CN100365021C

CN100365021C - 核蛋白“Shoca”-一种wnt信号传导途径的成分

Info

Publication number: CN100365021C
Application number: CNB028243986A
Authority: CN
Inventors: 乔治·安德里亚·荷兰德尔
Original assignee: Universitaets Kinderspital beider Basel UKBB
Current assignee: Universitaets Kinderspital beider Basel UKBB
Priority date: 2001-12-06
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2022-12-03
Also published as: DE60221698D1; NZ532990A; AU2002352214A1; EP1451219B1; EP1451219A1; ATE369381T1; CA2469356A1; CN1599752A; WO2003048200A1; JP2005527190A; RU2004120537A

Abstract

本发明涉及一种分离的Shoca多肽，该多肽包含：(i)：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列；或(ii)：(i)的变异体，该变异体能与wnt信号传导途径的多肽相互作用；或(iii)：(i)或(ii)的片段，该片段能与wnt信号传导途径的多肽相互作用。本发明还涉及一种编码如本发明所述的多肽的多核苷酸。本发明还涉及编码所述多肽的多核苷酸；利用所述的多肽或多核苷酸鉴定wnt信号传导途径中的调节子的方法以及诊断和治疗癌症的方法。

Description

核蛋白“Shoca”-一种wnt信号传导途径的成分

技术领域

本发明涉及一种新型的信号蛋白，该蛋白与健康的组织、瘤形成的组织和致瘤的组织相关。本发明还涉及鉴别该信号蛋白的活性和/或表达的调节子的筛选方法，并涉及与癌症的诊断、预后和治疗相关的方法。

背景技术

人类的癌症源自独立的遗传变异的积累，这些遗传变异影响那些正常情况下负责控制细胞生长和存活的转录程序。在单个临床类别之内，癌症表面上可表现出完全不同的遗传缺陷，然而，这些遗传缺陷却是共有的信号转导途径的一部分。Wnt信号传导途径(概括在图1中)的发现和对其独特的分子组分的结构/功能的分析为在肿瘤生成中鉴别共有的特征提供了一个突出的例子(Polakis(2000)《基因和发育(Genes &Development)》14：1837-1851；Peifer和Polakis(2000)《科学(Science)》287：1606-1609)。

Wnt信号传导途径是由分泌的wnt糖蛋白家族成员藉由与一个或几个其特异的细胞表面受体结合而启动的，这一过程称为卷曲化。当该七次跨膜受体的家族与它们各自的配体结合时，就能激活凌乱的蛋白。与轴蛋白结合的凌乱蛋白阻止糖原合酶激酶-3β磷酸化诸如β-连环蛋白等关键物质。其它物质包括负调节子轴蛋白本身和APC。非磷酸化的β-连环蛋白逃避经由泛素途径的降解并转移定位至核中，在核中其与转录因子如T-细胞因子(TCF)和白细胞增强因子(LEF)结合。在哺乳动物中，虽然所鉴别的在转录水平由wnt信号传导途径调节的目的基因的数目有限，但其还是包括c-myc、细胞周期蛋白D1、C-jun、基质金属蛋白酶和CD44。

已经有许多关于在人类癌症中wnt基因的转录过表达以及有时低表达的报道，但mRNA表达水平仅仅是相对应的。Wnt介导的信号参与肿瘤转化的更引人注目的证据来自于在wnt信号转导中起作用的调节基因的突变分析。例如，β-连环蛋白的某一突变，使得该蛋白不受APC的抑制从而避免其被降解。结果，出现β-连环蛋白/TCF调节的基因转录的组成型激活。相似地，APC和轴蛋白的突变也能破坏β-连环蛋白的正常调节并与多种形式的肿瘤有关。因此，鉴别wnt分子、它们的信号转导途径以及它们的生物学效应将会进一步帮助解释wnt在肿瘤生成过程中暗含的直接的和外遗传的证据，这些肿瘤生成过程包括生成结肠癌、家族性腺瘤息肉病、散发性硬纤维瘤(如侵袭性纤维瘤病)、胃癌、肝胚细胞瘤、威尔玛氏肿瘤、黑素瘤、胰腺瘤、恶性甲状腺瘤、成神经管细胞瘤、子宫内膜卵巢癌、前列腺癌以及急性淋巴母细胞白血病。

发明内容

本发明人鉴定了小鼠和人的组织中的一个新型基因，该基因的产物直接参与wnt介导的信号传导。该基因(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3)编码包含52kDa(由蛋白印迹证实)的衔接蛋白的SH2结构域，由此该基因被命名为Shoca-1(SH2-domain containing adaptor)。随后，通过在公共的结构域使用EST(表达序列标签)分析鉴定了另一个与Shoca类似的小鼠基因(Shoca-2)(SEQ ID NO：5)。在序列同源性的基础上，又鉴定了一个人Shoca-2同源物(SEQ ID NO：7)。

本发明人对Shoca进行了广泛的分子分析，确定了它的离体功能，并表明其在正常组织中不表达或低表达，并且其表达与多种组织中的癌变相关。Shoca-1的表达模式和Shoca介导的wnt信号调节的功能效应提示这一家族的分子在决定细胞的命运中起重要作用。与其它影响wnt信号转导的分子类似，正常Shoca功能的损害可影响不同组织的细胞的自体平衡，导致从生理上正常的细胞生长和分化向异常的细胞存活和功能转变。在本文中，Shoca功能异常的检测在预测疾病的进程、治疗反应和预后方面具有诊断意义。而且，那些调节Shoca功能的新型的互相作用分子为干预不受控制的细胞分化和增殖提供了独特的工具。本发明人因此指出Shoca可能在调节细胞的正常生理状态和自体平衡方面起着很重要的作用，并且由此Shoca可用于对人恶性肿瘤的诊断、危险性评测以及治疗。

因此，本发明提供：

-一种分离的Shoca多肽，该多肽包含：

(i)SEQ ID NO：2或SEQID NO：4的氨基酸序列；或

(ii)(i)的变异体，该变异体能与wnt信号传导途径的多肽相互作用；或

(iii)(i)或(ii)的片段，该片段能与wnt信号传导途径的多肽相互作用；

-一种编码如本发明所述的多肽的多核苷酸；

-一种编码能与wnt信号传导途径的多肽相互作用的Shoca多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含：

(i)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列和/或其互补序列；

(ii)在严谨条件下与(i)中定义的序列杂交的序列；

(iii)由于遗传密码子的原因，简并为(i)或(ii)中定义的序列的序列；或

(iv)与(i)、(ii)或(iii)中定义的序列具有至少85％同一性的序列；

-一种含有如本发明所述的多核苷酸的表达载体；

-一种含有如本发明所述的载体的宿主细胞；

-一种特异针对如本发明所述的多肽的抗体；

-一种鉴定能调节wnt信号传导途径的物质的方法，该方法包括：

(i)提供包含SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的多肽，或其变异体，或它们的片段，或编码所述多肽的多核苷酸，以及待测物质，其中所述变异体或片段能与wnt信号传导途径的多肽相互作用；

(ii)将所述多肽或多核苷酸与待测物质接触；以及

(iii)确定所述待测物质是否对所述多肽的表达或所述多肽的功能或性质具有任何影响，藉此确定所述待测物质是否能调节Shoca的活性；

-一种能调节Shoca活性的物质，该物质是按照本发明的方法鉴定出来的以用在治疗人或动物体的疗法中或用在对人或动物体实施的诊断方法中；

-一种按照本发明的方法鉴定的物质在制造诊断剂或用于诊断或治疗癌症的药剂中的用途；

-一种诊断癌症的方法，该方法包括确定被试者的组织样品中的Shoca表达水平；

-一种预测肿瘤进程的方法，该方法包括确定受试者的组织样品中的Shoca表达水平；

-一种抗癌剂在制造用于治疗个体癌症的药剂中的用途，其中，已使用如本发明的方法将所述个体诊断为癌症；以及

-一种治疗癌症的方法，该方法包括：

(i)鉴定能调节Shoca活性的物质；和

(ii)给需要所述物质的人或动物受试者施用治疗有效量的所述物质。

附图说明

图1是wnt信号传导途径的概图。所用缩写是：

sFRP：可溶的卷曲的受体蛋白

Fz：卷曲的

Dvl：凌乱的

JNK：Jun-激酶途径

PI3-K：磷脂酰肌醇3-羟基激酶

Akt：蛋白激酶B

GSK-3β：糖原合酶激酶3β

TCF：T细胞因子。

图2是小鼠、人和斑马鱼的Shoca蛋白N-末端氨基酸序列的比较。

图3是小鼠与人的Shoca-1和Shoca-2的SH2结构域的比较。

图4是小鼠和人的Shoca-1氨基酸序列的比对。

图5显示了预测的Shoca-1结构，其揭示卷曲-螺旋结构域和位于C-末端的SH2结构域。

图6显示了用TaqMan测定分析所得到的Shoca-1(图6A)和Shoca-2(图6B)在成年C57B6小鼠组织中的表达谱。

图7显示了萤光素酶报告基因测定分析所得的结果，结果表明Shoca-1调节β-连环蛋白-LEF/TCF调节的激活的转录激活。就细胞环境而言，野生型小鼠Shoca-1的表达抑制报告基因的自发活性，而突变体(R-K)使SH2结构域丧失功能，从而导致不能发挥抑制效应。

序列简介

SEQ ID NO：1显示鼠Shoca-1的核苷酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：2显示鼠Shoca-1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3显示人Shoca-1的核苷酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：4显示人Shoca-1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5显示鼠Shoca-2的核苷酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：6显示鼠Shoca-2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7显示人Shoca-2的核苷酸和氨基酸序列。

SEQ ID NO：8显示人Shoca-2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9显示人Shoca-1的N-末端氨基酸序列。

SEQ ID NO：10显示鼠Shoca-1的N-末端氨基酸序列。

SEQ ID NO：11显示人Shoca-2的N-末端氨基酸序列。

SEQ ID NO：12显示鼠Shoca-2的N-末端氨基酸序列。

SEQ ID NO：13显示斑马鱼同源物A的N-末端氨基酸序列。

SEQ ID NO：14显示斑马鱼同源物B的N-末端氨基酸序列。

SEQ ID NO：15显示人Shoca-1的SH2结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16显示鼠Shoca-1的SH2结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17显示人Shoca-2的SH2结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18显示鼠Shoca-2的SH2结构域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19显示用于产生Shoca抗体的肽Shoca#O的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20显示用于产生抗Shoca抗体的肽Shoca#1的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21显示用于产生抗Shoca抗体的肽Shoca#2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22显示用于产生抗Shoca抗体的肽Shoca#3的氨基酸序列。

SEQ ID NO：23显示用于产生抗Shoca抗体的肽Shoca#4的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24显示用于产生抗Shoca抗体的肽Shoca#5的氨基酸序列。

具体实施方式

蛋白质

本发明涉及一种新型的wnt信号传导途径的蛋白(在此称为Shoca)，其功能变异体和Shoca或Shoca的变异体的功能片段。鼠Shoca-1的序列信息如SEQ ID NO：1(核苷酸和氨基酸)和SEQ ID NO：2所示，人Shoca-1的序列信息如SEQ ID NO：3(核苷酸和氨基酸)和SEQ ID NO：4所示，鼠Shoca-2的序列信息如SEQ ID NO：5(核苷酸和氨基酸)和SEQ ID NO：6所示，以及人Shoca-2的序列信息如SEQ ID NO：7(核苷酸和氨基酸)和SEQ ID NO：8所示。因此，本发明的多肽实质上由SEQ IDNO：2、4、6或8的氨基酸序列，或这些序列的任何一个的变异体，或这些序列或变异体的任何一个片段组成。

