CN102977212B - 含有抗igf-1受体抗体的组合物和获得所述抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了涉及IGF-1R抗体或来源于其的药物组合物和方法。在特定的实施方案中，本发明提供了结合人IGF-1R的完全人的、人源化的或嵌合的抗IGF-1R抗体、这些抗体的IGF-1R结合片段和衍生物以及包含这些片段的IGF-1R结合性多肽。其他实施方案提供了编码这些抗体、抗体片段和衍生物及多肽的核酸、包含这些核酸的细胞、制备这些抗体、抗体片段和衍生物及多肽的方法和使用这些抗体、抗体片段和衍生物及多肽的方法，包括治疗或诊断患有IGF-1R相关性病症或疾病的受试者的方法。

Description

含有抗IGF-1受体抗体的组合物和获得所述抗体的方法
本申请是申请日为2005年12月20日、申请号为200580048584.9、发明名称为“含有抗IGF-1受体抗体的组合物和获得所述抗体的方法”的发明专利申请的分案申请。
参考相关申请
本申请要求2004年12月22日提交的美国临时专利申请系列60/638,961的利益，且在此引用作为参考。
发明领域
本申请提供了涉及抗IGF-1受体抗体的组合物和方法。
发明背景
胰岛素样生长因子1和2(分别为IGF-1和IGF-2)促进多种哺乳动物细胞类型的分化和增殖。
IGF-1和IGF-2两者随血浆广泛地在整个身体中循环。其通过结合并激活IGF-1受体(IGF-1R)来对细胞产生其作用。IGF-1R是酪氨酸激酶生长因子受体家族的成员。其氨基酸序列与胰岛素受体的氨基酸序列具有大约70%的同一性。
异常的IGF-1、IGF-2、和/或IGF-1R的活性与许多医学状况相关联，所述医学状况包括不同类型的癌症、生长缺陷（例如，肢端肥大症、巨人症和身材矮小症（smallstature)）、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管成形术后血管的平滑肌再狭窄（restonsis）、糖尿病、微血管增生、神经病变、肌肉质量减少（lossofmusclemass）和骨质疏松症。
附图概述
图1提供了编码轻链可变结构域L1至L52和重链可变结构域H1至H52的核苷酸序列。
图2提供了轻链可变结构域L1至L52的氨基酸序列。CDR和FR区被标示。
图3提供了重链可变结构域H1至H52的氨基酸序列。CDR和FR被标示。
图4提供了轻链可变结构域L1至L52的轻链CDR1区的氨基酸序列。也提供了成组的相关CDR序列的共有序列。
图5提供了轻链可变结构域L1至L52的轻链CDR2区的氨基酸序列。也提供了成组的相关CDR序列的共有序列。
图6提供了轻链可变结构域L1至L52的轻链CDR3区域的氨基酸序列。也提供了成组的相关CDR序列的共有序列。
图7提供了重链可变结构域H1至H52的重链CDR1区的氨基酸序列。也提供了成组的相关CDR序列的共有序列。
图8提供了重链可变结构域H1至H52的重链CDR2区的氨基酸序列。也提供了成组的相关CDR序列的共有序列。
图9提供了重链可变结构域H1至H52的重链CDR3区的氨基酸序列。也提供了成组的相关CDR序列的共有序列。
图10提供了融合至人IgG1Fc区域（下划线标示的）的人IGF-1R细胞外结构域的氨基酸序列，其具有caspace-3切割位点（粗体）。
图11提供了融合至人IgG1Fc区域（下划线标示的）的人胰岛素受体的细胞外结构域的氨基酸序列。
图12提供了在C末端与鸡抗生物蛋白融合的人IGR-1R细胞外结构域(包括信号肽)的蛋白序列。在该图中，将IGF-1RECD中的起始Met指定为位置1。
图13提供了人κ轻链抗体恒定区和人IgG1重链抗体恒定区的多肽序列。
图14提供了举例说明4个噬菌体展示的抗体对IGF-1R-Fc分子的结合显著好于其对胰岛素受体-Fc或鼠类Fc的结合的图。
图15提供了举例说明某些抗体与IGF-1和IGF-2竞争对IGF-1R的结合的能力的图。
图16提供了举例说明某些抗体抑制32DhuIGF-1R+IRS-1细胞生长的能力的图。
图17提供了举例说明某些抗体抑制Balb/C3T3huIGF-1R细胞生长的能力的图。
发明概述
在一个方面，本发明提供了分离的抗原结合蛋白，其包含：a.包含选自下列序列的轻链CDR3：i.与选自图6中所示L1-L52的轻链CDR3序列的CDR3序列相差不超过总共2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR3序列；ii.MX1X2X3X4X5PX6X7；iii.QQX8X9X10X11PX12T；和iv.QSYX13X14X15NX16X17X18；b.包含选自下列序列的重链CDR3：i.与选自图9中所示的H1-H52的重链CDR3序列的CDR3序列相差不超过总共3个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR3序列；ii.X19X20X21X22X23X24X25X26X27FDI;iii.X28X29X30X31X32X33X34X35X36X37X38MDV;iv.DSSX39;或c.(a)的轻链CDR3序列和(b)的重链CDR3序列；其中X1是谷氨酰胺残基或谷氨酸残基,X2是丙氨酸残基、甘氨酸残基、苏氨酸残基或丝氨酸残基,X3是亮氨酸残基、苯丙氨酸残基或苏氨酸残基,X4是谷氨酰胺残基、谷氨酸残基或组氨酸残基,X5是苏氨酸残基、甲硫氨酸残基、色氨酸残基或缬氨酸残基,X6是甘氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、脯氨酸残基、苯丙氨酸残基、甲硫氨酸残基、色氨酸残基或半胱氨酸残基,X7是苏氨酸残基、丙氨酸残基或丝氨酸残基,X8是精氨酸残基、丝氨酸残基、亮氨酸残基或丙氨酸残基,X9是天冬酰胺残基、丝氨酸残基或组氨酸残基,X10是天冬酰胺残基或丝氨酸残基,X11是色氨酸残基、缬氨酸残基、酪氨酸残基、脯氨酸残基或苯丙氨酸残基,X12是亮氨酸残基、酪氨酸残基或异亮氨酸残基,X13是天冬氨酸残基或谷氨酰胺残基,X14是丝氨酸残基或脯氨酸残基,X15是丝氨酸残基、酪氨酸残基、天冬氨酸残基或丙氨酸残基,X16是谷氨酰胺残基、精氨酸残基、缬氨酸残基或色氨酸残基,X17是精氨酸残基、缬氨酸残基、异亮氨酸残基或无残基，X18是缬氨酸残基或无残基，X19是谷氨酸残基或无残基，X20是酪氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基或无残基，X21是丝氨酸残基、天冬酰胺残基、色氨酸残基、谷氨酸残基、天冬氨酸残基或无残基,X22是丝氨酸残基、天冬氨酸残基、色氨酸残基、丙氨酸残基、精氨酸残基、苏氨酸残基、谷氨酰胺残基、亮氨酸残基、谷氨酸残基或无残基,X23是丝氨酸残基、甘氨酸残基、天冬酰胺残基、苏氨酸残基、色氨酸残基、缬氨酸残基、丙氨酸残基或异亮氨酸残基,X24是精氨酸残基、谷氨酰胺残基、酪氨酸残基、缬氨酸残基、丙氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、苯丙氨酸残基,或色氨酸残基,X25是天冬酰胺残基、亮氨酸残基、天冬氨酸残基、苏氨酸残基、色氨酸残基、酪氨酸残基、缬氨酸残基、丙氨酸残基,或组氨酸残基,X26是天冬氨酸残基、丝氨酸残基、天冬酰胺残基,或谷氨酰胺残基,X27是丙氨酸残基或脯氨酸残基,X28是丙氨酸残基或无残基，X29是谷氨酸残基、酪氨酸残基、甘氨酸残基或无残基，X30是精氨酸残基、丝氨酸残基或无残基,X31是甘氨酸残基、天冬氨酸残基、缬氨酸残基、丝氨酸残基或无残基,X32是丝氨酸残基、天冬氨酸残基、甘氨酸残基或无残基,X33是苯丙氨酸残基、天冬氨酸残基、酪氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、组氨酸残基、色氨酸残基或无残基，X34是色氨酸残基、天冬氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基或无残基,X35是天冬氨酸残基、谷氨酸残基、精氨酸残基、丝氨酸残基、甘氨酸残基、酪氨酸残基,或色氨酸残基,X36是酪氨酸残基、赖氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基或苯丙氨酸残基,X37是酪氨酸残基、丝氨酸残基、苯丙氨酸残基、天冬氨酸残基或甘氨酸残基,X38是甘氨酸残基、天冬酰胺残基,或酪氨酸残基,X39是缬氨酸残基、甘氨酸残基,或丝氨酸残基，且所述抗原结合蛋白特异性地结合人IGF-1R。在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列，所述序列选自：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相差总共不超过6个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.与图5中所示的L1-L52的CDR2序列相差总共不超过2个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的轻链CDR2序列；c.与图6中所示的L1-L52的CDR3序列相差总共不超过3个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的轻链CDR3序列；d.与图7中所示的H1-H52的CDR1序列相差总共不超过2个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的重链CDR1序列；e.与图8中所示的H1-H52的CDR2序列相差总共不超过5个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的重链CDR2序列；和f.与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相差总共不超过4个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相差总共不超过5个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.与图5中所示的L1-L52的CDR2序列相差总共不超过1个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的轻链CDR2序列；c.与图6中所示的L1-L52的CDR3序列相差总共不超过2个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的轻链CDR3序列；d.与图7中所示的H1-H52的CDR1序列相差总共不超过1个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的重链CDR1序列；e.与图8中所示的H1-H52的CDR2序列相异总共不超过4个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的重链CDR2序列；和f.与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相异总共不超过3个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的重链CDR3序列；在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相异总共不超过4个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.图5中所示的L1-L52的轻链CDR2序列；c.与图6中所示的L1-L52的CDR3序列相异总共不超过1个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的轻链CDR3序列；d.图7中所示的H1-H52的重链CDR1序列；e.与图8中所示的H1-H52的CDR2序列相异总共不超过3个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的重链CDR2序列；和f.与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相异总共不超过2个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的重链CDR3序列；在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相异总共不超过3个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.图6中所示的L1-L52的轻链CDR3序列；c.与图8中所示的H1-H52的CDR2序列相异总共不超过2个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的重链CDR2序列；和d.与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相异总共不超过1个氨基酸的添加、置换或缺失的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相异总共不超过2个氨基酸残基的添加、置换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.与图8中所示的H1-H52的CDR2序列相异总共不超过1个氨基酸的添加、置换或缺失的重链CDR2序列；和c.图9中所示的H1-H52的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相异总共不超过1个氨基酸残基的添加、置换或缺失的轻链CDR1序列；和b.图8中所示的H1-H52的重链CDR2序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含图4中所示的L1-L52的CDR1序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含序列，所述序列选自：a.选自i.RSSQSLLHSNGYNYLD、ii.RASQ(G/S)(I/V)(G/S)X(Y/F)L(A/N)和iii.RSSQS(L/I)XXXXX的轻链CDR1序列；b.选自i.LGSNRAS、ii.AASTLQS和iii.EDNXRPS的轻链CDR2序列；c.选自:i.SSNWWS、ii.XYYWS和iii.SYAM(S/H)的重链CDR1序列；和d.选自i.(E/I)(I/V)(Y/N)(H/Y)SGST(N/Y)YNPSLKS;和ii.XIS(G/S)SG(G/S)STYYADSVKG的重链CDR2序列；其中，括号内包括的氨基酸残基符号代表序列中相同位置的可选择的残基，各X独立地是任何氨基酸残基，各Z独立地是甘氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、脯氨酸残基、苯丙氨酸残基、甲硫氨酸残基、色氨酸残基,或半胱氨酸残基。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含重链CDR3序列，该序列与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含重链CDR3序列，该序列与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相异总共不超过1个氨基酸的添加、置换和/或缺失。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含图9中所示的H1-H52的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含2个氨基酸序列，所述序列选自：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相异总共不超过6个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.与图5中所示的L1-L52的CDR2序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR2序列；c.与图6中所示的L1-L52的CDR3序列相异总共不超过3个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR3序列；d.与图7中所示的H1-H52的CDR1序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR1序列；e.与图8中所示的H1-H52的CDR2序列相异总共不超过5个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR2序列；和f.与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相异总共不超过4个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含3个氨基酸序列，所述序列选自：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相异总共不超过6个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.与图5中所示的L1-L52的CDR2序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR2序列；c.与图6中所示的L1-L52的CDR3序列相异总共不超过3个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR3序列；d.与图7中所示的H1-H52的CDR1序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR1序列；e.与图8中所示的H1-H52的CDR2序列相异总共不超过5个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR2序列；和f.与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相异总共不超过4个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含4个氨基酸序列，所述序列选自：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相异总共不超过6个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.与图5中所示的L1-L52的CDR2序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR2序列；c.与图6中所示的L1-L52的CDR3序列相异总共不超过3个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR3序列；d.与图7中所示的H1-H52的CDR1序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR1序列；e.与图8中所示的H1-H52的CDR2序列相异总共不超过5个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR2序列；和f.与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相异总共不超过4个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含5个氨基酸序列，所述序列选自：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相异总共不超过6个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.与图5中所示的L1-L52的CDR2序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR2序列；c.与图6中所示的L1-L52的CDR3序列相异总共不超过3个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR3序列；d.与图7中所示的H1-H52的CDR1序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR1序列；e.与图8中所示的H1-H52的CDR2序列相异总共不超过5个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR2序列；和f.与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相异总共不超过4个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含：a.与图4中所示的L1-L52的CDR1序列相异总共不超过6个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.与图5中所示的L1-L52的CDR2序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR2序列；c.与图6中所示的L1-L52的CDR3序列相异总共不超过3个氨基酸的添加、置换和/或缺失的轻链CDR3序列；d.与图7中所示的H1-H52的CDR1序列相异总共不超过2个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR1序列；e.与图8中所示的H1-H52的CDR2序列相异总共不超过5个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR2序列；和f.与图9中所示的H1-H52的CDR3序列相异总共不超过4个氨基酸的添加、置换和/或缺失的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含：a.轻链可变结构域，其包含：i.图4中所示的轻链CDR1序列；ii.图5中所示的轻链CDR2序列；和iii.图6中所示的轻链CDR3序列；b.重链可变结构域，其包含：i.图7中所示的重链CDR1序列;ii.图8中所示的重链CDR2序列；和iii.图9中所示的重链CDR3序列；或c.(a)的轻链可变结构域和(b)的重链可变结构域。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含：a.轻链CDR1、CDR2和CDR3序列，所述各序列分别与选自L1-L52的相同轻链可变结构域序列的CDR1、CDR2和CDR3序列同一；b.各自分别与选自H1-H52的相同重链可变结构域序列的CDR1、CDR2和CDR3序列同一的重链CDR1、CDR2和CDR3序列；或c.（a）的轻链CDR1、CDR2和CDR3序列和(b)的重链CDR1、CDR2和CDR3序列。
在另一个方面，本发明提供了分离的抗原结合蛋白，其包含：a.轻链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列具有至少80%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列的至少15个连续氨基酸残基的氨基酸序列；iii.由与图1中所示的编码L1-L52的轻链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少80%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和iv.由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸序列在中等严紧条件下与由图1中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列组成的多核苷酸的互补序列杂交；b.重链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列具有至少80%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列的至少15个连续氨基酸残基的氨基酸序列；iii.由与图1中所示的编码H1-H52的重链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少80%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和iv.由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸序列在中等严紧条件下与由图1所示的H1-H52的重链可变结构域序列组成的多核苷酸的互补序列杂交；或c.（a）的轻链可变结构域和(b)的重链可变结构域；其中所述抗原结合蛋白结合人IGF-1R。在一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含：a.轻链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列具有至少85%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列的至少25个连续氨基酸残基的氨基酸序列；iii.由与图1中所示的编码L1-L52的轻链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少85%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和iv.由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸序列在高度严紧条件下与由图1所示的L1-L52的轻链可变结构域序列组成的多核苷酸的互补序列杂交；b.重链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列具有至少85%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列的至少25个连续氨基酸残基的氨基酸序列；iii.由与图1中所示的编码H1-H52的重链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少85%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和iv.由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸序列在高度严紧条件下与由图1中所示的H1-H52的重链可变结构域序列组成的多核苷酸的互补序列杂交；或c)（a）的轻链可变结构域和(b)的重链可变结构域。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含：a.轻链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列的至少35个连续氨基酸残基的氨基酸序列；和iii.由与图1中所示的编码L1-L52的轻链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少90%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和b.重链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列具有至少90%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列的至少35个连续氨基酸残基的氨基酸序列；和iii.由与图1中所示的编码H1-H52的重链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少90%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；或c)（a）的轻链可变结构域和(b)的重链可变结构域。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含：a.轻链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列的至少50个连续氨基酸残基的氨基酸序列；和iii.由与图1中所示的编码L1-L52的轻链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少95%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和b.重链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列的至少50个连续氨基酸残基的氨基酸序列；和iii.由与图1中所示的编码H1-H52的重链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少95%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；或c)（a）的轻链可变结构域和(b)的重链可变结构域。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含：a.轻链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列具有至少97%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列的至少75个连续氨基酸残基的氨基酸序列；和iii.由与图1中所示的编码L1-L52的轻链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少97%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和b.重链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列具有至少97%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列的至少75个连续氨基酸残基的氨基酸序列；和iii.由与图1中所示的编码H1-H52的重链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少97%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；或c)（a）的轻链可变结构域和(b)的重链可变结构域。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含：a.轻链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列具有至少99%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的L1-L52的轻链可变结构域序列的至少90个连续氨基酸残基的氨基酸序列；和iii.由与图1中所示的编码L1-L52的轻链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少99%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；和b.重链可变结构域序列，其选自：i.与图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列具有至少99%的同一性的氨基酸序列；ii.包含图2中所示的H1-H52的重链可变结构域序列的至少90个连续氨基酸残基的氨基酸序列；和iii.由与图1中所示的编码H1-H52的重链可变结构域序列的多核苷酸序列具有至少99%的同一性的多核苷酸序列编码的氨基酸序列；或c)（a）的轻链可变结构域和(b)的重链可变结构域。在另一个实施方案中，分离的抗原结合蛋白包含：a.轻链可变结构域，其选自图2中所示的L1-L52；b.选自图3中所示的H1-H52的重链可变结构域序列；或c.（a）的轻链可变结构域和(b)的重链可变结构域。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包含选自下列组合的轻链可变结构域和重链可变结构域的组合：L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14、L15H15、L16H16、L17H17、L18H18、L19H19、L20、H20、L21H21、L22H22、L23H23、L24H24、L25H25、L26H26、L27H27、L28H28、L29H29、L30H30、L31H31、L32H32、L33H33、L34H34、L35H35、L36H36、L37H37、L38H38、L39H39、L40H40、L41H41、L42H42、L43H43、L44H44、L45H45、L46H46、L47H47、L48H48、L49H49、L50H50、L51H51和L52H52。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白还包含：a.图13的κ轻链恒定序列，b.图13的IgG1重链恒定序列或c.图13的κ轻链恒定序列和图13的IgG1重链恒定序列。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白，当结合IGF-1R时:a.抑制IGF-1R;b.激活IGF-1R;c.与参照抗体交叉竞争对IGF-1R的结合；d.与所述参照抗体结合相同的IGF-IR的表位；e.结合IGF-1R，该结合具有基本上与所述参照抗体相同的Kd；或f.结合IGF-1R，其解离率（offrate）基本上与所述参照抗体相同；其中所述参照抗体包含选自下列组合的轻链和重链可变结构域序列的组合：L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14、L15H15、L16H16、L17H17、L18H18、L19H19、L20、H20、L21H21、L22H22、L23H23、L24H24、L25H25、L26H26、L27H27、L28H28、L29H29、L30H30、L31H31、L32H32、L33H33、L34H34、L35H35、L36H36、L37H37、L38H38、L39H39、L40H40、L41H41、L42H42、L43H43、L44H44、L45H45、L46H46、L47H47、L48H48、L49H49、L50H50、L51H51和L52H52。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白，当与人IGF-1R结合时，抑制IGF-1和/或IGF-2对所述人IGF-1R的结合。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白在选自血清、IGF-1和GF-2的生长刺激物存在的情况下抑制癌症的生长高于80%。在另一个实施方案中，所述癌细胞是MCF-7人乳腺癌细胞。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白以高于其对于人胰岛素受体的选择性至少50倍的选择性结合人IGF-1R。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白在体内抑制肿瘤的生长。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白抑制IGF-1R介导的酪氨酸磷酸化。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白特异性地结合非人灵长类、食蟹猴（cynomologousmonkey）、黑猩猩、非灵长类哺乳动物、啮齿动物、小鼠、大鼠、仑鼠、豚鼠、猫或狗的IGF-1R。在另一个实施方案中，所述分离的抗原结合蛋白包括：a.人抗体；b.人源化抗体；c.嵌合抗体；d.单克隆抗体；e.多克隆抗体；f.重组抗体；g.抗原结合抗体片段；h.单链抗体；i.双抗体；j.三链抗体;k.四链抗体（tetrabody）;l.Fab片段；m.F(ab’)2片段；n.结构域抗体（domainantibody）;o.IgD抗体;p.IgE抗体;q.IgM抗体;r.IgG1抗体;s.IgG2抗体;t.IgG3抗体;u.IgG4抗体;或v.具有至少一个减少形成H链内二硫键的趋势的铰链区内突变的IgG4抗体。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，该多核苷酸包含编码所述抗原结合蛋白的轻链、重链或两者的序列。在一个实施方案中，所述多核苷酸包含图1的轻链可变结构域核酸序列和/或图1的重链可变结构域核酸序列。在另一个实施方案中，质粒包含所述分离的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述质粒是表达载体。在另一个实施方案中，分离的细胞包含所述多核苷酸。在另一个实施方案中，所述细胞的染色体包含所述多核苷酸。在另一个实施方案中，所述细胞是杂交瘤细胞。在另一个实施方案中，表达载体包含所述核酸。在另一个实施方案中，所述细胞是CHO细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了制备结合人IGF-1R的抗原结合蛋白的方法，其包括在允许所述分离的细胞表达所述抗原结合蛋白的条件下温育所述细胞。
