JPH07285996A - 抗原特異的活性化tリンパ球、その検出及び使用 - Google Patents

抗原特異的活性化tリンパ球、その検出及び使用

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JPH07285996A
JPH07285996A JP7007746A JP774695A JPH07285996A JP H07285996 A JPH07285996 A JP H07285996A JP 7007746 A JP7007746 A JP 7007746A JP 774695 A JP774695 A JP 774695A JP H07285996 A JPH07285996 A JP H07285996A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 タイプI糖尿病患者からのT細胞と反応して
初期自己エピトープを規定する新規な自己反応性ペプチ
ドを提供する。 【構成】 以下の配列を含むペプチド又はペプチド誘導
体。 (a) アミノ酸配列(I) G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A (b) アミノ酸配列(II) E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K (c) 図1又は2に示すアミノ酸配列のうちの1つ (d) 少なくとも6アミノ酸の長さを有する (a)、(b) 及
び/又は(c) に示すアミノ酸配列の部分領域、及び/又
は (e) (a) 、(b) 、(c) 及び/又は(d) に示すアミノ酸配
列のものと本質的に等しいMHC分子への結合特異性及
び/又は親和性を示すアミノ酸配列。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、自己免疫反応を起こす
ペプチド、これらペプチドと主要組織適合性複合体(M
HC)の分子との複合体、これらペプチド及び/又はこ
れらペプチドの複合体と反応するT細胞サブ集団、並び
にこれら化合物の診断的及び治療的用途に関する。
【0002】
【従来の技術】ここ数年の間に、慢性関節リウマチ及び
若年型糖尿病(IDDM)の如き自己免疫疾患の発病に
おける分子相互の関係の解明が急速に進み、これら疾患
の初期診断及び原因療法の実際的適用が明らかになって
きた。今日では、遺伝的素質に加えて、環境的要因もこ
れら疾患の発病に一定の役割を果たしていることは確実
である。例えば、IDDMの場合においては、遺伝的危
険因子レベルで、MHCクラスII抗原の僅かな対立遺伝
子がこの疾患に密接に関係している。かくして、これら
対立遺伝子の分析によってIDDMについての危険グル
ープを特定するのは可能である(例えば、トムソン(Tho
mson) ら, Am.J. Hum. Genet. 43 (1988), 799-816 又
はトッド (Todd) ら, Nature 329 (1987), 599-604) 。
IDDMの発病に関与する環境的要因は、おそらく免疫
原として作用する外因性ペプチド配列であろう。この関
連における他のものの中では、内因性構造体に部分的相
同性を有するウィルス抗原が議論されてきた。特定の環
境下、特に出生後ではウシ血清アルブミンの如き食物を
介して摂取される抗原が、内因性構造体への相同性のた
めに自己攻撃プロセスの引き金になり得る免疫応答を誘
発することができる。細胞障害性リンパ球による膵臓β
細胞の進行性破壊は、IDDMにおける疾患過程の典型
的なものである。このプロセスは、グルコース代謝の顕
在障害が出るかなり前から始まる。糖尿病の顕在が見出
せた時にはこれらβ細胞の90%以上が既に破壊されて
いる。従って、危険性のある人におけるこれら自己攻撃
性T細胞の初期の検出は、患った個体に原因療法を提供
するのに極めて重要である。
【0003】今日、自己免疫疾患における体内組織の破
壊は、当初は非常にゆっくりと進行することが確認され
ている。このプロセスの初期段階では、自己攻撃性T細
胞は多分1又は2,3の自己抗原を認識するに過ぎない
であろう。タイプI糖尿病の動物モデル(NODマウ
ス)でのカウフマン(Kaufman) ら(Nature 368 (1993),
69-72)及びテッシュ(Tisch) ら(Nature 368 (1993),
72-78)の研究により、このマウス系で自発的に起こる
糖尿病の場合には、初期T細胞媒介自己免疫反応は、グ
ルタミン酸デカルボキシラーゼに向けられていることが
示された。この場合、グルタミン酸デカルボキシラーゼ
(GAD)のC末端における1又は2のエピトープだけ
が、NODマウス内において初めに認識される。この時
点では、上述のように、グルコース代謝における如何な
る変化もまだ確認することができないが、インスリン炎
(perinsulitis) は既に検出可能である。この疾患の経
過が更に進んだ時に、GADペプチドのスペクトルが自
己攻撃性T細胞の拡大によって認識されるだけである。
糖尿病が顕在した後は、他の膵島細胞抗原、例えば、ペ
リフェリン (peripherin) 、熱ショックタンパク質HS
P65及びカルボキシペプチダーゼHに対する前活性化
T細胞を検出することも可能となる。
【0004】ヒトの場合にも、GADに対する免疫応答
がタイプI糖尿病の発病に原因的に関連しているという
証拠がある。かくして、例えば、糖尿病前症患者の80
%以上に、GADに対する自己抗体を検出することが可
能である。しかしながら、これら自己抗体の原因論的役
割は、あまり重要ではないと判断されている。これに反
して、タイプI糖尿病においてはTリンパ球による膵臓
β細胞の進行性破壊があると仮定される。GADに向け
られたこれらTリンパ球は、幾つかの研究グループによ
って既に検出されている(ハリソン (Harrison) ら, J.
Clin. Invest.89 (1992), 1161;ハニーマン (Honeyma
n) ら, J. Exp. Med. 177 (1993), 535)。これらグル
ープによって見出された自己抗体は、GAD67kd分
子のアミノ酸208〜404から構成されるペプチド断
片と反応した。自己免疫的に反応するヒトGAD65k
d分子からのポリペプチドが、EP−A−051946
9に開示されている。これらポリペプチドは次のアミノ
酸配列を有している。 X-P-E-V-K-(T 又は E)-K-Z (式中、Xは1〜10アミノ酸から選ばれる任意配列で
あり、Zは1〜8アミノ酸から選ばれる任意配列であ
る。)
【0005】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、タイ
プI糖尿病患者からのT細胞、特に最近発見されたタイ
プI糖尿病患者からのT細胞と反応し、かくして初期自
己エピトープを規定する新規な自己反応性ペプチド (au
toreactive peptide) を提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】この目的は、自己反応性
T細胞の検出、単離、増殖、アネルギー化及び/又は除
去に適する、同じように結合するペプチド、ペプチド誘
導体又は分子によって達成させる。従って、本発明の主
題は、次の配列を含むペプチド又はペプチド誘導体であ
る: (a) アミノ酸配列(I) G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A
、 (b) アミノ酸配列(II) E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K 、 (c) 図1又は2に示すアミノ酸配列のうちの1つ、(d)
少なくとも6アミノ酸の長さを有する (a)、(b) 及び/
又は(c) に示すアミノ酸配列の部分領域、及び/又は
(e) (a) 、(b) 、(c) 及び/又は(d) に示すアミノ酸配
列のものと本質的に等しいMHC分子への結合特異性及
び/又は親和性を有するアミノ酸配列。
【0007】本発明によるペプチド又はペプチド誘導体
は、好ましくは次の配列を含む: (a) アミノ酸配列(I)、(b) アミノ酸配列(II)、
(c) アミノ酸配列(I)及び/又は(II)の部分領域、
及び/又は(d) (a) 、(b) 及び/又は(c) からのアミノ
酸配列と本質的に同等のMHC分子への結合特異性及び
/又は親和性を有するアミノ酸配列。本発明によるペプ
チド又はペプチド誘導体は、好ましくはアミノ酸配列
(I)の部分配列 L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F 又はそれから誘導される、N−末端配列 L-P 及びC−
末端配列 H-F が保存された配列を含む。アミノ酸配列
(I)は、ヒトGAD65のアミノ酸残基266〜29
0に対応し、アミノ酸配列(II)は、ヒトGAD65の
アミノ酸配列306〜325に対応する。図1及び2に
示したアミノ酸配列も、ヒトGAD65の部分配列であ
る。
【0008】驚いたことに、ヒトGAD65のアミノ酸
残基266〜285及び306〜325に対応するペプ
チドが、最近発見されたタイプI糖尿病患者から単離さ
れたT細胞サブ集団と特異的に反応することが分かっ
た。従って、本発明によるペプチドは、タイプI糖尿病
の非常に初期の診断に用いることができる初期自己エピ
トープである。更には、本発明によるペプチドは、これ
らペプチドと反応するT細胞集団を不活性化することに
より、治療的に用いることもできる。アミノ酸配列
(I)及び(II)を有する本発明によるペプチドと反応
するT細胞サブ集団の好ましい例は、T細胞株6/7及
び6/10又は同等の結合特異性を有するT細胞であ
る。T細胞株6/7及び6/10は、ブダペスト条約の
規定に従って、1994年5月10日にドイツ,381
28ブラウンシュバイク,マッシェローダー1b通りに
あるドイツ微生物及び細胞培養物収集社 (Deutsche Sam
mlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
(DSM)に、DSMACC2172(6/7)及びD
SM ACC2173(6/10)の番号で寄託した。
【0009】アミノ酸配列(I)及び(II)は、ヒトグ
ルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)の65kdイ
ソフォームの部分領域であって、その完全アミノ酸配列