本发明的多肽可以是一种实质上分离的形式。应该理解，所述多肽可与不干扰该多肽的预定目的的载体或稀释剂混合在一起，并仍被看作是实质上分离的。本发明的多肽也可以是一种实质上纯化的形式，在这一情况下，在制备物中通常包含多肽，其中制备物中超过50重量％，例如超过80重量％、90重量％、95重量％或99重量％的多肽是本发明所述的多肽。可用常规方法来纯化和/或合成本发明的蛋白。这些方法是本领域技术人员熟知的，包括如那些在Sambrook等人编写的《分子克隆：实验技术指南(Molecular Cloning：a Laboratory Manual)》(第二版，CSH实验室出版社，1989)中所描述的技术，在此整体引用作为参考。

术语“变异体”是指与Shoca-1共同拥有至少一种特征或功能的多肽。本发明的“片段”也具有Shoca-1的至少一种功能或特征。Shoca-1是wnt信号传导途径的信号蛋白。Shoca-1也可是调节细胞生存、增殖或分化的任何其它途径的信号蛋白。优选地，变异体多肽是能与wnt信号传导途径的分子，优选核分子相互作用的多肽。优选地，变异体多肽能与LEF、TCF和/或β-连环蛋白相互作用。变异体可与内源性Shoca蛋白相互作用。优选地，变异体多肽能调节由β-连环蛋白-LEF/TCF调节的转录。优选地，由本发明的多肽所调节的β-连环蛋白-LEF/TCF转录是组织特异性的，例如在胸腺上皮细胞中产生抑制和在成纤维细胞中产生刺激。

典型地，可通过监测Shoca的功能来鉴别本发明的变异体多肽，这些功能如与LEF和/或TCF和/或β-连环蛋白的结合、在LEF/TCF反应性控制序列控制下调节报告基因的表达。

在胸腺上皮细胞中，Shoca-1的SH2结构域对抑制LEF/TCF介导的转录是至关重要的。因而，优选地，Shoca的变异体或片段包含功能性的SH2结构域。其它的优选片段和变异体可包含Shoca-1的其它功能性结构域，如卷曲-螺旋结构域或磷酸化位点。

Shoca几乎专门在细胞核内表达。优选的片段和变异体可含有核定位序列。缺失N-末端前50个氨基酸的Shoca-1突变体不能从细胞质转移定位到细胞核，这表明这一序列内的一个基序含有核定位序列。因而，优选地，本发明的变异体或片段包含N-末端的结构域，该结构域包含核定位序列。更优选地，所述变异体或片段含有SEQ ID NO：4所示的从56位到63位的序列。

在本发明的另一方面，变异体是与Shoca不表现相同活性但却抑制Shoca的基本功能的多肽，即具有显性负调节活性。例如，变异体多肽是由Shoca抑制LEF/TCF介导转录的调节的多肽。

不同的Shoca蛋白在氨基酸水平上的同一性如下：人Shoca-1与小鼠Shoca-1具有91％同一性；人Shoca-2与小鼠Shoca-2具有72％同一性；人Shoca-1与人Shoca-2具有40％同一性；小鼠Shoca-1与小鼠Shoca-2具有40％同一性。

典型地，认为如下所述的多肽为所述蛋白的变异体：与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列的同一性大于约40％，优选至少70％，至少80％或至少90％，特别优选至少91％，至少95％，至少97％或至少99％的同一性的多肽。只要肽保留Shoca的至少一种功能或特性，所述变异体就可包括等位基因的变异体以及所述蛋白序列内的单个氨基酸残基或氨基酸残基的基团的缺失、修饰或添加。优选地，SEQ ID NO：2或4的变异体与Shoca-1具有相同的结构域结构，即卷曲-螺旋结构域和/或C-末端的SH2结构域。

可对氨基酸进行替代，例如替代1、2或3到10、20或30个氨基酸。修饰过的多肽通常保留wnt信号分子的活性。也可对氨基酸进行保守的替代，例如按照下表所示进行替代。第二列中相同区块中的氨基酸和优选第三列中同一行中的氨基酸可互相替代。

脂肪族	非极性	GAP
		GAP	ILV
		极性-不带电	ILV	CSTM
	NQ			CSTM
	NQ		极性-带电	DE
	KR			DE
	KR	芳香族			HFWY

本发明范围内的变异体多肽可通过合适的方法，例如基因重排(分子繁殖)技术产生。

本发明的范围包括较短的多肽序列。例如，可认为只要表明具有Shoca的基本生物学功能性，长度至少为20个氨基酸或多至50、60、70、80、100、150或200个氨基酸的肽片段均属于本发明的范围。特别地，但非限制性地，本发明的这一方面包括这一情况，即蛋白是完整蛋白序列的一个片段并且可以代表LEF/TCF-结合区。可将这样的片段用于构建嵌合分子。Shoca的这种片段或其变异体也可用于产生抗Shoca的抗体。

WO 01/54733鉴定了(许多其它序列中的一个)长度为235个氨基酸的氨基酸序列，其相当于SEQ ID NO：7的氨基酸序列的220位残基到454位残基，但在WO 01/54733中没有确定该肽的功能，该肽不是本发明的优选片段。WO 01/53455鉴定了(许多其它序列中的一个)SEQ ID NO：931，该序列从第四个残基开始相当于SEQ ID NO：7的氨基酸序列的266位残基到454位残基，但在WO 01/53455中没有鉴定该肽的特殊功能，该肽不是本发明的优选片段。

本发明的多肽可以经化学修饰，如翻译后修饰。例如，它们可以被糖基化或含有修饰过的氨基酸残基。也可通过添加有助于纯化它们的组氨酸残基或通过添加促进它们转移定位于细胞核的核定位序列而对它们进行修饰。这样修饰过的多肽归于本发明的术语“多肽”的范围。

多核苷酸

本发明也包括编码Shoca或其变异体或它们的片段的核苷酸序列，此外，还包括与它们互补的核苷酸序列。该核苷酸序列可以是RNA或DNA，其中DNA包括基因组DNA、合成的DNA或cDNA。优选地，该核苷酸是DNA序列，更优选是cDNA序列。鼠和人Shoca-1的核苷酸序列信息分别如SEQID NOs：1和3所示，鼠和人Shoca-2的核苷酸序列信息分别如SEQ ID NOs：5和7所示。这样的核苷酸可按照本领域所熟知的方法从细胞中分离或合成，Sambrook等人(1989)以例子的方式介绍了这些方法。

典型地，本发明的多核苷酸包含一段连续的核苷酸序列，该核苷酸序列能在选择的条件下与SEQ ID NO：1的编码序列或编码序列的互补序列杂交。这些序列包括SEQ ID NOs：3、5和7所示的序列。

本发明的多核苷酸能与SEQ ID NO：1的编码序列或编码序列的互补序列杂交，其杂交水平显著高于背景。举例来说，由于在cDNA文库中存在其它的cDNA，可发生背景杂交。本发明的多核苷酸与SEQ ID NO：1的编码序列或其编码序列的互补序列之间相互作用产生的信号水平一般为其它多核苷酸与SEQ ID NO：1的编码序列之间相互作用产生的信号水平的至少10倍，优选至少100倍。可以测量相互作用的强度，例如通过放射性标记探针，如用³²磷(³²P)。选择性杂交一般可通过使用中等到高严谨性的条件实现。然而，这样的杂交可在本领域熟知的任何合适条件下进行(参见Sambrook等人，1989)。例如，如果需要高严谨性，合适的条件包括从0.1至02稀释比的SSC，温度从60℃至高达65℃。如果需要低严谨性，合适的条件包括2倍稀释比的SSC，温度为60℃。

SEQ ID NO：1、3、5或7的编码序列可由核苷酸替代来修饰，例如替代1、2或3至10、25、50或100个核苷酸。SEQ ID NO：1、3、5或7的多核苷酸可选择性地或额外地通过一个或一个以上插入和/或缺失和/或在任一末端或同时在两端延长来修饰。多核苷酸可包括一个或一个以上的内含子，例如，可以含有基因组DNA。修饰过的多核苷酸通常编码具有Shoca活性的多肽。选择性地，多核苷酸编码多肽的配体结合部分或编码具有调节Shoca活性的多肽。可以进行简并替代和/或可以进行下述替代，该替代会导致当经修饰的序列被翻译后产生保守的氨基酸替代，例如上表所示。

不同的Shoca蛋白在DNA水平上的同一性如下：人Shoca-1与小鼠Shoca-1具有80％同一性；人Shoca-2与小鼠Shoca-2具有75％同一性；人Shoca-1与人Shoca-2具有57％同一性；小鼠Shoca-1与小鼠Shoca-2具有59％同一性。

能选择性地与SEQ ID NO：1或3的DNA编码序列的互补序列杂交的核苷酸序列在SEQ ID NO：1的至少20、优选至少30如至少40、至少60，更优选至少100个连续核苷酸区域，最优选在SEQ ID NO：1的全长序列的区域内，通常与SEQ ID NO：1的编码序列具有至少50％、至少57％、至少60％、至少70％、至少80％、至少88％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。优选地，所述核苷酸序列编码与Shoca-1具有相同的结构域结构，即卷曲-螺旋的结构域和/或C-末端的SH2结构域的多肽。

举例来说，UWGCG软件包提供了BESTFIT程序，该程序可被用来计算同源性(如在它的默认设置下使用)(Devereux等(1984)《核酸研究(Nucleic Acids Research)》12，p387-395)。可用PILEUP和BLAST算法计算同源性或排列序列(典型地在它们的默认设置下)，如在Altschul(1993)J.Mol.Evol.36：290-300；Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10所描述的那样。

执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。这一算法涉及首先通过在查询序列中鉴别长度W的短的代码(word)来鉴别高分值的序列对(HSPs)，当与数据库序列中的相同长度的代码进行比对时，高分值的序列对匹配或满足某些阳性值的阈值得分T。T指的是邻近代码的分值阈值(Altschul等；1990)。将这些最初的邻近代码采样数(word hits)作为起始检索的种子(seed)以寻找含有其的HSPs。只要积累比对还在增加，就沿着每条序列向两个方向延伸所述的代码采样数。当积累比对分值从其最高达到值下降了质量X时；当一个或一个以上阴性分值的残基比对增加导致积累分值达到0或低于0；或当到达一条序列的端点时，在每个方向中停止所述代码采样数的延伸。BLAST算法参数的W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLAST程序使用的默认参数：代码长度(W)为11，BLOSUM62分值矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915-10919)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝4和两条链的比较。

BLAST算法对两个序列间进行相似性的统计学分析；参见，例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787以及Altschul和Gish(1996)Methods Enzymol.266：460-480。BLAST算法提供的一种相似性测定是最小总数概率(smallest sum probality)，P(N)，其标志着在两个核苷酸序列或氨基酸序列之间偶然出现的匹配的可能性。例如，如果在对第一个序列与第二个序列进行比较时，所述最小总数概率约小于1，优选约小于0.1，更优选约小于0.01，最优选约小于0.001，则认为该序列与另一个序列相似。

可以使用上面提到的序列同一性的程度和最小大小的任何联合来定义本发明的多核苷酸，优选更严紧的联合(即在较长的范围内有较高的序列同一性)。因此，例如在超过25个优选超过30个核苷酸内具有至少90％序列同一性的多核苷酸构成本发明的一个方面，在超过40个核苷酸内具有至少95％序列同一性的多核苷酸也如此。

本发明的核苷酸可用于在体外、体内或离体生产本发明的蛋白。所述核苷酸可参与重组蛋白的合成或者实际上凭其本身的资格作为治疗剂，在基因治疗技术方面使用。也可在基因治疗方面使用与编码Shoca的序列互补的核苷酸序列，或者反义序列。

本发明还包括含有编码本发明蛋白的核苷酸序列的表达载体。这样的表达载体通常用分子生物学领域的技术构建，例如，可以包括使用质粒DNA和合适的起始子、启动子、增强子以及其它元件如可以是必需的多聚腺苷酸信号；为使蛋白表达，这些元件以正确方向放置。其它合适的载体对本领域的技术人员来说是显而易见的。这方面的其它例子，可参考Sambrook等人编的书(1989)。

