CN110248962A - 半胱氨酸肽使能抗体 - Google Patents

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Abstract

本文提供的是功能化单克隆抗体(mAb)，其包括通过二硫化物连接与肽化合物共价连接的抗体片段。二硫化物连接在抗体或其片段的Fab区中的半胱氨酸与肽化合物的侧链氨基酸的硫醇部分之间。包括本文提供的共价形成的复合物形成高度稳定和通用的药物递送和诊断组合物。

Description

半胱氨酸肽使能抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年12月6日提交的美国临时申请号62/430,848以及于2017年7月12日提交的美国临时申请号62/531,825的权益，所述两个申请均整体且为了所有目的引入本文作为参考。
作为ASCII文件提交的“序列表”、表或计算机程序列表附录的提及
于2017年12月5日创建，41,300字节，机器格式IBM-PC，MS-Windows操作系统的文件48440-627001WO Sequence Listing_ST25.TXT中写入的序列表，在此引入作为参考。
背景技术
由于它们的特异性和有利的药代动力学和药效学，已经进行了大量努力以用有力的细胞毒素或生物制品来配备单克隆抗体(mAb)以增强其治疗功效、或用放射性核素来配备单克隆抗体以使疾病成像。这些方法受到亲本mAb的可用化学品的限制和/或需要广泛的蛋白质工程。进一步地，存在通过共价键使抗体功能化的需要。本文提供的组合物和方法解决了本领域的这些及其它需要。
发明内容
在第一个方面，提供了共价复合物，其包括：(i)抗原结合结构域，其包括：(1)第一腔和第二腔之间的由抗原结合结构域的重链可变(VH)区、轻链可变区(VL)、重链恒定(CH1)区和轻链恒定(CL)区包围的中心孔；以及(2)非CDR肽结合区，其包括：(a)由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第一组氨基酸残基衬里的第一腔；(b)由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第二组氨基酸残基衬里的第二腔；或(c)包围在第一腔和第二腔之间的孔的孔区域，所述孔区域由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第三组氨基酸残基衬里。非CDR肽结合区包括第一半胱氨酸；以及(ii)肽化合物，其包括通过第一半胱氨酸和硫醇侧链氨基酸之间的二硫化物连接与抗原结合结构域共价结合的硫醇侧链氨基酸。
在另一个方面，提供了下式的肽化合物：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2(I)。在式(I)中，X0是Ser或空的。X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的。X2是Gln或空的。X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X4是Asp或Asn。X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X6是Cys、受保护的Cys或Ser。X7是Cys、受保护的Cys、Thr或Ser。X8是受保护的Arg、Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。X9是Cys、受保护的Cys、Arg或Ala。X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X11是Cys、受保护的Cys、Gln、Lys或Arg。X12是Ser、Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的。R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列。R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列。L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基。R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分。X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
在另一个方面，提供了下式的肽化合物：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-R2(II)。在式(II)中，X0是Ser或空的。X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的。X2是Gln或空的。X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X4是Asp或Asn。X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X6是Ser。X7是Cys、受保护的Cys、Thr或Ser。X8是Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。X9是Cys、受保护的Cys、Arg或Ala。X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X11是Cys、受保护的Cys、Gln、Lys或Arg。X12是Ser、Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的。X13是Gly或Ser。X14和X15独立地是Gly、Ser、Ala、Cys或受保护的Cys。R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列。R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列。L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基。R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分。X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
在另一个方面，提供了抗原结合结构域。抗原结合结构域包括：(1)第一腔和第二腔之间的由抗原结合结构域的重链可变(VH)区、轻链可变区(VL)、重链恒定(CH1)区和轻链恒定(CL)区包围的中心孔；以及(2)非CDR肽结合区，其包括：(a)由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第一组氨基酸残基衬里的第一腔；其中所述第一组氨基酸残基包括在对应于VL区的Kabat位置102、142或143的位置处的半胱氨酸；(b)由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第二组氨基酸残基衬里的第二腔；其中所述第二组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置208或158的位置处的半胱氨酸；或(c)包围在第一腔和第二腔之间的孔的孔区域，所述孔区域由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第三组氨基酸残基衬里，其中所述第三组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置174或175的位置处的半胱氨酸。
附图说明
图1.曲妥珠单抗中间位使能(enabled)抗体(memAb)的晶体结构，其中中间位在中间位结合口袋内结合。
图2A-2B.Cys修饰的(Ser6Cys)中间位(Cys-中间位)的半胱氨酸(Cys)残基与Cys修饰的(Ala175Cys)曲妥珠单抗中间位使能的片段抗原结合结构域(CYS-meFab)之间的二硫键形成的卡通和电子密度图描绘。图2A)描绘了线性Cys-中间位和Cys-meFab之间的反应的卡通。meFab和中间位的Cys残基形成二硫键，导致meFab和中间位的共价连接。图2B)结晶的Cys-中间位/Cys-meFab复合物的电子密度图和原子结构。椭圆形和箭头指示二硫键的形成。
图3A-3H.与固定的memAb变体结合的中间位肽变体的表面等离振子共振(SPR)传感图和晶体结构。图3A)与原始曲妥珠单抗memAb结合的原始中间位的Leu5的特写。图3B)与原始曲妥珠单抗memAB结合的长5-二苯基丙氨酸中间位的特写。图3C)原始曲妥珠单抗memAb的轻链中的I83的特写。图3D)I83突变为谷氨酸盐及其与中间位的Arg9的并置。图3E-H)在37℃下收集的SPR传感图。图3E)原始中间位和原始曲妥珠单抗memAb的SPR传感图和结合亲和力。图3F)5-二苯基丙氨酸中间位和原始曲妥珠单抗memAb的SPR传感图和结合亲和力。通过将中间位中的Leu5替换为5-二苯基丙氨酸，发生亲和力中的～25倍增加。图3G)原始中间位和突变的I83曲妥珠单抗memAb的SPR传感图和结合亲和力。对于I83突变为谷氨酸盐观察到亲和力中的～25增加。图3H)5-二苯丙氨酸中间位和突变的曲妥珠单抗memAb的SPR-传感图和结合亲和力。该组合产生总体亲和力中的1160倍增加。
图4A-4B.二硫键在Cys-中间位和曲妥珠单抗Cys-meFab之间形成，其中反应在大约3小时内完成。图4A)显示基于质谱分析的反应速率的曲线图。反应在165分钟内有效完成。图4B)结晶的Cys-中间位/Cys-meFab复合物的电子密度图和原子结构，指示二硫键的存在。
图5.差示扫描荧光测定法(DSF)揭示当允许Cys-中间位和Cys-meFabs相互作用时，热熔点中的增加。该曲线图显示了单独和与Cys-中间位组合的Cys-meFab的熔点。当允许Cys-meFab和Cys-中间位反应时，熔点中的增加提示二硫键的形成。
图6.指示与具有硫代-吡啶(SEQ ID NO：1)的Cys-中间位缀合的AlexaFluor647(AF647)的成功合成的质谱法。
图7.AF647硫代吡啶-中间位/曲妥珠单抗Cys-meFabs复合物与SKBR3细胞结合。
图8.与细胞结合的抗体的定量指示，中间位使能和模板化的二硫键结合不影响抗原结合。
图9A-9E.pH不影响Cys-中间位和曲妥珠单抗Cys-meFab之间的二硫桥形成。质谱数据指示二硫桥联的Cys-中间位/Cys-meFab复合物的存在，与反应在其下发生的pH无关。图9A)pH 6.5。图9B)pH 7.0。图9C)pH 7.5。图9D)pH 8.0。图9E)pH 8.5。
图10.显示了模板化的Fab-中间位技术可以如何扩展，以产生异二聚体抗体和/或Fab片段、生物制品和治疗剂的组合物的示意图。DBCO和叠氮化物中间位的产生可以促进这些技术扩展(SEQ ID NO：1)。
图11A-11B.DBCO缀合的硫代吡啶-中间位与Cys-meFab形成二硫键。图11A)质谱法结果指示DBCO缀合的硫代吡啶-中间位(SEQ ID NO：1)的成功合成。图11B)质谱数据指示DBCO缀合的硫代吡啶-中间位与Cys-meFab形成二硫桥。
图12A-12B.叠氮化物缀合的硫代吡啶-中间位与Cys-meFab形成二硫键。图12A)质谱法结果指示叠氮化物缀合的硫代吡啶-中间位(SEQ ID NO：1)的成功合成。图12B)质谱数据指示叠氮化物缀合的硫代吡啶-中间位与Cys-meFab形成二硫桥。
图13A-13B.叠氮化物-缀合的硫代吡啶-中间位与中间位使能的抗体CA19.9形成二硫键，所述抗体CA19.9突变以包括在位置175处的Cys。图13A)质谱法数据指示叠氮化物-缀合的硫代吡啶-中间位(SEQ ID NO：1)与Cys-中间位使能的抗体CA19.9形成二硫桥。图13B)显示了在预期质量处的峰的质谱法数据的放大视图。
图14A-14C.在meFab背面上的各种meFab重链和轻链位置处的半胱氨酸取代不影响Her2亲和力。图14A)I83E meFAb的SPR传感图和结合亲和力。图14B)K208C meFab的SPR传感图和结合亲和力。图14C)T158C meFab的SPR感应图和结合亲和力。
图15.Arg8辛基硫醇中间位(SEQ ID NO：2)的质谱法和化学结构。
图16.质谱法揭示了T158C Cys-meFab容易通过二硫桥与Cys-中间位形成共价连接。
图17.曲妥珠单抗meFab的晶体结构。左图显示了包括硫代吡啶-中间位的Cys-meFab的正视图。LC和HC分别表示meFab的轻链和重链部分。右图显示了meFab的90°旋转。该视图显示了硫代吡啶-中间位通过Fab孔的延伸。
图18.与meFab相互作用的叠氮化物缀合的硫代吡啶-中间位的横截面示意图。叠氮化物缀合的硫代吡啶-中间位可以进一步与高亲和力肽或小分子缀合。
图19.半胱氨酸可以在meFab轻链(LC)的位置143处被取代，以引导与Cys-中间位的二硫键形成。
图20A-20B.中间位可以用于指导与轻的二硫化物连接改变。图20A)Cys-中间位与轻链(LC)102半胱氨酸(C)的接近的描绘。图20B)Cys-中间位与轻链(LC)142半胱氨酸(C)的接近的描绘。
图21.包括在Cys13处的硫代-吡啶的中间位的质谱分析。
图22A-22B.Cys6硫代吡啶-中间位与中间位使能抗体的175C形成二硫键。图22A)质谱数据指示二硫桥的形成。图22B)显示了在预期质量处的峰的质谱数据的放大视图。
图23.中间位标签在抗CD16纳米抗体上的位置影响ADCC活性。使用下述共价复合物或对照抗体对SKBR-3细胞进行ADCC测定：cys-memAb(IgG1)(包括如本文提供的非CDR肽结合区的对照抗原结合结构域)；CD16-Fab C末端复合物(本文提供的共价复合物，其中所述抗原结合结构域是中间位使能的曲妥珠单抗结构域(包括曲妥珠单抗互补位的中间位使能的抗原结合结构域)，包括如本文提供的非CDR肽结合区，并且其中肽化合物的R20是CD16纳米抗体部分)；CD16-Fab N末端复合物(本文提供的共价复合物，其中所述抗原结合结构域是中间位使能的曲妥珠单抗结构域，包括如本文提供的非CDR肽结合区，并且其中肽化合物的R10是CD16纳米抗体部分)；cys-Fab(中间位使能的曲妥珠单抗结构域，包括如本文提供的非CDR肽结合区)和CD16(CD16纳米抗体)。
图24A-24E.使用半胱氨酸中间位的二硫化物形成的生物物理表征。图24A.中间位-抗体模板化的二硫化物形成的示意图：在meTras I83E的中间位和重链的界面处引入半胱氨酸残基，以驱动二硫键的形成。图24B.衍射数据指示在175Cys重链和SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK中间位之间的二硫键形成。显示了轻链。图24C.LC/MS用于跟踪175Cys Fab和SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK之间的二硫键形成的形成。上图突出显示了初始样品、中点(60分钟)和完全反应的样品(120分钟)，具有对应于单个中间位(1846Da)的质量位移。下图显示了在不同时间点的反应速率。图24D.差示扫描荧光测定法指示在二硫化物缀合后，175CFab的大的增加的热变性温度(Tm)。散列标记指示关于每种构建体的拐点(例如，Tm)。图24E.使用与SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK缀合的I83E、175Cys和175Cys曲妥珠单抗Fab作为配体与HER2的细胞外结构域作为固定至SPR芯片的分析物的表面等离振子共振，指示尽管半胱氨酸175或与cys-中间位的二硫键的引入，但抗原亲和力与亲本Fab无法区别。
图25A-25F.使用生物正交化学基团的功能化。图25A.DBCO-聚乙二醇聚合物(PEG-30k)通过无铜点击化学加入175Cys Fab-SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK-叠氮基中间位，在SDS-PAGE凝胶上在非还原条件下产生显著转变。图25B.使中间位使能的曲妥珠单抗Fab的175Cys变体和三种不同的αCD3Fab分别与携带四嗪或TCO的SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK反应，并且以1：1的比率混合。每种组合在SDS-PAGE凝胶上在非还原条件下产生显著转变，指示BiTE的形成。在强还原条件下，组分以预期质量迁移。图25C.175Cys曲妥珠单抗IgG与DM1-或MMAE-半胱氨酸中间位在近化学计量浓度下缀合(例如，2.2中间位-毒素与1个IgG)。通过cys-中间位的SKBR3(HER2阳性肿瘤细胞系)裂解，定量曲妥珠单抗ADC。EC50与临床曲妥珠单抗DM1可比较。通过临床曲妥珠单抗(例如，裸抗体)的肿瘤细胞裂解效果差得多。图25D.分析细胞计数法显示175Cys IgG结合SKBR3细胞。将临床曲妥珠单抗、A175C IgG和携带SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK-Alexa647中间位的A175C IgG与SKBR3细胞一起温育，用缀合至Alexa488的抗人IgG Fc二抗染色，并且通过FAC分析。显示无处理的细胞。图25E.用缀合至SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK-Alexa647中间位的曲妥珠单抗175Cys IgG染色SKBR3细胞。图25F.用缀合有SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK-Alexa647中间位的曲妥珠单抗175Cys IgG，使荷有MCF-7肿瘤的小鼠成像。在左侧上的小鼠具有在肩部中的肿瘤，并且在右侧上的小鼠具有在下侧腹中的肿瘤。摘除肿瘤并且在24小时后离体成像。
图26A-26I.使用遗传编码的生物制品的Fab功能化。图26A.在N末端、C末端或两个(NC)末端处携带半胱氨酸中间位序列的moxGFP的示意图。具有中间位的moxGFP和在每个末端处的中间位。图26B.中间位-GFP变体与175Cys曲妥珠单抗Fab的缀合使用SDS-PAGE在非还原条件下产生预期的质量位移。图26C.N、C和NC-/Fab复合物的SPR研究指示缀合的GFP变体不减少抗原结合。显示了关于每种复合物在313皮摩尔迹线处的代表性迹线。来自NC-GFP/Fab的略微更长的离开速率可能指示多价结合。显示了关于图33A-33D中的每种构建体的完整滴定。图26D.与175Cys曲妥珠单抗Fab缀合的N末端和C末端中间位αCD16纳米抗体的示意图。显示了轻链和重链。绘制了αCD16结构域并且显示了CDR。显示了遗传融合的中间位。图26E.具有含有N末端或C末端中间位标签的αCD16的175Cys曲妥珠单抗Fab的SDS-PAGE在非还原条件下产生预期的质量位移。复合物的减少显示了复合物解离成其各个组分。图26F.使用来自图26D的双特异性和IgG1的体外ADCC测定(在图例上指出)。N末端αCD16/Fab有力活化ADCC途径，其中SKBR3细胞作为靶，并且表达由NFAT活化控制的FcγRIIIa和萤光素酶的Jurkat细胞作为效应物。图26G.在与175Cys αCD3 Fab反应之前，具有中间位标签的ZHER2的示意图。如以前，显示了轻链和重链。显示了中间位标签并且显示了ZHER2。图26H.具有含有N末端中间位标签的ZHER2的三个175Cys αCD3 Fab的SDS-PAGE也在非还原条件下产生预期的位移。图26I.通过来自图26G的mPACT’ed BiTE的体外Jurkat活化显示了大量活化，而仅Fab则不是。
图27.关于A175C Tras Fab的中间位位点的图。显示的是关于三个中间位的图：Ac-SQFDFCTRRLQSGGSK(SEQ ID NO：27)、Ac-SQFDA(Ph)2CTRRLQSGGSK和Ac-CQFDLSTRRLKC-Am(SEQ ID NO：44)。
图28.显示了Fab和不能形成二硫化物的中间位组合之间无反应的质谱结果。上图显示了丝氨酸变体，Ac-SQFDA(Ph)2 STRRLQSGGSK(SEQ ID NO：24)，不与Ala175Cys Fab反应。当Ala175Cys半胱氨酸被碘乙酰胺封闭时，半胱氨酸中间位(Ac-SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK(SEQ ID NO：28)不再反应(中图)。最后，半胱氨酸中间位(Ac-SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK)和亲本Fab不是反应性的(下图)。
图29.在不同中间位的存在下I83E的解链温度中的增加的比较。将I83E Fab与不同比率的每种中间位混合，并且通过DSF测量解链温度。
图30.αCD3/曲妥珠单抗Fab点击产物在SKBR3细胞的存在下活化Jurkat细胞。NFAT活化导致Jurkat细胞中的萤光素酶表达。NFAT途径仅由含有点击在一起的αCD3和曲妥珠单抗Fab两者的构建体活化。单独的Fab未能引发(illicit)应答。
图31.细胞研究中使用的药物缀合物的HPLC迹线。上图显示了MMAE缀合物，并且下图显示了DM1缀合物。
图32.A175C Fab与携带n末端中间位标签的荧光蛋白mEos 3.2反应。除了在中间位中的半胱氨酸外，mEos 3.2还含有多重半胱氨酸残基，在不存在A175C Fab的情况下产生梯状效应。Fab到4小时完全耗尽，指示完全复合物形成。
图33A-33D.关于moxGFP/曲妥珠单抗175Cys缀合物的HER2结合的SPR迹线。图33A.单独的moxGFP。图33B.N-moxGFP缀合物。图33C.c-moxGFP缀合物。图33D.NC-moxGFP缀合物。
图34A-34B.Tras Ala175Cys-αCD16缀合物的稳定性。在图34A中，将缀合物在大鼠血清中在37℃下温育14天，并且且就在Fab上的κ轻链进行染色。二硫键在14天后看起来完整，因为看起来没有游离Fab。在图34B中，缀合物暴露于增加量的在其天然状态(左)或SDS变性状态(右)下的还原型谷胱甘肽。天然状态对于还原的抵抗力强得多，指示二硫化物的稳定性。
图35.在与ZHER2缀合之前和之后，αCD3Fab的热稳定性。
图36.通过ZHER2-αCD3BiTE与MCF7细胞的Jurkat细胞活化。
图37.与5-二苯基、8-辛基硫醇中间位反应后，T158C的变性质谱。
图38.具有关于T158C中间位二硫化物的图的晶体结构。显示了中间位、轻链和重链。
具体实施方式
虽然本文显示且描述了本发明的各种实施方案和方面，但对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案和方面仅作为示例提供。本领域技术人员现在将想到众多变化、改变和取代，而不背离本发明。应该理解，关于本文所述的本发明实施方案的各种替代方案可以用于实践本发明中。
本文使用的章节标题仅用于组构目的，并且不应解释为限制所述的主题。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文，明确地在此整体引入作为参考为了任何目的。
本文使用的缩写具有其在化学和生物学领域中的常规含义。本文所述的化学结构和化学式根据化学领域中已知的化学价的标准规则构建。
如本文使用的，术语“约”意欲包括指定值的一系列值，本领域普通技术人员将合理地认为其与指定值相似。在实施方案中，术语“约”意指在使用本领域一般可接受的测量的标准差内。在实施方案中，约意指延伸至指定值的+/-10％的范围。在实施方案中，约意指指定值。
当取代基团由其从左到右书写的常规化学式指定时，它们同样涵盖起因于从右到左书写结构的化学上相同的取代基，例如-CH2O-等价于-OCH2-。
除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一个取代基的部分，意指直链(即，非分支)或分支碳链(或碳)或其组合，其可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可以包括单价、二价和多价原子团。烷基可以包括指定数目的碳(例如，C1-C10意指一至十个碳)。烷基是未环化的链。饱和烃原子团的实例包括但不限于基团例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、甲基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等等的同系物和异构体。不饱和烷基基团是具有一个或多个双键或三键的那种。不饱和烷基基团的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基、以及更高级的同系物和异构体。烷氧基是经由氧接头(-O-)与分子的剩余部分附着的烷基。烷基部分可以是烯基部分。烷基部分可以是炔基部分。烷基部分可以是完全饱和的。除了一个或多个双键外，烯基还可以包括超过一个双键和/或一个或多个三键。除了一个或多个三键外，炔基还可以包括超过一个三键和/或一个或多个双键。
除非另有说明，否则术语“亚烷基”本身或作为另一个取代基的部分，意指衍生自烷基的二价原子团，如例示的但不限于-CH2CH2CH2CH2-。通常，烷基(或亚烷基)基团具有1至24个碳原子，其中具有10个或更少碳原子的那些基团是本文优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链的烷基或亚烷基基团，一般具有八个或更少的碳原子。除非另有说明，否则术语“亚烯基”本身或作为另一个取代基的部分意指衍生自烯烃的二价原子团。
除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一个术语组合，意指稳定的直链或支链或其组合，包括至少一个碳原子和至少一个杂原子(例如，O、N、P、Si和S)，并且其中氮和硫原子可以任选被氧化，并且氮杂原子可以任选被季铵化。杂原子(例如，N、S、Si或P)可以置于杂烷基基团的任何内部位置处或烷基在其下与分子的剩余部分附着的位置处。杂烷基是未环化的链。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3、-O-CH2-CH3和-CN。至多两个或三个杂原子可以是邻接的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。杂烷基部分可以包括一个杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括两个任选地不同的杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括三个任选地不同的杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括四个任选地不同的杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括五个任选地不同的杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。杂烷基部分可以包括至多8个任选地不同的杂原子(例如，O、N、S、Si或P)。除非另有说明，否则术语“杂烯基”本身或与另一个术语组合，意欲包括至少一个双键的杂烷基。除了一个或多个双键外，杂烯基还可以任选地包括超过一个双键和/或一个或多个三键。除非另有说明，否则术语“杂炔基”本身或与另一个术语组合，意欲包括至少一个三键的杂烷基。除了一个或多个三键外，杂炔基还可以任选地包括超过一个三键和/或一个或多个双键。
类似地，除非另有说明，否则术语“杂亚烷基”本身或作为另一个取代基的部分，意指衍生自杂烷基的二价原子团，如例示的但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。对于杂亚烷基基团，杂原子也可以占据链末端中的任一个或两个(例如亚烷氧基、亚烷二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等等)。再进一步地，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的取向不通过其中书写连接基团的式的方向暗示。例如，式-C(O)2R'-表示--C(O)2R'-和-R'C(O)2-两者。如上所述，如本文使用的，杂烷基基团包括通过杂原子与分子的剩余部分附着的那些基团，例如-C(O)R'、-C(O)NR'、-NR'R”、-OR'、-SR'和/或-SO2R'。当叙述“杂烷基”，随后为特定的杂烷基基团的叙述，例如-NR'R”等等时，应理解术语杂烷基和-NR'R”不是多余的或相互排斥的。相反，叙述特定的杂烷基基团以增加清晰度。因此，术语“杂烷基”在本文中不应解释为排除特定的杂烷基，例如-NR'R”等等。
除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合，分别意指“烷基”和“杂烷基”的环状形式。环烷基和杂环烷基并非芳族的。另外，对于杂环烷基，杂原子可以占据在其下杂环与分子的剩余部分附着的位置。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等等。单独或作为另一个取代基的部分的“环亚烷基”和“杂环亚烷基”分别意指衍生自环烷基和杂环烷基的二价原子团。
在实施方案中，术语“环烷基”意指单环、双环或多环环烷基环系统。在实施方案中，单环环系统是含有3至8个碳原子的环状烃基团，其中此类基团可以是饱和的或不饱和的，但并非芳族的。在实施方案中，环烷基基团是完全饱和的。单环环烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基和环辛基。双环环烷基环系统是桥联的单环环或稠合的双环环。在实施方案中，桥联的单环环含有单环环烷基环，其中单环环的两个不相邻的碳原子通过一个至三个另外的碳原子的亚烷基桥联接(即，形式(CH2)w的桥联基团，其中w是1、2或3)。双环环系统的代表性实例包括但不限于双环[3.1.1]庚烷、双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷、双环[3.2.2]壬烷、双环[3.3.1]壬烷和双环[4.2.1]壬烷。在实施方案中，稠合的双环环烷基环系统含有与苯基、单环环烷基、单环环烯基、单环杂环基或单环杂芳基稠合的单环环烷基环。在实施方案中，桥联或稠合的双环环烷基通过单环环烷基环内包含的任何碳原子与亲本分子部分附着。在实施方案中，环烷基基团任选地被一个或两个基团取代，所述基团独立地是氧代或硫杂。在实施方案中，稠合的双环环烷基是与苯环稠合的5或6元单环环烷基环、5或6元单环环烷基、5或6元单环环烯基、5或6元单环杂环基、或者5或6元单环杂芳基，其中所述稠合的双环环烷基任选被一个或两个基团取代，所述基团独立地是氧代或硫杂。在实施方案中，多环环烷基环系统是与以下中任一稠合的单环环烷基环(基环)：(i)选自双环芳基、双环杂芳基、双环环烷基、双环环烯基和双环杂环基的一个环系统；或(ii)独立地选自苯基、双环芳基、单环或双环杂芳基、单环或双环环烷基、单环或双环环烯基和单环或双环杂环基的两个其它环系统。在实施方案中，多环环烷基通过基环内包含的任何碳原子与亲本分子部分附着。在实施方案中，多环环烷基环系统是与以下中任一稠合的单环环烷基环(基环)：(i)选自双环芳基、双环杂芳基、双环环烷基、双环环烯基和双环杂环基的一个环系统；或(ii)独立地选自苯基、单环杂芳基、单环环烷基、单环环烯基和单环杂环基的两个其它环系统。多环环烷基基团的实例包括但不限于十四氢菲基、全氢吩噻嗪-1-基和全氢吩噁嗪-1-基。
在实施方案中，环烷基是环烯基。术语“环烯基”根据其平常的普通含义使用。在实施方案中，环烯基是单环、双环或多环环烯基环系统。在实施方案中，单环环烯基环系统是含有3至8个碳原子的环状烃基团，其中此类基团是不饱和的(即含有至少一个环形碳碳双键)，但并非芳族的。单环环烯基环系统的实例包括环戊烯基和环己烯基。在实施方案中，双环环烯基环是桥联的单环环或稠合的双环环。在实施方案中，桥联的单环环含有单环环烯基环，其中单环环的两个不相邻的碳原子通过一个至三个另外的碳原子的亚烷基桥联接(即，形式(CH2)w的桥联基团，其中w是1、2或3)。双环环烯基的代表性实例包括但不限于降冰片烯基和双环[2.2.2]辛2烯基。在实施方案中，稠合的双环环烷基环系统含有与苯基、单环环烷基、单环环烯基、单环杂环基或单环杂芳基稠合的单环环烷基环。在实施方案中，桥联或稠合的双环环烷基通过单环环烷基环内包含的任何碳原子与亲本分子部分附着。在实施方案中，环烷基基团任选地被一个或两个基团取代，所述基团独立地是氧代或硫杂。在实施方案中，多环环烯基环含有与以下中任一稠合的单环环烯基环(基环)：(i)选自双环芳基、双环杂芳基、双环环烷基、双环环烯基和双环杂环基的一个环系统；或(ii)独立地选自苯基、双环芳基、单环或双环杂芳基、单环或双环环烷基、单环或双环环烯基和单环或双环杂环基的两个环系统。在实施方案中，多环环烯基通过基环内包含的任何碳原子与亲本分子部分附着。在实施方案中，多环环烯基环含有与以下中任一稠合的单环环烯基环(基环)：(i)选自双环芳基、双环杂芳基、双环环烷基、双环环烯基和双环杂环基的一个环系统；或(ii)独立地选自苯基、单环杂芳基、单环环烷基、单环环烯基和单环杂环基的两个环系统。
除非另有说明，否则术语“芳基”意指多不饱和的芳族烃取代基，其可以是稠合在一起(即稠环芳基)或共价连接的单个环或多重环(优选1至3个环)。稠环芳基指稠合在一起的多重环，其中稠环中的至少一个是芳基环。术语“杂芳基”指含有至少一个杂原子如N、O或S的芳基基团(或环)，其中氮和硫原子任选被氧化，并且氮原子任选被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基基团(即，稠合在一起的多重环，其中稠环中的至少一个是杂芳环)。5,6-稠环杂亚芳基指稠合在一起的两个环，其中一个环具有5个成员且另一个环具有6个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。同样地，6,6-稠环杂亚芳基指稠合在一起的两个环，其中一个环具有6个成员且另一个环具有6个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。并且6,5-稠环杂亚芳基指稠合在一起的两个环，其中一个环具有6个成员且另一个环具有5个成员，并且其中至少一个环是杂芳基环。杂芳基基团可以通过碳或杂原子与分子的剩余部分附着。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、萘基、吡咯基、吡唑基、哒嗪基、三嗪基、嘧啶碱基、咪唑基、吡嗪基、嘌呤基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并呋喃、异苯并呋喃基、吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、异喹啉基、喹喔啉基、喹啉基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。关于上述芳基和杂芳基环系统各自的取代基选自下述可接受的取代基。单独或作为另一个取代基的部分的“亚芳基”和“杂亚芳基”分别意指衍生自芳基和杂芳基的二价原子团。杂芳基取代基可以-O-键合至环杂原子氮。
除非另有说明，否则术语“酰基”意指-C(O)R，其中R是取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。
稠环杂环烷基-芳基是与杂环烷基稠合的芳基。稠环杂环烷基-杂芳基是与杂环烷基稠合的杂芳基。稠环杂环烷基-环烷基是与环烷基稠合的杂环烷基。稠环杂环烷基-杂环烷基是与另一个杂环烷基稠合的杂环烷基。稠环杂环烷基-芳基、稠环杂环烷基-杂芳基、稠环杂环烷基-环烷基或稠环杂环烷基-杂环烷基可以各自独立地是未取代的或者被本文所述的一个或多个取代基取代。
如本文使用的，术语“烷基磺酰基”意指具有式-S(O2)-R'的部分，其中R'是如上定义的取代或未取代的烷基基团。R'可以具有指定数目的碳(例如，“C1-C4烷基磺酰基”)。
作为亚芳基部分的术语“烷基亚芳基”共价键合至亚烷基部分(在本文中也称为亚烷基接头)。在实施方案中，烷基亚芳基基团具有下式：
烷基亚芳基部分可以在亚烷基部分或亚芳基接头上(例如在碳2、3、4或6处)被卤素、氧代、-N3、-CF3、-CCl3、-CBr3、-CI3、-CN、-CHO、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO2CH3-SO3H、、-OSO3H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、取代或未取代的C1-C5烷基或者取代或未取代的2至5元杂烷基)取代。在实施方案中，烷基亚芳基是未取代的。
上述术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“环烷基”、“杂环烷基”、“芳基”和“杂芳基”)各自包括所示原子团的取代和未取代形式两者。下文提供了关于每种类型的原子团的优选取代基。
关于烷基和杂烷基原子团(包括经常称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可以是选自以下但不限于其的各种基团中的一种或多种：-OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤素、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R”、-OC(O)NR'R”、-NR”C(O)R'、-NR'-C(O)NR”R”'、-NR”C(O)2R'、-NR-C(NR'R”R”')＝NR””、-NR-C(NR'R”)＝NR”'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R”、-NRSO2R'、-NR'NR”R”'、-ONR'R”、-NR'C(O)NR”NR”'R””、-CN、-NO2、-NR'SO2R”、-NR'C(O)R”、-NR'C(O)-OR”、-NR'OR”，其数目范围为零至(2m'+1)，其中m'是此类原子团中的碳原子总数目。R、R'、R”、R”'和R””各自优选独立地指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基、或芳基烷基基团。当本文所述的化合物包括超过一个R基团时，例如，R基团各自独立地选择为当存在这些基团中的超过一个时的每个R'、R”、R”'和R””基团。当R'和R”附着至相同的氮原子时，它们可以与氮原子组合以形成4、5、6或7元环。例如，-NR'R”包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据取代基的上文讨论，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意欲包括包含与除氢基团外的基团结合的碳原子的基团，例如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等等)。
与对于烷基原子团描述的取代基类似，关于芳基和杂芳基基团的取代基是变化的，并且选自例如：-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤素、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R”、-OC(O)NR'R”、-NR”C(O)R'、-NR'-C(O)NR”R”'、-NR”C(O)2R'、-NR-C(NR'R”R”')＝NR””、-NR-C(NR'R”)＝NR”'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R”、-NRSO2R'、-NR'NR”R”'、-ONR'R”、-NR'C(O)NR”NR”'R””、-CN、-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基和氟代(C1-C4)烷基、-NR'SO2R”、-NR'C(O)R”、-NR'C(O)-OR”、-NR'OR”，其数目范围为零至芳环系统上的开放效价总数目；并且其中R'、R”、R”'和R””优选独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、以及取代或未取代的杂芳基。当本文所述的化合物包括超过一个R基团时，例如，R基团各自独立地选择为当存在这些基团中的超过一个时的每个R'、R”、R”'和R””基团。
关于环(例如环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环亚烷基、杂环亚烷基、亚芳基或杂亚芳基)的取代基可以描述为在环上而不是在环的特定原子上的取代基(通常称为浮动取代基)。在此类情况下，取代基可以附着至任何环原子(遵守化学价的规则)，并且在稠环或螺环环的情况下，取代基描述为与稠环或螺环环的一个成员(单个环上的浮动取代基)相关，可以是任何稠环或螺环环上的取代基(多重环上的浮动取代基)。当取代基附着至环而不是特定原子(浮动取代基)，并且关于取代基的下标是大于一的整数时，多重取代基可以在相同的原子、相同的环、不同的原子、不同的稠环、不同的螺环环上，并且每个取代基可以任选地不同。当环与分子的剩余部分的附着点并不限于单个原子(浮动取代基)时，附着点可以是环的任何原子，并且在稠环或螺环环的情况下，任何稠环或螺环环的任何原子，同时遵守化学价的规则。当环、稠环或螺环环含有一个或多个环杂原子，并且环、稠环或螺环环显示具有一个或多个浮动取代基(包括但不限于与分子的剩余部分的附着点)时，浮动取代基可以与杂原子键合。当环杂原子显示与具有浮动取代基的结构或式中的一个或多个氢(例如具有与环原子的两个键以及与氢的第三键的环氮)结合时，当杂原子与浮动取代基键合时，取代基被理解为替换氢，同时遵守化学价的规则。
螺环环是两个或更多个环，其中相邻的环通过单个原子附着。螺环环内的各个环可以相同或不同。螺环环中的各个环可以是取代或未取代的，并且可以具有与一组螺环环内的其它各个环不同的取代基。关于螺环环内的各个环的可能取代基是当并非螺环环的部分时(例如关于环烷基或杂环烷基环的取代基)，关于相同环的可能取代基。螺环环可以是取代或未取代的环烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环烷基、或者取代或未取代的杂环亚烷基，并且在螺环环基团内的各个环可以是紧前文列表的任何，包括具有一种类型的所有环(例如所有环都是取代的杂环亚烷基，其中每个环可以是相同或不同的取代的杂环亚烷基)。当提及螺环环系统时，杂环螺环环意指这样的螺环环，其中至少一个环是杂环环，并且其中每个环可以是不同的环。当提及螺环环系统时，取代的。在一些实施方案中，每个取代的基团环意指至少一个环被取代且每个取代基可以任选是不同的。
当部分被R取代基取代时，该基团可称为“R取代的”。当部分是R取代的时，该部分被至少一个R取代基取代，并且每个R取代基是任选地不同的。当化学属(例如式(I))的描述中存在特定R基团时，罗马字母符号可以用于区别该特定R基团的每次出现。例如，当存在多重R13取代基时，每个R13取代基可以区别为R13A、R13B、R13C、R13D等，其中R13A、R13B、R13C、R13D等各自定义在R13定义的范围内，并且任选不同
两个或更多个取代基可以任选地连接，以形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基基团。此类所谓的成环取代基通常(尽管不一定)发现与环状基础结构附着。在一个实施方案中，成环取代基附着至基础结构的相邻成员。例如，附着至环状基础结构的相邻成员的两个成环取代基产生稠环结构。在另一个实施方案中，成环取代基附着至基础结构的单个成员。例如，附着至环状基础结构的单个成员的两个成环取代基产生螺环结构。在另外一个实施方案中，成环取代基附着至基础结构的非相邻成员。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地形成式-T-C(O)-(CRR')q-U-的环，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR'-或单键，并且q是0至3的整数。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地替换为式-A-(CH2)r-B-的取代基，其中A和B独立地是-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-或单键，并且r是1至4的整数。如此形成的新环的单键之一可以任选地替换为双键。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地替换为式-(CRR')s-X'-(C”R”R”')d-的取代基，其中s和d独立地是0至3的整数，并且X'是-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR'-。取代基R、R'、R”和R”'优选独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、以及取代的或未取代的杂芳基。
如本文使用的，术语“杂原子”或“环杂原子”意欲包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。
如本文使用的，“取代基”意指选自下述部分的基团：
(A)氧代、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3,-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3,-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、未取代的烷基(例如，C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)、未取代的杂烷基(例如，2至8元杂烷基、2至6元杂烷基、或2至4元杂烷基)、未取代的环烷基(例如，C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)、未取代的杂环烷基(例如，3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基、或5至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如，C6-C10芳基、C10芳基或苯基)、或未取代的杂芳基(例如，5至10元杂芳基、5至9元杂芳基、或5至6元杂芳基)，和
