CN101308143B - c-Jun参与经典Wnt信号转导途径的新功能 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选调节c-Jun蛋白与蓬乱蛋白相互作用的调节剂的方法。本发明还公开了一种可抑制c-Jun蛋白与蓬乱蛋白相互作用的物质，即Dvl1-M多肽。本发明首次揭示在Wnt信号转导途径中，c-Jun蛋白可与Dvl蛋白发生相互作用，从而影响Wnt下游的信号转导。由于Wnt途径下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，因此本发明为筛选抑制肿瘤发生发展的药物提供了新靶点。

Description

c-Jun参与经典Wnt信号转导途径的新功能

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及经典Wnt信号转导途径中的相互作用蛋白及其用途。

背景技术

信号转导是生物学研究的前沿领域之一，近年来发现在不同种族个体间，存在一个非常保守的信号通路，它的信号分子是一类糖蛋白超家族——Wnt蛋白，故称其为Wnt信号转导途径。Wnt信号分子家族在人种属中包括19个成员，目前发现不同的Wnt分子引起的信号反应有所差异，分为经典的Wnt信号转导途径(Wnt/β-连环蛋白(catenin))，例如Wnt3和Wnt8，及非经典Wnt信号转导途径(Wnt/Ca²⁺和Wnt/JNK途径)，例如Wnt11和Wnt5a。其中对经典Wnt信号途径研究较多。

经典Wnt信号转导途径控制了许多生命过程，这些过程包括生物体的生长、发育、疾病、衰老与死亡等等；也包括细胞形态与功能的分化与维持、免疫、应激、细胞癌变与细胞凋亡等等。经典Wnt信号转导途径在不同物种之间具有高度的保守性，通过对果蝇、爪蟾、小鼠等模式生物的研究，已经大体确立了经典Wnt信号转导途径的分子框架。发育过程中，特定的时间和特定的环境诱导下，某些组织或细胞群体分泌Wnt蛋白，结合受体卷曲蛋白(Frizzled)家族成员，和共受体低密度脂蛋白LRP5/6，将信号传递至细胞内。在没有Wnt信号刺激时，这条信号转导途径的关键分子β-连环蛋白(β-catenin)参与由Axin，结肠癌抑制因子(APC)，糖原合酶激酶3β(GSK3β)，酪蛋白激酶1(CK1)，以及β-TrCP蛋白形成的巨大的蛋白质复合物，在GSK3β和CK1作用下受到磷酸化标记，进而在β-TrCP蛋白介导的泛素化修饰后被蛋白酶体降解。在Wnt信号刺激下，胞内的Dishevelled(Dvl)和Frat等Wnt途径的正向调节分子抑制了Axin、APC和GSK3β等蛋白对β-连环蛋白的降解，促使β-连环蛋白在细胞质中大量积聚。部分β-连环蛋白进入细胞核，与核内的含有HMG-Box的转录因子-淋巴细胞增强因子1/T细胞转录因子(LEF1/TCF)家族的相互作用，启动下游靶基因的开放。

Wnt信号转导途径不仅影响胚胎发育中的体轴诱导、胚层建立、体节分化、组织或器官形成等一系列重要的早期事件，参与体细胞的分化和极化；而且在成体中Wnt信号途径的异常活化已经证明与多种肿瘤的发生密切相关。研究发现，大约90％的结肠癌都是由于Wnt信号转导途径的激活性突变而引起的，此外Wnt信号途径的异常活化还与一系列的肿瘤发生有关，比如小肠腺瘤、肝癌、胃癌、食道腺癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌中均发现了Wnt信号异常或者是转导途径中信号分子的突变。因此对Wnt信号转导途径的分子机制的研究和理解，有助于在治疗肿瘤中寻找新的药物靶点和理论依据具有重要意义。

经典Wnt信号转导途径的生物学功能主要是通过下游靶基因的表达而得以实现。而很多靶基因比如c-myc、cyclinD1，在细胞增殖中起到重要作用。研究表明，在很多癌症细胞里可以检测到β-连环蛋白在细胞核中的大量积累以及c-myc、cyclinD1的高表达，说明这些肿瘤细胞中Wnt信号转导途径下游的转录复合物处于高转录活性状态。因为转录复合物的活性高低直接关系到Wnt信号效应，因此对转录复合物的分子调控机制的研究具有十分重要的意义。

c-Jun蛋白最初是作为一种原癌蛋白在鸟恶性肉瘤病毒17中被发现的。在细胞中广泛地参与基因的转录调控。大量的实验已经表明由c-Jun蛋白和Fos蛋白异源二聚形成的AP-1转录因子对细胞癌化具有正向调控作用。例如，c-Jun蛋白在皮肤瘤和肝肿瘤的增殖过程中有着重要的作用，在基底层角化细胞中用c-Jun蛋白的一个显形负突变c-Jun(TAM67)来降低c-Jun/AP-1的活性或者在肝细胞中选择性失活c-Jun蛋白分别对化学诱导的刺瘤和肝肿瘤的增殖有抑制作用。

已有研究发现，经典Wnt信号途径中的β-连环蛋白/TCF转录复合物与c-Jun存在相互作用并且这一相互作用在肠癌形成过程中有着重要的作用。被JNK磷酸化后的c-Jun和TCF-4发生相互作用从而使得c-Jun基因启动子区域的TCF和c-Jun结合位点相互靠近，开启下游基因的转录。但是对c-Jun对依赖β-连环蛋白/TCF转录复合物的Wnt信号下游靶基因的转录尚不清楚。

