JPWO2014142356A1 - 強皮症治療剤 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規な強皮症治療剤を提供することを目的とし、具体的には、葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含有する強皮症治療剤に関する。
Description
本発明は、例えば葉酸受容体βに対する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む強皮症治療剤に関する。
強皮症は、膠原病の一つで、線維化を特徴とする皮膚と身体のいろいろな部分に病変を発症する原因不明の慢性疾患である。強皮症の病態としては、線維芽細胞の活性化(コラーゲン等の細胞外基質の蓄積)、血管障害及び免疫異常(自己抗体)が挙げられる。
強皮症の発病機序の一つとして、マクロファージの早期浸潤と浸潤した当該マクロファージからの分泌によるTGF−βの上昇が注目されている。活性化マクロファージは線維化の早期に最初に浸潤する細胞であり、TGF−β、CTGF、PDGF等の因子を分泌して強皮症の線維化過程において重要な働きをすると推測されている(非特許文献1及び2)。
強皮症の治療の現状においては、早期の患者に対しては副腎皮質ステロイド薬が一般的に使用され、また肺の症状に対しては免疫抑制薬が一般的に使用される。また、研究中の治療方法はインターロイキン2、TGF−β等のサイトカインを抑制することに向けられている。例えば、抗TGF−β抗体を用いた治療が有意な治療効果を示したことが報告されている(非特許文献3)。しかしながら、従来において、強皮症の進行を完全に根治させる治療は確立していない。
一方、本発明者等は、葉酸受容体β(FRβ)がリウマチの滑膜のマクロファージ等の炎症時の組織マクロファージにおいて高発現し、そのFRβ陽性マクロファージの除去が線維芽細胞の活性化と血管新生を抑制することを報告した(非特許文献4及び5)。
また、本発明者等は、抗FRβ抗体の重鎖可変領域(VH)と緑膿菌毒素(PE)とを連結した融合タンパク質と、抗FRβ抗体の軽鎖可変領域(VL)とから成るリコンビナント抗FRβイムノトキシンを有効成分として含む間質性肺炎治療剤を開示する(特許文献1)。
しかしながら、非特許文献4及び5並びに特許文献1のいずれも、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを強皮症の治療に使用できることを開示していない。
強皮症の発病機序の一つとして、マクロファージの早期浸潤と浸潤した当該マクロファージからの分泌によるTGF−βの上昇が注目されている。活性化マクロファージは線維化の早期に最初に浸潤する細胞であり、TGF−β、CTGF、PDGF等の因子を分泌して強皮症の線維化過程において重要な働きをすると推測されている(非特許文献1及び2)。
強皮症の治療の現状においては、早期の患者に対しては副腎皮質ステロイド薬が一般的に使用され、また肺の症状に対しては免疫抑制薬が一般的に使用される。また、研究中の治療方法はインターロイキン2、TGF−β等のサイトカインを抑制することに向けられている。例えば、抗TGF−β抗体を用いた治療が有意な治療効果を示したことが報告されている(非特許文献3)。しかしながら、従来において、強皮症の進行を完全に根治させる治療は確立していない。
一方、本発明者等は、葉酸受容体β(FRβ)がリウマチの滑膜のマクロファージ等の炎症時の組織マクロファージにおいて高発現し、そのFRβ陽性マクロファージの除去が線維芽細胞の活性化と血管新生を抑制することを報告した(非特許文献4及び5)。
また、本発明者等は、抗FRβ抗体の重鎖可変領域(VH)と緑膿菌毒素(PE)とを連結した融合タンパク質と、抗FRβ抗体の軽鎖可変領域(VL)とから成るリコンビナント抗FRβイムノトキシンを有効成分として含む間質性肺炎治療剤を開示する(特許文献1)。
しかしながら、非特許文献4及び5並びに特許文献1のいずれも、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを強皮症の治療に使用できることを開示していない。
Higashi−Kuwata N.ら,Exp.Dermatol.,2009年,Vol.18,pp.727−729
Yamamoto T,ら,J.Invest.Dermatol.,1999年,Vol.112,pp.456−462
McCormick LL.ら,J.Immunol.,1999年,Vol.163,pp.5693−5699
Nagayoshi R.ら,Arthritis Rheum.,2005年,Vol.52,pp.2666−2675
Nagai T.ら,Arthritis Rheum.,2006年,Vol.54,pp.3126−3134
上述のように、従来において、強皮症の進行を完全に根治させる治療は確立しておらず、新規な強皮症治療剤を開発するニーズがある。
そこで、本発明は、新規な強皮症治療剤を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、強皮症モデルマウスにおいて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したところ、強皮症の病態である皮膚における線維化を抑制し、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが強皮症の治療に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
(1)葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含有する強皮症治療剤。
(2)前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、(1)記載の強皮症治療剤。
(3)前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、(1)又は(2)記載の強皮症治療剤。
(4)前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、(1)〜(3)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(5)前記抗体は、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチドに対して誘起されたものである、(1)〜(4)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(6)前記抗体は、配列番号2に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチドに対して誘起されたものである、(1)〜(4)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(7)前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、(1)〜(6)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(8)前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖(L鎖)可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(7)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(9)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(10)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(11)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(12)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(13)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(14)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(15)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(16)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(17)前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)及びジフテリアトキシン(diphtheria toxin)から成る群より選択されるものである、(1)〜(16)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(18)前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、(1)記載の強皮症治療剤。
(19)前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、(1)記載の強皮症治療剤。
(20)標識に結合した、(1)〜(19)のいずれか1に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を含む強皮症診断剤。
(21)前記標識が発蛍光団、色素又は放射性同位元素である、(20)記載の強皮症診断剤。
(22)(1)〜(19)のいずれか1に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体、又は(20)若しくは(21)記載の強皮症診断剤を含む強皮症診断キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013−054090号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
そこで、本発明は、新規な強皮症治療剤を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、強皮症モデルマウスにおいて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したところ、強皮症の病態である皮膚における線維化を抑制し、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが強皮症の治療に使用できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
(1)葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含有する強皮症治療剤。
(2)前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、(1)記載の強皮症治療剤。
(3)前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、(1)又は(2)記載の強皮症治療剤。
(4)前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、(1)〜(3)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(5)前記抗体は、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチドに対して誘起されたものである、(1)〜(4)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(6)前記抗体は、配列番号2に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチドに対して誘起されたものである、(1)〜(4)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(7)前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、(1)〜(6)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(8)前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖(L鎖)可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(7)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(9)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(10)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(11)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(12)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(13)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(14)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(15)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(16)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、(1)〜(8)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(17)前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)及びジフテリアトキシン(diphtheria toxin)から成る群より選択されるものである、(1)〜(16)のいずれか1記載の強皮症治療剤。
(18)前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、(1)記載の強皮症治療剤。
(19)前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、(1)記載の強皮症治療剤。
(20)標識に結合した、(1)〜(19)のいずれか1に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を含む強皮症診断剤。
(21)前記標識が発蛍光団、色素又は放射性同位元素である、(20)記載の強皮症診断剤。
(22)(1)〜(19)のいずれか1に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体、又は(20)若しくは(21)記載の強皮症診断剤を含む強皮症診断キット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013−054090号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
図1は、強皮症モデルマウスにおけるブレオマイシンによる(A)CD68陽性マクロファージと(B)FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示すグラフである。グラフの縦軸は、マクロファージ数(cells/HPF)である。
図2は、強皮症モデルマウスにおけるブレオマイシンによる(A)CD68陽性マクロファージと(B)FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示す免疫組織学的染色像である。
図3は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療1週後のトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAの測定結果を示すグラフである。
図4は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1の発現を示す免疫組織学的染色像である。マウス正常皮膚における(a)CD68/TGF−β1 二重染色及び(b)FRβ/TGF−β1 二重染色、並び強皮症モデルマウス皮膚における(c)CD68/TGF−β1 二重染色及び(d)FRβ/TGF−β1 二重染色。
図5は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1陽性細胞数(%)を示すグラフである。
図6は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の(A)CD68陽性マクロファージと(B)FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示すグラフである。グラフの縦軸は、マクロファージ数(cells/HPF)である。
図7は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後のCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示す免疫組織学的染色像である。CD68陽性マクロファージの皮膚への浸潤:(a)正常皮膚、(c)毒素だけのIV、(e)リコンビナント抗FRβイムノトキシンのIV。FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤:(b)正常皮膚、(d)毒素だけのIV、(f)リコンビナント抗FRβイムノトキシンのIV。
図8は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の(A)hydroxyproline分析を通じた皮膚のコラーゲン量(縦軸:ハイドロキシプロリン量(μg/area))、又(B)HE染色をしたマウスの皮膚の厚さ(縦軸:皮膚の厚さ(mm))を顕微鏡下で測定した結果を示すグラフである。
図9は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の皮膚の厚さを顕微鏡下で観察した顕微鏡写真である。
図10は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の皮膚の厚さを顕微鏡下で観察した顕微鏡写真である。
図2は、強皮症モデルマウスにおけるブレオマイシンによる(A)CD68陽性マクロファージと(B)FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示す免疫組織学的染色像である。
図3は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療1週後のトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAの測定結果を示すグラフである。
図4は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1の発現を示す免疫組織学的染色像である。マウス正常皮膚における(a)CD68/TGF−β1 二重染色及び(b)FRβ/TGF−β1 二重染色、並び強皮症モデルマウス皮膚における(c)CD68/TGF−β1 二重染色及び(d)FRβ/TGF−β1 二重染色。
図5は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1陽性細胞数(%)を示すグラフである。
図6は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の(A)CD68陽性マクロファージと(B)FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示すグラフである。グラフの縦軸は、マクロファージ数(cells/HPF)である。
図7は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後のCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤を示す免疫組織学的染色像である。CD68陽性マクロファージの皮膚への浸潤:(a)正常皮膚、(c)毒素だけのIV、(e)リコンビナント抗FRβイムノトキシンのIV。FRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤:(b)正常皮膚、(d)毒素だけのIV、(f)リコンビナント抗FRβイムノトキシンのIV。
図8は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の(A)hydroxyproline分析を通じた皮膚のコラーゲン量(縦軸:ハイドロキシプロリン量(μg/area))、又(B)HE染色をしたマウスの皮膚の厚さ(縦軸:皮膚の厚さ(mm))を顕微鏡下で測定した結果を示すグラフである。
図9は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の皮膚の厚さを顕微鏡下で観察した顕微鏡写真である。
図10は、強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療4週後の皮膚の厚さを顕微鏡下で観察した顕微鏡写真である。