在另一个方面，本发明提供了包含所述抗原结合蛋白的药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供了在受试者中治疗病症的方法，其包括给所述受试者施用所述药物组合物，其中可通过在所述受试者中减少IGF-1R的活性来治疗所述病症。在另一个实施方案中，所述受试者是人类。在另一个实施方案中，所述病症是多发性骨髓瘤、液体肿瘤（liquidtumor）、肝癌、胸腺疾病（thymusdisorder）、T细胞介导的自身免疫疾病、内分泌紊乱（endocronologicaldisorder）、局部缺血或神经变性疾病（neurodegenerativedisorder）。在另一个实施方案，所述液体肿瘤选自急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性髓细胞性白血病(CML);其中所述肝癌选自肝癌、肝细胞癌、胆管癌、血管肉瘤、血管肉瘤、肝胚细胞瘤;其中所述胸腺疾病选自胸腺瘤和甲状腺炎，其中所述T细胞介导的自身免疫疾病选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎、白塞病（Bechet'sDisease），其中所述内分泌紊乱选自II型糖尿病、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺炎、肾上腺皮质功能亢进和肾上腺皮质功能减退；其中所述局部缺血是心脏梗塞后局部缺血（postcardiacinfarctischemia），或其中所述神经变性病症是阿耳茨海默氏病。在另一个实施方案中，所述病症选自肢端肥大症、膀胱癌、肾母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺增生症、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、滑膜肉瘤、与转移类癌瘤相关的腹泻、分泌肠道血管活性肽的肿瘤（vasoactiveintestinalpeptidesecretingtumors）、巨人症、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管的平滑肌再狭窄、不适当的微血管增殖、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、头和颈鳞状上皮细胞癌、口腔癌、口腔白斑、前列腺上皮内瘤形成（prostateintraepithelialneoplasia）、肛门癌、食管癌、胃癌、骨癌、转移癌、真性红细胞增多症、与氧化应激相关的良性病症、早产儿视网膜病、急性呼吸窘迫综合征、对乙酰氨基酚的过度剂量、支气管肺发育异常、囊性纤维化、肺纤维化和糖尿病性视网膜病。在另一个实施方案中，所述方法还包括给所述受试者施用第二疗法。在另一个实施方案中，在给所述受试者施用所述药物组合物之前和/或与此同时和/或之后施用所述第二疗法。在另一个实施方案中，所述第二疗法包括放照治疗、手术或第二药物组合物。在另一个实施方案中，所述第二药物组合物包含药剂，所述药剂选自皮质类固醇、止吐药、盐酸昂丹司琼、盐酸格拉司琼、甲氧氯普胺（metroclopramide）、多潘立酮、氟派啶醇、赛克利嗪、劳拉西泮、丙氯拉嗪、地塞米松、甲氧异丁嗪、托吡西隆、癌症疫苗、GM-CSF抑制剂、GM-CSFDNA疫苗、基于细胞的疫苗、树突细胞疫苗、重组病毒疫苗、热激蛋白(HSP)疫苗、同种异体肿瘤疫苗（allogeneictumorvaccine）、自体肿瘤疫苗、止痛剂、布洛芬、萘普生、三水杨酸胆碱镁、盐酸氧可酮、抗血管生成（anti-angiogenicagent）、抗血管剂（anti-vascularagent）、贝伐单抗、抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体片段、抗TWEAK抗体、抗TWEAK受体抗体、可溶性TWEAK受体片段、AMG706、AMG386、抗增殖剂、法呢基蛋白转移酶抑制剂（farnesylproteintransferaseinhibitor）、αvβ3抑制剂、αvβ5抑制剂、p53抑制剂、kit受体抑制剂、ret受体抑制剂、PDGFR抑制剂、生长激素分泌抑制剂、血管生成素抑制剂（angiopoietininhibitor）、肿瘤浸润性巨噬细胞抑制剂、c-fms抑制剂、抗c-fms抗体、CSF-1抑制剂、抗CSF-1抗体、可溶性c-fms片段、培维索孟、吉西他滨、panitumumab、依立替康（irinothecan）、和SN-38。在另一个实施方案中，所述方法包括给所述受试者施用第三疗法。在另一个实施方案中，所述病症是癌症，所述第二疗法包括施用panitumumab，且所述第三疗法包括施用吉西他滨。在另一个实施方案中，所述病症选自：肢端肥大症、膀胱癌、肾母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺增生、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、滑膜肉瘤、与转移的类癌瘤相关的腹泻、血管活性肠肽分泌型肿瘤、巨人症、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管的平滑肌再狭窄、不适当的微血管增殖、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、头与颈鳞状上皮细胞癌、口腔癌、口腔白斑症、前列腺上皮内瘤形成、肛门癌、食管癌、胃癌、骨癌、转移癌、真性红细胞增多症、涉及氧化应激的良性病症、早产儿视网膜病、急性呼吸窘迫综合征、对乙酰氨基酚的过量、支气管肺发育异常、囊性纤维化、肺纤维化和糖尿病性视网膜病。
在另一个方面，本发明提供了增加受试者寿命的方法，其包括给所述受试者施用所述药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了在需要其的受试者中减少IGF-1R活性的方法，其包括给所述受试者施用所述药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了在需要其的受试者中减少IGF-1R信号转导的方法，其包括给所述受试者施用所述药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了在需要其的受试者中抑制IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合的方法，其包括给所述受试者施用所述药物组合物。
发明详述
本发明提供了涉及结合胰岛素样生长因子受体(“IGF-1R”)的分子的组合物、试剂盒和方法，所述分子包括激动或拮抗IGF-1R的分子，例如抗IGF-1R抗体、抗体片段和抗体衍生物，例如拮抗性抗IGF-1R抗体、抗体片段或抗体衍生物。也提供了包含编码结合IGF-1R的多肽的整体或部分的核苷酸序列的核酸及其衍生物和片段（例如编码抗IGF-1R抗体的整体或部分、抗体片段或抗体衍生物的核酸）、包含这些核酸的质粒和载体以及包含这些核酸和/或载体以及质粒的细胞或细胞系。提供的方法包括，例如制备、鉴定或分离结合IGF-1R的分子例如抗IGF-1R抗体的方法，确定分子是否结合IGF-1R的方法，确定分子是否激动或拮抗IGF-1R的方法，制备包含结合IGF-1R的分子的组合物例如药物组合物的方法，和给受试者施用结合IGF-1R的分子的方法，例如用于治疗由IGF-1R介导的病症的方法，和用于在体内或体外激动或拮抗IGF-1R、IGF-1和/或IGF-2的生物学活性的方法。
使用标准的单或三字母缩写标示多核苷酸和多肽序列。除非另外指出，多肽序列在左边具有其氨基末端，在右边具有其羧基末端以及单链核酸序列，双链核酸序列的上面的链在左边具有其5’末端，在右边具有其3’末端。也可通过说明其与参照序列的不同之处来描述特定的多肽或多核苷酸序列。
特定轻链和重链可变结构域的多核苷酸和多肽序列示于图1、2和3中，其中将其标记为，例如，L1（“轻链可变结构域1”）、H1（“重链可变结构域1”）等。通过组合轻链的名称和重链可变结构域的名称来表示包含来自图2和3的轻链和重链的抗体。例如，“L4H7”表示包含L4的轻链可变结构域和H7的重链可变结构域的抗体。
除非此处另外定义，所用的与本发明相关的科学和技术术语将具有由本领域技术人员通常理解的意思。此外，除非上下文另外要求，单数术语包括复数而复数术语包括单数。一般地，用于此处描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传和蛋白质以及核酸化学和杂交的术语学和技术是本领域内熟知和常用的术语和技术。除非另外说明，通常按照在整个本说明书中引用和描述的本领域熟知的和各种一般和更专业的参考资料中描述的常规方法进行本发明的方法和技术。参见，例如，Sambrook等人MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)和Ausubel等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992),和HarlowandLaneAntibodies:ALaboratoryManualColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1990),其在此引用作为参考。按照厂商说明书进行酶促反应和纯化技术，如通常在本领域内实现的或如此处所描述的。所用的与此处描述的分析化学、合成有机化学和医学和药物化学的实验室方法和技术相关的术语学是本领域熟知的和常用的术语学。可将标准的技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
下列术语，除非另外指出，将理解为具有下列意思：
术语“分离的分子”（其中所述分子是例如多肽、多核苷酸或抗体）是分子，依赖于其来源或衍生的来源，所述分子（1）不与在其天然状态下天然伴随其的组分结合，(2)基本上不含来自相同物种的其他分子，（3）由来自不同物种的细胞表达或（4）非天然地发生。因此，化学合成的或在与来自其天然起源的细胞不同的细胞系统中合成的分子将与其天然结合的组分“分离”。也可用本领域熟知的纯化技术通过分离使分子基本上不含天然结合的组分。可通过本领域内许多熟知的方法测定分子纯度或均质性。例如，可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和使用本领域内熟知的技术对凝胶染色以显示多肽来测定多肽样品的纯度。对于某些目的，可通过HPLC或本领域熟知的用于纯化的其他方法来提供更高的分辨率。
术语“IGF-1R抑制剂”和“IGF-1R拮抗剂”可互换使用。各为可检测地抑制IGF-1R的至少一种功能的分子。相反地，“IGF-1R激动剂”是可检测地增加IGF-1R的至少一种功能的分子。由IGF-1R抑制剂引起的抑制作用不必是完全的，只要使用测定法可检测其。可使用IGF-1R功能的任何测定法，此处提供其实例。可通过IGF-1R抑制剂抑制或通过IGF-1R激动剂增加的IGF-1R功能的实例，包括对IGF-1、IGF-12和/或另一种IGF-1R激活分子的结合、激酶活性、下游信号转导等。IGF-1R抑制剂和IGF-1R激动剂的类型的实例包括，但不限于，IGF-1R结合多肽例如抗原结合蛋白（例如，IGF-1R抑制性抗原结合蛋白）、抗体、抗体片段和抗体衍生物。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”各自指包含两个或多个通过肽键连接的氨基酸残基的分子。这些术语包括，例如，天然的和人工的蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物（例如突变蛋白、变体和融合蛋白）以及翻译后修饰或共价或非共价修饰的蛋白。肽、多肽或蛋白可以是单体或多聚体。
如此处所用的,术语“多肽片段”是指与对应的全长蛋白相比,具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。片段在长度上可以是，例如，至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、50、70、80、90、100、150或200个氨基酸。片段在长度上也可以是例如至多1,000、750、500、250、200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、14、13、12、11或10个氨基酸。片段还可在其任一末端或两个末端包含一个或多个额外的氨基酸，例如，来自不同的天然发生的蛋白（例如，Fc或亮氨酸拉链结构域)的氨基酸序列或人工氨基酸序列（例如，人工连接体序列)。
本发明的多肽包括已以任何方法和因任何理由修饰的多肽，例如，所述理由是例如：(1)减少对蛋白水解的敏感性，(2)减少对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(4)赋予或改变其他物化或功能特性。类似物包括多肽的突变蛋白。例如，可在天然发生的序列中（例如，在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分中）产生单个或多个氨基酸的置换(例如,保守性氨基酸置换)。“保守性氨基酸置换”是基本上不改变亲本序列的结构特征的置换（例如，取代氨基酸不应当倾向于打断亲本序列中发生的螺旋，或破坏表征亲本或其功能性所必需的其他类型的二级结构）。在Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton,Ed.,W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));IntroductiontoProteinStructure(C.Branden和J.Tooze,eds.,GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991));和Thornton等人Nature354:105(1991)中描述了本领域承认的多肽二级结构和三级结构的实例,所述参考资料各自在此引用作为参考。
本发明也提供了IGF-1R结合多肽的非肽类似物。非肽类似物通常在制药工业中用作具有类似于模板肽性质的性质的药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物（peptidemimetics）”或“拟肽（peptidomimetics）”。Fauchere,J.Adv.DrugRes.15:29(1986);Veber和FreidingerTINSp.392(1985);和Evans等人J.Med.Chem.30:1229(1987),其在此引用作为参考。在结构上与治疗有用的肽相似的肽模拟物可用于产生等同的治疗或预防功效。一般地，拟肽在结构上与范例多肽（paradigmpolypeptide）(即，具有想要的生物化学性质或药理活性的多肽)例如人抗体相似，但任选地通过本领域内熟知的方法使一个或多个肽键被选自下列的键取代：--CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH=CH-(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2—和--CH2SO--。用相同类型的D氨基酸系统性地置换共有序列的一个或多个氨基酸（例如，D赖氨酸取代L赖氨酸）也可用于产生更稳定的多肽。此外，可通过本领域已知的方法(Rizo和GieraschAnn.Rev.Biochem.61:387(1992),此处引用作为参考)例如通过添加能够形成使肽环化的分子内二硫键的内部半胱氨酸残基来产生受限制的肽（constrainedpeptide），所述肽包含共有序列或基本上相同的共有序列变异。
多肽（例如，抗体）的“变体”包含氨基酸序列，在所述氨基酸序列中，相对于另一个多肽序列，一个或多个氨基酸残基被插入、缺失和/或置换。本发明的变体包括融合蛋白。
多肽的“衍生物”是已通过例如缀合至另一个化学部分例如聚乙二醇、白蛋白（例如，人血清白蛋白）、磷酸化和糖基化被化学修饰的多肽（例如抗体）。除非另外指出，术语“抗体”包括，除了包含两条全长的重链和两条全长的轻链的抗体外，其衍生物、变体、片段和突变蛋白，下面描述了其实例。
“抗原结合蛋白”是包含结合抗原的部分和任选地支架或构架部分的蛋白，所述支架或构架部分允许所述抗原结合部分采取促进所述抗原结合蛋白对所述抗原结合的构象。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体片段（例如，抗体的抗原结合部分）、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可包括，例如，可选择的蛋白支架或具有移植的CDR或CDR衍生物的人工支架。这些支架包括，但不限于，包含被导入以例如稳定所述抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的支架以及包含例如生物可相容的聚合物的完全合成的支架。参见，例如，Korndorfer等人,2003,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,第53卷,Issue1:121-129;Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可使用肽抗体模拟物(“PAMs”)，以及基于使用纤连蛋白组分作为支架的抗体模拟物的支架。
抗原结合蛋白可具有例如天然发生的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然发生的免疫球蛋白中，各四聚体由两个相同的多肽链对组成，各对具有一个“轻”链（大约25kDa）和一个“重”链（大约50-70kDa）。各链的氨基末端部分包含大约100至110或更多个氨基酸组成的负责抗原识别的可变区。各链的羧基末端部分界定主要负责效应子作用（effectorfunction）的恒定区。人轻链被分类为κ和λ轻链。重链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并分别将抗体的同种型确定为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，所述可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区域连接，重链也包含大约10或更多个氨基酸的“D”区域。一般参照，FundamentalImmunologyCh.7(Paul,W.,ed.,第2版，RavenPress,N.Y.(1989))(对于所有目的，以其全文在此引用作为参考)。各轻/重链对的可变区形成了抗体结合位点，从而使完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
天然发生的免疫球蛋白链展示了由三个超变区（也称作互补决定区或CDR）连接的相对保守的框架区（FR）的相同的一般结构。从N端至C端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸至各结构域的分配Kabat等人在SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版,USDept.ofHealthandHumanServices,PHS,NIH,NIHPublicationno.91-3242,1991中的定义一致。
除非另外说明，“抗体”是指完整的免疫球蛋白或与所述完整的抗体竞争特异性结合的其抗原结合部分。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生抗原结合部分。抗原结合部分包括，除其他以外，可包含免疫球蛋白的至少一部分的Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体、三抗体、四链体和多肽，所述一部分足以赋予对该多肽的特异性抗原结合。
Fab片段是具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段;F(ab')2片段是具有在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；Fd片段具有VH和CH1结构域；Fv片段具有抗体的单臂的VL和VH结构域；以及dAb片段具有VH结构域、VL结构域，或VH或VL结构域的抗原结合片段(美国专利6,846,634、6,696,245,美国申请公开号05/0202512、04/0202995、04/0038291、04/0009507、03/0039958,Ward等人,Nature341:544-546,1989)。
单链抗体(scFv)是其中VL和VH区域通过连接体(例如，氨基酸残基的合成序列)连接形成连续蛋白链的抗体，其中所述连接体长度足以允许蛋白链自身折叠，从而形成单价抗原结合位点(参见，例如,Bird等人,1988,Science242:423-26和Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-83)。双抗体是包含两条多肽链的二价抗体，其中各肽链包含通过连接体连接的VH和VL链，所述连接体太短以至不能允许相同链上的两个结构域之间形成配对，从而允许各结构域与另一条多肽链上的互补结构域配对(参见，例如,Holliger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-48,andPoljak等人,1994,Structure2:1121-23)。如果双抗体的两条多肽链是相同的，那么由其配对所得的双抗体将具有两个相同的抗原结合位置。具有不同序列的多肽链可用于产生具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四链体是分别包含三条和四条多肽链且形成三个和四个抗原结合位点的抗体，所述抗原结合位点可以是相同的或不同的。
可使用由Kabat等人在SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第5版.,USDept.ofHealthandHumanServices,PHS,NIH,NIHPublicationno.91-3242,1991中描述的系统鉴定给定的抗体的互补决定区(CDR)和构架区(FR)。可将一个或多个CDR共价地或非共价地整合入分子以使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可将CDR整合为更大的多肽链的部分，可共价地将CDR连接至另一条多肽链，或可非共价地整合CDR。所述CDR允许抗原结合蛋白特异性地结合特定的目的抗原。
抗原结合蛋白可具有一个或多个结合位点。如果存在不止一个结合位点，结合位点相互之间可相同或可不同。例如，天然发生的人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。
术语“人抗体”包括具有一个或多个来源于人免疫球蛋白序列的可变和恒定区的所有抗体。在一个实施方案中，所有可变和恒定结构域来源于人免疫球蛋白序列（完全的人抗体）。可以许多方法制备这些抗体（其实例在下面进行了描述），包括通过用目的抗原免疫经基因工程改造从而表达来源于人重链和/或轻链编码基因的抗体的小鼠来制备。
人源化的抗体具有序列，所述序列与来源于非人物种的抗体的序列差异在于一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加，这样，和所述非人物种抗体相比，当将其给人受试者施用时，人源化抗体不太可能诱导免疫反应，和/或诱导较不严重的免疫反应。在一个实施方案中，对非人物种抗体的重链和/或轻链的构架区和恒定结构域中的某些氨基酸进行突变以产生人源化抗体。在另一个实施方案中，将来自人抗体的恒定结构域融合至非人物种的可变区。在另一个实施方案中，改变非人抗体的一个或多个CDR序列的一个或多个氨基酸残基以减少，当给人受试者施用时，非人抗体的可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对于抗体对其抗原的免疫特异性结合不是至关重要的，或产生的对所述氨基酸序列的改变是保守的改变，这样人源化抗体对抗原的结合不会明显地比非人抗体对抗原的结合弱。可在美国专利6,054,297、5,886,152和5,877,293中找到如何制备人源化抗体的实例。
术语“嵌合抗体”是指包含来自一种抗体的一个或多个区域和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区域的抗体。在一个实施方案中，一个或多个CDR来源于人抗IGF-1R抗体。在另一个实施方案中，所有CDR来源于人抗IGF-1R抗体。在另一个实施方案中，在嵌合抗体中混合和匹配来自不止一个的人抗IGF-1R抗体的CDR。例如，嵌合抗体可包含来自第一人抗IGF-1R抗体的轻链的CDR1、来自第二人抗IGF-1R抗体的轻链的CDR2和CDR3和来自第三抗IGF-1R抗体的重链的CDR。此外，所述构架区可来源于相同抗IGF-1R抗体中的一个，来源于一个或更多个不同的抗体例如人抗体或来自人源化抗体。在嵌合抗体的一个实例中，重链和/或轻链的部分与来自特定物种的抗体相同、同源或来源于其或属于特定抗体种类或亚类，而链的其余部分与来自另一种物种的抗体相同、同源或来源于其或属于另一种抗体种类或亚类。也包括展示想要的生物学活性（即，特异性结合IGF-1R的能力）的抗体片段。参见，例如，美国专利4,816,567和Morrison,1985,Science229:1202-07。
当过量的抗IGF-1R抗体减少结合IGF-1R的IGF-1和/或IGF-2的量至少大约20%（使用实施例9中描述的测定法测量）时，“中和抗体”或“抑制性抗体”是抑制IGF-1R对IGF-1和/或IGF-2的结合的抗体。在不同的实施方案中，所述抗体减少结合IGF-1R的IGF-1和/或IGF-2的量至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%和99.9%。
“激活性抗体”是当加入表达IGF-1R的细胞、组织或生物时激活IGF-1R至少大约20%的抗体，其中“100%的激活”是在生理条件下由相同摩尔量的IGF-1和/或IGF-2获得的激活水平。在不同实施方案中，所述抗体激活IGF-1R的活性至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、750%或1000%。
可由本领域技术人员按照本说明书的教导和使用本领域熟知的技术容易地制备抗体的片段或类似物。优选的片段或类似物的氨基和羧基末端可发生在功能结构域的边界的附近。可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或私人序列数据库比较来鉴定结构和功能结构域。可使用计算机化的比较方法鉴定在已知结构和/或功能的其他蛋白中发生的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。确定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。参见，例如，Bowie等人,1991,Science253:164。
“CDR移植抗体”是包含来源于特定物种的抗体或同种型的一个或多个CDR和相同或不同物种的另一种抗体或同种型的构架区的抗体。
“多特异性抗体”是识别一个或多个抗原上的多于一个表位的抗体。抗体的该类型的亚类是识别相同或不同抗原上的两种不同表位的“双特异性抗体”。
如果抗原结合蛋白以1纳摩尔或更少的解离常数结合抗原，则抗原结合蛋白“特异性结合”抗原（例如，人IGF-1R）。
“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或“抗原结合位点”是包含氨基酸残基（或其他部分）的抗原结合蛋白的部分，所述氨基酸残基或其他部分与抗原相互作用并促成抗原结合蛋白对于所述抗原的特异性和亲和力。对于特异性结合其抗原的抗体，其将包括其CDR结构域的至少一个结构域的至少部分。
“表位”是被抗原结合蛋白（例如，被抗体）结合的分子的部分。表位可包含分子的非连续部分（例如，在多肽中，在多肽的一级序列中不连续但在多肽的三级和四级结构的背景中相互之间充分靠近从而足以被抗原结合蛋白结合的氨基酸残基）。
通过使用GAP计算机程序（GCGWisconsinPackage,版本10.3(Accelrys,SanDiego,CA)的部分)，使用其缺省参数比较序列来确定两个多核苷酸或两个多肽序列的“百分比同一性”。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可完全互换使用且包括DNA分子（例如，cDNA或基因组DNA）、RNA分子（例如，mRNA）、使用核苷酸类似物（例如，肽核酸和非天然发生的核苷酸类似物）产生的DNA或RNA的类似物和其杂合物。核酸分子可以是单链或双链。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含编码本发明的抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的连续开放阅读框架。
如果两个单链多核苷酸可以反向平行方向比对以使一条核酸中的每一个核苷酸与另一个多核苷酸中的其互补核苷酸相对而不引入缺口且在任一序列的5’或3’末端上无未配对的核苷酸，则其为相互之间的“互补物”。如果两个多核苷酸可在中等严紧条件下相互杂交，则多核苷酸与另一个多核苷酸“互补”。因此，多核苷酸可与另一个多核苷酸互补而不为其互补物。
“载体”是可用于将另一个连接至其上的核酸导入细胞的核酸。载体的一种类型是“质粒”，其是指可将另外的核酸片段连接入其中的线性或环状双链DNA分子。载体的另一种类型是病毒载体（例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒），其中可将另外的DNA片段导入病毒基因组。某些载体能够在其被导入的宿主细胞中自主复制（例如，包含细菌复制起点和哺乳动物染色体外载体的细菌载体）。其他载体（例如，非染色体外哺乳动物载体），在导入宿主细胞后，被整合入宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组复制而复制。“表达载体”是能够指导选择的多核苷酸表达的载体类型。
如果调控序列影响核苷酸序列的表达（例如，表达的水平、时间或位置）那么所述核苷酸序列“有效地连接”至调控序列。“调控序列”是影响有效连接至其的核酸的表达（例如表达的水平、时间或位置）的核酸。调控序列可，例如直接地或通过一种或多种其他分子（例如，结合所述调控序列和/或所述核酸的多肽）的作用对被调控的核酸施加其作用。调控序列的实例包括启动子、增强子和其他表达控制元件（例如，聚腺苷酸化信号）。在例如Goeddel,1990,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA和Baron等人，1995,NucleicAcidsRes.23:3605-06中描述了调控序列的其他实例。
“宿主细胞”是可用于表达核酸，例如本发明的核酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如，大肠杆菌（E.coli），或其可以是真核生物，例如，单细胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物细胞（例如，烟草或番茄植物细胞）、动物细胞（例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞）或杂交瘤。宿主细胞的实例包括猴肾细胞的COS-7细胞系(ATCCCRL1651)(参见Gluzman等人,1981,Cell23:175)、L细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物例如VeggieCHO和在无血清培养基上生长的相关细胞系(参见Rasmussen等人,1998,Cytotechnology28:31)或CHO品系DX-B11(参见Urlaub等人,1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-20)（所述细胞系在DHFR方面具有缺陷）、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1(ATCCCCL70)的CV1/EBNA细胞系(参见McMahan等人,1991,EMBOJ.10:2821)、人胚胎肾细胞例如293、293EBNA或MSR293、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、其他转化的灵长类动物细胞系、正常的二倍体细胞、来源于灵长类动物组织、灵长类动物外植体的体外培养物的细胞品系、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。一般地，宿主细胞是可用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，所述核酸因此可在宿主细胞中表达。术语“重组宿主细胞”可用于表示已用要表达的核酸转化或转染的宿主细胞。如果不将调控序列导入宿主细胞以使其有效连接核酸，所述宿主细胞也可以是包含所述核酸但不在想要的水平上表达其的细胞。要理解，术语宿主细胞不仅是指特定的细胞还指该细胞的后代或潜在的后代。因为例如突变或环境影响的原因在连续世代中可发生某些修饰，所以所述后代事实上可以不与亲本细胞相同，但仍然包括在此处所用的术语的范围之内。
IGF-1R
IGF-1R是跨膜受体酪氨酸激酶(Blume-Jensen等人,2001,Nature411:355-65)。人IGF-1R被合成为1367个氨基酸的前体多肽，所述多肽包括在转运至内质网的过程中被除去的30个氨基酸的信号肽(Swiss-Prot:P08069)。所述IGF-1R前受体（proreceptor）在ER-高尔基体中成熟期间被糖基化且在位点708-711（从紧接信号肽序列的第一个氨基酸算起）被切割，从而导致仍然通过二硫键连接的α链(1-707)和β链(712-1337)的形成(Bhaumick等人,1981,ProcNatlAcadSciUSA78:4279-83,Chernausek等人,1981,Biochemistry20:7345-50,Jacobs等人,1983,ProcNatlAcadSciUSA80:1228-31,LeBon等人,1986,JBiolChem261:7685-89,Elleman,等人,2000,BiochemJ347:771-79)。存在于细胞表面的IGF-1R(和INSR)的主要形式是经蛋白水解加工且被糖基化的(αβ)2二聚体，该二聚体通过一个或多个二硫键共价连接。
IGF-1R的细胞外部分由α链和β链(712-905)的191个氨基酸组成。所述受体包含单个跨膜序列(906-929)和包含功能酪氨酸激酶的408个残基的胞质结构域(Rubin等人,1983,Nature305:438-440)。序列比较分析已表明IGF-1R由11个不同的结构基序组成(由Adams等人,2000,CellMolLifeSci57:1050-93,Marino-Buslje等人,1998,FEBSLtrs441:331-36,Ward等人,2001,BMCBioinformatics2:4综述)。细胞外结构域的N末端那一半包含由富含半胱氨酸（CR）的区域(152-298)分开的称为L1(1-151)和L2(299-461)的两个同源结构域(Ward等人,2001,同上)，所述富含半胱氨酸的区域由几个具有二硫键的结构组件组成，所述结构组件与TNF受体和层粘连蛋白中存在的重复单位比对(Ward等人,1995,Proteins22:141-53)。已解析了L1—CR-L2结构域的晶体结构(Garrett等人,1998,Nature394:395-99)。L2结构域之后接着是三个纤连蛋白III型结构域(Marino-Buslje等人,1998,同上，Mulhern等人,1998,TrendsBiochemSci23:465-66,Ward等人,1999,GrowthFactors16:315-22)。第一FnIII结构域(FnIII-1,461-579)长度为118个氨基酸。第二FnIII结构域(FnIII-2,580-798)被长度大约为120个氨基酸的主要插入序列（majorinsertsequence）（ID）打断。ID结构域包括分离成熟受体的α和β链的弗林蛋白酶切割位点。第三FnIII结构域(FnIII-3)完全位于β链(799-901)中，在跨膜序列之前几个残基处终止。IGF-1R酪氨酸激酶的催化结构域位于氨基酸位置973-1229之间，且其结构已被解析了(Favelyukis等人,2001,NatureStructuralBiol8:1058-63,Pautsch等人,2001,Structure9:955-65)。所述激酶侧翼连接两个调控区域，细胞膜附近区域(930-972)和108个氨基酸的C末端尾部(1220-1337)(Surmacz等人,1995,ExperimentalCellRes218:370-80,Hongo等人,1996,Oncogene12:1231-38)。两个调控区域包含当被激活的IGF-1R酪氨酸激酶磷酸化时用作信号转导蛋白的停泊位点的酪氨酸残基(由Baserga(ed.),1998TheIGF-1ReceptorinNormalandAbnormalGrowth，HormonesandGrowthFactorsinDevelopmentandNeoplasia,Wiley-Liss,Inc.,Adams等人,2000,CellMolLifeSci57:1050-93综述).