综上，尽管目前对经典Wnt信号途径有所了解，同时有报道c-Jun可以和β-catenin/TCF形成转录复合物，然而对于c-Jun参加经典Wnt途径及其影响作用仍然有待于进一步的研究和论证。

发明内容

本发明的目的在于提供一种筛选调节c-Jun蛋白与蓬乱蛋白之间相互作用的调节剂的方法。

本发明的另一目的在于提供一种蓬乱蛋白的活性片段，其可用于制备调节(特别是抑制)c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间相互作用的调节剂(特别是抑制剂)，或用于筛选调节c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间相互作用的调节剂。

在本发明的第一方面，提供一种筛选调节c-Jun蛋白与蓬乱蛋白(Dishevelled，Dvl)相互作用的调节剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将候选物质与c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间相互作用的体系接触；和

(b)检测候选物质对c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间相互作用的影响；

其中，若所述候选物质可抑制或促进c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间的相互作用，则表明该候选物质是调节c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用的调节剂。

在本发明的另一优选例中，所述的相互作用是c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间发生结合。

在本发明的另一优选例中，所述的蓬乱蛋白选自：蓬乱蛋白1(Dvl1)、蓬乱蛋白2(Dvl2)或蓬乱蛋白3(Dvl3)。

在本发明的另一优选例中，步骤(a)包括：向c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用的体系中添加候选物质；和

步骤(b)包括：检测c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用的体系；

若测试组中c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用在统计学上低于(优选显著低于，如低20％；更优选的低40％)对照组，就表明该候选物质是抑制c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用的调节剂；

若测试组中c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用在统计学上高于(优选显著低于，如高20％；更优选的高40％)对照组，就表明该候选物质是促进c-Jun蛋白和蓬乱蛋白相互作用的调节剂。

在本发明的另一优选例中，所述体系选自：溶液体系、细胞体系、或组织体系。

在本发明的另一优选例中，所述体系中还包含Wnt蛋白。

在本发明的另一优选例中，所述的Wnt蛋白包括但不限于：Wnt1蛋白、Wnt3a蛋白、Wnt8蛋白。

在本发明的另一优选例中，所述方法还包括：对于筛选出的调节剂，进一步测试其对于Wnt信号途径下游基因的影响；如果其可上调Wnt信号途径下游基因的表达，则表明该调节剂是促进c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间的相互作用的促进剂；如果其可下调Wnt信号途径下游基因的表达，则表明该调节剂是抑制c-Jun蛋白和蓬乱蛋白之间的相互作用的抑制剂。

在本发明的另一优选例中，Wnt信号途径下游基因例如(但不限于)：哺乳细胞中的c-myc基因、cyclinD1基因、Axin2基因、LEF1基因、PPARdelta基因；或鱼类(如斑马鱼)细胞中的vox基因、tbx6基因。

在本发明的另一优选例中，所述的Wnt信号途径下游基因异常活化(如上调)导致肿瘤(如结肠癌)的发生。

在本发明的第二方面，提供一种通过所述的方法获得的调节c-Jun蛋白与蓬乱蛋白相互作用的调节剂。

在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，通过抑制c-Jun蛋白与蓬乱蛋白的相互作用，从而抑制Wnt信号途径下游基因异常活化。

在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是抑制剂，所述的抑制剂为一种多肽，含有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

在本发明的另一优选例中，所述的多肽还含有核定位信号蛋白(NLS)的氨基酸序列。

在本发明的另一优选例中，所述的核定位信号蛋白的氨基酸序列位于所述多肽的C末端。

在本发明的另一优选例中，所述的调节剂是一种核酸分子或其转录本(mRNA)，所述核酸分子含有SEQ ID NO：6所示的序列。

在本发明的第三方面，提供一种蓬乱蛋白的用途，用于筛选调节c-Jun蛋白与蓬乱蛋白之间相互作用的调节剂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A显示了c-Jun与Dvl的免疫共沉淀实验，证实c-Jun在细胞内可以和三种Dvl(Dvl1、Dvl2、Dvl3)发生蛋白质相互作用。

图1B显示了在体外Pull Down实验中，用抗Dvl3抗体(anti-Dvl3)免疫沉淀His-Dvl3可以共沉淀到GST-c-Jun。

图1C显示了只有在Wnt3a刺激的条件下Dvl3才能共沉淀到内源的c-Jun。

图2A显示了在HEK293T细胞中，当内源的c-Jun蛋白质水平下降后，能够显著地降低Wnt3a激活的Topflash报告基因活性，但并不影响β-连环蛋白在核内的积累。

图2B显示了在SW480细胞中，当内源的c-Jun蛋白质水平下降后，能够显著地降低Wnt3a激活的Topflash报告基因活性。

图2C(左边)显示了注射c-Jun-MO的胚胎中vox和tbx6的表达明显地较对照组(Ctr-MO)胚胎下降。

图2C(右边)显示了tbx6和vox表达正常以及明显下调的胚胎的统计情况。

图3A显示了Pull Down实验的结果，利用抗GST-M抗体免疫沉淀GST-M能够共沉淀得到His-c-Jun，而GST不能。

图3B显示了竞争结合实验的结果，在共转染了M-NLS-HA的情况下，利用抗Flag抗体免疫沉淀Dvl3-NLS-Flag不能共沉淀到c-Jun-HA。

图3C显示了在HEK293细胞中，M-NLS能够有效地抑制Wnt3a激活的Topflash活性，而单独的M片段则不能。

图3D显示了在SW480细胞中M-NLS对Topflash活性的抑制是剂量依赖的。

图3E显示了核染色质免疫沉淀的结果，在Wnt3a刺激下，Dvl3能够结合到Wnt信号下游靶基因c-myc的启动子区域，但在转染M-NLS片段后，Dvl3结合到c-myc启动子区域的数量显著地下降。

