JP2002516610A - グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用 - Google Patents

グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用

Info

Publication number
JP2002516610A
JP2002516610A JP54735198A JP54735198A JP2002516610A JP 2002516610 A JP2002516610 A JP 2002516610A JP 54735198 A JP54735198 A JP 54735198A JP 54735198 A JP54735198 A JP 54735198A JP 2002516610 A JP2002516610 A JP 2002516610A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
antigen
amino acid
asn
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP54735198A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4187277B2 (ja
JP2002516610A5 (ja
Inventor
アール． フィルプラ，デイビッド
ワン，マオリャン
ジー．エル． ショー，ロバート
ディー． ウィトロー，マーク
エス． リー，リーシュン
Original Assignee
エンゾン，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by エンゾン，インコーポレイテッド filed Critical エンゾン，インコーポレイテッド
Publication of JP2002516610A publication Critical patent/JP2002516610A/ja
Publication of JP2002516610A5 publication Critical patent/JP2002516610A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4187277B2 publication Critical patent/JP4187277B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Abstract

(57)【要約】 本発明は、グリコシル化し得る抗原結合単鎖分子に関する。グリコシル化し得る一価および多価の抗原結合単鎖分子の組成物、この抗原結合単鎖分子をコードする遺伝構築物、およびこの抗原結合単鎖分子を産生するための方法が、記載されそして請求される。ポリアルキレンオキシド結合体化をし得る、グリコシル化された一価および多価の抗原結合単鎖分子の組成物、この抗原結合単鎖分子をコードする遺伝子構築物、およびこの抗原結合単鎖分子を産生するための方法が、記載されそして請求される。本発明はまた、増加したグリコシル化を有するポリペプチドを産生するための方法、および記載の方法によって産生されるポリペプチドに関する。グリコシル化／ポリアルキレンオキシド結合体化された抗原結合タンパク質の多官能性から生じる使用もまた、記載されそして請求される。

