CN107889463A

CN107889463A - 用三种完全人类单克隆抗egfr抗体的组合治疗具有表皮生长因子受体（egfr）的胞外结构域的突变的患者的方法

Info

Publication number: CN107889463A
Application number: CN201680035207.XA
Authority: CN
Inventors: S·阿里纳; A·巴德利; J·D·卡恩斯; B·B·沃尔夫; R·C·内林; H·王
Original assignee: Merrimack Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Merrimack Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2018-04-06
Also published as: KR20170138539A; WO2016172584A9; AU2016252877A1; JP2018516870A; IL255138A0; HK1250736A1; US20160311908A1; MA41948A; CA2983890A1; WO2016172584A1; EP3286219A1

Abstract

本文提供通过向患者给药寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合(例如，MM‑151，包括第一单克隆抗体(P1X)、第二单克隆抗体(P2X)和第三单克隆抗体(P3X)，其中P1X、P2X和P3X呈2:2:1摩尔比)治疗所述人类患者中的表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症的方法。在一个实施例中，所述癌症包括选自由EGFR R451C、S464L、K467T、G465R、G465E、I491M及S492R组成的群组的EGFR的所述胞外结构域中的至少一个突变。

Description

用三种完全人类单克隆抗EGFR抗体的组合治疗具有表皮生长因子受体(EGFR)的胞外结构域的突变的患者的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求以下美国临时申请的优先权和权益：2015年4月24日提交的第62/152,707号、2015年10月22日提交的第62/244,991号、2016年3月15日提交的第62/308,697号和2016年4月15日提交的第62/323,475号。前述申请的内容在此以引用的方式并入本文中。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)是通常通过结合例如表皮生长因子(EGF)的多种胞外配体中的任一种在经活化时向细胞的内部传递信号(包含驱动细胞增殖的促有丝分裂信号)的HER/ErbB受体家族中的细胞表面跨膜受体。

例如西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)的靶向EGFR的单克隆抗体针对表达EGFR的肿瘤并不是始终有效的。在许多情况下，对这些抗体制剂作出反应且受益于这些抗体制剂的患者最终对治疗产生继发性抗性。这种抗性的一个原因是产生呈现肿瘤细胞对西妥昔单抗和/或帕尼单抗无反应的EGFR的胞外结构域中的一或多个突变。

旨在改进抗EGFR抗体功效的一种方法是研发靶向EGFR的胞外结构域上的不同位点(表位)的抗EGFR单克隆抗体(即，寡克隆抗体)的混合物。参见例如PCT国际公开案第WO/2011/140254号和美国专利案第7,887,805号。这些研发已产生使得能够鉴定癌症患者的需求，所述癌症患者的肿瘤具有呈现其对单克隆抗EGFR抗体无反应的特征，使得此类患者可以经由给药寡克隆抗EGFR抗体接受有效治疗。本公开满足这一需求并提供其它益处。

发明内容

本文提供治疗已进展或变得对单克隆抗EGFR抗体(例如，西妥昔单抗或帕尼单抗)不应的癌症患者和针对所述癌症患者选择治疗的方法，所述方法包括测定患者的肿瘤细胞是否已获得编码胞外结构域的EGFR基因区中的突变，其中所述经选择治疗包括与EGFR胞外结构域结合的抗EGFR抗体的寡克隆混合物。

还提供预测肿瘤(例如，恶性肿瘤)是否将对用如本文所描述的寡克隆抗EGFR抗体治疗作出反应而不对用单一单克隆抗EGFR抗体(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗)或Sym004治疗作出反应的方法，所述方法包括测定患者的肿瘤细胞是否已获得编码胞外结构域的EGFR基因区中的突变。

另外提供治疗患有含有具有EGFR胞外结构域中的至少一个突变的细胞的肿瘤的患者的方法，所述方法包括向患者给药有效量的与EGFR胞外结构域(例如，在单一组合物中)结合的抗EGFR抗体的寡克隆混合物。

在一个实施例中，所述经选择抗EGFR抗体的寡克隆混合物包括：(a)包括分SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列和分别SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体；(b)包括分SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:10、SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体；和(c)包括分别SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体。

在另一实施例中，所述经选择抗EGFR抗体的寡克隆混合物包括：(a)包括重链可变区(包括SEQ ID NO:19)和轻链可变区(包括SEQ ID NO:20)的单克隆抗体；(b)包括重链可变区(包括SEQ ID NO:21)和轻链可变区(包括SEQ ID NO:22)的单克隆抗体；和(c)包括重链可变区(包括SEQ ID NO:23)和轻链可变区(包括SEQ ID NO:24)的单克隆抗体。

可以采用的其它抗EGFR寡克隆抗体组合物描述于PCT国际公开案第WO/2011/140254号和对应申请中的美国专利公开案第号和对应申请中的美国专利案第9,044,460号中和申请中的美国专利案第9,226,964号和第7,887,805号(“寡克隆应用(OligoclonalApplications)”)中，以及与其它抗EGFR抗体组合的此类抗体的寡克隆混合物适用于治疗癌症，例如，恶性(赘生性)肿瘤。

在一个实施例中，所述经选择寡克隆抗体(例如，包括(a)、(b)和(c))在2:2:1的摩尔比下(例如，在一组成物中)与彼此组合。

在另一实施例中，患者对与胞外结构域结合的单克隆抗体疗法(例如，西妥昔单抗、Sym004或帕尼单抗)中的一或多个是不应的。在另一实施例中，患者对于含氟嘧啶疗程、含奥赛力铂疗程或含伊立替康(irinotecan)疗程具有疾病进展或遵循所述疗程。在另一实施例中，患者在用抗肿瘤剂预先治疗后已进展或变得对抗肿瘤疗法不应。在另一实施例中，患者在用抗肿瘤剂预先治疗之后已变得对抗肿瘤疗法具有抗性。在另一实施例中，在用抗肿瘤剂预先治疗之后在疾病进展或复发后治疗患者。在另一实施例中，在用抗肿瘤剂治疗失败之后治疗患者。在另一实施例中，癌症经鉴定为已获得对抗肿瘤剂具有抗性的癌症。

在另一实施例中，患者已经诊断患有结肠直肠癌、转移性结肠直肠癌(例如，KRAS、NRAS和/或BRAF野生型转移性结肠直肠癌)、鳞状细胞头颈癌、复发性或转移性头颈癌、黑素瘤、乳癌、卵巢癌、肾癌、肠胃癌/结肠癌、肺癌(例如，NSCLC)或前列腺癌。

在又其它实施例中，根据本发明的方法测试和/或治疗的肿瘤是皮肤、中枢神经系统、头部、颈部、食道、胃、结肠、直肠、肛门、肝、胰脏、胆管、胆囊、肺、乳房、卵巢、子宫、子宫颈、阴道、睾丸、生殖细胞、前列腺、肾脏、输尿管、膀胱、肾上腺、垂体、甲状腺、骨骼、肌肉或结缔组织的肿瘤。

在一个实施例中，基于FDA批准的测试，肿瘤经测定以包括具有EGFR胞外结构域中的至少一个突变的细胞。在另一实施例中，肿瘤含有具有EGFR胞外结构域的结构域III中的突变的细胞。在另一实施例中，肿瘤含有具有EGFR基因的外显子12中的突变的细胞。

在某些实施例中，本发明的方法包括获得肿瘤的活检样本，和使用聚合酶链反应或下一代测序(NGS)测定肿瘤是否具有编码EGFR的胞外结构域的DNA或RNA中的至少一个突变。在另一实施例中，所述方法包括获得肿瘤的活检样本，和使用免疫组织化学或质谱法测定肿瘤是否具有EGFR的胞外结构域中的至少一个突变。在另一实施例中，所述方法包括从患者获得血液样本，和测定血液样本是否含有具有编码EGFR的胞外结构域的序列中的一或多个突变的循环DNA。

在特定实施例中，循环DNA是从血液样本中分离或从血液样本中的循环肿瘤细胞中分离的无细胞DNA。在其它实施例中，循环DNA是从血液样本中的循环外来体中分离的DNA或RNA。在其它实施例中，循环DNA是从尿样本中分离的无细胞DNA。在其它实施例中，活检肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或无细胞DNA具有编码EGFR的胞外结构域的DNA或RNA中的至少一个突变，且所述至少一个突变在EGFR基因的外显子12中。

另一实施例，EGFR的胞外结构域中的突变是蛋白质序列改变或导致蛋白质序列改变的DNA或RNA编码区，所述突变选自主要由EGFR R451C、S464L、K467T、G465R、G465E、I491M和S492R组成的群组。在特定实施例中，蛋白质序列改变是S492R。

在另一实施例中，本文所描述的治疗方法包括给药与一或多种其它抗肿瘤剂(例如，其它化学治疗剂或其它小分子药物)组合的抗EGFR抗体。在一个实施例中，在治疗周期内给药不多于三种其它抗肿瘤剂。在另一实施例中，在治疗周期内给药不多于两种其它抗肿瘤剂。在另一实施例中，在治疗周期内给药不多于一种其它抗肿瘤剂。在另一实施例中，在治疗周期内不给药其它抗肿瘤剂。

还提供治疗人类患者中的表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症的方法，所述方法包括向患者给药寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合。在一个实施例中，第一单克隆抗体是P1X，第二单克隆体是P2X，第三单克隆体是P3X，且寡克隆抗体组合包括呈2:2:1摩尔比的P1X、P2X和P3X。在另一实施例中，第一单克隆抗体包括分别SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；第二单克隆体包括分别SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:10、SEQID NO:11和SEQ ID NO:12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；且第三单克隆体包括分别SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一实施例中，第一单克隆抗体包括分别SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；第二单克隆体包括分别SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；且第三单克隆体包括分别SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在一个实施例中，所述方法包含在用不同抗EGFR疗法(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗或Sym004)治疗癌症之后治疗人类患者的EGFR胞外结构域(ECD)突变型癌症。在一个实施例中，在从患者获得血液样本且测定所述血液样本含有具有编码EGFR的胞外结构域的序列中的一个或多个突变的循环DNA之后向患者给药所述寡克隆抗体组合。在一个实施例中，在检测患者的血液中的EGFR胞外结构域的结构域III或结构域IV中的突变之后向患者给药所述寡克隆抗体组合。在另一实施例中，在检测人类患者中的EGFR的ECD区中的外显子12突变之后向患者给药所述寡克隆抗体组合。

在一个实施例中，癌症包括EGFR的胞外结构域中的至少一个突变，其为蛋白质序列改变或导致蛋白质序列改变的DNA或RNA编码区，所述至少一个突变选自由EGFR R451C、S464L、K467T、G465R、G465E、I491M和S492R组成的群组。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27(即，对应于EGFR的胞外结构域的氨基酸序列)的位置451处的精氨酸变为半胱氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置464处的丝氨酸变为亮氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQID NO:27的位置467处的赖氨酸变为苏氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置465处的甘氨酸变为精氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置465处的甘氨酸变为谷氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置491处的异亮氨酸变为甲硫氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置492处的丝氨酸变为精氨酸。

在一个实施例中，治疗方法涉及治疗EGFR胞外结构域(ECD)突变型癌症，例如K-Ras、N-Ras和/或BRAF野生型转移性结肠直肠癌。在一个实施例中，突变型癌症是如通过经FDA批准的测试所测定的K-Ras野生型、表达EGFR的转移性结肠直肠癌。在另一实施例中，突变型癌症是头颈癌(例如，局部或区域性地晚期头颈部鳞状细胞癌)。在另一实施例中，突变型癌症是如通过经FDA批准的测试所测定的Ras-野生型KRAS(外显子2)转移性结肠直肠癌(mCRC)。

在另一方面中，所述方法包含治疗患有表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症的人类患者，所述突变型癌症具有选自由EGFR R451C、S464L、K467T、G465R、G465E、I491M和S492R组成的群组的EGFR的ECD中的至少一个所检测的突变，所述方法包括向患者给药包括三种单克隆抗体的寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合，其中第一单克隆抗体是P1X，第二单克隆体是P2X，第三单克隆体是P3X，且寡克隆抗体组合包括呈2:2:1摩尔比的P1X、P2X和P3X。

在一另一方面中，所述方法包含治疗患有表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症的人类患者，所述突变型癌症具有EGFR的ECD的结构域III或结构域II的所检测的突变，所述方法包括向患者给药治疗上有效量的MM-151寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合，其中所述寡克隆抗体组合由呈2:2:1摩尔比的P1X单克隆抗体、P2X单克隆抗体和P3X单克隆抗体组成。

还提供寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合(例如，MM-151)在治疗人类患者的EGFR胞外结构域(ECD)突变型癌症中的用途。在一个实施例中，第一单克隆抗体是P1X，第二单克隆体是P2X，第三单克隆体是P3X，且寡克隆抗体组合包括呈2:2:1摩尔比的P1X、P2X和P3X。在另一实施例中，第一单克隆抗体包括分别SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；第二单克隆体包括分别SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；且第三单克隆体包括分别SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。在另一实施例中，第一单克隆抗体包括分别SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；第二单克隆体包括分别SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；且第三单克隆体包括分别SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。

在一个实施例中，寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合(例如，MM-151)在治疗人类患者中的EGFR胞外结构域(ECD)突变型癌症中的使用是在利用不同抗EGFR疗法(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗或Sym004)对癌症进行治疗之后。在一个实施例中，使用是在对人类患者的EGFR胞外结构域的结构域III或结构域IV中的突变进行检测之后。在另一实施例中，使用是在对人类患者的EGFR的ECD区域中的外显子12突变进行检测之后。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域存在至少一个突变，其为蛋白质序列改变或导致蛋白质序列改变的DNA或RNA编码区，所述至少一个突变选自由EGFR R451C、S464L、K467T、G465R、G465E、I491M和S492R组成的群组。在一个实施例中，在从患者获得血液样本且测定所述血液样本含有具有编码EGFR的胞外结构域的序列中的一个或多个突变的循环DNA之后检测突变。

在一个实施例中，用途涉及治疗EGFR胞外结构域(ECD)突变型癌症，例如K-Ras、N-Ras和/或BRAF野生型转移性结肠直肠癌。在一个实施例中，突变型癌症是如通过经FDA批准的测试所测定的Ras野生型、表达EGFR的转移性结肠直肠癌。在另一实施例中，突变型癌症是头颈癌(例如，局部或区域性地晚期头颈部鳞状细胞癌)。在另一实施例中，突变型癌症是如通过经FDA批准的测试所测定的Ras-野生型转移性结肠直肠癌(mCRC)。

另外提供寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合在治疗表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症中的用途，所述突变型癌症具有选自由EGFRR451C、S464L、K467T、G465R、G465E、I491M和S492R组成的群组的EGFR的ECD中的至少一个所检测的突变，其中寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合包括三种单克隆抗体，其中第一单克隆抗体是P1X，第二单克隆体是P2X，第三单克隆体是P3X，且寡克隆抗体组合包括呈2:2:1摩尔比的P1X、P2X和P3X。

附图说明

图1A到图1G为展示EGF配体与EGFR突变之间的相互作用的七个图示。用表达所指示突变体的质粒转染HEK 293细胞，且接着在存在(具有圆形标记的浅灰色线)或不存在(具有三角形标记的黑色线)过量的未标记EGF下用增加剂量的EGF示踪剂处理以评估，EGF示踪剂可以有效地与NanoLuc-EGFR结合，包含EGFR野生型(图1A)、EGFR R451C(图1B)、S464L(图1C)、K467T(图1D)、G465R(图1E)、I491M(图1F)和S492R(图1G)。增加剂量的未标记EGF(具有正方形标记的深灰色线)用作分析对照以证实，所测量信号对应于

图2A到图2G为展示MM-151能够在药物取代分析中结合所有EGFR胞外域突变体的七个图示。用表达野生型EGFR(图2A)和NanoLuc-EGFR突变EGFR R451C(图2B)、S464L(图2C)、K467T(图2D)、G465R(图2E)、I491M(图2F)和S492R(图2G)的质粒转染HEK 293细胞。接着用增加剂量(0μg/ml到100μg/ml)的抗EGFR药物西妥昔单抗(“CMAB”，灰色三角形)、帕尼单抗(“PMAB”，浅灰色圆形)或MM-151(黑色正方形)和HaloTag-EGF示踪剂(呈18ng/mL的浓度)处理突变体。