(B)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，其被选自以下的至少一个取代基取代：
(i)氧代、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3,-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3,-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、未取代的烷基(例如，C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)、未取代的杂烷基(例如，2至8元杂烷基、2至6元杂烷基、或2至4元杂烷基)、未取代的环烷基(例如，C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)、未取代的杂环烷基(例如，3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基、或5至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如，C6-C10芳基、C10芳基或苯基)、或未取代的杂芳基(例如，5至10元杂芳基、5至9元杂芳基、或5至6元杂芳基)，和
(ii)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，其被选自以下的至少一个取代基取代：
(a)氧代、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3,-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3,-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、未取代的烷基(例如，C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)、未取代的杂烷基(例如，2至8元杂烷基、2至6元杂烷基、或2至4元杂烷基)、未取代的环烷基(例如，C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)、未取代的杂环烷基(例如，3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基、或5至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如，C6-C10芳基、C10芳基或苯基)、或未取代的杂芳基(例如，5至10元杂芳基、5至9元杂芳基、或5至6元杂芳基)，和
(b)烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，其被选自以下的至少一个取代基取代：氧代、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3,-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3,-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、未取代的烷基(例如，C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)、未取代的杂烷基(例如，2至8元杂烷基、2至6元杂烷基、或2至4元杂烷基)、未取代的环烷基(例如，C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)、未取代的杂环烷基(例如，3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基、或5至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如，C6-C10芳基、C10芳基或苯基)、或未取代的杂芳基(例如，5至10元杂芳基、5至9元杂芳基、或5至6元杂芳基)。
如本文使用的，术语“氧代”意指与碳原子双重键合的氧。
除非另有说明，否则术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一个取代基的部分意指氟、氯、溴或碘原子。另外，术语如“卤代烷基”意欲包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等等。
如本文使用的，“尺寸受限的取代基”或“尺寸受限的取代基团”意指选自上文关于“取代基团”描述的所有取代基的基团，其中每个取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C20烷基，每个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至20元杂烷基，每个取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C8环烷基，每个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3至8元杂环烷基，每个取代或未取代的芳基是取代或未取代的C6-C10芳基，并且每个取代或未取代的杂芳基是取代或未取代的5至10元杂芳基。
如本文使用的，“低级取代基”或“低级取代基团”意指选自上文关于“取代基团”描述的所有取代基的基团，其中每个取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C8烷基，每个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至8元杂烷基，每个取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C7环烷基，每个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3至7元杂环烷基，每个取代或未取代的芳基是取代或未取代的C6-C10芳基，并且每个取代或未取代的杂芳基是取代或未取代的5至9元杂芳基。
在一些实施方案中，本文化合物中描述的每个取代基团被至少一个取代基团取代。更具体地，在一些实施方案中，本文化合物中描述的每个取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代杂芳基、取代的亚烷基、取代的杂亚烷基、取代的环亚烷基、取代的杂环亚烷基、取代的亚芳基和/或取代的杂亚芳基被至少一个取代基团取代。在其它实施方案中，这些基团中的至少一个或所有被至少一个尺寸受限的取代基团取代。在其它实施方案中，这些基团中的至少一个或所有被至少一个低级取代基团取代。
在本文化合物的其它实施方案中，每个取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C20烷基，每个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至20元杂烷基，每个取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C8环烷基，每个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3至8元杂环烷基，每个取代或未取代的芳基是取代或未取代的C6-C10芳基，并且每个取代或未取代的杂芳基是取代或未取代的5至10元杂芳基。在本文化合物的一些实施方案中，每个取代或未取代的亚烷基是取代或未取代的C1-C20亚烷基，每个取代或未取代的杂亚烷基是取代或未取代的2至20元杂亚烷基，每个取代或未取代的环亚烷基是取代或未取代的C3-C8环亚烷基，每个取代或未取代的杂环亚烷基是取代或未取代的3至8元杂环亚烷基，每个取代或未取代的亚芳基是取代或未取代的C6-C10亚芳基，并且每个取代或未取代的杂亚芳基是取代或未取代的5至10元杂亚芳基。在一些实施方案中，化合物是下文实施例节段、附图或表中所示的化学种类。
在一些实施方案中，每个取代或未取代的烷基是取代或未取代的C1-C8烷基，每个取代或未取代的杂烷基是取代或未取代的2至8元杂烷基，每个取代或未取代的环烷基是取代或未取代的C3-C7环烷基，每个取代或未取代的杂环烷基是取代或未取代的3至7元杂环烷基，每个取代或未取代的芳基是取代或未取代的C6-C10芳基，并且每个取代或未取代的杂芳基是取代或未取代的5至9元杂芳基。在一些实施方案中，每个取代或未取代的亚烷基是取代或未取代的C1-C8亚烷基，每个取代或未取代的杂亚烷基是取代或未取代的2至8元杂亚烷基，每个取代或未取代的环亚烷基是取代或未取代的C3-C7环亚烷基，每个取代或未取代的杂环亚烷基是取代或未取代的3至7元杂环亚烷基，每个取代或未取代的亚芳基是取代或未取代的C6-C10亚芳基，并且每个取代或未取代的杂亚芳基是取代或未取代的5至9元杂亚芳基。在一些实施方案中，化合物是下文实施例章节、附图或表中所示的化学种类。
在实施方案中，取代或未取代的部分(例如，取代或未取代的肽基部分、取代或未取代的肽序列、取代或未取代的氨基酸、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、和/或者取代或未取代的杂亚芳基)是未取代的(例如，是未取代的肽基部分、未取代的肽序列、未取代的氨基酸、取代或未取代的氨基酸，分别是未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基、未取代的杂芳基、未取代的亚烷基、未取代的杂亚烷基、未取代的环亚烷基、未取代的杂环亚烷基、未取代的亚芳基、和/或未取代的杂亚芳基)。在实施方案中，取代或未取代的部分(例如，取代或未取代的肽基部分、取代或未取代的肽序列、取代或未取代的氨基酸、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、和/或者取代或未取代的杂亚芳基)是取代的(例如，分别是取代的肽基部分、取代的肽序列、取代的氨基酸、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的杂亚烷基、取代的环亚烷基、取代的杂环亚烷基、取代的亚芳基、和/或取代的杂亚芳基)。
在实施方案中，取代的部分(例如，分别地取代的肽基部分、取代的肽序列、取代的氨基酸、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的杂亚烷基、取代的环亚烷基、取代的杂环亚烷基、取代的亚芳基和/或取代的杂亚芳基)被至少一个取代基团取代，其中如果取代的部分被多个取代基团取代，则每个取代基团可以任选是不同的。在实施方案中，如果取代的部分被多个取代基取代，则每个取代基是不同的。
在实施方案中，取代的部分(例如，分别地取代的肽基部分、取代的肽序列、取代的氨基酸、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的杂亚烷基、取代的环亚烷基、取代的杂环亚烷基、取代的亚芳基和/或取代的杂亚芳基)被至少一个尺寸受限的取代基团取代，其中如果取代的部分被多个尺寸受限的取代基团取代，则每个尺寸受限的取代基团可以任选是不同的。在实施方案中，如果取代的部分被多个尺寸受限的取代基取代，则每个尺寸受限的取代基是不同的。
在实施方案中，取代的部分(例如，分别地取代的肽基部分、取代的肽序列、取代的氨基酸、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的杂亚烷基、取代的环亚烷基、取代的杂环亚烷基、取代的亚芳基和/或取代的杂亚芳基)被至少一个低级取代基团取代，其中如果取代的部分被多个低级取代基团取代，则每个低级取代基团可以任选是不同的。在实施方案中，如果取代的部分被多个低级取代基取代，则每个低级取代基是不同的。
在实施方案中，取代的部分(例如，分别地取代的肽基部分、取代的肽序列、取代的氨基酸、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的杂亚烷基、取代的环亚烷基、取代的杂环亚烷基、取代的亚芳基和/或取代的杂亚芳基)被至少一个取代基团、尺寸受限的取代基团或低级取代基团取代；其中如果取代的部分被选自取代基团、尺寸受限的取代基团和低级取代基团的多个基团取代；则每个取代基团、尺寸受限的取代基团和/或低级取代基团可以任选是不同的。在实施方案中，如果取代的部分被选自取代基团、尺寸受限的取代基团和低级取代基团的多个基团取代；则每个取代基团、尺寸受限的取代基团和/或低级取代基团是不同的。
当部分被取代(例如，分别地取代的肽基部分、取代的肽序列、取代的氨基酸、取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的杂亚烷基、取代的环亚烷基、取代的杂环亚烷基、取代的亚芳基和/或取代的杂亚芳基)时，该部分被至少一个取代基(例如，取代基团、尺寸受限的取代基团或低级取代基团)取代，并且每个取代基团是任选地不同的。另外，当在部分上存在多虫取代基团时，每个取代基团可以是任选地不同的。
本公开内容的某些化合物具有不对称碳原子(光学或手性中心)或双键；对映异构体、外消旋体、非对映异构体、互变异构体、几何异构体、立体异构形式，可以根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-或者对于氨基酸(D)-或(L)-，并且各个异构体涵盖在本公开内容的范围内。本公开内容的化合物不包括本领域已知太不稳定而不能合成和/或分离的化合物。本公开内容意欲包括以外消旋和光学纯形式的化合物。光学活性的(R)-和(S)-、或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术分辨。当本文所述的化合物含有烯键或其它几何不对称中心时，并且除非另有说明，否则所述化合物包括E和Z几何异构体两者。
如本文使用的，术语“异构体”指具有相同数目和种类的原子，并且因此具有相同分子量，但在原子的结构排列或构型方面不同的化合物。
如本文使用的，术语“互变异构体”指两种或更多种结构异构体之一，其以平衡存在并且容易地从一种异构形式转换为另一种异构形式。
对于本领域技术人员显而易见的是，本公开内容的某些化合物可以以互变异构体形式存在，化合物的所有此类互变异构形式都在本公开内容的范围内。
除非另有说明，否则本文描述的结构也意欲包括该结构的所有立体化学形式；即，关于每个不对称中心的R和S构型。因此，本文化合物的单一立体化学异构体以及对映异构体和非对映异构体混合物都在公开内容的范围内。
除非另有说明，否则本文描述的结构还意欲包括仅在一个或多个同位素富集原子的存在方面不同的化合物。例如，除了氢替换为氘或氚、或者碳替换为富含13C或14C的碳之外，具有本文结构的化合物都在本公开内容的范围内。
本公开内容的化合物还可以在构成此类化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。例如，化合物可以用放射性同位素，例如氚(3H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)进行放射性标记。本公开内容的化合物的所有同位素变化，无论是否是放射性的，都涵盖在本公开内容的范围内。
应当注意，在申请自始至终，替代物用Markush组书写，例如，含有超过一种可能的氨基酸的每个氨基酸位置。特别考虑，Markush组的每个成员应该被分开考虑，从而包含另一个实施方案，并且Markush组不应被读作单个单元。
“类似物(Analog)”或“类似物(analogue)”根据其在化学和生物学内的平常的普通含义使用，并且指这样的化学化合物，其在结构上与另一种化合物(即，所谓的“参考”化合物)相似，但是在组成中不同，例如，在一个原子替换为不同元素的原子方面，或在特定官能团的存在下，或一个官能团替换为另一个官能团，或者参考化合物的一个或多个手性中心的绝对立体化学。相应地，类似物是在功能和外观方面与参考化合物相似或可比较，但在结构或起源方面则不是的化合物。
如本文使用的，术语“共轭(conjugate)”指原子或分子之间的结合。该结合可以是直接的或间接的。例如，抗原结合结构域和肽化合物之间的共轭可以是直接的，例如通过共价键(例如二硫键)，或间接的，例如通过非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤素键)、范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极-诱导偶极、伦敦分散)、环堆积(π效应)、疏水相互作用等等)。在实施方案中，使用共轭化学形成缀合物，所述共轭化学包括但不限于亲核取代(例如，胺和醇与酰卤、活性酯的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)以及对碳-碳的添加和碳-杂原子多重键(例如，迈克尔反应、Diels-Alder加成)。这些及其它有用的反应在例如March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，第3版，John Wiley&Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；以及Feeney等人，MODIFICATION OF PROTEINS；Advances in Chemistry Series，第198卷，AmericanChemical Society，Washington，D.C.，1982中讨论。
用于本文共轭化学(包括如本领域已知的“点击化学”)的有用的反应性部分或官能团包括例如：
(a)羧基及其各种衍生物，包括但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-羟基苯并三唑酯、酰卤、酰基咪唑、硫酯、对硝基苯酯、烷基、烯基、炔基和芳族酯；
(b)羟基，其可以转换为酯类、醚类、醛类等。
(c)卤代烷基，其中卤化物随后可以用亲核基团置换，所述亲核基团例如胺、羧酸根阴离子、硫醇阴离子、碳阴离子或醇盐离子，从而导致新基团在卤素原子的位点处的共价附着；
(d)能够参与Diels-Alder反应的亲二烯体基团，例如马来酰亚胺基团；
(e)醛或酮基团，使得后续衍生化经由羰基衍生物例如亚胺、腙、缩氨基脲或肟的形成，或者经由此类机制如格氏加成或烷基锂加成是可能的；
(f)磺酰卤基团，用于与胺的后续反应，例如以形成磺酰胺；
(g)硫醇基团，其可以转换为二硫化物，与酰卤反应，或与金属如金键合；
(h)胺或巯基基团，其可以是例如酰化、烷基化或氧化的；
(i)烯烃，其可以经历例如环加成、酰化、迈克尔加成等；
(j)环氧化物，其可以与例如胺和羟基化合物反应；
(k)亚磷酰胺及其它可用于核酸合成中的标准官能团；
(l)金属氧化硅键合；
(m)金属键合至反应性磷基团(例如膦)，以形成例如磷酸二酯键；和
(n)砜，例如乙烯基砜。
通过使用共轭(“点击”)化学连接小模块单元化学合成组合物是本领域众所周知的，并且在例如以下中描述：H.C.Kolb，M.G.Finn和K.B.Sharpless((2001)."ClickChemistry：Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions".AngewandteChemie International Edition 40(11)：2004–2021)；R.A.Evans((2007)."The Rise ofAzide–Alkyne 1,3-Dipolar'Click'Cycloaddition and its Application to PolymerScience and Surface Modification".Australian Journal of Chemistry 60(6)：384–395；W.C.Guida等人Med.Res.Rev.p 3 1996；Spiteri，Christian和Moses，John E.((2010)."Copper-Catalyzed Azide–Alkyne Cycloaddition：Regioselective Synthesisof1,4,5-Trisubstituted 1,2,3-Triazoles".Angewandte Chemie InternationalEdition49(1)：31–33)；Hoyle，Charles E.和Bowman，Christopher N.((2010)."Thiol–EneClick Chemistry".Angewandte Chemie International Edition49(9)：1540–1573)；Blackman，Melissa L.和Royzen，Maksim和Fox，Joseph M.((2008)."Tetrazine Ligation：Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactivity".Journal of the American Chemical Society 130(41)：13518–13519)；Devaraj，NealK.和Weissleder，Ralph和Hilderbrand，Scott A.((2008)."Tetrazine BasedCycloadditions：Application to Pretargeted Live Cell Labeling".BioconjugateChemistry 19(12)：2297–2299)；Henning；Neves，Andre；Stairs，Shaun；Brindle，Kevin；Leeper，Finian((2011)."Exploring isonitrile-based clickchemistry for ligation with biomolecules".Organic&Biomolecular Chemistry)，所有这些文献都在此整体且为了所有目的引入作为参考。
可以这样选择反应性官能团和反应性部分，使得它们不参与或干扰本文所述的抗原结合结构域和肽化合物的化学稳定性。
如本文提供的，术语“反应性部分”指分子的化学官能团(例如，本文提供的化合物或抗原结合结构域)，其能够与相同或不同分子的另一个反应性部分形成共价键或非共价键(例如静电相互作用(例如离子键、氢键、卤素键)、范德华相互作用(例如偶极-偶极、偶极-诱导偶极、伦敦分散)、环堆积(π效应)、疏水相互作用等等)(例如，共价键或非共价键)。在实施方案中，反应性部分是点击化学反应性基团或点击化学反应性部分(即，可用于共轭化学(包括如本领域已知的“点击化学”)的反应性部分或官能团)。如上所述，点击化学反应性基团是可用于共轭化学的化学官能团。因此，在实施方案中，反应性部分是叠氮化物部分。在实施方案中，反应性部分具有–N＝N+＝N-的结构。在实施方案中，反应性部分是炔烃。
在实施方案中，反应性部分是DBCO。如本文提供的，术语“DBCO”在通常意义上指由PubChem No.77078258鉴定的二苯并环辛基或任何包括DBCO的反应性基团。在实施方案中，反应性部分具有或包括以下结构：
其中表示与分子的剩余部分的附着点。在实施方案中，反应性部分是30kDa聚乙二醇化-DBCO。
在实施方案中，反应性部分是反式环辛烯(TCO)部分。如本文提供的，术语“TCO”在通常意义上指由PubChem No.89994470鉴定的反式环辛烯或包括TCO的任何反应性基团。在实施方案中，反应性部分具有或包括以下结构：
其中表示与分子的剩余部分的附着点。
在实施方案中，反应性部分是四嗪部分。如本文提供的，术语“四嗪”在通常意义上指由PubChem No.9263鉴定的四嗪或包括四嗪的任何反应性基团。在实施方案中，反应性部分具有或包括以下结构：
其中表示与分子的剩余部分的附着点。
如在本文中使用的，术语“一个”或“一种”意指一个或多个/一种或多种。另外，如本文使用的，短语“被[n]取代”意指特定的基团可以被任何或所有所述取代基中的一个或多个取代。例如，当基团例如烷基或杂芳基基团“被未取代的C1-C20烷基、或未取代的2至20元杂烷基取代”时，该基团可以含有一个或多个未取代的C1-C20烷基、和/或一个或多个未取代的2至20元杂烷基。此外，当部分被R取代基取代时，该基团可以称为“R取代的”。当部分是R取代的时，该部分被至少一个R取代基取代，并且每个R取代基是任选地不同的。
符号指示化学部分与分子或化学式的剩余部分的附着点。
本发明的化合物(肽化合物)的描述受到本领域技术人员已知的化学键合原理的限制。相应地，当基团可以被许多取代基中的一个或多个取代时，选择此类取代以便遵循化学键合的原理，并且给出并非固有不稳定的和/或对于本领域普通技术人员已知为在环境条件下可能是不稳定的化合物，所述环境条件例如水性、中性和几种已知的生理条件。例如，杂环烷基或杂芳基经由环杂原子与分子的剩余部分附着，顺应本领域技术人员已知的化学键合原理，从而避免固有不稳定的化合物。
如本文使用的，“治疗试剂”或“治疗部分”指这样的试剂(例如，化合物或组合物)，当施用于受试者时，其将具有预期的预防效应，例如，预防或延迟损伤、疾病、病理状况或状况的发作(或复发)，或减少损伤、疾病、病理状况或状况、或其症状发作(或复发)的可能性，或预期的疗效，例如损伤、疾病、病理状况或状况、或其症状的治疗或改善，包括任何客观或主观的治疗参数，如减轻；缓解；症状的缩小或使得损伤、病理状况或状况对患者更可耐受；变性或衰退的速率中的减慢；使得变性的最终点较不虚弱；或改善患者的身体或精神健康。
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。参见例如，Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY第2版，J.Wiley&Sons(New York，NY 1994)；Sambrook等人，MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL，Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor，NY1989)。与本文描述的那些类似或等价的任何方法、装置和材料都可以用于本发明的实践中。提供下述定义以促进本文中频繁使用的某些术语的理解，并不意味着限制本公开内容的范围。
“生物样品”或“样品”指得自或衍生自受试者或患者的材料。生物样品包括组织例如活组织检查和尸检样品的切片，以及为了组织学目的而获取的冷冻切片。此类样品包括体液，例如血液和血液级分或产品(例如血清、血浆、血小板、红血细胞等等)、痰、组织、培养细胞(例如原代培养物、外植体和转化细胞)、粪便、尿、滑液、关节组织、滑膜组织、滑膜细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、免疫细胞、造血细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞等。生物样品通常得自真核生物，例如哺乳动物，例如灵长类动物，例如黑猩猩或人；牛；狗；猫；啮齿类动物，例如豚鼠、大鼠、小鼠；兔子；或鸟；爬虫动物；或鱼。
如本文使用的，“细胞”指进行足以保存或复制其基因组DNA的代谢或其它功能的细胞。细胞可以通过本领域众所周知的方法鉴定，包括例如完整膜的存在、通过特定染料的染色、产生子代的能力、或者在配子的情况下、与第二配子结合以产生存活后代的能力。细胞可以包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞以及衍生自植物和动物的细胞，例如哺乳动物、昆虫(例如斜纹夜蛾)和人细胞。当细胞是天然不贴壁或已通过胰蛋白酶消化进行处理以不粘附至表面时，它们可能是有用的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，以指氨基酸残基的聚合物，其中所述聚合物可以任选地与不由氨基酸组成的部分缀合。该术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。“融合蛋白”指编码两种或更多种分开的蛋白质序列的嵌合蛋白质，所述蛋白质序列作为单一部分重组表达。
术语“肽基”和“肽基部分”指与分子的剩余部分附着的肽(例如式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物的R1、R2或–L3A-L3B-R3)。肽基部分可以被化学接头取代，所述化学接头作用于将肽基部分附着至式(I)或式(II)的肽化合物的R1、R2或–L3A-L3B-R3。肽基部分也可以被另外的化学部分(例如另外的R取代基)取代。在实施方案中，肽基部分形成式(I)的肽化合物的部分。在实施方案中，肽基部分形成式(II)的肽化合物的部分。如本文使用的，术语“中间位”指包括在如本文所述的肽化合物中的肽基部分。因此，在实施方案中，中间位是肽基部分。
肽基部分(例如，中间位)可以是线性或环肽部分。可以使用用于环化肽部分的各种方法，例如，以解决体内稳定性且使得对于后续共轭化学的化学选择性控制成为可能。在一些实施方案中，环化策略是内酰胺环化策略，包括头至尾(头尾)内酰胺环化(在非环肽的末端残基之间)和/或其它残基之间的内酰胺连接。通过将残基如甘氨酸、β-Ala和/或7-氨基庚酸等等掺入非环肽环化前体内，以产生不同的内酰胺环大小和连接模式，也可以影响内酰胺形成。还可以使用另外的环化策略，例如“点击”化学和烯烃复分解。肽和拟肽环化的此类方法是本领域众所周知的。在实施方案中，肽基部分(例如，中间位)是线性肽基部分(例如，线性中间位)。在实施方案中，肽基部分(例如，中间位)是环状肽基部分(例如，环状中间位)。
术语“肽化合物”指包括肽基部分的化合物。在实施方案中，肽化合物包括直接(共价)或间接(非共价)附着至一个或多个化学取代基(例如，R1、R2或–L3A-L3B-R3)的肽或肽基部分。在实施方案中，肽化合物包括与一个或多个化学取代基共价附着的肽或肽基部分。在实施方案中，肽化合物包括肽基部分。在实施方案中，肽化合物是式(I)的化合物。在实施方案中，肽化合物是式(II)的化合物。
“标记”、“可检测试剂”或“可检测部分”是可通过适当手段检测的组合物，所述适当手段例如光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学、磁共振成像或其它物理手段。例如，有用的可检测试剂包括18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y、89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、225Ac、Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、32P、荧光团(例如荧光染料)、电子致密试剂、酶(例如，如ELISA中常用的)、生物素、地高辛、顺磁分子、顺磁纳米颗粒、超小超顺磁性氧化铁(“USPIO”)纳米颗粒、USPIO纳米颗粒聚集体、超顺磁性氧化铁(“SPIO”)纳米颗粒、SPIO纳米颗粒聚集体、单晶氧化铁纳米颗粒、单晶氧化铁、纳米颗粒造影剂、脂质体或含有钆螯合物(“Gd-螯合物”)分子的其它递送媒介物、钆、放射性同位素、放射性核素(例如，碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、铷-82)、氟脱氧葡萄糖(例如，氟-18标记的)、任何发射γ射线的放射性核素、发射正电子的放射性核素、放射性标记的葡萄糖、放射性标记的水、放射性标记的氨、生物胶体、微泡(例如，包括包含白蛋白、半乳糖、脂质和/或聚合物的微泡壳；包括空气、重气体、全氟碳、氮、八氟丙烷、全氟己烷脂质微球体、全氟丙烷等的微泡气体核心)、碘化造影剂(例如，碘海醇、碘克沙醇、碘佛醇、碘帕醇、碘昔兰、碘普罗胺、泛影酸、甲泛影盐、碘克沙酸盐)、硫酸钡、二氧化钍、金、金纳米颗粒、金纳米颗粒聚集体、荧光团、双光子荧光团、或半抗原和蛋白质或其它实体，其可以例如通过将放射性标记掺入与靶肽特异性反应的肽或抗体内成为可检测的。可检测部分是单价可检测试剂或能够与另一种组合物形成键的可检测试剂。
可以用作根据本公开内容的实施方案的成像剂和/或标记试剂的放射性物质(例如放射性同位素)包括但不限于18F、32P、33P、45Ti、47Sc、52Fe、59Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、77As、86Y、90Y.89Sr、89Zr、94Tc、94Tc、99mTc、99Mo、105Pd、105Rh、111Ag、111In、123I、124I、125I、131I、142Pr、143Pr、149Pm、153Sm、154-1581Gd、161Tb、166Dy、166Ho、169Er、175Lu、177Lu、186Re、188Re、189Re、194Ir、198Au、199Au、211At、211Pb、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra和225Ac。可以用作根据本公开内容的实施方案的另外成像剂的顺磁离子包括但不限于过渡金属和镧系金属(例如原子序数为21-29、42、43、44或57-71的金属)的离子。这些金属包括Cr、V、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb和Lu的离子。
“标记的蛋白质或多肽”是通过接头或化学键共价结合，或通过离子、范德华力、静电或氢键非共价结合至标记的蛋白质或多肽，使得可以通过检测与标记的蛋白质或多肽结合的标记的存在来检测标记的蛋白质或多肽的存在。可替代地，使用高亲和力相互作用的方法可以获得相同的结果，其中一对结合配偶体之一与另一个例如生物素、链霉抗生物素蛋白结合。
术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后来进行修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
氨基酸在本文中可以通过其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过其通常公认的单字母代码来提及。
氨基酸或核苷酸碱基“位置”由基于其相对于N末端(或5'末端)的位置，序贯鉴定参考序列中的每个氨基酸(或核苷酸碱基)的数目表示。由于在确定最佳比对时可以考虑的缺失、插入、截短、融合等等，一般而言通过简单地从N末端计数确定的测试序列中的氨基酸残基数目不一定与其在参考序列中相应位置的数目相同。例如，在其中变体相对于比对的参考序列具有缺失的情况下，变体中将不存在对应于参考序列中在缺失位点处的位置的氨基酸。当在比对的参考序列中存在插入时，该插入将不对应于参考序列中的编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下，参考序列或比对序列中可以存在不对应于相应序列中的任何氨基酸的氨基酸段。
当在给定氨基酸或多核苷酸序列的编号的上下文中使用时，术语“提及的编号”或“对应于的编号”，指当给定氨基酸或多核苷酸序列与参考序列进行比较时，特定参考序列的残基编号。当氨基酸残基在蛋白质内占据与给定残基相同的基本结构位置时，蛋白质中的氨基酸残基“对应于”给定的残基。例如，当选择的残基占据与在Kabat位置40处的轻链苏氨酸相同的基本空间或其它结构关系时，选择的抗体(或抗原结合结构域)中的选择残基对应于在Kabat位置40处的轻链苏氨酸。在一些实施方案中，当选择的蛋白质就最大同源性与抗体(或抗原结合结构域)的轻链进行比对，比对的选择蛋白质中与苏氨酸40比对的位置被说成对应于苏氨酸40。代替一级序列比对，也可以使用三维结构比对，例如，当选择蛋白质的结构就最大对应性与在Kabat位置40处的轻链苏氨酸进行比对，并且比较总体结构时。在这种情况下，在结构模型中占据与苏氨酸40相同的基本位置的氨基酸被说成对应于苏氨酸40残基。
“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量的功能上相同的核酸序列编码任何给定的氨基酸残基。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在其中丙氨酸由密码子指定的每一个位置处，密码子可以改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，其是保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每一个核酸序列也描述了核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了通常是甲硫氨酸的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸的唯一密码子的TGG之外)可以进行修饰，以产生功能上相同的分子。相应地，编码多肽的核酸的每个沉默变异隐含在关于表达产物的每个所述序列，而不是关于实际探针序列中。
关于氨基酸序列，技术人员将认识到改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中所述改变导致用化学上相似的氨基酸的氨基酸取代。提供功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。此类保守修饰的变体是对本发明的多态变体、种间同源物和等位基因的补充，并且不排除其。
下述八组各自含有其为关于彼此的保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如，Creighton，Proteins(1984))。
“核酸”指以单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，及其互补体。术语“多核苷酸”指核苷酸的线性序列。术语“核苷酸”通常指多核苷酸的单个单元，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或其修饰形式。本文考虑的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA(包括siRNA)，以及具有单链和双链DNA和RNA的混合物的杂合分子。如本文使用的，核酸还指具有与天然存在的核酸相同的基本化学结构的核酸。此类类似物具有修饰的糖和/或修饰的环取代基，但保留与天然存在的核酸相同的基本化学结构。核酸模拟物指这样的化学化合物，其具有与核酸的一般化学结构不同的结构，但以与天然存在的核酸类似的方式起作用。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNA)。
“序列同一性的百分比”通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定，其中所述比较窗中的多核苷酸或多肽序列的部分可以包含与参考序列(其不包含添加或缺失)相比的添加或缺失(即，缺口)，用于两个序列的最佳比对。百分比通过以下进行计算：确定在其处在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数目，以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的位置总数目，并且将结果乘以100，以得到序列同一性的百分比。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或百分比“同一性”指如使用下述序列比较算法之一或通过手动比对和目视检查测量的，当在比较窗或指定区域上就最大对应性比较且比对时，其为相同的或具有指定百分比的其为相同(即在例如本发明的整个多肽序列或本发明多肽的各个结构域的指定区域上的60％同一性，任选65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％同一性)的氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列。此类序列然后称为“基本上相同的”。该定义还指测试序列的互补体。任选地，同一性存在于长度至少约50个核苷酸的区域上，或更优选地长度100至500或1000或更多个核苷酸的区域上。本发明包括与SEQ ID NO：1-21中任一个基本上相同的多肽。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机内，需要时，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用缺省程序参数，或者也可以指定替代参数。序列比较算法然后基于程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
如本文使用的，“比较窗”包括提及选自例如全长序列或20至600、约50至约200、或约100至约150个氨基酸或核苷酸的邻接位置数目中的任何一个的区段，其中序列可以在两个序列进行最佳比对后与相同数目的邻接位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域众所周知的。用于比较的最佳序列比对可以例如通过以下进行：Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法，Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法，Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性搜索方法，这些算法的计算机化实现(WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或手动比对和目视检查(参见例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995补充))。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402，以及Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中的相同长度的字比对时，所述HSP或匹配或满足一些正值阈值得分T。T称为邻域字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些最初的邻域字命中充当种子，用于起始搜索以找到包含其的更长HSP。只要可以增加累积比对得分，字命中就沿着每个序列在两个方向上延伸。对于核苷酸序列，使用参数M(关于一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(关于错配残基的惩罚得分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，停止每个方向上的字命中的扩展：累积比对得分从其最大实现值减少数目X；由于一个或多个负评分残基比对的积累，累积评分变为零或低于零；或达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望值(E)或10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10、以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)、比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为缺省值。
BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计学分析(参见例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N))，其提供了通过其两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则核酸视为与参考序列相似。
两个核酸序列或多肽基本上相同的指示是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体免疫交叉反应，如下文所述。因此，多肽通常与第二多肽基本上相同，例如，其中两种肽仅通过保守取代而不同。两个核酸序列基本上相同的另一个指示是两个分子或其互补体在严格条件下彼此杂交，如下文所述。两个核酸序列基本上相同的另外一个指示是相同的引物可以用于扩增序列。
如本文提及基因使用的，单词“表达”或“表达的”意指该基因的转录和/或翻译产物。可以基于细胞内存在的相应mRNA的量或由细胞产生的该DNA编码的蛋白质的量，来确定细胞中DNA分子的表达水平。非编码核酸分子(例如，siRNA)的表达水平可以通过本领域众所周知的标准PCR或RNA印迹方法进行检测。参见Sambrook等人，1989Molecular Cloning：ALaboratory Manual，18.1-18.88。
转染基因的表达可以在细胞中瞬时或稳定地发生。在“瞬时表达”期间，转染的基因在细胞分裂期间不转移到子细胞。由于其表达仅限于转染的细胞，因此基因的表达在一段时间内丧失。相比之下，当基因与对转染细胞赋予选择优点的另一种基因共转染时，可以发生转染基因的稳定表达。此类选择优点可以是对呈递给细胞的某种毒素的抗性。转染基因的表达可以通过转座子介导的插入宿主基因组内来进一步实现。在转座子介导的插入期间，基因以可预测的方式置于两个转座子接头序列之间，其允许插入宿主基因组内以及随后的切除。通过用慢病毒载体感染细胞可以进一步实现转染基因的稳定表达，所述慢病毒载体在感染后形成细胞基因组的部分(整合到其内)，从而导致基因的稳定表达。
术语“质粒”、“载体”或“表达载体”指编码基因和/或基因表达所必需的调节元件的核酸分子。来自质粒的基因的表达可以顺式或反式发生。如果基因以顺式表达，则基因和调节元件由相同的质粒编码。反式表达指其中基因和调节元件由分开的质粒编码的情况。