Shoca基因中AT6位点上游的侧翼序列对调节Shoca的表达起重要作用。优选在本发明的表达载体中包含使Shoca正确表达所必需的侧翼序列。

为产生反义RNA，也可以将本发明的多核苷酸以反义的方向插入上述载体中。也可以采用合成的方式产生反义RNA或其它的反义多核苷酸。这样的反义多核苷酸可以在本发明的分析中作为测试化合物使用或可用于治疗人或动物体的治疗方法中。

优选地，本发明的位于载体中的多核苷酸以可操纵的方式与控制序列连接在一起，所述控制序列能使宿主细胞表达编码序列，即所述载体是表达载体。术语“以可操纵的方式连接”是指毗邻，其中，所述组分以一种允许它们以各自设定的方式起作用的关系存在。将与编码序列“可操纵的连接”的调节序列如启动子以这种方式放置，即在与调节序列相兼容的条件下，编码序列得以表达。

载体可以是例如质粒、病毒或噬菌体载体，这些载体具有复制起始位点，选择性地，具有用于所述多核苷酸的表达的启动子以及选择性地，具有所述启动子的调节子。所述载体还可含有一个或一个以上的选择标记基因，例如细菌质粒的氨苄抗性基因或真菌载体的抗性基因。也可在体外使用载体，例如生产DNA或RNA或用来转染或转化宿主细胞，如哺乳动物宿主细胞。也可改造载体以在体内使用，例如在基因治疗方法中使用。

可以选择启动子和其它的表达调控信号，以使它们与指定用于表达的宿主细胞相兼容。例如，酵母启动子包括酿酒酵母(S.cerevisiae)的GAL4和ADH启动子、裂变酵母(S.pombe)的nmt1和adh启动子。哺乳动物启动子包括金属硫蛋白启动子，该启动子可被诱导以响应重金属如镉。可使用病毒启动子如SV40大T抗原启动子或腺病毒启动子，也可使用IRES启动子。所有这些启动子在本领域都是可轻易获得的。

可使用哺乳动物启动子如β-肌动蛋白启动子，特别优选组织特异性启动子。也可使用病毒启动子，例如莫洛尼氏鼠白血病病毒长末端重复(MMLV LTR)、劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、人巨细胞病毒(CMV)IE启动子、腺病毒、HSV启动子(如HSV IE启动子)或HPV启动子特别是HPV上游调控区(URR)。病毒启动子在本领域都是可轻易获得的。

载体还可包括位于所述多核苷酸侧翼的序列，这样产生的多核苷酸包含与真核基因组序列，优选哺乳动物基因组序列或病毒基因组序列同源的序列。这会使本发明的多核苷酸可通过同源重组的方式引入真核细胞或病毒基因组中。特别地，可将含有以病毒序列为侧翼的表达盒的质粒载体用于制备适于递送本发明的多核苷酸进入哺乳动物细胞的病毒载体。合适的病毒载体的其它例子包括单纯疱疹病毒载体和逆转录病毒(包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)和HPV病毒。使用这些病毒的基因传送技术是本领域技术人员已知的。如可将逆转录病毒载体用于稳定地整合多核苷酸从而使所述多核苷酸整合进入宿主基因组。对照来说，复制缺陷性的腺病毒载体始终是附加型的，因而可以用于瞬时表达。

本发明还包括为表达本发明的Shoca多肽而修饰的细胞。这样的细胞包括瞬时的或优选稳定的高等真核细胞系，如哺乳动物细胞或昆虫细胞(如杆状病毒表达系统的细胞)；低等真核细胞，如酵母或原核细胞系(如细菌细胞系)。可通过插入编码本发明的多肽的载体而修饰细胞，这些细胞的特例包括哺乳动物的胸腺上皮细胞、成纤维细胞、HEK293T、CHO、HeLa、BHK、3T3和COS细胞。本发明的多肽也可在转基因的非人类的动物，优选小鼠体内表达。本发明的范围包括表达本发明多肽的转基因的非人类的动物。

抗体

另一方面，本发明还涉及特异针对本发明多肽的抗体。例如，这样的抗体可用于与免疫沉淀技术有关的纯化、分离或筛选方法，或者，事实上，这些抗体自身就可作为治疗剂。抗体可以针对本发明多肽的特异性的表位而产生。

优选抗体针对如SEQ ID Nos：19、20和21的氨基酸序列而产生。

可使用抗体来削弱Shoca的功能。任何抗体或其它化合物与蛋白“特异地结合”，此时它以优势亲合力或高亲合力与它特异的蛋白结合，但实际上不结合或仅以低亲合力与其它蛋白结合。许多可用来确定抗体的特异性结合能力的竞争性结合或放射免疫分析的标准程序是本领域的技术人员熟知的(例如，参见Maddox等，J.Exp.Med.158，1211-1226，1993)。这些免疫分析通常涉及特异性蛋白及其与抗体之间形成的复合物并且涉及形成的复合物的测定。

本发明的抗体可以是针对人的多肽及其片段的抗体。就本发明的目的而言，术语“抗体”，除非另有规定与此相反，包括与本发明多肽结合的片段。这些片段除了单链抗体之外，还包括Fv、F(ab’)和F(ab’)₂片段。而且，所述抗体及其片段可以是嵌合抗体、CDR-移植抗体或人源化的抗体。

可以将抗体用于在生物样品中检测本发明的多肽的方法中，该方法包括：

I准备本发明的抗体；

II在允许形成抗体-抗原复合物的条件下将生物样品与所述抗体孵育；以及

III确定是否形成含有所述抗体的抗体-抗原复合物。

所述样品可以是例如组织提取物、血液、血清或唾液。可以将本发明的多肽与固相支持物结合和/或适当地包装进试剂盒中，其中还含有合适的试剂、对照、说明书等。抗体可以连接显色标记，这样可适用于在体内的Shoca显象方法。

本发明的抗体可以用任何合适的方法生产。制备和鉴定抗体的方法是本领域熟知的，例如，参见Harlow和Lane(1988)《抗体：实验手册(Antibodies：A Laboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。例如，可以通过在宿主动物体内激发针对完整多肽或其片段例如其抗原性表位(这里称“免疫原”)的抗体而生产抗体。

生产多克隆抗体的方法包括用免疫原免疫合适的宿主动物(例如实验动物)以及从所述动物血清中分离免疫球蛋白。因而，可以用免疫原接种动物，随后，从动物体内取出血液并且纯化IgG部分。

生产单克隆抗体的方法包括使产生所需抗体的细胞永生化。可通过将接种过的实验动物的脾脏细胞与肿瘤细胞融合来产生杂交瘤细胞。(Kohler和Milstein(1975)《自然(Nature)》256，495-497)。

可通过常规程序选择得到产生所需抗体的永生化的细胞。杂交瘤可在培养基中生长或腹腔内注射形成腹水或进入异源宿主或免疫应答减弱的宿主的血流中。人抗体可以通过以下方法制备，即体外免疫人淋巴细胞，之后用EB病毒转化淋巴细胞以及在转基因小鼠中生产人抗体。

合适的既能产生单克隆抗体又能产生多克隆抗体的实验动物是羊、兔子、大鼠或小鼠。如果需要，可以采用偶联物的形式施用免疫原，该偶联物中偶联了免疫原，例如通过将一个氨基酸残基的侧链与合适的载体偶联，而偶联免疫原。通常，载体分子是生理上可接受的载体。所得的抗体可被分离，如果需要，还可被纯化。

分析

本发明的一个重要方面是本发明的多肽在筛选方法中的用途。可使用筛选方法来鉴定与Shoca多肽或mRNA结合的物质。还可使用筛选方法来鉴定调节子，所述调节子可以是Shoca活性的抑制剂或激活剂，和/或使Shoca的表达上调或下调的物质。一般地，能结合Shoca、调节Shoca活性和/或调节Shoca表达的物质都能调节wnt信号传导途径。

任何合适的形式都可用于分析。概括地来说，这些筛选方法可包括将本发明的多肽与待测物质接触，监测所述待测物质与多肽的结合或测定Shoca的活性。也可将本发明的多肽与待测物质一起孵育。可以确定对Shoca活性的调节。在一个优选的方面，所述分析是基于细胞的分析。优选地，所述分析可以在微量滴定板的单个腔室中进行。优选采用能进行高通量筛选的分析形式。

可以通过将表达本发明多肽的细胞与某种待研究的物质接触并监测由该多肽所介导的效应来确定调节子的活性。表达多肽的细胞可在体外或体内。本发明的多肽可以是天然或重组表达的。优选地，所述分析在体外使用表达重组多肽的细胞来进行。优选地，对照实验在不表达本发明多肽的细胞内进行，以确定所观察到的反应是否是多肽被激活的结果。典型地，所述细胞将表达wnt信号传导途径的其它分子如β-连环蛋白、LEF和/或TCF。

鉴定能调节wnt信号传导途径的物质的方法基本上由以下步骤组成：

(i)准备本发明的多肽或编码所述多肽的本发明的多核苷酸以及待测物质；

(ii)将所述多肽或多核苷酸与待测物质接触；以及

(iii)监测所述多肽或多核苷酸与待测物质之间的任何相互作用，藉此确定待测物质是否能调节wnt信号传导途径。

所述多肽或多核苷酸与待测物质之间的相互作用可以通过监测所述多肽或多核苷酸与待测物质的结合来直接监测。优选监测所述待测物质与多肽或编码所述多肽的mRNA之间的直接结合。例如，可将放射性标记的待测物质与本发明的多肽孵育，并可监测所述待测物质与多肽的结合。

也可使用表达Shoca的细胞进行分析，并将这些细胞与待测物质共孵育。将该分析结果与在没有待测物质存在下进行相同分析所得的结果进行比较。可以准备组成性表达Shoca的细胞以用于Shoca功能的分析。作为选择，所述多肽或多核苷酸与待测物质之间的相互作用可以通过间接监测本发明多肽Shoca的活性来监测。能调节wnt信号传导途径的物质可以是Shoca活性的抑制剂或可以是Shoca活性的激活剂。

可以通过监测Shoca对细胞的刺激或抑制效应来确定Shoca活性，例如，通过监测细胞增殖、分化、生长或存活来监测。

可以通过监测本发明多肽的磷酸化情况来确定Shoca活性，并确定待测物质是否抑制或增强磷酸化作用。

Shoca在细胞核内直接或间接与LEF/TCF转录因子结合和/或与β-连环蛋白共联合。依赖于在细胞中的环境，Shoca可以在细胞核内抑制或激活β-连环蛋白-LEF/TCF介导的转录。为在这些转录中发挥效应，Shoca必须存在于细胞核。因此，可以通过监测本发明多肽在细胞内的定位，特别是转移定位进入细胞核内来确定Shoca活性。

可将本发明的方法用于鉴定抑制或增强Shoca与wnt信号传导途径的分子(如β-连环蛋白、LEF和/或TCF)结合的物质。依照本发明，鉴定能够调节wnt信号传导途径的物质的方法还可包含准备能与Shoca相互作用的wnt信号传导途径的分子。可使多肽或多核苷酸和待测物质以及wnt信号分子在适合所述多肽与wnt信号分子相互作用的条件下接触，而且可通过监测所述待测物质对多肽与wnt信号分子的相互作用来确定所述待测物质对多肽与wnt信号分子的相互作用的影响。优选地，wnt信号分子是β-连环蛋白、TCF、LEF或β-连环蛋白、TCF和/或LEF的任何组合。

也可通过以下方法来鉴定抑制本发明的多肽Shoca与wnt信号分子(如β-连环蛋白、LEF或TCF)的相互作用的物质：哺乳动物双杂交分析、酵母双杂交分析、酵母三杂交分析(蛋白-DNA相互作用分析)或其它的蛋白相互作用分析如免疫共沉淀或基于ELISA的技术。