所述IGF-1R氨基酸序列与胰岛素受体(INSR;Swiss-Prot:P06213)具有大约70%的同一性。所述受体之间的最高同源性位于酪氨酸激酶结构域(84%);最低同一性在CR区和C末端。IGF-1R也与胰岛素相关受体(IRR;Swiss-Prot:P14616)高度相关(大约55%的同一性)。
可通过胰岛素样生长因子，IGF-1和IGF-2以及胰岛素(INS)激活人IGF-1R(Hill等人,1985,PediatricResearch19:879-86)。IGF-1和IGF-2由非等位基因编码(Brissenden等人,1984,Nature310:781-8,Bell等人,1985,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica82:6450-54)，且两个基因都通过差异RNA剪接和蛋白加工表达可选择的相关性蛋白。IGF-1和IGF-2的最常见和研究最充分的成熟形式长度分别为70和67个氨基酸(Jansen等人,1983,Nature306:609-11,Dull等人,1984,Nature310:777-81)。这些蛋白（和其同种型)在11/21位置与胰岛素A肽同一，在12/30位置与胰岛素B肽同一。
IGF-1R在正常成年动物中在除了肝细胞和成熟B细胞外的所有细胞类型中表达。人血浆包含高浓度的IGF-1和IGF-2，且可在大多数组织中检测到IGF-1。所述受体是控制器官大小和内稳态的生理学机制的整合组分。不受特定理论的束缚，“生长调节素假说”说明儿童和青少年期间生长激素（GH）介导的身体生长依赖于主要由肝产生和分泌的IGF-1的内分泌形式(Daughaday,2000,PediatricNephrology14:537-40)。由脑下垂体中响应下丘脑GHRH(GH释放激素)的GH释放刺激肝IGF-1的合成。在人中，在年龄5-15岁之间IGF-1的血清浓度增加超过100倍。IGF-1的生物利用度由IGF结合蛋白3(IGFBP3)调控，大约99%的生长因子以结合状态被间隔化。由部分基因缺失产生的原发性IGF-1缺陷，和由于GH产生或信号转导中的缺陷导致的继发性IGF-1缺陷不是致死性的(Woods,1999,IGFDeficiencyinContemporaryEndocrinology:TheIGFSystem,R.a.R.Rosenfeld,C.Jr.Totowa,ed.s,HumanaPress,NJ:651-74)。受影响的个体在出生时展现生长迟缓，生长缓慢且可面临某些CNS异常。
IGF-1R信号转导通过PI3激酶/Akt途径的IRS接头蛋白依赖性激活促进细胞的生长和存活。IGF-1R通过IRS-4和Shc蛋白将信号传递至其主要的底物IRS-1(Blakesley等人,1999,IGF-1receptorfunction：transducingtheIGF-1signalintointracellulareventsinTheIGFSystem,R.G.a.R.Rosenfeld,Jr.C.T.Totowa,ed.s,HumanaPress,NJ:143-63)。这导致Ras/Raf/MAP激酶和PI3激酶/Akt信号转导途径的激活。然而，通过IRS诱导的Akt介导的细胞存活是对大多数细胞的IGF刺激作出反应的主要途径。参见图10。
抗原结合蛋白
在一个方面，本发明提供了结合IGF-1R例如人IGF-1R的抗原结合蛋白（例如，抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白和抗体变体）。
本发明的抗原结合蛋白包括抑制IGF-1R的生物学活性的抗原结合蛋白。这些生物学活性的实例包括结合信号转导分子（例如，IGF-1和/或IGF-2)以及转导响应结合信号转导分子的信号。
不同的抗原结合蛋白可结合IGF-1R的不同结构域或表位或通过不同的作用机制起作用。实例包括但不限于干扰IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合或抑制信号转导的抗原结合蛋白。作用的位点可以在例如细胞内（例如，通过干扰细胞内信号级联）或细胞外。抗原结合蛋白不需要完全抑制IGF-1和/或IGF-2诱导的活性以用于本发明；相反地，也可考虑使用减少IGF-1和/或IGF-2的特定活性的抗原结合蛋白。（此处关于结合IGF-1R的抗原结合蛋白在治疗特定疾病中的特定作用机制的描述仅作为举例说明，此处提供的方法不因此而受到束缚。）
已观察到IGF-1和IGF-2各展示对IGF-1R的两相性结合。已报导高亲和力结合具有0.2nM范围内的KD；高亲和力结合，大约超过10倍。因此，在一个实施方案中，本发明提供了抑制IGF-1和/或IGF-2对IGF-R的高和低亲和力结合的IGF-1R抑制剂。已暗示，GF-1和/或IGF-2对IGF-1R的高亲和力结合，而非低亲力结合，是激活IGF-1R的酪氨酸激酶活性的构象改变所必需的。因此，在另一个实施方案中，与低亲和力结合相比，IGF-1R抑制剂优选地抑制IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的高亲和力结合。
在另一个方面，本发明提供了包含选自L1至L52的轻链可变区和/或选自H1至H52的重链可变区的抗原结合蛋白和其片段、衍生物、突变蛋白和变体（参见图2和3）。可使用命名法“LxHy”表示这样的抗原结合蛋白，其中如图2和3中其被标记的那样，“x”对应于轻链可变区的编号，“y”对应于重链可变区的编号。例如，L2H1是指具有包含L2的氨基酸序列的轻链可变区和包含H1的氨基酸序列的重链可变区的抗原结合蛋白，如图2和3中所示。图2和3也标示了这些可变结构域序列的各序列的CDR和构架区的位置。也按类型和按序列相似性在图4至9中将各轻链和重链的CDR区分类。本发明的抗原结合蛋白包括，例如，具有选自下列组合的轻链和重链结构域的组合的抗原结合蛋白：L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14、L15H15、L16H16、L17H17、L18H18、L19H19、L20H20、L21H21、L22H22、L23H23、L24H24、L25H25、L26H26、L27H27、L28H28、L29H29、L30H30、L31H31、L32H32、L33H33、L34H34、L35H35、L36H36、L37H37、L38H38、L39H39、L40H40、L41H41、L42H42、L43H43、L44H44、L45H45、L46H46、L47H47、L48H48、L49H49、L50H50、L51H51和L52H52。
在一个实施方案中，本发明提供了包含轻链可变结构域的抗原结合蛋白，所述轻链可变结构域包含与选自L1至L52的轻链可变结构域的序列仅在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个残基上相异的氨基酸序列，其中每一个这样的序列差异独立地是一个氨基酸残基的缺失、插入或置换。在另一个实施方案中，轻链可变区结构域包含与选自L1至L52的轻链可变区的序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，轻链可变结构域包含核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码选自L1至L52的轻链可变区结构域的核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的同一性。在另一个实施方案中，轻链可变结构域包含氨基酸序列，所述氨基酸序列由多核苷酸编码，所述多核苷酸在中等严紧条件下与编码选自L1至L52的轻链可变结构域的多核苷酸的互补物杂交。在另一个实施方案中，轻链可变结构域包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸在中等严紧条件下与编码选自L1至L52的轻链可变结构域的多核苷酸的互补物杂交。在另一个实施方案中，轻链可变结构域包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸在中等严紧条件下与选自图1的轻链多核苷酸的互补序列物。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含重链可变结构域的抗原结合蛋白，所述重链可变结构域包含仅在15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个残基上与选自H1至H52的重链可变结构域的序列相异的氨基酸序列，其中每一个这样的序列差异独立地是一个氨基酸残基的缺失、插入或置换。在另一个实施方案中，重链可变区包含与选自H1至H52的重链可变区的序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，重链可变结构域包含由核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述核苷酸序列与编码选自H1至H52的重链可变结构域的核苷酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%的同一性。在另一个实施方案中，重链可变结构域包含由多核苷酸序列编码的氨基酸序列，所述多核苷酸在中等严紧条件下与编码选自H1至H52的重链可变结构域的多核苷酸的互补物杂交。在另一个实施方案中，重链可变结构域包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸在中等严紧条件下与编码选自H1至H52的重链可变结构域的多核苷酸的互补物杂交。在另一个实施方案中，重链可变结构域包含由多核苷酸编码的氨基酸序列，所述多核苷酸在中等严紧条件下与选自图1的重链多核苷酸的互补物杂交。
本发明的抗原结合蛋白的特定实施方案包含一个或多个氨基酸序列，所述序列与图2至9中举例说明的一个或多个CDR和/或FR的氨基酸序列同一。在一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图4中举例说明的轻链CDR1序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图5中举例说明的轻链CDR2序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图6中举例说明的轻链CDR3序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图7中举例说明的重链CDR1序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图8中举例说明的重链CDR2序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图9中举例说明的重链CDR3序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图2中举例说明的轻链FR1序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图2中举例说明的轻链FR2序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图2中举例说明的轻链FR3序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图2中举例说明的轻链FR4序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图3中举例说明的轻链FR1序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图3中举例说明的重链FR2序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图3中举例说明的重链FR3序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含图3中举例说明的重链FR4序列。
在一个实施方案中，本发明提供了包含一个或多个CDR序列的抗原结合蛋白，所述CDR序列与图2至9中所示的CDR序列相异不超过5、4、3、2或1个氨基酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供了抗原结合蛋白，所述蛋白包含至少一个来自图2至9中所示的L1-L52和/或H1-H52的CDR和至少一个来自抗IGF-1R抗体的CDR序列，在美国申请公开号03/0235582、04/0228859、04/0265307、04/0886503、05/0008642、05/0084906、05/0186203、05/0244408、PCT公开号WO03/059951、WO03/100008、WO04/071529A2、WO04/083248、WO04/087756、WO05/016967、WO05/016970或WO05/058967(对于所有目的，其各自在此以其全文引用作为参考)中描述了所述抗IGF-1R抗体，其中所述抗原结合蛋白结合IGF-1受体。在另一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含来自图2至9中所示的L1-L52和/或H1-H52的2、3、4或5个CDR序列。在另一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含2、3、4或5个来自美国专利申请公开号03/0235582、04/0228859、04/0265307、04/0886503、05/0008642、05/0084906、05/0186203、05/0244408、PCT公开号WO03/059951、WO03/100008、WO04/071529A2、WO04/083248、WO04/087756、WO05/016967、WO05/016970、或WO05/058967中描述的抗IGF-1R抗体的CDR序列。在另一个实施方案中，至少一个抗原结合蛋白的CDR3序列是来自如图2、3、6和9中所示的L1-L52和/或H1-H52的CDR3序列。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白的轻链CDR3序列是来自图2和6中所示的L1-L52的轻链CDR3序列且所述抗原结合蛋白的重链CDR3序列是来自图3和9中所示的重链序列。在另一个实施方案中，所述抗原结合蛋白包含1、2、3、4或5个CDR序列，所述序列各自独立地与L1-L52和/或H1-H52的CDR序列相异6、5、4、3、2、1或0个单个氨基酸添加、置换和/或缺失，抗原结合蛋白还包含1、2、3、4或5个CDR序列，所述各序列独立地与来自美国申请公开号03/0235582、04/0228859、04/0265307、04/0886503、05/0008642、05/0084906、05/0186203、05/0244408、PCT公开号WO03/059951、WO03/100008、WO04/071529A2、WO04/083248、WO04/087756、WO05/016967、WO05/016970或WO05/058967的CDR序列相异6、5、4、3、2、1或0个单个氨基酸的添加、置换和/或缺失。在另一个实施方案中，所述CDR序列来自美国申请公开号03/0235582、04/0228859、04/0265307、04/0886503、05/0008642、05/0084906、05/0186203、05/0244408、PCT公开号WO03/059951、WO03/100008、WO04/071529A2、WO04/083248、WO04/087756、WO05/016967、WO05/016970或WO05/058967。在另一个实施方案中，所述CDR序列来自结合IGF-1受体的细胞外结构域的L2部分的抗体。在另一个实施方案中，所述抗原结合蛋白不包含来自美国申请公开号03/0235582、04/0228859、04/0265307、04/0886503、05/0008642、05/0084906、05/0186203、05/0244408、PCT公开号WO03/059951、WO03/100008、WO04/071529A2、WO04/083248、WO04/087756、WO05/016967、WO05/016970或WO05/058967的抗IGF-1R抗体的轻链CDR3序列和/或重链CDR3序列。
在一个实施方案中，本发明提供了包含轻链CDR1的抗原结合蛋白，所述轻链CDR1包含序列RSSQSLLHX1X2GYNX3LX4(SEQIDNO:236)，其中X1是丝氨酸或苏氨酸残基,X2是天冬酰胺、丝氨酸或组氨酸残基,X3是酪氨酸或苯丙氨酸残基，X4是天冬氨酸或天冬酰胺残基。在另一个实施方案中，所述轻链CDR1包含序列TRSSGX1IX2X3NYVQ(SEQIDNO:237),其中X1是丝氨酸或天冬氨酸残基，X2是丙氨酸或天冬氨酸残基，X3是丝氨酸或天冬酰胺残基。在另一个实施方案中，所述轻链CDR1包含序列RASQX1X2X3X4X5LX6(SEQIDNO:238),其中X1是甘氨酸或丝氨酸残基,X2是异亮氨酸、缬氨酸或脯氨酸残基，和X3是丝氨酸、甘氨酸或酪氨酸残基，X4是任何氨基酸残基，X5是苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或色氨酸残基，X6是丙氨酸或天冬酰胺残基。在另一个实施方案中，X2是异亮氨酸或缬氨酸残基，X3是甘氨酸或丝氨酸残基，X4是精氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、酪氨酸或异亮氨酸残基，X5是苯丙氨酸或酪氨酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供了包含轻链CDR2的抗原结合蛋白，所述轻链CDR2包含序列LX1X2X3RX4S(SEQIDNO:239),其中X1是甘氨酸或缬氨酸残基，X2是丝氨酸或苯丙氨酸残基，X3是天冬酰胺、酪氨酸或苏氨酸残基，X4是丙氨酸或天冬氨酸残基。在另一个实施方案中，所述CDR2包含序列AX1SX2LX3S(SEQIDNO:240),其中X1是丙氨酸或苏氨酸残基，X2是苏氨酸或甘氨酸残基，X3是谷氨酰胺或谷氨酸残基。在另一个实施方案中，所述CDR2包含序列X1X2NX3RPS(SEQIDNO:241),其中X1是谷氨酸、谷氨酰胺或甘氨酸残基，X2是天冬氨酸或赖氨酸残基，X3是任何氨基酸。
在一个实施方案中，本发明提供了包含轻链CDR3的抗原结合蛋白，所述轻链CDR3包含序列MX1X2X3X4X5PX6X7(SEQIDNO:242),其中X1是谷氨酰胺或谷氨酸残基，X2是丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基，X3是亮氨酸或苏氨酸残基，X4是谷氨酰胺、谷氨酸或组氨酸残基，X5是苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸残基，X6是非极性侧链残基，X7是苏氨酸、丝氨酸或丙氨酸残基。在另一个实施方案中，所述CDR3包含序列QQX1X2X3X4PX5T(SEQIDNO:243),其中X1是精氨酸、丝氨酸、亮氨酸或丙氨酸残基，X2是天冬酰胺、丝氨酸或组氨酸残基，X3是丝氨酸或天冬酰胺残基，X4是非极性侧链残基，X5是亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸残基。在另一个实施方案中，所述CDR3包含序列QSYX1SX2NX3X4V(SEQIDNO:244),其中X1是天冬氨酸或谷氨酰胺残基，X2是丝氨酸或天冬氨酸残基，X3是谷氨酰胺、缬氨酸或色氨酸残基，X4是精氨酸残基或无残基。
在一个实施方案中，本发明提供了包含重链CDR1的抗原结合蛋白，所述重链CDR1包含序列X1X2X3WWS(SEQIDNO:245),其中X1是丝氨酸残基或无残基，X2是丝氨酸或天冬酰胺残基，X3是天冬酰胺残基和异亮氨酸残基。在另一个实施方案中，所述重链CDR1包含序列X1X2YWS(SEQIDNO:246),其中X1是甘氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸残基，X2是酪氨酸或苯丙氨酸残基。在另一个实施方案中，所述重链CDR1包含序列SYX1X2X3(SEQIDNO:247),其中X1是丙氨酸或甘氨酸残基，X2是甲硫氨酸或异亮氨酸残基，X3是丝氨酸或组氨酸残基。
在一个实施方案中，本发明提供了包含重链CDR2的抗原结合蛋白，所述重链CDR2包含序列X1X2X3X4X5GX6TX7YNPSLX8S(SEQIDNO:248),其中X1是谷氨酸、酪氨酸或丝氨酸残基，X2是异亮氨酸或缬氨酸残基，X3是酪氨酸、天冬酰胺或丝氨酸残基,X4是组氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或脯氨酸残基，X5是丝氨酸或精氨酸残基，X6是丝氨酸或天冬酰胺残基，X7是天冬酰胺或酪氨酸残基，X8是赖氨酸或谷氨酸残基。在另一个实施方案中，所述重链CDR2包含序列X1ISX2X3X4X5X6X7YYADSVKG(SEQIDNO:249),其中X1是苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸或酪氨酸残基，X2是甘氨酸、丝氨酸或酪氨酸残基，X3是丝氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸残基，X4是甘氨酸或丝氨酸残基,X5是甘氨酸、丝氨酸或天冬氨酸残基，X6是丝氨酸、苏氨酸或天冬酰胺残基，X7是苏氨酸、赖氨酸或异亮氨酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含重链CDR3的抗原结合蛋白，所述重链CDR3包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9FDI(SEQIDNO:250),其中X1是谷氨酸残基或无残基，X2是酪氨酸、甘氨酸或丝氨酸残基或无残基，X3是丝氨酸、天冬酰胺、色氨酸或谷氨酸残基，或无残基，X4是丝氨酸、天冬氨酸、色氨酸、丙氨酸、精氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸或谷氨酸残基或无残基，X5是丝氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、色氨酸、丙氨酸、缬氨酸或异亮氨酸残基，X6是精氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸或色氨酸残基，X7是亮氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、丙氨酸或组氨酸残基，X8是天冬氨酸、丝氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺残基，X9是丙氨酸或脯氨酸残基。在另一个实施方案中，所述重链CDR3包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11MDV(SEQIDNO:251),其中X1是丙氨酸残基或无残基，X2是谷氨酸、酪氨酸或甘氨酸残基或无残基，X3是丝氨酸或精氨酸残基或无残基，X4是天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸残基或无残基，X5是丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸残基或无残基，X6是甘氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸残基或无残基，X7是酪氨酸、色氨酸、丝氨酸或天冬氨酸残基或无残基，X8是天冬氨酸、精氨酸、丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸或色氨酸残基，X9是酪氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或赖氨酸残基，X10是酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸或甘氨酸残基，X11是甘氨酸、酪氨酸或天冬酰胺残基。在另一个实施方案中，所述重链CDR3包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10Y(SEQIDNO:252),其中X1是天冬氨酸或缬氨酸残基或无残基，X2是甘氨酸、酪氨酸、精氨酸或天冬氨酸残基或无残基，X3是天冬酰胺、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸残基或无残基，X4是亮氨酸、丝氨酸、色氨酸、丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、甘氨酸或天冬氨酸残基或无残基，X5是甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、丝氨酸、天冬氨酸或亮氨酸残基，X6是缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、组氨酸或谷氨酰胺残基，X7是谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、缬氨酸、色氨酸、组氨酸或精氨酸残基，X8是谷氨酰胺、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸、脯氨酸、亮氨酸、天冬氨酸或丝氨酸残基，X9是非极性侧链残基，X10是天冬氨酸或丙氨酸残基。在另一个实施方案中，所述重链CDR3包含序列X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10YFDX11(SEQIDNO:253),其中X1是甘氨酸残基或无残基，X2是脯氨酸残基或无残基，X3是精氨酸或天冬氨酸残基或无残基，X4是组氨酸或脯氨酸残基，X5是精氨酸或甘氨酸残基，X6是精氨酸、丝氨酸或苯丙氨酸残基，X7是天冬氨酸或丝氨酸残基,X8是甘氨酸、色氨酸或酪氨酸残基，X9是酪氨酸或丙氨酸残基，X10是天冬酰胺或色氨酸残基，X11是天冬酰胺或亮氨酸残基。在另一个实施方案中，所述重链CDR3包含序列X1X2X3X4DSSX5X6X7X8X9X10X11X12(SEQIDNO:254),其中X1是苯丙氨酸残基或无残基，X2是天冬酰胺或甘氨酸残基或无残基，X3是酪氨酸或亮氨酸残基或无残基，X4是酪氨酸或甘氨酸残基或无残基，X5是甘氨酸、丝氨酸或缬氨酸残基，X6是酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或谷氨酰胺残基或无残基，X7是酪氨酸、甘氨酸或异亮氨酸残基或无残基，X8是酪氨酸、亮氨酸或甘氨酸残基或无残基，X9是甲硫氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸残基或无残基，X10是天冬氨酸或甲硫氨酸残基或无残基，X11是缬氨酸、天冬氨酸或酪氨酸残基或无残基，X12是缬氨酸残基或无残基。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的抗原结合蛋白，其包含：a.包含序列的轻链CDR3，所述序列选自：i.选自图6中所示的L1-L52的轻链CDR3序列的轻链CDR3序列；ii.MQALQTPZT;iii.QQ(R/S)(N/S)(S/N)ZPLT;和iv.QSYDSSNXJV;b.包含序列的重链CDR3，所述序列选自：i.与选自图9中所示的H1-H52的重链CDR3序列的CDR3序列相异不超过总共3个氨基酸添加、置换或缺失的重链CDR3序列；ii.SRLDAFDI;iii.SXYDYYGMDV;iv.HRXDXAWYFDL;和v.DSSG;或c.(a)的轻链CDR3序列和(b)的重链CDR3序列;其中括号内的氨基酸残基符号表示序列中相同位置的可选择的残基，各X独立地是任何氨基酸残基，各Z独立地是甘氨酸残基、丙氨酸残基、缬氨酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸残基、脯氨酸残基、苯丙氨酸残基、甲硫氨酸残基、色氨酸残基或半胱氨酸残基，各J独立地是谷氨酰胺残基、精氨酸残基、缬氨酸残基或色氨酸残基，且抗原结合蛋白结合人IGF-1R。
可通过例如随机诱变或定点诱变（例如，寡核苷酸引导的位点特异性诱变）以产生与非突变的多核苷酸相比包含一个或多个特定核苷酸置换、缺失或插入的改变的多核苷酸，来改变图1的核苷酸序列或图2至9中的氨基酸序列。在Walder等人,1986,Gene42:133;Bauer等人1985,Gene37:73;Craik,BioTechniques,January1985,12-19;Smith等人,1981,GeneticEngineering：PrinciplesandMethods,PlenumPress;和美国专利4,518,584和4,737,462中描述了用于产生这些改变的技术的实例。这些技术和其他方法可用于产生例如抗IGF-1R抗体的衍生物，所述衍生物具有想要的性质，例如，与未衍生化的抗体相比，增加的对于IGF-1R的亲和力、抗体亲抗源性或特异性、增加的体内或体外的活性或稳定性、或减少的体内副作用。
本发明范围内的抗IGF-1R抗体的其他衍生物包括抗IGF-1R抗体或其片段与其他蛋白或多肽的共价或聚集缀合物（aggregativeconjugate），例如通过重组融合蛋白的表达产生的缀合物，所述融合蛋白包含融合至抗IGF-1R抗体多肽的N末端或C末端的异源多肽。例如，缀合的肽可以是异源信号（或前导）多肽，例如，酵母α因子前导序列或肽例如表位标签。包含抗原结合蛋白的融合蛋白可包含添加的以帮助纯化或鉴定抗原结合蛋白的肽（例如，多组氨酸）。抗原结合蛋白也可连接至Hopp等人,Bio/Technology6:1204,1988,和美国专利5,011,912中描述的FLAG肽Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DYKDDDDK)(SEQIDNO:255)。所述FLAG肽具有高度抗原性且提供由特定单克隆抗体（mAb）可逆地结合的表位，从而使得能够快速测定和容易地纯化表达的重组蛋白。用于制备其中FLAG肽融合至给定的多肽的融合蛋白的试剂可商购获得(Sigma,St.Louis,MO)。
包含一种或多种抗原结合蛋白的寡聚体可用作IGF-1R拮抗剂。寡聚体可以以共价连接的或非共价连接的二聚体、三聚体或更高阶寡聚体的形式存在。涉及使用包含两个或多个抗原结合蛋白的寡聚体，一个例子是同型二聚体。其他寡聚体包括异二聚体、同型三聚体、异三聚体、同型四聚体、异四聚体等。
一个实施方案涉及寡聚体，所述寡聚体包含通过融合至抗原结合蛋白的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接的多个抗原结合蛋白。这些肽可以是具有促进寡聚化的特性的肽连接体（间隔子)或肽。亮氨酸拉链和来源于抗体的某些多肽是如下面更详细描述的可促进附着至其上的抗原结合蛋白寡聚化的肽。
在特定的实施方案中，寡聚体包含两个至四个抗原结合蛋白。所述寡聚物的抗原结合蛋白可以任何形式例如上述形式的任一形式例如变体或片段的形式存在。优选地，所述寡聚物包含具有IGF-1R结合活性的抗原结合蛋白。
在一个实施方案中，使用来源于免疫球蛋白的多肽制备寡聚物。包含融合至抗体来源的多肽的各个部分（包括Fc结构域）的某些异源多肽的融合蛋白的制备已在例如Ashkenazi等人,1991,PNASUSA88:10535;Byrn等人,1990,Nature344:677;和Hollenbaugh等人,1992"ConstructionofImmunoglobulinFusionProteins",inCurrentProtocolsinImmunology，Suppl.4,pages10.19.1-10.19.11中进行了描述。
本发明的一个实施方案涉及包含两个融合蛋白的二聚体，所述二聚体通过将抗IGF-1R抗体的IGF-1R结合片段融合至抗体的Fc区域产生。可这样产生二聚体，即通过例如将编码融合蛋白的融合基因插入合适的表达载体，然后在用该重组表达载体转化的宿主细胞中表达该融合基因，并使所表达的融合蛋白象抗体分子一样进行装配，从而在Fc部分之间形成链间二硫键，产生二聚体。