术语“转染(transfection)”、“转导(transduction)”、“转染(transfecting)”或“转导(transducing)”可以互换使用，并且定义为将核酸分子或蛋白质引入细胞的过程。使用非病毒或基于病毒的方法将核酸引入细胞。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。非病毒转染方法包括任何适当的转染方法，其不使用病毒DNA或病毒颗粒作为将核酸分子引入细胞内的递送系统。示例性的非病毒转染方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核转染、声孔效应、通过热休克转染、磁转染(magnetifection)和电穿孔。在一些实施方案中，遵循本领域众所周知的标准程序，使用电穿孔将核酸分子引入细胞内。对于基于病毒的转染方法，任何有用的病毒载体都可以用于本文所述的方法中。关于病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体。在一些实施方案中，遵循本领域众所周知的标准程序，使用逆转录病毒载体将核酸分子引入细胞内。术语“转染”或“转导”还指将蛋白质从外部环境引入细胞内。通常，蛋白质的转导或转染依赖能够穿过细胞膜的肽或蛋白质与目的蛋白质的附着。参见例如，Ford等人(2001)Gene Therapy 8：1-4和Prochiantz(2007)Nat.Methods 4：119-20。
术语“调节(modulation)”、“调节(modulate)”或“调节剂”根据其平常的普通含义使用，并且指转变或改变一种或多种性质的动作。“调节剂”指增加或降低靶分子的水平或靶分子的功能或分子靶的物理状态的组合物。“调节”指转变或改变一种或多种属性的过程。例如，当应用于调节剂对生物学靶的作用时，调节意指通过增加或降低生物学靶的性质或功能或者生物学靶的量的改变。
如本文定义的，提及蛋白质-抑制剂(例如拮抗剂)相互作用的术语“抑制(inhibition)”、“抑制(inhibit)”、“抑制(inhibiting)”等等意指相对于在不存在抑制剂的情况下的蛋白质活性或功能，负面影响(例如降低)蛋白质的活性或功能。在实施方案中，抑制指疾病或疾病症状的减少。因此，在实施方案中，抑制包括至少部分、部分或完全阻断刺激，降低、预防或延迟活化，或灭活、脱敏或下调信号转导或酶促活性或蛋白质的量。与不存在拮抗剂的对照相比，抑制的量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更低。在实施方案中，与在不存在拮抗剂的情况下的表达或活性相比，抑制是1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
如本文定义的，提及蛋白质-活化剂(例如激动剂)相互作用的术语“活化(activation)”、“活化(activate)”、“活化(activating)”等等意指相对于在不存在活化剂(例如本文所述的组合物)的情况下的蛋白质活性或功能，正面影响(例如增加)蛋白质的活性或功能。因此，在实施方案中，活化可以包括至少部分、部分或完全增加刺激，增加或致使活化，或活化、敏化或上调信号转导或酶促活性或疾病中降低的蛋白质的量。与不存在激动剂的对照相比，活化的量可以是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在实施方案中，与不存在激动剂的情况下的表达或活性相比，活化是1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。
当关于例如细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”指示细胞、核酸、蛋白质或载体已进行修饰或是实验室方法的结果。因此，例如，重组蛋白质包括通过实验室方法产生的蛋白质。重组蛋白质可以包括在蛋白质的天然(非重组)形式内未发现的氨基酸残基，或者可以包括已进行修饰(例如标记)的氨基酸残基。
当关于核酸的部分使用时，术语“异源的”指示核酸包含在自然界中彼此未发现处于相同关系中的两个或更多个子序列。例如，核酸通常是重组产生的，具有来自被排列为产生新的功能性核酸的无关基因的两个或多个序列，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。类似地，异源蛋白质指示该蛋白质包含在自然界中彼此未发现处于相同关系中的两个或更多个子序列(例如，融合蛋白)。
当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离的”表示核酸或蛋白质基本上不含它与之在天然状态中结合的其它细胞组分。它可以例如处于同质状态，并且可以是干燥的或在水溶液中。纯度和同质性通常使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相层析进行测定。其为制剂中存在的占优势种类的蛋白质是基本上纯化的。
“抗体”指包含来自免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其特异性结合并识别抗原的片段。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次又分别定义免疫球蛋白类别，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区在确定结合的特异性和亲和力中起重要作用。在一些实施方案中，抗体或抗体的片段可以衍生自不同的生物，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、骆驼等。本发明的抗体可以包括在一个或多个氨基酸位置处进行修饰或突变的抗体，以改善或调节抗体的所需功能(例如糖基化、表达、抗原识别、效应子功能、抗原结合、特异性等)。
抗体是具有复杂内部结构的大的复杂分子(分子量为～150,000或约1320个氨基酸)。天然抗体分子含有两对相同的多肽链，每对具有一条轻链和一条重链。每条轻链和重链依次又由两个区域组成：涉及结合靶抗原的可变(“V”)区、以及与免疫系统的其它组分相互作用的恒定(“C”)区。轻链和重链可变区在3维空间中聚集在一起，以形成结合抗原(例如，细胞的表面上的受体)的可变区。在每个轻链或重链可变区内，存在称为互补决定区(“CDR”)的三个短区段(平均长度10个氨基酸)。抗体可变结构域中的六个CDR(三个来自轻链且三个来自重链)在3维空间中一起折叠，以形成对接到靶抗原上的实际抗体结合位点。CDR的位置和长度已由Kabat，E.等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，U.S.Department of Health and Human Services，1983，1987精确定义。未包含在CDR中的可变区的部分称为构架(“FR”)，其形成关于CDR的环境。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端限定了主要负责抗原识别、约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。Fc(即片段可结晶区)是免疫球蛋白的“碱基”或“尾部”，并且通常由两条重链组成，其依赖于抗体的类别而促成两个或三个恒定结构域。通过与特定蛋白质结合，Fc区确保每种抗体生成对于给定抗原的适当免疫应答。Fc区还结合各种细胞受体，例如Fc受体，及其它免疫分子，例如补体蛋白。
如本文提供的，术语“抗原”指能够结合本文提供的抗体结合结构域的分子，其中结合位点不是肽结合位点。
例如，抗体作为完整的免疫球蛋白或通过用各种肽酶消化产生的许多充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中的二硫化物连接以下的抗体，以产生F(ab)’2，Fab的二聚体，其本身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)’2可以在温和条件下还原，以破坏铰链区中的二硫化物连接，从而将F(ab)’2二聚体转换为Fab'单体。Fab'单体基本上是具有铰链区的部分的抗原结合部分(参见Fundamental Immunology(Paul编辑，第3版1993)。虽然各种抗体片段根据完整抗体的消化进行定义，但技术人员之一将理解，此类片段可以通过化学方法或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文使用的，术语抗体还包括通过完整抗体的修饰产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的那些(例如，单链Fv)，或使用噬菌体展示文库鉴定的那些(参见例如，McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990))。
单链可变片段(scFv)通常是与10至约25个氨基酸的短接头肽连接的，免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。接头通常可以富含甘氨酸用于柔性，以及丝氨酸或苏氨酸用于溶解性。接头可以将VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。
mAb的表位是mAb与之结合的其抗原的区域。如果每种抗体竞争性地抑制(阻断)另一种抗体与抗原的结合，则两种抗体结合相同或重叠的表位。即，如在竞争性结合测定中测量的，1x、5x、10x、20x或100x过量的一种抗体使另一种抗体的结合抑制至少30％，但优选50％、75％、90％或甚至99％(参见例如，Junghans等人，Cancer Res.50：1495，1990)。可替代地，如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。
如本文提供的，“抗体变体”指能够结合抗原，并且包括抗体或其片段的一个或多个结构域的多肽。抗体变体的非限制性实例包括单结构域抗体或纳米抗体、亲和体(小于单克隆抗体(例如，约6kDA)并且能够以高亲和力结合抗原并模仿单克隆抗体的多肽、单特异性Fab2、双特异性Fab2、三特异性Fab3、单价IgG、scFv、双特异性双抗体、三特异性三抗体、scFv-Fc、微抗体、IgNAR、V-NAR、hcIgG、VhH或肽体。如本文所述的，“纳米抗体”或“单结构域抗体”通常是本领域众所周知的，并且指由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。如同完整抗体，它能够选择性地结合特定抗原。如本文提供的，“肽体”指与抗体的Fc结构域附着的肽部分(通过共价或非共价接头)。本领域已知的抗体变体的进一步非限制性实例包括由软骨鱼或骆驼科动物产生的抗体。来自骆驼科动物的抗体及其可变区，以及关于其生产、分离和使用的方法的一般描述可以在参考文献WO97/49805和WO97/49805中找到，所述参考文献整体且为了所有目的引入本文作为参考。同样地，来自软骨鱼的抗体及其可变区，以及关于其生产、分离和使用的方法可以在WO2005/118629中找到，所述专利整体且为了所有目的引入本文作为参考。
关于本发明的合适抗体的制备和根据本发明的用途，例如重组、单克隆或多克隆抗体，可以使用本领域已知的许多技术(参见例如，Kohler&Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等人，Immunology Today4：72(1983)；Cole等人，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy中的第77-96页，Alan R.Liss，Inc.(1985)；Coligan，CurrentProtocols in Immunology(1991)；Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)；以及Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(第2版，1986))。可以从细胞中克隆编码目的抗体的重链和轻链的基因，例如，可以从杂交瘤中克隆编码单克隆抗体的基因，并且用于产生重组单克隆抗体。编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库也可以由杂交瘤或浆细胞制备。重链和轻链基因产物的随机组合生成具有不同抗原特异性的抗体的大型库(参见例如，Kuby，Immunology(第3版，1997))。用于产生单链抗体或重组抗体的技术(美国专利4,946,778、美国专利号4,816,567)可以适于产生针对本发明的多肽的抗体。另外，转基因小鼠或其它生物如其它哺乳动物可以用于表达人源化抗体或人抗体(参见例如，美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，Marks等人，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg等人，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild等人，Nature Biotechnology 14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；以及Lonberg&Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。可替代地，噬菌体展示技术可以用于鉴定特异性结合选择抗原的抗体和异聚Fab片段(参见例如，McCafferty等人，Nature 348：552-554(1990)；Marks等人，Biotechnology 10：779-783(1992))。抗体也可以制成双特异性的，即能够识别两种不同的抗原(参见例如，WO 93/08829，Traunecker等人，EMBO J.10：3655-3659(1991)；以及Suresh等人，Methods in Enzymology 121：210(1986))。抗体也可以是异源缀合物，例如两种共价连接的抗体或免疫毒素(参见例如，美国专利号4,676,980、WO 91/00360；WO 92/200373；以及EP 03089)。
用于人源化或灵长类化非人抗体的方法是本领域众所周知的(例如，美国专利号4,816,567；5,530,101；5,859,205；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,777,085；6,180,370；6,210,671；和6,329,511；WO87/02671；EP专利申请0173494；Jones等人(1986)Nature321：522；以及Verhoyen等人(1988)Science 239：1534)。人源化抗体进一步描述于例如Winter和Milstein(1991)Nature 349：293中。一般地，人源化抗体具有从其为非人的来源引入其内的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基经常称为输入残基，其通常取自输入可变结构域。人源化可以基本上遵守Winter和同事的方法(参见例如，Morrison等人，PNAS USA，81：6851-6855(1984)，Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-327(1988)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，44：65-92(1988)，Verhoeyen等人，Science 239：1534-1536(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)，Padlan，Molec.Immun.，28：489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)：169-217(1994))，通过用啮齿类动物CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列来进行。相应地，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿类动物抗体中的类似位点的残基取代。例如，包含编码人源化的免疫球蛋白构架区的第一序列和编码所需免疫球蛋白互补决定区的第二序列组的多核苷酸，可以合成产生或通过组合适当的cDNA和基因组DNA区段产生。可以根据众所周知的程序从各种人细胞中分离人恒定区DNA序列。
“嵌合抗体”是抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，使得抗原结合位点(可变区)与不同类别或改变类别、效应子功能和/或种类的恒定区连接，或对嵌合抗体赋予新性质的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其一部分用具有不同或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。根据本发明且用于根据本发明使用的优选抗体包括人源化和/或嵌合单克隆抗体。
如本文提供的，“治疗性抗体”指用于治疗癌症、自身免疫疾病、移植排斥、心血管疾病或者其它疾病或状况(例如本文所述的那些)的任何抗体或其功能片段(例如，纳米抗体)。治疗性抗体的非限制性实例包括鼠抗体、鼠源化或人源化嵌合抗体或人抗体，包括但不限于爱必妥(西妥昔单抗)，ReoPro(阿昔单抗)、舒莱(巴利昔单抗)、类克(英夫利昔单抗)；Orthoclone OKT3(莫罗单抗-CD3)；Rituxan(利妥昔单抗)、Bexxar(托西莫单抗)Humira(阿达木单抗)、Campath(阿仑珠单抗)、舒莱(巴利昔单抗)、阿瓦斯汀(贝伐珠单抗)、Cimzia(赛妥珠单抗)、赛尼哌(达克珠单抗)、Soliris(依库珠单抗)、Raptiva(依法珠单抗)、麦罗塔(吉妥珠单抗)、泽娃灵(替伊莫单抗)、Tysabri(那他珠单抗)、Xolair(奥马珠单抗)、Synagis(帕利珠单抗)、Vectibix(帕木单抗)、Lucentis(雷珠单抗)和赫赛汀(曲妥珠单抗)。
用于将治疗试剂与抗体缀合的技术是众所周知的(参见例如，Arnon等人，"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"，inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编辑)，第243-56页(AlanR.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery"in ControlledDrug Delivery(第2版)，Robinson等人(编辑)，第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review"inMonoclonal Antibodies‘84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(编辑)，第475-506页(1985)；以及Thorpe等人，"The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates"，Immunol.Rev.，62：119-58(1982))。如本文使用的，术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”指与抗体缀合或以其它方式共价结合的治疗试剂。
当提及蛋白质或肽时，短语“特异性地(或选择性地)结合抗体”或“与之特异性地(或选择性地)免疫反应”，指通常在蛋白质及其它生物制品的异质群体中，其为蛋白质存在的决定因素的结合反应。因此，在指定的免疫测定条件下，指定的抗体与特定蛋白质的结合是本底的至少两倍，且更通常是本底的10至100倍。在此类条件下与抗体的特异性结合通常需要就其对于特定蛋白质的特异性而选择的抗体。例如，可以选择多克隆抗体以仅获得与所选抗原而不与其它蛋白质特异性免疫反应的抗体子集。可以通过减去与其它分子交叉反应的抗体来实现该选择。各种免疫测定形式可以用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，照常规使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(关于可以用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述，参见例如，Harlow&Lane，Using Antibodies，A Laboratory Manual(1998))。
蛋白)。
“配体”指能够结合受体的试剂，例如多肽或其它分子。
“接触”根据其平常的普通含义使用，并且指允许至少两个不同的种类(例如包括生物分子或细胞的化学化合物)变得足够接近以反应、相互作用或物理接触的过程。应当了解，所得到的反应产物可以直接由添加的试剂之间的反应产生，或者由可以在反应混合物中产生的一种或多种添加的试剂的中间产物产生。
术语“接触”可以包括允许两个种类反应、相互作用或物理接触，其中所述两个种类可以是例如如本文所述的肽化合物和抗原结合结构域。在实施方案中，接触包括例如允许本文描述的化合物与抗原结合结构域相互作用，导致共价连接(例如，通过二硫键)。
“对照”样品或值指充当用于与测试样品比较的参考的样品，通常是已知的参考。例如，测试样品可以取自测试条件，例如，在测试化合物的存在下，并且与来自已知条件的样品比较，例如，在不存在测试化合物的情况下(阴性对照)，或在已知化合物的存在下(阳性对照)。对照还可以表示从多个测试或结果中收集的平均值。本领域技术人员将认识到，可以设计对照用于评价任何数目的参数。例如，可以设计对照以基于药理学数据(例如，半衰期)或治疗测量(例如，副作用的比较)来比较治疗益处。本领域技术人员将理解哪些对照在给定情况下是有价值的，并且能够基于与对照值的比较来分析数据。对照对于确定数据的重要性也是有价值的。例如，如果关于给定参数的值在对照中变化很大，则测试样品中的变化不被视为有意义的。
“患者”或“有此需要的受试者”指患有或易患疾病或状况的活生物，所述疾病或状况可以通过施用如本文提供的组合物或药物组合物来治疗。非限制性实例包括人、其它哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿及其它非哺乳动物。在一些实施方案中，患者是人。
术语“疾病”或“状况”指能够用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的患者或受试者的存在或健康状态。在实施方案中，该疾病是癌症(例如肺癌、卵巢癌、骨肉瘤、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如Merkel细胞癌)、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、头和颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑素瘤、乳腺癌、神经母细胞瘤)。
术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指在损伤、疾病、病理状况或状况的治疗或改善方面的任何成功标记，包括任何客观或主观参数，例如减轻；缓解；症状的缩小或使得损伤、病理状况或状况对患者更可耐受；变性或衰退的速率中的减慢；使得变性的最终点较不虚弱；或改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或改善可以基于客观或主观参数；包括身体检查、神经精神检查和/或精神病学评估的结果。术语“治疗”及其动词的变化包括损伤、疾病、病理状况或状况的预防。在实施方案中，“治疗”指癌症的治疗。
“有效量”是相对于化合物的不存在，足以使化合物实现所述目的的量(例如，实现对于其施用的效应、治疗疾病、减少酶活性、增加酶活性、减少信号传导途径、或者减少疾病或状况的一种或多种症状)。“治疗有效量”的实例是足以促成疾病的一种或多种症状的治疗、预防或减少的量，其也可以称为“治疗有效量”。一种或多种症状的“减少”(以及该短语的语法等价物)意指症状的严重程度或频率的降低、或症状的消除。确切的量将取决于治疗的目的，并且可由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如，Lieberman，Pharmaceutical Dosage Forms(vols.1-3，1992)；Lloyd，The Art，Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar，Dosage Calculations(1999)；和Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2003，Gennaro，Ed.，Lippincott，Williams&Wilkins)。
如本文使用的，术语“癌症”指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤、癌和肉瘤。可以用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头和颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、ER阳性、ER阴性、化学疗法抗性、赫赛汀抗性、HER2阳性、多柔比星抗性、他莫昔芬抗性、导管癌、小叶癌、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、前列腺癌、去势抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头部、颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性髓样白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。另外的实例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、头和颈癌、食道癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或髓母细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑瘤、癌、恶性胰岛素瘤(pancreatic insulanoma)、恶性类癌、膀胱癌、恶变前的皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌性胰腺赘生物、甲状腺髓样癌症、甲状腺髓样癌、黑素瘤、结肠直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌、乳头佩吉特氏病、叶状瘤、小叶状癌、导管癌、胰腺星形细胞癌、肝星形细胞癌或前列腺癌。
“抗癌剂”根据其平常的普通含义使用，并且指具有抗肿瘤性质或抑制细胞生长或增殖的能力的组合物(例如化合物、药物、拮抗剂、抑制剂、调节剂)。在实施方案中，抗癌剂是化学治疗试剂。在实施方案中，抗癌剂是本文鉴定的在治疗癌症的方法中具有效用的试剂。在实施方案中，抗癌剂是由FDA或除美国外的国家的类似管理机构批准用于治疗癌症的试剂。
如本文使用的，术语“异常”指与正常不同。当用于描述酶促活性时，异常指大于或小于正常对照的活性或者正常非患病对照样品的平均值。异常活性可以指导致疾病的活性的量，其中使异常活性返回到正常或非疾病相关的量(例如通过使用如本文所述的方法)，导致疾病或者一种或多种疾病症状的减少。
“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”指这样的物质，其帮助活性剂对受试者的施用和由受试者的吸收，并且可以包括在本发明的组合物中而不对患者引起显著的不良毒理学作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、正常蔗糖、正常葡萄糖、粘合剂、填料、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、香料、盐溶液(如林格氏溶液)、醇类、油、明胶、碳水化合物(如乳糖、直链淀粉或淀粉)、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷和颜料等等。此类制剂可以被灭菌，并且需要时，可以与辅助试剂混合，所述辅助试剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等等，其不与本发明的化合物有害地反应。本领域技术人员将认识到其它药物赋形剂可用于本发明中。
术语“制剂”预期包括具有包封材料作为载体的活性化合物的制剂，提供其中活性组分连同或不连同其它载体一起被载体包围的胶囊，其因此与之结合。类似地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉末、胶囊、丸剂、扁囊剂和锭剂可以用作适合于经口施用的固体剂型。
如本文使用的，术语“施用”意指经口施用，作为栓剂施用，局部接触，静脉内、肠胃外、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用，或缓慢释放装置例如微型渗透泵对受试者的植入。施用通过任何途径，包括肠胃外和经粘膜(例如经颊、舌下、腭、牙龈、鼻、阴道、直肠或经皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其它递送模式包括但不限于脂质体制剂、静脉输注、经皮贴剂等的使用。
药物组合物可以包括组合物，其中活性成分(例如本文所述的化合物，包括实施方案或实施例)以治疗有效量，即以有效实现其预期目的的量包含。对于特定应用有效的实际量尤其取决于待治疗的状况。当在治疗疾病的方法中施用时，此类组合物将含有有效实现所需结果的活性成分的量，所述结果例如调节靶分子的活性，和/或减少、消除或减慢疾病症状的进展。
共价复合物
本文提供的尤其是组合物，其包括通过二硫化物连接与肽化合物(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的化合物)共价结合的单克隆抗体(mAb)和抗体片段。二硫化物连接在抗体或Fab的半胱氨酸残基与肽化合物氨基酸之间形成，所述肽化合物氨基酸具有包括硫醇部分的侧链(即硫醇侧链氨基酸)。半胱氨酸残基可以是抗体或Fab的重链可变(VH)区、轻链可变(VL)区、重链恒定(CH1)区或轻链(CL)区的部分。硫醇侧链氨基酸可以是半胱氨酸、受保护的半胱氨酸(共价附着至保护基团的半胱氨酸)或被硫醇取代基取代的精氨酸(辛基-硫醇取代的精氨酸)。令人惊讶的是，申请人已发现肽化合物(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物)与抗体或其片段的共价附着改善抗体或Fab的热稳定性和治疗性质。进一步地，申请人已发现，当通过二硫化物连接与肽化合物结合时，本文提供的抗体或Fab以增加的亲和力结合抗原。因此，本文提供的功能化抗体赋予更好地靶向且影响位点或细胞的能力。另外，大量的诊断试剂、治疗试剂和可检测试剂可以与本文提供的肽化合物(包括其实施方案)缀合，从而使得本文提供的共价复合物成为用于各种治疗和诊断目的的有用试剂。
在第一个方面，提供了共价复合物，其包括：(i)抗原结合结构域，其包括：(1)第一腔和第二腔之间的由抗原结合结构域的重链可变(VH)区、轻链可变区(VL)、重链恒定(CH1)区和轻链恒定(CL)区包围的中心孔；以及(2)非CDR肽结合区，其包括：(a)由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第一组氨基酸残基衬里的第一腔；(b)由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第二组氨基酸残基衬里的第二腔；或(c)包围在第一腔和第二腔之间的孔的孔区域，所述孔区域由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第三组氨基酸残基衬里，其中所述非CDR肽结合区包括第一半胱氨酸；以及(ii)肽化合物，其包括通过第一半胱氨酸和硫醇侧链氨基酸之间的二硫化物连接与抗原结合结构域共价结合的硫醇侧链氨基酸。
如本文提供的，“重链可变(VH)区”是包括抗体的重链可变区或其片段的结构域。同样地，如本文提供的，“轻链可变(VL)区”是包括抗体的轻链可变区或其片段的结构域。在实施方案中，重链可变(VH)区是抗体的重链的可变区。在实施方案中，重链可变(VH)区是抗体片段的重链的可变区。在实施方案中，重链可变(VH)区是Fab的重链的可变区。在实施方案中，轻链可变(VL)区是抗体的轻链的可变区。在实施方案中，轻链可变(VL)区是抗体片段的轻链的可变区。在实施方案中，轻链可变(VL)区是Fab的轻链的可变区。
如本文提供的，“抗原结合结构域”是结合抗原(表位)的抗体区域。如上文所述，抗原结合结构域一般由重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域(分别为VL、VH、CL和CH1)组成。互补位或抗原结合位点在抗原结合结构域的N末端上形成。抗原结合结构域的两个可变结构域通常结合抗原上的表位。在实施方案中，抗原结合结构域形成抗体的部分。在实施方案中，抗原结合结构域形成治疗性抗体的部分。在实施方案中，抗原结合结构域形成Fab的部分。在实施方案中，抗原结合结构域是Fab。
在实施方案中，抗原结合结构域包括重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)。在实施方案中，重链恒定区(CH)是抗体或其片段的重链的恒定区。在实施方案中，轻链恒定区(CL)是抗体或其片段的轻链的恒定区。在实施方案中，重链恒定区(CH)是Fab的恒定区。在实施方案中，轻链恒定区(CL)是Fab的轻链的恒定区。在实施方案中，重链恒定区(CH)是F(ab)'2二聚体的恒定区。在实施方案中，轻链恒定区(CL)是F(ab)'2二聚体的轻链的恒定区。在实施方案中，抗原结合结构域包括Fc结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是人源化的抗原结合结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是人源化的小鼠抗原结合结构域。
在实施方案中，抗原结合结构域是中间位使能的曲妥珠单抗结构域、中间位使能的培妥珠单抗结构域、中间位使能的M5A结构域或中间位使能的利妥昔单抗结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是人源化的中间位使能的利妥昔单抗结构域。
在实施方案中，本文提供的抗原结合结构域(包括其实施方案)竞争抗原结合，特异性结合相同的抗原或表位，和/或含有一个、多个或所有CDR(或包含至少或与CDR的约75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的CDR)，例如包括一种或多种已知抗体的重链CDR1、2和/或3和/或轻链CDR1、2和/或3，所述已知抗体包括任何商购可得的抗体，例如阿巴伏单抗、阿昔单抗、阿达木单抗、阿德木单抗、阿仑珠单抗、阿妥莫单抗、喷替酸阿妥莫单抗、麻安莫单抗、马安莫单抗、阿西莫单抗、托西珠单抗、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、ectumomab、贝利木单抗、苯雷利珠单抗、贝伐珠单抗、本妥昔单抗、卡那奴单抗、卡罗单抗、卡罗单抗喷地肽、卡妥索单抗、塞妥珠单抗、克里伏妥珠单抗tetraxetan、达克珠单抗、地诺单抗、依库珠单抗、依决洛单抗、依法珠单抗、埃达珠单抗、厄马索单抗、法索单抗、Fbta05、芳妥珠单抗、吉妥珠单抗、吉利妥昔单抗、戈利木单抗、替伊莫单抗、伊戈伏单抗、英夫利昔单抗、伊匹木单抗、拉贝珠单抗、美泊利单抗、莫罗单抗、莫罗单抗-CD3、那他珠单抗、耐昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、奥法木单抗、奥马珠单抗、奥戈伏单抗、帕利珠单抗、帕木单抗、雷珠单抗、利妥昔单抗、沙妥莫单抗、硫索单抗、替伊莫单抗(ibritumomab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、Trbs07、乌司奴单抗、维西珠单抗、伏妥莫单抗、扎芦木单抗和/或brodalumab；和/或安芦珠单抗、巴匹珠单抗、达罗土珠单抗、地昔单抗、甘尼妥单抗、inotuzumab、马夫利列单抗、帕西妥莫单抗、利妥木单抗、西法木单抗、他尼珠单抗、tralokinumab、曲美木单抗、urelumab、由杂交瘤10B5产生的抗体(参见Edelson&Unanue，Curr Opin Immunol，2000Aug；12(4)：425-31)、B6H12.2(abcam)或其它抗CD47抗体(参见Chao等人，Cell，142，699–713，September 3，2010)。
在实施方案中，抗原结合结构域特异性结合选自以下的抗原：CD16、CA-125、糖蛋白(GP)IIb/IIIa受体、TNF-α、CD52、TAG-72、癌胚抗原(CEA)、白细胞介素-6受体(IL-6R)、IL-2、白细胞介素-2受体a链(CD25)、CD22、B细胞活化因子、白细胞介素-5受体(CD125)、VEGF、VEGF-A、CD30、IL-1β、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、CD3、EpCAM、EGF受体(EGFR)、MUC1、人白细胞介素-2受体、Tac、RANK配体、补体蛋白例如C5、EpCAM、CD11a例如人CD11a、整联蛋白例如α-vβ-3整联蛋白、玻连蛋白受体αvβ3整联蛋白、HER2、neu、CD3、CD15、CD20(小环和/或大环)、干扰素γ、CD33、CA-IX、TNFα、CTLA-4、癌胚抗原、IL-5、CD3ε、CAM、α-4-整联蛋白、IgE例如IgE Fc区、RSV抗原例如呼吸道合胞病毒(RSV)的F蛋白、TAG-72、NCA-90(粒细胞细胞抗原)、IL-6、GD2、GD3、IL-12、IL-23、IL-17、CTAA16.88、IL13、白细胞介素-1β、β-淀粉样蛋白、IGF-1受体(IGF-1R)、δ样配体4(DLL4)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子受体的α亚基、肝细胞生长因子、IFN-α、神经生长因子、IL-13、CD326、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1，又名CD274、B7-H1)、CD47和CD137。
在实施方案中，抗原结合结构域是抗CD16、抗HER2、抗CD19蛋白、抗CD20蛋白、抗CD22蛋白、抗CD30蛋白、抗CD33蛋白、抗CD44v6/7/8蛋白、抗CD123蛋白、抗CEA蛋白、抗EGP-2蛋白、抗EGP-40蛋白、抗erb-B2蛋白、抗erb-B2,3,4蛋白、抗FBP蛋白、抗胎儿乙酰胆碱受体蛋白、抗GD2蛋白、抗GD3蛋白、抗Her2/neu蛋白、抗IL-13R-a2蛋白、抗KDR蛋白、抗k-轻链蛋白、抗LeY蛋白、抗L1细胞粘附分子蛋白、抗MAGE-A1蛋白、抗间皮素蛋白、抗鼠CMV受感染细胞蛋白、抗MUC2蛋白、抗NKGD2蛋白、抗癌胚抗原蛋白、抗PCSA蛋白、抗PSMA蛋白、抗TAA(由mAb IfE靶向)蛋白、抗EGFR蛋白、抗TAG-72蛋白或抗VEGF-72蛋白。在实施方案中，抗原结合结构域不是西妥昔单抗。
在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：5的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：6的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：7的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：8的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：9的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：10的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：11的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：12的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：13的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：14的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：15的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：16的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：17的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：18的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQID NO：19的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：20的序列。在实施方案中，抗原结合结构域包括SEQ ID NO：21的序列。
如本文提供的，关于抗原结合结构域(例如，Fab)的三维结构，“中心孔”指抗原结合结构域(例如，Fab)内的孔，并且位于第一腔和第二腔之间。抗原结合结构域的中心孔以及第一腔和第二腔由重链和轻链可变区和恒定区的部分衬里。中心孔、第一腔和第二腔因此分别由VH、VL、CH1和CL区的氨基酸残基衬里。包围中心孔的VH、VL、CH1和CL区的氨基酸残基形成孔区域。衬里第一腔的氨基酸残基在本文中称为“第一组氨基酸残基”。衬里第二腔的氨基酸残基在本文中称为“第二组氨基酸残基”。并且衬里孔区域的氨基酸残基在本文中称为“第三组氨基酸残基”。包括在第一组、第二组和第三组氨基酸残基中的氨基酸残基(即，第一腔、第二腔和孔区域的氨基酸残基)是VH、VL、CH1和CL区的氨基酸残基，并且不形成CDR的部分。包括在第一腔、第二腔或孔区域中的氨基酸残基能够与本文提供的肽化合物包括其实施方案形成二硫化物连接。因此，本文提供的第一腔、第二腔和孔区域形成非CDR肽结合区的部分。“非CDR肽结合区”是抗原结合结构域的区域，其能够结合本文提供的肽化合物，包括其实施方案。本文提供的非CDR肽结合区是抗原结合结构域内的区域，其不包括重链的CDR残基和轻链的CDR残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括重链的FR残基和轻链的FR残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括构架区氨基酸残基。本文提供的非CDR肽结合区的第一腔也可以称为“中间位结合位点”。在实施方案中，中间位结合位点包括孔区域。
在实施方案中，第一组氨基酸残基(第一腔的氨基酸残基)的氨基酸与本文提供的肽化合物包括其实施方案(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物)相互作用。在实施方案中，第二组氨基酸残基(第二腔的氨基酸残基)的氨基酸与本文提供的肽化合物包括其实施方案(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物)相互作用。在实施方案中，第三组氨基酸残基(孔区域的氨基酸残基)的氨基酸与本文提供的肽化合物包括其实施方案(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物)相互作用。在实施方案中，第一组和第二组氨基酸残基(第一腔和第二腔的氨基酸残基)的氨基酸与本文提供的肽化合物包括其实施方案(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物)相互作用。在实施方案中，第一组和第三组氨基酸残基(第一腔和孔区域的氨基酸残基)的氨基酸与本文提供的肽化合物包括其实施方案(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物)相互作用。在实施方案中，第二组和第三组氨基酸残基(第二腔和孔区域的氨基酸残基)的氨基酸与本文提供的肽化合物包括其实施方案(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物)相互作用。在实施方案中，第一组、第二组和第三组氨基酸残基(第一腔和第二腔和孔区域的氨基酸残基)的氨基酸与本文提供的肽化合物包括其实施方案(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物)相互作用。
在实施方案中，结合非CDR肽结合区的肽化合物不影响(例如可测量地影响)抗原结合结构域与表位的结合。换言之，在实施方案中，该位点的占据不影响抗原结合。在实施方案中，非CDR肽结合区与本文提供的肽化合物的肽基部分(例如，中间位)相互作用，所述肽化合物包括其实施方案(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物)。能够与包括肽基部分(例如中间位)的肽化合物相互作用的氨基酸残基可以形成第一腔、第二腔、孔区域或其任何组合的部分。可以将非CDR肽结合区改造到任何适当的抗体内，从而与非CDR肽结合区形成抗体结构域(抗原结合结构域)。包括非CDR肽结合区的抗原结合结构域在本文中也称为中间位使能抗体、中间位使能结构域或中间位使能抗体区。包括本文提供的非CDR肽结合结构域(即，能够与蛋白质化合物(例如，中间位)形成二硫桥)的抗原结合结构域(例如，抗体、抗体结构域)在本文中也称为“半胱氨酸-中间位使能的抗体”、“半胱氨酸-中间位使能结构域”或“半胱氨酸-中间位使能抗体区”。
