JP5544626B2 - 間質性肺炎治療剤 - Google Patents
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Description
臨床的に間質性肺炎の線維化組織ではマクロファージの増加が観察される。マウスを用いたモデルによると、マクロファージを炎症組織に誘導させるタンパク質因子(MCP1)や、マクロファージが分泌するサイトカインの抑制は、間質性肺炎の症状を緩和させる。さらに、マクロファージそのものを攻撃する抗CD11抗体を投与することによっても線維化の抑制や病態の緩解が認められる(非特許文献1)。
以上のことから、間質性肺炎を促進させるタンパク質(サイトカイン)を広範に分泌するマクロファージを標的とすることは、該疾患の治療に効果的であると考えられる。
しかしながら、非特許文献1で報告された抗体は、正常組織や血液中のマクロファージに発現するCD11をも認識することから、易感染症などの副作用リスクが否定できず、したがって実際の治療薬としては不向きである。
そこで本発明は、副作用のリスクが低減された新規な間質性肺炎の治療剤を提供することを目的とする。
葉酸受容体β(FRβ)は、炎症に関連するマクロファージ、特に関節リウマチや悪性脳腫瘍中に局在するマクロファージの細胞表面に高レベルで発現される一方で、正常組織や末梢血では発現されないか又は非常に低レベルで発現されることが知られている(Nagayoshi R et al.,Arthritis Rheum.2005 Sep;52(9):2666−75;Nagai T et al.,Arthritis Rheum.2006 Oct;54(10):3126−34;及びTaku Nagai et al.,Cancer Immunol Immunotherapy,2009 Oct(Published online:February 24,2009);58(10):1577−1586参照)。
本発明者らは今回、マウスを用いた間質性肺炎モデルにおいて、線維化が進行しつつある組織中のマクロファージでFRβ発現が強発現していることを見出した。
そこで本発明者らは、抗マウスFRβに対するリコンビナントタイプイムノトキシンを作製し、同モデルにおける治療効果を検討したところ、間質性肺炎による致死率が低減するとともに(偽薬投与群では7/15個体が生存、イムノトキシン投与群では14/15個体が生存)、線維化の程度も抑制できることを組織化学的解析にて確認することができた。
本願発明は上記知見に基づくものであり、以下の特徴を包含する。
(1)葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む間質性肺炎治療剤。
(2)前記間質性肺炎は特発性間質性肺炎である、上記(1)記載の間質性肺炎治療剤。
(3)前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、上記(1)又は(2)記載の間質性肺炎治療剤。
(4)前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、上記(1)〜(3)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
(5)前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、上記(1)〜(4)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
(6)前記抗体は、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、上記(1)〜(5)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
(7)前記抗体は、配列番号2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸からなるその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、上記(1)〜(5)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
(8)前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、上記(1)〜(7)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
(9)前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖(L鎖)可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(8)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
(10)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤:
(a)配列番号3に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(11)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤:
(a)配列番号4に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(12)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤:
(a)配列番号5に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(13)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤:
(a)配列番号6に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(14)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤:
(a)配列番号7に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(15)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤:
(a)配列番号8に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(16)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤:
(a)配列番号9に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(17)前記抗体は、以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、上記(1)〜(9)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤:
(a)配列番号10に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(18)前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)からなる群から選択されるものである、上記(1)〜(17)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
(19)前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、上記(1)〜(18)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
(20)前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、上記(1)〜(18)のいずれか記載の間質性肺炎治療剤。
(21)葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体を含む間質性肺炎診断剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009−046826号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図2は、ブレオマイシン投与マウスモデルにおいて、本発明のリコンビナントイムノトキシンの投与がマウスの生存率を改善することを示す。
図3は、ブレオマイシン投与マウスモデルにおける、本発明のリコンビナントイムノトキシン又は偽薬(FRβへの結合性が欠損している)の投与後の肺領域の免疫組織学的染色を示す。FRβ抗体で認識される細胞は赤色に発色している。
図4は、ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデルにおける、本発明のリコンビナントイムノトキシン又は偽薬(FRβへの結合性が欠損している)の投与後の肺における腫瘍壊死因子(TNF)−α、CC ケモカインリガンド(CCL)2又はCCL12産生細胞の免疫組織化学染色(上図)及び当該細胞のカウント(下図)を示す。
本明細書で使用する「葉酸受容体β」又は「FRβ」は、間質性肺炎の病変部(すなわち線維化細胞)に局在するマクロファージ(以下、間質性肺炎関連マクロファージとも称する)の細胞表面に発現される受容体タンパク質である。FRβは正常組織や末梢血中のマクロファージでは発現されないか又は非常に低レベルで発現される。
哺乳動物には、ヒトを含む霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジなどの家畜動物、イヌ、ネコなどのペット動物などが含まれる。好ましい哺乳動物はヒトである。
本明細書で使用される「葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体」は、FRβタンパク質を認識して該タンパク質に結合することができる抗体であり、以下に述べるように、該抗体は、無傷の抗体であってもよいし、或いは、間質性肺炎関連マクロファージとの結合親和性を有する限り、抗体フラグメントや合成抗体(例えば組換え抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体など)であってもよい。これらの抗体はまた、間質性肺炎により線維化した細胞がその表面にFRβを発現するような場合には、間質性肺炎関連マクロファージ及び該線維化細胞の両方に結合することを可能にする。抗体をヒトに対して使用する場合、好ましい抗体はヒト抗体又はヒト化抗体である。
本明細書で使用する「細胞毒素」又は「細胞毒性剤」は、間質性肺炎関連マクロファージ及び、場合により、線維化細胞を死滅させる又は障害する能力をもつ任意の物質を指す。
1.複合体