は、ブウ (Bu) ら(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89
(1992), 2115 ff)により記載された。アミノ酸配列
(I)及び(II)は、タイプI糖尿病患者の末梢血から
T細胞株を樹立し、続いてブタの脳からのGADで in
vitro 刺激し、そしてこれらT細胞株をヒトGAD配列
から誘導された合成ペプチド配列での増殖アッセイで試
験することによって見出された。本発明によるペプチド
は、化学的方法を用いる周知の合成方法によっても、適
する宿主細胞、特に大腸菌内でのこれらペプチドをコー
ドするDNA配列のクローニング及び発現による遺伝子
工学によっても作ることができる。更に、本発明は、具
体的に述べたアミノ酸配列(I)若しくは(II)の又は
図1及び2に示したアミノ酸配列の部分領域を有するペ
プチドであって、少なくとも6アミノ酸、好ましくは少
なくとも8アミノ酸、特に好ましくは少なくとも10ア
ミノ酸、最も好ましくは少なくとも15アミノ酸の長さ
を有するペプチドも包含する。
【0010】本発明によるペプチドの最小の長さは、そ
のMHC分子を認識する能力、それに特異的に結合する
能力、及び対応するT細胞レセプターと反応する能力に
より決定される。GADから誘導されてMHCに結合す
る本発明によるペプチド中の切片の最大の長さは、好ま
しくは100アミノ酸、特に好ましくは50アミノ酸、
最も好ましくは25アミノ酸である。アミノ酸配列
(I)及び(II)又はその部分領域を有するペプチドに
加えて、本発明は、前述の配列と本質的に同等のMHC
分子への結合特異性及び/又は親和性を示すアミノ酸配
列を有するペプチドであって、好ましくは、アミノ酸配
列(I)若しくは(II)又は同じように結合する疎遠物
質からのアミノ酸残基の個々のアミノ酸残基又は短い切
片の置換、欠失又は挿入によって誘導されるペプチドに
も関する。
【0011】本発明は、特に、その配列が上記のアミノ
酸配列に完全には一致しないが同じか又は密接に関連す
る“アンカー位置”を有するペプチド変異体にも関す
る。これに関連して、“アンカー位置”という用語は、
MHC分子、特にクラスDR3、DR4又はDQのMH
C分子への結合に必須のアミノ酸残基を意味する。DR
B10401結合モチーフのためのアンカー位置は、例
えば、ハマー (Hammer)ら, Cell 74 (1993), 197-203
に示されている。かかるアンカー位置は、本発明による
ペプチド中に保存されているか又は化学的に非常に密接
に関連する側鎖を有するアミノ酸残基によって随意に置
換されている(例えば、バリンによるアラニンの置換、
イソロイシンによるロイシンの置換及びその逆の置
換)。本発明によるペプチド中のアンカー位置は、上記
の特異性ペプチドの変異体をMHC分子へのそれらの結
合能力について試験することによる簡単な方法で確認す
ることができる。本発明によるペプチドは、それらが前
述のペプチドと本質的に同等のMHC分子への結合特異
性及び/又は親和性を示すことを特徴とする。アミノ酸
配列(I)又は(II)を有するペプチドから又は図1若
しくは2に示すアミノ酸配列から誘導されるペプチド
は、その親ペプチド又はその部分配列に対して、好まし
くは少なくとも30%、特に好ましくは少なくとも50
%、最も好ましくは少なくとも60%の配列相同性を有
する。
【0012】これら詳細に述べたペプチドの変異体の例
は、ヒトGAD67からの対応する相同ペプチド切片で
あり、ヒトGAD67の完全アミノ酸配列もブウら(前
記文献)によって記載されている。“本質的に同等のM
HC分子への結合特異性及び/又は親和性”という用語
には、アミノ酸配列(I)、(II)又は図1及び2に示
すアミノ酸配列に比較して向上した結合特異性及び/又
は親和性も含まれ、それは好ましくは8〜15アミノ酸
の長さを有するトランケートペプチドの場合に特に見出
される。
【0013】更に、本発明はペプチド誘導体も包含す
る。この用語には、1又は幾つかのアミノ酸が化学反応
によって誘導化されたペプチドが含まれる。本発明によ
るペプチド誘導体の例は、特にその主鎖及び/又は反応
性アミノ酸側基、例えば、フリーのアミノ基、フリーの
カルボキシル基及び/又はフリーのヒドロキシル基が誘
導化された分子である。アミノ基の誘導体の具体的な例
は、スルホン酸又はカルボン酸アミド、チオウレタン誘
導体及びアンモニウム塩、例えば塩酸塩である。カルボ
キシル基誘導体の例は、塩、エステル及びアミドであ
る。ヒドロキシル基誘導体の例は、O−アシル又はO−
アルキル誘導体である。更には、本発明によるペプチド
誘導体という用語には、1又は幾つかのアミノ酸が天然
に存在するか又は非天然に存在する20の“標準”アミ
ノ酸のアミノ酸同族体によって置換されたペプチドも含
まれる。かかる同族体の例は、4−ヒドロキシプロリ
ン、5−ヒドロキシリシン、3−メチルヒスチジン、ホ
モセリン、オルニチン、β−アラニン及び4−アミノ酪
酸である。
【0014】アミノ酸配列(I)又は(II)を有するペ
プチドと本質的に同等のMHC分子への結合特異性及び
/又は親和性を有するが、これらペプチドとは対照的
に、T細胞を活性化させずにむしろT細胞内にアネルギ
ー状態をもたらすペプチドが特に好ましい。本発明は、
MHC結合性ペプチド切片がより大きなポリペプチド単
位の成分であって、そのMHC結合性ペプチドとそのポ
リペプチド単位の残部の間の連結基が予め決められた破
断点、例えば、プロテアーゼ開裂部位を有するポリペプ
チドも包含する。本発明の更なる主題は、シグナル又は
マーカー基、例えば、蛍光マーカー基(例えば、ローダ
ミン、フィコエリトリン)、ジゴキシン、ビオチン、放
射性基又はトキシン基(例えば、リシン、コレラトキシ
ン等)を生成する物質を保持するペプチド又はペプチド
誘導体である。本発明によるペプチドをマーカー基にカ
ップリングさせると、このペプチドが in vivo 又は i
n vitro (例えば、画像化)適用のための診断剤として
又は治療剤として用いることができるようになる。更
に、本発明によるペプチドは、例えば、MHC分子への
結合にとって重要な配列がスペーサー領域によって相互
に離されている環状型又はオリゴマー型で存在すること
もできる。
【0015】本発明は、前述のペプチド又はペプチド誘
導体と本質的に同等のMHC分子への結合特異性及び/
又は親和性を示すペプチド擬似物質にも関する。ペプチ
ド擬似物質又はペプチド擬似体は、MHC分子とのそれ
らの相互作用に関してペプチドに代わることができ、か
つ、天然のそのペプチドに比較して増加した代謝安定
性、向上した生物学的利用能及びより長い作用期間を有
することのできる化合物である。ペプチド擬似体の製造
方法は、ジャイアニス(Giannis) とコルター (Kolter),
Angew. Chem. 105 (1993), 1303-1326 、リー(Lee)
ら, Bull. Chem. Soc. Jpn. 66 (1993), 2006-2010 及
びドルシュ (Dorsch) ら, "Kontakte"(ダルムシュタッ
ト)(1993) (2), 48-56 に記載されている。これによ
り、本発明によるペプチド擬似物質の製造に関するこれ
らの文献の開示内容を参照したものとする。
【0016】本発明は、更に、本発明による少なくとも
1つのペプチド、ペプチド誘導体又はペプチド擬似体
と、少なくとも1つのMHC分子又はMHC分子のペプ
チド結合性誘導体とを含む複合体に関する。この複合体
において、ペプチド、ペプチド誘導体又はペプチド擬似
体は、好ましくは少なくとも10-7l/モル、特に好ま
しくは10-8〜10-9l/モルの結合定数でMHC分子
又はMHC分子のペプチド結合性誘導体に結合してい
る。一方、このペプチド、ペプチド誘導体又はペプチド
擬似体は、例えば、光リンカーにより又は共有結合性遺
伝的ペプチド−MHC融合体として、共有結合でMHC
分子にカップリングすることもできる。そのようなペプ
チド−MHC融合タンパク質は、好ましくはHLA−D
Rβ鎖及び遺伝的にそれと融合している自己反応性ペプ
チドを含有する。この複合体は、特に好ましくはMHC
クラスII分子又はそのペプチド結合性誘導体を含有す
る。
【0017】MHCクラスII分子は、好ましくは、DR
タイプ、例えば、DR1、DR2、DR3又はDR4タ
イプの分子である。MHCクラスII分子は、特に好まし
くはサブタイプDR B1 0101、DR B1 0
301、DR B1 0401、DR B1 040
2、DR B1 0404、又はDR B1 1601
の分子である。サブタイプDR B1 0101又はD
R B1 0401のMHCクラスII分子が最も好まし
い。T細胞株6/7(DSM ACC2172)は、ア
ミノ酸配列(I)の自己反応性ペプチドでDR B1対
立遺伝子0401及び0101及び/又は1601の存
在下で増殖する。DR B1対立遺伝子0401の存在
下での増殖は、アミノ酸配列(II)を有する自己反応性
ペプチドで見出される。T細胞株6/10(DSM A
CC2173)は、アミノ酸配列(I)及び(II)の自
己反応性ペプチドでDR B1対立遺伝子0401の存
在下で増殖する。上記サブタイプのMHCクラスII分子
をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、コレル (Co
rell) ら(Mol. Immunol. 28 (1991), 533-543)に公表
されている。これにより、これら刊行物をこれによって
参照したものとする。
【0018】“MHC分子のペプチド結合性誘導体”と
いう用語は、天然MHC分子のタンパク質分解により又
は組換えDNA技術により作られ、そしてそれらのペプ
チド結合性を本質的に保存しているMHC分子の断片を
含む。更に、この用語は、ペプチド結合を司るMHC部
分に加えて更なるポリペプチド成分も含有する融合タン
パク質を包含するとも理解される。本発明によるペプチ
ド−MHC複合体は、好ましくは、無ペプチドMHC分
子又はMHC分子誘導体と本発明によるペプチド、ペプ
チド誘導体又はペプチド擬似体との結合によって作られ
る。無ペプチドMHC分子の製造は、例えば、天然MH
C分子の折り畳みを解き放して結合しているペプチドを
解離させ、そして空になったMHC分子を折り畳み直す
ことによって行われる(ドーンマイヤー (Dornmair) と
