuerpo de captura fue anticuerpo anti-D2E7 policlonal el cual se purificó mediante proteína A y columnas de afinidad conjugadas por D2E7. Para el enlace al TNFa, la placa fue cubierta con TNFa. Los anticuerpos primarios y secundarios fueron anticuerpo anti-D2E7 biotinilado y estreptavidina-peroxidasa, respectivamente. Se recubrieron placas Maxisorp con 400 ng/depósito de anticuerpo anti-D2E7 ó TNFa en 50 µ? de 50 mM de bicarbonato de sodio a una temperatura de 25°C durante la noche. Al mismo tiempo, para dilución de muestras, las placas de microdepósitos Nunc o cualesquiera placas de 96 depósitos regulares que tuvieron una absorción mínima de proteína, fueron bloqueadas con regulador de bloqueo (1% BSA, 5% Sacarosa, y 0.05% NaN3 en PBS, pH 7.4) a una temperatura de 4°C durante la noche. Al siguiente día, se eliminó la solución de recubrimiento y la solución de bloqueo tanto de las placas ELISA como Nunc con un aspirador. Las placas ELISA fueron bloqueadas con solución de bloqueo (250 µ?/depósito) durante al menos 1 hora a una temperatura de 25°C y las placas Nunc se lavaron tres veces con regulador de lavado (PBS con 0.05% Tween-20, pH 7.4) o se dejaron secar con aire a una temperatura de 25°C y se almacenaron a una temperatura de 4°C para análisis adicional. Las placas ELISA después de eliminar la solución de bloqueo, fueron lavadas con regulador de lavado tres veces o se dejaron secar con aire a una temperatura de 25°C y se almacenaron selladas a una temperatura de 4°C hasta que se utilizaron adicionalmente. Las muestras de plasma fueron diluidas en 1:2 en una forma consecutiva desde la parte superior de la placa Nunc hasta la parte del fondo dejando 120 µ? en cada depósito. Después de la dilución previa con regulador de dilución, se transfirieron 100 µ? de las muestras a las placas ELISA y se incubaron a una temperatura de 4°C durante la noche. Una vez que las soluciones de la muestra se eliminaron y las placas se lavaron tres veces con regulador de lavado, se agregó a cada depósito 20-ng de anticuerpo anti-D2E7 de biotina en 50 µ? de regulador de dilución. Las muestras se incubaron a una temperatura de 25°C durante 2 horas. Se agregaron 100 µ? de estreptavidina-peroxidasa a una dilución de 1:16,000 después de que se eliminó el anticuerpo primario y las placas se lavaron con regulador de lavado cuatro veces. Las placas se incubaron a una temperatura de 25°C durante 1 hora. La solución se eliminó y las placas se lavaron tres veces con regulador de lavado. El color se desarrolló 10-20 minutos después de agregar 100 µ? de substrato TMBE y se detuvo agregando 50 µ? de 1 M H2S0 . Se registró la absorbancia a 450 nm. Adquisición de datos y análisis. Los datos se adquirieron y analizaron en un lector de microplaca de Molecular Devices. La curva estándar se obtuvo trazando la densidad óptica de los puntos de extremo a 400 nm versus las concentraciones del estándar y trazando la mejor curva de adaptación que tiene un coeficiente de correlación de 0.99 ó mejor. Todas las concentraciones de muestra no conocidas fueron calculadas a partir de la curva estándar una vez que se incorporó el factor de dilución. Los números más cercanos de todos los puntos de datos que tienen una densidad óptica adecuada han sido promediados para los resultados. Farmacocinéticas de conjugados y D2E7 SCA y PEG- D2E7 SCA en ratones. Se determinaron los parámetros PK para todas las series 2-7-SC-2 y (2-7-SC-2, etilo-2-7-SC-2, PEG-5k-2-7-SC-2, PEG-20k-2-7-SC-2, PEG-40k-2-7-SC-2). Se determinaron parámetros PK para 2-7-SC-5, PEG-20k-2-7-SC-5, y PEG-40k-2-7-SC-5. También se determinaron mediante inyección s.c. los parámetros PK para 2-7-SC-2 y PEG-20k-2-7-SC-2. A partir de los experimentos piloto, se observó una sensibilidad de detección inferior de 2-7-SC-2 (50 ng/ml) utilizando enlazador-218. Se observó una extensión de vida promedio de circulación de aproximadamente 10 veces en ratones en los compuestos PEG-SCA de 40 kDa (2-7-SC-2, 2-7-SC-5) cuando se compararon con la proteína SCA no modificada. La tabla 11, que se encuentra más adelante muestra los parámetros farmacocinéticos determinados para 2-7-SC-2, PEG-2-7-SC-2, 2-7-SC-5, PEG-2-7-SC-5 administrados a través de inyección intravenosa (IV) o inyección subcutánea (SC). o TABLA 11 Parámetros Farmacocinéticos de D2E7 SCA y PEG-SCA en Ratones1 SCA/PEG Rte ha (ta) MRT (hr) AUC CL Vss Gmax br. g ml ml/hr/kg nuTkg u-g/ml 2-7-SC2 i.v. 0.15±0.03 0.70*0.20 0.37*0.23 U.3±1.4 387*49 280±57 53.8*3.8 Etil-2-7-SC2 i.v. 0.08*0.00 0.7±O0 0.44±0.02 4.2±0.1 1035±12 450*20 36.5*0.1 PEG(5k)-2-7-SC22 i.v. 2.57±0.87 6.74*5.19 8.21*6.23 338±80 10.5±2.6 84.1*33.7 104±6 FEG(20k)2-7-SC23 i. . 