本発明に係る強皮症治療剤は、葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含有することを特徴とし、これにより、FRβ発現性マクロファージの細胞死を選択的に引き起こし、且つ強皮症の進行に伴う皮膚の線維化を抑制することができる。換言すれば、本発明に係る強皮症治療剤は、皮膚線維化抑制剤ということもできる。
本明細書で使用する「葉酸受容体β」又は「FRβ」は、強皮症の病変部(すなわち、線維化細胞)に局在するマクロファージ(以下、強皮症関連マクロファージとも称する)の細胞表面に発現される受容体タンパク質である。FRβは正常組織や末梢血中のマクロファージでは発現されないか又は非常に低レベルで発現される。
哺乳動物には、ヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等の家畜動物、イヌ、ネコ等のペット動物等が含まれる。好ましい哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用される「葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体」は、FRβタンパク質を認識して該タンパク質に結合することができる抗体であり、以下に述べるように、該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、或いは、強皮症関連マクロファージとの結合親和性を有する限り、抗体フラグメントや合成抗体(例えば組換え抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等)であってもよい。これらの抗体はまた、強皮症により線維化した細胞がその表面にFRβを発現するような場合には、強皮症関連マクロファージ及び該線維化細胞の両方に結合することを可能にする。抗体をヒトに対して使用する場合、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
本明細書で使用する「細胞毒素」又は「細胞毒性剤」は、強皮症関連マクロファージ及び、場合により、線維化細胞を死滅させる又は障害する能力を持つ任意の物質を指す。
1.複合体
本発明に係る強皮症治療剤の有効成分としての複合体は、上記の通り、強皮症関連マクロファージの表面に発現する分子標的としてのFRβと結合する抗体と、該マクロファージ(及び場合により、線維化細胞)の細胞死を引き起こす細胞毒素又は細胞毒性剤とから基本的に構成される。
ここで、細胞死は、細胞の死滅、殺傷又は障害を意味し、細胞毒素又は細胞毒性剤によって引き起こされる。細胞毒素は、いわゆるトキシンとも呼ばれるタンパク質であるのに対して、細胞毒性剤は、低分子量の化学療法剤であり、前者には、微生物、特に細菌由来のトキシンが含まれ、一方、後者には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤等が含まれる。
本発明における複合体が上記抗体と細胞毒素から成るとき、これらの成分は融合タンパク質の形態をとることができる。この場合、細胞毒素は、好ましくは抗体タンパク質のC末端に、必要に応じてリンカー(例えばペプチド)を介して、結合することができる。一方、本発明における複合体が上記抗体と細胞毒性剤から成るとき、これらの成分は、結合のための官能基を介して共有結合又は非共有結合によって結合することができる。
1.1 抗体
本発明において、上記抗体は、強皮症関連マクロファージのFRβに特異的に結合するものである。ここで、「特異的」とは、上記抗体が上記マクロファージのFRβと免疫学的反応により結合するが、FRβ又はそれと80%以上の配列同一性を持つタンパク質以外のタンパク質とは実質的に結合しないことを意味する。この点で、上記抗体は、FRのアイソフォームの1つであるFRα(例えばヒトFRαはヒトFRβとの間に約70%のアミノ酸配列同一性がある(特表2008−500025号公報))と結合しないことが望ましい。
本発明で使用可能な抗体は、抗原であるFRβタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメントである。部分ペプチドは、5以上、好ましくは7以上、より好ましくは8以上の連続アミノ酸を有する。一般に、抗原性エピトープ又は抗原決定基は、約5〜約10アミノ酸から成り、且つ連続的アミノ酸配列又は不連続的アミノ酸配列を有する。
本発明における抗体は、FRβと結合する、好ましくは特異的に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、それらの抗体フラグメントのいずれであってもよい。
本発明における抗体はまた、いずれの免疫グロブリン(Ig)クラス(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM等)及びサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)のものであってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ又はλのいずれであってもよい。
本発明における抗体フラグメントは、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、重鎖モノマー又はダイマー、軽鎖モノマー又はダイマー、1つの重鎖と1つの軽鎖から成るダイマー等を含む。このようなフラグメントの作製方法は当該技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、或いは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
本発明における抗体はまた、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等であってもよい。組換え抗体には、例えば一本鎖抗体(scFv)、二重特異性抗体等が含まれる。二重特異性抗体は、2つの異なる結合特異性を有する抗体を指し、例えばdiabody、ScDb(single chain diabody)、dsFv−dsFv等が含まれる(浅野竜太郎,生化学77(12)1497−1500,2005参照)。
以下、国際公開第2010/098503号の記載に準じて、本発明において使用するための抗体の作製方法について詳述する。
本発明において使用可能な抗体を作製するにあたり、最初に免疫原(抗原)として使用するタンパク質、すなわちFRβタンパク質又はその部分ペプチドを調製する。ここで部分ペプチドは、5以上、好ましくは7以上の連続アミノ酸からなる配列を有するものである。免疫原として使用することができるFRβタンパク質の由来は、標的とするFRβと特異的に結合することができる抗体を誘起できるものであるものであれば特に限定されず、例えばヒト、マウス等の哺乳動物に由来するFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として使用する。本発明では、免疫原として、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチド、あるいは配列番号2に示すアミノ酸配列から成るマウスFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することができる。免疫原として、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することが特に好ましい。
FRβタンパク質又はその部分ペプチドは、FRβのアミノ酸配列情報(例えば配列番号1等)に基づき、当該技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法等により調製することができる。ヒトを含む他の哺乳動物由来のFRβの配列情報は、例えばGenBank(NCBI、米国)、EMBL(EBI、欧州)等から入手可能である。
あるいは、遺伝子組換え手法を利用して、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することも可能である。簡単に説明すると、FRβタンパク質をコードするDNAの配列を適当なタンパク質産生用ベクターに連結し、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドが発現し得るように宿主中に導入し、該宿主中でFRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することができる。この手法は当業者に周知であり、この場合に採用するベクター、宿主細胞、形質転換方法、培養方法、標的タンパク質の精製方法は、当業者が適宜選択することができる。遺伝子組換え手法については、例えば、Sambrookら,Molecular Cloning A Laboratory Manual,2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1998)等を参照することができる。
上記のようにして調製したFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として、本発明で使用する抗体を製造することができる。あるいは、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドをコードするDNAを組み込んだ発現ベクター、或いは該タンパク質又はその部分ペプチドを発現する哺乳動物細胞を免疫原として使用して、本発明で使用する抗体を製造してもよい。
ポリクローナル抗体は、上記のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウス等に免疫して、抗血清を得ることによって製造することができる。具体的には、上記免疫原を、必要に応じて免疫原性を高めるためのアジュバントと共に、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内投与する。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、ミョウバン(Alum)、ムラミルペプチド(細菌細胞壁関連ペプチドの一種)等を使用することができる。その後、数日から数週間の間隔で、1〜7回の免疫を行い、最後の免疫日から1〜7日後に、ELISA等の酵素免疫測定法等によって抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血して抗血清を得る。このようにして取得した抗血清は、そのまま使用してもよいし、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを固定化したカラムで1回又は数回精製処理を行った後に使用してもよい。
本発明で使用可能なモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。すなわち、上記のようにして免疫感作した哺乳動物から得た抗体産生細胞(例えば、脾臓由来リンパ球細胞、リンパ系細胞等)と自己抗体産生能のないミエローマ細胞からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造することができる。ハイブリドーマの製造方法は当該技術分野で周知であり、例えばKohler及びMilsteinら(Nature(1975)256:495−96)の方法に準じて行うことができる。
本発明におけるモノクローナル抗体の例として、ヒトFRβ発現細胞により免疫されたマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合させることにより得られた、下記の参考例1に示すマウス−マウスハイブリドーマクローン36b又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
また本発明におけるモノクローナル抗体の他の例として、マウスFRβ発現細胞により免疫されたラットの脾細胞と、ラットミエローマ細胞とを融合させることにより得られた、下記の参考例1に示すラット−ラットハイブリドーマクローンCL5又はクローンCL10が産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが有する核酸であって、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖又はL鎖を含む抗体をコードする遺伝子を包含する。これらの核酸はハイブリドーマから通常の遺伝子工学的手法により得ることができ、またその塩基配列も公知の塩基配列決定法により決定することができる。例として、マウス−マウスハイブリドーマクローン36b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号3及び4に、マウス−マウスハイブリドーマクローン94b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号5及び6に示す。また他の例として、ラット−ラットハイブリドーマクローンCL5が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号7及び8に、ラット−ラットハイブリドーマクローンCL10が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号9及び10に示す。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号3、5、7、9)、L鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)に制限されず、これらの遺伝子の変異体を包含する。
かかる変異体としては例えば以下のものを挙げることができる。
(i)上記H鎖又はL鎖可変領域遺伝子において、1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体;(ii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸と実質的に同一の塩基配列を有し、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体;及び(iii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸に相補的な核酸(塩基配列)とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体。
本発明において、H鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「数個」という用語は、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個を指す。
本発明において、H鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「実質的に同一」とは、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号3、5、7、9)、L鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有することを意味する。なお、2つの配列間の同一性%は、配列が共有する同一な位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一な位置の数/位置(例えば、一部重複する位置)の総数x100)。
2つの配列間の同一性%の決定は、例えばカーリン(Karlin)及びアルトシュール(Altschul)(1993)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877)において改変されたカーリン及びアルトシュール(1990)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264)のアルゴリズムを用いて行うことができる。この種のアルゴリズムは、アルトシュールら(1990)J.Mol.Biol.215:403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。また、比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、アルトシュールら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389に記載されたGapped BLASTを用いるとよい。または、分子間の遠隔的な関連を検出する反復検索を行うためにPSI−BLASTを用いることもできる。BLAST、Gapped BLAST及びPSI−BLASTプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照)。配列比較のために使用できるアルゴリズムのその他の好ましい例として、例えばマイヤーズ(Myers)及びミラー(Miller)(1988)、CABIOS 4:11−17のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、GCC配列整列化ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている。
本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば30℃〜50℃で、3〜4×SSC(150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム、pH7.2)、0.1〜0.5% SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは40℃〜45℃で、3.4×SSC、0.3%SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、2×SSCと0.1%SDSを含む溶液、及び1×SSC溶液、0.2×SSC溶液による室温での連続した洗浄等の条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素(例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びGC含量、ハイブリダイゼーションの反応時間等)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本明細書において「同等」とは、例えばFRβ抗原に対する結合特異性、結合親和性といった生物学的な活性が実質的に同一であることを指す。またこの用語は、実質的に同質の活性を有する場合を含んでもよく、ここでいう「同質」の活性とは、FRβ抗原に対する特異的結合性といった活性の性質が同一であること、或いは生理的性質、薬理的性質、又は生物学的性質が同一であることをいう。
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばSambrookら(上記)、Ausubelら(上記)等に記載されており、これらの条件を本発明に使用してもよい。
上記変異体は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法(Site specific mutagenesis)を用いて常法により導入することができる(Proc Natl Acad Sci USA.,1984 81:5662;Sambrookら(上記))。
本発明では、上記のように作製したハイブリドーマに基づき、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体を作製することもできる。
具体的には、作製したハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞といった宿主に導入して、宿主において組換え抗体を生産させることができる(P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean.,Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS,J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies:principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS)。
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫した後、そのトランスジェニック動物の血液、ミルク中等からその抗体遺伝子に由来する抗体を大量に取得することも可能である。また、上記トランスジェニック動物の中には、内因性抗体遺伝子を欠失した且つヒト抗体遺伝子を保有するマウスやウシ等のヒト抗体産生動物も知られているので、このような動物を利用する場合には、ヒトFRβに結合する完全ヒト抗体を得ることができる(例えば国際公開WO96/9634096、WO96/33735、WO98/24893等)。さらにまた、当該動物の抗体産生細胞(例えばB細胞)とミエローマ細胞から作製したハイブリドーマをin vitroで培養する場合には、上記のような手法で、モノクローナル抗体を産生することもできる。このとき、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々の条件に応じて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知の栄養培地又は基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