本発明の治療剤の有効成分としての複合体は、上記のとおり、間質性肺炎関連マクロファージの表面に発現する分子標的としてのFRβと結合する抗体と、該マクロファージ(及び場合により、線維化細胞)の細胞死を引き起こす細胞毒素又は細胞毒性剤とから基本的に構成される。
ここで、細胞死は、細胞の死滅、殺傷又は障害を意味し、細胞毒素又は細胞毒性剤によって引き起こされる。細胞毒素は、いわゆるトキシンとも呼ばれるタンパク質であるのに対して、細胞毒性剤は、低分子量の化学療法剤であり、前者には、微生物、特に細菌由来のトキシンが含まれ、一方、後者には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤などが含まれる。
本発明の複合体が上記抗体と細胞毒素からなるとき、これらの成分は融合タンパク質の形態をとることができる。この場合、細胞毒素は、好ましくは抗体タンパク質のC末端に、必要に応じてリンカー(例えばペプチド)を介して、結合することができる。一方、本発明の複合体が上記抗体と細胞毒性剤からなるとき、これらの成分は、結合のための官能基を介して共有結合又は非共有結合によって結合することができる。
1.1 抗体
本発明において、上記抗体は、間質性肺炎関連マクロファージのFRβに特異的に結合するものである。ここで、「特異的」とは、上記抗体が上記マクロファージのFRβと免疫学的反応により結合するが、FRβ又はそれと80%以上の配列同一性をもつタンパク質以外のタンパク質とは実質的に結合しないことを意味する。この点で、上記抗体は、FRのアイソフォームの1つであるFRα(例えばヒトFRαはヒトFRβとの間に約70%のアミノ酸配列同一性がある(特表 2008−500025))と結合しないことが望ましい。
本発明で使用可能な抗体は、抗原であるFRβタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメントである。部分ペプチドは、5以上、好ましくは7以上、より好ましくは8以上の連続アミノ酸を有する。一般に、抗原性エピトープ又は抗原決定基は、約5〜約10アミノ酸からなり、かつ連続的アミノ酸配列又は不連続的アミノ酸配列を有する。
本発明の抗体は、FRβと結合する、好ましくは特異的に結合する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、それらの抗体フラグメントのいずれであってもよい。
本発明の抗体はまた、いずれの免疫グロブリン(Ig)クラス(IgA,IgG,IgE,IgD,IgMなど)及びサブクラス(IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2など)のものあってもよい。また、免疫グロブリンの軽鎖は、κ又はλのいずれであってもよい。
本発明の抗体フラグメントは、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、重鎖モノマー又はダイマー、軽鎖モノマー又はダイマー、1つの重鎖と1つの軽鎖からなるダイマーなどを含む。このようなフラグメントの作製方法は当該技術分野で公知であり、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる抗体分子の消化、或いは公知の遺伝子工学的手法により得ることができる。
本発明の抗体はまた、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などであってもよい。組換え抗体には、例えば一本鎖抗体(scFv)、二重特異性抗体などが含まれる。二重特異性抗体は、2つの異なる結合特異性を有する抗体を指し、例えばdiabody、ScDb(single chain diabody),dsFv−dsFvなどが含まれる(浅野竜太郎,生化学77(12)1497−1500,2005参照)。
以下、本発明において使用するための抗体の作製方法について詳述する。
本発明において使用可能な抗体を作製するにあたり、最初に免疫原(抗原)として使用するタンパク質、すなわちFRβタンパク質又はその部分ペプチドを調製する。ここで部分ペプチドは、5以上、好ましくは7以上の連続アミノ酸からなる配列を有するものである。免疫原として使用することができるFRβタンパク質の由来は、標的とするFRβと特異的に結合することができる抗体を誘起できるものであるものであれば特に限定されず、例えばヒト、マウス等の哺乳動物に由来するFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として使用する。本発明では、免疫原として、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチド、あるいは配列番号2に示すアミノ酸配列からなるマウスFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することができる。免疫原として、配列番号1に示すアミノ酸配列からなるヒトFRβタンパク質又はその部分ペプチドを使用することが特に好ましい。
かかるFRβタンパク質又はその部分ペプチドは、FRβのアミノ酸配列情報(例えば配列番号1など)に基づき、当該技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより調製することができる。ヒトを含む他の哺乳動物由来のFRβの配列情報は、例えばGenBank(NCBI、米国)、EMBL(EBI、欧州)などから入手可能である。
あるいは、遺伝子組換え手法を利用して、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することも可能である。簡単に説明すると、FRβタンパク質をコードするDNAの配列を適当なタンパク質産生用ベクターに連結し、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドが発現し得るように宿主中に導入し、該宿主中でFRβタンパク質又はその部分ペプチドを生産することができる。この手法は当業者に周知であり、この場合に採用するベクター、宿主細胞、形質転換方法、培養方法、標的タンパク質の精製方法は、当業者が適宜選択することができる。遺伝子組換え手法については、例えば、Sambrookら,Molecular Cloning A Laboratory Manual,2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、Ausubelら,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons(1998)などを参照することができる。
上記のようにして調製したFRβタンパク質又はその部分ペプチドを免疫原として、本発明の抗体を製造することができる。あるいは、標的FRβタンパク質又はその部分ペプチドをコードするDNAを組み込んだ発現ベクター、或いは該タンパク質又はその部分ペプチドを発現する哺乳動物細胞を免疫原として使用して、本発明の抗体を製造してもよい。
本発明のポリクローナル抗体は、上記のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに免疫して、抗血清を得ることによって製造することができる。具体的には、上記免疫原を、必要に応じて免疫原性を高めるためのアジュバントと共に、哺乳動物に静脈内、皮下又は腹腔内投与する。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム、ミョウバン(Alum)、ムラミルペプチド(細菌細胞壁関連ペプチドの一種)等を使用することができる。その後、数日から数週間の間隔で、1〜7回の免疫を行い、最後の免疫日から1〜7日後に、ELISA等の酵素免疫測定法などによって抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血して抗血清を得る。このようにして取得した抗血清は、そのまま使用してもよいし、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを固定化したカラムで1回又は数回精製処理を行った後に使用してもよい。
本発明で使用可能なモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。すなわち、上記のようにして免疫感作した哺乳動物から得た抗体産生細胞(例えば脾臓由来リンパ球細胞、リンパ系細胞など)と自己抗体産生能のないミエローマ細胞からハイブリドーマを調製し、ハイブリドーマをクローン化し、免疫に用いた抗原に対して特異的親和性を示すモノクローナル抗体を産生するクローンを選択することによって製造することができる。かかるハイブリドーマの製造方法は当該技術分野で周知であり、例えばKohler及びMilsteinら(Nature(1975)256:495−96)の方法に準じて行うことができる。
本発明のモノクローナル抗体の例として、ヒトFRβ発現細胞により免疫されたマウスの脾細胞と、マウスミエローマ細胞とを融合させることにより得られたマウス−マウスハイブリドーマクローン36b又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
また本発明のモノクローナル抗体の他の例として、マウスFRβ発現細胞により免疫されたラントの脾細胞と、ラットミエローマ細胞とを融合させることにより得られたラット−ラットハイブリドーマクローンCL5又はクローンCL10が産生するモノクローナル抗体等を挙げることができる。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが有する核酸であって、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖又はL鎖を含む抗体をコードする遺伝子を包含する。これらの核酸はハイブリドーマから通常の遺伝子工学的手法により得ることができ、またその塩基配列も公知の塩基配列決定法により決定することができる。例として、マウス−マウスハイブリドーマクローン36b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号3及び4に、マウス−マウスハイブリドーマクローン94b細胞が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号5及び6に示す。また他の例として、ラット−ラットハイブリドーマクローンCL5が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号7及び8に、ラット−ラットハイブリドーマクローンCL10が産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子及びL鎖可変領域遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号9及び10に示す。