4.38±1.76 27.2±49.0 19.9*34.1 347±I38 12.6*5.0 250*346 54.9*1.4 FEG(40k)2-7-SC2 i.v. 21.62*2.64 28.3±4.1 40.6±5.8 3463±387 1.26±0.14 51.3±3.2 111±5 2-7-SC-5 0.23=0.01 1.34*0.13 1.51±0.16 19.1*1.0 203*10 308*18 57.8*0.9 PEG(20k)2-7-SC-52 3.57±0.97 7.00±2.64 9.79±3.66 449.5*115.1 8.91*1.46 81.0* 88.2*10.8 LO 10.3 PEG(40k)-2-7-SC5 20.7±3.8 30.7*14.0 41.2*15.3 2624*466 1.36*0.24 56.0* 88.0*3.6 13.5 2-7-SC2 1.4*30.2 22.4*5.0 178*39 4.11*0.44 PEG(20k)2-7-SC2 26.0±3.0 1925*115 2.08*0.12 39.0*1.8 Se determinaron los parámetros farmacocinéticos para intravenoso ("i.v.") utilizando dos compartimentos, i.v. bolo, sin tiempo de retraso, modelo de eliminación de 1er. orden. Se determinaron parámetros farmacocinéticos para se utilizando un compartimento, entrada de 1er. orden, módelo de eliminación de primer orden. 2 Los datos son un promedio de dos análisis de modelado en computadora y se tomó la desviación estándar más alta. 3 Números altos de desviación estándar.
Estos resultados demuestran que las vidas en circulación de proteínas SCA PEGiladas pueden diseñarse para cubrir el rango de farmacocinéticas terapéuticamente útiles. La extensión dos-log de la vida promedio de suero en el SCA conjugado por PEG de 40 kDa, coloca a estos compuestos en el rango farmacocinético de anticuerpos monoclonales intactos. La adhesión específica del sitio del polímero PEG en un sitio único lejano al sitio de enlace de antígenos, permite la fabricación no únicamente de proteínas de enlace de antígenos activas, sino también la producción de un producto que es relativamente homogéneo en su composición, en contraste con la heterogeneidad substancial de proteínas SCA PEGiladas utilizando químicas de amino aleatoria. La gran diferencia en vidas en circulación de las proteínas SCA PEGiladas de 40 kDa de este estudio, cuando se compara con las proteínas SCA PEGiladas de 20 kDa, fue algo sorprendente. No se anticipó esto con base en los resultados de las proteínas SCA PEGiladas en forma aleatoria (CC49), e donde hubo evidencia de una meseta farmacocinética en un PEG de aproximadamente 20 kDa, ya que el PEG de 12 kDa mostró vidas en circulación comparables. Aunque no nos apegamos a alguna teoría o hipótesis en como la presente invención puede operar, se considera que es la estructura de cadena ramificada lo que también contribuye a prolongar en gran medida las vidas en circulación de los compuestos PEG-SCA de 40 kDa. Es de especial interés el éxito de utilizar PEG-SCA en inyecciones subcutáneas. Esta ruta de administración proporcionó valores AUC marcadamente mejores a la administración intravenosa. La ruta subcutánea puede finalmente ser la preferida para la formulación de terapéuticos PEG-SCA. La adhesión de enlazador de PEG a SCA probó éxito y también se comparó en estudios animales con la adhesión PEG de terminal-C. Posiblemente, la adhesión de enlazador de PEG también puede contribuir a la promoción de estabilidad SCA y disminuir la antigenicidad y/o proteólisis. EJEMPLO 10 PROTEÍNAS D2E7 PEG-SCA DIMÉRICAS A TRAVÉS DE BIS-MALE1MIDA-PEG Con el objeto de generar compuestos PEG-SCA bivalentes que tengan dos proteínas SCA por un polímero, se emplearon polímeros bis-maleimida-PEG. Estos tienen el grupo maleimida activado tanto en ambos términos del polímero. El análisis SDS PAGE demostró que los compuestos SCA-PEG-SCA podrían ser sintetizados utilizando los métodos de la presente descripción. Los efectos del pH de reacción y la proporción molar de reacción se muestran en las tablas 12 y 13, respectivamente.