産生されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法、例えばプロテインAあるいはプロテインGカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
本発明で使用可能な抗体はまた、キメラ抗体であることができる。キメラ抗体は、例えばMorrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851−6855;Neuberger et al.,1984,Nature,312:604−608;Takeda et al.,1985,Nature,314:452−454に記載される技術を用いて製造することができる。これらの技術では、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングする。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する異なる部分が存在する分子である。キメラ抗体として、例えば、抗FRβマウス又はラットモノクローナル抗体のH鎖及び/又はL鎖可変領域と他の哺乳動物由来の免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を挙げることができる。
本発明においてはまた、例えばマウス又はラットモノクローナル抗体由来の可変領域又は超可変領域を含む可変領域の一部と、ヒト免疫グロブリンの定常領域、又はヒト免疫グロブリンの可変領域の一部及び定常領域、とを有する抗体、例えば「ヒト化抗体」を挙げることができる。ヒト化抗体の場合、マウス由来の抗体領域部分は約10%未満が望ましい。
上記ヒト化抗体は、例えば抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体(又は抗マウスFRβラットモノクローナル抗体)のH鎖可変領域及び/又はL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR1、2及び3)を含むアミノ酸配列を含むことができる。さらに具体的には、以下の抗体を例示することができる。
(1)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(2)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(4)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(5)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(6)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(7)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(8)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
なお、配列番号3〜10のCDR1〜3のヌクレオチド位置を下記表1に示す。
上記マウスドナー配列に適するヒトアクセプター抗体配列は、マウス可変領域のアミノ酸配列の既知のヒト抗体のH鎖又はL鎖の配列とのコンピュータ比較によって同定されうる。そのフレームワーク配列がマウスL鎖可変領域及びH鎖可変領域のフレームワーク領域と高い配列同一性を表すヒト抗体からの可変ドメインは、マウスフレームワーク配列を用いてNCBI BLAST(米国)を利用するKabatデータベースに照会することによって同定することができる。このとき、マウスドナー配列と80%以上、好ましくは90%以上の配列の同一性を共有するアクセプター配列を選択することができる。ラットドナー配列についても同様に、それに適するヒトアクセプター抗体配列を同定することができる。
このようにして同定されたヒトアクセプター抗体H鎖及びL鎖配列をコードする塩基配列をベースにして、その可変領域の一部をマウス抗体のものと置換するように組換えを行う。得られたヒト/マウスキメラH鎖及びL鎖をコードするDNAを発現ベクターに組込み、適当な宿主細胞に形質転換することによって、ヒト化抗体をクローン化、産生することができる。
上記のようなキメラ抗体、ヒト化抗体は、ヒトへの適用に際し、抗原性を低減できるという利点を有する。
本発明において使用する抗体はまた、例えば米国特許第4,946,778号;Bird,1988,Science 242:423−426;Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883;Ward et al.,1989,Nature 334:544−546に記載される技術を用いて作製した、FRβタンパク質又はその部分ペプチドに対する一本鎖抗体(scFv)であってもよい。本発明において使用する一本鎖抗体は、例えば上述のモノクローナル抗体のH鎖可変領域(例えば配列番号3、5、7、9)及びL鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)の配列情報に基づき、常法に従ってそれぞれH鎖フラグメントとL鎖フラグメントを調製し、アミノ酸架橋によってFv領域のH鎖フラグメントとL鎖フラグメントとを連結し、一本鎖のポリペプチドを得ることにより形成することができる。
1.2 細胞毒素又は細胞毒性剤
本発明に使用することができる細胞毒素は、強皮症関連マクロファージの細胞死を誘導する目的で使用することができる任意の細胞毒素であり、例えば緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)等を挙げることができる。本発明においては、特に、PE38等の緑膿菌外毒素を使用することが好ましい。
あるいは、本発明に使用することができる細胞毒性剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤等から適宜選択可能である。このような細胞毒性剤としては、強皮症関連マクロファージを死滅させることができるものが好ましい。また、FRβを細胞表面に発現する線維化細胞の場合には、線維化細胞の死滅も誘導可能な細胞毒性剤を利用することができる。
1.3 リコンビナントイムノトキシン等の複合体
本発明における複合体の1つであるリコンビナントイムノトキシンを作製するために、上記のようにして作製された抗体又はその部分ペプチドは細胞毒素とコンジュゲートされる。すなわち、本発明におけるリコンビナントイムノトキシンとは、標的(すなわちFRβタンパク質)に結合する上記抗体が、細胞毒素又はそのサブユニットにコンジュゲートされたキメラ分子である。本発明においては、植物や細菌等に由来する細胞毒素、ヒト起源の細胞毒素、合成の細胞毒素を使用することができる。
抗体と細胞毒素とのコンジュゲートは、以下のようにして行うことができる。すなわち、抗体分子中の反応性基(例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等)を利用し、該反応性基と反応しうる官能基を持つ細胞毒素と該抗体とを接触させることによって、リコンビナントイムノトキシンを得ることができる。あるいは、上記抗体のH鎖可変領域遺伝子(配列番号3、5、7、9)及びL鎖可変領域遺伝子(配列番号4、6、8、10)の配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により、H鎖フラグメント又はL鎖フラグメントのいずれかを細胞毒素との融合タンパク質として作製し、細胞毒素と融合していない他方のフラグメントと一緒に、SH結合を介して一本鎖抗体又は二本鎖抗体を形成させることによって、リコンビナントタンパク質を作製してもよい。SH結合を介したH鎖フラグメントとL鎖フラグメントの結合は、βメルカプトエタノールやジチオスレイトール等の還元剤によってメルカプト基(−SH基)を露出後、両者を混和することによって達成することができる。
本発明において使用するリコンビナントイムノトキシンの一例として、それぞれ上記マウス−マウスハイブリドーマクローン36b細胞又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンであるリコンビナントイムノトキシンが挙げられる。マウス−マウスハイブリドーマクローン36bと緑膿菌外毒素のリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。またマウス−マウスハイブリドーマクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。
本発明において使用する複合体のもう1つの例は、上記のFRβに結合する抗体と細胞毒性剤との結合体である。一般に、抗体の定常領域、好ましくはC末端側に細胞毒性剤を結合することができる。結合は、抗体タンパク質のNH2基、SH基、OH基、COOH基等を利用し、これと反応性の官能基を持つ細胞毒性剤とを、場合により例えば炭化水素リンカーを介して、化学的に結合することによって実施できる。
2.治療剤
こうして作製された複合体は、強皮症関連マクロファージに特異的に高発現しているFRβを標的とし、強皮症関連マクロファージの細胞死を誘導して皮膚の線維化を抑制することができる。
このように、本発明におけるリコンビナントイムノトキシン等の複合体は、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体であり、強皮症に対する治療効果を有するものである。また、当該複合体は、強皮症において特異的に高発現しているFRβを標的とするため、正常細胞への影響が少なく、副作用のリスクが低いという利点を有する。
本発明における複合体は、これを有効成分として含有する強皮症治療剤として製剤化される。すなわち、本発明に係る強皮症治療剤は、治療上有効量の複合体を含むものである。ここで、「治療上有効量」とは、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量を指し、強皮症治療剤を適用する対象の性別、年齢、体重、疾患の重篤度、投与経路等様々な要因に応じて変化する。例えば、所与の用法に従って、60kgの成人に、本発明における複合体が1日当たり200μg以上、好ましくは500μg以上の量で投与される量を治療上有効量として含むことができる。
本発明に係る強皮症治療剤は、複合体に加えて、生理学的に許容し得る製薬上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、賦形剤及び担体等の1種以上を含むことができる。また強皮症の治療に効果的な他の薬剤との混合物としてよい。このような薬剤として、抗TGF−β抗体、immunoglobulin、プロスタグランジンE1等を挙げることができる。
本発明に係る強皮症治療剤は、経口投与、或いは注射、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与(すなわち静脈内又は筋肉内投与)用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。あるいは、本発明に係る強皮症治療剤は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水等で使用前に再構成するための凍結乾燥粉剤としてもよい。
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射等が考えられる。あるいは、患者の患部に直接本発明に係る強皮症治療剤を接触させてもよい。
本発明に係る強皮症治療剤を適用する対象は特に限定されず、強皮症に罹患している患者(特に、早期の強皮症罹患患者)、強皮症を治療している患者等のいずれであってもよい。またその対象はヒトに限らず、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物として、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ等を例として挙げることができる。
また、本発明は、上述の複合体又は強皮症治療剤の治療上有効量を強皮症患者に投与することを含む、強皮症の治療方法に関する。
3.強皮症の診断
上記第1節で説明した抗体又は複合体は、強皮症の診断、例えば、強皮症の存在又は不在、及び該疾患を有するリスクを判定するために使用することができる。
具体的には、本発明は、被験者由来の皮膚組織サンプルを、上記第1節で説明した抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させ、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は当該マクロファージの皮膚への浸潤を指標として、強皮症の存在又は不在、及び該疾患を有するリスクを測定(検査)する方法を提供する。
例えば、被験者由来の皮膚組織サンプルを、上述の抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させて、FRβ発現マクロファージが該皮膚組織中に存在するか否かあるいはFRβ発現マクロファージが皮膚組織へ浸潤しているか否かを調べ、陰性対照(例えば健常者の皮膚組織サンプル)と比較して、FRβ発現マクロファージが有意に存在するか又は皮膚組織へ浸潤している場合に、強皮症の存在を検査することができる。
あるいは、本発明は、強皮症治療を受けているか又は受けた被験者由来の皮膚組織サンプルを、上述の抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させて、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は不在あるいは皮膚組織への浸潤の存在又は不在を指標として強皮症治療の治療効果を判定する方法を提供する。
本明細書で使用する「判定する」という用語は、医師の判断、すなわち医療行為を意図したものではなく、医師に検査結果の情報又はデータを提示し、医師の判断を助けるための手段を意味する。従って、「判定する」という用語は、「測定する」、「検査する」、「決定する」又は「評価する」等の用語で置き換えることができる。
本発明はさらに、上記測定又は判定方法等において使用するための強皮症診断剤又は強皮症診断キットも提供する。
強皮症診断剤又は強皮症診断キットには、上記抗体又は複合体、あるいは上記抗体又は複合体に更に標識を結合した複合体を含めることができる。標識には、例えば発蛍光団(例えばGFP等)、色素、放射性同位元素(例えば、18F−FDG)等が含まれる。
上記抗体又は複合体によるFRβ発現マクロファージの検出は、ELISA、蛍光抗体法、放射免疫法、サンドイッチ法、組織染色法等によって行うことができる。二次抗体に、例えば酵素(例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等)、発蛍光団(例えばFITC、テトラメチルローダミン、テキサスレッド等)、色素、放射性同位元素等のラベル(標識)を結合したものを使用して、マクロファージに結合した抗体又は複合体を検出する。ラベルの結合には、化学的結合法、ビオチン−(ストレプト)アビジン系を利用する結合法等が含まれる。
画像診断の場合には、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体を上述の抗体又は複合体にラベルし、被験者に該抗体又は複合体を投与し、PET/CT等の画像診断技術を使用して画像をとり、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は皮膚への浸潤を判定又は検査することができる。
本発明に係る強皮症診断キットには、上記(標識された、又は標識されない)抗体又は複合体或いはそれらを含む造影剤の他に、測定に使用するためのバッファー、ラベル化二次抗体等の試薬、測定手順を記載した使用説明書等を含めることができる。試薬は、別々の容器に密封される。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔参考例1〕リコンビナント抗FRβイムノトキシンの製造
本参考例では、国際公開WO2010/098503の実施例の記載に準じて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを以下のように作製した。
1−1.抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の製造
[抗原であるFRβ発現細胞の調製]
関節リウマチ滑膜又はBalb/cマウス肝臓からTrizol(GibcoBRL)、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にて添付説明書に従って全RNAを抽出後、SuperScript plasmid System(Invitrogen)にて添付説明書に従ってcDNAを合成した。次に、1μlのリウマチ滑膜、又はBalb/cマウス肝臓cDNAをそれぞれ別個にBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、10ピコモル量に調整したセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:agaaagacatgggtctggaaatggatg(配列番号15);マウス肝臓:tctagaaagacatggcctggaaacag(配列番号16))及びアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:gactgaactcagccaaggagccagagtt(配列番号17);マウス肝臓:cccaacatggatcaggaact(配列番号18))を加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅したFRβ遺伝子のPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションを行った。すなわち、PCR産物2.5μlにNaCl溶液を1μL、滅菌蒸留水1.5μl、ベクタープラスミド(PCR2.1−TOPO)1μLを加えて室温で5分間インキュベートし、その内の2μLを大腸菌(TOP10F’)に加えて氷中で30分反応後、42℃30秒の熱処理し、氷中で2分間静置し、250μLのSOC培地を加えた後、37℃で1時間シェーカー内で培養した。培養終了後、LB培地に捲き、37℃で一晩培養した。
大腸菌培養の為、プレート上より採取した白いコロニーをアンピシリン(50mg/mL)を含むLB液体培地に加えて37℃一晩培養した。プラスミドの精製はQiagenプラスミド精製キット(Qiagen)にて行った。組み込まれたFRβ遺伝子は、制限酵素EcoRIによる処理後、アガロース電気泳動に展開し、約0.8kb(782bp)のFRβ遺伝子産物を確認後、その部位を切り出し、遺伝子産物の抽出をQuiagen PCR purification kit(Quiagen)にて精製した。次に予めEcoRI処理を行った哺乳細胞発現用ベクターpER−BOS(Mizushima et al.pEF−BOS,a powerful mammalian expression vector.Nucleic Acid Res.1990;18(17):5322)と混和し、T4 ligase(Roshe)を用いてライゲーションを行った。ライゲーション産物の大腸菌(TOP10F’)への遺伝子導入並びにFRβ遺伝子の確認は上記と同様の手法で行った。
pEF−BOSに組み込まれたFRβ遺伝子を確認後、ヒトFRβを含むベクターはマウスB300−19細胞に、マウスFRβを含むベクターはラットRBL2H3細胞にそれぞれ遺伝子導入を行った。すなわち、予め1x105個に調整した各細胞に、20μLのリポフェクタミン(GibcoBRL)と混和したFRβベクター1μgを加えて遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたB300−19マウス細胞及びラットRBL2H3細胞は抗生物質G418耐性を獲得するため、1mg/mLの濃度のG418を含む培地にて遺伝子導入された細胞を選択培養した。遺伝子導入された細胞のFRβ遺伝子導入の確認はPCR法にて行った。すなわち、1x107個に調整した各細胞をcDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成し、10ピコモル量に調整したセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:agaaagacatgggtctggaaatggatg(配列番号15);マウス肝臓:tctagaaagacatggcctggaaacag(配列番号16))及びアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:gactgaactcagccaaggagccagagtt(配列番号17);マウス肝臓:cccaacatggatcaggaact(配列番号18))をBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅後アガロース電気泳動を行い、FRβが示すバンド0.8kbを確認した。
