ES2870174T3 - Proteínas de fusión PD-1-CD28 y su uso en medicina - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende un polipéptido PD-1 que está ligado operativamente a través de su extremo C al extremo N de un dominio intracelular de un polipéptido CD28, en la que el polipéptido PD-1 comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1 y comprende la secuencia SEQ ID NO: 16 o una secuencia que tiene de 1 a 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la SEQ ID NO: 16, que se caracteriza por tener una actividad de unión a PD-L1 y/o PD-L2.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de fusión PD-1-CD28 y su uso en medicina

La presente invención se refiere a proteínas de fusión PD-1-CD28, moléculas de ácido nucleico, vectores, células transducidas portadoras de moléculas de ácido nucleico o vectores de la presente invención o que expresan las proteínas de fusión de la presente invención, procedimientos y kits que comprenden las moléculas de ácido nucleico, vectores y/o proteínas de fusión de la presente invención, en las que el polipéptido PD-1 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 16 o una secuencia que tiene de 1 a 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la SEQ ID NO: 16, caracterizado por tener una actividad de unión a PD-L1 y/o PD-L2. En el presente documento también se divulga el uso de dichas células transducidas en un procedimiento para el tratamiento de enfermedades particulares, así como en una composición farmacéutica/medicamento que comprende dichas células transducidas que expresan las proteínas de fusión como se divulgan en el presente documento para su uso en un procedimiento de tratamiento de enfermedades, en particular en la intervención médica de enfermedades caracterizadas por la expresión de PD-L1 y/o PD-L2.

La terapia adoptiva de células T (ACT) es un enfoque poderoso para tratar incluso las etapas avanzadas del cáncer metastásico (Rosenberg, Nat Rev Clin Oncol 8(10) (2011), 577-585). Para la ACT, las células T específicas de antígeno se aíslan o manipulan y se expanden in vitro antes de la reinfusión al paciente (Gattinoni y col., Nat Rev Immunol 6 (5) (2006), 383-393). En los ensayos clínicos, la ACT ha logrado tasas de respuesta incomparables en algunos pacientes con cáncer junto con la irradiación corporal total. Sin embargo, la mayoría de los pacientes no responden a este tratamiento (Dudley y col., J Clin Oncol 26 (32) (2008), 5233-5239; Rosenberg y col., Clin Cancer Res 17 (13) (2011), 4550-4557). La inmunosupresión inducida por tumores que no es contrarrestada por la irradiación corporal total se ha implicado en esta resistencia a la terapia (Leen y col., Annu Rev Immunol 25 (2007), 243-265). Recientemente, se ha mostrado que los receptores inhibidores regulados positivamente en las células T activadas y sus respectivos ligandos expresados dentro del medio tumoral contribuyen al fracaso de la terapia con células T (Abate-Daga y col., Blood 122 (8) (2013), 1399-410). Entre los receptores inhibidores, el receptor de muerte programada-1 (PD-1) desempeña un papel fundamental, dado que estudios recientes han identificado a PD-1 expresado en células T específicas de antígeno tumoral en tumores (Gros y col., J Clin Invest (2014), 10.1172/JCI73639). La interacción de PD-1 con su ligando PD-L1 suprime la señalización de TCR y la activación de las células T y, por tanto, evita la activación efectiva tras el reconocimiento de la diana (Gros y col., J Clin Invest (2014), 10.1172/JCI73639; Yokosuka y col., J Exp Med 209 (6) (2012), 1201-1217; Ding y col., Cancer Res (2014), 10.1158/0008-5472.CAN-13-3596; Karyampudi y col., Cancer Res (2014), 10.1158/0008-5472.CAN-13-2564). El peso clínico de estos mecanismos está subrayado por estudios terapéuticos que combinan ACT o células T modificadas genéticamente con un bloqueo de PD-1 basado en anticuerpos que dan como resultado una mejora notable de la actividad antitumoral (John y col., Clin Cancer Res 19 (20) (2013), 5636-5646; Goding y col., J Immunol 190 (9) (2013), 4899-4909). La aplicación sistémica de anticuerpos bloqueantes de PD-1- o PD-L1 tiene la desventaja de que potencialmente se orientan a las células T de cualquier reactividad y, por tanto, inducen efectos secundarios sistémicos (Topalian y col., N Engl J Med 366 (26) (2012), 2443-2454; Brahmer y col., N Engl J Med 366 (26) (2012), 2455-2465). Además, la ACT por sí sola conlleva un riesgo considerable de toxicidad, como se observó recientemente en estudios de fase I (Linette y col., Blood 122 (6) (2013), 863-871; Morgan y col., J Immunother 36 (2) (2013), 133-151). La combinación con el bloqueo indiscriminado de PD-1 conlleva el riesgo de potenciar los efectos secundarios de cualquiera de las terapias por sí sola. Una estrategia potencial para perseguir el bloqueo de PD-1-PD-L1 sin activación de células T no selectiva es limitar su efecto a las células T reactivas al tumor. Se ha demostrado la compatibilidad principal de la señalización entre un dominio extracelular CD28 y un dominio intracelular PD-1 (Riley y June, Blood (2005), 105 (1), 13-21; Chemnitz y col., J Immunol 173 (2) (2004), 945-954). Además, la compatibilidad de CTLA-4, PD-1 y CD28 se ha empleado para fortalecer la respuesta de las células T y usar el receptor de fusión CTLA-4-CD28 estimulante para inhibir la reactividad de las células T fuera de diana utilizando receptores inhibidores con el dominio de señalización de PD-1 y CTLA-4 (Morales-Kastresana y col., Clin Cancer Res 19 (20) (2013), 5546-5548, Yin y col., J Leukoc Biol 73 (1) (2003), 178-182). Además, se describieron constructos de fusión PD-1-CD28 que contienen un dominio extracelular truncado de PD-1 y el dominio transmembrana e intracelular de CD28 (Ankri y col., J. Immunol 191 (8) (2013), 4121-4129). Además, se describió una proteína de fusión PD-1-CD28 que contiene un dominio extracelular truncado de PD-1 y el dominio intracelular, el dominio transmembrana más parte del dominio extracelular CD28 (Prosser y col., Mol. Immunol. 51 (3 -4) (2012), 263-272).

Sin embargo, en vista de la inhibición de células T mediada por PD-L1, todavía existe la necesidad de proporcionar medios mejorados que tengan el potencial de mejorar la seguridad y eficacia de la ACT y superar las desventajas anteriores.

Esta necesidad se aborda mediante la presente invención proporcionando las realizaciones definidas en las reivindicaciones.

En particular, la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende un polipéptido PD-1 ligado operativamente a través de su extremo C al extremo N de un dominio intracelular de un polipéptido CD28, en la que el polipéptido PD-1 comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1 y comprende la secuencia ^s E^q ID NO: 16 o una secuencia que tiene de 1 a 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la SEQ ID NO: 16, caracterizada por tener una actividad de unión a PD-L1 y/o PD-L2. La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican la proteína de fusión, vectores que comprenden tales ácidos nucleicos y composiciones que comprenden tales ácidos nucleicos y/o vectores. La invención se refiere además a células transducidas que comprenden los ácidos nucleicos, vectores o composiciones como se definen en este párrafo y/o que expresan la proteína de fusión como se define anteriormente, así como composiciones farmacéuticas que comprenden tales células transducidas.

La proteína de fusión PD-1-CD28 descrita en el presente documento se caracteriza porque el polipéptido PD-1 que comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1 está ligado operativamente a través de su extremo C al extremo N de un dominio intracelular de un polipéptido CD28.

En contraste con las proteínas de fusión PD-1-CD28 descritas en Prosser y col., Mol. Immunol. 51 (3-4) (2012), 263­ 272 y Ankri y col., J. Immunol 191 (8) (2013), 4121-4129, la proteína de fusión PD-1-CD28 del La presente invención comprende el dominio transmembrana del polipéptido PD-1. Como se muestra en los Ejemplos adjuntos, la arquitectura de las proteínas de fusión PD-1-CD28 descritas anteriormente mostraba solo una inducción de citocinas modesta (de 2 a 3 veces) y poca o ninguna diferencia en la actividad lítica cuando se transdujeron en células T primarias. Esto contrasta notablemente con la proteína de fusión de la presente invención tal como se define en el presente documento, que lograba un aumento de hasta 300 veces en la secreción de IL-2 e IFN-y y una fuerte proliferación de células T, así como una potenciación de la actividad lítica de las células tumorales in vitro e in vivo (véanse las Fig.2, 3, 5 y 9). Por consiguiente, se encontró sorprendentemente que la proteína de fusión PD-1-CD28 portadora del dominio transmembrana PD-1 (PTM) que hace referencia a las proteínas de fusión PD-1-CD28 que tienen una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 14 (murino/ratón) o la SEQ ID NO: 24 (humano)) es superior a los constructos de fusión PD-1-CD28 descritos anteriormente descritos en Prosser y col., Mol. Immunol. 51 (3-4) (2012), 263-272 (haciendo referencia a una proteína de fusión PD-1-CD28 con una arquitectura como la proteína de fusión denominada en el presente documento "CEX") y Ankri y col., J. Immunol 191 (8) (2013), 4121-4129 (haciendo referencia a una proteína de fusión PD-1-CD28 con una arquitectura como la proteína de fusión denominada en el presente documento "CTM"; véase la Figura 2). Más precisamente, se muestra en los ejemplos adjuntos que la fusión del dominio extracelular más el dominio transmembrana al dominio intracelular de CD28 protege a las células transducidas de la inhibición de células T inducida por PD-1-L1 y convierte la señal inhibidora en una señal de coestimulación para una función óptima de las células T. Como se muestra en la Fig.6E (como prueba de concepto del mecanismo de acción), se encontró sorprendentemente que la proteína de fusión del dominio extracelular y transmembrana de PD-1 con el dominio intracelular de CD28 protege a las células T específicas de antígeno de la anergia mediada por PD-1-PD-L1 y convierte la señal inhibitoria en una coestimulación En otras palabras, las células, como las células T, transducidas con la proteína de fusión PD-1-CD28 de la presente divulgación son resistentes a la anergia mediada por PD-1-PD-L1. Además, la funcionalidad de los constructos de fusión PD-1-CD28 basados en las secuencias de PD-1 y CD28 humanas se muestra en la Fig. 8.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a una proteína de fusión que comprende un polipéptido PD-1 que está ligado operativamente a través de su extremo C al extremo N de un dominio intracelular de un polipéptido CD28, en la que el polipéptido comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1.