如本文所述，本文提供的抗原结合结构域包括中心孔和非CDR结合区，所述非CDR结合区包括第一腔、第二腔和孔区域。本文提供的第一腔也称为“中间位结合位点”。在实施方案中，非CDR肽结合区包括构架区氨基酸残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括重链或轻链的FR残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括重链和轻链的FR残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括在对应于Kabat位置83的位置处的残基、在对应于Kabat位置30的位置处的残基、或在对应于Kabat位置52的位置处的残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括在对应于Kabat位置40的位置处的残基、在对应于Kabat位置41的位置处的残基、在对应于Kabat位置30的位置处的残基、在对应于Kabat位置52的位置处的残基、在对应于Kabat位置83的位置处的残基、或在对应于Kabat位置85的位置处的残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括在对应于Kabat位置40的位置处的残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括在对应于Kabat位置41的位置处的残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括在对应于Kabat位置30的位置处的残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括在对应于Kabat位置52的位置处的残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括在对应于Kabat位置83的位置处的残基。在实施方案中，非CDR肽结合区包括在对应于Kabat位置85的位置处的残基。在实施方案中，形成非CDR肽结合区的残基描述于公开的美国申请US20120301400A1中，其在此整体且为了所有目的引入作为参考。
在实施方案中，非CDR肽结合区由根据Kabat编号，在VL区的位置8、9、10、38、39、40、41 42、43、44、45、82、83、84、85、86、87、99、100、101、102、103、104、105、142、162、163、164、165、166、167、168和173，以及VH区的位置6、9、38、39、40、41、42、43、44、45、84、86、87、88、89、90、91、103、104、105、106、107、108、111、110、147、150、151、152、173、174、175、176、177、185、186和187处的氨基酸残基形成。在实施方案中，非CDR肽结合区具有的轻链序列包括根据Kabat编号的P8、V9或I9、I10或L10、Q38、R39、T40、N41G42、S43、P44、R45、D82、I83、A84、D85、Y86、Y87、G99、A100、G101、T102、K103、L104、E105、R142、S162、V163、T164、E165、Q166、D167、S168和/或Y173，和/或具有的重链具有根据Kabat编号的Q6、P9、R38、Q39、S40、P41、G42、K43、G44、L45、S84、D86、T87、A88、I89、Y90、Y91、W103、G104、Q105、G106、T107、L108、V111、T110、Y147、E150、P151、V152、T173、F174、C175、A176、V177、Y185、S186和/或L187。
在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VL区的位置83处的Glu。在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VH区的位置40处的Thr或Ser。在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VL区的位置41处的Asn。在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VL区的位置85处的Asp或Asn。
本文提供的非CDR肽结合区包括第一半胱氨酸，其与本文提供的肽化合物中包括的硫醇侧链氨基酸形成二硫化物连接，从而将肽化合物共价附着至抗原结合结构域。在实施方案中，第一半胱氨酸形成第一组氨基酸残基(第一腔的氨基酸残基)、第二组氨基酸残基(第二腔的氨基酸残基)、或第三组氨基酸残基(孔区域的氨基酸残基)的部分。因此，在实施方案中，第一组氨基酸残基包括在对应于VL区的Kabat位置102、142或143的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第一组氨基酸残基包括在对应于VL区的Kabat位置102的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第一组氨基酸残基包括在对应于VL区的Kabat位置142的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第一组氨基酸残基包括在对应于VL区的Kabat位置143的位置处的第一半胱氨酸。
在实施方案中，第二组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置208或158的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第二组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置208的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第二组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置158的位置处的第一半胱氨酸。
在实施方案中，第三组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置174或175的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第三组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置174的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第三组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置175的位置处的第一半胱氨酸。
本文提供的共价复合物包括通过二硫化物连接与肽化合物(例如，式(I)或式(II)的肽化合物)共价附着的抗原结合结构域(例如，Fab)。如本文提供的，“二硫化物连接”、“二硫桥”或“二硫键”指通过使两个硫醇部分反应形成的共价键。两个反应硫醇部分中的第一个形成本文提供的抗原结合结构域的部分，并且第二个硫醇部分形成本文提供的肽化合物的部分。在实施方案中，本文提供的共价复合物具有RA-S-S-RB的结构，其中RA是抗原结合结构域，并且RB是肽化合物。二硫化物连接在肽化合物中包括的抗原结合结构域的半胱氨酸(第一半胱氨酸)和硫醇侧链氨基酸(例如半胱氨酸或取代的精氨酸)之间形成。本文提供的任何第一半胱氨酸都可以与肽化合物中包括的任何硫醇侧链氨基酸形成二硫化物连接。
如本文提供的，“硫醇侧链氨基酸”是包括具有硫原子的侧链的氨基酸，其中所述硫形成二硫化物连接的部分，并且在本文中也可以称为“含硫侧链氨基酸”。如本文提及的硫醇侧链氨基酸包括衍生自反应的-SH取代基的硫原子(即，硫醇基团或硫醇取代基，其为包括硫醇的基团或取代基)。因此，本文提供的硫醇侧链氨基酸也可以称为硫氨基酸侧链。硫醇侧链氨基酸的硫原子通过侧链硫醇基团与第二反应物的硫醇基团(例如第一半胱氨酸的侧链硫醇基团)的反应而形成。在实施方案中，硫原子形成氨基酸侧链(例如，半胱氨酸侧链)的部分。在实施方案中，硫原子形成取代的氨基酸侧链(例如，取代的精氨酸侧链)的部分。当硫原子形成取代的氨基酸侧链的部分时，氨基酸侧链可以被以下取代：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，取代的氨基酸侧链被辛基-硫醇取代。在实施方案中，辛基-硫醇具有下式：
在式(III)中，*表示具有氨基酸侧链的附着点，并且**表示与第一半胱氨酸的附着点。在实施方案中，取代的氨基酸侧链是取代的精氨酸侧链。在实施方案中，取代的精氨酸包括式(III)的化合物。在实施方案中，取代的精氨酸是辛基-硫醇取代的精氨酸。在实施方案中，辛基-硫醇取代的精氨酸包括式(III)的化合物。在实施方案中，硫醇侧链氨基酸是半胱氨酸。
在实施方案中，肽化合物具有下式：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2(I)。
在式(I)中，X0是Ser或空的。X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的。X2是Gln或空的。X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X4是Asp或Asn。X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X6是硫醇侧链氨基酸或丝氨酸。X7是硫醇侧链氨基酸、Thr或Ser。X8是硫醇侧链氨基酸、Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。X9是巯基侧链氨基酸、Arg或Ala。X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X11是硫醇侧链氨基酸、Gln、Lys或Arg。X12是Ser、Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的。R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列(在本文中也称为肽基部分)。R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列。L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基。R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分。X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
在实施方案中，X0是Ser。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1是Ser。在实施方案中，X1是Cys。在实施方案中，X1是Gly。在实施方案中，X1是β-丙氨酸。在实施方案中，X1是二氨基丙酸。在实施方案中，X1是β-叠氮基丙氨酸。在实施方案中，X1是空的。在实施方案中，X2是Gln。在实施方案中，X2是空的。在实施方案中，X3是Phe。在实施方案中，X3是Tyr。在实施方案中，X3是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X3是His。在实施方案中，X3是Asp。在实施方案中，X3是2-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是3-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是4-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是Asn。在实施方案中，X3是Gln。在实施方案中，X3是修饰的Phe。在实施方案中，X3是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X3是含硼酸的残基。在实施方案中，X4是Asp。在实施方案中，X4是Asn。在实施方案中，X5是Leu。在实施方案中，X5是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X5是Phe。在实施方案中，X5是Trp。在实施方案中，X5是Tyr。在实施方案中，X5是苯丙氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X5是色氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X5是酪氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X5是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X5是含硼酸的残基。在实施方案中，X6是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X6是丝氨酸。在实施方案中，X7是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X7是Thr。在实施方案中，X7是Ser。在实施方案中，X8是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X8是Ala。在实施方案中，X8是包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代的或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。在实施方案中，X9是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X9是Arg。在实施方案中，X9是Ala。在实施方案中，X10是Leu。在实施方案中，X10是Gln。在实施方案中，X10是Glu。在实施方案中，X10是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X10是Phe。在实施方案中，X10是Trp。在实施方案中，X10是Tyr。在实施方案中，X10是苯丙氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是色氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是酪氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X10是含硼酸的残基。在实施方案中，X11是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X11是Gln。在实施方案中，X11是Lys。在实施方案中，X11是Arg。在实施方案中，X12是Ser。在实施方案中，X12是Cys。在实施方案中，X12是Gly。在实施方案中，X12是7-氨基庚酸。在实施方案中，X12是β-丙氨酸。在实施方案中，X12是二氨基丙酸。在实施方案中，X12是炔丙基甘氨酸。在实施方案中，X12是异天冬氨酸。在实施方案中，X12是空的。在实施方案中，R1是空的。在实施方案中，R1是-L10A-L10B-R10。在实施方案中，R1是任选地被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列(在本文中也称为肽基部分)。在实施方案中，R2是空的。在实施方案中，R2是-L20A-L20B-R20。在实施方案中，R2是任选地被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列。在实施方案中，L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-,-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基。在实施方案中，R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分。在实施方案中，R10是反应性部分。在实施方案中，R20是反应性部分。在实施方案中，R10是诊断部分。在实施方案中，R20是诊断部分。在实施方案中，R10是治疗部分。在实施方案中，R20是治疗部分。在实施方案中，R10是可检测部分。在实施方案中，R20是可检测部分。在实施方案中，X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。在实施方案中，R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
在实施方案中，肽化合物具有下式：
R1-Ser-X2-X3-X4-β,β’二苯基Ala-Cys-Thr-X8-Arg-X10-X11-Ser-R2(IA)。
在式(IA)中，X2是Gln或空的。X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、修饰的Phe、含可水合羰基的残基、或含硼酸的残基。X4是Asp或Asn。X8是硫醇侧链氨基酸、Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X11是Gln、Lys或Arg。
在实施方案中，X2是Gln。在实施方案中，X2是空的。在实施方案中，X3是Phe。在实施方案中，X3是Tyr。在实施方案中，X3是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X3是His。在实施方案中，X3是Asp。在实施方案中，X3是2-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是3-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是4-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是Asn。在实施方案中，X3是Gln。在实施方案中，X3是修饰的Phe。在实施方案中，X3是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X3是含硼酸的残基。在实施方案中，X4是Asp。在实施方案中，X4是Asn。在实施方案中，X8是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X8是Ala。在实施方案中，X8是包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代的或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。在实施方案中，X10是Leu。在实施方案中，X10是Gln。在实施方案中，X10是Glu。在实施方案中，X10是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X10是Phe。在实施方案中，X10是Trp。在实施方案中，X10是Tyr。在实施方案中，X10是苯丙氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是色氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是酪氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X10是含硼酸的残基。在实施方案中，X11是Gln。在实施方案中，X11是Lys。在实施方案中，X11是Arg。
在实施方案中，肽化合物具有下式：
R1-Gln-X3-X4-β,β’-二苯基Ala-Ser-Thr-Arg-X9-X10-Lys-Ser-R2(IB)。
在式(IB)中，X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、修饰的Phe、含可水合羰基的残基、或含硼酸的残基。X4是Asp或Asn。X9是Arg或Ala。X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基，或含硼酸的残基。
在实施方案中，X3是Phe。在实施方案中，X3是Tyr。在实施方案中，X3是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X3是His。在实施方案中，X3是Asp。在实施方案中，X3是2-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是3-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是4-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是Asn。在实施方案中，X3是Gln。在实施方案中，X3是修饰的Phe。在实施方案中，X3是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X3是含硼酸的残基。在实施方案中，X4是Asp。在实施方案中，X4是Asn。在实施方案中，X9是Arg。在实施方案中，X9是Ala。在实施方案中，X10是Leu。在实施方案中，X10是Gln。在实施方案中，X10是Glu。在实施方案中，X10是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X10是Phe。在实施方案中，X10是Trp。在实施方案中，X10是Tyr。在实施方案中，X10是苯丙氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是色氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是酪氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X10是含硼酸的残基。
在实施方案中，肽化合物具有下式：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-R2(II)。
在式(II)中，X0是Ser或空的。X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的。X2是Gln或空的。X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X4是Asp或Asn。X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X6是Ser。X7是硫醇侧链氨基酸、Thr或Ser。X8是Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。X9是巯基侧链氨基酸、Arg或Ala。X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X11是硫醇侧链氨基酸、Gln、Lys或Arg。X12是Ser、Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的。X13是Gly或Ser。X14和X15独立地是Gly、Ser、Ala或硫醇侧链氨基酸。R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列。R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列。L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基。R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分。X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
在实施方案中，X0是Ser。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1是Ser。在实施方案中，X1是Cys。在实施方案中，X1是Gly。在实施方案中，X1是β-丙氨酸。在实施方案中，X1是二氨基丙酸。在实施方案中，X1是β-叠氮基丙氨酸。在实施方案中，X1是空的。在实施方案中，X2是Gln。在实施方案中，X2是空的。在实施方案中，X3是Phe。在实施方案中，X3是Tyr。在实施方案中，X3是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X3是His。在实施方案中，X3是Asp。在实施方案中，X3是2-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是3-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是4-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是Asn。在实施方案中，X3是Gln。在实施方案中，X3是修饰的Phe。在实施方案中，X3是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X3是含硼酸的残基。在实施方案中，X4是Asp。在实施方案中，X4是Asn。在实施方案中，X5是Leu。在实施方案中，X5是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X5是Phe。在实施方案中，X5是Trp。在实施方案中，X5是Tyr。在实施方案中，X5是苯丙氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X5是色氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X5是酪氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X5是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X5是含硼酸的残基。在实施方案中，X6是Ser。在实施方案中，X7是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X7是Thr。在实施方案中，X7是Ser。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X8是Ala。在实施方案中，X8是包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代的或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。在实施方案中，X9是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X9是Arg。在实施方案中，X9是Ala。在实施方案中，X10是Leu。在实施方案中，X10是Gln。在实施方案中，X10是Glu。在实施方案中，X10是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X10是Phe。在实施方案中，X10是Trp。在实施方案中，X10是Tyr。在实施方案中，X10是苯丙氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是色氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是酪氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X10是含硼酸的残基。在实施方案中，X11是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X11是Gln。在实施方案中，X11是Lys。在实施方案中，X11是Arg。在实施方案中，X12是Ser。在实施方案中，X12是Cys。在实施方案中，X12是Gly。在实施方案中，X12是7-氨基庚酸。在实施方案中，X12是β-丙氨酸。在实施方案中，X12是二氨基丙酸。在实施方案中，X12是炔丙基甘氨酸。在实施方案中，X12是异天冬氨酸。在实施方案中，X12是空的。在实施方案中，X13是Gly。在实施方案中，X13是Ser。X14和X15独立地是Gly、Ser、Ala或硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X14是Gly。在实施方案中，X14是Ser。在实施方案中，X14是Ala。在实施方案中，X14是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X15是Gly。在实施方案中，X15是Ser。在实施方案中，X15是Ala。在实施方案中，X15是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，R1是空的。在实施方案中，R1是-L10A-L10B-R10。在实施方案中，R1是任选地被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列(在本文中也称为肽基部分)。在实施方案中，R2是空的。在实施方案中，R2是-L20A-L20B-R20。在实施方案中，R2是任选地被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列。在实施方案中，L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-,-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基。在实施方案中，R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分。在实施方案中，R10是反应性部分。在实施方案中，R10是诊断部分。在实施方案中，R10是治疗部分。在实施方案中，R10是可检测部分。在实施方案中，R20是反应性部分。在实施方案中，R20是诊断部分。在实施方案中，R20是治疗部分。在实施方案中，R20是可检测部分。在实施方案中，X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
在实施方案中，肽化合物具有下式：
R1-Ser-X2-Phe-X4-β,β’-二苯基Ala-Ser-Thr-X8-Arg-Leu-Gln-Ser-X13-X14-X15-R2(IIA)。
在式(IIA)中，X2是Gln或空的。X4是Asp或Asn。X8是Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。X13是Gly或Ser。X14和X15独立地是Gly、Ser、Ala或硫醇侧链氨基酸。
在实施方案中，X2是Gln。在实施方案中，X2是空的。在实施方案中，X4是Asp。在实施方案中，X4是Asn。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X8是Ala。在实施方案中，X8是包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。在实施方案中，X13是Gly。在实施方案中，X13是Ser。在实施方案中，X14和X15独立地是Gly、Ser、Ala或硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X14是Gly。在实施方案中，X14是Ser。在实施方案中，X14是Ala。在实施方案中，X14是硫醇侧链氨基酸。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R1是取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R1是取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R1是未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R2是取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R2是取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R2是未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R3是取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R3是取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R3是未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R10是取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R10是取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R10是未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R20是取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R20是取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R20是未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的L3A可以是-O-、-S-、-S(O)2-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-N＝CH-、-NHC(O)NH-、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚芳基。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的L3A可以是-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的L3A可以是-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的L3B是化学接头。本文提供的化学接头可以是共价或非共价接头。本文提供的化学接头可以包括化学反应性官能团，以与第二化学反应性官能团反应，从而形成共价接头。如本文提及的化学接头可以包括通过使两个反应性基团(部分)反应形成的所得到的接头，所述反应性基团例如如本文所述的共价反应性基团(例如炔烃、硫醇、叠氮化物、马来酰亚胺)。在实施方案中，化学接头是1,3三唑接头(即，包含1,3-三唑接头部分的接头，例如与烷基(取代或未取代的)、酰胺、酯、磺酰胺等等组合，包括其组合)。本文提供的接头可以应用本领域众所周知的方法共价附着至非CDR肽结合区或空间位阻化学部分(R3)，并且与本文提供的复合物的组合物相容。本文提供的接头可以包括在与例如非CDR肽结合区或空间位阻化学部分的附着点处的反应性基团的缀合产物。因此，本文提供的接头可以是多价的和/或可以通过共轭化学技术形成。可用于本文提供的组合物和方法的接头的非限制性实例是包含烷基基团(包括取代的烷基基团以及含有杂原子部分的烷基基团和短烷基基团)、酯基团、酰胺基团、胺基团、环氧基团和/或乙二醇或其衍生物的接头。本文提供的接头可以包括形成磺酰胺的砜基团、酯基团和/或醚基团(例如，三乙基醚)。
在实施方案中，本文提供的化学接头是可切割的肽接头，包括蛋白酶切割位点。如本文使用的，“切割位点”指用于切割本文所述接头的一部分的可识别位点。因此，可以在如本文所述的可切割肽接头的序列中发现切割位点，包括其实施方案。在实施方案中，切割位点是被切割试剂(例如，肽基序列)识别且切割的氨基酸序列。示例性切割试剂包括蛋白质、酶、DNA酶、RNA酶、金属、酸和碱。在实施方案中，蛋白酶切割位点是肿瘤相关蛋白酶切割位点。如本文提供的，“肿瘤相关蛋白酶切割位点”是由蛋白酶识别的氨基酸序列，其表达对于肿瘤细胞或其肿瘤细胞环境是特异性的。在实施方案中，蛋白酶切割位点是基质金属蛋白酶(MMP)切割位点、含解整联蛋白和金属蛋白酶结构域(ADAM)的金属蛋白酶切割位点、前列腺特异性抗原(PSA)蛋白酶切割位点、尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)蛋白酶切割位点、膜型丝氨酸蛋白酶1(MT-SP1)蛋白酶切割位点或豆荚蛋白(legumain)蛋白酶切割位点。在实施方案中，基质金属蛋白酶(MMP)切割位点是MMP9切割位点、MMP 13切割位点或MMP 2切割位点。在实施方案中，含解整联蛋白和金属蛋白酶结构域(ADAM)的金属蛋白酶切割位点是ADAM 9金属蛋白酶切割位点、ADAM 10金属蛋白酶切割位点或ADAM 17金属蛋白酶切割位点。
如本文提供的化学接头(例如L3B)可以是-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚芳基。
如本文提供的化学接头(例如L3B)可以是-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
如本文提供的化学接头(例如L3B)可以是-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
在实施方案中，化学接头(L3B)是共价接头。在实施方案中，化学接头(L3B)是PEG接头。在实施方案中，化学接头(L3B)是烃接头。在实施方案中，化学接头(L3B)是可切割的肽接头。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的L10A、L10B、L20A和/或L20B可以独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚芳基。
在实施方案中，L10A、L10B、L20A和/或L20B可以独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
在实施方案中，L10A、L10B、L20A和/或L20B可以独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的L10A可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚芳基。
在实施方案中，L10A可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
在实施方案中，L10A可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的L10B可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚芳基。
在实施方案中，L10B可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
在实施方案中，L10B可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的L20A可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚芳基。
在实施方案中，L20A可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
在实施方案中，L20A可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的L20B可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环亚烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的亚芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂亚芳基。
在实施方案中，L20B可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
在实施方案中，L20B可以是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)亚烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂亚烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环亚烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环亚烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)亚芳基、或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂亚芳基。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的R3是空间位阻化学部分。本文提供的“空间位阻化学部分”是这样的部分，其是空间受阻的以穿过形成抗原结合结构域的部分的中心孔。空间位阻发生在空间位阻化学部分和衬里中心孔的氨基酸之间，从而促进机械互锁。因此，空间位阻化学部分在大小、尺寸或体积方面足以产生空间位阻(“塞子”)，从而显著降低(例如，抑制或预防)空间位阻化学部分穿过孔朝向孔形成第一腔的抗原结合结构域的一侧的能力。在实施方案中，其中空间位阻化学部分可以通过的中心孔的最长直径(例如，通过晶体结构从氨基酸残基到氨基酸残基测量的跨越中心孔的最长距离)短于空间位阻化学部分(本文也称为R3)的最长尺寸(例如，直径)。在实施方案中，中心孔(例如，如在晶体结构中测量的孔的最长直径)大小(例如，长度、直径)为约3至约在实施方案中，空间位阻化学部分的最长尺寸大小超过约3至约例如，当中心孔大小为时(例如，如在晶体结构中测量的孔的最长直径或直径)，空间位阻化学部分大小超过约 (即，最长尺寸大小超过约)。通常使用点击化学实现空间位阻化学部分与肽化合物的剩余部分的结合。在实施方案中，化学反应性官能团(例如，炔烃)存在于空间位阻化学部分上，其与存在于待反应的化学接头上的共轭(点击)化学反应。在实施方案中，空间位阻化学部分是取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、或者取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，空间位阻化学部分是取代或未取代的二苯基。空间位阻化学部分可以与非CDR肽结合区结合或相互作用或者不结合或不相互作用。在实施方案中，空间位阻化学部分与非CDR肽结合区不结合或不相互作用。
本文提供的式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的肽化合物可以包括治疗试剂或诊断试剂。因此，在实施方案中，R10和R20独立地是治疗试剂、诊断试剂或可检测试剂。治疗试剂、诊断试剂或可检测试剂(本文中也称为R10和/或R20)可以通过非共价或共价接头(本文中也称为L10A、L10B、L20A或L20B)与本文提供的肽化合物包括其实施方案附着。
本文提供的式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的肽化合物可以包括点击化学反应性部分。因此，在实施方案中，R1、R2、R10和R20独立地是反应性部分。反应性部分(在本文中也称为R1、R2、R10和/或R20)可以通过非共价或共价接头(在本文中也称为L10A、L10B、L20A或L20B)与本文提供的肽化合物包括其实施方案附着。在实施方案中，R1、R2、R10和R20独立地是反应性部分，并且反应性部分与本文提供的第二肽化合物包括其实施方案的第二反应性部分(第二R1、第二R2、第二R10或第二R20)反应。因此，在实施方案中，R1是反应性部分。在实施方案中，R2是反应性部分。在实施方案中，R10是反应性部分。在实施方案中，R20是反应性部分。本文提供的第一肽化合物的反应性部分(例如，R1、R2、R10和R20)可以与第二肽化合物的第二反应性部分(例如，R1、R2、R10和R20)反应(例如，通过点击化学)，由此形成将第一肽化合物与第二肽化合物共价连接的共价接头。在实施方案中，第一肽化合物是如本文提供的肽化合物，包括其实施方案。在实施方案中，第二肽化合物是如本文提供的肽化合物，包括其实施方案。在实施方案中，第一肽化合物与第一抗原结合结构域(例如，抗CD3抗原结合结构域、抗CD16抗原结合结构域)形成第一共价复合物(例如，通过二硫化物连接与之共价结合)，并且第二肽化合物与第二抗原结合结构域(例如，抗HER2抗原结合结构域)形成第二共价复合物(例如，通过二硫化物连接与之共价结合)，从而形成多特异性抗原结合复合物。因此，本文提供的组合物可以用于形成能够结合两种或更多种抗原的抗原结合缀合物，其中所述两种或更多种抗原可以是化学上不同的。
本文提供的肽化合物(例如，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的肽化合物)可以包括治疗部分(在本文中也称为R10或R20)。治疗部分可以是蛋白质部分。在实施方案中，蛋白质部分是抗体变体部分。在实施方案中，抗体变体部分是可变重链纳米抗体部分(包括可变重链结构域的纳米抗体部分)。在实施方案中，抗体变体部分是可变轻链纳米抗体部分(包括可变轻链结构域的纳米抗体部分)。在实施方案中，抗体变体部分是抗CD16纳米抗体部分。在实施方案中，抗体变体部分是抗HER2亲和体部分。如本文提及的，术语“部分”是与分子(例如式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的肽化合物的R1、R2或–L3A-L3B-R3)的剩余部分附着的蛋白质或肽(例如纳米抗体)。治疗部分(在本文中也称为R10或R20)可以通过接头L10A、L10B、L20A或L20B共价附着至分子的剩余部分。对于本文提供的复合物和肽化合物，治疗部分(例如，纳米抗体、亲和体)可以附着至肽化合物的C末端、肽化合物的N末端、或肽化合物在(连接)C末端和N末端之间的一部分。在实施方案中，治疗部分附着至肽化合物的C末端。在实施方案中，治疗部分附着至肽化合物的N末端。因此，在实施方案中，R10是治疗部分。在实施方案中，R20是治疗部分。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B独立地是肽基接头。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度至少2个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度至少4个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约2个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约4个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度2个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度4个氨基酸。在实施方案中，R10是治疗部分并且R2是空的。在实施方案中，R20是治疗部分并且R1是空的。