图3F(左边)显示了注射Dvl-M-NLS的mRNA的胚胎中vox和tbx6的表达明显地较对照组胚胎下降。

图3F(右边)显示了tbx6和vox表达正常以及明显下调的胚胎的统计情况。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现在经典Wnt信号转导途径中，c-Jun蛋白可与蓬乱蛋白(Dvl)在Wnt激活的条件下发生相互作用，从而帮助Dvl结合到Wnt信号下游靶基因c-myc的启动子区域，调节Wnt下游的信号转导途径。由于Wnt下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，因此依据该新发现的c-Jun蛋白和Dvl蛋白之间的相互作用机制，可提供通过抑制Wnt下游的信号转导从而实现抑制肿瘤发生的新的药物靶点。在此基础上完成了本发明。

c-Jun蛋白及其活性片段

本发明人发现，c-Jun蛋白可与Dvl蛋白发生相互作用。在本发明中，所用的c-Jun蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物。优选的，所述天然存在的c-Jun蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列基本上相同。此外，所述的c-Jun蛋白也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的c-Jun蛋白。优选的，本发明采用重组的c-Jun蛋白。此外，任何不影响c-Jun蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中，例如c-Jun蛋白的生物活性片段、衍生物，只要其也具有与Dvl蛋白相互作用的功能，并且不会带来其它不良影响。

蓬乱蛋白及其活性片段

目前发现的蓬乱蛋白(Dvl)家族成员有三种，即Dvl1、Dvl2、Dvl3，这三种蛋白具有较高的同源性。在以往的研究中，Dvl蛋白最初被作为一个细胞质蛋白参与经典Wnt信号的传递，它的主要功能是在细胞质中接受Wnt信号促使β-连环蛋白在细胞质中积累从而能够大量进入细胞核中启动下游靶基因的转录。近来，本领域人员发现Dvl蛋白不仅在细胞质中转导Wnt信号，而且在细胞核中也具有重要的作用，但对其作用机制尚不了解。

在本发明中，所用的Dvl蛋白可以是天然存在的，比如其可被纯化和分离自哺乳动物。优选的，所述天然存在的Dvl1蛋白的氨基酸序列可以与SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列基本上相同；Dvl2蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列基本上相同；Dvl3蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列基本上相同。此外，所述的Dvl蛋白也可以是重组制备的，比如可以根据常规的基因重组技术来生产重组的Dvl蛋白。优选的，本发明采用重组的Dvl蛋白。此外，任何不影响Dvl蛋白的生物活性的变化形式都可用于本发明中，例如Dvl蛋白的活性片段、衍生物，只要其也具有与c-Jun相互作用的功能，且不会带来其它不良影响，如可以是含有Dvl1蛋白第165-258位氨基酸的蛋白片段。

本发明还提供了一种由Dvl1蛋白的第165～258位氨基酸组成的多肽，本发明人将之命名为Dvl1-M多肽(片段)，其具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列。

所述的Dvl1-M多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选合成片段。所述的Dvl1-M多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。此外，任何不影响Dvl1-M多肽的生物活性的变化形式都可用于本发明中，例如Dvl1-M多肽的活性片段、衍生物或经过一个或多个氨基酸(通常为1-20个，较佳地1-10个，更佳地1-5个)缺失、插入和/或取代形成的变异体，只要其也具有与c-Jun相互作用的功能。

本发明还提供了Dvl1-M多肽的编码基因。所述的编码基因可以是单链的或是双链的。例如，所述Dvl1-M多肽的编码基因可具有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

优选的，为了使得Dvl1-M被定位到细胞核中，可将Dvl1-M与核定位信号(入核信号)相连接；更优选的，可在Dvl-M的C末端添加核定位信号。因此，本发明还提供了一种Dvl1-M-NLS蛋白，其能够与c-Jun蛋白相互作用。在细胞内，所述的Dvl1-M-NLS被定位到细胞核中，通过与c-Jun蛋白竞争结合，抑制细胞核内c-Jun蛋白与Dvl蛋白的相互作用。

所述的核定位信号是一种信号肽，其可帮助蛋白进入细胞核。本发明可采用任何不影响Dvl1-M与c-Jun相互作用的核定位信号。例如，所述的核定位信号具有氨基酸序列如下：DPKKKRKV DPKKKRKV DPKKKRKV(SEQ ID NO：7)。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法或人工合成法来大批量地获得有关序列。重组法通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

应用及筛选方法

在研究过程中，为了证实c-Jun与Dvl之间的相互作用，本发明人在人的胚胎肾细胞HEK293T细胞中瞬时转染外源的带有HA小肽标记的c-Jun和Flag标记的三种Dvl，利用免疫共沉淀(IP)技术来检测两者之间的相互作用情况。结果发现，只有共转染Dvl和c-Jun时c-Jun可以被检测到，说明c-Jun通过和Dvl相互作用，一起被Flag抗体吸附到珠子上而得以免疫沉淀。单独转染c-Jun无法在免疫沉淀样品中检测到c-Jun。可见c-Jun在细胞内和三种Dvl均可以发生蛋白质相互作用。

为了确定c-Jun和Dvl之间的蛋白质相互作用是否为直接作用，本发明人进行了体外Pull Down实验。结果发现，用Dvl3抗体免疫沉淀His-Dvl3可以共沉淀到GST-c-Jun，这说明c-Jun和Dvl之间蛋白质相互作用是直接的。并且，c-Jun和Dvl之间的蛋白质相互作用还受到Wnt3a信号的调节。