Como se usa en el presente documento, el término "proteína de fusión" se refiere a una proteína que está elaborada de partes polipeptídicas de diferentes fuentes. Por consiguiente, también puede entenderse como una "proteína quimérica". Normalmente, las proteínas de fusión son proteínas creadas mediante la unión de dos o más genes (o preferiblemente ADNc) que originalmente codificaban proteínas separadas. La traducción de este gen de fusión (o ADNc de fusión) da como resultado un único polipéptido, preferiblemente con propiedades funcionales derivadas de cada una de las proteínas originales. Las proteínas de fusión recombinantes se crean artificialmente mediante tecnología de ADN recombinante para su uso en investigación biológica o terapéutica. A continuación, se describen más detalles sobre la producción de la proteína de fusión como se divulga a continuación en el presente documento.

Como se usan en el presente documento, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan de manera intercambiable para hacer referencia a un polímero de residuos de aminoácidos. El término se aplica también a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial o un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Por consiguiente, el término "polipéptido" se refiere a una molécula que comprende o consiste en cadenas de monómeros de aminoácidos ligadas por enlaces peptídicos (amida). Los enlaces peptídicos son enlaces químicos covalentes que se forman cuando el grupo carboxilo de un aminoácido reacciona con el grupo amino de otro. En el presente documento, un "polipéptido" no está restringido a una molécula con una longitud definida. Por tanto, en el presente documento, el término "polipéptido" se refiere a un péptido, un oligopéptido, una proteína o un polipéptido que abarca cadenas de aminoácidos, en el que los residuos de aminoácidos están ligados por enlaces peptídicos covalentes. Sin embargo, en el presente documento, el término "polipéptido" también abarca peptidomiméticos de tales proteínas/polipéptidos en el que el aminoácido o aminoácidos y/o el enlace o enlaces peptídicos han sido reemplazados por análogos funcionales. El término polipéptido también hace referencia a, y no excluye, modificaciones del polipéptido, p. ej., glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Tales modificaciones se describen bien en la técnica.

El término "aminoácido" hace referencia a aminoácidos sintéticos y de origen natural, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos de origen natural son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, p. ej., hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina. Análogos de aminoácidos hace referencia a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono a que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, p. ej., homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metilsulfoniometionina. Tales análogos tienen grupos R modificados (p. ej., norleucina) o esqueletos peptídicos modificados, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural. Miméticos de aminoácidos hace referencia a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente a la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de una manera similar a un aminoácido de origen natural. Se hace referencia a los aminoácidos en el presente documento ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por sus símbolos de una letra recomendados por la Biochemical Nomenclature Commission (Comisión de Nomenclatura Bioquímica) de la IUPAC-IUB.

La proteína de fusión divulgada en el presente documento puede comprender un fragmento/parte polipeptídica del polipéptido PD-1 de longitud completa y un fragmento/parte polipeptídica del polipéptido CD28 de longitud completa. Por tanto, el "polipéptido PD-1" que está comprendido en la proteína de fusión proporcionada en el presente documento es un fragmento/parte polipeptídica del polipéptido PD-1 de longitud completa. Las secuencias de aminoácidos de PD-1 de murino/ratón y humano de longitud completa se muestran en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (de murino/ratón como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 1) y 4 (humano como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 3), respectivamente (el número de entrada de Uni Prot de PD-1 de longitud completa humana es Q15116 (número de acceso con el número de versión de entrada 138 y la versión 3 de la secuencia); el número de entrada de Uni Prot de PD-1 de murino/ratón de longitud completa es Q02242 (número de acceso con el número de versión de entrada 125 y la versión 1 de la secuencia). Análogamente, el "polipéptido CD28" que está comprendido en la proteína de fusión proporcionada en el presente documento es un fragmento/parte polipeptídica del polipéptido CD28 de longitud completa. Las secuencias de aminoácidos de CD28 humano y de murino/ratón de longitud completa se muestran en el presente documento como SEQ ID NO: 26 (de murino/ratón como el codificado por la secuencia de ADN de copia (ADNc) mostrada en la SEQ ID NO: 25) y 28 (humano como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 27), respectivamente. Como se menciona anteriormente, la proteína de fusión proporcionada en el presente documento comprende un polipéptido PD-1 que está ligado operativamente a través de su extremo C al extremo N de un dominio intracelular de un polipéptido CD28, en la que el polipéptido PD-1 comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1.

La proteína de fusión proporcionada en el presente documento puede comprender los aminoácidos 1 a 200, preferiblemente los aminoácidos 1 a 190 de la secuencia de aminoácidos de PD-1 como se muestra en la SEQ ID NO: 2 (PD-1 de murino/ratón de longitud completa como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 1). Además, la proteína de fusión PD-1-CD28 proporcionada en el presente documento puede comprender los aminoácidos 1 a 180, 1 a 181, 1 a 182, 1 a 183, 1 a 184, 1 a 185, 1 a 186, 1 a 187, 1 a 188, 1 a 189, 1 a 190, 1 a 191, 1 a 192, 1 a 193, 1 a 194, 1 a 195, 1 a 196, 1 a 197, 1 a 198, 1 a 199, o 1 a 200 de la secuencia de aminoácidos de PD-1 como se muestra en la SEQ ID NO: 2 (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, el polipéptido PD-1 que está comprendido en la proteína de fusión puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 8 (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 7) (murino/ratón). Sin embargo, más preferiblemente, la proteína de fusión divulgada en el presente documento comprende polipéptidos que derivan de un origen humano. Por tanto, más preferiblemente, la proteína de fusión proporcionada en el presente documento comprende los aminoácidos 1 a 200, incluso más preferiblemente los aminoácidos 1 a 191 de la secuencia de aminoácidos de PD-1 como se muestra en la SEQ ID NO: 4 (PD-1 humano de longitud completa como el codificado por el ADNc mostrado en la SEQ ID NO: 3). Por consiguiente, la proteína de fusión proporcionada en el presente documento comprende preferiblemente los aminoácidos 1 a 180, 1 a 181, 1 a 182, 1 a 183, 1 a 184, 1 a 186, 1 a 187, 1 a 188, 1 a 189, 1 a 190, 1 a 191, 1 a 192, 1 a 193, 1 a 194, 1 a 195, 1 a 196, 1 a 197, 1 a 198, 1 a 199, o 1 a 200 de la secuencia de aminoácidos de PD-1 como se muestra en la SEQ ID NO: 4 (PD-1 humano de longitud completa como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 3). Por ejemplo, el polipéptido PD-1 que está comprendido en la proteína de fusión del presente documento puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 16 (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 15). Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, la proteína de fusión PD-1-CD28 comprende la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 16 o una secuencia que tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la SEQ ID NO: 16 y que se caracteriza por tener una actividad de unión a PD-L1 o PD-L2.

La sustitución, deleción, inserción/adición mencionada anteriormente puede ser una mutación conservadora. Una “mutación conservadora” hace referencia a sustituciones de aminoácidos en una proteína por otros aminoácidos que tengan características similares (p. ej., carga, tamaño de la cadena lateral, hidrofobicidad/hidrofilicidad, conformación del esqueleto, rigidez, etc.), de tal forma que puedan realizarse cambios frecuentemente sin alterar la actividad biológica de la proteína. Los expertos en la técnica reconocerán que, en general, las sustituciones de un aminoácido en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran la actividad biológica de forma sustancial (véase, p. ej., Watson Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224 (4a Ed.)) (1987). Además, es menos probable que las sustituciones de aminoácidos estructural o funcionalmente similares alteren la actividad biológica. Diversas realizaciones de los compuestos de unión como se divulgan en el presente documento comprenden cadenas polipeptídicas con secuencias que incluyen hasta ninguna, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos específicas divulgadas en el presente documento, p. ej., las SEQ ID NO: 6, 8, 10, 16, 18 o 20.

