CN113480653A - 一种含有γδT细胞的药物组合物在治疗癌症中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有γδT细胞的药物组合物在治疗癌症中的用途。本发明提供一种特异性针对VEGFR2蛋白的VEGFR2单克隆抗体，同时分离制备得到了高活性的γδT细胞，二者分别针对肝癌细胞均具有较好的抑制活性，同时将所述单克隆抗体与γδT细胞一起使用能够有效的抑制肝癌肿瘤的生长，具有较好的应用前景。

Description

一种含有γδT细胞的药物组合物在治疗癌症中的用途
技术领域
本发明涉及生物领域，更具体的涉及一种含有γδT细胞的药物组合物在治疗癌症中的用途。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我国及全球范围发病率第5位、致死率第2位的恶性肿瘤。全球每年60万-70万人死于HCC，约55％发生在中国。HCC的发生、发展与机体免疫状态有关机体免疫低下和肿瘤细胞逃离免疫监视.导致癌症的发生、发展。
肝癌单抗研究大多为甲胎蛋白，铁蛋白单抗，肝癌单抗研究很少，在肝癌单抗的制备方面，多数采用传统的方法，即以可溶性物质或肝癌培养细胞为免疫原，由于肿瘤抗原的变异或部分丢失，因而该方法难以获得高亲和性、高特异性的单抗。用肿瘤新鲜组织制备细胞悬液免疫动物制备单抗已有成功报道，该法虽然筛选麻烦，但能较好地保持抗原性，不失为制备单抗的好方法，用该方法融合获得特异性肝癌单抗，其中特异性较好的HAb18肝癌免疫组化染色阳性率为75％，已通过了中国药品生物制品检定所的《人用鼠源性单克隆抗体制备及质量控制要点》的要求。此外，中科院上海细胞所谢弘报道了一株鼠抗人原发性肝癌(PHC)细胞膜抗体Hepama-I，研究证明对PHC细胞有较高的亲和力。这些均为我国肝癌单抗的深入研究增添了信心。
以单抗为载体的导向化疗，放疗及放免显象诊断，近年取得了实质性进展。①化学药物—单抗交联物：国内外用于交联的抗癌药物有数十种，主要有MTX，MMC，DM，AM等，依肿瘤类别选择。谢弘用Hepama-I IgG-BSA-MTX对肝癌细胞的IC50值为8×10-8M，而对Hela细胞的IC50值只有3×10-6M；②细胞毒素—单抗交联物：用于制备细胞毒素的有蓖麻毒蛋白，天花毒蛋白，白喉毒素，植物毒蛋白，A链类似的致核糖体失活蛋白；③同位素—单抗交联物：由于肿瘤抗原的不均一性，抗体不能到达肝癌细胞，因此用特异性放疗，效果比化疗好。
抗体导向化疗可改变药物在体内自然分布，造成药物在瘤区浓集，从而发挥其特异性杀伤作用。张尚权等研究了抗肝癌单抗Hepama-I丝裂霉素结合物，经荷瘤裸鼠动物实验表明，该导向化疗药物较单纯的化疗有明显的亲和性，是其应用的前提和关键。
用放射性核素标记单抗制备而成的放免显象剂和治疗剂已成为肿瘤早期诊断，综合治疗及术后清扫的有力手段之一。截止目前，美国约有近十种显象剂和治疗剂通过FDA，进入I，II期临床验证阶段，但尚无一种针对肝癌的制剂，国内这方面的研究已初露端倪。施乐华报道了131I-Hepama-I经股动脉介入放免定位及治疗30例失去手术指征的原发性肝癌患者的研究，显象率为14/18，很优等显象时间在注射后96h，AFP下降率为75.0％，肿瘤部分缩小率66。6％，与对照组比较，生存时间明显延长，认为核素碘标记的Hepama-Ⅰ肝癌单抗可作为治疗晚期肝癌的综合疗法之一。肝癌单抗HAb18也得到了广泛的应用研究，其中131I-HAb18放免显象剂和导向治疗剂均已通过国家一类新药评审，获得临床批号进入I，II期临床，成为我国首批通过的核素—抗体放射药品。临床应用显示，肝癌患者的体内双核素减影阳性显象率达90.9％(40/44)，能检出的小肝癌瘤块直径为0.5cm。导向治疗肿瘤完全缓解率3.7％(1/27)，部分缓解率48.1％(13/27)，稳定14.3％(4/27)，无效33.3％(9/27)，2a以上生存率46.2％(6/13)，对患者血液学功能，肾功能及甲状腺功能无明显影响。
近年，集化疗和内照射治疗于一体的“双弹头”免疫导向治疗药物已有报道，隋延方报道以肝癌单抗HAb18为载体，以131I-ADM为弹头，制备出肝癌双弹头组合单抗免疫导向结合物131I-HAb18-ADM，结果表明，双弹头集中了化疗与放疗的优点，二者协同提高了肝癌导向治疗的效果，该药物提高了对肿瘤细胞的抑制和杀伤作用。
AU2016232104B2公开了用于预防和治疗肝细胞癌的抗Claudin 1单克隆抗体，所述单克隆抗体能够抑制肝癌细胞系HUH-7.5.1，但是抑制效果并不是特别突出。
US10927170B2公开了通过施用这种单克隆抗体或其药物组合物预防和/或治疗肝细胞癌的方法，给出了肝癌细胞系HUH-7.5.1的实验结果。同样的，所述单克隆抗体的效果同样不是很突出。
