JP2019501961A - 食品、飲料、化粧料、及び医薬の組成物中のオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Abstract
Description
DNAシーケンシングによるDNA配列の獲得
DNAは、製品名「Quick−DNATM ユニバーサルキット」(ZymoResearch Europe社、フライブルク、ドイツ)などの市販のキットを使用して、対象の動物又は植物の体液又は組織から抽出される。製造業者の取扱説明書に従って、NextraXT DNAサンプル調製キット(Illumina社、サンディエゴ、米国)を使用して、シーケンシングのためのショットガンライブラリを生成させる。ゲノムアナライザーllx(Illumina社、サンディエゴ、米国)を用いて、対応する動物や植物の全ゲノムを配列決定する。112bpペアエンドシングルインデックスの実行において、ライブラリを配列決定する。適切に装備したGNU/Linuxのコンピューティングクラスタにおいて、スペードアセンブラ(Bankevich A et al. (2012) SPAdes: A New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-Cell Sequencing, J Comp Biol. 5: 455-77, doi:10.1089/cmb.2012.0021)又はMIRA(Chevreux B, Wetter T et al. Genome Sequence Assembly Using Trace Signals and Additional Sequence Information, in German Conference on Bioinformatics, 1999, 45-56.)を用いて、ペアエンドの読み取り結果をアセンブル(再構成)する。既知の機能を有するヒト遺伝子との相同体を同定するために、ヒトタンパク質配列を使用して、tblastnを用いて、連続配列(コンティグ)を検索する(E. Michael Gertz et al. Composition-Based Statistics and Translated Nucleotide Searches: Improving the TBLASTN Module of BLAST. BMC Biol. 2006, December 7; no.1 : 41, doi:10.1186/1741-7007-4-41.)。
特定のオリゴヌクレオチド分子の製造
対象の配列(SOI)、即ち、配列番号1〜18を含むオリゴヌクレオチドをいくつかの方法によって製造できる。
1.サーマルサイクラーを用いたポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、以前に記載された方法(Saiki RK et al. Enzymatic Amplification of Beta-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia. Science 1985, December 20. 230, no. 4732: 1350-54, doi:10.1 126/science.2999980.)に従って実施される。対象(SOI)の各配列の増幅のために、20から25の間の塩基長さを有し且つ常にグアニン又はシトシン塩基で終わるオリゴヌクレオチドプライマーを化学的に合成し、そして、SOIを含有する化学的に合成されたDNA(GenScript社、米国)を含む、ゲノムDNAのテンプレート(鋳型)、又は、プラスミドの1μgに、各プライマー100pmolを添加する。製造業者(OptiTag、RoboKlon社、ドイツ)の取扱説明書に従って、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して、サーマルサイクラー(DNA EngineTetrad2、Bio−Rad社、米国)において、35回の増幅サイクルを実施する。SOIのキロベースあたり、変性を98℃で30秒間実施し、プライマーアニーリングを55℃で25秒間実施し、プライマー伸長を72℃で1分間実施する。DNAサイズ標準(1kbp DNA−Ladder、Carl−Roth社 ドイツ)を有する1.0%アガロースゲル(CAS−Nr.9012−36−6)において、得られた生成物の分析試料(約2μL)を分析する。アガロースゲル(Roti−GelStain、Carl−Roth社、ドイツ)の染色後、SOIの予想されるサイズのオリゴヌクレオチドの存在が、トランスイルミネーター(ベンチトップUVトランスイルミネーター、UVP、米国)において確認される。SOI以外の非特異的バンドが検出された場合、アニーリング温度を変化させてPCRグレードのDMSO(CAS−Nr.67−68−5)などの増強剤を添加することによって、又は、バッファー組成物や利用されたテンプレートDNAの濃度を変化させることによって、PCRを繰り返して最適化する。SOIを増幅のみさせる高度に特異的なプロトコルを確立するに際して、使用されるオリゴヌクレオチド及びデオキシヌクレオチドの量を増加させること、及び、96ウェル又は384ウェルのPCRプレート(twin.tecPCRプレート、エッペンドルフ社、ドイツ)における処理を並列化することによって、スケールアップを達成させる。