Por consiguiente, el polipéptido PD-1 que comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1 (PD-1 humano de longitud completa (SEQ ID NO: 4 (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 3)) puede comprender una secuencia que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 16, en la que la secuencia de aminoácidos tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, preferiblemente de 1 a 8, más preferiblemente 1 a 6, incluso más preferiblemente 1 a 5, incluso más preferiblemente 1 o 2, o incluso más preferiblemente 1 sustitución, deleción o inserción en comparación con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 16. Si en la proteína de fusión proporcionada en el presente documento el polipéptido PD-1 comprende una o más sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, respectivamente, entonces dicha proteína de fusión se caracteriza por tener una actividad de unión a PD-L1 y/o PD-L2. Esta actividad de unión se define como la capacidad de unirse al ligando PD-L1 y/o PD-L2 con la misma afinidad, potenciada o reducida en comparación con la proteína PD-1 de longitud completa natural (p. ej., una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 4). La proteína PD-1 natural de longitud completa se une al ligando PD-L1 con una constante de disociación en equilibrio (KD) de 770 nM o menos (Butte y col., Molecular Immunology 45 (2008), 3567-3572) y las proteínas PD-1 naturales de longitud completa se unen al ligando PD-L2 con una constante de disociación en equilibrio (KD) de 140 nM o menos (Butte y col., Molecular Immunology 45 (2008), 3567-3572). Por consiguiente, el polipéptido PD-1 que comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1 (como, p. ej., se muestra en la SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma que tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 16) puede unirse al ligando PD-L1 y/o PD-L2 con la misma unión que la proteína PD-1 natural de longitud completa. Como alternativa, el polipéptido PD-1 que comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1 (como, p. ej., se muestra en la SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma que tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 16) puede unirse al ligando PD-L1 y/o PD-L2 con una afinidad de unión que es al menos 1000, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5 veces mayor (es decir, potenciada) o menor (es decir, reducida) en comparación con la proteína PD-1 natural de longitud completa. El término "KD", tal como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para interacciones proteína-proteína entre, p. ej., el polipéptido PD-1 descrito anteriormente en el presente documento y PD-L1 y/o PD-L2 se pueden determinar usando procedimientos bien establecidos en la técnica. Los procedimientos para determinar la afinidad de unión hacia el ligando PD-L1 y/o PD-L2 son conocidos en la técnica y se describen en el presente documento a continuación con más detalle e incluyen, p. ej., resonancia de plasmón superficial (RPS), medición Biacore, citometría de flujo o ELISA.

La proteína de fusión PD-1-CD28 puede comprender el dominio extracelular de PD-1 que se localiza en los aminoácidos 1 a 169 de la proteína PD-1 de ratón de longitud completa como se muestra en la SEQ ID NO: 2 (como el codificado por el ADNc mostrado en la SEQ ID NO: 1). Como alternativa, la proteína de fusión comprende el dominio extracelular de PD-1 que se localiza en los aminoácidos 1 a 170 de la proteína PD-1 humana de longitud completa como se muestra en la SEQ ID NO: 4 (como el codificado por el ADNc mostrado en la SEQ ID NO: 3). La proteína de fusión PD-1-CD28 puede comprender o consistir en el dominio extracelular de PD-1 como se muestra en la SEQ ID NO: 8 (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 7) o más preferiblemente como se muestra en la SEQ. ID NO: 18 (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 17). El dominio extracelular de la proteína PD-1 (que está comprendido en la proteína de fusión proporcionada en el presente documento) se caracteriza por la capacidad de unirse a los ligandos naturales de PD-1 (es decir, PD-L1 (humano) (entrada de Uni Prot: Q9NZQ7 (número de acceso con la versión de entrada: 130 y la versión 1 de la secuencia) o PD-L2 (humano) (entrada de Unit Prot: Q9BQ51 (número de acceso con la versión de entrada: 115 y la versión 2 de la secuencia) con la misma (es decir, igual), afinidad, potenciada o reducida (es decir, disminuida) en comparación con la proteínaPD-1 natural. La afinidad de una proteína de fusión con PD-L1 y/o PD-L2 puede ensayarse como se describe a continuación en el presente documento. Las secuencias de aminoácidos de PD-L1 humano de longitud completa y PD-L2 humano de longitud completa se muestran en el presente documento como SEQ ID NO: 34 (PD-L1 como el codificado por la secuencia de a Dnc mostrada en la SEQ ID NO: 33) o SEQ ID NO: 36 (PD-L2 como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 35). Una afinidad reducida (es decir, disminuida), la misma (es decir, igual) o preferiblemente potenciada por PD-L1 o PD-L2 puede lograrse mediante mutaciones puntuales en el dominio extracelular de la proteína de fusión que se proporciona en el presente documento. Por ejemplo, cambiar la alanina en la posición correspondiente a la posición del aminoácido 132 de la SEQ ID NO: 18 por una leucina potencia la afinidad de PD-1 (es decir, la unión) a PD-L1 y PD-L2. Potenciar la afinidad del polipéptido PD-1 (que está comprendido en la proteína de fusión proporcionada en el presente documento) por PD-L1 y PD-L2 potencia la actividad de la proteína de fusión proporcionada en el presente documento en las células en términos de secreción de citocinas, proliferación y lisis.

La afinidad de unión de la proteína de fusión proporcionada en el presente documento por PD-L1 o PD-L2 puede evaluarse mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica que incluyen, pero sin limitación, citometría de flujo, ELISA, inmunoprecipitación, transferencia Western, microscopía confocal o convencional (Terawaki y col., International Immunology, 19(7) (2007), 881-890; Cheng y col., J Biol Chem. 288 (17) (2013), 11771-11785; Ghiotto y col., Int Immunol. 22 (8) (2010), 651-660). En particular, la unión de dicha proteína de fusión a PD-L1 o PD-L2 conduce a la agrupación de células T alrededor de la célula diana que podría ser una célula tumoral u otra inmunitaria y a la activación de esas células por medio de la proteína de fusión. La propia proteína de fusión se agrupa en el punto de contacto con la célula diana. Esto se puede medir y/o visualizar, p. ej., mediante microscopía confocal 0 convencional. La unión de la proteína de fusión (es decir, del polipéptido PD-1 que está comprendido en la proteína de fusión) a PD-L1 o PD-L2 es fundamental para cualquier señalización posterior a través de los motivos de señalización CD28 de la proteína de fusión y los efectos resultantes de la misma. Las mutaciones en la proteína de fusión que dan como resultado una afinidad potenciada por los ligandos PD-L1 y/o PD-L2 pueden potenciar la funcionalidad de la proteína de fusión. Los procedimientos para medir la afinidad de una proteína por otra son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen resonancia de plasmón superficial (RPS), medición Biacore, citometría de flujo o ELISA.

Como se describe anteriormente, la proteína de fusión PD-1-CD28 proporcionada en el presente documento comprende el dominio transmembrana de PD-1 que está localizado en los aminoácidos 170 a 191 de la proteína PD-1 de ratón de longitud completa como se muestra en la SEC ID NO: 2 (como el codificado por el ADNc mostrado en la SEQ ID NO: 1). El dominio transmembrana de PD-1 está localizado en los aminoácidos 171 a 191 de la proteína PD-1 humana de longitud completa (como se muestra en la SEC ID NO: 4 (como el codificado por el ADNc que se muestra en la SEC ID NO: 3)). El dominio transmembrana de PD-1 es un componente importante de la proteína de fusión como se describe en el presente documento y permite la transducción de señal a los dominios intracelulares de CD28 tras el acoplamiento del receptor PD-1 (es decir, el polipéptido PD-1 de la proteína de fusión) . El dominio transmembrana que está comprendido en las proteínas de fusión PD-1-CD28 puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10 (de murino/ratón como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 9) o SEQ ID NO: 20 (humano como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 19). Sin embargo, el dominio transmembrana que está comprendido en la proteína de fusión como se describe en el presente documento (SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 20) puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que incluye hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, preferiblemente, 1 a 8, más preferiblemente 1 a 6, incluso más preferiblemente 1 a 4, incluso más preferiblemente 1 a 2, o incluso más preferiblemente 1 sustitución, deleción o inserción en comparación con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10 (de murino/ratón) o 20 (humano). Si en la proteína de fusión proporcionada en el presente documento, el dominio transmembrana comprende ninguna, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con las secuencias de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 10 (de murino/ratón) o 20 (humano), entonces dicha proteína de fusión se caracteriza por mostrar la misma o preferiblemente una actividad de transducción de señal potenciada. La actividad de transducción de señal puede medirse mediante citometría de flujo, transferencia Western o ensayos basados en ELISA que detectan proteínas fosforiladas tales como el homólogo 1 del oncogén de timoma de murino V-akt (AKT). La actividad de transducción de señal también puede detectarse mediante efectos funcionales posteriores tales como la liberación de citocinas, la proliferación o la actividad lítica de células, tales como las células T (como se describe, p. ej., en el presente documento en los Ejemplos adjuntos y en Krutzik y col., Methods Mol Biol. 699 (2011), 179-202; Ekkens y col., Infect Immun. 75 (5) (2007), 2291-2296; Ge y col., Proc Natl Acad Sci US A. 99 (5) (2002), 2983-2988; Düwell y col., Cell Death Differ. 21 (12) (2014), 1825-1837, Fe de erratas en: Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161). Por consiguiente, el dominio transmembrana de PD-1 es un componente importante de la proteína de fusión PD-1-CD28 y proporciona la transducción de señal a los dominios intracelulares de CD28 tras el acoplamiento del dominio receptor de PD-1 (es decir, el polipéptido PD-1 de la proteína de fusión) que puede medirse, p. ej., mediante la producción de citocinas, la proliferación o la actividad lítica de células tales como las células T. Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, la transmembrana de PD-1 puede tener la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 20 (como la codificada por el ADNc mostrado en la SEQ ID NO: 19).