本発明は、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号3、5、7、9)、L鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)に制限されず、これらの遺伝子の変異体を包含する。
かかる変異体としては例えば以下のものを挙げることができる。
(i)上記H鎖又はL鎖可変領域遺伝子において、1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を有し、かつFRβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体;(ii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸と実質的に同一の塩基配列を有し、かつFRβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体;及び(iii)上記H鎖可変領域コード核酸又はL鎖可変領域コード核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつFRβに結合する同等もしくは同質の生物学的活性を有するタンパク質をコードする変異体。
本発明のH鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「数個」という用語は、1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個を指す。
本発明のH鎖及びL鎖可変領域遺伝子の関連で使用する「実質的に同一」とは、上記のようにして作製したハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のH鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号3、5、7、9)、L鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有することを意味する。なお、2つの配列間の同一性%は、配列が共有する同一な位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一な位置の数/位置(例えば、一部重複する位置)の総数x100)。
2つの配列間の同一性%の決定は、例えばカーリン(Karlin)及びアルトシュール(Altschul)(1993)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−5877)において改変されたカーリン及びアルトシュール(1990)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264)のアルゴリズムを用いて行うことができる。この種のアルゴリズムは、アルトシュールら(1990)J.Mol.Biol.215:403のNBLAST及びXBLASTプログラムに組み込まれている。また、比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、アルトシュールら(1997)Nucleic Acids Res.25:3389に記載されたGapped BLASTを用いるとよい。または、分子間の遠隔的な関連を検出する反復検索を行うためにPSI−BLASTを用いることもできる。BLAST、Gapped BLAST及びPSI−BLASTプログラムを用いる際には、それぞれのプログラム(例えば、XBLAST及びNBLAST)のデフォルトパラメーターを使用することができる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.参照)。配列比較のために使用できるアルゴリズムのその他の好ましい例として、例えばマイヤーズ(Myers)及びミラー(Miller)(1988)、CABIOS 4:11−17のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、GCC配列整列化ソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(version2.0)に組み込まれている。
本明細書において使用する「ストリンジェントな条件」とは、これに限定されるものではないが、例えば30℃〜50℃で、3〜4×SSC(150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム、pH7.2)、0.1〜0.5%SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、より好ましくは40℃〜45℃で、3.4×SSC、0.3%SDS中で1〜24時間のハイブリダイゼーション、そしてその後の洗浄を含む。洗浄条件としては、例えば、2×SSCと0.1%SDSを含む溶液、および1×SSC溶液、0.2×SSC溶液による室温での連続した洗浄などの条件を挙げることができる。ただし、上記条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記の又は他の要素(例えば、ハイブリダーゼーションプローブの濃度、長さ及びGC含量、ハイブリダイゼーションの反応時間など)を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
本明細書において「同等」とは、例えばFRβ抗原に対する結合特異性、結合親和性といった生物学的な活性が実質的に同一であることを指す。またこの用語は、実質的に同質の活性を有する場合を含んでもよく、ここでいう「同質」の活性とは、FRβ抗原に対する特異的結合性といった活性の性質が同一であること、或いは生理的性質、薬理的性質、又は生物学的性質が同一であることをいう。
これらのハイブリダイゼーションにおける「ストリンジェントな条件」の他の例については、例えばSambrookら(上記)、Ausubelら(上記)などに記載されており、これらの条件を本発明に使用してもよい。
上記変異体は、天然に生じたものであってもよいし、人為的に変異を導入したものであってもよい。人為的な変異の導入は、例えば部位特異的変異導入法(Site specific mutagenesis)を用いて常法により導入することができる(Proc Natl Acad Sci USA.,1984 81:5662;Sambrookら(上記))。
本発明では、上記のように作製したハイブリドーマに基づき、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体を作製することもできる。
具体的には、作製したハイブリドーマからモノクローナル抗体をコードする遺伝子をクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等の哺乳類細胞株、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞といった宿主に導入して、宿主において組換え抗体を生産させることができる(P.J.Delves.,ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.,1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean.,Monoclonal Antibodies.,2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS,J.W.Goding.,Monoclonal Antibodies:principles and practice.,1993 ACADEMIC PRESS)。
さらに、トランスジェニック動物作製技術を用いて目的抗体の遺伝子が内在性遺伝子に組み込まれたトランスジェニックなマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ又はブタを作製し、FRβタンパク質又はその部分ペプチドを抗原として免疫したのち、そのトランスジェニック動物の血液、ミルク中などからその抗体遺伝子に由来する抗体を大量に取得することも可能である。また、上記トランスジェニック動物のなかには、内因性抗体遺伝子を欠失したかつヒト抗体遺伝子を保有するマウスやウシなどのヒト抗体産生動物も知られているので、このような動物を利用する場合には、ヒトFRβに結合する完全ヒト抗体を得ることができる(例えば国際公開WO 96/9634096、WO 96/33735、WO98/24893など)。さらにまた、当該動物の抗体産生細胞(例えばB細胞)とミエローマ細胞から作製したハイブリドーマをin vitroで培養する場合には、上記のような手法で、モノクローナル抗体を産生することもできる。このとき、培養する細胞種の特性、試験研究の目的及び培養方法等の種々の条件に応じて、ハイブリドーマを増殖、維持及び保存させ、培養上清中にモノクローナル抗体を産生させるために用いられるような既知の栄養培地又は基本培地から誘導調製されるあらゆる栄養培地を用いて実施することが可能である。
産生されたモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知の方法、例えばプロテインAあるいはプロテインGカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせることにより精製することができる。
本発明で使用可能な抗体はまた、キメラ抗体であることができる。本発明のキメラ抗体は、例えばMorrison et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851−6855;Neuberger et al.,1984,Nature,312:604−608;Takeda et al.,1985,Nature,314:452−454に記載される技術を用いて製造することができる。これらの技術では、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングする。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する異なる部分が存在する分子である。キメラ抗体として、例えば、抗FRβマウス又はラットモノクローナル抗体のH鎖及び/又はL鎖可変領域と他の哺乳動物由来の免疫グロブリン定常領域とを有する抗体を挙げることができる。
本発明においてはまた、例えばマウス又はラットモノクローナル抗体由来の可変領域又は超可変領域を含む可変領域の一部と、ヒト免疫グロブリンの定常領域、又はヒト免疫グロブリンの可変領域の一部及び定常領域、とを有する抗体、例えば「ヒト化抗体」を挙げることができる。ヒト化抗体の場合、マウス由来の抗体領域部分は約10%未満が望ましい。