Description

【発明の詳細な説明】 グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用 発明の背景 発明の分野 本発明は、一般に、グリコシル化し得る抗原結合単鎖分子に関する。より具体 的には、本発明は炭水化物部分に付着し得るAsn結合型グリコシル化部位を有す る抗原結合タンパク質に関する。本発明はまた、グリコシル化し得る多価の抗原 結合分子に関する。本発明はさらに、ポリアルキレンオキシド結合体化し得るグ リコシル化抗原結合分子に関する。ポリアルキレンオキシドと結合体化し得るグ リコシル化抗原結合タンパク質の組成物、このグリコシル化抗原結合タンパク質 についての遺伝構築物、このグリコシル化抗原結合タンパク質の使用方法、およ び産生方法が開示される。本発明はまた、増加したグリコシル化を有するポリペ プチドを産生するための方法および記載された方法により生成されるポリペプチ ドに関する。 背景技術の説明 抗体は、抗原と呼ばれる侵入する分子と複合体化し得る特定の分子を提供する 免疫系により生成されるタンパク質である。天然の抗体は、2つの同一の抗原結 合部位を有し、これら両方は特定の抗原に特異的である。抗体分子は、エピトー プと呼ばれる抗原の領域とその抗原結合領域との複合体化により、抗原を「認識 」する。エピトープは、抗体の抗原結合部位のコンフォメーション構造物に適合 し、抗体が抗原に結合することが可能になる。 IgG抗体は、例えば、2つの同一のポリペプチド重鎖および軽鎖からなり、鎖間 のジスルフィド結合によりともに保持される。抗体についてのこの議論の残りは 、軽鎖/重鎖の一対にのみ言及する。なぜなら、それぞれの軽鎖/重鎖の対は同一 であるからである。各個々の軽鎖および重鎖は、約110アミノ酸の領域に折畳ま れ、保存された3次元コンホメーションをとる。軽鎖は、1つの可変領域（VL）お よび 1つの定常領域（CL）を含むが、重鎖は1つの可変領域（VH）および3つの定常領 域（CH1、CH2、およびCH3）を含む。領域の対が会合して、個別の構造を形成す る。特に、軽鎖および重鎖の可変領域は会合して、抗原結合部位を含む「Fv」領 域を形成する。 免疫生物学、組換えDNA技術およびコンピューターサイエンスにおける今日の 進歩は、抗原に結合する単一のポリペプチド鎖分子の作成を可能にしてきた。こ れらの単一鎖の抗原結合分子（「SCA」）または抗体の単鎖可変フラグメント（ 「sFv」）は、リンカーポリペプチドを組み込んで個別の可変領域であるVLおよ びVHを単一のポリペプチド鎖と架橋する。抗原結合単鎖タンパク質の理論および 生成についての説明は、Ladnerら、米国特許第4,946,778号、同第5,260,203号、 同第5,455,030号および同第5,518,889号に見い出される。上記の米国特許に記載 されるプロセスにおいて生成される抗原結合単鎖タンパク質は、Fabフラグメン トに対応する抗原結合単鎖タンパク質に実質的に類似する結合特異性および親和 性を有する。リンカー設計についてのコンピューターが介助する方法は、Ladner ら、米国特許第4,704,692号および同第4,881,175号およびW094/12520においてよ り詳細に記載される。 SCAポリペプチドのインビボ特性は、MAbおよび抗体フラグメントとは異なる。 それらの小さなサイズに起因して、SCAポリペプチドは、血液からより迅速に消 失し、そして組織へより迅速に浸透する（Milenic、D.E.ら、Cancer Reseach 51 ：6363-6371（1991）；Colcherら、J.Natl．Cancer Inst．82：1191（1990）；Y okotaら、Cancer Reseach 52：3402（1992））。定常領域の欠失に起因して、SC Aポリペプチドは、肝臓および腎臓のような組織では保持されない。定常領域の 迅速なクリアランスおよび欠失に起因して、SCAポリペプチドは、低い免疫原生 を有する。従って、SCAポリペプチドは、癌の診断および治療における適用を有 し、ここで、迅速な組織浸透性およびクリアランス、ならびに微生物生成の容易 さが有利である。 多価抗原結合タンパク質は、1つより多くの抗原結合部位を有する。多価抗原 結合タンパク質は、2つ以上の単鎖タンパク質分子を含む。増強された結合活性 、2つ以上の特異的結合、および多価抗原結合タンパク質の他の新規の作用が実 証 されてきた。Whitlow,M.ら、Protein Engng.7:1017-1026(1994);Hoogenboom、H. R.Nature Biotech 15:125-126(1997);およびWO93/11161を参照のこと。 タンパク質の炭水化物修飾は3つの一般的なカテゴリーに分けられる：アスパ ラギンのＮ結合型（またはAsn結合型）修飾、セリンまたはトレオニンの0結合型 修飾、ならびにＣ末端のカルボキシル基のグリコシル-ホスハチジルイノシトー ル誘導。それぞれのこれらの形質転換は、異なるペプチド配列要件および反応特 異性を実証する1つ以上の酵素により触媒される。Ｎ結合型グリコシル化は、単 一の酵素であるオリゴ糖トランスフェラーゼ（oligosaccharyl transferase）（ OT）により触媒され、そして発生段階でのポリペプチド内部のアスパラギン側鎖 への脂質結合型テトラ-デカ多糖類（GlcNAc2-Man9-Glc3）の同時翻訳転移を含む (Imperiali，B．およびHendrickson,T.L.，Bioorganic & Med．Chem．3:1565-15 78(1995))。アスパラギン残基は、トリペプチドのＮ結合型グリコシル化コンセ ンサス配列Asn-Xaa-Thr/Ser（NXT/S）（ここで、Xaaはプロリンを除く20個の天 然アミノ酸のいずれかであり得る）の内部に存在しなければならない。 アミノ酸18-20位（Kabatの番号付け）における天然のＮ結合型グリコシル化配 列（Asn-Val-Thr）が、マウス抗Ｂ細胞リンパ腫抗体であるLL-2の軽鎖可変ドメ インのフレームワーク1（FR-1）領域において同定された（Leung，S．-O．ら、J ．Immunol．154：5919-5926（1995））。アルギニンからアスパラギンへの単一 変異により、IL-2の配列と類似するＮ結合型グリコシル化配列は、非グリコシル 化ヒト化抗癌胎児性Ag（CEA）AbのFR-1セグメント、MN-14に導入される（Leung 、S．-O．ら、J.Immunol.154：5919-5926（1995）（これは本明細書において参 考として援用される）。 システイン残基でのジスルフィド結合による架橋手段を有するＣ末端を有する sFvが報告されている（Hustonら、米国特許第5,534,254号）。モノクローナル抗 体もまた、VL領域の約アミノ酸18位でのAsn結合型グリコシル化部位での炭水化 物部分を介して、診断剤または治療剤と共有結合することが報告されている（Ha nsenら、米国特許第5,443,953号）。VH鎖でのAsn結合型グリコシル化される抗デ キストラン抗体の結合についての研究が実施されており、これは、VH領域でのAs n結合型炭水化物部分の位置におけるわずかな変化が実質的に異なる抗原結合の 効果を生じることを示す（Wrightら、EMBO J．10：2717-2723（1991））。sFvの VH領域内部の19位でのグリコシル化は、細胞内にsFvの全体の量の発現を増強し 、その約半分はグリコシル化され(Greenman，Jら、J.Immunol.Methods 194:169- 180(1996))、かつグリコシル化sFvの合成および分泌は非グリコシル化sFvを超え て増強された（Jost，C.R.ら、J.Biol．Chem．269：26267-26273（1994））こと も報告されている。Coら、米国特許第5,714,350号は、グリコシル化部位の除去 による抗体の結合親和性の増加に関する。 ポリペプチド分子へのポリアルキレングリコールまたはポリアルキレンオキシ ドの鎖の共有結合は、Davisらの米国特許第4,179,337号、ならびにAbuchowskiお よびDavisの「Enzymes as Drugs」HolcenbergおよびRoberts編、367-383頁、Joh n Wiley and Sons,New York(1981)、ならびにZalipskyら、WO92/16555に開示さ れる。これらの参考文献は、ポリエチレングリコールにより修飾されたタンパク 質および酵素が、元々の化合物と比較して、減少した免疫原性および抗原性を有 し、そして血流中におけるより長い生存時間を有することを開示した。化学的に 修飾された結合体の得られた有益な特性は、様々な治療的適用において非常に有 用である。 ポリエチレングリコール（PEG）および類似のポリ（アルキレンオキシド）の 分子への共有結合をもたらすために、ポリマーのヒドロキシル末端基が、最初に 、反応性官能基へ変換されなければならない。このプロセスは、「活性化」と頻 繁に言われ、そして生成物は「活性化PEG」と呼ばれる。 ヒドラジドは、アルデヒドおよびケトンの縮合により比較的安定なヒドラゾン 結合体を容易に形成する(Andresz,H.ら、Makromol.Chem.179:301(1978))。この 特性は、酸化オリゴ糖部分を介する糖タンパク質の修飾について広範に使用され てきた(Wilchek,M．& Bayer,E.A.,Meth.Enzymol.138.429(1987))。 活性化PEGヒドラジドは、アルデヒド基との反応を可能にする。アルデヒドは タンパク質のポリペプチド鎖には通常存在しない。しかし、タンパク質が炭水化 物部分を含む場合、そのときは、炭水化物が活性化されて、マンノースのような 糖環の酸化により反応性のアルデヒド基を提供し得る。免疫結合体の活性化の方 法は、Selaら、Immunoconjugates，Vogel編、Oxford University Press(1987)に 記載される。この方法では、PEGヒドラジドは炭水化物構造を介してタンパク質 と共有結合され得る。Zalipsky，S.ら、WO92/16555では、ポリマーに結合された ヒドラジド官能基またはヒドラゾン官能基を含む結合による糖ポリペプチドの酸 化炭水化物部分と共有結合されたPAOを記載する。炭水化物部分の酸化は反応性 アルデヒドを生成する。ヒドラゾン結合は、ペプチド配列を含むポリマーのアシ ルヒドラジン誘導体をこれらのアルデヒド基と反応させることにより形成される 。 先行技術は、塩化シアヌル酸とのPEGのヒドロキシル基の活性化し、次いで得 られた化合物は、タンパク質と結合される（Abuchowskiら、J.Biol.Chem.252：3 578（1977）；Abuchowski & Davis、前出（1981）。しかし、この方法の使用に おいては欠点が存在する（例えば、塩化シアヌル酸の毒性およびアミンではない 官能基（例えば、遊離型の必須システインまたはチロシン残基）を有するタンパ ク質についてのその非特異的反応性）。 これらおよび他の欠点を克服するために、別の活性化PEG（例えば、PEGのスク シンイミジルスクシネート誘導体（「SS-PEG」）が導入された(Abuchowskiら、C ancer Biochem.Biophys.7:175-186(1984))。これは、穏やかな条件下でタンパク 質と迅速に反応し（30分）、さらに広範に修飾された結合体を得る。 Zalipskyは、米国特許第5,122,614号において、ポリ（エチレングリコール） −Ｎ-スクシンイミド炭酸塩およびその調製物を開示した。このポリマーの形態 は、タンパク質のアミノ基、ならびに低分子量ペプチドおよび遊離のアミノ基を 含む他の物質と容易に反応すると言われていた。 タンパク質のアミノ基とPEGの間の他の結合型（例えば、ウレタン結合型(Vero neseら、Appl．Biochem．Biotechnol．11:141-152(1985))、カルバメート結合型 (Beauchampら、Analyt．Biochem．131:25-33(1983))など）もまた、当該分野で 公知である。 sFvのポリアルキレンオキシド修飾は、米国仮特許出願第60/050,472号（1997 年6月23日出願）に開示され、この開示は本明細書において参考として援用され る。 活性化ポリマーはまた、付着部位として働く求核性官能基を有する治療剤と反 応し得る。接着部位として一般に使用される1つの求核性官能基は、リジンの∈- アミノ基である。遊離カルボキシル酸基、適切には、活性化カルボニル基、酸化 型炭水化物部分およびメルカプト基もまた、接着部位として使用されてきた。 ポリ（エチレングリコール）またはポリ（アルキレンオキシド）の有機低分子 との結合は、Greenwald，R.B.,Exp．Opin．Ther．Patents 7:601-609(1997)、En zon Inc.，WO95/11020およびEnzon Inc.，WO96/23794（これらの開示は、本明細 書において参考としてすべてが援用される）に記載される。PEGバラストと劇薬 との間の種々のリンカー基の使用に基づく組成物は、WO96/23794に記載される。 発明の要旨 本発明は、グリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドに関し、このポリペ プチドは、以下： （ａ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプ チド； （ｂ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプ チド；ならびに （ｃ）第一のポリペプチド（ａ）および第二のポリペプチド（ｂ）を連結して 、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにするペプチドリンカー、 を含み、ここで、抗原結合単鎖ポリペプチドは、Asn-Xaa-Yaa（ここで、Xaaはプ ロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンである）を 含む少なくとも1つのトリペプチドのAsn結合型グリコシル化配列を有し、ここで 、トリペプチドグルコシル化配列は、（ｉ）軽鎖可変領域のアミノ酸11位、12位 、13位、14位、または15位；（ii）軽鎖可変領域のアミノ酸77位、78位、または 79位；（iii）重鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14位、または15位； （iv）重鎖可変領域のアミノ酸82B位、82C位、または83位；（v）ペプチドリン カーの任意のアミノ酸位置；（vi）第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端の近傍； ならびに（Vii）それらの組み合わせ、からなる群から選択される位置に位置す るAsn残基で炭水化物部分と結合体化し得、ここで、グリコシル化された抗原結 合単鎖ポリペプチドは、抗原と結合体化し得る。 本発明はさらに、グリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドをコードする ポリヌクレオチドに関し、このポリペプチドは、以下： （ａ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプ チド； （ｂ）抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプ チド；ならびに （ｃ）第一のポリペプチド（ａ）および第二のポリペプチド（ｂ）を連結して 、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにするペプチドリンカー、 を含み、ここで、抗原結合単鎖ポリペプチドは、少なくとも1つのAsn-Xaa-Yaa（ ここで、Xaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセ リンである）を含む少なくとも1つのトリペプチドのAsn結合型グリコシル化配列 を有し、ここで、トリペプチドグルコシル化配列は、（ｉ）軽鎖可変領域のアミ ノ酸11位、12位、13位、14位、または15位；（ii）軽鎖可変領域のアミノ酸77位 、78位、または79位；（iii）重鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14ま たは15位；（iv）重鎖可変領域のアミノ酸82B位、82C位、または83位；（v）ペ プチドリンカーの任意のアミノ酸位置；（vi）第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末 端の近傍；および（vii）それらの組み合わせ、からなる群から選択される位置 に位置するAsn残基で炭水化物部分と付着し得、ここで、グリコシル化抗原結合 単鎖ポリペプチドは、抗原と結合体化し得る。 ポリヌクレオチドはDNAまたはRNAであり得る。 本発明は、上記のDNA配列を含む複製クローニングまたは発現ビヒクルに関す る。本発明はまた、プラスミドのようなビヒクルに関する。本発明はさらに、上 記のDNAで形質転換された宿主細胞に関する。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞 もしくは他の真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞株であり得る。好ましい 宿主はPichia pastorisである。 本発明は、グリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドを生成する方法に関 し、この方法は、以下の工程を包含する： （ａ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプ チドをコードする第一のポリヌクレオチドを提供する工程； （ｂ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプ チドをコードする第二のポリヌクレオチドを提供する工程；ならびに （ｃ）第一のポリヌクレオチド（ａ）および第二のポリヌクレオチド（ｂ）を 、ペプチドリンカーをコードする第３のポリヌクレオチドと連結して、抗原結合 部位を有する単鎖ポリペプチドをコードする第４のポリヌクレオチドにする、工 程であって、ここで、抗原結合単鎖ポリペプチドは、Asn-Xaa-Yaa（ここで、Xaa はプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンである ）を含む少なくとも1つのトリペプチドのAsn結合型グリコシル化配列を有し、こ こで、トリペプチドグルコシル化配列は、（ｉ）軽鎖可変領域のアミノ酸11位、 12位、13位、14位、または15位；（ii）軽鎖可変領域のアミノ酸77位、78位、ま たは79位；（iii）重鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14位、または15 位；（iv）重鎖可変領域のアミノ酸82B位、82C位、または83位；（v）ペプチド リンカーの任意のアミノ酸部位；（vi）第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端の近 傍;および（vii）それらの組み合わせ、からなる群から選択される位置に位置す るAsn残基で炭水化物部分と結合体化し得、ここで、グリコシル化抗原結合単鎖 ポリペプチドは、抗原と結合体化し得る、工程；ならびに （ｄ）（ｃ）の抗原結合単鎖ポリペプチドを宿主中で発現させ、それによりグ リコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドを生成する、工程。 本発明に従う方法では、宿主細胞はグリコシル化を触媒し得る。宿主細胞は、 植物細胞、細菌細胞、酵母細胞もしくは他の真菌細胞、または昆虫細胞、または 哺乳動物細胞株である。好ましい宿主細胞は、Pichia pastorisである。 本発明はさらに、多価抗原結合単鎖タンパク質に関し、これは2つ以上の抗原 結合単鎖ポリペプチドを含み、各単鎖結合ポリペプチドは以下： （ａ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプ チド （ｂ）抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプ チド；ならびに （ｃ）第一のポリペプチド（ａ）および第二および（ｂ）を連結して、抗原結 合部位を有する単鎖ポリペプチドにする、ペプチドリンカー、 を含み、ここで、抗原結合単鎖ポリペプチドは、Asn-Xaa-Yaa（ここで、Xaaはプ ロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンである）を 含む少なくとも1つのトリペプチドのAsn結合型グリコシル化配列を有し、ここで 、トリペプチドグルコシル化配列は、（ｉ）軽鎖可変領域のアミノ酸11位、12位 、13位、14位、または15位；（ii）軽鎖可変領域のアミノ酸77位、78位、または 79位；（iii）重鎖可変領域のアミノ酸11位、12位、13位、14位または15位；（i v）重鎖可変領域のアミノ酸82B位、82C位、または83位；（v）ペプチドリンカー の任意のアミノ酸部位；（vi）第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端の近傍；およ び（vii）それらの組み合わせ、からなる群から選択される位置に位置するAsn残 基で炭水化物部分と付着し得、ここで、グリコシル化抗原結合単鎖ポリペプチド は、抗原と結合し得る。 本発明の上記の実施態様において、トリペプチドグリコシル化配列は、以下か ら選択される部位に位置するAsn残基での炭水化物部分を結合し得る：（ｉ’） 軽鎖可変領域のアミノ酸12位；（ｉｉ’）軽鎖可変領域のアミノ酸77位；（ｉｉ ｉ’）重鎖可変領域のアミノ酸13位；（ｉｖ’）重鎖可変領域のアミノ酸82B位 ；（ｖ’）ペプチドリンカーのアミノ酸2位；（ｖｉ’）第二のポリペプチド（ ｂ）のＣ末端へ隣接した；ならびに（ｖｉｉ’）それらの組み合わせ、ここで、 グリコシル化抗原結合単鎖ポリペプチドは、抗原に結合し得る。 本発明の上記の実施態様において、少なくとも1つの抗原結合単鎖ポリペプチ ドは、少なくとも2つのタンデムなトリペプチドグリコシル化配列を有し得、そ の結果、Asn残基は、2つのアミノ酸残基および/または少なくとも1セットの重複 したトリペプチドグリコシル化配列により隔てられており、その結果、Asn残基 が隣接する。少なくとも1つの抗原結合単鎖ポリペプチドは、3つのタンデムなト リペプチドグリコシル化配列を有し得る。少なくとも1つの抗原結合単鎖ポリペ プチドは、少なくとも２セットの2つのタンデムなトリペプチドグリコシル化配 列および少なくとも２セットの2つの重複したトリペプチドグリコシル化配列を 有し得る。 本発明の上記の実施態様においてもまた、トリペプチドグリコシル化配列のAs n残基は、炭水化物部分と結合され得る。炭水化物部分は、ポリアルキレンオキ シドとさらに結合体化され得る。炭水化物および/またはアルキレンオキシド部 分は、１または複数のペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレート剤、付加さ れたホウ素または検出可能な標識分子と結合体化し得る。炭水化物および/また はポリアルキレン部分は、キャリアと結合した１または複数のペプチド、脂質、 核酸、薬物、毒素、キレート剤、付加されたホウ素または検出可能な標識分子と 結合体化し得る。 本発明の上記の実施態様おいて、第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端は、第二 のポリペプチド（ｂ）のネイティブなＣ末端であり得る。あるいは、第二のポリ ペプチド（ｂ）のＣ末端は、１または複数のアミノ酸残基の欠失を含み得、その 結果、第二のポリペプチドの残りのＮ-末端アミノ酸残基は、抗原と結合し得る グリコシル化ポリペプチドについて十分である。あるいは、第二のポリペプチド のＣ末端は、１または複数のアミノ酸残基の付加を含み得、その結果、グリコシ ル化ポリペプチドは抗原と結合し得る。1つの実施態様において、グリコシル化 配列のAsn残基は、任意の上記の言及された第二のポリペプチドのＣ末端を局所 的に隣接し得、そしてグリコシル化配列が、少なくとも1個のアミノ酸残基に続 き得る。あるいは、グリコシル化配列は、2個、3個、4個、または5個のアミノ酸 残基に続き得る。 本発明の好ましい実施態様において、第一のポリペプチドは、（ａ）抗体軽鎖 の可変領域の抗原結合部分を含み得、そして第二のポリペプチドは、（ｂ）抗体 重鎖の可変領域の抗原結合部分を含む。 本発明はまた、試料中にあると予想される抗原を検出する方法に関し、以下の 工程を包含する： （ａ）試料を本発明のグリコシル化ポリペプチドまたは多価タンパク質と接触 させる工程であって、ここで、炭水化物部分は１または複数の検出可能な標識分 子と結合されるか、またはキャリアと結合した１または複数の検出可能な分子を 有するキャリアと結合される、工程；ならびに （ｂ）グリコシル化抗原結合単鎖ポリペプチドが抗原と結合するか否かを検出 する工程。 本発明はさらに、動物の内部構造を画像化する方法に関し、有効量の本発明の グリコシル化ポリペプチドまたは多価タンパク質を投与する工程を包含し、ここ で、炭水化物部分は、１または複数の検出可能な標識もしくはキレート分子と結 合体化されているか、またはキャリアと結合した１または複数の検出可能な標識 またはキレート分子と結合体化されており、そして、動物に関連する検出可能な 放射線を測定する工程を包含する。動物は、ヒトおよび非ヒトを含む。 本発明はまた、標的化された疾患を処置するための方法に関し、この方法は、 本発明のグリコシル化されたポリペプチドまたは多価タンパク質および薬学的に 受容可能なキャリアビヒクルを含む組成物の有効量を投与する工程を包含し、こ こで、炭水化物部分は、１または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、 ホウ素付加物（addend）または放射性同位体分子）に結合体化されているか、ま たはキャリアに結合体化されており、このキャリアは、このキャリアに結合した 、１または複数の、薬物、毒素、ホウ素付加物または放射性同位体分子を有する 。 上記の方法は、１または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キレー ト剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識化分子にもまた結合体化され得る、 ポリアルキレンオキシドに結合体化した本発明のグリコシル化ポリペプチドまた は多価タンパク質を用いて容易にされ得る。 本発明はまた、（１）増大したグリコシル化を有するポリペプチドを産生する 方法であって、（a）そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少な くとも２つのトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって 、ここで、各トリペプチドグリコシル化配列は、Asn-Xaa-Yaaを含み、ここで、X aaは、プロリン以外のアミノ酸であり、Yaaは、トレオニンまたはセリンであり 、そしてここで、トリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が２つのアミノ酸 残基によって隔てられるように、タンデムになっている、工程；ならびに（ｂ） Asn残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞において、上記ポリヌクレオチド を発現する工程、を包含する方法、ならびに（２）記載したプロセスによって産 生される増大したグリコシル化を有するポリペプチドに関する。 本発明はさらに、（１）増大したグリコシル化を有するポリペプチドを産生す る方法であって、（a）そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少 なくとも１セットの２つのトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する 工 程であって、そしてここで各トリペプチドグリコシル化配列が、Asn-Xaa-Yaaを 含み、ここでXaaは、プロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaは、トレオニン またはセリンであり、ここでこの２つのトリペプチドグリコシル化配列は、Asn 残基が隣接するように重複する、工程；ならびに（ｂ）Asn残基で炭水化物部分 を結合し得る宿主細胞において、上記ポリヌクレオチドを発現する工程、を包含 する方法、ならびに（２）記載したプロセスによって産生される増大したグリコ シル化を有するポリペプチドに関する。 本発明はまた、（１）増大したグリコシル化を有するポリペプチドを産生する 方法であって、（a）そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少な くとも２つのトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって 、ここで各トリペプチドグリコシル化配列は、Asn-Xaa-Yaaを含み、ここでXaaは 、プロリン以外のアミノ酸であり、Yaaは、トレオニンまたはセリンであり、こ こでこのトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が２つのアミノ酸残基によ って隔てられるようにタンデムになっている、工程；（ｂ）そのポリヌクレオチ ドに、少なくとも１セットの２つのトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を 提供する工程であって、ここで、この２つのトリペプチドグリコシル化配列は、 Asn残基が隣接するように重複する、工程；および（ｃ）Asn残基で炭水化物部分 を結合し得る宿主細胞において、上記ポリペプチドを発現する工程、を包含する 方法、ならびに（２）記載したプロセスによって産生される増大したグリコシル 化を有するポリペプチドに関する。 図面の簡単な説明 図１．操作されたN連結グリコシル化部位を有する、CC49/218 SCAのDNA配列（ 配列番号１）および翻訳されたタンパク質配列（配列番号２）。可変軽鎖(VL） および可変重鎖（VH）を示す。制限部位に下線を付し、そして名前を付す。CDR 配列には、二重下線を付してある。218リンカーに下線を付し、名前を付す。提 案されたトリペプチドN連結グリコシル化部位に下線を付してある。N連結グリコ シル化部位を生成するように作製された変異を、提案されたグリコシル化部位の 下に括弧内に示し、そしてオリゴ糖結合の部位を、変異した配列の下に*によっ て示し、そして番号を付す。グリコシル化のためのC末端の延長を括弧内に示す 。 図２．ELISAにおける、E．coli GX9251(A)またはP．pastoris EN225(B)から得 られた親CC49/218 SCAの連続希釈物の、固定されたウシ下顎ムチンへの結合。E ．coli（100μg/ml）からの精製されたCC49/218 SCAおよびP．pastoris EN225（ 約50μg/ml SCA）からの精製されていない培養上清を、材料および方法に記載さ れるように、抗原の直接結合についてアッセイした。405nmでの吸光度(A405)を 、PNPP基質の、アルカリホスファターゼ結合体化ウサギ抗マウス抗体とのインキ ュベーションの10分後に測定した。２つのコントロールを右側に示す。Clは、固 定化したブタ下顎ムチンを用いてアッセイしたCC49/218（3.3倍希釈）の吸光度 を記録する。C2は、ウシ下顎ムチンに固定化された誘導されたP．pastoris宿主G S115(3.3倍希釈)のバックグランド結合を示す。 図３．Nアセチルグルコサミン特異的エンドグリコシダーゼでの酵素的処置の 前および後のCC49/2l8SCAおよびグリコSCAのウエスタンブロット分析。EN225、E N235、およびEN236の培養上清由来の精製されていないCC49/218 SCAを、ペプチ ドNグリコシダーゼFまたはエンドグリコシダーゼHで消化した。サンプル（１レ ーンあたり約１μg）を、４〜20％SDS-PAGEスラブゲル上で泳動し、そしてウサ ギ抗CC49/218 SCAポリクローナル抗体を使用するウエスタン分析のためにニトロ セルロース膜に移した。レーン１〜３、EN236；レーン４〜６、EN235；レーン７ 〜９、EN225。レーン１、４、および７、エンドグリコシダーゼH処置；レーン２ 、５、および８、ペプチドNグリコシダーゼF処置；レーン３、６、および９、非 処置。隣接するレーン10（示さず）は、分子量マーカーを含み、そして抗体に対 して交差反応性を示さなかった。 図４．EN235の培養上清由来のCC49/218 SCAのアフィニティークロマトグラフ ィー。SDS-PAGE分析を、実施例１の「材料および方法」の節に記載したように、 ムチンSepharoseカラム上でのクロマトグラフィーの後に、修飾していないSCAお よびグリコSCAの混合物に由来するEN235上で行った。クーマシーブルー染色ゲル を、Molecular Dynamics Laser Scanner Model PD-SIを使用してスキャンし、そ して面積定量化を、精製されたサンプル（Ａ）および出発上清（B）について表 示する。グリコシル化SCA（ピーク１）の修飾していないSCA（ピーク２）に対す る比は、1.2(A)および1.1(B)である。 図５．Con A Sepharoseによる修飾していないSCAからのグリコSCAのレクチン 特異的分離。EN235培養上清からのCC49/218 SCAを、モル過剰のCon A Sepharose 樹脂（Pharmacia Biotech）とともにインキュベートした。結合していない上清 の画分を除去し、そして結合した画分をα-D-メチルマンノシドで溶出した。SDS -PAGE分析を、４〜20％スラブゲル（レーンあたり約１μg）上で行った。クーマ シーブルーで染色したゲルを、Ａに示す：レーンa、結合画分；レーンｂ、非結 合画分；レーンｃ、非処置培養上清。ゲルを、図４に示すようにスキャンし、そ して結果をBに示す。ここで、ピーク１および２は、それぞれバンド１および２ に対応する。 図６．操作されたグリコシル化部位を有するKabatコンセンサスVκI/218/VHII I SCA。218リンカーによって連繋されたVLドメイン（ヒトκ軽鎖サブグループＩ コンセンサス配列由来）およびVHドメイン（ヒト重鎖サブグループIIIコンセン サス配列由来）を含むコンセンサスヒトSCAタンパク質についてのアミノ酸配列 （配列番号３）および操作されたN連結グリコシル化部位。アミノ酸の割り当て は、Kabaら、Sequences of Proteins of Immunological Interest，108および33 1頁、第５版、U.S．Dept.Health and Human Services，Bethesda，MD（1991）に 従った。ここで、ある位置に割り当てられたアミノ酸残基は、その位置で最も一 般的に生じるアミノ酸である。アミノ酸は、標準的な１文字コドンに従って列挙 され、そしてXは、任意のアミノ酸を示す。CDR配列に、二重下線を付す。218リ ンカーに上線を付し、そして名前を付す。提案されたトリペプチドN連結グリコ シル化部位に下線を付し、そしてオリゴ糖結合の部位を*で示す。N連結グリコシ ル化部位を生成する提案された残基変化を、下に括弧内に示す。グリコシル化の ためのC末端延長を、括弧内に示す。３つの共通でないVκICDR1位置、27D、27E 、および27Fは、示されていない。VHIII末端部位113は、任意であり、そして代 替のSCAは、112位で終結し得る。＋３位のトリペプチド配列に隣接するプロリン 残基は、Gavel，Y.,およびvon Heijne，G.，Protein Engng．3:433-442(1990)の 編集物によって推奨されるように、アラニンに変化している。 図７．操作されたグリコシル化部位を有するC6.5/218 SCA。218リンカーによ って連繋されたVLドメイン（ヒトλ鎖サブグループ１セグメントに由来）および VHドメイン（ヒト重鎖サブグループ５セグメントに由来）を含むヒトC6.5 SCAタ ンパク質についてのアミノ酸配列（配列番号４）および操作されたN連結グリコ シル化部位。野生型C6.5可変ドメインのアミノ酸の割り当ては、Schier，R.ら、 J．Mol．Biol．255:28-43(1996)に従った。CDR配列に二重下線を付す。218リン カーに、上線を付し、そして名前を付す。提案されたトリペプチドN連結グリコ シル化部位に、下線を付し、そしてオリゴ糖結合の部位を、＊によって示す。生 成されたN連結グリコシル化部位を生成するための提案された残基変化を、下に 括弧内に示す。グリコシル化のためのC末端延長は、括弧内に示す。VH末端位置1 13は、任意であり、そして代替のSCAは、112位で終結し得る。＋３位のトリペプ チド配列に隣接するプロリン残基は、Gavel，Y.およびvon Heijne，G.，Protein Engng．3:433-442(1990)の編集物によって推奨されるように、アラニンに変化 している。 図８．操作されたグリコシル化部位を有するA33/218 SCA。218リンカーによっ て連繋されたマウスVLドメインおよびマウスVHドメインを含有するpGX9451のマ ウスA33 SCAタンパク質についてのアミノ酸配列（配列番号５）および操作され たN連結グリコシル化部位。アミノ酸割り当ては、Kabatら、Sequences of Prote ins of Immunological Interest，第５版、U.S.Dept.Health and Services，Bet hesda，MD(1991)の番号付けシステムに従う。CDR配列に二重下線を付す。218リ ンカーに上線を付し、そして名前を付す。提案されたトリペプチドN連結グリコ シル化部位に、下線を付し、そしてオリゴ糖結合の部位を、*によって示す。N連 結したグリコシル化部位を生成するための提案された残基変化を、下に括弧内に 示す。グリコシル化のためのC末端延長を、括弧内に示す。 図９．エンドグリコシダーゼHでの処置の前および後の、１、２、または３つ のグリコシル化部位を有するCC49/218 SCAおよびグリコCC49/218 SCAのウエスタ ンブロット分析。条件は上記した。レーン１、コントロールP．pastoris宿主GS1 15；レーン２、CC49/218 SCA；レーン３および４、グリコCC49/218 SCA EN236（ １つのグリコシル化部位）；レーン５および６、グリコCC49/218 SCA EN279（２ つのグリコシル化部位）；レーン７および８、グリコCC49/218 SCA EN280 （３つのグリコシル化部位）。レーン４、６、および８、エンドグリコシダーゼ Hで処置した。 図10．修飾していないCC49 SCA（E．coli CC49およびP．pastoris EN225）、 ならびに１つ（EN 236）、２つ（EN279）、または３つ（EN280）のグリコシル化 部位を有するCC49によるムチン結合活性のELISA定量化。２つのコントロール、B SAおよびGS115（P．pastoris宿主）は、非常に少ないムチン結合活性を示した。 （切貼）＝BSA；（切貼）＝E．coli CC49；（切貼）＝GS115；（切貼）＝EN225 ；（切貼）＝EN236；（切貼）＝EN279；および（切貼）＝EN280。 図11．A.グリコシル化CC49および２つのタンデムグリコシル化部位を有するPE G修飾CC49のSECクロマトグラフィー。グリコCC49/2(EN279)を、陽イオン交換ク ロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィーの組み合わせによって 精製した。グリコシル化CC49/2のPEG化（PEG修飾）のための条件は、実施例４に 記載したとおりであった。反応混合物のSECクロマトグラフィーは、PEG化前の唯 一のピークであった低分子量非グリコシル化ピークに加えて、高分子量ピークの 出現を示した。B．反応混合物のSDS-PAGE分析は、グリコシル化CC49/2およびPEG 化CC49/2が、すべて高分子量種に変換されたことを示した（レーン２）。レーン ２および３は、グリコシル化、およびPEGヒドラジド修飾されていない非グリコ シル化CC49の50/50混合物を含んでいた。非グリコシル化CC49/2（レーン３）は 、非修飾種に対応する位置に残った。これは、反応が、炭水化物部分に特異的で あり、そして炭水化物を含まないSCAに影響を与えなかったことを示した。レー ン１および４は、分子量標準を含んでいた。 図12．グリコCC49/2(EN279)のPEG化の後のサイズ排除クロマトグラフィーから の画分のSDS-PAGE分析。レーン１、分子量マーカー；レーン２、天然の非PEG化g CC49/2（非グリコシル化およびグリコシル化画分）；レーン３、低分子量画分（ 非グリコシル化SCA）；レーン４、高分子量画分（PEG化およびグリコシル化され た単鎖gCC49/2）。 