如此处所用的，术语“Fc多肽”包括抗体的Fc区域的天然形式和从所述区域衍生的多肽的突变蛋白形式。也包括包含促进二聚化的铰链区的这些多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白（和从其形成的寡聚体）提供了使用通过A蛋白或G蛋白柱的亲和层析进行容易的纯化的有利方面。
在PCT申请WO93/10151(此处引用作为参考)中描述的一个合适的Fc多肽是从人IgG1抗体的N末端铰链区延伸至Fc区域的天然C末端的单链多肽。另一个有用的Fc多肽是美国专利5,457,035和Baum等人,1994,EMBOJ.13:3992-4001中描述的Fc突变蛋白。该突变蛋白的氨基酸序列，除了氨基酸19已从Leu改变为Ala、氨基酸20已从Leu改变成Glu以及氨基酸22已从Gly改变成Ala外，其它与WO93/10151提供的天然Fc序列的氨基酸序列相同。所述突变蛋白展示了减少的对于Fc受体的亲和力。
在其他实施方案中，抗IGF-1R抗体的重链和/或轻链的可变部分可替代抗体重链和/或轻链的可变部分。
可选择地，所述寡聚体是包含多个抗原结合蛋白、具有或不具有肽连接体（间隔肽）的融合蛋白。其中合适的肽连接体可以是美国专利4,751,180和4,935,233中描述的肽连接体。
用于制备寡聚抗原结合蛋白的另一种方法包括使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域是促进含有其的蛋白寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初在几种DNA结合蛋白中被鉴定(Landschulz等人,1988,Science240:1759),且从此在许多不同的蛋白中被发现。在已知的亮氨酸拉链中，其都是天然发生的二聚化或三聚化的肽和其衍生物。适合于产生可溶性寡聚蛋白的亮氨酸拉链的实例描述于PCT申请WO94/10308,从肺表面活性剂蛋白D(SPD)衍生的亮氨酸拉链描述于Hoppe等人,1994,FEBSLetters344:191,此处引用作为参考。在Fanslow等人,1994,Semin.Immunol.6:267-78中描述了允许融合至其上的异源蛋白的稳定三聚化的经修饰的亮氨酸拉链的用途。在一个方法中，在合适的宿主细胞中表达包含融合至亮氨酸拉链肽的抗IGF-1R抗体片段或衍生物的重组融合蛋白，并从培养物上清液回收形成的可溶性寡聚抗IGF-1R抗体片段或衍生物。
在一个方面，本发明提供了干扰IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合的抗原结合蛋白。可产生抗IGF-1R或其片段、变体或衍生物的这些抗原结合蛋白，并就干扰IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合的能力在常规测定法中筛选其。合适的测定法的实例是这样的测定法，所述测定法就抑制IGF-1和/或IGF-2对表达IGF-1R的细胞的结合的能力检测抗原结合蛋白或就减少生物学或细胞反应的能力检测抗原结合蛋白，所述反应由IGF-1和/或IGF-2对细胞表面IGF-1R受体的结合导致。
在另一个方面，本发明提供了阻止IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合但不显著地阻止胰岛素对胰岛素受体（INS-R）的结合的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，抗原结合蛋白不结合INS-R。在另一个实施方案中，抗原结合以低至其不能有效地阻止胰岛素对INS-R的结合的亲和力结合所述INS-R。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白结合INS-R，但被抗原结合蛋白结合的INS-R仍可结合胰岛素。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白对于IGF-1R的选择性至少比其对于胰岛素受体的选择性高50倍。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白的选择性比其对于胰岛素受体的选择性高100倍。
在另一个方面，本发明提供了显示物种选择性的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，抗原结合蛋白结合一种或多种哺乳动物IGF-1R,例如，结合人IGF-1R和一种或多种小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔子、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类动物的IGF-1R。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白结合一种或多种灵长类动物的IGF-1R,例如，结合人IGF-1R和一种或多种食蟹猴、狨猴、猕猴和黑猩猩的IGF-1R。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白特异性地结合人、食蟹猴、狨猴、猕猴或黑猩猩的IGF-1R。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白不结合一种或多种小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔子、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类动物的IGF-1R。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白不结合NewWorld猴物种例如狨猴的IGF-1R。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白不展示对除了IGF-1R外的任何天然发生的蛋白的特异性结合。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白不展示对于除了哺乳动物IGF-1R外的任何天然发生的蛋白的特异性结合。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白不展示对除了灵长类动物的IGF-1R外的任何天然发生的蛋白的特异性结合。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白不展示对除了人IGF-1R外的任何天然发生的蛋白的特异性结合。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白特异性地结合小鼠、大鼠、食蟹猴和人IGF-1R。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白以相似的结合亲和力特异性地结合小鼠、大鼠、食蟹猴和人的IGF-1R。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白阻止人IGF-1和IGF-2与小鼠、大鼠、食蟹猴和人IGF-1R的结合。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白以相似的Ki阻止人IGF-1和IGF-2与小鼠、大鼠、食蟹猴和人的IGF-1R的结合。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白以大约0.57和大约0.61nM之间的Ki阻止人IGF-1和IGF-2与小鼠、大鼠、食蟹猴和人的IGF-1R的结合。
可使用本领域熟知的方法和按照本说明书的教导确定抗原结合蛋白对于IGF-1R的选择性。例如，可使用Western印迹法、FACS、ELISA或RIA确定选择性。
在另一个方面，本发明提供了结合IGF-1R的抗原结合蛋白(例如，抗IGF-1R抗体),所述蛋白具有一种或多种下列特征：结合人和鼠类的IGF-1R、抑制IGF-1和IGF-2两者对人IGF-1R的结合、抑制IGF-1和IGF-2两者对鼠类IGF-1R的结合,优选地抑制IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的高亲和力结合、结合IGF-1R的L2结构域、在17小时的暴露后引起细胞表面表达的IGF-1R的相对小的下调(与MAB391相比(R&Dsystems,Minneapolis,MN)，例如，IGF-1R的量减少不到20%)、在每周一次200微克的剂量进行4周后，在小鼠如MAB391中的Colo-205或MiaPaCa-2异种移植肿瘤细胞上产生下调的细胞表面表达的IGF-1R的水平。
可通过常规技术产生本发明的抗原结合蛋白的抗原结合片段。这些片段的实例包括，但不限于，Fab和F(ab')2片段。也涉及由基因工程技术产生的抗体片段和衍生物。
其他实施方案包括嵌合抗体，例如，非人（例如，鼠类）的单克隆抗体的人源化形式。这些人源化抗体可通过已知的技术制备，且当将所述抗体给人施用时，提供了减少的免疫原性的有利方面。在一个实施方案中，人源化单克隆抗体包含鼠类抗体的可变结构域（或其抗原结合位点的全部或部分）和来源于人抗体的恒定结构域。可选择地，人源化抗体片段可包含鼠类单克隆抗体的抗原结合位点和来源于人抗体的可变结构域片段（缺少抗原结合位点）。用于产生嵌合抗体和经基因工程改造的其他单克隆抗体的方法包括Riechmann等人,1988,Nature332:323,Liu等人,1987,Proc.Nat.Acad.Sci.USA84:3439,Larrick等人,1989,Bio/Technology7:934,和Winter等人,1993,TIPS14:139中描述的方法。在一个实施方案中，所述嵌合抗体是CDR移植抗体。用于人源化抗体的技术在例如美国专利申请号10/194,975(2003年2月27日公布)、美国专利号5,869,619、5,225,539、5,821,337、5,859,205,Padlan等人,1995,FASEBJ.9:133-39,和Tamura等人,2000,J.Immunol.164:1432-41中进行了描述。
已发展了在非人动物中产生人或部分人抗体的方法。例如，已产生了其中通过各种方法使一个或更多个内源免疫球蛋白基因失活的小鼠。已将人免疫球蛋白基因导入所述小鼠，从而置换失活的小鼠基因。动物中产生的抗体整合了由已导入该动物中的人遗传材料编码的人免疫球蛋白多肽链。在一个实施方案中，用IGF-1R多肽免疫非人动物，例如转基因小鼠，这样使得在动物中产生抗所述IGF-1R的抗体。合适的免疫原的一个例子是可溶性人IGF-1R，例如包含图10的蛋白的细胞外结构域的多肽，或图10的蛋白的其他免疫原片段。用于产生和使用用于生产人或部分人抗体的转基因动物的技术的实例描述于美国专利5,814,318、5,569,825和5,545,806,Davis等人,2003,ProductionofhumanantibodiesfromtransgenicmiceinLo,ed.AntibodyEngineering:MethodsandProtocols,HumanaPress,NJ:191-200,Kellermann等人,2002,CurrOpinBiotechnol.13:593-97,Russel等人,2000,InfectImmun.68:1820-26,Gallo等人,2000,EurJImmun.30:534-40,Davis等人,1999,CancerMetastasisRev.18:421-25,Green,1999,JImmunolMethods.231:11-23,Jakobovits,1998,AdvancedDrugDeliveryReviews31:33-42,Green等人,1998,JExpMed.188:483-95,JakobovitsA,1998,Exp.Opin.Invest.Drugs.7:607-14,Tsuda等人,1997,Genomics.42:413-21,Mendez等人,1997,NatGenet.15:146-56,Jakobovits,1994,CurrBiol.4:761-63,Arbones等人,1994,Immunity.1:247-60,Green等人,1994,NatGenet.7:13-21,Jakobovits等人,1993,Nature.362:255-58,Jakobovits等人,1993,ProcNatlAcadSciUSA.90:2551-55.Chen,J.,M.Trounstine,F.W.Alt,F.Young,C.Kurahara,J.Loring,D.Huszar."ImmunoglobulingenerearrangementinBcelldeficientmicegeneratedbytargeteddeletionoftheJHlocus."lnternationalImmunology5(1993):647-656,Choi等人,1993,NatureGenetics4:117-23,Fishwild等人,1996,NatureBiotechnology14:845-51,Harding等人,1995,AnnalsoftheNewYorkAcademyofSciences,Lonberg等人,1994,Nature368:856-59,Lonberg,1994,TransgenicApproachestoHumanMonoclonalAntibodiesinHandbookofExperimentalPharmacology113:49-101,Lonberg等人,1995,InternalReviewofImmunology13:65-93,Neuberger,1996,NatureBiotechnology14:826,Taylor等人,1992,NucleicAcidsResearch20:6287-95,Taylor等人,1994,InternationalImmunology6:579-91,Tomizuka等人,1997,NatureGenetics16:133-43,Tomizuka等人,2000,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA97:722-27,Tuaillon等人,1993,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA90:3720-24,和Tuaillon等人,1994,JournalofImmunology152:2912-20中。
在另一方面，本发明提供了结合IGF-1R的单克隆抗体。可使用任何本领域已知的技术，例如通过永生化脾细胞来产生单克隆抗体，所述脾细胞收获自完成免疫接种程序后的转基因动物。可使用本领域已知的任何技术使所述脾细胞永生化，例如通过将其与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤来使其永生化。用于产生杂交瘤的融合方法的骨髓瘤细胞优选地是非抗体产生性的，具有高融合效率和酶缺陷的细胞，所述酶缺陷使其不能在某些选择培养基中生长，所述培养基只支持想要的融合细胞（杂交瘤）生长。用于小鼠融合的合适的细胞系的实例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul;用于大鼠融合的细胞系的实例包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210。用于细胞融合的其他细胞系是U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
在一个实施方案中，用IGF-1R免疫原免疫动物（例如，具有人免疫球蛋白序列的转基因动物）来产生杂交瘤细胞系；收获来自免疫的动物的脾细胞；将收获的脾细胞融合至骨髓瘤细胞系，从而产生杂交瘤细胞；从所述杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系，并鉴定产生结合IGF-1R多肽的抗体的杂交瘤细胞系。这些杂交瘤细胞系和由其产生的抗IGF-1R单克隆抗体包括在本发明内。
可使用本领域内已知的任何技术纯化由杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。可进一步筛选杂交瘤或mAb以鉴定具有特定性质例如阻断IGF-1和/或IGF-2诱导的活性的能力的mAb。在下面的实施例中提供了这些筛选的实例。
抗体结合位点中心的互补决定区（CDR）的分子进化也已被用来分离具有增加的亲和力的抗体，例如由Schier等人,1996,J.Mol.Biol.263:551描述的具有增加的对于c-erbB-2的亲和力的抗体。因此，这些技术可用于制备抗IGF-1R的抗体。
抗IGF-1R的抗原结合蛋白可用于例如在体外或体内检测IGF-1R多肽存在的测定法中。抗原结合蛋白也可用于通过免疫亲和层析纯化IGF-1R蛋白。这些额外地可阻止IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合的抗原结合蛋白可用于抑制由这些结合导致的生物学活性。阻断性抗原结合蛋白可用于本发明的方法。用作IGF-1和/或IGF-2拮抗剂的这些抗原结合蛋白可用于治疗任何IGF-1和/或IGF-2诱导的病症，包括但不限于癌症。在一个实施方案中，由涉及转基因小鼠的免疫的方法产生的人抗IGF-1R单克隆抗体用于治疗这些病症。
可在体外方法中使用抗原结合蛋白，或体内施用其以抑制IGF-1和/或IGF-2诱导的生物学活性。因此可治疗由IGF-1和/或IGF-2与细胞表面IGF-1R的相互作用引起或恶化（直接地或间接地）的病症（上面提供了其实例）。在一个实施方案中，本发明提供了包括在体内以有效地减少IGF-1和/或IGF-2诱导的生物学活性的量给需要其的哺乳动物施用IGF-1和/或IGF-2阻断性抗原结合蛋白的疗法。
本发明的抗原结合蛋白包括抑制IGF-1的生物学活性并且也抑制IGF-2的生物学活性的部分人和完全人单克隆抗体。一个实施方案涉及至少部分地阻止IGF-1和IGF-2对表达人IGF-1R的细胞的结合的人单克隆抗体。在一个实施方案中，通过用IGF-1R免疫原免疫转基因小鼠来产生所述抗体。在另一个实施方案中，所述免疫原是人IGF-1R多肽(例如，包含所有或部分IGF-1R细胞外结构域的可溶性片段)。此处也提供了来源于这些免疫小鼠的杂交瘤细胞系，其中所述杂交瘤分泌结合IGF-1R的单克隆抗体。
尽管人、部分人或人源化的抗体适合于许多应用，特别是包括给人受试者施用所述抗体的应用，但其他类型的抗原结合蛋白可适用于某些应用。本发明的非人抗体可以例如来源于任何抗体产生性动物，例如小鼠、大鼠、兔子、山羊、驴或非人灵长类动物（例如猴子（例如，食蟹猴或猕猴)或猿(例如，黑猩猩))。本发明的非人抗体可用于体外和基于细胞培养的应用或其中不发生对本发明的抗体的免疫反应、所述免疫反应不显著、可被阻止、不被考虑或是想要的任何其他应用。在一个实施方案中，给非人受试者施用本发明的非人抗体。在另一个实施方案中，非人抗体不在非人受试者中引发免疫反应。在另一个实施方案中，所述非人抗体来自与非人受试者相同的物种，例如将本发明的小鼠抗体给小鼠施用。来自特定物种的抗体可通过例如用想要的免疫原（例如，可溶性IGF-1R多肽）免疫该物种的动物，或使用用于产生该物种的抗体的人工系统（例如，用于产生特定物种的抗体的基于细菌或噬菌体展示的系统）、或通过将来自一个物种的抗体转化成来自另一个物种的抗体（通过例如用来自另一个物种的恒定区置换抗体的恒定区或通过置换抗体的一个或多个氨基酸残基以使其与来自另一个物种的抗体序列更相似）来产生。在一个实施方案中，抗体是包含来源于抗体（其来自两个或更多个不同的物种）的氨基酸序列的嵌合抗体。
可通过许多常规技术的任一技术制备抗原结合蛋白。例如，可使用本领域已知的任何技术从天然表达其的细胞纯化其（例如，可从产生其的杂交瘤中纯化抗体），或在重组表达系统中产生其。参见，例如，MonoclonalAntibodies，Hybridomas:ANewDimensioninBiologicalAnalyses,Kennet等人(eds.),PlenumPress,NewYork(1980);和Antibodies:ALaboratoryManual，Harlow和Land(eds.),ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,(1988)。
可使用本领域已知的任何表达系统生产本发明的重组多肽。一般地，用包含编码想要的多肽的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可使用的宿主细胞是原核细胞、酵母或高等真核细胞。原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌（bacilli）。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的来源于哺乳动物的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的COS-7系(ATCCCRL1651)(Gluzman等人,1981,Cell23:175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL10)细胞系和由McMahan等人,1991,EMBOJ.10:2821描述的来源于非洲绿猴肾细胞系CVI(ATCCCCL70)的CVI/EBNA细胞系。由Pouwels等人(CloningVectors:ALaboratoryManual，Elsevier,NewYork,1985)描述了用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体。
可在促进多肽表达的条件下培养转化的细胞，并通过常规的蛋白纯化方法回收所述多肽。一个这样的纯化方法包括在例如具有被结合至其上的完整或部分（例如，细胞外结构域）的IGF-1R的基质上使用亲和层析。此处所用的多肽包括基本上均质的、基本上不含污染性内源材料的重组哺乳动物抗IGF-1R抗体多肽。
可通过许多已知的技术中的任一种技术制备抗原结合蛋白，并就想要的性质对其进行筛选。某些技术包括分离编码目的抗原结合蛋白（例如，抗IGF-1R抗体）多肽链（或其部分）的核酸和通过重组DNA技术操作该核酸。例如，可将核酸融合至另一种目的核酸，或改变（例如，通过诱变或其他常规技术）其以添加、缺失或置换一个或多个氨基酸残基。
在一个方面，本发明提供了本发明的抗IGF-1R抗体的抗原结合片段。这些片段可完全由来源于抗体的序列组成或可包含额外的序列。抗原结合片段的实例包括Fab、F(ab')2、单链抗体、双抗体、三抗体、四链体（tetrabody）和结构域抗体。在Lunde等人,2002,Biochem.Soc.Trans.30:500-06中提供了其他实例。
可通过氨基酸桥（短肽连接体）连接重链和轻链可变区（Fv区域）片段形成单链抗体，产生单个多肽链。通过在编码两个可变结构域多肽（VL和VH）的DNA之间融合编码肽连接体的DNA来制备这样的单链Fvs(scFvs)。依赖于所述两个可变区之间的柔性连接体的长度，所得的多肽自身可折叠回去以形成抗原结合单体，或其可形成多体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)(Kortt等人,1997,Prot.Eng.10:423;Kortt等人,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通过组合不同的包含VL和VH的多肽，可形成结合不同表位的多聚scFvs(Kriangkum等人,2001,Biomol.Eng.18:31-40)。发展用于产生单链抗体的方法包括美国专利4,946,778;Bird,1988,Science242:423;Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879;Ward等人,1989,Nature334:544,deGraaf等人,2002,MethodsMolBiol.178:379-87中描述的方法。此处提供的来源于抗体的单链抗体包括，但不限于，包含可变结构域组合L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14、L15H15、L16H16、L17H17、L18H18、L19H19、L20H20、L21H21、L22H22、L23H23、L24H24、L25H25、L26H26、L27H27、L28H28、L29H29、L30H30、L31H31、L32H32、L33H33、L34H34、L35H35、L36H36、L37H37、L38H38、L39H39、L40H40、L41H41、L42H42、L43H43、L44H44、L45H45、L46H46、L47H47、L48H48、L49H49、L50H50、L51H51和L52H52的scFvs，其包括于本发明的范围之内。
本发明的抗原结合蛋白（例如，抗体、抗体片段和抗体衍生物）可包含本领域已知的任何恒定区。轻链恒定区可以是例如κ或λ类型轻链恒定区，例如人κ或λ类型轻链恒定区。重链恒定区可以是例如，α、δ、ε、γ或μ类型重链恒定区，例如人α、δ、ε、γ或μ类型重链恒定区。在一个实施方案中，轻链或重链恒定区是天然发生的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。
用于从目的抗体衍生不同亚类或同种型的抗体即亚类转换的技术是已知的。因此，例如可从IgM抗体衍生IgG抗体，反之亦然。这些技术允许制备新的抗体，所述新抗体不仅具有给定的抗体（亲本抗体）的抗原结合特性而且还展示与抗体同种型或亚型相关的但与亲本抗体的生物学特性不同的生物学特性。可使用重组DNA技术。可在这些方法中使用编码特定抗体多肽的克隆DNA，例如编码想要的同种型抗体的恒定结构域的DNA。也参见Lantto等人,2002,MethodsMol.Biol.178:303-16。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含图13的IgG1重链结构域或图13的IgG1重链结构域的片段。在另一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含图13的κ轻链恒定链区域或图13的κ轻链恒定链区域的片段。在另一个实施方案中，本发明的抗原结合蛋白包含图13的IgG1重链结构域或其片段和图13的κ轻链结构域或其片段。
因此，本发明的抗原结合蛋白包括包含例如可变结构域组合L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14、L15H15、L16H16、L17H17、L18H18、L19H19、L20H20、L21H21、L22H22、L23H23、L24H24、L25H25、L26H26、L27H27、L28H28、L29H29、L30H30、L31H31、L32H32、L33H33、L34H34、L35H35、L36H36、L37H37、L38H38、L39H39、L40H40、L41H41、L42H42、L43H43、L44H44、L45H45、L46H46、L47H47、L48H48、L49H49、L50H50、L51H51和L52H52、具有想要的同种型（例如，IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE和IgD）的抗原结合蛋白以及其Fab或F(ab')2片段的抗原结合蛋白。此外，如果IgG4是想要的，那么如Bloom等人,1997,ProteinScience6:407（此处引用作为参考)中所述在铰链区导入点突变(CPSCP->CPPCP)以减少形成重链内二硫键的趋势（其可导致IgG4抗体中的不均一性）也是想要的。
此外，用于衍生具有不同特性（即，对于其结合的抗原的不同亲和力）的抗原结合蛋白的技术也是已知的。一个这样的技术，称作链改组（chainshuffling），包括在丝状噬菌体的表面上展示免疫球蛋白可变区基因库，通常称作噬菌体展示。已使用链改组制备如由Marks等人,1992,BioTechnology,10:779描述的抗半抗原2-苯基唑-5-酮的高亲和力抗体。
在特定的实施方案中，本发明的抗原结合蛋白具有如实施例中描述所测量的至少106的对于IGF-1R的结合亲和力(Ka)。在其他实施方案中，所述抗原结合蛋白展示了至少107、至少108、至少109或至少1010的Ka。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有低的与IGF-1R的解离速率的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白具有1x10-4s-1或更低的Koff。在另一个实施方案中，Koff是5x10-5s-1或更低。在另一个实施方案中，所述Koff基本上与具有重链和轻链可变区序列的组合的抗体相同，所述组合选自：L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14、L15H15、L16H16、L17H17、L18H18、L19H19、L20H20、L21H21、L22H22、L23H23、L24H24、L25H25、L26H26、L27H27、L28H28、L29H29、L30H30、L31H31、L32H32、L33H33、L34H34、L35H35、L36H36、L37H37、L38H38、L39H39、L40H40、L41H41、L42H42、L43H43、L44H44、L45H45、L46H46、L47H47、L48H48、L49H49、L50H50、L51H51和L52H52。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白以基本上与包含一个或多个CDR的抗体相同的Koff结合IGF-1R，所述CDR来自具有轻链和重链可变区序列的组合的抗体，所述组合选自L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14、L15H15、L16H16、L17H17、L18H18、L19H19、L20H20、L21H21、L22H22、L23H23、L24H24、L25H25、L26H26、L27H27、L28H28、L29H29、L30H30、L31H31、L32H32、L33H33、L34H34、L35H35、L36H36、L37H37、L38H38、L39H39、L40H40、L41H41、L42H42、L43H43、L44H44、L45H45、L46H46、L47H47、L48H48、L49H49、L50H50、L51H51和L52H52。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白以基本上与包含图2至9中举例说明的氨基酸序列中的一个序列的抗体相同的Koff结合IGF-1R。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白以基本上与包含一个或多个CDR的抗体相同的Koff结合IGF-1R，所述CDR来自包含图2至9中举例说明的氨基酸序列中的一个序列的抗体。
在一个方面，本发明提供了结合人IGF-1R的L2结构域的抗原结合蛋白。可使用本领域已知的任何技术制备结合所述L2结构域的抗原结合结构域。例如，可使用全长IGF-1R多肽（例如，在膜结合制剂中）、IGF-1R的可溶性细胞外结构域片段（实施例1中提供了其实例）、或包含或由L2结构域组成的IGF-1R细胞外结构域的更小片段（实施例10提供了其实例）分离这些抗原结合蛋白。可使用本领域已知的任何方法（实施例10中提供了其实例）筛选所分离的抗原结合蛋白以确定其结合特异性。