マクコネル (McConnell), Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A. 87 (1990), 4134-4138及びWO91/14701
を参照のこと)。
【0019】一方、無ペプチドMHC分子は、MHC分
子又はその誘導体の組換え産生によっても得ることがで
きる。この例は、線維芽細胞内でのMHCクラスII分子
の発現(ジャーマイン(Germain) とマリセン (Malisse
n), Ann Rev. Immunol. 4 (1990), 281-315)並びにC
HO細胞内での膜アンカーを有さない可溶性MHCクラ
スII分子誘導体の発現(ウェットシュタイン(Wettstei
n) ら, J. Exp. Med. 174(1991), 219-228、ブエロウ
(Buelow) ら, Eur. J. Immunol. 23 (1990), 69-76 )
及び昆虫細胞内でのバキュロウィルス発現系による発現
(スターン(Stern)とウィリイ (Wiley), Cell 68 (199
2), 465-477 ;シャール (Scheirle) ら, J.Immunol. 1
49 (1992), 1994-1999 )である。MHCクラスI分子
は、CHO細胞内(ファーネストック (Fahnestock)
ら, Science 258 (1992), 1658-1662 )、昆虫細胞内
(ジャクソン(Jackson) ら, Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 89 (1992), 12117-12120;マサムラ(Matsamura)
ら, J. Biol. Chem. 267 (1992), 23589-23595)及び
線維芽細胞内(マージ (Mage) ら, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 89 (1992), 10658-10661)でも発現されて
いる。
【0020】更に、無ペプチドMHC分子を大腸菌内で
発現できることも知られている(パーカー (Parker)
ら, Mol. Immunol. 29 (1992), 371-378;ザング(Zhan
g) ら,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1992), 840
3-8407;ガルボクジ (Garboczi) ら, Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 89 (1992), 3429-3433;アルトマン (A
ltman) ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (199
3), 10330-10334)。これにより、本発明のためにこれ
ら刊行物に記載されたMHC分子又はMHC分子誘導体
の組換え発現の技術を参照したものとする。本発明によ
る複合体のMHC成分は、好ましくは組換えMHC分子
又はそのペプチド結合性誘導体であり、特に好ましくは
膜アンカーが部分的又は完全に欠如した可溶性MHC分
子誘導体である。本発明による自己反応性を提示するM
HC分子を同定するには、ドナーの抗原提示細胞を本発
明による標識型のペプチドと共にインキュベートし、好
ましくは最初に、天然MHC分子の変性によって結合し
ているペプチドを解離させる。続いて、これら標識MH
C−ペプチド複合体をMHC分子のフレームワーク特異
性決定基に向けられたサブタイプ特異性抗体で免疫沈降
させ、そして標識ペプチドの存在によって同定すること
ができる。別に、このドナーのEBV(エプスタイン−
バーウィルス)形質転換B細胞を抗原提示細胞として用
いてもよい。
【0021】組換えMHC分子誘導体からの本発明によ
る複合体の製造は、例えば、MHC分子、例えば、MH
C DR3、DR4又はDQ分子のα及びβ鎖の可溶性
部分のDNA断片を、ドナーのEBV形質転換B細胞株
からのcDNAであって対応するMHC分子を発現する
cDNAを鋳型として用いるPCRにより単離するよう
な方法で行うことができる。この工程では、精製の助け
となるもの、例えば、オリゴヒスチジンセグメント(例
えば、ヘキサヒスチジンセグメント)を、PCRプライ
マーの妥当な選択によってα及びβ鎖のC末端に導入す
るのが好ましい。続いて、そのPCR産物を大腸菌内に
サブクローン化し、封入小体として発現させることがで
きる。これら封入小体は、既知の方法により可溶化する
ことができ(大腸菌内でのMHC分子の発現に関する前
記文献)、そしてそれらMHCタンパク質を金属キレー
トアフィニティクロマトグラフィーによって精製するこ
とができる。続いて、α及びβサブユニットをペプチド
の存在下で復元する。本発明によるペプチド−MHC複
合体は、上記のようなマーカー基も有することができ、
その場合、マーカー基は既知の方法によってその複合体
のペプチド成分並びにMHC成分に結合させることがで
きる。
【0022】本発明の更なる主題は、共有結合又は非共
有結合相互作用によって結合した少なくとも2つのMH
C分子又はMHC分子誘導体を含有するオリゴマー化し
たペプチド−MHC複合体である。そのようなオリゴマ
ー化ペプチド−MHC分子複合体の既知の(MHC分子
に関して)単量体である複合体に比較した利点は、それ
がより高い親和性を有するために向上した診断的及び/
又は治療的効力を有することである。本発明の1態様に
おいては、そのようなオリゴマー化複合体は、単量体の
ペプチド−MHC複合体の化学的カップリング試薬、例
えば、N−スクシンイミジル−3(2−ピリジルチオ)
プロピオネート、3−マレイミド−ベンゾイル−N−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル、マレイミドヘキサノ
イル−N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビス
(マレイミドメチル)エーテル、ジスクシンイミジルス
ベレート、グルタルジアルデヒド等による共有架橋結合
による、既知の方法によって作ることができる。任意
に、ペプチド成分又はMHC成分の個々のアミノ酸を、
独特なカップリング試薬がこの位置に好ましく攻撃する
ように修飾することも可能である。かくして、SHリン
カーによるか又はアミノ基を介するカップリングを、追
加のシステイン又はリシン残基を導入することによっ
て、タンパク質成分の場合には組換え的手段により、ペ
プチド成分の場合には化学合成により行うことができ
る。
【0023】本発明の更なる態様においては、オリゴマ
ー化ペプチド−MHC複合体を、MHC分子に結合する
ペプチド成分をオリゴマーとして、即ち、少なくとも2
つのMHC結合領域を含有するペプチド分子であってM
HC分子への結合に重要な配列がスペーサー領域によっ
て相互に離されているペプチド分子として用いるような
方法で作ることができる。これらスペーサー領域は、通
常は10〜15のアミノ酸から構成される。グリシン、
アラニン、セリン、プロリンの如き小さな親水性アミノ
酸又はそれらの組み合わせを用いる。無ペプチドMHC
分子をこれらペプチドオリゴマーの存在下で復元する
と、非共有結合相互作用を介してオリゴマー化ペプチド
成分により架橋されたMHC分子を含有する本発明によ
るオリゴマー化複合体が生成する。更に、オリゴマー化
ペプチド−MHC複合体を、組換え技術で産生させたM
HC分子を修飾することよって作ることができる。かく
して、MHCクラスII分子の組換えα又はβ鎖の発現用
ベクターの構築の間に、抗体により認識されるエピトー
プをコードする遺伝子セグメント内に、好ましくはC−
末端にクローン化することが可能である。この抗体は、
IgG型のものであってもよいが、好ましくはIgM型
のものである。次いで、これら復元した単量体であるペ
プチド−MHC複合体を、導入したエピトープを認識す
る抗体と共にインキュベートして、幾つかの抗体と幾つ
かのペプチド−MHC複合体から構成される非共有結合
架橋免疫複合体を生成させる。エピトープをコードする
DNAセグメントの、MHC分子のα又はβ鎖をコード
するDNA断片内への導入は、周知の分子生物学的技術
によって、例えば、制限部位への挿入又は部位特異的突
然変異誘発によって行うことができる。
【0024】本発明によるオリゴマー化ペプチド−MH
C複合体は、好ましくは、アミノ酸配列(I)、(I
I)、図1及び2に示したアミノ酸配列、それらの部分
領域及び/又はそれらから誘導したアミノ酸配列を含む
ペプチド、又はペプチド誘導体又はそのペプチド擬似体
を含有する。このオリゴマー化複合体は、好ましくは、
タイプI糖尿病の診断薬又は治療薬として用いることが
できる。従って、本発明は、ペプチド、ペプチド誘導
体、ペプチド擬似体及び/又はペプチド−MHC複合体
を活性成分として含有し、所望により通常の医薬用添加
剤を共に含有する医薬組成物にも関する。この組成物
は、補助刺激成分、例えば、IL−2及びIL−4の如
きサイトカイン及び/又はT細胞上の表面分子CD−2
8に結合できる表面抗原B7(ウィス−コレイ (Wyss-C
oray) ら, Eur. J. Immunol. 23 (1993), 2175-2180 ;
フリーマン(Freeman) ら, Science 262 (1993), 909-91
1)を更に含有してもよい。この補助刺激成分の存在は、
この組成物の治療効果を向上させ及び/又は修飾するこ
とができる。更には、本発明は、免疫系に影響を及ぼす
疾患若しくはその疾患への個体素因の診断薬又は腫瘍性
疾患若しくは腫瘍性疾患への個体素因の診断薬を製造す
るための、特に自己免疫疾患若しくは自己免疫疾患への
個体素因の診断薬、例えば、糖尿病タイプI又はタイプ
II、好ましくは糖尿病タイプIの診断薬を製造するため
の、ペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド擬似体及び/
又はペプチド−MHC複合体を含有する医薬組成物の使
用に関する。
【0025】しかしながら、他の自己免疫疾患の場合に
は、類似の診断的応用も可能である。かかる自己免疫疾
患の例は、ミエリン塩基性タンパク質又はプロテオリピ
ドタンパク質に対する反応性T細胞を確認できる多発性
硬化症;コラーゲンタイプII、サイトケラチン類及びH
sp65に対する反応性T細胞を確認できる慢性関節リ
ウマチ;サイロイドペルオキシダーゼに対する反応性T
細胞を確認できるバセドウ病である。一般に、診断的応