図13．gCC49/3（グリコ-CC49/３重部位)(EN280)およびPEG化gCC49/3のSDS-PAG E分析。グリコシル化されたCC49/3のPEG化のための条件を、実施例５に記載した とおりであった。レーン１、天然の非PEG化グリコシル化CC49/3；レーン２、gCC 49/3-HZ5,000-PEG（高度にPEG化された画分）；レーン３、gCC49/3-HZ5,000-PEG （低度にPEG化された画分）；レーン４、分子量マーカー（116.3、97.4、66.3、 55.4、36.5、31、26.5（CC29/218天然）、21.5、14.4、６kDa）。PEG化およびグ リコシル化されたCC49/3の高度にPEG化された画分およびより低度にPEG化された 画分の両方が、非PEG化グリコシル化CC49/3の分子量よりもかなり高い分子量を 有していた。 図14．グリコ-SCAおよびPEG-グリコ-SCAの循環寿命。（切貼）＝gCC49/3(EN28 0)；（切貼）＝PEG5-gCC49/3。詳細を、実施例６に記載する。 図15．SCAおよびPEG-SCAの血漿保持の薬物動力学。（切貼）＝CC49；および（ 切貼）＝PEG20-CC49。詳細を実施例７に記載する。 図16．SCAのウエスタンブロット：レーン１および10、分子量マーカー；レー ン２、EN293；レーン３、EN280；レーン４、EN294；レーン５、EN279；レーン６ 、EN292；レーン７、EN236；レーン８、E．coli CC49；レーン９、GS115。 図17．EN290（リンカー領域の３つのグリコシル化配列）およびEN225(CC49親) のウエスタンブロット。分子量マーカー（27kDa、30kDa、および43kDa）を示し た。 好ましい実施態様の詳細な説明 本発明は、グリコシル化抗原結合単鎖分子（「SCA」)または抗体の単鎖可変フ ラグメント（「sFv」）が、非グリコシル化抗原結合単鎖タンパク質の有用性を 超える有意な有用性を有するという発見に関する。抗原結合部位を維持すること に加えて、グリコシル化SCAタンパク質は、第二の生物学的エフェクターとして 作用する炭水化物部分を有する。オリゴ糖機能には、細胞および組織標的化、血 清タンパク質との特異的結合および相互作用、細胞レセプター、細胞マトリック スおよび細胞内タンパク質との特異的結合および相互作用が含まれ得る。従って 、本発明は、グリコシル化が可能な１価および多価SCAタンパク質、１価および 多価のグリコシル化SCAタンパク質の組成物、１価および多価のグリコシル化SCA タンパク質を作製および精製する方法、ならびにグリコシル化SCAタンパク質の ための使用に関する。本発明はまた、Asn結合型炭水化物部分に共有結合した 診断的または治療的薬剤を有するグリコシル化SCAタンパク質に関する。 用語「抗原結合単鎖分子」（SCA）または「単鎖Fv」（sFv）は、本明細書中で 互換的に使用される。これらは、抗体の可変領域VH（または、VL）由来の第二の ポリペプチド結合部分に結合された、抗体の可変領域VL（または、VH）由来の第 一のポリペプチド結合部分（その２つのポリペプチドは、第一のポリペプチドお よび第二のポリペプチドを１本のポリペプチド鎖に連結させるペプチドリンカー により結合されている）を含むものとして構造的に定義され、その結果、第一の ポリペプチドはリンカーに対してＮ末端側であり、そして第二のポリペプチドは 、第一のポリペプチドおよびリンカーに対してＣ末端側である。従って、１本の ポリペプチド鎖は、ポリペプチドリンカーにより結合された可変領域の対を含む 。領域が、適切に対になった相補性決定領域(CDR)を有する軽鎖可変領域と重鎖 可変領域との対を含む場合と同様に、その領域は、機能的な抗原結合部位を形成 するために結合され得る。この場合、単鎖タンパク質は、「抗原結合単鎖タンパ ク質」または「抗原結合単鎖分子」と呼ばれる。 単鎖Fvは、いくつかの方法において構築され得、そして構築されている。VLが 、リンカーおよびVHの続くＮ末端ドメイン（VL-リンカー-VH構築物）であるか、 またはVHが、リンカーおよびVLの続くＮ末端ドメイン（VH-リンカー-VL構築物） であるかのいずれかである。好ましい実施態様は、Ｎ末端ドメインにVLを含む（ Anand，N.N.ら、J．Biol．Chem．266:21874-21879(1991)を参照のこと）。ある いは、多価リンカーもまた使用されている。いくつかのタイプのsFv（SCA）タン パク質は、首尾良く構築され、精製されており、そして結合親和性およびそれら が由来した抗体と同様の特異性が示されている。 抗原結合単鎖タンパク質の理論および生成の記載は、Ladnerら、米国特許第4, 946,778号、同第5,260,203号、同第5,455,030号、および同第5,518,889号に、な らびにHustonら、米国特許第5,091,513号（「生合成抗体結合部位」（BABS）） において見出され、全てが本明細書に参考として援用されている。上記の特許に 記載されたプロセス下で生成された抗原結合単鎖タンパク質は、結合特異性およ び対応するFabフラグメントの親和性と実質的に同様の親和性を有する。 代表的に、Fvドメインは、以下の文献において、その略名（26-10、MOPC 315 、 741F8、520C9、McPC 603、D1.3、マウスphOx、ヒトphOx、RFL3.8sTCR、1A6、Se1 55-4、18-2-3、4-4-20、7A4-1、B6.2、CC49、3C2、2c、MA-15C5/K12G0、Oxなど ）により公知のモノクローナル抗体の群から選択されている。Huston J.S.ら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA 85:5879-5883(1988);Huston J.S.ら、SIM News 38 （4）(補遺):11(1988);McCartney,J.ら、ICSU Short Reports 10:114(1990);McC artney，J.E.ら、未公開結果(1990);Nedelman，M.A.ら、J．Nuclear Med．32(補 遺):1005(1991);Huston J.S.ら、「Molecular Design and Modeling Concepts a nd Applications」,B部,J.J．Langone編，Methods in Enzymology 203:46-88(19 91);Huston，J.S.ら、Advances in the Applications of Monoclonal Antibodie s in Clinical Oncology，Epenetos,A.A.（編），London，Chapman & Hall(1993 );Bird，R.E.ら、Science 242:423-426(1988);Bedzyk，W.D.ら、J．Biol．Chem ．265:18615-18620(1990);Colcher D.ら、J．Nat．Cancer Inst．82:1191-1197( 1990);Gibbs R.A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:4001-4004(1991);Mileni c，D.E.ら、Cancer Research 51:6363-6371(1991);Pantoliano，M.W．ら、Bioch emistry 30:10117-10125(1991);Chaudhary，V.K.ら、Nature 339:394-397(1989) ;Chaudhary,V.K.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1066-1070(1990);Batra， J.K.ら、Biochem．Biophys．Res．Comm．171:1-6(1990);Batra,J.K.ら、J．Biol ．Chem．265:15198-15202(1990);Chaudhary,V.K.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 87:9491-9494(1990);Batra,J.K.ら、Mol．Cell．Biol．11:2200-2205(1991); Brinkmann，U.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8616-8620(1991);Seetharam ，S.ら、J．Biol．Chem．266:17376-17381(1991);Brinkmann，U.ら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 89:3075-3079(1992);Glockshuber，R.ら、Biochemistry 29:1 362-1367(1990);Skerra，Aら、Bio/Technol．9:273-278(1991);Pack，P.ら、Bio chemistry 31:1579-1534(1992);Clackson，T.ら、Nature 352:624-628(1991);Ma rks，J.D.ら、J．Mol．Biol．222:581-597(1991);Iverson，B.L.ら、Science 24 9:659-662(1990);Roberts，V.A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:6654-6658 (1990);Condra，J.H.ら、J．Biol．Chem．265:2292-2295(1990);Laroche，Y.ら 、J．Biol．Chem．266:16343-16349(1991);Holvoet，P.ら、J．Biol．Chem．266 :19717-19724(1991);Anand,N.N.ら、J．Biol． Chem．266:21874-21879(1991);Fuchs，P.ら、Bio/Technol．9:1369-1372(1991); Breitling，F.ら、Gene 104:104-153(1991);Seehaus，T.ら、Gene 114:235-237( 1992);Takkinen，K.ら、Protein Engng 4:837-841(1991);Dreher，M.L.ら、J．I mmunol．Methods 139:197-205(1991);Mottez，E.ら、Eur．J．Immunol．21:467- 471(1991);Traunecker,A.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8646-8650(1991) ;Traunecker,A.ら、EMBO J．10:3655-3659(1991);Hoo，W.F.S.ら、Proc．Natl． Acad．Sci．USA 89:4759-4763(1993)を参照のこと。 SCAポリペプチドを構築するために使用される本発明のリンカーは、VLのＣ末 端（または、その近傍部位）とVHのＮ末端（または、その近傍部位）とにわたる ように、すなわちVHのＣ末端とVLのＮ末端との間を架橋するために設計される。 ペプチドリンカーの好ましい長さは、２〜約50アミノ酸であるべきである。それ ぞれの特定の場合において、好ましい長さは、連結されるポリペプチドの性質、 および連結により生じる連結された融合ポリペプチドの所望の活性に依存する。 一般的に、リンカーは、得られる連結された融合ポリペプチドを、所望の生物学 的活性を提供する立体配座に適切に折りたたむことを可能にするのに十分長いべ きである。立体配座の情報が利用可能な場合、以下に議論されるSCAポリペプチ ドの場合のように、適切なリンカーの長さは、置換ポリペプチドの３次元立体配 座および得られる連結された融合ポリペプチドの所望の立体配座を考慮すること により推定され得る。このような情報が利用可能でない場合、適切なリンカーの 長さは、種々の長さのリンカーを有する一連の連結された融合ポリペプチドを所 望の生物学的活性について試験することにより、経験的に決定され得る。このよ うなリンカーは、WO 94/12520において詳細に記載され、これは本明細書に参考 として援用される。 SCAポリペプチドを構築するために使用される好ましいリンカーは、10と30の 間のアミノ酸残基を有する。このリンカーは、フレキシブルとなるよう設計され ており、そしてGlyとSer残基が交互の基礎配列が使用されることが推奨されてい る。リンカーおよびその結合単鎖Fvタンパク質の溶解性を増強するために、３つ の荷電した残基（２つの正に荷電したリジン残基（K）および１つの負に荷電し たグルタミン酸残基（E））が含まれ得る。好ましくは、リンカーとVHとのペプ チド結合を形成する場合に失われた正荷電を置換するために、リジン残基の１つ が、VHのＮ末端に近接して配置される。 さらに、18残基に等しいかまたはより長いリンカーの長さは、凝集を減少させ ることが見出されている。これは、高濃度において、凝集が明らかになる傾向に ある場合、重要になる。従って、18〜30残基を有するリンカーは、１価のコンホ メーションにおけるSCAポリペプチドのために最も好ましい。10残基より短いリ ンカーの長さは、多価コンホメーションにおけるSCAにとって有利である。 SCAポリペプチドまたは任意の他の連結した融合ポリペプチドを操作するのに 重要な別の特性は、タンパク質分解に対する安定性である。212リンカー(Pantol ianoら、Biochemistry 30:10117(1991))は、ズブチリシンBPN'によるタンパク質 溶解性に対して感受性である。212リンカーにおけるタンパク質溶解性クリップ は、リンカーのLys8とSer9との間で生じる（表１を参照のこと）。プロリンをタ ンパク質分解性クリップ部位に配置することによって、リンカーを保護し得る。 表１は、例示のために種々のリンカーを示す。Whitlow,M.ら、Protein Engng. 7:1017-1026(1994)もまた参照のこと。それぞれ、217リンカーは、リジン-プロ リン対を６位および７位に含み；218リンカーは、リジン-プロリン対を８位およ び９位に含み、従って、リンカーはタンパク質分解をより受けにくくされる。21 8リンカーは、より少ない凝集、より大きなタンパク質分解安定性、および必要 な可撓性および可溶性を実証してSCAタンパク質についての機能的リンカーをも たらす。 (1)Science 242:423(1988) (2)J.Biol.Chem．265:18615-18620(1990) (3)配列番号６ (4)配列番号７ (5)配列番号８ (6)配列番号９ (7)配列番号10 リンカー設計における第二のガイド考慮は、リンカーが減少した凝集を有する ことが好ましいことである。上記の通り、18残基の216リンカーは、14残基の212 リンカーと比較して減少した凝集を示す。216リンカーの最初の11個の残基は、2 12リンカーと同一であり、タンパク質分解に感受性のペプチド結合をLys8とSer9 との間に含む。従って、過剰の４つの残基が、減少した凝集に寄与すると考えら れる。従って、18個以上の残基を有するリンカーが最も好ましい。 上記を考慮に入れて、18残基の216リンカーにおけるLys8の後でプロリンで９ 位のセリンを置換したリンカーを設計した。このリンカーを218と称する（表１ を参照のこと）。WO 94/12520（その開示は本明細書中で参考として援用される ）を参照のこと。 タンパク質分解を阻害するためにプロリンをリンカー配列中の適切な位置に配 置することは、感受性配列におけるタンパク質分解性攻撃の点を決定することに より達成される。当業者は、この点を決定する方法が分かる。１つの方法におい て、ズブチリシンBPN'のようなプロテアーゼを候補リンカーと接触させる。次い で、得られるペプチドを配列決定することにより切断が決定され得、これは存在 するならば、切断点をもまた明らかにする。任意のプロテアーゼを用い得、そし て選択はリンカーが実際の使用に遭遇する環境を考慮することにより導かれる。 SCAについての必要要件は、リンカーが12アミノ酸よりも長いことである。SCA におけるリンカーの好ましい長さは、上記のように凝集を減少させるためには18 残基よりも長い。 多価SCAについては、２つ以上のSCAの結合がその形成に必要である。多価SCA は、25残基と同じくらいの長さのリンカーを用いてSCAから生成され得るが、そ れらは不安定である傾向がある。Holliger,P.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:6444-6448(1993)は、最近、０から15残基長のリンカーが２価のFvsの形成を 容易にすることを示した。Whitlow，M.ら、Protein Engng．7:1017-1026(1994) ；Hoogenboom，H.R.,Nature Biotech．15:125-126(1997);およびWO 93/11161を 参照のこと。 本発明の目的は、Asn結合型グリコシル化部位（グリコシル化配列内のアスパ ラギン残基）が炭水化物部分に付着し得る、そしてグリコシル化ポリペプチドが 抗原を結合し得る（すなわち、グリコシル化されたポリペプチドが抗原に結合す る能力は破壊されない）ように、１以上（または少なくとも１）のAsn結合型グ リコシル化配列を有するSCAを生成することである。例えば、SCAは、１、２、３ 、５、７、または10個のＮ結合型グリコシル化配列を有し得るが、記載された数 には制限されない。Asn結合型グリコシル化（Ｎ結合型グリコシル化とも呼ばれ る）は、糖残基がアスパラギン残基のアミド窒素を介して結合する場合に生じる 。Asn結合型オリゴ糖の細胞内生合成は、小胞体の内腔およびゴルジ装置へのタ ンパク質の輸送に続いての両方で生じる。Asn結合型グリコシル化は、以下のト リペプチドグリコシル化コンセンサス配列で生じる：Asn-Xaa-Yaa（Asn-Xaa-Thr /Ser;NXT/S）、ここで、Xaaはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得、そしてY aaはセリンまたはトレオニンである。 全てのAsn結合型オリゴ糖は、共通の生合成中間体に由来する共通の五糖コア （Man3GlcNAc2）を有する。これらは、分枝の数および末端糖（例えば、フコー スおよびシアル酸）の存在が異なる。これらは、それらの分枝構成成分に従って 分類され得る。分枝構成成分は、マンノースのみ（高マンノース型Ｎグリカン） ；種々の糖配列で終結し、そして分枝するFucおよびコアGlcNAcの鎖内置換の可 能性を有する交互のGlcNAc残基およびGal残基（複合型Ｎグリカン）；または高 マンノースおよび複合鎖の両方の寄与（ハイブリッド型Ｎグリカン）から構成さ れ得る。Hounsell，E.F.編、「Glycoprotein Analysis in Biomedicine」，Meth ods in Molecular Biology 14:298(1993)を参照のこと。 本発明のさらなる目的は、１つ以上のAsn結合型グリコシル化配列を有する一 価および多価のSCAを生成することである。多価のSCAについては、２つ以上のSC Aの会合が、その形成のために必要である。例えば、多価SCAは、２つのSCAをＣ 末端システイン残基と化学的に架橋することにより（Cumberら、J．Immunol．14 9:120-126(1992)）、および２つのSCAを第３のポリペプチドリンカーと連結して 二量体Fvを形成することにより（Georgeら、J．Cell．Biochem．15E:127(1991) ）、生成され得る。凝集により多価のSCAを生成することについての詳細は、Whi tlow，M.ら、Protein Engng．7:1017-1026(1994)において記載されている。本発 明の多価の抗原結合融合タンパク質は、任意のプロセスにより作製され得るが、 好ましくは、その開示が本明細書に参考として援用されるWO 93/11161に示され ている多価の抗原結合タンパク質の作製プロセスに従って作製され得る。 本発明のなおさらなる目的は、Asn残基が２つのアミノ酸残基で隔てられるよ うに、少なくとも２つのトリペプチドグリコシル化配列をタンデムで有する、上 記の通りの一価または多価のSCAを生成することである。本発明の別の目的は、A sn残基が隣接するように、少なくとも１セットの２つの重複するトリペプチドグ リコシル化配列を有する、上記の通りの一価または多価のSCAを生成することで ある。本発明の別の目的は、ポリアルキレンオキシドに結合体化した、上記の通 りの一価または多価のグリコシル化SCAを生成することである。 Ｎ結合型グリコシル化配列の同定および合成 本発明では、トリペプチドグリコシル化コンセンサス配列内のＮ結合型グリコ シル化部位は、VLおよびVH領域、第二のポリペプチドのＣ末端（VL、VH、または その隣接部位）、第一のポリペプチドのＮ末端（VL、VH、またはその隣接部位） 、第一のポリペプチド領域と第二のポリペプチド領域との間のリンカー領域で生 じ得るか、またはこれらの領域の組み合わせにおいて生じ得る。タンパク質にお ける炭水化物部位の設計は、タンパク質および抗原結合に関与するそのタンパク 質における残基について公知の構造情報を調べることを含む。炭水化物部位は、 その抗原結合部位の破壊を防止するために可能な限りこれらの残基から遠くにな るように選択される。Asn結合型グリコシル化の合成およびプロセシングの総説 についてはHubbard，S.C.およびIvatt，R.J.,Ann.Rev.Biochem．50:555-583(198 1)を参照のこと。 グリコシル化配列は、以下に隣接して生じ得る：（１）ＶL（またはＶH）のネ イティブなＣ末端残基、（２）ＶL（またはＶH）のＣ末端（ここでこのＣ末端は １または複数のアミノ酸残基の欠失を有し、その結果、そのペプチドの残りのＮ 末端アミノ酸残基は、グリコシル化されたポリペプチドが抗原に結合し得るのに 十分である）、または（３）ＶL（またはＶH）のＣ末端（ここでこのＣ末端残基 は１または複数のアミノ酸残基の付加を有し、その結果、グリコシル化ポリペプ チドは抗原に結合し得る）。「ネイティブ」によって、天然に存在する免疫グロ ブリン（第二のポリペプチド）のＣ末端が意図される。「Ｃ末端」によって、ポ リペプチドの最初のＮ末端アミノ酸残基を除く、ポリペプチドのアミノ酸残基の 全てに至るまで含み得る、ポリペプチドのＣ末端アミノ酸残基またはＣ末端領域 が意図されるものとして、当該分野において十分に理解される。しかし、本発明 において、「Ｃ末端」は、他に示されるか、または意図されない限り、上記の３ つのタイプのＣ末端（１、２、または３）のＣ末端アミノ酸残基として意図され る。 グリコシル化配列は、抗原結合部位に対して正反対であるSCA領域におけるル ープ部位内の残基で同定され、そして操作された。グリコシル化の好ましい部位 として選択された５つのループ領域およびＣ末端伸長は、結合部位から空間的に 離れた最も遠い領域にある。 抗原結合部位から最も遠い６つのSCA部分は、以下の通りである： １）軽鎖における残基11〜15で構成されるループ； ２）軽鎖における残基77〜79で構成されるループ； ３）リンカーのＮ末端； ４）重鎖における残基11〜15で構成されるループ； ５）重鎖における残基82B、82C、および83で構成されるループ；および ６）SCAのＣ末端。 残基は、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interst，第５版 ，US．Dept．Health and Human Services，Bethesda，MD(1991)によるように同 定される。これらの可能なグリコシル化部位は、4-4-20マウスFab構造を調べる ことにより決定された（その開示が参考として本明細書に援用される、Whitlow ，M．ら、Protein Engng．8:749-761(1995)を参照のこと）。 抗原結合部位から最も遠いループを同定した後、それぞれのループの核酸配列 およびアミノ酸配列が、ループ領域へと操作され得る可能なＮ結合型グリコシル 化配列について調べられる。最良の部位は、Asn-Xaa-Thr/Serグリコシル化配列 を生成するために最少数のアミノ酸変化を要する部位である（その開示が本明細 書中で参考として援用されるGavel，Y.およびvon Heijne,G.,Protein Engng．3: 433-442(1990)によれば、Thrは、Serの約２倍の頻度で好結果のグリコシル化ト リペプチド配列中に生じる）。これは、手動で、またはIntelligenetics，Inc． (Mountain View，CA)からの「GeneWorks」プログラムのような配列相同性規則を 用いるコンピュータープログラムを用いて実施され得る。しかし、これらの６個 の同定された領域のいずこかにおけるＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列のＮの操作された配置 は、SCAグリコシル化に好ましい部位を生成し得る。 上記の設計アプローチは、CC49/218 SCAに使用されている。図１は、以下の生 成設計物を示す：CC49/218 SCAの軽鎖において設計されたグリコシル化部位番号 Ｉおよび２；CC49/218 SCAのリンカーのＮ末端において設計されたグリコシル化 部位番号３；CC49/218 SCAの重鎖において設計されたグリコシル化部位番号４お よび５；CC49/218 SCAのＣ末端に隣接して設計されたグリコシル化部位番号６。 これらの６個の部位の任意の組合せが用いられ得る。設計アプローチは、他のSC CA（例えば、それぞれ図６〜８に示されるような、KabatコンセンサスVκI/218/ VHIII、C6.5/218、およびA33/218）に用いられ得る。 Asn結合型グリコシル化配列を、種々の位置に導入するために使用される特定 のヌクレオチド配列は、天然に存在するヌクレオチド配列に依存する。最も好ま しい部位は、Asn結合型グリコシル化配列の生成のために最小数のアミノ酸変化 を要する部位である。例えば、図１におけるグリコシル化配列番号１は、アミノ 酸12であるPro(CCT)をAsn(ACC)に変異させて、Asn-Val-SerというAsn結合型グリ コシル化配列を生じることにより生成された。同様に、他のAsn結合型配列が生 成され得る。もちろん、遺伝コードの重複性に基づいて、特定のアミノ酸は複数 のヌクレオチド配列によりコードされ得る。 部位特異的変異誘発が、ネイティブのタンパク質配列を、Ｎ結合型グリコシル 化のために設計された部位を組み込む配列に変化させるために使用される。変異 タンパク質の遺伝子は、タンパク質をグリコシル化し得る発現系（例えば、細菌 細胞、酵母細胞、もしくは他の真菌細胞、昆虫細胞または哺乳動物細胞）に配置 される。変異体糖タンパク質を均質にグリコシル化する系を見出すことが重要で あり得る。変異体糖タンパク質は、標準的な精製方法により精製され得る。 Asn結合型グリコシル化配列を生成するためのオリゴヌクレオチド特異的変異 誘発法、およびクローン化されたDNAの変異誘発のための関連技術は、当該分野 で周知である。Sambrookら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第２版 ，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989);Ausubel ら（編）、CURREN TPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley and Sons(19 87)（各々の開示は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。本発明 のための好ましいオリゴヌクレオチド特異的変異誘発法は、Hoら、Gene 77:51-5 9(1989)に従っており、この開示は本明細書に参考として援用される。タンデム なおよび／または重複するグリコシル化配列を生成するために用いられるプライ マー配列は、下記の実施例１、材料および方法の節に開示される。 タンデムおよび重複するグリコシル化配列の合成 グリコシル化のために利用可能な遺伝的配列（ポリヌクレオチド）を有する抗 原結合単鎖分子（例えば、CC49）は、真核生物細胞（例えば、酵母Pichia）にお いて利用可能な翻訳後プロセスにより炭水化物部分を含むようにされ得る。 gCC49は、グリコシル化遺伝配列を取り込むことにより、最初のクローンCC49/ 218から誘導された。いくつかのクローンを作製した。 プラスミドpEN270を、Pichia中に形質転換して、gCC49/2と称されるグリコシ ル化されたCC49タンパク質を分泌するクローンEN279を得た。このクローンは、 ２つのグリコシル化配列を含んでいた。酵母により生成される遺伝子産物は、50 ％を超える、発現された全ての抗原結合単鎖分子をグリコシル化形態で有した。 プラスミドpEN271を、Pichia中に形質転換して、gCC49/3と称されるグリコシ ル化されたCC49タンパク質を分泌するクローンEN280を得た。このクローンは、 ３つのグリコシル化配列を含んでいた。酵母により生成される遺伝子産物は、90 ％を超える抗原結合単鎖タンパク質をグリコシル化形態で有した。 Ｃ末端に隣接する例示的な１、２、または３個のグリコシル化配列（太字）を 有するCC49を以下に提供する。 １個のグリコシル化配列を有するCC49のＣ末端： ２個のグリコシル化配列を有するCC49のＣ末端： 3個のグリコシル化配列を有するCC49のＣ末端： Ｃ末端に隣接する１個のグリコシル化配列を有するCC49は、グリコシル化配列 Ｎ−Ｋ−Ｔ（太字で示したアミノ酸は、グリコシル化部位に必要なアミノ酸であ る）を含む。Ｃ末端に隣接する２個のタンデムなグリコシル化配列を有するCC49 もまた示す：Ｎ−Ｋ−Ｔ−Ｎ−Ａ−Ｔ（配列番号17）。さらに、Ｃ末端に隣接す る３個の重複しかつタンデムなグリコシル化配列を有するCC49を示す：Ｎ−Ｋ− Ｔ−Ｎ−Ｎ−Ｔ−Ｔ（配列番号18）。もちろん、SCAは、３、５、７、もしくは1 0個のような２個以上（もしくは少なくとも２個）の例えばＮ結合型グリコシル 化配列をタンデムで、または３、５、７、もしくは10個のセットのような１個以 上（もしくは少なくとも１個）のセットの、例えば、２つのタンデムな配列を有 し得る。SCAは、２、３、５、７、もしくは10個のセットのような１個以上（少 なくとも１個）のセットの２つの重複配列を有し得る。 グリコシル化CC49を、陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換ク ロマトグラフィーの組合せにより精製した。炭水化物を含まないタンパク質画分 を、サイズ排除クロマトグラフィーにより除去した。 他のタンパク質はまた、タンデムまたは重複するグリコシル化配列の付加によ り修飾され得る。このようなタンパク質は、ジスルフィドにより安定化されたFv フラグメント（Reiter，Y.ら，Nature Biotech．14:1239-1245(1996)、ラクダ免 疫グロブリン（Muyldermans，S.ら，Protein Engng．7:1129-1135(1994)）、ガ ンウイルス、セレクチンのような細胞接着タンパク質、免疫グロブリンスーパー ファミリーのメンバー（IgG、IgM、IgE、IgD、およびIgAを含む）、ならびに他 の免疫グロブリンファミリータンパク質）を含むがこれらに限定されない。治療 用酵素（例えば、DNase、RNase、および代謝酵素）、サイトカイン、ホルモン、 ならびに増殖因子（例えば、エリトロポイエチン、GCSF（顆粒細胞コロニー刺激 因子）、GMCSF（顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子））もまた含まれる 。インターロイキン-2、α-インターフェロン、インスリン、ヒト成長ホルモン 、および他の血液タンパク質（例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーターな らびに第VIII因子および第XI因子）もまた含まれる。さらに、これらの方法は、 ワクチン（例えば、Ｂ型肝炎ワクチン、AIDSワクチン、ライム病ワクチン、およ び他の感染性疾患のワクチン）に適用され得る。この技術の使用はまた、このよ うな操作されたＮ結合型糖タンパク質を含む遺伝子治療ベクター（ウイルス性ベ クター、非ウイルス性ベクター、および細胞性ベクターを含む）の選択的Ｎ結合 型修飾を含む。 複数のタンデムなおよび/または重複するグリコシル化配列を含有するSCAが、 立体障害に遭遇すると予測される互いに近接するかまたは隣接するAsn残基にお いて単一のグリコシル化配列を炭水化物接着物として含有するSCAよりも完全に グリコシル化されることは驚くべきことである。特に、約35〜50％が修飾された 単一部位バージョンと比較して、２個の配列バージョンは、50％を超えて修飾さ れ、そして３個の配列バージョンは95％を超えて修飾された。さらに、三重配列 バージョンでは、より長いオリゴ糖鎖が存在することが明らかである。従って、 本発明は、以下に関する：(1)増加したグリコシル化を有するポリペプチドを生 成する方法であって、(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少な くとも２個のトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程であって 、ここで各トリペプチドグリコシル化配列はAsn-Xaa-Yaaを含み、ここでxaaはプ ロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり、そ してここでトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が２つのアミノ酸残基に より隔てられるようにタンデムである、工程；および(b)ポリヌクレオチドを、A sn残基において炭水化物部分を付着させ得る宿主細胞において発現する工程、を 含む方法、ならびに(2)記載されるプロセスにより生成される、増加したグリコ シル化部位を有するポリペプチド。 本発明はさらに、以下に関する：(1)増加したグリコシル化を有するポリペプ チドを生成する方法であって、(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド に、少なくとも１セットの２個のトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提 供する工程であって、ここで各トリペプチドグリコシル化配列はAsn-Xaa-Yaaを 含み、ここでXaaはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまた はセリンであり、そしてここで２個のトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残 基が隣接するように重複している、工程；および(b)ポリヌクレオチドを、Asn残 基において炭水化物部分を付着させ得る宿主細胞において発現する工程、を含む 方法、ならびに(2)記載されるプロセスにより生成される、増加したグリコシル 化部位を有するポリペプチド。 本発明はまた、以下に関する：(1)増加したグリコシル化を有するポリペプチ ドを生成する方法であって、(a)ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに 、少なくとも２個のトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列を提供する工程で あって、ここで各トリペプチドグリコシル化配列はAsn-Xaa-Yaaを含み、ここでX aa はプロリン以外のアミノ酸であり、そしてYaaはトレオニンまたはセリンであり 、そしてここで２個のトリペプチドグリコシル化配列は、Asn残基が２個のアミ ノ酸残基により隔てられるようにタンデムである、工程；(b)このポリヌクレオ チドに、少なくとも１セットの２個のトリペプチドAsn結合型グリコシル化配列 を提供する工程であって、ここで２個のトリペプチドグリコシル化配列は、Asn 残基が隣接するように重複している、工程；および(c)このポリヌクレオチドを 、Asn残基において炭水化物部分を付着させ得る宿主細胞において発現する工程 、を含む方法、ならびに(2)記載されるプロセスにより生成される、増加したグ リコシル化部位を有するポリペプチド。 宿主およびベクター 「ポリヌクレオチド」により、DNA、RNA、または遺伝的配列が意図される。SC Aのヌクレオチド配列を変異させた後、変異型DNAは、さらなる分析のため（例え ば、DNA配列の確認のため）にクローニングベクターに挿入され得る。変異型DNA 配列によってコードされるポリペプチドを発現させるため、DNA配列は、転写発 現を制御する調節配列に作動可能に連結され、そして原核生物宿主細胞または真 核生物宿主細胞のいずれかに導入される。 SCAは、代表的には原核生物宿主細胞によって産生されるが、真核生物宿主細 胞は好ましい宿主細胞である。好ましい宿主細胞は、植物細胞、酵母もしくは他 の真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞を含む。標準的なタンパク質精製法 は、これらの変異タンパク質を精製するために使用され得る。ネイティブのタン パク質精製スキームにほんのわずかの改変が必要とされ得る。 また、本発明によって、Ｎ結合型グリコシル化をし得る操作された配列を有す る本発明のSCAをコードするDNA分子（例えば、精製された遺伝的配列またはプラ スミドもしくはベクター）が提供される。グリコシル化SCAポリペプチドについ てのDNA配列は、植物細胞、原核生物、酵母もしくは他の真菌細胞、昆虫細胞、 または哺乳動物細胞のような生物体における産生を最適化するために選択され得 る。 Asn結合型グリコシル化配列を有するSCAをコードするDNA分子は、その細胞に よるグリコシル化SCAタンパク質の発現を可能にするために、発現ベクターに作 動可能に連結され、そして宿主細胞に導入され得る。Asn結合型グリコシル化配 列を有するSCAをコードするDNA配列は、従来技術に従ってベクターDNAと組換え られ得る。 本発明の単鎖タンパク質を産生するための、組換え宿主およびそれを使用する 方法もまた、本明細書中に提供される。 本発明のそのようなSCAタンパク質の発現は、原核生物細胞において達成され 得る。好ましい原核生物宿主は、グリコシル化し得る組換え異種酵素を発現する 、Neisseria、Mycobacteria、Streptococci、Chlamydia、およびE．coliのよう な細菌を含むが、これらに限定されない。 本発明のそのようなSCAタンパク質のクローニングおよび発現のための真核生 物宿主は、インビボまたは組織培養のいずれかにおいて、昆虫細胞、酵母、真菌 、および哺乳動物細胞（例えば、ヒトまたは霊長類細胞）を含む。本発明に好ま しい宿主は、Pichia pastorisである。 一価、多価、および融合形態タンパク質（特に、SCAポリペプチド）の、産生 、単離、および精製の、適切なDNA分子、宿主、方法は、先行技術に十分に記載 されている(例えば、米国特許第4,946,778号、これは、本明細書中において参考 として援用される)。 Asn結合型グリコシル化配列および作動可能に連結されたプロモーターを有す るSCAコード配列は、非複製DNA（またはRNA）分子（線状分子、またはより好ま しくは共有結合閉環分子のいずれかであり得る）のいずれかとしてレシピエント 原核生物細胞または真核生物細胞に導入され得る。そのような分子は、自律的複 製をし得ないので、所望のSCAタンパク質の発現は、導入された配列の一過性発 現を介して生じ得る。あるいは、恒久的な発現は、導入されたSCA配列の、宿主 染色体への組込みを介して生じ得る。 １つの実施態様において、SCA配列は、宿主細胞染色体へ組み込まれ得る。導 入DNAをそれらの染色体に安定に組み込んだ細胞は、SCA配列およびマーカーを含 む宿主細胞の選択を可能にする、１つ以上のマーカーを導入することによっても また選択され得る。マーカーは、宿主における栄養要求性（例えば、his4、leu2 、 またはura3、これらは、共通の酵母栄養要求性マーカーである）、生物致死耐性 （例えば、抗生物質）、または重金属（例えば、銅）に対する耐性などを補充し 得る。選択マーカー遺伝子は、発現されるべきSCADNA配列に直接連結されるか、 または同時トランスフェクションによって同じ細胞に導入されるかのいずれかで あり得る。 別の実施態様において、導入された配列は、レシピエント宿主細胞において自 律的複製をし得るプラスミドベクターに取り込まれる。広範な種々の任意のベク ターは、この目的のために使用され得る。特定のプラスミドまたはウイルスベク ターを選択する際に重要な因子は、以下を含む：ベクターを含むレシピエント細 胞が認識され得、そしてベクターを含まないそれらのレシピエント細胞から選択 され得る容易さ：特定の宿主において所望されるベクターのコピー数；および異 なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」し得ることが望ましいか否か。 