在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约2至约10个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约3至约10个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约4至约10个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约5至约10个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约6至约10个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约7至约10个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约8至约10个氨基酸。
在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约2至约9个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约3至约9个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约4至约9个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约5至约9个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约6至约9个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约7至约9个氨基酸。
在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约2至约8个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约3至约8个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约4至约8个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约5至约8个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约6至约8个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约2至约7个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约3至约7个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约4至约7个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约5至约7个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约2至约6个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约3至约6个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约4至约6个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约2至约5个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约3至约5个氨基酸。在实施方案中，接头L10A、L10B、L20A或L20B为长度约2至约4个氨基酸。
在实施方案中，治疗部分是纳米抗体部分，并且纳米抗体部分附着至肽化合物的C末端。因此，在实施方案中，R20是抗CD16纳米抗体部分，并且L20A或L20B为长度约2至约10个氨基酸。在实施方案中，R20是抗CD16纳米抗体部分，并且L20A或L20B为长度约4至约6个氨基酸。在实施方案中，R20是抗CD16纳米抗体部分，并且L20A或L20B为长度4个氨基酸。在实施方案中，R20是抗CD16纳米抗体部分，并且L20A或L20B为长度5个氨基酸。在实施方案中，R20是抗CD16纳米抗体部分，并且L20A或L20B为长度6个氨基酸。在实施方案中，R20是抗CD16纳米抗体部分，并且L20A或L20B为长度7个氨基酸。在实施方案中，R20是抗CD16纳米抗体部分，并且L20A或L20B为长度8个氨基酸。在实施方案中，R20是抗CD16纳米抗体部分，并且L20A或L20B为长度9个氨基酸。在实施方案中，R20是抗CD16纳米抗体部分，并且L20A或L20B为长度10个氨基酸。
在实施方案中，治疗部分是纳米抗体部分，并且纳米抗体部分附着至肽化合物的N末端。因此，在实施方案中，R10是抗CD16纳米抗体部分，并且L10A或L10B独立地是长度约2至约10个氨基酸。在实施方案中，R10是抗CD16纳米抗体部分，并且L10A或L10B独立地是长度约4至约6个氨基酸。在实施方案中，R10是抗CD16纳米抗体部分，并且L10A或L10B独立地是长度4个氨基酸。在实施方案中，R10是抗CD16纳米抗体部分，并且L10A或L10B独立地是长度5个氨基酸。在实施方案中，R10是抗CD16纳米抗体部分，并且L10A或L10B独立地是长度6个氨基酸。在实施方案中，R10是抗CD16纳米抗体部分，并且L10A或L10B独立地是长度7个氨基酸。在实施方案中R10是抗CD16纳米抗体部分，并且L10A或L10B独立地是长度8个氨基酸。在实施方案中，R10是抗CD16纳米抗体部分，并且L10A或L10B独立地是长度9个氨基酸。在实施方案中，R10是抗CD16纳米抗体部分，并且L10A或L10B独立地是长度10个氨基酸。
对于本文提供的肽化合物包括其实施方案，R20可以是治疗部分。在实施方案中，R20是蛋白质部分。在实施方案中，R20是纳米抗体部分。在实施方案中，R20是可变重链纳米抗体部分。在实施方案中，R20是抗CD16纳米抗体部分。在实施方案中，L20A或L20B独立地是肽基接头。在实施方案中，L20A是肽基接头。在实施方案中，L20B是肽基接头。在实施方案中，L20A或L20B独立地是长度约2至约10个氨基酸。在实施方案中，L20A或L20B独立地是长度约4至约6个氨基酸。在实施方案中，L20A为长度约2至约10个氨基酸。在实施方案中，L20A为长度约4至约6个氨基酸。在实施方案中，L20B为长度约2至约10个氨基酸。在实施方案中，L20B为长度约4至约6个氨基酸。
在实施方案中，治疗部分是亲和体(单链抗原结合多肽)部分，并且亲和体部分附着至肽化合物的N末端。因此，在实施方案中，R10是抗HER2亲和体部分(在本文中也称为zHER2部分)，并且L10A或L10B独立地是长度约2至约10个氨基酸。在实施方案中，R10是抗HER2亲和体部分，并且L10A或L10B独立地是长度约4至约6个氨基酸。在实施方案中，R10是抗HER2亲和体部分，并且L10A或L10B独立地是长度4个氨基酸。在实施方案中，R10是抗HER2亲和体部分，并且L10A或L10B独立地是长度5个氨基酸。在实施方案中，R10是抗HER2亲和体部分，并且L10A或L10B独立地是长度6个氨基酸。在实施方案中，R10是抗HER2亲和体部分，并且L10A或L10B独立地是长度7个氨基酸。在实施方案中，R10是抗HER2亲和体部分，并且L10A或L10B独立地是长度8个氨基酸。在实施方案中，R10是抗HER2亲和体部分，并且L10A或L10B独立地是长度9个氨基酸。在实施方案中，R10是抗HER2亲和体部分，并且L10A或L10B独立地是长度10个氨基酸。
对于本文提供的肽化合物包括其实施方案，R20可以是治疗部分。在实施方案中，R20是蛋白质部分。在实施方案中，R20是亲和体部分。在实施方案中，R20是抗HER2亲和体部分。在实施方案中，L20A或L20B独立地是肽基接头。在实施方案中，L20A是肽基接头。在实施方案中，L20B是肽基接头。在实施方案中，L20A或L20B独立地是长度约2至约10个氨基酸。在实施方案中，L20A或L20B独立地是长度约4至约6个氨基酸。在实施方案中，L20A为长度约2至约10个氨基酸。在实施方案中，L20A为长度约4至约6个氨基酸。在实施方案中，L20B为长度约2至约10个氨基酸。在实施方案中，L20B为长度约4至约6个氨基酸。
在实施方案中，式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的肽化合物包括通过接头L10A、L10B、L20A或L20B共价附着至分子的剩余部分的治疗部分(在本文中也称为R10或R20)。在实施方案中，R10和R20独立地是治疗部分。如本文提供的，术语“治疗部分”根据其平常的普通含义使用，并且指当给予有此需要的受试者时，具有治疗益处(例如，待治疗的潜在病症的预防、根除、改善)的单价化合物。如本文提供的治疗部分可以包括但不限于肽、蛋白质、核酸、核酸类似物、小分子、抗体、纳米抗体、酶、前药、细胞毒素剂(例如毒素)，包括但不限于蓖麻毒素、多柔比星、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、二羟基蒽二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思子毒素和糖皮质激素。在实施方案中，治疗部分是如本文所述的抗癌剂或化学治疗试剂。在实施方案中，治疗部分是核酸部分、肽部分或小分子药物部分。在实施方案中，治疗部分是核酸部分。在实施方案中，治疗部分是抗体部分。在实施方案中，治疗部分是肽部分。在实施方案中，治疗部分是小分子药物部分。在实施方案中，治疗部分是核酸酶。在实施方案中，治疗部分是免疫刺激剂。在实施方案中，治疗部分是毒素。在实施方案中，治疗部分是核酸酶。在实施方案中，治疗部分是奥里斯他汀。在实施方案中，治疗部分是美登素。
式(I)、(IA)、(IB)、(II)和(IIA)的肽化合物可以包括成像或可检测部分。在实施方案中，R10和R20独立地是可检测部分。如本文提供的“成像或可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的单价化合物。在实施方案中，成像部分与肽化合物共价附着。示例性成像部分并不限于32P、放射性核素、正电子发射同位素、荧光染料、荧光团、抗体、生物发光分子、化学发光分子、光活性分子、金属、电子致密试剂、酶(例如，如ELISA中常用的)、磁性造影剂、量子点、纳米颗粒、生物素、地高辛、半抗原和蛋白质或其它实体，其可以例如通过将放射性标记掺入与靶肽特异性反应的肽或抗体内成为可检测的。可以采用本领域已知的用于将抗体与该部分缀合的任何方法，例如，使用Hermanson，Bioconjugate Techniques 1996，Academic Press，Inc.，San Diego中描述的方法。示例性荧光团包括荧光素、罗丹明、GFP、香豆素、FITC、ALEXA氟、Cy3、Cy5、BODIPY和花青染料。示例性放射性核素包括氟-18、镓-68和铜-64。示例性磁性造影剂包括钆、氧化铁和铁铂、以及锰。在实施方案中，成像部分是生物发光分子。在实施方案中，成像部分是光活性分子。在实施方案中，成像部分是金属。在实施方案中，成像部分是纳米颗粒。
在式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的实施方案中，X0是Ser。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1是Ser。在实施方案中，X1是Cys。在实施方案中，X1是Gly。在实施方案中，X1是β-丙氨酸。在实施方案中，X1是二氨基丙酸。在实施方案中，X1是β-叠氮基丙氨酸。在实施方案中，X1是空的。
在实施方案中，X2是Gln。在实施方案中，X2是空的。
在实施方案中，X3是Phe。在实施方案中，X3是Tyr。在实施方案中，X3是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X3是His。在实施方案中，X3是Asp。在实施方案中，X3是2-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是3-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是4-溴-L-苯丙氨酸。在实施方案中，X3是Asn。在实施方案中，X3是Gln。在实施方案中，X3是修饰的Phe。在实施方案中，X3是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X3是含硼酸的残基。
在实施方案中，X4是Asp。在实施方案中，X4是Asn。
在实施方案中，X5是Leu。在实施方案中，X5是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X5是Phe。在实施方案中，X5是Trp。在实施方案中，X5是Tyr。在实施方案中，X5是苯丙氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X5是色氨酸。在实施方案中，X5是酪氨酸。在实施方案中，X5是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X5是含硼酸的残基。
在实施方案中，X6是Cys。在实施方案中，X6是受保护的Cys。在实施方案中，X6是Ser。在实施方案中，X6是硫醇侧链氨基酸。
在实施方案中，X7是Cys。在实施方案中，X7是受保护的Cys。在实施方案中，X7是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X7是Thr。在实施方案中，X7是Ser。
在实施方案中，X8是受保护的Arg。在实施方案中，X8是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X8是Ala。在实施方案中，X8是包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。
在实施方案中，X9是Cys。在实施方案中，X9是受保护的Cys。在实施方案中，X9是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X9是Arg。在实施方案中，X9是Ala。
在实施方案中，X10是Leu。在实施方案中，X10是Gln。在实施方案中，X10是Glu。在实施方案中，X10是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X10是Phe。在实施方案中，X10是Trp。在实施方案中，X10是Tyr。在实施方案中，X10是苯丙氨酸的非天然类似物。在实施方案中，X10是色氨酸。在实施方案中，X10是酪氨酸。在实施方案中，X10是含可水合羰基的残基。在实施方案中，X10是含硼酸的残基。
在实施方案中，X11是Cys。在实施方案中，X11是受保护的Cys。在实施方案中，X11是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X11是Gln。在实施方案中，X11是Lys。在实施方案中，X11是Arg。
在实施方案中，X12是Ser。在实施方案中，X12是Cys。在实施方案中，X12是受保护的Cys。在实施方案中，X12是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X12是Gly。在实施方案中，X12是7-氨基庚酸。在实施方案中，X12是β-丙氨酸。在实施方案中，X12是二氨基丙酸。在实施方案中，X12是炔丙基甘氨酸。在实施方案中，X12是异天冬氨酸。在实施方案中，X12是空的。
在式(II)的实施方案中，X13是Gly。在实施方案中，X13是Ser。
在实施方案中，X14是Gly。在实施方案中，X14是Ser。在实施方案中，X14是Ala。在实施方案中，X14是Cys。在实施方案中，X14是受保护的Cys。在实施方案中，X14是硫醇侧链氨基酸。
在实施方案中，X15是Gly。在实施方案中，X15是Ser。在实施方案中，X15是Ala。在实施方案中，X15是Cys。在实施方案中，X15是受保护的Cys。在实施方案中，X15是硫醇侧链氨基酸。
在实施方案中，X13和X14独立地是Gly、Ala、Pro、Gln、Asn、Lys、Arg、Glu、Asp或His。
在实施方案中，X6是硫醇侧链氨基酸。在一个进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是半胱氨酸。在实施方案中，X7是硫醇侧链氨基酸。在一个进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是半胱氨酸。在实施方案中，X8是硫醇侧链氨基酸。在一个进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是取代的精氨酸。在实施方案中，X9是硫醇侧链氨基酸。在一个进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是半胱氨酸。在实施方案中，X11是硫醇侧链氨基酸。在一个进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是半胱氨酸。在实施方案中，X11是硫醇侧链氨基酸。在一个进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是半胱氨酸。
在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置175的位置处，并且X6是硫醇侧链氨基酸。在进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是半胱氨酸。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置174的位置处，并且X6是硫醇侧链氨基酸。在进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是半胱氨酸。
在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置158的位置处，并且X8是硫醇侧链氨基酸。在进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是取代的精氨酸。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置208的位置处，并且X8是硫醇侧链氨基酸。在进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是取代的精氨酸。
在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置142的位置处，并且X15是硫醇侧链氨基酸。在进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是半胱氨酸。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置143的位置处，并且X15是硫醇侧链氨基酸。在进一步的实施方案中，硫醇侧链氨基酸是半胱氨酸。
在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置175的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：1的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置175的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：4的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置175的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：22的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置175的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：27的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置175的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：23的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置175的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：28的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置175的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：44的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置174的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：1的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置174的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：4的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置175的位置处，并且肽化合物是SEQ ID NO：1的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置175的位置处，并且肽化合物是SEQ ID NO：4的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置174的位置处，并且肽化合物是SEQ ID NO：1的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置174的位置处，并且肽化合物是SEQ ID NO：4的序列。
在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置158的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：2的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置208的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：2的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置158的位置处，并且肽化合物是SEQ ID NO：2的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置208的位置处，并且肽化合物是SEQ ID NO：2的序列。
在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置142的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：3的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置143的位置处，并且肽化合物包括SEQ ID NO：3的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置142的位置处，并且肽化合物是SEQ ID NO：3的序列。在实施方案中，第一半胱氨酸在对应于Kabat位置143的位置处，并且肽化合物是SEQ ID NO：3的序列。
在式(I)的实施方案中，在位置X6处的硫醇侧链氨基酸是Cys。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1和X12独立地是Ser。在实施方案中，X1和X12是Ser。在实施方案中，X5是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是-Gly-Gly-Lys。在实施方案中，X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。在实施方案中，肽化合物是线性肽化合物。如本文提供的“线性肽化合物”是包括线性肽基部分的肽化合物。如本文提供的线性肽化合物不包括环肽基部分。在实施方案中，肽化合物包括SEQID NO：1的序列。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、或SEQ ID NO：44的序列。
在式(I)的实施方案中，X6是Ser。在实施方案中，X5是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，在位置X8处的硫醇侧链氨基酸是取代的精氨酸。在实施方案中，取代的精氨酸是辛基-硫醇取代的精氨酸。在实施方案中，X0和X1是空的。在实施方案中，X11是赖氨酸。在实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是-Gly-Gly-Lys。在实施方案中，R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：2的序列。
在式(I)的实施方案中，X6是Ser。在实施方案中，X5是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X12是Ser。在实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是–Ser-Gly-X15-Gly-Lys，其中X15是硫醇侧链氨基酸。在实施方案中，X15是Cys。在实施方案中，X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：3的序列。
在式(I)的实施方案中，在位置X6处的硫醇侧链氨基酸是Cys。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1和X12独立地是Ser。在实施方案中，X1和X12是Ser。在实施方案中，X5是Phe。在实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的或–C(O)-CH3，并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是-Gly-Gly-Ser-Lys。在实施方案中，X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。在实施方案中，肽化合物是线性肽化合物。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：27的序列。
在式(I)的实施方案中，在位置X6处的硫醇侧链氨基酸是Cys。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1和X12独立地是Ser。在实施方案中，X1和X12是Ser。在实施方案中，X5是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的或–C(O)-CH3，并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是-Gly-Gly-Ser-Lys。在实施方案中，X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。在实施方案中，肽化合物是线性肽化合物。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：28的序列。
在式(I)的实施方案中，X1是Cys。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1是空的。在实施方案中，X12是Cys。在实施方案中，X5是Leu。在实施方案中，R1是–C(O)-CH3。在实施方案中，肽化合物是线性肽化合物。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：44的序列。
在式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是1至90个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是1至80个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是1至70个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是1至60个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是1至50个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是1至40个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是1至30个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是1至20个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是1至10个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至90个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至80个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至70个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至60个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至50个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至40个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至30个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至20个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至10个氨基酸的肽序列。
在式(I)、(IA)、(IB)、(II)或(IIA)的实施方案中，R1是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是1至90个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是1至80个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是1至70个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是1至60个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是1至50个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是1至40个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是1至30个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是1至20个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是1至10个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R1是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是空的并且R1是1至90个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是空的并且R1是1至80个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是空的并且R1是1至70个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是空的并且R1是1至60个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是空的并且R1是1至50个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是空的并且R1是1至40个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是空的并且R1是1至30个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是空的并且R1是1至20个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是空的并且R1是1至10个氨基酸的肽序列。
在式(II)的实施方案中，R2是1至10个氨基酸的肽序列。在式(II)的实施方案中，R1是空的并且R2是1至10个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是–Gly-Lys。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：3的序列。
在实施方案中，R10和R20独立地是取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的芳基、或者取代(例如，被取代基团、尺寸受限的取代基或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。
R10和R20可以独立地是取代或未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、取代或未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、取代或未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、取代或未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、取代或未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或者取代或未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
R10和R20可以独立地是未取代的(例如，C1-C20、C1-C10、C1-C5)烷基、未取代的(例如，2至20元、2至10元、2至5元)杂烷基、未取代的(例如，C3-C8、C3-C6、C3-C5)环烷基、未取代的(例如，3至8元、3至6元、3至5元)杂环烷基、未取代的(例如，C6-C10、C6-C8、C6-C5)芳基、或者未取代的(例如，5至10元、5至8元、5至6元)杂芳基。
在实施方案中，抗原结合结构域包括片段抗原结合(Fab)结构域。在实施方案中，抗原结合结构域包括Fc结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是片段抗原结合(Fab)结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是人源化的抗原结合结构域。
在实施方案中，非CDR肽结合区由根据Kabat编号，在VL区的位置8、9、10、38、39、40、41 42、43、44、45、82、83、84、85、86、87、99、100、101、102、103、104、105、142、162、163、164、165、166、167、168和173，以及VH区的6、9、38、39、40、41、42、43、44、45、84、86、87、88、89、90、91、103、104、105、106、107、108、111、110、147、150、151、152、173、174、175、176、177、185、186和187处的氨基酸残基形成。
在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VL区的位置83处的Glu。在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VH区的位置40处的Thr或Ser。在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VL区的位置41处的Asn。在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VL区的位置85处的Asp或Asn。在实施方案中，抗原结合结构域以相对于肽化合物的不存在增加的亲和力结合抗原。
在实施方案中，抗原结合结构域以相对于肽化合物的不存在增加的亲和力结合抗原。当抗原结合结构域以相对于肽化合物的不存在增加的亲和力结合抗原时，抗原结合结构域与抗原的结合在肽化合物的存在下比在肽化合物的不存在下更强。
在实施方案中，抗原结合结构域以小于100nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于95nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于90nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于85nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于80nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于75nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于70nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于65nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于60nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于55nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于50nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于45nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于40nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于35nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于30nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于25nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于20nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于15nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于10nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于9nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于8nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于7nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于6nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于5nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于4nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于3nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于2nM的KD结合抗原。在实施方案中，抗原结合结构域以小于1nM的KD结合抗原。
肽化合物
本文提供的肽化合物可以是线性或环状化合物(即，包括线性或环状肽基部分的化合物)，并且可以包括空间位阻化学部分、治疗或诊断部分。在实施方案中，肽化合物被环化(例如通过氨基酸侧链部分环化)。对于本节段中描述的肽化合物，与关于描述共价复合物的节段中定义的肽化合物相同的定义和实施方案是适用的，除了此处所述的肽化合物不是复合的之外。因此，在另一个方面，提供了下式的肽化合物：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2(I)
。在式(I)中，X0是Ser或空的。X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的。X2是Gln或空的。X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X4是Asp或Asn。X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X6是Cys、受保护的Cys或Ser。X7是Cys、受保护的Cys、Thr或Ser。X8是受保护的Arg、Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。X9是Cys、受保护的Cys、Arg或Ala。X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X11是Cys、受保护的Cys、Gln、Lys或Arg。X12是Ser、Cys、受保护的Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的。R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列。R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列。L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基。R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分。X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
如本文提供的，“受保护的氨基酸残基”(例如，受保护的Cys或受保护的Arg)指与保护基团或离去基团共价附着的氨基酸。保护基团或离去基团可以附着至氨基酸的侧链。术语“保护基团”或“离去基团”基于其在化学领域中众所周知的一般含义使用。示例性的离去基团包括但不限于Isidro-Llobet等人(Chem.Rev.，2009，109(6)，第2455–2504页)和Andreu等人(Methods in Molecular Biology，第35卷，第7章，Peptide SynthesisProtocols，1994，Humana Press Inc.)中描述的任何氨基酸保护基团，所述参考文献在此整体且为了所有目的引入作为参考。在实施方案中，受保护的Cys包括硫代-嘧啶部分。在实施方案中，受保护的Cys包括硫代-吡啶部分。在实施方案中，硫代-吡啶部分(通过二硫键)共价附着至Cys的侧链。因此，在实施方案中，受保护的Cys是硫代-吡啶取代的Cys。在实施方案中，硫代-吡啶部分具有下式：
在式(IV)中，表示与氨基酸侧链的附着点。
在式(I)的实施方案中，X6是Cys。在式(I)的实施方案中，X6是受保护的Cys。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1和X12独立地是Ser。在实施方案中，X1和X12是Ser。在实施方案中，X5是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是-Gly-Gly-Lys。在实施方案中，X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：1的序列。