上記ヒト化抗体は、例えば抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体(又は抗マウスFRβラットモノクローナル抗体)のH鎖可変領域及び/又はL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR1、2及び3)を含むアミノ酸配列を含むことができる。さらに具体的には、以下の抗体を例示することができる。
(1)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号3に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号3に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号3に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(2)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号4に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号4に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号4に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(3)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号5に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号5に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号5に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(4)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号6に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号6に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号6に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(5)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号7に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号7に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号7に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(6)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号8に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号8に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号8に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(7)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号9に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号9に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号9に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(8)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む抗体:
(a)配列番号10に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド;
(b)配列番号10に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、かつFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(d)配列番号10に示す塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
なお、配列番号3〜10のCDR1〜3のヌクレオチド位置を下記表1に示す。
このようにして同定されたヒトアクセプター抗体H鎖及びL鎖配列をコードする塩基配列をベースにして、その可変領域の一部をマウス抗体のものと置換するように組換えを行う。得られたヒト/マウスキメラH鎖及びL鎖をコードするDNAを発現ベクターに組込み、適当な宿主細胞に形質転換することによって、ヒト化抗体をクローン化、産生することができる。
上記のようなキメラ抗体、ヒト化抗体は、ヒトへの適用に際し、抗原性を低減できるという利点を有する。
本発明の抗体はまた、例えば米国特許第4,946,778号;Bird,1988,Science242:423−426;Huston et al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883;Ward et al.,1989,Nature 334:544−546に記載される技術を用いて作製した、FRβタンパク質又はその部分ペプチドに対する一本鎖抗体(scFv)であってもよい。本発明の一本鎖抗体は、例えば本発明のモノクローナル抗体のH鎖可変領域(例えば配列番号3、5、7、9)及びL鎖可変領域遺伝子(例えば配列番号4、6、8、10)の配列情報に基づき、常法に従ってそれぞれH鎖フラグメントとL鎖フラグメントを調製し、アミノ酸架橋によってFv領域のH鎖フラグメントとL鎖フラグメントとを連結し、一本鎖のポリペプチドを得ることにより形成することができる。
1.2 細胞毒素又は細胞毒性剤
本発明に使用することができる細胞毒は、間質性肺炎関連マクロファージの細胞死を誘導する目的で使用することができる任意の細胞毒素であり、例えば緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)、リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha−sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)などを挙げることができる。本発明においては、特に、PE38等の緑膿菌外毒素を使用することが好ましい。
あるいは、本発明に使用することができる細胞毒性剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗生物質、分子標的薬、植物アルカロイド、ホルモン剤などから適宜選択可能である。このような細胞毒性剤としては、間質性肺炎関連マクロファージを死滅させることができるものが好ましい。また、FRβを細胞表面に発現する線維化細胞の場合には、線維化細胞の死滅も誘導可能な細胞毒性剤を利用することができる。
1.3 リコンビナントイムノトキシンなどの複合体
本発明の複合体の1つであるリコンビナントイムノトキシンを作製するために、上記のようにして作製された本発明の抗体又はその部分ペプチドは細胞毒素とコンジュゲートされる。すなわち、本発明に係るリコンビナントイムノトキシンとは、標的(すなわちFRβタンパク質)に結合する本発明の上記抗体が、細胞毒素又はそのサブユニットにコンジュゲートされたキメラ分子である。本発明においては、植物や細菌等に由来する細胞毒素、ヒト起源の細胞毒素、合成の細胞毒素を使用することができる。
本発明の抗体と細胞毒素とのコンジュゲートは、以下のようにして行うことができる。すなわち、抗体分子中の反応性基(例えばアミノ基、カルボキシル基、水酸基等)を利用し、該反応性基と反応しうる官能基をもつ細胞毒と該抗体とを接触させることによって、本発明のリコンビナントイムノトキシンを得ることができる。あるいは、本発明の抗体のH鎖可変領域遺伝子(配列番号3、5、7、9)及びL鎖可変領域遺伝子(配列番号4、6、8、10)の配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により、H鎖フラグメント又はL鎖フラグメントのいずれかを細胞毒素との融合タンパク質として作製し、細胞毒素と融合していない他方のフラグメントと一緒に、SH結合を介して一本鎖抗体又は二本鎖抗体を形成させることによって、本発明のリコンビナントタンパク質を作製してもよい。SH結合を介したH鎖フラグメントとL鎖フラグメントの結合は、βメルカプトエタノールやジチオスレイトールなどの還元剤などによってメルカプト基(−SH基)を露出後、両者を混和することによって達成することができる。
本発明のリコンビナントイムノトキシンの一例として、それぞれ上記マウス−マウスハイブリドーマクローン36b細胞又はクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンであるリコンビナントイムノトキシンが挙げられる。マウス−マウスハイブリドーマクローン36bと緑膿菌外毒素のリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号11に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。またマウス−マウスハイブリドーマクローン94bが産生するモノクローナル抗体と緑膿菌外毒素とのリコンビナントイムノトキシンは、例えば配列番号13に示すポリペプチドからなるH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドからなるL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である。
本発明の複合体のもう1つの例は、上記のFRβに結合する抗体と細胞毒性剤との結合体である。一般に、抗体の定常領域、好ましくはC末端側に細胞毒性剤を結合することができる。結合は、抗体蛋白質のNH2基、SH基、OH基、COOH基などを利用し、これと反応性の官能基をもつ細胞毒性剤とを、場合により例えば炭化水素リンカーを介して、化学的に結合することによって実施できる。
2.治療剤
こうして作製された本発明の複合体は、間質性肺炎関連マクロファージに特異的に高発現しているFRβを標的とし、間質性肺炎関連マクロファージの細胞死を誘導して肺の線維化を抑制することができる(下記実施例4、及び図2、3参照)。
このように、本発明のリコンビナントイムノトキシン等の複合体は、ミサイル療法等の治療目的に使用可能な複合体であり、間質性肺炎に対する治療効果を有するものである。また、本発明の複合体は、間質性肺炎において特異的に高発現しているFRβを標的とするため、正常細胞への影響が少なく、副作用のリスクが低いという利点を有する。
