JP2023500671A - がんのt細胞治療のための細胞傷害性エフェクターメモリーt細胞の産生方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書では、CD161+T細胞を増大させる方法を提供する。キメラ抗原受容体(CAR)を含む改変CD161+T細胞を生成するための方法および組成物も提供される。特定の態様では、CAR発現T細胞は、疾患(例えば、がん)治療において産生され、増大され、かつ/または使用される。
Description
関連出願の参照
本出願は、2019年11月6日に出願された米国仮出願第62/931,670号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2019年11月6日に出願された米国仮出願第62/931,670号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所から授与された助成金番号AI127387の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所から授与された助成金番号AI127387の下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
1.分野
本開示は、概して、医学、免疫学、細胞生物学、および分子生物学の分野に関する。ある特定の態様では、本開示の分野は、免疫療法に関する。より具体的には、本開示は、改善されたキメラ抗原受容体(CAR)T細胞の生成、およびそのような細胞を使用する治療方法に関する。
本開示は、概して、医学、免疫学、細胞生物学、および分子生物学の分野に関する。ある特定の態様では、本開示の分野は、免疫療法に関する。より具体的には、本開示は、改善されたキメラ抗原受容体(CAR)T細胞の生成、およびそのような細胞を使用する治療方法に関する。
2.関連技術の説明
膵管腺がん(PDAC)は、積極的な手術、放射線、および高用量化学療法にもかかわらず、5年生存率が9%未満の非常に侵襲性の高い腫瘍である(Ansari et al.,2015)。近年、養子キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、がん、具体的には、選択されたCD19+悪性腫瘍のための治療法として大きな可能性を示している(Maude et al.,2018、Neelapu et al.,2017)。CAR構築物は、細胞表面腫瘍抗原を標的とする単鎖可変領域フラグメント(scFv)、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、および典型的には4-1BBまたはCD28共刺激分子のいずれかに融合されたCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインからなる(van der Stegen et al.,2015)。パイロット第I相臨床試験では、自己メソテリン特異的CAR-T細胞の養子細胞療法は、少数の患者において、化学療法不応性転移性ヒトPDACに対して安全で軽度の有効性が示された(Beatty et al.,2018)が、膵腫瘍に対するCAR T細胞療法は、依然として十分に発展していない。実際、現時点では、固形腫瘍の状態で、CARに基づく療法は、何らの有意な有効性も示されていない。
膵管腺がん(PDAC)は、積極的な手術、放射線、および高用量化学療法にもかかわらず、5年生存率が9%未満の非常に侵襲性の高い腫瘍である(Ansari et al.,2015)。近年、養子キメラ抗原受容体(CAR)T細胞療法は、がん、具体的には、選択されたCD19+悪性腫瘍のための治療法として大きな可能性を示している(Maude et al.,2018、Neelapu et al.,2017)。CAR構築物は、細胞表面腫瘍抗原を標的とする単鎖可変領域フラグメント(scFv)、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、および典型的には4-1BBまたはCD28共刺激分子のいずれかに融合されたCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインからなる(van der Stegen et al.,2015)。パイロット第I相臨床試験では、自己メソテリン特異的CAR-T細胞の養子細胞療法は、少数の患者において、化学療法不応性転移性ヒトPDACに対して安全で軽度の有効性が示された(Beatty et al.,2018)が、膵腫瘍に対するCAR T細胞療法は、依然として十分に発展していない。実際、現時点では、固形腫瘍の状態で、CARに基づく療法は、何らの有意な有効性も示されていない。
ウイルス感染に対する細胞媒介性免疫の重要な特徴は、加速された増大および細胞傷害性動態を通じて、その後のチャレンジに対する耐久性免疫を提供する長寿命化メモリーT細胞集団の確立である(Seaman et al.,2004)。いくつかのグループは、マウスにおける天然細胞傷害性受容体NK1.1またはヒトにおけるCD161の発現によって特定され得る、そのようなメモリーT細胞の興味深いサブセットを以前に特定している(Martin et al.,2009、Turtle et al.,2009、Northfield et al.,2008、Takahashi et al.,2006、Assarsson et al.,2000、Billerbeck et al.,2010、Fergusson et al.,2011、Fergusson et al.,2016、Fergusson et al.,2014)。TCRインバリアントまたはCD8αα+CD161+細胞とは対照的に、ポリクローナルαβ細胞集団は、自己複製および分化のための幹細胞様の能力、グランザイムスーパーファミリーからの遺伝子の有意な上方調節を有する明確な転写プロファイル(Fergusson et al.,2011、Fergusson et al.,2014)、特徴的な抗ウイルス特異性(Fergusson et al.,2008、Billerbeck et al.,2010、Havenith et al.,2012、Neelapu et al.,2005)、ならびに組織ホーミング特性(Billerbeck et al.,2010)を示す。典型的には、CD161は先天性NK細胞受容体として知られているが、CD4、CD8、およびNKT細胞上にも発現され得る(Fergusson et al.,2016)。循環にも見出されるが、CD8+CD161+細胞は、慢性ウイルス感染および自己免疫状態中に、組織常在性特性および/または血管外漏出の傾向に起因する組織病因に寄与する(Assarsson et al.,2000、Billerbeck et al.,2010、Annibali et al.,2011)。さらに、腫瘍常在性免疫浸潤におけるCD161の高発現レベルは、NSCLCにおける実質的に改善された臨床転帰および生存と関連している(Braud et al.,2018)。
第1の実施形態では、(a)細胞の試料を得ることであって、試料がCD161+T細胞を含む、ことと、(b)IL-7、IL-15、およびIL-21の存在下でT細胞を培養し、それによって、CD161+細胞の数が非CD161+細胞と比べて増大しているT細胞の集団を提供することと、を含む、インビトロまたはエクスビボ方法が提供される。ある特定の態様では、T細胞は、CD8+CD161+T細胞を含む。さらなる態様では、T細胞は、CD4+CD161+T細胞を含む。
IL-7は、約5~20ng/mlで存在してもよく、IL-15は、約2.5~10ng/mlで存在してもよく、かつ/またはIL-21は、約20~40ng/mlで存在してもよく、例えば、10ng/mlのIL-7、5ng/mlのIL-15、および/または30ng/mlのIL-21である。本方法は、ステップ(b)の前に、試料中のCD8+CD161+細胞の存在についてT細胞を精製または濃縮することをさらに含み得る。本方法は、ステップ(b)の後に、試料中のCD8+CD161+細胞の存在についてT細胞を精製または濃縮することをさらに含み得る。試料中のT細胞を濃縮することは、蛍光細胞選別、磁気または常磁性ビーズ分離を含み得る。培養することは、最長で7、14、21、28、35、または42日間持続し得る。
いくつかの態様では、細胞は、CD3および/またはCD28刺激剤を含む培地中でさらに培養される。いくつかの態様では、CD3および/またはCD28刺激剤は、CD3および/またはCD28結合抗体を含む。いくつかの態様では、細胞は、CD3、CD28、および/またはCD161刺激剤を含む培地中でさらに培養される。いくつかの態様では、CD3、CD28、および/またはCD161刺激剤は、CD3、CD28、および/またはCD161結合抗体を含む。いくつかの態様では、細胞は、CD3結合抗体、CD28結合抗体、Clec2d、および/またはCD161刺激抗体を含む培地中でさらに培養される。いくつかの態様では、細胞は、約0.1~5.0、0.3~3.0、または0.5~2.0μg/mlのCD3結合抗体、CD28結合抗体、Clec2d、および/またはCD161刺激抗体を含む培地中でさらに培養される。
一態様では、CD8+CD161+細胞、CD8+CD161neg細胞、およびバルクPBMCは、プレート結合抗CD3/CD28で刺激され、10ng/mlのIL-7、5ng/mlのIL-15、および30ng/mlのIL-21(すべて、Peprotech,Rocky Hill,NJ)から構成されるサイトカインカクテル中で増大される。一態様では、CD8+CD161+細胞を、それぞれ1ug/mLの抗CD/CD28/CD161による刺激に対して単離培養し、10ng/mlのIL-7、5ng/mlのIL-15、および30ng/mlのIL-21から構成されるサイトカインカクテルにおいて、RPMI-1640、10%のFBSおよび2mmol/lのGlutaMAX中で増大させる。細胞を、37℃で48時間、加湿されたチャンバ内に配置する。48時間後、抗体刺激なしでIL7/15/21サイトカインカクテルで細胞を増大させる。
この方法は、例えば、アフェレーシスまたは静脈穿刺によって得られるなどして、対象から細胞を得ることをさらに含み得る。試料は、凍結保存された試料であってもよい。試料は、臍帯血由来であってもよい。試料は、対象からの末梢血試料であってもよい。試料は、対象から得られた同等の試料と比較して増加した割合のCD8+CD161+細胞を含むT細胞の亜集団を含み得る。試料は、第三者機関から得てもよい。
本方法は、例えば、ウイルスベクターを用いて、または、T細胞にウイルスで形質導入することを必要としない方法を通して、CARをコードする核酸を、該試料中のT細胞に導入することをさらに含み得る。CARまたはトランスジェニックTCRをコードする核酸をT細胞に導入することは、ステップ(b)の前またはステップ(b)の後に行ってもよい。T細胞は、内因性T細胞受容体および/または内因性HLAの発現に関して不活性化され得る。
本方法は、膜結合Cγサイトカインが膜結合IL-15であるような、膜結合Cγサイトカインをコードする核酸をT細胞に導入することをさらに含み得る。膜結合Cγサイトカインは、IL-15-IL-15Rα融合タンパク質であり得る。
培養することは、T細胞を、樹状細胞または人工抗原提示細胞(aAPC)の存在下で培養することを含み得る。aAPCは、aAPCの表面上で発現するCAR結合またはトランスジェニックTCR結合抗体もしくはそのフラグメントを含み得る。aAPCは、T細胞を活性化または共刺激する追加の分子を含み得る。追加の分子は、膜結合Cγサイトカインを含み得る。T細胞をaAPCの存在下で培養することは、細胞を約10:1~約1:10(CAR細胞対aAPC)の比で培養することを含み得る。
本方法は、トランスジェニックCARまたはトランスジェニックTCR細胞の集団の試料を凍結保存することをさらに含み得る。CARまたはトランスジェニックTCRは、がん細胞抗原、例えば、CD19、CD20、ROR1、CD22がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘍抗原、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原、変異型p53、変異型ras、HER2/Neu、葉酸結合タンパク質、HIV-1エンベロープ糖タンパク質gp120、HIV-1エンベロープ糖タンパク質gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、メオテリン、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ鎖、λ鎖、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、HER2-HER3の組み合わせ、またはHER1-HER2の組み合わせを、標的とすることができる。CARまたはトランスジェニックTCRは、真菌、ウイルス、または細菌病原体などの病原体抗原を標的としてもよい。病原体は、プラスモディウム、トリパノソーマ、アスペルギルス、カンジダ、HSV、HIV、RSV、EBV、CMV、JCウイルス、BKウイルス、またはエボラ病原体であってもよい。
本方法は、ステップ(b)の前、ステップ(b)の後、またはステップ(b)の前後両方で、例えば細胞計数/フローサイトメトリーによって、該試料のCD8+CD161+細胞の含有量を評価することをさらに含み得る。
本明細書に記載の方法によって作製されたT細胞組成物も提供する。
さらなる実施形態は、疾患を有するヒト対象においてT細胞応答を提供する方法であって、有効量の、本明細書に記載されるようなT細胞を投与することを含む、方法を伴う。疾患は、がんであり得、CARまたはトランスジェニックTCRは、がん細胞抗原を標的とする。対象は、以前に抗がん療法を受けていてもよい。対象は、寛解状態であってもよく、またはがんの症状を有しなくてもよいが、検出可能ながん細胞を含む。
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本開示の趣旨および範囲内の様々な変更および修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるであろうため、詳細な説明および具体的な実施例は、本開示の好ましい実施形態を示す一方で、例示としてのみ提供されることを理解されたい。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの1つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
例示的な実施形態の説明
上述のように、CAR-T療法は、転移性マウス管腺がん(PDAC)などのがんの治療において有望性を示している。前回の研究では、本発明者らは、養子移入された抗原経験のあるCD8+NK1.1+細胞が、PDACのモデルにおいて耐久性のある保護を媒介することができることを実証した。興味深いことに、これらの細胞は、抗原への最初の曝露から9ヶ月後に存在し、その後、親PDAC細胞株でチャレンジされたナイーブマウスに養子移入されたときに高度に保護された(Konduri et al.,2016)。これらの結果をさらに発展させて、本発明者らは、PDACの治療のためのCAR T細胞療法のSCID異種移植片モデルを含む、様々なインビボモデルシステムにおいて、これらの細胞のさらなる生物学的特性および機能的特性を特徴付けることを試みた。結果は、CD8+CD161+T細胞がCAR T細胞療法のための優れたプラットフォームを含むことを実証したが、ただし、形質導入および増大中の出発細胞集団の分化を防止するように適応させることを条件とする。さらに、それらは、現在、そのような細胞をエクスビボで増大させることができ、それによって、CAR-T療法を、それを必要とする対象に提供することをより容易にする、改良された方法を開発した。本開示のこれらおよび他の特徴は、以下により詳細に記載される。
上述のように、CAR-T療法は、転移性マウス管腺がん(PDAC)などのがんの治療において有望性を示している。前回の研究では、本発明者らは、養子移入された抗原経験のあるCD8+NK1.1+細胞が、PDACのモデルにおいて耐久性のある保護を媒介することができることを実証した。興味深いことに、これらの細胞は、抗原への最初の曝露から9ヶ月後に存在し、その後、親PDAC細胞株でチャレンジされたナイーブマウスに養子移入されたときに高度に保護された(Konduri et al.,2016)。これらの結果をさらに発展させて、本発明者らは、PDACの治療のためのCAR T細胞療法のSCID異種移植片モデルを含む、様々なインビボモデルシステムにおいて、これらの細胞のさらなる生物学的特性および機能的特性を特徴付けることを試みた。結果は、CD8+CD161+T細胞がCAR T細胞療法のための優れたプラットフォームを含むことを実証したが、ただし、形質導入および増大中の出発細胞集団の分化を防止するように適応させることを条件とする。さらに、それらは、現在、そのような細胞をエクスビボで増大させることができ、それによって、CAR-T療法を、それを必要とする対象に提供することをより容易にする、改良された方法を開発した。本開示のこれらおよび他の特徴は、以下により詳細に記載される。
I.定義
本明細書で使用される場合、「a」または「an」は、1つ以上を意味し得る。本明細書の請求項で使用されるとき、「含む(comprising)」という単語と併せて使用されるとき、「a」または「an」という単語は、1つまたは複数を意味し得る。
本明細書で使用される場合、「a」または「an」は、1つ以上を意味し得る。本明細書の請求項で使用されるとき、「含む(comprising)」という単語と併せて使用されるとき、「a」または「an」という単語は、1つまたは複数を意味し得る。
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されない限り、または代替物が互いに排他的である場合、「および/または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物と「および/または」のみを指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の(another)」は、少なくとも2番目以上を意味し得る。
本出願全体を通して、「約」という用語は、値がデバイスに関する誤差の固有の変動、値を決定するために使用される方法、研究対象間に存在する変動、または記載された値の10%以内の値を含むことを示すために使用される。