Efecto de proporción molar de reacción formación de bis- y mono-D2E7-SCA TABLA 12 Los datos se obtuvieron mediante análisis de imagen de gel en 4 a 20% de SDS-PAGE. Se disolvió bis-mal-PEG (20k) en 100 mM de fosfato de sodio, pH 6 en una concentración de 3.7 mg/ml. Posteriormente se agregó lentamente a 1 mg/m, D2E7 2-7-SC-2 en 100 mM de fosfato de sodio, pH 6 y 1 mM EDTA en 1/30 a 1/10 volúmenes de D2E7 2-7-SC-2, y se indicó la proporción molar de reacción. La reacción se condujo a una temperatura de 25°C bajo nitrógeno durante 1.5 horas. Efecto de pH de reacción en la formación de bis y mono-D2E7 SCA-PEG (20k) TABLA 13 La reacción contuvo 1 mg/ml de compuesto D2E7 2-7-SC-2 y 0.12 mg/ml de compuesto bis-mal-PEG en una proporción molar de reacción de 0.165:1 (bis-mal-PEG :2-7-SC-2) en 100 mM de fosfato de sodio en el pH indicado. Las muestras se analizaron en 4-20% de gel SDS-PAGE y la banda correspondiente de cada compuesto fue cuantificada. Las impurezas de peso molecular alto fueron menores al 1% y el dímero de 2-7-SC-2 fue menor al 5%. EJEMPLO 11 CONFIRMACIÓN DE ACTIVIDAD ANTI-TNFa EN RATONES Este ejemplo confirma la eficacia de anticuerpo de cadena simple de factor-a de anti-necrosis de tumor PEGilado (Peg-anti-TNFa SCA), SCA anti-TNFa nativo y anticuerpo anti-TNFa Humira® (D2E7 intacto) para neutralizar la cascada de inflamación (profilaxis) promovida por TNFa en un modelo animal estándar con base en el estímulo de TNFa, tal como se describe en la Publicación de Galanos y Asociados, 1979, Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA) 76:5939-5943, incorporada a la presente invención como referencia. En síntesis, se indujo la endotoxemia en ratones C57/BL6 inyectando TNFa en ratones sensibilizados con D-galactosamina (NGal) a través de ruta intraperitoneal (i.p.). En síntesis, se inyectaron i.p. ratones con diferentes dosis de SCA nativo, PEG-SCA, y Humira®, 30 minutos antes de el estímulo de los ratones con una combinación de TNFa humano recombinante (1.0 pg/animal) y N-galactosamina (20 mg/animal). Los ratones que sobrevivieron se eutanizaron después de 24 horas. La inyección de NGal y TNF juntos originó la letalidad en casi todos los animales en 24 horas. 30 minutos antes de la administración intraperitoneal ("IP") de 1 microgramo de TNF y 20 mg de NGal, se administraron varias dosis de D2E7 MAb (Humira®), MAb de neutralización TNF ó los compuestos PEG-SCA de 20 ó 40 kDa. Los ratones tratados tanto con MAb E27 como con compuestos PEG-SCA exhibieron altos índices de supervivencia comparables en dosis comparables. Materiales y Métodos Los animales de prueba fueron ratones hembra C57B1/6 (Sprague Dawley Harían) con 7 a 8 semanas de edad, que pesaban aproximadamente 25 g al inicio. Los ratones se mantuvieron con agua del grifo y con papilla de laboratorio comercialmente disponible ad libitum. Los agentes probados con respecto a las propiedades protectoras contra el estímulo mediante TNFa, fueron SCA nativo 2-7-SC-5; 2-7-SC-5-20k-PEG-SCA; 2-7-SC-5-43K-PEG-SCA, preparados como se describió anteriormente, y MAb D2E7 intacto (Humira® de Abbott Immunology, Abbott Park, Illinois). El control fue una solución reguladora de fosfato ("PBS"). Los agentes se administraron a través de una sola inyección intraperitoneal ("IP").