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の作製]
FRβ発現マウスB300−19細胞あるいはラットRBL2H3細胞を1x107個に調整し、フロインド完全アジュバンドと混合し、Balb/Cマウス(抗ヒトFRβモノクローナル抗体用)あるいはWhister Kyotoラット(抗マウスFRβモノクローナル抗体用)の尾部に3ヵ所、腹腔内に免疫した。この免疫を2〜4回繰り返した。
モノクローナル抗体の作製はKolerの方法(Kohler & Milstein,Nature(1975)256:495−96)に従って行った。すなわち、脾臓あるいは腸骨リンパ節を取りだし、単一細胞に解離させた。解離した細胞を骨髄腫由来の細胞(NS−1)と細胞融合させてハイブリドーマを作製し、HAT選択培地にて培養し、培養上清中に分泌された抗体を、先のFRβ発現細胞との反応性で選別を行った。
得られたハイブリドーマのクローン化は、96穴プレートの各穴当たり1細胞となるように調整した限界希釈培養にて行った。クローン化細胞の選別は、FRβ発現細胞との反応性で行った。
クローン化したハイブリドーマを1x107個に調整し、ヌードマウス腹腔内に投与して腹水を調整し、Protein Gカラム(GEバイオサイエンス)にてモノクローナル抗体を精製した。精製したマウス及びラットモノクローナル抗体のアイソタイプは、アイソタイピングELISAキット(Pharmingen)を用いて決定した。その結果、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体はIgG2aタイプのクローン36bとIgG1タイプの94bの二つが得られ、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体は、IgG2aタイプのCL5とCL10の二つが得られた。これら各抗体の抗原に対する反応性はフローサイトメトリーにて解析した。
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の重鎖遺伝子可変領域(VH)及び軽鎖遺伝子可変領域(VL)遺伝子の決定]
マウスハイブリドーマクローン36b、94bを1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。36b及び94bはIg−Prime Kitを用いてVH及びVLの遺伝子をPCRにて決定した。PCR条件は添付の説明書に従って行った。すなわち、94℃60秒、50℃60秒、72℃120秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させ、VH及びVLの遺伝子を増幅した。増幅したVH及びVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。遺伝子導入した大腸菌よりプラスミドを精製し、36b、94bのVH及びVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、PCR産物をABI 310 DNA sequencerにて解析した。
ラットハイブリドーマクローンCL5、CL10を1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。次に、Ig−Prime Kit及びラットVH増幅用にデザインしたプライマー(caccatggagttacttttgag(配列番号19))を用い、VH及びVLの遺伝子をPCRで増幅させた。増幅したVH及びVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。次に、大腸菌よりプラスミドを精製し、VH及びVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、ABI 310 DNA sequencerにて解析した。
1−2.リコンビナント抗FRβイムノトキシンの製造
[免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)にシステインの変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)の63番目のアミノ酸グリシン(塩基配列ggc)をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製し(センスプライマー:cagaggcctgaacattgtctggagtggattggaag(配列番号20)、アンチセンスプライマー:cttccaatccactccagacactgttcaggcctctg(配列番号21))、Quick change site−directed mutagenesis kit(Stratagene)を用いて上記第1−1節で得た94bのVHを含むプラスミドpCR2.1−TOPO 94bVHに変異誘発処理を行った。このPCR反応は、反応液を95℃30秒、55℃60秒、68℃4分のサイクルを12回連続して行った。抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)へのシステイン導入も上記と同様の方法にてプライマーをデザインして行った(センスプライマー:gtccgccaggctccaacgaagtgtctggagtgggtcgc(配列番号22)、アンチセンスプライマー:gcgacccactccagacacttcgttggagcctggcggac(配列番号23))。
次に、反応後のDNAを大腸菌XL1−Blueに遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地で選択培養した。選択した形質転換体のプラスミドをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、63番目のグリシンがシステイン(塩基配列tgt)に変異したことを確認した。
[pRK79PE38ベクターに変異を導入したVHを挿入]
次に、PE38遺伝子を含むpRK79ベクターpRK79PE38に、94bVH及びCL10VHの変異を導入したVHの挿入を以下の方法にて行った。
変異を導入した94bの5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてtaagaaggagatatacatatggaggttcagctgcagcagtc(配列番号24)とgccctcgggacctccggaagcttttgaggagactgtgagagtgg(配列番号25)を、CL10の5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてatacatatggaggtgcagctggtggagtctggg(配列番号26)とtccggaagcttttgaggagacagtgactgaagc(配列番号27)をそれぞれデザインした。アニーリングプライマーにはそれぞれ制限酵素であるNdeIがあり、この部位でのクローニングにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。また、もう片方のアニーリングプライマーにはHindIII部位が挿入されており、この部位でのクローニングにより、VHとPE遺伝子が結合した融合タンパク質の発現が可能である。
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使って変異を導入したpCR2.1−TOPO−94bVH及びpCR2.1−TOPO−CL10VHプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とHindIII(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VHと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79−VHPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VHの塩基配列がpRK79ベクターのPE38塩基配列と連結していることを確認した。
[免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(センスプライマー:taagaaggagatatacatatggacattgtgatgtcacaatc(配列番号28)(このプライマーには制限酵素NdeI切断可能な塩基catatgを含むため、この部位でクローニングすることにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である);アンチセンスプライマー:gctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt(配列番号29)(このプライマーは125番目のアミノ酸をシステイン(tgt)に変異させ、終始コドンtagに続いて制限酵素EcoRI切断可能な塩基gaattcが来るようにデザインしてある))。同様に抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(atacatatggacattgtgatgcccaatctccatcc(配列番号30)及びgctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt(配列番号31))。
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使ってpCR2.1−TOPO−94bVLプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とEcoRI(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VLと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79−VLPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VLの125アミノ酸がシステインに変異していることや、終始コドンtagが配置されていることを確認した。
[リコンビナントタンパク質封入体の調製]
上記の変異導入VHを組み込んだプラスミドpRK79−94bVHPE、pRK79−CL10VHPE、変異導入VLを組み込んだプラスミドpRK79−VL94b、pRK79−VLCL10を50ng調整し、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)に遺伝子導入した。遺伝子が導入された大腸菌の選抜は0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて37℃15〜18時間の培養で行った。
選択終了後の大腸菌は1000mLのスーパーブロース培地で37℃の条件で培養し、可視吸光度600nmで1.0−1.5に到達するまで培養した。培養後、IPTG(isopropyl−beta−D−thio−galactopyranoside)を終濃度1mMになるように培地に添加し、さらに90分間37℃で培養した。培養終了後、遠心分離にて大腸菌を回収後、50mMトリス緩衝液(pH7.4、20mM EDTAを含む)を用いて200mLとなるまで懸濁した。懸濁終了後、卵白リゾチームを最終濃度0.2mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させて大腸菌の破壊を行った。破壊後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿物はさらに50mMトリス緩衝液(pH7.4、2.5%のTritonX−100、0.5M NaCl、20mM EDTAを含む)で200mLとなるまで懸濁し、卵白リゾチームを最終濃度0.2mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させた。反応終了後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿はさらに50mMトリス緩衝液(pH7.4、2.5%のTritonX−100、0.5M NaCl、20mM EDTAを含む)で200mLとなるまで懸濁し、十分混和させた後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を5回繰り返した後の沈殿物をリコンビナントイムノトキシン封入体とし、さらに0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、6Mグアニジン塩酸塩、1mM EDTAを含む)で溶解させ、最終濃度10mg/mLとなるように調節した。
[リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンの作製]
上記で調製した94b−VHPEと94b−VL、CL10−VHPEとCL10−VLを混和させ、リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンを作製した。
まず、0.5mLのVHPE、0.25mLのVLを混和し、ジチオトレイトール(DTT)を最終濃度10mg/mLとなるように加え、室温で4時間の還元処理を行った。処理後、75mLの0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、0.5Mアルギニン、0.9mM酸化型グルタチオン、2mM EDTAを含む)に溶解させた。この溶液を10℃で40時間放置することによって、VHとVLを結合させた。結合終了後、分子量10,000カットの遠心濃縮器(Centricon 10、Amicon)で5mLまで濃縮し、さらに50mLのトリス緩衝液(pH7.4、0.1M尿素、1mM EDTAを含む)で希釈した。この希釈液をリコンビナントイムノトキシン精製の出発物質とした。
次に、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で平衡化したイオン交換カラムHi−Trap Q(GE)に、30mL/時間の流速で、上記出発物質を吸着させた後、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で洗浄した。洗浄後、吸着したリコンビナントタイプイムノトキシンの溶出をトリス緩衝液(pH7.4、0.3M NaCl、1mM EDTAを含む)で行った。溶出サンプルはトリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で透析した後、イオン交換カラムPOROS HQ(POROS)でさらに精製した。すなわち、透析した精製物質を10mL/分の流速で吸着させ、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で洗浄後、上記緩衝液に0Mから1.0MのNaCl勾配を設定することにより、リコンビナントタイプイムノトキシンの溶出を行った。精製リコンビナントタイプイムノトキシンの最終調製はTSK300SW(Tosoh)ゲル濾過クロマトグラフィーにて行った。まず、75%の消毒用エタノールで48時間洗浄することによってTSK300SWカラム中のエンドトキシン除去を行った。次に日本薬局方注射用蒸留水で洗浄し、その後日本薬局方生理食塩水でTSK300SWカラムの平衡化を行った。平衡化終了後、リコンビナントタイプイムノトキシンを投与し、流速0.25mL/分でカラムからの溶出液を採取した。採取後、0.22μmの濾過滅菌機で処理し、純度をSDS−PAGEにて確認後、−80℃で保存した。
[SDS−PAGEによる純度検定]
SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動)は0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む12%ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動相には終濃度0.1%のSDS、130mMグリシン、25mMトリスを含む水溶液を用いた。各サンプルは終濃度0.1%のSDSを含む100mMトリス緩衝液pH6.5で調整し、5分間の煮沸処理を行った。煮沸終了後、平板ゲルにサンプルを投与し、30mAの定電流で電気泳動を展開させた。展開後、0.05%のクマシーブリリアントブルーR溶液(ナカライテスク)でリコンビナントタイプイムノトキシンの染色を行った。
本明細書で使用する「葉酸受容体β」又は「FRβ」は、強皮症の病変部(すなわち、線維化細胞)に局在するマクロファージ(以下、強皮症関連マクロファージとも称する)の細胞表面に発現される受容体タンパク質である。FRβは正常組織や末梢血中のマクロファージでは発現されないか又は非常に低レベルで発現される。
哺乳動物には、ヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等の家畜動物、イヌ、ネコ等のペット動物等が含まれる。好ましい哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用される「葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体」は、FRβタンパク質を認識して該タンパク質に結合することができる抗体であり、以下に述べるように、該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、或いは、強皮症関連マクロファージとの結合親和性を有する限り、抗体フラグメントや合成抗体(例えば組換え抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等)であってもよい。これらの抗体はまた、強皮症により線維化した細胞がその表面にFRβを発現するような場合には、強皮症関連マクロファージ及び該線維化細胞の両方に結合することを可能にする。抗体をヒトに対して使用する場合、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
本明細書で使用する「細胞毒素」又は「細胞毒性剤」は、強皮症関連マクロファージ及び、場合により、線維化細胞を死滅させる又は障害する能力を持つ任意の物質を指す。
1.複合体
本発明に係る強皮症治療剤の有効成分としての複合体は、上記の通り、強皮症関連マクロファージの表面に発現する分子標的としてのFRβと結合する抗体と、該マクロファージ(及び場合により、線維化細胞)の細胞死を引き起こす細胞毒素又は細胞毒性剤とから基本的に構成される。
ここで、細胞死は、細胞の死滅、殺傷又は障害を意味し、細胞毒素又は細胞毒性剤によって引き起こされる。細胞毒素は、いわゆるトキシンとも呼ばれるタンパク質であるのに対して、細胞毒性剤は、低分子量の化学療法剤であり、前者には、微生物、特に細菌由来のトキシンが含まれ、一方、後者には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤等が含まれる。
本発明における複合体が上記抗体と細胞毒素から成るとき、これらの成分は融合タンパク質の形態をとることができる。この場合、細胞毒素は、好ましくは抗体タンパク質のC末端に、必要に応じてリンカー(例えばペプチド)を介して、結合することができる。一方、本発明における複合体が上記抗体と細胞毒性剤から成るとき、これらの成分は、結合のための官能基を介して共有結合又は非共有結合によって結合することができる。
1.1 抗体
本発明において、上記抗体は、強皮症関連マクロファージのFRβに特異的に結合するものである。ここで、「特異的」とは、上記抗体が上記マクロファージのFRβと免疫学的反応により結合するが、FRβ又はそれと80%以上の配列同一性を持つタンパク質以外のタンパク質とは実質的に結合しないことを意味する。この点で、上記抗体は、FRのアイソフォームの1つであるFRα(例えばヒトFRαはヒトFRβとの間に約70%のアミノ酸配列同一性がある(特表2008−500025号公報))と結合しないことが望ましい。
本発明で使用可能な抗体は、抗原であるFRβタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメントである。部分ペプチドは、5以上、好ましくは7以上、より好ましくは8以上の連続アミノ酸を有する。一般に、抗原性エピトープ又は抗原決定基は、約5〜約10アミノ酸から成り、且つ連続的アミノ酸配列又は不連続的アミノ酸配列を有する。
本発明における抗体は、FRβと結合する、好ましくは特異的に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、それらの抗体フラグメントのいずれであってもよい。
本発明における抗体はまた、いずれの免疫グロブリン(Ig)クラス(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM等)及びサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)のものであってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ又はλのいずれであってもよい。
本発明における抗体フラグメントは、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、重鎖モノマー又はダイマー、軽鎖モノマー又はダイマー、1つの重鎖と1つの軽鎖から成るダイマー等を含む。このようなフラグメントの作製方法は当該技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、或いは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