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体(CAR)」という用語は、例えば、人工T細胞受容体、キメラT細胞受容体、トランスジェニックT細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を指すことができ、特定の免疫エフェクター細胞に人工特異性を移植する操作された受容体を包含する。CARは、T細胞にモノクローナル抗体の特異性を付与するために用いられてもよく、それにより、例えば、養子細胞療法で使用するために、多数の特異的T細胞を生成することが可能になる。特定の実施形態では、CARは、例えば、腫瘍関連抗原に対する細胞の特異性を指示する。いくつかの実施形態では、CARは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、および腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の態様では、CARは、CD3-ゼータ膜貫通ドメインおよびエンドドメインに融合したモノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント(scFv)の融合を含む。他のCAR設計の特異性は、受容体のリガンド(例えば、ペプチド)に由来し得るか、またはデクチンなどのパターン認識受容体に由来し得る。ある特定の場合では、抗原認識ドメインの間隔は、活性化誘導細胞死を低減するように改変され得る。ある特定の場合では、CARは、CD3-ゼータ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10および/またはOX40などの追加の共刺激シグナル伝達のためのドメインを含む。場合によっては、共刺激分子、イメージング用(例えば、陽電子放射断層撮影用)のレポーター遺伝子、プロドラッグの添加時にT細胞を条件付きで除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、およびサイトカイン受容体が含まれる分子が、CARと共発現することができる。
本明細書で使用される場合、「T細胞受容体(TCR)」という用語は、T細胞上のタンパク質受容体であり、アルファ(α)およびベータ(β)鎖のヘテロ二量体から構成されるものを指すが、いくつかの細胞では、TCRは、ガンマおよびデルタ(γ/δ)鎖からなる。本開示の実施形態では、TCRは、例えば、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、メモリーT細胞、調節性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、およびガンマデルタT細胞が含まれるTCRを含む任意の細胞上で改変されてもよい。
「腫瘍関連抗原」および「がん細胞抗原」という用語は、本明細書では同義に使用される。各場合において、用語は、がん細胞によって特異的または優先的に発現されるタンパク質、糖タンパク質、または炭水化物を指す。
II.キメラ抗原受容体
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体またはT細胞受容体によって結合されることができる分子である。抗原は、Bリンパ球および/もしくはTリンパ球の産生をもたらす体液性免疫応答および/もしくは細胞性免疫応答をさらに誘導することができる。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体またはT細胞受容体によって結合されることができる分子である。抗原は、Bリンパ球および/もしくはTリンパ球の産生をもたらす体液性免疫応答および/もしくは細胞性免疫応答をさらに誘導することができる。
本開示の実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および1つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む、免疫原性(hCAR)を低減するようにヒト化されたCARを含む、抗原特異的キメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドをコードする核酸を含む、核酸を伴う。ある特定の実施形態では、CARは、1つ以上の抗原間の共有空間から構成されるエピトープを認識し得る。デクチン-1などのパターン認識受容体を使用して、炭水化物抗原に対する特異性を導き出すことができる。ある特定の実施形態では、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および/またはその抗原結合フラグメントを含むことができる。別の実施形態では、その特異性は、受容体に結合するペプチド(例えば、サイトカイン)に由来する。相補性決定領域(CDR)は、抗原を補完し、したがって、その特定の抗原に対するその受容体の特異性を提供する、抗原受容体(例えば、免疫グロブリンおよびT細胞受容体)タンパク質の可変ドメインに見出される短いアミノ酸配列である。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、3つのCDR(CDR1、CDR2、およびCDR3)を含有する。抗原受容体は、典型的には、2つのポリペプチド鎖から構成されるため、抗原と接触することができる各抗原受容体に対して6つのCDRがあり、各重鎖および軽鎖は、3つのCDRを含む。免疫グロブリンおよびT細胞受容体に関連するほとんどの配列変異がCDR内に見出されるため、これらの領域は、超可変ドメインと呼ばれることがある。これらのうち、CDR3は、VJ(重鎖およびTCR αβ鎖の場合、VDJ)領域の組換えによってコードされるため、最大の変動性を示す。
ヒトCAR核酸は、ヒト患者のための細胞免疫療法を増強するためのヒト遺伝子であることが想定される。特定の実施形態では、本開示は、完全長CAR cDNAまたはコード領域を含む。抗原結合領域またはドメインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,109,304号に記載されるものなどの、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント(scFv)のVHおよびVL鎖のフラグメントを含むことができる。フラグメントは、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインであることもできる。より具体的な実施形態では、フラグメントは、ヒト細胞における発現のためのヒトコドン使用に最適化された配列によってコードされる抗原特異的scFvである。
構成は、ダイアボディまたは多量体などの多量体であってもよい。多量体は、Wintersによってダイアボディと称されているものへの軽鎖および重鎖の可変部分の交差対合によって形成される可能性が最も高い。構築物のヒンジ部分は、完全に欠失され、第1のシステインが維持され、セリン置換ではなくプロリンが維持され、第1のシステインまで切断されることから、複数の代替案を有することができる。Fc部分は欠失され得る。安定であり、かつ/または二量体化する任意のタンパク質は、この目的を果たすことができる。Fcドメイン、例えば、ヒト免疫グロブリン由来のCH2またはCH3ドメインのいずれか1つのみを使用することができる。また、二量体化を改善するように改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ、CH2およびCH3領域を使用することもできる。免疫グロブリンのヒンジ部分だけを使用することもできる。CD8αの部分を使用することもできる。
本開示のキメラ受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体が配置されている免疫細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、分化細胞の特殊な機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。ナイーブ、メモリー、またはメモリー型T細胞におけるエフェクター機能には、抗原依存性増殖が含まれる。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞に特殊な機能を実行させるタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられるが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮された部分が使用され得る限りにおいて、そのような短縮された部分は、依然としてエフェクター機能シグナルを形質導入する限りは、インタクト鎖の代わりに使用されてもよい。したがって、細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを形質導入するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮された部分を含むことを意味する。例としては、T細胞受容体のゼータ鎖、またはその相同体のいずれか(例えば、イータ、デルタ、ガンマ、もしくはイプシロン)、MB1鎖、B29、Fc RIII、Fc RI、ならびにCD3ζおよびCD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40などのシグナル伝達分子の組み合わせ、ならびにそれらの組み合わせ、ならびに他の同様の分子およびフラグメントが挙げられる。FcγRIIIおよびFcεRIなどの活性化タンパク質ファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分を使用することができる。好ましい実施形態では、ヒトCD3ζ細胞内ドメインは、活性化のために摂取される。
抗原特異的細胞外ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトIgG4FcヒンジおよびFc領域などの膜貫通ドメインによって連結されてもよい。代替物としては、ヒトCD4膜貫通ドメイン、ヒトCD28膜貫通ドメイン、ヒト膜貫通CD3ζドメイン、もしくはシステイン変異ヒトCD3ζドメイン、またはCD16およびCD8ならびにエリスロポエチン受容体などの他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質由来の他の膜貫通ドメインが挙げられる。
いくつかの実施形態では、CAR核酸は、膜貫通ドメインおよび改変CD28細胞内シグナル伝達ドメインなどの他の共刺激受容体をコードする配列を含む。他の共刺激受容体としては、CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10、および4-1BB(CD137)のうちの1つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。CD3ζによって開始された一次シグナルに加えて、ヒトCARに挿入されたヒト共刺激受容体によって提供された追加のシグナルは、T細胞の完全な活性化に重要であり、養子免疫療法のインビボでの持続性および治療の成功の改善に役立つことができる。
特定の実施形態では、本開示は、CARをコードするDNA配列を組み込んだ単離された核酸セグメントおよび発現カセットに関する。本開示のベクターは、主に、免疫細胞、好ましくは、制御された真核生物プロモーター、例えば、MNDU3プロモーター、CMVプロモーター、EF1αプロモーター、またはユビキチンプロモーターの制御下でT細胞に所望の遺伝子を送達するように設計されている。また、ベクターは、他の理由がない場合、インビトロでの操作を容易にするために、選択可能なマーカーを含有してもよい。他の実施形態では、CARは、DNAテンプレートからインビトロで転写されたmRNAから発現され得る。
キメラ抗原受容体分子は、組換え体であり、その細胞質尾部に存在する免疫受容体活性化モチーフ(ITAM)を介して、抗原に結合し、活性化シグナルを形質導入する両方の能力によって区別される。(例えば、単鎖抗体(scFv)から生成される)抗原結合部分を利用する受容体構築物は、HLA非依存的な様式で標的細胞表面上の天然抗原に結合するという点で、「ユニバーサル」であるという追加の利点をもたらす。例えば、いくつかの研究所は、CD3複合体のゼータ鎖(ζ)、Fc受容体ガンマ鎖、およびskyチロシンキナーゼの細胞内部分をコードする配列に融合されたscFv構築物について報告している(Eshhar et al.,1993、Fitzer-Attas et al.,1998)。CTLによる腫瘍認識および溶解を含むリダイレクトされたT細胞エフェクター機構が、いくつかのマウスおよびヒト抗原-scFv:ζ系において文書化されている(Eshhar,1997、Altenschmidt et al.,1997、Brocker et al.,1998)。
現在までに、非ヒト抗原結合領域は、典型的には、キメラ抗原受容体の構築に使用されている。マウスモノクローナル抗体などの非ヒト抗原結合領域の使用に関与する潜在的な問題は、ヒトエフェクター機能の欠如および腫瘍塊に浸透することができないことである。言い換えると、そのような抗体は、抗体依存性細胞毒性またはFc受容体媒介性食作用を介して、補体依存性溶解を媒介するか、またはヒト標的細胞を溶解して、CARを発現する細胞を破壊することができない場合がある。さらに、非ヒトモノクローナル抗体は、ヒト宿主が外来タンパク質として認識することができ、したがって、そのような外来抗体の繰り返し注射は、有害な過敏性反応をもたらす免疫応答の誘導をもたらす場合がある。マウスベースのモノクローナル抗体の場合、これはしばしばヒト抗マウス抗体(HAMA)応答と呼ばれる。したがって、ヒト抗体の使用は、マウス抗体ほど強力なHAMA応答を誘発しないため、より好ましい。同様に、CARにおけるヒト配列の使用は、免疫媒介性認識を回避し、したがって、レシピエントに存在し、HLAとの関連で処理された抗原を認識する内因性T細胞による排除を回避することができる。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、a)細胞内シグナル伝達ドメイン、b)膜貫通ドメイン、およびc)抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。
特定の実施形態では、CAR内の細胞内受容体シグナル伝達ドメインとしては、例えば、CD3、またFcγ RIII共刺激シグナル伝達ドメイン、CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2、単独で、またはCD3ゼータと連続しているゼータ鎖などのT細胞抗原受容体複合体のものが挙げられる。具体的な実施形態では、細胞内ドメイン(細胞質ドメインと呼ばれてもよい)は、TCRゼータ鎖、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rベータ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12、およびCD40のうちの1つ以上の部分またはすべてを含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインにおける内因性T細胞受容体複合体の任意の部分を用いる。いわゆる第3世代CARは、例えば、相加効果または相乗効果のために一緒に融合された少なくとも2つまたは3つのシグナル伝達ドメインを有するので、1つまたは複数の細胞質ドメインを用いてもよい。
キメラ抗原受容体の特定の実施形態では、受容体の抗原特異的部分(抗原結合領域を含む細胞外ドメインと呼ばれてもよい)は、腫瘍関連抗原またはデクチン-1などのパターン認識受容体によって認識される炭水化物抗原を含む病原体特異的抗原結合ドメインを含む。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上に発現されている限り、任意の種類であってもよい。腫瘍関連抗原の例示的な実施形態としては、CD19、CD20、がん胎児性抗原、α-フェトプロテイン、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、変異型p53、変異型rasなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、CARは、少量の腫瘍関連抗原が存在するときの持続性を改善するために、膜結合サイトカインと共発現され得る。例えば、CARは、膜結合IL-15と共発現することができる。
ある特定の実施形態では、HA-1、サバイビン、WT1、およびp53などの細胞内腫瘍関連抗原が標的とされ得る。これは、HLAと関連して細胞内腫瘍関連抗原から説明される処理されたペプチドを認識するユニバーサルT細胞上に発現されるCARによって達成され得る。さらに、ユニバーサルT細胞は、HLAとの関連で細胞内で処理された腫瘍関連抗原を認識するT細胞受容体対合を発現するように遺伝子改変されてもよい。
病原体は、任意の種類であってもよいが、特定の実施形態では、病原体は、例えば、真菌、細菌、またはウイルスである。例示的なウイルス病原体としては、アデノウイルス科のファミリー、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)、JCウイルス、BKウイルス、HSV、ウイルスのHHVファミリー、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、フラビウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、パポバウイルス科、ポリオマウイルス科、ラブドウイルス科、およびトガウイルス科のものが挙げられる。例示的な病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、流行性耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ、および風疹を引き起こす。例示的な病原性真菌としては、Candida、Aspergillus、Cryptococcus、Histoplasma、Pneumocystis、およびStachybotrysが挙げられる。例示的な病原性細菌としては、Streptococcus、Pseudomonas、Shigella、Campylobacter、Staphylococcus、Helicobacter、E.coli、Rickettsia、Bacillus、Bordetella、Chlamydia、Spirochetes、およびSalmonellaが挙げられる。一実施形態では、病原体受容体デクチン-1は、真菌の細胞壁上の炭水化物構造を認識するCARを生成するために使用され得る。デクチン-1の特異性に基づいてCARを発現するように遺伝子改変されたT細胞は、Aspergillusを認識し、菌糸の成長を標的とすることができる。別の実施形態では、CARは、ウイルス感染および病理を妨害するために、ウイルス決定因子(例えば、CMVおよびエボラ由来の糖タンパク質)を認識する抗体に基づいて作製することができる。