任意の一連の酵母ベクター系が利用され得る。そのような発現ベクターの例は 、酵母2μ環、発現プラスミドYEP13、YCP、およびYRPなど、またはそれらの誘導 体を含む。そのようなプラスミドは、当該分野において周知である(Botsteinら 、Miami Wntr．Symp．19:265-274(1982);Broach，J.R.，The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces:Life Cycle and Inheritance，Cold Spring Harb or Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，445-470頁(1981);Broach，J.R.，Cel l 28:203-204(1982))。 哺乳動物宿主について、いくつかの可能なベクター系が発現のために利用可能 である。１つのクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイ ルス、アデノウイルス、またはSV40ウイルスのような動物のウイルス由来の、自 律的複製染色体外プラスミドを提供するDNAエレメントを利用する。第２のクラ スのベクターは、宿主染色体への所望の遺伝子配列の組込みに依存する。導入さ れたDNAをそれらの染色体へ安定に組み込んだ細胞は、発現ベクターを含む宿主 細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することによってもまた選択 され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、生物致死性耐性（例 えば、抗生物質）、または重金属（例えば、銅）に対する耐性などを提供し得る 。選択マーカー遺伝子は、発現されるべきDNA配列に直接的に連結され得るか、 ま たは同時形質転換によって同じ細胞に導入され得る。さらなるエレメントはまた 、mRNAの最適な合成に必要とされ得る。これらのエレメントは、スプライスシグ ナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終結シグナルを含み得 る。そのようなエレメントを取り込むcDNA発現ベクターは、Okayama，H.，Mol． Cell．Biol．3:280(1983)などによって記載されるものを含む。 細菌における使用のために好ましいベクターには、pQE70、pQE60、およびpQE- 9（Qiagenから入手可能）；pBSベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベ クター、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A（Stratageneから入手可能）；およびp trc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5（Pharmaciaから入手可能）が挙げ られる。好ましい真核生物ベクターには、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、およ びpSG（Stratageneから入手可能）；およびpSVK3、pBPV、pMSG、およびpSVL（Ph amaciaから入手可能）がある。Pichiaにおける発現のために好ましいベクターは 、pHIL-SI（Invitrogen Corp.）およびpPIC9(Invitrogen Corp.)である。他の適 切なベクターは、当業者に容易に明らかである。 一旦、構築物を含むベクターまたはDNA配列が発現のために調製されると、DNA 構築物は、適切な宿主に導入または形質転換され得る。種々の技術（例えば、形 質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降法 、エレクトロポレーション、または他の従来技術）が使用され得る。細胞が、組 換えDNA(またはRNA)分子で形質転換された後、細胞は、培地において増殖され、 そして適切な活性についてスクリーニングされる。配列の発現は、本発明のグリ コシル化SCAの産生を生じる。 代替的なアプローチにおいて、Ｎ結合型グリコシル化は、インビトロで、本明 細書に記載される変異SCAポリペプチドを精製されたＮ結合型グリコシル化酵素 と反応させ、そしてさらに、このようなグリコシル化されたSCAを他の炭水化物 修飾酵素と反応させることにより、達成され得る。 ポリ（アルキレン）−グリコール修飾 本発明の実施において使用される直鎖ポリアルキレングリコールは、以下の構 造式のものである： ここで、Ｒは、水素、低級アルキル、およびその混合物からなる群から選択され 、Ｒ1は、水素および低級アルキルからなる群から選択され、そしてｎは、正の 整数である。「低級アルキル」は、１〜４つの炭素原子を有するアルキル基（す なわち、メチル、エチル、プロピル、ブチル）、および前述の異性体を意味する 。Ｒは、好ましくは、水素、メチル、およびそれらの混合物からなる群から選択 され、Ｒ1は、好ましくは水素およびメチルからなる群から選択され、そしてｎ は、好ましくは500以下の正の整数である。Ｒは、最も好ましくは水素であり、 Ｒ1は、最も好ましくはメチルであり、そしてｎは最も好ましくは７〜150の整数 である。本発明の実施において使用される好ましいポリ（アルキレングリコール ）が、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、それらの 混合物、およびポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール ）のコポリマーであり、ここでポリマーの末端のヒドロキシル基の一方が、低級 アルキル基で置換され得ることは、当業者には容易に明らかである。本発明にお ける使用のために好ましいポリアルキレングリコールは、ポリ（エチレングリコ ール）−ヒドラジドである。 簡便のために、本発明の実施において使用されるポリアルキレングリコールは 、PAGと命名され、その用語は、Ｒ1が水素である化合物、およびＲ1がアルキル である化合物の両方を含むことが意図される。PEGとは、ポリ（エチレングリコ ール）をいい、そしてmPEGとはメトキシポリ（エチレングリコール）をいう。 PAGは、特定の分子量である必要はないが、好ましくは分子量は約500〜約40,0 00の間であり；より好ましくは約2,000〜約20,000の間である。PAGの分子量の選 択は、使用される特定のポリペプチドの性質（例えば、修飾のためにポリペプチ ド上で利用可能なアミノ基または他の基の数）に基づいてなされる。約10,000お よび約20,000の分子量が最も好ましい。 Zalipskyら、Eur．Pol．J．19(12):1177-1183(1983)は、とりわけ、メトキ シポリ（エチレングリコール）と無水コハク酸との反応を記載している： 塩基（例えば、第３級ブタノール中のK第三級ブトキシド、テトラヒドロフラ ン中のNaナフタレン、またはベンゼン中のブチルリチウム）の存在下で、mPEGを エチルブロモアセテートでアルキル化することもまた公知である： PEGの末端ヒドロキシル基は、アミン基、カルボキシル基、またはヘキサメチ ルイソシアネート基に転換され得る。例えば、Zalipskyら、1983、前出を参照の こと。カルボキシル化mPEGの混合無水物誘導体は、トリエチルアミンの存在化で 調製され、次いでタンパク質と反応され得る： カルボキシル化mPEGはまた、タンパク質との反応のためのジシクロヘキシルカ ルボジイミドおよびジメチルホルムアミドの存在下で、ヒドロキシスクシンイミ ドと反応され得る： KingおよびWeiner（Int．J．Peptide Protein Res．16:147(1980)）は、mPEG のジチオカーボネートを記載している： Beauchampら、Analytical Biochem．131:25-33(1983)は、1,1'-カルボニルジ イミダゾールでのPEGの活性化を記載している。ペプチドとのこの誘導体の反応 は、カルバメート結合を生じる： Veroneseら、Appl．Biochem．& Biotechnol．11:141-152(1985)は、フェニル クロロホルメート(例えば、2,4,5,-トリクロロフェニルクロロホルメートまたは p-ニトロフェニルクロロホルメート)でのメトキシポリ（エチレングリコール） の活性化を記載している。これらの誘導体は、ウレタン結合によってペプチドに 結合される： Uenoら(欧州特許出願第87103259.5号)は、脱水低級アルコールの存在下での乾 燥塩化水素との反応によって、対応するニトリルからmPEGイミドエステルを形成 している。 Abuchowskiら、Cancer Biochem．Biophys．7:175-186(1984)は、上記のように mPEGスクシネートを形成し、次いでジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で のヒドロキシスクシンイミドとの反応によってメトキシポリエチレングリコリル スクシンイミジルスクシネート（「SS-PEG」）を形成することを記載している。 Sanoら(欧州特許出願番号89107960.0)は、ペプチドにおけるグアニジノ基を修 飾し得る、メトキシポリ（エチレングリコール）のフェニルグリオキサル誘導体 を開示している： Zalipsky（米国特許第5,122,614号）は、そのN-スクシンイミドカーボネート 誘導体（「SC-PEG」）への変換によるPEGの活性化を記載している： Zalipskyら、J．Macromol．Sci．Chem．A21:839は、メトキシポリ（エチレン グリコール）のアミノ酸エステル誘導体を開示している： Davisら（米国特許第4,179,337号）は、アルデヒドおよびケトンならびに他の 官能基を修飾し得る、メトキシポリ（エチレングリコール）のヒドラジド誘導体 を開示している： PEGの二官能誘導体（すなわち、ポリエチレングリコール-ビス-スクシニジル （succinidyl）カーボネート（「BSC-PEG」））が類似の手段によって調製され 得ることが、さらに開示されている。次いで、SC-PEGおよびBSC-PEG化合物は、 タンパク質中のアミン基と反応され、そしてウレタン（カルバメート）結合を介 して結合される。 他の活性化PAGもまた、本発明の実施において使用され得ることは、当業者に 容易に明らかである。本発明の実施における使用のために好ましい活性化PAGは 、PEG-ヒドラジドである。 分岐ポリマー 本発明は、以下の式に対応するSCAタンパク質のPEG化について実質的に非抗原 性の分岐ポリマーの使用をさらに提供する： (R)nL-A （II） ここで(R)は、水溶性非抗原性ポリマーを含む； (n)=2または3; (L)は、それぞれの(R)に共有結合した脂肪族の結合部分である；そして (A)は、求核置換を起こし得る活性化官能基を表す。例えば、(A)は、生物学的に 活性な求核剤を結合できる基であり得、または同じ事を行い得る部分で有り得る 。 本発明の特に好ましい局面において、(R)は、ポリ（エチレングリコール）PRG またはmPEGのようなポリ(アルキレンオキシド)PAOを含む。それぞれの鎖は、約2 00ダルトンと約12,000ダルトンとの間の分子量を有することが好ましく、そして 好ましくは、約1,000ダルトンと約10,000ダルトンとの間の分子量を有する。分 子量約5,000ダルトンが、最も好ましい。 式IIに示すように、本明細書において(R)と命名した２または３のポリマー鎖 は、脂肪族の結合部分(L)に結合している。適切な脂肪族は、置換アルキルジア ミンおよびトリアミン、リジンエステルおよびマロン酸エステル誘導体を含む。 結合部分は、好ましくは非平面であり、故にポリマー鎖は、強固に固定されてい ない。結合部分(L)はまた、複数のポリマー鎖、すなわち「分岐」を(Ａ)に結合 するための手段であり、この部分を介してポリマーが、SCAタンパク質に結合す る。 (L)は、好ましくは、18まで、そしてより好ましくは1〜10炭素原子を含む多官 能基化されたアルキル基を含む。窒素、酸素、イオウのようなヘテロ原子は、ア ルキル鎖中に含まれ得る。アルキル鎖はまた、炭素原子または窒素原子で分岐さ れ得る。本発明の別の局面において、(L)は、単一の窒素原子である。 (L)および(R)を、好ましくは、(R)および(L)の両方の求核官能基間の反応によ って結合する。それぞれの(R)は、(L)と求核置換および結合を起こすために適切 に官能基化される。このようなポリマーの官能基化は、当業者において容易に明 らかである。 広範囲で種々の(R)と(L)との結合が、意図される。ウレタン（カルバメート） 結合が好ましい。結合は、例えば、米国特許第5,122,614号に記載されるように メトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカーボネートで1,3-ジアミノ -2-プロパノールのようなアミノ基を反応させることによって形成し得る。アミ ド結合、これは塩化アシル官能基でメトキシポリエチレングリコールアミン(mPE Gアミン)のようなアミノ末端化非抗原性ポリマーを反応させることによって形成 し得る。他のこのような結合の例は、エーテル、アミン、尿素、ならびにそれら のチオおよびチオールアナログならび上記に記載されるにウレタンおよびアミド 結合のチオおよびチオールアナログを含む。 式IIの部分(A)は、生物学的に活性な物質との結合体化のために本発明の分岐 ポリマーを「活性化する」基を示す。(A)は、以下から選択される部分であり得 る： １．以下のようなアミノ基と反応し得る官能基： a)p-ニトロフェニルまたはスクシンイミジルのようなカーボネート； b)カルボニルイミダゾール； c)アズラクトン； d)環状イミドチオン；または e)イソシアネートもしくはイソチオシアネート。 ２．カルボン酸基と反応し得、そして以下のようなカルボニル基と反応性である 官能基： a)一級アミン；または b)アシルヒドラジド、カルバゼート、セミカルバメート、チオカルバゼ ートなどのようなヒドラジンおよびヒドラジド官能基。 ３．フェニルグリオキサールのようなメルカプトまたはスルフヒドリル基と反応 し得る官能基；例えば、米国特許第5,093,531号を参照のこと。 ４．求電子性中心と反応し得る他の求核基。非限定的なリストは、例えば、ヒド ロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、活性メチレンなどを含む 。 部分(A)はまた、脂肪族結合部分(L)に近位に位置するスペーサー部分を含み得 る。スペーサー部分は、18炭素原子まで、またはさらなるポリマー鎖でさえも含 む、ヘテロアルキル、アルコキシル、アルキルであり得る。スペーサー部分は、 標準的な合成技術を使用して付加し得る。 分岐ポリマー、一般的にU-PAOポリマーまたはU-PEGポリマーは、当業者に公知 の通常の反応技術を使用して形成される。 本発明のこれらの傘状に分岐したポリマー(U-PAOポリマーまたはU-PEGポリマ ー)は、生物学的に活性な求核基と反応させての結合体を形成する。ポリマーの 結合点は、官能基(A)に依存する。例えば、(A)は、スクシンイミジルスクシネー トまたはカーボネートであり得、そしてε-アミノリジンと反応し得る。分岐ポ リマーはまた、生物学的に活性なポリペプチドに見られる任意の一級または二級 のアミノ基、メルカプト基、カルボン酸基、反応性カルボニル基などと連結する ために活性化され得る。他の基は、当業者にとって明白である。 分岐ポリマーの使用の主な利点の１つは、分岐が、結合する物質に対して傘様 の三次元の保護カバーを与えることである。これは、上記に議論した直鎖ポリマ ーの列様の構造と対照的である。分岐ポリマーのさらなる利点は、ポリマーのい くつかの鎖をSCAタンパク質または炭水化物部分に結合することに関連する利点 を提供するが、実質的により少ない結合部位を必要とすることである。PEG化の 所望の特性を、実現し、そして生物活性の欠失が最小化される。 1つ以上の活性化分岐ポリマーは、標準的な化学反応により、SCAタンパク質の ような生物学的に活性な求核剤と結合し得る。その結合体は、以下の式によって 表される： [(R)nL-A1]z-(求核基) （III） ここで(R)は、水溶性の実質的に非抗原性のポリマーである；n=2または3;(L)は 、脂肪族の結合部分である；(A1)は、(L)と求核基との間の結合を表し、そして( z)を表す。(z)についての上限を、利用可能な求核基結合部位の数および当業者に よって探求されるポリマー結合の程度によって決定する。結合の程度は、周知の 技術を使用して、反応化学量論を変えることによって改変し得る。求核基に結合 した１つより多くのポリマーは、求核基で活性化ポリマーの化学量論的な過剰量 と反応することによって得られ得る。 Seaら、Immunoconjugates，Vogel，C.編，Oxford University Press，189頁(1 987)（この開示は、本明細書に参考として援用される）に一般的に記載される方 法を用いて、活性化PAOは、炭水化物部分に結合され得る。簡潔には、グリコシ ル化SCAは、過ヨウ素酸ナトリウム（PAOが結合し得るアルデヒド基を提供する） を用いて酸化される。この反応は、ホウ素化水素ナトリウムにより安定化される 。ポリペプチドまたはグリコポリペプチドへのPAO結合もまた、例えば、Zalipsk y，S.ら、WO92/16555（この開示は、本明細書中に参考として援用される）に記 載されている。 結合体 本発明のグリコシル化SCAの生成において、グリコシル化SCAは、SCAの炭水化 物部分に診断剤または治療剤を結合することによってさらに修飾され得る。本発 明による抗体結合体を調製する一般的な方法は、Shih,L.B.ら、Cancer Res.51:4 192(1991);Shih,L.B.,およびD.M.Goldenberg,Cancer Immunol.Immunother.31:19 7(1990);Shlh,L.B.ら、Intl.J.Cancer 46:1101(1990);Shih,L.B.ら、Intl.J.Can cer 41:832(1988)(これらの開示は、全ては本明細書に参考として援用される)に 記載される。間接的な方法は、抗体(またはSCA)（それらの炭水化物部分は酸化 されている）と、１または複数のペプチド(例えば、脂質、核酸、薬物、毒素、 キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子)を充填したキャリアポ リマーとの反応を包含する。 あるいは、グリコシル化SCAは、直接的に診断剤または治療剤に結合し得る。 一般的な手順は、診断剤または治療剤が、直接的に酸化型sFv成分に結合するこ とを除いて、間接的な結合体化の方法と類似している。Hansenら、米国特許第5, 443,953号(この開示は、本明細書中に参考として援用される)を参照のこと。 グリコシル化ＳＣＡは、充填される、特定の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素 付加物（addend）または標識の活性形態の誘導体、好ましくは、カルボキシル活 性化誘導体（これは、従来の手段、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ DCC）またはその水溶性の改変体を用いて調製される）と結合されて、中間体付 加物を形成させ得る。 上記に挙げた特定の例に加えて、ヒトに感染し得、そして病巣を生じさせ得る 腫瘍細胞または微生物に対する細胞傷害効果を有する多くの薬物および毒素が、 公知である。これらは、Merck Indexなどのような薬物および毒素の大要に見い 出される。任意のこのような薬物は、当該分野で周知な従来の方法により、キャ リアに充填され得るかまたはSCAの炭水化物部分に直接に充填され得、そして上 記に記載されるのと同様に、例示され得る。 放射性金属または磁性共鳴エンハンサーについてのキレート剤はまた、当該分 野で周知である。エチレンジアミン四酢酸（EDTA）およびジエチレントリアミン 五酢酸（DTPA）の誘導体が代表的である。これらは、代表的に、キレート剤がキ ャリアに、またはSCAの炭水化物部分に直接結合され得る基を側鎖に有する。こ のような基には、例えば、ベンジルイソチオシアネートが挙げられ、これによっ て、DTPAまたはEDTAは、SCAの反応基へと結合され得る。 放射性同位体、酵素、蛍光化合物、電子伝達因子などのような標識はまた、キ ャリアに、またはSCAの炭水化物部分に直接、当該分野で周知の従来方法によっ て連結され得る。これらの標識およびそれらから調製されたSCA結合体は、SCAへ の標識の直接結合によって調製されたSCA結合体と同様に、免疫アッセイおよび 免疫組織学のために使用され得る。しかし、本発明に従う結合体の複数の標識で の充填は、アッセイの感度または組織学的手順を増加し得、ここで、標的抗原へ のSCAの結合は低い程度しか達成されない。 ホウ素付加物は、例えば、カルボランは、抗原結合単鎖分子に結合され、そし て損傷に対して標的化される場合、熱中性子照射によって活性化され得、そして 放射性原子へと変換され得、これは、α放射によって崩壊して高度に細胞傷害性 の短期の効果を生じ得る。ホウ素付加物および磁性共鳴増強イオンの高度の充填 は、これらの効果を強化するのに非常に重要である。カルボランは、当該分野で 周知なように、付属の側鎖においてカルボキシル官能基とともに作製され得る。 キャリアへの薬物の充填は、薬物の効力、SCA標的化の効率、および結合体が 一旦その標的に達した場合の結合体の効力に依存する。ほとんどの場合、少なく とも20、好ましくは50、およびしばしば100以上の薬物分子がキャリアへ充填さ れることが望ましい。薬物が循環している間に、結合体としての薬物を本発明に 従って部分的または完全に無毒化する能力は、結合体化していない薬物の全身投 与が受容されない場合に、薬物の全身性副作用を低減させ得、そしてその使用を 可能にさせ得る。本発明に従い、より多くの薬物分子（ただし、キャリア上でSC Aと結合体化されている）の投与は、全身毒性を緩和しながら治療を可能にする 。 毒素はしばしば、薬物より少ない密度で充填されるが、少なくとも５、好まし くは１０、およびいくつかの場合には２０以上の毒素分子が、キャリアに充填さ れ、そして標的化送達のためには、少なくとも１つのキャリア鎖がSCAに充填さ れることがなお有利である。 診断剤または治療剤の上記の結合体はまた、グリコシル化SCAを用いて、ポリ アルキレンオキシドと、炭水化物部分および／またはポリマー部分でさらに結合 体化されることが意図される。ポリ（エチレングリコール）またはポリ（アルキ レンオキシド）の有機低分子との結合体化は、Greenwald、R.B.、Exp.Opin.Ther .Patents ７：６０１−６０９（1997）、Enzon Inc.、WO95/11020、およびEnzon Inc.WO96/23794に記載されており、これらの開示はすべて、本明細書において 参考として援用される。PEGバラストと活性薬物との間の種々のリンカー基の使 用に基づく組成物は、WO96/23794に記載されている。 用途 グリコシル化SCAの主要な有用性の一つは、その二官能性（または、三官能性 、四官能性などを含む多官能性）であり、ここで、１つの特異性は、１つのハプ テン型または抗原型に対してであり、そして第二の特異性は、第二の分子または レセプターに対してである。２つの異なる結合特異性を有するグリコシル化SCA 分子は、多くの潜在的な用途を有する。例えば、炭水化物部分は、標的細胞（例 えば、腫瘍細胞または他の所望されない細胞）の細胞表面エピトープに対して特 異的であり得る。抗原結合部位は、エフェクター細胞（例えば、細胞傷害性T細 胞のCD3タンパク質）の細胞表面エピトープに対して特異的であり得る。このよ うにして、グリコシル化SCAタンパク質は、優先的に攻撃されるべき特定のクラ スの細胞へと細胞傷害性細胞を導き得る。あるいは、両方とも標的である抗原お よび炭水化物レセプターは、同一の細胞上に存在し得、その結果、一方の標的が 結合特異性を調節し、そして他方の標的が、取り込みまたはインターナリゼーシ ョンに影響を与える。 マンノース特異的なレクチンがE.coli、Salmonella、およびPseudomonasのよ うな腸内細菌種の表面線毛上に産生されることが報告されている。このような細 菌は、グリコSCAのオリゴ糖に（徹底的に）結合され得る一方で、SCA特異性は、 免疫細胞に指向されるか、またはそうでなければ、微生物の除去を促進する。同 様に、腫瘍細胞上のマンノース特異的レセプターは、同様の適用を有し得る。細 菌レクチンはまた、宿主に対する細胞接着および感染において重要であると考え られており、このことは、別の適用を示唆する。 細胞、ウイルス、または粒子表面上の炭水化物部分は、それらの同一性の主要 な決定因子である。細胞、ウイルス、または粒子表面へ結合するSCA特異性を用 いること、およびオリゴ炭水化物部分を突出させることは、この分子（entity） に、他の細胞、ウイルス、およびタンパク質との相互作用について新たな性質（ identity）を与え得る。 診断剤または治療剤は、抗体に結合体化され、そして診断のためおよび治療の ために有用である分子または原子である。この抗体の免疫反応性は保持される。 診断剤または治療剤は、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素化合物および検出可能 な標識を含む。さらに詳細には前述の「結合体」の節を参照のこと。 診断剤または治療剤は、核酸、化合物、タンパク質、元素、脂質、抗体、糖類 、同位元素、炭水化物、造影剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、検出可 能プローブ、および抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの任意の組合 せから選択される少なくとも１つであり得るが、それらに限定されず、それらは 、本明細書に記載のように、抗体を標識するためと同様に検出可能に標識され得 る。このような標識は、酵素的標識、放射性同位体または放射性化合物または元 素、蛍光化合物もしくは金属、化学発光化合物および生物発光化合物を含むが、 それらに限定されない。あるいは、任意の他の公知の診断剤または治療剤が、本 発明の方法において使用され得る。 本発明において使用される治療剤は、標的細胞に対する治療効果を有し得、こ の効果は、欠損遺伝子またはタンパク質の修正、薬物作用、毒性効果、成長刺激 効果、成長阻害効果、代謝効果、異化効果、同化効果、抗ウイルス効果、抗菌効 果、ホルモン効果、神経液性効果、細胞分化刺激効果、細胞分化阻害効果、神経 調節効果、抗新生物効果、抗腫瘍効果、インスリン刺激効果または阻害効果、骨 髄刺激効果、多能性幹細胞刺激効果、免疫系刺激効果、および本発明による送達 系を介して細胞に送達される治療剤によって提供され得る任意の他の公知の治療 効果から選択されるがそれらに限定されない。 SCA結合体は、感染または疾患の防御、抑制または処置のために使用され得る 。本明細書に使用されるような、用語、感染または疾患からの「防御」は、「予 防」、「抑制」または「処置」を意図する。「予防」は、疾患の誘発の前のグリ コシル化SCA結合体の投与を含む。「抑制」は、疾患の臨床的な出現の前の組成 物の投与を含む。 「処置」は、疾患の出現後の防御組成物の投与を含む。医学および獣医学にお いては、「予防」と「抑制」との間を区別することが常に可能であるわけではな いことが理解される。なぜなら、最終的な誘発事象が、未知であり、不顕性であ るか、または患者が、その事象の出現の十分後になるまで確認されないためであ る。それ故に、本明細書に定義するように「予防」および「抑制」の両方を包含 するために、「処置」とは異なるような用語「予防(prophylaxis)」を使用する ことが一般的である。本明細書に使用される用語「防御」は、「予防」を含むこ とが意味される。 本発明の治療剤または組成物をさらに含み得るこのようなさらなる治療剤は、 抗生物質、ステロイド、細胞傷害性薬剤、血管作用性薬物、抗体および他の治療 様式を含む公知および新規な化合物および組成物から選択され得るが、それらに 限定されない。このような薬剤の非限定な例は、ゲンタマイシン、トブラマイシ ン、ナフシリン、非経口セファロスポリンなどのような、細菌ショックの処置に おいて使用される抗生物質を含み；メチルプレドニゾロンのような、副腎性コル チコステロイドおよびそのアナログは、内毒素によって生じる細胞傷害を和らげ ；αレセプター遮断剤(例えば、フェノキシベンザミン)、βレセプターアゴニス ト(例えばイソプロテレノール)、およびドパミンのような血管作用性薬物は、敗 血性ショックを処置するために適切な薬剤である。 本発明のグリコシル化SCAはまた、疾患の診断のため、および治療応答をモニ ターするために使用され得る。グリコシル化SCAタンパク質の他の用途は、腫瘍 細胞および酵素に対する特異性を有する二重特異的分子による、腫瘍細胞へのプ ロドラック活性化酵素の特異的標的化である。グリコシル化SCAは、腫瘍のよう なインビボ標的への薬物の特異的な送達、腫瘍放射免疫診断または放射免疫治療 のための放射性金属の送達(Goldenberg,D.M.,Am J.Med.94:297(1993))、ホウ素 ／ウラン中性子捕獲治療(Ranadive,G.N.ら、Nucl.Med.Biol.20:l(1993);Barth,R .F.ら、Bioconjug.Chem.5.58(1994)）のような適用における非放射性金属の送達 、および核磁気共鳴画像診断(Sieving,P.F.ら、Bioconjug.Chem.1:65(1990))に 使用し得る。この列挙は、ただの例示であり、そしてオリゴ糖特異性が適切であ る任意の用途が本発明の範囲内に含まれる。 本発明はまた、精製およびバイオセンサーにおけるグリコシル化SCAタンパク 質のための使用にまで拡張される。アフィニティー精製は、支持体にグリコシル 化SCAタンパク質を添加することによって可能にされ、リガンド分子に曝露され 、これと接触した抗原結合部位が分離され、従って精製される。バイオセンサー は、 抗原結合分子への特異的抗原の結合の際に検出可能なシグナルを生成し、続いて そのシグナルを処理する。グリコシル化SCAタンパク質は、バイオセンサーにお いて抗原結合分子として使用する場合、結合の際にコンフォメーションを変化さ せ得、従って検出され得るシグナルを生成し得る。 本発明はまた、その炭水化物部分によって標識化されているグリコシル化SCA とサンプルとを接触させることによって、サンプル中に存在すると推測される抗 原を検出する方法に関する。１つのサンプルは、少なくとも１つの化合物、混合 物、表面、溶液、乳濁液、懸濁液、混合物、細胞培養物、発酵培養物、細胞、組 織、分泌物および／またはそれらの誘導物または抽出物を含み得る。 このようなサンプルはまた、例えば、動物組織(例えば、血液、リンパ液、脳 脊髄液(CNS)、骨髄、胃腸内容物、ならびに、皮膚、心臓、肺および呼吸系、肝 臓、脾臓、腎臓、膵臓、胆嚢、胃腸管、平滑筋、骨格筋または心筋、循環系、生 殖器官、聴覚系、自律神経系および中枢神経系の部分、細胞または内分泌物およ び外分泌物)およびそれらの抽出物または細胞培養物を含み得る。このようなサ ンプルは、インビトロ、インビボ、およびインサイチュにおいて、本発明の方法 を使用して測定され得る。 このようなサンプルはまた、土壌、大気または水のサンプルのような環境サン プル、ならびに、化合物、混合物、表面、水性化学溶液、乳濁液、懸濁液または 混合物のような産業的または商業的サンプルを含み得る。 さらに、本発明の方法において使用され得るサンプルは、細菌、酵母、哺乳動 物細胞、植物細胞および昆虫細胞のような、原核生物または真核生物の細胞およ び／または組織の増殖のために使用される細胞培養培地および発酵培地を含む。 モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体またはそれらのフラグメント が先行技術によって想起される用途の本質的に全てが、本発明のグリコシル化SC Aタンパク質によって取り組まれ得る。これらの用途は、グリコシル化SCAタンパ ク質の検出可能な標識化形態を含む。標識の型は、当業者に周知である。それら は、放射標識化、化学発光標識化、蛍光色素標識化、および発色団標識化を含む 。他の用途は、グリコシル化SCAタンパク質の標識化形態の有効量を投与するこ と、およびその動物に付随する検出可能放射能を測定することによって、動物( ヒト を含む)の内部構造を造影することを含む。それらはまた、標識化抗体が本発明 のグリコシル化SCAタンパク質によって置き換えられ得る、サンドイッチ免疫ア ッセイ、競合免疫アッセイ、および他の免疫アッセイを含む、改良された免疫ア ッセイを含む。例えば、Kohlerら、Nature256:495(1975);Kohlerら、Eur.J.Immu nol.6:511(1976);Kohlerら、Eur.J.Immunol.6:292(1976);Hammerlingら、Monocl onal Antibodies and T-Cell Hybridomas,563-681頁,Elsevier,N(1981);Sambroo kら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Labo ratory(1989)を参照のこと。 上記に記載した用途はまた、特に例えば、血流における免疫原性および抗原性 の低減ならびにより長期の寿命のために、ポリアルキレンオキシドと結合体化し たグリコシル化SCAを用いることも意図される。 投与 インビボ診断および治療適用のための本発明のグリコシル化SCA結合体の投与 は、同一または同様の薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能 な標識の結合体と類似の方法によってであり、ここで、診断または治療成分（pr inciple）が抗体に直接連結されるか、または充填されたキャリアが非部位特異 的様式でSCAのアミノ酸残基上のアミン基またはカルボキシル基にランダムに結 合することによって連結される。 本発明の結合体（免疫結合体）は、薬学的に有用な組成物を調製するための公 知の方法に従って（例えば、薬学的に受容可能なキャリアビヒクルとの混合によ って）処方され得る。適切なビヒクルおよびそれらの処方物は、例えば、Reming ton's Pharmaceutical Sciences、第18版、Osol,A.編、Mack，Easton PA（1990 ）に記載される。有効な投与のために適切な薬学的に受容可能な組成物を形成す るために、このような組成物は、単独でまたは適切な量のキャリアビヒクルと共 にのいずれかで、治療的有効量の免疫結合体を含む。 さらなる薬学的方法を使用して、作用の持続時間を制御し得る。制御された放 出調製物は、本発明の免疫結合体を複合体化または吸着するためのポリマーの使 用によって達成され得る。制御された送達は、適切な高分子（例えば、ポリエス テル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチ ルセルロース、カルボキシメチルセルロース、または硫酸プロタミン）を選択す ることによって行われ得る。薬物放出の速度はまた、このような高分子の濃度を 変化させることによって制御され得る。作用の持続を制御するための別の可能性 のある方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）または エチレンビニルアセテート共重合体のような重合体物質の粒子への治療剤の組み 込みを含む。あるいは、例えば、コロイド脱混合現象技術、または界面重合（例 えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルも しくはポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルの使用によって）によっ て調製されたマイクロカプセルにおいて、またはコロイドドラッグデリバリーシ ステム（例えば、リポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ 粒子、ナノカプセル、または巨大エマルジョンにおいて）において、本発明の免 疫結合体を包括することは可能である。このような教示は、Remington's Pharma ceutical Sciences、第16版、Osol,A.編、Mack,Easton PA(1990)に開示される。 免疫結合体は、当該分野で周知の手段によって患者に提供され得る。このよう な導入の手段は、経口手段、経鼻手段、皮下手段、筋肉内手段、静脈内手段、動 脈内手段、または非経口的手段を含む。静脈内投与、動脈内投与、または胸膜内 投与は、通常、肺腫瘍、乳房腫瘍、および白血病性腫瘍に対して使用される。腹 腔内投与は、卵巣腫瘍に勧められる。くも膜下腔内投与は、脳腫瘍および白血病 に勧められる。皮下投与は、ホジキン病、リンパ腫および乳癌に対して勧められ る。カテーテル灌流は、転移性肺、乳房または肝臓の胚細胞癌のために有用であ る。病巣内投与は、肺および乳房病巣のために有用である。 治療的または診断的適用のために、本発明による組成物は、従来の注射用液体 キャリア（例えば、滅菌無発熱物質(sterile pyrogen-free)水、滅菌無ペルオキ シド(sterile peroxidase-free)オレイン酸エチル、無水アルコール、またはプ ロピレングリコール）と組み合わせて非経口的に投与され得る。安定化剤、可溶 化剤および緩衝液（例えば、エタノール、エチレンジアミン四酢酸のような錯体 形成剤、酒石酸およびクエン酸緩衝液）ならびに粘性調節のためのポリエチレン オキシドのような高分子量ポリマーのような注射溶液用の従来の薬学的アジュバ ントが添加され得る。このような組成物は、筋肉内、腹腔内、または静脈内に注 射され得る。 キャリアおよび希釈物のさらなる非制限的な例は、アルブミンおよび/または 他の血漿タンパク質成分（例えば、低密度リポタンパク質、高密度リポタンパク 質およびこれらの血清タンパク質と結合する脂質）を含む。これらの脂質は、ホ スファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン 、および中性脂質（例えば、トリグリセリド）を含む。脂質キャリアはまた、ト コフェロールを含むがこれに限定されない。 本発明による治療剤に連結された少なくとも１つのグリコシル化結合SCAは、 これらの意図される目的、例えば種々の症状（例えば、細胞炎症、アレルギー、 組織損傷または他の関連する症状）を処置することを達成する任意の手段によっ て投与され得る。 種々の症状を予防、抑制、または処置するための代表的な投与計画は、１日ま たは数日の間（１週間までおよび１週間と約24ヶ月との間を含む）にわたって投 与された、有効な量のSCA結合体の投与を含む。 インビボまたはインビトロで投与された本発明の投薬量は、レシピエントの年 齢、性別、健康状態、および体重、併用処置の種類、もしあるなら処置の程度、 および所望される効果の性質に依存することが理解される。以下に提供される有 効用量の範囲が、本発明を制限することは意図されず、そして好ましい用量範囲 を代表する。しかし、最も好ましい投薬量は、過度の実験なく当業者によって理 解されそして決定され得るように、個々の被検体に合わせて変更される。例えば 、Berkowら編、Merck Manual，第16版、Merck and Co.、Rahway，N.J.(1992);Go odmanら編、Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutic s、第８版、Pergamon Press，Inc.，Elmsford，N.Y.(1990);Avery's Drug Treat ment:Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics， 第３版、ADIS Press，LTD.、WilliamsおよびWilkins,Baltimore，MD．(1987),Eb adi，Pharmacology,Little，Brown and Co.,Boston(1985)，Katzung，Basic and Clinical Phamacology，Appleton and Lange，Norwalk，Conn.(1992)（これら の参考文献および本明細書中で引用される参考文献は、本明細書中で参考とし て全体的に援用される）を参照のこと。 各処置に必要な総用量が、複数回用量によってまたは単回用量で投与され得る 。本発明の診断的/薬学的化合物または組成物の有効な量は、約0.001μg〜約100 mg/kg体重であり、2時間〜５年の期間の間、４〜72時間の間隔で投与されるか、 またはその中の任意の範囲または値(例えば、0.01〜1.0、1.0〜10、10〜50およ び50〜100mg/kgを、1〜4、6〜12、12〜24および24〜72時間の間隔で、0.5、1.0 〜2.0、2.0〜4.0および4.0〜7.0日または１、１〜２、２〜４、４〜52もしくは それより長いの週、または１、２、３〜10、10〜20、20〜60年もしくはそれより 長い期間、あるいはそれらの中の任意の範囲または値で投与される)である。 