图3A到图3H为展示过表达EGFR胞外域突变体且对西妥昔单抗或对西妥昔单抗和帕尼单抗两个具有抗性的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)对MM-151敏感的八个图示。用表达所指示EGFR胞外域突变体的慢病毒感染LIM1215，且用增加浓度的西妥昔单抗(“CMAB”，具有三角形标记的深灰色线)、帕尼单抗(“PMAB”，具有圆形标记的浅灰色线)和MM-151(具有正方形标记的黑色线)处理所选择的细胞6天。通过三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。所展示的突变体和对照是GFP对照(图3A)、EGFR野生型(图3B)、EGFR R451C(图3C)、S464L(图3D)、K467T(图3E)、G465R(图3F)、I491M(图3G)和S492R(图3H)。

图4A到图4H为过表达EGFR胞外域突变体的LIM1215细胞中的EGFR信号传导的蛋白质印迹分析(western blot analysis)的一系列图像。用表达所指示EGFR胞外域突变体的慢病毒感染LIM1215细胞。所展示的突变体和对照是GFP对照(图4A)、EGFR野生型(图4B)、EGFR R451C(图4C)、S464L(图4D)、K467T(图4E)、G465R(图4F)、I491M(图4G)和S492R(图4H)。在西妥昔单抗(“CETUX”)、帕尼单抗(“PMAB”)或MM-151的存在下培养所选择的细胞2小时且接着用EGF(5ng/ml)刺激15分钟。使用对包含磷酸化EGFR(“pEGFR”)、总细胞EGFR(“TOTEGFR”)、磷酸化AKT(“pAKT”)、总细胞AKT(“TOT AKT”)、磷酸化ERK(“pERK”)、总细胞ERK(“TOTERK”)和纽蛋白(用以证实面板内的样本中的类似蛋白质浓度的管家对照)的所指示蛋白质具有特异性的抗体对细胞裂解物执行蛋白质印迹分析。

图5A到图5E为展示通过表达EGFR胞外域突变而对西妥昔单抗具有获得性抗性的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)对MM-151敏感的五个图示。通过连续暴露于1.4μM西妥昔单抗经由重复的细胞传代3到9个月在活体外产生获得性抗性。接着执行亚克隆以分离已获得针对EGFR胞外结构域的突变的亚群。接着在西妥昔单抗(“CETUX”)、帕尼单抗(“PMAB”)或MM-151的存在下培养细胞6天。通过三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。用于此分析的对照为亲本细胞系(“LIM1215WT”；图5A)和经工程改造以表达S492R突变体的细胞系(“LIM1215 KI EGFR S492R”；图5E)。所展示的获得性抗性细胞系是“R5”群(图5B)和被鉴定为具有EGFR G465R突变(图5D)的亚克隆细胞系。同样展示的是来自被鉴定为具有EGFRI491M突变(图5C)的“R1”群的亚克隆细胞系。

图6A到图6C为展示通过表达EGFR胞外域突变而对西妥昔单抗具有获得性抗性的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)对MM-151敏感的三个图示。通过连续暴露于1.4μM西妥昔单抗经由重复的细胞传代3到9个月在活体外产生获得性抗性。接着执行亚克隆以分离已获得针对EGFR胞外结构域的突变的亚群。接着在西妥昔单抗(“CETUX”)、帕尼单抗(“PMAB”)或MM-151的存在下培养细胞6天。通过三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。用于此分析的对照是亲本细胞系(“OXCO2 WT”；图6A)。所展示的获得性抗性细胞系是“R2”群(图6B)和被鉴定为具有EGFR I491M和NRAS G13D突变的共表达的亚克隆细胞系(“OXCO2 R2 cl.88”；图6C)。

图7A到图7D为展示通过表达EGFR胞外域突变而对西妥昔单抗具有获得性抗性的CCK81和HCA46细胞(人类结肠直肠癌)对MM-151敏感的四个图示。通过连续暴露于1.4μM西妥昔单抗经由重复的细胞传代3到9个月(HCA46)或逐步地暴露于680nM到1.4μM西妥昔单抗6个月(CCK81)在活体外产生获得性抗性。接着执行亚克隆以分离已获得针对EGFR胞外结构域的突变的亚群。接着在西妥昔单抗(“CETUX”)、帕尼单抗(“PMAB”)或MM-151的存在下培养细胞6天。通过三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。用于此分析的对照为对应的亲本细胞系“CCK81WT”(图7A)和“HCA46WT”(图7C)。所展示的是CCK81(图7B)和HCA46(图7D)的获得性抗性亚克隆细胞系，其分别具有EGFR S464L突变和EGFR G465E突变。

图8A到图8D为通过表达EGFR胞外域突变而对西妥昔单抗具有获得性抗性的LIM1215(图8A)、OXCO2(图8B)、CCK81(图8C)和HCA46(图8D)细胞中的EGFR信号传导的蛋白质印迹分析的一系列图像。通过连续暴露于1.4μM西妥昔单抗经由重复细胞传代3到9个月(LIM1215、OXCO2和HCA46)或逐步地暴露于680nM到1.4μM西妥昔单抗6个月(CCK81)在活体外产生获得性抗性。接着执行亚克隆以分离已获得针对EGFR胞外结构域的突变的亚群。在西妥昔单抗(“CETUX”)、帕尼单抗(“PMAB”)或MM-151的存在下培养所选择的细胞2小时且接着用EGF(10ng/ml)刺激15分钟。使用对包含磷酸化EGFR(“pEGFR”)、总细胞EGFR(“TOTEGFR”)、磷酸化AKT(“pAKT”)、总细胞AKT(“TOT AKT”)、磷酸化ERK(“pERK”)、总细胞ERK(“TOT ERK”)和纽蛋白(用以证实面板内的样本中的类似蛋白质浓度的管家对照)的所指示蛋白质具有特异性的抗体对细胞裂解物执行蛋白质印迹分析。针对L IM1215细胞系所展示的是亲本细胞系(“LIM1215WT”)、“R5”获得性抗性群、具有EGFR G565R突变的“R5”群的“CL55”亚克隆、具有EGFR I491M突变和NRAS G12C突变的共表达的“R1”群的“CLONE4”亚克隆和经工程改造以表达S492R突变的“LIM1215 KI”细胞系。针对OXCO2细胞系所展示的是亲本细胞系(“OXCO2 WT”)、“R2”获得性抗性群、具有EGFR I491M突变和NRAS G13D突变的共表达的“R2”群的“CL88”亚克隆和具有NRAS G13D突变的表达的“R2”群的“CL113”亚克隆。针对CCK81细胞系所展示的是亲本细胞系(“CCK81 WT”)和具有EGFR S464L突变的表达的“R1”获得性抗性群的亚克隆。针对HCA46细胞系所展示的是亲本细胞系(“HCA46WT”)和具有EGFRG465E突变的表达的“R5”群的亚克隆。

图9A到图9C为展示衍生自具有EGFR胞外域中的G465E突变的临床结肠直肠肿瘤样本(“异种患者”)的细胞系对MM-151敏感的一系列三个图示。执行亚克隆以分离同样具有G465E突变的亚群。接着在西妥昔单抗(“CETUX”)、帕尼单抗(“PMAB”)或MM-151的存在下培养细胞6天。通过三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。所展示的是衍生自异种患者的的细胞系(图9A)和两个亚克隆细胞系(图9B和图9C)。

图10A到图10C为展示三种抗体组合内的个别抗体同时接合相同EGFR分子的能力的一系列三个图示。用共轭到生物传感器的组合内的一种抗体，随后与重组EGFR胞外结构域突变体一起培育，且接着用组合内的一或多种剩余抗体来执行生物层干涉测量分析培育的顺序如每一图式面板中所指示。所评估的是EGFR胞外结构域突变体K467T、R451C和S492R。所评估抗体组合是MM-151(图10A)、三种抗体的组合(25E+P2X+P3X；图10B)和两种抗体的组合(Sym992和Sym1024；图10C)。

图11A到图11B为展示过表达EGFR胞外域突变且由代表性EGFR配体活化的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)对MM-151敏感的一系列两个图示。稳定地转染LIM1215以表达S492REGFR胞外域突变体且在8nM重组型人类EGF配体的存在下用增加浓度的西妥昔单抗(“CMAB”；具有三角形标记的深灰色线)、Sym992抗体和Sym1024抗体的组合(“Sym004”；具有圆形标记的浅灰色线)和MM-151(具有正方形标记的黑色线)处理所选择细胞3天。通过三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。所展示的是亲本LIM1215细胞系(未经转染；仅表达野生型EGFR)(图11A)和过表达EGFR S492R突变的经转染LIM1215细胞系(图11B)。

图12A到图12C为展示过表达EGFR S492R胞外域突变或经工程改造以表达EGFRS492R胞外域突变的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)在活体内鼠类异种移植模型中对MM-151敏感的一系列三个图示。对4到5周大的重量为16±0.5g的雌性nu/nu小鼠(NU-Foxn1^nu；Charles River Labs)以每只小鼠5×10⁶个细胞的密度接种含有生长因子减少的Matrigel(BD Biosciences)的含0.2mL的LIM1215(#2)、LIM1215(#2)EGFR S492R或LIM1215(#2)EGFRS492R KI细胞悬浮液的的PBS。一旦肿瘤已达到大约300mm³的体积，将小鼠随机分组为治疗组(10小鼠/组)以接受PBS、呈12.5mg/kg或25mg/kg的西妥昔单抗或MM-151工具化合物(由25E抗体、P2X抗体和P3X抗体组成)。通过在Q7D时间表(例如，星期一)上用西妥昔单抗和25E和P3X以及在每周3×时间表(例如，星期一、星期三、星期五)用P2X进行IP注射来给药治疗。以经计算以产生组合等效于12.5mg/kg(6.25mg/kg Q7D的25E；8.75mg/kg每周3×的P2X；3.125mg/kg Q7D的P3X)和25mg/kg(12.5mg/kg Q7D的25E；17.5mg/kg每周3×的P2X6.25mg/kg Q7D的P3X)的西妥昔单抗剂量水平的经求和暴露量的剂量来给药MM-151工具化合物。西妥昔单抗、25E和P3X在第一次给药时给药2×的负载剂量，接着在随后给药时将剂量维持处于所指示剂量水平。通过卡尺每周三次测量肿瘤尺寸且使用以下公式计算肿瘤体积：π/6×L×W²，其中L和W分别表示较大肿瘤直径和较小肿瘤直径。

图13A到图13B为展示在早期阶段临床试验(NCT#01520389)中用MM-151处理的两个人类结肠直肠癌患者中的临床反应与EGFR ECD突变的存在的重叠的一系列两个图示。在所指示日期给药MM-51之前抽吸血清样本且通过微滴式数字PCR(ddPCR)用突变特异性引物检测EGFR ECD突变的存在。每一EGFR ECD突变的等位基因频率反映具有所指示突变的血清样本中的无细胞DNA(cfDNA)的百分比。临床反应由实体肿瘤的反应评估准则(RECIST)1.1指导原则定义且在所指示问诊(包含在用MM-151治疗之前、在用MM-151治疗的过程期间和疾病进展后的基线)时进行测量。第一患者(095)经筛选用于录用于2014年8月29日的临床试验，于2014年9月23日进行第一次治疗，且治疗直到于2015年1月22日评估疾病进展。第二患者(051)经筛选用于录用于2013年2月25日的临床试验，于2013年3月19日进行第一次治疗，且治疗直到于2013年8月28日评估疾病进展。

图14为展示个别抗体接合表达野生型EGFR(LIM1215(#2))或经工程改造以表达EGFR S492R胞外域突变(LIM1215(#2)EGFR S492R KI)的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)上的EGFR的能力的图示。抗体标记有染料且通过流式细胞术测量其与细胞表面上的EGFR结合。所评估的抗体为西妥昔单抗(“CMAB”)、P1X、P2X和P3X。将每一种别抗体的结果标准化为在LIM1215(#2)对照细胞系上观测到的结合值。

图15A到图15C为展示过表达EGFR S492R胞外域突变或经工程改造以表达EGFRS492R胞外域突变且通过代表性EGFR配体活化的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)对MM-151敏感的一系列三个图示。LIM1215(#2)细胞经由CRISPR/Cas9靶向的基因组编辑系统工程改造以表达S492R EGFR胞外域突变体。在8nM重组型人类EGF配体的存在下用西妥昔单抗(“CMAB”)、帕尼单抗(“PMAB”)、Sym992抗体和Sym1024抗体的组合(“Sym004”)和MM-151处理细胞3天。通过三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。图15A中展示的是LIM1215(#2)细胞系(仅表达野生型EGFR)、表达EGFR S492R突变的经工程改造的LIM1215(#2)EGFR S492RKI细胞系和过表达EGFR S492R突变的经转染LIM1215(#2)EGFR S492R细胞系，用1μM浓度的每一种抑制剂处理每一细胞系。图15B和图15C中展示的分别是亲本LIM1215(#2)细胞系和表达EGFR S492R突变的经工程改造的LIM1215(#2)EGFR S492R KI细胞系，用增加浓度的西妥昔单抗(具有三角形标记的深灰色线)、帕尼单抗(具有菱形标记的浅灰色线)、Sym004(具有圆形标记的浅灰色线)或MM-151(具有正方形标记的黑色线)处理每一细胞系。

图16A到图16B为展示经工程改造以表达EGFR S492R或G465R胞外域突变的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)经由用西妥昔单抗治疗的时程扩展但对MM-151敏感的图示。使用两种LIM1215细胞系池：一种含有表达EGFR野生型和EGFR S492R突变体的细胞的混合物且第二种含有表达EGFR野生型和EGFR G465R的细胞。这些池在工程改造LIM1215(#2)EGFR S492R KI和LIM1215(#2)EGFR G465R KI细胞系的过程期间产生。EGFR S492R突变体池中的第0天的初始等位基因频率经测量为4.6％(突变EGFR S492R比野生型EGFR)且EGFRG465R突变体池中第0天的初始等位基因频率为0.6％。用西妥昔单抗(“CMAB”；具有三角形标记的深灰色线)、MM-151(具有正方形标记的黑色线)或仅介质(具有圆形标记的浅灰色线)处理细胞超过十五天(S492R)或七天(G465R)且在于第4天、第10天和第15天(S492R)或于第0天、第3天和第7天(G465R)收集的基因组DNA中测量EGFR胞外域突变的等位基因频率。作为阴性对照，还用表达野生型EGFR的LIM1215(#2)细胞(点画线)的未经稀释板和针对所有治疗条件在所有时间点处测量的0％的等位基因频率执行实验。

图17A到图17B为人类EGFR基因的示意图和EGFR胞外域突变的表格。图17中展示的是具有记录七个结构化蛋白质结构域、28个DNA编码外显子和标记每一蛋白质结构域之间的界限的氨基酸序列数的标记的人类EGFR基因的示意图。未展示的是包含氨基酸1到24的假定的信号肽。存在一起包括以下621个氨基酸和前15个外显子(外显子#15横跨胞外结构域IV和跨膜结构域)的四个胞外域(I、II、III、IV)。已在编码氨基酸433到499的外显子12中鉴定出EGFR胞外域突变。这个区域横跨胞外结构域III的末端部分和结构域IV的开始部分。图17B中展示的是列举已在临床和/或临床前样本中鉴定和文献中公开的EGFR胞外域突变的表格。通过氨基酸改变、DNA碱基改变和DNA密码子改变来鉴定突变。