用は、免疫系に影響を及ぼす全ての疾患に可能であり、
例えば、動脈硬化症の場合にも可能である。この場合、
この疾患は、熱ショックタンパク質Hsp65に対する
免疫応答と関係することが分かっている(クス (Xu)ら,
Lancet 341, 840 (1993), 255-259)。更なる応用は、
腫瘍抗原に反応するT細胞の診断的検出である。この例
は、メラノーマ患者から単離されたメラノーマ関連抗原
MAGE1に対するT細胞である(ファン・デル・ブル
ゲン(van der Bruggen) ら, Science 254 (1991), 1643
-1647)。本発明によるオリゴマー化複合体を用いて、細
胞量が不十分であるために従来の方法によっては未だ腫
瘍が検出できない段階でこれらT細胞を検出することが
できる。更には、特異的に反応するT細胞の検出を用い
て、抗腫瘍ワクチン接種を追跡することもできる。
【0026】従って、本発明は、特異性T細胞サブ集団
の確認方法であって、好ましくは体液、例えば、全血か
ら誘導したT細胞を含有するサンプルを、本発明による
ペプチド、ペプチド誘導体、ペプチド擬似体、及び/又
は本発明による複合体に接触させ、そしてそのペプチド
又は複合体とのT細胞の反応を確認することを特徴とす
る方法にも関する。複合体又はペプチドとのT細胞の特
異的反応は、例えば、放射能の取り込みによって測定で
きるT細胞増殖の増加によって検出できる。一方、この
T細胞の反応を、標識ペプチド又は複合体の使用によっ
て直接確認することもできる。この態様では、ペプチド
又は複合体は、好ましくは、それにカップリングした蛍
光マーカー基と共に用いられる。その評価は、例えば、
T細胞をT細胞特異性抗体とカップリングさせた第1蛍
光マーカーと接触させてから第2蛍光マーカーとカップ
リングさせたペプチド−MHC複合体と接触させ、そし
て二重標識細胞の存在を蛍光光度分析により確認する、
FACS分析によって行うことができる。このようにし
て、本発明によるペプチド又はペプチド誘導体及び/又
は本発明によるペプチド−MHC複合体とのその反応性
によって特徴付けられるT細胞サブ集団を確認する。血
液中での特異性T細胞集団の濃度が低いため、この方法
の第1段階として前活性化T細胞の選択を行うのが好ま
しい。例えば、IL−2とのインキュベーション及び/
又はIL−2レセプター抗体とのインキュベーションに
よりIL−2レセプター陽性T細胞の選択的濃縮を行
い、続いて、例えば、イムノマグネチック法を用いて抗
体結合細胞を分離するのである。一方、この前活性化細
胞の選択は、T細胞のペプチド又は複合体との接触後に
行ってもよい。
【0027】この方法に手を加えると、前活性化自己反
応性T細胞、即ち、表面マーカーとしてIL−2レセプ
ターを有するT細胞の、非活性化自己反応性T細胞、即
ちIL−2レセプターを有さないT細胞に対する比率
も、測定することができる。この方法は、特に、タイプ
I糖尿病を診断するのに用いることができ、免疫系に影
響を及ぼす他の疾患の診断又はかかる疾患への個体素因
の診断にも用いることができる。本発明は、更に、免疫
系に影響を及ぼす疾患の治療薬又は予防薬を製造するた
めの、本発明によるペプチド、ペプチド誘導体、ペプチ
ド擬似体、及び/又はペプチド−MHC複合体を含有す
る医薬組成物の使用に関する。本発明によるペプチド及
び本発明によるペプチド−MHC複合体の治療的応用に
は、例えば、トキシンにカップリングさせたペプチド又
はペプチド−MHC複合体を用いることが可能であり、
一方、T細胞レセプターに結合するのを可能にするがT
細胞を活性化させることはないペプチド、即ち、アネル
ギー化作用を有するペプチドを単独で用いるか又はこの
複合体の成分として用いることも可能である。
【0028】かかるアネルギー化ペプチド類似体の治療
的作用は、T細胞を活性化するためには、そのT細胞レ
セプター(TCR)がクラスI又はクラスIIのMHC抗
原によって提示されるペプチドと相互作用しなければな
らないという事実による。このプロセスにおいて、その
ペプチドのアンカー位置におけるアミノ酸は特にMHC
分子への結合を司っているのに対して、そのペプチド中
の他のアミノ酸はTCRとの相互作用に寄与しており、
かくしてT細胞が刺激されるのである。従って、ペプチ
ド中のアミノ酸を置換することにより、アンカー位置の
存在のために依然としてMHC分子に結合するが一方で
はT細胞を部分的にしか又は全く活性化しないペプチド
類似体を作ることが可能である(例えば、スローン−ラ
ンカスター(Sloan-Lancaster) ら, Nature 363 (1993),
156-159)。かかるペプチド類似体は、例えば、特定の
表面分子(例えば、IL−2レセプター、LFA−1)
の発現をより高レベルに上げるが増殖又はサイトカイン
発現を起こさないという作用を有することができる。そ
のようなペプチド類似体と相互作用するT細胞は、いわ
ゆるアネルギー状態に変換される、即ち、それらは、免
疫原性ペプチドでのその後の通例の刺激を受けた後でさ
えもはや増殖することができない。このアネルギー状態
は少なくとも7日間続くので、自己免疫疾患の処置にお
いて治療的に利用することができるのである。
【0029】本発明の更なる治療的側面は、ペプチド又
はペプチドとMHC分子の複合体を抗原として使用でき
ることである。そのような抗原は、この場合において、
免疫原、即ち、免疫応答を刺激する物質として、又は寛
容原、即ち、免疫寛容を起こさせる物質として作用する
ことができる。免疫原としての応用を用いて、例えば、
抗原化した腫瘍に対するワクチン接種に用いることがで
きる。この目的のためにこれまで用いられてきた全腫瘍
細胞の代わりに、T細胞によって認識される腫瘍特異的
ペプチドであって対応するMHC分子との複合体中で、
特にオリゴマー化複合体の形で注射して、その腫瘍に対
するT細胞応答をもたらすことが可能である。免疫刺激
を増加するには、その複合体を追加の刺激性物質と組み
合わせて投与することも可能である。本発明によるペプ
チド−MHC複合体に任意にそして好ましくは共有結合
で結合しているIL−2又はIL−4の如きサイトカイ
ンが、例えば、この目的に適している。更なる可能性
は、この複合体をT細胞活性化のための補助成分、特に
抗原提示細胞に必須の表面分子、例えば、表面分子B7
と結合させることである。好ましい治療用製剤は、ペプ
チドを保持するMHC分子を人工の小胞、例えば、任意
に更なる膜結合分子、例えば、B7及び/又は固定化サ
イトカインを保持していてもよい脂質小胞の中に組み入
れたものである。
【0030】本発明は、更に、本発明によるペプチド又
はペプチド−MHC複合体と反応するT細胞サブ集団の
単離方法に関する。そのような方法では、例えば、前も
って患者から採集しておいた体液由来のT細胞含有サン
プルを、本発明によるペプチド又は本発明によるペプチ
ド−MHC複合体に接触させ、該ペプチド又は複合体と
反応するT細胞を同定し、そして所望によりそれらを他
のT細胞と分離する。この場合、T細胞をペプチド又は
複合体と接触させる前及び/又は後に、前活性化T細
胞、即ち、IL−2レセプターを有するT細胞を選択す
ることも可能である。そのような方法では、ペプチド又
はペプチド−MHC複合体をキャリヤー上に固定化した
形で用いることができる。これにより、陽性に反応する
T細胞集団を他のT細胞から分離するのが簡単になる。
再刺激によって、このようにして単離したT細胞サブ集
団からT細胞株を樹立することができる。次いで、これ
ら自己反応性T細胞株を用いて患者を免疫感作すること
ができる。
【0031】タイプI糖尿病の格別な免疫療法は、ま
ず、自己抗原、例えば、IDDM患者からのGAD65
に対する特異性T細胞株を単離することを含む。次い
で、そのT細胞株の優れた特異性を確認する、即ち、自
己反応性ペプチドを同定する。優勢なペプチド、即ち、
単離したT細胞株の幾つかが反応するペプチドを認識す
るT細胞株をあとの患者のワクチン接種のために選択す
る。これらは、特に、アミノ酸配列(I)又は(II)を
有するペプチドを認識するT細胞株である。患者におい
て明らかに優勢であるペプチドがない場合には、あとの
接種のために幾つかのT細胞株を混合しなければならな
い。活性化分子の、特にT細胞レセプターの良好な発現
を確保するために、これら選択されたT細胞クローンを
接種前に再度抗原提示細胞及び適当なペプチドで刺激す
る。次いで、例えば、熱処理及び/又は好ましくは40
00〜10000rad、特に好ましくは約8000r
adの線量の放射性照射によってT細胞株を不活性化
し、そしてそれらが得られたその患者に好ましくは1×
107 〜5×107 の細胞数を用いて皮下注射する。通
常は6〜12カ月の期間をかけて少なくとも3回の注射
を行う。
【0032】その後に、接種物に対する患者のT細胞応
答を試験することができる。これを行うために、その患
者の末梢血リンパ球(PBL)を、例えば、フィコール
比重差遠心によって単離し、そしてその接種物により起
こる増殖を標準的増殖試験で試験する。免疫感作が成功
した後は、接種物に応答した患者のPBLの相当な増殖
を検出することが可能になる筈である。免疫感作の成功
を更にコントロールするには、免疫感作の途中の患者の
GAD反応性T細胞の度数を測定する。これは、例え
ば、GADとのインキュベーション後に例えば4000
radで照射した自家刺激細胞を用いる標準的限界希釈
法によって行うことができる。免疫感作がうまく行け
ば、自己反応性T細胞の度数が有意に減少する。調節性
T細胞により認識される接種物のT細胞上の表面構造体
が更に制限された後は、調節性T細胞の部分構造体で、
例えば、T細胞レセプターのセグメントで免疫感作する
ことも可能である。一方、抗腫瘍ワクチン接種の場合に
は、分割できるT細胞を再注射することができる。そう
すれば、腫瘍細胞に対する患者の活性な免疫感作を導く
ことができる。
【0033】特異性T細胞サブ集団を同定又は活性化/
抑制するための診断法及び治療法では、MHC−ペプチ
ド複合体の作用を刺激する抗イディオタイプ抗体も、本
発明によるペプチド又はペプチド−MHC分子の代わり
に用いることができる。かかる抗体は、特定のペプチド
に対する特異性T細胞サブ集団を抗体産生用免疫原とし
て(例えば、マウス内で)用いることによって、又はM
HC−ペプチド複合体に対する第1抗体を最初に産生さ
せてからその第1抗体に対する抗イディオタイプ抗体を
産生させることによって容易に得ることができる。従っ