非経口的投与のための調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および エマルジョンを含む（これらは、当該分野で公知である補助薬剤または賦形剤を 含み得る）。錠剤およびカプセルのような薬学的組成物はまた、日常的な方法に よって調製され得る。例えば、Berker（前出）、Goodman（前出）、Avery（前出 ）およびEbadi（前出）(これらの開示は、その全体（そこに引用された全ての文 献を含む）が本明細書において参考として援用される)を参照のこと。 本発明のSCA結合体の少なくとも１つの型、または本発明のSCA結合体の１型、 ２型、３型、４型、５型、６型、７型、８型、９型または１０型を含む薬学的組 成物は、その意図される目的を達成するために有効な量で含まれ得る。少なくと も１つのSCA結合体に加えて、薬学的組成物は、適切な薬学的に受容可能なキャ リア（例えば、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物の加工を容易にする 賦形剤、キャリアおよび/または補助剤）を含み得る。 薬学的組成物はまた、静脈内投与、皮下投与、経皮投与、経口投与、粘膜投与 、または直腸投与のために適切な溶液を含み得、そして賦形剤と共に、約0.01〜 99％、好ましくは約20〜75％の活性成分（すなわちSCA）を含み得る。経口投与 のための薬学的組成物は、錠剤およびカプセルを含む。直腸的に投与され得る組 成物は座剤を含む。例えば、Berker（前出）、Goodman（前出）、Avery（前出） 、およびEbadi（前出）を参照のこと。本明細書中に含まれ得るさらなる脂質お よびリポタンパク質ドラッグデリバリーシステムは、Annals N.Y．Acad．Sci.50 7:775-88、98-103、および252-271（この開示は本明細書中で参考として援用さ れ る）でより十分に記載される。 組成物はまた、１つ以上の生理学的に適合性のキャリアまたは賦形剤を含む経 口投与可能な組成物へと処方され得、そして固体形態または液体形態であり得る 。これらの組成物は、所望される場合、結合剤（例えば、シロップ、アカシア、 ゼラチン、ソルビトール、トラガカントまたはポリビニルピロリドン）；賦形剤 （例えば、ラクトース、マンニトール、デンプン、リン酸カルシウム、ソルビト ール、シクロデキストラン、またはメチルセルロース）；滑沢剤（例えば、ステ アリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコールのような高分子量ポリマー、ス テアリン酸のような高分子量脂肪酸、またはシリカ）；デンプンのような崩壊剤 ；例えばラウリル硫酸ナトリウムのような受容可能な湿潤剤）のような従来の成 分を含み得る。 経口組成物は、任意の従来の形態（例えば、錠剤、カプセル、トローチ剤（lo zenge）、水性または油性懸濁液、エマルジョン、あるいは使用前に水または他 の液体媒体と再構成するために適切な乾燥産物）を想定し得る。当然、液体経口 形態は、香料、甘味料、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ−ヒドロキシ安 息香酸プロピルのような防腐剤；ソルビトール、グルコースまたは他の糖シロッ プ、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、またはカルボキシメチル セルロースあるいはゼラチンのような懸濁剤；レシチンまたはソルビタンモノオ レエートのような乳化剤、あるいは増粘剤（thickening agent）を含む。非水溶 性組成物もまた処方され得、これは例えば、魚肝臓または植物油のような食用油 を含む。これらの液体組成物は、例えば単位投薬量でゼラチンカプセルに都合良 く封入され得る。 本発明による薬学的組成物はまた、適切な場合、エアロゾルとして、またはク リームまたは軟膏のような従来の基剤で処方されるかのいずれかで局所的に投与 され得る。 本発明の薬学的組成物はまた、リポソームのようなコロイド性キャリアに活性 成分を組み込むことによって投与され得る。リポソーム技術は当該分野で周知で あり、Allisonら、Nature 252:252-254(1974)、およびDancyら、J.Immunol.120: 1109-1113(1978)によって記載されている。 上記に記載された組成物の投与はまた、ポリアルキレンオキシドと結合体化し たグリコシル化SCAを含む。 本発明を一般的に記載したので、本発明は、以下の実施例を参照すれば、より 容易に理解される。実施例は、例示の目的で提供され、限定することは意図しな い。 実施例 実施例１．CC49/218におけるAsn結合グリコシル化配列の合成およびグリコシル 化SCAの発現 CC49モノクローナル抗体は、National Cancer Instituteの腫瘍免疫学および 生物学研究室で、Jeffrey Schlom博士のグループによって開発された。これは、 膵臓ガン腫抗原TAG-72に特異的に結合する（Muraro，R.ら、Cancer Res．48:458 8-4596（1988））。CC49のSCA遺伝子バージョンは、Milenicら、Cancer Res．51 ：6363-6371（1991）によって記載されている。オリゴヌクレオチド特異的変異 誘発を、図１において示されるDNA配列において示されるように、CC49/218（218 リンカーは、前出の「好ましい実施態様の詳細な説明」の節において記載される ）において、Asn結合グリコシル化配列を作製するために用いた（すなわち、（ １）２つのVL変化；（２）２つのVH変化；（３）１つのリンカー変化；（４）１ つのＣ末端変化）。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発をまた、CC49/218におい て、２つもしくは３つのタンデムなまたは重複するグリコシル化部位を作製する ために用いた。さらに、６つの全ての変化を有する変異体遺伝子、Ｃ末端変化以 外の５つの変化を有する変異体遺伝子、およびＣ末端＋リンカー変化を有する変 異体遺伝子を作製した。これらの変異体CC49遺伝子および変異されていないCC49 SCA遺伝子を、Pichia移入プラスミドpHIL-S1（Invitrogen Corp.）に個々にラ イゲーションし、そして酵母Pichia pastorisに形質転換した。これらの手順に ついての詳細なプロトコルは、Invitrogen CorporationからのPichia発現キット 使用説明書マニュアルカタログ番号X1710-01（1994）において示される。CC49遺 伝子改変体を、これらの構築において酵母シグナル配列の後ろに配置し、そして 酵母形質転換体中に取込まれたSCA遺伝子を、SCAタンパク質または糖タンパク 質産物の分泌について試験した。発現の評価を、SDS-PAGEゲルのクマシーブルー 染色によって行った。 修飾していないCC49/218SCA（約27kDa）を、組換えPichiaにおいて高レベルで 発現（分泌）させた（取込まれる遺伝子のコピー数に依存して約20〜100mg/l） 。上記の変異体遺伝子の全ては、約27〜35kDaの範囲におけるタンパク質バンド によって観察されるように、分泌されたグリコ-SCA＋グリコシル化されていない SCAの検出可能な（しかし、減少した）発現を与えた。各グリコシル化事象は、P ichiaが、約８〜14残基のオリゴマンノース鎖を、コアＮ-アセチルグルコサミン に付加することが報告されているので（Cregg，J.M.ら、Bio/Technol．11:905-9 10（1993））、約２〜３kDaの質量を付加することが予測される。Ｃ末端変異体 は、発現（分泌）の最も高いレベル、ならびにほぼ等しい割合で約27kDaおよび 約30kDaの２つの顕著なバンドを与えた。変異体による分泌されたグリコ-SCAの 発現を、表２にまとめる。 これらの結果は、全ての変異体SCAタンパク質のいくつかのグリコシル化が存 在し、そしてＣ末端変異体が、グリコ-SCAの最も高い発現（分泌）を与えたこと を示す。この変異体を、より詳細な研究のために選択した。 E.coli GX9251からの精製されたCC49/218 SCAおよびP.pastoris EN225からの 未精製の培養上清を、抗原の、ウシ下顎部ムチンへの直接結合について、ELISA によりアッセイした。図２に示すように、E.coliおよびPichiaの両方からの親CC 49/218 SCA産物は、ELISAによって、ウシ下顎部ムチンを結合するにおいて活性 であることが示された。このことは、Pichiaにおいて産生されるCC49/218 SCAが 、活性であることを示す。 Ｃ末端＋リンカー二重変異体（EN236）CC49/218 SCAを、SDS-PAGEゲルにおい て泳動した（図３）。製造業者によって記載されるように、ダブレットの上部の バンドを、Oxford GlycoSystemsからのGlyco Track炭水化物キットK-050を使用 することによって、選択的に染色した。より低い約27kDa（修飾されていない） のバンドは染色されず、約30kDaのバンドが、糖タンパク質であったことを示し た。 さらに、Ｃ末端変異体（EN235）およびＣ末端＋リンカー二重変異体（EN236） CC49/218 SCAを、ポリペプチド鎖からのアスパラギン結合（Ｎ結合型）炭水化物 を選択的に切断するペプチド-Ｎ-グリコシダーゼ（PNGアーゼ）Ｆまたはエンド- グリコシダーゼＨ（Oxford Glycosystems）で消化した。PNGアーゼＦまたはエン ド-グリコシダーゼＨ処理後、サンプルを、SDS-PAGEによって分析し、これは、 以前のダブレット（約27および約30kDa）が、単一の約27kDaバンドに変換された ことを、クマシー染色によって示した。図３に示されるように、抗CC49 SCAウサ ギ血清抗体（HRP Inc.）を使用するウエスタン分析によって、Ｃ末端変異体、お よびＣ末端＋リンカー二重変異体から発現されるタンパク質ダブレットの両方の バンドは、このCC49特異的抗体と反応することが確認された。 Ｃ末端変異体CC49/218 SCAダブレットタンパク質を、ウシ下顎部ムチン−Seph aroseアフィニティーカラムに結合し、そして尿素濃度を増加することによって 溶出した。図４に示されるように、結合し、溶出したダブレットは、開始サンプ ルにおけるように、等しい化学量論であるようであり、グリコ-SCAは、ムチン結 合特異性を維持することを示す。 EN235培養上清からのCC49/218 SCAを、モル過剰のConA Sepharose樹脂（Pharm acia Biotech）とともにインキュベートした。未結合の上清画分を除去し、そし て結合画分を、α-D-メチルマンノシドで溶出した。図５に示されるように、グ リコシル化された結合画分は、約30kDaであったが、グリコシル化されていない 未結合の画分は、約27kDaであった。 Ｃ末端において１つ、２つ、または３つのグリコシル化配列を有するCC49 SCA を、図９において示す。Ｃ末端に近接する１つのグリコシル化部位を有するCC49 SCAのウェスタンブロット分析（図９、レーン３および４）は、これが、修飾さ れたポリペプチド（約30kDaバンド）および修飾されていないポリペプチド（約2 7kDa）の混合物であることを示す。２つのグリコシル化部位を有するCC49 SCA（ 図９、レーン５および６）は、より少ない割合の修飾していないポリペプチドを 有し、１つおよび２つのグリコシル化部位の種、ならびに高グリコシル化（hype rglycosylated）種（約43kDaバンド）の混合物を有した。３つのグリコシル化部 位を有するCC49（図９、レーン７および８）は、事実上、修飾されていないポリ ペプチドを有さず、２つのグリコシル化部位種および高グリコシル化種の混合物 を有した。 ３つのグリコシル化配列を含有するSCA（図９、レーン７およびレーン８）は 、主に、２つの付着されたオリゴ糖または高グリコシル化種を有した（および事 実上、修飾されていないタンパク質を有さなかった）。より高分子量の高グリコ シル化種は、３つの部位の付着および／または１つ以上のグリコシル化の部位で のより広範なより長い鎖のオリゴ糖付着の両方を含み得る。 修飾されていないCC49 SCA（E.coli CC49およびP．pastoris EN225）、EN236 （１つのＣ末端グリコシル化配列）、EN279（２つのグリコシル化配列）、なら びにEN280（３つのグリコシル化配列）を、ELISAによって、抗原であるウシ下顎 ムチンへの直接的な結合について、アッセイした（図10）。２つのコントロール のBSAおよびGS115（P．pastoris宿主）は、ムチン結合活性をほとんど示さなか った。 材料および方法 材料。CC49/218 SCAの遺伝子を、プラスミドpGX5608（Enzon，Inc.）から得た 。CC49/218 SCAの完全なDNA配列は、報告されている（Filpula，D.ら、「１本鎖 Fvモノマーおよびマルチマーの生成：Antibody Engineering：A Practical Appr oach（J．McCafferty，H．HoogenboomおよびD.J．Chiswell編、Oxford Universi ty Press，Oxford、UK）、253-268頁（1996））。オリゴヌクレオチドを、Milli po re Cyclone DNA Synthesizerを使用して合成した。GlycoTrack炭水化物検出キッ トK-050、エンドグリコシダーゼＨ、およびペプチド-Ｎ-グリコシダーゼＦを、O xford GlycoSystems（Rosedale、NY）から購入した。予め成形されたポリアクリ ルアミドスラブゲル（４〜20%）を、Novex Corporation（San Diego，CA）から 得た。ウシ下顎部ムチンＩ型、ブタ下顎部ムチンIII型、およびCNBr-活性化Seph arose 4Bを、Sigma Inc．(St．Louis，MO)から購入した。ConA Sepharoseを、Ph armacia Biotech（Piscataway、NJ）から得た。E.coli GX9251に由来する精製さ れたCC49/218 SCAタンパク質を、Enzon，Inc.から得た。ウサギ抗CC49/218 SCA ポリクローナル抗体を、HRP Inc.から得た（Denver，PA）。マウス抗CC49/218ポ リクローナル抗体を、Enzon，Inc.から得た。 SCA遺伝子構築。プラスミドpGX5608からのCC49/218 SCA遺伝子を、Hoら、Gene 77:51-59（1989）の手順を使用して、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発によ って修飾した。Ｎ結合型グリコシル化についての６つの指定された変化（N-X-T/ S）を、図１において示す。T7 Sequenase version 2.0（Amersham Corporation ，Arlington Heights，IL）を使用するDNA配列解析を、製造業者の指示に従って 行って、正確な構築を確認した。EcoRI-BamHIフラグメントとして、P．pastoris ベクターpHIL-SIに連結可能であるEN235 SCA遺伝子の最終的な構築のために、プ ライマー対５'-CGGAATTCGACGTCGTGATGTCACAG-3'（配列番号１９）および５'-CCA GGATCCTATTAACTGGTCTTGTTGGAGACGGTGACTGA-３'（配列番号２０）を、PCR反応に おいて使用した。 ２つおよび３つのタンデムなまたは重複するＮ結合型グリコシル化部位につい ての指定される変化は、以下のように提供される： 二重のグリコシル化部位を有するCC49のＣ末端： 三重のグリコシル化部位を有するCC49のＣ末端： これらの例示的な部位の構築のために、PCR反応において使用されるプライマ ー対は、以下のように提供される。 オリゴヌクレオチド5228：ベクターPhilS1のBamHI部位に、CC49のＣ末端の２ つのＮ結合型グリコシル化部位をクローニングするための３'PCRプライマー： オリゴヌクレオチド5229：ベクターPhilS1のBamHI部位に、CC49のＣ末端の３ つのＮ結合型グリコシル化部位を配置するための３'PCRプライマー： オリゴヌクレオチド5230：ベクターpPic9のEcoRI部位に、CC49のＣ末端の２つ のＮ結合型グリコシル化を配置するための３'PCRプライマー： Pichia pastorisにおけるSCAの発現。Pichia発現ベクターpHIL-S1（Invitroge n Corporation）を、修飾されていないSCAおよびグリコシル化されたSCAの両方 の発現のために使用した。このベクターは、酵母遺伝子PH01に由来するシグナル 配列を提供し、これは目的の遺伝子に融合される。融合点は、EcoRI部位でであ る。シグナルプロセシング後、SCAタンパク質の予測されるＮ末端配列はREFDで あり−正常なＮ末端Ｄ（斜字体）は、３つのアミノ酸によって先行される。Phch iaにおけるSCAの生成のための、全てのクローニングおよび発現手順は、Invitro gen Corporation，San Diego，CA（カタログ番号K1710-01；1994）からの「Pich ia発現キット使用説明書」において記載されるように行った。pHIL-S1/SCAベク ターを用いるP.pastorisGS115の形質転換を、スフェロプラスト形質転換手順に よって行い、続いて、His+およびMut-表現型を単離した。BMGYおよびBMMYにおけ る増殖プロトコルをまた、Invitrogenのマニュアルにおいて記載されるように行 った。BMMY培地における、30℃での増殖の48時間後、誘導された培養上清を、遠 心分離後に回収した。 SDS-PAGE。SDSの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動を、製造業者の 指示に従って、Novex Corporation（San Diego、CA）からの予め成形された４〜 20%スラブゲルを使用して行った。タンパク質バンドを、クマシーブルーで染色 することによって可視化した。染色したバンドの面積定量を、Molecular Dynami cs PD-SIレーザースキャナを使用して行った。 ウェスタン分析。セミードライ法によるゲルからニトロセルロースメンブレン へのタンパク質のトランスファーについてのイムノブロッティング手順を、Harl owら，E．& Lane，D.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，（1998）において記載されるよ うに行った。ブロット発色をまた、このマニュアルにおける手順に従って行った 。簡潔には、ブロットされたメンブレンを、室温で、２時間、PBS中の１% BSAブ ロッキング試薬中でブロックし；PBSで３回洗浄し；そして1:1,000希釈のウサギ 抗CC49/218 SCA抗体を含有する、PBS中の３% BSAとともに、４℃で一晩インキュ ベートした。次に、1:1000希釈の、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサ ギIgGを含有するPBS中の３% BSA溶液を、室温で１時間のインキュベーションに おいて使用した。PBSによる洗浄後、メンブレンを、TMBM-500（MOSS，Inc.）で 、室温にて１分間、発色させた。 ムチン−Sepharoseクロマトグラフィー。抗原結合シアノゲンブロミド活性化 ビーズの調製のためのプロトコルは、Harlowら，E．およびLane，D.、Antibodie s：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、（1988）において記載される。CNBr活性化Sepharose4B（Sigma Co rporation、カタログ番号C9412）を、ウシ下顎部ムチン（Sigma、カタログ番号M 4503）に結合した。５mgのムチンを、１mlの0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3中 に溶解した。CNBr活性化樹脂の2.5gアリコートを、１mM HCl中で膨潤させた。次 に、ムチン溶液を、樹脂とともに、１時間、22℃で穏やかに混合した。25mlの上 記の結合溶液で未結合のムチンを洗浄した後、Sepharose 4Bムチンを、0.1M Tri s-HCl、pH8.0に移した。樹脂を、0.1M酢酸ナトリウム、pH4.0、0.5M NaCl；およ び0.1M Tris-HCl、pH8.0、0.5M NaClで、交互に、３サイクル洗浄した。ゲルを 、10mlカラムに注ぎ、そして25mlの0.1M Tris-HCl、pH8.0、0.1M NaClで洗浄 した。EN235 Pichia培養上清を、４℃で一晩、0.1M Tris-HCl、pH7.4、0.1M NaC lに対して透析し、次いで、ムチン-Sepharoseカラム上にロードした。カラムを 、0.1M Tris-HCl、pH8.0、0.1M NaClで、OD280＝０になるまで洗浄した（約50ml ）。結合されたSCAタンパク質の溶出を、10mlの溶出液１（0.1Mクエン酸ナトリ ウム、pH4.0）、続いて、10mlの溶出液２（８M尿素、0.1M Tris-HCl、pH7.4）を 使用することによって行った。結合したSCAは溶出液２中に溶出した。 エンドグリコシダーゼ消化。ペプチド-N-グリコシダーゼＦおよびエンド-グリ コシダーゼＨを、Oxford GlycoSystems（Rosedale，NY）から入手し、そして添 付の製品文献に従って、使用した。 糖タンパク質染色。GlycoTrackTM炭水化物検出キット（カタログ番号K-050） をOxford GlycoSystems（Rosedale、NY）から購入し、そして製造業者の使用説 明書に従って使用した。 ConA Sepharoseへのグリコ-SCAの結合。ConA Sepharoseを、Pharmacia Biotec h（カタログ番号17-0440-03）から入手し、そして製造業者の使用説明書に従っ て使用した。結合緩衝液(20mM Tris-HCl、pH7.4、0.5M NaCl）中の１mlの樹脂を 、50μlの透析したEN235培養上清とともに、30分間、22℃でインキュベートした 。ビーズをマイクロ遠心分離によってペレット化し、そして上清を除去した。結 合したグリコ-SCAの溶出を、0.2M α-D-メチルマンノシドを含有する結合緩衝液 で、樹脂を洗浄することによって、行った。 SCA結合活性についてのELISA。イムノアッセイ手順を、Harlow，E．およびLan e，D.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess，Cold Spring Harbor，NY，（1988）からのプロトコルの改変を使用して行 った。直接的な結合アッセイを行い、そして用量応答曲線を構築した。ウシ下顎 部ムチン（100μlウェル当たり250ng）抗原を使用して、マイクロタイタープレ ートウェル（MaxiSorp、Nunc．VWR Scientific、Boston、MA）をコートした。EN 225または精製したCC49/218 SCAタンパク質を、１% BSAを含有するPBS中で連続 的に希釈し、そして22℃で１時間、コートしたウェルにおいてインキュベートし た。0.05% Tween 20を含有するPBS（PBS-T）で、プレートを洗浄した後、結合し たSCAを、二次抗体（マウス抗CC49/218）とともに１時間インキュベーションし 、 続いてPBS-Tで洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗マウスIgG抗 体とともに１時間インキュベートすることによって、検出した。（図10について 、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgGを使用した）。シグナル生 成を、HarlowおよびLane（597頁）において記載されるように、PNPPを使用して 行った。プレートを、Molecular Devices（Sunnyvale、CA）プレート読み取り器 を使用して、405nmで読み取った。 実施例２．他のSCAにおけるAsn結合グリコシル化配列の合成 実施例１において記載される方法を使用して、オリゴヌクレオチド特異的変異 誘発を用いて、それぞれ、図６〜８において示されるように、Kabatコンセンサ スVkI/218/VHIIISCA、C6.5/218 SCA、およびA33/218 SCAの同定されたループ領 域における、Asn結合グリコシル化コンセンサス配列を作製する（すなわち、（ １）２つのVL変化；（２）２つのVH変化；（３）１つのリンカー変化；（４）１ つのＣ末端変化；または（５）その組合わせ）。VkI/218/VHIIISCAおよびC6.5/2 18 SCAにおいて、Gavel，Y.およびvon Heijne，G.、Protein Engng．3:433-442 （1990）の編集によって推奨されるように、＋３位においてトリペプチド配列に 隣接するプロリン残基を、アラニンに変化した。KabatコンセンサスVkI/218/VHI IISCAおよびA33/218 SCAのアミノ酸割当ては、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、108および331頁、第５版、U.S．Dept．Health an d Human Services、Bethesda、MD（1991）に従い、ここである位置で割当てられ たアミノ酸残基は、その位置で最も一般に生じるアミノ酸である。野生型C6.5可 変ドメインのアミノ酸割当ては、Schier，R.ら、J．Mol．Biol．255:28-43（199 6）に従う。 実施例１の「材料および方法」の節において記載されるように、変異されたSC Aを、Pichia移入プラスミドpHIL-S1（Invitrogen Corp.）に、個々に連結し、そ してPichia pastorisに形質転換した。これらの手順についての詳細なプロトコ ルは、Invitrogen CorporationからのPichia発現キット使用説明書マニュアルカ タログ番号X1710-01（1994）において示される。SCA改変体を、これらの構築に おいて酵母シグナル配列の後ろに配置し、そして酵母形質転換体中に取込まれた SCAを、SCAタンパク質または糖タンパク質産物の分泌について試験する。発現の 評価を、SDS-PAGEゲルのクマシーブルー染色によって行う。さらなる試験が、実 施例１において記載されるように、グリコシル化SCAの発現を確認するためにな され得る。 実施例３．グリコ-CC49の精製 Pichia細胞を、発酵器から採集し、そして5000rpmで40分間、遠心分離した。 澄明化された培地を、回収し、そして0.22μmフィルターを通して濾過した。サ ンプルを、3500の分子量カットオフのメンブレンを用いて、１mS未満の最終伝導 率になるまで水に対して透析した。カチオン交換カラム（Poros-HS）を、pH6.15 の、15mM Tris-酢酸で平衡化した。サンプルを、pH6.2に調整し、そしてカラム 上にロードした。次いで、グリコ-CC49を、Tris-酢酸緩衝液pH7.4中の0.15M NaC lの塩濃度で溶出した。次いで、これを、0.15M NaCl、Tris-酢酸緩衝液pH7.4で 平衡化したPoros-HQカラムを通過させた。次いで、素通りした物質を、サイズ排 除カラム（Pharmacia、Superdex-75）上でプロセスした。25〜35kDaの分子量に 対応する画分を、回収した。 実施例４．PEG-ヒドラジドによる、二つの部位−１本鎖gCC49/2の部位特異的PEG 化 精製したgCC/2（EN279）を、Tris-HCl、pH７、0.1M NaCl中に２mg/mlに濃縮し 、次いで、PEGYLATION緩衝液（0.1M酢酸、pH5.5）中でサイズ排除カラム（Super dex-75）を通過させた。過ヨウ素酸ナトリウムを、最終濃度が10mMになるように 添加した。サンプルを、室温で、暗所において、１時間、酸化した。反応の終わ りに、グリセロールを、５%の最終濃度となるように添加し、そしてサンプルを 、サイズ排除カラム上にロードして、未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを除去した 。次いで、タンパク質を、２mg/mlに濃縮した。 同じ緩衝液中に溶解されたPEG-ヒドラジド（5000分子量）（Shearwater）を、 PEG：タンパク質＝100：１のモル比で、タンパク質に添加した。反応を、37℃で 、振盪しながら、2.5時間、進行させた。 PBS（リン酸緩衝化生理食塩水）中で作製されたホウ化水素ナトリウムを、10m Mの最終濃度となるように、反応混合物に添加した。次いで、10分間、室温で、 攪拌した。 次いで、反応産物を、SDS-ポリアクリルアミドゲルおよびサイズ排除クロマト グラフィー分析で分析した。反応混合物のSECクロマトグラフィー分析は、低分 子量のグリコシル化されていないピーク（これは、PEGYLATIONの前の唯一のピー クであった）に加えて、高分子量ピークの出現を示した（図11（ａ））。図11（ ｂ）および12は、PEGYLATION反応は炭水化物部分に特異的であり、そして炭水化 物を含有しない１本鎖抗原結合分子に影響しないことを示す。 実施例５．PEG-ヒドラジドによる、３つの部位−１本鎖gCC49/3の部位特異的PEG 化 精製したgCC/3（EN280）を、10mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH７中で、２mg/ml に濃縮した。PEGYLATION反応の直前に、1/10容量の1M酢酸ナトリウムpH5.5を添 加することによって、pHを5.5に調整した。次いで、酢酸緩衝液pH5.5中に調製さ れた新鮮な過ヨウ素酸ナトリウムを、最終濃度10mMに添加した。次いで、タンパ ク質を１時間、暗所において、室温で酸化した。反応の終わりに、サンプルをサ イズ排除カラムにロードして、未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを除去した。次い で、タンパク質を、2.5mg/mlに濃縮した。 タンパク質のモル数よりも140倍モル過剰で、同じ緩衝液中に作製されたPEG- ヒドラジド（5000分子量）（Shearwater）を、タンパク質に添加した。反応は、 2.5時間、振盪しながら、室温（25℃）で進行させた。 PBS中のホウ化水素ナトリウムを、反応混合液に10mMの最終濃度で添加し、そ して混合物を、10分間、室温で攪拌した。 反応産物を、サイズ排除カラムにおいて分画した。次いで、精製した産物を、 SDS-PAGEによって分析した（図13）。修飾されていないかまたはPEGで修飾され たかのいずれかであった、グリコシル化CC49/3のSDS-PAGE分析は、PEG修飾され た、グリコシル化CC49/3が、修飾されていない種よりも非常に高い分子量を有す ることを示す。このことは、グリコシル化CC49/3がまた、PEG化され得ることを 示す。 実施例６．グリコ-SCAおよびPEG-グリコ-SCAの循環寿命 Pichia pastoris株EN280から精製された60μgのグルコシル化SCA、または60μ gのPEG修飾されたこのグリコ-SCAを、ICR（CD-1）雌性マウス（Harlan約25g、７ 〜８週齢）に、０時間で静脈内に注射した。マウスを図14において示される時点 で採血した。血漿中の保持パーセントをELISA法によって定量した。PEG修飾され た結合体について、グリコ-CC49/218 SCAを、分子質量5,000のPEG-ヒドラジドに 結合した（プロトコルは、Zalipsky，S.ら、PCT WO 92/16555において記載され 、この開示は本明細書中に参考として援用される）。試験したPEG-グリコ-SCA結 合体における平均のPEG：SCAのモル比は、約４：１であった。 実施例７．SCAおよびPEG-SCAの血漿保持の薬物動態学 60μgのCC49/218 SCAタンパク質、または60μgのPEG修飾されたSCAタンパク質 を、ICR（CD-1）雌性マウス（Harlan約25g、７〜８週齢）に、０時間で静脈内に 注射した。マウスを、図15において示される時点で、採血した。血漿中の保持パ ーセントを、ELISA法によって定量した。PEG修飾された結合体について、CC49/2 18 SCAを、分子質量20,000のSC-PEGに結合した（プロトコルは、米国特許第5,12 2,614号において記載され、この開示は本明細書中に参考として援用される）。 試験したPEG-SCA結合体における平均のPEG：SCAのモル比は、約１：１であった 。 実施例８．グリコシル化およびPEG化CC49 SCAの親和定数（Kd）測定 ビオチン化CC49 SCAを使用して、HarlowおよびLaneによるように、競合ELISA 法を行い、親和定数（Kd）を測定した。結果を以下の表３において提供する。 非PEG化CC49SCA（ネイティブ-CC49）、ビオチン化CC49 SCA（Bio-CC49）、お よび三重部位グリコシル化CC49 SCA（ネイティブGC；EN280）は、全て、それぞ れ、3.6nM、6.2nM、および7.34nMの非常に類似のKd値を有する。三重部位グリコ -SCAのPEG化バージョンは、減少されたが、実質的なムチン結合親和性を示した 。SCA（EN280）当たり約３つのPEGポリマーを有するPIB調製物は、48.37nMのKd を有する。約４〜７のPEG/SCA（EN280）モル比を有するPIA調製物は、51.54のKd を示す。８を超えるPEG/SCA（EN280）モル比を有するZ919調製物は、341nMのKd を与える。 実施例９．Ｃ末端のＮ結合型グリコシル化配列の後ろに５残基の付加を有するSC A 本発明者らはすでに、第二のポリペプチドのＣ末端に近接する、その後ろにた だ１つのさらなる残基が続く単一のトリペプチドＮ結合型グリコシル化配列が、 十分なグリコシル化を与えることを確立した。SCAの約50%がグリコシル化される 。文献は、Ｃ末端のＮ結合型修飾が稀であることを示すので、本発明者らは、以 前に記載される方法（以下）を使用して、５つの後に続く残基の付加が、ただ１ つよりもむしろ、より効率的な全体のコアグリコシル化を促進するか否かを調査 した。この改変体についてのウエスタンブロットの結果（図16、EN292）は、SCA の90%以上が、見かけ上のコアグリコシル化で修飾され、高グリコシル化の証拠 を伴わないことを示す。このことは、Ｎ結合型コアグリコシル化を有するグリコ -SCAの生成の改善を提供する。この改変体について使用される遺伝子の配列は、 以下のようである。 Pichia株番号EN292 合計５つアミノ酸が、下線を付す最初のＮ結合型トリペプチドグリコシル化配列 に続く。修飾されていないCC49 SCAの最後の５つの残基を、太字で示す。 実施例10．Ｃ末端に近接する３つのタンデムなN結合型グリコシル化配列を有す るSCA 本発明者らはすでに、Ｃ末端に近接する三重配列改変体（２つのタンデムな部 位および１つの重複する部位を含む）が、優勢な高グリコシル化を伴って、ほぼ 完全な全体のグリコシル化を生成することを示した。本発明者らは、純粋な３つ のタンデムな部位バージョンが、同様な結果を生じるか否かを次に調査すること を望んだ。ウェスタンブロット（図16、EN293）において示されるように、３つ のタンデムな配列バージョンは、完全な修飾を生成し、これはもっぱら高グリコ シル化のカテゴリー内に存在する。これは、ウェスタンにより、以前の三重部位 バージョンよりも均一な産物であるようである。しかし、本発明者らの最初の結 果は、全体の発現が減少されることを示す。それゆえ、これは、発現が改善され 得る場合、三重配列アプローチにおける潜在的な改善であり得る。この改変体の 遺伝子配列は、実施例９におけるような表記法を伴って、以下に示される。 Pichia株番号EN293 実施例11．Ｃ末端に近接する２つの重複するグリコシル化配列を有するSCA 本発明者らはすでに、第二のポリペプチドのＣ末端に近接する２つのタンデム なＮ結合型トリペプチド配列を有するSCAが、２つの部位のコアグリコシル化お よび存在するいくつかの高グリコシル化の両方を伴う合計約70〜90%の修飾を生 成することを示した。さらに、小量の修飾されていないSCAが観察される。次に 、 本発明者らはここで、タンデムな配列ではなく重複するトリペプチド配列を有す る、Ｃ末端に近接する２つのトリペプチド配列バージョンを調査する。ウェスタ ンブロット（図16、EN294）において見られるように、この改変体は、修飾され ていないSCAを生成しなかったが、ウエスタンブロットについて使用されたSDS-P AGEゲルにおけるこれらの産物の分子量によって判断されるように、いくつかの 見かけ上の２つの部位のコア修飾を有する高グリコシル化されたSCAを、優勢に 生成した。この結果は、Pichiaにおける「高グリコシル化」の現象が、Ｃ末端か らのただ１つの残基に配置される、最小の重複する２つの部位の配列Asn-Asn-Th r-Thrによって効率的にPichiaにおいて誘導され得ることを示す。対照的に、類 似の単一配列バージョンは、相対的により少ない全体の修飾を示し、本質的に検 出可能な高グリコシル化を示さなかった。この改変体についての遺伝子配列は、 実施例９におけるような表記法を伴って、以下に示される。 Phichia株EN294 実施例12．リンカー領域において３つのＮ結合型グリコシル化配列を有するSCA 本発明者らは以前に、CC49/218 SCAの218リンカー中に操作された単一のＮ結 合型トリペプチド配列における効率の悪いグリコシル化の証拠を見出した。本発 明者らはさらに、218リンカーのSmaI部位に挿入される三重トリペプチド配列の グリコシル化を調査した。ウェスタンブロット（図17、EN290）は、修飾されて いないSCA、コア修飾されたSCA、および高グリコシル化されたSCAの不均一な混 合物が観察されることを示した。予備的なELISAは、ムチン結合活性の保持を確 認する。それゆえ、この結果は、活性なグリコ-SCAは、リンカーにおけるＮ結合 部位を有する、Pichiaから生成され得ることを示す。しかし、本発明者らのＣ末 端データは、全体により完全であるようである。この改変体の遺伝子配列は、以 下のようであり、SmaI部位で開かれる隣接する218リンカー配列を、太字で示す 。 Pichia株EN290 実施例13．リンカー領域において６つのＮ結合型グリコシル化配列を有するSCA 本発明者らはまた、218リンカーのSmaI部位に、６つのＮ結合型配列を挿入し た。ウェスタンブロットは、発現は不十分であったが、全体のグリコシル化は完 全であると思われる（ほとんどコアＩ部位であるが）ことを示した。それゆえ、 この改変体は、発現レベルが改善され得る場合、価値があり得る。さらにまた、 Ｃ末端バージョンは、それを用いて研究するのにより容易であり得るようである 。この改変体の遺伝子配列は、以下のようであり、SmaI部位で開かれる隣接する 218リンカー配列を、太字で示す。 Pichia株EN291 ELISA結果は、上記の実施例９〜13における改変体のそれぞれが、ムチン結合 特異性を維持することを示す。ウェスタンブロットのために使用されるクマシー 染色したSDS-PAGEゲルをまた、相対的な発現量について調べた。Pichiaベクター pHIL-S1を、この研究について以前に記載されるように使用した。 本発明は、本発明またはその任意の実施態様の精神および範囲から逸脱するこ となく、組成物、濃度、投与の態様、および条件の等価なパラメーターの広範な 範囲内で行われ得ることが、当業者によって理解される。 全ての文献（例えば、本明細書中に引用される科学文献、特許、および特許文 献）は、各個々の文献が、具体的におよび個々に、その全体が参考として援用さ れることが示されるのと同じ程度に、その全体が本明細書中に参考として援用さ れる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号 ６０／０６３，０７４ (32)優先日 平成９年10月27日(1997．10．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／０６７，３４１ (32)優先日 平成９年12月２日(1997．12．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ショー，ロバート ジー．エル. アメリカ合衆国 ニュージャージー 08817，エディソン，ブルックフォール ロード 28 (72)発明者 ウィトロー，マーク ディー. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94803, エル ソブラント，メイ ロード 3675 (72)発明者 リー，リーシュン エス. アメリカ合衆国 ニュージャージー 08550，プリンストン ジャンクション, バン ウィック ドライブ 22