本発明の複合体は、これを有効成分として含む間質性肺炎治療剤として製剤化される。すなわち、本発明の間質性肺炎治療剤は、治療上有効量の複合体を含むものである。ここで、「治療上有効量」とは、所与の症状や用法について治療効果を与え得る量を指し、間質性肺炎治療剤を適用する対象の性別、年齢、体重、疾患の重篤度、投与経路など様々な要因に応じて変化する。例えば、所与の用法に従って、60kgの成人に、本発明の複合体が1日当たり200μg以上、好ましくは500μg以上の量で投与される量を治療上有効量として含むことができる。
本発明の間質性肺炎治療剤は、本発明の複合体に加えて、生理学的に許容し得る製薬上の添加物、例えば希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、酸化防止剤、等張化剤、賦形剤及び担体などの1種以上を含むことができる。また間質性肺炎の治療に効果的な他の薬剤との混合物としてよい。かかる薬剤として、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、トリアムシノロン等のステロイド剤や、ピルフェニドンなどを挙げることができる。
本発明の間質性肺炎治療剤は、経口投与、或いは注射、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与(すなわち静脈内又は筋肉内投与)用に製剤化することができる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。あるいは、本発明の間質性肺炎治療剤は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水などで使用前に再構成するための凍結乾燥粉剤としてもよい。
投与経路は、経口経路、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射などが考えられる。あるいは、患者の患部に直接本発明の間質性肺炎治療剤を接触させてもよい。
本発明の間質性肺炎治療剤は、その病因にFRβ発現性マクロファージが関与しているものであればいずれの間質性肺炎の治療に用いてもよく、例えば、特発性間質性肺炎や、肺線維化が認められた膠原病、がん治療時における放射線や薬剤によって誘発された肺線維症などに有用である。
本発明の間質性肺炎治療剤を適用する対象は特に限定されず、健常者、間質性肺炎に罹患している患者、間質性肺炎を治療している患者、間質性肺炎の予防を検討している健常者等のいずれであってもよい。またその対象はヒトに限らず、ヒト以外の哺乳動物であってもよい。例えば、ヒト以外の哺乳動物として、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ネコなどを例として挙げることができる。
3.間質性肺炎の診断
上記節1.1で説明した本発明の抗体又はそのフラグメントは、間質性肺炎の診断、例えば、間質性肺炎の存在又は不在、及び該疾患を有するリスクを判定するために使用することができる。具体的には、本発明の間質性肺炎の診断方法(以下、本発明の方法という)は、本発明の抗体又はそのフラグメントを使用してサンプル中の該疾患に由来するFRβを免疫学的に検出又は測定することを含んでいる。
本発明の方法は、これが抗体を用いるアッセイ(すなわち免疫学的アッセイ)である限り、いずれの手法に基づいて行うこともできる。したがって、本発明の抗体又はそのフラグメントを前記アッセイで使用する抗体として用いてFRβを検出することができる。例えばFRβは、免疫組織染色、酵素イムノアッセイ(ELISA及びEIA)などのイムノアッセイ、免疫蛍光アッセイ、ラジオイムノアッセイ(RIA)又はウエスタンブロッティングを用いることによって検出することができる。
本発明の方法で試験されるべきサンプルは、間質性肺炎に由来するFRβを含む可能性のある生物学的サンプルであれば特に制限されない。サンプルの例として、細胞又は器官の抽出物、組織切片、肺洗浄液、バイオプシーなどを挙げることができる。本発明の抗体又はそのフラグメントを用いることによって測定されるFRβの存在量は、間質性肺炎のリスクの指標として特に有用である。
例えば、本明細書に記載される抗体及びそのフラグメントは、FRβを定量的又は定性的に検出するために使用することができる。本発明の抗体(又はそのフラグメント)は、例えばFRβのin situ検出のために、さらに組織学的に使用することができる。in situ検出は、被験体から組織学的サンプル、例えばパラフィン包埋した組織切片(外科標本など)、を取り出し、これに標識した本発明の抗体をアプライすることによって行うことができる。
FRβのためのイムノアッセイは、典型的には、調査する被験体由来のサンプルを、検出可能に標識された本発明の抗体の存在下でインキュベートすること、及び当該分野で周知の多くの技術のいずれかによって、結合した抗体を検出すること、を含んでいる。
抗FRβ抗体の結合活性は、周知の方法に従って測定することができる。当業者は、慣用の実験を使用することによって各測定に効果的な及び最適なアッセイ条件を決定することができる。
本発明の方法は、他の間質性肺炎診断手法と併用することが好ましい。上記の通り、FRβは、間質性肺炎の他、関節リウマチや悪性腫瘍などの病変部位に局在するマイクロファージの細胞表面上でも発現が認められることがあるため、他の診断手法と併用することで、間質性肺炎の診断精度を高めることができる。本発明の方法で使用することができる他の間質性肺炎診断手法としては、血液検査、レントゲン、関節液、胸水、腹水、バイオプシー、肺洗浄液などを挙げることができる。
実施例1
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体及び抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の製造
[抗原であるFRβ発現細胞の調製]
関節リウマチ滑膜またはBalb/cマウス肝臓からTrizol(GibcoBRL)、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にて添付説明書に従って全RNAを抽出後、SuperScript plasmid System(Invitrogen)にて添付説明書に従ってcDNAを合成した。次に、1μlのリウマチ滑膜、またはBalb/cマウス肝臓cDNAをそれぞれ別個にBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、10ピコモル量に調整したセンス(ヒトリウマチ滑膜:agaaagacatgggtctggaaatggatg(配列番号15);マウス肝臓:tctagaaagacatggcctggaaacag(配列番号16))およびアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:gactgaactcagccaaggagccagagtt(配列番号17);マウス肝臓:cccaacatggatcaggaact(配列番号18))を加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅したFRβ遺伝子のPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションを行った。すなわちPCR産物2.5μlにNaCl溶液を1μL、滅菌蒸留水1.5μl、ベクタープラスミド(PCR2.1−TOPO)1μLを加えて室温で5分間インキュベートし、その内の2μLを大腸菌(TOP10F’)に加えて氷中で30分反応後、42℃30秒の熱処理し、氷中で2分間静置し、250μLのSOC培地を加えた後、37℃で1時間シェーカー内で培養した。培養終了後、LB培地に捲き、37℃で一晩培養した。
大腸菌培養の為、プレート上より採取した白いコロニーをアンピシリン(50mg/mL)を含むLB液体培地に加えて37℃一晩培養した。プラスミドの精製はQiagenプラスミド精製キット(Qiagen)にて行った。組み込まれたFRβ遺伝子は、制限酵素EcoRIによる処理後、アガロース電気泳動に展開し、約0.8kb(782bp)のFRβ遺伝子産物を確認後、その部位を切り出し、遺伝子産物の抽出をQuiagen PCR purification kit(Quiagen)にて精製した。次にあらかじめEcoRI処理を行った哺乳細胞発現用ベクターpER−BOS(Mizushima et al.pEF−BOS,a powerful mammalian expression vector.Nucleic Acid Res.1990;18(17):5322)と混和し、T4 ligase(Roshe)を用いてライゲーションを行った。ライゲーション産物の大腸菌(TOP10F’)への遺伝子導入ならびに、FRβ遺伝子の確認は上記と同様の手法で行った。
pEF−BOSに組み込まれたFRβ遺伝子を確認後、ヒトFRβを含むベクターはマウスB300−19細胞に、マウスFRβを含むベクターはラットRBL2H3細胞にそれぞれ遺伝子導入を行った。すなわち、あらかじめ1x105個に調整した各細胞に、20μLのリポフェクタミン(GibcoBRL)と混和したFRβベクター1μgを加えて遺伝子導入を行った。遺伝子導入されたB300−19マウス細胞およびラットRBL2H3細胞は抗生物質G418耐性を獲得するため、1mg/mLの濃度のG418を含む培地にて遺伝子導入された細胞を選択培養した。遺伝子導入された細胞のFRβ遺伝子導入の確認はPCR法にて行った。すなわち、1x107個に調整した各細胞をcDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成し、10ピコモル量に調整したセンス(ヒトリウマチ滑膜:agaaagacatgggtctggaaatggatg(配列番号15);マウス肝臓:tctagaaagacatggcctggaaacag(配列番号16))およびアンチセンスプライマー(ヒトリウマチ滑膜:gactgaactcagccaaggagccagagtt(配列番号17);マウス肝臓:cccaacatggatcaggaact(配列番号18))をBioneer PCR premix(Bioneer)に加え、94℃20秒、58℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させることにより、ヒトあるいはマウスFRβを増幅した。増幅後アガロース電気泳動を行い、FRβが示すバンド0.8kbを確認した。
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体および抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の作製]