现有技术已知了阿帕替尼能够高度选择性的与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合，阻断信号传导，强效抗肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的生长、转移和散播。但是目前针对VEGFR2的单克隆抗体还不够多，可选择的种类也不够丰富，因此，存在巨大的市场需求。
此外，γδT细胞是一群兼有固有免疫和特异性免疫双重特征的T细胞.具有杀伤与调节的双重功能.在维持局部免疫稳态中发挥不可替代的作用。γδT细胞杀伤肿瘤细胞的机制与CTL细胞和γδT细胞相似.主要通过穿孔素、颗粒酶和Fas/FasL途径发挥作用。在体外大量扩增自身具有抗肿瘤活性的γδT细胞并回输.可杀伤那些经机体免疫逃逸的肿瘤细胞。但是目前，将γδT细胞联合其他抗肿瘤药物一起作用的方式还比较少，有待于进一步的研究。
发明内容
本发明一方面，本发明提供一种用于治疗肝癌的药盒，所述药盒由特异性抑制VEGFR2的单克隆抗体以及γδT细胞组成，所述单克隆抗体的重链可变区(SEQ ID NO:1)
EVQLEESATELARPGASVKLSCKASGYIFSQLVERWIKQRPGQGLEWIGPRMIGTSNKHGADFPVGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCAGANGFRRFWGLGTTLAVSS
轻链可变区(SEQ ID NO:2)
DIVITQRPALMAASPGEKVTITCMKACLKCNRSYDWYQQKSGISPKPWIYAWTEVRRGVPARFSGSGSGTSYSLTITSMEAEDAATYYCCDVGRAMMYFGAGTKLELK。
更进一步的，本发明还提供特异性抑制VEGFR2的单克隆抗体以及γδT细胞在制备用于治疗肝癌的药盒中的用途；其中，所述单克隆抗体的重链可变区(SEQ ID NO:1)
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轻链可变区(SEQ ID NO:2)
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另外一方面，提供一种特异性抑制VEGFR2的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区(SEQ ID NO:1)
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轻链可变区(SEQ ID NO:2)
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在一些实施方案中，VEGFR2的单克隆抗体是特异性结合人VEGFR2的人免疫球蛋白。在一些实施方案中，VEGFR2的单克隆抗体选自Fab，Fab′，F(ab′)2，scFv，小体或双抗体的抗体片段。
在一些实施方案中，特异性结合人VEGFR2的FABs，例如人或人源化FABs。
另一方面，本文提供了包含至少一种本文所述的VEGFR2的单克隆抗体和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施例中，VEGFR2的单克隆抗体为约5％至约95％，或约10％至约90％，或约15％至约85％，或约20％至约80％，或约25％至约75％，或约30％至约70％，或约40％至约60％，或约40-50％(w/w)的药物组合物。在一些实施方案中，所述药盒包含壳形成剂，例如三亮氨酸或亮氨酸。在一些实施方案中，三亮氨酸或亮氨酸为组合物的约10-75％(w/w)。在一些实施方案中，三亮氨酸为组合物的约10-30％(w/w)。在其它实施方案中，亮氨酸为组合物的约50-75％(w/w)。在一些实施方案中，所述药盒包含至少一种玻璃形成赋形剂，其中所述玻璃形成赋形剂选自组氨酸，海藻糖，甘露醇，蔗糖或柠檬酸钠。在一些实施方案中，至少一种玻璃形成赋形剂是海藻糖或海藻糖和甘露醇的混合物。在一些实施方案中，玻璃形成赋形剂为药盒的约15-35％(w/w)。在一些实施方案中，药盒包含缓冲液，例如组氨酸，甘氨酸，乙酸酯或磷酸酯缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液为药盒的约5-13％。
在一些实施方案中，本文提供的药盒被配制成干粉制剂，例如适于吸入的干粉制剂。
有益效果
本发明提供一种特异性针对VEGFR2蛋白的VEGFR2单克隆抗体，同时分离制备得到了高活性的γδT细胞，二者分别针对肝癌细胞均具有较好的抑制活性，同时将所述单克隆抗体与γδT细胞一起使用能够有效的抑制肝癌肿瘤的生长，具有较好的应用前景。