本発明における抗体はまた、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体等であってもよい。組換え抗体には、例えば一本鎖抗体(scFv)、二重特異性抗体等が含まれる。二重特異性抗体は、2つの異なる結合特異性を有する抗体を指し、例えばdiabody、ScDb(single chain diabody)、dsFv−dsFv等が含まれる(浅野竜太郎,生化学77(12)1497−1500,2005参照)。
以下、国際公開第2010/098503号の記載に準じて、本発明において使用するための抗体の作製方法について詳述する。
本発明において使用可能な抗体を作製するにあたり、最初に免疫原(抗原)として使用するタンパク質、すなわちFRβタンパク質又はその部分ペプチドを調製する。ここで部分ペプチドは、5以上、好ましくは7以上の連続アミノ酸からなる配列を有するものである。免疫原として使用することができるFRβタンパク質の由来は、標的とするFRβと特異的に結合することができる抗体を誘起できるものであるものであれば特に限定されず、例えばヒト、マウス等の哺乳動物に由来するFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として使用する。本発明では、免疫原として、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチド、あるいは配列番号2に示すアミノ酸配列から成るマウスFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することができる。免疫原として、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することが特に好ましい。
FRβタンパク質又はその部分ペプチドは、FRβのアミノ酸配列情報(例えば配列番号1等)に基づき、当該技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法等により調製することができる。ヒトを含む他の哺乳動物由来のFRβの配列情報は、例えばGenBank(NCBI、米国)、EMBL(EBI、欧州)等から入手可能である。
あるいは、遺伝子組換え手法を利用して、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することも可能である。簡単に説明すると、FRβタンパク質をコードするDNAの配列を適当なタンパク質産生用ベクターに連結し、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドが発現し得るように宿主中に導入し、該宿主中でFRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することができる。この手法は当業者に周知であり、この場合に採用するベクター、宿主細胞、形質転換方法、培養方法、標的タンパク質の精製方法は、当業者が適宜選択することができる。遺伝子組換え手法については、例えば、Sambrookら,Molecular Cloning A Laboratory Manual,2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1998)等を参照することができる。
上記のようにして調製したFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として、本発明で使用する抗体を製造することができる。あるいは、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドをコードするDNAを組み込んだ発現ベクター、或いは該タンパク質又はその部分ペプチドを発現する哺乳動物細胞を免疫原として使用して、本発明で使用する抗体を製造してもよい。
ポリクローナル抗体は、上記のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウス等に免疫して、抗血清を得ることによって製造することができる。具体的には、上記免疫原を、必要に応じて免疫原性を高めるためのアジュバントと共に、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内投与する。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、ミョウバン(Alum)、ムラミルペプチド(細菌細胞壁関連ペプチドの一種)等を使用することができる。その後、数日から数週間の間隔で、1〜7回の免疫を行い、最後の免疫日から1〜7日後に、ELISA等の酵素免疫測定法等によって抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血して抗血清を得る。このようにして取得した抗血清は、そのまま使用してもよいし、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを固定化したカラムで1回又は数回精製処理を行った後に使用してもよい。
本発明で使用可能なモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。すなわち、上記のようにして免疫感作した哺乳動物から得た抗体産生細胞(例えば、脾臓由来リンパ球細胞、リンパ系細胞等)と自己抗体産生能のないミエローマ細胞からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造することができる。ハイブリドーマの製造方法は当該技術分野で周知であり、例えばKohler及びMilsteinら(Nature(1975)256:495−96)の方法に準じて行うことができる。
本発明におけるモノクローナル抗体の例として、ヒトFRβ発現細胞により免疫されたマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合させることにより得られた、下記の参考例1に示すマウス−マウスハイブリドーマクローン36b又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
また本発明におけるモノクローナル抗体の他の例として、マウスFRβ発現細胞により免疫されたラットの脾細胞と、ラットミエローマ細胞とを融合させることにより得られた、下記の参考例1に示すラット−ラットハイブリドーマクローンCL5又はクローンCL10が産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが有する核酸であって、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖又はL鎖を含む抗体をコードする遺伝子を包含する。これらの核酸はハイブリドーマから通常の遺伝子工学的手法により得ることができ、またその塩基配列も公知の塩基配列決定法により決定することができる。例として、マウス−マウスハイブリドーマクローン36b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号3及び4に、マウス−マウスハイブリドーマクローン94b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号5及び6に示す。また他の例として、ラット−ラットハイブリドーマクローンCL5が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号7及び8に、ラット−ラットハイブリドーマクローンCL10が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号9及び10に示す。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号3、5、7、9)、L鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)に制限されず、これらの遺伝子の変異体を包含する。
かかる変異体としては例えば以下のものを挙げることができる。
(i)上記H鎖又はL鎖可変領域遺伝子において、1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体;(ii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸と実質的に同一の塩基配列を有し、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体;及び(iii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸に相補的な核酸(塩基配列)とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、且つFRβに結合する同等若しくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体。
本発明において、H鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「数個」という用語は、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個を指す。
本発明において、H鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「実質的に同一」とは、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号3、5、7、9)、L鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有することを意味する。なお、2つの配列間の同一性%は、配列が共有する同一な位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一な位置の数/位置(例えば、一部重複する位置)の総数x100)。
2つの配列間の同一性%の決定は、例えばカーリン(Karlin)及びアルトシュール(Altschul)(1993)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877)において改変されたカーリン及びアルトシュール(1990)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264)のアルゴリズムを用いて行うことができる。この種のアルゴリズムは、アルトシュールら(1990)J.Mol.Biol.215:403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。また、比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、アルトシュールら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389に記載されたGapped BLASTを用いるとよい。または、分子間の遠隔的な関連を検出する反復検索を行うためにPSI−BLASTを用いることもできる。BLAST、Gapped BLAST及びPSI−BLASTプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照)。配列比較のために使用できるアルゴリズムのその他の好ましい例として、例えばマイヤーズ(Myers)及びミラー(Miller)(1988)、CABIOS 4:11−17のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、GCC配列整列化ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version 2.0)に組み込まれている。
本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば30℃〜50℃で、3〜4×SSC(150mM 塩化ナトリウム、15mM クエン酸ナトリウム、pH7.2)、0.1〜0.5% SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは40℃〜45℃で、3.4×SSC、0.3%SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、2×SSCと0.1%SDSを含む溶液、及び1×SSC溶液、0.2×SSC溶液による室温での連続した洗浄等の条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素(例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びGC含量、ハイブリダイゼーションの反応時間等)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本明細書において「同等」とは、例えばFRβ抗原に対する結合特異性、結合親和性といった生物学的な活性が実質的に同一であることを指す。またこの用語は、実質的に同質の活性を有する場合を含んでもよく、ここでいう「同質」の活性とは、FRβ抗原に対する特異的結合性といった活性の性質が同一であること、或いは生理的性質、薬理的性質、又は生物学的性質が同一であることをいう。
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばSambrookら(上記)、Ausubelら(上記)等に記載されており、これらの条件を本発明に使用してもよい。
上記変異体は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法(Site specific mutagenesis)を用いて常法により導入することができる(Proc Natl Acad Sci USA.,1984 81:5662;Sambrookら(上記))。
本発明では、上記のように作製したハイブリドーマに基づき、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体を作製することもできる。
具体的には、作製したハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞といった宿主に導入して、宿主において組換え抗体を生産させることができる(P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean.,Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS,J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies:principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS)。
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫した後、そのトランスジェニック動物の血液、ミルク中等からその抗体遺伝子に由来する抗体を大量に取得することも可能である。また、上記トランスジェニック動物の中には、内因性抗体遺伝子を欠失した且つヒト抗体遺伝子を保有するマウスやウシ等のヒト抗体産生動物も知られているので、このような動物を利用する場合には、ヒトFRβに結合する完全ヒト抗体を得ることができる(例えば国際公開WO96/9634096、WO96/33735、WO98/24893等)。さらにまた、当該動物の抗体産生細胞(例えばB細胞)とミエローマ細胞から作製したハイブリドーマをin vitroで培養する場合には、上記のような手法で、モノクローナル抗体を産生することもできる。このとき、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々の条件に応じて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知の栄養培地又は基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
産生されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法、例えばプロテインAあるいはプロテインGカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
本発明で使用可能な抗体はまた、キメラ抗体であることができる。キメラ抗体は、例えばMorrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851−6855;Neuberger et al.,1984,Nature,312:604−608;Takeda et al.,1985,Nature,314:452−454に記載される技術を用いて製造することができる。これらの技術では、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングする。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する異なる部分が存在する分子である。キメラ抗体として、例えば、抗FRβマウス又はラットモノクローナル抗体のH鎖及び/又はL鎖可変領域と他の哺乳動物由来の免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を挙げることができる。
本発明においてはまた、例えばマウス又はラットモノクローナル抗体由来の可変領域又は超可変領域を含む可変領域の一部と、ヒト免疫グロブリンの定常領域、又はヒト免疫グロブリンの可変領域の一部及び定常領域、とを有する抗体、例えば「ヒト化抗体」を挙げることができる。ヒト化抗体の場合、マウス由来の抗体領域部分は約10%未満が望ましい。
上記ヒト化抗体は、例えば抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体(又は抗マウスFRβラットモノクローナル抗体)のH鎖可変領域及び/又はL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR1、2及び3)を含むアミノ酸配列を含むことができる。さらに具体的には、以下の抗体を例示することができる。
(1)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(2)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(4)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(5)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(6)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(7)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(8)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
なお、配列番号3〜10のCDR1〜3のヌクレオチド位置を下記表1に示す。
このようにして同定されたヒトアクセプター抗体H鎖及びL鎖配列をコードする塩基配列をベースにして、その可変領域の一部をマウス抗体のものと置換するように組換えを行う。得られたヒト/マウスキメラH鎖及びL鎖をコードするDNAを発現ベクターに組込み、適当な宿主細胞に形質転換することによって、ヒト化抗体をクローン化、産生することができる。
上記のようなキメラ抗体、ヒト化抗体は、ヒトへの適用に際し、抗原性を低減できるという利点を有する。
本発明において使用する抗体はまた、例えば米国特許第4,946,778号;Bird,1988,Science 242:423−426;Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883;Ward et al.,1989,Nature 334:544−546に記載される技術を用いて作製した、FRβタンパク質又はその部分ペプチドに対する一本鎖抗体(scFv)であってもよい。本発明において使用する一本鎖抗体は、例えば上述のモノクローナル抗体のH鎖可変領域(例えば配列番号3、5、7、9)及びL鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)の配列情報に基づき、常法に従ってそれぞれH鎖フラグメントとL鎖フラグメントを調製し、アミノ酸架橋によってFv領域のH鎖フラグメントとL鎖フラグメントとを連結し、一本鎖のポリペプチドを得ることにより形成することができる。
1.2 細胞毒素又は細胞毒性剤
本発明に使用することができる細胞毒素は、強皮症関連マクロファージの細胞死を誘導する目的で使用することができる任意の細胞毒素であり、例えば緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)等を挙げることができる。本発明においては、特に、PE38等の緑膿菌外毒素を使用することが好ましい。