いくつかの実施形態では、病原性抗原は、CARにおける細胞外ドメインが、デクチン-1などを介して、真菌細胞壁の炭水化物のパターンを認識するAspergillus炭水化物抗原である。
本開示によるキメラ免疫受容体は、当該技術分野において既知の任意の手段により産生され得るが、好ましくは、DNA組換え技術を使用して産生される。キメラ受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列を調製し、分子クローニングの標準技術(ゲノムライブラリスクリーニング、PCR、プライマー支援ライゲーション、酵母および細菌由来のscFvライブラリ、部位特異的変異誘発など)によって完全なコード配列に組み立てることができる。得られたコード領域を発現ベクターに挿入し、好適な発現宿主同種T細胞株を形質転換するために使用することができる。
本明細書で使用する場合、核酸構築物もしくは核酸配列またはポリヌクレオチドは、T細胞に形質転換または導入され、転写および翻訳されて生成物(例えば、キメラ抗原受容体)を産生することができるDNA分子を意味することが意図される。
本開示で用いる例示的な核酸構築物(ポリヌクレオチド)において、プロモーターは、本開示のキメラ受容体をコードする核酸配列に作用可能に連結され、すなわち、それらは、キメラ受容体をコードするDNAからのメッセンジャーRNAの転写を促進するように位置付けられる。プロモーターは、ゲノム起源であるか、または合成的に生成されることができる。T細胞で使用するための様々なプロモーターは、当該技術分野において周知である(例えば、Marodon et al.,2003によって開示されるCD4プロモーター)。プロモーターは、例えば、誘導が特定の細胞型または特定の成熟レベルに関連している場合、構成的または誘導的であってもよい。あるいは、多数の周知のウイルスプロモーターも好適である。目的のプロモーターとしては、β-アクチンプロモーター、SV40初期および後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、およびフレンド脾限局巣形成ウイルスプロモーターが挙げられる。プロモーターは、エンハンサーと会合しても、または会合しなくてもよく、エンハンサーは、特定のプロモーターと自然に会合しても、異なるプロモーターと会合してもよい。
キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムDNA源、cDNA源から得られ得るか、もしくは合成され得る(例えば、PCRを介して)か、またはそれらの組み合わせである。ゲノムDNAのサイズおよびイントロンの数に応じて、イントロンがmRNAを安定化する、またはT細胞特異的発現をもたらすことが見出されるので、cDNAまたはそれらの組み合わせを使用することが望ましい場合がある(Barthel and Goldfeld,2003)。また、mRNAを安定化するために内因性または外因性非コード領域を使用することがさらに有利であり得る。
本開示のキメラ抗原受容体の発現のために、キメラ受容体のN末端構成要素をコードする核酸配列の天然または内因性転写開始領域を使用して、標的宿主においてキメラ受容体を生成することができる。あるいは、構成的または誘導的発現を可能にする外因性転写開始領域を使用することができ、ここで、発現は、標的宿主、所望の発現レベル、標的宿主の性質などに応じて制御することができる。
同様に、キメラ受容体を表面膜に誘導するシグナル配列は、キメラ受容体のN末端成分の内因性シグナル配列であり得る。任意選択的に、場合によっては、この配列を異なるシグナル配列と交換することが望ましい場合がある。しかしながら、選択されたシグナル配列は、キメラ受容体がT細胞の表面に提示されるように、T細胞の分泌経路と適合するべきである。
同様に、終結領域は、キメラ受容体のC末端構成要素をコードする核酸配列の天然または内因性転写終結領域によって提供されてもよい。代替的に、終結領域は、異なる供給源から誘導されてもよい。ほとんどの場合、終結領域の供給源は、一般に、組換えタンパク質の発現に重要ではないと考えられ、多種多様な終結領域が、発現に悪影響を及ぼすことなく使用され得る。
当業者に理解されるように、場合によっては、CAR内の抗原結合ドメインの末端にあるいくつかのアミノ酸を、例えば、通常は10個以下、より通常は5個以下の残基を欠失させることができる。また、少数のアミノ酸を境界に導入することが望ましい場合があり、通常は10個以下、より通常は5個以下の残基である。アミノ酸の欠失または挿入は、構築物のニーズの結果として、便利な制限部位、操作の容易さ、発現レベルの改善などをもたらし得る。加えて、1つ以上のアミノ酸の異なるアミノ酸との置換は、同様の理由で生じ得るが、通常、任意の1つのドメイン内で約5個を超えるアミノ酸を置換しない。
本開示によるキメラ受容体をコードするキメラ構築物は、従来の方法で調製することができる。ほとんどの場合、天然配列を用いてもよいため、天然遺伝子は、様々な構成要素の適切な結合を可能にするように、必要に応じて単離され、操作されてもよい。したがって、キメラ受容体のN末端およびC末端タンパク質をコードする核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いることによって、遺伝子の望ましくない部分の欠失をもたらす適切なプライマーを使用して単離され得る。あるいは、クローニングされた遺伝子の制限消化を使用して、キメラ構築物を生成することができる。いずれの場合も、配列を選択して、平滑末端であるか、または相補的な重複を有する制限部位を提供することができる。
キメラ構築物を調製するための様々な操作は、インビトロで実行することができ、特定の実施形態では、キメラ構築物は、標準的な形質転換またはトランスフェクション方法を使用して、適切な宿主におけるクローニングおよび発現のためにベクターに導入される。したがって、各操作の後、DNA配列の結合から得られた構築物をクローニングし、ベクターを単離し、配列をスクリーニングして、配列が所望のキメラ受容体をコードすることを確実にする。配列は、制限分析、配列決定などによってスクリーニングすることができる。
本開示のキメラ構築物は、腫瘍のサイズを低減させるか、またはこれらの対象における腫瘍の増殖もしくは再増殖を防止することにより、がんを有するか、またはがんを有する疑いのある対象における用途を見出す。したがって、本開示は、本開示のキメラ構築物を対象の単離されたT細胞に導入し、形質転換されたT細胞を対象に再導入し、それにより、対象における腫瘍を低減または排除するための抗腫瘍応答をもたらすことによって、対象における増殖を低減させるか、または腫瘍形成を防止する方法に関する。使用され得る好適なT細胞としては、細胞傷害性リンパ球(CTL)、または破壊を必要とするT細胞受容体を有する任意の細胞が挙げられる。当業者に周知であるように、これらの細胞を対象から単離するための様々な方法が容易に利用可能である。例えば、細胞表面マーカー発現を使用するか、または市販のキット(例えば、Pierce,Rockford,Ill.からのISOCELL(商標))を使用することである。
キメラ構築物は、対象自身のT細胞に、裸のDNAとして、または好適なベクター中に導入され得ることが想定される。裸のDNAを使用したエレクトロポレーションによってT細胞を安定的にトランスフェクションする方法は、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第6,410,319号を参照されたい。裸のDNAは、一般に、発現のための適切な配向でプラスミド発現ベクターに含まれる本開示のキメラ受容体をコードするDNAを指す。有利には、裸のDNAの使用は、本開示のキメラ受容体を発現するT細胞を産生するのに必要な時間を短縮させる。
あるいは、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター)を使用して、キメラ構築物をT細胞に導入することができる。本開示の方法に従って使用するのに好適なベクターは、対象のT細胞において複製しない。ウイルスに基づく多数のベクターが知られており、細胞内で維持されるウイルスのコピー数は、細胞の生存率を維持するのに十分低い。例示的なベクターとしては、本明細書に開示されるpFB-ネオベクター(STRATAGENE(登録商標))、ならびにHIV、SV40、EBV、HSV、またはBPVに基づくベクターが挙げられる。
一旦、トランスフェクトまたは形質導入されたT細胞が、所望の調節レベルで、所望のレベルで、表面膜タンパク質としてキメラ受容体を発現させることができることが確立されると、キメラ受容体が宿主細胞において機能し、所望のシグナル誘導をもたらすかどうかを決定することができる。その後、形質導入されたT細胞を対象に再導入または投与して、対象における抗腫瘍応答を活性化させる。投与を容易にするために、本開示による形質導入されたT細胞は、薬学的組成物にすることができ、または適切な担体もしくは希釈剤を用いて、インビボで投与するのに適切なインプラントにすることができ、これはさらに薬学的に許容され得る。そのような組成物またはインプラントを作製する手段は、当該技術分野において説明されている(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th Ed.,Mack,ed.,1980を参照されたい)。必要に応じて、形質導入されたT細胞は、それぞれの投与経路のための通常の方法で、カプセル、溶液、注射、吸入剤、またはエアロゾルなどの半固体または液体形態の調製物に製剤化され得る。当該技術分野において既知の手段を利用して、組成物が標的組織もしくは器官に到達するまで、組成物の放出および吸収を防止もしくは最小限に抑えることができ、または組成物の持続放出を確実にすることができる。しかしながら、望ましくは、キメラ受容体を発現する細胞を無効にしない薬学的に許容される形態が用いられる。したがって、好ましくは、形質導入されたT細胞は、平衡塩類溶液、好ましくはハンクス平衡塩類溶液、または通常の生理食塩水を含有する薬学的組成物に作製され得る。
III.実施形態に関連する方法および組成物
ある特定の態様では、本開示は、抗原特異的CD8+CD161+T細胞の作製および/または増大方法を含み、これは、T細胞を、hCARをコードするDNA構築物を含有する発現ベクターでトランスフェクトし、次いで、任意選択で、抗原陽性細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で細胞を刺激して、細胞を増殖させることを含む。実施例に記載されるように、インターロイキン-IL-7、IL-15、およびIL-21の特定の組み合わせは、CD8+CD161+T細胞の実質的に改善された増大を提供する。
ある特定の態様では、本開示は、抗原特異的CD8+CD161+T細胞の作製および/または増大方法を含み、これは、T細胞を、hCARをコードするDNA構築物を含有する発現ベクターでトランスフェクトし、次いで、任意選択で、抗原陽性細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で細胞を刺激して、細胞を増殖させることを含む。実施例に記載されるように、インターロイキン-IL-7、IL-15、およびIL-21の特定の組み合わせは、CD8+CD161+T細胞の実質的に改善された増大を提供する。
別の態様では、エレクトロポレーション、または裸のDNAを使用する他の非ウイルス遺伝子導入(限定されないが、ソノポレーションなど)によってT細胞を安定的にトランスフェクトおよびリダイレクトする方法が提供される。ほとんどの研究者は、異種遺伝子をT細胞に運ぶためにウイルスベクターを使用してきた。裸のDNAを使用することにより、リダイレクトT細胞を産生するのに必要な時間を短縮することができる。「裸のDNA」とは、発現のために適切な配向で発現カセットまたはベクターに含まれるキメラT細胞受容体(cTCR)をコードするDNAを意味する。本開示のエレクトロポレーション法は、キメラTCR(cTCR)を発現し、その表面上で担持する安定したトランスフェクタントを産生する。
「キメラTCR」とは、T細胞によって発現され、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含む受容体を意味し、細胞外ドメインは、MHCの制限されない方法で、その方法で通常T細胞受容体によって結合されない抗原に特異的に結合することができる。適切な条件下での抗原によるT細胞の刺激は、細胞の増殖(増大)および/またはIL-2の産生をもたらす。本出願の例示的なキメラ受容体は、キメラTCRの例である。しかしながら、本方法は、HER2/Neu(Stancovski et al.,1993)、ERBB2(Moritz et al.,1994)、葉酸結合タンパク質(Hwu et al.,1995)、腎細胞がん(Weitjens et al.,1996)、およびHIV-1エンベロープ糖タンパク質gp120ならびにgp41(Roberts et al.,1994)に特異的であるキメラTCRなどの他の標的抗原に特異的であるキメラTCRを用いたトランスフェクションに適用可能である。他の細胞表面標的抗原としては、CD20、がん胎児性抗原、メソテリン、ROR1、c-Met、CD56、GD2、GD3、α-フェトプロテイン、CD23、CD30、CD123、IL-11Rα、κ鎖、λ鎖、CD70、CA-125、MUC-1、EGFRおよびバリアント、上皮腫瘍抗原などが挙げられるが、これらに限定されない。
ある特定の態様では、T細胞は、原発性ヒトT細胞、例えば、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)に由来するT細胞、G-CSFで刺激した後に採取されたPBMC、骨髄、または臍帯血である。条件としては、mRNAおよびDNAの使用ならびにエレクトロポレーションの使用が挙げられる。トランスフェクション後、細胞は直ちに注入されてもよいか、または保管されてもよい。ある特定の態様では、トランスフェクション後、細胞は、細胞への遺伝子導入後約1、2、3、4、5日間、またはそれ以上の間、バルク集団として数日間、数週間、または数ヶ月間、エクスビボで繁殖され得る。さらなる態様では、トランスフェクション後、トランスフェクタントをクローニングし、単一の組み込まれたまたはエピソーム維持された発現カセットもしくはプラスミドの存在を示すクローンを作製し、エクスビボでキメラ受容体の発現を増大させる。増大のために選択されたクローンは、標的細胞を特異的に認識する能力を示す。組換えT細胞は、IL-2、または共通のガンマ鎖に結合する他のサイトカイン(例えば、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、および他のもの)による刺激によって増大されてもよい。組換えT細胞は、人工抗原提示細胞による刺激によって増大されてもよい。組換えT細胞は、人工抗原提示細胞上で、またはT細胞表面上のCD3を架橋するOKT3などの抗体で増大されてもよい。組換えT細胞のサブセットは、人工抗原提示細胞上で、またはT細胞表面上のCD52に結合するCampathなどの抗体で欠失されてもよい。さらなる態様では、遺伝子改変細胞は、凍結保存されてもよい。
注入後のT細胞繁殖(生存)は、(i)CARに特異的なプライマーを使用したq-PCR、(ii)CARに特異的な抗体を使用したフローサイトメトリー、および/または(iii)可溶性TAAによって評価され得る。
本開示のある特定の実施形態では、CAR細胞は、それを必要とする個体、例えば、がんまたは感染症を有する個体に送達される。次いで、細胞は、個体の免疫系を増強して、それぞれのがんまたは病原性細胞を攻撃する。場合によっては、個体に、抗原特異的CAR T細胞の1回以上の投与が提供される。個体に抗原特異的CAR T細胞の2回以上の投与が提供される場合、投与間の持続時間は、個体における繁殖のための時間を可能にするのに十分であるべきであり、特定の実施形態では、投与間の持続時間は、1、2、3、4、5、6、7日、またはそれ以上である。
キメラ抗原受容体の両方を含むように改変され、機能的TCRを欠く同種T細胞の供給源は、任意の種類であってもよいが、特定の実施形態では、細胞は、例えば、臍帯血、末梢血、ヒト胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞のバンクから得られる。治療効果に好適な用量は、例えば、好ましくは、一連の投与サイクルにおいて、1用量当たり少なくとも105個または約105~約1010個の細胞であろう。例示的な投与レジメンは、0日目に少なくとも約105個の細胞から開始し、例えば、患者内用量漸増スキームを開始してから数週間以内に、約1010個の細胞の目標用量まで漸増する、4つの用量漸増の1週間の投与サイクルからなる。好適な投与様式としては、静脈内、皮下、空洞内(例えば、リザーバアクセス装置による)、腹腔内、および腫瘍塊への直接注射が挙げられる。
本開示の薬学的組成物は、単独で、またはがんの治療に有用な他の確立された薬剤と組み合わせて使用することができる。単独で送達されようが、または他の薬剤と組み合わせて送達されようが、本開示の薬学的組成物は、特定の効果を達成するために、様々な経路を介して、および哺乳類、特にヒトの体内の様々な部位に送達され得る。当業者は、複数の経路を投与に使用することができるが、特定の経路が別の経路よりも即時的かつより効果的な反応を提供することができることを認識するであろう。例えば、皮内送達は、黒色腫の治療のために吸入よりも有利に使用され得る。局所送達または全身送達は、製剤の体腔への適用もしくは滴下を含む投与、エアロゾルの吸入もしくは送気、または筋肉内、静脈内、門脈内、肝臓内、腹腔内、皮下、もしくは皮内投与を含む非経口導入によって達成され得る。