接着，本发明人利用Topflash报告基因活性系统来检测c-Jun在经典Wnt信号转导途径的功能。结果表明，c-Jun是经典Wnt信号转导途径中的一个新成员，对下游的β-连环蛋白-LEF-1/Tcf转录复合物的转录激活具有正向调节功能。进一步地，本发明人利用模式生物斑马鱼来检测c-Jun在Wnt信号途径中的功能。结果也表明，c-Jun是经典Wnt信号转导途径所必需的，是Wnt信号转导途径一个新成员。

本发明人还通过对Dvl缺失突变找到了Dvl上与c-Jun相互作用的片段M(165～258位氨基酸)。通过竞争结合实验发现，M-NLS-HA能够阻断Dvl和c-Jun之间的相互作用。在共转染了M-NLS-HA的情况下，Dvl3-NLS-Flag不能共沉淀到c-Jun-HA。以上实验说明，Dvl上的片段M是负责和c-Jun相互作用的片段。

为了进一步研究这个相互作用在Wnt/β-连环蛋白信号途径中的作用，本发明人将单独的M片段和带有入核信号的M片段分别转染入HEK293T细胞中，通过Topflash报告基因的活性来检测它们对转录复合物的转录活性的影响。结果发现，M-NLS能够有效地抑制Wnt3a激活的Topflash活性，而单独的M片段则不能。并且，在SW480细胞中，M-NLS对Topflash活性的抑制是剂量依赖的。以此可见，Dvl-M-NLS片段是在核里β-连环蛋白的下游发挥作用的，通过阻断Dvl和c-Jun的相互作用来抑制Wnt3a激活的转录活性。

本发明人还利用核染色质免疫沉淀的方法(Chip)来研究M-NLS片段对Wnt3a激活前后转录复合物的影响。结果表明，在经典Wnt信号途径中c-Jun帮助Dvl结合到Wnt信号下游靶基因c-myc的启动子区域，并且c-Jun和Dvl之间的相互作用对于β-连环蛋白-LEF-1/TCF转录复合物的形成是必需的。

最后，本发明人利用模式生物斑马鱼来检测c-Jun和Dvl之间的相互作用在生物体中的功能。结果表明，c-Jun和Dvl之间的相互作用在斑马鱼的发育过程中具有重要的功能，它是经典Wnt信号途径所必需的。

基于本发明人的上述新发现，对c-Jun蛋白或其活性片段与Dvl蛋白或其活性片段相互作用的研究有着多方面的用途，所述的用途包括(但不限于)：筛选抑制c-Jun蛋白或其活性片段与Dvl蛋白或其活性片段相互作用的物质，从而抑制经典Wnt信号转导途径的异常激活，以防治由于经典Wnt信号转导途径的异常激活导致的疾病，如肿瘤。

因此，本发明提供了一种筛选调节c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂的方法，通过向c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的反应体系中添加待筛选的候选物，并观察c-Jun蛋白与Dvl蛋白的相互作用情况来进行筛选。所述方法包括以下步骤：

(a)将候选物质与c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的体系接触；和

(b)检测候选物质对c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的影响；

其中，若所述候选物质可抑制或促进c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用，则表明该候选物质是调节c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂。

更优选的，步骤(a)包括：在c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的体系中添加候选物质；和步骤(b)包括：检测c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的体系。

作为筛选的条件，若测试组中c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用在统计学上低于(优选显著低于，如低20％；更优选的低40％)对照组，就表明该候选物质是抑制c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂；若测试组中c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用在统计学上高于(优选显著低于，如高20％；更优选的高40％)对照组，就表明该候选物质是促进c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂。

如本文所用，所述的“c-Jun蛋白和(或“与”)Dvl蛋白相互作用的体系”指一种体系，其中含有c-Jun蛋白和Dvl蛋白，并且c-Jun蛋白和Dvl蛋白可发生相互作用(如相互结合)。

在本发明中，所述的体系选自(但不限于)：溶液体系、细胞体系、亚细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。

作为本发明的优选方式，所述体系中还包含：Wnt家族蛋白。例如，所述的Wnt家族蛋白包括(但不限于)：Wnt1、Wnt3a、Wnt8。

调节c-Jun与Dvl相互作用的物质及其组合物

通过上述方法初步筛选出的调节剂可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于调节Wnt信号途径有用的药物。

本发明还提供了一种通过所述的方法筛选获得的调节c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的物质。例如，所述物质是抑制c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的物质，如抑制剂、拮抗剂、阻滞剂；或者，所述物质是促进c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的物质，如促进剂、激动剂。通常，抑制c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的物质可抑制Wnt信号途径的异常激活，从而可防治Wnt信号途径的异常激活导致的疾病，因此，c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的抑制剂、拮抗剂、阻滞剂是尤其有用的。

此外，针对本发明发现的c-Jun蛋白与Dvl蛋白之间的相互作用特性，还可设计一些通过竞争结合或抑制其中一种蛋白而阻止c-Jun蛋白与Dvl蛋白结合的物质。除了作为本发明的一种优选方式，提供了一种基于Dvl1设计的可通过竞争性结合c-Jun蛋白来阻止胞内c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的物质，即Dvl1-M多肽。更优选的，将Dvl1-M多肽与核定位信号(NLS)相连接，从而其在被导入细胞后，可直接被定位到细胞核中，在细胞核中阻止c-Jun蛋白与Dvl蛋白的相互作用。

作为本发明的另一种优选方式，所述的抑制剂也可以是一种c-Jun的小干扰分子，如siRNA，其可通过在转录水平上的基因沉默来下调基因的表达。本领域人员熟知制备这类小干扰分子的方法。