附图说明
图1Western检测结果图
图2γδT细胞杀伤效果图
图3肿瘤抑制率效果图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。
实施例1VEGFR2单抗抗体的制备及鉴定
首次免疫时，在小鼠颈背部皮下注射100μg VEGFR2蛋白(重组人血管内皮生长因子受体-2，货号：PKA-242，艾美捷科技有限公司)。首免后第21天进行第2次免疫，每只小鼠颈背部皮下注射100μg VEGFR2蛋白。第2次免疫后第14天进行第3次免疫，经腹腔给每只小鼠注射100μg VEGFR2蛋白，并经小鼠眼眶静脉丛采血。第3次免疫后的第14天进行第4次免疫，分别在邻近脾和腹腔内给小鼠注射50μg VEGFR2蛋白。第4次免疫7d后经眼眶静脉丛采血，与三免血清一起用ELISA检测血清效价。融合前3～4d再经脾给小鼠注射100μg生理盐水稀释的VEGFR2蛋白。取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按常规方法融合。间接ELISA法筛选、有限稀释法克隆化。
经细胞融合、筛选及克隆化，获得2株能稳定分泌VEGFR2单抗的杂交瘤细胞株，克隆号分别为6C11和4E09。按照常规方法，用上述杂交瘤细胞株制备小鼠腹水，将腹水纯化后获得单抗。
(1)利用小鼠Ig类/亚类/亚型检测试剂盒对单抗进行检测，结果如表1所示。
表1 4E09单克隆抗体亚型检测结果
克隆号 重链亚类 轻链亚型
4E09 IgM κ
(2)单克隆抗体的鉴定-Western印迹法：检测分别将VEGFR2蛋白、VEGFR和BSA蛋白制备成Western印迹样本，进行电泳并转膜，依次孵育抗体，4℃反应过夜，HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗室温孵育40min后进行显影。如图1所示，克隆号为4E09的单抗能够特异性的结合VEGFR2蛋白，而不与VEGFR和BSA结合，具由较好的特异性。
(3)单克隆抗体4E09的解离常数测定
对于单克隆抗体4E09，通过以下的方法测定解离常数(Kd值)。将VRGFR2蛋白用10mM乙酸钠溶液(pH5.0)稀释，制备终浓度50μg/mL的配体溶液。关于配体的固定化和Kd值的计算，使用Biacore T200。使用胺偶联试剂盒，将配体溶液固定在感应芯片CM5上。然后，用电泳缓冲液HBS-P+制作0.1～50nM的4E09抗体稀释溶液，得到传感图线。作为拟合模型，采用1:1绑定，对传感图线进行分析，结果，4E09单克隆抗体的Kd值为10.96nM，具有较好的结合特性。
(4)抗体可变区序列鉴定：使用总RNA提取试剂盒从4E09杂交瘤细胞提取总RNA，并利用抗体亚型特异性引物和通用引物将其逆转录为cDNA。随后通过PCR试剂盒扩增鼠免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段，将所得的PCR片段亚克隆至pMD19-T载体系统中，并使用载体特异性引物对插入片段进行测序。最终获得了克隆4E09的独特V-区域核苷酸/氨基酸序列。其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
实施例2 4E09对肝癌细胞的抑制实验
(1)种板:取对数生长期的肝癌SMMC-7721细胞用胰蛋白酶消化，使用吸管小心吹打(尽量避免产生气泡)，将细胞悬液充分混合均匀，通过细胞计数板计数，使用低血清(5％)完全培养液稀释密度为1×105个/mL的细胞悬液，取出96孔板，其中3-5个孔加入不含细胞悬液的完全培养基作为调零孔，其余各孔精确加入100uL细胞悬浮液，均匀铺板，确保每孔接种的细胞浓度为1×104个，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h以使悬浮细胞贴壁。
(2)加药：待细胞贴壁后，用无菌PBS或生理盐水清洗1-2遍，外圈36孔加入PBS溶液，调零孔仍只加入完全培养基，选取其中3-5个孔仅加入100ul RPMI-1640完全培养基，不加入任何药物作为对照孔，其余孔使用移液枪将含有不同药物浓度的RPMI-1640完全培养基100uL加入其中，作为实验孔。分别设置3种单抗预浓度(5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL)，并分别干预24h、72h二个时间点，每个时间点复测两次。以阿帕替尼20ug/mL作为阳性对照；