在式(I)的实施方案中，X6是Ser。在实施方案中，X5是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X12是Ser。在实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是–Ser-Gly-X15-Gly-Lys，其中X15是Cys或受保护的Cys。在实施方案中，X15是Cys。在实施方案中，X15是受保护的Cys。在实施方案中，X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：3的序列。
在式(I)的实施方案中，在位置X6处的硫醇侧链氨基酸是Cys。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1和X12独立地是Ser。在实施方案中，X1和X12是Ser。在实施方案中，X5是Phe。在实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的或–C(O)-CH3，并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是-Gly-Gly-Ser-Lys。在实施方案中，X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。在实施方案中，肽化合物是线性肽化合物。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：22或SEQ IDNO：27的序列。
在式(I)的实施方案中，在位置X6处的硫醇侧链氨基酸是Cys。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1和X12独立地是Ser。在实施方案中，X1和X12是Ser。在实施方案中，X5是β,β’-二苯基-Ala。在实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的或–C(O)-CH3，并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是-Gly-Gly-Ser-Lys。在实施方案中，X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。在实施方案中，肽化合物是线性肽化合物。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：28的序列。
在式(I)的实施方案中，X1是Cys。在实施方案中，X8是Arg。在实施方案中，X0是空的。在实施方案中，X1是空的。在实施方案中，X12是Cys。在实施方案中，X5是Leu。在实施方案中，R1是–C(O)-CH3。在实施方案中，肽化合物是线性肽化合物。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：44的序列。
在实施方案中，肽化合物具有下述结构：
在另一个方面，提供了下式的肽化合物：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-R2(II)
。在式(II)中，X0是Ser或空的。X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的。X2是Gln或空的。X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X4是Asp或Asn。X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X6是Ser。X7是Cys、受保护的Cys、Thr或Ser。X8是Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分。X9是Cys、受保护的Cys、Arg或Ala。X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基。X11是Cys、受保护的Cys、Gln、Lys或Arg。X12是Ser、Cys、受保护的Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的。X13是Gly或Ser。X14和X15独立地是Gly、Ser、Ala、Cys或受保护的Cys。R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列。R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列。L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基。R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分。X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
在实施方案中，X15是Cys。在实施方案中，X15是受保护的Cys。在实施方案中，R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。在实施方案中，R2是–Gly-Lys。在实施方案中，肽化合物包括SEQ ID NO：3的序列。
在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：1的序列。在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：4的序列。在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO.23的序列。在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO.28的序列。在一个实施方案中，X0是空的，X1是Ser，X2是Gln，X3是Asp，X5是β,β'-二苯基-Ala，X6是Cys，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12是Ser，R1是–C(O)CH3，并且R2是-Gly-Gly-Lys或-Gly-Gly-Ser-Lys
在一个实施方案中，X0是空的，X1是Ser，X2是Gln，X3是Phe，X4是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是硫代-吡啶取代的Cys，X7是Thr X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12是Ser，R1是–C(O)CH3，并且R2是-Gly-Gly-Lys。
在一个实施方案中，X0是空的，X1是Ser，X2是Gln，X3是Phe，X4是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是Cys，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12是Ser，R1是–C(O)CH3并且R2是-L20A-L20B-R20，其中L20A是具有序列-Gly-Gly-Lys-的肽基接头，-L20B是键并且-R20是可检测部分。
在一个实施方案中，X0是空的，X1是Ser，X2是Gln，X3是Phe，X4是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是硫代-吡啶取代的Cys，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12是Ser，R1是–C(O)CH3并且R2是-L20A-L20B-R20，其中L20A是具有序列-Gly-Gly-Lys-的肽基接头，-L20B是键并且-R20是可检测部分。
在一个实施方案中，X0是空的，X1是Ser，X2是Gln，X3是Phe，X4是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是Cys，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12是Ser，R1是–C(O)CH3并且R2是-L20A-L20B-R20，其中L20A是具有序列-Gly-Gly-Lys-的肽基接头，-L20B是键并且-R20是反应性部分。
在一个实施方案中，X0是空的，X1是Ser，X2是Gln，X3是Phe，X4是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是硫代-吡啶取代的Cys，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12是Ser，R1是–C(O)CH3并且R2是-L20A-L20B-R20，其中L20A是具有序列-Gly-Gly-Lys-的肽基接头，-L20B是键并且-R20是反应性部分。
在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：2的序列。在一个实施方案中，X0是空的，X1是空的，X3是Phe，X4是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是Ser，X7是Thr，X8是正辛基硫醇取代的Arg，X9是Arg，X10是Leu，X11是Lys，X12是Ser，R1是氨基庚酸并且R2是-Gly-Gly-Lys。
在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：3的序列。在一个实施方案中，X0是空的，X1是Ser，X2是Gln，X3是Phe，X4是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是Ser，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12是Ser，R1是–C(O)CH3并且R2是-Ser-Gly-Cys-Gly-Lys。
在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：3的序列。在一个实施方案中，X0是空的，X1是Ser，X2是Gln，X3是Phe，X4是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是Ser，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12是Ser，R1是-C(O)CH3并且R2是-Ser-Gly-X15-Gly-Lys，其中X15是硫代-吡啶取代的Cys。
在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：3的序列。在一个实施方案中，X0是空的，X1是Ser，X2是Gln，X3是Phe，X4是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是Ser，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12和X13是Ser，X14是Gly，X15是Cys，R1是-C(O)CH3并且R2是-Gly-Lys。
在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：3的序列。在一个实施方案中，X0是空的，X1是Ser，X2是Gln，X3是Phe，X4是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是Ser，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12和X13是Ser，X14是Gly，X15是硫代-吡啶取代的Cys，R1是-C(O)CH3并且R2是-Gly-Lys。
在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：22的序列。在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：27的序列。在一个实施方案中，X0是Ser，X1是Gln，X2是Phe，X3是Asp，X4是Phe，X5是Cys，X6是Thr，X7是Arg，X8是Arg，X9是Leu，X10是Gln，X11是Ser，X12是Gly，X13是Gly，X14是Ser，X15是Lys，R1是-C(O)CH3或空的并且R2是空的。
在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：24的序列。在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：26的序列。在一个实施方案中，X0是Ser，X1是Gln，X2是Phe，X3是Asp，X5是β,β’-二苯基-Ala，X6是Ser，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Gln，X12是Ser，X13是Gly，X14是Gly，X15是Ser，R1是-C(O)CH3并且R2是-Lys。
在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：44的序列。在一个实施方案中，X0是空的，X1是Cys，X2是Gln，X3是Phe，X4是Asp，X5是Leu，X6是Ser，X7是Thr，X8和X9是Arg，X10是Leu，X11是Lys，X12是Cys，R1是-C(O)CH3并且R2是空的。
在实施方案中，肽化合物具有SEQ ID NO：25的序列。
抗原结合结构域
对于本文所述的抗原结合结构域组合物，与关于描述共价复合物的节段中定义的抗原结合结构域相同的定义和实施方案是适用的。例如，本文所述的抗原结合结构域可以包括肽结合位点，其包括在对应于Kabat位置175的位置处的半胱氨酸；可以包括Fab或是Fab，并且非CDR结合位点可以包括构架区氨基酸残基。因此，在另一个方面，提供了抗原结合结构域。抗原结合结构域包括：(1)由第一腔和第二腔之间的抗原结合结构域的重链可变(VH)区、轻链可变区(VL)、重链恒定(CH1)区和轻链恒定(CL)区包围的中心孔；以及(2)非CDR肽结合区，其包括：(a)由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第一组氨基酸残基衬里的第一腔；其中所述第一组氨基酸残基包括在对应于VL区的Kabat位置102、142或143的位置处的半胱氨酸；(b)由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第二组氨基酸残基衬里的第二腔；其中所述第二组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置208或158的位置处的半胱氨酸；或(c)包围在第一腔和第二腔之间的孔的孔区域，所述孔区域由抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第三组氨基酸残基衬里，其中所述第三组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置174或175的位置处的半胱氨酸。
在实施方案中，第一组氨基酸残基包括在对应于VL区的Kabat位置102的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第一组氨基酸残基包括在对应于VL区的Kabat位置142的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第一组氨基酸残基包括在对应于VL区的Kabat位置143的位置处的第一半胱氨酸。
在实施方案中，第二组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置208的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第二组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置158的位置处的第一半胱氨酸。
在实施方案中，第三组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置174的位置处的第一半胱氨酸。在实施方案中，第三组氨基酸残基包括在对应于VH区的Kabat位置175的位置处的第一半胱氨酸。
在实施方案中，抗原结合结构域包括片段抗原结合(Fab)结构域。在实施方案中，抗原结合结构域包括Fc结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是片段抗原结合(Fab)结构域。在实施方案中，抗原结合结构域是人源化的抗原结合结构域。在实施方案中，非CDR肽结合区包括构架区氨基酸残基。
在实施方案中，非CDR肽结合区由根据Kabat编号，在VL区的位置8、9、10、38、39、40、41 42、43、44、45、82、83、84、85、86、87、99、100、101、102、103、104、105、142、162、163、164、165、166、167、168和173，以及VH区的6、9、38、39、40、41、42、43、44、45、84、86、87、88、89、90、91、103、104、105、106、107、108、111、110、147、150、151、152、173、174、175、176、177、185、186和187处的氨基酸残基形成。
在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VL区的位置83处的Glu。在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VH区的位置40处的Thr或Ser。在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VL区的位置41处的Asn。在实施方案中，非CDR肽结合区包括根据Kabat编号在VL区的位置85处的Asp或Asn。
实施例
实施例1：Cys-中间位
在一些情况下，期望通过共价键对单克隆抗体添加功能性。为实现此目的，申请人使用中间位/中间位使能的Fab(meFab)相互作用，以产生二硫键(图1和图2A)。
基于中间位-meFab相互作用的仔细检查和通过定点诱变在K208处引入的半胱氨酸(Cys)未被氧化的先前观察，申请人在曲妥珠单抗中间位使能的单克隆抗体(memAb)V2(I83E)中的丙氨酸(Ala)175位置处引入Cys。另外，申请人合成了线性中间位(SEQ.ID NO：4)，其中X是二苯丙氨酸，并且在位置6处的丝氨酸(Ser)替换为Cys。申请人假设memAb重链中的Ala175Cys突变和中间位的Ser6Cys突变使硫基团达到紧密接近，促进二硫键的形成(图2A)。
申请人将诱变的Ala175Cys曲妥珠单抗memAb纯化至同质性，并且从IgG产生Fab(Cys-meFab)。线性诱变的Ser6Cys中间位(Cys-中间位)被广泛透析且加入Cys-meFab中。伴随氧充当还原剂的假设，允许反应发生。在X射线晶体衍射数据中观察到二硫键形成的明确证据(图2B和图4B)。
为了确定反应速率，申请人使用质谱法。在强变性条件下，观察到在49602AMU处的峰，与Cys-meFab和线性Cys-中间位之间的二硫化物形成一致。在一段时间内，49602峰强度中的增加和随后的平稳期指示反应在3小时内有效完成(图4A)。
为了更好地理解机制(例如，氧介导的还原)，申请人将在厌氧条件下运行反应。
为了理解Cys突变对meFab稳定性的作用，申请人使用差示扫描荧光测定法(DSF)来测量热熔点。Cys修饰的‘apo’Fab(例如，不含Cys-中间位的Cys-meFab)的解链温度类似于memFab V2(I83E)。线性Cys-中间位与Cys-meFab的组合使熔点显著增加大约12℃(图5)。重要的是，在确定混合物的熔点之前去除过量的线性Cys-中间位。当测试环状、高亲和力中间位和meFab V2(例如，没有形成二硫键)时，申请人观察到熔点中的类似转变，但是该转变是浓度依赖性的。因此，该研究提供了在Cys-meFab和Cys-中间位之间形成二硫键的另外证据。
DSF研究的结果进一步提示，共价连接可以充当急剧改善单克隆抗体(mAb)的稳定性的简单但有效的手段。稳定性与有利的治疗特性相关联。这种改善稳定性的手段也提出‘冷链’问题(例如，向世界上没有冷藏的偏远地区的运送)的解决方案。
申请人已证实天然氨基酸可以用于通过模板化反应生成二硫键。初步数据指示该反应是氧依赖性的。为了促进二硫键相互作用，将离去基团硫代吡啶加入中间位中的Cys6的硫醇中。质谱法指示反应迅速完成。具体地，为了测量反应速率，将硫代吡啶-中间位和Cys-Fab混合，在不同时间点加入LC柱中，以将具有二硫桥联的中间位的Fab与未反应的分开，然后通过质谱法进行分析。第一个时间点(例如，混合且喷射–t＝0秒)是完全反应的。
申请人使用硫代吡啶-中间位(SEQ ID NO：1)合成了AlexaFluor647缀合的中间位(图6)。
为了确定AlexaFuor647缀合的硫代吡啶-中间位/曲妥珠单抗meFab复合物是否仍然可以与细胞结合，将10nM与AlexaFluor647硫代吡啶-中间位缀合的A175C meFab纯化，并且加入SKBR3细胞中共30分钟。反应在冰上进行。将细胞洗涤三次，随后用二抗(AlexaFluor488)染色。分析揭示，AlexaFluor647缀合的硫代吡啶-中间位与meFab的共价连接不影响Fab细胞结合亲和力，并且此外，标记实际上是完全的(图7)。事实上，通过缀合的中间位实现和模板化的二硫化物结合均不影响抗体抗原结合(图8)。
申请人确认Cys-中间位和Cys-meFab之间的二硫桥形成不是pH依赖性的(图9A-9E)。
二硫键的成功形成开辟了众多途径。重要的是，它允许产生具有Cys-中间位的生物制品。然后可以将具有Cys-中间位的生物制品与Cys-memAb简单地混合，以生成个性化疗法。中间位无需用非天然氨基酸合成，使得它们可用于开发Fab架，产生具有确定几何形状的多价Fab(例如，环状三价中间位)，以及添加可以在细胞系中容易地产生的生物制品。
申请人设想该技术可用于产生异源二聚体抗体和/或Fab片段、生物制品和药物的组合物(图10)。为了促进这一点，申请人产生了DBCO，申请人用于机械结合的应变环辛炔，中间位(图11A)和叠氮化物中间位(图12A)。两种缀合的Cys-中间位均能够结合Cys-meFab(图11B和图12B)。这些结果指示，模板化反应可以用于以有效和位点特异性方式添加独特的功能性。申请人假设在一些情况下，在模板化二硫键制备后添加功能性将更佳。申请人因此将不同的官能团加入预先形成的DBCO/Azido Fab，包括药物中。
申请人发现他们可以将半胱氨酸加入其它位点中，并且使用中间位指导硫醇以产生二硫键。半胱氨酸可以加入meFab的重链和轻链中。
在meFab的背面，申请人产生了K208C和T158C修饰。每种都表达得非常好，进行纯化且结晶。使用SPR确定meFab修饰可能如何影响对于Her2的结合亲和力，揭示了关于抗原的亲和力基本上不受影响(图14A-14C)。另外，T158C修饰的meFab能够与Cys-中间位形成二硫键(图16)。
申请人进一步证实，他们可以将精氨酸衍生物置于中间位的位置8处，以使硫醇穿过Fab孔(图17和图18)。如之前，紧密接近有利于产生二硫键(如关于重链上的158C所证实的)。中间位可以用于将二硫化物引导至meFab轻链(图20A-20B)。
实施例2：使用中间位肽辅助的二硫化物缀合的单克隆抗体的稳定的位点特异性修饰
单克隆抗体(mAb)的高特异性和有利的药理学性质已引起了对重新改造这类分子以增强其治疗和诊断潜力的显著兴趣。在本文中，申请人使用中间位肽和中间位使能的mAb(memAb)之间的高亲和力相互作用来驱动二硫键的快速、有效和稳定的位点特异性形成。申请人使用这种中间位、肽辅助缀合技术(mPACT)平台，将荧光染料、细胞毒素或“点击”化学处理附着到memAb和meFab。更重要的是，申请人开发了遗传编码的加上中间位标签的生物制品，以产生稳定的双功能Fab和mAb。这包括含有N-、C-或两个末端中间位标签的细菌表达的荧光蛋白、纳米抗体和亲和体与memAb和meFab的缀合。使用mPACT平台，很容易产生多重T细胞和NK细胞-Her2靶向双特异性分子，并且在体外测定中证实有力活化T细胞信号传导途径。总之，mPACT平台提供了构建且交换一系列功能部分的机会，包括在任何175Cys、中间位使能的mAb和Fab中的蛋白质生物制品，以快速产生、测试且优化稳定的多功能生物制品。
单克隆抗体(mAb)及其片段继续在当前和下一代治疗剂和诊断学中发挥重要作用1-5。为了利用其特异性并扩展其治疗范围，经过过去40多年，已开发了一系列广泛的方法。以最广泛的方式，仅存在功能化mAb的两种手段–或通过化学缀合或通过基因工程。化学缀合通过小分子、毒素、成像剂、siRNA和免疫调节剂的靶向递送扩展了mAb的治疗潜力6-9。然而，有效地产生同质、功能化的mAb仍然具有挑战性。许多缀合方法依赖胺缀合，导致复杂的非同质混合物10。引入不成对的半胱氨酸和非经典氨基酸已极大地改善了这些问题，但主要限于小分子或具有低产率的多个步骤11-12。可替代地，通过将另外的结构域融合到基础mAb的基因工程提供了产生具有独特机制的新治疗剂的手段，例如双特异性T细胞衔接物、细胞因子融合物或双可变结构域mAb13。优化这些遗传融合的生物制品的参数，例如动力学、亲和力、效价、受体衔接的几何形状、稳定性等，需要生成大型构建体实验对象组。在此处，申请人报道了用于蛋白质和小分子与mAb的快速、有效和稳定缀合的替代方法。
申请人最近鉴定了在西妥昔单抗的Fab臂中独特的肽结合位点，并且证实该位点在人中不存在，但可以容易地移植到其它mAb包括曲妥珠单抗14。因为环状、十二个残基的肽在一个孔中结合，所述孔穿过Fab臂的中间，所以申请人已将其命名为中间位。在移植后或在中间位的存在下，抗原结合不改变14-15。像这样，申请人理解他们可以使用中间位相互作用作为用于递送细胞毒素、成像剂或生物制品的联结装置(hitch)。对于西妥昔单抗的原始中间位肽或中间位使能的曲妥珠单抗的寿命是在37℃下数秒。通过广泛的结构-功能研究，申请人通过修饰中间位和Fab两者来改善亲和力，将在37℃下的半衰期显著延长至40分钟。申请人通过用叠氮化物修饰在位置8处的精氨酸，将其穿过Fab孔，并且使用点击化学来空间阻断其解离，通过产生机械键来进一步改善寿命。虽然这种机械互锁的Fab复合物的寿命难以确定，但申请人能够成像动物异种移植物中的肿瘤。
尽管机械键的成功，但其形成需要掺入非天然氨基酸。寻求消除随后修饰或掺入非天然氨基酸的必要性，申请人询问他们是否可以使用这种相互作用来驱动且随后稳定二硫键的形成。为此，申请人鉴定了中间位上的Ser6和Fab重链上的Ala175，其是并置的并且应该可顺应修饰(图24A)。因此，申请人将Ile83Glu曲妥珠单抗mAb中的Ala175突变为半胱氨酸(称为175Cys)，产生修饰的mAb并且将其纯化至同质性。为了避免在循环中间位内的混合二硫化物的可能性，申请人用丝氨酸替换在位置1和12处的半胱氨酸。Ser6替换为半胱氨酸，提供了线性中间位SQFDFCTRRLQSGGSK(SEQ ID NO：22)。由于申请人已优化了具有中间位的曲妥珠单抗Fab的结晶14，申请人使用结晶学来表征二硫键的形成。将晶体衍射至并且使用中间位-Fab结构4ioi.pdb通过分子替换来确定结构。在初始图中，关于中间位肽的电子密度包括关于二硫键的密度是清楚的。在精制结构中硫原子的位置和改造的半胱氨酸的立体化学值与二硫键一致(图24B，图27)。申请人用第二种更高亲和力的线性半胱氨酸中间位，5-二苯基丙氨酸(SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK；SEQ ID NO：23)重复上述结晶，以建立二硫化物形成的第二个实例。为了进一步确认在这些结构中观察到的电子密度与二硫键一致，申请人也使与原始中间位结合的apo-175Cys-Fab和175Cys-Fab结晶，收集衍射数据并解析其结构(例如，在位置6处的丝氨酸(图27，表1))。在两种情况下，取代的175Cys的电子密度与减少的硫侧链一致。在Fab的175Cys和中间位中的Ser6之间没有观察到另外的密度。与申请人的先前观察一致，来自每个结构的Fab的总体结构不受亲本曲妥珠单抗Fab的干扰。每个结构对apo-亲本结构的RMSD小于(表2)。
为了进一步验证衍射数据且更好地表征模板化反应，申请人使用LCMS在变性条件下监测中间位肽和175Cys Fab之间的二硫化物形成。将五倍过量的线性半胱氨酸，5-二苯基丙氨酸中间位(SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK；SEQ ID NO：23)加入175Cys Fab中，并且监测反应进程16小时(图24C，上)。在反应开始时，175Cys Fab的质量与apo-Fab的质量一致。反应到120分钟时完成，并且最终产物的质量与具有中间位的Fab的质量相匹配(图24C，下)。申请人使用中间位和缺少其各自硫醇的Fab组合进一步确认了二硫化物反应对175Cys的特异性，并且因此不能形成二硫化物(图28)。亲本Ile83Glu Fab(即，无半胱氨酸)不与SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK(SEQ ID NO：23)反应，175Cys Fab也不与丝氨酸中间位变体SQFDA(Ph)2 STRRLQSGGSK(SEQ ID NO：24)反应。另外，用碘乙酰胺阻断175Cys Fab硫醇完全预防了与SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK(SEQ ID NO：23；图28)的反应。
为了确认二硫化物的形成不扰乱Fab的抗原结合或总体稳定性，申请人进行了表面等离振子共振(SPR)和热位移测量。利用与SPR传感器芯片偶联的HER2的可溶性细胞外结构域，测定Fab：Ile83Glu、175Cys以及与SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK缀合的175Cys的动力学和亲和力(图24D)。在不同的Fab中未观察到计算的结合速率(ka)或解离速率(kd)的可辨别的差异，这与申请人的先前观察一致(图24D，表3)。
此外，申请人进行了差示扫描荧光测定法，以表征半胱氨酸突变对mAb稳定性的作用。175Cys变体的解链温度(Tm＝70.9℃)类似于原始的中间位使能的mAb(Tm＝70.8℃)(图24E)。175Cys Fab-SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK(SEQ ID NO：23)复合物的稳定性显著更高，Tm＝81.2℃。热稳定性中的这种10℃增加可能反映了中间位和Fab构架之间的有利相互作用，因为申请人已观察到使用具有Ile83Glu Fab的非半胱氨酸中间位的解链温度中的类似增加。然而，需要10-50倍摩尔过量的中间位以产生类似位移(图29)。
由于模板化的二硫化物反应是位点特异性且快速的，申请人询问他们是否可以使用其将小分子附着至175Cys memAb/Fab。申请人将叠氮化物、反式环辛烯(TCO)或四嗪与乙酰化的SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK(SEQ ID NO：28)的末端赖氨酸缀合用于点击化学。首先，申请人使叠氮基-半胱氨酸中间位与175Cys Fab反应。接下来，申请人使用点击化学，以将30kDa聚乙二醇化DBCO加入叠氮基-175Cys Fab中。如由SDS-PAGE所示，在非还原条件下，在反应16小时后，观察到质量中的30kDa增加(图25A)。还原后，中间位和Fab之间以及轻链和重链之间的二硫键被还原。SDS-PAGE显示‘点击的’DBCO-175Cys Fab的轻链和重链以与未反应的叠氮基-A175C Fab相同的质量运行。
由于叠氮基-DBCO点击化学是成功的，申请人测试申请人是否可以使用替代的TCO-四嗪点击来产生双特异性分子。申请人生成了三种中间位使能的175CysαCD3Fab。申请人独立地将四嗪-半胱氨酸中间位与175Cys曲妥珠单抗Fab混合，并且将TCO-半胱氨酸中间位与175CysαCD3Fab混合。申请人分别将含有四嗪的曲妥珠单抗Fab与每种含有αCD3Fab的TCO组合。纯化“点击的”产物并且通过SDS-PAGE确认。观察到具有～100kDa的质量的条带(图25B)。各个中间位-缀合的Fab各自为～50kD。如之前，在强还原条件下，～100kD复合物解离成与Fab的轻链和重链一致的条带。在SKBR3细胞的存在下，点击的BiTE能够活化表达萤光素酶的Jurkat细胞(图30)。对于514-522、710-778和1050-1234点击缀合物，EC50分别为66、77和62pM。
接下来，申请人证实模板化键可以用于产生抗体-药物缀合物。通过赖氨酸胺，将美登素(DM1)和单甲基奥里斯他汀E(MMAE)加入乙酰化的SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK(SEQ IDNO：28)中间位中。将五倍过量的DM1-半胱氨酸中间位和MMAE-半胱氨酸中间位产物个别地与175Cys曲妥珠单抗memAb反应，得到两种不同的药物缀合物，两者具有1.84的药物-抗体比(DAR)(图31)。增加药物-半胱氨酸中间位的量并未将产率改善超过1.9(表4)。使用SKBR3细胞测试两种药物缀合物的活性，并且与恩美曲妥珠单抗(临床抗体-药物缀合物)进行比较(图25C)。尽管恩美曲妥珠单抗具有3.4的平均DAR，但基于中间位的DM1和MMAE缀合物的EC50是相似的(175Cys-DM1EC50＝107pM；175Cys-MMAE EC50＝100pM；临床DM1EC50＝93pM)。
为了进一步探究模板化二硫化物反应的效用，申请人将Alexa Fluor647(AF647)与乙酰化的SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK(SEQ ID NO：28)中间位的赖氨酸偶联。该AF647-中间位与175Cys曲妥珠单抗memAb反应，得到1.8的染料-抗体比率。分析细胞计数和荧光显微术指示特异性和稳固的抗原结合(图25D和25E)。接下来，申请人成像四只NSG小鼠中的肿瘤异种移植物。在完整动物中注射后24小时对小鼠成像。随后，对小鼠实施人道安乐死并且收获器官(图25F)。在除了一只小鼠外的所有小鼠中，AF647-175Cys缀合的mAb与肿瘤结合。在GI道中也观察到荧光信号，这是成像研究中的常见观察16。另外研究正在进行中以优化信噪比，并且添加不同的荧光团，以了解其在生物分布中的作用。尽管如此，这些数据指示，模板化的二硫键提供了通用方法以使具有小分子和生物正交化学部分的mAb功能化。
虽然上述许多工作依赖在位置5处携带二苯基丙氨酸的线性半胱氨酸中间位，但申请人询问申请人是否可以遗传编码在蛋白质内的半胱氨酸中间位，并且将该蛋白质与中间位使能的mAb和携带175Cys修饰的mAb片段缀合。首先，申请人测试了Eos3.2荧光蛋白与半胱氨酸175Cys曲妥珠单抗Fab的缀合。将编码半胱氨酸中间位的DNA序列SQFDLCTRRLQS(SEQ ID NO：25)框内添加到Eos3.2的N末端。申请人使中间位-Eos3.2与175Cys Fab反应16小时，获取自始至终的时间点。申请人发现反应到4小时完成(图32)。为了避免起于Eos3.2上存在的表面半胱氨酸引起的复杂性，申请人转为使用moxGFP，不含单体半胱氨酸的GFP变体。申请人将中间位标签与moxGFP的N-或C末端融合，以产生N-moxGFP(SEQ ID NO：38)和C-moxGFP(SEQ ID NO：39；图26A)。两种构建体均很容易与175Cys Fab反应。另外，将175CysFab加入携带N末端和C末端半胱氨酸中间位标签的moxGFP中。通过SDS PAGE验证纯化的moxGFP-Fab构建体(图26B)。此外，如通过SPR研究所证明的，moxGFP的缀合不影响抗原结合(图26C，图33A-33D)。因此，这些研究指示，申请人可以将携带N末端、C末端或两者(SEQ IDNO：40)半胱氨酸中间位标签的蛋白质附着到Fabs，以产生新型抗体缀合物或产生多价Fab缀合物(即多个cys-中间位标签)。
由于申请人可以容易地将GFP变体附着至175Cys曲妥珠单抗Fab，并且因为相互作用稳定Fab，申请人寻求产生双特异性免疫接合物17。首先，将半胱氨酸中间位标签加入αCD16纳米抗体的N末端(SEQ ID NO：42)或C末端(SEQ ID NO：43)(图26D)。N末端和C末端中间位αCD16纳米抗体两者均在大肠杆菌中表达良好，并且以高产率提供高度纯化的材料。将纯化的N末端和C末端αCD16变体加入175Cys曲妥珠单抗Fab中，允许反应，并且通过层析纯化。通过非还原和还原SDS-PAGE验证二硫键的形成(图26E)。
接下来，申请人在体外抗体依赖性细胞毒性测定(ADCC)中测试这些构建体的功效。具有C末端融合的模板化的αCD16-Fab构建体证实有力的ADCC活性，其中测量的EC50为3.2pM(独立测量1)和4.7pM(独立测量2)。对于N末端模板化的αCD16-曲妥珠单抗Fab变体，如通过体外测定测量的ADCC活性显著减少。个别片段、αCD16和曲妥珠单抗meFab未能引发应答。临床曲妥珠单抗、175Cys曲妥珠单抗memAb和临床帕妥珠单抗的效力几乎低100倍(图26F)。
为了表征模板化的αCD16-曲妥珠单抗Fab的血清稳定性，将双特异性缀合物在37℃下在正常大鼠血清中温育。在14天的过程内抽取小等分试样的αCD16-Fab掺料的血清并且立即冷冻。在收集所有样品后，通过SDS-PAGE将它们分开，并且通过蛋白质免疫印迹检测(图34A)。另外，申请人通过添加增加量的还原型谷胱甘肽测试了αCD16Fab的稳定性。模板化的复合物保持基本上完整，直至[GSH]＝6.4mM，比通常在血清中发现的还原型谷胱甘肽的量高得多，[GSH]ave＝1.02mM(图34B)18。
转向抗CD3，通过产生三种不同的αCD3/HER2双特异性T细胞接合物(BiTES)，申请人证实了该系统的容易性和灵活性(图26G)。在此处，遗传编码对于ZHER2的N末端半胱氨酸中间位(SEQ ID NO：41)，所述ZHER2是以高亲和力结合人HER2的亲和体(报道的KD＝22pM)19。申请人将如上所述的三种175CysαCD3Fab与ZHER2个别地混合，并且纯化每种复合物(图26H)。申请人测量单独的αCD3以及具有ZHER2的热稳定性。ZHER2缀合物使总体解链温度增加5-11℃(图35)。申请人然后测试了这些复合物在SKBR3(高Her2水平)和MCF7(低Her2水平)细胞的存在下接合且活化Jurkat细胞的能力。所有三种Fab-ZHER2复合物都活化T细胞，而Fab仅对照则不。对于514-522、710-778和1050-1234缀合物，各自对SKBR3细胞的EC50分别为38、54和34pM(图26I)。各自对MCF7细胞的EC50分别为118、181和139(图35)。值得注意的是，这些值不同于化学缀合的BiTe(如上所述)。变化可能反映了接合的亲和力和几何形状中的差异，申请人将在未来的研究中彻底探索的性质。
总之，mPACT平台开辟了组合方法，以毫不费力地且有效地产生一系列广泛的稳定的抗体缀合物。使用mPACT平台，申请人证实申请人可以概括用于增加mAb的功能性的当前方法(例如，化学缀合)。与这些方法不同，申请人还显示申请人可以使用天然氨基酸来实现这些目标。该特点开辟了在其它表达系统(例如大肠杆菌)中产生有力生物制品的可能性，其耐受在哺乳动物细胞系中是细胞毒性的酶促活性(例如，白喉毒素、PE38；两栖类核糖核酸酶、onconase；等)。此外，与用于产生双功能分子的许多遗传方法不同，中间位相互作用基本上改善了所需双功能生物制品的总体稳定性。另外，申请人在此处证实使用移植中间位位点的三种不同的mAb是直截了当的，并且在生物化学测定(例如SPR)中不对抗原结合产生可测量的影响，与先前结果一致14，20。最后，申请人注意到175Cys中间位使能的mAb以高产率制备(通常瞬时超过100mg/L而不依赖于表达条件的交替)，并且mPACT的反应几乎是化学计量的(表4)。除了治疗和诊断可能性之外，申请人预期mPACT平台可用于基础研究，包括mAb与不同荧光团或生物制品(例如萤光素酶)的有效、位点特异性缀合。
方法
蛋白质生产和纯化
抗体：关于每种抗体的密码子优化的DNA由ATUM产生。通过在PKSCDKTH序列后引入终止密码子获得Fab DNA。通过在ExpiCHO细胞(ThermoFisher)中的瞬时表达产生抗体。遵循制造商的高滴度方案进行转染和细胞生长。
为了纯化抗体，将ExpiCHO培养基离心，随后为通过0.45微米和0.22微米滤器。然后将澄清的培养基应用到蛋白G树脂(Genscript)，用20柱体积的PBS冲洗，并且用10柱体积的100mM甘氨酸缓冲液pH 3.0洗脱。立即用1M Tris pH 9.0中和洗脱的抗体。抗体通过在S200 26/60(GE Healthcare)上的尺寸排阻层析进一步纯化，并且在4℃下贮存于PBS中。
对于Fab纯化，如上所述澄清ExpiCHO培养基，并且使用蛋白G树脂纯化Fab。使用S75 26/60(GE Healthcare)进一步纯化单体Fab。
细菌表达的蛋白质：Histag-SMT3-ZHER2和Histag-SMT3-moxGFP融合物使用Studier的自诱导培养基在BL21(DE3)大肠杆菌中在25℃下表达。SMT3融合物首先在1mLHisTrap HP(GE Healthcare)上纯化，用Histag-ULP1切割，随后通过反向镍层析纯化至同质性。
使用Studier的自诱导培养基在25℃下在BL21(DE3)大肠杆菌中表达N末端和C末端中间位-αCD16纳米抗体。通过使用Ni-NTA Superflow(Qiagen)的亲和层析和使用在PBS(pH 7.4)中的S75 26/60柱(GE Healthcare)的尺寸排阻纯化每种中间位-αCD16。
肽合成：标准固相N-αFmoc化学用于在CS136XT肽合成仪(C S BIO)上合成肽Ac-SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK和Ac-SQFDA(Ph)2 STRRLQSGGSK。在N末端乙酰化后，肽从树脂中取出，并且使用试剂K(TFA/水/苯酚/茴香硫醚/EDT＝82.5：5：5：5：2.5)脱保护。粗制肽通过从冷乙醚中沉淀收集，并且使用反相HPLC(Agilent 1200系统，具有Agilent prep-C18柱，21.2×150mm，5μm)与水(0.1％TFA)/乙腈(0.1％TFA)溶剂系统纯化。
为了将小分子附着至Ac-SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK的末端赖氨酸，在NHS缀合之前用硫代吡啶保护半胱氨酸。将纯化的肽用2,2'-联吡啶二硫化物在100mM NaHCO 3缓冲液和乙腈(v：v＝2：1)中处理过夜。通过HPLC纯化分离硫代吡啶修饰的肽。然后使硫代吡啶修饰的肽与NHS酯形式的叠氮化物(1070-5G，Click Chemistry Tools)、四嗪(1127-25，ClickChemistry Tools)、TCO-PEG4(A137-25，Click Chemistry Tools)、DM1和Glu-Val-Cit-PAB-MMAE(SET0100，Levena Biopharma)在100mM NaHCO3缓冲液和乙腈(v：v＝2：1)中反应30分钟，以提供相应的肽。使用适当的缓冲系统，使用反相HPLC纯化所有肽。通过质谱法表征所有肽。
Ac-SQFDFCTRRLQSGGSK肽由CS Bio Co合成且纯化。
结晶和结构测定：如先前所述21，通过悬滴扩散使meTrastuzumab变体的Fab结晶。将等摩尔浓度的蛋白L和蛋白A加入meTrastuzmab Fab(50-80μM)中。将结晶缓冲液(10mMNaCl、1mM EDTA、10mM Tris pH8.0)中的蛋白A/L/meTrastuzumab Fab复合物与沉淀剂溶液(15％PEG 3350、50mM Tris，pH 7.5)混合，1μL+1μL。晶体形成过夜，并且准备在48小时内收获。使晶体通过含有20％内消旋赤藓糖醇的沉淀剂溶液，并且在液氮中快速冷冻。在具有RAXIS IV++检测器的Rigaku Micromax X-007HF或在以100K的SSRL束线9-2上内部收集数据。用XDS22处理数据，在Coot23中构建模型，并且用Phenix24精制结构。
差示扫描荧光测定法(DSF)：DSF变性曲线用作关于蛋白质稳定性的代表25。20μlDSF反应由在100mM Hepes(pH 7.4)和150mM NaCl中的0.2mg/mL蛋白质和5x Sypro Orange(Life Technologies)组成。遵循制造商的方案，在Viia7实时PCR仪器(LifeTechnologies)上的384孔板中进行反应。用Protein Thermal Shift Software v1.3(LifeTechnologies)计算在半最大值下的解链温度Tm。
表面等离振子共振结合测定：表面等离振子共振用于在Biacore T200上确定曲妥珠单抗变体对于HER2的亲和力。使用标准胺偶联(EDC/NHS)，在10mM乙酸盐缓冲液pH 4.0中，以适合于动力学的密度，将HER2-Fc(R&D Systems)固定至CM5S系列传感器芯片(GEHealthcare)。为了避免二价结合，Fab用于所有实验。将Fab在HBS-EP+(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA，0.05％(v/v)表面活性剂P20)中从5nM到78pM连续稀释，并且以30μl分钟-1流过芯片。使用100mM甘氨酸缓冲液(pH 2.0)，随后为HBS-EP+再生芯片。使用Biacore T200Evaluation软件v.3.0处理数据。
液相层析/质谱法：使用配备有HPLC和Chip Cube Source(Agilent，Santa Clara，CA)的Agilent 6520质谱仪分析样品。将样品在C8LC/MS芯片上分开，并且直接喷雾到质谱仪内。手动整合含有蛋白质的峰。将来自目的峰的光谱取平均值，并且减去来自梯度的一部分的本底光谱，在所述梯度期间没有洗脱蛋白质。使用具有最大熵算法的MassHunterBioconfirm B06.00(Agilent)，对本底扣除的光谱进行解卷积。