所述的c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂，可以施用于个体，用于调节细胞内Wnt信号途径的活性。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、或皮下给药。

本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有安全有效量的(a)c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。所述的c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的调节剂优选一种抑制剂，如Dvl1-M多肽。

目前，已知DNA序列，将该目的DNA序列引入到各种已知DNA分子(如载体)和细胞中是本领域中的常规技术，一般人员只要根据本发明的提示，都可以方便的进行操作。此外，将各种形式的突变引入到各种DNA分子中也是本领域熟知的技术。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞也是本领域技术人员熟知的常规技术。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用Mg Cl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。获得的转化子可以用常规方法培养，表达目的多肽。

在本发明中，检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如GST沉降技术、噬菌体展示技术、酵母双杂交系统或免疫共沉淀技术。在本发明的一个优选例中，采用了酵母双杂交系统来筛选与Dvl相互作用的蛋白。更具体的，在酵母细胞中，一种与DNA-结构域融合的诱饵蛋白与一种与活化域融合的猎物蛋白相互作用，所述猎物蛋白可以是已知的，也可以是从cDNA文库中选出来的。相互作用的成对分子结合于专一的序列模式，从而活化两个独立的报道基因的转录。

在本发明的一种优选方式中，采用免疫沉淀技术来验证蛋白与蛋白之间的特异性相互作用。所述的免疫共沉淀技术的原理是：在保持蛋白-蛋白相互作用的条件下，收获和裂解细胞，从细胞提取液中特异性地免疫沉淀目的蛋白，然后通过电泳等方法分离免疫沉淀物。具有已知特性的蛋白的共沉淀，可采用抗该蛋白的抗体，通过比如Western印迹来检测。此外，如果细胞在裂解前已经用标记物进行过标记，则可通过放射自显影或其它免疫学技术来观察共沉淀的蛋白。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示在经典Wnt信号转导途径中，Dvl蛋白与c-Jun蛋白在Wnt激活的条件下可发生相互作用，从而帮助Dvl结合到Wnt信号下游靶基因c-myc的启动子区域，调节Wnt下游的信号转导途径。

(2)由于已知Wnt途径下游的信号转导的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关，因此，依据本发明的新发现，可提供抑制Wnt下游的信号转导从而实现抑制肿瘤发生的新的药物靶点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1c-Jun的获得

本发明人以由Dvl1蛋白(序列参见SEQ ID NO：2)的第1-375位氨基酸(称为Dvl1-N7)构成的蛋白作为“诱饵”，通过酵母双杂交筛选小鼠10.5天胚胎库(Invitrogen)。采用的双杂交系统为ProQuest^TM Two-Hybrid System(购自Invitrogen)，具体的实验方法见该双杂交系统所提供的使用说明书。结果得到缺失N端73个氨基酸的c-Jun克隆。

实施例2c-Jun和Dvl蛋白质相互作用

1.c-Jun在细胞内可以和三种Dvl发生蛋白质相互作用

为了进行进一步的研究，本发明人设计了人c-Jun基因两端的引物并分别在N端和C端引入XhoI和NotI酶切位点，所述的引物为：

正向：CTAGCTCGAGGACTGCAAAGATGGAAAC(SEQ ID NO：8)

反向：ATAAGAATGCGGCCGCTCAAAATGTTTGCAACT(SEQ ID NO：9)

以常规方法制备的人cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长c-Jun的序列，然后用XhoI/NotI进行双酶切，将酶切产物分别克隆入pCMV载体(购自Bioscience)的XhoI/NotI酶切位点中以及pET28c的SalI/NotI酶切位点中，构建出可分别在真核细胞和原核细胞中表达的质粒pCMV/c-Jun和pET28c/c-Jun。

Dvl家族含有三个成员，分别为：Dvl1、Dvl2和Dvl3。

Dvl1基因的获得：

设计引物如下：正向：5’-CTAGTCTAGAGGCGGAGACCAAAATCA-3’(SEQID NO：12)，反向：5’-CTAGCTCGAGCATGATGTCCACAAAGAA-3’(SEQ IDNO：13)。以常规方法制备的鼠cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长Dvl1的序列。

Dvl2基因的获得：

设计引物如下：正向：5’-CTAGTCTAGAGGCGGGTAGCAGCACT-3’(SEQID NO：14)，反向：5’-CTAGCTCGAGCATAACATCCACAAAGA-3’(SEQ ID NO：15)。以人cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长Dvl2的序列。

Dvl3基因的获得：

设计引物如下：正向：5’-CTAGTCTAGAGGGCGAGACCAAGAT-3’(SEQ IDNO：16)，反向：5’-CTAGCTCGAGCATCACATCCACAAAGA-3’(SEQ ID NO：17)。以人cDNA库为模板，通过PCR反应得到含有全长Dvl3的序列。

为了证实c-Jun与Dvl之间的相互作用，本发明人构建了带有HA标记的c-Jun和Flag标记的三种Dvl的表达载体pCMV/c-Jun-HA，pCMV/Dvl1-Flag，pCMV/Dvl2-Flag，pCMV/Dvl3-Flag。其中，pCMV/c-Jun-HA如下构建：以XhoI和NotI酶切c-Jun，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pCMV/HA(购自Bioscience，自带HA标签)中。pCMV/Dvl1-Flag如下构建：以XbaI/XhoI酶切Dvl1，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pCMV/Flag(购自Bioscience，自带Flag标签)中。pCMV/Dvl2-Flag如下构建：以XbaI/XhoI酶切Dvl2，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pCMV/Flag中。pCMV/Dvl3-Flag如下构建：以XbaI/XhoI酶切Dvl3，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pCMV/Flag(购自Bioscience)中。