本開示の組成物は、単位剤形で提供することができ、各投与単位、例えば、注射剤は、単独で、または他の活性剤と適切な組み合わせで、所定量の組成物を含有する。本明細書で使用される場合、単位剤形という用語は、ヒトおよび動物対象のための単一の剤形として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、単独でまたは他の活性剤と組み合わせて、所望の効果を生じさせるのに十分な量で、適切な場合、薬学的に許容される希釈剤、担体、またはビヒクルと関連して計算される、所定量の本開示の組成物を含有する。本開示の新規の単位剤形の仕様は、特定の対象における薬学的組成物に関連する特定の薬力学に依存する。
望ましくは、単離され形質導入されたT細胞の有効量または十分な数が、組成物中に存在し、対象に導入されることで、その結果、長期的な特異的な抗腫瘍応答が確立され、そのような処置の非存在下で他の方法でもたらされるよりも腫瘍のサイズを低減させるか、または腫瘍の増殖もしくは再増殖を排除する。望ましくは、対象に再導入される形質導入されたT細胞の量は、形質導入されたT細胞が存在しない他の同じ条件と比較して、腫瘍サイズの10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%または100%の減少を引き起こす。
したがって、投与される形質導入されたT細胞の量は、投与経路を考慮に入れるべきであり、所望の治療応答を達成するために十分な数の形質導入されたT細胞が導入されるようにするべきである。さらに、本明細書に記載の組成物に含まれる各活性剤の量(例えば、接触させる各細胞当たりの量または特定の体重当たりの量)は、異なる用途で変化し得る。一般に、形質導入されたT細胞の濃度は、望ましくは、少なくとも約1×106~約1×109個の形質導入されたT細胞を、さらに望ましくは、約1×107~約5×108個の形質導入されたT細胞を、治療されている対象において提供するのに十分であるべきであるが、上記を上回る任意の好適な量、例えば、5×108個を超える、または上記を下回る量、例えば、1×107個未満のいずれかで利用することができる。投与スケジュールは、十分に確立された細胞ベースの療法に基づくことができ(例えば、Topalian and Rosenberg,1987、米国特許第4,690,915号を参照されたい)、または代替の連続注入戦略を用いることができる。
これらの値は、本開示の実施のための本開示の方法を最適化する際に、実施者によって利用される形質導入されたT細胞の範囲の一般的なガイダンスを提供する。本明細書におけるそのような範囲の列挙は、特定の用途において保証され得るように、より高いまたはより低い量の構成要素の使用を決して排除しない。例えば、実際の用量およびスケジュールは、組成物が他の薬学的組成物と組み合わせて投与されるかどうか、または薬物動態、薬物消長、および代謝における個体間の差に応じて変化し得る。当業者は、特定の状況の緊急性に応じて、任意の必要な調整を容易に行うことができる。
IV.例示的なヒト抗原受容体T細胞
上述のように、本開示は、CD8+CD161+T細胞の培養および使用に関する。
上述のように、本開示は、CD8+CD161+T細胞の培養および使用に関する。
CD8(分化抗体群8)は、T細胞受容体(TCR)の共受容体として機能する膜貫通糖タンパク質である。TCRと同様に、CD8は、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子に結合するが、クラスI MHCタンパク質に特異的である。このタンパク質の2つのアイソフォーム、αおよびβがあり、それぞれ異なる遺伝子によってコードされている。ヒトでは、両方の遺伝子は2p12位の2番染色体上に位置している。
CD8共受容体は、主に細胞傷害性T細胞の表面に発現されるが、ナチュラルキラー細胞、皮質胸腺細胞、および樹状細胞にも見出すことができる。CD8分子は、細胞傷害性T細胞集団のマーカーである。これは、T細胞リンパ芽球性リンパ腫および色素沈着性真菌症性肉芽腫で発現される。
機能するために、CD8は、一対のCD8鎖からなる二量体を形成する。CD8の最も一般的な形態は、CD8-αおよびCD8-β鎖から構成され、これらはいずれも、薄い柄部によって膜に接続された免疫グロブリン可変(IgV)様細胞外ドメイン、および細胞内尾部を有する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CD8-α鎖の非共通ホモ二量体もいくつかの細胞上で発現する。各CD8鎖の分子量は約34kDaである。CD8分子の構造は、Leahy,D.J.,Axel,R.、およびHendrickson,W.A.によって、2.6Aの分解能でX線回折により決定された。構造は、免疫グロブリン様βサンドイッチ折り畳みおよび114個のアミノ酸残基を有することが決定された。タンパク質の2%はαヘリックスに巻かれ、46%はβシートに巻かれ、分子の残りの52%はループ部分に残っている。
CD8-αの細胞外IgV様ドメインは、クラスI MHC分子のα3部分と相互作用する。この親和性は、抗原特異的活性化中に、細胞傷害性T細胞のT細胞受容体と標的細胞とが密接に結合した状態を維持する。CD8表面タンパク質を有する細胞傷害性T細胞は、CD8+細胞と呼ばれる。主な認識部位は、MHC分子のα3ドメインにおけるフレキシブルループである。これは変異分析を行うことによって発見された。フレキシブルα3ドメインは、ゲノム内の残基223と229との間に位置する。CD8共受容体は、細胞傷害性T細胞抗原相互作用を補助することに加えて、T細胞シグナル伝達においても役割を果たす。CD8共受容体の細胞質尾部は、Lck(リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ)と相互作用する。T細胞受容体がその特異的抗原Lckに結合すると、TCR複合体の細胞質CD3およびζ鎖がリン酸化され、これがリン酸化のカスケードを開始し、最終的に、特定の遺伝子の発現に影響を及ぼすNFAT、NF-κB、およびAP-1などの転写因子の活性化につながる。
KLRB1またはNKR-P1Aとしても知られるCD161は、外部C末端を有するため、II型膜タンパク質として分類される。CD161は、機能的リガンドとしてレクチン様転写産物-1(LLT1)を認識する。ナチュラルキラー(NK)細胞は、細胞傷害を媒介し、免疫刺激後にサイトカインを分泌するリンパ球である。糖タンパク質のげっ歯類NKRP1ファミリーを含むC型レクチンスーパーファミリーのいくつかの遺伝子は、NK細胞によって発現され、NK細胞機能の調節に関与し得る。CD161は、C型レクチンに特徴的ないくつかのモチーフを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含有する。
一態様では、本実施形態の組成物および方法は、キメラ抗原受容体(またはCAR)ポリペプチド)を発現するヒトCD8+CD161+T細胞に関する。CARは、任意の抗原結合特異性を有し得るが、CAR構築物に存在する典型的な細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞外ドメインを含む。細胞外ドメインは、CAR-Tが設計される用途に応じて、所与の結合領域を含むであろう。結合領域は、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、またはscFvである。結合領域は、野生型アミノ酸配列と少なくとも、最大でも、または約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。細胞内ドメインは、ヒトCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含み得、ヒトCD28細胞内セグメントをさらに含み得る。ある特定の態様では、膜貫通ドメインは、CD28膜貫通ドメインである。
さらなる態様では、組成物は、上述のポリペプチドをコードする核酸を含み得る。ある特定の態様では、核酸配列は、ヒトコドン使用のために最適化される。
なおさらなる態様では、組成物は、本明細書に記載のポリペプチドを発現する細胞を含み得る。T細胞は、CARポリペプチドをコードする発現カセットを含んでもよい。発現カセットは、トランスポゾン、ヒトトランスポゾン、またはその組換えバリアントなどの非ウイルスベクターに含まれ得る。発現カセットは、ウイルスベクターまたはその組換えバリアントに含まれ得る。発現カセットは、ゲノム組み込みされるか、またはエピソーム的に維持されるか、またはmRNAから発現され得る。
なおさらなる態様では、本開示は、ヒトCARを発現するT細胞を作製する方法であって、発現カセットを細胞内に導入することを含み、発現カセットは、細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および1つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドをコードする、方法を含む。この方法は、標的抗原、または受容体に対する抗体で細胞を刺激して、細胞に増殖、殺傷、および/もしくはサイトカインを作製させることをさらに含んでもよく、例えば、細胞は、標的抗原担持人工抗原提示細胞で増殖もしくは増大するように刺激されてもよい。
ある特定の態様では、本開示は、ヒト疾患状態を治療するのに十分な量のヒトCARを発現する組換え細胞を患者に注入することを含む、ヒト疾患状態の治療方法を含み、ヒトCARは、細胞外標的結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。状態は、例えば、がん、自己免疫疾患、または感染症であり得る。
hCARは、CD3-ζ由来活性化ドメインなどの1つ以上の活性化エンドドメインを含むキメラ受容体であってもよい。追加のT細胞活性化モチーフとしては、CD28、CD27、OX-40、DAP10、および4-1BBが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の態様では、活性化ドメインはまた、CD28膜貫通および/または活性化ドメインを含むことができる。さらなる態様では、ヒト細胞および対象における発現のために最適化されたhCARコード領域および/または発現カセットコドン、例えば、一実施形態では、標的特異的ヒト抗体のVHおよびVL配列から得られたscFv領域が、hCARの結合セグメントに組み込まれる。別の実施形態では、hCAR発現カセットは、エピソーム的に維持されるか、または組換え細胞のゲノムに組み込まれる。ある特定の態様では、発現カセットは、インテグラーゼ機構、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター、またはトランスポゾン機構などの非ウイルスベクターを使用することによって組み込み可能な核酸に含まれる。さらなる実施形態では、発現カセットは、トランスポゾンベースの核酸に含まれる。特定の実施形態では、発現カセットは、強化された非ウイルス遺伝子移入のためにトランスポゾンおよびトランスポザーゼを利用する2成分のSleeping Beauty(SB)またはpiggyBacシステムの一部である。
組換えhCAR発現細胞は、臨床的に意味のある数値に量的に増大され得る。そのような増大の一例は、人工抗原提示細胞(aAPC)を使用する。組換えhCAR発現細胞は、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロット分析によって検証および特定され得る。T細胞を発現する組換えhCARは、CARを発現することにより、標的細胞を認識し、殺傷することができる。さらなる態様では、hCARは、免疫原性を防止するのに役立つように、移植の障壁を超えて注入され得るユニバーサル細胞に発現され得る。hCARは、細胞傷害性の場合に、(陽電子放射断層撮影、PETなどによる)イメージングおよびT細胞の条件付きアブレーションのために、ヒト遺伝子とともに使用することができる。本開示の組換え細胞は、特定の細胞療法に使用され得る。
V.微小残存病変を標的とするための例示的な膜結合IL-15共発現キメラ抗原受容体またはトランスジェニックTCR T細胞
成人および小児のB系統急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)の化学療法的治療は、それぞれ、65%および20%の薬剤耐性残存病変に起因する疾患再発率を有する。B-ALL再発の高発生率、特に予後不良群では、同種造血幹細胞移植(HSCT)を使用した免疫ベースの療法の使用が促されている。この療法は、無病生存率を改善するために、残存する白血病細胞、または微小残存病変の根絶のためにドナー移植片に存在する同種反応性細胞に依存している。ドナーリンパ球注入は、生着T細胞が同種異系HSCT後に残存B-ALLを標的にする能力を向上させるために使用されてきたが、このような患者に対するこの治療アプローチは、10%未満の寛解率を達成するにすぎず、移植片対宿主病(GVHD)の頻度および重症度からの高い罹患率および死亡率と関連している。再発が一般的で致死的な問題であるこれらの難治性悪性腫瘍では、HSCT後に末梢血単核細胞(PBMC)由来T細胞を使用した養子療法を使用して、ドナーT細胞の腫瘍関連抗原(TAA)に対する特異性を再標的化することによって、抗腫瘍効果、または移植片対白血病(GVL)効果を増加させることができる。
成人および小児のB系統急性リンパ芽球性白血病(B-ALL)の化学療法的治療は、それぞれ、65%および20%の薬剤耐性残存病変に起因する疾患再発率を有する。B-ALL再発の高発生率、特に予後不良群では、同種造血幹細胞移植(HSCT)を使用した免疫ベースの療法の使用が促されている。この療法は、無病生存率を改善するために、残存する白血病細胞、または微小残存病変の根絶のためにドナー移植片に存在する同種反応性細胞に依存している。ドナーリンパ球注入は、生着T細胞が同種異系HSCT後に残存B-ALLを標的にする能力を向上させるために使用されてきたが、このような患者に対するこの治療アプローチは、10%未満の寛解率を達成するにすぎず、移植片対宿主病(GVHD)の頻度および重症度からの高い罹患率および死亡率と関連している。再発が一般的で致死的な問題であるこれらの難治性悪性腫瘍では、HSCT後に末梢血単核細胞(PBMC)由来T細胞を使用した養子療法を使用して、ドナーT細胞の腫瘍関連抗原(TAA)に対する特異性を再標的化することによって、抗腫瘍効果、または移植片対白血病(GVL)効果を増加させることができる。
現在、CAR改変T細胞は、腫瘍抗原との遭遇時にのみ生じるCARを介した生存シグナル伝達を得ることに依存している。これらのCAR改変T細胞が巨大病変を有する患者に注入される臨床的状況では、CARを介して十分な活性化および生存シグナル伝達を提供するために、十分な腫瘍抗原が存在する。しかしながら、再発したB-ALL患者は、多くの場合、骨髄機能廃絶化学療法、続いてHSCTを行い、微小残存病変(MRD)を呈する。この場合、患者は低い腫瘍細胞量を有し、微小レベルのTAAは、注入されたT細胞を支持するために必要なCAR媒介性シグナル伝達を厳しく制限し、結果として治療的可能性を損なわれる。T細胞の持続性を改善するための代替のCAR非依存性手段は、CAR改変T細胞の生着を改善することが予想される。
一般的なガンマ鎖受容体ファミリー(γC)内のサイトカインは、リンパ系の機能、生存、および増殖に重要なT細胞にとって重要な共刺激分子である。IL-15は、養子療法に望ましいいくつかの属性を有する。IL-15は、長寿命化メモリー細胞傷害性T細胞の生存を支援し、腫瘍常在細胞の機能的抑制を緩和することによって確立された腫瘍の根絶を促進し、AICDを阻害する恒常性サイトカインである。
IL-15は組織に制限があり、病理学的条件下でのみ、血清中の任意のレベル、または全身で観察される。周囲環境に分泌される他のγCサイトカインとは異なり、IL-15は、産生細胞によって、IL-15受容体アルファ(IL-15Rα)との関連でT細胞にトランス提示される。このサイトカインのT細胞および他の応答細胞への独自の送達機構は:(i)高度に標的化かつ局在化されており、(ii)IL-15の安定性および半減期を増加させ、かつ(iii)可溶性IL-15によって達成されるものとは質的に異なるシグナル伝達をもたらす。
一実施形態では、本開示は、例えば、微小残存病変(MRD)を呈する白血病患者を治療する目的で、長寿命化インビボ可能性を有するキメラ抗原受容体(CAR)改変T細胞またはトランスジェニックTCR T細胞を生成する方法を提供する。全体として、本方法は、サイトカインなどの可溶性分子を細胞表面に融合させて、治療的可能性を増大させる方法を記載する。本方法の核心は、CAR T細胞またはトランスジェニックTCR T細胞を、インターロイキン-15(IL-15)のヒトサイトカイン変異タンパク質(mutein)(以下、mIL15と呼ぶ)と共改変することに依存する。mIL15融合タンパク質は、フレキシブルセリン-グリシンリンカーを介して完全長IL15受容体αに融合したIL-15のコドン最適化cDNA配列から構成される。このIL-15変異タンパク質は、以下のように設計された:(i)mIL15の発現をCAR+またはトランスジェニックTCR+T細胞の表面に制限して、サイトカインの非標的インビボ環境への拡散を制限し、それによって、外因性可溶性サイトカイン投与が毒性をもたらしたら、その安全性プロファイルを潜在的に改善し、(ii)IL-15Rαとの関連で、IL-15を提示して、生理学的に適切で定性的なシグナル伝達を模倣し、かつIL-15/IL-15Ra複合体の安定化およびリサイクルをより長いサイトカイン半減期にわたって行う。mIL15を発現するT細胞は、注入後の生存に重要な、継続的な支持サイトカインシグナル伝達が可能である。臨床的に適用可能なプラットフォーム上での非ウイルスSleeping Beautyシステム遺伝子改変およびその後のエクスビボ増大によって生成されたmIL15+CAR+T細胞またはmIL15+トランスジェニックTCR+T細胞は、高腫瘍細胞量、低腫瘍細胞量の、または腫瘍細胞量を有しないマウスモデルにおいて、注入後の持続性が向上したT細胞注入生成物を得た。さらに、mIL15+CAR+T細胞は、高腫瘍細胞量または低腫瘍細胞量のモデルの両方において、改善された抗腫瘍有効性も示した。
高腫瘍細胞量のモデルにおけるCAR+T細胞に対するmIL15+CAR+T細胞の改善された持続性および抗腫瘍活性は、腫瘍細胞量が優勢である活動的な疾患を有する白血病患者を治療する際に、mIL15+CAR+T細胞が、CAR+T細胞がよりも有効であり得ることを示す。したがって、mIL15+CAR+T細胞は、最も広範な用途において、養子療法においてCAR+T細胞に取って代わることができる。mIL15+CAR+T細胞がCARを介して生存シグナル伝達から独立して生存する能力は、これらの改変T細胞が、腫瘍抗原の欠如にもかかわらず、注入後も持続することを可能にする。したがって、これは、特に骨髄機能廃絶化学療法および造血幹細胞移植を受けた患者において、MRD治療現場での治療有効性において最大の影響をもたらすと予想される。これらの患者は、MRDを治療し、再発を予防するために、mIL15+CAR+T細胞とともに養子T細胞移入を受ける。