FRβ発現マウスB300−19細胞あるいはラットRBL2H3細胞を1x107個に調整し、フロインド完全アジュバンドと混合し、Balb/Cマウス(抗ヒトFRβモノクローナル抗体用)あるいはWhister Kyotoラット(抗マウスFRβモノクローナル抗体用)の尾部に3ヵ所、腹腔内に免疫した。この免疫を2〜4回繰り返した。
モノクローナル抗体の作成はKolerの方法(Kohler & Milstein,Nature(1975)256:495−96)に従って行った。すなわち、脾臓あるいは腸骨リンパ節を取りだし、単一細胞に解離させた。解離した細胞を骨髄腫由来の細胞(NS−1)と細胞融合させてハイブリドーマを作製し、HAT選択培地にて培養し、培養上清中に分泌された抗体を、先のFRβ発現細胞との反応性で選別を行った。
得られたハイブリドーマのクローン化は、96穴プレートの各穴あたり1細胞となるように調整した限界希釈培養にて行った。クローン化細胞の選別は、FRβ発現細胞との反応性で行った。
クローン化したハイブリドーマを1x107個に調整し、ヌードマウス腹腔内に投与して腹水を調整し、Protein Gカラム(GEバイオサイエンス)にてモノクローナル抗体を精製した。精製したマウスおよびラットモノクローナル抗体のアイソタイプは、アイソタイピングELISAキット(Pharmingen)を用いて決定した。その結果、抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体はIgG2aタイプのクローン36bとIgG1タイプの94bの二つが得られ、抗マウスFRβラットモノクローナル抗体は、IgG2aタイプのCL5とCL10の二つが得られた。これら各抗体の抗原に対する反応性はフローサイトメトリーにて解析した。
[抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体および抗マウスFRβラットモノクローナル抗体の重鎖遺伝子可変領域(VH)および軽鎖遺伝子可変領域(VL)遺伝子の決定]
マウスハイブリドーマクローン36b、94bを1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。36bおよび94bはIg−Prime Kitを用いてVHおよびVLの遺伝子をPCRにて決定した。PCR条件は添付の説明書に従って行った。すなわち、94℃60秒、50℃60秒、72℃120秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させ、VHおよびVLの遺伝子を増幅した。増幅したVHおよびVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。遺伝子導入した大腸菌よりプラスミドを精製し、36b、94bのVHおよびVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、PCR産物をABI310 DNA sequencerにて解析した。
ラットハイブリドーマクローンCL5、CL10を1x107個にそれぞれ調整し、cDNA synthesis kit(Invitrogen)にてcDNAを合成した。次に、Ig−Prime KitおよびラットVH増幅用にデザインしたプライマー(caccatggagttacttttgag(配列番号19))を用い、VHおよびVLの遺伝子をPCRに増幅させた。増幅したVHおよびVLのPCR産物をプラスミドPCR2.1−TOPO(Invitrogen)にライゲーションし、大腸菌(TOP10F’)に遺伝子導入した。次に、大腸菌よりプラスミドを精製し、VHおよびVLの塩基配列を決定した。塩基配列はBigDye Terminaor V3.1 cycle sequencing kit(ABI)を用いてPCRを行い、ABI 310 DNA sequencerにて解析した。
実施例2
ヒト間質性肺炎およびマウスブレオマイシン間質性肺炎モデルにおけるFRβ陽性マクロファージの免疫組織学的検出
[ヒト間質性肺炎組織の免疫組織化学的染色]
ホルマリン固定したヒト特発性間質性肺炎組織のパラフィン封埋ブロックを2μmにて薄切し、組織標本を作製した。得られた標本はキシレンおよびエタノールにてパラフィンの洗浄を行い、さらに抗原回復液(Diva Decloaker,Biocare Medical Inc.)に浸し、121℃で15分間処理した。抗原回復後の標本は、3%牛血清アルブミンを含む10%ヒト血清にて、免疫組織染色の非特異的吸着のブロッキングを行った。抗体反応には5〜10μg/mLに調整した抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体(94b)または抗ヒトCD68マウスモノクローナル抗体(クローン名:PG−M1,ダコ・ジャパン)を用い、室温で一時間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液で洗浄し、二次抗体反応(抗マウスIgG,MAX−PO、ニチレイ)を行った。反応終了後、過剰量のリン酸緩衝液にて洗浄を行い、FRβ陽性細胞の発色をNOVA RED(Vector)を用いて行った。
[マウスブレオマイシン間質性肺炎モデルにおけるFRβ陽性マクロファージの免疫組織学的検出]
C57BL/6J雄マウス(日本クレア)、8〜12週齢にイソフルラン(アボット)呼気麻酔を施し、拡大耳鏡下にて4.5Unit/kg/0.1mLに調整したブレオマイシン(日本化薬)の気管内投与を行った。投与3、7、14、21日後にマウスを致死過剰量のイソフルランにて安楽死を施し、両肺を切除し、凍結組織標本用のコンパウンドに封埋させた。封埋後の組織は、クライオスタットにて薄切し、標本スライドグラスを作成した。得られた標本はアセトン固定後、純水にて洗浄してコンパウンドを除去した。洗浄後の標本は0.3%の過酸化水素水にて内因性のペルオキシダーを失活させた後、5%牛血清アルブミンを含む10%正常マウス血清で次の抗体反応の前処理を行った。抗体反応には5−10μg/mLに調整した抗マウスFRβラットモノクローナル抗体(CL10もしくはCL5)を用い、室温で一時間反応させた。反応終了後、リン酸緩衝液で洗浄し、二次抗体反応(マウス組織用MAX−PO、ニチレイ)を行った。反応終了後、過剰量のリン酸緩衝液にて洗浄を行い、FRβ陽性細胞の発色をNOVA RED(Vector)を用いて行った。
[結果]
染色結果を図1に示す。図1の上図から明らかな通り、CD68を標的としたマクロファージマーカーの局在とFRβの局在の大部分が重複しており、ヒト特発性間質性肺炎組織中のマクロファージの多くがFRβを高発現していることが分かった。
また、マウスブレオマイシン間質性肺炎モデルにおいて、図1の下図から明らかな通り、肺組織の線維化に伴ってFRβ発現性マクロファージが増加していることが分かる。
以上のことから、FRβ発現性マクロファージの選択的除去が、間質性肺炎の治療に有効である可能性が示唆された。
実施例3
リコンビナントイムノトキシンの製造
[免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)にシステインの変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)の63番目のアミノ酸グリシン(塩基配列ggc)をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製し(センス:cagaggcctgaacattgtctggagtggattggaag(配列番号20)、アンチセンス:cttccaatccactccagacactgttcaggcctctg(配列番号21))、Quick change site−directed mutagenesis kit(Stratagene)を用いて実施例1で得た94bのVHを含むプラスミドpCR2.1−TOPO 94bVHに変異誘発処理を行った。このPCR反応は、反応液を95℃30秒、55℃60秒、68℃4分のサイクルを12回連続して行った。抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン重鎖遺伝子可変領域(VH)へのシステイン導入も上記と同様の方法にてプライマーをデザインして行った(センス:gtccgccaggctccaacgaagtgtctggagtgg gtcgc(配列番号22)、アンチセンス:gcgacccactccagacacttcgttggagcctggcggac(配列番号23))。
次に、反応後のDNAを大腸菌XL1−Blueに遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地で選択培養した。選択した形質転換体のプラスミドをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、63番目のグリシンがシステイン(塩基配列tgt)に変異したことを確認した。
[pRK79PE38ベクターに変異を導入したVHを挿入]
次に、PE38遺伝子を含むpRK79ベクターpRK79PE38に、94bVHおよびCL10VHの変異を導入したVHの挿入を以下の方法にて行った。
変異を導入した94bの5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてtaagaaggagatatacatatggaggttcagctgcagcagtc(配列番号24)とgccctcgggacctccggaagcttttgaggagactgtgagagtgg(配列番号25)を、CL10の5’末端部と3’末端部のアニーリングプライマーとしてatacatatggaggtgcagctggtggagtctggg(配列番号26)とtccggaagcttttgaggagacagtgactgaagc(配列番号27)をそれぞれデザインした。アニーリングプライマーにはそれぞれ制限酵素であるNdeIがあり、この部位でのクローニングにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である。また、もう片方のアニーリングプライマーにはHindIII部位が挿入されており、この部位でのクローニングにより、VHとPE遺伝子が結合した融合タンパク質の発現が可能である。
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使って変異を導入したpCR2.1−TOPO−94bVHおよびpCR2.1−TOPO−CL10VHプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とHindIII(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VHと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79−VHPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VHの塩基配列がpRK79ベクターのPE38塩基配列と連結していることを確認した。