图18为展示过表达EGFR S492R胞外域突变或经工程改造以表达EGFR S492R胞外域突变且由代表性EGFR配体活化的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)对MM-151敏感的EGFR信号传导的蛋白质印迹分析的一系列图像。所展示的是分别具有野生型EGFR的表达、EGFRS492R胞外域突变的经工程改造表达或EGFR S492R胞外域突变的过表达的LIM1215(#2)、LIM1215(#2)EGFR S492R KI和LIM1215(#2)EGFR S492R细胞。在100nM的西妥昔单抗、Sym004或MM-151的存在下培养细胞24小时且接着用AREG(8nM)或EGF(8nM)配体刺激10分钟。作为对照，使细胞保持未经处理(无药物或配体)或仅用每一种配体刺激，如所指示。使用对包含磷酸化EGFR(“pEGFR”)和肌动蛋白(用以证实面板内的样本中的类似蛋白质浓度的管家对照)的所指示蛋白质具有特异性的抗体对细胞裂解物执行蛋白质印迹分析。

图19A到图19C为展示过表达EGFR S492R胞外域突变或经工程改造以表达EGFRS492R胞外域突变且由代表性EGFR配体活化的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)对MM-151敏感的ERK信号传导的ELISA分析的一系列三个绘图。所展示的是分别具有野生型EGFR的表达、EGFR S492R胞外域突变的经工程改造表达或EGFR S492R胞外域突变的过表达的LIM1215(#2)、LIM1215(#2)EGFR S492R KI和LIM1215(#2)EGFR S492R细胞。用增加浓度(1000nM与0.244nM之间的1:4连续稀释)的西妥昔单抗、Sym004或MM-151处理细胞两小时且接着用AREG(8nM)或EGF(8nM)配体刺激10分钟。磷酸化ERK蛋白质通过ELISA测量。通过配体(EGF或AREG)将结果标准化为仅用配位体刺激(无药物)的对照样本的中位值。图19A中展示的是在用增加浓度的药物治疗且用EGF配体刺激之后经标准化的磷酸-ERK反应的热度图表示。图19B和图19C中展示的是在用250nM的药物治疗且分别用EGF或AREG刺激之后经标准化的磷酸-ERK反应的条形图。

图20A到图20I为展示过表达EGFR S492R胞外域突变或经工程改造以表达EGFRS492R胞外域突变且由代表性EGFR配体活化的LIM1215细胞(人类结肠直肠癌)对MM-151敏感的细胞生长速率分析的一系列九个图示。所展示的是分别具有野生型EGFR的表达、EGFRS492R胞外域突变的经工程改造表达或EGFR S492R胞外域突变的过表达的LIM1215(#2)、LIM1215(#2)EGFR S492R KI和LIM1215(#2)EGFR S492R细胞。在无配体、AREG(8nM)或EGF(8nM)的存在下用增加浓度(0.15nM与1000nM之间)的西妥昔单抗、帕尼单抗、Sym004或MM-151处理细胞。以两小时的间隔下在活细胞成像器中测量72小时时段的细胞汇合度。计算每一种处理情况的的生长速率且将结果标准化为每一种细胞系的对照样本(无药物)。

具体实施方式

术语“EGFR”和“EGF受体”在本文中可以互换地使用以指人类EGFR蛋白质(还被称作ErbB1或HER1)；参见UniProtKB/Swiss-Prot登录号P00533。EGFR胞外域或EGFR-ECD是活体内扩展超出细胞表面的EGFR蛋白质的部分，且因此可接近细胞外部的抗体。野生型EGFR-ECD蛋白质序列阐述于SEQ ID NO:19中。如本文所使用，“EGFR-ECD突变”或“EGFR的胞外结构域中的突变”可以指代与野生型序列相比相差至少一个氨基酸残基的EGFR-ECD蛋白质序列；“EGFR-ECD突变”也可以指对应于EGFR的胞外结构域的蛋白质序列的改变的DNA或RNA编码序列的部分的改变。在一些实施例中，DNA或RNA编码序列中的改变发生于EGFR基因的外显子12或转录物中。在其它实施例中，EGFR-ECD突变是对应于EGFR的胞外结构域的结构域III的蛋白质序列的改变。

术语“抗体”描述包括至少一个衍生自抗体的抗原结合位点(例如，VH/VL区或Fv或CDR)的多肽。抗体包含抗体的已知形式。举例来说，抗体可以为人类抗体、人类化抗体、双特异性抗体或嵌合抗体。抗体也可以为Fab、Fab'2、ScFv、SMIP、纳米抗体或结构域抗体。抗体还可以为以下同种型中的任一种：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD及IgE。抗体可以为天然存在的抗体或可以为已通过蛋白质工程改造技术(例如，通过突变、缺失、取代，与非抗体部分结合)改变的抗体。举例来说，抗体可以包含改变抗体的特性(例如，功能特性)的一或多个变异体氨基酸(与天然存在的抗体相比)。举例来说，在所属领域中已知多种这类改变，所述改变影响例如患者的抗体的半衰期、效应功能和/或免疫反应。术语抗体还包含包括至少一个衍生自抗体的抗原结合位点的人工或经工程改造的多肽构建体。

如本文所使用的术语“单克隆抗体”指代从基本上同质的抗体的群体获得的抗体，即包括除可以极少量存在的可能的天然发生的突变以外相同的群体的个别抗体。术语“寡克隆抗体混合物”或“抗体混合物”指代两种或多于两种抗体的组合，例如，存在于单一组合物中的单克隆抗体。在特定实施例中，寡克隆抗体混合物或抗体混合物是MM-151。抗体混合物的另一实例是Sym004(Symphogen)。

用于本文中所描述的方法中的本文所描述的抗体或其抗原结合片段可以使用各种领域公认的技术来产生。单克隆抗体可以通过所属领域的技术人员所熟悉的各种技术获得。简单来说，通常通过与骨髓瘤细胞融合来永生化来自经所需抗原免疫的动物的脾细胞(参见，Kohler和Milstein,Eur.J.Imanol.6:511-519(1976))。永生化的替代方法包含用埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus)、致癌基因或逆转录病毒转化或在所属领域中熟知的其它方法。对于产生针对抗原的所需特异性和和亲和力的抗体筛选由单一永生化细胞产生的群落筛选，且可以通过各种技术(包括注射到脊椎动物宿主的腹膜腔中)来提高由此类细胞产生的单克隆抗体的产率。替代地，我们可以根据由Huse等人,Science 246:1275-1281(1989)概述的通用方法通过筛选来自人类B细胞的DNA库来分离编码单克隆抗体或其结合片段的DNA序列。

如本文所使用的术语“抑制”指代生物活性的任何统计学上显著的减少，包含活性的完全阻断。举例来说，“抑制”可以指生物活性在统计学上显著减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约100％。

如本文所使用，磷酸化的抑制指代抗体相对于在不存在抗体的情况下的信号传导(对照)在统计学上显著减少基质蛋白质的磷酸化的能力。如所属领域中已知，胞内信号传导路径包含例如磷酸肌醇3′-激酶/Akt(PI3K/Akt/PTEN或“AKT”)和/或丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/ERK或“ERK”)路径。同样如所属领域中已知，EGFR介导的信号传导可以通过分析基质的磷酸化水平(例如，AKT和/或ERK的磷酸化或不磷酸化)来测量。因此，在一个实施例中，抗EGFR抗体组合和组合物提供AKT和ERK中的任一个或两个的磷酸化水平相对于在不存在此类抗体下AKT和/或ERK的磷酸化水平(对照)的至少10％，或至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或约100％的统计学上显著的抑制。此类EGFR介导的信号传导可以使用在涉及EGFR的细胞级联中测量蛋白质的领域公认的技术来测量，例如ELISA、蛋白质印迹法(western)或多重方法，如短语“EGFR下游信号传导的抑制”指代抗体或抗体混合物降低来自EGF受体的信号传导水平的能力，如通过例如AKT和/或ERK的磷酸化减少量所测量。

如本文所使用的短语“细胞生长的抑制”指代抗体或抗体混合物相对于在活体内或活体外不存在抗体的情况下细胞或细胞的生长(对照)在统计学上显著减少表达EGFR的一或多个细胞的生长的能力。在一个实施例中，相对于在不存在组合的抗体组合物的情况下测量的生长(对照)表达EGFR的细胞(例如，癌细胞)的生长在细胞与本文中所公开的组合的抗体组合物接触时或在细胞与单克隆抗体的单一物种接触时，可以减少至少10％，或至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％，或至少70％，或至少80％，或至少90％，或约100％。可以使用测量细胞分裂的速率、进行细胞分裂的细胞在细胞群体内的分数和/或由于终末分化或细胞死亡的从细胞群体损失细胞的速率(例如，使用或类似分析法)的领域公认的技术来分析细胞生长。

如本文所使用的术语“治疗(treat/treating/treatment)”指代本文所描述的治疗性或防治性措施。“治疗”的方法采用向个体给药本文中所公开的抗体或抗体对或三种抗体，例如具有与EGFR依赖性信号传导相关联的病症或易患此类疾病或病症的个体，以便预防、治愈、延迟、降低疾病或病症的强度或复发疾病或病症，或改善疾病或病症的一或多种症状或复发疾病或病症，或以便延长超出个体在无此类治疗的存在下所预期的存活期。

术语“患者”包含接受防治性或治疗性治疗的人类和其它哺乳动物个体。

术语“样本”指代从患者采集的组织、体液或细胞(或上述中的任一个的一部分)。通常，将从患者去除组织或细胞，但同样涵盖活体内诊断。在实体肿瘤的情况下，组织样本可以从以手术方式去除的肿瘤采集且经制备以供通过常规技术进行测试。在淋巴瘤和白血病的情况下，可以(例如，来自血液的白血病细胞)获得淋巴细胞、白血病细胞或淋巴组织并进行恰当地制备。包含尿、泪液、血清、血浆、脑脊髓液、大便、痰液、细胞提取物、恶性胸膜积液等的其它样本也可以适用于特定癌症。

由所属领域的技术人员使用的任何活检技术可以用于从个体分离样本。活检可以为敞开式活检，其中使用通用麻醉；或为密闭式活检，其中比敞开式活检制造更小的切口。活检可以为：核芯活检或切取活检，其中去除组织的一部分；切除活检，其中作出去除整个病灶的尝试；或针抽吸(经皮)活检(精细针抽吸活检)，其中用针去除组织或流体的样本。针头可以为较薄、中空的针头，且其可以插入到块体中以从块体提取细胞。在一个实施例中，样本为组织样本，例如通过手术切除或任何种类的活检(例如，核芯针活检、精细针抽吸(FNA)活检等)获得的组织样本在另一实施例中，样本为血液样本(例如，血浆、血清或全血样本)或为尿样本。

可以处理活检体。举例来说，可以通过福尔马林固定和链烷烃嵌入(FFPE)组织来保存活检体。可以将活检体处理为较小碎片。活检体可以经处理以保存RNA。活检体可以存储在室温(大约25℃)下的湿冰(大约4℃)上，存储于在大约-20℃下或在大约-80℃下，例如存储于干冰上或冷冻于液氮或干冰/乙醇浆料中。可以在手术切除的0.5分钟、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、120分钟或240分钟内冷冻组织。可以在活检体组织上使用的固定剂包含例如甲醇-丙酮、卡诺氏固定液(Carnoy's fixative)(60％乙醇，30％氯仿，10％冰乙酸)、布安氏固定液(Bouin's fixative)、乙醇、丙酮、福尔马林、梅萨卡恩(methacarn)(60％甲醇替代卡诺氏固定液中的乙醇)、UMFIX(通用分子固定液)、Omnifix和FINEfix。

如本文所使用，“抗肿瘤剂”或“抗癌剂”指代具有抑制人类肿瘤(尤其恶性(癌)病灶，例如癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病)的发展或进展的功能特性的试剂。癌转移的抑制经常为抗肿瘤剂的特性。

如本文所使用，“Ras-野生型”指代在K-Ras或N-Ras且下文被称作“Ras”的外显子2(密码子12和13)、外显子3(密码子59和61)和外显子4(密码子117和146)中不具有体细胞突变的癌症。

如本文所使用，“BRAF野生型”指代在密码子600中不具有体细胞突变(例如，V600E)的癌症。

I.抗EGFR抗体

适用于本发明的抗EGFR抗体(或由其衍生的VH/VL结构域)的组合物可以使用所属领域中熟知的方法产生。替代地，可以使用包括公认的抗EGFR抗体的组合物，例如Sym-004(Symphogen)、西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗(nimotuzumab)。其它医药学上抗EGFR抗体包含研发中的扎芦木单抗(zalutumumab)和马妥珠单抗(matuzumab)。可采用的另外的抗EGFR寡克隆抗体组合物描述于PCT国际公开案第WO/2011/140254号和对应申请中美国专利案第9,044,460号中抗体和申请中美国专利案第9,226,964号和第7,887,805号(“寡克隆应用(Oligoclonal Applications)”)中，以及与其它抗EGFR抗体组合的此类抗体的寡克隆混合物适用于治疗癌症，例如恶性(赘生性)肿瘤。也可使用与这些领域公认的抗体中的任一个竞争以供与EGFR结合的抗体。

适用于本发明的抗EGFR抗体的示例性组合物是“MM-151”。MM-151是一种由被设计成结合表皮生长因子受体(EGFR)且抑制所述表皮生长因子受体的信号传导的三种完全人类单克隆抗体的混合物组成的寡克隆治疗剂。MM-151是三种独立抗体的混合物(P1X+P2X+P3X)，其在EGFR上有三个不重叠位点以最大化配体依赖性信号传导和配体非依赖性信号传导的抑制(参见，例如WO 2013/006547，其教示内容以引入的方式明确地并入本文中)。P1X、P2X和P3X单克隆抗体为分别被称作ca、cd和ch的亲本抗体的亲和力成熟的抗体，所述抗体揭示于WO 2011/140254中，其教示内容以引入的方式明确地并入本文中。P1X、P2X和P3X的CDR氨基酸序列展示于下文表1中：

表1：P1X、P2X和P3X的CDR氨基酸序列

P1X的全长V_H和V_L氨基序列分别展示于SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20中。P2X的全长V_H和V_L氨基序列分别展示于SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22中。P3X的全长V_H和V_L氨基序列分别展示于SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24中。另外，如本文中呈现的V_H CDR区段和V_L CDR区段以例如CDR1、CDR2和CDR3的氨基到羧基末端顺序布置。

在一个实施例中，抗EGFR抗体的组合物包括：(1)包括分别SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体；(2)包括分别SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8和SEQ ID NO:9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体；和(3)包括分别SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列的单克隆抗体。

在另一实施例中，抗EGFR抗体的组合物包括：(1)包括重链可变区(包括SEQ IDNO:19)的单克隆抗体；(2)包括重链可变区(包括SEQ ID NO:21)的单克隆抗体；和(3)包括重链可变区(包括SEQ ID NO:23)的单克隆抗体。

在另一实施例中，抗EGFR抗体的组合物包括：(1)包括轻链可变区(包括SEQ IDNO:20)的单克隆抗体；(2)包括轻链可变区(包括SEQ ID NO:22)的单克隆抗体；和(3)包括轻链可变区(包括SEQ ID NO:24)的单克隆抗体。

在另一实施例中，抗EGFR抗体的组合物包括：(1)包括重链可变区(包括SEQ IDNO:19)和轻链可变区(包括SEQ ID NO:20)的单克隆抗体；(2)包括重链可变区(包括SEQ IDNO:21)和轻链可变区(包括SEQ ID NO:22)的单克隆抗体；(3)包括重链可变区(包括SEQ IDNO:23)和轻链可变区(包括SEQ ID NO:24)的单克隆抗体。

在另一实施例中，组合物中的抗EGFR抗体(1)、(2)和(3)与彼此呈2:2:1的摩尔比。

抗EGFR抗体可以单独给药或与同寡克隆抗体结合或协同作用以治疗与EGFR介导的信号传导相关联的疾病的另一治疗剂一起给药。

如本文所使用，辅助或组合给药(共给药)包含同步给药呈相同或不同剂型的抗EGFR抗体和一或多种抗肿瘤剂，或单独给药抗EGFR抗体和一或多种抗肿瘤剂(例如，依序给药)。此类同时或依序给药优选地导致抗EGFR抗体和一或多种试剂两个同时存在于所治疗患者中。