Alexa647与175Cys memAb的缀合：在室温下用20mM半胱氨酸处理500μL PBS中的2mg曲妥珠单抗175Cys IgG共30分钟，以减少改造的半胱氨酸。通过>10,000倍稀释和使用10k Amicon离心滤器的浓缩去除半胱氨酸。AF647与硫代吡啶保护的半胱氨酸中间位(Ac-SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK)的末端赖氨酸缀合。使十倍过量的AF647中间位与500μL PBS中的还原IgG反应。使用10k Amicon离心滤器，将样品浓缩至100微升。使用由Zeba 7K MWCO柱(ThermoFisher)的两轮脱盐，去除未反应的中间位。由在280nm和650nm处的吸光度计算染料-抗体比率。
点击化学缀合和反应：在室温下用20mM半胱氨酸将1mg在500μL PBS中的每种175Cys Fab还原30分钟，以从Fab中去除二硫化物加合物。通过>10,000倍稀释和使用10kAmicon离心滤器的浓缩去除半胱氨酸。将五倍过量的通过其末端赖氨酸与叠氮化物、TCO或四嗪缀合的硫代吡啶保护的半胱氨酸中间位(Ac-SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK)与还原的Fab在500μL PBS中混合。允许反应进行四小时，并且通过用10k Amicon离心滤器(Millipore)的5轮浓缩和稀释去除过量的中间位。使叠氮化物中间位与175Cys曲妥珠单抗Fab反应。在去除过量的中间位后，将叠氮化物-Fab与30k DBCO一起温育16小时，并且在SDS-PAGE凝胶上运行。四嗪和TCO中间位分别与曲妥珠单抗的175Cys Fab和α-CD3Fab反应。如上所述，申请人通过超滤去除了过量的中间位。申请人将TCO-Fab和四嗪Fab温育3小时。通过SDS-PAGE评价点击的形成。
DM1和MMAE缀合：在室温下用20mM半胱氨酸将1mg曲妥珠单抗175Cys IgG还原30分钟，以从Fab臂中去除二硫化物加合物。通过>10,000倍稀释和使用10k Amicon离心滤器的浓缩去除半胱氨酸。MMAE和DM1缀合至硫代吡啶保护的半胱氨酸中间位(Ac-SQFDA(Ph)2 CTRRLQSGGSK)的赖氨酸。将五倍过量的药物-半胱氨酸中间位溶解于DMA中，并且与还原的曲妥珠单抗175Cys memAb混合四小时。最终体积为800μL具有3％DMA的PBS。通过用含有3％DMA的PBS的5轮浓缩和稀释去除过量的中间位。将最终产物缓冲液交换为纯PBS。
在Agilent 1200系统上，使用TSKgel Butyl-NPR，4.6mm×10cm柱，2.5μm粒径(Tosoh Biosciences)，通过HPLC评价缀合程度。缓冲液A由1.5M硫酸铵、25mM磷酸盐(pH7.0)组成，并且缓冲液B由25％异丙醇、25mM磷酸盐(pH7.0)组成。样品以0.5mL/分钟从0-100％缓冲液B运行60分钟。通过整合来自HPLC迹线的峰面积计算关于各自的抗体-药物比率。在HPLC迹线中未观察到游离的中间位-药物，指示未反应的中间位-药物的完全去除。
关于DM1和MMAE缀合的细胞活力研究：来自Promega的Luminescent Assay(#G7571)用于检测细胞活力。将BT-474或SKBR3接种在白壁96孔板中，并且每个孔含有100μl 10,000个BT-474细胞或7,000个SKBR3细胞。将接种的细胞在37℃、5％CO2下温育过夜用于粘附。对于治疗，制备具有两倍最终浓度的药物，并且将100μL药物直接加入每个孔中。在72小时，将板在室温下平衡，并且向每个孔中加入Reagent，用于细胞裂解和发光反应10分钟。通过Biotek的Synergy 4多检测微板阅读器读取发光。
moxGFP与175Cys曲妥珠单抗memAbs/Fab的缀合：175Cys Fab或IgG独立地与N-、C-或NC-moxGFP混合。三倍过量的N-moxGFP和C-moxGFP用于与2mg Fab的反应。四倍过量的C-moxGFP用于与1.5mg IgG反应。四倍过量的Fab与2mg NC-moxGFP反应。在室温下用20mM半胱氨酸将每种组合物还原30分钟。用10k Amicon离心滤器去除半胱氨酸。将混合物在室温下温育4小时，然后在4℃下贮存过夜用于纯化。使用Mono Q GL5/50柱(GE Healthcare)，将缀合物与起始分子分开。
ZHER2与中间位使能的175Cys a-CD3Fab的缀合：1mg每种中间位使能的175Cysα-CD3Fab与五倍过量的ZHER2独立地共还原。在室温下用20mM半胱氨酸将Fab-ZHER2样品还原30分钟。如先前，用10k Amicon离心滤器去除半胱氨酸。在半胱氨酸去除后，允许混合的样品在室温下温育4小时。使用Mono S GL 5/50柱(GE Healthcare)，将未反应的α-CD3Fab和ZHER2与二硫化物缀合物分开。
T细胞活化测定：ZHER2-α-CD3Fab缀合物就其活化表达萤光素酶的Jurkat细胞的能力进行测试。将SKBR3细胞以15,000个细胞/100μL DMEM/孔接种于96孔板中，并且温育过夜用于附着。第二天，去除96孔板中的培养基，并且每个孔中加入100,000个Jurkat-LuciaTM NFAT细胞(Invivogen#jktl-nfat)/50μL RPMI。然后，在含有SKBR3和Jurkat-LuciaTM NFAT细胞的每个孔中，加入50μL在RPMI中制备的具有两倍浓度的药物。在37℃下温育6小时后，将来自每个孔的50μL培养基移至白壁96孔板中，并且在每个孔中加入50μLQUANTI-LucTM萤光素酶检测试剂(Invivogen#rep-qlc1)。通过Biotek的Synergy 4多检测微板阅读器立即读取发光。
α-CD16纳米抗体与中间位使能的175Cys曲妥珠单抗Fab的缀合：与ZHER2缀合物一样，1mg中间位使能的175Cys曲妥珠单抗Fab与五倍过量的α-CD16纳米抗体共还原。将Fab-纳米抗体复合物在室温下还原30分钟，脱盐，并且允许在室温下反应4小时。使用1mLHiTrap SP HP(GE Healthcare)去除未反应的Fab，并且通过用Superdex 75Increase 10/300GL(GE Healthcare)的尺寸排阻去除未反应的αCD16。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)测定：遵循其对于曲妥珠单抗的方案，使用商业ADCC试剂盒(Promega)，αCD16-Tras175Cys缀合物就ADCC活性进行测试。将SKBR3细胞以每孔5,000个细胞接种在白壁96孔板的内部60孔中，并且允许在37℃下在5％CO2中下粘附过夜。第二天早上，去除旧培养基。向每个孔中，加入25μL ADCC测定缓冲液、25μL3x浓度的稀释抗体和25μL效应细胞。最终效应物与靶细胞比率为15：1。将混合物在37℃下温育6小时。通过添加75μl Bio-GloTM Luciferase Assay Reagent，评价通过靶细胞的萤光素酶产生。
血清稳定性研究：将70μg纯化的N-α-CD16-Tras175Cys缀合物在正常大鼠血清中在37℃下温育。在0、30、70、100、140、194、236、294和344小时时取出2μg等分试样。关于κ轻链的蛋白质印迹用于在每个时间点检测缀合物或单独的Fab。单独的Fab的存在指示二硫键的丧失。时间点在非还原的4–20％TGX预制凝胶(Biorad)上运行，并且通过Trans-BlotTurbo系统(Biorad)转移至硝酸纤维素。用在PBST(具有0.05％Tween的PBS)中的10％乳，将膜封闭1小时。使用HRP-抗κ轻链抗体(ab202549，Abcam)，以在PBST中的1/20,000稀释度检测κ轻链。将抗体在室温下与印迹一起温育3小时，并且用PBST洗涤6次。使用ECL(Pierce)检测印迹。
对还原的抗性：在1％SDS(天然)的存在(变性)和不存在下，将23μM纯化的N-α-CD16-Tras175Cys缀合物在37℃下与0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2或6.4mM还原型谷胱甘肽一起温育1小时。在1小时后，将样品与1：1 2X Laemmli样品缓冲液(Biorad)混合，并且在4-20％TGX预制凝胶(Biorad)上运行。通过N-α-CD16或单独的Fab的出现，检测N-α-CD16和Fab之间的缀合物的还原。可以通过轻链和重链的出现来检测Fab的还原。
动物成像：在5e6MCF-7.her2细胞悬浮于汉克斯平衡盐溶液(HBSS)中的1％人血清白蛋白(HSA)中之前两天，大约8周龄的无胸腺雌性小鼠(NCI Charles River)接受Delestrogen(0.8mg/0.25ml，戊酸雌二醇)的肌内(IM)注射，在肩部或下侧腹处皮下注射的总体积200ul用于建立21天。
小鼠接受100ug用盐水(USP)稀释的AF647-175Cys IgG作为单次弹丸静脉内注射。Spectral Instruments Imaging Ami X系统，640nm激发和690发射滤光片，用于在注射时间点后1、6和24小时的荧光成像获取。用异氟烷吸入剂使小鼠镇静，用于成像获取大约20分钟。在24小时点后，使小鼠安乐死且解剖。用相同的滤光片组再次对组织成像。
流式细胞术：将SKBR3细胞维持在37℃和5％CO2下在补充10％FBS的DMEM中。使用非酶促细胞解离试剂(C5789，SIGMA)将SKBR3细胞移出，并且稀释至1x 106个细胞/mL的浓度。将细胞与10nM meTrastuzumab175Cys，与Alexa647中间位缀合的meTrastuzumab175Cys、或临床曲妥珠单抗一起在洗涤缓冲液(1x PBS中的10％FBS)或单独的洗涤缓冲液中温育，并且在冰上温育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤细胞三次，以去除未结合的抗体。通过添加与Alexa488(Life Technologies)缀合的抗人IgG Fc二抗来检测结合的抗体。将二抗在冰上温育30分钟。通过三个洗涤步骤去除未结合的二抗。用BD LSRFortessaCellanalyzer(BD Biosciences)进行流式细胞术，并且使用FlowJo软件进行分析。
荧光成像：将SKBR3细胞以8 x 104个细胞/孔(4 x 105个细胞/mL和0.2mL/孔)的密度接种到8孔微腔室载玻片(Ibidi)内过夜。第二天，细胞用PBS中的50nM抗体在冰上处理1小时。用PBS将细胞洗涤三次，每次5分钟，并且经历在37℃下用50μL 4％多聚甲醛的PBS溶液的10分钟固定，随后为用PBS的两次洗涤。然后用Alexa 488标记的抗人IgG二抗(ThermoFisher)以在PBS中1：500的稀释度处理细胞。在用二抗标记两小时后，将细胞在PBS中洗涤三次，每次5分钟。将具有DAPI的Gold Antifade Reagent(Cell SignalingTechnologies)加入每个孔中，并且在室温下温育过夜，然后在Zeiss Axio Observer Z1倒置显微镜(Zeiss)上以40x成像。使用ZEN 2处理且分析图像。
表1：晶体学数据收集和精制统计。
表2：在434个Cα原子上计算的A175C晶体相对于亲本apo I83E的RMSD值。含有中间位的结构具有更大的RMSD。
表3：针对HER2的所选曲妥珠单抗fab衍生物的Biacore值。误差值是三次运行的标准差。
表4：最终的药物-抗体比率不随着增加初始反应中的中间位-DM1与抗体的比率而改善。
药物与抗体的倍数 最终Dar
24x 1.88
12x 1.88
8x 1.88
4x 1.88
2x 1.88
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实施方案
实施方案1.共价复合物，其包含：抗原结合结构域，其包含：
(1)第一腔和第二腔之间的由所述抗原结合结构域的重链可变(VH)区、轻链可变(VL)区、重链恒定(CH1)区和轻链恒定(CL)区包围的中心孔；和
(2)非CDR肽结合区，其包含：
(a)由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第一组氨基酸残基衬里的所述第一腔；
(b)由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第二组氨基酸残基衬里的所述第二腔；和
(c)包围所述第一腔和所述第二腔之间的所述孔的孔区域，所述孔区域由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第三组氨基酸残基衬里；
其中所述非CDR肽结合区包含第一半胱氨酸；和
(i)肽化合物，其包含通过所述第一半胱氨酸和所述硫醇侧链氨基酸之间的二硫化物连接与所述抗原结合结构域共价结合的硫醇侧链氨基酸。
实施方案2.实施方案1的共价复合物，其中所述第一组氨基酸残基包含在对应于所述VL区的Kabat位置102、142或143的位置处的所述第一半胱氨酸。
实施方案3.实施方案1的共价复合物，其中所述第二组氨基酸残基包含在对应于所述VH区的Kabat位置208或158的位置处的所述第一半胱氨酸。
实施方案4.实施方案1的共价复合物，其中所述第三组氨基酸残基包含在对应于所述VH区的Kabat位置174或175的位置处的所述第一半胱氨酸。
实施方案5.实施方案1-4中任一个的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区包含构架区氨基酸残基。
实施方案6.实施方案1-5之一的共价复合物，其中所述肽化合物具有下式：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2(I)
其中：
X0是Ser或空的；
X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的；
X2是Gln或空的；
X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X4是Asp或Asn；
X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X6是所述硫醇侧链氨基酸或丝氨酸；
X7是硫醇侧链氨基酸、Thr或Ser；
X8是所述硫醇侧链氨基酸、Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分；
X9是硫醇侧链氨基酸、Arg或Ala；
X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X11是硫醇侧链氨基酸、Gln、Lys或Arg；
X12是Ser、Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的；
R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列；
R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列；
其中，
L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分；
其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分；和
其中R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
实施方案7.实施方案1-6之一的共价复合物，其中R20是治疗部分。
实施方案8.实施方案1-7之一的共价复合物，其中R20是蛋白质部分。
实施方案9.实施方案1-8之一的共价复合物，其中R20是纳米抗体部分。
实施方案10.实施方案1-9之一的共价复合物，其中R20是可变重链纳米抗体部分。
实施方案11.实施方案1-10之一的共价复合物，其中R20是抗CD16纳米抗体部分。
实施方案12.实施方案1-11之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地是肽基接头。
实施方案13.实施方案1-12之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地是长度约2至约10个氨基酸。
实施方案14.实施方案1-13之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地是长度约4至约6个氨基酸。
实施方案15.实施方案1-14之一的共价复合物，其中在位置X6处的所述硫醇侧链氨基酸是Cys。
实施方案16.实施方案1-15之一的共价复合物，其中X 8是Arg。
实施方案17.实施方案1-16之一的共价复合物，其中X0是空的。
实施方案18.实施方案1-17之一的共价复合物，其中X1和X12独立地是Ser。
实施方案19.实施方案1-17之一的共价复合物，其中X1和X12是Ser。
实施方案20.实施方案1-19之一的共价复合物，其中X5是β,β’-二苯基-Ala。
实施方案21.实施方案1-20之一的共价复合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案22.实施方案1-21之一的共价复合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案23.实施方案1-22之一的共价复合物，其中R2是-Gly-Gly-Lys。
实施方案24.实施方案1-23之一的共价复合物，其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
实施方案25.实施方案1-23之一的共价复合物，其中所述肽化合物是线性肽化合物。
实施方案26.实施方案1-25之一的共价复合物，其中所述肽化合物包含SEQ IDNO：1的序列。
实施方案27.实施方案1-6之一的共价复合物，其中X6是Ser。
实施方案28.实施方案1-6或27之一的共价复合物，其中X5是β,β’-二苯基-Ala。
实施方案29.实施方案1-6或27-28之一的共价复合物，其中在位置X8处的所述硫醇侧链氨基酸是取代的精氨酸。
实施方案30.实施方案1-6或27-29之一的共价复合物，其中所述取代的精氨酸是辛基-硫醇取代的精氨酸。
实施方案31.实施方案1-6或27-30之一的共价复合物，其中X0和X1是空的。
实施方案32.实施方案1-6或27-31之一的共价复合物，其中X11是赖氨酸。
实施方案33.实施方案1-6或27-32之一的共价复合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案34.实施方案1-6或27-33之一的共价复合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案35.实施方案1-6或27-34之一的共价复合物，其中R2是-Gly-Gly-Lys。
实施方案36.实施方案1-6或27-32之一的共价复合物，其中R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
实施方案37.实施方案1-6或27-36之一的共价复合物，其中所述肽化合物包含SEQID NO：2的序列。
实施方案38.实施方案1-6之一的共价复合物，其中X6是Ser。
实施方案39.实施方案1-6或38之一的共价复合物，其中X5是β,β’-二苯基-Ala。
实施方案40.实施方案1-6或38-39之一的共价复合物，其中X8是Arg。
实施方案41.实施方案1-6或38-40之一的共价复合物，其中X12是Ser。
实施方案42.实施方案1-6或38-41之一的共价复合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案43.实施方案1-6或38-42之一的共价复合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案44.实施方案1-6或38-43之一的共价复合物，其中R2是–Ser-Gly-X15-Gly-Lys，其中X15是所述硫醇侧链氨基酸。
实施方案45.实施方案44的共价复合物，其中X15是Cys。
实施方案46.实施方案1-6或38-44之一的共价复合物，其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
实施方案47.实施方案1-6或38-46之一的共价复合物，其中所述肽化合物包含SEQID NO：3的序列。
实施方案48.实施方案1-5之一的共价复合物，其中所述肽化合物具有下式：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-R2(II)
其中：
X0是Ser或空的；
X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的；
X2是Gln或空的；
X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X4是Asp或Asn；
X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X6是Ser；
X7是硫醇侧链氨基酸、Thr或Ser；
X8是Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分；
X9是硫醇侧链氨基酸、Arg或Ala；
X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X11是硫醇侧链氨基酸、Gln、Lys或Arg；
X12是Ser、Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的；
X13是Gly或Ser；
X14和X15独立地是Gly、Ser、Ala或所述硫醇侧链氨基酸；
R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列；
R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列；
其中，
L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；
R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分；和
其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
实施方案49.实施方案48的共价复合物，其中R20是治疗部分。
实施方案50.实施方案48-49之一的共价复合物，其中R20是蛋白质部分。
实施方案51.实施方案48-50之一的共价复合物，其中R20是纳米抗体部分。
实施方案52.实施方案48-51之一的共价复合物，其中R20是可变重链纳米抗体部分。
实施方案53.实施方案48-52之一的共价复合物，其中R20是抗CD16纳米抗体部分。
实施方案54.实施方案48-53之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地是肽基接头。
实施方案55.实施方案48-54之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地是长度约2至约10个氨基酸。
实施方案56.实施方案48-55之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地是长度约4至约6个氨基酸。
实施方案57.实施方案48-56之一的共价复合物，其中X15是所述硫醇侧链氨基酸。
实施方案58.实施方案48的共价复合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案59.实施方案48的共价复合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案60.实施方案48的共价复合物，其中R2是–Gly-Lys。
实施方案61.实施方案48-60之一的共价复合物，其中所述肽化合物包含SEQ IDNO：3的序列。
实施方案62.实施方案1-61之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域包含片段抗原结合(Fab)结构域。
实施方案63.实施方案1-62之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域包含Fc结构域。
实施方案64.实施方案1-61之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域是片段抗原结合(Fab)结构域。
实施方案65.实施方案1-64之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域是人源化的抗原结合结构域。
实施方案66.实施方案1-65之一的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区由根据Kabat编号，在所述VL区的位置8、9、10、38、39、40、41 42、43、44、45、82、83、84、85、86、87、99、100、101、102、103、104、105、142、162、163、164、165、166、167、168和173，以及所述VH区的位置6、9、38、39、40、41、42、43、44、45、84、86、87、88、89、90、91、103、104、105、106、107、108、111、110、147、150、151、152、173、174、175、176、177、185、186和187处的氨基酸残基形成。
实施方案67.实施方案1-66之一的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置83处的Glu。
实施方案68.实施方案1-67之一的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置40处的Thr或Ser。
实施方案69.实施方案1-68之一的共价复合物，其中其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置41处的Asn。
实施方案70.实施方案1-69之一的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置85处的Asp或Asn。
实施方案71.实施方案1-70之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域相对于所述肽化合物的不存在以增加的亲和力结合抗原。
实施方案72.实施方案1-71之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域以小于100nM的KD结合抗原。
实施方案73.实施方案1-72之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域以小于50nM的KD结合抗原。
实施方案74.实施方案1-73之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域以小于10nM的KD结合抗原。
实施方案75.实施方案1-74之一的共价复合物，中所述抗原结合结构域以小于1nM的KD结合抗原。
实施方案76.具有下式的肽化合物：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2(I)
其中：
X0是Ser或空的；
X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的；
X2是Gln或空的；
X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X4是Asp或Asn；
X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X6是Cys、受保护的Cys或Ser；
X7是Cys、受保护的Cys、Thr或Ser；
X8是受保护的Arg、Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分；
X9是Cys、受保护的Cys、Arg或Ala；
X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X11是Cys、受保护的Cys、Gln、Lys或Arg；
X12是Ser、Cys、受保护的Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的；
R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列；
R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列；
其中，
L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分；
其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分；和
其中R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
实施方案77.实施方案76的化合物，其中R20是治疗部分。
实施方案78.实施方案76-77之一的化合物，其中R20是蛋白质部分。
实施方案79.实施方案76-78之一的化合物，其中R20是纳米抗体部分。
实施方案80.实施方案76-79之一的化合物，其中R20是可变重链纳米抗体部分。
实施方案81.实施方案76-80之一的化合物，其中R20是抗CD16纳米抗体部分。
实施方案82.实施方案76-81之一的化合物，其中L20A或L20B独立地是肽基接头。
实施方案83.实施方案76-82之一的化合物，其中L20A或L20B独立地是长度约2至约10个氨基酸。
实施方案84.实施方案76-83之一的化合物，其中L20A或L20B独立地是长度约4至约6个氨基酸。
实施方案85.实施方案76-84之一的化合物，其中X6是Cys。
实施方案86.实施方案76-85之一的化合物，其中X6是受保护的Cys。
实施方案87.实施方案76-86中任一个的化合物，其中X8是Arg。
实施方案88.实施方案76-87中任一个的化合物，其中X0是空的。
实施方案89.实施方案76-88中任一个的化合物，其中X1和X12独立地是Ser。
实施方案90.实施方案76-88中任一个的化合物，其中X1和X12是Ser。
实施方案91.实施方案76-90中任一个的化合物，其中X5是β,β’-二苯基-Ala。
实施方案92.实施方案76-91中任一个的化合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案93.实施方案76-92中任一个的化合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案94.实施方案76-93中任一个的化合物，其中R2是-Gly-Gly-Lys。
实施方案95.实施方案76-94中任一个的化合物，其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
实施方案96.实施方案76-95中任一个的化合物，其中所述肽化合物是线性肽化合物。其中所述肽化合物包含SEQ ID NO：1的序列。
实施方案97.实施方案76的化合物，其中X6是Ser。
实施方案98.实施方案76的化合物，其中X5是β,β’-二苯基-Ala。
实施方案99.实施方案76或98的化合物，其中X8是Arg。
实施方案100.实施方案76或98-99中任一个的化合物，其中X12是Ser。
实施方案101.实施方案76或98-100中任一个的化合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案102.实施方案76或98-101中任一个的化合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案103.实施方案76或98-102中任一个的化合物，其中R2是–Ser-Gly-X15-Gly-Lys，其中X15是Cys或受保护的Cys。
实施方案104.实施方案103的化合物，其中X15是Cys。
实施方案105.实施方案103的化合物，其中X15是受保护的Cys。
实施方案106.实施方案76或98-105中任一个的化合物，其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
实施方案107.实施方案76或98-106中任一个的化合物，其中所述肽化合物包含SEQ ID NO：3的序列。
实施方案108.具有下式的肽化合物：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-R2(II)
其中：
X0是Ser或空的；
X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的；
X2是Gln或空的；
X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X4是Asp或Asn；
X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X6是Ser；
X7是Cys、受保护的Cys、Thr或Ser；
X8是Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分；
X9是Cys、受保护的Cys、Arg或Ala；
X10是Leu、Gln、Glu、β,β’-二苯基-Ala、Phe、Trp、Tyr；苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X11是Cys、受保护的Cys、Gln、Lys或Arg；
X12是Ser、Cys、受保护的Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的；
X13是Gly或Ser；
X14和X15独立地是Gly、Ser、Ala、Cys或受保护的Cys；
R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列；
R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列；
其中，
L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；
R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分；和
其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
实施方案109.实施方案108的化合物，其中R20是治疗部分。
实施方案110.实施方案108-109之一的化合物，其中R20是蛋白质部分。
实施方案111.实施方案108-110之一的化合物，其中R20是纳米抗体部分。
实施方案112.实施方案108-111之一的化合物，其中R20是可变重链纳米抗体部分。
实施方案113.实施方案108-112之一的化合物，其中R20是抗CD16纳米抗体部分。
实施方案114.实施方案108-113之一的化合物，其中L20A或L20B独立地是肽基接头。
实施方案115.实施方案108-114之一的化合物，其中L20A或L20B独立地是长度约2至约10个氨基酸。
实施方案116.实施方案108-115之一的化合物，其中L20A或L20B独立地是长度约4至约6个氨基酸。
实施方案117.实施方案108-116之一的化合物，其中X15是Cys。
实施方案118.实施方案108-117之一的化合物，其中X15是受保护的Cys。
实施方案119.实施方案117或118的化合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案120.实施方案108-119中任一个的化合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
实施方案121.实施方案108-120中任一个的化合物，其中R2是–Gly-Lys。
实施方案122.实施方案108-121中任一个的化合物，其中所述肽化合物包含SEQID NO：3的序列。
实施方案123.抗原结合结构域，其包含：
(1)第一腔和第二腔之间的由所述抗原结合结构域的重链可变(VH)区、轻链可变(VL)区、重链恒定(CH1)区和轻链恒定(CL)区包围的中心孔；和
(2)非CDR肽结合区，其包含：
(a)由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第一组氨基酸残基衬里的所述第一腔；其中所述第一组氨基酸残基包含在对应于所述VL区的Kabat位置102、142或143的位置处的半胱氨酸；
(b)由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第二组氨基酸残基衬里的所述第二腔；其中所述第二组氨基酸残基包含在对应于所述VH区的Kabat位置208或158的位置处的半胱氨酸；或
(c)包围在所述第一腔和所述第二腔之间的所述孔的孔区域，所述孔区域由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第三组氨基酸残基衬里，其中所述第三组氨基酸残基包含在对应于所述VH区的Kabat位置174或175的位置处的半胱氨酸。
实施方案124.实施方案123的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含片段抗原结合(Fab)结构域。
实施方案125.实施方案123或124的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含Fc结构域。
实施方案126.实施方案123的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域是片段抗原结合(Fab)结构域。
实施方案127.实施方案123-126之一的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域是人源化的抗原结合结构域。
实施方案128.实施方案123-127之一的抗原结合结构域，其中所述非CDR肽结合区包含构架区氨基酸残基。
实施方案129.实施方案123-128之一的抗原结合结构域，其中所述非CDR肽结合区由根据Kabat编号，在所述VL区的位置8、9、10、38、39、40、41 42、43、44、45、82、83、84、85、86、87、99、100、101、102、103、104、105、142、162、163、164、165、166、167、168和173，以及所述VH区的位置6、9、38、39、40、41、42、43、44、45、84、86、87、88、89、90、91、103、104、105、106、107、108、111、110、147、150、151、152、173、174、175、176、177、185、186和187处的氨基酸残基形成。
实施方案130.实施方案123-129之一的抗原结合结构域，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置83处的Glu。
实施方案131.实施方案123-130之一的抗原结合结构域，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置40处的Thr或Ser。
实施方案132.实施方案123-131之一的抗原结合结构域，其中其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置41处的Asn。
实施方案133.实施方案123-132之一的抗原结合结构域，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置85处的Asp或Asn。
序列表
<110> 希望之城
J·C·威廉斯
K·布兹伊梅克
Y·马
D·霍内
J·金
<120> 半胱氨酸肽使能抗体
<130> 048440-627001WO
<150> 62/430,848
<151> 2016-12-06
<150> 62/531,825
<151> 2017-07-12
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> X = β-β'-二苯基-Ala
<220>
<221> misc_feature
<223> Z = Lys或AlexaFluor或DBCO或叠氮化物
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 1
Ser Gln Phe Asp Xaa Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Gly Glx
1 5 10 15
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> X = β-β'-二苯基-Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X = 正辛基硫醇取代的-Arg
<400> 2
Gln Phe Asp Xaa Ser Thr Xaa Arg Leu Lys Ser Gly Gly Lys
1 5 10
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> X = β-β'-二苯基-Ala
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 3
Ser Gln Phe Asp Xaa Ser Thr Arg Arg Leu Gln Ser Ser Gly Cys Gly
1 5 10 15
Lys
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> X = β-β'-二苯基-Ala
<400> 4
Ser Gln Phe Asp Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Gly Lys
1 5 10
<210> 5
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 5
His Thr Phe Pro Cys Thr Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 6
His Pro Phe Pro Cys Thr Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 7
His Ala Phe Pro Cys Thr Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 8
His Ser Phe Pro Cys Thr Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 9
His Thr Asp Pro Cys Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 10
His Thr Gly Pro Cys Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 11
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 11
His Thr Thr Pro Cys Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 12
His Thr Glu Pro Cys Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 13
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 13
His Thr His Pro Cys Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 14
His Thr Ala Pro Cys Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 15
His Thr Phe Pro Cys Ile Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 16
His Thr Phe Pro Cys Thr Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 17
His Thr Phe Pro Cys Leu Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 18
His Thr Phe Pro Cys Ser Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 19
His Thr Phe Pro Cys Leu Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 20
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 20
His Thr Phe Pro Cys Phe Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 21
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 21
His Thr Phe Pro Cys Glu Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 22
Ser Gln Phe Asp Phe Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Gly Ser Lys