[免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域にシステイン変異を導入]
抗ヒトFRβマウスモノクローナル抗体94bの免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(センス:taagaaggagatatacatatggacattgtgatgtcacaatc(配列番号28)(このプライマーには制限酵素NdeI切断可能な塩基catatgを含むため、この部位でクローニングすることにより、atgを開始コドンとしたタンパク質の発現が可能である)アンチセンス:gctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt(配列番号29)(このプライマーは125番目のアミノ酸をシステイン(tgt)に変異させ、終始コドンtagに続いて制限酵素EcoRI切断可能な塩基gaattcが来るようにデザインしてある)。同様に抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10の免疫グロブリン軽鎖遺伝子可変領域(VL)の125番目のアミノ酸をシステイン(塩基配列tgt)に変異させるようにデザインしたプライマーを作製した(atacatatggacattgtgatgcccaatctccatcc(配列番号30)およびgctttgttagcagccgaattcctatttgatttccagcttggtgccacaaccgaacgt(配列番号31))。
これらのプライマーの組み合わせとpfu DNA polymerase(Stratagene)を使ってpCR2.1−TOPO−94bVLプラスミドのPCRを行った。この反応は94℃20秒、55℃30秒、72℃60秒で30サイクルPCRを行い、その後72℃5分で反応させた。次に、PCR産物を精製し、精製産物に制限酵素NdeI(New England Biolabs)とEcoRI(New England Biolabs)を加えて反応後、電気泳動に展開し、QIAquick gel extraction kit(Qiagen)を用いてゲルから目的の大きさのDNAを回収した。回収したDNAに、制限酵素処理した変異導入VLと同様の制限酵素で処理したpRK79PE38を添加し、さらにLigation High(Toyobo)を用いてVHとpRK79PE38のライゲーション反応を行った。ライゲーション反応終了、大腸菌TOP10F’(Invitrogen)に遺伝子導入し、0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて形質転換体を選択した。選択した形質転換体のプラスミドpRK79−VLPEをQIAprep spin Miniprep KIT(Qiagen)により精製した。さらに塩基配列をBig Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit(ABI)とABI310シーケンサーにて決定し、変異導入VLの125アミノ酸がシステインに変異していることや、終始コドンtagが配置されていることを確認した。
[リコンビナントタンパク質封入体の調製]
上記の変異導入VHを組み込んだプラスミドpRK79−94bVHPE、pRK79−CL10VHPE、変異導入VLを組み込んだプラスミドpRK79−VL94b、pRK79−VLCL10を50ng調整し、タンパク質発現用大腸菌BL21(DE3)に遺伝子導入した。遺伝子が導入された大腸菌の選抜は0.1mg/mLのアンピシリンを含むLB培地にて37℃15〜18時間の培養で行った。
選択終了後の大腸菌は1000mLのスーパーブロース培地で37℃の条件で培養し、可視吸光度600nmで1.0−1.5に到達するまで培養した。培養後、IPTG(isopropyl−beta−D−thio−galactopyranoside)を終濃度1mMになるように培地に添加し、さらに90分間37℃で培養した。培養終了後、遠心分離にて大腸菌を回収後、50mMトリス緩衝液(pH7.4、20mM EDTAを含む)を用いて200mLとなるまで懸濁した。懸濁終了後、卵白リゾチームを最終濃度0.2mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させて大腸菌の破壊を行った。破壊後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿物はさらに50mMトリス緩衝液(pH7.4、2.5%のTritonX−100、0.5M NaCl、20mM EDTAを含む)で200mLとなるまで懸濁し、卵白リゾチームを最終濃度0.2mg/mLとなるように加え、室温で1時間反応させた。反応終了後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。沈殿はさらに50mMトリス緩衝液(pH7.4、2.5%のTritonX−100、0.5M NaCl、20mM EDTAを含む)で200mLとなるまで懸濁し、十分混和させた後、20,000xgで遠心分離を行い、沈殿を回収した。この操作を5回繰り返した後の沈殿物をリコンビナントイムノトキシン封入体とし、さらに0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、6Mグアニジン塩酸塩、1mM EDTAを含む)で溶解させ、最終濃度10mg/mLとなるように調節した。
[リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンの作製]
上記で調製した94b−VHPEと94b−VL、CL10−VHPEとCL10−VLを混和させ、リコンビナント二重鎖Fv抗FRβイムノトキシンを作製した。
まず、0.5mLのVHPE、0.25mLのVLを混和し、ジチオトレイトール(DTT)を最終濃度10mg/mLとなるように加え、室温で4時間の還元処理を行った。処理後、75mLの0.1Mトリス緩衝液(pH8.0、0.5Mアルギニン、0.9mM酸化型グルタチオン、2mM EDTAを含む)に溶解させた。この溶液を10℃で40時間放置することによって、VHとVLを結合させた。結合終了後、分子量10,000カットの遠心濃縮器(Centricon 10、Amicon)で5mLまで濃縮し、さらに50mLのトリス緩衝液(pH7.4、0.1M尿素、1mM EDTAを含む)で希釈した。この希釈液をリコンビナントイムノトキシン精製の出発物質とした。
次に、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で平衡化したイオン交換カラムHi−Trap Q(GE)に、30mL/時間の流速で、上記出発物質を吸着させた後、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で洗浄した。洗浄後、吸着したリコンビナントタイプイムノトキシンの溶出をトリス緩衝液(pH7.4、0.3M NaCl、1mM EDTAを含む)で行った。溶出サンプルはトリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で透析した後、イオン交換カラムPOROS HQ(POROS)でさらに精製した。すなわち、透析した精製物質を10mL/分の流速で吸着させ、トリス緩衝液(pH7.4、1mM EDTAを含む)で洗浄後、上記緩衝液に0Mから1.0MのNaCl勾配を設定することにより、リコンビナントタイプイムノトキシンの溶出を行った。精製リコンビナントタイプイムノトキシンの最終調製はTSK300SW(Tosoh)ゲル濾過クロマトグラフィーにて行った。まず、75%の消毒用エタノールで48時間洗浄することによってTSK300SWカラム中のエンドトキシン除去を行った。次に日本薬局方注射用蒸留水で洗浄し、その後日本薬局方生理食塩水でTSK300SWカラムの平衡化を行った。平衡化終了後、リコンビナントタイプイムノトキシンを投与し、流速0.25mL/分でカラムからの溶出液を採取した。採取後、0.22μmの濾過滅菌機で処理し、純度をSDS−PAGEにて確認後、−80℃で保存した。
[SDS−PAGEによる純度検定]
SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミド電気泳動)は0.1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む12%ポリアクリルアミドの平板ゲルを用い、移動相には終濃度0.1%のSDS、130mMグリシン、25mMトリスを含む水溶液を用いた。各サンプルは終濃度0.1%のSDSを含む100mMトリス緩衝液pH6.5で調整し、5分間の煮沸処理を行った。煮沸終了後、平板ゲルにサンプルを投与し、30mAの定電流で電気泳動を展開させた。展開後、0.05%のクマシーブリリアントブルーR溶液(ナカライテスク)でリコンビナントタイプイムノトキシンの染色を行った。
実施例4
リコンビナントイムノトキシンによる間質性肺炎の治療効果の検証
C57BL/6J雄マウス、8〜12週齢に呼気麻酔を施し、4.5Unit/kg/0.1mLに調整したブレオマイシンの気管内投与を行い、間質性肺炎モデルを作製した。本実施例においては、実施例3で調製したリコンビナントイムノトキシンを使用し(イムノトキシン投与群)、また対照として、FRβとの結合性が欠損している偽薬(PE38と抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10のVHとの融合タンパク質)を使用した(偽薬投与群)。イムノトキシン投与群及び偽薬投与群にはそれぞれ15個体のマウスを割り当てた。ブレオマイシン投与後3日目より15日までの間、二日間隔で3μg相当のリコンビナントイムノトキシンあるいは偽薬を経鼻的に投与した。ブレオマイシン投与後の生存率を経日的に計測すると共に、投与後21日目にマウスを安楽死させ、両肺を切除して凍結組織標本用を作製し、上記実施例2と同様にして組織化学的解析を行った。
生存率の追跡結果を図2に示す。図2の結果から明らかな通り、イムノトキシン投与群では、治療期間中は100%の生存率を示し、また治療終了後5日目の時点で15個体中14個体が生存できたのに対し、偽薬投与群では、治療終了後5日目の時点で15個体中7個体しか生存できなかった。
図3は、イムノトキシン投与群及び偽薬投与群の肺組織の免疫組織染色結果の一例を示す。図3から明らかな通り、イムノトキシン投与群ではFRβ発現性マクロファージが除去され(上図)、さらに組織線維化が抑制されていることが分かる(下図)。
以上の結果から、FRβ発現性マクロファージの選択的除去が、間質性肺炎の治療に効果的であることが示された。
実施例5
ブレオマイシン誘発性肺線維症を有するマウスの肺における腫瘍壊死因子(TNF)−α、CCケモカインリガンド(CCL)2及びCCL12産生細胞の頻度に対するリコンビナントイムノトキシンの効果の検証