II.治疗方法

本文提供治疗人类患者的癌症的方法。在一个实施例中，癌症是皮肤、中枢神经系统、头部、颈部、食道、胃、结肠、直肠、肛门、肝、胰脏、胆液管、胆囊、肺、乳房、卵巢、子宫、子宫颈、阴道、睾丸、生殖细胞、前列腺、肾脏、输尿管、膀胱、肾上腺、垂体、甲状腺、骨骼、肌肉或结缔组织的肿瘤。在另一实施例中，癌症选自以下组成的群组：结肠直肠癌、转移性结肠直肠癌、非小细胞肺癌、鳞状细胞头颈癌或复发性或转移性头颈癌。在另一实施例中，患者已经诊断患有K-Ras野生型转移性结肠直肠癌。在另一实施例中，癌症是EGFR胞外结构域(ECD)突变型癌症，例如K-Ras、N-Ras和/或BRAF野生型转移性结肠直肠癌。在另一实施例中，突变型癌症是如通过经FDA批准的测试所测定的K-Ras野生型、表达EGFR的转移性结肠直肠癌。在另一实施例中，突变型癌症是头颈癌(例如，局部或区域性地晚期头颈部鳞状细胞癌)。在另一实施例中，突变型癌症是如通过经FDA批准的测试所测定的Ras-野生型野生型KRAS(外显子2)转移性结肠直肠癌(mCRC)。

在另一实施例中，基于经FDA批准的测试，肿瘤经测定包括具有EGFR胞外结构域中的至少一个突变的细胞。在另一实施例中，癌症是包括具有EGFR胞外结构域的结构域III或结构域IV中的突变的细胞的肿瘤。在另一实施例中，癌症是含有具有EGFR基因的外显子12中的突变的细胞的肿瘤。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域的至少一个突变是蛋白质序列改变或导致蛋白质序列改变的DNA或RNA编码区，所述至少一个突变选自EGFR R451C、S464L、K467T、G465R、G465E、I491M和S492R组成的群组。在一个实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27(即，对应于EGFR的胞外结构域的序列)的位置451处的精氨酸变为半胱胺酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置464处的丝氨酸变为亮氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置467处的赖氨酸变为苏氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置465处的甘氨酸变为精氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置465处的甘氨酸变为谷氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置491处的异亮氨酸变为甲硫氨酸。在另一实施例中，EGFR的胞外结构域中的突变是在SEQ ID NO:27的位置492处的丝氨酸变为精氨酸。

在一个方面中，提供治疗具有包括具有EGFR胞外结构域中的至少一个突变的细胞的肿瘤的患者的方法，所述方法包括向患者给药有效量的与包括至少一个突变的EGFR胞外结构域结合的单克隆抗体混合物，其中所述方法包括向患者给药呈单一组合物的与EGFR胞外结构域结合的抗EGFR抗体的寡克隆混合物，如本文所描述。

在另一方面中，所述方法包含治疗已进展或变得对与EGFR胞外结构域结合的单克隆抗体中的一或多种(例如，西妥昔单抗或帕尼单抗)不应的患者。在另一实施例中，患者在用抗肿瘤剂预先治疗后已进展或变得对抗肿瘤疗法不应。在另一实施例中，患者在用抗肿瘤剂预先治疗之后已变得对抗肿瘤疗法具有抗性。在另一实施例中，在用抗肿瘤剂预先治疗之后在疾病进展或复发后治疗患者。在另一实施例中，在用抗肿瘤剂治疗失败之后治疗患者。在另一实施例中，癌症经鉴定为已获得对抗肿瘤剂具有抗性的癌症。

在另一方面，所述方法包含治疗已具有疾病进展或在含氟嘧啶疗程、含奥赛力铂疗程或含伊立替康疗程之后的患者。

在另一方面，所述方法包含通过向患者给药寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合(例如，MM-151)来治疗人类患者的表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症。

在另一方面，所述方法包含通过以下来治疗人类患者的表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症：(a)检测患者的EGFR的ECD(例如，患者的血液)的外显子12中的突变；和接着(b)向患者给药治疗上有效量的寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合(例如，MM-151)。

在另一方面，所述方法包含通过以下来治疗人类患者的表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症(其中癌症选自头颈癌和结肠直肠癌组成的群组)：(a)检测EGFR胞外结构域(例如，患者的血液)的结构域III或结构域IV中的突变；和接着(b)向患者给药治疗上有效量的MM-151寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合(例如，MM-151)。在另一方面，所述方法包含治疗具有表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症的人类患者，所述癌症具有EGFR的ECD的结构域III或结构域IV中的所检测的突变，所述方法包括向患者给药治疗上有效量的MM-151寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合，其中所述寡克隆抗体组合由呈2:2:1摩尔比的P1X单克隆抗体、P2X单克隆抗体和P3X单克隆抗体组成。

在另一方面中，所述方法包含治疗具有表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症的人类患者，所述癌症具有EGFR的ECD中的至少一个所检测的突变，所述至少一个所检测的突变选自EGFR R451C、S464L、K467T、G465R、G465E、I491M和S492R组成的群组，所述方法包括向患者给药包括三种单克隆抗体的寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合，其中第一单克隆抗体是P1X，第二单克隆体是P2X，第三单克隆体是P3X，且所述寡克隆抗体组合包括呈2:2:1摩尔比的P1X、P2X和P3X。

在另一方面中，所述方法包含通过向患者给药寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合(例如，MM-151)来预防人类患者的表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症的出现或抑制所述癌症的生长。在一个实施例中，向尚未接受预先抗EGFR疗法(例如，用西妥昔单抗、帕尼单抗或Sym004治疗)的患者给药寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合。在一个实施例中，向已接受预先抗EGFR疗法(例如，用西妥昔单抗、帕尼单抗或Sym004治疗)的患者给药寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合。在一个实施例中，在紧接着检测EGFR ECD突变之后(例如，在检测后数小时或数天内)给药寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合。

可以使用已知技术在任何适合生物样本(例如，组织、血液、尿等)中检测到EGFR突变的存在。举例来说，在一个实施例中，使用基于聚合酶链反应(PCR)的方法检测EGFR突变，所述方法包含(但不限于)：使用等位基因特异性引物的实时PCR、使用等位基因特异性TaqMan探针的实时PCR、定量测序(基于PCR的测序)、微滴式数字PCR(ddPCR)、BEAMing数字PCR和在较低变性温度下的经改进和完全富集共扩增(ICECOLD)-PCR。在另一实施例中，使用如例如由Jorge S Reis-Filho(Breast Cancer Research,2009,11(增刊3):S12)所描述的下一代测序(NGS)检测EGFR突变。NGS(也被称作“高通量测序”或“大规模平行测序”)是用于描述多种不同现代测序技术的术语，所述测序技术包含(但不限于)Illumina(Solexa)测序、Roche 454测序、离子激流：质子/PGM测序和SOLiD测序。用于分析EGFR突变的其它平台包含例如Sanger测序单核苷酸多态性(SNP)阵列、高压液相色谱法(HPLC)、质谱法、FISH等。用于测量EGFR ECD结构域突变的示例性分析法包含(但不限于)FoundationOne(Foundation Medicine，NGS)、OncoBEAM(Sysmex Inostics，PCR)、Guardant360(GuardantHealth，NGS)、Trovagene精度癌症监测(PCM)(Trovagene，PCR)、MX-ICP EGFR外显子12(S492R)(Transgenomic，PCR)和OmniSeq综合面板(Omniseq LLC，NGS)。

测定EGFR突变(例如，EGFR外显子12中的突变)的存在或不存在可以以多种方式来执行。通常使用从生物样本收集的DNA或RNA来执行此类测试。在一个实施例中，可以根据任何适合方法和/或标准的制造商的说明书来执行用于检测此类突变的分析。在一个实施例中，用于检测EGFR外显子12中的突变的基于NGS的方法提供对外显子12的完全覆盖。在另一实施例中，基于PCR的方法提供针对外显子12中的所有密码子的密码子特异性分析。在另一实施例中，其它方法用于分析外显子12。在分析不覆盖所有外显子12的一特定实施例中，分析法优选地至少评估所有已知的外显子12突变。然而，如果仅评估突变的亚组的有限分析能够鉴定突变，那么其足以测定EGFR-ECD突变阳性。关于分析敏感度，EGFR-ECD突变状态通过高于分析的检测极限中的突变的存在来确定。没有必要使用高于检测极限(即，EGFR突变的最小水平)的切割点(阈值)。针对EGFR-ECD等位基因频率(突变DNA％相对于野生型DNA％的测量值)的所公开的报导展示低至0.1％的水平。在一个实施例中，适合分析应具有<1％(优选地，更低)的检测极限以防止潜在假阴性。在一优选实施例中，分析能够通过临床实验室改进修正(Clinical Laboratory Improvement Amendments，CLIA)(即，经CLIA验证的分析法)来验证。

可以使用针对肿瘤反应的标准测量来评估治疗结果。将针对疗法的靶病灶(肿瘤)反应分类为：

完全反应(CR)：所有靶病灶消失。任何病理性淋巴结(无论靶标或非靶标)必须在短轴上减少到<10mm；

部分反应(PR)：靶病灶的直径的总和减少至少30％，采取基线总和直径作为参考；

进展型疾病(PD)：靶病灶的直径的总和增加至少20％，采取研究的最小总和作为参考(如果基线总和为研究的最小值，那么这包括基线总和)。除20％的相对增加之外，总和也必须证实至少5mm的绝对增加。(注意：一或多个新病灶的出现也视为进展)；和

稳定疾病(SD)：既没有足够的缩小以满足PR，也没有足够的增加以满足PD，采取研究时的最小总和直径作为参考。(注意：将直径总和不增加5mm或更多的20％或更少的变化编码为稳定疾病)。为指定稳定疾病的状态，测量值在研究一旦进入6周的最小间隔之后必须即至少符合稳定疾病标准。

将针对疗法的非靶病灶反应分类为：

完全反应(CR)：所有非靶病灶消失且肿瘤标记物水平标准化。所有淋巴结在大小上必须为非病理性的(<10mm短轴)。如果肿瘤标记物最初高于正常值上限，那么其必须针对在完全临床反应中考虑的患者进行标准化；

非CR/非PD：一或多个非靶病灶的存留和/或高于正常限值的肿瘤标记物水平的维持；和

进展型疾病(PD)：一或多个新病灶的出现和现有非靶病灶的明确进展中的任一个或两个。在此上下文中，明确进展必须代表整体疾病状态改变，而不是单个病灶增加。

根据本文中所公开的方法治疗的患者优选地经历癌症的至少一个迹象的改进。举例来说，治疗可以产生选自以下组成的群组的至少一个治疗效果：肿瘤大小的减少、癌转移的减少、完全缓解、部分缓解、稳定疾病、整体反应速率的增加或病理性完全反应。反应也可以通过可测量肿瘤病灶的数量和/或大小的减少来测量。将可测量病灶定义为可以通过CT扫描(CT扫描片层厚度不超过5mm)在至少一个维度(待记录的最长直径)上准确地测量为>10mm，通过临床检查的10mm卡尺量测值或通过胸腔X射线的>20mm的那些病灶。也可以测量非靶病灶(例如，病理性淋巴结)的大小以用于改进。可以使用例如X射线、CT或MRI图像来测量病灶。显微法、细胞学或组织学也可以用于评估对疗法的反应。可以考虑在可测量肿瘤已以其它方式符合反应或稳定疾病的标准时在治疗期间出现或恶化的积液，以指示肿瘤进展，但仅在存在积液的赘生性来源的细胞学证实的情况下。

在另一实施例中，因此治疗的患者经历肿瘤缩小和/或增长速率减少，即肿瘤生长的遏止。在另一实施例中，减少或抑制肿瘤细胞增殖。替代地，以下中的一或多个可以指示对治疗的有益反应：可以减少癌细胞的数目；可以减少肿瘤大小；可以抑制、延缓、减缓或停止穿透到周边器官中的癌细胞；可以减缓或抑制肿瘤癌转移；可以抑制肿瘤生长；可以预防或延迟肿瘤的复发；可以在一定程度上减轻与癌症相关联的症状中的一或多个。有利反应的其它指示包含可测量肿瘤病灶或非靶病灶的数量和/或大小的减少。

III.选择的方法

本文还提供选择治疗具有表达EGFR的肿瘤的患者的方法，其中所述患者对基于抗体的抗EGFR疗法不应。

在一个实施例中，所述方法包括：a)测定来自肿瘤的细胞是否具有EGFR的胞外结构域中的至少一个突变；和b)如果具有，那么选择包括本文所描述的抗EGFR抗体组合物的治疗。在一另一实施例中，所述方法包括：获得肿瘤的活检样本；和使用包括聚合酶链反应或下一代测序的方法来测定肿瘤是否具有编码EGFR的胞外结构域的DNA或RNA中的至少一个突变。在一另一实施例中，所述方法包括：获得肿瘤的活检样本；和(例如，经由免疫组织化学或质谱法)测定肿瘤是否具有EGFR的胞外结构域中的至少一个突变。在一另一实施例中，所述方法包括：获得来自患者的血液样本；和测定血液样本是否含有具有编码EGFR的胞外结构域的序列中的一或多个突变的循环DNA(例如，从血液样本分离的无细胞DNA或从血液样本中的循环肿瘤细胞分离的DNA)。在一另一实施例中，经活检肿瘤细胞、循环肿瘤细胞或无细胞DNA具有编码EGFR的胞外结构域的DNA或RNA中的至少一个突变，且所述至少一个突变处于EGFR基因的外显子12中。在一另一实施例中，EGFR的胞外结构域的至少一个突变是蛋白质序列改变或导致蛋白质序列改变的DNA或RNA编码区，所述至少一个突变选自主要由EGFR R451C、S464L、K467T、G465R、I491M和S492R组成的群组。在一另一实施例中，肿瘤经测定以包括具有如通过经FDA批准的测试所检测的EGFR胞外结构域中的至少一个突变的细胞。

IV.预测的方法

本文还提供测定寡克隆抗体混合物是否可以用于治疗患有癌症的患者的方法，所述癌症对利用仅包括单一物种的抗EGFR抗体的一或多种单克隆抗EGFR抗体制剂的治疗不应。描述用于癌症的治疗的寡克隆抗EGFR抗体的用途，其中癌症表达EGFR且所述EGFR经测定以具有胞外结构域的至少一个突变。

在一个实施例中，预测哪些肿瘤(例如，恶性肿瘤)将对用寡克隆抗EGFR抗体治疗作出反应而不对用单一单克隆抗EGFR抗体(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗)治疗作出反应的方法，所述方法包括测定患者的肿瘤细胞是否已获得编码胞外结构域的EGFR基因区中的突变。

其他实施例描述于以下非限制性实例中。由于许多变化和等效物将在阅读本公开后对所属领域的技术人员变得显而易见，以下实例仅为说明性的且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。

贯穿本申请列举的所有引用、基因库条目、专利和公开的专利申请的内容以引用的方式明确地并入本文中。

实例

材料和方法

贯穿所述实例，除非另外说明，否则使用以下材料和方法。

一般来说，除非另外指明，否则使用化学的常规技术、分子生物学的常规技术、重组DNA技术、免疫学(尤其，例如抗体技术)和多肽制备的标准技术。参见例如：Sambrook、Fritsch和Maniatis，《分子选殖(Molecular Cloning)》，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；《抗体工程改造方法(Antibody Engineering Protocols)》(《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》)，510，Paul，S.,Humana Pr(1996)；《抗体工程改造：一种切实可行的方法(Antibody Engineering:A Practical Approach)》(《切实可行的方法系列(Practical Approach Series)》，169)，McCafferty编，Irl Pr(1996)；《抗体：实验手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》，Harlow等人，C.S.H.L.Press，公开(1999)；和《分子生物学的当前方法(Current Protocols in Molecular Biology)》，Ausubel等人编，John Wiley&Sons(1992)。