在另一方面，本发明提供了结合细胞表面上表达的人IGF-1R的抗原结合蛋白，当这样结合时，其抑制细胞中的IGF-1R信号转导活性而不引起细胞表面上的IGF-1R的量显著减少。可使用确定或估计细胞表面上和/或内部的IGF-1R的量的任何方法。在一个实施方案中，本发明提供了结合在细胞表面上表达的人IGF-1R的L2结构域的抗原结合蛋白，且当这样结合时，抑制了细胞中的IGF-1R信号转导活性而不显著地增加细胞表面的IGF-1R的内化率。在其他实施方案中，抗原结合蛋白对表达IGF-1R的细胞的结合引起低于大约75%、50%、40%、30%、20%、15%、10%、5%、1%或0.1%的细胞表面IGF-1R被内化。在另一个方面，抗原结合蛋白对表达IGF-1R的细胞的结合导致细胞表面上的IGF-1R的量逐渐减少，这样在将细胞与所述抗原结合蛋白接触的数小时内，很少或未检测到细胞表面IGF-1R的减少，但在细胞暴露于抗原结合蛋白数天或数周后，检测到细胞表面IGF-1R的明显减少。
在另一个方面，本发明提供了具有体外或体内（例如，当给人受试者施用时）至少一天的半衰期的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，所述抗原结合蛋白具有至少3天的半衰期。在另一个实施方案中，所述抗原结合蛋白具有4天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白具有8天或更长的半衰期。在另一个实施方案中，衍生或修饰抗原结合蛋白以使其和非衍生的或未修饰的抗原结合蛋白相比具有更长的半衰期。在另一个实施方案中，抗原结合蛋白包含一个或多个点突变以增加血清半衰期，例如2000年2月24日公布的WO00/09560（引用作为参考）中所描述的情况。
本发明还提供了多特异性抗原结合蛋白，例如，双特异性抗原结合蛋白，例如，通过两个不同的抗原结合位点或区域结合两种不同的IGF-1R的表位或结合一种IGF-1R的表位和另一种分子的表位的抗原结合蛋白。此外，此处公开的双特异性抗原结合蛋白可包含来自此处描述的抗体中的一种抗体的IGF-1R结合位点和来自此处描述的抗体的另一种抗体的第二IGF-1R结合区域，其包括通过参考其他出版物在此处描述的那些。可选择地，双特异性抗原结合蛋白可包含来自此处描述的抗体的一种抗体的抗原结合位点和来自本领域已知的另一种IGF-1R抗体或来自通过已知的方法或此处描述的方法制备的抗体的第二抗原结合位点。
制备双特异性抗体的许多方法在本领域内是已知的，且描述于2001年4月20日提交的美国专利申请09/839,632(此处引用作为参考)。这些方法包括使用由Milstein等人，1983,Nature305:537,和其他资料(美国专利4,474,893、美国专利6,106,833)中描述的杂交瘤和抗体片段的化学偶联(Brennan等人，1985,Science229:81;Glennie等人，1987,J.Immunol.139:2367;美国专利6,010,902)。此外，可通过重组方法，例如通过使用亮氨酸拉链部分（即，来自优选地形成异二聚体的Fos和Jun蛋白；Kostelny等人，1992,J.Immnol.148:1547)或美国专利5,582,996中描述的其他锁和钥匙相互作用结构域结构产生双特异性抗体。其他有用的技术包括Kortt等人，1997,同上；美国专利5,959,083;和美国专利5,807,706中描述的技术。
在另一个方面，本发明的抗原结合蛋白包括抗体的衍生物。所述衍生的抗体可包含给所述抗体提供想要的特性例如特定用途中增加的半衰期的任何分子或物质。所述衍生抗体可包含，例如，可检测的（或标记的）部分（例如，放射性物质、比色物质、抗原性分子或酶分子、可检测小珠（例如磁性或电子致密(例如,金)小珠)、或结合另一种分子的分子（例如，生物素或链霉抗生物素））、治疗或诊断部分（例如，放射性、细胞毒性或药物活性部分）或增加用于特定用途（例如给受试者例如人受试者施用或其他体内或体外用途）的抗体的适应性的分子。可用于衍生抗体的分子的实例包括白蛋白（例如，人血清白蛋白）和聚乙二醇（PEG）。可使用本领域内熟知的技术制备白蛋白偶联的抗体和抗体的聚乙二醇化衍生物。在一个实施方案中，将抗体缀合至或连接至运甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体。可用例如化学药品化学修饰TTR或TTR变体，所述化学药品选自葡聚糖、聚(正乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚丙二醇同聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇。美国专利申请20030195154。
在另一个方面，本发明提供了使用本发明的抗原结合蛋白筛选结合IGF-1R的分子的方法。可使用任何合适的筛选技术。在一个实施方案中，将与本发明的抗原结合蛋白结合的IGF-1R分子或其片段与本发明的抗原结合蛋白和另一种分子接触，其中如果所述另一种分子减少所述抗原结合蛋白对IGF-1R的结合那么其结合IGF-1R。可使用任何合适的方法例如ELISA检测抗原结合蛋白的结合。可通过如上所述可检测地标记抗原结合蛋白来简化抗原结合蛋白对IGF-1R的结合的检测。在一个实施方案中，进一步分析所述IGF-1R结合分子以确定其是否抑制IGF-1R、IGF-1和/或IGF-2介导的信号转导。
核酸
在一个方面，本发明提供了分离的核酸分子。所述核酸分子包括，例如编码抗原结合蛋白的整体或部分（例如，本发明的抗体的一条或两条链或其片段、衍生物、突变蛋白或变体）的多核苷酸、足以用作杂交探针、PCR引物或用于鉴定、分析、突变或扩增编码多肽的多核苷酸的测序引物、用于抑制多核苷酸表达的反义核酸和前述序列的互补序列。所述核酸可以是任何长度。其长度可以是例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000或更多个核苷酸，和/或可包含一个或多个额外的序列，例如调控序列，和/或可以是更大的核酸例如载体的部分。所述核酸可以是单链的或双链的且可包含RNA和/或DNA核苷酸，和其人工变体（例如，肽核酸）。
可从已用IGF-1R免疫的小鼠的B细胞分离编码抗体多肽（例如，重链或轻链，只为可变结构域或全长）的核酸。可通过常规的方法例如聚合酶链式反应（PCR）分离核酸。
图1提供了编码图2和图3中所示的重链和轻链可变区的可变区的核酸序列。本领域技术人员认识到，由于遗传密码子的简并性的原因，图2至9中各个多肽序列也由许多其他核酸序列编码。本发明提供了编码本发明的各抗原结合蛋白的各简并核苷酸序列。
本发明还提供了在特定的杂交条件下与其他核酸（例如，包含图1的核苷酸序列的核酸）杂交的核酸。用于杂交核酸的方法在本领域是熟知的。参见，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。如此处所定义的，中等严紧杂交条件使用包含5X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)、0.5%SDS、1.0mMEDTA(pH8.0)的预洗涤液（prewashingsolution）、大约50%的甲酰胺、6XSSC的杂交缓冲液，和55℃的杂交温度(或其他相似的杂交溶液，例如包含大约50%的甲酰胺的溶液，42℃的杂交温度)以及在0.5XSSC、0.1%SDS中在60℃下的洗涤条件。严紧杂交条件在6XSSC中在45℃下进行杂交，然后在0.1XSSC、0.2%SDS中在68℃下进行一次或多次洗涤。此外，本领域技术人员可操作杂交和/或洗涤条件以增加或减少杂交的严紧度，以使包含相互之间至少65、70、75、80、85、90、95、98或99%的同一性的核苷酸序列的核酸总体上保持相互杂交。在例如Sambrook,Fritsch,和Maniatis(1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,chapters9and11;和CurrentProtocolsinMolecularBiology,1995,Ausubel等人，eds.,JohnWiley&Sons,Inc.,sections2.10and6.3-6.4)中列出了影响杂交条件的选择的基本参数和设计合适的条件的指导,且可通过本领域技术人员基于例如DNA的长度和/或碱基组成容易地确定所述参数和指导。
可通过突变向核酸导入改变，从而导致其编码的多肽（例如，抗原结合蛋白）的氨基酸序列的改变。可使用本领域内已知的任何技术导入突变。在一个实施方案中，使用例如定点诱变方案来改变一个或多个特定的氨基酸残基。在一个实施方案中，使用例如随机诱变方案改变一个或多个随机选择的残基。然而这使得，可表达突变的多肽并就想要的性质（例如，对IGF-1R的结合或阻止IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合）对其进行筛选。
可将突变引入核酸而不显著地改变其编码的多肽的生物学活性。例如，可进行核苷酸置换（nucleotidesubstitution），从而导致在非必需氨基酸残基上的氨基酸置换。在一个实施方案中，突变图1中提供的核苷酸序列或其想要的片段、变体或衍生物以使其编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含图2至9中所示的一个或多个氨基酸的缺失或置换，所述氨基酸为两个或更多个序列在其上相异的残基。在另一个实施方案中，所述诱变在与图2至9中所示的一个或多个氨基酸残基（所述氨基酸为两个或更多个序列在其上相异的残基）相邻的位置插入氨基酸。可选择地，可向核酸导入一个或多个突变，所述突变可选择性地改变由其编码的多肽的生物学活性（例如，IGF-1R的结合，抑制IGF-1和/或IGF-2等）。例如，所述突变可定量或定性地改变生物学活性。定量改变的实例包括增加、减少或消除所述活性。定性改变的实例包括改变抗原结合蛋白的抗原特异性。
在另一个方面，本发明提供了适合用作引物或用于检测本发明的核酸序列的杂交探针的核酸分子。本发明的核酸分子可只包含编码本发明的全长多肽的核酸序列的部分，例如可用作探针或引物的片段或编码本发明的多肽的活性部分（例如，IGF-1R结合部分）的片段。
基于本发明的核酸的序列的探针可用于检测该核酸或相似的核酸，例如编码本发明的多肽的转录物。所述探针可包含标记基团，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子（enzymeco-factor）。这些探针可用于鉴定表达多肽的细胞。
在另一个方面，本发明提供了包含编码本发明的多肽或其部分的核酸的载体。载体的示例包括，但不限于，质粒、病毒载体、非染色体外哺乳动物载体和表达载体，例如重组表达载体。
本发明的重组表达载体可包含以适合于在宿主细胞中表达该核酸的形式存在的本发明的核酸。重组表达载体包含基于用于表达的宿主细胞选择的一个或多个调控序列，所述调控序列有效地连接至要表达的核酸序列。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核酸序列的组成型表达的调控序列（例如，SV40早期基因增强子、劳斯肉瘤病毒启动子和细胞巨化病毒启动子）、只在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列（例如，组织特异性调控序列，参见Voss等人，1986,TrendsBiochem.Sci.11:287,Maniatis等人,1987,Science236:1237,此处以其全文在此引用作为参考）和在对特定处理或条件的响应中指导核酸序列的诱导型表达的调控序列（例如，哺乳动物细胞中的金属硫蛋白启动子和原核和真核系统中的tet反应和/或链霉素反应性启动子（参见上述）。本领域技术人员认识到，表达载体的设计可依赖于这些因素如被转化的宿主细胞的选择、想要的蛋白的表达水平等。可将本发明的表达载体导入宿主细胞，从而产生蛋白或肽，包括由此处描述的核酸编码的融合蛋白或肽。
在另一个方面，本发明提供了已将本发明的重组表达载体导入其中的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核细胞（例如，大肠杆菌）或真核细胞（例如，酵母、昆虫或哺乳动物细胞（例如，CHO细胞））。可通过常规的转化或转染技术将载体DNA导入原核或真核细胞。为了稳定地转染哺乳动物细胞，已知依赖于所用的表达载体和转染技术，只有少数细胞可将外源DNA整合入其基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，一般可将编码选择标记（例如，对于抗生素的抗性）的基因和目的基因一起导入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予对药物例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤的抗性的选择标记。除其他方法以外，可通过药物选择鉴定稳定地转染了导入的核酸的细胞（例如，已整合了标记基因的细胞可存活，而其他细胞将死亡）。
适应症
在一个方面，本发明提供了治疗受试者的方法。所述方法可，例如，对受试者具有一般的增进健康的效应，例如，其可增加受试者的预期寿命。可选择地，所述方法可，例如，治疗、预防、医治、缓解或改善（“治疗”）病变、病症、症状或疾病（“病状”）。根据本发明治疗的病症是特征在于IGF-1、IGF-2和/或IGF-1R的不恰当的表达或活性的病症。在一些这样的病症中，所述表达或活性太高，从而治疗包括施用此处描述的IGF-1R拮抗剂。在其他这样的病症中，表达或活性水平太低，所述治疗包括施用此处描述的IGF-1R激动剂。
可使用本发明的方法和组合物治疗的病症的类型的一个实例是涉及细胞生长的病症，例如癌性病症。因此，在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症病症的组合物和方法。所述癌症病症可以是可使用此处包括例如IGF-1R拮抗性抗原结合蛋白（例如抗IGF-1R抗体、抗体片段或抗体衍生物）的组合物治疗的任何癌症病症。癌症病症的实例包括，例如，急性成淋巴细胞性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关性癌症、AIDS相关性淋巴瘤、肛门癌、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、基底细胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨癌、脑肿瘤(例如，脑干神经胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原发性神经外胚层瘤、视通路和下丘脑神经胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、胃肠类癌瘤、原因不明的原发性中枢神经系统癌（CarcinomaofUnknownPrimary，PrimaryCentralNervousSystem）、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、子宫颈癌、儿童期癌症、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生病、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食管癌、尤文家族肿瘤、颅外生殖细胞瘤（ExtracranialGermCellTumor）、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼内黑色素瘤眼癌、视网膜成神经细胞瘤眼癌（RetinoblastomaEyeCancer）、胆囊癌、胃癌、胃肠类癌瘤、生殖细胞瘤(例如，颅外、性腺外和卵巢)、妊娠性滋养层细胞瘤、神经胶质瘤(例如，成人、儿童脑干、儿童大脑星形细胞瘤、儿童视通道和下丘脑)、毛细胞性白血病、头与颈癌、肝细胞(肝)癌、何杰金氏淋巴瘤、下咽癌(hypopharyngealcancer)、下丘脑和视通路神经胶质瘤、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西氏肉瘤、肾(肾细胞)癌、喉癌、白血病(例如，急性成淋巴细胞的、急性骨髓的、慢性淋巴细胞的、慢性髓细胞性白血病和毛样细胞白血病)、唇和口腔癌、肝癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤(例如，AIDS相关性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、表皮T细胞淋巴瘤、何杰金氏、非何杰金淋巴瘤和原发性中枢神经系统淋巴瘤)、特发性巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、具有隐蔽原发灶的转移鳞状颈癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物（PlasmaCellNeoplasm）、蕈样霉菌病、骨髓增生异常综合征、骨髓发育异常（Myelodysplastic）/骨髓组织增殖病（MyeloproliferativeDiseases）、髓细胞性白血病、慢性髓细胞样白血病、多发性骨髓瘤、慢性骨髓增生病、鼻腔和鼻窦癌（NasalCavityandParanasalSinusCancer）、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞瘤（OvarianGermCellTumor）、低恶性度卵巢肿瘤（OvarianLowMalignantPotentialTumor）、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌（IsletCellPancreaticCancer）、鼻窦和鼻腔癌（ParanasalSinusandNasalCavityCancer）、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、成松果体细胞瘤、垂体瘤、浆细胞赘生物（PlasmaCellNeoplasm）/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤（PleuropulmonaryBlastoma）、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管转移细胞癌（RenalPelvisandUreterTransitionalCellCancer）、视网膜成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、软组织肉瘤、子宫肉瘤、塞扎里氏综合征、非黑色素瘤皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌（MerkelCellSkinCarcinoma）、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、皮肤T淋巴细胞瘤、睾丸癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、妊娠性滋养层细胞瘤、原发部位不明癌、原发部位不明癌、尿道癌、子宫内膜癌（EndometrialUterineCancer）、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌（VulvarCancer）、特发性巨球蛋白血症和肾母细胞瘤。
4个不同的研究小组通过放射免疫测定法（“RIA”）或免疫组织化学法（“IHC”）已研究了总共425例乳腺癌（大部分是管起源的）和48例正常组织或良性样品(Papa等人，1993,CancerResearch53:3736-40,Happerfield等人，1997,JournalofPathology183:412-17;Ellis等人，1998,BreastCancerResearch&Treatment52:175-84,Lee等人，1998,BreastCancerResearch&Treatment47:295-302,Schnarr等人,2000,InternationalJournalofCancer89:506-13)。这些研究表明提高的IGF-1R表达（5-10倍）与有利的预后和生物标记(ER+PR+)相关，暗示着雌激素和IGF在良好分化的肿瘤的维持或进展中协同作用。类似地，已显示雌激素是ER+MCF-7乳腺癌细胞系的生长和存活所必需的，且在该情况中IGF-1R通过雌激素处理上调(在Ellis等人，1998,BreastCancerResearch&Treatment52:175-84中进行了综述)。因此，在一个实施方案中，本发明提供了在需要该治疗的受试者中治疗乳腺癌的方法，其包括给受试者施用有效量的此处描述的IGF-1R拮抗剂。在另一个实施方案中，所述方法还包括施用激素抑制剂例如雌激素抑制剂。
已报导了关于12个结肠腺瘤、36个原发性结肠直肠腺瘤和27个对应的转移灶和34个相邻的正常组织的汇集的回顾性IGF-1RIHC分析(Hakam等人，1999,HumanPathology.30:1128-33)。中度至强IHC染色的频率似乎随更高的阶段和肿瘤分级度（0%正常对93%转移）急剧地增加。该结果与通过RNA酶保护测定法(“RPA”)(Freier等人，1999,Gut44:704-08)进行的RNA分析一致。因此，在一个实施方案中，本发明提供了在需要该治疗的受试者中治疗结肠癌的方法，其包括给所述受试者施用有效量的此处描述的IGF-1R拮抗剂。
40-80岁的男性中高血浆IGF-1和减少的IGFbp3与增加的前列腺癌风险相关(Chan等人，1998,Science279:563-6)。高IGF-1与其他癌症的风险相关，所述癌症包括乳腺癌(Hankinson等人，1998,Lancet351:1393-96)、结肠癌(Ma等人，1999,JournaloftheNationalCancerInstitute91:620-25)和肺癌（Yu等人，1999,JournaloftheNationalCancerInstitute91:151-56)。在转基因小鼠模型中，IGF-1在各位置中的过表达促进肿瘤发病率的增加(Bol等人，1997,Oncogene14:1725-34;DiGiovanni等人，2000,CancerResearch60:1561-70;DiGiovanni等人,2000,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica97:3455-60,Hadsell等人，2000,Oncogene19:889-98)。这些小鼠研究涉及血清和基质产生的IGF-1的作用。因此，在一些实施方案中，本发明提供了治疗需要该治疗的受试者的方法，其包括给所述受试者施用有效量的此处描述的IGF-1R的拮抗剂，其中所述拮抗剂抑制IGF-1对IGF-1R的激活。在另一个实施方案中，所述癌症是前列腺癌、乳腺癌、结肠癌或肺癌。
已观察到骨是身体中IGF-1的主要来源。因此，在一个方面，本发明提供了用于在受试者的骨中抑制IGF-1R的组合物和方法。在一个实施方案中，给受试者施用本发明的IGF-1R抑制剂，所述受试者在骨中具有肿瘤或处于发生该肿瘤的风险中。所述肿瘤可以是例如，原发性肿瘤或转移肿瘤。所述治疗任选地还包括给受试者施用一种或多种额外的治疗性和/或姑息疗法，例如抗肿瘤疗法(例如,化学疗法、放射疗法或抗激素疗法)或抑制骨转换（boneturnover）的治疗（例如，denosumab(AmgenInc.,ThousandOaks,CA))。
IGF-2在许多肿瘤和基质组织中过表达。IGF-2的水平在原发性肝癌(Cariani等人，1988,CancerResearch48:6844-49)和结肠的腺癌(Freier等人，1999,Gut44:704-08)中表现特别高（高至40倍）。许多过度生长病症与增加的儿童期肿瘤发病率相关。5至10%的具有出生前生长疾病贝克威斯韦德曼氏症（BWS）或偏侧发育过度的个体发生肿瘤例如肾胚细胞瘤、肾上腺癌和成神经细胞瘤(由Morison等人，1998,MolecularMedicineToday4:110-05综述)。这些儿童中的肿瘤易感因素似乎是母体IGF-2基因印迹的嵌合式丢失、或具有IGF-2的亲本染色体臂（11p）的加倍。两种改变都可增加IGF-2的表达水平。也在肾母细胞瘤中检测到由嵌合式单亲二倍体或IGF-2基因印迹的丢失造成的IGF-2过表达。即使IGF-2基因改变也在一些正常的组织中发生，也没在这些儿童中观察到生长病症，这可能反映受影响的细胞的组织分布。在小鼠中也发生母体IGF-2基因的印迹，且IGF-2过表达的效应与人的状况一致(Cariani等人,1991,JournalofHepatology13:220-26,Schirmacher等人,1992,CancerResearch52:2549-56;Harris等人，1998,Oncogene16:203-09)。在转基因表达过量IGF-2的的小鼠中，肿瘤和器官巨大症的发病率增加(Christofori等人，1994,Nature369:414-18,Ward等人，1994,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica91:10365-9,Wolf等人，1994,Endocrinology135:1877-86,Bates等人，1995,BritishJournalofCancer72:1189-93,Hassan等人，2000,CancerResearch60:1070-76)。局部IGF-2过表达增加前列腺、乳房、肠、肝和表皮肿瘤的自发出现。使用肝启动子的血浆特异性表达提高了肝细胞癌和淋巴瘤。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗需要该治疗的受试者的方法，其包括给受试者施用有效量的此处描述的IGF-1R的拮抗剂，其中所述拮抗剂抑制IGF-2对IGF-1R的激活。在另一个实施方案中，所述受试者具有癌症。在另一个实施方案中，所述受试者具有肿瘤。在另一个实施方案中，所述受试者具有肝癌、结肠腺癌、贝克威斯韦德曼氏症（Beckwith-WeidmannSyndrome）、偏侧发育过度、肾胚细胞瘤、肾上腺癌、成神经细胞瘤、母体IGF-2基因印迹的嵌合式丢失、亲本染色体臂（11p）的加倍、增加的IGF-2表达、肿瘤(例如,前列腺瘤、乳腺瘤、肠肿瘤、肝肿瘤、表皮肿瘤或肾母细胞瘤)、器官巨大症、肝细胞癌或淋巴瘤。
在另一个方面，本发明提供了预防或抑制癌症扩散至身体的另一部分或治疗已扩散至身体的另一部分的癌症的方法。在一个实施方案中，癌症已扩散至局部淋巴结。在另一个实施方案中，所述癌症是转移性的。原发性肿瘤可以是任何种类的肿瘤，例如，腺癌肿瘤（例如，前列腺腺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、或肾细胞癌肿瘤)、非小细胞或小细胞肺癌肿瘤、甲状腺癌肿瘤等。转移肿瘤的位置可以是身体中的任何位置。其可以在例如骨、淋巴系统、肺、大脑、眼、皮肤、胰腺、或肝中。在一个特定的实施方案中，用有效量的本发明的IGF-1R抑制性组合物治疗具有肿瘤疾病的受试者以阻止原发性肿瘤转移。在另一个特定的实施方案中，用有效量的本发明IGF-1R抑制性组合物治疗具有原发性肿瘤的受试者以抑制原发性肿瘤转移。在另一个特定的实施方案中，用有效量的本发明的IGF-1R抑制性组合物治疗具有转移肿瘤的受试者以抑制继发性肿瘤的生长或扩散。在另一个特定的实施方案中，用有效量的本发明的IGF-1R抑制性组合物治疗具有转移肿瘤的受试者以使继发性肿瘤的大小减小。在其他特定的实施方案中，原发性肿瘤是腺癌肿瘤、非小细胞肺肿瘤、小细胞肺肿瘤、或甲状腺癌。在另一个特定的实施方案中，所述转移肿瘤在骨中。在另一个特定的实施方案中，阻止或抑制转移肿瘤在骨中形成。在另一个明确确定的实施方案中，所述方法包括用本发明的IGF-1R抑制性组合物和一种或多种其他治疗法（例如，杀死或抑制癌细胞生长的治疗法，例如放射疗法、激素疗法或化学疗法，或抑制骨转换的治疗剂，例如denosumab)治疗受试者，此处提供其非限定性实例。一种或多种其他的疗法可包括，例如受试者的特定病症的护理和/或姑息护理的标准。
不束缚于任何特定的理论，肿瘤细胞似乎依赖于PI3激酶/Akt信号转导途径以抗化学疗法、放射疗法和抗激素疗法的编程性细胞死亡诱导性活性。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗需要该治疗的受试者的方法，其包括给所述受试者施用本发明的IGF-1R拮抗剂和化学疗法、放射疗法和/或抗激素疗法。通过反义技术和显性失活突变（dominantnegativemutations），该概念已在细胞培养物模型和啮齿动物肿瘤模型中通过实验得到验证(由Baserga等人，1997,BiochimicaetBiophysicaActa1332:F105-26,Baserga,2000,Oncogene19:5574-81综述)。在一个实施方案中，化学治疗剂选自有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、嵌入性抗生素、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、抗存活剂、生物学反应修饰剂、抗激素药例如抗雄激素和抗血管生成剂。
可与本发明的IGF-1受体抑制剂一起施用的化学治疗剂的一个实例是CPT-11。CPT-11(盐酸伊立替康三水合物)是喜树碱（植物生物碱）的半合成的、水溶性衍生物。CPT-11和称为SN38的相关代谢产物抑制拓扑异构酶1(TOPO1)。该酶在DNA中引入允许解旋从而允许DNA复制进行的可逆的单链断裂。TOPO1的抑制阻止了DNA复制后单链断裂的再连接，从而导致增加的染色体断裂。该DNA破坏通过由p53和监控基因组完整性的其他系统的作用产生的编程性细胞死亡促进细胞死亡。CPT-11的细胞毒性效应通常限制在正在复制DNA（S期）的细胞中。静息细胞大多不受影响。
在另一个实施方案中，本发明提供了以有效量的本发明的IGF-1R拮抗剂和有效量的细胞编程性死亡诱导剂治疗需要其的受试者的方法。
在另一个实施方案中，抗血管生成剂例如MMP-2(基质金属蛋白酶2)抑制剂、MMP-9(基质金属蛋白酶9)抑制剂和/或COX-II(环加氧酶II)抑制剂与本发明的化合物一起使用。有用的COX-II抑制剂的实例包括CELEBREXTM(alecoxib)、BEXTRATM(伐地考昔)和VIOXXTM(罗非考昔)。有用的基质金属蛋白酶抑制剂的实例描述于WO96/33172(1996年10月24日公布的)、WO96/27583(1996年3月7日公布的)、欧洲专利申请No.97304971.1(1997年7月8日提交的)、欧洲专利申请No.99308617.2(1999年10月29日提交的)、WO98/07697(1998年2月26日公布的)、WO98/03516(1998年1月29日公布的)、WO98/34918(1998年8月13日公布的)、WO98/34915(1998年8月13日公布的)、WO98/33768(1998年8月6日公布的)、WO98/30566(1998年7月16日公布的)、欧洲专利公开No.606,046(1994年7月13公布的)、欧洲专利公开No.931,788(1999年7月28日公布的)、WO90/05719(1990年5月31日公布的)、WO99/52910(1999年10月21日公布的)、WO99/52889(1999年10月21日公布的)、WO99/29667(1999年6月17日公布的)、PCT国际申请PCT/IB98/01113(1998年7月21日提交的)、欧洲专利申请No.99302232.1(1999年3月25日提交的)、大不列颠专利申请号9912961.1(1999年6月31日提交的)、美国临时申请No.60/148,464(1999年8月12日提交的)、美国专利No.5,863,949(1999年1月26日颁布的)、美国专利No.5,861,510(1999年1月19日颁布的)和欧洲专利公开780,386(1997年6月25日公布的)，其所有在此以其全文引用作为参考。在一个实施方案中，MMP抑制剂是不显示关节痛的抑制剂。在另一个实施方案中，所述MMP抑制剂，相对于其他基质金属蛋白酶(即,MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12和MMP-13)，选择性地抑制MMP-2和/或MMP-9。用于本发明的MMP抑制剂的一些特定实例是AG-3340、RO32-3555、RS13-0830和下列列表中引述的化合物：3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰]-(1-羟基氨甲酰基-环戊基)-氨基]-丙酸;3-外（exo）-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺;(2R,3R)1-[4-(2-氯-4-氟-苯甲氧基)--苯磺酰]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺;4-[4-(4-氟-苯氧基)--苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺;3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰-基]-(1-羟基氨甲酰基-环丁基)-氨基]-丙酸;4-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-4-羧酸羟基酰胺;(R)3-[4-(4-氯-苯氧基)--苯磺酰氨基]-四氢-吡喃-3-羧酸羟基酰胺;(2R,3R)1-[4-(4-氟-2-甲基-苯甲氧基)-苯磺酰]-3-羟基-3-甲基-哌啶-2-羧酸羟基酰胺;3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰]-(1-羟基氨甲酰基-1-甲基-乙基)-氨基]-丙酸;3-[[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰]-(4-羟基氨甲酰基-四氢-吡喃-4-基)-氨基]-丙酸;3-外-3-[4-(4-氯-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺;3-内（endo）-3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-8-氧杂-二环[3.2.1]辛烷-3-羧酸羟基酰胺;和(R)3-[4-(4-氟-苯氧基)-苯磺酰氨基]-四氢-呋喃-3-羧酸羟基酰胺;和所述化合物的药物可接受的盐、溶剂化物、衍生物或其他制剂。