て、本発明によるペプチド若しくはペプチド誘導体に対
する又は本発明による複合体に対する抗体(第1抗体)
であって、該ペプチド、ペプチド誘導体又は複合体で免
疫感作し、その免疫感作によって産生する抗体、好まし
くはコーラー (Kohler) とミルスタイン (Milstein) の
方法によって産生されるモノクローナル抗体又はその更
なる発達物を単離することによって得ることができる抗
体も、本発明の主題である。
【0034】最後に、本発明は、本発明のペプチド又は
ペプチド誘導体又は複合体に向けられた第1抗体で免疫
感作し、そしてその免疫感作によって産生する抗イディ
オタイプ抗体を単離することによって得ることができる
第1抗体に対する抗イディオタイプ抗体にも関する。本
発明のなお更なる主題は、本発明による自己反応性ペプ
チド、ペプチド誘導体若しくはペプチド擬似体又はその
ペプチドとMHC分子との複合体と反応するT細胞であ
る。好ましい例は、T細胞株6/7(DSM ACC2
172)又は6/10(DSM ACC2173)由来
のT細胞又は同等のT細胞レセプター結合特異性を有す
るT細胞、即ち、MHC分子により提示されるペプチド
又はアミノ酸配列(I)及び/又は(II)及び/又はこ
れらアミノ酸配列の部分領域を有するペプチド誘導体を
認識するT細胞である。
【0035】図1は、本発明による自己反応性アミノ酸
配列である。図2は、本発明による自己反応性アミノ酸
配列である。図3は、ペプチドプールでのT細胞株6/
7増殖アッセイの結果である。図4は、ペプチドプール
でのT細胞株6/10増殖アッセイの結果である。図5
は、プール7及び11からの個々のペプチドでのT細胞
株6/7の増殖アッセイの結果である。図6は、プール
7及び11からの個々のペプチドでのT細胞株6/10
の増殖アッセイの結果である。図1〜6を参照しなが
ら、以下の実施例により本発明を更に説明する。
【0036】
【実施例】実施例1 GAD特異性T細胞株の樹立 1.一次刺激 末梢血リンパ球(PBL)をタイプI糖尿病患者のED
TA血液からフィコール比重差遠心により単離した。こ
れら細胞をRPMI培地で2回洗浄してから、RPMI
1640、5%ヒト血清、2mMグルタミン及び100
U/mlペニシリンと100μg/mlストレプトマイ
シンから構成される培地に加えた。100000細胞に
相当する100μl細胞懸濁液を96ウェル丸底プレー
トの各ウェルに分配した。その後、ブタGAD(SW−
GAD)を2.5μg/mlの最終濃度になるように添加
した。これら細胞をインキュベーター内で37℃/7%
CO2 で3〜4日間インキュベートした。この時間の経
過後、100μlのIL−2(30U/ml)を添加し
た。更に3〜4日してから、全ての培養混合液から10
0μlを吸引除去して再度100μlのIL−2(30
U/ml)を添加した。これを3〜4日毎に繰り返し
た。
【0037】2.再刺激 最初の再刺激を一次刺激の開始後14日目に行った。こ
れを行うために、一次刺激に比較して2倍数の自家PB
Lをフィコール法により単離して、培地中で2×106
/mlの細胞濃度に調節した。これら刺激性細胞の半分
を抗原SW−GAD(最終濃度5μg/ml)(抗原パ
ルス)と共に37℃/7%CO2 で2時間インキュベー
トした。他方の半分は、抗原なしの同じ条件下で培地と
だけインキュベートした。続いて、全ての刺激性細胞を
400radで照射した。次いで、これら刺激性細胞
を、抗原を含有する刺激性細胞有りのウェルが抗原なし
の刺激性細胞有りのウェルと常に隣接するようなやり方
で96ウェル丸底プレートに配分した(100000細
胞/ウェル)。
【0038】続いて、T細胞を一次刺激試料から調製し
た。これを行うために、一次刺激試料からの上澄み液を
吸引除去してプレート内の細胞を1回に付き100μl
の洗浄用培地(ダルベッコ改良イーグル培地=DME
M)で2回洗浄した。これら洗浄の間に細胞をプレート
内で400gで遠心分離した。続いて、細胞をそれぞれ
について100μlの培地に加え、それらの50μlを
それぞれについて再刺激プレートの2つの隣接するウェ
ルに配分した。このようにして、抗原を含む1ウェルと
抗原を含まないその隣接ウェル内でT細胞をインキュベ
ートしたので、再刺激物の抗原特異性を追跡するのが可
能であった。再刺激の開始後2日又は3日目から、顕微
鏡により増殖を評価するのが可能になった。このプロセ
スでは、それら微小培養ペアだけを、抗原が存在するウ
ェルにおいてのみ増殖が起こるということで、関連ある
ものとみなした。4日目から100μlのIL−2(3
0U/ml)を各培養ウェルに順次添加した。14日目
まで約50%の培地を3〜4日毎にIL−2(30U/
ml)と交換した。生育が良好である場合は、培養物を
幾つかの96ウェルプレートに分けた。後の再刺激で
は、それらをより大きなウェルに配分することも可能で
あった。再び新しくした再刺激は、上述の方法により2
週間毎に行った。3回目の再刺激以降に微小培養物の特
異性が増殖試験において確認された。
【0039】3.SW−GADでの増殖試験 全ての試験は、同一の試料で少なくとも二重に行った。 a)刺激性細胞:HLAクラスII抗原に関して同一であ
る自家PBL又は正常ドナーのPBLを刺激性細胞とし
て用いた。これらPBLを「2.再刺激」に記載した抗
原と共にインキュベートし、4000radで照射して
96ウェルプレートに配分した(100000細胞/ウ
ェル)。 b)T細胞:用いたT細胞は、常に再刺激期間の最終段
階から誘導したものであった。それらをDMEMを用い
て抗原及びIL−2が無くなるまで3回洗浄して600
0細胞/ウェルに分割した。このようにして単離したT
細胞株6/7及び6/10は、ブダペスト条約の規定に
従ってDSMにDSM ACC2172及びDSM A
CC2173の番号で寄託した。SW−GADとのイン
キュベーションに加えて、コントロールをGADなしで
インキュベートした。37℃/7%CO2 で3〜4日経
過した後、1μCi 3H−チミジンを添加して更に16
〜20時間インキュベートした。その後、細胞採取器具
によって細胞をグラスファイバーフィルター上に移し、
取り込まれた放射能をβ計数器で測定した。表1は、S
W−GADでの増殖試験の典型的な結果を示す。
【0040】
【表1】 SW−GADでのT細胞株6/7及び6/10の増殖試験の結果 ────────────────────────────────── コントロール cpm 細胞株 抗原なし SW−GAD ────────────────────────────────── 6/7 129 9373 6/10 117 5222 ──────────────────────────────────
【0041】4.H−GAD配列から誘導したペプチド
での増殖試験 少なくとも4再刺激サイクルによって拡大しかつ増殖試
験でSW−GADと反応したT細胞株を、H−GADの
相重複するペプチドで試験した。これら実験の目的は、
T細胞によって認識されるH−GADのエピトープを規
定することである。これを行うために、まず、H−GA
Dの相重複する20量体ペプチドを合成した(重複領域
10アミノ酸,合計で59の異なるペプチド)。それぞ
れの場合において、これらペプチドの4〜5を混合して
1つのプールを形成して、それぞれについて18μg/
mlの最終濃度になるように刺激性細胞に添加した(刺
激性細胞は3aに記載した通りに調製した)。これら刺
激性細胞の更なる処理は、3aに記載した通りに行っ
た。続いて、微小培養ウェル当たり6000〜20,00
0のT細胞を添加した。更なる操作は、3bに記載した
のと類似の操作であった。
【0042】図3及び4は、ヒトGAD65kdのペプ
チドプールを用いるT細胞株6/7及び6/10の増殖
アッセイの結果を示す。両方のT細胞株ともプール11
からのペプチドで大きく増殖している。それより小さい
が有意な増殖がプール7でも認められる。図5及び6
は、プール7及び11からの10μg/mlの個々のペ
プチドでのT細胞株6/7及び6/10の増殖アッセイ
の結果を示す。両方のT細胞株ともペプチド5G1(ヒ
トGAD65のアミノ酸266〜285に対応する)で
有意な増殖を示しており、ペプチド5F3(ヒトGAD
65のアミノ酸306〜325に対応する)ではそれよ
り小さいが有意な増殖を示している。
【0043】実施例2 抗原特異性T細胞集団の単離法及び確認法 抗原特異性Tリンパ球、特に自己抗原に向けられたもの
は、非常に少ない数(期待度数10-5〜10-6)で末梢
血中に存在するので、まず、選択工程によってin vivo
前活性化T細胞を濃縮するのは当然である。これは2
つの方法によって行うことができる。 1.IL−2とのインキュベーションによる in vivo
前活性化T細胞の拡大 これを行うために、フィコール比重差遠心によってPB
Lを単離して、IL−2を含有する細胞培地(RPMI
1640/5%ヒト血清/30U/mlIL−2)中で
2×106 細胞/mlに調節した。これら細胞の200
μlアリコートを48ウェルプレート中に配分して7日
間インキュベートした。4日後、IL−2をもう1回添
加した。前活性化T細胞は高親和性IL−2レセプター
を発現するので、in vivo 前活性化T細胞はこの刺激期
間内に選択的に増殖し、一次培養物中に蓄積した。刺激
期間完了後、細胞を個々のウェル中で洗浄し、計数し、
そして増殖試験に用いた。
【0044】2.イムノマグネチック分離法による in
vivo 前活性化T細胞の濃縮 これを行うために、フィコール単離PBLを、高親和性
IL−2レセプターに対するモノクローナル抗体と共に
インキュベートした(7×106 PBL/ml;10μ
g/ml抗IL−2レセプター抗体(ベーリンガー・マ
ンハイム);4℃で30分間)。続いて、この細胞懸濁
液を氷冷RPMI1640/10%ヒト血清(HS)で
2回洗浄(400g/10分間)してから、この懸濁液
を1〜3×107 /mlの細胞密度に調節した。ヒツジ
抗マウス抗体にカップリングしたダイナール(Dynal) 社
からのダイナビーズ (Dynabead) M−280をこれに添
加した(ダイナビーズの標的細胞に対する比率は約10
〜15)。この懸濁液をローラー上で非常にゆっくりと
4℃で動かした。その後、この懸濁液をRPMI/10
%HSで10倍に希釈し、前もって冷やしておいた磁性
粒子濃縮器(MPC)内に1〜2分間放置した。IL−
2レセプターを保持する樹脂処理T細胞を磁石により固