得られたPCR産物を、DNAポリメラーゼ、緩衝液成分、及びデオキシヌクレオチドから分離しなればならない。これは、供給者の取扱説明書に従って、市販の精製キット(例えばNucleoSpinゲル及びPCRClean−up、MACHEREY−NAGEL社、ドイツ)を使用すること、又は、沈殿処理のいずれかによって達成される。沈殿のために、PCR反応物をプールし、酢酸ナトリウム(CAS−Nr.127−09−3)(0.3M、pH5.2、最終濃度)をオリゴヌクレオチド混合物に加え、1体積部のオリゴヌクレオチドに対して氷冷無水エタノール(CAS−Nr.64−17−5)を2容量部加え、続いて、−80℃で少なくとも2時間インキュベートする。この沈殿の後、17000×gで30分間遠心分離する。上清を除去した後、オリゴヌクレオチドペレットを70%エタノールで洗浄し、17000×gで15分間遠心分離し、空気で30分間乾燥し、2.0MのNaCl(7647−14−5)及び50mMのTris−CI(CAS−Nr.1185−53−1)で再懸濁する。HCl(CAS−Nr.7647−01−0)でpHを7.5に調整する。
得られた生成物をスクロース(CAS−Nr.57−50−1)と混合し、20mg/μLの最終濃度にして、加水分解クラス1型褐色FIOLAXガラスバイアル(Schott社、ドイツ)に充填し、ブチルゴム凍結乾燥栓(Wheaton社、米国)で閉じる。次のようにして凍結乾燥を行う。バイアルを−21℃に凍結し、乾燥を−21℃の棚温度及び0.35ミリバールのチャンバ圧力で開始し、乾燥工程中に−10℃まで温度を上昇させる。二次乾燥を−21℃の棚温度及び0.2ミリバールのチャンバ圧力で行う。得られた生成物をテンパープルーフキャップ(WestFlip−Offseals、WestPharmaceutical社、ドイツ)を用いて封止する。有意に分解することなく、暗所で、25℃/60%の相対湿度(6ヶ月)、2〜8℃(24ヶ月)、そして−20℃(66ヶ月)、凍結乾燥されたDNAを保存することができる(van der Heijden I, Beijnen JH et al. (2013) Long Term Stability of Lyophilized Plasmid DNA pDERMATT. Int J Pharm. 10; 453, no. 2: 648-50, doi:10.1016/j.ijpharm.2013.06.010.)。
特定のオリゴヌクレオチド配列を、複製可能プラスミドと一体化させることによって、大量に生産することができる。増殖及び分裂しつつ、SOIを担持するプラスミドを複製及び伝播する細菌、例えばEscherichia coli 及び Bacillus subtilisといった細菌の細胞を形質転換するために、そのプラスミドを使用できる。
経済的に実現可能なオリゴヌクレオチドの収率を得るために、細胞あたりの高コピー数、高細胞密度、及び、効率的な終了段階の処理方法を達成しなければならない。
SOIは、標準的なクローニング技術(前述のように例えばSLIC(Kumpfmuller J, Kabisch J et al. (2013) An Optimized Technique for Rapid Genome Modifications of Bacillus Subtilis. J Microbiol Met. 3: 350-52, doi:10.1016/j.mimet.2013.10.003))を用いて、細胞において高コピー数をもたらすこととなる複製起点(ORI)を有する複製可能プラスミドと組み合わせることができる。そのような起点の例は、ColE1及びpUCORIs(Prather KJ et al. (2013) Industrial Scale Production of Plasmid DNA for Vaccine and Gene Therapy: Plasmid Design, Production, and Purification. Enz Micro Tech. 7: 865-83, doi:10.1016/S0141 -0229(03)00205-9.)、又は、温度シフトの後に複製規制の制御を失ういわゆる“暴走複製”を有する起点(Uhlin BE and Nordstrom KA. (1978) Runaway-Replication Mutant of Plasmid R1 drd-19: Temperature-Dependent Loss of Copy Number Control. Mol General Gen MGG. 165, no. 2: 167-79, doi:10.1007/BF00269904; Remaut E, Tsa H. (1983) Improved Plasmid Vectors with a Thermoinducible Expression and Temperature-Regulated Runaway Replication. Gene, no. 1 : 103-13.)であり、グラム陰性菌のEscherichia coliにおいて細胞あたり1000のコピー数をもたらすことができる。グラム陽性菌のBacillus subtilisにおいてRepEORI(Swinfield TJ et al. (1990) Physical Characterisation of the Replication Region of the Streptococcus Faecalis Plasmid pAM Beta 1 . Gene. 87, no. 1 : 79-90.)を適用できる。SOIを担持する得られたプラスミドを適切な宿主に形質転換しなければならない。