(3)MTT与细胞作用：分别在24h、72h后用生理盐水或PBS液清洗1-2遍，96孔板中加入100uL RPMI-1640完全培养基，然后再在每孔加入20ul已配好的MTT溶液，继续在培养箱中孵育4h，4h后轻轻将96孔板中的溶液吸尽，再向96孔板中分别加入150ulDMSO溶液，将其再摇床上避光慢速震荡10min，待甲瓒与DMSO溶液充分混合均匀。
(4)测定吸光度并计算：使用酶标仪测定490nm处吸光度值(OD值)。按公式计数：细胞生长抑制率(％)＝(0D值对照组-OD值实验组)/(OD值对照组-OD值调零组)×100％。结果如表2所示。
表2不同浓度单抗作用细胞的增殖抑制率
组别 剂量(μg/ml) 24h抑制率(％) 72h抑制率(％)
空白对照组 0 0.000 0.000
阳性对照组 20ug/mL 36.37±2.15 84.26±2.50
单抗实验组1 5ug/mL 14.17±0.23 44.30±1.57
单抗实验组2 10ug/mL 27.42±1.05 57.19±2.13
单抗实验组3 20ug/mL 49.28±1.22 90.88±2.34
实验组与空白对照组相比，实验组对肝癌细胞的增殖有明显的抑制作用，且随着时间及浓度的增加，抑制作用效果越明显，差异有统计学意义(P＜0.05)，(如表2)。在上述抗体药物的浓度和时间内，抗体对细胞的增殖抑制作用有量-效及时-效依赖关系，说明单抗对人肝癌细胞HepG2的增殖有明显的抑制作用。该抗体药物在同浓度条件下比阳性对照组阿帕替尼在72h的抑制率效果上要有大幅度的提高，具有较好的效果。
实施例3高活性γδT细胞的制备
取健康献血者静脉抗凝血100mL以淋巴细胞分离液分离出末梢血单个核细胞(PBMC)。将PBMC加入γδT细胞RPMll640培养液(含100mL/L小牛血清、IPP 2μg/L 50mL/L人AB型血清和IL-2 200IU/mL)中，调整细胞密度为1×108/L，置75cm2细胞培养瓶中，于37℃、50mL/L CO2细胞培养箱中培养10d收获细胞。
用抗TCRγδ-FITC、抗CD44-FITC与培养0和10d时收集的培养细胞直接染色后进行流式细胞术检测分析，阴性对照为FITC标记的小鼠IgG。结果显示，PBMC为培养前γδT细胞数为4.57％，培养10d时γδT细胞数为71.46％。同时，第10d CD44的表达量达到了95.1％，结果表明制备的γδT细胞具有较好的纯度。
实施例4γδT细胞的杀伤实验
γδT细胞对肝癌SMMC-7721的杀伤效果研究以肝癌细胞为靶细胞，ΓΔT细胞为效应细胞，按10∶1的效/靶比将效应细胞加入到靶细胞中，同时设相应的靶细胞孔，效应细胞孔和培养基空白对照孔。每组均设3个平行孔。靶细胞数为1×104个，靶细胞接种6h后加入效应细胞，分别于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养0、12、24、36h时向各孔加入10μl CCK-8溶液，37℃孵育1h±10min，用酶标仪于450nm波长下测定OD值。杀伤率由下式计算:杀伤率％＝[1－(效靶细胞作用孔OD值－效应细胞孔OD值)]/靶细胞孔OD值×100％。结果如图2所示。
从图2的γδT细胞杀伤效果的时间关系上可以看出，肝癌的杀伤效果呈现一定的时间依赖性，说明γδT细胞可实现对肿瘤细胞的杀伤作用，在36h时，杀伤率可达到63.3％左右，比此前研究的高活性ΓΔT细胞的效果还有一定的提高。
实施例5肝癌移植瘤的建立与分组实验
将收集的SMMC-7721肝癌细胞株(2×107/mL)直接腹腔接种到5只小鼠体内，7d后小鼠腹腔产生大量腹水，在无菌条件下抽取3mL小鼠腹水作为肿瘤源，并加入15mL生理盐水进行稀释，将肿瘤细胞调整至2.0×108/mL，分别取0.3mL细胞悬液接种于小鼠右前肢腋部皮下，3d后小鼠皮下即可长出瘤块。将小鼠随机分为对照组、单抗处理组、γδT细胞处理组和单抗联合γδT细胞处理组以及阳性对照氯喹处理组，每组各10只。阳性氯喹处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射氯喹(100μg/kg)，单抗处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射单抗(100μg/kg)，γδT细胞处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射实施例制备的γδT细胞(5×109/kg)，单抗联合γδT细胞处理组小鼠于建模后第2天开始腹腔注射实施例制备的γδT细胞(5×109/kg)以及单抗(100μg/kg)，对照组则注射生理盐水作为对照，连续处理16d并密切观察小鼠存活状态。16d后所有小鼠腹腔注射0.8％戊巴比妥(60mg/kg)，待小鼠失去意识后处死，收集肿瘤标本，根据steel公式(V＝a×b2/2)计算建模后的肿瘤体积以及处死后的肿瘤体积，计算肿瘤体积的生长抑制率。结果如图3所示。