El dominio intracelular de la proteína de fusión PD-1-CD28 de la presente invención deriva del gen CD28 (humano) (entrada de Uni Prot No: P10747 (número de acceso con la versión de entrada: 164 y la versión 1 de la secuencia) y proporciona actividad de CD28, definida como producción de citocinas, proliferación y actividad lítica de la célula transducida descrita en el presente documento, como una célula T transducida. La actividad de CD28 puede medirse mediante la liberación de citocinas por ELISA o citometría de flujo de citocinas tales como interferón-gamma (IFN-y) o interleucina 2 (IL-2) (como se describe a continuación en el presente documento en los Ejemplos adjuntos), la proliferación de células T medida, p. ej., por medición de ki67, la cuantificación celular por citometría de flujo (como se describe a continuación en el presente documento en los Ejemplos adjuntos) o mediante la actividad lítica como se evalúa por medición de impedancia a tiempo real de la célula diana (usando, p. ej., un instrumento ICELLligence como se describe a continuación en los Ejemplos adjuntos en la sección 3.1 y p. ej. en Thakur y col., Biosens Bioelectron.

35(1) (2012), 503-506; Krutzik y col., Methods Mol Biol. 699 (2011), 179-202; Ekkens y col., Infect Immun. 75(5) (2007), 2291-2296; Ge y col., Proc Natl Acad Sci USA. 99(5) (2002), 2983-2988; Düwell y col., Cell Death Differ. 21(12) (2014), 1825-1837, fe de erratas en: Cell Death Differ. 21(12) (2014), 161). Los dominios de señalización PYAP (^aA 208 a 211 de la SEQ ID NO: 28 (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 27)) e YMNM (AA 191 a 194 de SEQ ID NO: 28) son beneficiosos para la función del polipéptido CD28 y los efectos funcionales enumerados anteriormente. La secuencia de aminoácidos del dominio YMNM se muestra en la SEQ ID NO: 29; la secuencia de aminoácidos del dominio PYAP se muestra en la SEQ ID NO: 30. Por consiguiente, en la proteína de fusión de la presente invención, el polipéptido CD28 preferiblemente comprende una secuencia derivada del dominio intracelular de un polipéptido CD28 que tiene las secuencias YMNM (SEQ ID NO: 29) y/o PYAP (SEQ ID NO: 30). En el contexto de la presente invención, un dominio intracelular de un polipéptido CD28 que tiene las secuencias YMNM (SEQ ID NO: 29) y/o PYAP (SEQ ID NO: 30) se caracteriza por una actividad de CD28, definida como producción de citocinas, proliferación y actividad lítica de una célula transducida descrita en el presente documento, como p. ej. una célula T transducida. Por consiguiente, el dominio intracelular de la proteína de fusión PD-1-CD28 como se describe en el presente documento tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (humano) (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 21) o SEQ ID NO: 12 (ratón/murino) (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 11). Sin embargo, en la proteína de fusión divulgada en el presente documento, uno o ambos de estos dominios pueden mutar a FMNM (SEQ ID NO: 31) y/o AYAA (SEQ ID NO: 32), respectivamente. Cualquiera de estas mutaciones reduce la capacidad de la proteína de fusión para liberar citocinas sin afectar a su capacidad para proliferar y puede usarse ventajosamente para prolongar la viabilidad y por tanto el potencial terapéutico de las células transducidas. O, en otras palabras, tal mutación no funcional potencia preferiblemente la persistencia de las células que se transducen con la proteína de fusión proporcionada en el presente documento in vivo. Sin embargo, estos motivos de señalización pueden estar presentes en cualquier sitio dentro del dominio intracelular de la proteína de fusión proporcionada en el presente documento.

Por consiguiente, la proteína de fusión PD-1-CD28 puede comprender los aminoácidos 170 a 218, preferiblemente los aminoácidos 178 a 218 de la secuencia de aminoácidos de CD28 como se muestra en SEQ ID NO: 26 (CD28 de ratón de longitud completa codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 25). El polipéptido CD28 intracelular puede tener cualquier longitud siempre que el dominio intracelular comprenda las secuencias YMNM (SEQ ID NO: 29) y/o PYAP (SEQ ⁱD NO: 30). Por consiguiente, el dominio intracelular de CD28 de la proteína de fusión PD-1-CD28 puede comprender una secuencia derivada del dominio intracelular del polipéptido CD28 que tiene las secuencias YMNM (SEQ ID NO: 29) y/o PYAP (SEQ ID NO: 30). Por ejemplo, el polipéptido CD28 que está comprendido en la proteína de fusión como se describe en el presente documento puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 12 (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 11). Como se menciona, la proteína de fusión comprende preferiblemente polipéptidos de origen humano. Por tanto, más preferiblemente, la proteína de fusión proporcionada en el presente documento comprende los aminoácidos 170-220, incluso más preferiblemente los aminoácidos 180 a 220 de la secuencia de aminoácidos de CD28 como se muestra en la SEQ ID NO: 28 (CD28 humano de longitud completa como el codificado por el ADNc mostrado en la SEQ ID NO: 27). Por ejemplo, el polipéptido CD28 que está comprendido en la proteína de fusión puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 22 (como el codificado por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 21). El polipéptido CD28 intracelular puede tener cualquier longitud siempre que el dominio intracelular de la proteína de fusión comprenda las secuencias YMNM (SEQ ID ⁿO: 29) y/o PYAP (S^eQ ID NO: 30). Por consiguiente, el dominio intracelular de CD28 de la proteína de fusión PD-1-CD28 puede comprender una secuencia derivada del dominio intracelular del polipéptido CD28 que tiene las secuencias YMNM (SEQ ID NO: 29) y/o PYAP (SEQ ID NO: 30). Por ejemplo, el polipéptido CD28 que está comprendido en la proteína de fusión como se describe en el presente documento puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 12 (de murino/ratón) o 22 (humano). En el presente contexto, el polipéptido CD28 de la proteína de fusión PD-1-CD28 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En el presente contexto, la proteína de fusión comprende un dominio intracelular de un polipéptido CD28 que tiene las secuencias YMNM (SEQ ID NO: 29) y/o PYAP (SEQ ID NO: 30). Por consiguiente, en el presente contexto, el polipéptido CD28 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 (humano).

Además, la proteína de fusión PD-1-CD28 proporcionada en el presente documento puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 14 (proteína de fusión de PTM de murino/ratón (mPTM) como la codificada por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 13). Lo más preferiblemente, la proteína de fusión proporcionada en el presente documento comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 24 (proteína de fusión de PTM humana (hPTM) como la codificada por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 23). Por consiguiente, la presente invención se refiere a una proteína de fusión PD-1-CD28 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24.

Además, la presente invención se refiere a una fusión de proteína que consiste en la SEQ ID NO: 24, en la que dicha proteína de fusión tiene

(a) un polipéptido PD-1 que comprende una secuencia que tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, preferiblemente 1 a 8, más preferiblemente 1 a 6, incluso más preferiblemente 1 a 5, incluso más preferiblemente 1 o 2, o incluso más preferiblemente 1 sustitución, deleción o inserción en comparación con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 18 y que se caracteriza por tener una actividad de unión a PD-L1 o PD-L2;

(b) un dominio transmembrana de PD-1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, y

(c) un polipéptido CD28 que comprende una secuencia derivada del dominio intracelular de un polipéptido CD28 que tiene las secuencias YMNM (SEQ ID NO: 29) y/o PYAP (SEQ ID NO: 30).