Se asignaron ciento veintiséis (126) de acuerdo con el siguiente protocolo: TABLA 14: Parte 1 *Los ratones que reciben tratamiento PBS serán dosificados en un volumen de 100 µ?, ip.
TABLA 14: Parte 2 Después de al menos una semana de aclimatación, los ratones se inyectaron i.p. con el tratamiento especificado indicado anteriormente. Treinta minutos después de la inyección (t = 0), los ratones fueron estimulados i.p. con estimulantes como los que se indicaron. (Los ratones recibieron 1.0 g/ratón de TNFa recombinante en 50 µ?/PBS y/o 20 mg/ratón D-galactosamina en 200 µ? PBS). Posteriormente se repitió el experimento anterior, utilizando los mismos procedimientos, pero con dosis mayores de los compuestos de prueba: 0.125 pg, 0.625 pg, 2.5 µg, y 10.0 µg por ratón por cada 2-7-SC-5-20K-PEG- SCA y 2-7-SC-5-40K-PEG-SCA, respectivamente. Se probó 2-7-SC-5 SCA no conjugado a 20 g y se probó D2E5 (Humira) a 0.625 g/ratón. Resultados Se trazó el porcentaje de datos de supervivencia contra la dosis del compuesto (datos no mostrados). La dosis del compuesto que ofrece al menos el 70% de protección a ratones estimulados con TNFa, fue considerado como la línea de base para comparación de eficacia. Dosis idénticas (0.625 g/animal) de Humira® y PEG-SCAs, ambas de 20k y 40 kDa-PEG-SCAs) protegieron a los ratones de letalidad inducidas por TNF. Sin embargo, se requirió una mayor dosis de SCA no conjugado, nativo (20 µg/animal ó aproximadamente 800 µg/kg), para lograr un nivel de protección similar en estos ratones. Sobre bases molares, los datos derivados demostraron que fue necesario aproximadamente un exceso de tres veces de PEG-SCA de 20 ó 40 kDa para lograr la equivalencia de supervivencia similar al anticuerpo de longitud total. Por otra parte, se requirieron 100 veces de exceso molar del SCA nativo para lograr una protección similar contra letalidad inducida por TNF. Estos datos sugieren que la modificación de D2E7 SCA a través de PEG, ofrece distintas ventajas con respecto a la proteína nativa, incrementando de la vida promedio en circulación de la proteína en plasma.
Ya que los animales de prueba tuvieron en promedio aproximadamente 25 gramos, 0.625 pg/animal corresponde a la dosis de aproximadamente 25 pg/kg 7 100 pg/animal corresponde a aproximadamente 400 pg/kg.

Claims (30)

  1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Un polipéptido de enlace de antígeno de cadena simple con la capacidad de conjugación específica del sitio a un polímero de óxido de polialquileno, que comprende, (a) un primer polipéptido que comprende una parte de enlace de antígeno de una región variable de una cadena de anticuerpo pesada o ligera; (b) un segundo polipéptido que comprende una parte de enlace de antígeno de una región variable de una cadena de anticuerpos pesada o ligera; y (c) un enlazador de péptido que enlaza al primer y segundo polipéptidos, en donde el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple tiene al menos un residuo cis que tiene la capacidad de ser conjugado a un polímero de óxido de polialquileno, y tiene al menos un sitio de enlace de antígenos, y en donde el residuo cis se localiza en una posición seleccionada del grupo que consiste de: (i) un término-C de la región variable de cadena pesada o cadena ligera; (ii) un término-N de la región variable de cadena pesada o cadena ligera; (¡ii) cualquier posición de aminoácidos del enlazador de péptido; (iv) tanto el término-N como el término-C; (v) posición 2 del enlazador; (vi) tanto la posición 2 del enlazador como el término-C; (¡v) combinaciones de los mismos; y en donde el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple enlaza TNFct.
  2. 2. El polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el residuo cis se localiza en una posición seleccionada del grupo que consiste en la posición 2 del enlazador, el término-C y combinaciones de los mismos.