失活PETN基因产物的散发性突变在大多数人癌症中发生相对频繁(Yamada等人，2001,JCellSci114:2375-82,Hill等人，2002,PharmacolTherapeut93:243-51)。PTEN的丢失通过丧失下调始于IGF-1R和其他来源的刺激信号的能力保持Akt磷酸化状态。p53肿瘤抑制剂的状态也影响IGF-1R信号转导系统的活性。在基态，由p53通过间接机制抑制IGF-1R的基础或组成型转录。Akt的激活提高了mdm2的磷酸化，该磷酸化的mdm2结合p53肿瘤抑制子并促进其降解(Mayo等人，2002,TIBS27:462-67),从而导致增加的IGF-1R表达。当通过突变使p53失活时观察到相似的结果。当在Saos-2(人骨肉瘤细胞系)和RD(横纹肌肉瘤细胞系)中短暂表达时,野生型p53能够抑制共转染的IGF-1R启动子构建体的活性，而来源于肿瘤的p53的突变体形式不具有作用。有人提出增加的IGF-1R水平提高对编程性细胞死亡（该死亡与恶性肿瘤细胞中的p53的丢失相关）的抗性(Werner等人，2000,CellMolLifeSci57:932-42)。因此在一个实施方案中，本发明提供了在需要其的受试者中治疗癌症的方法，其包括给所述受试者施用有效量的此处描述的IGF-1R拮抗剂，其中所述癌症的特征在于具有减少的p53的表达或活性的细胞。
也已显示WT1(威尔姆氏肾肿瘤抑制子1蛋白)结合和抑制IGF-1R启动子。因此，在一个实施方案中，本发明提供了在需要该治疗的受试者中治疗癌症病症的方法，其包括给所述受试者施用有效量的此处描述的IGF-1R拮抗剂，其中所述癌症病症的特征在于减少的WT1的表达或活性。
已显示在确定的培养条件下，正常成纤维细胞的增殖需要IGF和基质生长因子（例如PDGF、EGF）的组合作用以增加Ras/Raf/Map激酶和促进细胞周期进入(G0至G1的转换)。来源于IGF-1R(-/-)小鼠的成纤维细胞不对单独的生长因子或大多数致癌基因（例如致癌性Ras）作出反应，所数生长因子或致癌基因激活Ras/Raf/Map激酶途径。因此，在一个实施方案中，本发明提供了治疗需要该治疗的受试者的方法，其包括给所述受试者施用此处描述的IGF-1R拮抗剂和靶向生长因子和/或生长因子受体的试剂例如生长因子受体酪氨酸激酶例如EGFR、HER-2、bcr-abl、VEGFR、Kit、raf、mTOR、CDK1/2、VEGFR2、PKCβ、Mek和/或KDR。靶向这些生长因子和/或受体的分子的实例包括panitumumab(Abgenix,Fremont,CA/Amgen,ThousandOaks,CA)、HERCEPTINTM(Genentech,SouthSanFrancisco,CA)、GLEEVECTM(Novartis,EastHanover,NJ)、IRESSATM(AstraZeneca,Wilmington,DE)、ERBITUXTM(ImClone,NewYork,NY)、AVASTINTM,(Genentech)、PTK787(Novartis)、SU11248(Pfizer,NewYork,NY)、TARCEVATM(OSIPharmaceuticals,Melville,NY)、43-9006(Bayer,WestHaven,CT)、CCI-779(Wyeth,Madison,NJ)、RAD001(Novartis)、BMS-387032(Bristol-MyersSquibb,NewYork,NY)、IMC-1C11(ImClone)、LY333531(EliLilly,Indianapolis,IN)、PD184352(Pfizer)、2C4(Genentech)和GW2016(GlaxoSmithKline,ResearchTrianglePark,NC)。
已由(Novak等人，2003,Insulin-LikeGrowthFactorsandHematologicalMalignanciesinInsulin-LikeGrowthFactors,LeRoith等人，ed.s,LandesBioscience)等人综述了IGF-1R在血液恶性肿瘤中的作用。通过例如IGF-1R单克隆抗体阻止培养中的转化细胞生长的能力证明IGF-1R在血液恶性肿瘤中的功能作用。已发现IGF-I增强新分离的人急性骨髓性白血病和急性成淋巴细胞性白血病胚细胞（acutelymphoblasticleukemiablast）的生长。关于T细胞恶性肿瘤，已显示IGF-I影响具有前T细胞表型的鼠类淋巴瘤细胞的生长，发现未成熟和成熟的原代人T谱系急性成淋巴细胞性白血病细胞表达大量的IGF-1R。因此，在一个实施方案中，本发明提供了在需要其的受试者中治疗血液恶性肿瘤的方法，其包括给所述受试者施用此处描述的IGF-1R的拮抗剂。在另一个实施方案中，所述恶性肿瘤是急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病或T细胞恶性肿瘤。
在另一个方面，本发明提供了鉴定更可能从使用本发明的组合物和/或方法的治疗中受益的受试者的方法。这些方法可使护理人员更好地对特定受试者的需要制定治疗方案和减少无效或反效果疗程的可能性。在一个实施方案中，本发明提供了确定受试者是否是使用此处描述的组合物或方法进行治疗的候选者的方法，所述方法包括确定所述受试者中的靶细胞类型是否表达IGF-1R，其中如果所述靶细胞类型表达IGF-1R，那么所述受试者是疗法的候选者。在另一个实施方案中，本发明包括确定每靶细胞中IGF-1R分子的近似平均数，其中每细胞102、103、104、105或106个IGF-1R表明受试者是疗法的候选者。可使用本领域已知的任何技术，例如通过用IGF-1R结合分子对包含所述靶细胞类型的细胞的样品进行染色，然后检测结合至样品的IGF-1R结合分子的量来确定每靶细胞中IGF-1R分子的近似平均数目，其中所检测的IGF-1R结合分子的量与样品中IGF-1R分子的平均数目成比例。在另一个实施方案中，所述方法包括将每靶细胞IGF-1R分子的近似平均数目与参照标准进行比较，其中如果每靶细胞IGF-1R分子的近似平均数目比参照标准大时，那么所述受试者更可能从使用本发明的组合物和/或方法的治疗中受益。在另一个实施方案中，所述靶细胞是癌细胞类型。在另一个实施方案中，所述靶细胞类型是结肠癌细胞类型、乳腺癌细胞类型、NSCLC细胞类型或白血病细胞类型。
在另一个实施方案中，通过检测靶细胞类型或靶细胞类型层（stratum）中的IGF-1和/或IGF-2来鉴定作为治疗的候选者的受试者。在另一个实施方案中，所述靶细胞类型是癌细胞类型。在另一个实施方案中，所述靶细胞类型是结肠癌细胞类型、乳腺癌细胞类型、NSCLC细胞类型或白血病细胞类型。
在另一个实施方案中，通过在靶细胞类型中检测IGF-1R介导的信号转导的活性鉴定作为治疗的候选者的受试者，其中靶细胞类型中的IGF-1R介导的信号转导表明所述受试者是治疗的候选者。可就IGF-1R依赖性变化而被监控的分子的实例显示于图10中，所述分子是例如PI3/Akt途径中的分子，例如IGF-1R、IRS接头（adapter）、Akt等。可就例如磷酸化状态例如磷酸化的增加对这些分子进行监控。已充分发展了识别这些蛋白标记的激活形式的磷酸特异性抗体（Phosphospecificantibody），并且已证明这些试剂对于实验系统中的免疫印迹检测是可靠的。
也可在例如美容疗法中、兽医疗法中使用本发明的组合物和/或方法以增加寿命、治疗生殖缺陷和治疗多种生长相关性病症。
抗原结合蛋白的治疗方法和施用
此处提供的某些方法包括给受试者施用结合IGF-1R的抗原结合蛋白，从而减少在特定病症中起作用的IGF-1诱导的生物学反应。在特定的实施方案中，本发明的方法包括例如通过给受试者施用或通过以离体的方法将内源IGF-1R与IGF-1R结合性抗原结合蛋白接触。
术语“治疗”包括减轻或预防病症的至少一种症状或其他方面或减轻疾病严重度等。对于构建可行的治疗剂，抗原结合蛋白不需要实现完全治愈或根除疾病的每一个症状或表现。正如在相关领域内所承认的，用作治疗剂的药物可减少给定的疾病状态的严重度，但不需要消除疾病的每一个表现而被当作有用的治疗剂。类似地，为了构建可行的预防药，预防性施用的疗法不必在预防病症的发病中完全有效。仅仅减轻疾病的影响（例如，通过减少其症状的数目或严重度，或通过增加另一种疗法的有效性，或通过产生另一种有益效果）或减少疾病将在受试者中发生或恶化的可能性就足够了。本发明的一个实施方案涉及方法，所述方法包括以足以诱导高于反映特定病症的严重度的指标的基线的持续的改善的量和时间给患者施用IGF-1R拮抗剂。
正如在相关领域内所理解的，以适合于适应症的方式给受试者施用包含本发明的分子的药物组合物。可通过任何合适的技术，包括但不限于胃肠外、局部途径或通过吸入施用药物组合物。如果进行注射，可通过关节内、静脉内、肌内、伤口内、腹膜内或皮下途径，通过推注或连续输注施用药物组合物。涉及在例如疾病或受伤的位置的局部施用，如透皮给药和从植入物的持续释放。通过吸入进行的递送包括，例如，鼻或口的吸入，喷雾器的使用，以气雾剂形式进行的拮抗剂的吸入等。其他选择包括滴眼剂；口服制剂，包括丸剂、糖浆剂、锭剂或嚼胶（chewinggum）；和局部制剂例如洗剂、凝胶剂、喷雾剂和软膏剂。
也涉及以离体方法使用抗原结合蛋白。例如，可将患者的血液或其他体液离体地与结合IGF-1R的抗原结合蛋白接触。可将抗原结合蛋白结合至合适的不溶性基质或固体支持材料。
有利地，以包含一种或多种额外的组分例如生理可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物形式施用抗原结合蛋白。任选地，所述组合物额外地包含一种或多种生理活性剂，例如第二IGF-1受体抑制性物质、抗血管生成物质、化疗物质、止痛物质等，此处提供了非排他性实例。在各种特定的实施方案中，所述组合物，除了IGF-1R结合性抗原结合蛋白外，还包含1、2、3、4、5或6种生理活性剂。
在一个实施方案中，药物组合物包含本发明的抗原结合蛋白和一种或多种物质，所述物质选自缓冲剂、抗氧化剂例如抗坏血酸、低分子量多肽（例如具有少于10个氨基酸的多肽）、蛋白、氨基酸、糖例如葡萄糖、蔗糖或糊精、螯合剂例如EDTA、谷胱甘肽、稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐或与同种的血清白蛋白混合的盐是合适的稀释剂的实例。根据合适的工业标准，也可加入防腐剂例如苯甲醇。可使用合适的赋形剂溶液（例如，蔗糖）作为稀释剂将所述组合物配制为冻干剂（lyophilizate）。合适的组分在使用的剂量和浓度上对接受者是无害的。可用于药物制剂的组分的其他实例示于Remington’sPharmaceuticalSciences,第16版(1980)和第20版(2000),MackPublishingCompany,Easton,PA。
由医生使用的试剂盒包括本发明的IGF-1受体抑制性物质和用于治疗此处描述的任何病症的标签或其他说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒包括一种或多种IGF-1R结合性抗原结合蛋白的无菌制剂，该制剂可以以上面公开的组合物的形式存在，且可存在于一个或多个药瓶中。
施用的剂量和频率可根据这些因素如给药途径、使用的特定抗原结合蛋白、被治疗的疾病的性质和严重度、所述疾病是急性的还是慢性的以及受试者的身材大小和一般身体状况而变化。可通过相关领域内例如在可包括剂量递增研究的临床试验中已知的方法确定合适的剂量。
可在例如一段时间内按一定间隔例如一次或多次地施用本发明的IGF-1受体抑制性物质。在特定的实施方案，在至少一个月或更长的时间例如1、2或3个月或甚至无限期的时期内施用抗原结合蛋白。为了治疗慢性病症，长期治疗通常是最有效的。然而，为了治疗急性病症，更短的时期例如1至6周的施用可以是足够的。一般地，施用抗原结合蛋白直至患者表现高于所选指标的基线水平的医疗相关程度的改善。
本发明的特定实施方案包括以从每天每Kg受试者体重大约1ng(“1ng/kg/天”)的抗原结合蛋白至大约10mg/kg/天，更优选地从大约500ng/kg/天至大约5mg/kg/天，最优选地从大约5μg/kg/天至大约2mg/kg/天的剂量给受试者施用抗原结合蛋白。在其他实施方案中，每周一次、每周每次或每周三次或多次给成人施用抗原结合蛋白以治疗IGF-1和/或IGF-2介导的疾病、病状或病症，例如此处公开的医学病症。如果进行注射，每成人剂量的抗原结合蛋白的有效量可在1-20mg/m2的范围内变动，优选地为大约5-12mg/m2。可选择地，可施用平台剂量（flatdose）；所述量可在5-100mg/剂的范围内变动。平台剂量的一个范围是每剂大约20-30mg。在本发明的一个实施方案中，通过注射重复施用25mg/剂的平台剂量。如果使用除了注射以外的施用途径，根据标准的医疗实践适当地调整剂量。治疗方案的一个实例包括在至少三周的时期内每周一至三次注射大约20-30mg的抗原结合蛋白的剂量，虽然更长时期的治疗可能是诱导想要的改善程度所必需的。对于儿科受试者（年龄4-17岁），一个示例性合适的方案包括皮下注射0.4mg/kg，至多25mg的抗原结合蛋白的最大剂量，每周给药2或3次。
此处提供的方法的特定实施方案包括每周一次或两次皮下注射从0.5mg至10mg，优选地从3至5mg的抗原结合蛋白。另一个实施方案涉及每周一次的3或更多mg的抗原结合蛋白的肺部给药（例如，通过喷雾器）。
此处提供的治疗方案的实例包括每周一次以1.5至3mg的剂量皮下注射抗原结合蛋白以治疗其中IGF-1R信号转导起作用的病症。此处提供了这些病症的实例，包括例如癌症、肢端肥大症和其他过度生长病症、糖尿病、肥胖症、黄斑变性和衰老。持续进行抗原结合蛋白每周一次的施用直至获得想要的结果，例如受试者的症状消退。当需要时可继续进行治疗，或可选择地，可施用维持剂量。
此处提供的治疗方案的其他实例包括皮下或静脉内施用每千克受试者体重1、3、5、6、7、8、9、10、11、12、15或20毫克（mg/kg）本发明的IGF-1R抑制剂的剂量。可一次将所述剂量给受试者施用，或以一定的间隔不止一次地例如每天一次、每周三次、每周两次、每周一次、每月三次、每月二次、每月一次、每二月一次、每三月一次、每六月一次或每年一次地给受试者施用。可在治疗过程中改变或变化治疗的持续时间和对剂量和/或治疗频率的任何改变、以满足受试者的特定需要。
在另一个实施方案中，以足以诱导至少一个指标的改善，优选地持续改善的量和时间施用抗原结合蛋白，所述指标反映被治疗的病症的严重度。可评估反映受试者的病症、疾病或病状的各种指标以确定治疗的量和时间是否充足。这些指标包括，例如，临床上承认的疾病严重度、症状或所述病症的表现的指标。在一个实施方案中，如果受试者在至少两个相隔2至4周的时期展示改善则所述改善被认为是持续的。一般由可基于征候(sign）、症状、活组织检查或其他检测结果作出该确定和也可使用发给受试者的问卷（例如经设计用于给定的疾病的生活质量调查表）的医生确定改善的程度。
提高的IGF-1和/或IGF-2水平与许多病症相关，所述病症包括例如癌症（例如，肺、前列腺、乳腺和结肠癌）和肢端肥大症以及其他过度生长病症(例如，体格高的儿童（constitutionallytallchildren）)。可筛查具有给定的病症的受试者以鉴定具有提高的IGF-1和/或IGF-2水平的个体，从而鉴定可从使用IGF-1R结合性抗原结合蛋白的治疗中获得最大益处的受试者。因此，此处提供的治疗任选地包括测量受试者的IGF-1和/或IGF-2水平的第一步骤。可给受试者施用抗原结合蛋白，在所述受试者中，IGF-1和/或IGF-2的水平被提高至高于正常水平。在一个实施方案中，本发明提供了治疗过度生长病症（例如，肢端肥大症）的方法，所述方法包括给需要其的受试者施用本发明的抗原结合蛋白和培维索孟。
可在使用抗原结合蛋白的治疗之前、期间和/或之后监控受试者的IGF-1和/或IGF-2水平以检测其水平的变化（如果有的话）。对于一些病症，提高的IGF-1和/或IGF-2水平的发生率可随这些因素如疾病的阶段或疾病的特定形式而变化。可使用已知的技术测量例如受试者血清中的IGF-1和/或IGF-2水平。可使用任何合适的技术例如ELISA测量血液样品中的IGF-1和/或IGF-2水平。
本发明的方法和组合物的特定实施方案包括使用抗原结合蛋白和一种或多种额外的IGF-1R拮抗剂，例如两种或更多种本发明的抗原结合蛋白或本发明的抗原结合蛋白和一种或多种其他IGF-1R拮抗剂。在其他实施方案中，单独地或与用于治疗患者所遭受的病症的其他药物一起施用抗原结合蛋白。这些药物的实例包括蛋白质和非蛋白质药物。当共施用多种治疗剂时，相应地调整剂量，如在相关领域内所承认的。“共施用”和组合疗法不限于同时施用，其还包括这样的治疗方案，在所述治疗方案中在包括给患者至少施用一种其他治疗剂的治疗过程中至少施用一次抗原结合蛋白。
可与抗原结合蛋白一起共施用的其他试剂的实例是根据被治疗的特定病症选择的其他抗原结合蛋白或治疗性多肽。可选择地，用于治疗上述特定病症中的一种的非蛋白质药物可与IGF-1R拮抗剂共施用。
组合疗法
在另一方面，本发明提供了用IGF-1R抑制性抗原结合蛋白和一种或多种其他疗法治疗受试者的方法。在一个实施方案中，这样的组合疗法通过例如攻击肿瘤的多个位置或分子靶获得协同或累加效应。可与本发明一起使用的组合疗法类型包括抑制或激活（适当时）单个疾病相关性途径中的多个节点、靶细胞中的多个途径和靶组织内（例如，肿瘤内）的多种细胞类型。例如，本发明的IGF-1R抑制剂可与抑制IGF-1、促进细胞编程性死亡、抑制血管发生或抑制巨噬细胞的疗法组合。在另一个实施方案中，当单独使用时不能引起治疗上想要的效果的靶向药物可用于例如使癌细胞致敏或提高其他药物的治疗效果。在另一个实施方案中，本发明的IGF-1R抑制剂与细胞毒性药物或诱导编程性细胞死亡的其他靶向药物一起使用。在另一个实施方案中，将IGF-1R抑制剂与抑制不同的靶（该靶参与细胞生存）（例如，PKB、mTOR)、不同的受体酪氨酸激酶(例如，ErbB1、ErbB2、c-Met、c-kit)或不同的细胞类型(例如,KDR抑制剂、c-fms)的一种或多种药物一起使用。在另一个实施方案中，向现有的用于特定病症的护理标准中加入本发明的IGF-1R抑制剂。治疗剂的实例包括，但不限于，吉西他滨、泰素、泰索帝和CPT-11。
在另一个实施方案中，组合治疗方法包括给受试者施用2、3、4、5、6或更多种此处描述的IGF-1R激动剂或拮抗剂。在另一个实施方案中，所述方法包括给受试者施用一起抑制或激活（直接或间接地）IGF-1R介导的信号转导的两种或更多种疗法。这些方法的实例包括使用两种或更多种IGF-1R抑制性抗原结合蛋白的组合、IGF-1R抑制性抗原结合蛋白和一种或多种其他IGF-1、IGF-2、和/或IGF-1R激动剂或拮抗剂(例如,IGF-1和/或IGF-2结合多肽、IGF-1R结合多肽、IGF-1和/或IGF-2衍生物、抗IGF-1和/或IGF-2抗体、抗IGF-1、IGF-2和/或IGF-1R的反义核酸或结合IGF-1、IGF-2和/或IGF-1R多肽或核酸的其他分子)的组合或IGF-1R抑制性抗原结合蛋白和一种或多种其他疗法（例如，手术、超声、放射疗法、化学疗法或使用其它抗癌剂的疗法），例如美国专利5,473,054(1995年12月5日颁布的)、6,051,593(2000年4月18日颁布的)、6,084,085(2000年7月4日颁布的)、6,506,763(2003年1月14日颁布的)、美国专利申请公开号03/0092631(2003年5月15日公布的)、03/0165502(2003年9月4日公布的)、03/0235582(2003年12月25日公布的)、04/0886503(2004年5月6日公布的)、05/0272637(2005年12月8日公布的)、PCT公开系列号WO99/60023(1999年11月25日公布的)、WO02/053596(2002年7月11日公布的)、WO02/072780(2002年9月19日公布的)、WO03/027246(2003年3月3日公布的)、WO03/020698(2003年3月13日公布的)、WO03/059951(2003年7月24日公布的)、WO03/100008(2003年12月4日公布的)、WO03/106621(2003年12月24日公布的)、WO04/071529(2004年8月26日公布的)、WO04/083248(2004年9月30日公布的)、WO04/087756(2004年10月14日公布的)、WO05/112969(2005年12月1日公布的)、Kull等人，1983,JBiolChem258:6561-66,Flier等人，1986,ProcNatlAcadSciUSA83:664-668,Conover等人，1987,JCellPhysiol133:560-66,Rohlik等人,1987,BiochemBiophysResComm149:276-81,Arteaga等人,1989,JClinicalInvestigation84:1418-23,Arteaga等人,1989,CancerRes49:6237-41,Gansler等人,1989,AmericanJPathol135:961-66,Gustafson等人,1990,JBiolChem265:18663-67,Steele-Perkins等人,1990,BiochemBiophysResComm171:1244-51,Cullen等人,1992,MolEndocrinol6:91-100,Soos等人,1992,JBiolChem267:12955-63,Xiong等人,1992,ProcNatlAcadSciUSA89:5356-60,Brunner等人,1993,EuroJCancer29A:562-69,Furlanetto等人,1993,CancerRes53:2522-26,Li等人,1993,BiochemBiophysResComm196:92-98,Kalebic等人,1994,CancerRes54:5531-34,Lahm等人,1994,IntlJCancer58:452-59,Zia等人,1996,JCellBiochemSupp24:269-75,Jansson等人,1997,JBiolChem272:8189-97,Scotlandi等人,1998,CancerRes58:4127-31,Logie等人,1999,Li等人,2000,CancerImmunolImmunotherapy49:243-52,JMolEndocrinol23:23-32,DeMeyts等人,2002,NatureReviews1:769-83,Hailey等人,2002,MolCancerTherapeutics1:1349-53,Maloney等人,2003,CancerResearch63:5073-83,Burtrum等人,2003,CancerResearch63:8912-21,和Karavitaki等人,2004,Hormones3:27-36,(各自在此以其全文引用作为参考)中描述的疗法，可将所述疗法用于本发明的方法和组合物。此外，一种或多种抗IGF-1R抗体或抗体衍生物可与一种或多种分子或其他疗法一起使用，其中所述其他分子和/或疗法不直接结合或影响IGF-1R、IGF-1或IGF-2，但其组合对于治疗或预防病症，例如癌症或过度生长病症（例如肢端肥大症）是有效的。在一个实施方案中，一种或多种分子和/或疗法治疗或预防在治疗过程中由一种或多种其他分子或疗法引起的病症，例如恶心、疲劳、秃发症、恶病质、失眠症等。在当使用分子和/或其他疗法的组合时的每一种情况下，可以任何顺序，在任何长度的有效时期内施用例如同时、连续或交替地施用个体分子和/或疗法。在一个实施方案中，治疗的方法包括在开始第二疗程前用一种分子或其他疗法完成第一疗程。第一疗程结束和第二疗程开始之间的时间长度可以是允许总的治疗过程是有效的任何时间长度例如数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或甚至数年。
在另一个实施方案中，所述方法包括施用一种或多种此处描述的IGF-1R拮抗剂和一种或多种其他疗法（例如，治疗性疗法或姑息疗法），例如抗癌疗法（例如手术、超声、放射疗法、化学疗法或使用其它抗癌剂的疗法）。当所述方法包括给受试者施用不止一种疗法时，要理解施用的顺序、时间安排、次数、浓度和体积只受到医疗要求和疗法的局限性限制，即可将两种疗法例如同时、连续、交替或按照任何其他的方案给受试者施用。可与此处描述的IGF-1R拮抗剂一起施用的试剂的实例包括，但不限于，嗜中性白细胞增强剂（neutrophil-boostingagent）、伊立替康（irinothecan）、SN-38、吉西他滨、herstatin或IGF-1R结合性herstatin衍生物(例如美国专利申请05/0272637中所描述的)、(Genentech,SouthSanFrancisco,CA)、(Genentech)、(Genentech)、(AstraZeneca,Wilmington,DE)、(AstraZeneca)、(Corixa,Seattle,WA)、(BiogenIdec,Cambridge,MA)、(ImcloneSystemsInc.,NewYork,NY)、(EliLillyandCo.,Indianapolis,IN)、(Pfizer,NewYork,NY)、(Novartis)、SU-11248(Pfizer)、BMS-354825(Bristol-MyersSquibb)、panitumumab(Abgenix,Fremont,CA/AmgenInc.,ThousandOaks,CA)和denosumab(AmgenInc.,ThousandOaks,CA)。
下列实施例，实际的和预期的（prophetic），都是为了举例说明本发明的特定实施方案或特征而提供的且不限定其范围。
实施例1:抗体的制备
本实施例演示了制备识别IGF-1受体的抗体的方法。IGF-1受体多肽可在通过常规方法产生单克隆抗体中用作免疫原。人们认识到，各种形式的多肽例如全长蛋白、其片段、其融合蛋白例如Fc融合蛋白、在细胞表面表达重组蛋白的细胞等可用作免疫原。
为概述这样的方法的实例，将在完全弗氏佐剂中乳化的IGF-1R免疫原以10-100μl范围内变动的量皮下注射入Lewis大鼠。3周后，用在不完全弗氏佐剂中乳化的额外免疫原加强免疫的动物，此后每3周加强一次。通过眼球后放血（retro-orbitalbleeding）或尾尖切除周期性地采集血液样品以进行点印迹测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）或125I-IGF-1或125I-IGF-2对表达IGF-1R的细胞的提取物的结合的抑制。在适合的抗体滴度检测之后，给阳性动物进行在盐水中配制的抗原的最后静脉内注射。3至4天后，杀死动物，获取脾细胞，并将其融合至鼠类骨髓瘤细胞系AG8653。将所得的杂交瘤细胞系涂板在多个微量滴定板的HAT选择培养基（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷）中以抑制非融合细胞、骨髓瘤杂交体和脾细胞杂交体的增殖。
就与IGF-1R的反应性筛选所产生的杂交瘤克隆。杂交瘤上清液的初步筛选使用部分纯化的125I-IGF-1受体的抗体捕获和结合。通过改进的抗体捕获法检测在该筛选方法中呈阳性的杂交瘤以检测正在产生阻断性抗体的杂交瘤细胞系。从而检测分泌能够抑制125I-IGF-1对表达IGF-1R的细胞的结合的单克隆抗体的杂交瘤。然后可将这些杂交瘤注射入裸小鼠的腹腔内以产生包含高浓度(>1mg/ml)的抗IGF-1R单克隆抗体的腹水。可通过硫酸铵沉淀，然后进行凝胶排阻层析和/或基于抗体对G蛋白的结合的亲和层析纯化所得单克隆抗体。
可使用类似的方法在转基因小鼠中产生人抗体。参见，例如，Chen等人,1993,lnternat.Immunol.5:647-56;Chen等人,1993,EMBOJ.12:821-30;Choi等人,1993,NatureGenetics4:117-23;Fishwild等人,1996,NatureBiotech.14:845-51;Harding等人,1995,AnnalsNewYorkAcad.Sci.;Lonberg等人,1994,Nature368:856-59;Lonberg,1994,HandbookExper.lPharmacol.113:49-101;Lonberg等人,1995,InternalRev.Immunol.13:65-93;Morrison,1994,Nature368:812-13;Neuberger,1996,NatureBiotech.14:826;Taylor等人,1992,Nuc.AcidsRes.20:6287-95;Taylor等人,1994,lnternat.Immunol.6:579-91;Tomizuka等人,1997,NatureGenetics16:133-43;Tomizuka等人,2000,Proc.Nat.Acad.Sci.USA97:722-27;Tuaillon等人,1993,Proc.Nat.Acad.Sci.USA90:3720-24;Tuaillon等人,1994,J.Immunol.152:2912-20;Russel等人,2000,InfectionandImmunityApril2000:1820-26;Gallo等人,2000,Eur.J.Immunol.30:534-40;Davis等人,1999,CancerMetastasisRev.18:421-25;Green,1999,J.Immunol.Methods231:11-23;Jakobovits,1998,AdvancedDrugDeliveryRev.31:33-42;Green等人,1998,J.Exp.Med.188:483-95;Jakobovits,1998,Exp.Opin.Invest.Drugs7:607-14;Tsuda等人,1997,Genomics42:413-21;Mendez等人,1997,NatureGenetics15:146-56;Jakobovits,1996,Weir’sHandbookofExperimentalImmunology,TheIntegratedImmuneSystem第IV卷,194.1-194.7;Mendez等人,1995,Genomics26:294-307;Jakobovits,1994,CurrentBiol.4:761-63;Arbones,1994,Immunity1:247-60;Green等人,1994,NatureGenetics7:13-21;Jakobovits等人,1993,Nature362:255-58;Jakobovits等人,1993,.Proc.Nat.Acad.Sci.USA90:2551-55.