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．グリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドであって、以下： （ａ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、第一のポリペ プチド； （ｂ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、第二のポリペ プチド；ならびに （ｃ）該第一のポリペプチド（ａ）および該第二のポリペプチド（ｂ）を連結 して、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにするペプチドリンカー を含み、 ここで、該抗原結合単鎖ポリペプチドは、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｙａａを含む少な くとも１つのトリペプチドＡｓｎ結合型グリコシル化配列を有し、ここでＸａａ はプロリン以外のアミノ酸であり、Ｙａａはトレオニンまたはセリンであり、該 トリペプチドグリコシル化配列は、 （ｉ）該軽鎖可変領域のアミノ酸１１位、１２位、１３位、１４位、または１ ５位； （ｉｉ）該軽鎖可変領域のアミノ酸７７位、７８位、または７９位； （ｉｉｉ）該重鎖可変領域のアミノ酸１１位、１２位、１３位、１４位、また は１５位； （ｉｖ）該重鎖可変領域のアミノ酸８２Ｂ位、８２Ｃ位、または８３位； （ｖ）該ペプチドリンカーの任意のアミノ酸位置； （ｖｉ）該第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端の近傍；および （ｖｉｉ）それらの組合わせ、 からなる群から選択される位置に存在する該Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合し 得、そして ここで該グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドは抗原と結合し得る、 ポリペプチド。 ２．前記Ａｓｎ残基が２つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデム な少なくとも２つの前記トリペプチドグリコシル化配列を有する、請求項１に記 載のポリペプチド。 ３．タンデムな３つの前記トリペプチドグリコシル化配列を有する、請求項２に 記載のポリペプチド。 ４．前記Ａｓｎ残基が隣接するように、少なくとも１セットの２つの重複する前 記トリペプチドグリコシル化配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。 ５．（Ａ）前記Ａｓｎ残基が２つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タ ンデムな少なくとも２つの前記トリペプチドグリコシル化配列（Ａ）、および（ Ｂ）該Ａｓｎ残基が隣接するように、少なくとも１セットの２つの重複する該ト リペプチドグリコシル化配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。 ６．少なくとも２セットの２つのタンデムな前記トリペプチドグリコシル化配列 、および少なくとも２セットの２つの重複する該トリペプチドグリコシル化配列 を有する、請求項５に記載のポリペプチド。 ７．前記トリペプチドグリコシル化配列が、以下 （ｉ’）前記軽鎖可変領域のアミノ酸１２位； （ｉｉ’）前記軽鎖可変領域のアミノ酸７７位； （ｉｉｉ’）前記重鎖可変領域のアミノ酸１３位； （ｉｖ’）前記重鎖可変領域のアミノ酸８２Ｂ位； （ｖ’）前記ペプチドリンカーのアミノ酸２位； （ｖｉ’）前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端の近傍；および （ｖｉｉ’）それらの組み合わせ からなる群から選択される位置に位置する前記Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合 し得る、請求項１に記載のポリペプチド。 ８．前記第一のポリペプチド（ａ）が抗体軽鎖の可変領域の抗体結合部分を含み 、そして前記第二のポリペプチド（ｂ）が抗体重鎖の可変領域の抗原結合部分を 含む、請求項１に記載のポリペプチド。 ９．前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端が、該第二のポリペプチド（ｂ）の ネイティブなＣ末端である、請求項１に記載のポリペプチド。 １０．前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端は、該第二のポリペプチドの残り のＮ末端アミノ酸残基が、前記グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドが 抗原を結合し得るのに十分であるように、１または複数のアミノ酸残基の欠失を 含む、請求項１に記載のポリペプチド。 １１．前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端は、前記グリコシル化された抗原 結合単鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るように、１または複数のアミノ酸残基 の付加を含む、請求項１に記載のポリペプチド。 １２．前記グリコシル化配列の前記Ａｓｎ残基が前記第二のポリペプチド（ｂ） のＣ末端の近傍に位置し、そして該グリコシル化配列には少なくとも１つのアミ ノ酸残基が続く、請求項９、１０、または１１に記載のポリペプチド。 １３．前記グリコシル化配列には５つのアミノ酸残基が続く、請求項１２に記載 のポリペプチド。 １４．前記トリペプチドグリコシル化配列の前記Ａｓｎ残基が、ポリアルキレン オキシド結合体化され得る炭水化物部分に結合される、請求項１に記載のポリペ プチド。 １５．前記炭水化物部分が、１または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒 素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子に結合体化されてい る、請求項１４に記載のポリペプチド。 １６．前記炭水化物部分が、キャリアに結合体化されており、該キャリアが、該 キャリアに結合した、１または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キ レート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子を有する、請求項１４に記 載のポリペプチド。 １７．前記炭水化物部分がポリアルキレンオキシド部分と結合体化されている、 請求項１４に記載のポリペプチド。 １８．前記ポリアルキレンオキシド部分が、１または複数の、ペプチド、脂質、 核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子と結 合体化されている、請求項１７に記載のポリペプチド。 １９．前記ポリアルキレンオキシド部分が、キャリアに結合体化されており、該 キャリアが、該キャリアに結合した、１または複数の、ペプチド、脂質、核酸、 薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子を有する、 請求項１７に記載のポリペプチド。 ２０．グリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオ チドであって、以下 （ａ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、第一のポリペ プチド； （ｂ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む、第二のポリペ プチド；ならびに （ｃ）該第一のポリペプチド（ａ）および該第二のポリペプチド（ｂ）を連結 して、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにするペプチドリンカー を含み、 ここで、該抗原結合単鎖ポリペプチドが、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｙａａを含む、少 なくとも１つのトリペプチドＡｓｎ結合型グリコシル化配列を有し、ここで、Ｘ ａａはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてＹａａはトレオニンまたはセリン であり、該トリペプチドグリコシル化配列は、 （ｉ）該軽鎖可変領域のアミノ酸１１位、１２位、１３位、１４位、または１ ５位； （ｉｉ）該軽鎖可変領域のアミノ酸７７位、７８位、または７９位； （ｉｉｉ）該重鎖可変領域のアミノ酸１１位、１２位、１３位、１４位、また は１５位； （ｉｖ）該重鎖可変領域のアミノ酸８２Ｂ位、８２Ｃ位、または８３位； （ｖ）該ペプチドリンカーの任意のアミノ酸位置； （ｖｉ）該第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端の近傍；および （ｖｉｉ）それらの組合せ、 からなる群から選択される位置に位置する該Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合し 得、そして ここで、該グリコシル化される抗原結合単鎖ポリペプチドは抗原に結合し得る 、ポリヌクレオチド。 ２１．前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記Ａｓｎ残基が２つのアミノ酸残基 によって隔てられるように、タンデムな少なくとも２つの前記トリペプチドグリ コシル化配列を有する、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。 ２２．前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、タンデムな３つの前記トリペプチドグ リコシル化配列を有する、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。 ２３．前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記Ａｓｎ残基が隣接するように、少 なくとも１セットの２つの重複する前記トリペプチドグリコシル化配列を有する 、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。 ２４．前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、（Ａ）前記Ａｓｎ残基が２つのアミノ 酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも２つの前記トリペプチ ドグリコシル化配列、および（Ｂ）該Ａｓｎ残基が隣接するように、少なくとも １セットの２つの重複する該トリペプチドグリコシル化配列を有する、請求項２ ０に記載のポリヌクレオチド。 ２５．前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、少なくとも２セットの２つのタンデム な前記トリペプチドグリコシル化配列、および少なくとも２セットの２つの重複 する該トリペプチドグリコシル化配列を有する、請求項２４に記載のポリヌクレ オチド。 ２６．前記トリペプチドグリコシル化配列が、 （ｉ’）前記軽鎖可変領域のアミノ酸１２位； （ｉｉ’）前記軽鎖可変領域のアミノ酸７７位； （ｉｉｉ’）前記重鎖可変領域のアミノ酸１３位； （ｉｖ’）前記重鎖可変領域のアミノ酸８２Ｂ位； （ｖ’）前記ペプチドリンカーのアミノ酸２位； （ｖｉ’）前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端の近傍；および （ｖｉｉ’）それらの組合せ、 からなる群から選択される位置に位置する前記Ａｓｎ残基で炭水化物部分に結合 し得る、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。 ２７．前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端が、該第二のポリペプチド（ｂ） のネイティブなＣ末端である、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。 ２８．前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端は、該第二のポリペプチドの残り のＮ末端アミノ酸残基が、前記グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドが 抗原を結合し得るのに十分であるように、１または複数のアミノ酸残基の欠失を 含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。 ２９．前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端は、前記グリコシル化された抗原 結合単鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るように、１または複数のアミノ酸残基 の付加を含む、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。 ３０．前記グリコシル化配列の前記Ａｓｎ残基が前記第二のポリペプチド（ｂ） のＣ末端の近傍に位置し、そして該グリコシル化配列には少なくとも１つのアミ ノ酸残基が続く、請求項２７、２８、または２９に記載のポリヌクレオチド。 ３１．前記グリコシル化配列には５つのアミノ酸残基が続く、請求項３０に記載 のポリヌクレオチド。 ３２．ＤＮＡである、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。 ３３．ＲＮＡである、請求項２０に記載のポリヌクレオチド。 ３４．請求項３２に記載のＤＮＡ配列を含む、複製可能なクローニングまたは発 現ビヒクル。 ３５．プラスミドである、請求項３４に記載のビヒクル。 ３６．請求項３２に記載のＤＮＡで形質転換した、宿主細胞。 ３７．細菌細胞、酵母細胞もしくは他の真菌細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細 胞株である、請求項３６に記載の宿主細胞。 ３８．Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項３７に記載の宿主細胞。 ３９．グリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドを産生する方法であって、 以下の工程： （ａ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプ チドをコードする第一のポリヌクレオチドを提供する工程； （ｂ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプ チドをコードする第二のポリヌクレオチドを提供する工程；ならびに （ｃ）該第一のポリヌクレオチド（ａ）および該第二のポリヌクレオチド（ｂ ）を、ペプチドリンカーをコードする第三のポリヌクレオチドと連結して、抗原 結合部位を有する単鎖ポリペプチドをコードする第四のポリヌクレオチドにする 工程、 を包含し、 ここで、該抗原結合単鎖ポリペプチドは、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｙａａを含む少な くとも１つのトリペプチドＡｓｎ結合型グリコシル化配列を有し、ここでＸａａ はプロリン以外のアミノ酸であり、Ｙａａはトレオニンまたはセリンであり、該 トリペプチドグリコシル化配列は、 （ｉ）該軽鎖可変領域のアミノ酸１１位、１２位、１３位、１４位、または１ ５位； （ｉｉ）該軽鎖可変領域のアミノ酸７７位、７８位または７９位； （ｉｉｉ）該重鎖可変領域のアミノ酸１１位、１２位、１３位、１４位、また は１５位； （ｉｖ）該重鎖可変領域のアミノ酸８２Ｂ位、８２Ｃ位、または８３位； （ｖ）該ペプチドリンカーの任意のアミノ酸位置； （ｖｉ）該第二のポリペプチド（ｂ）Ｃ末端の近傍；および （ｖｉｉ）それらの組合わせ、 からなる群から選択される位置に位置する該Ａｓｎ残基で炭水化物部分と結合し 得、そして ここで、該グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドは抗原と結合し得、 ならびに （ｄ）宿主細胞中で工程（ｃ）の該抗原結合単鎖ポリペプチドを発現させ、そ れによってグリコシル化し得る抗原結合単鎖ポリペプチドを産生する工程、 を包含する、方法。 ４０．前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記Ａｓｎ残基が２つのアミノ酸残基 によって隔てられるように、タンデムな少なくとも２つの前記トリペプチドグリ コシル化配列を有する、請求項３９に記載の方法。 ４１．前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記Ａｓｎ残基が隣接するように、少 なくとも１セットの２つの重複する前記トリペプチドグリコシル化配列を有する 、請求項３９に記載の方法。 ４２．前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、（Ａ）前記Ａｓｎ残基が２つのアミノ 酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも２つの前記トリペプチ ドグリコシル化配列、および（Ｂ）該Ａｓｎ残基が隣接するように、少なくとも １セットの２つの重複する該トリペプチドグリコシル化配列を有する、請求項３ ９に記載の方法。 ４３．前記トリペプチドグリコシル化配列が、以下 （ｉ’）前記軽鎖可変領域のアミノ酸１２位； （ｉｉ’）前記軽鎖可変領域のアミノ酸７７位； （ｉｉｉ’）前記重鎖可変領域のアミノ酸１３位； （ｉｖ’）前記重鎖可変領域のアミノ酸８２Ｂ位； （ｖ’）前記ペプチドリンカーのアミノ酸２位； （ｖｉ’）前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端の近傍；および （ｖｉｉ’）それらの組み合わせ からなる群から選択される位置に位置する前記Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合 し得る、請求項３９に記載の方法。 ４４．前記宿主細胞がグリコシル化を触媒し得る、請求項３９に記載の方法。 ４５．前記宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞もしくは他の真菌細胞、昆虫細胞、 または哺乳動物細胞株である、請求項４４に記載の方法。 ４６． 前記宿主細胞が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項４５ に記載の方法。 ４７．第一のポリペプチド（ａ）をコードする前記第一のポリヌクレオチドが、 抗体の軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含み、そして第二のポリペプチド（ｂ） をコードする前記第二のポリヌクレオチドが、抗体の重鎖の可変領域の抗原結合 部分を含む、請求項３９に記載の方法。 ４８．前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端が該第二のペプチド（ｂ）のネイ ティブなＣ末端である、請求項３９に記載の方法。 ４９．前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端は、該第二のポリペプチドの残り のＮ末端アミノ酸残基が、前記グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドが 抗原を結合し得るのに十分であるように、１または複数のアミノ酸残基の欠失を 含む、請求項３９に記載の方法。 ５０．前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端が、前記グリコシル化された抗原 結合単鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るように、１または複数のアミノ酸残基 の付加を含む、請求項３９に記載の方法。 ５１．２つ以上の抗原結合単鎖ポリペプチドを含む多価抗原結合単鎖タンパク質 であって、各抗原結合単鎖ポリペプチドは以下： （ａ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第一のポリペプ チド； （ｂ）抗体の重鎖または軽鎖の可変領域の抗原結合部分を含む第二のポリペプ チド；ならびに （ｃ）該第一のポリペプチド（ａ）および該第二のポリペプチド（ｂ）を連結 して、抗原結合部位を有する単鎖ポリペプチドにするペプチドリンカー を含み、 ここで、少なくとも１つの該抗原結合単鎖ポリペプチドは、Ａｓｎ−Ｘａａ− Ｙａａを含む少なくとも１つのトリペプチドＡｓｎ結合型グリコシル化配列を有 し、ここで、Ｘａａはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてＹａａはトレオニ ンまたはセリンであり、該トリペプチドグリコシル化配列は、 （ｉ）該軽鎖可変領域のアミノ酸１１位、１２位、１３位、１４位、または１ ５位； （ｉｉ）該軽鎖可変領域のアミノ酸７７位、７８位、または７９位； （ｉｉｉ）該重鎖可変領域のアミノ酸１１位、１２位、１３位、１４位、また は１５位； （ｉｖ）該重鎖可変領域のアミノ酸８２Ｂ位、８２Ｃ位、または８３位； （ｖ）該ペプチドリンカーの任意のアミノ酸位置； （ｖｉ）該第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端の近傍；および （ｖｉｉ）それらの組合せ、 からなる群から選択される位置に位置する該Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合し 得、そして ここで、該グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドは抗原を結合し得る 、多価タンパク質。 ５２．少なくとも１つの前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記Ａｓｎ残基が２ つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも２つの前記 トリペプチドグリコシル化配列を有する、請求項５１に記載の多価タンパク質。 ５３．少なくとも１つの前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、前記Ａｓｎ残基が隣 接するように、少なくとも１セットの２つの重複する前記トリペプチドグリコシ ル化配列を有する、請求項５１に記載の多価タンパク質。 ５４．少なくとも１つの前記抗原結合単鎖ポリペプチドが、（Ａ）前記Ａｓｎ残 基が２つのアミノ酸残基によって隔てられるように、タンデムな少なくとも２つ の前記トリペプチドグリコシル化配列、および（Ｂ）該Ａｓｎ残基が隣接するよ うに、少なくとも１セットの２つの重複する該トリペプチドグリコシル化配列を 有する、請求項５１に記載の多価タンパク質。 ５５．前記トリペプチドグリコシル化配列が、 （ｉ’）前記軽鎖可変領域のアミノ酸１２位； （ｉｉ’）前記軽鎖可変領域のアミノ酸７７位； （ｉｉｉ’）前記重鎖可変領域のアミノ酸１３位； （ｉｖ’）前記重鎖可変領域のアミノ酸８２Ｂ位； （ｖ’）前記ペプチドリンカーのアミノ酸２位； （ｖｉ’）前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端の近傍；および （ｖｉｉ’）それらの組合せ、 からなる群から選択される位置に位置する前記Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合 し得る、請求項５１に記載の多価タンパク質。 ５６．前記第一のポリペプチド（ａ）が抗体軽鎖の可変領域の抗体結合部分を含 み、そして前記第二のポリペプチド（ｂ）が抗体重鎖の可変領域の抗原結合部分 を含む、請求項５１に記載の多価タンパク質。 ５７．少なくとも１つの前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端が該第二のポリ ペプチド（ｂ）のネイティブなＣ末端である、請求項５１に記載の多価タンパク 質。 ５８．少なくとも１つの前記第二のポリペプチド（ｂ）のＣ末端は、該第二のポ リペプチドの残りのＮ末端アミノ酸残基が、前記グリコシル化された抗原結合単 鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るのに十分であるように、１または複数のアミ ノ酸残基の欠失を含む、請求項５１に記載の多価タンパク質。 ５９．少なくとも１つの前記第二のポリペプチドのＣ末端は、前記グリコシル化 された抗原結合単鎖ポリペプチドが抗原を結合し得るように、１または複数のア ミノ酸残基の付加を含む、請求項５１に記載の多価タンパク質。 ６０．少なくとも１つの前記トリペプチドグリコシル化された配列の前記Ａｓｎ 残基が、ポリアルキレンオキシド結合体化し得る炭水化物部分に結合される、請 求項５１に記載の多価タンパク質。 ６１．前記炭水化物部分が１または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素 、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子に結合体化されている 、請求項６０に記載の多価タンパク質。 ６２．前記炭水化物部分が、キャリアに結合体化されており、該キャリアが、該 キャリアに結合した、１または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、キ レート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子を有する、請求項６０に記 載の多価タンパク質。 ６３．前記炭水化物部分がポリアルキレンオキシド部分と結合体化されている、 請求項６０に記載の多価タンパク質。 ６４．前記ポリアルキレンオキシド部分が、１または複数の、ペプチド、脂質、 核酸、薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子と結 合体化されている、請求項６０に記載の多価タンパク質。 ６５．前記ポリアルキレンオキシド部分が、キャリアに結合体化されており、該 キャリアが、該キャリアに結合した、１または複数の、ペプチド、脂質、核酸、 薬物、毒素、キレート剤、ホウ素付加物、または検出可能な標識分子を有する、 請求項６０に記載の多価タンパク質。 ６６．サンプル中に存在すると疑われる抗原を検出する方法であって、以下の工 程： （ａ）該サンプルと請求項１０に記載のポリペプチドとを接触させる工程であ って、ここで前記炭水化物部分が、１または複数の検出可能な標識分子と結合体 化されているか、またはキャリアと結合体化されており、該キャリアは、該キャ リアに結合した１または複数の検出可能な標識分子を有する、工程；ならびに （ｂ）前記グリコシル化された抗原結合単鎖ポリペプチドまたはタンパク質が 該抗原と結合したかどうかを検出する工程、 を包含する、方法。 ６７．動物の内部構造を画像化する方法であって、請求項１０に記載のポリペプ チドの有効量を該動物に投与する工程であって、ここで、前記炭水化物部分が、 １または複数の検出可能な標識分子またはキレート剤分子と結合体化されている か、またはキャリアと結合体化されており、該キャリアは該キャリアに結合した １または複数の検出可能な標識分子またはキレート剤分子を有する、工程；およ び該動物に関連する検出可能な放射線を測定する工程を包含する、方法。 ６８．前記動物がヒトを含む、請求項６７に記載の方法。 ６９．標的化された疾患を処置するための方法であって、請求項１０に記載のポ リペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアビヒクルを含む組成物の有効量を 投与する工程であって、ここで該炭水化物部分が、１たは複数の、ペプチド、脂 質、核酸、薬物、毒素、ホウ素付加物、または放射性同位体分子と結合体化され ているか、またはキャリアに結合体化されており、該キャリアが、該キャリアに 結合した、１または複数の、ペプチド、脂質、核酸、薬物、毒素、ホウ素付加物 、または放射性同位体分子を有する、工程、 を包含する、方法。 ７０．増加したグリコシル化を有するポリペプチドを産生する方法であって、以 下： （ａ）少なくとも２つのトリペプチドＡｓｎ結合型グリコシル化配列に該ポリ ペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する工程であって、ここで各該ト リペプチドグリコシル化配列は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｙａａを含み、ここでＸａａ はプロリン以外のアミノ酸であり、そしてＹａａはトレオニンまたはセリンであ り、そしてここで該トリペプチドグリコシル化配列は、該Ａｓｎ残基が２つのア ミノ酸残基によって隔てられるようにタンデムである、工程、および （ｂ）該Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞中で該ポリヌクレオ チドを発現させる工程、 を包含する、方法。 ７１．以下の工程を包含するプロセスによって産生される増加したグリコシル化 を有するポリペプチド： （ａ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも１セット の２つのトリペプチドＡｓｎ結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、 ここで各該トリペプチドグリコシル化配列は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｙａａを含み、 ここでＸａａはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてＹａａはトレオニンまた はセリンであり、そしてここで該トリペプチドグリコシル化配列は、該Ａｓｎ残 基が２つのアミノ酸残基を離すようにタンデムである、工程；および （ｂ）該Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞中で該ポリヌクレオ チドを発現させる工程。 ７２．増加したグリコシル化を有するポリペプチドを産生する方法であって、以 下の工程： （ａ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも１セット の２つのトリペプチドＡｓｎ結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、 ここで、各該トリペプチドグリコシル化配列は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｙａａを含み 、ここでＸａａはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてＹａａはトレオニンま たはセリンであり、そしてここで該２つのトリペプチドグリコシル化配列は、該 Ａ ｓｎ残基が隣接するように重複する、工程；および （ｂ）該Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞中で該ポリヌクレオ チドを発現させる工程、 を包含する、方法。 ７３．以下の工程を包含するプロセスによって産生される増加したグリコシル化 を有するポリペプチド： （ａ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも１セット の２つのトリペプチドＡｓｎ結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、 ここで各該トリペプチドグリコシル化配列は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｙａａを含み、 ここでＸａａはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてＹａａはトレオニンまた はセリンであり、そしてここで該２つのトリペプチドグリコシル化配列は、該Ａ ｓｎ残基が隣接するように重複する、工程；および （ｂ）該Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞中で該ポリヌクレオ チドを発現させる工程。 ７４．増加したグリコシル化を有するポリペプチドを産生する方法であって、以 下の工程： （ａ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも２つのト リペプチドＡｓｎ結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで、各 該トリペプチドグリコシル化配列は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｙａａを含み、ここでＸ ａａはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてＹａａはトレオニンまたはセリン であり、そしてここで該トリペプチドグリコシル化配列は、該Ａｓｎ残基が２つ のアミノ酸残基によって隔てられるようにタンデムである、工程； （ｂ）該ポリヌクレオチドに、少なくとも１セットの２つのトリペプチドＡｓ ｎ結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで該２つのトリペプチ ドグリコシル化配列が、該Ａｓｎ残基が隣接するように重複する、工程；および （ｃ）該Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞中で該ポリヌクレオ チドを発現させる工程、 を包含する、方法。 ７５．以下の工程を包含するプロセスによって産生される増加したグリコシル化 を有するポリペプチド： （ａ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも２つのト リペプチドＡｓｎ結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで、各 該トリペプチドグリコシル化配列は、Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｙａａを含み、ここでＸ ａａはプロリン以外のアミノ酸であり、そしてＹａａはトレオニンまたはセリン であり、そしてここで該トリペプチドグリコシル化配列は、該Ａｓｎ残基が２つ のアミノ酸残基によって隔てられるようにタンデムである、工程； （ｂ）該ポリヌクレオチドに、少なくとも１セットの２つのトリペプチドＡｓ ｎ結合型グリコシル化配列を提供する工程であって、ここで該２つのトリペプチ ドグリコシル化配列は、該Ａｓｎ残基が隣接するように重複する、工程；および （ｃ）該Ａｓｎ残基で炭水化物部分を結合し得る宿主細胞中で該ポリヌクレオ チドを発現させる工程。
JP54735198A 1997-04-30 1998-04-30 グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用 Expired - Lifetime JP4187277B2 (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4444997P 1997-04-30 1997-04-30
US5047297P 1997-06-23 1997-06-23
US6307497P 1997-10-27 1997-10-27
US6734197P 1997-12-02 1997-12-02
US60/050,472 1997-12-02
US60/044,449 1997-12-02
US60/063,074 1997-12-02
US60/067,341 1997-12-02
PCT/US1998/008662 WO1998049198A1 (en) 1997-04-30 1998-04-30 Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2002516610A true JP2002516610A (ja) 2002-06-04
JP2002516610A5 JP2002516610A5 (ja) 2005-12-02
JP4187277B2 JP4187277B2 (ja) 2008-11-26