Como se describe anteriormente, la actividad de unión a PD-L1 y/o unión a PD-L2 se define como la capacidad de unirse al ligando PD-L1 y/o PD-L2 con la misma afinidad, potenciada o reducida en comparación con la proteína PD-1 natural de longitud completa (p. ej., Una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 4 (como la codificada por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 3). Por consiguiente, el polipéptido PD-1 que comprende el dominio extracelular de PD-1 puede unirse al ligando PD-L1 y/o PD-L2 con la misma unión que la proteína PD-1 natural de longitud completa. Como alternativa, el polipéptido PD-1 que comprende el dominio extracelular puede unirse al ligando PD-L1 y/o PD-L2 con una afinidad de unión que es al menos 1000, 100, 50, 40, 30, 20, 10, 5 veces mayor (es decir, potenciada) o menor (es decir, reducida) en comparación con la proteína PD-1 natural de longitud completa. Además, los procedimientos para la determinación de la actividad de unión a PD-L1 y/o PD-L2 son bien conocidos por el experto y se describen anteriormente en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "PD-1" se refiere a la proteína 1 de muerte celular programada, también conocida como PD-1 y CD279 (grupo de diferenciación 279). PD-1 es una proteína que en seres humanos está codificada por el gen PDCD1. Además, PD-1 es un receptor de superficie celular que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulinas y se expresa en células T y células pro-B. Se sabe que PD-1 se une a dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. PD-1 y sus ligandos desempeñan un papel importante en la regulación negativa del sistema inmunitario al evitar la activación de las células T, lo que a su vez reduce la autoinmunidad y promueve la autotolerancia. El efecto inhibidor de PD-1 se logra a través de un mecanismo dual de promover la apoptosis (muerte celular programada) en las células T específicas de antígeno en los ganglios linfáticos mientras simultáneamente se reduce la apoptosis en las células T reguladoras (células T supresoras). Las secuencias de proteína de PD-1 humana y de ratón se muestran en el presente documento en la SEQ ID NO: 4 (como la codificada por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 3) o SEQ ID NO: 2 (como la codificada por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 1). Las secuencias de ácido nucleico de PD-1 humana y de ratón se muestran en las SEQ ID NO: 3 (humana) y 1 (de murino/ratón), respectivamente.

Como se usa en el presente documento, el término "CD28" se refiere al receptor "grupo de diferenciación 28". CD28 es una de las proteínas expresadas en las células T que proporcionan señales coestimuladoras necesarias para la activación y supervivencia de las células T. La estimulación de células T a través de CD28 además del receptor de células T (TCR) puede proporcionar una señal potente para la producción de diversas interleucinas (p. ej., IL-6). CD28 es el receptor de las proteínas CD80 (B7.1) y CD86 (B7.2). Las secuencias de aminoácidos de la proteína CD28 humana y de ratón se muestran en el presente documento como la SEQ ID NO: 28 (como la codificada por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 27) o la SEQ ID NO: 26 (como la codificada por la secuencia de ADNc mostrada en la SEQ ID NO: 25). Las secuencias de ácido nucleico de CD28 humana y de ratón se muestran en las SEQ ID NO: 27 (humana) y 25 (de murino/ratón), respectivamente.

Como se usa en el presente documento, el término "ligado operativamente" hace referencia al ligamiento funcional entre al menos dos secuencias de proteínas, es decir, entre el polipéptido PD-1 descrito en el presente documento que comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1 y el dominio intracelular de CD28. El polipéptido PD-1 y el polipéptido CD28 comprendidos en las proteínas de fusión divulgadas en el presente documento pueden ligarse covalentemente. El ligamiento covalente de un polipéptido PD-1 que comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1 con un dominio intracelular de un polipéptido CD28 da como resultado una proteína de fusión en la que dicho polipéptido PD-1 está conectado a través de su extremo C al extremo N del polipéptido CD28. Un enlace covalente es un enlace químico que se caracteriza por el intercambio de pares de electrones entre átomos, como, entre otros, el obtenido mediante la unión cruzada ejemplificada en el presente documento mediante compuestos químicos. Sin embargo, también se prevé la producción recombinante de constructos como se divulga en el presente documento, es decir, polipéptido PD-1 que comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1 y un dominio intracelular unido covalentemente de un polipéptido CD28. "Ligado operativamente" hace referencia a un enlace funcional entre al menos dos polipéptidos, lo que significa que ambos polipéptidos retienen sus funcionalidades.

Además, la proteína de fusión proporcionada en el presente documento puede comprender un ligador (o "espaciador"). Un ligador es normalmente un péptido que tiene una longitud de hasta 20 aminoácidos. Por consiguiente, el ligador puede tener una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más aminoácidos. Por ejemplo, la proteína de fusión proporcionada en el presente documento puede comprender un ligador entre el polipéptido PD-1 y el polipéptido CD28. Tales ligadores tienen la ventaja de que pueden hacer más probable que los diferentes polipéptidos de la proteína de fusión (es decir, el polipéptido PD-1 y el polipéptido CD28) se plieguen independientemente y se comporten como se esperaba. Por tanto, el polipéptido PD-1 y el polipéptido CD28 pueden estar comprendidos en un polipéptido multifuncional monocatenario. Un constructo de fusión PD-1-CD28 monocatenario, por ejemplo, puede consistir en (a) polipéptido o polipéptidos que comprenden un dominio o dominios derivados de PD-1 y un dominio o dominios intracelulares de un polipéptido CD28. Dichos dominios están conectados por un ligador polipeptídico, en el que dicho ligador está dispuesto entre dicho dominio o dominios derivados de PD-1 y dicho dominio polipeptídico intracelular de CD28.

Como se usa en el presente documento, el término "extremo N" puede usarse indistintamente con el extremo amino de un polipéptido, el extremo NH2, el extremo N-terminal o el extremo amina. El término significa el comienzo natural de una proteína o polipéptido.

Como se usa en el presente documento, el término "extremo C" puede usarse indistintamente con el extremo carboxi de un polipéptido, el extremo carboxi, el extremo carboxilo, la cola C-terminal, el extremo C-terminal o el extremo COOH. El término significa el final natural de una proteína o polipéptido.

En el presente documento, el término "dominio extracelular", en particular en el contexto del dominio extracelular de PD-1, se refiere a la parte del receptor (es decir, de PD-1) que sobresale de la membrana en el exterior de la célula. La actividad del dominio extracelular es unirse a un ligando específico (p. ej., PD-L1 o PD-L2). El dominio extracelular de la proteína de fusión PD-1-CD28 puede tener la secuencia de aminoácidos/polipeptídica de SEQ ID NO: 18 o una secuencia polipeptídica que tiene hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la SEQ ID NO: 18 y que se caracteriza por tener actividad de unión a PD-L1 y/o PD-L2 como se describe en el presente documento anteriormente. En el presente documento, el término "dominio transmembrana", en particular en el contexto del dominio transmembrana de PD-1, se refiere a la parte del receptor (es decir, PD-1) que se localiza naturalmente dentro de la membrana de la célula (p. ej., la célula T). El dominio transmembrana de PD-1 puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 o una secuencia de aminoácidos que tiene hasta 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la SEQ ID NO: 20 y que se caracteriza por mostrar la misma o preferiblemente una actividad de transducción de señal potenciada como se describe en el presente documento anteriormente. En el presente documento, el término "dominio intracelular", en particular en el contexto del dominio intracelular de CD28, se refiere al dominio citoplasmático del receptor (es decir, CD28). El dominio intracelular se refiere a una secuencia de aminoácidos que deriva del dominio intracelular de un polipéptido CD28 que tiene las secuencias YMNM (SEQ ID NO: 29) y/o PYAP (SEQ ID NO: 30), como la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 22. El dominio intracelular interactúa con el interior de la célula.

La producción de las proteínas de fusión divulgadas en el presente documento se conoce comúnmente en la técnica. Por ejemplo, la proteína de fusión como se describe en el presente documento puede crearse mediante manipulación genética de un gen de fusión. Esto típicamente implica retirar el codón de terminación de una secuencia de ADNc que codifica el primer polipéptido (es decir, el polipéptido PD-1) y entonces agregar la secuencia de ADNc del segundo polipéptido (es decir, el polipéptido CD28) en fase mediante ligación o PCR de extensión por superposición. Esa secuencia de ADN puede ser expresada entonces por una célula como una sola proteína. Por ejemplo, la proteína de fusión se puede generar mediante PCR de superposición y clonación de expresión recombinante en un vector retrovírico (p. ej., el vector pMP71) como se describe en los ejemplos ilustrativos adjuntos.

También están abarcadas por la presente invención una molécula o moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión como se definen en el presente documento.

El término "molécula de ácido nucleico" se refiere a la secuencia de bases que comprenden bases de purina y pirimidina que están compuestas por polinucleótidos, por lo que dichas bases representan la estructura primaria de una molécula de ácido nucleico. En el presente documento, el término "molécula de ácido nucleico" incluye ADN, ADNc, ADN genómico, ARN, formas sintéticas de ADN y polímeros mixtos que comprenden dos o más de estas moléculas. Además, el término "molécula de ácido nucleico" incluye tanto hebras con sentido como antisentido. Además, la "molécula de ácido nucleico" descrita en el presente documento puede contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Las moléculas de ácido nucleico ejemplares que codifican la proteína de fusión humana y de ratón como se describe en el presente documento se muestran en la SEQ ID NO: 23 (humana) o SEQ ID NO: 13 (de ratón).