实施例2：人IGF-1R(ECD)-C3-muIgG1的分离
本实施例提供了制备用于产生抗体的IGF-1R的可溶性片段的方法。
pDSRα:huIGF-1R(ECD)-C3-muIgG1Fc的克隆
引物2830-36:5’AGCAAGCTTCCACCATGAAGTCTGGCTCCGGAGGAGG3’SEQIDNO:256)2830-38:5’ATTTGTCGACTTCGTCCAGATGGATGAAGTTTTCAT3'，SEQIDNO：257)用于扩增人IGF-1R细胞外结构域（1-906)cDNA序列。引物包括起始密码子前的Kozak翻译起始序列(下划线标示的)、用于随后亚克隆的限制性位点和caspace-3位点（紧靠细胞外结构域C末端插入该位点）。在下列条件下在PerkinElmer2400(PerkinElmer,Torrance,CA)上进行PCR：1个循环：在95℃下进行2分钟；23个循环：在95℃下进行30秒，58.5℃下进行30秒和在72℃进行3分钟；以及1个循环：在72℃下进行10分钟。终反应条件为1Xpfu缓冲液(Stratagene,LaJolla,CA),200μMdNTPs,2μM各引物,5Upfu(Stratagene)和1ng模板DNA。按照厂商说明书使用ClontechNucleospinColumn(Clontech,PaloAlto,CA)纯化PCR产物，用HindIII和SalI(Roche,Indianapolis,IN)降解PCR产物并进行凝胶纯化。将人IGF-1R插入物连接入HindIII/SalI降解的pDSRα-muIgG1。通过DNA测序验证插入物的整合。由所得可读框(IGF-1R-C3-muFc)编码的蛋白的序列示于图10中。最终的表达载体，pDSRα:huIGF1R(ECD)-C3-muIgG1Fc,描述于表1中。
表1
pDSRα:huIGF1R(ECD)-C3-muIgG1Fc
质粒碱基对编码:
huIGF-1R(ECD)-C3-muIgG1Fc的表达
使用LT1脂转染剂(PanVeraCorp.,Madison,WI)将15微克的线性化表达载体pDSRα:huIGF1R(ECD)-C3-muIgG1Fc转染入AM-1/DCHOd-细胞，并在允许蛋白表达和分泌入细胞培养基的条件下培养细胞。在DHFR选择培养基(补充有10%透析的胎牛血清、1x青霉素-链霉素(Invitrogen)的Dulbecco改良Eagles培养基(Invitrogen))中进行10-14天后选择24个集落，通过western印迹法估量表达水平。为进行该测定法，向单孔中的汇合细胞（所述细胞培养在24孔板(Falcon)中）加入0.5ml无血清培养基。在48小时后回收条件化培养基。将进行western印迹分析的样品在10%的Tris-甘氨酸凝胶(Novex)中进行跑胶，然后使用小型电转移印迹槽（MiniTrans-Blotcell）(Biorad)将其吸印在0.45μm的硝酸纤维素膜(Invitrogen)上。用缀合辣根过氧化物酶(Pierce)的兔抗小鼠IgGFc抗体温育被印迹的膜。将表达最高水平的IGF-1R(ECD)-C3-muIgG1Fc的克隆在DHFR选择培养基中进行扩增，将2x107个细胞接种入50个滚瓶(Corning)中，各瓶装有250ml高葡萄糖DMEM(Invitrogen)、10%透析的FBS(Invitrogen)、1x谷氨酰胺(Invitrogen)、1x非必需氨基酸(Invitrogen)、1x丙酮酸钠(Invitrogen)。在给滚瓶加盖前向培养基中充入10%CO2/平衡气体，进行5秒钟。将滚瓶在37℃下在滚瓶架（rollerrack）上以0.75rpm旋转保持。
当细胞达到大约85-90%的汇合时(在培养大约5-6天后)，弃去培养基，用100mlPBS清洗细胞，然后加入200ml生产培养基(50%DMEM(Invitrogen)/50%F12(Invitrogen)、1x谷氨酰胺(Invitrogen)、1x非必需氨基酸(Invitrogen)、1x丙酮酸钠(Invitrogen)、1.5%DMSO(Sigma))。收获条件化培养基并以一周的间隔更换培养基。将获得的30升条件化培养基通过0.45μm醋酸纤维素过滤器(Corning,Acton,MA)过滤。
huIGF-1R(ECD)-C3-muIgG1Fc的纯化
使用缠绕式筒（spiral-woundcartridge）(分子量截断值=10kDa)浓缩从条件化培养基所得的过滤液，然后用3MKCl,1M甘氨酸,pH9.0以1:1稀释，使最终的盐浓度达到1.5MKCl,0.5M甘氨酸,pH9.0。将该样品用于重组A蛋白-琼脂糖柱(AmershamPharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)，所述柱子已在1.5MKCl、0.5M甘氨酸,pH9.0中平衡。用40倍柱体积的相同缓冲液洗涤柱子，然后用20倍柱体积的0.1M甘氨酸HCl,pH2.8进行洗脱。收集5mL级分并用1mL1MTris-HCl,pH7.5立即中和。通过SDS-PAGE鉴定包含huIGF1R(ECD)-C3-muIgGFc的级分，合并所述级分并对磷酸缓冲盐溶液透析。产量为2.4mg/L的条件化培养基。检测到的主要蛋白种类为成熟的α和β链以及鼠类Fc,基于其提高的和不均匀的分子量，其各自表现出被正确地糖基化。未加工的IGF-1R(ECD)以及糖基化但未被蛋白水解切割的IGF-1R(CED)也存在于制剂中。非还原条件下变成更高分子量的带表明二硫键连接α和β链。终产物的氨基末端的测序表明60%的蛋白在IGF-1R(ECD)的α和β链之间被正确加工，而40%仍保持未加工。
实施例3:人INSR(ECD)-muIgG1的分离
本实施例提供了克隆和表达人胰岛素受体的可溶性片段的方法。
pDSRα:huINSR(ECD)-muIgG1Fc的克隆
引物2830-40:
5’AGCAAGCTTCCACCATGGGCACCGGGGGCCGG3’SEQIDNO:259
(下划线标示HindIII位点)和2830-41:
5’ATTTGTCGACTTTTGCAATATTTGACGGGACGTCTAA3’SEQIDNO:260
(下划线标示SalI位点)用于扩增人INSR细胞外结构域(1-929)，所述INSR细胞外结构域来自编码B型INSR剪接变体的INSR亲本质粒(Ullrich等人,1985,Nature313:756-61;Ebina等人,1985,Cell40:747-58)。所述引物包括起始密码子前的Kozak翻译起始序列和用于随后亚克隆的限制性位点。在下列条件下在PerkinElmer2400上进行PCR：1个循环：在95°C下进行2分钟，32个循环：在95°C下进行30秒，在58.5°C下进行30秒，和在72°C下进行3分钟，和1个循环：在72°C下进行10分钟。终反应条件为1Xpfu缓冲液、200μMdNTP、2μM各引物、5Upfu(Stratagene)和10ng模板DNA。按照厂商说明书使用柱(BDBiosciencesClontech,PaloAlto,CA)纯化PCR产物，用HindIII和SalI(Roche)降解所述PCR产物，在连接入HindIII/SalI降解的pDSRα-muIgG1之前用凝胶对其进行纯化。通过DNA测序确认插入物的完整性。INSR-muFc的蛋白序列显示于图11中。最终的表达载体描述于表2中。
表2
质粒碱基对编号:
huINSR(ECD)-C3-muIgG1Fc的表达
使用FUGENETM6脂转染剂(RocheDiagnosticsCorp.,Indianapolis,IN)用15μm线性化的表达载体pDSRa:huINSR(ECD)-muIgG1Fc转染AM-1/DCHOd细胞，然后在允许蛋白表达和分泌入细胞培养基的条件下培养细胞。如上所述选择和分析集落。
huINSR(ECD)-C3-muIgG1Fc的纯化
使用缠绕式筒（spiral-woundcartridge）(分子量截断值=10kDa)浓缩包含huINSR(ECD)-muIgGFc的过滤的条件化培养基17倍，然后用3MKCl,1M甘氨酸,pH9.0以1:1稀释，使最终的盐浓度达到1.5MKCl,0.5M甘氨酸,pH9.0。将该样品用于已在1.5MKCl,0.5M甘氨酸,pH9.0中平衡的重组A蛋-琼脂糖柱(Pharmacia)。用40倍柱体积的相同缓冲液洗涤柱子，然后用20倍柱体积的0.1M甘氨酸HCl,pH2.8进行洗脱。收集5mL级分并用1mL1MTris-HCl,pH7.5立即中和。通过SDS-PAGE鉴定包含huINSR(ECD)-C3-muIgGFc的级分，合并所述级分并对磷酸缓冲盐溶液透析。产量为0.9mg/L的条件化培养基。主要蛋白种类为成熟的α和β链以及鼠类Fc。基于其提高的和不均一的分子量，这些种类都表现出被正确地糖基化。未加工的INSR(ECD)以及被糖基化但未被蛋白水解切割的INSR(CED)也存在于制剂中。在非还原条件下变成更高分子量的带表明二硫键连接α和β链。终产物的氨基末端的测序表明87%的蛋白在INSR(ECD)的α和β链之间被正确加工，而13%仍保持未被加工。
实施例3:抗IGF-1R噬菌体Fab的初步筛选
本实施例提供了鉴定抗IGF-1R抗体的方法。
获得使用来自四个健康供体的外周血淋巴细胞和来自患有胃癌的一个患者的脾淋巴细胞构建的TargetQuestQFab文库(“TQ文库”;TargetQuest,Maastricht,theNetherlands)。所述文库的多样性为3.7x1010个克隆，包含3x109个重链。已公开了所述文库的来源、筛选方法和特征(deHaard等人,1999,JBiolChem274:18218-30)。用PBS洗涤未包被的Dynabead(200μl)M-450(目录号140.02,Dynal,LakeSuccess,NY)3次，将其重悬浮于200μlIGF1R(ECD)-C3-mFc中，产生PBS中的0.5μM的浓度，并在4℃下在振荡器上温育过液。用1ml在PBS(2%MPBS)中配制的2%脱脂奶粉(M)洗涤IGF-1R(ECD)-C3-mFc包被的小珠3次，然后用1ml2%的MPBS在室温下封闭1小时。平行地，通过与250μl8%MPBS在室温下混合30分钟至1小时预封闭750μl的TQ文库(4x1012pfu)。将500μl封闭的小珠转移入另一个微量离心管中，并在磁力分离器上与封闭溶液分离。将预封闭的噬菌体混合物加入至封闭的小珠并在室温下在转动器上温育90分钟。将结合小珠的噬菌体与未结合的噬菌体分开，然后用1ml2%MPBS/0.1%Tween20洗涤6次，用1mlPBS/0.1%Tween20洗涤6次，用PBS洗涤2次，在不同的洗涤溶液之间更换管。用1ml0.1MTEA(pH11)洗脱结合的噬菌10分钟，然后立即与小珠分离并用0.5ml1MTris.HCl中和。将洗脱的噬菌体混合物与4ml2xYT液体培养基(10g酵母提取液,16g细菌培养用胰蛋白胨,每升水5gNaCl)和5mlTG1细菌培养物(O.D.590大约为0.5)在50ml锥形管中混合。在37°C下在培养箱中温育感染混合物30分钟，然后在3500rpm下离心20分钟。将细胞沉淀重悬浮于1500μl2xYT-CG液体培养基中，并将300μl涂布在5个2xYT-CG(含有100μg/ml羧苄青霉素和2%的葡萄糖的2xYT液体培养基)板的各板上。在30°C下温育20小时后，向各板加入4ml2xYT-AG，然后用细胞刮棒从板上回收所述细胞。重复该步骤3次。将少部分回收的细胞用于噬菌体拯救(参见下面)。在3500rpm下离心剩下的细胞悬浮液20分钟。将细胞沉淀悬浮入大致为沉淀体积一半的量的50%的甘油中并在-80℃下贮存。
为了拯救噬菌体，使用涂板扩增的细胞悬浮液接种40ml2xYT-CG直至达到大约0.05的OD590。将培养物在37°C下在振荡器上温育至OD5900.5。用M.O.I.20的M13KO7辅助噬菌体(GIBCOBRL,Gaithersburg,MD,目录号18311-019,1.1x1011pfu/ml)感染对数期培养物，然后在37°C下温育30分钟。在4000rpm下离心被感染的细胞20分钟。将细胞沉淀重悬浮于200ml2xYT-CK(100μg/ml羧苄青霉素和40μg/ml卡那霉素)并转移至两个250ml培养瓶中，然后在30℃下以270rpm振荡温育20小时。在4000rpm下离心过夜培养物20分钟以除去细胞碎片。重复离心以确保细胞碎片的去除。向上清液中加入大约1/5体积的PEG溶液(20%PEG8000,2.5MNaCl)以沉淀噬菌体颗粒。将混合物在冰上温育至少1小时，然后在4000rpm下离心20分钟以收集沉淀的噬菌体颗粒。将噬菌体沉淀重悬浮入1mlPBS中，然后转移至微量离心管。将噬菌体悬浮液保留在冰上进行1小时以允许噬菌体颗粒的完全悬浮，然后通过在14,000rpm下离心2分钟以除去残留的细胞碎片来使所述悬浮液澄清。重复噬菌体沉淀步骤。在澄清后，将最终的噬菌体沉淀悬浮入PBS。所述拯救的噬菌体悬浮物用于下一轮选择。
进行4轮选择，所述选择包括各种标准结合参数的改变。第二轮选择与第一轮选择相同。在第三和第四轮中引入输入的噬菌体数目和洗脱试剂的变化。对于第三轮选择，选择5x1011pfu的噬菌体并用1μMIGF-1(目录号I3769,Sigma,St.Louis,MO)或用1μM浓度的嵌合αIR3-huFc抗体洗脱结合的噬菌体以产生两个第三轮的库TQ4-3IS和TQ4-3CA。在来自两个第三轮的库的拯救噬菌体库上进行第四轮选择。使用小鼠IgGFc包被的(DynalBiotech,Oslo,Norway)的两轮负选择用于在实际的IGF-1R选择之前除去小鼠Fc结合剂。负选择的温育时间各为30分钟。分别选择3.78x1011pfu的TQ4-3IS库和3.75x1012pfu的TQ4-3CA库。用1μMIGF-2(目录号I2526,Sigma,St.Louis,MO)洗脱结合噬菌体以产生两个第4轮库TQ4-4ISI2和TQ4-4CAI2。在各洗脱步骤中确定大约96-192个噬菌体DNA插入物的序列。
在一些情况下，进行第二筛选。按照厂商说明书(Qiagen,Valencia,CA)使用DNAMaxiprep试剂盒制备总TQ文库的噬菌粒DNA混合物和在几轮抗IGF-1R的选择后扩增的选择的噬菌体。用AscI和EcoRI(NewEnglandBiolab,Beverly,MA)降解所有四个DNA制剂。在制备级0.5%的琼脂糖凝胶上分离所得的两个AscI/EcoRI片段。从IGF-1R选择的噬菌体凝胶纯化包含重链的2.1kb片段。从总TQ文库DNA凝胶纯化包含轻链和pCES1载体部分的3.9kb片段。以3:1的比例将2.1kb片段连接至来自TQ文库的DNA样品的3.9kb的片段。沉淀连接的DNA并通过电穿孔将其用于转化TG1细胞。所得轻链改组的第二文库的文库大小为8.8x108。在对96个随机挑选的克隆测序后，获得76个独特的轻链序列，表明改组轻链的尝试是成功的。
用于筛选轻链改组文库的结合、洗涤和洗脱条件基本上与对于初步筛选所描述的相同。然而，进行了几个变化以增加对具有更高亲和力的IGF-1R结合剂（特别是具有显著更低的解离速率的IGF-1R结合剂）的扩增的选择压力。这些参数是：输入噬菌体的更多数目(2-2.7x1013pfu)、更小的小珠体积(100μl用于第1轮,50μl用于第2轮和25μl用于第3轮)和长达20小时的长特异性洗脱时间。第1轮(RD1)的洗脱缓冲液是0.1MTEA，RD2的是在0.4%的MPBS中配制的1μMIGF-1，RD3的是在0.4%的MPBS中配制的1μMIGF-1或IGF-2。在RD2和RD3中，弃去在15分钟或2小时洗脱的结合剂。继续洗脱并在8-10小时后和在20小时后再次收集洗脱的噬菌体。
噬菌体Fab的ELISA筛选
在96孔2ml深孔板中，用20μl单个克隆的过夜培养物接种480μl/孔2xYT-CG的液体培养基，然后在37℃、300rpm下温育3小时。向各孔中加入50μl1:3稀释的M13KO7辅助噬菌体以感染细胞。将板在不振荡的情况下在37℃下温育30分钟，然后在150rpm下再轻微地振荡30分钟。将板在3600rpm下离心20分钟以沉淀受感染的细胞。将各孔中的细胞沉淀悬浮于480μl的2xYT-CK(包含100μg/ml羧苄青霉素和40μg/ml卡那霉素的2xYT液体培养基)中，并在30℃下温育过夜，进行大约20小时。通过在3600rpm下离心20分钟分离细胞碎片。将拯救的噬菌体上清液用于噬菌体ELISA以检查个体克隆的IGF-1R特异性、INSR交叉反应性或小鼠Fc结合。
分别用100μl/孔在PBS中配制的5μg/mlIGF-1R-C3-mFc、5μg/mlINSR-mFc或2μg/ml小鼠IgG1(目录号010-0103,Rockland,Gilbertsville,PA)包被三组NuncMaxiSorbImmunoplate，在4℃下过夜。用300μl/孔的PBS洗涤包被的板3次。在室温下用300μl/孔2%MPBS封闭洗涤的板1小时。同时，通过将170μl拯救的噬菌体与170μl4%MPBS混合来预封闭个体克隆的拯救的噬菌体。用300μl/孔TBST(TBS:10mMTris-HCl,pH7.5,1mMEDTA,150mMNaCl;Tween-20.0.1%)洗涤封闭的板5次。将100μl/孔的预封闭的噬菌体稀释液分配至各组包被的板，将所述板在室温下在架子上温育90分钟。用300μl/孔TBST洗涤板5次。分配100μl/孔的在2%MPBS中配制的抗M13-HRP(1:3000稀释度,目录号27-9421-01,AmershamPharmaciaBiotech)，然后将板置于架子上于室温下温育1小时。用300μl/孔TBST洗涤板5次。加入100μl/孔的底物1-StepTMABTS(PierceBiotechnology,Rockford,IL,目录号37615)。将板温育1小时。测量OD405以进行信号检测。
噬菌体展示的抗体基本上不展示与胰岛素受体和鼠类Fc结构域的交叉反应性。因此在IGF-1RELISA中观察到的信号对于IGF-1R细胞外结构域是特异性的。来自关于4个噬菌体展示抗体的相似测定的结果显示于图14。
对IGF-1R阳性、INSR和muIgG1阴性克隆的DNA插入物进行测序。鉴定了52个独特的Fab序列，所述序列具有下列轻链和重链可变结构域序列的组合：L1H1,L2H2,L3H3,L4H4,L5H5,L6H6,L7H7,L8H8,L9H9,L10H10,L11H11,L12H12,L13H13,L14H14,L15H15,L16H16,L17H17,L18H18,L19H19,L20H20,L21H21,L22H22,L23H23,L24H24,L25H25,L26H26,L27H27,L28H28,L29H29,L30H30,L31H31,L32H32,L33H33,L34H34,L35H35,L36H36,L37H37,L38H38,L39H39,L40H40,L41H41,L42H42,L43H43,L44H44,L45H45,L46H46,L47H47,L48H48,L49H49,L50H50,L51H51和L52H52，其中“Lx”表示轻链可变结构域编号“x”，而“Hx”表示重链可变结构域编号“x”。图1提供了这些轻链和重链可变结构域的各结构域的多核苷酸序列。图2和3提供了对应的氨基酸序列。
实施例4:VH和VL至IgG1表达载体的亚克隆
本实施例提供了将之前鉴定的可变结构域序列亚克隆IgG1表达载体的方法。
pDSRα20和pDSRα20:hIgG1CH的构建
pDSRα20:hIgG1CH表达载体(WO90/14363)是pDSR19:hIgG1CH的衍生物(参见2002年4月5日提交的美国临时专利申请60/370,407,“HumanAnti-OPGLNeutralizingAntibodiesAsSelectiveOPGLPathwayInhibitors,”此处以其全文在此引用作为参考)。pDSRα19:hIgG1CH质粒编码大鼠可变区/人恒定区IgG1(rVh/hCh1)。通过以XbaI和BsmBI结尾的大鼠抗体可变区PCR产物、人IgG1恒定区(CH1，铰链区,CH2和CH3结构域)（其通过SalI切割和凝胶分离来自线性质粒pDSRα19:hIgG1CH(HindIII和BsmBI末端)的BsmBI和SalI片段产生）和具有XbaI和SalI末端的线性化pDSRα19的三片段连接构建所述质粒。通过定向诱变将pDSRα19中的核苷酸2563从鸟嘌呤核苷改变成腺嘌呤核苷来产生pDSRα20。重链表达载体pDSRα20:hIgG1CH大鼠可变区/人恒定区IgG1(rVh/hCh1)具有6163个碱基对且包含表3中描述的7个功能区。
表3
质粒碱基对编号:
通过用限制性内切酶XbaI和BsmBI降解pDSR20:大鼠可变区/人恒定区IgG1质粒以除去大鼠可变区来制备线性质粒pDSRα20:hIgG1CH，并使用QIAquickGelExtraction试剂盒进行纯化。使用包含1.0kbp人IgG1恒定区结构域的线性质粒pDSRα20:hIgG1CH接受抗IGF-1R可变重链编码序列。
抗IGF-1RIgG1重链表达克隆的构建
用互补寡核苷酸引物从噬菌粒DNA扩增编码重链的抗IGF-1R可变区的序列。设计用于聚合酶链式反应的引物以将HindIII位点、XbaI位点、Kozak序列(CCACC)和信号序列(翻译的肽为MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC;SEQIDNO:263)整合在所述可变区的5’末端，同时将BsmBI位点加入至PCR产物的3’末端。用XbaI和BsmBI降解PCR产物，然后将其克隆入包含人IgG1恒定区的XbaI-BsmBI线性pDSRα20:hIgG1CH表达载体（图13）。最终的表达载体包含表4中描述的7个功能区域。
表4
质粒碱基对编号:
抗IGF-1RIgG1可变链表达克隆的构建。
在抗IGF-1R噬菌体中编码的轻链是κ或λ类型。使用两种方法中的一种克隆其。设计互补引物以将HindIII位点、XbaI位点、Kozak序列(CCACC)和信号序列(翻译的肽是MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC,SEQIDNO:264)加至编码区的5’末端。将这些具有无错误的编码区的链克隆为全长产物。将所述全长轻链以XbaI和SalI片段克隆入表达载体pDSRα20。最终的表达载体包含表5中描述的7个功能区。
表5
质粒碱基对编号:
当与天然的人恒定区序列相比较时，一些κ克隆在其恒定区中具有错误。为了消除这些错误，用可将XbaI位点导入5’末端和将BsmBI位点导入3’末端的引物扩增κ可变区。然后将该片段与具有可相容的5’末端上的BsmBI和3’SalI末端的人κ恒定区（图13）一起连接入具有XbaI和SalI末端的pDSRα20。
实施例5:抗体的瞬时表达
本实施例提供了瞬时表达抗IGF-1R抗体的方法。
在适应无血清悬浮的293T细胞中瞬时表达所述抗体。以250mL培养物的形式进行所有转染。简而言之，在4℃、2,500RPM下离心1.25x108个细胞(5.0x105个细胞/mLx250mL)10分钟以除去条件化培养基。将细胞重悬浮于无血清DMEM并在4℃、2,500RPM下再次离心10分钟。在抽吸洗涤溶液后，将细胞重悬浮于50mL旋转玻瓶培养物中的生长培养基[DMEM/F12(3:1)+1x胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂+1XPenStrepGlut+2mML-谷氨酰胺+20mMHEPES+0.01%PluronicF68]中。将旋转玻瓶培养物保持在以125RPM旋转的磁力搅拌板上，所述搅拌板置于保持在37℃和5%CO2下的潮湿培养箱中。将所述质粒DNA与转染剂在50mL锥形管中温育。以5%的终培养体积在无血清DMEM中配制DNA-转染剂复合物。首先将每毫升培养物1微克质粒DNA加入无血清DMEM，然后加入1μlX-TremeGeneRO-1539/mL培养物。将所述混合物在室温下温育大约30分钟，然后再将其加至旋转波瓶中的细胞中。进行转染/表达7天，之后通过在4℃、4,000RPM下离心60分钟收获条件化培养基。
如果初步转染不能产生所需要的100μg纯化的抗体，在滚瓶中再表达这些克隆。这些转染使用培养和保持在补充有5%FBS+1x非必需氨基酸+1xPenStrepGlut+1x丙酮酸钠的DMEM中的293T贴壁细胞。近似地，将4-5x107个293T细胞播种在850cm2的滚瓶中过夜。然后在第二天使用FUGENETM6转染剂转染之前播种的细胞。在大约6.75mL无血清DMEM中制备DNA-转染剂混合物。首先加入675μlFUGENETM6转染剂，然后加入112.5μg质粒DNA。在室温下温育所述混合物30分钟。然后将整个混合物加入至滚瓶。用5%CO2气体混合物充注滚瓶，盖紧盖，然后将其放在在以0.35RPM旋转的滚转机架上，置于37℃的培养箱中。在用100mLDMEM+1X胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂+1XPenStrepGlu+1X非必需氨基酸+1X丙酮酸钠更换所述培养基前进行转染24小时。一般地，以48小时的间隔从各滚瓶获得2-3次收获物(100ml)。将收获的无血清条件化培养基混合在一起，然后在4℃以4,000RPM离心30分钟。
实施例6:抗IGF-1R抗体的小规模纯化
本实施例提供了在小规模上纯化抗IGF-1R抗体的方法。
将条件化培养基通过0.45μm醋酸纤维薄膜过滤器过滤，然后使用Vivaflow20050K切线流膜(Vivascience,Goettingen,Germany)将其浓缩大约8倍。用磷酸缓冲盐溶液(2.7mM氯化钾、138mM氯化钠、1.5mM磷酸钾和8.1mM磷酸钠,pH7.4)(PBS)洗涤rProteinASEPHAROSETMFastFlow树脂(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)4次，然后直接用于浓缩的介质。使用的树脂的量基于通过ELISA确定的抗体浓度，其中每5μg抗体使用1μl树脂。在温和搅拌下在4℃下温育所述培养基过夜。在4℃下以500g离心树脂10分钟。将上清液作为未结合的级分轻轻倒出。在室温下，在温和的搅拌下，用PBS洗涤树脂4次，每次进行1分钟，每一次通过在4℃下以500g离心树脂10分钟来收集树脂。通过在室温下用1.5倍体积的0.1M甘氨酸pH3.0温育树脂10分钟来洗脱抗体。在4℃下以500g离心树脂10分钟并将上清液作为洗脱的抗体轻轻倒出。重复上述步骤进行总共三次洗脱；每一次用0.04倍体积的1.0Mtris-HCl,pH9.2中和洗脱的材料。将样品通过0.2μm醋酸纤维素薄膜过滤器进行过滤。按照提供的说明书使用人IgG(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)作为标准通过Bradford法使用Bio-RadProteinAssay(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)确定蛋白的浓度。使用用考马斯亮蓝染色的4-20%的tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)将样品与人IgG1,K标准(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)进行比较。在这些制剂中没有看到污染性蛋白。
实施例7:稳定的表达抗体的CHO克隆的分离
本实施例提供了用于分离稳定的表达抗IGF-1R抗体的CHO细胞系的方法。
通过用pDSRα20重链和轻链IgG1表达构建体共转染AM1-DCHO细胞(美国专利No.6,210,924,此处以其全文引用)获得TQ11C、TQ25、TQ58和TQ59IgG1的稳定表达。按照厂商说明书使用LF2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)进行质粒转染。简而言之，在转染前24小时，将4x106个AM1-DCHO细胞涂板在100mm直径FALCONTM塑料培养皿(BDFalcon,FranklinLakes,NJ)中的补充有5%胎牛血清、1x青霉素-链霉素和谷氨酰胺(Invitrogen)、非必需氨基酸(Invitrogen)、丙酮酸钠和HT(0.1mM次黄嘌呤钠、16nM胸苷;Invitrogen)的10mlDulbecco改良Eagle培养基(Invitrogen)中。使用PvuI(NewEnglandBiolabs)线性化大约15mg的各pDSRα21-轻链和重链质粒DNA并将其稀释在2ml(Invitrogen)中。将稀释的质粒与在2ml中稀释的75μlLIPOFECTAMINETM2000(LF2000;GIBCO/BRL)混合并将该混合物在室温下温育20分钟。第二天加入新配制的生长培养基。将细胞在完全生长培养基中培养48小时，然后以1:20和1:50的稀释度涂板在HT选择培养基中。转染后大约2周，使用无菌克隆盘（cloningdiscs）(RPI)将12-24个可见的集落挑入24孔培养板。通过western免疫印迹分析鉴定表达最高水平的TQ11C、TQ25、TQ58和TQ59IgG1的克隆。为进行该测定，向培养在24孔板(BDFalcon)中的单孔汇合细胞中加入0.5ml无血清培养基。24小时后回收条件化培养基，然后将10μl的CM与等体积的上样缓冲液混合以进行10%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺蛋白凝胶(Invitrogen)跑胶。将凝胶转移至0.45μm孔径大小的硝酸纤维素膜(Invitrogen),然后使用1:1000稀释度的山羊抗IgGFcImmunoPure抗体(PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL)和ECL作为检测剂进行western印迹分析。
实施例8:抗体的中等规模表达
本实施例提供了通过稳定的CHO细胞系表达抗IGF-1R抗体的方法。
将按照实施例7制备的CHO细胞系扩增至T-175组织培养瓶(Falcon)中以进行扩大的表达。将汇合的T175瓶(大约2-3x107个细胞)用于播种3-850cm2滚瓶(CorningLifeSciences,Acton,MA),且将3个汇合滚瓶(每滚瓶大约1-2x108个细胞)用于播种30个滚瓶，各滚瓶装有250ml的高葡萄糖DMEM(Invitrogen)、10%透析的FBS(Invitrogen)、1x谷氨酰胺(Invitrogen)、1x非必需氨基酸(Invitrogen)、1x丙酮酸钠(Invitrogen)。在滚瓶加盖前用10%CO2/平衡空气充注培养基5秒。将滚瓶在37℃下在滚瓶架上以0.75rpm旋转温育。
当细胞达到大约85-90%的汇合度时(培养大约5-6天)，弃去生长培养基，用100mlPBS洗涤细胞,然后加入200ml生产培养基(50%DMEM(Invitrogen)/50%F12(Invitrogen)、1x谷氨酰胺(Invitrogen)、1x非必需氨基酸(Invitrogen)、1x丙酮酸钠(Invitrogen)、1.5%DMSO(Sigma))。每7天收获条件化培养基，总共收获4次。
将条件化培养基通过0.45μm醋酸纤维素薄膜过滤器过滤，然后使用SartoriusSartoconSliceDisposable30K切线流膜(SartoriusAG,Goettingen,Germany)将其浓缩大约10倍。将浓缩的材料在4℃下用于10ml重组A蛋白琼脂糖柱，收集流出液（flowthrough）作为未结合的级分。用4倍柱体积的PBS洗涤柱子。用大约4倍柱体积的0.1M甘氨酸pH3.0洗涤结合的样品。收集洗脱峰，并用0.04倍体积的1.0Mtris-HCl,pH9.2进行中和。将洗脱物在4℃下对150倍体积的PBS透析过夜。将样品通过0.2μm醋酸纤维素薄膜过滤器过滤，然后通过使用14,000M-1的消光系数确定280nm处的吸光率来测量蛋白浓度。使用用考马斯亮蓝染料染色的4-20%tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶将样品与人IgG1,K标准(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri,USA)进行比较。按照提供的说明书使用PyrotellLimulusAmebocyteLysateAssay(AssociatesofCapeCod,Inc.,Falmouth,Ma)确定各抗体制剂中的内毒素水平。
实施例9:剂量反应竞争测定
本实施例提供了检测抗体阻断配体对IGF-1R的结合的能力的方法。