マクロファージにより産生されるTNF−α、CCL2、CCL12等のサイトカインは線維化活性を示すことが知られている。そこで、これらサイトカイン発現に対するリコンビナントイムノトキシン治療の効果を検証するために、ブレオマイシン誘発性肺線維症を有するマウスの肺において、リコンビナントイムノトキシン投与後のTNF−α、CCL2またはCCL12産生細胞について免疫組織化学染色を行い、陽性細胞数のカウントを行った。
ブレオマイシン誘発性肺線維症マウスモデルの作製は実施例4と同様にして行い、実施例3で調製したリコンビナントイムノトキシンを使用した(イムノトキシン投与群)。また対照として、FRβとの結合性が欠損している偽薬(PE38と抗マウスFRβラットモノクローナル抗体CL10のVHとの融合タンパク質)を使用した(偽薬投与群)。イムノトキシン投与群及び偽薬投与群にはそれぞれ10個体のマウスを割り当てた。ブレオマイシン投与後3日目より15日までの間、二日間隔で3μg相当のリコンビナントイムノトキシンあるいは偽薬を経鼻的に投与した。投与後21日目にマウスを安楽死させ、両肺を切除して凍結組織標本用を作製し、上記実施例2と同様にして組織化学的解析を行った。
具体的に免疫組織化学染色は、抗TNF−aヤギ抗体(R&D社)、抗CCL2ヤギ抗体(Santa Cruz社)、抗CCL12ヤギ抗体(Santa Cruz社)を用い、実施例2と同様の手法で行った。また、TNF−α、CCL2またはCCL12産生細胞数のカウントは、NIS−Elements画像解析ソフトウェア(ニコン社製)を用いて行った。
結果を図4に示す。図4において、上図は、健康なマウス(正常)、偽薬投与群およびイムノトキシン投与群の各群におけるTNF−α産生細胞(それぞれ、パネルA、DおよびG)、CCL2産生細胞(それぞれ、パネルB、EおよびH)およびCCL12産生細胞(それぞれ、パネルC、FおよびI)を免疫組織化学的に染色した結果の一例を示す。一方、下図は、健康なマウス(正常)、偽薬投与群およびイムノトキシン投与群の各群におけるTNF−α産生細胞(パネルJ)、CCL2産生細胞(パネルK)およびCCL12産生細胞(パネルL)の計数を示す。縦軸は、400倍の顕微鏡視野10個当たりの細胞数を示す。なお、グラフは各群の10個体の平均値±標準誤差(SEM)(*は、偽薬投与群に対してP<0.05であることを示す)で表す。
図4から明らかな通り、イムノトキシン投与群ではTNF−α、CCL2およびCCL12産生細胞数が減少したことが分かる。
以上の結果から、本発明のリコンビナントイムノトキシンが肺線維症の治療に効果的であることが示された。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
[配列表]
Claims (21)
- 葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体と細胞毒素又は細胞毒性剤とをコンジュゲートした複合体を有効成分として含む間質性肺炎治療剤。
- 前記間質性肺炎は、特発性間質性肺炎である、請求項1記載の間質性肺炎治療剤。
- 前記複合体は、リコンビナントイムノトキシンである、請求項1又は2記載の間質性肺炎治療剤。
- 前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項1〜3のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤。
- 前記抗体は、葉酸受容体αに結合しない、請求項1〜4のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤。
- 前記抗体は、配列番号1に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、請求項1〜5のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤。
- 前記抗体は、配列番号2に示すアミノ酸配列から成るポリペプチド、又は7以上の連続アミノ酸から成るその部分ペプチド、に対して誘起されたものである、請求項1〜5のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤。
- 前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、それらの抗体フラグメント、又は組換え抗体である、請求項1〜7のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤。
- 前記抗体は、抗ヒト葉酸受容体βマウスモノクローナル抗体又は抗マウス葉酸受容体βラットモノクローナル抗体のいずれかの重鎖(H鎖)可変領域及び/又は軽鎖(L鎖)可変領域の各アミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜8のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤。
- 前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤:
(a) 配列番号3に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b) 配列番号3に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号3に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤:
(a) 配列番号4に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b) 配列番号4に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号4に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤:
(a) 配列番号5に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b) 配列番号5に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号5に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤:
(a) 配列番号6に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b) 配列番号6に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号6に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤:
(a) 配列番号7に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b) 配列番号7に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号7に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤:
(a) 配列番号8に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b) 配列番号8に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号8に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるH鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤:
(a) 配列番号9に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b) 配列番号9に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号9に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記抗体は、以下の(a)、(b)又は(c)に示すポリヌクレオチドによりコードされるL鎖可変領域のアミノ酸配列中の少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜9のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤:
(a) 配列番号10に示す塩基配列から成るポリヌクレオチド;
(b) 配列番号10に示す塩基配列において1個〜数個の塩基の欠失、置換、付加又は挿入を含み、且つFRβに結合する生物学的活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c) 配列番号10に示す塩基配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、且つFRβに結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。 - 前記細胞毒素は、緑膿菌外毒素(Pseudomonas aeruginosa exotoxin)リシンA鎖(ricin A chain)、脱糖鎖リシンA鎖(deglycosylated ricin A chain)、リボゾーム不活性化タンパク質(a ribosome inactivating protein)、アルファサルシン(alpha-sarcin)、ゲロニン(gelonin)、アスペルギリン(aspergillin)、リストリクトシン(restrictocin)、リボヌクレアーゼ(ribonuclease)、エポドフィロトキシン(epidophyllotoxin)、ジフテリアトキシン(diphtheria toxin)から成る群から選択されるものである、請求項1〜17のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤。
- 前記複合体は、配列番号11に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号12に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項1〜18のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤。
- 前記複合体は、配列番号13に示すポリペプチドから成るH鎖と、配列番号14に示すポリペプチドから成るL鎖との一本鎖又は二本鎖抗体である、請求項1〜18のいずれか1項記載の間質性肺炎治療剤。
- 葉酸受容体β(FRβ)に結合する抗体を含む間質性肺炎診断剤。
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