细胞培养和抗性细胞的产生

在补充有5％FBS的Iscove介质(英杰公司(Invitrogen))中培养OXCO-2细胞；在补充有5％FBS和胰岛素(1mg/mL)的RPMI1640介质(英杰公司)中培养LIM1215细胞；在补充有5％FBS的DMEM(英杰公司)中培养HCA-46细胞；且在补充有5％FBS的MEM(英杰公司)中培养CCK81细胞。所有介质同样含有2mmol/L L-谷氨酰胺和抗生素(100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素)，且细胞在37℃和5％CO₂空气培育箱中生长。OXCO-2细胞系是2010年3月来自V.Cerundolo博士(英国，牛津，牛津大学，分子医学的Weatherall研究所)的一个礼物。LIM1215亲本细胞系先前已描述(R.H.Whitehead、F.A.Macrae、D.J.St John、J.Ma，《源自患有遗传性非息肉性结肠直肠癌的患者的结肠癌细胞系(LIM1215)(A colon cancer cellline(LIM1215)derived from a patient with inherited nonpolyposis colorectalcancer)》，J.Natl.Cancer Inst.74,759-765(1985))且从Robert Whitehead教授(田纳西州，那什维尔，范德比尔特大学)获得来自针对癌症研究的路德维格研究所(LudwigInstitute for Cancer Research)(瑞士，苏黎士)的权限。从欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures)获得HCA-46细胞系(由西格玛-阿尔德里奇科学研究实验室(Sigma-Aldrich Srl)分配)。从健康科学研究资源库(HealthScience Research Resources Bank)获得CCK81细胞系。HEK293细胞系购自ATCC(LGCStandards S.r.l)且在补充有10％FBS的DMEM(英杰公司)中培养。

通过细胞ID系统且通过基因打印10系统(普洛麦格(Promega))，通过10个不同基因座(D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、D21S11、vWA、TH01、TPOX、CSF1PO和牙釉蛋白基因)处的短串联重复序列(STR)来测试每一细胞系的身份并进行验证。通过毛细电泳法(3730DNA分析器，Applied Biosystems)分离来自多重PCR的扩增子且使用来自生命技术公司(Life Technologies)的GeneMapperID软件进行分析。将所得细胞系STR谱进行交叉比较，且与来自ATCC、ECACC和CellBank澳大利亚储存库在线数据库的可用STR进行匹配。测试所有细胞系且用Venor GeM传统试剂盒(Minerva Biolabs)生针对支原体污染产生阴性。

LIM1215R1通过连续暴露于浓度为1.4μM的药物来产生。LIM1215R2通过将西妥昔单抗剂量从针对LIM1215的350nM逐步增加到1.4μM来获得。LIM1215R3-5和OXCO-2以及HCA-46西妥昔单抗抗性衍生物在连续暴露于针对NCIH508的浓度0.3μM与针对LIM1215、OXCO-2和HCA-46的浓度1.4μM的药物3到9个月之后来产生。CCK81西妥昔单抗抗性衍生物通过在6个月的时程期间将西妥昔单抗剂量从680nM逐步增加到1.4μM来获得。

细胞系中的突变分析

通过Wizard SV基因组DNA纯化系统(普洛麦格)提取基因组DNA样本。对于Sanger测序，所有样本经受由ABI PRISM 3730(Applied Biosystems)进行的自动测序。在别处(6、9)列出引物序列。分析以下基因和外显子：KRAS(外显子2、外显子3和外显子4)、NRAS(外显子2和外显子3)、PIK3CA(外显子9和外显子20)、BRAF(外显子15)、EGFR(外显子12)。从独立PCR反应开始，确认所有突变两次。

KI细胞(LIM1215KI EGFR S492R)的产生

LIM1215细胞在10cm盘中生长直到60％到80％的汇合度。接着抽吸介质且将2μl的rAAV(英国，剑桥，Horizon Discovery，pAAV0223EGFR S492R)和5ml的新鲜适合生长介质添加到细胞。使病毒在37℃下感染细胞4小时。随后，将5ml的生长介质添加到细胞，且接着在14到16小时之后完全更新为新鲜介质。使经感染细胞生长48小时，且接着通过胰蛋白酶消化来采集并分配于具有含有遗传霉素(geneticin)(纽约，格兰德岛，生命技术公司，G418)的介质的96孔板中。在采集和筛选以供重组之前在37℃下培育板2周。基因座特异性同源重组现象通过“Neo筛选”PCR使用位于左侧同源臂外的正向引物(FW：5'AAGATGGGGGAAAGAAGAGC 3'(SEQ ID NO:28))和位于Neo基因内的反向引物(RV：5'GCATGCTCCAGACTGCCTTG 3'(SEQ ID NO:29))来筛选。来自单克隆的基因组DNA通过遵循制造商的说明书裂解具有Lyse-N-GoTM PCR反应剂(Pierce，Rockford，IL)的细胞来获得。使用以下条件以10μl反应体积来进行PCR筛选：1个循环(94℃下3min)；3个循环(94℃下15s，64℃下30s，70℃1分30秒)；3个循环(94℃下15s，61℃下30s，70℃下1分30秒)；3个循环(94℃下15s，58℃下30s，70℃下1分30秒)；35个循环(94℃下15s，55℃下30s，70℃下1分30秒)；1个循环(70℃下5min)。在阳性克隆中，S492R突变的导入和表达通过在gDNA和cDNA水平下的测序来检查。

为去除LoxedP Neo盒，将LIM1215EGFR S492R敲入细胞与含1μl Cre重组酶腺病毒的5mL适合生长介质一起培育。使病毒在37℃下感染细胞4小时。接着将5ml生长介质添加到细胞中，且接着在14到16小时之后完全更新为新鲜介质。接着在限制稀释度下将细胞接种于96孔板以供分离单克隆。当单克隆达到50％到60％汇合度时，采集所述克隆且使用Lyse-N-Go PCRTM反应剂从每一孔提取基因组DNA，如先前段落中所描述，且执行双重PCR筛选以评估Neo盒的去除。确认为阴性的第一PCR反应类似于如上文所描述的“Neo筛选”。使用针对基因组DNA的退火引物(FW：5'AAGATGGGGGAAAGAAGAGC 3'(SEQ ID NO:30))和针对新霉素基因的退火引物(RV：5'GCATGCTCCAGACTGCCTTG 3'(SEQ ID NO:31))进行所述第一PCR反应：。这种PCR对于CRE出克隆是阴性的。第二PCR反应预期检查突变的存在。使用上文针对neo筛选提到的相同条件、循环次数和温度分别以10μl和20μl反应体积执行PCR反应。为证明Neo盒的去除同样在功能性水平下，将所述经选择克隆接种于含G418(0.8mg/mL)和不含G418的两种介质中。正如期望，CRE出克隆仅能够存活于不含G418的介质中。这些克隆接着经受扩展和最终突变分析。

LIM1215(#2)EGFR S492R细胞系的产生

从额外细胞库(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))获得LIM1215细胞且在本文中将这些细胞称为“LIM1215(#2)”。细胞通过短串联重复序列通过制造商剖析来验证，且根据制造商的说明书在我们的实验室中传代少于3个月。在5％CO₂氛围，37℃下的含湿气培育箱中在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素(生命技术公司)的RPMI1640介质(生命技术公司)中培养LIM1215(#2)细胞。从DNA 2.0获得从EF1α启动子表达具有S492R突变的EGFR的pD2539稳定表达构建体。这种构建体是通过DNA 2.0在多步处理中产生的。首先，经由具有以下静默突变的DNA合成来产生全长EGFR：去除两个内部BsaI限制酶位点；通过添加两个BsaI定向核酸内切酶位点在碱基1253与1572(这包括所有的EGFR外显子12)之间产生较短克隆盒；和插入唯一“mod1a”和“mod2a”qPCR引物结合位点以监测表达。其次，接着将这种EGFR序列插入到PM269载体中以产生“PM269-EGFR”构建体。第三，接着合成含有S492R突变(1474A>C)的克隆盒且使用两个插入的BsaI定向核酸内切酶位点将其插入到PM269-EGFR构建体中。第四，接着使用Electra亚克隆系统(DNA 2.0)以将经修饰EGFR序列(SEQ ID NO:33)转移到pD2539稳定表达载体(在本文中称为“pD2539-EGFR-S492R”)中。

使用6转染试剂(罗奇(Roche)，目录号11-814-443-001)，用pD2539-EGFR-S492R转染LIM1215(#2)细胞。经转染的细胞在补充有10％FBS和1μg/mL嘌呤霉素(生命技术公司)的RPMI1640介质(生命技术公司)中生长两周以产生稳定表达池。收集RNA且使用RNeasy plus mini试剂盒(凯杰(Qiagen))提取，且使用大容量cDNA反转录试剂盒(生命技术公司)执行反转录。在ViiA7仪器(生命技术公司)上执行SYBR绿色实时PCR以使用mod1a引物(5'GGGTTCGCATCAGATCTCGTTA3'(SEQ ID NO:36)、5'TCAAGCACCTATGAACTCGGAC3'(SEQID NO:37))来确认EGFR S492R mRNA的表达。使用从凯杰获得的引物(Hs_ACTB_1_SG)将表达标准化为β-肌动蛋白管家对照。

接着以每板50个细胞的初始密度将具有pD2539-EGFR-S492R质粒的稳定表达的LIM1215(#2)接种于10cm板中并在具有1μg/mL嘌呤霉素的选择压力下生长。每五天更换介质且接着用克隆盘选取24个单克隆并使其在选择压力下扩展。接着在24个克隆中评估S492R mRNA的表达且选择具有最高表达的克隆以用于进一步实验。通过免疫印迹测量总EGFR蛋白质的表达且发现比亲本LIM1215(#2)细胞系高大约5.7倍。这种克隆在本文中被称为“LIM1215(#2)EGFR S492R”。

LIM1215(#2)EGFR S492R KI细胞系的产生

使用CRISPR设计工具(麻省理工学院(Massachusetts Institute ofTechnology)；http://crispr.mit.edu)设计单导RNA(sgRNA)序列以靶向EGFR S492区域(“S492”；5'AATTTTGGTTTTCTGACCGG3'(SEQ ID NO:38))，且作为对照，一种非特异性序列(“rg_0111”；5'ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA3'(SEQ ID NO:39))。将两个sgRNA序列单独地克隆到从DNA 2.0获得的哺乳动物Cas9基因组编辑载体(pD1321-AD、CAG-Cas9-2A-GFP)中且在本文中分别被称为“pD1321-AD-S492R”和“pD1321-AD-rg_0111”。通过集成的DNA技术合成含有EGFR S492R突变的单链供体寡核苷酸(SEQ ID NO:34)。

对于每一质粒(pD1321-AD-S492R和pD1321-AD-rg_0111)，用质粒和EGFR S492R单股供体寡核苷酸(SEQ ID NO:34)两个瞬时转染LIM1215(#2)。基于在质粒上编码的GFP蛋白质的表达，通过流式细胞术分选经转染细胞。根据制造商的说明书使用来自凯杰的DNA Mini试剂盒(产品目录号51306)提取基因组DNA(gDNA)。在50μL洗脱缓冲液(10mM Tris-Cl，0.5mM EDTA，pH 9.0)中洗脱gDNA且根据制造商的说明书在2000C UV-Vis分光光度计(赛默科技公司(ThermoScientific))上测量gDNA浓度。通过Sanger测序确认S492R突变的存在。

将来自所收集培养物的单个细胞分离到96孔板的个别孔中且提取gDNA以供基因分型。保存经鉴定含有EGFR S492R突变的单克隆并进行选择以供进一步实验。执行流式细胞术抗体结合分析以鉴定在维持P2X结合的同时降低西妥昔单抗结合(两个皆与同表达野生型EGFR的LIM1215(#2)细胞系结合有关)的克隆。这种克隆在本文中被称为“LIM1215(#2)EGFR S492R KI”。

用利用pD1321-AD-rg_0111质粒(维持野生型EGFR基因型的非靶向序列)产生的所收集的培养物执行流式细胞术实验以确认相对于表达野生型EGFR的LIM1215(#2)细胞系维持西妥昔单抗和P2X抗体的结合。这种所收集的培养物在本文中被称为“LIM1215(#2)EGFRS492野生型”。

LIM1215(#2)EGFR G465R KI细胞系的产生

使用CRISPR设计工具(麻省理工学院；http://crispr.mit.edu)设计单导RNA(sgRNA)序列以靶向EGFR G465区(“G465sg1”；5'CTCCATCACTTATCTCCTTG3'(SEQ ID NO:40)；“G465sg2”；5'GCTATGCAAATACAATAAAC3'(SEQ ID NO:41))，且作为对照，一种非特异性序列(“dual-rg0111”；5'ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA3'(SEQ ID NO:42)；“dual-rg-0135”；5'CGCTTCCGCGGCCCGTTCAA3'(SEQ ID NO:43))。将两个sgRNA序列克隆到从DNA 2.0获得的哺乳动物nikase Cas9-D10A基因组编辑载体(pD1431-AD、EF1a-Cas9N-2A-GFP)中且在本文中分别被称为“pD1431-AD-nCas9G465R”和“pD1431-AD-nCas9non_targeting”。通过集成的DNA技术合成含有EGFR G465R突变的单链供体寡核苷酸(SEQ ID NO:35)。

对于每一质粒(pD1431-AD-nCas9G465R和pD1431-AD-nCas9non_targeting)，用质粒和EGFR G465R单链供体寡核苷酸(SEQ ID NO:35)两个瞬时转染LIM1215(#2)细胞。基于在质粒上编码的GFP蛋白质的表达通过流式细胞术分选经转染的细胞。根据制造商的说明书使用来自凯杰的Mini试剂盒(产品目录号51306)提取基因组DNA(gDNA)。在50μL洗脱缓冲液(10mM Tris-Cl，0.5mM EDTA，pH 9.0)中洗脱gDNA且根据制造商的说明书在2000C UV-Vis分光光度计(赛默科技公司)上测量gDNA浓度。通过Sanger测序确认G465R突变的存在。

用表达野生型EGFR的细胞和表达EGFR ECD突变的细胞的混合物在活体外所收集的培养物系统中分析EGFR ECD突变。

在实验的第一天，以1×10⁵个细胞/孔的密度将具有野生型EGFR和EGFR胞外域突变两个的表达的一池细胞接种于24孔板中。在含有分别具有EGFR S492R或EGFR G465R基因编辑的细胞的LIM1215(#2)EGFR S492R KI细胞系和LIM1215(#2)EGFR G465R KI细胞系的发育期间产生两个池。在5％CO₂氛围，37℃下的含湿气培育箱中，在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素(生命技术公司)的RPMI1640介质(生命技术公司)中培养细胞。作为阴性对照，接种仅表达野生型EGFR的一池细胞且以相同方式培养(这个池在LIM1215(#2)EGFR S492野生型对照细胞系的发育期间产生)。

同样在第一天，在台式离心机中将5×10⁵个细胞以3000RPM沉淀5分钟，去除上清液，且在-80℃下存储细胞团块以用于后续基因组DNA提取。其后的一天，用1μM浓度的抗体或仅介质(对照)处理细胞。在第4天、第10天和第15天，将每一板孔中的细胞的一半转移到新板且细胞的一半用于如上形成细胞团块，以用于后续基因组DNA提取。

在收集所有细胞团块后，解冻样本，将其再悬浮于200μL的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，且根据制造商的说明书使用来自凯杰的QIAamp DNA Mini试剂盒(产品目录号51306)提取基因组DNA。在50μL洗脱缓冲液(10mM Tris-Cl，0.5mM EDTA，pH 9.0)中洗脱基因组DNA，且根据制造商的说明书在2000C UV-Vis分光光度计(赛默科技公司)上测量gDNA浓度。