mIL15などの膜結合サイトカインは、広範にわたる影響を有する。膜結合IL-15に加えて、他の膜結合型サイトカインが想定される。膜結合サイトカインは、ヒト用途に使用される細胞の活性化および繁殖に関連する他の分子の細胞表面発現にも拡張することができる。これらには、サイトカイン、ケモカイン、およびヒト用途に使用される細胞の活性化および増殖に寄与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。
mIL15などの膜結合サイトカインは、ヒト用途のために細胞を調製するためにエクスビボで使用することができ、ヒト用途に使用される注入細胞(例えば、T細胞)上で使用することができる。例えば、膜結合IL-15は、K562に由来するなどの人工抗原提示細胞(aAPC)上で発現させて、活性化および/または増殖のためにT細胞およびNK細胞(ならびに他の細胞)を刺激することができる。aAPC上でmIL15によって活性化/繁殖されたT細胞の集団は、遺伝子改変リンパ球を含むが、腫瘍浸潤性リンパ球、および他の免疫細胞も含む。これらのaAPCは注入されない。対照的に、mIL15(および他の膜結合分子)は、注入されるT細胞、および他の細胞上で発現することができる。
CAR改変T細胞によるMRD治療の治療有効性は、T細胞の養子移入後の持続性の欠如によって妨げられる。mIL15+CAR+T細胞またはmIL15+トランスジェニックTCR+T細胞の腫瘍抗原とは無関係に長期にインビボで生存する能力は、MRDを有する患者を治療するための大きな可能性を示す。この場合、MRD患者に対する現在のアプローチが不十分であるため、mIL15およびそれをサポートする持続性T細胞は、ニーズに対処する。MRDを有する患者に注入されるT細胞および他のリンパ球の持続性は、CAR+T細胞を超えて適用される。悪性腫瘍、感染症、または自己免疫疾患を治療および予防するために使用される任意の免疫細胞は、継続的な治療効果を達成するためには、長期にわたって持続することができなければならない。したがって、内因性T細胞受容体または導入された免疫受容体に由来するシグナルを超える持続性のためにT細胞を活性化することは、養子免疫療法の多くの様相で重要である。したがって、膜結合サイトカインの発現は、様々な病理学的条件のために注入されたT細胞および他の免疫細胞の治療可能性ならびに持続性を増強するために使用され得る。
本発明者らは、CAR+T細胞またはトランスジェニックTCR+T細胞上でIL-15およびIL-15Rα(mIL15)の膜結合融合タンパク質として発現されるIL-15変異タンパク質を生成した。mIL15構築物を(0日目に)CD19特異的CARとともに、2つのSleeping Beauty DNAトランスポゾンプラスミドとして初代ヒトT細胞に共電気泳動転写した(co-electro-transferred)。CD19+人工抗原提示細胞および補充IL-21上での共培養によって、臨床的に関連する数のmIL15+CAR+T細胞を生成した。遺伝子改変T細胞におけるIL-15受容体複合体を通じたシグナル伝達は、STAT5のリン酸化(pSTAT5)によって検証され、これらのT細胞は、CAR+T細胞と同等のCD19+腫瘍標的のリダイレクトされた特異的溶解を示した。さらに、抗原枯渇後、mIL15によって生成されたシグナル伝達は、特異的な細胞表面マーカー、転写因子、およびIL-2を分泌する能力を含むメモリー関連属性を有する、分化の少ない/若い表現型を有するT細胞の有病率を増加させた。これらの特徴は、養子移入で使用されるT細胞における望ましい形質であり、それらは、インビボで長期にわたって持続する能力が実証されているT細胞サブセットと相関している。播種性CD19+白血病を有する免疫不全NSGマウスにおいて、mIL15+CAR+T細胞は、持続性および抗腫瘍効果の両方を示したが、CAR+T細胞対応物は、TAAの存在にもかかわらず、著しい持続性を維持することができなかった。mIL15+/-CAR+T細胞を6日間最初に生着し、続いて播種性CD19+白血病を導入した予防マウス(NSG)モデルでは、mIL15+CAR+T細胞のみが持続し、かつ腫瘍生着を防止することが見出された。mIL15+CAR+T細胞がTAAからの刺激に無関係に持続可能であったかどうかを試験するために、mIL15+/-CAR+T細胞を、腫瘍を有しないNSGマウスに養子移入した。mIL15+CAR+T細胞のみが、外因性サイトカインのサポートまたはCD19 TAAの存在なしに、このインビボ環境で持続することができた。これらのデータは、mIL15が、CAR+T細胞またはトランスジェニックTCR+T細胞上で共発現され、TAAまたは外因性サイトカインのサポートを必要とせずにインビボでの持続性を向上させることができることを実証する。要約すると、このサイトカイン融合分子は、(i)腫瘍特異的機能性を維持しながらインビボT細胞持続性の増強をもたらすpSTAT5を介して刺激シグナルを提供し、(ii)メモリー様表現型を促進するT細胞サブセットを維持し、(iii)インビトロおよびインビボT細胞増大および持続性に対する臨床グレードIL-2の必要性および費用を排除し、かつ(iv)臨床グレード可溶性IL-15の必要性を軽減する。
VI.膵臓腺がん
膵臓がんは、胃の後ろにある腺器官である膵臓の細胞が、制御不能な状態で増殖し始め、腫瘤を形成する場合に生じる。これらのがん細胞は、身体の他の部分に侵入する能力を有している。膵臓がんには多数の種類がある。最も一般的な膵臓腺がんは、約85%の症例を占め、「膵臓がん」という用語は、その種類のみを指すために使用される場合がある。これらの腺がんは、消化酵素を作る膵臓の部分から始まる。非腺がんの大部分を総称するいくつかの他の種類のがんもまた、これらの細胞から生じ得る。膵臓がんの症例の1~2パーセントは神経内分泌腫瘍であり、これは膵臓のホルモン産生細胞から生じる。これらは一般に、膵臓腺がんよりも侵襲性が低い。
膵臓がんは、胃の後ろにある腺器官である膵臓の細胞が、制御不能な状態で増殖し始め、腫瘤を形成する場合に生じる。これらのがん細胞は、身体の他の部分に侵入する能力を有している。膵臓がんには多数の種類がある。最も一般的な膵臓腺がんは、約85%の症例を占め、「膵臓がん」という用語は、その種類のみを指すために使用される場合がある。これらの腺がんは、消化酵素を作る膵臓の部分から始まる。非腺がんの大部分を総称するいくつかの他の種類のがんもまた、これらの細胞から生じ得る。膵臓がんの症例の1~2パーセントは神経内分泌腫瘍であり、これは膵臓のホルモン産生細胞から生じる。これらは一般に、膵臓腺がんよりも侵襲性が低い。
膵臓がんの最も一般的な形態の徴候および症状は、黄色の皮膚、腹痛または腰痛、原因不明の体重減少、薄い色の便、暗色の尿、および食欲不振を含み得る。通常、疾患の初期段階には症状はなく、膵臓がんを示唆するほど特異的な症状は、疾患が進行段階に達するまで発症しない。診断の時点で、膵臓がんはしばしば身体の他の部分に広がっている。
膵臓がんは40歳未満で発症することはほとんどなく、膵臓腺がんの症例の半数超が70歳超で発症する。膵臓がんの危険因子としては、喫煙、肥満、糖尿病、およびある特定の稀な遺伝的状態が挙げられる。症例の約25%が喫煙に関連しており、5~10%が受け継がれた遺伝子に関連している。膵臓がんは、通常、超音波またはコンピュータ断層撮影などの医学的イメージング技術、血液検査、および組織試料の検査(生検)などの組み合わせによって診断される。疾患は早期(I期)から後期(IV期)までの病期に分けられる。一般集団へのスクリーニングは有効性が認められていない。
膵臓がんを発症するリスクは、非喫煙者、および健康的な体重を維持し、赤身または加工肉の摂取を制限する人々の間では低い。喫煙者が喫煙をやめる場合、疾患を発症する可能性は減少し、20年後にはほぼ他の人々の可能性に戻る。膵臓がんは、手術、放射線療法、化学療法、緩和ケア、またはこれらの組み合わせで治療することができる。治療の選択肢は、部分的にはがんの病期に基づいている。手術は、膵臓腺がんを治癒することができる唯一の治療であり、治癒の可能性なしに生活の質を向上させるためにも行われ得る。疼痛管理および消化を改善する薬剤が必要な場合がある。治癒を目指す治療を受けている人でも、早期の緩和ケアが推奨される。
2015年には、すべての種類の膵臓がんは、世界で411,600人の死者をもたらした。膵臓がんは、英国ではがんの5番目に多い死因であり、米国では3番目に多い死因である。この疾患は、先進国で非常に頻繁に発生しており、ここでは2012年の新規症例の約70%が発症している。膵臓腺がんは通常、予後が非常に悪く、診断後、25%の人が1年生存し、5%の人が5年生存する。早期に診断されたがんの場合、5年生存率は20%程度まで上昇する。神経内分泌がんは、より良い転帰を有し、診断から5年で、診断された人の65%が生存しているが、腫瘍の種類によって生存率は大きく異なる。
VII.免疫系および免疫療法
いくつかの実施形態では、医学的障害は、特定の免疫応答を誘発するリダイレクトT細胞の移入によって治療される。本開示の一実施形態では、B細胞系統悪性腫瘍または障害は、特異的免疫応答を誘発するリダイレクトT細胞の移入によって治療される。したがって、免疫応答の基本的な理解が必要である。
いくつかの実施形態では、医学的障害は、特定の免疫応答を誘発するリダイレクトT細胞の移入によって治療される。本開示の一実施形態では、B細胞系統悪性腫瘍または障害は、特異的免疫応答を誘発するリダイレクトT細胞の移入によって治療される。したがって、免疫応答の基本的な理解が必要である。
適応免疫系の細胞は、リンパ球と呼ばれる白血球の一種である。B細胞およびT細胞は、リンパ球の主な種類である。B細胞およびT細胞は、同じ多能性造血幹細胞に由来し、活性化されるまで互いに区別できない。B細胞は体液性免疫応答において大きな役割を果たすが、T細胞は細胞媒介性免疫応答に密接に関与する。これらは、T細胞受容体(TCR)と呼ばれる細胞表面上の特別な受容体の存在によって、B細胞およびNK細胞などの他のリンパ球型と区別することができる。ほとんどすべての他の脊椎動物において、B細胞およびT細胞は、骨髄内の幹細胞によって産生される。T細胞は胸腺に移動して発達し、そこから名前の由来となっている。ヒトでは、リンパ球プールの約1%~2%は、抗原特異的リンパ球が二次リンパ組織内でその特異的抗原を発見する機会を最適化するために、時々刻々と再循環する。
Tリンパ球は、骨髄の造血幹細胞から生じ、典型的には胸腺に移行して成熟する。T細胞は、膜上に独自の抗原結合受容体(T細胞受容体)を発現し、これは、他の細胞の表面上の主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子と会合してのみ抗原を認識することができる。少なくとも2つの集団のT細胞があり、Tヘルパー細胞およびT細胞傷害性細胞として知られている。Tヘルパー細胞およびT細胞傷害性細胞は、それぞれ、膜結合糖タンパク質CD4およびCD8の表示によって主に区別される。Tヘルパー細胞は、B細胞、T細胞傷害性細胞、マクロファージ、および免疫系の他の細胞の活性化に不可欠な様々なリンホカインを秘匿する。対照的に、抗原-MHC複合体を認識するT細胞傷害性細胞は増殖し、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。CTLは、細胞溶解をもたらす物質を産生することによって、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞などの抗原を示す身体の細胞を排除する。ナチュラルキラー細胞(またはNK細胞)は、先天性免疫系の主要な構成要素を構成する細胞傷害性リンパ球の一種である。NK細胞は、腫瘍およびウイルスによって感染した細胞の拒絶において主要な役割を果たす。細胞は、パーフォリンおよびグランザイムと呼ばれるタンパク質の小さな細胞質顆粒を放出することによって、標的細胞をアポトーシスによって死滅させる。
マクロファージ、Bリンパ球、および樹状細胞を含む抗原提示細胞は、特定のMHC分子の発現によって区別される。APCは、抗原を内在化し、その抗原の一部を、それらの外側細胞膜上のMHC分子とともに再発現する。主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)は、複数の遺伝子座を有する大きな遺伝子複合体である。MHC遺伝子座は、クラスIおよびクラスII MHCと呼ばれるMHC膜分子の2つの主要なクラスをコードする。ヘルパーTリンパ球は、一般に、MHCクラスII分子と関連付けられた抗原を認識し、T細胞傷害性リンパ球は、MHCクラスI分子と関連付けられた抗原を認識する。ヒトでは、MHCはHLA複合体と呼ばれ、マウスではH-2複合体と呼ばれる。
T細胞受容体、またはTCRは、Tリンパ球(またはT細胞)の表面に見出される分子であり、一般に、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子に結合した抗原の認識を担っている。T細胞の95%ではα鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体であるが、T細胞の5%ではガンマ鎖およびデルタ鎖からなるTCRを有する。TCRと抗原およびMHCとの係合は、関連する酵素、共受容体、および特殊な付属分子によって媒介される一連の生化学的事象を通じて、そのTリンパ球の活性化をもたらす。免疫学において、CD3抗原(CDは分化抗原群の略)は、哺乳動物における4つの異なる鎖(CD3γ、CD3δ、および2倍CD3ε)からなるタンパク質複合体であり、T細胞受容体(TCR)およびζ鎖として知られる分子と会合して、Tリンパ球において活性化シグナルを生成する。TCR、ζ鎖、およびCD3分子はともに、TCR複合体を含む。CD3γ、CD3δ、およびCD3ε鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。CD3鎖の膜貫通領域は負に帯電しており、この特徴は、これらの鎖が正に帯電したTCR鎖(TCRαおよびTCRβ)と会合することを可能にする。CD3分子の細胞内尾部は、TCRのシグナル伝達能に不可欠な、免疫受容体チロシン系活性化モチーフまたは略してITAMとして知られる単一の保存されたモチーフを含有する。
CD28は、T細胞活性化に必要とされる、共刺激シグナルを提供するT細胞上で発現される分子のうちの1つである。CD28は、B7.1(CD80)およびB7.2(CD86)の受容体である。Toll様受容体リガンドによって活性化されると、B7.1発現は抗原提示細胞(APC)において上方調節される。抗原提示細胞上のB7.2発現は構成的である。CD28は、ナイーブT細胞上で構成的に発現される唯一のB7受容体である。TCRに加えてCD28を介した刺激は、様々なインターロイキン(特にIL-2およびIL-6)の産生のためにT細胞に強力な共刺激シグナルを提供することができる。
ヒト疾患の治療的介入として抗原特異的T細胞を単離および増大させる戦略は、臨床試験において検証されている(Riddell et al.,1992、Walter et al.,1995、Heslop et al.,1996)。
自己免疫疾患、または自己免疫は、生物が自身の構成要素を(サブ分子レベルまで)「自己」として認識することに失敗することであり、その結果、自己の細胞および組織に対して免疫応答を引き起こす。そのような異常な免疫応答から生じるいかなる疾患も、自己免疫疾患と称される。顕著な例としては、セリアック病、1型糖尿病(IDDM)、全身性エリテマトーデス(SLE)、シェーグレン症候群、多発性硬化症(MS)、橋本甲状腺炎、グレーブス病、特発性血小板減少性紫斑病、および関節リウマチ(RA)が挙げられる。
自己免疫疾患を含む炎症性疾患も、B細胞障害に関連する疾患のクラスである。自己免疫疾患の例としては、急性特発性血小板減少性紫斑病、慢性特発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、リウマチ熱、多腺症候群、水疱性天疱瘡、真性糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌後腎炎、結節性紅斑、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、IgA腎炎、結節性多発動脈炎、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans)、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変症、橋本甲状腺炎、甲状腺中毒症、強皮症、慢性活性肝炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性天疱瘡、ウェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄癆、巨細胞性動脈炎/多発筋痛、悪性貧血、急速進行性糸球体腎炎、乾癬、および繊維化性肺胞炎が挙げられるが、これらに限定されない。最も一般的な治療は、コルチコステロイドおよび細胞傷害性薬物であり、これは非常に毒性があり得る。これらの薬剤はまた、免疫系全体を抑制し、重篤な感染症をもたらし得、骨髄、肝臓、および腎臓に悪影響を及ぼす。これまでクラスIII自己免疫疾患を治療するために使用されてきた他の治療薬は、T細胞およびマクロファージに向けられてきた。自己免疫疾患、特にクラスIII自己免疫疾患を治療するためのより効果的な方法が必要である。
VIII.人工抗原提示細胞
いくつかの実施形態では、aAPCは、実施形態の治療用組成物および細胞療法製品の調製に有用である。抗原提示系の調製および使用に関する一般的なガイダンスについては、例えば、米国特許第6,225,042号、同第6,355,479号、同第6,362,001号および同第6,790,662号、米国特許出願公開第2009/0017000号および同第2009/0004142号、ならびに国際公開第2007/103009号を参照されたい)。
いくつかの実施形態では、aAPCは、実施形態の治療用組成物および細胞療法製品の調製に有用である。抗原提示系の調製および使用に関する一般的なガイダンスについては、例えば、米国特許第6,225,042号、同第6,355,479号、同第6,362,001号および同第6,790,662号、米国特許出願公開第2009/0017000号および同第2009/0004142号、ならびに国際公開第2007/103009号を参照されたい)。