Las moléculas de ácido nucleico como se describen en el presente documento pueden estar bajo el control de secuencias reguladoras. Por ejemplo, pueden emplearse promotores, potenciadores transcripcionales y/o secuencias que permitan la expresión inducida de la proteína de fusión divulgada en el presente documento. Las moléculas de ácido nucleico pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo o inducible. Son promotores adecuados, p. ej., el promotor CMV (Qin y col., PLoS One 5 (5) (2010), e10611), el promotor UBC (Qin y col., PLoS One 5 (5) (2010), e10611), PGK (Qin y col., PLoS One 5 (5) (2010), e10611), el promotor EF1A (Qin y col., PLoS One 5 (5) (2010), e10611), el promotor CAGG (Qin y col., PLoS One 5 (5) (2010), e10611), el promotor SV40 (Qin y col., PLoS One 5 (5) (2010), e10611), el promotor COPIA (Qin y col., PLoS One 5 (5) (2010), e10611), el promotor ACT5C (Qin y col., PLoS One 5 (5) (2010), e10611), el promotor TRE (Qin y col., PLoS One. 5 (5) (2010), e10611), el promotor Oct3/4 (Chang y col., Molecular Therapy 9 (2004), S367-S367 (doi: 10.1016/j.ymthe.2004.06.904)) o el promotor Nanog (Wu y col., Cell Res. 15 (5) (2005), 317-24).

El término "secuencia regulatoria" hace referencia a secuencias de ADN que son necesarias para realizar la expresión de secuencias codificantes a las que están enlazadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador. En procariotas, las secuencias de control incluyen generalmente un promotor, un sitio de unión ribosómico y terminadores. En eucariotas, las secuencias de control incluyen generalmente promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores o factores de transcripción. El término "secuencia de control" pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes ventajosos adicionales.

Además, se prevé para fines adicionales que las moléculas de ácido nucleico puedan contener, por ejemplo, enlaces tioéster y/o análogos de nucleótidos. Dichas modificaciones pueden ser útiles para la estabilización de la molécula de ácido nucleico contra endo- y/o exonucleasas en la célula. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden ser transcritas por un vector apropiado que contiene un gen quimérico que permite la transcripción de dicha molécula de ácido nucleico en la célula. A este respecto, también debe entenderse que tal polinucleótido se puede usar para enfoques de "orientación genética" o "terapia génica". Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en el presente documento pueden marcarse. Los procedimientos para la detección de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica, p. ej., transferencia Southern y Northern, PCR o extensión de cebadores. Esto puede ser útil para procedimientos de cribado para verificar la introducción satisfactoria de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente durante los enfoques de terapia génica. Dicha molécula o moléculas de ácido nucleico puede ser una molécula de ácido nucleico quimérica producida de manera recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, ya sea solas o en combinación. La molécula de ácido nucleico puede ser parte de un vector.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a vectores que comprenden la molécula de ácido nucleico de la presente invención como se define en el presente documento. En el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico circular o lineal que puede replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora (es decir, en una célula transducida) en la que se ha introducido. El "vector" como se usa en el presente documento hace referencia particularmente a un plásmido, un cósmido, un virus, un bacteriófago y otros vectores comúnmente usados en ingeniería genética. Además, el vector como se divulga en el presente documento puede ser adecuado para la transformación de células, preferiblemente de células T. Por consiguiente, en un aspecto de la divulgación, el vector que se proporciona en el presente documento es un vector de expresión. Los vectores de expresión se han descrito ampliamente en la bibliografía. En particular, el vector proporcionado en el presente documento comprende preferiblemente un polinucleótido recombinante (es decir, una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión como se describe en el presente documento) así como secuencias de control de la expresión ligadas operativamente a la secuencia de nucleótidos que se va a expresar. El vector como se proporciona en el presente documento preferiblemente comprende además un promotor. El vector descrito en el presente documento también puede comprender un gen marcador de selección y un origen de replicación que asegura la replicación en el hospedador (es decir, la célula transducida). Además, el vector proporcionado en el presente documento también puede comprender una señal de terminación para la transcripción. Entre el promotor y la señal de terminación hay preferiblemente al menos un sitio de restricción o un poliligador que permite la inserción de una molécula de ácido nucleico (p. ej., una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión como se describe en el presente documento) que se desea expresar. El experto en la materia sabe cómo se puede poner en práctica tal inserción. Se conocen en la técnica ejemplos de vectores adecuados para comprender una molécula de ácido nucleico como se describe en el presente documento para formar el vector de la presente divulgación. Por ejemplo, los vectores adecuados incluyen cósmidos, plásmidos (p. ej., desnudos o contenidos en liposomas) y virus (p. ej., lentivirus, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) que incorporan la molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento (es decir, la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión como se describe en el presente documento). Preferiblemente, el vector como se divulga en el presente documento es un vector vírico. Más preferiblemente, el vector divulgado en el presente documento es un vector lentivírico, e incluso más preferiblemente, el vector de la presente divulgación es un vector retrovírico (p. ej., el vector pMP71). Por consiguiente, el vector puede ser un vector lentivírico o un vector retrovírico. El vector como se divulga en el presente documento permite la expresión constitutiva o condicional de la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión PD-1-CD28 como se describe en el presente documento. En este contexto, se conocen en la técnica vectores retrovíricos adecuados para la expresión de la proteína de fusión como se describe en el presente documento tales como SAMEN CMV/SRa (Clay y col., J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS-id3-IHRES (Heemskerk y col., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV (Neil y col., Nature 308 (1984), 814-820), SAX (Kantoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL (Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2 (Kasid y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6 (Tiberghien y col., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO (Chen y col., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN (Mullen y col., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pGlXsNa (Taylor y col., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX (Sun y col., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo y col., Blood 90 (1997), LXSN (Sun y col., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo y col., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb-Hu (Vieillard y col., Proc. Natl. Acad. Sci. ^uS^a 94 (1997), 11595-11600), pMV7 (Cochlovius y col., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH (Weitjens y col., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR (Yang y col., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132), pBAG (Wu y col., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn (Gilham y col., J. Immunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN (Engels y col., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pMP71 (Engels y col., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM (Morgan y col., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV (Zhao y col., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423), o pMX (de Witte y col., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136). Además, los vectores lentivíricos adecuados para la expresión de la proteína de fusión como se describe en el presente documento son, por ejemplo, el vector lentivírico PL-SIN (Hotta y col., Nat Methods. 6 (5) (2009), 370-376), p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/MeI (Campeau y col., PLoS One 4 (8) (2009), e6529), pCMVR8.74 (N°. de catálogo de Addgene:22036), FUGW (Lois y col., Science 295 (5556) (2002), 868-872, pLVX-EF1 (No de catálogo de Addgene: 64368), pLVE (Brunger y col., Proc Natl Acad Sci USA 111 (9) (2014), E798-806), pCDH1-MCS1-EF1 (Hu y col., Mol Cancer Res. 7 (11) (2009), 1756-1770), pSLIK (Wang y col., Nat Cell Biol. 16 (4) (2014), 345-356), pLJM1 (Solomon y col., Nat Genet. 45 (12) (2013), 1428-30), pLX302 (Kang y col., Sci Signal. 6 (287) (2013), rs13), pHR-IG (Xie y col., J Cereb Blood Flow Metab. 33 (12) (2013), 1875-85), pRRLSIN (No. de catálogo de Addgene: 62053), pLS (Miyoshi y col., J Virol. 72 (10) (1998), 8150-8157), pLL3.7 (Lazebnik y col., J Biol Chem. 283 (7) (2008), 11078-82), FRIG (Raissi y col., Mol Cell Neurosci. 57 (2013), 23-32), pWPT (Ritz-Laser y col., Diabetologia. 46 (6) (2003), 810-821), pBOB (Marr y col., J Mol Neurosci. 22 (1-2) (2004), 5-11) o pLEX (No. de catálogo de Addgene: 27976).