通过微滴式数字PCR(ddPCR)使用QX200^TM微滴式Digital^TM PCR系统(伯乐(Bio-Rad))评估每一基因组DNA样本中的EGFR ECD突变的等位基因频率。从生命技术公司获得含有对EGFR S492R和G465R突变以及对应野生型具有特异性的ddPCR引物的常规SNP基因分型分析试剂盒(目录号4331349；分析ID：AHN1YEK、EGFRS492R；分析ID：AHPAWKS、EGFRG465R)。根据制造商的说明书，每个反应使用20ng基因组DNA执行ddPCR分析，且将等位基因频率计算为EGFR突变DNA等位基因与总(EGFR突变加野生型)DNA等位基因的百分比。

NanoBRET分析

用HD转染试剂(普洛麦格，目录号E2311)瞬时转染HEK293细胞以允许EGFR-NanoLuc突变的表达。接着用增加的剂量(0μg/ml到100μg/ml)的药物和浓度为18ng/ml的HaloTag-EGF(示踪剂)处理经转染细胞30分钟。接着添加NanoBRET^TM 基质且用微量板多模式读取器来分析板。为计算原始NanoBRET^TM比率值，对于每个样本，受体发射值(610nm)除以供体发射值(450nm)。

细胞生存力分析

从意大利米兰的Niguarda Ca'Granda医院的药房获得西妥昔单抗和帕尼单抗。从Merrimack Pharmaceuticals获得MM-151。在96孔板中将细胞系以以下密度(对于LIM1215、HCA-46、NCIH508和OXCO-2为2×10³个，对于CCK81为3×10³个)接种于100μL介质中。其后的一天，将100μL连续稀释的每一种药物(西妥昔单抗、帕尼单抗、MM-151)添加到含细胞的无血清介质以达到在100μg/ml与0μg/ml之间的最终浓度。在5％CO₂中，在37℃下培育板6天，之后使用发光分析法(普洛麦格)通过ATP含量评估细胞生存力。使用Victor-X4板读取器(PerkinElmer)记录测量值。将经处理孔标准化为未经处理的。

用LIM1215(#2)细胞系和源自其的细胞系的实验使用一种经修改方法。从Myoderm获得西妥昔单抗且使用来自专利文献的序列信息表达Sym004组合(Sym992+Sym1024)抗体并对其进行纯化，且从Merrimack Pharmaceuticals获得MM-151。在96孔板板中以5×10³个细胞/孔的密度将细胞系接种于100μL补充有10％胎牛血清的RPMI介质(生命技术公司)中。其后的一天，将100μL连续稀释的每一种药物(西妥昔单抗、Sym004、MM-151)添加到含细胞的补充有8nM EGF配体(Preprotech)的RPMI介质以达到在1000nM与1nM之间的最终浓度。在5％CO₂中，在37℃下培育板3天，之后使用发光分析法(普洛麦格)通过ATP含量评估细胞生存力。使用Envision板读取器(PerkinElmer)记录测量值。将经处理孔标准化为仅用8nM EGF配体处理的孔。

细胞生长速率分析

从Myoderm获得西妥昔单抗，且使用来自专利文献的序列信息表达Sym004组合(Sym992+Sym1024)抗体并对其进行纯化，且从Merrimack Pharmaceuticals获得MM-151。在96孔板板中以5×10³个细胞/孔的密度将细胞系接种于100μL补充有10％胎牛血清的RPMI介质(生命技术公司)中。其后的一天，将接种介质更换为300μL的RPMI处理介质，所述RPMI处理介质含有2％胎牛血清和连续稀释的每一种药物(以达到在1000nM与0.15nM之间的最终浓度)且补充有无配体、8nM EGF配体(派普泰克(Peprotech))或8nM AREG配体(派普泰克)中的任一种。将板立即移动到IncuCyte ZOOM活细胞成像器且以两小时的间隔获得相差图像持续72小时时段。为计算增长率，自然对数变换汇合度数据(被细胞覆盖的孔表面的百分比)，且经由线性回归测定所得线的斜率。为排除在较高汇合度下的生长饱和度，仅使用在0％与70％汇合度之间的测量值。将生长速率标准化为针对每一种细胞系的对照(非药物)条件。

磷酸-ERK细胞信号传导分析

在96孔板(Costar；目录号3997)中以3.5×10⁴个细胞/孔的密度将细胞系接种于100μL补充有10％胎牛血清的RPMI介质(生命技术公司)中。其后的一天，将接种介质更换为100μL补充有1％胎牛血清的RPMI介质。其后的一天，用100μL含有1％胎牛血清和连续稀释的每一种药物的介质处理细胞两小时(以达到在1000nM与0.15nM之间的最终浓度)。接着用50μL含有1％胎牛血清和无配体、EGF配体(派普泰克)或AREG配体(派普泰克)中的任一种的RPMI刺激细胞10分钟。在添加之后，配体的最终浓度是8nM。接着用150μL冷PBS洗涤细胞且将其溶解于54μL MPER缓冲液+150mM NaCl+磷酸酶抑制剂(罗奇；目录号04906837001和4693124001)中。在-80℃下冷冻分解物15分钟且接着在冰上解冻30分钟。

通过夹层ELISA测量磷酸-ERK。用在PBS中稀释(1:50)100×的25μL 2×捕获抗体(Cell Signaling Technologies；目录号R92TC-1)涂布96孔空白MSD板(Meso ScaleDiscovery；目录号L15XA-3)，且在室温下培育隔夜。其后的一天，在BIOTEK板洗涤器上用100微升/孔PCST(0.05％Tween-20)洗涤板三次。随后在室温下用150μL MSD阻断物(1％，在PBS中，0.2μm过滤)阻断板一小时。在BIOTEK板洗涤器上用100微升/孔PBST(0.05％Tween-20)洗涤板三次。以25微升/孔添加细胞裂解物(纯)或磷酸-ERK标准物(R&D Systems；目录号DYC1018BE)且在4℃下培育隔夜。在BIOTEK板洗涤器上用100微升/孔PBST(0.05％Tween-20)洗涤板三次。检测抗体(Cell Signaling Technologies；目录号R92TC-1)在1％MSD阻断溶液中稀释(1:50)从100×到2×，以25微升/孔添加，且在室温下培育两小时。在BIOTEK板洗涤器上用100微升/孔PBST(0.05％Tween-20)洗涤板三次。具有磺酸标记(Sulfo-tag)的二级检测抗小鼠IgG(MesoScale Discovery；目录号R32AC-5)在1％MSD阻断溶液中以1:1000稀释，以25微升/孔添加，且在室温下在定轨振荡器(300rpm)上培育一小时。在BIOTEK板洗涤器上用100微升/孔PBST(0.05％Tween-20)洗涤板三次。具有表面活性剂的MSD读取缓冲液(Meso Scale Discovery；目录号R92TC-1)在ddH20中稀释从4×到2×，且以150微升/孔添加。在MSD区段成像器2400(Meso Scale Discovery)上读取板。通过减去背景信号来分析结果，回归为重组ERK标准，且反算以校正稀释因子。平均化重复样本并计算标准差。

DNA构建体和突变诱发

WT载体购自普洛麦格公司，而pLX301-EGFR WT构建体为来自C.Sun博士和R.Bernards教授(荷兰，阿姆斯特丹，NKI)的慷慨礼物。

使用WT对应质粒作为模板DNA，使用来自Agilent Technologies的QuikChange II定点突变诱发试剂盒构建含有6个点突变(R451C、S464L、G465R、K467T、I491M和S492R)的EGFR突变体。通过DNA测序确认突变的存在。

免疫印迹分析

在生物化学分析之前，在补充有10％FBS的其特异性介质中生长亲本细胞，在5％FBS介质中生长KI细胞。通过在1mM原钒酸钠、100mM氟化钠和蛋白酶抑制剂的混合物(胃酶抑素、亮肽素、抑肽酶和STI)的存在下将细胞溶解于冷EB缓冲液(50mM Hepes pH 7.4，150mM NaCl，1％Triton X-100，10％甘油，5mM EDTA，2mM EGTA；所有反应剂均来自西格玛-奥德里奇，除Triton X-100来自Fluka以外)提取总的细胞蛋白质。通过离心澄清提取物，且使用BCA蛋白质分析反应剂试剂盒(赛默(Thermo))测定蛋白质浓度。用增强型化学发光系统(通用电气医疗集团(GE Healthcare))和经氧化酶结合的二级抗体(Amersham)执行西方印迹法检测。以下初级抗体用于西方印迹法(所有均来自Cell Signaling Technologies，除其中所指示的以外)：抗磷酸-p44/42ERK(thr202/tyr204)；抗p44/42ERK；抗磷酸-AKT(Ser473)、抗AKT；抗磷酸-EGFR(tyr1068)；抗EGFR(clone13G8，Enzo Life Sciences)；抗纽蛋白(西格玛-奥德里奇)。其后的一天，在与适合的二级抗体一起培育1h之后，使用ECL系统(Amersham Biosciences)产生信号。用LIM1215(#2)细胞系和源自其的细胞系的实验使用一种经修改方法。在6孔板中以5×10⁵个的密度将细胞接种于2mL补充有10％胎牛血清的RPMI介质中。其后的一天，将接种介质更换为1mL补充有1％胎牛血清的RPMI介质。其后的一天，用111μL含有1％胎牛血清和药物的介质处理细胞24小时(以达到100nM的最终浓度)。其后的一天，用123μL含有1％胎牛血清和无配体、EGF配体(派普泰克)或AREG配体(派普泰克)中的任一种的RPMI刺激细胞10分钟。在添加之后，配体的最终浓度是8nM。接着用1mL冷PBS洗涤细胞且将其溶解于100μL MPER缓冲液+150mM NaCl+磷酸酶抑制剂(罗奇；目录号04906837001和4693124001)中。在-80℃下冷冻提取物。在稍后日，通过离心澄清提取物，且使用BCA蛋白质分析反应剂试剂盒(赛默飞世尔)测定蛋白质浓度。

按以下制备样本以用于西方印迹法分析。将40μg蛋白质稀释于补充有10％b-巯基乙醇的负载缓冲液(伯乐(Bio-Rad))和MPER缓冲液中，达到30μL的最终体积。样本在90℃下沸腾5分钟，接着涡旋和离心。将25μL样本装载到4％到12％Criterion XT Bis-Tris胶的孔(伯乐；目录号3450124)中且在180V下根据制造商说明书运行90分钟。接着在振荡器上在2×NuPAGE转移缓冲液(赛默飞世尔)中培育胶20分钟，且接着用iBlot转移系统(赛默飞世尔)将其转移到硝酸纤维膜上。在Odyssey阻断缓冲液(Li-cor；目录号927-40000)中在振荡器上在室温下阻断膜1小时，且接着在振荡器上在4℃下在稀释于阻断缓冲液中的初级抗体中培育隔夜(pEGFR：Cell Signaling Technologies，目录号3777；总EGFR：Cell SignalingTechnologies，目录号4267；肌动蛋白辅助对照物：西格玛，目录号A1978)。其后的一天，用TBS-T溶液洗涤膜三次，每次5分钟，且接着在振荡器上在室温下在阻断缓冲液中与二级抗体一起培育一小时。所使用的二级抗体是IRDye 800CW山羊抗家兔IgG(H+L)(Li-cor，目录号926-32211)和IRDye 680RD山羊抗小鼠IgG(H+L)(Li-cor，目录号926-68070)。接着用TBS-T溶液洗涤膜三次，每次5分钟，且接着用PBS洗涤一次。接着使用Odyssey成像器(Li-Cor)扫描膜。

通过流式细胞术结合抗体的评估

将细胞在45μL FACS缓冲液(磷酸盐缓冲的血清，pH 7.4，补充有1％胎牛血清和0.1％叠氮化钠)和5μL人类TruStain FcX^TM溶液(博莱德公司(BioLegend,Inc)；目录号422302)中以1×10⁵个细胞/孔的密度转移到U形底部96板孔板(Falcon；目录号353077)中。在冰(4℃)上培育细胞10分钟。接着，添加在0.1μM最终浓度下的与488染料(赛默飞世尔)结合且稀释于FACS缓冲液中的抗体1小时。为确认结合特异性，首先将孔的一半与未标记抗体(在5μM的最终浓度下)一起培育1小时。在冰(4℃)上用FACS缓冲液洗涤细胞两次且将细胞再悬浮于以1:10000稀释在FACS缓冲液中的碘(642/661)溶液(赛默飞世尔；目录号T3605)中。接着将细胞装载到FACSCalibur^TM(碧迪生物科学公司(BDBiosciences))上以供分析。选择存活细胞(阴性)且测量的强度。软件(FlowJo，LLC)用于计算每一个样本的平均荧光强度。

鼠类异种移植研究

如所指示以每只小鼠5×10⁶个细胞的密度用含0.2mL LIM1215(#2)EGFR S492R、0.2mL LIM1215(#2)EGFR S492R KI或0.2mL LIM1215(#2)细胞悬浮液的PBS(含有生长因子减少的基质胶(碧迪生物科学公司))接种4周龄到5周龄的重16±0.5g的雌性nu/nu小鼠(NU-Foxn1nu；Charles River Labs)。一旦肿瘤已达到大约300mm³的体积，那么将小鼠随机分组为治疗组以接受PBS(媒剂对照)或药物。通过IP注射给药治疗组。通过卡尺每周三次测量肿瘤尺寸且使用以下公式计算肿瘤体积：π/6×L×W²，其中L和W分别表示较大肿瘤直径和较小肿瘤直径。

基于其药物动力学来确定抗体的给药时间表。不与鼠类EGFR(25E、P3X、西妥昔单抗)交叉反应的抗体经观测在小鼠中具有大约4到5天的接近等效半衰期值且以Q7d时间表(例如，星期一)给药。与鼠类EGFR(P1X、P2X)交叉反应的抗体经观测由于靶标介导的药物配置而具有更快消除，且以每周3×时间表(例如，星期一、星期三、星期五)给药。

由25E、P2X和P3X抗体组成的三种抗体混合物用作MM-151工具化合物以用于小鼠的肿瘤生长实验。抗体25E替代P1X，因为其不接合鼠类EGFR且因此允许符合西妥昔单抗比较剂的每周一次给药时间表，且应更好反映人类患者的药物动力学。P1X是25E的亲和力成熟的变异体(11pmol/L对比于145pmol/L)且抗体接合EGFR上的重叠表位。使用针对每一种抗体的药物动力学模型的计算模拟来计算MM-151工具化合物中的三种抗体的剂量以产生等效于对应剂量的西妥昔单抗的总计血清暴露。

来自人类患者的循环无细胞DNA中的EGFR ECD突变的分析

进行患有难治性晚期实体肿瘤的患者中的MM-151的阶段1研究以评价安全性并确立作为单药疗法或与伊立替康(方法MM-151-01-01-01，NCT#01520389)组合的MM-151的最大耐受剂量。作为这个方法的一部分，收集血液和肿瘤组织样本且从所有患者获得书面知情同意书以供探索性生物标记分析以进一步表征且与可能有助于预测或评价MM-151反应和/或安全性的可能的生物标记相关。根据当地准则，在每个处通过机构审查委员会审查和批准研究。研究经设计以评价各个时间表处的MM-151的递增剂量。如通过调查员所评估，治疗患者直到的进展型疾病(从第一次给药之日起每八周通过放射性扫描进行评估)、不能忍受的毒性或其它中止原因。在方法限定的时间点处收集血清样本以支撑生物标记分析。在每个收集时间点处，将9.5mL血液收集在不具有添加剂的红色顶管中且在室温下使其结块15到30分钟。接着以3000rpm离心样本10到15分钟以从血清分离细胞。将血清分成两个相同等分试样并放置到-80℃存储器直到装运到主要存储设施。