也可以通过确定待测物质是否抑制或增强由本发明的Shoca多肽所调节的基因转录来鉴定能够调节wnt信号传导途径的物质。由此可在本发明的方法中监测待测物质对Shoca介导的基因表达的抑制或激活的影响。典型地，准备含有报告基因的报告基因构建体，该报告基因在LEF和/或TCF的转录调控之下；将本发明的多肽与待测物质在适合报告基因表达的条件下接触。可监测报告基因的表达，并将其与没有待测物质的对照实验中的表达相比较以确定所述待测物质是否调节Shoca的活性。

也可进行分析来鉴别调节Shoca表达的物质，例如使表达上调或下调的物质。总的来说，在这些分析中，本发明的多核苷酸与待测物质相接触。所述多核苷酸可以是mRNA；所述待测物质可以调节翻译。优选地，所述多核苷酸是DNA；所述待测物质优选调节转录。作为选择，例如可通过使用针对Shoca的抗体来实施这些分析以监测Shoca表达的水平。

也可进行额外的对照实验。

在以上分析中可被测试的合适的待测物质包括组合文库、定义的化学个体和化合物、肽和肽模拟物、寡核苷酸以及天然产物库，所述天然产物库如展示文库(例如噬菌体展示文库)和抗体产物库。

典型地，将筛选有机分子，优选分子量从50到2500道尔顿的有机小分子。候选产物可以是生物分子，所述生物分子包括糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、或其衍生物、结构类似物或其组合。候选物质可以从广泛的来源得到，这些来源包括合成的或天然的化合物库。可以对已知的药理学的物质进行定向或随机的化学修饰，所述化学修饰如酰化、烷化、酯化、酰胺化等以产生结构类似物。

例如，可以在最初的筛选中使用待测物质，即在每一反应筛选10个物质，并且，单独测试显示抑制或激活作用的这些批次的物质。待测物质的使用浓度可以从1nM到1000μM，优选从1μM至100μM，更优选从1μM至10μM。优选地，在待测物质存在时的Shoca的活性与在没有待测物质存在时Shoca表现的活性进行比较。作为抑制剂的待测物质可抑制50％的Shoca活性。此外，作为激活剂的待测物质可以增强Shoca活性达50％。

对于β-连环蛋白-TCF/LEF的转录活性，Shoca的活性是组织特异性的。例如，在胸腺上皮细胞，Shoca通过抑制这种转录活性起作用，而在成纤维细胞中，Shoca增强在LEF/TCF控制下的基因序列的转录。在一个实施方案中，本发明提供了一种鉴别与Shoca相互作用的细胞组分的方法，并且该方法负责确定Shoca的组织特异性活性。这样的方法通常包含在此所述的任何分析，所述分析用于鉴定wnt信号传导途径的调节分子，在该分析中待测物质是细胞组分。合适的待测物质包括如细胞粗提物、细胞提取物的一部分、从细胞提取物中纯化的蛋白或从目的细胞类型或组织中提取的蛋白。

本发明的另一方面是编码本发明Shoca多肽的多核苷酸在鉴定Shoca基因的突变中的用途，这些基因涉及人类疾病，特别是，涉及对癌症的易感性。鉴定这些突变可以用于辅助诊断这些疾病或了解对这些疾病的易感性，并用在分析这些疾病的生理学中。也可以在杂交研究上使用多核苷酸，以监测Shoca表达的上调或下调。可以用多核苷酸如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或其片段来鉴定等位基因变异体、基因组DNA以及种变异体。

诊断

本发明提供了一种检测Shoca基因编码的表达产物变异的方法。该方法可以包含确定细胞中表达的Shoca的水平或者确定表达产物中特异的改变。用于诊断目的的靶序列包括但不限于由序列相似性所鉴定的保守部分以及内含子/外显子结构的保守序列。可以与家族研究一起进行所述诊断，以确定在一个家族内目的突变是否与疾病表型共分离。

本发明者已展示了Shoca在许多不同细胞类型和瘤形成的组织中的表达。特别地，Shoca与截然不同的肿瘤类型包括乳腺癌、结肠癌和颈癌有关。发现在相当广泛的器官的正常组织中，要么Shoca为阴性要么低水平表达Shoca，而在这些组织中Shoca的表达与恶性程度较低的肿瘤形式相关。进一步地，在许多肿瘤中显示癌症的进程与Shoca表达的丢失一致。因此，Shoca是临床上与肿瘤相关的预兆标记物，所述肿瘤特别是乳腺癌、结肠癌和颈癌。也可将Shoca用作与良性组织变化相关的疾病的诊断标记物，所述疾病如乳腺病、顶分泌转化、管内增生、乳头状瘤和癌。

因此，在进一步的实施方案中，本发明提供了一种诊断癌症的方法，该方法通过确定在来自受试者的组织样品中Shoca表达的水平来诊断癌症。本发明还提供了一种预测肿瘤进程的方法，该方法通过确定在来自受试者的组织样品中Shoca表达的水平来预测肿瘤的进程。本发明也提供一种诊断与良性组织变化相关的疾病的方法，该方法通过确定在来自受试者的组织样品中Shoca表达的水平来诊断与良性组织变化相关的疾病，这些疾病如乳腺病、顶分泌转化、管内增生、乳头状瘤和癌。可以通过监测本发明的多肽或编码本发明多肽的mRNA的水平来确定Shoca表达的水平。可以使用任何合适的组织样品，例如活组织检查或切除的组织样品。优选地，所述癌症是乳腺癌、结肠癌或颈癌。

通过使用与Shoca相互作用的物质可以确定Shoca蛋白或mRNA的表达。使用本发明的筛选方法可以鉴定合适的物质。优选地，所述物质能够与Shoca蛋白特异地结合。更优选地，所述物质是本发明的抗体。

诊断癌症或预测肿瘤进程或诊断与良性组织变化相关的疾病如乳腺病、顶分泌转化、管内增生、乳头状瘤和癌的方法可包括以下步骤：

(i)鉴定能与Shoca相互作用的物质；

(ii)将来自人或动物实验者的样品与所述物质接触；

(iii)监测所述物质与样品的结合；以及

(iv)与来自没有癌症或所述疾病的人或动物实验者的样品中Shoca表达的水平比较，确定所述样品中Shoca的表达水平是否升高或降低。

可以采用从个体分离的多核苷酸来实施诊断程序或者，作为选择，可以原位直接在从活组织检查或切除术得到的患者组织的组织切片(固定和/或冰冻)上来实施诊断程序，此时不需要纯化核酸。例如，在Nuovo，G.J.，1992，《PCR原位杂交：操作规程和应用(PCR In SituHybridization：Protocols And Applications)》(Raven出版社，纽约)介绍了适合的程序。这些分析技术包括DNA或RNA印迹分析、单链构象多态性分析、原位杂交分析以及聚合酶链反应分析。这些分析既可揭示Shoca表达模式的定量方面的情况，也可揭示Shoca表达和/或组合物的定性方面的情况。

检测Shoca核酸分子的另外的诊断方法可涉及它们的纯化，如通过PCR(聚合酶链反应，美国专利号4,683,202所述的实验方案)，连接酶链反应(Barany，1991，《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》，88：189-193)，自我维持的序列的复制(Guatelli等，1990，《美国科学院院报》，87：1874-1878)，转录扩增系统(Kwoh等，1989，《美国科学院院报》，86(15)：1173-1177)，Q-β复制酶(Lizardi等，1988，《生物技术(Bio/Technology)》6：1197)或任何其它的核酸扩增方法(例如，Holland等人，1991，《美国科学院院报》，88：7276-7280)，然后使用本领域技术人员熟知的技术来检测所述扩增的分子。如果核酸分子以非常低的数目存在，这些检测方案对检测所述分子特别有用。

特别地，合适的诊断方法是基于芯片的DNA技术，如由Hacia等人，1996，《自然遗传学(Nature Genetics)》14：441-447；Shoemaker等，1996，《自然遗传学》14：450-456以及Welford等，1998，《核酸研究(Nucl.Ac.Res.)》，26：3059-3065所介绍的方法。简言之，这些技术涉及快速、精确分析大量核酸序列目的物的定量的方法。通过用寡核苷酸标记或使用固定的探针阵列，可以应用芯片技术以高密度阵列的形式来分离目的分子并在杂交的基础上筛选这些分子。

检测完成后，在给定的患者体内所见的结果可以与由正常患者和患有癌症的患者所组成的具有统计学意义的参考组的结果进行比较。用这种方法，可使检测到的Shoca编码的产物的数量或种类与各种癌症或对各种癌症的敏感性相关联。总的来说，在没有肿瘤的个体组织内只能见到低水平的Shoca表达或没有Shoca表达，因此，可以将Shoca在这些组织中的表达看作是肿瘤癌变的指示。

在已知患有肿瘤的个体体内，典型地，Shoca表达指示肿瘤不具强烈的侵袭性；在肿瘤细胞内，典型地，Shoca不表达指示肿瘤是恶性的。

治疗方法

本发明还提供了在个体中治疗癌症的方法，该方法包括：

(i)对来自个体的组织样品实施本发明的分析方法；以及

(ii)给个体施用抗癌剂。

本发明的另一方面是用如上所述的筛选技术鉴定的物质在治疗疾病病症如癌症中的用途，这些疾病病症对Shoca活性的调节是有反应的。特别地，这些物质可以用于治疗结肠癌、乳腺癌以及颈癌。所述治疗可以是治疗性的或是预防性的。

因此，本发明提供了一种能调节wnt信号传导途径的物质，该物质是由本发明的方法鉴定出来的，该方法用在治疗人体或动物体的方法中或用在对人体或动物体实施诊断的方法中。本发明也提供了由本发明的方法鉴定的物质在制造用于诊断或治疗癌症的药剂中的用途。

依照本发明，治疗癌症的方法实际上可由以下步骤组成：

(i)鉴定能调节Shoca活性的物质；以及

(ii)给需要所述物质的人或动物患者施用治疗有效量的所述物质。

需要治疗的人或动物患者可以由本发明的诊断方法鉴定。

所述物质的治疗有效量是指当给患癌症的患者施用所述物质时能改善患者的病症的量。如果癌症的一种或一种以上症状减轻，就可以说患者的病症得到改善。例如，所述物质可以杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤的进程。

按药学技术上的惯例，可以将按照上面概述的筛选方法鉴定的物质，与标准的药物学上可接受的载体和/或赋形剂一起制成制剂。例如，合适的物质可以溶解在生理盐水或注射用水中。制剂的精确性质依赖于多个因素，这些因素包括被施用的特定的物质以及期望的施用途径。在以下书中充分描述了合适的制剂类型：《雷明顿氏制药科学(Remington’sPharmaceutical Sciences)》，马克出版公司(Mack Publishing Company)，东宾夕法尼亚，第17版，1985，在此包括该书全部内容作为参考。

所述物质可以经由肠道或非肠道途径施用，如经过口、面颊、肛门、肺、静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、局部或其它合适的施用途径。

给患者施用治疗有效量的调节剂。可以按照多种参数来确定调节剂的剂量，特别是可以依照以下参数来确定：所使用的物质；待治疗的患者的年龄、体重和状况；施药的方式；以及所需的治疗方案。对任何特定患者，医生能够确定施药的方式和剂量。典型的日剂量为每千克体重从约0.1到50毫克，这需要按照特定的调节剂的活性，待治疗的患者的年龄、体重和状况，恶化的类型和严重程度以及施用的频率和途径而定。优选地，日剂量水平从5毫克到2克。

可以将编码能抑制或增强Shoca活性的本发明Shoca多肽的核酸或者反义核酸施用给哺乳动物。核酸如RNA或DNA，优选DNA是以载体的形式提供的，如上面描述的多核苷酸，该多核苷酸可在哺乳动物细胞内表达。

施用给哺乳动物用于基因治疗的核酸可以编码削弱功能的Shoca的变异体，如破坏内源性Shoca功能的显性负突变体或者可以编码增强内源性Shoca功能的组成性活性的Shoca变异体。