La invención también se refiere a células transducidas que expresan una proteína de fusión codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la presente invención como se define en el presente documento. Por consiguiente, la célula transducida de la invención puede comprender una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de la presente invención como se define en el presente documento o un vector de la presente invención que expresa una proteína de fusión de la presente invención como se define en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "célula transducida" se refiere a una célula modificada genéticamente (es decir, una célula en la que se ha introducido deliberadamente una molécula de ácido nucleico). La célula transducida proporcionada en el presente documento puede comprender el vector de la presente divulgación. Preferiblemente, la célula transducida proporcionada en el presente documento comprende la molécula de ácido nucleico (que codifica la proteína de fusión) como se describe en el presente documento y/o el vector de la presente divulgación. La célula transducida divulgada en el presente documento puede ser una célula que expresa de forma transitoria o estable el ADN extraño (es decir, la molécula de ácido nucleico que se ha introducido en la célula). En particular, la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión como se describe en el presente documento puede integrarse de manera estable en el genoma de la célula usando una transducción retrovírica o lentivírica. Usando la transfección de ARNm, la molécula de ácido nucleico que codifica la fusión divulgada en el presente documento puede expresarse de forma transitoria. Preferiblemente, la célula transducida proporcionada en el presente documento se ha modificado genéticamente mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico en la célula mediante un vector vírico (p. ej., un vector retrovírico o un vector lentivírico). La expresión puede ser constitutiva o constitucional, dependiendo del sistema usado. La proteína de fusión PD-1-CD28 se expresa en la superficie de la célula transducida proporcionada en el presente documento. La proporción extracelular del polipéptido PD-1 de la proteína de fusión se puede detectar en la superficie celular, mientras que la intracelular (tanto transmembrana como, p. ej., una parte del dominio intracelular del polipéptido PD-1) se une a la membrana, pero es no detectable en la superficie celular. La detección del dominio extracelular del polipéptido PD-1 se puede llevar a cabo usando un anticuerpo que se une específicamente a este dominio extracelular del polipéptido PD-1. Los ejemplos de tales anticuerpos son bien conocidos en la técnica e incluyen el clon EH12.2H7 (disponible comercialmente en BioLegend, número de catálogo: 329911), el clon J116 (disponible comercialmente en eBioscience, número de catálogo: 16-9989­ 80), J105 (disponible comercialmente en eBioscience, número de catálogo: 8012-2799) o MiH4 (disponible comercialmente en eBioscience, número de catálogo: 14-9969). El dominio extracelular se puede detectar usando estos anticuerpos mediante citometría de flujo o microscopía. La célula transducida como se divulga en el presente documento puede ser, por ejemplo, una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula T ^y§, una célula T citolítica natural (NK), una célula linfocítica natural (NK), una célula linfocítica infiltrante de tumor (TIL), una célula mieloide o un citoblasto mesenquimatoso. Preferiblemente, la célula transducida proporcionada en el presente documento es una célula T (por ejemplo, una célula T autóloga), más preferiblemente, la célula transducida es una célula T CD8+. Por consiguiente, la célula transducida puede ser una célula T CD8+. Además, la célula transducida puede ser una célula T autóloga. Por consiguiente, la célula transducida es preferiblemente una célula T CD8+ autóloga. Además del uso de células autólogas (por ejemplo, células T) aisladas del sujeto, la presente divulgación también comprende el uso de células alogénicas. Por consiguiente, la célula transducida también puede ser una célula alogénica, tal como una célula T CD8+ alogénica. Como alternativa o adicionalmente, la divulgación proporciona una célula T CD4+ transducida, que puede ser una célula T CD4+ autóloga o una célula T CD4+ alogénica. Como alternativa o adicionalmente, la divulgación proporciona poblaciones de células T CD4+ y/o células T CD8+ transducidas (incluidas, pero sin limitación, poblaciones que comprenden células T CD4+ transducidas, poblaciones que comprenden células T CD8+ transducidas y poblaciones que comprenden células T CD4+ transducidas y células T CD8+ transducidas), en las que las células transducidas pueden ser autólogas y/o alogénicas (p. ej., la población puede comprender solo células autólogas, solo células alogénicas o combinaciones de células tanto autólogas como alogénicas). Las poblaciones de células T de la divulgación como se describen en el presente documento pueden comprender células T tanto transducidas como no transducidas.

El uso de células alogénicas se basa en el hecho de que las células, preferiblemente las células T, pueden reconocer un epítopo de antígeno específico presentado por células presentadoras de antígenos extraños (APC), siempre que las APC expresen la molécula de MHC, de clase I o clase II, a la que se restringe la población de células de respuesta específica, es decir, la población de células T, junto con el epítopo de antígeno reconocido por las células T. Por tanto, el término alogénico hace referencia a las células que provienen de un individuo/sujeto donante no emparentado que es de antígeno leucocitario humano (HLA) compatible con el individuo/sujeto que se tratará, p. ej., mediante la célula transducida que expresa la proteína de fusión PD-1-CD28 descrita en el presente documento. Las células autólogas hacen referencia a células que se aíslan/obtienen como se describe en el presente documento anteriormente a partir del sujeto a tratar con la célula transducida descrita en el presente documento.

Como se describe anteriormente, la célula transducida divulgada en el presente documento se transduce con una molécula de ácido nucleico que expresa la proteína de fusión proporcionada en el presente documento. En el caso de células portadoras de especificidad antitumoral natural, tales como las células linfocíticas infiltrantes de tumores (TIL, Dudley y col., J Clin Oncol. 31 (17) (2013), 2152-2159 (doi: 10.1200/JCO.2012.46.6441)) o células específicas de antígeno seleccionadas de la sangre periférica de pacientes por su especificidad tumoral mediante citometría de flujo (Hunsucker y col., Cancer Immunol Res. 3 (3) (2015), 228-235 (doi: 10.1158/2326-6066.CIR-14-0001)), las células descritas en el presente documento solo se transducirían con la proteína de fusión como se divulga en el presente documento. Sin embargo, la célula transducida como se describe en el presente documento puede cotransducirse con moléculas de ácido nucleico adicionales, p. ej., con una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T o un receptor de antígeno quimérico.

Como se usa en el presente documento, el término "receptor de células T" se conoce comúnmente en la técnica. En particular, en el presente documento, el término "receptor de células T" hace referencia a cualquier receptor de células T, siempre que se cumplan los siguientes tres criterios: (i) especificidad tumoral, (ii) reconocimiento de (la mayoría de) las células tumorales, lo que significa que un antígeno o la diana debe expresarse en (la mayoría de) las células tumorales y (iii) que el TCR coincida con el tipo de HLA del sujeto a tratar. En este contexto, se conocen en la técnica receptores de células T adecuados que cumplen los tres criterios mencionados anteriormente, tales como receptores que reconocen WT1 (antígeno específico del tumor de Wilms 1; para obtener información sobre la secuencia, véase, p. ej., Sugiyama, Japanese Journal of Clinical Oncology 40 (2010), 377-87), MAGE (para obtener información sobre la secuencia, véanse, p. ej., los documentos WO-A1 2007/032255 y PCT/US2011/57272), SSX (solicitud provisional de EE. UU. Núm. 61/388.983), NY-ESO-1 (para obtener información sobre la secuencia, véase, p. ej., el documento PCT/GB2005/001924) y/o HER2neu (para obtener información sobre la secuencia, véase el documento WO-A1 2011/0280894).

El término "receptor de antígeno quimérico" o "receptor quimérico" es conocido en la técnica y hace referencia a un receptor constituido por una porción extracelular de un dominio de anticuerpo monocatenario fusionado por una secuencia espaciadora a los dominios señal de CD3z y CD28. De nuevo, este receptor de antígeno quimérico debería proporcionar especificidad tumoral y permitir el reconocimiento de la mayoría de las células tumorales. Los receptores quiméricos adecuados incluyen: anti-EGFRv3-CAR (para la secuencia véase el documento WO-A1 2012/138475), anti-CD22-CAR (véase el documento WO-A1 2013/059593), anti-BCMA-CAR (véase el documento WO-A1 2013/154760), anti-CD19-CAR (véanse los documentos WO-A1 2012/079000 o US-A1 2014/0271635), anti-CD123-CAR (véase el documento US-A1 2014/0271582), anti-CD30-CAR (véase el documento WO-A1 2015/028444) o antimesotelina-CAR (véase el documento WO-A1 2013/142034).

La presente divulgación también hace referencia a un procedimiento para la producción de una célula transducida que expresa una proteína de fusión como se describe en el presente documento, que comprende las etapas de transducción de una célula con un vector como se divulga en el presente documento, cultivo de la célula transducida en condiciones que permitan la expresión de la proteína de fusión en o sobre dicha célula transducida y recuperación de dicha célula transducida.

La célula transducida como se describe en el presente documento se produce preferiblemente mediante el siguiente proceso: las células (p. ej., células T) se aíslan/obtienen a partir de un sujeto (preferiblemente un paciente humano). Los procedimientos para aislar/obtener las células (p. ej., células T) de pacientes o de donantes son bien conocidos en la técnica y, en el presente contexto, las células (p. ej., células T) de pacientes o de donantes pueden aislarse mediante extracción de sangre o extracción de médula ósea. Después aislar/obtener células como muestra del paciente, las células (p. ej., células T) se separan de los otros ingredientes de la muestra. Se conocen varios procedimientos para separar células (p. ej., células T) de la muestra e incluyen, sin ser limitativos, p. ej., leucocitaféresis para obtener células de la muestra de sangre periférica de un paciente o de un donante, aislamiento/obtención de células mediante el uso de un aparato FACSort, recogiendo células vivas de células muertas de especímenes de biopsia recientes que albergan células vivas a mano o mediante el uso de un micromanipulador (véanse, por ejemplo, Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342; Robbins, Clin. Oncol. 29 (2011), 917-924 o Leisegang, J. Mol. Medicina. 86 (2008), 573-58). Los procedimientos y procesos divulgados en este párrafo y divulgados de otro modo en el presente documento se realizan preferiblemente con respecto a las células T CD8+, pero también son aplicables a otros tipos de células T tales como las células T CD4+.