aAPCは典型的には、追加の処理なしに、MHC分子へのペプチドの直接結合を可能にする最適長のペプチドとともにインキュベートされる。あるいは、細胞は、発現することができ、かつ目的の抗原(すなわち、MHC非依存性抗原認識の場合)。目的のペプチド-MHC分子または抗原に加えて、aAPC系はまた、少なくとも1つの外因性補助分子を含み得る。補助分子の任意の好適な数および組み合わせを用いてもよい。補助分子は、共刺激分子および接着分子などの補助分子から選択され得る。例示的な共刺激分子としては、CD70およびB7.1(B7.1は以前にB7として知られており、CD80としても知られていた)が挙げられ、これらはとりわけ、T細胞の表面上のCD28および/またはCTLA-4分子に結合し、それによって、例えば、T細胞の増大、Th1分化、短期T細胞生存、およびインターロイキン(IL)-2などのサイトカイン分泌に影響を及ぼす(Kim et al.,2004を参照されたい)。接着分子としては、例えば、細胞間または細胞対マトリックス接触を促進する、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、および細胞間接着分子(ICAM)などのシングルパス膜貫通免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリータンパク質が挙げられ得る。例示的な接着分子としては、LFA-3およびICAM-1などのICAMが挙げられる。共刺激分子および接着分子を含む、例示的な補助分子の選択、クローニング、調製、および発現に有用な技術、方法、および試薬は、例えば、米国特許第6,225,042号、同第6,355,479号、および同第6,362,001号に例示されている。
aAPCになるように選択された細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチド輸送、および/または細胞内MHCクラスIもしくはクラスII分子ペプチド装填における欠陥を有するか、あるいはポイキロサーミック(すなわち、哺乳類細胞株よりも温度チャレンジに対する感受性が低い)であるか、あるいは欠陥およびポイキロサーミック特性の両方を有する。好ましくは、aAPCになるように選択された細胞は、外因性MHCクラスIまたはクラスII分子に少なくとも1つの内因性対応物(例えば、上述の内因性MHCクラスIもしくはクラスII分子および/または内因性補助分子)を発現し、細胞に導入される補助分子成分を補助する能力も欠く。さらに、aAPCは、好ましくは、aAPCを生成するためにそれらの改変前に細胞によって保有されていた欠陥およびポイキロサーミック特性を保持する。例示的なaAPCは、昆虫細胞株などの抗原プロセシング(TAP)欠損細胞株に関連するトランスポーターを構成するか、またはそれに由来する。例示的なポイキロサーミック昆虫細胞株は、シュナイダー2細胞株などのショウジョウバエ細胞株である(例えば、Schneider,1972を参照されたい)。シュナイダー2細胞の調製、増殖、および培養のための例示的な方法は、米国特許第6,225,042号、同第6,355,479号、および同第6,362,001号に提供されている。
一実施形態では、aAPCはまた、凍結融解サイクルに供される。例示的な凍結融解サイクルでは、aAPCを含有する好適な容器を、凍結が速やかに起こるように、適切な量の液体窒素、固体二酸化炭素(すなわち、ドライアイス)、または同様の低温材料と接触させることによって、aAPCを凍結してもよい。次いで、低温材料からのaAPCの除去および周囲室温条件への曝露のいずれかにより、またはぬるま湯浴もしくは温かい手を使用して短い解凍時間を促進する容易な解凍プロセスにより、凍結されたaAPCを解凍する。さらに、aAPCは、解凍前に凍結され、長期間保存されてもよい。凍結されたaAPCは、さらなる使用の前に解凍され、次いで凍結乾燥されてもよい。好ましくは、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ポリエチレングリコール(PEG)、および他の保存剤等の、凍結融解手順に有害な影響を及ぼす可能性のある保存剤は、凍結融解サイクルを受けるaAPCを含有する培地には存在しないか、または本質的に除去され、例えば、aAPCを、本質的にそのような保存剤を含まない培地に移すことによって除去される。
他の好ましい実施形態では、異種核酸およびaAPCに内因性の核酸は、架橋によって不活性化されてもよく、その結果、不活性化後に核酸の細胞増殖、複製または発現は本質的に発生しない。一実施形態では、aAPCは、外因性MHCおよび補助分子の発現、aAPCの表面上のそのような分子の提示、ならびに提示されたMHC分子の選択されたペプチド(複数可)での装填の後の時点で不活性化される。したがって、そのような不活性化および選択されたペプチド装填aAPCは、本質的に増殖または複製することができなくなる一方で、選択されたペプチド提示機能を保持する。好ましくは、架橋はまた、aAPCの抗原提示細胞機能を実質的に低下させることなく、細菌およびウイルスなどの汚染微生物を本質的に含まないaAPCをもたらす。したがって、架橋は、aAPCの重要なAPC機能を維持すると同時に、aAPCを使用して開発された細胞療法製品の安全性に関する懸念を緩和するのに役立つ。架橋およびaAPCに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2009/0017000号を参照されたい。
IX.本開示のキット
本明細書に記載される組成物のいずれかは、キットに含まれ得る。いくつかの実施形態では、同種異系CAR T細胞がキットに提供され、これはまた、培地、aAPC、成長因子、抗体(例えば、CAR T細胞を選別または特徴付けるための)、および/またはCARもしくはトランスポザーゼをコードするプラスミドなどの細胞の増大に好適な試薬を含み得る。
本明細書に記載される組成物のいずれかは、キットに含まれ得る。いくつかの実施形態では、同種異系CAR T細胞がキットに提供され、これはまた、培地、aAPC、成長因子、抗体(例えば、CAR T細胞を選別または特徴付けるための)、および/またはCARもしくはトランスポザーゼをコードするプラスミドなどの細胞の増大に好適な試薬を含み得る。
非限定的な例では、キメラ受容体発現構築物、キメラ受容体発現構築物を生成するための1つ以上の試薬、発現構築物のトランスフェクションのための細胞、および/または発現構築物のトランスフェクションのための同種異系細胞を得るための1つ以上の器具(そのような器具は、シリンジ、ピペット、鉗子、および/または任意のそのような医学的に承認された装置であってもよい)。
いくつかの実施形態では、内因性TCR α/β発現を排除するための発現構築物、構築物を生成するための1つ以上の試薬、および/またはCAR+T細胞が、キットに提供される。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする発現構築物が含まれる。
いくつかの態様では、キットは、細胞のエレクトロポレーションのための試薬または装置を含む。
キットは、本開示の組成物を生成するために、本開示の1つ以上の好適に等分された組成物または試薬を含み得る。キットの構成要素は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装してもよい。キットの容器手段は、少なくとも1つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の容器手段を含み得、構成要素は、その中に配置されてもよく、好ましくは、好適に等分されてもよい。キット内に複数の構成要素がある場合、キットは、一般に、追加の構成要素が別々に配置され得る第2、第3、または他の追加の容器も含有する。しかしながら、成分の様々な組み合わせは、バイアルに含まれてもよい。本開示のキットはまた、典型的には、キメラ受容体構築物および任意の他の試薬容器を商業的販売のために密閉収容するための手段を含む。そのような容器は、例えば、所望のバイアルが保持されている注入または吹込み成形プラスチック容器を含んでもよい。
以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本開示の実施において良好に機能するために発明者によって発見された技術を表し、したがってその実施のために好ましいモードを構成すると見なすことができることが当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、依然として本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
実施例1-材料および方法
マウスマイクロアレイ分析. CD8+NK1.1+細胞およびCD8+NK1.1neg細胞を、以前に膵臓腫瘍を受容したマウスから単離し、ゲムシタビン化学療法と併せて細胞ベースのワクチンで治療的に処置した(Konduri et al.,2016)。単離された細胞を、PDAC抗原装填自己DCで活性化し、総RNAを、製造業者の説明書に従って、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して単離した。CD8+NK1.1+およびCD8+NK1.1neg細胞の遺伝子発現プロファイリングを、Affymetrixマウストランスクリプトームアレイ1.0チップ(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)を用いて、テキサス大学MDアンダーソンがんセンター(Texas MD Anderson Cancer Center(Houston,TX))の配列決定およびマイクロアレイ施設によって行った。
マウスマイクロアレイ分析. CD8+NK1.1+細胞およびCD8+NK1.1neg細胞を、以前に膵臓腫瘍を受容したマウスから単離し、ゲムシタビン化学療法と併せて細胞ベースのワクチンで治療的に処置した(Konduri et al.,2016)。単離された細胞を、PDAC抗原装填自己DCで活性化し、総RNAを、製造業者の説明書に従って、RNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用して単離した。CD8+NK1.1+およびCD8+NK1.1neg細胞の遺伝子発現プロファイリングを、Affymetrixマウストランスクリプトームアレイ1.0チップ(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)を用いて、テキサス大学MDアンダーソンがんセンター(Texas MD Anderson Cancer Center(Houston,TX))の配列決定およびマイクロアレイ施設によって行った。
インフルエンザモデル. 養子移入のためのT細胞を生成するために、C57/BL6マウスを、Brian Gilbert博士から丁重に提供されたH3N2 A型インフルエンザウイルスのスイスマウス肺適応株であるA型インフルエンザ/HongKong/8/68(H3N2)で、記載されるように(Liang et al.,2017)チャレンジした。感染は、Aridyne 2000空気圧縮機から生成された10L/分の室内空気に起因するAerotech IIネブライザーを使用して、MEM培地+0.05%ゼラチン中で希釈されたインフルエンザウイルスの20分間の噴霧されたエアロゾル曝露で実施した。任意の所与の実験で感染したすべてのマウスを、単一の曝露室内で同時に感染させた。感染から2週間後、マウスを屠殺し、脾臓を採取し、CD8+細胞を陰性選択(Miltenyi Biotec)した。単離されたCD8+細胞をさらに、NK1.1+およびNK1.1neg集団に磁気選別(Miltenyi Biotec)した。続いて、500,000個のCD8+NK1.1+およびCD8+NK1.1neg細胞をインフルエンザウイルスでチャレンジしたナイーブマウスに養子移入した。
黒色腫モデル. 養子移入のためのT細胞を生成するために、C57/BL6マウスに、100μlのPBS中に懸濁させた250,000個のB16F10黒色腫腫瘍細胞(American Type Culture Collection,Manassas,VA,)を皮下接種した。記載されるように、DCに黒色腫腫瘍抗原を装填させた(Konduri et al.,2016)。腫瘍接種の1週間後、50μlのPBS中に懸濁した200,000個の抗原装填DCを、7日後に投与されたブースターワクチン接種を足裏に注射した。ブースト後10日、ワクチン接種したマウスを屠殺し、CD8+脾細胞を陰性選択(Miltenyi Biotec)によって単離した。単離されたCD8+細胞をさらに、NK1.1+およびNK1.1neg集団に磁気選別(Miltenyi Biotec)した。それぞれ8匹のナイーブマウスの3つの群に、250,000個のB16F10腫瘍細胞の皮下注射を行った。各群が類似した平均腫瘍サイズおよび標準誤差を有するように、腫瘍サイズを記録し、動物を無作為化した。腫瘍接種の7日後、処置群のマウスは、腹腔内養子移入によって、CD8+NK1.1+細胞またはCD8+NK1.1-細胞の各150万個を受容した。ナイーブマウスは、未処置の対照として機能した。腫瘍サイズは、外部キャリパー測定により決定し、式(長さ×幅2)×π/6により算出した。対照群における腫瘍細胞量が比較医学センター(CCM)によって設定された許容限界を超えると、マウスを腫瘍接種の22日後に安楽死させた。
マウスPBMCの分析. インフルエンザ感染の2週間後または腫瘍移植の3週間後に、後眼窩静脈叢からの採血により、養子移入を受けたマウスからPBMCを採取した。赤血球を、製造業者の説明書に従い、塩化アンモニウム(Sigma-Aldrich)で処理することによって溶解させた。白血球ペレットをPBSで1回洗浄し、10%マウス血清を含むAIM-V培地に再懸濁した。フローサイトメトリーによる分析のために、細胞を抗CD3、CD4、CD8、CD25、IFN-γで染色した。すべてのフローサイトメトリー分析は、LSR IIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して実施し、OS-XについてFlowJoバージョン10.0.00003(Tree Star Inc.,Ashland,OR)で分析した。
ヒトのマイクロアレイ分析. CD8+CD161+およびCD8+CD161neg細胞を、3人の健康なドナーおよび3人のPDAC患者に由来する末梢血から磁気的に分離した。単離された細胞は、活性化されなかった。細胞からの全RNAを、製造業者の説明書に従い、RNeasy Mini Kit(Qiagen)によって単離した。CD8+CD161+およびCD8+CD161neg細胞の遺伝子発現プロファイリングを、Affymetrixヒトトランスクリプトームアレイ1.0チップ(Affymetrix,Santa Clara,CA,USA)を用いて、テキサス大学MDアンダーソンがんセンター(Texas MD Anderson Cancer Center(Houston,TX))の配列決定およびマイクロアレイ施設によって行った。試料要件およびデータの事前分析の詳細な説明は、施設のウェブサイト(world-wide-web at mdanderson.org/research/research-resources/core-facilities/sequencing-and-microarray-facility-smf/services-and-fees/microarray-services-overview.html)で利用可能である。データを分析し、Transcriptome Analysis Console v3.0(Affymetrix)で可視化した。
TCR Vβスペクトラタイピング. 正常なドナーの末梢血から単離したCD8+CD161+細胞を、Mayo Clinicによってスペクトラタイピングした。得られた画像は、ドナーの元のRNAに表されるそのサイズのフラグメントの数にほぼ対応する、一塩基対の分離および異なる蛍光強度を有する蛍光ピークのクラスターである。ピークパターンを、組織(ピーク数)、ピーク間の相対強度、およびサイズ分布についてレビューした。
細胞傷害性アッセイ. CD8+CD161+細胞の細胞傷害能力をCD8+CD161neg細胞およびバルクPBMCの細胞傷害能力に対して評価するために、クロムベースの短期細胞傷害性アッセイをインビトロで行った。CD8+CD161+、CD8+CD161neg、および操作されていないバルクPBMCを、ヒト末梢血製品から新たに単離した。単離された細胞を、51Cr標識同種異系293-HEK標的を使用した4時間殺傷アッセイにおいて、5:1、25:1、および50:1のT細胞:標的細胞の比で、細胞傷害能力について直ちに試験した。Wizard2ガンマカウンター(Perkin Elmer)を使用して読み取った、培地中に放出されたクロムによって、細胞溶解を決定した。
CD8+CD161+細胞のエクスビボ培養条件. 正常なドナーのアフェレーシス生成物から単離されたCD8+CD161+細胞、CD8+CD161neg細胞、およびバルクPBMCを、プレート結合抗CD3/CD28で刺激し、10ng/mlのIL-7、5ng/mlのIL-15、および30ng/mlのIL-21(すべて、Peprotech,Rocky Hill,NJ)から構成されるサイトカインカクテル中で増大させた。CD8+CD161+細胞を健康なドナーアフェレーシス生成物から単離し、抗CD3/CD28/Clec2d(抗ヒトCD3-eBioscienceカタログ番号16-0037-8、BD Biosciencesカタログ番号555725からの抗ヒトCD28、組換えヒトClec2d、Novus Biologicalsカタログ番号NBP2-22966)を用いて、それぞれ1ug/mLで刺激に対して培養し、10ng/mLのIL-7、5ng/ml、IL-15、および30ng/mlのIL-21(いずれもPeprotech,Rocky Hill,NJから)から構成されたサイトカインカクテル中のRPMI-1640、10%のFBSおよび2mmol/lのGlutaMAX(Invitrogen)中で増大させた。細胞を、37℃で48時間、加湿されたチャンバ内に配置した。48時間後、抗体刺激なしでIL7/15/21サイトカインカクテルで細胞を増大させた。