首先在人的胚胎肾细胞HEK293T细胞(ATCC)中瞬时转染(分别转染或同时转染)外源的带有HA小肽标记的c-Jun和Flag标记的三种Dvl的表达载体pCMV/c-Jun-HA，pCMV/Dvl1-Flag，pCMV/Dvl2-Flag，pCMV/Dvl3-Flag。转染24小时后，收细胞，用1×裂解缓冲液(NP401％，甘油10％，NaCl0.135M，Tis-Cl PH8.0，PMSF0.5M，PPi1mM，NaF10mM，Na₃VO₄2mM)裂解细胞，离心(14,000rpm/10min)后取上清，加入抗Flag抗体(anti-Flag，购自Sigma)和protein A/G Plus agarose珠子，低温旋转3小时，离心(5000rpm/1min)收集珠子，通过Western印迹检测珠子上所带的蛋白(上述过程即PullDown实验)。IgG在加入Flag抗体的时候加入到对照管中，作为抗体的负对照。

结果由图1A所示，只有共转染Dvl和c-Jun时，c-Jun可以被抗Flag抗体检测到，说明c-Jun通过和Dvl相互作用，一起被Flag抗体吸附到珠子上而得以免疫沉淀。单独转染c-Jun无法在免疫沉淀样品中检测到c-Jun。这提示c-Jun在细胞内可以和三种Dvl发生蛋白质相互作用。

2.c-Jun和Dvl之间的蛋白质相互作用是直接作用

为了确定c-Jun和Dvl之间的蛋白质相互作用是否为直接作用，本发明人分别从大肠杆菌中表达得到了GST-c-Jun和His-Dvl3。首先构建了包含GST-c-Jun和His-Dvl3的重组质粒pGEX-4T-2-c-Jun和pET28c/His-Dvl3。pGEX-4T-2-c-Jun构建如下：以XhoI/NotI酶切c-Jun，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pGEX-4T-2(购自Novagen，自带GST)中。pET28c/His-Dvl3构建如下：以SalI/NotI酶切Dvl3，将酶切产物克隆入经过同样酶切的pET28c/His(购自Novagen，自带His标签)中。

重组表达质粒pGEX-4T-2-c-Jun和pET28c/His-Dvl3分别转化大肠杆菌BL21，接种单克隆菌落于LB培养液，37℃培养过夜；取上述过夜菌1：100接种于新鲜的LB培养基中，22℃培养至A600为0.6～0.8，分别加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，表达GST-c-Jun的菌液达终浓度100μM，表达His-Dvl3的菌液达终浓度1μM，22℃培养16h。离心收集菌体，将菌体溶于含有0.5mg/ml溶菌酶的破菌缓冲液中，液氮冻融，反复三次，加入DNase I至终浓度为25mg/ml以及MgSO₄至终浓度20mM，冰上消化至不粘，高速离心(16000rpm/20min)后取上清得到破菌抽提物，进行体外Pull Down实验(方法同前述“1”)。结果由图1B所示，在体外Pull Down实验中用抗Dvl3抗体(anti-Dvl3，购自SantzCruz)免疫沉淀His-Dvl3可以共沉淀到GST-c-Jun，这说明c-Jun和Dvl之间蛋白质相互作用是直接的。

3.c-Jun和Dvl之间相互作用需要Wnt3a的刺激

为了进一步证实c-Jun和Dvl在内源是否存在相互作用，本发明人分别收获Wnt3a(Wnt3a通过收获wnt3a/NIH3T3细胞的培养上清获得，wnt3a/NIH3T3细胞及其培养方法参见尹宗生，张辉等，《第四军医大学学报》，Vo1???.26，No.24，p2212-2215，2006)刺激或不刺激的HEK293T细胞，其中重组质粒的构建以及转染入细胞等步骤同前。分离细胞核得到核组分上清，分别用IgG和抗Dvl3抗体(anti-Dvl3)免疫沉淀内源的Dvl3。

结果如图1C所示，只有在Wnt3a刺激的条件下Dvl3才能共沉淀到内源的c-Jun。

综上，这些实验一致证明，c-Jun和Dvl在体内存在蛋白质相互作用并且这种相互作用受到Wnt3a信号的调节。

实施例3c-Jun在经典Wnt信号转导途径的功能

主要利用Topflash报告基因活性系统来检测。

Topflash报告基因来源于Upstate公司；报告基因的活性检测采用：Luciferase Reporter Gene Assay，High Sensitivity，来源于Roche公司，检测方法参见同时提供的使用说明书。根据c-Jun的序列，设计针对c-Jun的siRNA序列如下：5’-GUCAUGAACCACGUUAACA dTdT-3’(SEQ ID NO：10)，该序列直接转染即可。

在人的胚胎肾细胞293T细胞和结肠癌细胞SW480细胞(购自ATCC，是APC蛋白功能缺失的结肠癌细胞株)中转染上述含荧光素酶启动子区带有Tcf结合位点的报告基因，绿色荧光蛋白，c-Jun的小分子干扰RNA(siJun)。转染约48小时，换液用含有Wnt3a(其用量为可以激活报告基因10～15倍的量)的培养基进行刺激约6小时。收细胞，24孔盘中每孔加200ul1×裂解缓冲液(Roche)裂解细胞5分钟，在测活的96孔板中每点加40ul细胞裂解液，在加入20ul荧光酶底物(Roche)，在酶标仪中计荧光量。以荧光值反映转录复合物的转录活性。siCtr为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT-3’(SEQ ID NO：11)，直接用于转染。Ctr为不利用Wnt3a进行刺激，其它条件相同。