細菌細胞へのプラスミドDNAの転写を意味する形質転換は、刊行物で示された手順に従って、B. subtilis(枯草菌)のエレクトロポレーション(電気穿孔)(Kabisch J et al. (2012) Characterization and Optimization of Bacillus Subtilis ATCC 6051 as an Expression Host. J Biotechnol. doi:10.1016/j.jbiotec.2012.06.034.)、及び、E. coli(大腸菌)のエレクトロポレーション(Dower WJ, Miller JF et al. (1988) High Efficiency Transformation of E.coli by High Voltage Electroporation. Nuc Acids Res. 16, no. 13: 6127-45, doi:10.1093/nar/16.13.6127.)によって、達成できる。
プラスミドを保有する細胞は、Enpresso(BioSilta社、ケンブリッジシャー州、イギリス)などのC−源放出媒体を用いたインキュベーターシェーカーにおいて、又は、バイオリアクターを用いた流加処理において培養される。いくつかの最適化処理は、最も一般的に適用される大腸菌株について記載されている(Quaak SGL et al. (2008) GMP Production of pDERMATT for Vaccination against Melanoma in a Phase I Clinical Trial. Euro J Pharma Biopharma. 70, no. 2: 429-38, doi:10.1016/j.ejpb.2008.05.002.)。要約すると、プラスミドを担持する細胞における選択圧を維持するための適切な抗生物質を含む溶原性培養液(LB)プレートは、配列番号1〜18のプラスミドpUCを保有するE. coli DH5α株の凍結グリセロールストックから、多量に植菌される。これらのプレートを30℃で一晩インキュベートし、予め温めた2.5mLのEnPressoB培地を用いて、得られた細菌叢を2回プレートから洗い流す。得られた懸濁液を10Lの撹拌タンクバイオリアクター(Labfor5、InforsAG社、スイス)に移し、pH6.7の設定で、酵素制御グルコース制限の流加培養(EnPressoB、BiosiltaOy社、フィンランド)において、細胞を培養する。先の実験によって決定された正確な時点である、遷移段階に入る前に、10000×gの遠心分離によって細胞を回収し、実施例2.1に記載するように、SOIを保有するプラスミドを単離する。
生成物を投与するために、タンパク質、エンドトキシン(内毒素)、リポ多糖、RNA、及び染色体DNAなどの主要不純物を、拡大可能であり且つ安定した処理によって除去する必要がある。
開示されたほとんどのプラスミド精製手順は、3つの工程からなる。細胞溶解、一次精製、及び、沈殿又は濾過による濃縮、続いて、1又は2以上の仕上げ(ポリッシング)クロマトグラフィーカラムを利用する二次精製工程。
単離のために、SOIを有するプラスミドを保有する細胞は、アルカリ溶解(Bimboim HC and Doly J. (1979) A Rapid Alkaline Extraction Procedure for Screening Recombinant Plasmid DNA. Nuc Acids Res. 7, no. 6: 1513-23, doi:10.1093/nar/7.6.1513.)を用いて溶解され、上述した沈殿がそれに続く。迅速であり且つ拡大化可能な方法で不純物を除去するために、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)が適用される。無傷のプラスミドDNAは保持されないが、RNA及び損傷DNAに見られるように、遊離プリン塩基が金属電荷樹脂(例えばCu(II)を有するイミノ二酢酸)と結合することが示された。プラスミド骨格からSOIを遊離させるために、単離されたプラスミドは、適切な制限エンドヌクレアーゼ(RE)、例えば、複製可能プラスミド骨格を有するSOIを結合させるために使用されたREを使用して切断される。SOIは、その後、スーパーロース6(GEHealthcare社、米国)サイズ排除クロマトグラフィーカラムを用いて、複製可能プラスミド骨格及びREから分離される。
得られたオリゴヌクレオチドを上記のようにして保存する。
生成物の用途
生成物の用途のさまざまな手段が考えられる。
1.飲料との混合