あるいは、本発明に使用することができる細胞毒性剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤等から適宜選択可能である。このような細胞毒性剤としては、強皮症関連マクロファージを死滅させることができるものが好ましい。また、FRβを細胞表面に発現する線維化細胞の場合には、線維化細胞の死滅も誘導可能な細胞毒性剤を利用することができる。
1.3 リコンビナントイムノトキシン等の複合体
本発明における複合体の1つであるリコンビナントイムノトキシンを作製するために、上記のようにして作製された抗体又はその部分ペプチドは細胞毒素とコンジュゲートされる。すなわち、本発明におけるリコンビナントイムノトキシンとは、標的(すなわちFRβタンパク質)に結合する上記抗体が、細胞毒素又はそのサブユニットにコンジュゲートされたキメラ分子である。本発明においては、植物や細菌等に由来する細胞毒素、ヒト起源の細胞毒素、合成の細胞毒素を使用することができる。
抗体と細胞毒素とのコンジュゲートは、以下のようにして行うことができる。すなわち、抗体分子中の反応性基(例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等)を利用し、該反応性基と反応しうる官能基を持つ細胞毒素と該抗体とを接触させることによって、リコンビナントイムノトキシンを得ることができる。あるいは、上記抗体のH鎖可変領域遺伝子(配列番号3、5、7、9)及びL鎖可変領域遺伝子(配列番号4、6、8、10)の配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により、H鎖フラグメント又はL鎖フラグメントのいずれかを細胞毒素との融合タンパク質として作製し、細胞毒素と融合していない他方のフラグメントと一緒に、SH結合を介して一本鎖抗体又は二本鎖抗体を形成させることによって、リコンビナントタンパク質を作製してもよい。SH結合を介したH鎖フラグメントとL鎖フラグメントの結合は、βメルカプトエタノールやジチオスレイトール等の還元剤によってメルカプト基(−SH基)を露出後、両者を混和することによって達成することができる。
本発明において使用するリコンビナントイムノトキシンの一例として、それぞれ上記マウス−マウスハイブリドーマクローン36b細胞又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンであるリコンビナントイムノトキシンが挙げられる。マウス−マウスハイブリドーマクローン36bと緑膿菌外毒素のリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。またマウス−マウスハイブリドーマクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。
本発明において使用する複合体のもう1つの例は、上記のFRβに結合する抗体と細胞毒性剤との結合体である。一般に、抗体の定常領域、好ましくはC末端側に細胞毒性剤を結合することができる。結合は、抗体タンパク質のNH2基、SH基、OH基、COOH基等を利用し、これと反応性の官能基を持つ細胞毒性剤とを、場合により例えば炭化水素リンカーを介して、化学的に結合することによって実施できる。
2.治療剤
こうして作製された複合体は、強皮症関連マクロファージに特異的に高発現しているFRβを標的とし、強皮症関連マクロファージの細胞死を誘導して皮膚の線維化を抑制することができる。
このように、本発明におけるリコンビナントイムノトキシン等の複合体は、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体であり、強皮症に対する治療効果を有するものである。また、当該複合体は、強皮症において特異的に高発現しているFRβを標的とするため、正常細胞への影響が少なく、副作用のリスクが低いという利点を有する。
本発明における複合体は、これを有効成分として含有する強皮症治療剤として製剤化される。すなわち、本発明に係る強皮症治療剤は、治療上有効量の複合体を含むものである。ここで、「治療上有効量」とは、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量を指し、強皮症治療剤を適用する対象の性別、年齢、体重、疾患の重篤度、投与経路等様々な要因に応じて変化する。例えば、所与の用法に従って、60kgの成人に、本発明における複合体が1日当たり200μg以上、好ましくは500μg以上の量で投与される量を治療上有効量として含むことができる。
本発明に係る強皮症治療剤は、複合体に加えて、生理学的に許容し得る製薬上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、賦形剤及び担体等の1種以上を含むことができる。また強皮症の治療に効果的な他の薬剤との混合物としてよい。このような薬剤として、抗TGF−β抗体、immunoglobulin、プロスタグランジンE1等を挙げることができる。
本発明に係る強皮症治療剤は、経口投与、或いは注射、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与(すなわち静脈内又は筋肉内投与)用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。あるいは、本発明に係る強皮症治療剤は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水等で使用前に再構成するための凍結乾燥粉剤としてもよい。
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射等が考えられる。あるいは、患者の患部に直接本発明に係る強皮症治療剤を接触させてもよい。
本発明に係る強皮症治療剤を適用する対象は特に限定されず、強皮症に罹患している患者(特に、早期の強皮症罹患患者)、強皮症を治療している患者等のいずれであってもよい。またその対象はヒトに限らず、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物として、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコ等を例として挙げることができる。
また、本発明は、上述の複合体又は強皮症治療剤の治療上有効量を強皮症患者に投与することを含む、強皮症の治療方法に関する。
3.強皮症の診断
上記第1節で説明した抗体又は複合体は、強皮症の診断、例えば、強皮症の存在又は不在、及び該疾患を有するリスクを判定するために使用することができる。
具体的には、本発明は、被験者由来の皮膚組織サンプルを、上記第1節で説明した抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させ、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は当該マクロファージの皮膚への浸潤を指標として、強皮症の存在又は不在、及び該疾患を有するリスクを測定(検査)する方法を提供する。
例えば、被験者由来の皮膚組織サンプルを、上述の抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させて、FRβ発現マクロファージが該皮膚組織中に存在するか否かあるいはFRβ発現マクロファージが皮膚組織へ浸潤しているか否かを調べ、陰性対照(例えば健常者の皮膚組織サンプル)と比較して、FRβ発現マクロファージが有意に存在するか又は皮膚組織へ浸潤している場合に、強皮症の存在を検査することができる。
あるいは、本発明は、強皮症治療を受けているか又は受けた被験者由来の皮膚組織サンプルを、上述の抗体又は複合体(発蛍光団、色素、放射性同位元素等のラベルで標識された抗体又は複合体(強皮症診断剤)、或いは、非標識抗体又は複合体)と接触させて、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は不在あるいは皮膚組織への浸潤の存在又は不在を指標として強皮症治療の治療効果を判定する方法を提供する。
本明細書で使用する「判定する」という用語は、医師の判断、すなわち医療行為を意図したものではなく、医師に検査結果の情報又はデータを提示し、医師の判断を助けるための手段を意味する。従って、「判定する」という用語は、「測定する」、「検査する」、「決定する」又は「評価する」等の用語で置き換えることができる。
本発明はさらに、上記測定又は判定方法等において使用するための強皮症診断剤又は強皮症診断キットも提供する。
強皮症診断剤又は強皮症診断キットには、上記抗体又は複合体、あるいは上記抗体又は複合体に更に標識を結合した複合体を含めることができる。標識には、例えば発蛍光団(例えばGFP等)、色素、放射性同位元素(例えば、18F−FDG)等が含まれる。
上記抗体又は複合体によるFRβ発現マクロファージの検出は、ELISA、蛍光抗体法、放射免疫法、サンドイッチ法、組織染色法等によって行うことができる。二次抗体に、例えば酵素(例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等)、発蛍光団(例えばFITC、テトラメチルローダミン、テキサスレッド等)、色素、放射性同位元素等のラベル(標識)を結合したものを使用して、マクロファージに結合した抗体又は複合体を検出する。ラベルの結合には、化学的結合法、ビオチン−(ストレプト)アビジン系を利用する結合法等が含まれる。
画像診断の場合には、薬学的に許容可能な放射性核種や発光体を上述の抗体又は複合体にラベルし、被験者に該抗体又は複合体を投与し、PET/CT等の画像診断技術を使用して画像をとり、FRβ発現強皮症関連マクロファージの存在又は皮膚への浸潤を判定又は検査することができる。
本発明に係る強皮症診断キットには、上記(標識された、又は標識されない)抗体又は複合体或いはそれらを含む造影剤の他に、測定に使用するためのバッファー、ラベル化二次抗体等の試薬、測定手順を記載した使用説明書等を含めることができる。試薬は、別々の容器に密封される。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔参考例1〕リコンビナント抗FRβイムノトキシンの製造
本参考例では、国際公開WO2010/098503の実施例の記載に準じて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを以下のように作製した。
1−1.抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の製造
[抗原であるFRβ発現細胞の調製]
関節リウマチ滑膜又はBalb/cマウス肝臓からTrizol(GibcoBRL)、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にて添付説明書に従って全RNAを抽出後、SuperScript plasmid System(Invitrogen)にて添付説明書に従ってcDNAを合成した。次に、1μlのリウマチ滑膜、又はBalb/cマウス肝臓cDNAをそれぞれ別個にBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、10ピコモル量に調整したセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:agaaagacatgggtctggaaatggatg(配列番号15);マウス肝臓:tctagaaagacatggcctggaaacag(配列番号16))及びアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:gactgaactcagccaaggagccagagtt(配列番号17);マウス肝臓:cccaacatggatcaggaact(配列番号18))を加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅したFRβ遺伝子のPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションを行った。すなわち、PCR産物2.5μlにNaCl溶液を1μL、滅菌蒸留水1.5μl、ベクタープラスミド(PCR2.1−TOPO)1μLを加えて室温で5分間インキュベートし、その内の2μLを大腸菌(TOP10F’)に加えて氷中で30分反応後、42℃30秒の熱処理し、氷中で2分間静置し、250μLのSOC培地を加えた後、37℃で1時間シェーカー内で培養した。培養終了後、LB培地に捲き、37℃で一晩培養した。
大腸菌培養の為、プレート上より採取した白いコロニーをアンピシリン(50mg/mL)を含むLB液体培地に加えて37℃一晩培養した。プラスミドの精製はQiagenプラスミド精製キット(Qiagen)にて行った。組み込まれたFRβ遺伝子は、制限酵素EcoRIによる処理後、アガロース電気泳動に展開し、約0.8kb(782bp)のFRβ遺伝子産物を確認後、その部位を切り出し、遺伝子産物の抽出をQuiagen PCR purification kit(Quiagen)にて精製した。次に予めEcoRI処理を行った哺乳細胞発現用ベクターpER−BOS(Mizushima et al.pEF−BOS,a powerful mammalian expression vector.Nucleic Acid Res.1990;18(17):5322)と混和し、T4 ligase(Roshe)を用いてライゲーションを行った。ライゲーション産物の大腸菌(TOP10F’)への遺伝子導入並びにFRβ遺伝子の確認は上記と同様の手法で行った。
pEF−BOSに組み込まれたFRβ遺伝子を確認後、ヒトFRβを含むベクターはマウスB300−19細胞に、マウスFRβを含むベクターはラットRBL2H3細胞にそれぞれ遺伝子導入を行った。すなわち、予め1x105個に調整した各細胞に、20μLのリポフェクタミン(GibcoBRL)と混和したFRβベクター1μgを加えて遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたB300−19マウス細胞及びラットRBL2H3細胞は抗生物質G418耐性を獲得するため、1mg/mLの濃度のG418を含む培地にて遺伝子導入された細胞を選択培養した。遺伝子導入された細胞のFRβ遺伝子導入の確認はPCR法にて行った。すなわち、1x107個に調整した各細胞をcDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成し、10ピコモル量に調整したセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:agaaagacatgggtctggaaatggatg(配列番号15);マウス肝臓:tctagaaagacatggcctggaaacag(配列番号16))及びアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:gactgaactcagccaaggagccagagtt(配列番号17);マウス肝臓:cccaacatggatcaggaact(配列番号18))をBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅後アガロース電気泳動を行い、FRβが示すバンド0.8kbを確認した。
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の作製]
FRβ発現マウスB300−19細胞あるいはラットRBL2H3細胞を1x107個に調整し、フロインド完全アジュバンドと混合し、Balb/Cマウス(抗ヒトFRβモノクローナル抗体用)あるいはWhister Kyotoラット(抗マウスFRβモノクローナル抗体用)の尾部に3ヵ所、腹腔内に免疫した。この免疫を2〜4回繰り返した。
モノクローナル抗体の作製はKolerの方法(Kohler & Milstein,Nature(1975)256:495−96)に従って行った。すなわち、脾臓あるいは腸骨リンパ節を取りだし、単一細胞に解離させた。解離した細胞を骨髄腫由来の細胞(NS−1)と細胞融合させてハイブリドーマを作製し、HAT選択培地にて培養し、培養上清中に分泌された抗体を、先のFRβ発現細胞との反応性で選別を行った。
得られたハイブリドーマのクローン化は、96穴プレートの各穴当たり1細胞となるように調整した限界希釈培養にて行った。クローン化細胞の選別は、FRβ発現細胞との反応性で行った。
クローン化したハイブリドーマを1x107個に調整し、ヌードマウス腹腔内に投与して腹水を調整し、Protein Gカラム(GEバイオサイエンス)にてモノクローナル抗体を精製した。精製したマウス及びラットモノクローナル抗体のアイソタイプは、アイソタイピングELISAキット(Pharmingen)を用いて決定した。その結果、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体はIgG2aタイプのクローン36bとIgG1タイプの94bの二つが得られ、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体は、IgG2aタイプのCL5とCL10の二つが得られた。これら各抗体の抗原に対する反応性はフローサイトメトリーにて解析した。
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の重鎖遺伝子可変領域(VH)及び軽鎖遺伝子可変領域(VL)遺伝子の決定]
マウスハイブリドーマクローン36b、94bを1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。36b及び94bはIg−Prime Kitを用いてVH及びVLの遺伝子をPCRにて決定した。PCR条件は添付の説明書に従って行った。すなわち、94℃60秒、50℃60秒、72℃120秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させ、VH及びVLの遺伝子を増幅した。増幅したVH及びVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。遺伝子導入した大腸菌よりプラスミドを精製し、36b、94bのVH及びVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、PCR産物をABI 310 DNA sequencerにて解析した。
ラットハイブリドーマクローンCL5、CL10を1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。次に、Ig−Prime Kit及びラットVH増幅用にデザインしたプライマー(caccatggagttacttttgag(配列番号19))を用い、VH及びVLの遺伝子をPCRで増幅させた。増幅したVH及びVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。次に、大腸菌よりプラスミドを精製し、VH及びVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、ABI 310 DNA sequencerにて解析した。
1−2.リコンビナント抗FRβイムノトキシンの製造
[免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)にシステインの変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)の63番目のアミノ酸グリシン(塩基配列ggc)をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製し(センスプライマー:cagaggcctgaacattgtctggagtggattggaag(配列番号20)、アンチセンスプライマー:cttccaatccactccagacactgttcaggcctctg(配列番号21))、Quick change site−directed mutagenesis kit(Stratagene)を用いて上記第1−1節で得た94bのVHを含むプラスミドpCR2.1−TOPO 94bVHに変異誘発処理を行った。このPCR反応は、反応液を95℃30秒、55℃60秒、68℃4分のサイクルを12回連続して行った。抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)へのシステイン導入も上記と同様の方法にてプライマーをデザインして行った(センスプライマー:gtccgccaggctccaacgaagtgtctggagtgggtcgc(配列番号22)、アンチセンスプライマー:gcgacccactccagacacttcgttggagcctggcggac(配列番号23))。
次に、反応後のDNAを大腸菌XL1−Blueに遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地で選択培養した。選択した形質転換体のプラスミドをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、63番目のグリシンがシステイン(塩基配列tgt)に変異したことを確認した。
[pRK79PE38ベクターに変異を導入したVHを挿入]
次に、PE38遺伝子を含むpRK79ベクターpRK79PE38に、94bVH及びCL10VHの変異を導入したVHの挿入を以下の方法にて行った。