統計的分析. 差異の有意性は、別段の指示がない限り、多重比較のためのボンフェローニの事後検定を使用して、二元配置分散分析(ANOVA)または一元配置分散分析によって決定した。カプランマイヤーの生存有意性は、ログランク(Mantel-Cox)検定によって決定された。すべてのデータは、別段の指示がない限り、平均±SEMとして表示され、すべての分析は、Prismソフトウェア(GraphPadソフトウェア)を使用して実施した。統計学的有意性は、p≦0.05と定義した。
実施例2-結果
PDACの化学免疫療法後のT細胞発現プロファイリングは、CD3+CD8+NK1.1+細胞の先天性様の細胞傷害性の特性を特定する。以前の研究は、同所性PDACの治療のための化学免疫療法の9ヶ月後に単離された脾臓CD8+NK1.1+細胞の非常に少ない数(マウスあたり1,500未満)が、転移性疾患のモデルにおいて依然として親PDAC細胞株に対して迅速かつ堅牢な抗腫瘍保護を提供することができることを実証した(Konduri et al.,2016)。本発明者らは、このNK1.1+CD3+CD8+T細胞の主要な機能的特徴に関する洞察を得るために、KrasG12D/p53-/-PDAC腫瘍を有するマウスのコホートを同所的に移植し、その後、以前に公開された(Konduri et al.,2016)免疫ベースの治療プロトコルによってそれらを治癒させた。治療および治癒の2ヶ月後、CD8+脾細胞を陰性選択し、NK1.1+およびNK1.1neg画分に細分化した。次いで、これらの画分を、PDACが装填された成熟DCと一晩別々に共培養し、PDAC抗原特異的細胞を特定し、上方調節されたCD69発現によって単離した。マイクロアレイは、抗原刺激時に、1642個の遺伝子が、CD8+NK1.1+とCD8+NK1.1neg細胞との間で、0.1の一変量有意水準で差異的に調節されたことを示した(図1)。多くの異なる経路が影響を受ける可能性はあった(表1)が、最も顕著な違いは、細胞溶解性グランザイムセリンプロテアーゼ、特に非古典的なグランザイムアイソフォームF、D、G、およびC、ならびに先天性様細胞傷害性受容体に見られた(表2)。これらの結果は、CD8+NK1.1+細胞が、著しく増強された細胞溶解能を有するCD8+T細胞の集団を表すことを示唆した。
PDACの化学免疫療法後のT細胞発現プロファイリングは、CD3+CD8+NK1.1+細胞の先天性様の細胞傷害性の特性を特定する。以前の研究は、同所性PDACの治療のための化学免疫療法の9ヶ月後に単離された脾臓CD8+NK1.1+細胞の非常に少ない数(マウスあたり1,500未満)が、転移性疾患のモデルにおいて依然として親PDAC細胞株に対して迅速かつ堅牢な抗腫瘍保護を提供することができることを実証した(Konduri et al.,2016)。本発明者らは、このNK1.1+CD3+CD8+T細胞の主要な機能的特徴に関する洞察を得るために、KrasG12D/p53-/-PDAC腫瘍を有するマウスのコホートを同所的に移植し、その後、以前に公開された(Konduri et al.,2016)免疫ベースの治療プロトコルによってそれらを治癒させた。治療および治癒の2ヶ月後、CD8+脾細胞を陰性選択し、NK1.1+およびNK1.1neg画分に細分化した。次いで、これらの画分を、PDACが装填された成熟DCと一晩別々に共培養し、PDAC抗原特異的細胞を特定し、上方調節されたCD69発現によって単離した。マイクロアレイは、抗原刺激時に、1642個の遺伝子が、CD8+NK1.1+とCD8+NK1.1neg細胞との間で、0.1の一変量有意水準で差異的に調節されたことを示した(図1)。多くの異なる経路が影響を受ける可能性はあった(表1)が、最も顕著な違いは、細胞溶解性グランザイムセリンプロテアーゼ、特に非古典的なグランザイムアイソフォームF、D、G、およびC、ならびに先天性様細胞傷害性受容体に見られた(表2)。これらの結果は、CD8+NK1.1+細胞が、著しく増強された細胞溶解能を有するCD8+T細胞の集団を表すことを示唆した。
NK1.1は、疾患の複数のマウスモデルにおける重要な循環メモリーT細胞集団を特定する。NK1.1が、モデルに依存しない様式で細胞溶解性メモリー細胞の同様の重要な集団を特定することができることを検証するために、本発明者らは、第2の腫瘍モデルおよび感染性疾患モデルにおいて養子移入実験を行った。まず、6~8週齢のマウスのドナーコホートに、亜致死量のH2N3マウス適応インフルエンザウイルスを接種した。接種および体重減少からの回復から3週間後、脾細胞を採取し、陰性選択によってCD8+非付着細胞を単離した。陽性選択によるNK1.1+およびNK1.1neg画分への分離後に、各NK1.1群の5×105個の細胞/マウスを、養子移入の24時間後に同じインフルエンザウイルス株で致死的にチャレンジしたナイーブコホートに養子移入した(図7A)。体重を回復の指標として記録し、生存率をカプランマイヤー分析によって決定した。ドナーCD8+NK1.1+細胞で養子移入されたコホートは、完全な体重を取り戻し、感染を生き延びたが、CD8+NK1.1neg細胞で養子移入されたコホートは、いずれも体重を減少させ、ナイーブCD8+脾細胞で養子移入された対照と同じ速度で死亡した(図2A~B)。感染の7日後のPBMCの分析は、ナイーブおよびCD8+NK1.1negの養子移入されたコホートと比較して、CD8+NK1.1+細胞を受けたマウス間の循環CD3+CD8+IFN-γ+細胞で40%の増加を示した(p<0.003)(図2C)。
第2のモデルシステムでは、ドナーマウスのコホートに、2×105個のB16黒色腫細胞を皮下接種し、接種後7日目および14日目に、B16を装填した細胞ベースのワクチンでワクチン接種した。21日目に、マウスを屠殺し、脾細胞を再度採取し、CD8+NK1.1+およびCD8+NK1.1neg細胞集団に選別した。次いで、触知可能なB16腫瘍を接種したナイーブコホートを、それぞれ、1.5×106個のCD8+NK1.1+またはCD8+NK1.1neg細胞で養子移入した(図7B)。CD8+NK1.1+細胞を受けたマウスは、生存利益を付随して腫瘍成長の有意な遅延を示したが、CD8+NK1.1neg細胞を受けたコホートは、ナイーブ脾細胞で養子移入された対照コホートと同一に生存した(図2D~E)。末梢血リンパ球の分析は、CD8+NK1.1negまたはナイーブ脾細胞で養子移入されたコホートと比較して、CD8+NK1.1+細胞で養子移入されたコホートにおけるGP100四量体特異的CD8+細胞間のメモリーマーカーCD62LおよびCCR7のレベルが有意に上昇したことを示した(図2F)。これらの結果を合わせると、CD161ホモログNK1.1は、単一の病原性損傷を受けた青年期のマウスのうちの疾患の単純なモデルにおいて、主要なCD8+メモリー細胞集団を画定することを示唆している。
マウスCD3+CD8+NK1.1+細胞集団は、ヒトCD3+CD8+CD161+の対応物の間で表現型的に保存されている。様々なシステムにおけるCD8+NK1.1+細胞によって提供される保護的メモリー応答に促され、本発明者らは次に、NK1.1発現によって画定されるメモリーCD8+T細胞のサブセットが、末梢循環における類似のCD3+CD8+CD161+細胞集団のうちのヒト集団において表現的および転写的に保存されたかどうかを求めた。この分析のために、CD8+CD161+およびCD8+CD161neg細胞を、6つの異なるヒトドナーから差異的に単離した。TCR-VβスペクトラタイピングによってCD161+細胞がポリクローナルであることを確認した後(図8)、各集団の転写プロファイリングをマイクロアレイ分析によって行った。これらの細胞は、分析前に活性化されておらず、恒常静止状態であったにもかかわらず、上方調節されたグランザイムおよび天然細胞傷害性受容体のプロファイルを、0.1の一変数有意水準でこれらの細胞で再現した(図3、表3)。活性化されたマウス細胞と非活性化されたヒト細胞との間の遺伝子の種間比較分析は、2つの集団間で差異的に調節された共通の命名法を用いて、206個の遺伝子の保存されたシグネチャーを特定した(図9)。上方調節されたヒト遺伝子のリアクトーム経路分析は、HDAC脱アセチル化、DNAおよびヒストンメチル化、ヌクレオソームアセンブリ、RNAポリメラーゼIプロモーター脱出、小RNAによる転写調節、ならびにRNAによる遺伝子サイレンシングを含む、<5×10-4のFDRでの分化および調節に関連するシグネチャーを特定した。
PDACのCAR T細胞療法のモデルシステムの開発。その新規な生物学の可能性に基づいて、本発明者らは、ヒトCD8+CD161+サブセットが、固形腫瘍CAR T細胞療法との関連で、従来のバルクPBMCよりもより機能的で持続的な抗腫瘍有効性を提供することができるかもしれないと仮定した。
抗CD3/CD28/Clec2dによるプレート結合刺激と組み合わせたIL7/15/21を有するCD8+CD161+細胞のエクスビボ増大は、セントラルメモリー表現型(CD45RA-CCR7+)を増強した。CD8+CD161+細胞を正常ドナーから選別し、エクスビボ刺激条件を最適化した。IL2、IL-2/7/15、IL2/7/15/21刺激と比較して、IL7/15/21と、抗CD3/CD28/Clec2dのプレート結合刺激との組み合わせは、セントラルメモリー(CD45RA-CCR7+)の有意な上方調節をもたらした(図5)。
抗CD3/CD28/Clec2dによるプレート結合刺激と組み合わせたIL7/15/21を有するCD8+CD161+細胞のエクスビボ増大は細胞傷害性グランザイム産生を増強した。CD8+CD161+細胞を正常ドナーから選別し、エクスビボ刺激条件を最適化した。IL2、IL-2/7/15、IL2/7/15/21刺激と比較して、IL7/15/21と、抗CD3/CD28/Clec2dのプレート結合刺激との組み合わせは、細胞傷害性分子、グランザイムおよびパーフォリンの有意な上方調節をもたらした(図6)。
CD8+CD161+細胞は、インビトロにおいて固有の殺傷利点を示す。CD8+CD161+細胞の細胞傷害能力をCD8+CD161neg細胞およびバルクPBMCの細胞傷害能力に対して評価するために、クロムベースの短期細胞傷害性アッセイをインビトロで行った。CD8+CD161+、CD8+CD161neg、および操作されていないバルクPBMCを、ヒト末梢血製品から新たに単離した。単離された細胞を、51Cr標識同種異系293-HEK標的を使用した4時間殺傷アッセイにおいて、細胞傷害能力について直ちに試験した。図4に示されるように、CD8+CD161+細胞は、25:1のE:T比で100%の標的溶解を誘導し、一方、バルクPBMCおよびCD8+CD161neg細胞は、50:1の最大E:T比でそれぞれ22%および15%の溶解能を示した(50:1でp<0.002、25:1でp<0.0007、および5:1でp<0.00002、一元配置分散分析による)。これらのデータは、CD8+CD161+T細胞が、CD8+CD161negまたはバルクPBMC対応物のうちでは再現されない、増強された細胞傷害性を有することを示した。
実施例3-考察
表面分子および分泌サイトカインの発現に基づいて、リンパ球は、異なるサブセットおよび系統に分類される。しかしながら、この分類は、以前に特定された細胞サブセットおよび系統からのマーカーを時折発現する新しい細胞サブセットの特定に伴って常に変動する。1つのそのような表面分子は、NK細胞、NKT細胞、および他のT細胞系統上で発現されることが知られているCD161である(Fergusson et al.,2011)。CD161は、マウス対応物のNK1.1と47%の相同性を共有し、末梢T細胞の最大4分の1によって発現される(Neelapu et al.,1994)。NK-T細胞は末梢T細胞の1%未満を構成するため、CD3+CD161+細胞は、それらが循環T細胞の5%超を構成することを考慮して、T細胞の別個の系統を表す(Takahashi et al.,2006)。CD8+T細胞では、CD161の発現は中間または高いいずれかとして定義されるが、CD161を発現するCD4+T細胞間ではそのような区別ははっきりしない(Takahashi et al.,2006)。CD8+CD161high細胞は、MAIT細胞(Martin et al.,2009、Goldfinch et al.,2010)、Tc17細胞(Northfield et al.,2008、Billerbeck et al.,2010)またはメモリー幹細胞(Turtle et al.,2009)として以前に定義されている。異なるCD161発現細胞の転写プロファイル分析は、CD8+CD161+T細胞中で濃縮された保存されたCD161++/MAIT細胞転写シグネチャーを特定し、これはCD4+CD161+およびTCRγδ+CD161+T細胞に拡大することができる(Fergusson et al.,2014)。さらに、CD161T細胞発現集団は、インターロイキン(IL)-12+IL-18に対する先天性様のTCR非依存性応答を共有する。この応答は、T細胞受容体刺激との関連で共刺激分子として作用するCD161による調節とは無関係である。したがって、CD161の発現は、ヒトTリンパ球で共有され、T細胞受容体(TCR)発現および細胞系統の両方に依存しない、転写および機能表現型を特定する。CD8+CD161+およびCD4+CD161+細胞の役割は、ウイルス感染(Northfield et al.,2008、Billerbeck et al.,2010、Rowan et al.,2008)および自己免疫疾患(Annibali et al.,2011、Cosmi et al.,2008、Kleinschek et al.,2009)中で定義されてきたが、現在までに、がん生物学におけるCD8+CD161+細胞のいかなる役割も明確に定義されていない。本研究では、本発明者らは、CD8+CD161+細胞の生物学的および機能的特性を理解するために出発した。
表面分子および分泌サイトカインの発現に基づいて、リンパ球は、異なるサブセットおよび系統に分類される。しかしながら、この分類は、以前に特定された細胞サブセットおよび系統からのマーカーを時折発現する新しい細胞サブセットの特定に伴って常に変動する。1つのそのような表面分子は、NK細胞、NKT細胞、および他のT細胞系統上で発現されることが知られているCD161である(Fergusson et al.,2011)。CD161は、マウス対応物のNK1.1と47%の相同性を共有し、末梢T細胞の最大4分の1によって発現される(Neelapu et al.,1994)。NK-T細胞は末梢T細胞の1%未満を構成するため、CD3+CD161+細胞は、それらが循環T細胞の5%超を構成することを考慮して、T細胞の別個の系統を表す(Takahashi et al.,2006)。CD8+T細胞では、CD161の発現は中間または高いいずれかとして定義されるが、CD161を発現するCD4+T細胞間ではそのような区別ははっきりしない(Takahashi et al.,2006)。CD8+CD161high細胞は、MAIT細胞(Martin et al.,2009、Goldfinch et al.,2010)、Tc17細胞(Northfield et al.,2008、Billerbeck et al.,2010)またはメモリー幹細胞(Turtle et al.,2009)として以前に定義されている。異なるCD161発現細胞の転写プロファイル分析は、CD8+CD161+T細胞中で濃縮された保存されたCD161++/MAIT細胞転写シグネチャーを特定し、これはCD4+CD161+およびTCRγδ+CD161+T細胞に拡大することができる(Fergusson et al.,2014)。さらに、CD161T細胞発現集団は、インターロイキン(IL)-12+IL-18に対する先天性様のTCR非依存性応答を共有する。この応答は、T細胞受容体刺激との関連で共刺激分子として作用するCD161による調節とは無関係である。したがって、CD161の発現は、ヒトTリンパ球で共有され、T細胞受容体(TCR)発現および細胞系統の両方に依存しない、転写および機能表現型を特定する。CD8+CD161+およびCD4+CD161+細胞の役割は、ウイルス感染(Northfield et al.,2008、Billerbeck et al.,2010、Rowan et al.,2008)および自己免疫疾患(Annibali et al.,2011、Cosmi et al.,2008、Kleinschek et al.,2009)中で定義されてきたが、現在までに、がん生物学におけるCD8+CD161+細胞のいかなる役割も明確に定義されていない。本研究では、本発明者らは、CD8+CD161+細胞の生物学的および機能的特性を理解するために出発した。
発明者らは、以前に、CD161+細胞のマウス対応物のCD8+NK1.1+の機能的意義を報告しており、ウイルス感染を模倣する条件下でこれらの細胞の数の上昇を見てきた(Konduri et al.,2016)。
マウスCD8+NK1.1+細胞のマイクロアレイ分析は、CD8+NK1.1neg対応物と比較して、抗原刺激の際のこれらの細胞によるグランザイム産生の有意な上方調節を明らかにした。細胞傷害性機能の役割を果たす先天性遺伝子および経路の発現の差があった。CD161+ヒト等価物もまた、細胞傷害性メディエーターであるグランザイムBおよびパーフォリンを構成的に発現することが以前に報告されている。対照的に、CD161発現を欠く細胞の4分の1は、ナイーブCD8+T細胞であり、メモリー集団内でさえ、より低レベルのグランザイムBおよびパーフォリンを発現する(Neelapu et al.,2018)。CD8+CD161+細胞上でのCCR4およびCCR6の発現は、それらが組織の常在性を維持し、異なる臓器にいたる能力を示す。同様の発現パターンは、MS患者の循環血液中のCD161high細胞において観察され、CNSへのそれらの侵入を強化し、病因に寄与している(Annibali et al.,2011)。本発明者らは、静止時のCD8+CD161neg細胞も、より高いレベルのCXCR3を発現することを見出し、CXCR3は、CD8+T細胞の分化を、メモリーのための限られた可能性を有する短命のエフェクターへと導くエフェクターメモリーマーカーである(Kurachi et al.,2011)。