通过使用厂商(Igen,Inc.,Gaithersburg,MD)提供的方法，结合测定法可用于确定TQ11C、TQ25、TQ58和TQ59IgG1抗体是否可阻断配体对IGF-1R的结合。为了用钌标记IGF-1和IGF-2，将冻干的蛋白溶解在PBS中以产生1.0mg/ml溶液。以5:1(标记:蛋白)的摩尔比向蛋白中加入标记(来自Igen的ORI-TAG-NHS酯,Cat#110034)，所述标记来自DMSO中配制的5mg/ml的标记母液。在黑暗处在室温(20-22℃)下温育所述混合物1小时，然后用20μl2M甘氨酸在室温下处理10分钟。通过应用至在PBS中平衡的AmershamBiosciencesNAP-5柱(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)，将标记的蛋白与游离标记分离并收集0.33ml的级分。通过MicroBCAProteinAssay(PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL)确定级分的蛋白浓度。级分2和3包含大量的蛋白，将其混合。使用下式：IGF-1和IGF-2的钌三联吡啶化合物(Ru(bpy)3 2+)标记，估量整合的钌标记的量。
将山羊抗小鼠IgG包被的DynalM450顺磁小珠用作IGF-1R(ECD)-C3-muFc的固体支持相。通过用含有1xPBS、0.05%TWEENTM20(ICIAmericas,Inc.,WilmingtonDE)0.1%BSA、0.01%叠氮化钠的测定缓冲液洗涤3次制备用于受体装载的M450小珠。在25μl体积的测定缓冲液中以每1x106个M450小珠50ng受体的比例结合IGF-1R(ECD)-C3-muFc1小时。为产生剂量反应数据，以不断增加的浓度(10-11M至10-6M)加入抗体或未标记的IGF-1和IGF-2因子，同时加入1nMRu-IGF-1和2nMRu-IGF-2。最终的反应体积为100μl。在黑暗处在室温下温育2小时后，使用M8Analyzer(Igen)除去游离的钌标记的配体并确定结合至受体的配体的量。所述数据表示为在与过量未标记的生长IGF1或IGF-2竞争后剩下的总的结合配体减去背景的百分比。使用单组分平衡模型（singlecomponentequilibiriummodel），用GraphPadPrism软件(GraphPadSoftware,SanDiego,CA)产生竞争曲线。基本上所有(>98%)的结合与过量的未标记的生长因子竞争。结合分析中的阳性对照抗体是鼠类抗IGF-1R抗体αIR3(Calbiochem,SanDiego,CA)或MAB391(R&Dsystems,Minneapolis,MN)、24-57(Biocarta,SanDiego,CA)和1H7(SantaCruzBiotechnology,Inc.,SantaCruz,CA)。负对照抗体是抗CD20抗体。配体竞争数据显示于图15中。观察到的IGF-1和IGF-2结合反应的Ki和最大抑制值列于表6中。
表6
1抑制的Ki。
21μM抗体浓度的抑制的最大水平。
实施例10:SPA剂量反应竞争测定法
本实施例提供了用于估量抗体对胰岛素（INS）与胰岛素受体（INSR）的相互作用以及IGF-1和IGF-2对IGF-1R的相互作用的影响的闪烁亲近测定法(SPA)。
TQ11C,TQ25,TQ58和TQ59IgG1抗体的IGF-1R结合反应体系包含1xPBS、0.05%20(Mallinkrodt)、0.1%BSA(EMScience,Gibbstown,NJ)、50ngIGF-1R(ECD)-C3-muFc、500ugSPAPVT抗小鼠IgG荧光微球（fluoromicrospheres）(Amersham)和终浓度为0.64nM的125I-标记的IGF-1或IGF-2（获自Amersham）。总反应体积为100μl。除了其包含50ngINSR(ECD)-muFc和0.64nM125I-INS(Amersham)外，INSR结合反应体系是相同的。在结合反应体系的建立之前将受体在室温下装载至SPAPVT微球，进行1小时。为了产生剂量反应数据，以不断增加的浓度(10-11M至10-6M)加入抗体或未标记的生长因子，同时加入125I标记的生长因子。基本上所有的结合都与过量的未标记的生长因子竞争。由SPTPVT微球的随机γ刺激导致产生的不依赖于受体的背景低于输入的125Icpm的0.5%。所述数据表示为与过量的未标记的生长IGF1或IGF-2竞争后剩余的总的结合配体减去背景的百分比。使用单一组分平衡模型，用GraphPadPrism软件产生竞争曲线。
实施例11:抗体对IGF-1R的结合
本实施例提供了检测抗IGF-1R抗体对IGF-1R的结合的方法。
2000、传感器芯片CM5、表面活性剂P20、HBS-EP(10mMHEPES、0.15MNaCl、3.4mMEDTA、0.005%P20,pH7.4)、胺偶联试剂盒、10mM醋酸pH4.5和10mM甘氨酸pH1.5全部从BIACore,Inc.(Piscataway,NJ)购买。磷酸缓冲盐溶液(PBS,1X,无氯化钙、无氯化镁)购自Gibco。牛血清白蛋白(BSA,级分V,不含IgG)购自Sigma。重组G蛋白(“rProteinG”)购自PierceBiotechnology。
按照厂商说明书，使用10mMHEPES、0.15MNaCl、3.4mMEDTA、0.005%P20,pH7.4(HBS-EP缓冲液)的连续流动进行重组G蛋白和IGF-1R-C3-muFc至传感器芯片表面的固定。简而言之，通过注射60μl混合物激活传感器芯片表面上的羧基，所述混合物包含0.2MN-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和0.05MN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。通过以20和50μg/ml之间的浓度注射在10mM醋酸,pH4.5中稀释的重组A蛋白(Pierce)或IGF-1R-C3-mFc获得特异性表面。通过注射60μl1M乙醇胺使表面上的过量活性基团失活。对于G蛋白，表面，最终的固定水平是5,000-6,000共振单位（resonanceunit）(RU)，对于IGF-1R-mFc表面为大约7,800RU。也在IGF-1R-mFc传感器芯片上制备空白、偶联模拟物的参照表面。
如下进行IGF-1R-mFc和抗体之间相互作用的动力学分析。将抗体和阳性对照抗体(抗IR3-CDR-人-小鼠嵌合体)在PBS+0.005%P20+0.1mg/mlBSA中稀释，然后注射在G蛋白表面上以捕获抗体。将IGF-1R-mFc在PBS+0.005%P20+0.1mg/mlBSA中稀释（从500nM至3.9nM）,然后将各浓度注射在捕获的抗体表面上和注射在空白G蛋白表面上以进行本底扣除。在10分钟的解离后，通过注射10mM甘氨酸,pH1.5再生各表面。使用BIAEvaluation,v.3.2(BIACore,Inc.)进行所得感应(sensorgram)图的动力学分析。
通过将两种不同浓度(0.2nM和1nM)的抗体与在PBS+0.005%P-20+0.1mg/mlBSA中配制的各种浓度(0.01nM至50nM)的IGF-1R-mFc一起温育进行溶液亲和力分析。在室温下进行温育至少5个小时以允许样品达到平衡。然后将样品注射在固定的IGF-1R-mFc表面上。在样品注射后，通过注射25μl8mM甘氨酸,pH1.5再生所述表面。获得的结合信号与平衡时溶液中的游离抗体成比例。通过使用双曲线单位点同质结合模型（dual-curveone-sitehomogeneousbindingmodel）(KinExA软件v.2.3,SapidyneInstrumentsInc.,BoiseID)从竞争曲线的非线性回归分析获得解离平衡常数(KD)。数据示于表7中。
表7
实施例12:抗生物素蛋白-融合蛋白的表位作图
本实施例提供了确定被抗IGF-1R抗体结合的IGF-1R的表位的方法。
使用抗生物素蛋白-IGF-1R融合蛋白确定被抗体TQ11C、TQ25、TQ58和TQ59结合的IGF-1R的亚结构域。为表达各蛋白，将完整IGF-1R(ECD)的编码DNA序列克隆入表达载体pCep4-抗生物素蛋白-C中以使鸡抗生物素蛋白序列被连接至表达的IGF-1R蛋白的C末端。使用下列PCR引物从亲本IGF-1R质粒PCR扩增ECD编码序列(1-932):
2804-25
5’GCAAGCTTGGGAGAAATCTGCGGGCCAG3’SEQIDNO:265
和2826-68:
5’ATTGCGGCCGCTTCATATCCTGTTTTGGCCTG3’SEQIDNO:266
所述引物包括用于克隆入pCep4avidin-C的5’HindIII位点和3’NotI位点。抗生物素蛋白-人IGF-1R(ECD)融合蛋白的氨基酸序列显示于图12。用于表位作图的IGF-1R亚结构域构建体包含：L1(1-151)、CR(152-298)、L2(299-461)、FnIII-1(461-579)、FnIII-2/ID(580-798)、FnIII-3(799-901)、L1+CR+L2(1-461)和L1+CR(1-298)。在括号中提供了各表达质粒中的IGF-1R亚结构域的氨基酸座标（coordinate）。使用下列引物对从亲本IGF1RcDNA克隆PCR扩增各结构域的编码序列:
L1:
2804-25:(SEQIDNO:265)
2804-19:
5’ATTGCGGCCGCCCCACATTCCTTTGGGGGC3’SEQIDNO:267
CR:
2804-38:
5’AGCAAGCTTGGACCTGTGTCCAGGGACC3’SEQIDNO:268
2804-20:
5’ATTGCGGCCGCGCAAGGACCTTCACAAGGG3’SEQIDNO:269
L2:
2804-39:
5’AGCAAGCTTGCCGAAGGTCTGTGAGGAAG3’SEQIDNO:270
2804-23:
5’ATTGCGGCCGCACTTTCACAGGAGGCTCTC3’SEQIDNO:271
FnIII-1:
2808-08:
5’AGCAAGCTTGGACGTCCTGCATTTCACCTC3’SEQIDNO:272
2804-52:
5’ATTGCGGCCGCGGTGCGAATGTACAAGATCTC3’SEQIDNO:273
FnIII-2+ID:
2804-41:
5’AGCAAGCTTGAATGCTTCAGTTCCTTCCATTC3’SEQIDNO:274
2804-51:
5’ATTGCGGCCGCAGTCCTTGCAAAGACGAAGTTG3’SEQIDNO:275
FnIII-3:
2804-42:
5’AGCAAGCTTGATGCCCGCAGAAGGAGCAG3’SEQIDNO:276
2804-50:
5’ATTGCGGCCGCTTTAATGGCCACTCTGGTTTC3’SEQIDNO:277
L1+CR+L2:
2804-25:
5’AGCAAGCTTGGGAGAAATCTGCGGGCCAG3’SEQIDNO:278
2804-23(SEQIDNO:272)
L1+CR:
2804-25:AGCAAGCTTGGGAGAAATCTGCGGGCCAG(SEQIDNO:279)
2804-20(SEQIDNO:270)
引物包括用于克隆（如对于IGF-1R(ECD)所描述的）的HindIII和NotI位点。将IGF-1R亚结构域克隆入表达载体pCep4avidin-N以使鸡抗生物素蛋白序列(具有内源信号序列)连接至表达的IGF-1R蛋白的N末端。通过瞬时转染滚瓶培养物中的人293-EBNA细胞(Invitrogen)获得各抗生物素蛋白融合蛋白的表达。将所述细胞生长和保持在补充有5%FBS+1x非必需氨基酸+1xPenStrepGlut+1x丙酮酸钠的DMEM中。将大约4-5x107个293-EBNA细胞播种在850cm2滚瓶中过夜。然后在第二天通过使用FUGENETM6转染剂，用pCep4-抗生物素蛋白质粒DNA转染之前播种的细胞。在大约6.75mL无血清DMEM中制备DNA-转染剂混合物。首先加入675μlFUGENETM6转染剂，然后加入112.5μg质粒DNA。在室温下温育混合物30分钟。然后向滚瓶中加入整个混合物。用5%CO2气体混合物灌注滚瓶，盖紧盖子，然后将其放在以0.35RPM旋转的滚动架上，置于37℃的培养箱中。在用100mLDMEM+1X胰岛素-转铁蛋白-硒补充剂+1XPenStrepGlu+1X非必需氨基酸+1X丙酮酸钠更换培养基前进行转染24小时。以48小时的间隔进行条件化培养基的收获和用新配制的培养基进行更换（2-3轮）。将收获的无血清条件化培养基混合在一起并通过在4℃下以10,000xg离心30分钟来使其澄清。
使用基于定量FACS的方法确定各条件化培养基中的抗生物素蛋白-融合蛋白的浓度。通过在室温下与5μl(大约3.5x105)生物素包被的聚苯乙烯小珠(Spherotech,Inc.,Libertyville,IL)一起温育2小时来捕获200μl条件化培养基中的抗生物素蛋白融合蛋白。通过在包含0.5%BSA的PBS(BPBS)中进行三轮抗生物素蛋白包被的小珠的离心和重悬浮除去条件化培养基。用在1mlBPBS中配制的1μg/ml山羊FITC-标记的抗抗生物素蛋白抗体(VectorLabBurlingame,CA)对抗生物素蛋白-小珠进行染色。在半小时温育后，通过在1800rpm下离心5分钟收集抗体-小珠复合物，然后洗涤沉淀3次。用FACSCAN(BecktonDicksonBioscience,FranklinLakes,NJ)检测FITC荧光。使用用重组抗生物素蛋白产生的标准曲线将信号转化成蛋白质的质量。为进行表位作图，通过与合适量(1-20ml)的条件化培养基温育以每大约3.5x105个小珠50-100ng抗生物素蛋白-融合蛋白的量给生物素小珠加载。在1mlBPBS中充分洗涤加载的小珠并重悬浮其。对于所有实验，在加载融合蛋白之前用PBS中的10%的BSA封闭生物素-小珠。
方法1，单色测定法（OneColorAssay）:将用IGF-1R(ECD)和IGF-1R亚结构域融合蛋白装载的生物素包被的聚苯乙烯小珠与1mlBPBS中配制的1μg抗IGF-1R抗体混合。在室温下温育1小时后，加入4ml洗涤缓冲液并通过在750g下离心5分钟收集抗体-小珠复合物。通过在4mlBPBS中重悬浮来洗涤沉淀3次。通过用1mlBPBS中的0.5μg/ml藻红蛋白-(PE)标记的山羊抗人F(ab’)2(SouthernBiotechAssociates,Inc.,Birmingham,AL)处理来检测结合抗生物素蛋白-小珠复合物的抗体。发现受试抗体结合包含完整IGF-1RECD和L2结构域的抗生物素蛋白-融合蛋白。在本实验中未检测到对L1、CR或FnIII-1的结合。也观察到与L1结构域相对弱的反应。
方法2，两色测定法（Twocolorassay）:为同时监测抗IGF-1R单克隆抗体和结合至生物素-小珠的抗生物素蛋白-融合蛋白的量，将FITC标记的抗抗生物素蛋白抗体(1μg/ml)用于与0.5μg/mlPE-标记的山羊抗人IgG1的结合反应。如对于单色测定法的描述一样制备用于FACSCAN分析的小珠。
方法3，抗体竞争：为准备用荧光素进行标记，透析抗体或以1mg/ml的浓度重悬浮于PBS(pH8.5)中。以9.5:1(标记:蛋白)的摩尔比向蛋白中加入标记([6-荧光素-5-(和-6)-甲酰胺基]己酸,琥珀酰亚胺酯5(6)-SFX]混合异构体（来自MolecularProbe(Eugene,OR,Cat.No.F2181)），所述标记来自DMSO中配制的5mg/ml的标记母液。将混合物在黑暗处在4℃下温育过夜。通过在PBS中透析将标记的抗体与游离标记分离。获得的FITC/抗体比例在3至8的范围内变化。对于各竞争实验，建立包含50倍过量(10-50μg/ml)的未标记竞争抗体、存在于BPBS中的3.5x105个用抗生物素蛋白融合蛋白包被的生物素小珠的结合反应体系。在30分钟预温育后加入FITC标记的抗体(1μg/ml)。
从该点之后所述方法遵循单色法。
四种受试抗体中的每一种结合表8中所示的IGF-1RL2结构域。然而，在IGF-1RL2结构域中各抗体的精确氨基酸接触可以不同。
表8
抗体 L11 CR1 L21 FnIII-11 ECD1,2
TQ11C 无 无 有 无 有
TQ25 无 无 有 无 有
TQ58 有 无 有 无 有
TQ59 无 无 有 无 有
1使用包含所示的人IGF-1R区域的抗生物素蛋白-IGF-1R融合蛋白进行表位作图。
2ECD融合蛋白包含L1+CR+L2+FnIII-1+FnIII-2+ID+FnIII-3。
实施例13:抗体对细胞表面IGF-1R的结合
本实施例提供了用于检测抗IGF-1R抗体对细胞表面表达的IGF-1R的结合的方法。
使用Balb/C3T3成纤维细胞和MCF-7人乳腺癌细胞评估抗体TQ11C、TQ25、TQ58和TQ59结合细胞表面展示的人IGF-1R的能力，所述细胞经基因工程改造以每细胞大约3-4x105个分子的水平过表达所述人IGF-1R受体。基本上如Pietrzkowski等人,1992,CellGrowthDifferentiation3:199-205所述，使用逆转录病毒载体产生稳定地过表达人IGF-1R(每细胞大约3x105个受体)的Balb/C3T3细胞系。用pcDNA3.1表达载体(InvitrogenCorp.)转染过量产生huIGF-1R的MCF-7乳腺癌细胞。在使用抗IGF-1R单克隆抗体αIR3和PE标记的山羊抗鼠类IgG抗体(CaltagLaboratories,Burlingame,CA)通过FACS选择后，扩增表达高水平huIGF-1R(每细胞大约4x105个受体)的抗Zeocin细胞。重复选择和扩增的方法4次。
如下通过FACS监测IGF-1R受体抗体染色和受体表达：通过用过量的PBS（无Ca/Mg)洗涤2次，然后用5ml细胞离解液（CellDissociationBuffer）(Sigma)在室温下处理10分钟来从T175培养瓶(Corning)释放细胞。通过离心收集细胞，然后通过将其重悬浮于PBS，然后离心，进行两次洗涤。为进行一抗染色，向悬浮于100μlPBS和0.5%BSA(BPBS)中的106个细胞中加入1μg抗体并将所述细胞在4℃下温育1.5个小时。通过离心收集细胞并用BPBS洗涤2次以除去未结合的一抗。将细胞重悬浮于100μlBPBS中并在4℃下用1μgFITC标记的山羊抗人F(ab’)2(SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.,Birmingham,AL)温育30分钟。在洗涤除去未结合的FITC二抗后，将细胞重悬浮于1mlPBS+0.5%BSA中并用FACSCAN(BecktonDicksonBioscience,FranklinLakes,NJ)检测FITC细胞荧光。通过使用具有预先确定的IgG1结合能力的Quantum微珠(BangsLaboratories,Inc.,Fishers,IN)产生标准曲线来将荧光水平转化成绝对受体水平。用由厂商提供的QuickCalv2.1软件(VeritySoftwareHouse,Topsham,ME)进行数据换算。
对于各受试抗体，相对于亲本Balb/C3T3和MCF-7细胞，IGF-1R过表达者的抗IGF-1R抗体标记的峰荧光强度增加了10-20倍。这是对特异性结合IGF-1R的抗体的预测的结果。不用抗体或只用FITC标记的二抗处理的细胞的背景荧光不明显。
实施例14:IGF-1R的抑制
本实施例提供了检测抗IGF-1R抗体抑制IGF-1R的方法。
32DhuIGF-1R+IRS-1细胞的抑制
已证明共表达人IGF-1R受体（每细胞20K）和人IRS-1的鼠类32D细胞是检查分子组分IGF-1R信号转导的有效系统（Valentinis等人,1999,JBiolChem274:12423-30）。正常的32D细胞表达相对低水平的这两种基因产物的鼠类直向同源物。32D细胞通常需要IL3以进行生长和存活。如图16图框A中所示，IGF-1或IGF-2可替代32DhuIGF-1R+IRS-1细胞中的IL3。所述IGF-1剂量反应曲线的EC50是大约0.5nM,而IGF-2EC50(2.8nM)高大约6倍，反映了IGF-2对IGF-1R的更弱的亲和力。为了评估抗体TQ11C、TQ25、TQ58和TQ59阻断IGF-1或IGF-2刺激的能力，以每孔200μlRPMI(Gibco/BRL)中30,000个32DhuIGF-1R+IRS-1细胞播种96孔微量滴定板，所述RPMI包含5%胎牛血清(Gibco/BRL)和1x青霉素、链霉素、谷氨酰胺(Giboco/BRL)和浓度不断增加的抗体(10-12M至10-6M)或无抗体。在用抗体预温育1小时后，加入IGF-1(2nM)、IGF-2(8nM)或不加入任何物质。在抗体加入后27小时加入3H-胸苷(每孔1μCi)。在21小时后收获细胞，且确定各样品的3H胸苷至DNA的整合。以三次重复进行所述测定法。将抗CD20抗体用作负对照。抗体TQ11C、TQ25、TQ58和TQ59的各抗体能够完全阻断IGF-1和IGF-2介导的32D细胞的刺激。在加入的IGF-1和IGF-2不存在的情况下背景增殖的减少归因于血清IGF-1和IGF-2的抑制。使用GraphPadPRIZMTM软件分析结合数据。数据显示于图16中。
Balb/C3T3huIGF-1R细胞的抑制
IGF-1极大地刺激了3H胸苷被过表达(每细胞大约1x106个IGF1R)IGF-1R的小鼠胚胎成纤维细胞(Balb/C3T3或NIH3T3)的血清饥饿培养物的整合。Kato等人,1993,JBiolChem268:2655-61;Pietrzkowski等人,1992,CellGrowthDifferentiation3:199-205。在Balb/C3T3细胞系huIGF-1R过表达者中用IGF-1和IGF-2概括该现象。两种生长因子都刺激3H-胸苷的整合大约20倍。IGF-1剂量反应曲线的EC50大约为0.7nM,而IGF-2EC50(4.4nM)高7倍，表明IGF-2对IGF-1R的亲和力更弱。为评估给定的抗体阻断IGF-1或IGF-2的刺激的能力，以每孔200μlDMEM(Gibco/BRL)中10,000个细胞播种96孔微量滴定板，所述DMEM包含10%小牛血清(Gibco/BRL)和1x青霉素、链霉素、谷氨酰胺(Giboco/BRL)。过夜温育后，当细胞大约80%汇合时，在用200μlPBS洗涤一次后用100μl包含0.1%BSA的DMEM更换生长培养基。在血清饥饿后24小时以不断增加的浓度(10-12M至10-6M)加入抗体或不加入抗体。在用抗体预温育1小时后加入IGF-1(2nM)、IGF-2(8nM)和3H胸苷(每孔1μCi)。24小时后收获细胞，确定每个样品的3H胸苷至DNA的整合。以三次重复进行所述测定。如图17中所示，各受试抗体能够完全阻断IGF-1和IGF-2介导的Balb/C3T3细胞的刺激。抗CD20抗体用作负对照(图17中的“CD20”)。
对于其教导的所有内容和对于所有目的，此处引用的各参考资料以其全文引用作为参考。

Claims (38)

1.分离的抗IGF-1R抗体或分离的其抗原结合片段，其中所述抗体或片段包含轻链可变区和重链可变区，并且其中：
a.所述轻链可变区由SEQIDNO:102的氨基酸序列组成；且所述重链可变区由SEQIDNO:206的氨基酸序列组成；或者
b.所述轻链可变区包含：
i.SEQIDNO:102的残基23至35的CDR1序列；和
ii.SEQIDNO:102的残基51至57的CDR2序列；和
iii.SEQIDNO:102的残基92至100的CDR3序列；
且所述重链可变区包含：
i.SEQIDNO:206的残基31至35的CDR1序列；和
ii.SEQIDNO:206的残基50至66的CDR2序列；和
iii.SEQIDNO:206的残基99至108的CDR3序列。
2.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其还包含：
a.SEQIDNO:234的κ轻链恒定序列，
b.SEQIDNO:235的IgG1重链恒定序列，或
c.SEQIDNO:234的κ轻链恒定序列和SEQIDNO:235的IgG1重链恒定序列。
3.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，当与人IGF-1R结合时，其抑制IGF-1和IGF-2对所述人IGF-1R的结合。
4.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段在血清、IGF-1或IGF-2存在的情况下抑制癌细胞的生长高于80％。
5.权利要求4的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述癌细胞是MCF-7人乳腺癌细胞。
6.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段以高于其对于人胰岛素受体的选择性至少50倍的选择性结合人IGF-1R。
7.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段在体内抑制肿瘤的生长。
8.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段抑制IGF-1R介导的酪氨酸磷酸化。
9.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段特异性地结合非人灵长类或非灵长类哺乳动物的IGF-1R。
10.权利要求9的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述非人灵长类为食蟹猴或黑猩猩。
11.权利要求9的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述非灵长类哺乳动物为啮齿动物、猫或狗。
12.权利要求11的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述啮齿动物为小鼠、大鼠、仓鼠或豚鼠。
13.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段包括：
a.嵌合抗体；
b.单克隆抗体；
c.多克隆抗体；
d.重组抗体；
e.抗原结合抗体片段；
f.单链抗体；
g.双抗体；
h.三抗体；
i.四链抗体；
j.Fab片段；
k.F(ab')2片段；
l.结构域抗体；
m.IgD抗体；
n.IgE抗体；
o.IgM抗体；
p.IgG1抗体；
q.IgG2抗体；
r.IgG3抗体；
s.IgG4抗体；或
t.具有至少一个减少形成H链内二硫键的趋势的铰链区突变的IgG4抗体。
14.特异性地结合人IGF-1R的分离的抗体，其中所述分离的抗体的轻链包含SEQIDNO:102的可变区及SEQIDNO:234的κ轻链恒定序列，并且所述分离的抗体的重链包含SEQIDNO:206的重链可变区及SEQIDNO:235的IgG1重链恒定序列。
15.分离的多核苷酸，该多核苷酸由编码权利要求1的所述分离的抗体或抗原结合片段或者权利要求14的所述分离的抗体的轻链、重链或两者的序列组成。
16.包含权利要求15的所述分离的多核苷酸的质粒。
17.权利要求16的质粒，其中所述质粒是表达载体。
18.包含权利要求15的所述多核苷酸的分离的细胞。
19.权利要求18的分离的细胞，其中所述细胞的染色体包含所述多核苷酸。
20.权利要求18的分离的细胞，其中所述细胞是杂交瘤。
21.权利要求18的分离的细胞，其中表达载体包含所述多核苷酸。
22.权利要求18的分离的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
23.制备结合人IGF-1R的抗体或抗原结合片段的方法，其包括在允许其表达所述抗体或抗原结合片段的条件下培养权利要求18的所述分离的细胞。
24.包含权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段的药物组合物。
25.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段或权利要求24的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在受试者中治疗病症，其中所述病症可通过在所述受试者中减少IGF-1R的活性来治疗。
26.权利要求25的用途，其中所述受试者是人类。
27.权利要求25的用途，其中所述病症是多发性骨髓瘤、液体肿瘤、肝癌、胸腺疾病、T细胞介导的自身免疫疾病、内分泌紊乱、局部缺血或神经变性疾病。
28.权利要求27的用途，其中所述液体肿瘤选自急性淋巴细胞性白血病(ALL)和慢性髓细胞性白血病(CML)；其中所述肝癌选自肝细胞癌、胆管癌、血管肉瘤、肝胚细胞瘤；其中所述胸腺疾病选自胸腺瘤和甲状腺炎；其中所述T细胞介导的自身免疫疾病选自多发性硬化症、类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎、白塞病；其中所述内分泌病症选自II型糖尿病、甲状腺功能亢进、甲状腺功能减退、甲状腺炎、肾上腺皮质功能亢进和肾上腺皮质功能减退；其中所述局部缺血是心脏梗塞后局部缺血；或其中所述神经变性病症是阿耳茨海默氏病。
29.权利要求25的用途，其中所述病症选自肢端肥大症、膀胱癌、肾母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺增生症、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、子宫颈癌、滑膜肉瘤、与转移类癌瘤相关的腹泻、分泌肠道血管活性肽的肿瘤、巨人症、牛皮癣、动脉粥样硬化、血管的平滑肌再狭窄、不适当的微血管增殖、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、头和颈鳞状上皮细胞癌、口腔癌、口腔白斑、前列腺上皮内赘瘤、肛门癌、食管癌、胃癌、骨癌、转移癌、真性红细胞增多症、与氧化应激相关的良性状况、早产儿视网膜病、急性呼吸窘迫综合征、对乙酰氨基酚的过度剂量、支气管肺发育异常、囊性纤维化、肺纤维化和糖尿病性视网膜病。
30.权利要求25的用途，所述用途还包括给所述受试者施用第二疗法。
31.权利要求30的用途，其中在给所述受试者施用所述药物之前和/或与此同时和/或之后给所述受试者施用所述第二疗法。
32.权利要求30的用途，其中所述第二疗法包括放射疗法、手术或施用第二药物组合物。
33.权利要求32的用途，其中所述第二药物组合物包含药剂，所述药剂选自皮质类固醇、止吐药、盐酸昂丹西琼、盐酸格拉司琼、甲氧氯普胺(metroclopramide)、多潘立酮、氟派啶醇、赛克力嗪、劳拉西泮、丙氯拉嗪、地塞米松、左美丙嗪、托烷司琼、癌症疫苗、GM-CSF抑制剂、GM-CSFDNA疫苗、基于细胞的疫苗、重组病毒疫苗、热激蛋白(HSP)疫苗、同种异体肿瘤疫苗、自体肿瘤疫苗、止痛剂、布洛芬、萘普生、三水杨酸胆碱镁、盐酸羟考酮、抗血管生成剂、抗血管剂、贝伐单抗、抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体片段、抗TWEAK抗体、抗TWEAK受体抗体、可溶性TWEAK受体片段、AMG706、AMG386、抗增殖剂、法尼基蛋白转移酶抑制剂、αvβ3抑制剂、αvβ5抑制剂、p53抑制剂、Kit受体抑制剂、ret受体抑制剂、PDGFR抑制剂、生长激素分泌抑制剂、血管生成素抑制剂、肿瘤浸润巨噬细胞抑制剂、c-fms抑制剂、抗c-fms抗体、CSF-1抑制剂、抗CSF-1抗体、可溶性c-fms片段、培维索孟、吉西他滨、panitumumab、伊立替康和SN-38。
34.权利要求32的用途，其中所述第二药物组合物包含药剂，所述药剂为树突细胞疫苗。
35.权利要求30的用途，所述用途还包括给所述受试者施用第三疗法。
36.权利要求35的用途，其中所述病症是癌症，所述第二疗法包括施用panitumumab，且所述第三疗法包括施用吉西他滨。
37.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段或权利要求24的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在需要其的受试者中减少IGF-1R的活性。
38.权利要求1的分离的抗体或抗原结合片段或权利要求24的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在需要其的受试者中抑制IGF-1和/或IGF-2对IGF-1R的结合。
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