  3. 3. El polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer polipéptido comprende una región variable de una cadena ligera de anticuerpo y el segundo polipéptido comprende una región variable de una cadena pesada de anticuerpo.
  4. 4. El polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el término C del segundo polipéptido es el término-C nativo.
  5. 5. El polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el enlazador de péptido fluctúa en tamaño de 2 a 18 residuos.
  6. 6. Un conjugado que comprende el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple de conformidad con la reivindicación 1, y que comprende un polímero de óxido de polialquileno, caracterizado porque el polímero de óxido de polialquileno está enlazado en forma covalente al polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple en un residuo cis.
  7. 7. El conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el óxido de polialquileno está enlazado al polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple en un residuos cis, a través de un enlazador del grupo que consiste en un enlazador de maleimida, vinilsulfona, tiol, disulfuro de ortopiridilo y un enlazador de yodoacetamida.
  8. 8. El conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el óxido de polialquileno está enlazado al polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple en un residuo cis a través de un enlazador de maleimida.
  9. 9. El conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el óxido de polialquileno fluctúa en tamaño desde aproximadamente 5,000 hasta aproximadamente 40,000 dáltones.
  10. 10. El conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el óxido de polialquileno es un óxido de polietileno.
  11. 11. El conjugado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el óxido de polialquileno se conjuga para al menos dos polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple, y cada polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple es el mismo o diferente.
  12. 12. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple se conjuga en forma adicional a una porción funcional adicional.
  13. 13. El conjugado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la porción funcional adicional es una etiqueta o marca detectable.
  14. 14. Un polinucleótido que codifica el polipéptido de enlace de antígenos de cadena variable de conformidad con la reivindicación 1.
  15. 15. Un vector de expresión que se puede replicar que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 14.
  16. 16. Un método para producir el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple, en donde el método comprende los pasos de: (a) cultivar una célula huésped que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 12, y (b) recolectar el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple expresado por la célula huésped.
  17. 17. Un método para detectar TNFa que se sospecha se encuentra en una muestra, en donde el método comprende: (a) contactar la muestra con un reactivo que comprende el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple de conformidad con la reivindicación 1, y (b) detectar si el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple se ha enlazado al TNFa.
  18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple está conjugado en forma covalente para al menos un polímero de óxido de poiiaiquileno a través de un residuo cis del polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple.
  19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el conjugado está anclado a un substrato sólido.
  20. 20. Un método para tratar o prevenir toxicidad relacionada con TNF-a en un mamífero, en donde el método comprende administrar el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple de conformidad con la reivindicación 1 al mamífero, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple se administra en una cantidad efectiva para inhibir la actividad TNFa en el mamífero.
  21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple administrado se conjuga en forma covalente al menos un polímero de óxido de polialquileno a través de al menos uno de los residuos cis.
  22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple se administra en una cantidad que fluctúa de aproximadamente 10 ug/kg a aproximadamente 4,000 µg/kg.
  23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple se administra en una cantidad que fluctúa de aproximadamente 20 ug/kg a aproximadamente 400 pg/kg.
  24. 24. Una proteína que comprende dos o más polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cada polipéptido de enlace de antígenos de cadena simple es el mismo o diferente.
  25. 25. La proteína de conformidad con la reivindicación 24 la cual es bivalente, trivalente o tetravalente.
  26. 26. La proteína de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque los polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple constituyentes están asociados en forma no covalente.
  27. 27. La proteína de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el enlazador de péptido de los polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple constituyentes fluctúan en tamaño de 2 a 18 residuos.
  28. 28. La proteína de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque los polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple constituyentes están enlazados en forma covalente.
  29. 29. La proteína de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque se codifica como una proteína multivalente simple.
  30. 30. Un polinucleótido que codifica la proteína de conformidad con la reivindicación 19. R E S U M E N La presente invención se refiere a polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple monovalentes y multivalentes con modificaciones específicas de sitio. Los polipéptidos proporcionados tienen la capacidad de ser enlazados o conjugados en forma covalente a óxidos de polialquileno en los sitios modificados. Los conjugados resultantes retienen las propiedades de enlace de antígeno y exhiben tiempo en circulación prolongado y antigenicidad reducida con relación a los polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple no conjugados. También se proporcionan métodos y composiciones para elaborar y utilizar los polipéptidos de enlace de antígenos de cadena simple con modificaciones específicas de sitio.
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