CAR-T細胞療法は、CD19+血液悪性腫瘍に対しては有効であるが、固形腫瘍を標的とすることには効果がなかった(Neelapu et al.,2016、Abken,2015)。1つの主な課題は、tregによる抑制性シグナル伝達を克服し、エフェクターおよびメモリー機能を増強することである(Klebanoff et al.,2012)。エフェクターおよびメモリーT細胞の持続性を増強することで、効率的なCAR-T細胞療法をもたらすことができる。前臨床モデルにおいて、CD8+およびCD4+サブセットの両方が相乗的抗腫瘍CAR-T活性を発現した(Sommermeyer et al.,2016)。類似の結果は、操作されたCD4+およびCD8+T細胞の組み合わせが強力な腫瘍拒絶を誘導した前臨床マウス実験で見られた(Moeller et al.,2005、Shedlock and Shen,2003)。非ホジキンリンパ腫および慢性リンパ性白血病を有する患者に関する最近の臨床試験データは、インビトロで別々に増大され、1:1の比で注入されたCD8+およびCD4+T細胞サブセットの組成物から生成されたCD19-CAR-T細胞の高い抗がん活性を実証した(Turtle et al.,2016a)。B細胞急性リンパ芽球性白血病患者を対象とした臨床試験でも同様の結果が得られた(Turtle et al.,2016b)。単離されたCD8+TCMサブセットを使用して第1世代CD19-CAR-Tで治療したか、またはCD8+およびCD4+TCMサブセットの両方を使用して第2世代CD19-CAR-Tで治療したかのいずれかの高リスク中間悪性度B系統非ホジキンリンパ腫を有する患者を対象とした別の臨床研究は、両方のアプローチの実行可能性および安全性を実証したが(Turtle et al.,2016c)、CD4+とCD8+TCMとを有するCAR-Tの群および第2世代CAR-T細胞群は、より良好な持続性を示した。これらの研究は、CAR-T細胞療法におけるT細胞およびリンパ球の異なるサブセットを評価する必要性を強調している。NK、NKTおよびγδT細胞のような固有の殺傷可能性を有するリンパ球サブセットは、CARの可能性について評価されている(Ngai et al.,2018、Liu et al.,2018、Zoon et al.,2015)。CD8+CD161+細胞は、1%未満の、セントラルメモリーマーカーCD62L+CCR7+を発現するCD161highCD8+CD45RAneg細胞を有するエフェクターメモリー表現型として依然に定義されている(Takahashi et al.,2006)。以前の報告によれば、CD161陰性細胞は、抗CD2、CD3またはCD28刺激でCD161の発現を変化させず、インフルエンザ特異的細胞は、サイトカインの存在下であっても、再刺激後にCD161を発現せず(Northfield et al.,2008)、CD161が単に活性化のマーカーではなく、別個の系統を定義することを暗示した。
CAR T細胞産生で典型的に使用されるバルクPBMC調製物は、高度に分化した抗原経験サブセットも含む不均一な細胞群を表す。CAR操作のためのナイーブ(Tn)、幹細胞メモリー(Tscm)、およびセントラルメモリー(Tcm)サブセットが、より強力な抗腫瘍応答をもたらしたことが以前に報告されている(Wang et al.,2011、Berger et al.,2008、Gattinoni et al.,2011、Gattinoni et al.,2005)。低分化の細胞がより有益であり得るが、エクスビボ培養法(サイトカイン組成物および培養持続時間)は、T細胞分化を促進し得る(Alizadeh et al.,2019)。IL-7およびIL-15の包含は、T細胞のエクスビボ増大中にリンパ球の発生、分化、および恒常性に有益であり、IL-2増大CAR-T細胞と比較して、インビボでより高い生存率をもたらすことが示されている(Xu et al.,2014、Rochman et al.,2009)。いくつかの研究は、IL-7およびIL-15を一緒に使用することで、Tscm表現型を保存し、CAR-T細胞の効力を増強し得ることを示している(Rochman et al.,2009、Cieri et al.,2013)。IL-7およびIL-15の存在下でのCD3/CD28-CAR-Tのエクスビボ増大は、GD2腫瘍抗原に対する幹/メモリー可能性を保持しながら、エフェクター活性を増強した(Gargett et al.,2015)。IL-15が増大されたCAR-T細胞が、幹細胞メモリー表現型(CD62L+CD45RA+CCR7+)を保存することも実証されている。IL-15はまた、抗原チャレンジ時に疲弊(exhaustion)マーカーの発現を低減させ、増殖を増加させた(Alizadeh et al.,2019)。他の研究では、IL-21がCD2+CD28+CD8+T細胞の増大を促進し(Santegoets et al.,2013)、CD19-CAR-Tの効力を増強することが示されている(Rosenberg,2014)。IL-15およびIL-21の添加は、NKT細胞のメモリー可能性を向上させ、維持するのに役立つことが以前に報告されている(Ngai et al.,2018)。IL-7、IL-15、およびIL-21の組み合わせベースのリンパ球のエクスビボ増大は、メモリー細胞を増強し、転移を低減し、マウス黒色腫に対する生存を改善することが報告された(Zoon et al.,2015)。本研究では、本発明者らは、IL-7、IL-15、およびIL-21カクテルのカクテルを用いたエクスビボでの培養およびバルクT細胞の増大は、主に、IL-21なしで、あるいはIL-2単独で増殖したバルクPBMCまたはCD8+CD161neg細胞の表現型を大幅に変化させることなく、CD8+CD161+細胞集団に利益をもたらすことを見出した。
要約すると、本発明者らは、CD8+CD161+細胞およびそれらのマウス等価物CD8+NK1.1+細胞が、極めて高い細胞傷害性の可能性を示すことを報告する。マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイル分析は、NK1.1negおよびCD161neg対応物と比較して、活性化されたときに、これらの細胞によるグランザイム、パーフォリン、および先天性様受容体の発現レベルが向上したことを明らかにした。インビトロでは、CD8+CD161+T細胞は、バルクPBMCまたはCD8+CD161neg集団よりも高い効率で死滅した。T細胞ベースの療法のためのこのサブセットの使用は、PDACを含む固形腫瘍の効果的な治療のためのエキサイティングな新しい機会を提供する。
本明細書に開示されかつ特許請求されるすべての方法は、本開示に照らして、過度の実験なしに作製され、実行され得る。本開示の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点から説明されてきたが、変形が、本開示の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法およびステップ、または方法のステップの順序に適用され得ることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的に関連する特定の薬剤が、同じまたは類似の結果が達成される一方で、本明細書に記載の薬剤の代わりに置換され得ることが明らかになるであろう。当業者に明らかな、そのような類似の代替物および修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨、範囲、および概念内であると見なされる。
XI.参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されるものに補足する例示的な手続き的または他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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Claims (55)
- (a)細胞の試料を得ることであって、前記試料がCD161+T細胞を含む、ことと、
(b)IL-7、IL-15およびIL-21の存在下で前記T細胞を培養し、
それによって、CD161+細胞の数が非CD161+細胞と比較して増大しているT細胞の集団を提供することと
を含む、インビトロまたはエクスビボ方法。 - (a)細胞の試料を得ることであって、前記試料がCD8+CD161+T細胞を含む、ことと、
(b)IL-7、IL-15、およびIL-21の存在下で前記T細胞を培養し、
それによって、CD8+CD161+T細胞の数が非CD8+CD161+細胞と比較して増大しているT細胞の集団を提供することと
を含む、請求項1に記載の方法。 - (a)細胞の試料を得ることであって、前記試料がCD4+CD161+T細胞を含む、ことと、
(b)IL-7、IL-15、およびIL-21の存在下で前記T細胞を培養し、
それによって、CD4+CD161+T細胞の数が非CD4+CD161+細胞と比較して増大しているT細胞の集団を提供することと
を含む、請求項1に記載の方法。 - 前記細胞が、CD3および/またはCD28刺激剤を含む培地中でさらに培養される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記CD3および/またはCD28刺激剤が、CD3および/またはCD28結合抗体を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が、CD3結合抗体、CD28結合抗体、Clec2d、および/またはCD161結合抗体を含む培地中でさらに培養される、請求項4に記載の方法。
- 前記細胞が、約0.1~5.0、0.3~3.0、または0.5~2.0μg/mlのCD3結合抗体、CD28結合抗体、Clec2d、および/またはCD161結合抗体を含む培地中でさらに培養される、請求項6に記載の方法。
- (a1)細胞の試料を得ることであって、前記試料がCD161+T細胞を含む、ことと、
(a2)CD3および/またはCD28刺激剤の存在下、ならびにIL-7、IL-15、およびIL-21の存在下で、前記T細胞を培養することと、
(b)IL-7、IL-15、およびIL-21の存在下で前記T細胞を培養することと
を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。 - (a1)細胞の試料を得ることであって、前記試料がCD161+T細胞を含む、ことと、
(a2)CD3結合抗体、CD28結合抗体、CD161結合抗体、および/またはClec2dの存在下、ならびにIL-7、IL-15、およびIL-21の存在下で、前記T細胞を培養することと、
(b)IL-7、IL-15、およびIL-21の存在下で前記T細胞を培養することと
を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。 - ステップ(b)の前記培養が、CD3結合抗体、CD28結合抗体、Clec2d、および/またはCD161結合抗体を本質的に含まない、請求項9に記載の方法。
- ステップ(a2)の前記培養が、約12~72時間、24~58時間、または24~36時間にわたる、請求項10に記載の方法。
- ステップ(b)の前記培養が、少なくとも約12時間にわたる、請求項10に記載の方法。
- ステップ(b)の前記培養が、少なくとも約1、2、3、4、5、6、または7日間にわたる、請求項12に記載の方法。
- ステップ(b)の前記培養が、CD3結合抗体およびCD28結合抗体を本質的に含まない、請求項9に記載の方法。
- IL-7が、約5~20ng/mlで存在し、IL-15が、約2.5~10ng/mlで存在し、かつ/またはIL-21が、約20~40ng/mlで存在し、例えば、10ng/mlのIL-7、5ng/mlのIL-15、および/または30ng/mlのIL-21である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(b)の前に、前記試料中のCD8+CD161+細胞の存在についてT細胞を精製または濃縮することをさらに含む、請求項1または15に記載の方法。
- ステップ(b)の後に、前記試料中のCD8+CD161+細胞の存在についてT細胞を精製または濃縮することをさらに含む、請求項1または15に記載の方法。
- 前記試料中のT細胞を濃縮することが、蛍光細胞選別、磁気ビーズ分離、または常磁性ビーズ分離を含む、請求項16または17に記載の方法。
- 培養することが、最長で7、14、21、28、35、または42日間持続する、請求項1~18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養することが、血清含有培地中である、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養することが、無血清培地中である、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 対象から前記細胞を得ることをさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、アフェレーシスによって得られる、請求項22に記載の方法。
- 前記試料が、凍結保存された試料である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、臍帯血由来である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、前記対象からの末梢血試料である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、アフェレーシスによって得られた、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、静脈穿刺によって得られた、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、前記対象から得られた同等の試料と比較して増加した割合のCD8+CD161+細胞を含むT細胞の亜集団を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料を得ることが、前記試料を第三者機関から得ることを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料中のT細胞に、キメラ抗原受容体(CAR)またはトランスジェニックT細胞受容体(TCR)をコードする核酸を導入することをさらに含む、請求項1~30のいずれか一項に記載の方法。
- 導入することが、前記T細胞をウイルスで感染させるかまたは形質導入することを必要としない、請求項31に記載の方法。
- 前記T細胞にCARまたはトランスジェニックTCRをコードする核酸を導入することが、ステップ(b)の前に行われる、請求項31または32に記載の方法。
- 前記T細胞にCARまたはトランスジェニックTCRをコードする核酸を導入することが、ステップ(b)の後に行われる、請求項31または32に記載の方法。
- 前記T細胞が、内因性T細胞受容体および/または内因性HLAの発現に関して不活性化される、請求項31に記載の方法。
- 膜結合Cγサイトカインをコードする核酸を、前記T細胞に導入することをさらに含む、請求項31に記載の方法。
- 前記膜結合Cγサイトカインが、膜結合IL-15である、請求項36に記載の方法。
- 前記膜結合Cγサイトカインが、IL-15-IL-15Rα融合タンパク質である、請求項36に記載の方法。
- 培養することが、前記T細胞を、樹状細胞または人工抗原提示細胞(aAPC)の存在下で培養することを含む、請求項31に記載の方法。
- 前記aAPCが、前記aAPCの表面上で発現するCAR結合抗体またはそのフラグメントを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記aAPCが、T細胞を活性化または共刺激する追加の分子を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記追加の分子が、膜結合Cγサイトカインを含む、請求項40に記載の方法。
- 前記T細胞をaAPCの存在下で培養することが、前記細胞を約10:1~約1:10(CAR細胞対aAPC)の比で培養することを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記トランスジェニックCARまたはトランスジェニックTCR細胞の集団の試料を凍結保存することをさらに含む、請求項31に記載の方法。
- 前記CARまたは前記トランスジェニックTCRが、がん細胞抗原を標的とする、請求項31に記載の方法。
- 前記がん細胞抗原が、CD19、CD20、ROR1、CD22がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘍抗原、前立腺特異的抗原、黒色腫関連抗原、変異型p53、変異型ras、HER2/Neu、葉酸結合タンパク質、HIV-1エンベロープ糖タンパク質gp120、HIV-1エンベロープ糖タンパク質gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、メオテリン、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ鎖、λ鎖、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、HER2-HER3の組み合わせ、またはHER1-HER2の組み合わせである、請求項45に記載の方法。
- 前記CARまたは前記トランスジェニックTCRが、病原体抗原を標的とする、請求項31に記載の方法。
- 前記病原体が、真菌、ウイルス、または細菌病原体である、請求項47に記載の方法。
- 前記病原体が、プラスモディウム、トリパノソーマ、アスペルギルス、カンジダ、HSV、HIV、RSV、EBV、CMV、JCウイルス、BKウイルス、またはエボラ病原体である、請求項47に記載の方法。
- ステップ(b)の前、ステップ(b)の後、またはステップ(b)の前後両方で、例えば細胞計数/フローサイトメトリーによって、前記試料のCD161+T細胞の含有量を評価することをさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1~50のいずれか一項に記載の方法によって作製されたT細胞組成物。
- 疾患を有するヒト対象においてT細胞応答を提供する方法であって、有効量の請求項31または32に記載のT細胞を前記対象に投与することを含む、前記方法。
- 前記疾患が、がんであり、前記CARまたは前記トランスジェニックTCRが、がん細胞抗原を標的とする、請求項52に記載の方法。
- 前記対象が、以前に抗がん療法を受けている、請求項53に記載の方法。
- 前記対象が、寛解状態であるか、または前記がんの症状を有しないが、検出可能ながん細胞を含む、請求項54に記載の方法。
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