これは、飲料製造者において凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを再水和することと、オリゴヌクレオチドを飲料に混合して1提供あたりオリゴヌクレオチド分子の濃度を少なくとも100万とすることとを含む。
1.5% w/vのカルシウム−乳酸水和物(CAS番号:41372−22−9)を食用溶液(例えば、マンゴージュース、アマレット)に溶解し、各オリゴヌクレオチドを様々な濃度でこの溶液に添加する。シリンジ又はJetCutter(geniaLab社、ブラウンシュヴァイク、ドイツ)を用いて、得られた懸濁液を、脱イオン水及びアルギン酸ナトリウム(CAS番号:9005−38−3)の0.5%w/v分散液に滴下し、室温で3分間インキュベートする。得られたオリゴヌクレオチド担体複合体を、脱イオン水で2回洗浄し、既に使用した食用溶液中で保存する。
凍結乾燥オリゴヌクレオチドを、化粧料において粘度調整のために一般的に使用されるキレート化剤であるエチレンジアミン四酢酸塩(EDTA)とともに、再懸濁する。EDTAは、オリゴヌクレオチドにとって周知の安定化剤である。この懸濁液を、少なくとも100万分子/mLの濃度で化粧料と混合する。さらに、オリゴヌクレオチドの皮膚浸透を高めるために、オメガ−3−オレイン酸を添加することができる(Touitou, E, Godin, B et al. (2002) Oleic acid, a skin penetration enhancer, affects Langerhans cells and corneocytes. J Con Rel. 80: 1 -7. doi:10.1016/S0168-3659(02)00004-4.)。
オリゴヌクレオチドのin vitroでの消化
ヒト試験を行うことなく、また、絶滅危惧種を傷つけることなく、消化とオリゴヌクレオチド取り込みとの効果をシミュレーションするために、in vitroでの胃腸消化実験を行った。これらは、配列番号1のオリゴヌクレオチドを用いて、主要共同体によって示唆されるような設定に従った(Minekus, M. et al. (2014) A standardised static in vitro digestion method suitable for food - an international consensus. Food Fund. 5, 1113-1124. doi: 10.1039/C3FO60702J)。要約すれば、経口、胃、及び腸の経路を、それぞれの化学的及び酵素的組成を模倣することによってシミュレートした。
示唆されるように、各フェーズにおいて、サンプルを2分間インキュベートし、QIAampDNAマイクロキット(Qiagen社、ドイツ)を用いてオリゴヌクレオチドを直ちに単離し、定量化まで4℃で保存した。
in vitro消化後のオリゴヌクレオチドの完全性をリアルタイムPCRによって決定した。製品名「qScriptTMOne−Step SYBR(登録商標) Green QRT−PCRキット ROXTM(QuantaBio社)を備えた、アプライド・バイオシステムズ7500(ThermoFisherScientific社製)と、オリゴヌクレオチドプライマー(Prim_SEQ1_for [ATGCCCTTGTCCAGTC] Prim_SEQ1_rev [CTAGAAAGCACAGCTG])とを用いて、全長遺伝子の両端でアニーリング(53℃)して、完全長遺伝子の定量を行った。100万又はそれ以上のオリゴヌクレオチド分子の使用によって、in vitro消化アッセイ(23〜40サイクル後の交差点(Cp))を通過した後に、配列番号1の完全長オリゴヌクレオチドの検出可能量が容易に得られた。伝統的な抽出物のin vitroでの経路をシミュレートするために、乾燥牛肉の一部(「ビーフジャーキー」、Bos taurus)を用い、対応する成長因子1(GenBank:V00111.1)のためのオリゴヌクレオチドを取り出した(for [acggctcagg gtccgtgaca]、rev [ctaataaaat gaggaaattg])。乾燥した牛肉サンプルを、21℃で14時間、脱イオン滅菌水で洗浄し、続いて、プロテイナーゼK(400ng/mL、P2308Sigma−Aldrich社、米国)及び塩酸グアニジン(5モル/L CAS番号:50−01−1)の1mL体積とともに、55℃で12時間インキュベートした。サンプルを遠心分離(15000g10分間)によって沈降させ、続いて、フェノール/クロロホルム抽出した。成長因子1遺伝子オリゴヌクレオチドのごく少量だけが、in vitro消化(23〜40サイクル後のCp)の前に検出することができ、in vitro消化後にバックグランド閾値を超える信号がなく、合成オリゴヌクレオチドの優位性が明らかに示された。
オリゴヌクレオチドの安定性における安定剤の影響