1 5 10 15
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> (Ph)2
<222> (5)..(5)
<400> 23
Ser Gln Phe Asp Ala Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Gly Ser Lys
1 5 10 15
<210> 24
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> (Ph)2
<222> (5)..(5)
<400> 24
Ser Gln Phe Asp Ala Ser Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Gly Ser Lys
1 5 10 15
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 25
Ser Gln Phe Asp Leu Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser
1 5 10
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> (Ph)2
<222> (5)..(5)
<400> 26
Ser Gln Phe Asp Ala Ser Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Gly Ser Lys
1 5 10 15
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 27
Ser Gln Phe Asp Phe Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Gly Ser Lys
1 5 10 15
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 28
Ser Gln Phe Asp Ala Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Gly Ser Lys
1 5 10 15
<210> 29
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ile Leu Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 30
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1 5 10 15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 31
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly
1 5 10 15
Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
165 170 175
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
180 185 190
Pro Cys Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
245 250 255
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
260 265 270
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
275 280 285
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
290 295 300
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
370 375 380
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 32
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ile Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Asn Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 33
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 33
Glu Val His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Met Ser Gly Tyr Gly His Tyr Gly Lys Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225 230
<210> 34
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ile Leu Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Ile Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Trp Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 35
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Phe
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Asn Ser Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Lys Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Arg Phe Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His
225 230
<210> 36
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ile Leu Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 37
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Asp Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Ser Arg Gly Tyr Gly His Tyr Lys Tyr Leu Gly Leu Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
225 230
<210> 38
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 38
Ser Gln Phe Asp Leu Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile
20 25 30
Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg
35 40 45
Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe
50 55 60
Ile Ser Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr
65 70 75 80
Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Ser Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met
85 90 95
Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln
100 105 110
Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala
115 120 125
Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys
130 135 140
Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu
145 150 155 160
Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys
165 170 175
Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly
180 185 190
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
195 200 205
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys
210 215 220
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu
225 230 235 240
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
245 250 255
<210> 39
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 39
Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Ser
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu
50 55 60
Thr Tyr Gly Val Gln Ser Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg
65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg
85 90 95
Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile
115 120 125
Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly
145 150 155 160
Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly Ser Val
165 170 175
Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Ser
225 230 235 240
Gly Ser Gly Ser Ser Gln Phe Asp Leu Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser
245 250 255
<210> 40
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 40
Ser Gln Phe Asp Leu Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10 15
Gly Ser Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile
20 25 30
Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Arg
35 40 45
Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Asn Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe
50 55 60
Ile Ser Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr
65 70 75 80
Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Ser Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met
85 90 95
Lys Arg His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln
100 105 110
Glu Arg Thr Ile Ser Phe Lys Asp Asp Gly Thr Tyr Lys Thr Arg Ala
115 120 125
Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys
130 135 140
Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu
145 150 155 160
Tyr Asn Phe Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Thr Ala Asp Lys Gln Lys
165 170 175
Asn Gly Ile Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Val Glu Asp Gly
180 185 190
Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp
195 200 205
Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys
210 215 220
Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu
225 230 235 240
Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
245 250 255
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ser Gln Phe Asp Leu Cys Thr Arg Arg Leu
260 265 270
Gln Ser
<210> 41
<211> 74
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 41
Ser Gln Phe Asp Leu Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Met Arg Asn Ala Tyr Trp Glu Ile
20 25 30
Ala Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asn Gln Gln Lys Arg Ala Phe Ile Arg
35 40 45
Ser Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala
50 55 60
Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys
65 70
<210> 42
<211> 165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Ser Gln Phe Asp Leu Cys Thr Arg Arg Leu Gln Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln
35 40 45
Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe
50 55 60
Ser Ser Tyr Asn Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg
65 70 75 80
Glu Phe Val Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Arg Asp Thr Phe Tyr Ala
85 90 95
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
100 105 110
Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
115 120 125
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asn Pro Trp Pro Val Ala Ala Pro Arg Ser Gly
130 135 140
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser His
145 150 155 160
His His His His His
165
<210> 43
<211> 163
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 43
Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser
1 5 10 15
Ala Ser Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln
20 25 30
Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Asn Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg
50 55 60
Glu Phe Val Ala Ser Ile Thr Trp Ser Gly Arg Asp Thr Phe Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Asn Pro Trp Pro Val Ala Ala Pro Arg Ser Gly
115 120 125
Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Ser His
130 135 140
His His His His His Gly Gly Ser Gln Phe Asp Leu Cys Thr Arg Arg
145 150 155 160
Leu Gln Ser
<210> 44
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成多肽
<400> 44
Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys
1 5 10

Claims (128)

1.一种共价复合物，其包含：
(i)抗原结合结构域，其包含：
(1)第一腔和第二腔之间的由所述抗原结合结构域的重链可变(VH)区、轻链可变(VL)区、重链恒定(CH1)区和轻链恒定(CL)区包围的中心孔；和
(2)非CDR肽结合区，其包含：
(a)由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第一组氨基酸残基衬里的所述第一腔；
(b)由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第二组氨基酸残基衬里的所述第二腔；和
(c)包围所述第一腔和所述第二腔之间的所述孔的孔区域，所述孔区域由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第三组氨基酸残基衬里；
其中所述非CDR肽结合区包含第一半胱氨酸；和
(ii)肽化合物，其包含硫醇侧链氨基酸，所述硫醇侧链氨基酸通过所述第一半胱氨酸和所述硫醇侧链氨基酸之间的二硫化物连接与所述抗原结合结构域共价结合。
2.权利要求1的共价复合物，其中所述第二组氨基酸残基包含在对应于所述VH区的Kabat位置158的位置处的所述第一半胱氨酸。
3.权利要求1的共价复合物，其中所述第三组氨基酸残基包含在对应于所述VH区的Kabat位置175的位置处的所述第一半胱氨酸。
4.权利要求1-3中任一项的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区包含构架区氨基酸残基。
5.权利要求1-4之一的共价复合物，其中所述肽化合物具有下式：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2(I)
其中：
X0是Ser或空的；
X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的；
X2是Gln或空的；
X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X4是Asp或Asn；
X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X6是所述硫醇侧链氨基酸或丝氨酸；
X7是硫醇侧链氨基酸、Thr或Ser；
X8是所述硫醇侧链氨基酸、Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分；
X9是硫醇侧链氨基酸、Arg或Ala；
X10是Leu，Gln，Glu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X11是硫醇侧链氨基酸、Gln、Lys或Arg；
X12是Ser、Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的；
R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列；
R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列；
其中，
L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分；
其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分；和
其中R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
6.权利要求1-5之一的共价复合物，其中R20是治疗部分。
7.权利要求1-6之一的共价复合物，其中R20是蛋白质部分。
8.权利要求1-7之一的共价复合物，其中R20是纳米抗体部分。
9.权利要求1-8之一的共价复合物，其中R20是可变重链纳米抗体部分。
10.权利要求1-9之一的共价复合物，其中R20是抗CD16纳米抗体部分。
11.权利要求1-10之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地是肽基接头。
12.权利要求1-11之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地长度是约2至约10个氨基酸。
13.权利要求1-12之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地长度是约4至约6个氨基酸。
14.权利要求1-13之一的共价复合物，其中在位置X6处的所述硫醇侧链氨基酸是Cys。
15.权利要求1-14之一的共价复合物，其中X8是Arg。
16.权利要求1-15之一的共价复合物，其中X0是空的。
17.权利要求1-16之一的共价复合物，其中X1和X12独立地是Ser。
18.权利要求1-16之一的共价复合物，其中X1和X12是Ser。
19.权利要求1-18之一的共价复合物，其中X5是β,β’-二苯基-Ala。
20.权利要求1-19之一的共价复合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
21.权利要求1-20之一的共价复合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
22.权利要求1-21之一的共价复合物，其中R2是-Gly-Gly-Lys或-Gly-Gly-Ser-Lys。
23.权利要求1-22之一的共价复合物，其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
24.权利要求1-22之一的共价复合物，其中所述肽化合物是线性肽化合物。
25.权利要求1-24之一的共价复合物，其中所述肽化合物包含SEQ ID NO：1的序列。
26.权利要求1-5之一的共价复合物，其中X6是Ser。
27.权利要求1-5或26之一的共价复合物，其中X5是β,β’-二苯基-Ala。
28.权利要求1-5或26-27之一的共价复合物，其中在位置X8处的所述硫醇侧链氨基酸是取代的精氨酸。
29.权利要求1-5或26-28之一的共价复合物，其中所述取代的精氨酸是辛基-硫醇取代的精氨酸。
30.权利要求1-5或26-29之一的共价复合物，其中X0和X1是空的。
31.权利要求1-5或26-30之一的共价复合物，其中X11是赖氨酸。
32.权利要求1-5或26-31之一的共价复合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
33.权利要求1-5或26-32之一的共价复合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
34.权利要求1-5或26-33之一的共价复合物，其中R2是-Gly-Gly-Lys。
35.权利要求1-5或26-31之一的共价复合物，其中R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
36.权利要求1-5或26-35之一的共价复合物，其中所述肽化合物包含SEQ ID NO：2的序列。
37.权利要求1-5之一的共价复合物，其中X6是Ser。
38.权利要求1-5或37之一的共价复合物，其中X5是β,β’-二苯基-Ala。
39.权利要求1-5或37-38之一的共价复合物，其中X8是Arg。
40.权利要求1-5或37-39之一的共价复合物，其中X12是Ser。
41.权利要求1-5或37-40之一的共价复合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
42.权利要求1-5或37-41之一的共价复合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
43.权利要求1-5或37-42之一的共价复合物，其中R2是–Ser-Gly-X15-Gly-Lys，其中X15是所述硫醇侧链氨基酸。
44.权利要求43的共价复合物，其中X15是Cys。
45.权利要求1-5或37-43之一的共价复合物，其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
46.权利要求1-5或37-45之一的共价复合物，其中所述肽化合物包含SEQ ID NO：3的序列。
47.权利要求1-4之一的共价复合物，其中所述肽化合物具有下式：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-R2(II)
其中：
X0是Ser或空的；
X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的；
X2是Gln或空的；
X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X4是Asp或Asn；
X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X6是Ser；
X7是硫醇侧链氨基酸、Thr或Ser；
X8是Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分；
X9是硫醇侧链氨基酸、Arg或Ala；
X10是Leu，Gln，Glu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X11是硫醇侧链氨基酸、Gln、Lys或Arg；
X12是Ser、Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的；
X13是Gly或Ser；
X14和X15独立地是Gly、Ser、Ala或所述硫醇侧链氨基酸；
R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列；
R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列；
其中，
L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；
R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分；和
其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
48.权利要求47的共价复合物，其中R20是治疗部分。
49.权利要求47-48之一的共价复合物，其中R20是蛋白质部分。
50.权利要求47-49之一的共价复合物，其中R20是纳米抗体部分。
51.权利要求47-50之一的共价复合物，其中R20是可变重链纳米抗体部分。
52.权利要求47-51之一的共价复合物，其中R20是抗CD16纳米抗体部分。
53.权利要求47-52之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地是肽基接头。
54.权利要求47-53之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地长度是约2至约10个氨基酸。
55.权利要求47-54之一的共价复合物，其中L20A或L20B独立地长度是约4至约6个氨基酸。
56.权利要求47-55之一的共价复合物，其中X15是所述硫醇侧链氨基酸。
57.权利要求47的共价复合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
58.权利要求47的共价复合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
59.权利要求47的共价复合物，其中R2是–Gly-Lys。
60.权利要求47-59之一的共价复合物，其中所述肽化合物包含SEQ ID NO：3的序列。
61.权利要求1-60之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域包含片段抗原结合(Fab)结构域。
62.权利要求1-61之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域包含Fc结构域。
63.权利要求1-60之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域是片段抗原结合(Fab)结构域。
64.权利要求1-63之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域是人源化的抗原结合结构域。
65.权利要求1-64之一的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区由根据Kabat编号，在所述VL区的位置8、9、10、38、39、40、41、42、43、44、45、82、83、84、85、86、87、99、100、101、102、103、104、105、142、162、163、164、165、166、167、168和173，以及所述VH区的位置6、9、38、39、40、41、42、43、44、45、84、86、87、88、89、90、91、103、104、105、106、107、108、111、110、147、150、151、152、173、174、175、176、177、185、186和187处的氨基酸残基形成。
66.权利要求1-65之一的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置83处的Glu。
67.权利要求1-66之一的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置40处的Thr或Ser。
68.权利要求1-67之一的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置41处的Asn。
69.权利要求1-68之一的共价复合物，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置85处的Asp或Asn。
70.权利要求1-69之一的共价复合物，其中相对于不存在所述肽化合物，所述抗原结合结构域以增加的亲和力结合抗原。
71.权利要求1-70之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域以小于100nM的KD结合抗原。
72.权利要求1-71之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域以小于50nM的KD结合抗原。
73.权利要求1-72之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域以小于10nM的KD结合抗原。
74.权利要求1-73之一的共价复合物，其中所述抗原结合结构域以小于1nM的KD结合抗原。
75.一种具有下式的肽化合物：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-R2(I)
其中：
X0是Ser或空的；
X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的；
X2是Gln或空的；
X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X4是Asp或Asn；
X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X6是Cys或Ser；
X7是Cys、Thr或Ser；
X8是受保护的Arg、Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分；
X9是Cys、Arg或Ala；
X10是Leu，Gln，Glu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X11是Cys、Gln、Lys或Arg；
X12是Ser、Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的；
R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列；
R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列；
其中，
L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分；
其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分；和
其中R1和X11任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
76.权利要求75的化合物，其中R20是治疗部分。
77.权利要求75-76之一的化合物，其中R20是蛋白质部分。
78.权利要求75-77中任一项的化合物，其中R20是纳米抗体部分。
79.权利要求75-78中任一项的化合物，其中R20是可变重链纳米抗体部分。
80.权利要求75-79中任一项的化合物，其中R20是抗CD16纳米抗体部分。
81.权利要求75-80中任一项的化合物，其中L20A或L20B独立地是肽基接头。
82.权利要求75-81之一的化合物，其中L20A或L20B独立地长度是约2至约10个氨基酸。
83.权利要求75-82中任一项的化合物，其中L20A或L20B独立地长度是约4至约6个氨基酸。
84.权利要求75-83之一的化合物，其中X6是Cys。
85.权利要求75-84中任一项的化合物，其中X8是Arg。
86.权利要求75-85中任一项的化合物，其中X0是空的。
87.权利要求75-86中任一项的化合物，其中X1和X12独立地是Ser。
88.权利要求75-86中任一项的化合物，其中X1和X12是Ser。
89.权利要求75-88中任一项的化合物，其中X5是β,β’-二苯基-Ala。
90.权利要求75-89中任一项的化合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
91.权利要求75-90中任一项的化合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
92.权利要求75-91中任一项的化合物，其中R2是-Gly-Gly-Lys。
93.权利要求75-92中任一项的化合物，其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
94.权利要求75-93中任一项的化合物，其中所述肽化合物是线性肽化合物，其中所述肽化合物包含SEQ ID NO：1的序列。
95.权利要求75的化合物，其中X6是Ser。
96.权利要求75的化合物，其中X5是β,β’-二苯基-Ala。
97.权利要求75或96的化合物，其中X8是Arg。
98.权利要求75或96-97中任一项的化合物，其中X12是Ser。
99.权利要求75或96-98中任一项的化合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
100.权利要求75或96-99中任一项的化合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
101.权利要求75或96-100中任一项的化合物，其中R2是–Ser-Gly-X15-Gly-Lys，其中X15是Cys。
102.权利要求75或96中任一项的化合物，其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
103.权利要求75或96-102中任一项的化合物，其中所述肽化合物包含SEQ ID NO：3的序列。
104.一种具有下式的肽化合物：
R1-X0-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-R2(II)
其中：
X0是Ser或空的；
X1是Ser、Cys、Gly、β-丙氨酸、二氨基丙酸、β-叠氮基丙氨酸或空的；
X2是Gln或空的；
X3是Phe、Tyr、β,β’-二苯基-Ala、His、Asp、2-溴-L-苯丙氨酸、3-溴-L-苯丙氨酸、4-溴-L-苯丙氨酸、Asn、Gln、改性Phe、含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X4是Asp或Asn；
X5是Leu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X6是Ser；
X7是Cys、Thr或Ser；
X8是Arg、Ala或包含式–L3A-L3B-R3的侧链的氨基酸，其中L3A是键、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基，L3B是化学接头，并且R3是空间位阻化学部分；
X9是Cys、Arg或Ala；
X10是Leu，Gln，Glu，β,β’-二苯基-Ala，Phe，Trp，Tyr，苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸的非天然类似物，含可水合羰基的残基或含硼酸的残基；
X11是Cys、Gln、Lys或Arg；
X12是Ser、Cys、Gly、7-氨基庚酸、β-丙氨酸、二氨基丙酸、炔丙基甘氨酸、异天冬氨酸或空的；
X13是Gly或Ser；
X14和X15独立地是Gly、Ser、Ala或Cys；
R1是空的、-L10A-L10B-R10、任选被-L10A-L10B-R10取代的氨基酸肽序列；
R2是空的、-L20A-L20B-R20、任选被–L20A-L20B-R20取代的氨基酸肽序列；
其中，
L10A、L10B、L20A、L20B独立地是键、肽基接头、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-S(O)2NH-、-NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的杂亚烷基、取代或未取代的环亚烷基、取代或未取代的杂环亚烷基、取代或未取代的亚芳基、或者取代或未取代的杂亚芳基；
R10和R20独立地是反应性部分、诊断部分、治疗部分或可检测部分；和
其中X1和X12任选地连接在一起，以形成环状肽基部分。
105.权利要求104的化合物，其中R20是治疗部分。
106.权利要求104-105之一的化合物，其中R20是蛋白质部分。
107.权利要求104-106之一的化合物，其中R20是纳米抗体部分。
108.权利要求104-107之一的化合物，其中R20是可变重链纳米抗体部分。
109.权利要求104-108之一的化合物，其中R20是抗CD16纳米抗体部分。
110.权利要求104-109之一的化合物，其中L20A或L20B独立地是肽基接头。
111.权利要求104-110之一的化合物，其中L20A或L20B独立地长度是约2至约10个氨基酸。
112.权利要求104-111之一的化合物，其中L20A或L20B独立地长度是约4至约6个氨基酸。
113.权利要求104-112之一的化合物，其中X15是Cys。
114.权利要求113的化合物，其中R2是1至100个氨基酸的肽序列。
115.权利要求104-114中任一项的化合物，其中R1是空的并且R2是1至100个氨基酸的肽序列。
116.权利要求104-115中任一项的化合物，其中R2是–Gly-Lys。
117.权利要求104-116中任一项的化合物，其中所述肽化合物包含SEQ ID NO：3的序列。
118.一种抗原结合结构域，其包含：
(1)第一腔和第二腔之间的由所述抗原结合结构域的重链可变(VH)区、轻链可变(VL)区、重链恒定(CH1)区和轻链恒定(CL)区包围的中心孔；和
(2)非CDR肽结合区，其包含：
(a)由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第一组氨基酸残基衬里的所述第一腔；其中所述第一组氨基酸残基包含在对应于所述VL区的Kabat位置102、142或143的位置处的半胱氨酸；
(b)由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第二组氨基酸残基衬里的所述第二腔；其中所述第二组氨基酸残基包含在对应于所述VH区的Kabat位置208或158的位置处的半胱氨酸；或
(c)包围在所述第一腔和所述第二腔之间的所述孔的孔区域，所述孔区域由所述抗原结合结构域的VH、VL、CH1和CL区的第三组氨基酸残基衬里，其中所述第三组氨基酸残基包含在对应于所述VH区的Kabat位置174或175的位置处的半胱氨酸。
119.权利要求118的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含片段抗原结合(Fab)结构域。
120.权利要求118或119的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含Fc结构域。
121.权利要求118的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域是片段抗原结合(Fab)结构域。
122.权利要求118-121之一的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域是人源化的抗原结合结构域。
123.权利要求118-122之一的抗原结合结构域，其中所述非CDR肽结合区包含构架区氨基酸残基。
124.权利要求118-123之一的抗原结合结构域，其中所述非CDR肽结合区由根据Kabat编号，在所述VL区的位置8、9、10、38、39、40、41、42、43、44、45、82、83、84、85、86、87、99、100、101、102、103、104、105、142、162、163、164、165、166、167、168和173，以及所述VH区的位置6、9、38、39、40、41、42、43、44、45、84、86、87、88、89、90、91、103、104、105、106、107、108、111、110、147、150、151、152、173、174、175、176、177、185、186和187处的氨基酸残基形成。
125.权利要求118-124之一的抗原结合结构域，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置83处的Glu。
126.权利要求118-125之一的抗原结合结构域，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置40处的Thr或Ser。
127.权利要求118-126之一的抗原结合结构域，其中其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置41处的Asn。
128.权利要求118-127之一的抗原结合结构域，其中所述非CDR肽结合区包含根据Kabat编号在所述VL区的位置85处的Asp或Asn。
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