根据制造商的说明书使用QIAamp循环核酸试剂盒(凯杰)从血清分离循环无细胞DNA(cfDNA)。接着将6μl的ctDNA用作每一个qPCR反应的模板以供GE/ml测量。分析所有样本重复三次。使用含有5μlqPCR主混合物(用CXR参考染料2×)(普洛麦格)和LINE-1[1.5μmol]正向引物和反向引物的10μl最终体积执行PCR反应。使用对每一个EGFR ECD突变具有特异性的引物，使用用于探针的ddPCR超混合液(伯乐)扩增经分离cfDNA。根据制造商的方法执行微滴式数字PCR(ddPCR)且结果报告为突变DNA等位基因与总(突变加野生型)DNA等位基因的百分比或分数丰度。将8μl到10μl的DNA模板添加到10μl用于探针的ddPCR超混合液(伯乐)和2μl引物/探针混合物。将这20μl样本添加到70μl用于探针的微滴式产生油(伯乐)并用于微滴式产生。接着用以下条件热循环微滴式：95℃下5分钟；94℃下30秒，55℃下1分钟，接着为98℃下10分钟，40个循环(斜率2℃/秒)。接着将样本转移到QX200微滴式读取器(伯乐)以用于FAM和HEX探针的荧光测量。基于阳性对照和阴性对照执行选通并鉴定突变群体。针对每一个样本使用QuantaSoft软件(伯乐)计算野生型DNA背景中的突变DNA的分数丰度。针对每一个样本执行多次重复(最少三次)。与所有样本平行执行来自细胞系的正常对照gDNA和无DNA模板(水)对照的ddPCR分析，同样包含作为无污染对照的多次重复。

实例1：EGFR胞外结构域(ECD)突变体已降低结合配体和单克隆抗EGFR抗体制剂的能力。

生物发光共振能量转移(BRET)用于定量地测量活细胞中的蛋白质之间的相互作用。NanoBRET^TM系统(普洛麦格)与作为生物发光能量供体的荧光素酶和作为能量受体的经荧光标记的蛋白质一起使用。为测定EGF配体是否能结合EGFR突变体，执行EGFR示踪剂剂量反应分析。用表达所指示的NanoLuc-EGFR突变体(图1)的质粒转染HEK 293细胞且接着在过量的未标记EGF的存在(浅灰色线)或不存在(黑色线)下用增加剂量的EGF示踪剂(HaloTag-EGF)处理以评估EGF示踪剂可以有效地与NanoLuc-EGFR结合。添加NanoBRET^TM 基质且用微量板多模式读取器分析板。为计算原始NanoBRET^TM比率值，对于每一个样本，受体发射值(618nm)除以供体发射值(460nm)。

如图1所展示，测量配体(EGF)和EGFR野生型(图1A)与胞外结构域突变体之间的蛋白质-蛋白质相互作用，所述突变体包含EGFR R451C(图1B)、S464L(图1C)、K467T(图1D)、G465R(图1E)、I491M(图1F)和S492R(图1G)。除EGFR I491M以外，所测试的所有EGFR突变体均能够在这种EGFR示踪剂剂量反应分析中结合EGF示踪剂。

实例2：MM-151能够在药物置换分析中结合所有EGFR胞外域突变体

为评价EGFR突变体与抗EGFR疗法之间的相互作用，执行药物置换分析。用表达野生型EGFR(图2A)和NanoLuc-EGFR突变EGFR R451C(图2B)、S464L(图2C)、K467T(图2D)、G465R(图2E)、I491M(图2F)和S492R(图2G)的质粒转染HEK293细胞。接着用增加剂量(0μg/ml到100μg/ml)的抗EGFR药物西妥昔单抗(“CMAB”，灰色三角形)、帕尼单抗(“PMAB”，浅灰色圆形)或MM-151(黑色正方形)和浓度为18ng/ml的HaloTag-EGF(示踪剂)处理突变体30分钟。添加NanoBRET^TM 基质且用微量板多模式读取器分析板。为计算原始NanoBRET^TM比率值，对于每一个样本，受体发射值(618nm)除以供体发射值(460nm)。

如图2所展示，MM-151有效地与所测试的所有EGFR突变体结合，而西妥昔单抗并不与EGFR-S464L、EGFR-G465R或EGFR-S492R结合，且帕尼单抗并不有效地与EGFR-S464L或EGFR-G465R结合。因此，仅来自所测试药物的MM-151将结合所有突变EGFR胞外域。

实例3：过表达EGFR胞外域突变体和对西妥昔单抗或对西妥昔单抗和帕尼单抗两个具有抗性的LIM1215对MM-151敏感

用表达所指示EGFR胞外域突变体和对照的慢病毒感染LIM1215细胞(人类结肠直肠癌，CellBank Australia，目录号CBA-0161)，所述对照包含GFP对照(图3A)、EGFR野生型(图3B)、EGFR R451C(图3C)、S464L(图3D)、K467T(图3E)、G465R(图3F)、I491M(图3G)和S492R(图3H)。用增加浓度的西妥昔单抗(“CMAB”，深灰色线)、帕尼单抗(“PMAB”，浅灰色线)和MM-151(黑色线)处理所选择细胞6天。通过三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。如图3中所展示，西妥昔单抗并不能够抑制表达具有突变S464L、G465R、K467T、I491M或S492R的EGFR的细胞的生长；且帕尼单抗并不能够抑制表达具有突变S464L、G465R或I491M的细胞的生长。相反，MM-151能够抑制所测试的所有突变体和对照的细胞生长。

实例4：MM-151阻断对西妥昔单抗或对西妥昔单抗和帕尼单抗两个具有抗性的过表达EGFR胞外域突变体的LIM1215中的EGFR下游信号传导

为证实在前述实例观测到的生长抑制是由于EGF信号传导级联的阻断，用表达空白载体对照(图4A)、野生型EGFR(图4B)或包含R451C(图4C)、S464L(图4D)、K467T(图4E)、G465R(图4F)、I491M(图4G)和S492R(图4H)的EGFR胞外结构域突变体的慢病毒感染LIM1215人类结肠直肠癌细胞。在西妥昔单抗(“CETUX”)、帕尼单抗(“PMAB”)或MM-151的存在下培养所选择细胞2小时且用EGF(5ng/ml)刺激15分钟。使用抗体对磷酸-EGFR(“pEGFR”)、总EGFR(“EGFR”)、磷酸-AKT(“pAKT”)、总AKT(“TOT AKT”)、磷酸-ERK(“pERK”)、总ERK(TOT ERK)和作为加样对照的纽蛋白执行免疫印迹法。

如图4A到图4H中所展示，MM-151能够抑制所有对照细胞和表达EGFR胞外结构域突变体的细胞中的EGFR下游信号传导。相反，西妥昔单抗在抑制表达K467T或S492R突变的细胞中的信号传导时并不是有效的，且西妥昔单抗和帕尼单抗两个在遏抑表达S464L、G465R或I491M突变的细胞中的信号传导均不是有效的。

实例5：MM-151在表达EGFR胞外域突变时有效地抑制LIM1215西妥昔单抗抗性克隆细胞群体的增殖

用增加浓度(0.01μg/ml到100μg/ml)的西妥昔单抗、帕尼单抗或MM-151处理LIM1215野生型细胞、LIM1215抗性细胞群体(即，具有野生型和抗性细胞的混合物的细胞群体，其中的一些具有EGFR-ECD突变)和LIM1215抗性克隆(即，生长为克隆群体的表达EGFR-ECD突变的经分离细胞)六天。通过上文所描述的三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。所有分析法独立地执行至少三次。CMAB：西妥昔单抗；PMAB：帕尼单抗。

如图5A中所展示，所有三种药物均能够抑制野生型细胞的细胞生存力。相反，三中药物中无一种能够强有力地抑制细胞的一个抗性群体(图5B，“LIM1215 R5 pop”)的细胞生存力。仅MM-151能够抑制细胞的第二抗性群体(图5C，“LIM1215R5pop EGFR G465R”)的细胞生存力，其中细胞群体携载EGFR-ECD突变G465R。在具有EGFR-ECD突变I491M的克隆群体中(图5D)，三种药物中无一种能够在极大程度上抑制细胞生存力，尽管存在用MM-151处理的细胞的生存力的轻微减少。在具有EGFR-ECD突变S492R的克隆群体中(图5E)，仅西妥昔单抗未能抑制细胞生长。总之，这些结果证实见于以上实例的观测结果：三种药物中的每一种对表达EGFR-ECD突变体的细胞的有效性。

实例6：MM-151适度地影响OXCO-2西妥昔单抗抗性细胞的增殖

如同LIM1215野生型细胞，OXCO-2细胞内源性地表达EGFR且对抗EGFR疗法敏感。因此，使用以上实例5中所描述的方法评价OXCO-2细胞。如图6A中所展示，所有三种药物均能够抑制野生型细胞的细胞生存力。相反，三种药物中无一种能够强有力地抑制细胞的一个抗性群体的细胞生存力(图6B)，尽管MM-151与西妥昔单抗和帕尼单抗相比似乎对细胞生存力具有轻微影响；类似结果见于图6C中，其中所述细胞是表达EGFR ECD突变I491M的克隆群体。

实例7：MM-151有效地抑制表达高水平EGFR胞外域突变的CCK81和HCA46西妥昔单抗抗性细胞的增殖。

如针对实例5中的细胞所描述，用增加浓度的西妥昔单抗、帕尼单抗或MM-151处理CCK81和HCA46野生型以及抗性细胞群体六天。通过以上方法中所描述的三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。如同其它细胞系，所有三种药物均抑制野生型CCK81细胞(图7A)和野生型HCA46细胞(图7C)的生存力。相反，具有S464L突变的CCK81克隆细胞群体不受用西妥昔单抗或帕尼单抗处理影响，而MM-151能够抑制细胞生存力(图7B)。对于具有G465E突变的HCA46细胞的克隆群体发现类似结果(图7D)。

实例8：MM-151阻断西妥昔单抗抗性细胞中的EGFR下游信号传导

在西妥昔单抗(“CETUX”)、帕尼单抗(“PMAB”)或MM-151的存在下培养野生型和西妥昔单抗抗性群体以及克隆2小时且用EGF(10ng/ml)刺激15分钟。使用抗体对磷酸-EGFR(“pEGFR”)、总EGFR(“EGFR”)、磷酸-AKT(“pAKT”)、总AKT(“TOT AKT”)、磷酸-ERK(“pERK”)、总ERK(TOT ERK)和作为加样对照的纽蛋白执行免疫印迹法。

评价抗EGFR敏感细胞系LIM1215、OXCO-2、CCK81和HCA46。如图8A到图8D中所展示，MM-151能够抑制所有对照细胞和表达EGFR胞外结构域突变体的细胞中的EGFR下游信号传导。在LIM1215细胞中，帕尼单抗和西妥昔单抗均不能够抑制西妥昔单抗抗性细胞(“R5pop”)的混合群体、表达EGFR-ECD突变G465R(R5 CL55)、I491M(“R1 CLONE4”)或S492R(“KI”)的细胞的克隆群体(图8A)。在OXCO-2细胞中，帕尼单抗和西妥昔单抗均不能够抑制西妥昔单抗抗性细胞(“R2”)的混合群体或表达EGFR-ECD突变I491M(“R2 CL88”)的细胞的克隆群体。相反，其轻微地抑制具有NRAS突变但无EGFR-ECD突变(“R2 CL113”)的细胞的克隆群体中的EGFR信号传导(图8B)。在CCK81细胞中，所有三种药物均抑制野生型细胞，但仅MM-151抑制具有S464L突变(“R1”)的细胞的克隆群体(图8C)。最后，在HCA46细胞中，如在CCK81细胞中所见，所有三种药物均抑制野生型细胞，但仅MM-151抑制具有G465E突变(“R5”)的细胞的克隆群体(图8D)。

实例9：MM-151有效地抑制源自异种患者的细胞和表达EGFR胞外域突变的克隆的增殖

用增加浓度的西妥昔单抗、帕尼单抗和MM-151处理源自异种患者iCRC0104的细胞(从患者肿瘤中分离且接着活体外培养的细胞)(携带EGFR G465E)和抗性衍生克隆六天。通过上文所描述的三磷酸腺苷(ATP)分析法测量CRC104培养物(图9A)和两个克隆细胞群体(cl.1，图9B；cl.2，图9C)的细胞生存力。在所有三种培养物中，MM-151能够抑制细胞生存力，而西妥昔单抗和帕尼单抗仅能够在混合细胞群体(图9A)中且仅在极高浓度下在第二克隆细胞群体(图9C)中极轻微地抑制生存力。西妥昔单抗和帕尼单抗并不抑制第一克隆细胞群体(图9B)的细胞生存力。

实例10：三种抗体混合物与EGFR-ECD突变体的结合

不同于排他性的结合EGFR-ECD结构域的结构域III的单克隆抗体制剂，结合除结构域III之外的胞外结构域的其它部分的MM-151抗体混合物在与EGFR-ECD突变体中的许多结合时是有效的。为测定其它混合物是否将产生相同活性，如下文所描述执行无细胞结合实验。

平衡所有反应剂且在生物层干涉测量分析之前使样本达到室温。在装载之前，在无蛋白质阻断缓冲液(Pierce)中水合链霉亲和素生物传感器10min以最小化任何非特异性结合。按照制造商的说明书使用软件和程序运行分析。所述分析由以下步骤组成：在1×PBS中平衡5min；生物素标记的抗体装载(10μg/mL)1min；基线稳定1min，与列出的EGFR的胞外结构域变异体(500nM)一起培育3min；基线稳定1min；与第一个列出的抗体(呈500nM的P3X或“sym992”)一起培育3分钟；基线稳定另外1min；接着与第二个列出的抗体(呈500nM的P1X或25E)一起培育3分钟。1×PBS在通篇中用作基质。用数据分析软件分析和处理数据。

图10A展示评价MM-151的无细胞结合实验。三种ECD突变体(K467T、R451C和S492R)成功地与抗体P2X结合，且对于所有三种ECD突变体，也能够结合P3X。与ECD的结构域III结合的P1X能够结合K467T和R451C ECD突变，但不能结合S492R突变。类似结果见于图10B中，其中P1X被类似抗体25E置换。展示于图10C中的双抗体混合物在能够用第一抗体(“sym1024”)结合所有三个突变胞外域时，能够结合K467T和R451C ECD突变，但不能结合S492R突变。总之，这些结果确认见于以上实例的观测结果：MM-151寡克隆混合物用至少两种抗体接合EGFR胞外域突变的能力。此外，这些结果表明，针对MM-151和三种抗体的相关组合而非sym-992和sym-1024的寡克隆混合物所观测到的效用。

实例11：过表达EGFR S492R胞外域突变的LIM1215对西妥昔单抗和Sym004两个具有抗性且对MM-151敏感

用表达EGFR S492R胞外域突变的质粒稳定地转染LIM1215(#2)细胞系。在8nM EGF配体的存在下用增加浓度的西妥昔单抗(“CMAB”，深灰色)、sym-992和sym-1024的双抗体混合物(“Sym004”，浅灰色线)和MM-151(黑色线)处理所选择细胞3天。通过三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。如图11A和图11B中所展示，西妥昔单抗并不能够抑制表达野生型EGFR(未经转染的对照)或EGFR S492R突变的细胞的生长，且Sym004双抗体混合物并不能够抑制表达EGFR S492R突变的细胞的生长。相反，MM-151能够抑制表达野生型EGFR和EGFRS492R突变的细胞的细胞生长。

实例12：表达或过表达EGFR S492R胞外域突变的LIM1215对西妥昔单抗两个具有抗性且在活体内异种移植模型中对MM-151敏感

在接种有以下三个细胞系的雌性nu/nu小鼠中进行鼠类异种移植功效研究：LIM1215(#2)、LIM1215(#2)EGFR S492R KI(经工程改造以表达EGFR S492R胞外域突变)或LIM1215(#2)EGFR S492R(用表达EGFR S492R胞外域突变的质粒稳定地转染)。使肿瘤生长到大约300mm³且接着将小鼠随机分组为10个治疗组。在随机化之后，用PBS(媒剂对照)、西妥昔单抗或MM-151工具化合物治疗小鼠两周。如图12A中所展示，亲本LIM1215(#2)细胞系在两种所指示剂量下对西妥昔单抗和MM-151两个敏感。如图12B和图12C中所展示，西妥昔单抗并不能够在两种所指示剂量下抑制具有EGFR S492R胞外域突变的表达(图12B)或过表达(图12C)的细胞系的肿瘤生长。相反，MM-151能够在两种剂量下抑制肿瘤生长