変異を導入した94bの5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてtaagaaggagatatacatatggaggttcagctgcagcagtc(配列番号24)とgccctcgggacctccggaagcttttgaggagactgtgagagtgg(配列番号25)を、CL10の5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてatacatatggaggtgcagctggtggagtctggg(配列番号26)とtccggaagcttttgaggagacagtgactgaagc(配列番号27)をそれぞれデザインした。アニーリングプライマーにはそれぞれ制限酵素であるNdeIがあり、この部位でのクローニングにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。また、もう片方のアニーリングプライマーにはHindIII部位が挿入されており、この部位でのクローニングにより、VHとPE遺伝子が結合した融合タンパク質の発現が可能である。
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使って変異を導入したpCR2.1−TOPO−94bVH及びpCR2.1−TOPO−CL10VHプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とHindIII(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VHと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79−VHPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VHの塩基配列がpRK79ベクターのPE38塩基配列と連結していることを確認した。
[免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(センスプライマー:taagaaggagatatacatatggacattgtgatgtcacaatc(配列番号28)(このプライマーには制限酵素NdeI切断可能な塩基catatgを含むため、この部位でクローニングすることにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である);アンチセンスプライマー:gctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt(配列番号29)(このプライマーは125番目のアミノ酸をシステイン(tgt)に変異させ、終始コドンtagに続いて制限酵素EcoRI切断可能な塩基gaattcが来るようにデザインしてある))。同様に抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(atacatatggacattgtgatgcccaatctccatcc(配列番号30)及びgctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt(配列番号31))。
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使ってpCR2.1−TOPO−94bVLプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とEcoRI(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VLと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79−VLPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VLの125アミノ酸がシステインに変異していることや、終始コドンtagが配置されていることを確認した。
[リコンビナントタンパク質封入体の調製]
上記の変異導入VHを組み込んだプラスミドpRK79−94bVHPE、pRK79−CL10VHPE、変異導入VLを組み込んだプラスミドpRK79−VL94b、pRK79−VLCL10を50ng調整し、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)に遺伝子導入した。遺伝子が導入された大腸菌の選抜は0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて37℃15〜18時間の培養で行った。
選択終了後の大腸菌は1000mLのスーパーブロース培地で37℃の条件で培養し、可視吸光度600nmで1.0−1.5に到達するまで培養した。培養後、IPTG(isopropyl−beta−D−thio−galactopyranoside)を終濃度1mMになるように培地に添加し、さらに90分間37℃で培養した。培養終了後、遠心分離にて大腸菌を回収後、50mMトリス緩衝液(pH7.4、20mM EDTAを含む)を用いて200mLとなるまで懸濁した。懸濁終了後、卵白リゾチームを最終濃度0.2mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させて大腸菌の破壊を行った。破壊後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿物はさらに50mMトリス緩衝液(pH7.4、2.5%のTritonX−100、0.5M NaCl、20mM EDTAを含む)で200mLとなるまで懸濁し、卵白リゾチームを最終濃度0.2mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させた。反応終了後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿はさらに50mMトリス緩衝液(pH7.4、2.5%のTritonX−100、0.5M NaCl、20mM EDTAを含む)で200mLとなるまで懸濁し、十分混和させた後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を5回繰り返した後の沈殿物をリコンビナントイムノトキシン封入体とし、さらに0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、6Mグアニジン塩酸塩、1mM EDTAを含む)で溶解させ、最終濃度10mg/mLとなるように調節した。
[リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンの作製]
上記で調製した94b−VHPEと94b−VL、CL10−VHPEとCL10−VLを混和させ、リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンを作製した。
まず、0.5mLのVHPE、0.25mLのVLを混和し、ジチオトレイトール(DTT)を最終濃度10mg/mLとなるように加え、室温で4時間の還元処理を行った。処理後、75mLの0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、0.5Mアルギニン、0.9mM酸化型グルタチオン、2mM EDTAを含む)に溶解させた。この溶液を10℃で40時間放置することによって、VHとVLを結合させた。結合終了後、分子量10,000カットの遠心濃縮器(Centricon 10、Amicon)で5mLまで濃縮し、さらに50mLのトリス緩衝液(pH7.4、0.1M尿素、1mM EDTAを含む)で希釈した。この希釈液をリコンビナントイムノトキシン精製の出発物質とした。
次に、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で平衡化したイオン交換カラムHi−Trap Q(GE)に、30mL/時間の流速で、上記出発物質を吸着させた後、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で洗浄した。洗浄後、吸着したリコンビナントタイプイムノトキシンの溶出をトリス緩衝液(pH7.4、0.3M NaCl、1mM EDTAを含む)で行った。溶出サンプルはトリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で透析した後、イオン交換カラムPOROS HQ(POROS)でさらに精製した。すなわち、透析した精製物質を10mL/分の流速で吸着させ、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で洗浄後、上記緩衝液に0Mから1.0MのNaCl勾配を設定することにより、リコンビナントタイプイムノトキシンの溶出を行った。精製リコンビナントタイプイムノトキシンの最終調製はTSK300SW(Tosoh)ゲル濾過クロマトグラフィーにて行った。まず、75%の消毒用エタノールで48時間洗浄することによってTSK300SWカラム中のエンドトキシン除去を行った。次に日本薬局方注射用蒸留水で洗浄し、その後日本薬局方生理食塩水でTSK300SWカラムの平衡化を行った。平衡化終了後、リコンビナントタイプイムノトキシンを投与し、流速0.25mL/分でカラムからの溶出液を採取した。採取後、0.22μmの濾過滅菌機で処理し、純度をSDS−PAGEにて確認後、−80℃で保存した。
[SDS−PAGEによる純度検定]
SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動)は0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む12%ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動相には終濃度0.1%のSDS、130mMグリシン、25mMトリスを含む水溶液を用いた。各サンプルは終濃度0.1%のSDSを含む100mMトリス緩衝液pH6.5で調整し、5分間の煮沸処理を行った。煮沸終了後、平板ゲルにサンプルを投与し、30mAの定電流で電気泳動を展開させた。展開後、0.05%のクマシーブリリアントブルーR溶液(ナカライテスク)でリコンビナントタイプイムノトキシンの染色を行った。
強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンによる強皮症治療の評価
1−1.材料及び方法
[強皮症モデルマウスの作製]
8週齢20gぐらいのC3H/HeJ純系マウスの背部両側の皮膚を、直径20mmぐらいに毛を剃ってモデル作製用のマウスを用意した。
一方、抗腫瘍性抗生物質である注射用医薬品ブレオマイシン(日本化薬株式会社製)をリン酸バッファーで0.5mg/mlの濃度に溶解させた。無菌状態の当該ブレオマイシン溶液100μlを上記マウスの右側の皮膚に、またリン酸バッファー100μlを対照群として同一マウスの左側の皮膚に毎日皮下注射した。全ての注射は直径8〜9mm前後の定められた部位に打った。
本実験は2つのセットに分かれて行った。ワンセットはブレオマイシンの注射後3日、1週、2週、4週後にマウスを3匹ずつ屠殺して、ブレオマイシン注射の皮膚と対照皮膚へのマクロファージ浸潤を調べた。
別のワンセットは、ブレオマイシン注射開始次の日から静脈注射による参考例1で作製したリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療を併用で行った。本実施例で使用するリコンビナント抗FRβイムノトキシンは、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10由来の免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と緑膿菌外毒素(PE38)とが連結した融合タンパク質と抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10由来の免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)とから成る二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンである。
先ず、リコンビナント抗FRβイムノトキシンがトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAの発現に影響があるか否かを調べるために、6匹のマウスをランダムに2群に分けて、一組はリコンビナント抗FRβイムノトキシンをリン酸バッファーに溶かして0.25mg/kg/100μl/マウスの量で3日に一回マウス尾静脈にて投与した。コントロール群は100μl/マウスのリン酸バッファーを静脈注射した。計3回の静脈注射とブレオマイシンの7日目の皮下注射後24時間の時、マウスを屠殺して生検用の直径5mmテルマパンチでブレオマイシン注射の中心部位皮膚を取った。
続いて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンの抗線維化効果を観察するために、マウス30匹をランダムに3組に分けて、一組において0.25mg/kg/100μl/マウスの量でリコンビナント抗FRβイムノトキシンを尾静脈注射し、もう一組においてFRβ結合部位が欠けたコントロールVHPE(抗体の結合を欠くVH鎖と緑膿菌毒素)を0.25mg/kg/100μl/マウスの量で尾静脈注射し、更にもう一組においてリン酸バッファー100μlを尾静脈注射した。ブレオマイシン皮下注射開始次の日から三日に一回で2週間、合計5回投与した後、続いてブレオマイシンだけの投与2週間、即ち4週間後にマウスを屠殺して抗線維化効果を検討した。
なお、上述の実験は全て重複実験で行った。
[TGF−βmRNAとCTGFmRNAの相対定量]
治療1週後のマウス皮膚からトータルRNAを抽出した。皮膚サンプルに500μlのSepasol(登録商標)−RNA I Super G(Nacalai Tesque)を加え、ホモジナイズ後、室温で5分間静置した。次いで、200μlのクロロホルムを加え、転倒混和し、室温で5分間静置した。静置後、4℃、12,000xgで15分間遠心し、上層(水相)を別チューブに移した。
さらに、当該上層含有チューブに500μlの2−プロパノールを加え、転倒混和し、室温で10分間静置した。静置後、4℃、12,000xgで10分間遠心し、上清(約1ml)を除いてから、1mlの75%エタノールを加えて撹拌し、ペレットを懸濁させた。懸濁後、4℃、12,000xgで5分間遠心し、上清(約1ml)を除いた。75%エタノール洗浄をもう一回行った後、ペレットを乾かして、20μlのDEPC処理水でRNAを融解し、0.5μlのRNase Inhibitor(TOYOBO)を加えて、RNaseの活性を抑えた。
得られた各トータルRNAサンプルを、トータルRNA総量が800ngで且つ容量7μlになるように調整して、逆転写PCRに使用した。
逆転写PCRでは、最初65℃で5分間インキュベートし、氷上で急冷して、RNAの変性を行った。続き、各サンプルにReverTra Ace(登録商標)qPCR RT Kit(TOYOBO)の5×RT buffer 2μl、RT Enzyme Mix 0.5μl及びPrimer Mix 0.5μlを添加し、37℃で15分間インキュベートして逆転写PCRを行った。逆転写PCR後、サンプルを98℃で5分間インキュベートし、酵素失活反応を行った後、サンプルをReal time PCR反応に使用した。
上述の実験で得たcDNAの10倍希釈液2μl、Taqman(登録商標)Gene expression master mix 10μl、20×Taqman Gene Expression Assay Mix 1μl及びDEPC処理水7μl(合計20μl反応液/well)で、Roche社のlightcycler 2.0機におけるReal time PCR分析を行った。温度設定は以下の通りである:開始95℃、10分後にサイクルに入る;変性95℃:15秒、アニール60℃:1分の45サイクルの反応をさせ、蛍光を測定した。
用いたプローブは以下の3種類である:
CTGFプローブsequence−GCCCTGCCCTAGCTGCCTACCGACT(配列番号32);
Glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase(GAPDH)プローブsequence−GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG(配列番号33);
TGF−β1プローブsequence−CTATTGCTTCAGCTCCACAGAGAAG(配列番号34)。
コントロール群の対照皮膚の一つのサンプルをリファレンス遺伝子として、1、1/2、1/4、1/8の比率で希釈し、反応させ、標準曲線を作成した。全ての測定は重複ウェルを設置し、平均値を取った。測定結果は、GAPDH遺伝子を内因性コントロールとして、同一サンプルのターケット遺伝子との割合にて補正を行い、リファレンスターゲット遺伝子との比率で表した相対定量である。
[免疫染色を用いたマクロファージ皮膚浸潤検討]
直径5mmテルマパンチで取った皮膚サンプルをOCTで包埋して−80℃にて凍らせた。次いで、クリオスタットで厚さ5μmの皮膚横断面切片を作製し、−20℃のアセトンの中で一夜放置し、固定した。固定後、切片をアセトンの中から取り出し、十分乾燥させた後、0.3% H2O溶液で10分反応させ、内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次いで、切片をリン酸バッファーで洗浄し、ノン血清プロテインブロック試薬(Dako製)と室温で1時間インキュベートし、非特異性反応を抑えた。一次抗体としてラット抗マウスCD68(マクロファージマーカー)又はラット抗マウスFRβを5μg/mlの濃度で、切片と室温で1時間反応させた。リン酸バッファーによる洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ラット2次抗体(ニチレイ製)を、切片と室温で1時間インキュベートさせた。2次抗体を洗浄した後、Nova Red発色試薬で免疫反応を可視化した。
結果の検定として顕微鏡下で褐色に染まったCD68又はFRβ陽性細胞を数えた。顕微鏡下で、皮膚の真皮から皮下脂肪組織までの構造が40倍の視野に満たされるように動かして、一匹のマウスでランダムに5ヶ所視野の陽性細胞数を数え、その平均値を皮膚に浸潤したマクロファージ陽性細胞数の統計に用いた。
[ハイドロキシプロリンアッセイ]
参考例1で作製したリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療を併用して4週後のマウス皮膚を液体窒素で潰し、75%エタノール500μlで収集して、110℃で30分間乾燥させた。乾燥後、サンプルに6Nの塩酸を500μl添加し、110℃で一夜放置した。次いで、0.5Mの500μlナトリウムバッファーに2−propanolを添加して10%に調整した溶液250μlをサンプルと混濁し、中和した後、12,000xgで10分間遠心し、上清を取った。
0.5M酢酸ナトリウムの2−propanol溶液で1.4%のクロラミンTを調整し、1.4%のクロラミンT溶液500μlを、得られた上清サンプルに添加した。室温で10分インキュベートし、クロラミンTによって酸化されたハイドロキシプロリンに0.1%P−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液500μlを添加した。P−ジメチルアミノベンズアルデヒドは70%のMethylcellosolveに30%の過酸化酸(60%の溶液)の比率で融解させたものである。サンプルを60℃で20分反応させた後、マイクロプレートリーダーで550nMの吸光度を測定した。ターゲットサンプルと同時にL−4−ハイドロキシプロリン12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlのスタンダードの吸光度も測定した。L−4−ハイドロキシプロリンの吸光度で標準曲線を作成してターゲットサンプルのハイドロキシプロリン量を求めた。
[皮膚の厚さの検定]
上述のクリオスタットで作製した厚さ5μmの皮膚横断面切片をヘマトキシリンとイオジンでHE染色を行った。ヘマトキシリンを30秒反応させ、核を染めた後、イオジンで細胞質を染色し、100%エタノールで脱水し、キシリンで透明、永久性封入剤で封入した。10倍の顕微鏡下で、多層鱗状上皮の下から脂肪組織までの距離、即ち、真皮の厚さを測定した。一つのサンプルでランダムに5ヶ所の距離を測り、平均値を取って統計を行った。
[統計]
全ての有意差を求める統計は、One−way analysis of variance(ANOVA)で有意差を確認した後、post hoc analysisのBonferroni/Dunn testで有意差を検定した。
1−2.結果及び考察
[BLM(ブレオマイシン)で誘発した強皮症モデルマウスでのFRβ+マクロファージ]
マウス皮膚にBLMを毎日皮下注射し、3日、1週、2週後のマクロファージの動態的変化を観察した。
結果を図1及び2に示す。BLMの代わりにリン酸バッファーを皮下注射した皮膚を陰性コントロール(N.C)とした。陰性コントロールに比べてBLM注射後、CD68(マクロファージマーカーとして使われている膜タンパク質)陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤は徐々に増加して2週の時にピークに達した。
[強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療]