可以用任何可用的技术施用编码所述多肽的核酸。例如，可以用针注射将核酸导入，优选皮内、皮下或肌肉内注射。选择地，可以使用核酸递送设备如粒子介导的基因递送设备直接穿过皮肤递送核酸。核酸可以局部施用到皮肤或粘膜表面如通过鼻内、口、阴道内或直肠内施用。

可以通过多种已知的转染技术增强对核酸构建体的吸收，例如，包括使用转染剂的技术。这些转染剂的实例包括阳离子物质如磷酸钙和二乙氨乙基葡聚糖，以及脂质转染剂如lipofectam和transfectam。施用的核酸的剂量可变化。典型地，施用的核酸在1皮克至1毫克范围内，对于粒子介导的基因递送，优选1皮克至10微克，对于其它方式则优选10微克至1毫克。

以下实施例阐明了本发明。

实施例1.Shoca-1，参与wnt介导的信号传导的新型基因。

本发明人最近在小鼠和人体组织鉴定了一个新型基因，其产物直接参与wnt介导的信号传导。基因(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3)编码包含52kDa的衔接蛋白质的SH2结构域(由蛋白印迹杂交实验证明)，由此将该基因命名为Shoca(SH2-domain containing adaptor protein)-1。随后，通过在公共结构域中使用EST分析，鉴定了另一个与Shoca类似的基因(SEQ ID NO：5)。目前没有报道过这些基因在任何种属中的存在或功能。

通过使用小鼠Shoca-1的cDNA序列在EST数据库中进行的blast搜索发现了小鼠的Shoca-2。为得到全长的编码序列，使用部分EST序列进行了5’和3’RACE(cDNA末端快速扩增法)。之后，与小鼠Shoca-2具有同一序列的全长cDNA被提交给公共数据库(登记号为AK008803)。相似地，对人EST和人基因组数据库进行blast搜索，发现了人Shoca-2。在EST数据库中发现了人Shoca-2(登记号为AK024799)。人Shoca-2序列完全来自EST数据库。

人Shoca-1在染色体上定位于10q22-q23.1，人Shoca-2在染色体上定位于8pter-p23.3。另外，在公共结构域发现了与小鼠Shoca-1的N-末端部分对应的一段DNA序列。然而，在这一序列的开放阅读框中的一个错误引入了一个翻译错误。通过纠正这一错误(一个碱基对)，能正确翻译具有214个残基的氨基酸序列。

小鼠Shoca-1有一个拼接变异体，该变异体具有选择性的外显子1，并因此在该蛋白的N-末端具有一个不同的氨基酸序列。迄今为止，没有确定关于这一变异体在人体中存在的证据(基于Shoca-1区域的基因组序列)，并且不知道其是否具有任何生物学功能。小鼠Shoca-2和人Shoca-2的差别在于由几个氨基酸残基构成的一段氨基酸残基，似乎在单一外显子(基于人的基因组序列)中编码该段氨基酸残基。这一序列具有一些有趣的Prosite基序。迄今为止，不知道这一外显子是否包含在小鼠的某些转录本中或在人的某些转录本中是否缺乏这一外显子。

Shoca家族在小鼠和人的整个序列中都非常保守，揭示小鼠和人的Shoca-1之间序列同源性为约90％，Shoca-2之间为约70％。小鼠和人的直系之间的氨基酸序列显示91％的同源性和95％的相似性(图4)。本发明人也已经在斑马鱼(D.rerio)中检测到了两个Shoca家族成员(目前仅有已知登记号分别是AW419549和BE016614的EST序列)。已知的小鼠、人和斑马鱼的N-末端和C-末端序列惊人地相似，以此揭示了功能可能截然不同的非常保守的结构域。(图2和图3)。尽管具有SH2基序，Shoca-1几乎总是专门在细胞核内表达。丢失了N-末端前50个氨基酸的Shoca突变体不能从细胞质转移定位至细胞核，提示这一序列之内的基序包含有用于核定位的信息。已有预测揭示在人Shoca-1中56至63位(PPKTKRAA)具有包含NLS(核定位信号)的可能性超过30％。

实施例2.Shoca特异性抗体的产生

抗体制备物A

在发明人的研究所内生产了用于确定亚细胞定位的抗Shoca-1的抗体(兔多克隆血清)。使用不同批次，藉此使动物在反复加强免疫之后于不同时间取血。免疫原是与载体蛋白KLH偶联的小鼠Shoca-1来源的肽：

肽Shoca#0：NH₂-CLPDTSPPSPLTGPDRTWERPLRC-CONH₂

该肽代表了与小鼠Shoca-1的残基272至293位对应的一段22个氨基酸。为加强免疫，引入了N-末端和C-末端的半胱氨酸残基以使在蛋白载体上形成环。

抗体制备物B

由Eurogentec在两只兔子体内产生了实施例5的染色实验所用的抗Shoca-1的抗体，该抗体也代表了多克隆的制备物。染色所用的所有制备物使用装在柱上的肽进行亲和纯化。纯化过的血清取自四次加强免疫之后的单个动物。免疫原代表与载体蛋白KLH偶联的来源于小鼠Shoca-1的两个肽的混合物并伴随注射所述免疫原：

肽Shoca#1：NHCOCH₃-CGEGPGDKPYEEISEEC-COOH

肽Shoca#2：NHCOCH₃-ADEERSRRAQRARDEYRRC-CONH₂

肽#1代表小鼠Shoca-1蛋白序列从83至97位的一段15个氨基酸残基；肽#2代表小鼠Shoca-1蛋白序列从220至237位的一段18个氨基酸残基。为了使在蛋白载体上形成环以便于免疫(肽#1)或者为了在肽#2中引入C-末端的锚定残基，引入了N-末端(对于肽#1)和C-末端(对于两种肽)的半胱氨酸残基。两种肽都与载体蛋白偶联并被伴随注射至兔子体内。

抗体制备物C

由Eurogentec在兔子体内产生了人特异性的抗Shoca-1的抗体，该抗体也代表了多克隆的制备物。免疫原代表与载体蛋白KLH偶联的来源于人Shoca-1的肽，其中利用了添加至特异的Shoca序列的N-末端或C-末端的半胱氨酸残基以及异双功能交联剂MBS的优势。皮下注射所述肽-KLH的偶联物：

肽Shoca#3：NHCOCH₃-CGLRPPKTKRAASDKHIQC-COOH

肽#3代表人Shoca-1蛋白序列的从53位至69位的17个氨基酸残基。使用如下所述的装有肽的柱子来亲和纯化在染色实验中使用的制备物。纯化的血清获自经过四次加强免疫之后的单一动物。

粗制的抗血清经过0.45微米的过滤器过滤并在肽柱上进行亲和纯化。用来免疫动物的游离的肽通过其自由巯基与碘乙酰偶联的交联琼脂糖共价结合(SulfoLink Coupling Gel，Pierce#20401)。用半胱氨酸淬灭未结合的反应性碘乙酰基团。具有各自反应性的抗血清可结合在肽柱上。用0.1M，pH值3.0的甘氨酸洗脱结合于柱的部分。立即用1MTris-HCl中和洗脱液至pH值为7.0。将纯化的抗体对PBS(磷酸盐缓冲液，pH值为7.3)进行平衡，并在50kD的MWCO(分子量截留值)的柱子(Vivascience#VS0131)中浓缩。用BCA方法(Pierce#23223/23224)，用购买的兔IgG作为浓度标准(Peprotech#500-P00)测定蛋白的浓度。通过添加0.02％的叠氮化钠来稳定最终制备物。纯化的血清来自经过第四次加强免疫之后的单一动物。

抗体制备物D

产生了SH2结构域特异的抗Shoca-1的抗体，除了C-末端引入半胱氨酸残基作为锚定残基这一点不同之外，按照如同上述的制备抗体制备物C的方法亲和纯化该抗体。

肽Shoca#4：NHCOCH₃-DASGDFYSFLGVDPNRHC-CONH₂

肽#4代表人Shoca-1蛋白序列从376位到392位的17个氨基酸残基。这一序列片段在人和小鼠Shoca-1之间是相同的。将所述肽与如上所述的载体蛋白偶联并注射到兔子体内。

抗体制备物E

产生了人特异性的抗Shoca-2的抗体，并按照如同制备抗体制备物D中所述的方法进行亲和纯化。

肽Shoca#5：NHCOCH₃-QQMLADSINRMKC-CONH₂

肽#5代表人Shoca-2蛋白序列从181位至192位的12个氨基酸残基。这一段序列既与人Shoca-1没有序列同一性，也与小鼠Shoca-1或Shoca-2没有序列同一性。将该肽与载体蛋白偶联并注射到兔子体内。

抗体制备物的确定

为确定所述抗体制备物的特异性，在多种细胞和蛋白材料上进行了蛋白印迹分析。特别是，用抗体制备物B进行了印迹分析。用多种小鼠的Shoca-1构建体转染HEK293细胞，即1.用对照质粒转染HEK293；2.用没有标签的小鼠的Shoca-1转染HEK293；3.用小鼠Shoca-1的C-末端HA标签转染HEK293；以及4.未转染的HEK293。

抗体制备物B：在小鼠Shoca-1转染的HEK293细胞内看见与没标签的和HA标签的Shoca-1相对应的单一条带(数据未显示)。

抗体制备物C：在正确的分子量处，看见在人肿瘤细胞系NCI-H520的细胞核部分有一条单一的条带。当对小鼠TEC细胞进行染色时没有检测到条带，证明该制备物是人特异的。

抗体制备物D：采用抗体制备物D的印迹分析在小鼠TEC细胞内进行Shoca-1的核检测。使用小鼠胸腺上皮细胞的细胞质和细胞核部分：1.TEC1-2，细胞质；2.TEC1-2细胞核(数据没有显示)。对重组表达的小鼠Shoca-1的SH2结构域进行染色。分别用抗5个组氨酸的抗体和抗体制备物D进行了印迹分析。鉴定了小鼠Shoca-1的SH2结构域(包括组氨酸标签为14.5kDa)在细菌中的表达，诱导5个小时后，在上清液中检测到了较高水平的表达：1.诱导3小时后收集的上清；2.诱导5小时后收集的上清；3.诱导5小时后收集的沉淀(数据没有显示)；已经测试了对其它SH2结构域蛋白的特异性。用抗体制备物D未能使GST融合的Grb2-SH2染色而对照抗GST的抗体却染出了一条很好的条带。

按照下面的操作程序进行蛋白印迹分析。为得到全裂解物，将细胞悬浮在裂解缓冲液(75mM Tris pH8.0；100mM NaCl，1％NP-40，0.1mMAEBSF和蛋白酶抑制剂混合物)中，离心以除去碎片。收集上清，将相同量的蛋白在还原条件下、10％的Bis/Tris凝胶上进行SDS-PAGE。依据半干的印迹实验，将所述蛋白转移至PVDF膜上(缓冲液：25mM Tris，0.2M甘氨酸，20％乙醇)。在与亲和纯化的抗Shoca抗体(100-200ng/ml)孵育之前，将所述的膜用溶于TBST的5％奶粉封闭。在TBST中洗涤3遍之后，将膜与1∶2000稀释的HRP偶联的抗兔Ig抗体(Amersham/Pharmacia)孵育。最后，洗涤所述的膜并用ECL-plus(Amersham/Pharmacia)化学发光法显色。为得到细胞质对细胞核的裂解物，将细胞于裂解缓冲液A(10mM N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(Hepes)、10mM氯化钾(KCl)、0.1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、1mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、1mM二硫苏糖醇(DTT)、蛋白酶抑制剂混合物)中置于冰上溶胀15分钟。然后，加入NP-40至终浓度为0.6％，接着立即涡旋混匀10秒并离心30秒。将上清作为胞质提取物。沉淀在缓冲液A中洗一次，重悬在缓冲液B(20mM N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸，0.4M氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，1mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸，1mM二硫苏糖醇、蛋白酶抑制剂混合物)中，并在4℃涡旋30分钟。离心5分钟后，回收上清并将其作为细胞核提取物。