定化した後、その上澄み液を吸引除去し、インキュベー
ション容器をMPCから出し、そして残った細胞をRP
MI/10%HS中に再懸濁した。標的細胞の分離をも
う1度MPC内で行った。この洗浄工程をもう1度繰り
返した。続いて、分離した細胞を培地中に再懸濁して細
胞数を1×107 /mlに調節した。磁性ビーズを解離
用抗体による既知の方法によって取り除いた。続いて、
2.1又は2.2による方法によって濃縮した前活性化T細
胞を自己抗原ペプチド又はペプチド/MHC複合体に対
する活性について試験した。これにも幾つかの方法があ
る。
【0045】3.抗原としての照射刺激性細胞とペプチ
ドでの増殖試験 最初に自己刺激性細胞をフィコール単離PBLから調製
した。これら刺激性細胞を細胞培地中106 細胞/ml
の濃度に調節し、ペプチド(最終濃度10μg/ml)
と共に37℃/7%CO2 で2時間インキュベートし
た。その後、これら刺激性細胞を4000radで照射
し、続いて100000細胞/ウェルの細胞数で96ウ
ェル丸底プレートに配分した。2.1又は2.2から得られ
た100000の in vivo 前活性化T細胞をそれぞれ
についてこれに添加して37℃/7%CO2 で4日間イ
ンキュベートした。次いで、この試料容量の半分をIL
−2(30U/ml)と交換した。更に4日間してから
これをもう1度繰り返した。微小培養を開始してから1
2日目に本番の増殖試験を行った。これを行うために、
微小培養物をまずDMEMで2回洗浄して抗原とIL−
2を除いた。それぞれの培養物を4つに分割して100
000自家照射PBLの存在下で3日間、ペプチドパル
スを含む場合と含まない場合について、同じものを二重
にインキュベートした(37℃/7%CO2)。この期間
経過後、 3H−チミジンを添加し、そして更に16〜2
0時間後に取り込まれた放射能を測定した。
【0046】4.オリゴマー化ペプチド/HLA複合体
による標識による自己抗原反応性T細胞の直接検出 方法2.2に従って濃縮した in vivo 前活性化T細胞を
これに用いた。これら細胞をRPMI/10%HS中で
106 細胞/mlの濃度に調節し、そして蛍光標識を備
えたオリゴマー化HLA−ペプチド複合体と共に4℃で
30分間インキュベートした。続いて、これら細胞を氷
冷した細胞培地で2回洗浄した。蛍光標識細胞集団の分
析はフロー・サイトメーターで行った。
【0047】実施例3 規定した自己反応性ペプチドを提示するMHC分子の同
定 これを行うために、まず、例えば、ボルトン (Bolton,
A.E.) とハンター (Hunter, W.M.) の方法(ボルトンと
ハンター, Biochem. J. 133 (1993), 529-531)に従っ
てペプチドを 125Iで標識した。次いで、検査するMH
C型を有するドナーの2〜5×106 PBLを 125I−
標識ペプチドを含有する細胞培地(2〜10μM)中で
37℃で4時間インキュベートした。細胞を洗浄した
後、0.5%NP40;0.5%Mega9;150mM
NaCl;5mM EDTA;50mMトリスpH7.
5;2mMフッ化フェニルメチルスルホニルから構成さ
れる細胞溶解緩衝液中でこれらを溶解した。プロテイン
A−セファロースに結合したフレームワーク特異性モノ
クローナル抗体(例えば、HLA−DRの場合における
モノクローナル抗体L243(ATCC HB 55)
での)によりMHC分子をこの混合液から免疫沈降さ
せ、プロテインA−セファロースに結合した放射能をγ
計数器で測定した。
【0048】実施例4 T細胞株6/7(DSM ACC2172)及び6/1
0(DSM ACC2173)への自己反応性ペプチド
を提示するMHC分子のサブタイプの確認 この実験操作は実施例1.3に類似している。しかしなが
ら、抗原提示細胞として自家PBLを用いず、その代わ
りにこのドナーのMHC分子に完全には一致しない異種
ドナーからのPBLを用いた。この異種ドナーからもT
細胞株を発達させたが規定したMHC対立遺伝子に関す
るものだけであった。増殖試験は、自己抗原性ペプチド
5G1(ヒトGAD65のアミノ酸266〜285に対
応する)及び5F3(ヒトGAD65のアミノ酸306
〜325に対応する)を用いて行った。表2は、そのよ
うな試験混合物の結果を示す。T細胞株6/7及び6/
10はDR B1−対立遺伝子0401の存在下で両方
のペプチドで増殖した。DQA1又はDQ B1対立遺
伝子の変化は、これらT細胞株の刺激能に影響しなかっ
た。T細胞株6/7は、更に対立遺伝子DR B1 0
101及び/又は1601の存在下でペプチド5G1を
認識した。
【0049】
【表2】 種々のハプロタイプを有するPBLを抗原提示細胞として用いるペプチド5G1 及び5F3での刺激後のT細胞増殖 ──────────────────────────────────── ドナ APCのハプロタイプ TCLのドナーの TCL 6/7 TCL 6/10 ー DR B1* DQ A1* DQ B1* AL* とのALの cpm cpm 同一性 +ペプチド SI +ペプチド SI ──────────────────────────────────── A.K. 0301 0501 0201 DR:2 AL 同一 5G1 55.0 5G1 6.0 0401 0301 0302 DQ:4 AL 同一 5F3 3.8 5F3 3.8 G.H. 0301 0501 0201 DR:1 AL 同一 5G1 0.9 5G1 1.5 1 AL 非同一 5F3 0.6 5F3 1.5 0404 0301 0302 DQ:4 AL 同一 G.E. 0302 0102 0604 DR:1 AL 同一 5G1 67.8 5G1 22.6 1 AL 非同一 5F3 7.0 5F3 6.5 0401 0301 0302 DQ:2 AL 同一 2 AL 非同一 19 0301 0501 0301 DR:2 AL 同一 5G1 45.7 5G1 8.5 0401 0201 0301 DQ:1 AL 同一 5F3 3.1 5F3 2.8 3 AL 非同一 D.J. 0101 0101 0501 DR:2 AL 非同一 5G1 28.6 5G1 2.2 1601 0102 0502 DQ:4 AL 非同一 5F3 1.2 5F3 1.4 ──────────────────────────────────── TCL=T細胞株 APC=抗原提示細胞 SI =刺激指数:ペプチドなしのcpmで割ったペプ
チド存在下のcpm AL =対立遺伝子
【0050】実施例5 T細胞株6/10を用いるペプチド5G1の変異体での
増殖試験 刺激性ペプチド5G1のコア構造を明らかにするため
に、T細胞株6/10を用いてこのペプチドの種々の変
異体で増殖試験を行った(表3を参照のこと)。20量
体変異体の第1組での試験は、5G1構造にC−又はN
−末端で接するアミノ酸がT細胞株6/10による認識
にある役割を果たしているか否かを確認しようとするも
のである。刺激指数が示すように、C−末端の方向に2
0量体ペプチドがシフトしても増殖活性は増加しなかっ
た。N−末端の方へ6アミノ酸だけシフトすると、刺激
能力が低下した。第2組のペプチド変異体での試験は、
C−末端の短縮の影響を調べるものである。この組の実
験は、C−末端アミノ酸残基ヒスチジン(H)とフェニ
ルアラニン(F)が刺激能力にとって重要であることを
示している。第3組のペプチド変異体での試験の目的
は、最小刺激活性ペプチドのN−末端を規定することで
ある。アミノ酸ロイシン(L)とプロリン(P)とを無
傷のC−末端を有する18量体から取り去ると、刺激指
数が大きく減少した。従って、このN−末端はLとPに
よって規定される。C−末端をHとFだけ更に短くする
と、やはり刺激指数が減少した。従って、T細胞株6/
10の場合には、依然として刺激することができる最小
ペプチドは、配列 LPRLIAFTSEHSHF を有する14量体で
ある。
【0051】
【表3】 依然として刺激活性を有する最小ペプチド構造を同定するためのペプチド5G1 の変異体とのTCL6/10の反応 ────────────────────────────────── 5G1のペプチド変異体 刺激指数 ────────────────────────────────── 5G1 GMAALPRLIAFTSEHSHFSL 5.4 ALPRLIAFTSEHSHFSLKKG 3.0 RLIAFTSEHSHFSLKKGAAA 3.2 PEVKEKGMAALPRLIAFTSE 0.6 AALPRLIAFTSEHSHFSL 4.5 AALPRLIAFTSEHSHF 2.9 AALPRLIAFTSEHS 0.7 AALPRLIAFTSE 0.6 GMAALPRLIAFTSE 0.8 GMAALPRLIAFT 1.0 LPRLIAFTSEHSHFSLKK 3.2 RLIAFTSEHSHFSL 1.4 LPRLIAFTSEHSHF 4.6 LPRLIAFTSEHS 0.4 ──────────────────────────────────
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明による自己反応性アミノ酸配列である。
【図2】本発明による自己反応性アミノ酸配列である。
【図3】ペプチドプールでのT細胞株6/7の増殖アッ
セイの結果である。
【図4】ペプチドプールでのT細胞株6/10の増殖ア
ッセイの結果である。
【図5】プール7及び11からの個々のペプチドでのT
細胞株6/7の増殖アッセイの結果である。
【図6】プール7及び11からの個々のペプチドでのT
細胞株6/10の増殖アッセイの結果である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 A61K 39/395 D U C07H 21/04 B C07K 7/06 16/18 16/42 19/00 C12N 5/06 G01N 33/53 D 7729−4B C12N 5/00 E (72)発明者 ウィンフリード アルバート ドイツ連邦共和国 82390 エバーフィン ク ハオプトシュトラーセ 16エイ番地 (72)発明者 ギュンター−ゲルハルト ユンク ドイツ連邦共和国 72076 チュービンゲ ン オブ デル グラフェンハルデ 5番 地 (72)発明者 ドロレス ジェイ.シェンデル ドイツ連邦共和国 80469 ミュンヘン ハンス−サッハ−シュトラーセ 123番地 (72)発明者 エドガー マインル ドイツ連邦共和国 82152 クライリンク スティーグリッツ ヴェーク 11番地 (72)発明者 クラオス ドーンマイアー ドイツ連邦共和国 82275 エマーリンク アオエンシュトラーセ 1エイ番地