结果如图2A所示，在HEK293T细胞中利用RNA干扰技术沉默c-Jun的基因表达，当细胞中内源的c-Jun蛋白质水平下降后，能够显著地降低Wnt3a激活的Topflash报告基因活性，但并不影响β-连环蛋白在核内的积累。

同样，在SW480细胞中，当内源的c-Jun蛋白质水平下降后，也能显著地抑制Topflash报告基因活性，如图2B所示。

上述数据一致表明，c-Jun是经典Wnt信号转导途径中的一个新成员，通过在Wnt3a刺激下直接和β-连环蛋白-LEF-1/Tcf形成转录复合物，对下游基因的转录激活具有正向调节功能。

进一步地，本发明人利用模式生物斑马鱼来检测c-Jun在Wnt信号途径中的功能。在斑马鱼胚胎一至四细胞的时期注射含c-Jun和/或c-Jun mRNA(用量10mM)的吗啉代反义寡核苷酸(morpholino antisense oligonucleotide(MO))(即c-Jun-MO和/或c-Jun mRNA)，分别在胚胎发育的二个时期：动物极细胞包被40％和胚盾(shield)时期收获胚胎，利用常规的原位杂交的技术来检测Wnt信号途径下游基因vox和tbx6的表达(参见：《Zebrafish》，由Christiane Nusslein-Volhard和Ralf Dahm主编，Oxford UniversityPress，2002)。对照为同样条件下注射MO的斑马鱼胚胎(Ctr-MO)。

结果如图2C所示，注射c-Jun-MO的胚胎中vox和tbx6的表达明显地较对照组胚胎下降(图2C左边)，对83个胚胎统计后有68.7％的胚胎对tbx6的表达有明显下调，对119个胚胎统计后有57.2％的胚胎对vox的表达有明显下调(图2C右边)，并且这一现象在同时注射c-Jun mRNA的时候能够被解除。这一结果表明了c-Jun是经典Wnt信号途径所必需的，是Wnt信号途径的一个新成员。

实施例4c-Jun与Dvl的相互作用对于经典Wnt信号转导途径是必需的

本发明人通过常规的缺失突变技术对Dvl1进行缺失突变，并验证各突变体与c-Jun蛋白的相互作用情况。结果发现，Dvl1上第165～258位氨基酸是与c-Jun发生相互作用的片段(Dvl1-M，简称M)。为了便于后续的克隆，在Dvl1-M基因片段的末端分别设置SalI/NotI酶切位点的序列。

首先，构建了含有His-c-Jun和GST-M的重组质粒pET28c/His-c-Jun和pGEX-4T-2-M。pET28c/His-c-Jun构建方法如下：利用XhoI/NotI酶切c-Jun，将酶切产物克隆入经同样酶切的pET28c/His(购自Novagen，自带His标签)中。pGEX-4T-2-M的构建方法如下：利用SalI/NotI酶切M，将酶切产物克隆入经同样酶切的pGEX-4T-2中。将上述构建的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21，在大肠杆菌BL21中分别表达得到His-c-Jun和GST-M蛋白。通过Pull Down实验(过程与前述类似)发现，His-c-Jun和GST-M之间存在直接相互作用，如图3A所示，利用GSH-Sepharose4B的树脂免疫沉淀GST-M能够共沉淀得到His-c-Jun，而GST不能。

进一步地，本发明人构建了含有入核信号(NLS)的pCMV/M-NLS-HA、pCMV/Dvl3-NLS-Flag质粒。pCMV/M-NLS-HA的构建如下：利用引物退火后二端带有的XbaI/NotI酶切位点的粘端，将NLS的基因序列(序列为：5’-CTAGACTAGACCTAGCTCGAGGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAG-3’(SEQ ID NO：18))引入pCMV/HA中，形成pCMV/NLS-HA；然后再利用SalI/NotI酶切M，将酶切产物克隆入经同样酶切的pCMV/NLS-HA中，获得pCMV/M-NLS-HA。pCMV/Dvl3-NLS-Flag的构建方法与前述类似。

在HEK293T中共转染上述含有入核信号的pCMV/M-NLS-HA、pCMV/Dvl3-NLS-Flag以及pCMV/c-Jun-HA质粒，使细胞中表达M-NLS-HA、Dvl3-NLS-Flag、c-Jun-HA。通过竞争结合实验发现，M-NLS-HA能够阻断Dvl3和c-Jun之间的相互作用。

结果如图3B所示，在共转染了M-NLS-HA的情况下，利用抗Flag抗体(anti-Flag，购自Sigma)免疫沉淀Dvl3-NLS-Flag不能共沉淀到c-Jun-HA。以上实验说明，Dvl上的片段M是负责和c-Jun相互作用的片段。

为了进一步研究Dvl与c-Jun之间的相互作用在Wnt/β-连环蛋白信号途径中的作用，本发明人将含有单独M片段的pCMV/HA-M(M在HA的N端，构建方法：在M片段的两端设置酶切位点XbaI/XhoI，将之克隆入pCMV/HA的相应位点中)和带有入核信号的M片段pCMV/NLS-HA-M分别转染入HEK293T细胞中，通过Topflash报告基因的活性来检测它们对β-连环蛋白-LEF-1/Tcf转录复合物的转录活性的影响(Topflash报告基因来源Upstate公司，报告基因的活性检测采用：Luciferase Reporter Gene Assay，High Sensitivity，来源于Roche公司)。以常规的LacZ作为空白质粒对照，并且，Wnt3a为在HEK293T细胞的培养基中加入Wnt3a的情况，Ctr为不利用Wnt3a进行刺激、其它条件相同的情况。