实施例3.Shoca-1和Shoca-2表达谱

Shoca-1在小鼠胸腺细胞内表达，其表达早至第一次检测到胸腺原基的时候，并且其也存在于裸鼠的胸腺中。因此，Shoca-1的表达独立于胸腺淋巴细胞的生成，并且特别是胸腺细胞和胸腺上皮细胞之间的结构上的交叉部分(cross-talk)。在骨髓中也检测到了Shoca-1的表达，特别是在已知支持血细胞的生成的间质细胞中。尽管Northern印迹分析(RNA印迹分析)对检测特异的转录本不够敏感，但PCR分析显示脑、肾和肺是Shoca-1以低丰度表达的其它位点(图6)。相反，在不同的组织中，Shoca-2的表达更常见(图6)。

实施例4.功能研究揭示Shoca-1在wnt/β-连环蛋白信号传导途径中位于上位

Shoca-1的体外功能分析揭示其在胸腺上皮细胞的表达抑制β-连环蛋白-LEF/TCF调节的报告基因激活的转录激活。该抑制依赖于功能性的SH2结构域，原因在于该结构域中的点突变消除了任何抑制功能(图7)。SH2结构域中的Arg350(小鼠Shoca-1的精氨酸350)变成了赖氨酸残基。该精氨酸位于pTyr口袋中，并且对SH2结构域的功能很关键(Sawyer，1998，《生物聚合物(Biopolymers)》47：243-261)。该氨基酸残基与包含SH2结构域配体的pTyr的pTyr侧链的磷酸氧形成重要的接触。此外，过表达Shoca-1的R/K突变体与细胞增殖的减少有关。用Shoca-1的特异性抗体进行的电迁移率变动分析揭示Shoca-1与LEF/TCF形成复合物。

这一发现已在独立的实验中进一步得到证实，在所述实验中编码TCF结合序列的DNA序列能捕获来自细胞核提取物的Shoca-1。在这些实验中，将包含TCF结合位点的生物素酰化的双链DNA衔接蛋白与来自鼠TEC 1-2细胞的细胞核提取物共孵育。用顺磁性的链亲和素珠子捕捉衔接蛋白(由此，与TCF结合位点形成的蛋白复合物)。洗涤珠子，将其与蛋白样品缓冲液混合，加样到PAGE凝胶上并转移印迹到硝酸纤维素膜上。用多克隆兔抗Shoca的抗体作为第一抗体来进行蛋白印迹分析。

与不仅包含LEF/TCF也包含β-连环蛋白的转录活性复合物的相互作用进一步被共聚焦显微镜术所证实，其显示Shoca与β-连环蛋白在细胞核内共定位。此外，在锂刺激之后，可以观察到Shoca-1磷酸化的增加。这可以被以下实验证实，即将鼠TEC 1-2细胞与包含20mM锂的培养基在不同的时间点孵育、用多克隆的兔抗Shoca抗体免疫沉淀Shoca-1、在PAGE凝胶上分离蛋白以及在蛋白印迹分析中用磷酸酪氨酸特异的抗体作为探针进行检测。

总之，这些数据支持在wnt/β-连环蛋白信号传导途径中，Shoca蛋白处于非常靠近中心和上位的位置。与在胸腺上皮细胞中观察到的相反，Shoca-1在成纤维细胞中的过表达刺激依赖于LEF/TCF的报告基因的转录，因此进一步证明组织特异的分子在功能和/或物理上与Shoca-1相互作用。因此，Shoca-1通过与另一分子形成可能的联合形式而可以发挥组织特异性抑制剂的功能。

实施例5.Shoca的组织限制性的表达及其在肿瘤发生过程中的作用

Wnt信号传导途径在成人组织中的主要作用是调节细胞增殖。APC或β-连环蛋白的组成型突变会导致过度增殖和形成癌。包含人的不同器官的正常和恶性组织的筛选阵列的结果揭示，许多肿瘤，主要是上皮细胞来源的肿瘤表达Shoca-1(表1)。

表1：Shoca-1表达的组织微阵列免疫染色

对一组组织微阵列(每组7个载物片(slide))进行分析以分析Shoca的表达。该组组织微阵列含有129个不同肿瘤分类中的约3000种肿瘤。首先在测试载物片上对免疫染色进行优化。认为如下所述的条件是优化的。然后，在一次实验中对该研究中使用的所有TMA载物片进行免疫染色。仅阴性对照反应在以后进行(当提供了试剂时)。按照下列操作程序完成免疫染色：

抗体：Shoca-1特异型B

载物片预处理：链霉蛋白酶，15分钟，37℃

过氧化物酶封闭：0.3％H₂O₂/甲醇，30分钟

抗体稀释：1∶32000

孵育：过夜(4℃)

检测系统：ABC；DAB

阳性对照：胸腺上皮细胞

阴性对照：产生所述抗体的动物血清(在提取抗体之后)

使用如上所述的条件，阴性对照反应完全为阴性，而对于Shoca-1抗体，在多种肿瘤和正常组织中观察到各种强度的染色。为了最大限度地增加内部一致性，在同一天，由一个病理学家对所有部分(染色的部分和对照部分)进行再检查。对于所有的肿瘤样品，评估阳性细胞所占的百分比并根据4级标准(0-3+)来记录染色的强度。使用随意选择的系统对肿瘤进行分类。

表2：肿瘤的分类

类别	定义
类别	定义	阴性微弱中度强烈	未染色0-50％细胞1+＞50％1+或＜50％2+＞50％2+或任何3+染色

似乎在许多不同的细胞类型和肿瘤组织中表达所述的蛋白。可能是在选定的免疫组化条件下被认为是阴性的组织中也表达该蛋白。尽管考虑到免疫组化具有的所有缺陷，仍认为在组织微阵列上确定的不同染色水平确实至少代表了Shoca-1的表达水平的不同。这意味着：标记为3+的肿瘤通常比标记为2+的肿瘤具有较高的表达水平；2+肿瘤比1+肿瘤具有较高的表达水平；1+肿瘤比标记为阴性的肿瘤表达更多的Shoca-1。

这些数据显示Shoca-1与包括乳腺癌、结肠癌和颈癌在内的不同肿瘤类型相关。对不同组织和肿瘤实体进行的广泛分析进一步显示大量器官的正常组织对于Shoca为低阳性至阴性，而这种分子的表达与这些组织中低恶性肿瘤的形式有关。此外，在许多肿瘤中癌症的进展与Shoca-1表达的丢失相符(表3)。这种结果特别令人感兴趣，原因在于就目前本发明人的知识而言，可获得极少的临床上相关的预测标记物，该标记物在乳腺癌、结肠癌和颈癌的肿瘤进程中被下调或丢失。

表3.Shoca的表达和恶性肿瘤的关系

实施例6.Shoca基因在人恶性肿瘤中的表达

在超过50个人癌细胞系中，通过逆转录聚合物酶链反应(RT-PCR)检测了Shoca-1和Shoca-2在恶性肿瘤中的作用，所述癌细胞系代表各种恶性肿瘤和癌发展中的不同阶段。

起始材料为利用Qiagen Rneasy Total RNA isolation kit(QiagenRneasy总RNA分离试剂盒)从培养的细胞系中分离的总RNA。从1微克总RNA起始，使用随机六聚物(Roche)引发逆转录反应(Titan One TubeRT-PCR(Roche))。对于Shoca-1和Shoca-2都在两轮中扩增cDNA。在两者的初轮PCR反应中，获得了全长的扩增产物，在第二轮PCR反应中对所述初轮PCR扩增产物的一部分进行扩增。使用的引物如下所示：

表4：PCR引物

用于Shoca-1的初轮PCR引物
用于Shoca-1的初轮PCR引物	名称核苷酸位置序列(5’-3’)
Shoca1 5’ TGC TGC AGC AGA TCC TGC AC	名称核苷酸位置序列(5’-3’)
Shoca1 5’ TGC TGC AGC AGA TCC TGC AC	Shoca1 3’ CCT GAA GTA ACT CTC CTC C
	Shoca1 3’ CCT GAA GTA ACT CTC CTC C
	Shoca_F1 n258-278 CCCTGGTGACAAGCCCTACGA
Shoca_R1 n710-731 ATAGCACGGAGCGAGTGGTGTC	Shoca_F1 n258-278 CCCTGGTGACAAGCCCTACGA
Shoca_R1 n710-731 ATAGCACGGAGCGAGTGGTGTC
用于Shoca-2的初轮PCR引物
用于Shoca-2的初轮PCR引物	Shoca2_F2 348-365 TCA CTC TGA AGA ATT CAC
Shoca2_R2 1063-1046 TGA GTG TGA GAA TTC CAT	Shoca2_F2 348-365 TCA CTC TGA AGA ATT CAC
Shoca2_R2 1063-1046 TGA GTG TGA GAA TTC CAT
用于Shoca-2反应的嵌套式PCR引物
用于Shoca-2反应的嵌套式PCR引物	Shoca2_F3 511-528 GAT CAC TCT CCA GTT CTT
Shoca2_R3 717-697 GGA TTT TCG CAG AGA TGCCTG	Shoca2_F3 511-528 GAT CAC TCT CCA GTT CTT

通过在0.8％琼脂糖凝胶上过夜电泳分离所述的PCR产物，并在用0.5微克/毫升的溴乙啶染色后在紫外线下检查。如下所述的表详细记录了结果。给出的结果为POS(阳性)，其表示检测到分子量正确的条带；和NEG(阴性)，其中没有检测到PCR产物。

表5：Shoca基因在各种人类癌细胞系中的表达

列出了54个细胞系中的20个细胞系的结果。其余34个细胞系对Shoca-1都为阴性而对Shoca-2都为阳性。

名称	肿瘤类型	Shoca-1	Shoca-2
名称	肿瘤类型	Shoca-1	Shoca-2	1.T47 D/62.PAN 023.U-874.T84 MCB5.NCI-H5206.KLE7.SK-LU-18.U-251 MG9.NCI-H12810.SCATT11.NCI-H46012.LoVo13.GLC-0814.Hep G215.HT137616.N41717.LN Cap18.U105MG19.SW 83720.Colo 32021.没有模板	乳房胰腺的成胶质细胞瘤来自结肠癌的肺met鳞状细胞瘤肺子宫内膜癌肺腺癌胶质瘤SCLC(小细胞肺癌)肾的大细胞肺癌结肠met位点锁骨上的SCLC肝细胞癌膀胱癌小细胞肺前列腺胶质瘤直肠腺癌结肠	NEGNEGNEGNEGPOSNEG未知NEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEGNEG	POSNEGPOSPOSPOSNEGPOSNEGNEGPOSPOSPOSPOSPOSPOSNEGPOSNEGPOSNEGNEG

Shoca-1的结果显示其极少在人类癌细胞系中表达，仅有一个(NCIH520)为明显的阳性。Shoca-2在人类肿瘤细胞中比Shoca-1表达得广泛得多。在54个检测的细胞系中仅7个为明显的阴性。这些阴性的细胞系为PAN02、KLE、U251MG、NCIH128、N417、U105MG和Colo320。这些肿瘤涵盖了6种不同的肿瘤类型，其中仅有胶质瘤被表示了2次。另一胶质瘤(U87)对于Shoca-2为阳性。

序列表

<110>巴塞尔州大学儿童医院

<120>核蛋白“Shoca”-一种wnt信号传导途径的成分

<130>P046B053616

<150>GB 0129278.8

<151>2001-12-06

<150>US 60/33617 6

<151>2001-12-06

<160>32

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>1296

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<220

<221>CDS

<222>(1)..(12 96)