Family

ID=27488916

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP54735198A Expired - Lifetime JP4187277B2 (ja) 1997-04-30 1998-04-30 グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用
JP54734798A Pending JP2002505574A (ja) 1997-04-30 1998-04-30 ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド
JP2008008563A Withdrawn JP2008115193A (ja) 1997-04-30 2008-01-17 ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド
JP2009281051A Withdrawn JP2010051331A (ja) 1997-04-30 2009-12-10 ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP54734798A Pending JP2002505574A (ja) 1997-04-30 1998-04-30 ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド
JP2008008563A Withdrawn JP2008115193A (ja) 1997-04-30 2008-01-17 ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド
JP2009281051A Withdrawn JP2010051331A (ja) 1997-04-30 2009-12-10 ポリアルキレンオキシド修飾された単鎖ポリペプチド

Country Status (6)

Country Link
US (8) US6323322B1 (ja)
EP (2) EP0979102A4 (ja)
JP (4) JP4187277B2 (ja)
AU (2) AU7266698A (ja)
CA (2) CA2288994C (ja)
WO (2) WO1998048837A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008528002A (ja) * 2005-01-25 2008-07-31 セル セラピューティクス インコーポレーテッド 改善された生体内半減期を有する生物学的に活性なタンパク質

Families Citing this family (363)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2288994C (en) 1997-04-30 2011-07-05 Enzon, Inc. Polyalkylene oxide-modified single chain polypeptides
US20040009166A1 (en) * 1997-04-30 2004-01-15 Filpula David R. Single chain antigen-binding polypeptides for polymer conjugation
US6333396B1 (en) 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
AU768295B2 (en) * 1998-11-03 2003-12-04 Centocor Inc. Modified antibodies and antibody fragments with increased duration of activity
US6610286B2 (en) 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
US7122632B2 (en) 1999-12-23 2006-10-17 Zymogenetics, Inc. Soluble Interleukin-20 receptor
SK11672002A3 (sk) 2000-01-10 2002-12-03 Maxygen Holdings Ltd. Polypeptidový konjugát, spôsob jeho výroby, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom a jeho použitie
JP2003521930A (ja) 2000-02-11 2003-07-22 マキシゲン・エイピーエス 第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子様分子
US20030027207A1 (en) * 2000-02-29 2003-02-06 Filpula David Ray Anti-platelet binding proteins and polymer conjugates containing the same
US6410246B1 (en) * 2000-06-23 2002-06-25 Genetastix Corporation Highly diverse library of yeast expression vectors
US6410271B1 (en) * 2000-06-23 2002-06-25 Genetastix Corporation Generation of highly diverse library of expression vectors via homologous recombination in yeast
CZ2003678A3 (cs) * 2000-09-08 2004-03-17 Gryphon Therapeutics, Inc. Syntetické proteiny stimulující erytropoézu
US7118737B2 (en) * 2000-09-08 2006-10-10 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Polymer-modified synthetic proteins
US8110218B2 (en) * 2000-11-30 2012-02-07 The Research Foundation Of State University Of New York Compositions and methods for less immunogenic protein-lipid complexes
AU2002223350A1 (en) * 2000-12-01 2002-06-11 Eleanor N. Fish Cytokine receptor binding peptides
US6979556B2 (en) 2000-12-14 2005-12-27 Genentech, Inc. Separate-cistron contructs for secretion of aglycosylated antibodies from prokaryotes
US7195923B2 (en) * 2001-01-31 2007-03-27 Scripps Laboratories, Inc. Ratiometric determination of glycated protein
EP2080771A3 (en) 2001-02-27 2010-01-06 Maxygen Aps New interferon beta-like molecules
KR100968664B1 (ko) 2001-08-27 2010-07-06 제넨테크, 인크. 항체 발현 및 조립을 위한 시스템
US7795210B2 (en) * 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US8008252B2 (en) 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
WO2003051384A1 (en) 2001-12-17 2003-06-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating cervical cancer
WO2003062278A1 (en) 2002-01-25 2003-07-31 G2 Therapies Ltd MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST EXTRACELLULAR LOOPS OF C5aR
WO2004000366A1 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Novo Nordisk Health Care Ag Pegylated factor vii glycoforms
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US20050026866A1 (en) * 2002-08-02 2005-02-03 Pawelek John M. Agents and methods for treatment of disease by oligosaccharide targeting agents
US20040067532A1 (en) 2002-08-12 2004-04-08 Genetastix Corporation High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody
AU2003262845A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Millipore Corporation Compositions of solution for sequencing reaction clean-up
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8034900B2 (en) 2002-12-30 2011-10-11 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Water-soluble thioester and selenoester compounds and methods for making and using the same
US20040229793A1 (en) * 2003-02-05 2004-11-18 Balasubramanian Sathyamangalam V. Compositions and methods for less immunogenic protein formulations
US7351688B2 (en) * 2003-02-05 2008-04-01 The Research Foundation Of State University Of New York Compositions and methods for less immunogenic protein formulations
JP2006523211A (ja) 2003-03-14 2006-10-12 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 分岐水溶性ポリマーとその複合物
EP1615945B1 (en) 2003-04-09 2011-09-28 BioGeneriX AG Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
CA2524936A1 (en) * 2003-05-09 2004-12-02 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of human growth hormone glycosylation mutants
CA2529819A1 (en) * 2003-06-30 2004-09-23 Domantis Limited Pegylated single domain antibodies
US9005625B2 (en) * 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
US20050069578A1 (en) * 2003-08-05 2005-03-31 Balasubramanian Sathyamangalam V. Reconstitution medium for protein and peptide formulations
US20050055024A1 (en) * 2003-09-08 2005-03-10 James Anthony H. Orthopaedic implant and screw assembly
DE602004029173D1 (de) 2003-10-10 2010-10-28 Novo Nordisk As Il-21-derivate
EP2641611A3 (en) 2003-10-17 2013-12-18 Novo Nordisk A/S Combination therapy
WO2005052000A2 (en) * 2003-11-21 2005-06-09 Zymogenetics, Inc. Anti-il-20 antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
US8633157B2 (en) 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US7956032B2 (en) 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
AU2004296376B2 (en) 2003-12-05 2010-03-04 Bristol-Myers Squibb Company Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors
US20080220049A1 (en) * 2003-12-05 2008-09-11 Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company Compositions and methods for intraocular delivery of fibronectin scaffold domain proteins
EP1765853B1 (en) 2004-01-08 2015-10-28 ratiopharm GmbH O-linked glycosylation of G-CSF peptides
GB2429207A (en) 2004-02-02 2007-02-21 Ambrx Inc Modified human interferon polypeptides and their uses
JP2008503217A (ja) 2004-06-18 2008-02-07 アンブレツクス・インコーポレイテツド 新規抗原結合ポリペプチド及びそれらの使用
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
US20090292110A1 (en) * 2004-07-23 2009-11-26 Defrees Shawn Enzymatic modification of glycopeptides
US20060045866A1 (en) * 2004-09-01 2006-03-02 Chris Chappelow Novel high purity and high molecular weight mPEG alcohol compositions
US8268967B2 (en) 2004-09-10 2012-09-18 Novo Nordisk A/S Glycopegylated interferon α
EP3061461A1 (en) 2004-10-29 2016-08-31 ratiopharm GmbH Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
MX2007007587A (es) 2004-12-22 2007-12-11 Ambrx Inc Formulaciones de la hormona del crecimiento humano que comprenden un aminoacido codificado de manera no natural.
WO2006073846A2 (en) 2004-12-22 2006-07-13 Ambrx, Inc. Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone
CN101087875B (zh) 2004-12-22 2012-08-22 Ambrx公司 氨酰基-tRNA合成酶的组合物及其用途
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
WO2006074467A2 (en) 2005-01-10 2006-07-13 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006097682A1 (en) * 2005-03-18 2006-09-21 Ucl Business Plc Mechano growth factor peptides and their use
WO2006102659A2 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Nektar Therapeutics Al, Corporation CONJUGATES OF AN hGH MOIETY AND A POLYMER
JP2008534640A (ja) 2005-04-05 2008-08-28 イステイチユート・デイ・リチエルケ・デイ・ビオロジア・モレコラーレ・ピ・アンジエレツテイ・エツセ・ピー・アー タンパク質の機能部位またはエピトープの遮蔽方法
EP1871795A4 (en) 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag COMPOSITIONS AND METHOD FOR PRODUCING GLYCOSYLATION MUTANTS OF A PROTEASE-RESISTANT HUMAN GROWTH HORMONE
WO2006127910A2 (en) 2005-05-25 2006-11-30 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin formulations
US20110003744A1 (en) * 2005-05-25 2011-01-06 Novo Nordisk A/S Glycopegylated Erythropoietin Formulations
EP1891231A4 (en) 2005-05-25 2011-06-22 Novo Nordisk As GLYCOPEGYLATED FACTOR IX
CA2609205A1 (en) 2005-06-03 2006-12-14 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
US8028453B2 (en) * 2005-06-16 2011-10-04 Hold That Thought, Inc. Apparatus and methods for displaying a card
ES2553160T3 (es) 2005-06-17 2015-12-04 Novo Nordisk Health Care Ag Reducción y derivatización selectivas de proteínas Factor VII transformadas por ingeniería que comprenden al menos una cisteína no nativa
JP2008543943A (ja) * 2005-06-20 2008-12-04 ペプゲン コーポレイション ヒトインターフェロンアルファ類似体とインターフェロンタウの低毒性長期循環性キメラ
US7695710B2 (en) * 2005-06-20 2010-04-13 Pepgen Corporation Antitumor and antiviral combination therapies using low-toxicity, long-circulating human interferon-alpha analogs
WO2007002886A2 (en) * 2005-06-29 2007-01-04 The Research Foundation Of State University Of New York Compositions and methods for less immunogenic pr0tein-lip1d complexes
WO2007021822A2 (en) * 2005-08-09 2007-02-22 The Research Foundation Of State Of University Of New York At Buffalo Compositions and methods of preparation of liposomal microparticulate il-12
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
WO2007026972A2 (en) * 2005-09-01 2007-03-08 Canon Kabushiki Kaisha Binding protein molecule
US8168592B2 (en) 2005-10-21 2012-05-01 Amgen Inc. CGRP peptide antagonists and conjugates
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
WO2007059312A2 (en) 2005-11-16 2007-05-24 Ambrx, Inc. Methods and compositions comprising non-natural amino acids
US7875288B2 (en) * 2006-03-30 2011-01-25 The Research Foundation Of State University Of New York Method for treating blood coagulation disorders
EP2007357B1 (en) * 2006-03-30 2016-11-09 The Research Foundation Of State University Of New York Compositions of less immunogenic and long-circulating protein-lipid complexes
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
EP2010222A1 (en) 2006-03-31 2009-01-07 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
EP2004231A4 (en) 2006-04-07 2013-07-10 Nektar Therapeutics CONJUGATES OF ANTI-TNF-ALPHA ANTIBODY
EP2444499A3 (en) 2006-05-02 2012-05-09 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
US20080096819A1 (en) * 2006-05-02 2008-04-24 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
EP2213733A3 (en) 2006-05-24 2010-12-29 Novo Nordisk Health Care AG Factor IX analogues having prolonged in vivo half life
CN101484471B (zh) 2006-06-30 2013-11-06 诺沃-诺迪斯克有限公司 抗-nkg2a抗体及其用途
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
EP2615108B1 (en) 2006-09-08 2016-10-26 Ambrx, Inc. Modified human plasma polypeptide or fc scaffolds and thier uses
CA2662753C (en) 2006-09-08 2016-02-23 Ambrx, Inc. Hybrid suppressor trna for vertebrate cells
JP2008069073A (ja) * 2006-09-12 2008-03-27 Yokohama Tlo Co Ltd ラクトフェリン複合体及びその製造方法
AU2007296056B2 (en) * 2006-09-15 2012-09-13 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Targeted polymeric prodrugs containing multifunctional linkers
US8367065B2 (en) * 2006-09-15 2013-02-05 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Targeted polymeric prodrugs containing multifunctional linkers
US7985783B2 (en) 2006-09-21 2011-07-26 The Regents Of The University Of California Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
MX2009005466A (es) * 2006-11-22 2009-08-17 Adnexus A Bristol Myers Sqibb Terapeuticos dirigidos a base de proteinas manipuladas para receptores de tirosina cinasas, incluyendo receptor de factor de crecimiento tipo insulina-i.
WO2008074032A1 (en) 2006-12-15 2008-06-19 Baxter International Inc. Factor viia- (poly) sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
CN103755789B (zh) * 2007-01-30 2016-12-07 埃皮瓦克斯公司 调节性t细胞表位、组合物及其用途
ATE516814T1 (de) * 2007-02-02 2011-08-15 Bristol Myers Squibb Co 10fn3 domain zur behandlung von krankheiten begleitet von unerwünschter angiogenese
KR20160121601A (ko) 2007-03-30 2016-10-19 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
CA2682897C (en) 2007-04-03 2016-11-22 Biogenerix Ag Methods of treatment using glycopegylated g-csf
EP2076533B1 (en) 2007-05-02 2014-10-08 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
US7968811B2 (en) * 2007-06-29 2011-06-28 Harley-Davidson Motor Company Group, Inc. Integrated ignition and key switch
US20090110679A1 (en) * 2007-07-13 2009-04-30 Luk-Chiu Li Methods and compositions for pulmonary administration of a TNFa inhibitor
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
CA3128656A1 (en) 2007-08-22 2009-02-26 The Regents Of The University Of California Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
US8207112B2 (en) 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
BRPI0816785A2 (pt) 2007-09-14 2017-05-02 Adimab Inc bibliotecas de anticorpos sintéticos racionalmente desenhadas, e, usos para as mesmas
AU2008322886A1 (en) * 2007-11-15 2009-05-22 Australasian Food Group Pty Ltd. Production of food products with enhanced in mouth and mental refreshment
US8946148B2 (en) 2007-11-20 2015-02-03 Ambrx, Inc. Modified insulin polypeptides and their uses
CN101946171B (zh) * 2007-12-14 2014-03-12 拜奥蒂乌姆股份有限公司 荧光化合物
DK2222706T4 (en) 2007-12-14 2016-11-21 Novo Nordisk As Antibodies that bind to NKG2D and its use
RU2010133892A (ru) 2008-01-24 2012-02-27 Ново Нордиск А/С (DK) Гуманизированные моноклональные антитела против человеческого nkg2a
NZ586947A (en) 2008-02-08 2012-11-30 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
JP2011517314A (ja) * 2008-02-14 2011-06-02 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｅｇｆｒに結合する操作されたタンパク質に基づく標的化された治療薬
MX2010009190A (es) 2008-02-20 2010-09-10 G2 Inflammation Pty Ltd Anticuerpos anti-c5ar humanizados.
CN101965200B (zh) 2008-02-27 2013-06-19 诺沃-诺迪斯克有限公司 缀合的因子ⅷ分子
EP2799448A1 (en) 2008-05-22 2014-11-05 Bristol-Myers Squibb Company Multivalent fibronectin based scaffold domain proteins
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
NZ601659A (en) 2008-09-26 2014-02-28 Ambrx Inc Modified animal erythropoietin polypeptides and their uses
EA201170493A1 (ru) 2008-09-26 2011-10-31 Амбркс, Инк. Микроорганизмы и вакцины, зависимые от репликации неприродных аминокислот
KR20110112301A (ko) 2008-11-18 2011-10-12 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 인간 혈청 알부민 링커 및 그 콘쥬게이트
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
CA2745317C (en) 2008-12-22 2019-03-05 Ida Hilden Antibodies against tissue factor pathway inhibitor
CA2749339A1 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Cytomx Therapeutics, Llc Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
US9181341B2 (en) 2009-01-19 2015-11-10 Innate Pharma Anti-KIR3D antibodies
CA2753294A1 (en) 2009-02-23 2010-08-26 Cytomx Therapeutics, Inc. Proproteins and methods of use thereof
US8067201B2 (en) * 2009-04-17 2011-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Methods for protein refolding
WO2010150213A1 (en) * 2009-06-25 2010-12-29 Danisco A/S Protein
EP2448593B1 (en) 2009-07-03 2020-11-25 Bionor Immuno AS Hiv related peptides combination or fusion for use in hiv vaccine composition or as diagnostic means
AU2010277438B2 (en) 2009-07-27 2015-08-20 Baxalta GmbH Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
EP3093029A1 (en) 2009-07-27 2016-11-16 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
DK2459224T3 (en) * 2009-07-27 2016-07-25 Baxalta GmbH Blodstørkningsproteinkonjugater
EP2475682B1 (en) 2009-09-10 2018-01-31 UCB Biopharma SPRL Multivalent antibodies
US8658434B2 (en) * 2009-10-28 2014-02-25 Biotium, Inc. Fluorescent pyrene compounds
GB0920127D0 (en) * 2009-11-17 2009-12-30 Ucb Pharma Sa Antibodies
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
WO2011087810A1 (en) 2009-12-21 2011-07-21 Ambrx, Inc. Modified porcine somatotropin polypeptides and their uses
TWI513466B (zh) 2010-01-20 2015-12-21 Boehringer Ingelheim Int 抗凝血劑解毒劑
WO2011100508A2 (en) * 2010-02-12 2011-08-18 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Of Arizona State University Methods and compositions related to glycoprotein-immunoglobulin fusions
RS61082B1 (sr) 2010-02-26 2020-12-31 Novo Nordisk As Stabilno antitelo koje sadrži kompozicije
JP6148013B2 (ja) 2010-03-05 2017-06-14 リグショスピタレト 補体活性化のキメラ抑制分子
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
EP2569331A1 (en) 2010-05-10 2013-03-20 Perseid Therapeutics LLC Polypeptide inhibitors of vla4
ES2573108T3 (es) 2010-05-26 2016-06-06 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas de armazón a base de fibronectina que tienen estabilidad mejorada
KR20130086144A (ko) 2010-05-28 2013-07-31 노보 노르디스크 에이/에스 항체 및 보존제를 포함하는 안정한 다중-투여 조성물
US9127052B2 (en) 2010-06-29 2015-09-08 Centre National De La Recherche Scientifique LLT-1 antibodies with new functional properties
TW201212938A (en) 2010-06-30 2012-04-01 Novo Nordisk As Antibodies that are capable of specifically binding tissue factor pathway inhibitor
KR102159272B1 (ko) 2010-07-16 2020-09-24 아디맵 엘엘씨 항체 라이브러리
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
RS65223B1 (sr) 2010-08-17 2024-03-29 Ambrx Inc Modifikovani polipeptidi relaksina i njihova primena
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
CA2822591C (en) 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
KR20140009437A (ko) 2011-03-30 2014-01-22 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 항응고제 해독제
JP6038121B2 (ja) 2011-04-21 2016-12-07 ガーバン インスティテュート オブ メディカル リサーチ 修飾された可変ドメイン分子及びその製造及び使用の方法ｂ
CN103702721A (zh) 2011-05-31 2014-04-02 诺沃—诺迪斯克有限公司 Il-21表位和il-21配体
CN103596982B (zh) 2011-06-06 2016-11-02 诺沃—诺迪斯克有限公司 治疗性抗体
CA2838220C (en) 2011-06-17 2020-07-21 Novo Nordisk A/S Use of nkg2a antibodies for treatment of bone loss
KR20140054009A (ko) 2011-07-01 2014-05-08 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 릴랙신 융합 폴리펩타이드 및 그의 용도
CN103747807B (zh) 2011-07-05 2016-12-07 比奥阿赛斯技术有限公司 P97‑抗体缀合物和使用方法
WO2013011062A2 (en) 2011-07-18 2013-01-24 Novo Nordisk A/S Oscar antagonists
WO2013011063A1 (en) 2011-07-18 2013-01-24 Novo Nordisk A/S Antagonistic antibodies against oscar
WO2013011059A1 (en) 2011-07-18 2013-01-24 Novo Nordisk A/S Antagonist antibodies against oscar
WO2013011061A1 (en) 2011-07-18 2013-01-24 Novo Nordisk A/S Antagonistic antibodies against oscar
WO2013092983A2 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
HUE036955T2 (hu) 2012-02-15 2018-08-28 Novo Nordisk As Antitestek, amelyek a trigger receptort kötik és blokkolják, amely Myeloid-sejteken-1 (TREM-1) van expresszálva
US9550830B2 (en) 2012-02-15 2017-01-24 Novo Nordisk A/S Antibodies that bind and block triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (TREM-1)
LT2814842T (lt) 2012-02-15 2018-11-12 Novo Nordisk A/S Antikūnai, kurie suriša peptidoglikaną atpažįstantį baltymą 1
CN104717974A (zh) 2012-06-06 2015-06-17 比奥诺尔免疫有限公司 疫苗
EP3505534A1 (en) 2012-06-08 2019-07-03 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising sitespecific nonnatural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
US9732161B2 (en) 2012-06-26 2017-08-15 Sutro Biopharma, Inc. Modified Fc proteins comprising site-specific non-natural amino acid residues, conjugates of the same, methods of their preparation and methods of their use
WO2014006230A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Novo Nordisk A/S Il-20 epitopes and il-20 ligands
WO2014009426A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Innate Pharma Screening of conjugated antibodies
AU2013296557B2 (en) 2012-07-31 2019-04-18 Bioasis Technologies Inc. Dephosphorylated lysosomal storage disease proteins and methods of use thereof
WO2014036520A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-erbb3 agents
PL3584255T3 (pl) 2012-08-31 2022-05-16 Sutro Biopharma, Inc. Modyfikowane aminokwasy zawierające grupę azydkową
US10036010B2 (en) 2012-11-09 2018-07-31 Innate Pharma Recognition tags for TGase-mediated conjugation
WO2014074218A1 (en) 2012-11-12 2014-05-15 Redwood Bioscience, Inc. Compounds and methods for producing a conjugate
WO2014078733A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 The Regents Of The University Of California Pictet-spengler ligation for protein chemical modification
US9310374B2 (en) 2012-11-16 2016-04-12 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate
US10077315B2 (en) 2013-02-05 2018-09-18 Engmab Sàrl Bispecific antibodies against CD3 and BCMA
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
EP2970433B1 (en) 2013-03-13 2019-09-18 Bioasis Technologies Inc. Fragments of p97 and uses thereof
US9896513B2 (en) 2013-03-15 2018-02-20 Novo Nordisk A/S Antibodies capable of specifically binding two epitopes on tissue factor pathway inhibitor
US10611824B2 (en) 2013-03-15 2020-04-07 Innate Pharma Solid phase TGase-mediated conjugation of antibodies
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
WO2014202773A1 (en) 2013-06-20 2014-12-24 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
JP6744212B2 (ja) 2013-06-21 2020-08-19 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニムＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ Ｐｈａｒｍａ Ｓ．Ａ． ポリペプチドの酵素的結合
US9764039B2 (en) 2013-07-10 2017-09-19 Sutro Biopharma, Inc. Antibodies comprising multiple site-specific non-natural amino acid residues, methods of their preparation and methods of their use
WO2015007337A1 (en) 2013-07-19 2015-01-22 Bionor Immuno As Method for the vaccination against hiv
WO2015031673A2 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Bioasis Technologies Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
US9840493B2 (en) 2013-10-11 2017-12-12 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising tetrazine functional groups, methods of preparation, and methods of their use
EA201690780A1 (ru) 2013-10-15 2016-08-31 Сиэтл Дженетикс, Инк. Пегилированные лекарственные средства-линкеры для улучшенной фармакокинетики конъюгатов лиганд-лекарственное средство
US20160297892A1 (en) 2013-11-07 2016-10-13 Novo Nordisk A/S Novel Methods and Antibodies for Treating Coagulapathy
CN115504924A (zh) 2013-11-27 2022-12-23 雷德伍德生物科技股份有限公司 肼基-吡咯并化合物及用于生成缀合物的方法
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
MX370138B (es) 2014-02-26 2019-12-03 Univ Texas Liberación de protones de nitrobenzaldehído para la manipulación de la acidosis celular.
LT3116909T (lt) 2014-03-14 2020-02-10 Novartis Ag Antikūno molekulės prieš lag-3 ir jų panaudojimas
EP3119423B1 (en) 2014-03-15 2022-12-14 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor
SG11201607820QA (en) 2014-03-20 2016-10-28 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin-binding fibronectin type iii domains
AU2015279316B2 (en) 2014-06-27 2021-03-04 Innate Pharma Multispecific NKp46 binding proteins
CA2952532A1 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
EP3026061A1 (en) 2014-11-26 2016-06-01 Novo Nordisk A/S Site directed mutagenesis of trem-1 antibodies for decreasing viscosity.
KR20240029114A (ko) 2014-07-17 2024-03-05 노보 노르디스크 에이/에스 점도를 감소시키기 위한 trem-1 항체의 부위 지정 돌연변이유발
EP2975056A1 (en) 2014-07-17 2016-01-20 Novo Nordisk A/S Site directed mutagenesis of TREM-1 antibodies for decreasing viscosity
WO2016014553A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Sortase synthesized chimeric antigen receptors
ES2805475T3 (es) 2014-07-21 2021-02-12 Novartis Ag Tratamiento del cáncer utilizando un receptor antigénico quimérico de CD33
EP3193915A1 (en) 2014-07-21 2017-07-26 Novartis AG Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
EP3172237A2 (en) 2014-07-21 2017-05-31 Novartis AG Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
EP3660042B1 (en) 2014-07-31 2023-01-11 Novartis AG Subset-optimized chimeric antigen receptor-containing t-cells
AU2015301460B2 (en) 2014-08-14 2021-04-08 Novartis Ag Treatment of cancer using GFR alpha-4 chimeric antigen receptor
EP3712171A1 (en) 2014-08-19 2020-09-23 Novartis AG Treatment of cancer using a cd123 chimeric antigen receptor
MX2017003645A (es) 2014-09-17 2017-05-30 Novartis Ag Direccion de celulas citotoxicas con receptores quimericos para inmunoterapia adoptiva.
WO2016055592A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Engmab Ag Bispecific antibodies against cd3epsilon and ror1
PE20171067A1 (es) 2014-10-14 2017-07-24 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas
CA2965502A1 (en) 2014-10-24 2016-04-28 Bristol-Myers Squibb Company Modified fgf-21 polypeptides and uses thereof
WO2016090034A2 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Novartis Ag Methods for b cell preconditioning in car therapy
WO2016102657A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 Novo Nordisk A/S Alpha-cell re-generation combined with conversion to beta cells
US10253086B2 (en) 2015-04-08 2019-04-09 Novartis Ag CD20 therapies, CD22 therapies, and combination therapies with a CD19 chimeric antigen receptor (CAR)-expressing cell
EP3286211A1 (en) 2015-04-23 2018-02-28 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric antigen receptor and protein kinase a blocker
EP3313876A2 (en) 2015-06-23 2018-05-02 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
WO2016207278A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Innate Pharma Multispecific nk engager proteins
WO2017019897A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
ES2878188T3 (es) 2015-07-29 2021-11-18 Novartis Ag Terapias de combinación que comprenden moléculas de anticuerpos contra LAG-3
DK3331910T3 (da) 2015-08-03 2020-03-16 Engmab Sarl Monoklonale antistoffer mod humant b-cellemodningsantigen (bcma)
KR20180056701A (ko) 2015-09-23 2018-05-29 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 패스트-오프 레이트 혈청 알부민 결합 피브로넥틴 유형 iii 도메인
TWI814699B (zh) 2015-12-04 2023-09-11 美商思進公司 四級胺化妥布賴森(tubulysin)化合物之結合物
US11793880B2 (en) 2015-12-04 2023-10-24 Seagen Inc. Conjugates of quaternized tubulysin compounds
KR20180094977A (ko) 2015-12-17 2018-08-24 노파르티스 아게 c-Met 억제제와 PD-1에 대한 항체 분자의 조합물 및 그의 용도
MX2018007423A (es) 2015-12-17 2018-11-09 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-1 y usos de las mismas.
MA55746A (fr) 2016-01-21 2022-03-02 Novartis Ag Molécules multispécifiques ciblant cll-1
RU2018134771A (ru) 2016-03-04 2020-04-06 Новартис Аг Клетки, экспрессирующие множество молекул химерных антигенных рецепторов (car), и их применение
WO2017165683A1 (en) 2016-03-23 2017-09-28 Novartis Ag Cell secreted minibodies and uses thereof
WO2017165851A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Seattle Genetics, Inc. Process for the preparation of pegylated drug-linkers and intermediates thereof
ES2944607T3 (es) 2016-04-15 2023-06-22 Novartis Ag Composiciones y métodos para la expresión selectiva de receptores quiméricos para el antígeno
DK3458478T3 (da) 2016-05-18 2021-03-22 Boehringer Ingelheim Int Anti-pd-1- og anti-lag3-antistoffer til cancerbehandling
EP3463449A1 (en) 2016-05-27 2019-04-10 ALK-Abelló A/S Immunogenic proteins and fragments thereof from allergenic mites
WO2017210617A2 (en) 2016-06-02 2017-12-07 Porter, David, L. Therapeutic regimens for chimeric antigen receptor (car)- expressing cells
US10501775B2 (en) 2016-07-12 2019-12-10 Kite Pharma, Inc. Antigen binding molecules and methods of use thereof
JP7219376B2 (ja) 2016-07-15 2023-02-08 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体をキナーゼ阻害薬と併用して使用したサイトカイン放出症候群の治療及び予防
KR20190034588A (ko) 2016-07-28 2019-04-02 노파르티스 아게 키메라 항원 수용체 및 pd-1 억제제의 조합 요법
CN110267677A (zh) 2016-08-01 2019-09-20 诺华股份有限公司 使用与原m2巨噬细胞分子抑制剂组合的嵌合抗原受体治疗癌症
EP3523331A1 (en) 2016-10-07 2019-08-14 Novartis AG Chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
MX2019004621A (es) 2016-11-02 2019-11-28 Engmab Sarl Anticuerpo biespecifico contra bcma y cd3 y un farmaco inmunologico para uso combinado en el tratamiento del mieloma multiple.
US11135307B2 (en) 2016-11-23 2021-10-05 Mersana Therapeutics, Inc. Peptide-containing linkers for antibody-drug conjugates
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3360898A1 (en) 2017-02-14 2018-08-15 Boehringer Ingelheim International GmbH Bispecific anti-tnf-related apoptosis-inducing ligand receptor 2 and anti-cadherin 17 binding molecules for the treatment of cancer
EP3559032A1 (en) 2016-12-23 2019-10-30 Innate Pharma Heterodimeric antigen binding proteins
US11535662B2 (en) 2017-01-26 2022-12-27 Novartis Ag CD28 compositions and methods for chimeric antigen receptor therapy
TW201837051A (zh) 2017-02-08 2018-10-16 美商必治妥美雅史谷比公司 包含藥物動力學增強劑之經修飾之鬆弛素(relaxin)多肽及其用途
EP3589647A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Novartis AG Shp inhibitor compositions and uses for chimeric antigen receptor therapy
IL269398B1 (en) 2017-03-24 2024-01-01 Seagen Inc A process for the preparation of glucuronide-drug binders and their intermediates
EP3615068A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
PE20200717A1 (es) 2017-06-22 2020-07-21 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a cd73 y usos de las mismas
CA3066747A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Novartis Ag Dosage regimens for anti-tim-3 antibodies and uses thereof
TWI820031B (zh) 2017-07-11 2023-11-01 美商坎伯斯治療有限責任公司 結合人類cd137之促效劑抗體及其用途
JP2020527572A (ja) 2017-07-20 2020-09-10 ノバルティス アーゲー 抗ｌａｇ−３抗体の投薬量レジメンおよびその使用
US11718679B2 (en) 2017-10-31 2023-08-08 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and PD-1 antagonists and uses thereof
CA3081602A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Novartis Ag Combination therapies
US11851497B2 (en) 2017-11-20 2023-12-26 Compass Therapeutics Llc CD137 antibodies and tumor antigen-targeting antibodies and uses thereof
US20200325232A1 (en) 2017-11-21 2020-10-15 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
EP3732254A4 (en) 2017-12-26 2021-12-22 Becton, Dickinson and Company DEEP UV-EXCITABLE WATER-SOLVATIZED POLYMER DYES
EP3746116A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 Novartis AG Combination therapy using a chimeric antigen receptor
US10844228B2 (en) 2018-03-30 2020-11-24 Becton, Dickinson And Company Water-soluble polymeric dyes having pendant chromophores
PE20201343A1 (es) 2018-04-02 2020-11-25 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos anti-trem-1 y usos de los mismos
US20210147547A1 (en) 2018-04-13 2021-05-20 Novartis Ag Dosage Regimens For Anti-Pd-L1 Antibodies And Uses Thereof
EP3784351A1 (en) 2018-04-27 2021-03-03 Novartis AG Car t cell therapies with enhanced efficacy
EP3569618A1 (en) 2018-05-19 2019-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Antagonizing cd73 antibody
CN112384534A (zh) 2018-05-21 2021-02-19 指南针制药有限责任公司 用于增强nk细胞对靶细胞的杀死的组合物和方法
WO2019226658A1 (en) 2018-05-21 2019-11-28 Compass Therapeutics Llc Multispecific antigen-binding compositions and methods of use
WO2019227003A1 (en) 2018-05-25 2019-11-28 Novartis Ag Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
MX2020013443A (es) 2018-06-13 2021-02-26 Novartis Ag Receptores de antigeno quimerico de bcma y usos de los mismos.
US20210238268A1 (en) 2018-06-19 2021-08-05 Atarga, Llc Antibody molecules to complement component 5 and uses thereof
AR116109A1 (es) 2018-07-10 2021-03-31 Novartis Ag Derivados de 3-(5-amino-1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona y usos de los mismos
WO2020023300A1 (en) 2018-07-22 2020-01-30 Bioasis Technologies, Inc. Treatment of lymmphatic metastases
WO2020021465A1 (en) 2018-07-25 2020-01-30 Advanced Accelerator Applications (Italy) S.R.L. Method of treatment of neuroendocrine tumors
JP7441826B2 (ja) 2018-09-11 2024-03-01 アンブルックス，インコーポレイテッド インターロイキン－２ポリペプチド抱合物およびその使用
WO2020082057A1 (en) 2018-10-19 2020-04-23 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates, dimers thereof, and their uses
GB201818477D0 (en) 2018-11-13 2018-12-26 Emstopa Ltd Tissue plasminogen activator antibodies and method of use thereof
CA3119161A1 (en) 2018-11-13 2020-05-22 Compass Therapeutics Llc Multispecific binding constructs against checkpoint molecules and uses thereof
EP3897637A1 (en) 2018-12-20 2021-10-27 Novartis AG Dosing regimen and pharmaceutical combination comprising 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives
JP2022513255A (ja) 2018-12-20 2022-02-07 ノバルティス アーゲー ＨＤＭ２－ｐ５３相互作用阻害剤とＢＣＬ２阻害剤との組み合わせ及び癌を処置するためのその使用
SG11202108254YA (en) 2019-02-12 2021-08-30 Ambrx Inc Compositions containing, methods and uses of antibody-tlr agonist conjugates
EA202192019A1 (ru) 2019-02-15 2021-11-02 Новартис Аг Производные 3-(1-оксо-5-(пиперидин-4-ил)изоиндолин-2-ил)пиперидин-2,6-диона и пути их применения
US10871640B2 (en) 2019-02-15 2020-12-22 Perkinelmer Cellular Technologies Germany Gmbh Methods and systems for automated imaging of three-dimensional objects
CN113329792A (zh) 2019-02-15 2021-08-31 诺华股份有限公司 取代的3-(1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮衍生物及其用途
US20220088075A1 (en) 2019-02-22 2022-03-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Combination therapies of egfrviii chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
MA55519A (fr) 2019-03-29 2022-02-09 Atarga Llc Anticorps anti-fgf23
US11208477B2 (en) 2019-04-01 2021-12-28 Novo Nordisk A/S Antibodies and use thereof
US20220332817A1 (en) 2019-07-15 2022-10-20 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against human trem-1 and uses thereof
JP2022540674A (ja) 2019-07-15 2022-09-16 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗ｔｒｅｍ－１抗体およびその使用
KR20220077127A (ko) * 2019-09-06 2022-06-08 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 암 치료를 위한 키메라 항원 수용체 및 관련 방법 및 조성물
JP2022553306A (ja) 2019-10-21 2022-12-22 ノバルティス アーゲー Ｔｉｍ－３阻害剤およびその使用
BR112022007376A2 (pt) 2019-10-21 2022-07-05 Novartis Ag Terapias de combinação com venetoclax e inibidores de tim-3
EP4065158A2 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Chimeric antigen receptors binding bcma and cd19 and uses thereof
BR112022011902A2 (pt) 2019-12-20 2022-09-06 Novartis Ag Terapias de combinação
CN113186185B (zh) * 2020-01-14 2023-05-26 东北林业大学 一种从哺乳动物粪便中高效富集宿主dna的方法
CA3167413A1 (en) 2020-01-17 2021-07-22 Novartis Ag Combination comprising a tim-3 inhibitor and a hypomethylating agent for use in treating myelodysplastic syndrome or chronic myelomonocytic leukemia
CN115298322A (zh) 2020-01-17 2022-11-04 贝克顿迪金森公司 用于单细胞分泌组学的方法和组合物
CN115397460A (zh) 2020-02-27 2022-11-25 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
KR20220151202A (ko) 2020-03-11 2022-11-14 암브룩스, 인코포레이티드 인터류킨-2 폴리펩타이드 접합체 및 그의 사용 방법
US20210355468A1 (en) 2020-05-18 2021-11-18 Bioasis Technologies, Inc. Compositions and methods for treating lewy body dementia
JP2023504675A (ja) 2020-05-19 2023-02-06 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ガンの処置のための結合分子
US20210371503A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 University Of Cologne Neutralizing antibodies against sars-related coronavirus
US20210393787A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Bioasis Technologies, Inc. Compositions and methods for treating frontotemporal dementia
MX2022015852A (es) 2020-06-23 2023-01-24 Novartis Ag Regimen de dosificacion que comprende derivados de 3-(1-oxoisoindolin-2-il)piperidina-2,6-diona.
EP4182025A1 (en) 2020-07-16 2023-05-24 Novartis AG Anti-betacellulin antibodies, fragments thereof, and multi-specific binding molecules
WO2022026592A2 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Celltas Bio, Inc. Antibody molecules to coronavirus and uses thereof
EP4188549A1 (en) 2020-08-03 2023-06-07 Novartis AG Heteroaryl substituted 3-(1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione derivatives and uses thereof
US20230296611A1 (en) 2020-08-10 2023-09-21 Innate Pharma Cell surface mica and micb detection using antibodies
TW202227449A (zh) 2020-08-20 2022-07-16 美商Ａｍｂｒｘ 公司 抗體－ｔｌｒ促效劑偶聯物、其方法及用途
EP4204021A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
EP4204020A1 (en) 2020-08-31 2023-07-05 Advanced Accelerator Applications International S.A. Method of treating psma-expressing cancers
TW202233668A (zh) 2020-10-21 2022-09-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 用於治療眼部疾病之雙特異性抗-VEGF及抗-TrkB結合分子
JP2023548034A (ja) 2020-10-22 2023-11-15 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド デルタ様リガンド３（ｄｌｌ３）抗原結合ドメインを含むタンパク質及びその使用
EP4240765A2 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Novartis AG Antibody fc variants
CA3198447A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Novartis Ag Combination therapies with chimeric antigen receptor (car)-expressing cells
WO2022162569A1 (en) 2021-01-29 2022-08-04 Novartis Ag Dosage regimes for anti-cd73 and anti-entpd2 antibodies and uses thereof
WO2022182872A2 (en) 2021-02-24 2022-09-01 Alladapt Immunotherapeutics, Inc. Compositions and methods for identification of cross-reactive allergenic proteins and treatment of allergies
CA3207652A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Stephanie Cornen Cytokine anchors for nkp46-binding nk cell engager proteins
TW202304990A (zh) 2021-03-26 2023-02-01 美商健生生物科技公司 針對成對螺旋絲ｔａｕ之人源化抗體及其用途
KR20240004342A (ko) 2021-04-03 2024-01-11 암브룩스, 인코포레이티드 항-her2 항체-약물 접합체 및 이의 용도
KR20230165913A (ko) 2021-04-05 2023-12-05 이나뜨 파르마 에스.에이. 면역조직화학 방법 및 kir3dl2-특이적 시약
TW202304979A (zh) 2021-04-07 2023-02-01 瑞士商諾華公司 抗ＴＧＦβ抗體及其他治療劑用於治療增殖性疾病之用途
AR125874A1 (es) 2021-05-18 2023-08-23 Novartis Ag Terapias de combinación
EP4095156A1 (en) 2021-05-28 2022-11-30 Universität zu Köln Neutralizing antibodies against hepatitis c virus
EP4352098A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp46, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
IL308531A (en) 2021-06-09 2024-01-01 Innate Pharma Multiple specific antibodies that bind to CD20, NKP46, CD16 and are equipped with IL-2
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
EP4355778A1 (en) 2021-06-17 2024-04-24 Boehringer Ingelheim International GmbH Novel tri-specific binding molecules
WO2023044483A2 (en) 2021-09-20 2023-03-23 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
EP4155349A1 (en) 2021-09-24 2023-03-29 Becton, Dickinson and Company Water-soluble yellow green absorbing dyes
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
EP4190810A1 (en) 2021-12-01 2023-06-07 Universität zu Köln Neutralizing antibodies against sars-related coronavirus
WO2023099688A1 (en) 2021-12-01 2023-06-08 Universität Zu Köln Neutralizing antibodies against sars-related coronavirus
TW202342548A (zh) 2022-02-07 2023-11-01 美商威特拉公司 抗獨特型(anti-idiotype)抗體分子及其用途
WO2023170295A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Janssen Pharmaceutica Nv Multispecific antibodies and uses thereof
WO2023170290A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Janssen Pharmaceutica Nv Multispecific antibodies and uses thereof
TW202400636A (zh) 2022-03-11 2024-01-01 比利時商健生藥品公司 多特異性抗體及其用途(一)
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024007016A2 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Beckman Coulter, Inc. Novel fluorescent dyes and polymers from dihydrophenanthrene derivatives
US20240052065A1 (en) 2022-07-15 2024-02-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Binding molecules for the treatment of cancer
WO2024030976A2 (en) 2022-08-03 2024-02-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for crossing the blood brain barrier
WO2024044327A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Beckman Coulter, Inc. Dhnt monomers and polymer dyes with modified photophysical properties
WO2024056861A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for stimulating nk cells and use thereof