从图3的结果可以看出，γδT处理组、单抗处理组、单抗联合γδT细胞处理组以及阳性对照氯喹处理组均能够有效的抑制肿瘤的生长。特别是单抗联合γδT细胞一起使用，能够显著的提高肿瘤生长的抑制率抑制率达到96.3±3.75％，具有较好的效果。
应当理解，以上所述的仅是本发明的一些实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的创造构思的前提下，还可以做出其它变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京戴域生物技术有限公司
<120> 一种含有γδT细胞的药物组合物在治疗癌症中的用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Ala Thr Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Ser Gln Leu
20 25 30
Val Glu Arg Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Pro Arg Met Ile Gly Thr Ser Asn Lys His Gly Ala Asp Phe Pro
50 55 60
Val Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Gly Ala Asn Gly Phe Arg Arg Phe Trp Gly Leu Gly Thr Thr Leu
100 105 110
Ala Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Ile Thr Gln Arg Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Met Lys Ala Cys Leu Lys Cys Asn Arg
20 25 30
Ser Tyr Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ile Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Ala Trp Thr Glu Val Arg Arg Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Cys Asp Val Gly Arg Ala Met
85 90 95
Met Tyr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105

Claims (7)

1.一种特异性抑制VEGFR2的单克隆抗体，其特征在于所述单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID NO:1所示，轻链可变区如SEQ ID NO:2所示。
2.特异性抑制VEGFR2的单克隆抗体以及γδT细胞在制备用于治疗肝癌的药盒中的用途；其特征在于，其中，所述单克隆抗体的重链可变区如SEQ ID NO:1和轻链可变区SEQ IDNO:2所示；其中γδT细胞的制备方法如下：取健康献血者静脉抗凝血100mL以淋巴细胞分离液分离出末梢血单个核细胞(PBMC)，将PBMC加入γδT细胞RPMll640培养液：含100mL/L小牛血清、IPP 2μg/L、50mL/L人AB型血清和IL-2 200IU/mL，调整细胞密度为1×108/L，置75cm2细胞培养瓶中，于37℃、50mL/L CO2细胞培养箱中培养10d收获细胞即为γδT细胞。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述药盒中还含有药学上可接受的载体。
4.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述药盒中包含至少一种赋形剂。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述药盒中的赋形剂选自组氨酸，海藻糖，甘露醇，蔗糖或柠檬酸钠。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述药盒中包含缓冲液。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于所述药盒中的缓冲液为组氨酸，甘氨酸或磷酸缓冲液。
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