<400>1

atg ctg cag cag atc ctg cag gac atg tac atc gac ccg gag ctg ttg 48

Met Leu Gln Gln Ile Leu Gln Asp Met Tyr Ile Asp Pro Glu Leu Leu

1 5 10 15

gcc gag ctc agc gat gtg cag aag cac atc ctc ttc tat aag atg cga 96

Ala Glu Leu Ser Asp Val Gln Lys His Ile Leu Phe Tyr Lys Met Arg

20 25 30

gag gag cag ctg cgg cga tgg agg gaa cgg gag gcg tgg gat gcc ctg 144

Glu Glu Gln Leu Arg Arg Trp Arg Glu Arg Glu Ala Trp Asp Ala Leu

35 40 45

gct cag gca gag ggc ctg agg ccc gca aag gtc aag aga gcg agc aac 192

Ala Gln Ala Glu Gly Leu Arg Pro Ala Lys Val Lys Arg Ala Ser Asn

50 55 60

aag cat ctc cag tgg ctt ctg gga gca gat ggt gag gtc tgg gtg tgg 240

Lys His Leu Gln Trp Leu Leu Gly Ala Asp Gly Glu Val Trp Val Trp

65 70 75 80

gtc atg ggc gaa ggc cct gga gac aag ccc tac gaa gag ata tct gaa 288

Val Met Gly Glu Gly Pro Gly Asp Lys Pro Tyr Glu Glu Ile Ser Glu

85 90 95

gaa ctg att gca gag agg gcc cgg ctg caa gca cag aaa gag gct gaa 336

Glu Leu Ile Ala Glu Arg Ala Arg Leu Gln Ala Gln Lys Glu Ala Glu

100 105 110

gag ctc tgg aga cag aag gaa gca gag atc acc aag aag ttc cgg gat 384

Glu Leu Trp Arg Gln Lys Glu Ala Glu Ile Thr Lys Lys Phe Arg Asp

115 120 125

gcc ttg gcc aat gag aaa gct cgg att ctg gca gag aag tgg aaa gtg 432

Ala Leu Ala Asn Glu Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Lys Trp Lys Val

130 135 140

gag atg gag gac cgc aag gct gct aaa att ttg gag gaa cgt ata cac 480

Glu Met Glu Asp Arg Lys Ala Ala Lys Ile Leu Glu Glu Arg Ile His

145 150 155 160

gag gaa ttc aag agg aaa gag gaa gaa gag agg cgg cga ggg gaa gaa 528

Glu Glu Phe Lys Arg Lys Glu Glu G1u Glu Arg Arg Arg Gly Glu Glu

165 170 175

cag att cgg ctc caa gag gag cag agg gca aag gaa ctc tac tgg act 576

Gln Ile Arg Leu Gln Glu Glu Gln Arg Ala Lys Glu Leu Tyr Trp Thr

180 185 190

ctg aag cag gcc cag ctg cac agc caa gcc agt gag aat gag gag cgt 624

Leu Lys Gln Ala Gln Leu His Ser Gln Ala Ser Glu Asn Glu Glu Arg

195 200 205

gaa tgg gaa gaa cag ctg cgg aga tcc aag gct gct gat gaa gag agg 672

Glu Trp Glu Glu Gln Leu Arg Arg Ser Lys Ala Ala Asp Glu Glu Arg

210 215 220

agc cgt cgt gct cag cga gcc cgg gat gag tac cgg cgc cat tca ctc 720

Ser Arg Arg Ala Gln Arg Ala Arg Asp Glu Tyr Arg Arg His Ser Leu

225 230 235 240

cga gcc atc cag aag ggc act gtt gct ggc cta agc acc atg ttc caa 768

Arg Ala Ile Gln Lys Gly Thr Val Ala Gly Leu Ser Thr Met Phe Gln

245 250 255

gag ctt ggc cag aac cac gag caa gag gca aga ctt tat cac caa ctt 816

Glu Leu Gly Gln Asn His Glu Gln Glu Ala Arg Leu Tyr His Gln Leu

260 265 270

cct gac acc agt cca cca tca ccc ctc aca gga cct gac agg acc tgg 864

Pro Asp Thr Ser Pro Pro Ser Pro Leu Thr Gly Pro Asp Arg Thr Trp

275 280 285

gag cga cct ctg cgt cca ctc tcc aga gaa gtc atc gtg cgc tgg ttc 912

Glu Arg Pro Leu Arg Pro Leu Ser Arg Glu Val Ile Val Arg Trp Phe

290 295 300

aag gag gaa cag ctg cct cgc cga gca ggc ttt gag agg aac acc aag 960

Lys Glu Glu Gln Leu Pro Arg Arg Ala Gly Phe Glu Arg Asn Thr Lys

305 310 315 320

tcc atc gcc cct tgg ttt cat gga att att agc cga gag agt gca gaa 1008

Ser Ile Ala Pro Trp Phe His Gly Ile Ile Ser Arg Glu Ser Ala Glu

325 330 335

gac ctt ctg gag aat atg acc gag gga gca ttt ctg gtc cgg gtc agt 1056

Asp Leu Leu Glu Asn Met Thr Glu Gly Ala Phe Leu Val Arg Val Ser

340 345 350

gag aag atc tgg ggt tat acc ctg tcc tac cgc ctg cag aga ggc ttc 1104

Glu Lys Ile Trp Gly Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Leu Gln Arg Gly Phe

355 360 365

aaa cac ttc ctt gtg gat gct tct ggg gac ttc tac agc ttt ctg gga 1152

Lys His Phe Leu Val Asp Ala Ser Gly Asp Phe Tyr Ser Phe Leu Gly

370 37 380

gtg gac cct aat cge cat gcc acc cta aca gat ctc att gat ttc cac 1200

Val Asp Pro Asn Arg His Ala Thr Leu Thr Asp Leu Ile Asp Phe His

385 390 395 400

aag gag gag atc atc act gtt tca ggg gga gag ttg cta cag gaa ccc 1248

Lys Glu Glu Ile Ile Thr Val Ser Gly Gly Glu Leu Leu Gln Glu Pro

405 410 415

tgt gga cag agg gat agc cca cca gac tat cac ctg ttg ttt gaa tga 1296

Cys Gly Gln Arg Asp Ser Pro Pro Asp Tyr His Leu Leu Phe Glu

420 425 430

<210>2

<211>431

<212>PRT

<213>小鼠

<400>2

Met Leu Gln Gln Ile Leu Gln Asp Met Tyr Ile Asp Pro Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Glu Leu Ser Asp Val Gln Lys His Ile Leu Phe Tyr Lys Met Arg

20 25 30

Glu Glu Gln Leu Arg Arg Trp Arg Glu Arg Glu Ala Trp Asp Ala Leu

35 40 45

Ala Gln Ala Glu Gly Leu Arg Pro Ala Lys Val Lys Arg Ala Ser Asn

50 55 60

Lys His Leu Gln Trp Leu Leu Gly Ala Asp Gly Glu Val Trp Val Trp

65 70 75 80

Val Met Gly Glu Gly Pro Gly Asp Lys Pro Tyr Glu Glu Ile Ser Glu

85 90 95

Glu Leu Ile Ala Glu Arg Ala Arg Leu Gln Ala Gln Lys Glu Ala Glu

100 105 110

Glu Leu Trp Arg Gln Lys Glu Ala Glu Ile Thr Lys Lys Phe Arg Asp

115 120 125

Ala Leu Ala Asn Glu Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Lys Trp Lys Val

130 135 140

Glu Met Glu Asp Arg Lys Ala Ala Lys Ile Leu Glu Glu Arg Ile His

145 150 155 160

Glu Glu Phe Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Arg Arg Arg Gly Glu Glu

165 170 175

Gln Ile Arg Leu Gln Glu Glu Gln Arg Ala Lys Glu Leu Tyr Trp Thr

180 185 190

Leu Lys Gln Ala Gln Leu His Ser Gln Ala Ser Glu Asn Glu Glu Arg

195 200 205

Glu Trp Glu Glu Gln Leu Arg Arg Ser Lys Ala Ala Asp Glu Glu Arg

210 215 220

Ser Arg Arg Ala Gln Arg Ala Arg Asp Glu Tyr Arg Arg His Ser Leu

225 230 235 240

Arg Ala Ile Gln Lys Gly Thr Val Ala Gly Leu Ser Thr Met Phe Gln

245 250 255

Glu Leu Gly Gln Asn His Glu Gln Glu Ala Arg Leu Tyr His Gln Leu

260 265 270

Pro Asp Thr Ser Pro Pro Ser Pro Leu Thr Gly Pro Asp Arg Thr Trp

275 280 285

Glu Arg Pro Leu Arg Pro Leu Ser Arg Glu Val Ile Val Arg Trp Phe

290 295 300

Lys Glu Glu Gln Leu Pro Arg Arg Ala Gly Phe Glu Arg Asn Thr Lys

305 310 315 320

Ser Ile Ala Pro Trp Phe His Gly Ile Ile Ser Arg Glu Ser Ala Glu

325 330 335

Asp Leu Leu Glu Asn Met Thr Glu Gly Ala Phe Leu Val Arg Val Ser

340 345 350

Glu Lys Ile Trp Gly Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Leu Gln Arg Gly Phe

355 360 365

Lys His Phe Leu Val Asp Ala Ser Gly Asp Phe Tyr Ser Phe Leu Gly

370 375 380

Val Asp Pro Asn Arg His Ala Thr Leu Thr Asp Leu Ile Asp Phe His

385 390 395 400

Lys Glu Glu Ile Ile Thr Val Ser Gly Gly Glu Leu Leu Gln Glu Pro

405 410 415

Cys Gly Gln Arg Asp Ser Pro Pro Asp Tyr His Leu Leu Phe Glu

420 425 430

<210>3

<211>1302

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1302)