Family Cites Families (58)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US5049504A (en) * 1986-11-24 1991-09-17 Genex Corporation Bioadhesive coding sequences
US5202236A (en) * 1984-09-13 1993-04-13 Enzon Labs Inc. Method of producing bioadhesive protein
US5202256A (en) * 1984-09-13 1993-04-13 Enzon Labs, Inc. Bioadhesive precursor protein expression vectors
US4946778A (en) * 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4881175A (en) * 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US4704692A (en) * 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5260203A (en) * 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5166320A (en) * 1987-04-22 1992-11-24 University Of Connecticut Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5091513A (en) * 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4904582A (en) * 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5122614A (en) * 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US5358932A (en) * 1989-12-29 1994-10-25 Zymogenetics, Inc. Hybrid protein C
GB9012995D0 (en) * 1990-06-11 1990-08-01 Celltech Ltd Multivalent antigen-binding proteins
US5766897A (en) * 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
WO1992016555A1 (en) 1991-03-18 1992-10-01 Enzon, Inc. Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
US5212075A (en) 1991-04-15 1993-05-18 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for introducing effectors to pathogens and cells
US5872222A (en) 1991-04-19 1999-02-16 Tanox Biosystems, Inc. Conjugates of polymers and antibodies specific for T lymphocytes, and their use as adjuvants
US6787153B1 (en) * 1991-06-28 2004-09-07 Mitsubishi Chemical Corporation Human monoclonal antibody specifically binding to surface antigen of cancer cell membrane
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
US5981273A (en) * 1991-09-30 1999-11-09 Boehringer Ingelheim Int'l. Gmbh Composition comprising an endosomolytic agent for introducing nucleic acid complexes into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) * 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
AU3178993A (en) 1991-11-25 1993-06-28 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US6025165A (en) * 1991-11-25 2000-02-15 Enzon, Inc. Methods for producing multivalent antigen-binding proteins
ATE419355T1 (de) 1992-02-06 2009-01-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US6113946A (en) 1992-04-03 2000-09-05 The Regents Of The University Of California Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations
US6329507B1 (en) 1992-08-21 2001-12-11 The Dow Chemical Company Dimer and multimer forms of single chain polypeptides
AU5670194A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
US5359030A (en) * 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
AU8052194A (en) 1993-10-20 1995-05-08 Enzon, Inc. 2'- and/or 7- substituted taxoids
US5880131A (en) 1993-10-20 1999-03-09 Enzon, Inc. High molecular weight polymer-based prodrugs
US5443953A (en) * 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US5844107A (en) * 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
US5656465A (en) * 1994-05-04 1997-08-12 Therion Biologics Corporation Methods of in vivo gene delivery
US5730990A (en) * 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US5888773A (en) 1994-08-17 1999-03-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of producing single-chain Fv molecules
US5670132A (en) 1994-09-20 1997-09-23 Immunomedics, Inc. Modified radioantibody fragments for reduced renal uptake
US5763733A (en) 1994-10-13 1998-06-09 Enzon, Inc. Antigen-binding fusion proteins
ATE202145T1 (de) 1994-11-01 2001-06-15 Winfried Wels Nukleinsäure-einbringungssystem
AU6255096A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The Pegylated modified proteins
US5853723A (en) 1995-09-21 1998-12-29 University Of Utah Research Foundation Targeting of peg antibody conjugates to islet cells
BR9606706A (pt) 1995-10-16 1999-04-06 Unilever Nv Análogo de fragmento de anticorpo biespecífico ou bivalente uso processo para produzir o mesmo
US6090382A (en) * 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
CZ292465B6 (cs) * 1996-02-09 2003-09-17 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Lidské protilátky k lidskému TNFalfa
GB9625640D0 (en) 1996-12-10 1997-01-29 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6025158A (en) 1997-02-21 2000-02-15 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
DK0968291T3 (da) 1997-02-21 2004-06-07 Genentech Inc Antistoffragment-polymerkonjugater
US6117980A (en) * 1997-02-21 2000-09-12 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US5830698A (en) * 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
CA2288994C (en) * 1997-04-30 2011-07-05 Enzon, Inc. Polyalkylene oxide-modified single chain polypeptides
GB9812545D0 (en) 1998-06-10 1998-08-05 Celltech Therapeutics Ltd Biological products
US6333396B1 (en) * 1998-10-20 2001-12-25 Enzon, Inc. Method for targeted delivery of nucleic acids
US6908963B2 (en) * 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
PL369739A1 (en) * 2001-11-12 2005-05-02 Merck Patent Gmbh Modified anti-tnf alpha antibody
US7101978B2 (en) * 2003-01-08 2006-09-05 Applied Molecular Evolution TNF-α binding molecules

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008528002A (ja) * 2005-01-25 2008-07-31 セル セラピューティクス インコーポレーテッド 改善された生体内半減期を有する生物学的に活性なタンパク質
US8129348B2 (en) 2005-01-25 2012-03-06 Cell Therapeutics, Inc. Conjugates of biologically active proteins having a modified in vivo half-life
JP2013100292A (ja) * 2005-01-25 2013-05-23 Cell Therapeutics Inc 改善された生体内半減期を有する生物学的に活性なタンパク質
US8748577B2 (en) 2005-01-25 2014-06-10 Cell Therapeutics, Inc. Conjugates of biologically active polypeptides having an increased in vivo half-life

Also Published As

Publication number Publication date
JP2008115193A (ja) 2008-05-22
CA2288994A1 (en) 1998-11-05
US6743896B2 (en) 2004-06-01
WO1998049198A1 (en) 1998-11-05
JP2002505574A (ja) 2002-02-19
US20020098192A1 (en) 2002-07-25
US20050008650A1 (en) 2005-01-13
AU7266698A (en) 1998-11-24
CA2288992C (en) 2012-06-12
US20020155498A1 (en) 2002-10-24
US6743908B2 (en) 2004-06-01
EP0981548A1 (en) 2000-03-01
CA2288992A1 (en) 1998-11-05
US20020161201A1 (en) 2002-10-31
EP0981548A4 (en) 2005-11-23
JP4187277B2 (ja) 2008-11-26
WO1998048837A9 (en) 1999-04-22
WO1998048837A1 (en) 1998-11-05
EP0979102A1 (en) 2000-02-16
US20020061307A1 (en) 2002-05-23
JP2010051331A (ja) 2010-03-11
US7150872B2 (en) 2006-12-19
US6323322B1 (en) 2001-11-27
US20050042680A1 (en) 2005-02-24
CA2288994C (en) 2011-07-05
US6824782B2 (en) 2004-11-30
AU7266898A (en) 1998-11-24
US20050048064A1 (en) 2005-03-03
US7632504B2 (en) 2009-12-15
US6872393B2 (en) 2005-03-29
EP0979102A4 (en) 2005-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4187277B2 (ja) グリコシル化し得る抗原結合単鎖タンパク質、それらの生成および使用
AU773568B2 (en) Antobody to human gastrointestinal epithelial tumor antigen related to alpha 6 beta 4 integrin
US20070199078A1 (en) Antibody fragments specific for human carcinoembryonic antigen (CEA)
ZA200305980B (en) Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
Wang et al. Single-chain Fv with manifold N-glycans as bifunctional scaffolds for immunomolecules.
KR20060006942A (ko) 고분자 접합용 단일 사슬 항원결합성 폴리펩티드
MXPA02008315A (es) Anticuerpo novedoso con especifidad para cancer de color.

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20050428

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050428

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070619

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070905

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20071023

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080213

A911 Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911

Effective date: 20080313

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20080213

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080416

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080616

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080722

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20080724

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20080828

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20080909

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110919

Year of fee payment: 3

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120919

Year of fee payment: 4

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130919

Year of fee payment: 5

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term