実施例4に記載したように、オリゴヌクレオチド単独で、また、様々な安定剤を組み合わせて用いて、オリゴヌクレオチドのin vitro消化を実施した。様々な段階で消化された経路(経口、胃、腸)をシミュレーションした後の検出は、実施例4に示した条件下で、リアルタイムPCRによって再度実施された。様々な安定剤が試験された。Stabi1:アルギン酸カリウム; Stabi2:ヒアルロン酸; Stabi3:ポリ(エチレン−酢酸ビニル 共重合); Stabi4:ポリ−L−乳酸。図1から認識されるように、安定剤は、模擬(シミュレート)消化経路において有利な効果を有した。検出オリゴヌクレオチドの割合(オリゴヌクレオチドの初期量に対して)が、全ての時点において、安定剤がない場合よりも安定剤がある場合で、より高かったからである。
Claims (30)
- 哺乳類、鳥類、爬虫類、又は植物における非ヒトDNAの少なくとも100万のオリゴヌクレオチドを含む組成物であって、
オリゴヌクレオチドは、ヒトへの投与のために、配列番号1〜18からなる群から選択される配列の1つ又は複数に対して、少なくとも80%の相同性を持つ配列を有する、非免疫学的用途のための組成物。 - 前記オリゴヌクレオチドは、生理学的に許容される適切な安定剤とオリゴヌクレオチドとを含むDNA担体複合体の状態で存在する、請求項1に記載の組成物。
- 前記組成物が、化粧料組成物又は局所皮膚用組成物である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記組成物が、食品組成物である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記組成物が、飲食料品組成物である、請求項4に記載の組成物。
- 前記組成物が、医薬組成物である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号1からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号2からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号3からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号4からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号5からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号6からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号7からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号8からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号9からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号10からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号11からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号12からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号13からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号14からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号15からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号16からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号17からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記配列は、配列番号18からなる群から選択される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の組成物を製造するための方法であって、
(i)配列番号1〜18からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドを凍結乾燥された状態で提供する工程、
(ii)凍結乾燥された状態の前記オリゴヌクレオチドを再水和する工程、
を含む、方法。 - 化粧料又は食料品と前記組成物とを混合する工程をさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の組成物の、個人用潤滑剤における使用。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の組成物の、スパイス混合物における使用。
- 請求項1〜24のいずれか1項に記載の組成物を含むキット。
- 哺乳類、鳥類、爬虫類、又は植物における非ヒトポリペプチドの少なくとも100万の分子を含む組成物であって、
ポリペプチドは、ヒトへの投与のために、配列番号1〜18からなる群から選択された1つ又は複数の配列に対して少なくとも80%の相同性を持つ配列によってエンコードされる組成物。
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