<400>3

atg ctg cag cag atc ctg cac gac atg tac atc gac ccc gag ctc ctt 48

Met Leu Gln Gln Ile Leu His Asp Met Tyr Ile Asp Pro Glu Leu Leu

1 5 10 15

gcc gag ctc agc gat gtg cag aag cac atc ctc ttc tac aaa atg cgg 96

Ala Glu Leu Ser Asp Val Gln Lys His Ile Leu Phe Tyr Lys Met Arg

20 25 30

gag gag cag ctg agg cgc tgg aag gag cgg gag act tgg gag gcc ctg 144

Glu Glu Gln Leu Arg Arg Trp Lys Glu Arg Glu Thr Trp Glu Ala Leu

35 40 45

gcc cag gac gag ggt ctc agg cct cca aag acc aag cga gca gcg agt 192

Ala Gln Asp Glu Gly Leu Arg Pro Pro Lys Thr Lys Arg Ala Ala Ser

50 55 60

gac aag cac atc caa tgg ctc cta ggg gca gat ggc gag gtc tgg gtc 240

Asp Lys His Ile Gln Trp Leu Leu Gly Ala Asp Gly Glu Val Trp Val

65 70 75 80

tgg atc atg gga gaa ggc cct ggt gac aag ccc tac gaa gag atc tct 288

Trp Ile Met Gly Glu Gly Pro Gly Asp Lys Pro Tyr Glu Glu Ile Ser

85 90 95

gag gag ctg att gca gag agg gcg cgg ctg cag gca cag agg gaa gct 336

Glu Glu Leu Ile Ala Glu Arg Ala Arg Leu Gln Ala Gln Arg Glu Ala

100 105 110

gag gag ctc tgg aga cag aag gag gca gag atc acc aag aag ttc cgg 384

Glu Glu Leu Trp Arg Gln Lys Glu Ala Glu Ile Thr Lys Lys Phe Arg

115 120 125

gat gct ctg gcc aat gag aaa gcc cgg atc ttg gcg gag aag tgg aaa 432

Asp Ala Leu Ala Asn Glu Lys Ala Arg Ile Leu Ala Glu Lys Trp Lys

130 135 140

gtg gag atg gaa gac cgc aag gct gcc aaa gtc ctg gag gaa cgc atc 480

Val Glu Met Glu Asp Arg Lys Ala Ala Lys Val Leu Glu Glu Arg Ile

145 150 155 160

cac gag gaa ttc aag agg aaa gag gaa gag gag agg aag cga gga gaa 528

His Glu Glu Phe Lys Arg Lys Glu Glu Glu Glu Arg Lys Arg Gly Glu

165 170 175

gag cag att cgc ctc cag gaa gag cag agg gcg aag gag ctc tac tgg 576

Glu Gln Ile Arg Leu Gln Glu Glu Gln Arg Ala Lys Glu Leu Tyr Trp

180 185 190

acc ctg aag cag gct cag ctg cat tgc caa gcc agt gag aaa gag gag 624

Thr Leu Lys Gln Ala Gln Leu His Cys Gln Ala Ser Glu Lys Glu Glu

195 200 205

cga gag tgg gaa gaa cag ctg cgg aga tcc aag gcg gct gat gag gag 672

Arg Glu Trp Glu Glu Gln Leu Arg Arg Ser Lys Ala Ala Asp Glu Glu

210 215 220

agg agc cgc cga gcc cag cgc gcc cgg gac gag tac cga cac cac tcg 720

Arg Ser Arg Arg Ala Gln Arg Ala Arg Asp Glu Tyr Arg His His Ser

225 230 235 240

ctc cgt gct atc cag aag ggc acg gtc gct ggc ctc agc tcc atg ttc 768

Leu Arg Ala Ile Gln Lys Gly Thr Val Ala Gly Leu Ser Ser Met Phe

245 250 255

cgg gag ctt ggc cag agc cat gag cag gag gca aga ctc tac cac cac 816

Arg Glu Leu Gly Gln Ser His Glu Gln Glu Ala Arg Leu Tyr His His

260 265 270

ctc ccc gac ccg ggt ctg ccg cag ccc ctt gcc ctg ccg gtc agc agg 864

Leu Pro Asp Pro Gly Leu Pro Gln Pro Leu Ala Leu Pro Val Ser Arg

275 280 285

acc tgg gag cgc ccg ctg cgc cca gtc tcc aga gat gtc atc gtc cgc 912

Thr Trp Glu Arg Pro Leu Arg Pro Val Ser Arg Asp Val Ile Val Arg

290 295 300

tgg ttt aag gag gag cag ctg cct cgc cga gct ggc ttc gag agg aac 960

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Glu

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<400>12

Met Leu Arg Gln Ile Leu Ser Asp Met Phe Ile Asp Pro Asp Leu Leu

1 5 10 15

Ala Glu Leu Ser Glu Glu Gln Lys Gln Ile Leu Phe Tyr Lys Met Arg

20 25 30

Glu Glu Gln Ile Arg Arg Trp Lys Glu Arg Glu Ala Ala Met Glu Arg

35 40 45

Lys Glu Ser Leu Pro Val Lys Ser Arg Pro Lys Lys Glu Asn Gly Lys

50 55 60

Ser Val His Trp Lys Leu Gly Ala Asp Lys Gln Val Trp Val Trp Val

65 70 75 80

Met Gly Glu His His Leu Asp Lys Pro Tyr Asp Val Leu Cys Asp Glu

85 90 95

Ile Leu Ala Glu Arg Glu His Leu Arg Ala Ala Lys Asp Ser Glu Leu

100 105 110

Arg Lys Thr Gln Ser Leu Glu Leu Ala Asn Ser Leu Lys Ile Lys Ser

115 120 125

Gln Asn Cys Asp Leu Gln Ala Met Lys Lys Thr Glu Pro Gln Asn Val

130 135 140

Thr Arg Lys Ala Ala Ser Glu Glu Ala Ser Gly Gln Gly Pro Arg Ala

145 150 155 160

Ile Pro Thr Arg Lys Asp Asp Lys Ala Gln Thr Lys Pro

165 170

<210>13

<211>93

<212>PRT

<213>斑马鱼(Danio rerio)

<400>13

Met Leu Gln Gln Ile Leu Lys Asp Met Tyr Ile Asp Pro Asp Val Leu

1 5 10 15

Glu Ala Leu Asn Asp Glu Gln Lys Lys Met Leu Phe Leu Lys Met Arg

20 25 30

Glu Glu His Val Arg Arg Trp Lys Glu Arg Glu Glu Lys Leu Glu Arg

35 40 45

Glu Pro Leu Lys Pro Lys Ala Lys Thr Ala His Ser Lys Ser Val Ser

50 55 60Trp Leu Leu Gly Arg Asp Gly Asp Val Gln Val Ile Val Ile Gly Glu

65 70 75 80

Met Asp Glu Phe Lys Ser Ser Lys Ile Ile Tyr Ser Gly

85 90

<210>14

<211>139

<212>PRT

<213>斑马鱼

<220>

<221>misc feature

<222>(128)..()

<223>x未知

<400>14

Met Leu Gln Gln Ile Leu Ala Asp Met Tyr Ile Asp Pro Asp Val Leu

1 5 10 15

Glu Ala Leu Asn Glu Glu Gln Lys Lys Ile Leu Phe Phe Lys Met Arg

20 25 30

Glu Glu Gln Val Arg Arg Trp Lys Glu Arg Glu Glu Gln Glu Ser Lys

35 40 45

Gly Glu Ile Lys Lys Glu Lys Leu Arg Lys Lys Lys Gly Pro Cys Lys

50 55 60

Asn Val Ser Trp Leu Leu Gly Arg Asp Gly Asp Val His Val Cys Ile

65 70 75 80

Ile Gly Glu Ser Asp Val Leu Glu Ser Pro Lys Leu Ile Leu Ser Glu

85 90 95

Leu Arg Asn Asn Thr Thr Ala Asn Gly Asn Asn Ile Asn Arg Ala Asn

100 105 110

Ala Glu Ser Ile Lys Ser Ser Ser Ile Lys Leu Asn Arg Val Gln Xaa

115 120 125

Thr Ser Thr Glu Pro Gly Ile Gln Leu Leu Leu

130 135

<210>15

<211>107

<212>PRT

<213>智人

<400>15

Trp Phe His Gly Ile Ile Ser Arg Glu Asp Ala Glu Ala Leu Leu Glu

1 5 10 15

Asn Met Thr Glu Gly Ala Phe Leu Val Arg Val Ser Glu Lys Ile Trp

20 25 30

Gly Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Leu Gln Lys Gly Phe Lys His Phe Leu

35 40 45

Val Asp Ala Ser Gly Asp Phe Tyr Ser Phe Leu Gly Val Asp Pro Asn

50 55 60

Arg His Ala Thr Leu Thr Asp Leu Val Asp Phe His Lys Glu Glu Ile

65 70 75 80

Ile Thr Val Ser Gly Gly Glu Leu Leu Gln Glu Pro Cys Gly Gln Arg

85 90 95

Asp Ser Pro Pro Asp Tyr His Leu Leu Phe Glu

100 105

<210>16

<211>107

<212>PRT

<213>小鼠

<400>16

Trp Phe His Gly Ile Ile Ser Arg Glu Ser Ala Glu Asp Leu Leu Glu

1 5 10 15

Asn Met Thr Glu Gly Ala Phe Leu Val Arg Val Ser Glu Lys Ile Trp

20 25 30

Gly Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Leu Gln Arg Gly Phe Lys His Phe Leu

35 40 45

Val Asp Ala Ser Gly Asp Phe Tyr Ser Phe Leu Gly Val Asp Pro Asn

50 55 60

Arg His Ala Thr Leu Thr Asp Leu Ile Asp Phe His Lys Glu Glu Ile

65 70 75 80

Ile Thr Val Ser Gly Gly Glu Leu Leu Gln Glu Pro Cys Gly Gln Arg

85 90 95

Asp Ser Pro Pro Asp Tyr His Leu Leu Phe Glu

100 105

<210>17

<211>108

<212>PRT

<213>智人

<400>17

Trp Phe His Gly Ile Leu Thr Leu Lys Lys Ala Asn Glu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Thr Gly Met Pro Gly Ser Phe Leu Ile Arg Val Ser Glu Arg Ile

20 25 30

Lys Gly Tyr Ala Leu Ser Tyr Leu Ser Glu Asp Gly Cys Lys His Phe

35 40 45

Leu Ile Asp Ala Ser Ala Asp Ala Tyr Ser Phe Leu Gly Val Asp Gln

50 55 60

Leu Gln His Ala Thr Leu Ala Asp Leu Val Glu Tyr His Lys Glu Glu

65 70 75 80

Pro Ile Thr Ser Leu Gly Lys Glu Leu Leu Leu Tyr Pro Cys Gly Gln

85 90 95

Gln Asp Gln Leu Pro Asp Tyr Leu Glu Leu Phe Glu

100 105

<210>18

<211>107

<212>PRT

<213>小鼠

<400>18

Trp Phe His Gly Ile Leu Thr Leu Lys Lys Ala Asn Glu Leu Leu Ser

1 5 10 15

Thr Gly Val Pro Gly Ser Phe Leu Ile Arg Val Ser Glu Lys Ile Lys

20 25 30

Gly Tyr Ala Leu Ser Tyr Leu Ser Glu Glu Gly Cys Lys His Phe Leu

35 40 45

Ile Asp Ala Ser Ala Asn Ser Tyr Ser Phe Leu Gly Val Asp Gln Leu

50 55 60

Gln His Ala Thr Leu Ala Asp Leu Val Glu Tyr His Lys Glu Glu Pro

65 70 75 80

Ile Thr Ser Leu Gly Lys Glu Leu Leu Leu Tyr Pro Cys Gly Gln Gln

85 90 95

Asp Lys Leu Pro Asp Tyr Leu Glu Leu Phe Gln

100 105

<210>19

<211>24

<212>PRT

<213>小鼠

<400>19

Cys Leu Pro Asp Thr Ser Pro Pro Ser Pro Leu Thr Gly Pro Asp Arg

1 5 10 15

Thr Trp Glu Arg Pro Leu Arg Cys

20

<210>20

<211>17

<212>PRT

<213>小鼠

<400>20

Cys Gly Glu Gly Pro Gly Asp Lys Pro Tyr Glu Glu Ile Ser Glu Glu

1 5 10 15

Cys

<210>21

<211>19

<212>PRT

<213>小鼠

<400>21

Ala Asp Glu Glu Arg Ser Arg Arg Ala Gln Arg Ala Arg Asp Glu Tyr

1 5 10 15

Arg Arg Cys

<210>22

<211>19

<212>PRT

<213>小鼠

<400>22

Cys Gly Leu Arg Pro Pro Lys Thr Lys Arg Ala Ala Ser Asp Lys His

1 5 10 15

Ile Gln Cys

<210>23

<211>18

<212>PRT

<213>小鼠

<400>23

Asp Ala Ser Gly Asp Phe Tyr Ser Phe Leu Gly Val Asp Pro Asn Arg

1 5 10 15

His Cys

<210>24

<211>13

<212>PRT

<213>小鼠

<400>24

Gln Gln Met Leu Ala Asp Ser Ile Asn Arg Met Lys Cys

1 5 10

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>25

tgctgcagca gatcctgcac 20

<210>26

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>26

cctgaagtaa ctctcctcc 19

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>27

ccctggtgac aagccctacg a 21

<210>28

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>28

atagcacgga gcgagtggtg tc 22

<210>29

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>29

tcactctgaa gaattcac 18

<210>30

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>30

tgagtgtgag aattccat 18

<210>31

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>31

gatcactctc cagttctt 18

<210>32

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>32

ggattttcgc agagatgcct g 21

Claims

1.一种分离的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示。

2.一种编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求2或3所述的多核苷酸，该多核苷酸为cDNA或mRNA。

5.一种含有如权利要求2至4任一项所述的多核苷酸的表达载体。

6.一种含有如权利要求5所述的载体的宿主细胞。