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 以下の配列を含むペプチド又はペプチド
    誘導体: (a) アミノ酸配列(I) G-M-A-A-L-P-R-L-I-A-F-T-S-E-H-S-H-F-S-L-K-K-G-A-A (b) アミノ酸配列(II) E-R-G-K-M-I-P-S-D-L-E-R-R-I-L-E-A-K-Q-K (c) 図1又は2に示すアミノ酸配列のうちの1つ (d) 少なくとも6アミノ酸の長さを有する (a)、(b) 及
    び/又は(c) に示すアミノ酸配列の部分領域、及び/又
    は (e) (a) 、(b) 、(c) 及び/又は(d) に示すアミノ酸配
    列のものと本質的に同等のMHC分子への結合特異性及
    び/又は親和性を示すアミノ酸配列。
  2. 【請求項2】 以下の配列を含む、請求項1記載のペプ
    チド又はペプチド誘導体: (a) アミノ酸配列(I) (b) アミノ酸配列(II) (c) アミノ酸配列(I)及び/又は(II)の部分領域、
    及び/又は (d) (a)、(b) 及び/又は(c) からのアミノ酸配列のも
    のと本質的に同等のMHC分子への結合特異性及び/又
    は親和性を有するアミノ酸配列。
  3. 【請求項3】 少なくとも8アミノ酸の長さを有する、
    請求項1又は2記載のペプチド又はペプチド誘導体。
  4. 【請求項4】 少なくとも10アミノ酸の長さを有す
    る、請求項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド又は
    ペプチド誘導体。
  5. 【請求項5】 25アミノ酸までの長さを有する、請求
    項1〜3のいずれか1項に記載のペプチド又はペプチド
    誘導体。
  6. 【請求項6】 マーカー基を保持する、請求項1〜5の
    いずれか1項に記載のペプチド又はペプチド誘導体。
  7. 【請求項7】 請求項1〜6のいずれか1項に記載のペ
    プチド又はペプチド誘導体のものと本質的に同等のMH
    C分子への結合特異性及び/又は親和性を有するペプチ
    ド擬似体。
  8. 【請求項8】 請求項1〜6のいずれか1項に記載の少
    なくとも1つのペプチド若しくはペプチド誘導体又は請
    求項7に記載のペプチド擬似体を含む複合体であって、
    MHC分子に又はMHC分子のペプチド結合性誘導体に
    結合している複合体。
  9. 【請求項9】 MHCクラスII分子又はそのペプチド結
    合性誘導体を含む、請求項8記載の複合体。
  10. 【請求項10】 MHCクラスII分子が、タイプDR
    1、DR2、DR3又はDR4の分子である、請求項9
    記載の複合体。
  11. 【請求項11】 MHCクラスII分子が、サブタイプD
    R B1 0101、DR B1 0301、DR B
    1 0401、DR B1 0402、DRB1 04
    04、又はDR B1 1601を有する、請求項10
    記載の複合体。
  12. 【請求項12】 MHCクラスII分子が、サブタイプD
    R B1 0101又はDR B1 0401を有す
    る、請求項11記載の複合体。
  13. 【請求項13】 組換えMHC分子又はそのペプチド結
    合性誘導体を含む、請求項8〜12のいずれか1項に記
    載の複合体。
  14. 【請求項14】 MHC分子の可溶性ペプチド結合性誘
    導体を含む、請求項13記載の複合体。
  15. 【請求項15】 マーカー基を保持する、請求項8〜1
    4のいずれか1項に記載の複合体。
  16. 【請求項16】 共有結合又は非共有結合相互作用によ
    って結合している少なくとも2つのMHC分子又はMH
    C分子誘導体を含有するオリゴマー化ペプチド−MHC
    分子複合体。
  17. 【請求項17】 化学的カップリング試薬によって架橋
    されたペプチド−MHC分子複合体を含有する、請求項
    16記載のオリゴマー化複合体。
  18. 【請求項18】 幾つかのMHC結合領域を有するオリ
    ゴマー化ペプチド成分によって架橋されたMHC分子又
    はMHC分子誘導体を含有する、請求項16記載のオリ
    ゴマー化複合体。
  19. 【請求項19】 抗体によって架橋されたペプチド−M
    HC分子複合体を含有する、請求項16記載のオリゴマ
    ー化複合体。
  20. 【請求項20】 請求項9〜14のいずれか1項に記載
    のMHC分子を含有する、請求項16〜19のいずれか
    1項に記載のオリゴマー化複合体。
  21. 【請求項21】 請求項1〜6のいずれか1項に記載の
    少なくとも1つのペプチド若しくはペプチド誘導体又は
    請求項7に記載のペプチド擬似体を含有する、請求項1
    6〜20のいずれか1項に記載のオリゴマー化複合体。
  22. 【請求項22】 請求項1〜6のいずれか1項に記載の
    ペプチド又はペプチド誘導体、請求項7に記載のペプチ
    ド擬似体、及び/又は請求項8〜21のいずれか1項に
    記載の複合体を活性成分として含有し、所望により通常
    の医薬用添加剤を共に含有する医薬組成物。
  23. 【請求項23】 補助刺激成分を更に含む、請求項22
    記載の組成物。
  24. 【請求項24】 補助刺激成分がサイトカイン及び/又
    は表面抗原B7から選択される、請求項23記載の組成
    物。
  25. 【請求項25】 免疫系に影響を及ぼす疾患若しくはそ
    の疾患への個体素因の診断薬又は腫瘍性疾患若しくは腫
    瘍性疾患への個体素因の診断薬を製造するための、請求
    項22〜24のいずれか1項に記載の医薬組成物の使
    用。
  26. 【請求項26】 自己免疫疾患又は自己免疫疾患への個
    体素因の診断薬を製造するための、請求項25記載の使
    用。
  27. 【請求項27】 糖尿病又は糖尿病への個体素因の診断
    薬を製造するための、請求項25又は26記載の使用。
  28. 【請求項28】 特異性T細胞サブ集団の確認方法であ
    って、T細胞を含有するサンプルを、請求項1〜6のい
    ずれか1項に記載のペプチド又はペプチド誘導体、請求
    項7に記載のペプチド擬似体、及び/又は請求項8〜2
    1のいずれか1項に記載の複合体に接触させ、そして該
    サンプル中のT細胞の該ペプチド又は複合体との反応を
    確認する方法。
  29. 【請求項29】 T細胞の反応を蛍光標識ペプチド又は
    複合体を用いるFACS分析によって確認する、請求項
    28記載の方法。
  30. 【請求項30】 ペプチド又は複合体とのT細胞の接触
    の前及び/又は後に前活性化T細胞の選択を行う、請求
    項28又は29記載の方法。
  31. 【請求項31】 免疫系に影響を及ぼす疾患の治療薬又
    は予防薬を製造するための、請求項22〜24のいずれ
    か1項に記載の医薬組成物の使用。
  32. 【請求項32】 自己免疫疾患の治療薬又は予防薬を製
    造するための、請求項31記載の使用。
  33. 【請求項33】 糖尿病の治療薬又は予防薬を製造する
    ための、請求項31又は32記載の使用。
  34. 【請求項34】 抗原、特に免疫原又は寛容原を製造す
    るための、請求項1〜6のいずれか1項に記載のペプチ
    ド又はペプチド誘導体、請求項7に記載のペプチド擬似
    体、又は請求項8〜21のいずれか1項に記載の複合体
    の使用。
  35. 【請求項35】 特異性T細胞サブ集団の単離方法であ
    って、T細胞を含有するサンプルを、請求項1〜6のい
    ずれか1項に記載のペプチド又はペプチド誘導体、請求
    項7に記載のペプチド擬似体、又は請求項8〜21のい
    ずれか1項に記載の複合体に接触させ、該ペプチド又は
    複合体と反応するT細胞を同定し、そして所望により他
    のT細胞と分離する方法。
  36. 【請求項36】 ペプチド又は複合体とのT細胞の接触
    の前及び/又は後に前活性化T細胞の選択を行う、請求
    項35記載の方法。
  37. 【請求項37】 抗原を製造するための、請求項35記
    載の方法によって単離したT細胞又はその部分構造体の
    使用。
  38. 【請求項38】 T細胞又はその部分構造体を、それら
    がもともとの由来とする患者に再注射する、請求項37
    記載の使用。
  39. 【請求項39】 不活性化T細胞を再注射する、請求項
    38記載の使用。
  40. 【請求項40】 分割可能なT細胞を再注射する、請求
    項39記載の使用。
  41. 【請求項41】 請求項1〜6のいずれか1項に記載の
    ペプチド又はペプチド誘導体、請求項7に記載のペプチ
    ド擬似体、又は請求項8〜21のいずれか1項に記載の
    複合体での免疫感作及び該免疫感作によって産生する抗
    体の単離によって得ることができる該ペプチド、ペプチ
    ド誘導体、ペプチド擬似体、又は複合体に対する抗体。
  42. 【請求項42】 請求項41記載の抗体に対する抗イデ
    ィオタイプ抗体であって、該ペプチド、ペプチド誘導
    体、ペプチド擬似体、又は複合体に対する抗体での免疫
    感作及び該免疫感作によって産生する抗イディオタイプ
    抗体の単離によって得ることができる抗イディオタイプ
    抗体。
  43. 【請求項43】 請求項1〜6のいずれか1項に記載の
    ペプチド又はペプチド誘導体、請求項7に記載のペプチ
    ド擬似体、又は請求項8〜15又は21のいずれか1項
    に記載の複合体と反応するT細胞。
  44. 【請求項44】 T細胞株6/7(DSM ACC21
    72)に由来するか又は同等のT細胞レセプター結合特
    異性を有する請求項43記載のT細胞。
  45. 【請求項45】 T細胞株6/10(DSM ACC2
    173)に由来するか又は同等のT細胞レセプター結合
    特異性を有する請求項43記載のT細胞。