BLM注射開始の次の日からリン酸バッファー(Vehicle)、抗体の結合を欠くVH鎖と緑膿菌毒素(VHPE)又はリコンビナント抗FRβイムノトキシンを3日に一回2週間、合計5回で静脈注射(IV)した。治療1週後にトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAを測定し、4週後にhydroxyproline分析を通じて皮膚のコラーゲン量、又HE染色をしたマウスの皮膚の厚さを顕微鏡下で測定した。更に、4週後の皮膚のマクロファージ浸潤を調べた。
(1)TGF−β1 mRNA及びCTGF mRNAの変化
結果を図3に示す。BLM注射開始1週間後、皮膚のTGF−β1 mRNAとCTGF mRNAはそれぞれ2.4倍、1.4倍上昇したが、リコンビナント抗FRβイムノトキシン治療によってこれらのサイトカインmRNA量は低下した。このように、リコンビナント抗FRβイムノトキシン治療によって強皮症の発病早期のTGF−β mRNA発現量を抑制した。
図4は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1の発現を示す免疫組織学的染色像である。また、図5は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1陽性細胞数(%)を示すグラフである。図4及び5に示すように、FRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1発現の割合は、CD68陽性マクロファージにおけるTGF−β1発現の割合より有意に高かった。
(2)治療後の皮膚マクロファージの変化
結果を図6及び7に示す。4週後の皮膚サンプルで、リコンビナント抗FRβイムノトキシンで治療したグループのCD68陽性マクロファージ数とFRβ陽性マクロファージ数は有意に減少した。
(3)抗線維化効果
結果を図8〜10に示す。リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したグループ(FR−β−rIT)のコラーゲンの主成分であるハイドロキシプロリン量は、溶媒だけ注射したグループ(Vehicle)と毒素だけ注射したグループ(VHPE)に比べて有意に低下した。皮膚の厚さも、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したグループ(FR−β−rIT)は、当該2つのコントロール群に比べて有意に薄くなった。
[まとめ]
リコンビナント抗FRβイムノトキシンは、従来の強皮症の治療に関する報告における抗TGF−β抗体と同じ治療効果を示した。リコンビナント抗FRβイムノトキシンは、抗TGF−β抗体と比べて以下の利点がある。すなわち、抗TGF−β抗体を用いた強皮症の治療に関する報告(J Immunol.1999 Nov 15;163(10):5693−9.)では4週続いて治療をしたが、本実施例ではリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた2週間の治療で有意な治療効果が証明された。短時間の治療は抗体の免疫拒絶反応を避けられる。
また、これまでに、本発明者等は、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが肺線維症に効果があることを報告した(Clinical and Experimental immunology(2010)Vol.161,pp.348−356)。しかしながら、動物モデル肺疾患に効果的な投与経路である鼻腔経路では効果があったものの、ヒト疾患に一般的な静脈経路においては効果が得られなかった。鼻腔内投与経路は、毒素に対する抗体産生が少ないことや直接肺に到達する等の利点があるものの、本実施例において、皮膚線維化抑制が静脈経路において効果が得られたことは、当該イムノトキシンの新たな投与経路を示す。
臓器の線維化のメカニズムには臓器固有に存在する細胞が関与することから、種々の臓器において線維化のメカニズムは異なっており、例えば肺線維症に効果のある薬剤が皮膚の線維化を抑制するとは限らない。従って、本実施例において、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが皮膚の線維化抑制に有効であったことは、新たな皮膚線維化抑制薬を提供することを示す。
1−1.材料及び方法
[強皮症モデルマウスの作製]
8週齢20gぐらいのC3H/HeJ純系マウスの背部両側の皮膚を、直径20mmぐらいに毛を剃ってモデル作製用のマウスを用意した。
一方、抗腫瘍性抗生物質である注射用医薬品ブレオマイシン(日本化薬株式会社製)をリン酸バッファーで0.5mg/mlの濃度に溶解させた。無菌状態の当該ブレオマイシン溶液100μlを上記マウスの右側の皮膚に、またリン酸バッファー100μlを対照群として同一マウスの左側の皮膚に毎日皮下注射した。全ての注射は直径8〜9mm前後の定められた部位に打った。
本実験は2つのセットに分かれて行った。ワンセットはブレオマイシンの注射後3日、1週、2週、4週後にマウスを3匹ずつ屠殺して、ブレオマイシン注射の皮膚と対照皮膚へのマクロファージ浸潤を調べた。
別のワンセットは、ブレオマイシン注射開始次の日から静脈注射による参考例1で作製したリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療を併用で行った。本実施例で使用するリコンビナント抗FRβイムノトキシンは、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10由来の免疫グロブリン重鎖可変領域(VH)と緑膿菌外毒素(PE38)とが連結した融合タンパク質と抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10由来の免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)とから成る二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンである。
先ず、リコンビナント抗FRβイムノトキシンがトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAの発現に影響があるか否かを調べるために、6匹のマウスをランダムに2群に分けて、一組はリコンビナント抗FRβイムノトキシンをリン酸バッファーに溶かして0.25mg/kg/100μl/マウスの量で3日に一回マウス尾静脈にて投与した。コントロール群は100μl/マウスのリン酸バッファーを静脈注射した。計3回の静脈注射とブレオマイシンの7日目の皮下注射後24時間の時、マウスを屠殺して生検用の直径5mmテルマパンチでブレオマイシン注射の中心部位皮膚を取った。
続いて、リコンビナント抗FRβイムノトキシンの抗線維化効果を観察するために、マウス30匹をランダムに3組に分けて、一組において0.25mg/kg/100μl/マウスの量でリコンビナント抗FRβイムノトキシンを尾静脈注射し、もう一組においてFRβ結合部位が欠けたコントロールVHPE(抗体の結合を欠くVH鎖と緑膿菌毒素)を0.25mg/kg/100μl/マウスの量で尾静脈注射し、更にもう一組においてリン酸バッファー100μlを尾静脈注射した。ブレオマイシン皮下注射開始次の日から三日に一回で2週間、合計5回投与した後、続いてブレオマイシンだけの投与2週間、即ち4週間後にマウスを屠殺して抗線維化効果を検討した。
なお、上述の実験は全て重複実験で行った。
[TGF−βmRNAとCTGFmRNAの相対定量]
治療1週後のマウス皮膚からトータルRNAを抽出した。皮膚サンプルに500μlのSepasol(登録商標)−RNA I Super G(Nacalai Tesque)を加え、ホモジナイズ後、室温で5分間静置した。次いで、200μlのクロロホルムを加え、転倒混和し、室温で5分間静置した。静置後、4℃、12,000xgで15分間遠心し、上層(水相)を別チューブに移した。
さらに、当該上層含有チューブに500μlの2−プロパノールを加え、転倒混和し、室温で10分間静置した。静置後、4℃、12,000xgで10分間遠心し、上清(約1ml)を除いてから、1mlの75%エタノールを加えて撹拌し、ペレットを懸濁させた。懸濁後、4℃、12,000xgで5分間遠心し、上清(約1ml)を除いた。75%エタノール洗浄をもう一回行った後、ペレットを乾かして、20μlのDEPC処理水でRNAを融解し、0.5μlのRNase Inhibitor(TOYOBO)を加えて、RNaseの活性を抑えた。
得られた各トータルRNAサンプルを、トータルRNA総量が800ngで且つ容量7μlになるように調整して、逆転写PCRに使用した。
逆転写PCRでは、最初65℃で5分間インキュベートし、氷上で急冷して、RNAの変性を行った。続き、各サンプルにReverTra Ace(登録商標)qPCR RT Kit(TOYOBO)の5×RT buffer 2μl、RT Enzyme Mix 0.5μl及びPrimer Mix 0.5μlを添加し、37℃で15分間インキュベートして逆転写PCRを行った。逆転写PCR後、サンプルを98℃で5分間インキュベートし、酵素失活反応を行った後、サンプルをReal time PCR反応に使用した。
上述の実験で得たcDNAの10倍希釈液2μl、Taqman(登録商標)Gene expression master mix 10μl、20×Taqman Gene Expression Assay Mix 1μl及びDEPC処理水7μl(合計20μl反応液/well)で、Roche社のlightcycler 2.0機におけるReal time PCR分析を行った。温度設定は以下の通りである:開始95℃、10分後にサイクルに入る;変性95℃:15秒、アニール60℃:1分の45サイクルの反応をさせ、蛍光を測定した。
用いたプローブは以下の3種類である:
CTGFプローブsequence−GCCCTGCCCTAGCTGCCTACCGACT(配列番号32);
Glyceraldehyde−3−phosphate dehydrogenase(GAPDH)プローブsequence−GGTGTGAACGGATTTGGCCGTATTG(配列番号33);
TGF−β1プローブsequence−CTATTGCTTCAGCTCCACAGAGAAG(配列番号34)。
コントロール群の対照皮膚の一つのサンプルをリファレンス遺伝子として、1、1/2、1/4、1/8の比率で希釈し、反応させ、標準曲線を作成した。全ての測定は重複ウェルを設置し、平均値を取った。測定結果は、GAPDH遺伝子を内因性コントロールとして、同一サンプルのターケット遺伝子との割合にて補正を行い、リファレンスターゲット遺伝子との比率で表した相対定量である。
[免疫染色を用いたマクロファージ皮膚浸潤検討]
直径5mmテルマパンチで取った皮膚サンプルをOCTで包埋して−80℃にて凍らせた。次いで、クリオスタットで厚さ5μmの皮膚横断面切片を作製し、−20℃のアセトンの中で一夜放置し、固定した。固定後、切片をアセトンの中から取り出し、十分乾燥させた後、0.3% H2O溶液で10分反応させ、内在性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。次いで、切片をリン酸バッファーで洗浄し、ノン血清プロテインブロック試薬(Dako製)と室温で1時間インキュベートし、非特異性反応を抑えた。一次抗体としてラット抗マウスCD68(マクロファージマーカー)又はラット抗マウスFRβを5μg/mlの濃度で、切片と室温で1時間反応させた。リン酸バッファーによる洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗ラット2次抗体(ニチレイ製)を、切片と室温で1時間インキュベートさせた。2次抗体を洗浄した後、Nova Red発色試薬で免疫反応を可視化した。
結果の検定として顕微鏡下で褐色に染まったCD68又はFRβ陽性細胞を数えた。顕微鏡下で、皮膚の真皮から皮下脂肪組織までの構造が40倍の視野に満たされるように動かして、一匹のマウスでランダムに5ヶ所視野の陽性細胞数を数え、その平均値を皮膚に浸潤したマクロファージ陽性細胞数の統計に用いた。
[ハイドロキシプロリンアッセイ]
参考例1で作製したリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療を併用して4週後のマウス皮膚を液体窒素で潰し、75%エタノール500μlで収集して、110℃で30分間乾燥させた。乾燥後、サンプルに6Nの塩酸を500μl添加し、110℃で一夜放置した。次いで、0.5Mの500μlナトリウムバッファーに2−propanolを添加して10%に調整した溶液250μlをサンプルと混濁し、中和した後、12,000xgで10分間遠心し、上清を取った。
0.5M酢酸ナトリウムの2−propanol溶液で1.4%のクロラミンTを調整し、1.4%のクロラミンT溶液500μlを、得られた上清サンプルに添加した。室温で10分インキュベートし、クロラミンTによって酸化されたハイドロキシプロリンに0.1%P−ジメチルアミノベンズアルデヒド溶液500μlを添加した。P−ジメチルアミノベンズアルデヒドは70%のMethylcellosolveに30%の過酸化酸(60%の溶液)の比率で融解させたものである。サンプルを60℃で20分反応させた後、マイクロプレートリーダーで550nMの吸光度を測定した。ターゲットサンプルと同時にL−4−ハイドロキシプロリン12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/mlのスタンダードの吸光度も測定した。L−4−ハイドロキシプロリンの吸光度で標準曲線を作成してターゲットサンプルのハイドロキシプロリン量を求めた。
[皮膚の厚さの検定]
上述のクリオスタットで作製した厚さ5μmの皮膚横断面切片をヘマトキシリンとイオジンでHE染色を行った。ヘマトキシリンを30秒反応させ、核を染めた後、イオジンで細胞質を染色し、100%エタノールで脱水し、キシリンで透明、永久性封入剤で封入した。10倍の顕微鏡下で、多層鱗状上皮の下から脂肪組織までの距離、即ち、真皮の厚さを測定した。一つのサンプルでランダムに5ヶ所の距離を測り、平均値を取って統計を行った。
[統計]
全ての有意差を求める統計は、One−way analysis of variance(ANOVA)で有意差を確認した後、post hoc analysisのBonferroni/Dunn testで有意差を検定した。
1−2.結果及び考察
[BLM(ブレオマイシン)で誘発した強皮症モデルマウスでのFRβ+マクロファージ]
マウス皮膚にBLMを毎日皮下注射し、3日、1週、2週後のマクロファージの動態的変化を観察した。
結果を図1及び2に示す。BLMの代わりにリン酸バッファーを皮下注射した皮膚を陰性コントロール(N.C)とした。陰性コントロールに比べてBLM注射後、CD68(マクロファージマーカーとして使われている膜タンパク質)陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージの皮膚への浸潤は徐々に増加して2週の時にピークに達した。
[強皮症モデルマウスにおけるリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた治療]
BLM注射開始の次の日からリン酸バッファー(Vehicle)、抗体の結合を欠くVH鎖と緑膿菌毒素(VHPE)又はリコンビナント抗FRβイムノトキシンを3日に一回2週間、合計5回で静脈注射(IV)した。治療1週後にトランスフォーミング増殖因子−β(TGF−β)mRNA及び結合組織増殖因子(CTGF)mRNAを測定し、4週後にhydroxyproline分析を通じて皮膚のコラーゲン量、又HE染色をしたマウスの皮膚の厚さを顕微鏡下で測定した。更に、4週後の皮膚のマクロファージ浸潤を調べた。
(1)TGF−β1 mRNA及びCTGF mRNAの変化
結果を図3に示す。BLM注射開始1週間後、皮膚のTGF−β1 mRNAとCTGF mRNAはそれぞれ2.4倍、1.4倍上昇したが、リコンビナント抗FRβイムノトキシン治療によってこれらのサイトカインmRNA量は低下した。このように、リコンビナント抗FRβイムノトキシン治療によって強皮症の発病早期のTGF−β mRNA発現量を抑制した。
図4は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1の発現を示す免疫組織学的染色像である。また、図5は、強皮症モデルマウス皮膚でのCD68陽性マクロファージとFRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1陽性細胞数(%)を示すグラフである。図4及び5に示すように、FRβ陽性マクロファージにおけるTGF−β1発現の割合は、CD68陽性マクロファージにおけるTGF−β1発現の割合より有意に高かった。
(2)治療後の皮膚マクロファージの変化
結果を図6及び7に示す。4週後の皮膚サンプルで、リコンビナント抗FRβイムノトキシンで治療したグループのCD68陽性マクロファージ数とFRβ陽性マクロファージ数は有意に減少した。
(3)抗線維化効果
結果を図8〜10に示す。リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したグループ(FR−β−rIT)のコラーゲンの主成分であるハイドロキシプロリン量は、溶媒だけ注射したグループ(Vehicle)と毒素だけ注射したグループ(VHPE)に比べて有意に低下した。皮膚の厚さも、リコンビナント抗FRβイムノトキシンを投与したグループ(FR−β−rIT)は、当該2つのコントロール群に比べて有意に薄くなった。
[まとめ]
リコンビナント抗FRβイムノトキシンは、従来の強皮症の治療に関する報告における抗TGF−β抗体と同じ治療効果を示した。リコンビナント抗FRβイムノトキシンは、抗TGF−β抗体と比べて以下の利点がある。すなわち、抗TGF−β抗体を用いた強皮症の治療に関する報告(J Immunol.1999 Nov 15;163(10):5693−9.)では4週続いて治療をしたが、本実施例ではリコンビナント抗FRβイムノトキシンを用いた2週間の治療で有意な治療効果が証明された。短時間の治療は抗体の免疫拒絶反応を避けられる。
また、これまでに、本発明者等は、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが肺線維症に効果があることを報告した(Clinical and Experimental immunology(2010)Vol.161,pp.348−356)。しかしながら、動物モデル肺疾患に効果的な投与経路である鼻腔経路では効果があったものの、ヒト疾患に一般的な静脈経路においては効果が得られなかった。鼻腔内投与経路は、毒素に対する抗体産生が少ないことや直接肺に到達する等の利点があるものの、本実施例において、皮膚線維化抑制が静脈経路において効果が得られたことは、当該イムノトキシンの新たな投与経路を示す。
臓器の線維化のメカニズムには臓器固有に存在する細胞が関与することから、種々の臓器において線維化のメカニズムは異なっており、例えば肺線維症に効果のある薬剤が皮膚の線維化を抑制するとは限らない。従って、本実施例において、リコンビナント抗FRβイムノトキシンが皮膚の線維化抑制に有効であったことは、新たな皮膚線維化抑制薬を提供することを示す。
本発明によれば、新規な強皮症治療剤が提供される。本発明に係る強皮症治療剤は、皮膚の線維化に関与するFRβ発現マクロファージの細胞死又は細胞傷害を選択的に誘導することによって、強皮症の治療効果をもたらすことができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
Claims (15)
- 葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含有する強皮症治療剤。
- 前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、請求項1記載の強皮症治療剤。
- 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1又は2記載の強皮症治療剤。
(a)配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)及びジフテリアトキシン(diphtheria toxin)から成る群より選択されるものである、請求項1〜10のいずれか1項記載の強皮症治療剤。
- 前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項1記載の強皮症治療剤。
- 前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項1記載の強皮症治療剤。
- 標識に結合した、請求項1〜13のいずれか1項に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を含む強皮症診断剤。
- 請求項1〜13のいずれか1項に規定される葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体又は該抗体と細胞毒素若しくは細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体、又は請求項14記載の強皮症診断剤を含む強皮症診断キット。
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