结果如图3C所示，M-NLS能够有效地抑制Wnt3a激活的Topflash活性，而单独的M片段则不能。由图3D所示，在SW480细胞中M-NLS对Topflash活性的抑制是剂量依赖的，其中，“—”表示没有M-NLS表达，“+”表示含有100ng量的M-NLS，“++”表示含有300ng量的M-NLS。

上述结果进一步证实，Dvl1-M-NLS片段是在核里β-连环蛋白的下游发挥作用的(SW480细胞是APC蛋白功能缺失的结肠癌细胞株)，通过阻断Dvl和c-Jun之间的相互作用来抑制Wnt3a激活的转录活性。

同时，本发明人利用核染色质免疫沉淀的方法(ChIp)来研究M-NLS片段对Wnt3a激活前后转录复合物的影响。在HEK293T细胞中瞬时转染含有M-NLS片段的质粒pCMV/M-NLS-HA。转染24小时后，通过甲醛固定细胞，超声裂解细胞，预结合步骤得到可用于免疫沉淀的上清，分别加入IgG、抗Dvl3抗体和proteinA/G Plus agarose珠子进行免疫沉淀，然后进行洗涤和洗脱得到可用于PCR扩增的样品，最后通过Agarose电泳检测。以GAPDH作为PCR阴性对照。

结果如图3E所示，在Wnt3a刺激下，Dvl3能够结合到Wnt信号下游靶基因c-myc的启动子区域，但在转染M-NLS片段后，Dvl3结合到c-myc启动子区域的数量显著地下降。

上述结果说明，在经典Wnt信号途径中，c-Jun帮助Dvl结合到Wnt信号下游靶基因c-myc的启动子区域，并且c-Jun和Dvl之间的相互作用对于β-连环蛋白-LEF-1/TCF转录复合物的形成是必需的。

最后，本发明人利用模式生物斑马鱼来检测c-Jun和Dvl之间的相互作用在生物体中的功能。在斑马鱼胚胎一至四细胞的时期注射Dvl1-M-NLS的mRNA，分别在胚胎发育的二个时期：动物极细胞包被40％和胚盾(shield)时期收获胚胎，利用常规的原位杂交的技术来检测Wnt信号途径下游基因vox和tbx6的表达。以在斑马鱼一细胞期的胚胎中注射绿色荧光蛋白(GFP)的mRNA为对照。

结果如图3F所示，注射Dvl-M-NLS的mRNA的胚胎中vox和tbx6的表达明显地较对照组胚胎下降(图3F左边)，对64个胚胎统计后有73.4％的胚胎对tbx6的表达有明显下调，对69个胚胎统计后有52.2％的胚胎对vox的表达有明显下调(图3F右边)。这一结果表明了c-Jun和Dvl之间的相互作用在斑马鱼的发育过程中的功能，它是经典Wnt信号途径所必需的。

综上，本发明人的研究揭示了c-Jun参与经典Wnt信号途径的分子机制，揭示了c-Jun与Dvl之间的相互作用的重要性。从研究中发现的片段Dvl1-M-NLS抑制c-Jun参与经典Wnt信号调控来抑制肿瘤发生这个角度来看，提供了很好的筛选模型方案和为设计分子药物提供了作用的靶位点。

实施例5筛选抑制c-Jun与Dvl之间相互作用的物质

如实施例2中“1”所述相同的方法，分别构建带有HA小肽标记的c-Jun和Flag标记的Dvl1的表达载体pCMV/c-Jun-HA、pCMV/Dvl1-Flag。

测试组：添加候选物且共转染有pCMV/c-Jun-HA和pCMV/Dvll-Flag的HEK293细胞体系。

对照组：未添加候选物且共转染有pCMV/c-Jun-HA和pCMV/Dvl1-Flag的HEK293细胞体系。

采用如实施例2的PullDown实验方法，检测测试组以及对照组中c-Jun蛋白与Dvl1蛋白相互作用情况。

如果与不添加候选物质的对照组相比较，添加候选物质后c-Jun蛋白与Dvl1蛋白的相互作用明显被抑制(如利用抗Flag抗体免疫沉淀共转染Dvl1-Flag和c-Jun-HA的体系无法沉淀到c-Jun-HA)，则说明该候选物质是抑制c-Jun蛋白与Dvl蛋白相互作用的物质，因而是一种预期可影响Wnt信号转导途径的物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>c-Jun参与经典Wnt信号转导途径的新功能

<130>071527

<160>18

<170>PatentIn version3.3

<210>1

<211>331

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

<210>2

<211>690

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>2

<210>3

<211>736

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>3

<210>4

<211>716

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapiens)

<400>4

<210>5

<211>94

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>5

<210>6

<211>282

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>6

<210>7

<211>24

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>MISC FEATURE

<223>核定位信号

<400>7

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>9

<210>10

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>小干扰分子

<400>10

                                 

<210>11

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>小干扰分子

<400>11

                                  

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>13

                             

<210>14

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>14

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>15

                           

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>16

                             

<210>17

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>17

                             

<210>18

<211>93

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>核定位信号

<400>18

Claims (2)

1.一种调节c-Jun蛋白与蓬乱蛋白相互作用的调节剂，所述的调节剂是抑制剂，所述的抑制剂为一种多肽，其氨基酸序列由SEQ ID NO:5与核定位信号蛋白的氨基酸序列组成；核定位信号蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，且氨基酸序列SEQ ID NO:7位于SEQ ID NO:5的C末端。

2.如权利要求1所述的调节剂，其特征在于，SEQ ID NO:5的氨基酸序列由SEQ ID NO:6所示的序列编码。

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