JP00774695A 1994-01-20 1995-01-20 抗原特異的活性化tリンパ球、その検出及び使用 Expired - Fee Related JP3386614B2 (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002542483A (ja) * 1999-04-16 2002-12-10 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 濃縮された抗原特異的t細胞、ならびに関係する治療および予防の組成物および方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5820866A (en) * 1994-03-04 1998-10-13 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Product and process for T cell regulation
US5635363A (en) * 1995-02-28 1997-06-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells
DE19525784A1 (de) * 1995-07-14 1997-01-16 Boehringer Mannheim Gmbh Autoreaktive Peptide aus der humanen Glutamin-Decarboxylase (GAD)
DE19526561A1 (de) * 1995-07-20 1997-01-23 Boehringer Mannheim Gmbh In-vivo-Diabetes-Test
AU2044197A (en) * 1996-04-01 1997-10-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnostic composition for diseases accompanied by autoimmune reactions caused by 65k-glutamic acid decarboxylase
DE19925199A1 (de) 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Ag Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
DE19925235A1 (de) 1999-06-01 2000-12-07 Medigene Ag Zytotoxische T-Zellepitope des Papillomavirus L1-Proteins und ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie
CN100493617C (zh) * 2003-11-28 2009-06-03 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 用于治疗和预防ⅰ型糖尿病的重组腺相关病毒及其用途
CN1291231C (zh) 2003-12-08 2006-12-20 胡军 活化淋巴细胞特异性的检测方法
GB2422834B8 (en) * 2005-02-04 2007-01-04 Proimmune Ltd MHC oligomer and method of making the same
WO2007085266A1 (en) * 2006-01-30 2007-08-02 Dako Denmark A/S High-speed quantification of antigen specific t-cells in whole blood by flow cytometry
GB2442048B (en) * 2006-07-25 2009-09-30 Proimmune Ltd Biotinylated MHC complexes and their uses
GB2440529B (en) * 2006-08-03 2009-05-13 Proimmune Ltd MHC Oligomer, Components Therof, And Methods Of Making The Same
EP2361930A3 (en) 2007-03-26 2011-10-26 Dako Denmark A/S Multimers of MHC-peptide complexes and uses thereof in Borrelia infectious diseases
EP3023436A1 (en) * 2007-07-03 2016-05-25 Dako Denmark A/S Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers
WO2009039854A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Dako Denmark A/S Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
US10968269B1 (en) 2008-02-28 2021-04-06 Agilent Technologies, Inc. MHC multimers in borrelia diagnostics and disease
US10722562B2 (en) 2008-07-23 2020-07-28 Immudex Aps Combinatorial analysis and repair
GB0817244D0 (en) 2008-09-20 2008-10-29 Univ Cardiff Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells
US10369204B2 (en) 2008-10-02 2019-08-06 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
JP5674339B2 (ja) * 2009-05-22 2015-02-25 協和メデックス株式会社 可溶性インターロイキン−2受容体の測定方法及び測定用試薬

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0770182A (ja) * 1991-06-18 1995-03-14 Univ California クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5171568A (en) * 1984-04-06 1992-12-15 Chiron Corporation Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine
US5194425A (en) 1988-06-23 1993-03-16 Anergen, Inc. Mhc-mediated toxic conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5260422A (en) * 1988-06-23 1993-11-09 Anergen, Inc. MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity
US5674978A (en) * 1990-09-21 1997-10-07 The Regents Of The University Of California Peptides derived from glutamic acid decarboxylase
US6682906B1 (en) 1990-09-21 2004-01-27 The Regents Of The University Of California Cloned glutamic acid decarboxylase
US5489742A (en) * 1990-10-23 1996-02-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Transgenic rats and animal models of inflammatory disease
JPH06508030A (ja) * 1991-05-15 1994-09-14 ザイモジェネティクス,インコーポレイティド ヒトすい島グルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗原のクローニング及び発現
JPH08502244A (ja) * 1992-08-11 1996-03-12 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 免疫調節ペプチド
US5691448A (en) * 1992-12-03 1997-11-25 Baekkeskov; Steinunn Reagents and methods for the diagnosis and treatment of diabetes and stiff man syndrome
US6060309A (en) * 1995-06-07 2000-05-09 Anergen, Inc. Immune mediators and related methods

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0770182A (ja) * 1991-06-18 1995-03-14 Univ California クローン化グルタミン酸デカルボキシラーゼ

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002542483A (ja) * 1999-04-16 2002-12-10 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 濃縮された抗原特異的t細胞、ならびに関係する治療および予防の組成物および方法
JP4673978B2 (ja) * 1999-04-16 2011-04-20 オーソ−マクニール・フアーマシユーチカル・インコーポレーテツド 濃縮された抗原特異的t細胞、ならびに関係する治療および予防の組成物および方法

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