实例13：对患者的循环无细胞DNA中的EGFR ECD突变的纵向监测可以充当响应于 MM-151疗法的标记

对在MM-151阶段1临床研究(NCT#01520389)(25)上收集的血清样本的亚组执行循环无细胞DNA的EGFR ECD突变的分析。亚组包含具有所记录的先前暴露于抗EGFR抗体(例如，西妥昔单抗、帕尼单抗)的11名结肠直肠癌患者，所述患者的合适血清样本是可用的。在向11名患者中的2名第一次给药MM-151之前，在基线样本中通过微滴式数字PCR检测到EGFRECD突变。在MM-151治疗的过程期间在所收集的样本中进行纵向分析，突出显示无细胞DNA中的EGFR ECD突变的等位基因频率在MM-151给药期间改变。在患者095中观测到的EGFRG465E突变的等位基因频率的鲜明的减少预见到通过CT扫描大约四周后测量的肿瘤体积的显著减少(图13A)。EGFR S464L和G465R突变的减少和稳定分别伴随在患者051中观测到经延长疾病稳定(图13B)。这些突变的等位基因频率的减退的逆转预见到在24周处的进展。

实例14：个别抗体与表达EGFR S492R突变的细胞的结合

进行流式细胞术结合实验以评估西妥昔单抗(“CMAB”)和MM-151混合物的三种组分抗体(P1X、P2X和P3X)与经工程改造以表达EGFR S492R胞外域突变(“LIM1215(#2)EGFRS492R KI”，灰色条柱)的细胞结合的程度(图14)。在冰(4℃)上将细胞与饱和浓度(0.1μM)的经Alexa-488标记的抗体一起培育1小时。对于每一种抗体，测量平均荧光强度(MFI)值且用EGFR野生型对照(LIM1215(#2)EGFR S492野生型，黑色条柱)对MFI进行标准化。与来自描述于实例10中的无细胞结合分析的结果一致，西妥昔单抗和P1X的结合在经工程改造以表达EGFR S492R胞外域突变的细胞上减少，而P2X抗体和P3X抗体的结合不受影响。

实例15：过表达或经工程改造以表达EGFR S492R胞外域突变的LIM1215对西妥昔单抗、帕尼单抗和Sym004具有抗性且对MM-151敏感

用表达野生型EGFR(LIM1215(#2)EGFR S492野生型)、过表达除野生型EGFR以外的EGFR S492R突变(LIMI1215(#2)EGFR S492R)和经由基因编辑表达EGFR S492R突变(LIM1215(#2)EGFR S492R KI)的细胞进行细胞生存力实验。在8nM EGF配体的存在下用西妥昔单抗(“CMAB”)、帕尼单抗(“PMAB”)、sym-992和sym-1024的双抗体混合物(“Sym004”)和MM-151处理细胞3天。通过三磷酸腺苷(ATP)分析法测量细胞生存力。

如图15A中所展示，西妥昔单抗(黑色)和帕尼单抗(暗灰色)并不能够抑制表达野生型EGFR或EGFR S492R突变的细胞的生长，且Sym004双抗体混合物(浅灰色)并不能够抑制表达EGFR S492R突变的细胞的生长。相反，MM-151(黑色和白条纺图案)能够抑制表达野生型EGFR、过表达EGFR S492R突变或经工程改造以表达EGFRS492R突变的细胞的细胞生长。所有抗体以1μM的浓度给药。

在8nM EGF配体的存在下用LIM1215(#2)EGFR S492野生型和LIM1215(#2)EGFRS492R KI细胞，但用增加浓度的西妥昔单抗(具有三角形标记的暗灰色线)、帕尼单抗(具有菱形标记的浅灰色线)、Sym004(具有圆形标记的灰色线)或MM-151(具有正方形标记的黑色线)进行第二次实验(图15B和图15C)。西妥昔单抗和帕尼单抗并不能够抑制表达野生型EGFR或EGFR S492R突变的细胞的生长。Sym004并不能够抑制表达EGFR S492R突变的细胞。相反，MM-151能够抑制表达野生型EGFR(相对于Sym004具有经改进效价)和EGFR S492R突变的细胞。

实例16：表达EGFR S492R或EGFR G465R突变的细胞的扩展在用西妥昔单抗治疗的过程期间观测到且通过MM-151抑制

为模拟含有肿瘤(其中其它细胞表达野生型EGFR)中的EGFR突变的细胞随时间推移的选择性扩展，进行两个经活体外合并培养物实验以经由用西妥昔单抗(具有三角形标记的灰色线)、MM-151(具有正方形标记的黑色线)或仅介质(具有圆形标记的浅灰色线)治疗的过程来评估两个代表性EGFR胞外域突变——EGFR S492R(图16A)和EGFR G465R(图16B)——的等位基因频率的改变。用含有经工程改造以分别表达EGFR S492R或EGFR G465R胞外域突变(实线)的LIM1215(#2)的经合并培养物进行十五天或七天实验。表达野生型EGFR(用非靶向sgRNA工程改造以维持野生型EGFR基因型；点画线)的LIM1215(#2)细胞的经合并培养物在EGFR S492R实验中的作为对照。在处理前第0天且在将细胞转移到新板前第4天、第10天和第15天(每一板孔中的大约一半细胞)沉淀细胞(5×10⁵个细胞)且对细胞进行基因组DNA提取。

通过微滴式数字PCR评估基因组DNA中的EGFR S492R和EGFR G465R胞外域突变的等位基因频率。正如预期的，S492R等位基因频率在实验的所有天在野生型对照孔(不管处理)中经测量为0％。在处理之前(第0天)在EGFR S492R孔中的平均S492R等位基因频率经测量为4.6％且历经15天在仅介质的存在下保持稳定(范围：4.6％到3.8％)。类似地，在处理之前(第0天)在EGFR G465R孔中的平均G465R等位基因频率经测量为0.6％且历经七天在仅介质的存在下保持稳定(范围：0.3％到0.6％)。

用西妥昔单抗处理的EGFR S492R孔中的平均等位基因频率历经十五天时间段从4.6％增加到42.1％。相反，用MM-151处理导致EGFR S492R孔中的平均S492R等位基因频率从4.6％减少到0.3％。类似地，用西妥昔单抗处理的EGFR G465R孔中的平均等位基因频率历经七天时间段从0.6％增加到9.8％。相反，用MM-151处理导致EGFR G465R孔中的平均G465R等位基因频率从0.6％减少到0.3％。

实例17：将已知EGFR胞外结构域突变分离到EGFR上的67个氨基酸序列。

人类EGFR基因由编码1210个氨基酸序列的28个外显子组成(图17A)。EGFR蛋白质由七个结构化蛋白质结构域组成且假定信号肽由氨基酸1到24组成。存在一起包括621个氨基酸和前15个外显子(外显子#15横跨胞外结构域IV和跨膜结构域)的四个胞外结构域(I、II、III、IV)。

已在编码氨基酸433到499的外显子12中鉴定出EGFR胞外域突变。图17B中所展示的是已在临床和/或临床前研究中鉴定出并在文献中报告的代表性突变的表格。这个区域横跨胞外结构域III的末端部分和结构域IV的开始部分。

实例18：MM-151通过表达或过表达代表性S492R胞外域突变的LIM1215细胞中的较低亲和力和较高亲和力EGFR配体两个来阻断EGFR的活化

为证实在先前实例15和实例16中观测到的生长抑制和克隆扩展抑制是由于EGFR信号传导的阻断，用表达野生型EGFR(LIM1215(#2)EGFRS492野生型)、过表达除野生型EGFR以外的EGFR S492R突变(LIMI1215(#2)EGFR S492R)和经由基因编辑而表达EGFR S492R突变(LIM1215(#2)EGFR S492R KI)的细胞进行磷酸-EGFR抑制分析用西妥昔单抗、sym-992和sym-1024的双抗体混合物(“Sym004”)和MM-151处理细胞24小时，随后用8nM EGF或AREG配体刺激10分钟。使用抗体对磷酸-EGFR(“pEGFR”)和作为装载对照的肌动蛋白进行免疫印迹法。

如图18中所展示，MM-151能够通过LIM1215(#2)对照细胞和表达或过表达EGFRS492R胞外域突变的细胞中的AREG和EGF配体来抑制EGFR活化。相反，当西妥昔单抗和Sym004能够抑制表达野生型EGFR的细胞中的EGFR活化时，其仅引起通过表达或过表达EGFRS492R突变的细胞中的AREG和EGF刺激的磷酸-EGFR的部分或低效抑制。

实例19：MM-151通过表达或过表达代表性S492R胞外域突变的LIM1215细胞中的较低亲和力和较高亲和力EGFR配体两个来阻断ERK的活化

为证实在先前实例15和实例16中观测到的生长抑制和克隆扩展抑制是由于EGFR的细胞信号传导下游的阻断，用表达野生型EGFR(LIM1215(#2)EGFR S492野生型)、过表达除野生型EGFR以外的EGFR S492R突变(LIM1215(#2)EGFR S492R)和经由基因编辑而表达EGFR S492R突变(LIM1215(#2)EGFR S492R KI)的细胞进行磷酸-ERK抑制分析。用西妥昔单抗、sym-992和sym-1024的双抗体混合物(“Sym004”)和MM-151处理细胞两小时，随后用8nMEGF或AREG配体刺激10分钟。进行ELISA实验以测量ERK(磷酸-ERK)的活化。

如图19A中所展示，MM-151能够通过LIM1215(#2)对照细胞和表达或过表达EGFRS492R胞外域突变的细胞中的EGF来抑制ERK活化。相反，西妥昔单抗和Sym004仅抑制对照细胞中的磷酸-ERK，且帕尼单抗仅抑制对照细胞和经工程改造的LIM1215(#2)EGFR S492R KI细胞中的磷酸-ERK。西妥昔单抗、帕尼单抗和Sym004在抑制过表达EGFR S492R突变的细胞中的磷酸-ERK时是低效的。

图19B和图19C展示通过用呈250nM药物的浓度的药物处理，随后用8nM EGF或AREG配体刺激10分钟来对磷酸-ERK的抑制。MM-151能够抑制通过三个细胞系中的AREG和EGF配体活化的磷酸-ERK。相反，西妥昔单抗和帕尼单抗在抑制通过EGF配体刺激的磷酸-ERK时无效，且Sym004仅在LIM1215(#2)对照细胞中提供中等抑制。西妥昔单抗、帕尼单抗和Sym004能够抑制通过LIM1215(#2)对照细胞中的AREG配体活化的磷酸-ERK，但在表达或过表达EGFR S492R突变的细胞中提供低效或部分的抑制。

实例20：由表达或过表达EGFR S492R胞外域突变的较低亲和力或较高亲和力EGFR 配体刺激的LIM1215细胞的生长通过对西妥昔单抗具有抗性的MM-151来抑制，且通过帕尼单抗和Sym004仅选择性地抑制。

为证实MM-151抑制具有代表性EGFR S492R突变的表达的细胞中的配体非依赖性和经配体刺激两个的细胞生长，用表达野生型EGFR(LIM1215(#2)EGFR S492野生型)、过表达除野生型EGFR以外的EGFR S492R突变(LIM1215(#2)EGFR S492R)和经由基因编辑而表达EGFR S492R突变(LIM1215(#2)EGFR S492R KI)的细胞进行细胞生长分析。

在8nM EGF或AREG配体存在下将细胞在活细胞成像器上与增加浓度的西妥昔单抗(“CMAB”，具有三角形标记的暗灰色线)、帕尼单抗(“PMAB”；具有菱形标记的浅灰色线)、sym-992和sym-1024的双抗体混合物(“Sym004”；具有圆形标记的暗灰色线)和MM-151(具有正方形标记的黑色线)一起培育三天。以两小时间隔评估孔的汇合度度历经72小时实验且将其用于计算针对每一条件下的细胞生长速率。

如图20A和图20B中所展示，不具有配体且用较低亲和力EGFR配体AREG刺激的LIM1215(#2)细胞的细胞生长速率受所有四种药物来抑制。然而，如图20C中所展示，西妥昔单抗和帕尼单抗并不能够抑制通过这种细胞系中的较高亲和力EGFR配体EGF而刺激的细胞生长，而Sym004引发部分抑制(对于无配体对照)。相反，MM-151引发强有力抑制(低于无配体对照)。

用LIM1215(#2)EGFR S492R KI细胞系进行第二次实验。如图20D到图20F中所展示，表达EGFR S492R突变的细胞在仅生长于介质中或具有外源性AREG或EGF时对西妥昔单抗具有抗性。如图20E中所展示，用较低亲和力EGFR配体AREG刺激降低通过Sym004(相比于图20B中的亲本细胞系)提供抑制，但保持对帕尼单抗和MM-151的敏感性。如图20F中所展示，通过EGF刺激的细胞生长仅受MM-151抑制。

用LIM1215(#2)EGFR S492R细胞系进行第三次实验(图20G到到20I)。过表达EGFRS492R突变的细胞在仅生长于介质中或具有外源性AREG或EGF时对西妥昔单抗具有抗性。Sym004在仅介质中提供细胞生长的部分抑制，但不提供配体依赖性细胞生长(AREG或EGF)的抑制。帕尼单抗在仅介质中和AREG的存在下而不是EGF的存在下抑制细胞生长。相反，MM-151抑制过表达代表性EGFR S492R突变的细胞中的配体非依赖性和配体依赖性的细胞生长两个。

序列概述

Claims

1.一种寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合在治疗具有选自EGFR R451C、S464L、K467T、G465R、G465E、I491M和S492R的EGFR的ECD中的至少一个所检测突变的表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ECD)突变型癌症中的用途，其中所述寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合包含三种单克隆抗体，其中第一单克隆抗体是P1X，第二单克隆抗体是P2X，第三单克隆抗体是P3X，且所述寡克隆抗体组合包含呈2∶2∶1摩尔比的P1X、P2X和P3X。

2.一种寡克隆抗表皮生长因子受体(抗EGFR)抗体组合在治疗人类患者中的EGFR胞外结构域(ECD)突变型癌症中的用途，其中所述寡克隆抗体组合包含：

a.第一单克隆抗体，包括分别SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；

b.第二单克隆抗体，包括分别SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列；和

c.第三单克隆抗体，包括分别SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的重链CDR1、CDR2和CDR3序列，和分别SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述第一单克隆抗体是P1X，所述第二单克隆抗体是P2X，所述第三单克隆抗体是P3X，且所述寡克隆抗体组合包含呈2∶2∶1摩尔比的P1X、P2X和P3X。

4.根据权利要求1或2所述的用途，接着用不同抗EGFR疗法治疗所述癌症。

5.根据权利要求1或2所述的用途，接着用西妥昔单抗、帕尼单抗或Sym004治疗所述癌症且检测所述人类患者中的EGFR的ECD区中的外显子12突变。

6.根据权利要求2到4中任一项所述的用途，接着检测所述患者中的EGFR的所述ECD区中的外显子12突变。

7.根据权利要求1到5中任一项所述的用途，其中所述癌症是K-Ras、N-Ras和/或BRAF野生型转移性结肠直肠癌。

8.根据权利要求2到4中任一项所述的用途，接着检测所述患者的血尿中的所述EGFR胞外结构域的结构域III中的突变。

9.根据权利要求2到4中任一项所述的用途，接着从所述患者获得血液样本，且测定所述血液样本含有具有编码EGFR的所述胞外结构域的序列中的一或多个突变的循环DNA。

10.根据权利要求9所述的用途，其中EGFR的所述胞外结构域中的所述至少一个突变是蛋白质序列改变或导致蛋白质序列改变的DNA或RNA编码区，所述至少一个突变选自EGFRR451C、S464L、K467T、G465R、G465E I491M和S492R。

11.根据权利要求1到9中任一项所述的用途，其中所述癌症是头颈癌或Ras野生型结肠直肠癌。