En el presente documento, el término "biopsia reciente del paciente" hace referencia a tejido (preferiblemente tejido tumoral) extraído de un sujeto mediante cirugía o cualquier otro medio conocido, así como líneas de células tumorales o células (aisladas) de un tejido tumoral/célula tumoral. Las células T aisladas/obtenidas (p. ej., células T CD8+) se cultivan y expanden posteriormente, p. ej., mediante el uso de un anticuerpo anti-CD3, mediante el uso de anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28 y/o usando un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD28 e interleucina-2 (IL-2) (véanse, por ejemplo, Dudley, Immunother. 26 (2003), 332-342 o Dudley, Clin. Oncol. 26 (2008), 5233-5239).

En una etapa posterior, las células (p. ej., células T) se modifican/transducen artificial/genéticamente mediante procedimientos conocidos en la técnica (véase, p. ej., Lemoine, J Gene Med 6 (2004), 374-386). Los procedimientos para transducir células (p. ej., células T) son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, en un caso en el que se transduce un ácido nucleico o un ácido nucleico recombinante, por ejemplo, un procedimiento de electroporación, procedimiento de fosfato cálcico, procedimiento de lípidos catiónicos o procedimiento de liposomas. El ácido nucleico que se va a transducir se puede transducir de manera convencional y muy eficaz usando un reactivo de transfección disponible comercialmente, por ejemplo, Lipofectamine (fabricado por Invitrogen, n.° de catálogo: 11668027). En un caso en el que se use un vector, el vector se puede transducir de la misma manera que el ácido nucleico mencionado anteriormente siempre que el vector sea un vector de plásmido (es decir, un vector que no es un vector vírico). Los procedimientos para transducir células (p. ej. células T) incluyen la transducción de células T retrovíricas o lentivíricas, así como la transfección de ARNm. "Transfección de ARNm" hace referencia a un procedimiento bien conocido por los expertos en la técnica para expresar transitoriamente una proteína de interés, como en el presente caso la proteína de fusión PD-1-CD28 divulgada en el presente documento, en una célula a transducir. En resumen, las células pueden electroporarse con el ARNm que codifica la presente proteína de fusión mediante el uso de un sistema de electroporación (tal como, p. ej., Gene Pulser, Bio-Rad) y luego cultivarse mediante el protocolo de cultivo de células estándar (p. ej., células T) como se describe anteriormente (véase Zhao y col., Mol Ther. 13 (1) (2006), 151-159). Preferiblemente, la célula transducida como se describe en el presente documento es una célula T (lo más preferiblemente una célula T CD8+) y es generada por la transducción de células T lentivíricas, o más preferiblemente retrovíricas.

En este contexto, se conocen en la técnica vectores retrovíricos adecuados para transducir células (p. ej., células T) tales como SAMEN CMV/SRa (Clay y col., J. Immunol. 163 (1999), 507-513), LZRS-id3-IHRES (Heemskerk y col., J. Exp. Med. 186 (1997), 1597-1602), FeLV (Neil y col., Nature 308 (1984), 814-820), SAX (Kantoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83 (1986), 6563-6567), pDOL (Desiderio, J. Exp. Med. 167 (1988), 372-388), N2 (Kasid y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 473-477), LNL6 (Tiberghien y col., Blood 84 (1994), 1333-1341), pZipNEO (Chen y col., J. Immunol. 153 (1994), 3630-3638), LASN (Mullen y col., Hum. Gene Ther. 7 (1996), 1123-1129), pGlXsNa (Taylor y col., J. Exp. Med. 184 (1996), 2031-2036), LCNX (Sun y col., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo y col., Blood 90 (1997), LXSN (Sun y col., Hum. Gene Ther. 8 (1997), 1041-1048), SFG (Gallardo y col., Blood 90 (1997), 952-957), HMB-Hb-Hu (Vieillard y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 11595-11600), pMV7 (Cochlovius y col., Cancer Immunol. Immunother. 46 (1998), 61-66), pSTITCH (Weitjens y col., Gene Ther 5 (1998), 1195-1203), pLZR (Yang y col., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 123-132), pBAG (Wu y col., Hum. Gene Ther. 10 (1999), 977-982), rKat.43.267bn (Gilham y col., J. Immunother. 25 (2002), 139-151), pLGSN (Engels y col., Hum. Gene Ther.

14 (2003), 1155-1168), pMP71 (Engels y col., Hum. Gene Ther. 14 (2003), 1155-1168), pGCSAM (Morgan y col., J. Immunol. 171 (2003), 3287-3295), pMSGV (Zhao y col., J. Immunol. 174 (2005), 4415-4423), o pMX (de Witte y col., J. Immunol. 181 (2008), 5128-5136). Son vectores lentivíricos adecuados para transducir células (p. ej., células T), p. ej. el vector lentivírico PL-SIN (Hotta y col., Nat Methods. 6(5) (2009), 370-376), p156RRL-sinPPT-CMV-GFP-PRE/NheI (Campeau y col., PLoS One 4(8) (2009), e6529), pCMVR8.74 (No. de catálogo de Addgene:22036), FUGW (Lois y col., Science 295(5556) (2002), 868-872, pLVX-EF1 (No. de catálogo de Addgene: 64368), pLVE (Brunger y col., Proc Natl Acad Sci USA 111(9) (2014), E798-806), pCDH1-MCS1-EF1 (Hu y col., Mol Cancer Res. 7(11) (2009), 1756-1770), pSLIK (Wang y col., Nat Cell Biol. 16(4) (2014), 345-356), pLJM1 (Solomon y col., Nat Genet. 45(12) (2013), 1428-30), pLX302 (Kang y col., Sci Signal. 6(287) (2013), rs13), pHR-IG (Xie et al., J Cereb Blood Flow Metab.

33(12) (2013), 1875-85), pRRLSIN (No. de catálogo de Addgene: 62053), pLS (Miyoshi y col., J Virol. 72(10) (1998), 8150-8157), pLL3.7 (Lazebnik y col., J Biol Chem. 283(7) (2008), 11078-82), FRIG (Raissi y col., Mol Cell Neurosci.

57 (2013), 23-32), pWPT (Ritz-Laser y col., Diabetologia. 46(6) (2003), 810-821), pBOB (Marr y col., J Mol Neurosci.

22(1-2) (2004), 5-11), o pLEX (No. de catálogo de Addgene: 27976).

La célula o células transducidas de la presente divulgación crecen preferiblemente en condiciones controladas, fuera de su entorno natural. En particular, el término "cultivo" significa que las células (p. ej., la célula o células transducidas como se describe en el presente documento) que derivan de eucariotas multicelulares (preferiblemente de un paciente humano) crecen in vitro. El cultivo de células es una técnica de laboratorio para mantener vivas las células que se separan de su fuente de tejido original. En el presente documento, la célula transducida de la presente divulgación se cultiva en condiciones que permiten la expresión de la proteína de fusión como se describe en el presente documento en o sobre dichas células transducidas. Las condiciones que permiten la expresión de un transgén (es decir, de la proteína de fusión divulgada en el presente documento) se conocen comúnmente en la técnica e incluyen, p. ej., anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 agonistas y la adición de citocinas tales como interleucina 2 (IL- 2), interleucina 7 (IL-7), interleucina 12 (IL-12) y/o interleucina 15 (IL-15). Después de la expresión de la proteína de fusión divulgada en el presente documento en la célula transducida cultivada, la célula transducida se recupera (es decir, se vuelve a extraer) del cultivo (es decir, del medio de cultivo).

También está abarcada por la invención una célula transducida que expresa una proteína de fusión codificada por una molécula de ácido nucleico de la invención que se puede obtener mediante el procedimiento de la presente invención.

Además, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula transducida que expresa una proteína de fusión de la presente invención como se define en el presente documento o una célula transducida como se obtiene/produce por el procedimiento divulgado anteriormente. Como se usa en el presente documento, dicha composición es una composición farmacéutica que además comprende, opcionalmente, formulaciones adecuadas de vehículo, estabilizadores y/o excipientes.

Como se usa en el presente documento, el término "medicamento" se usa indistintamente con el término "composición farmacéutica" y se refiere a una composición para la administración a un paciente, preferiblemente un paciente humano. El medicamento/composición farmacéutica ha de administrarse al paciente del cual las células transducidas se aislaron/obtuvieron. En el contexto de la presente divulgación, el paciente hace referencia a un paciente humano. Además, en el contexto de la presente divulgación, ese paciente padece una enfermedad caracterizada por expresar un ligando para PD-1 (es decir, PD-L1 y/o PD-L2). En el contexto de la presente divulgación, las enfermedades que se caracterizan por expresar un ligando para PD-1 (es decir, PD-L1 y/o PD-L2) son conocidas en la técnica e incluyen, p. ej., cáncer de pulmón (Dong y col., Nat Med. 8 (8) (2002), 793-800), cáncer de ovario (Dong y col., Nat Med. 8 (8) (2002), 793-800), melanoma (Dong y col., Nat Med. 8 (8) (2002), 793-800), cáncer de colon (Dong y col., Nat Med. 8 (8) (2002), 793-800), cáncer gástrico (Chen y col., World J Gastroenterol. 9 (6) (2003), 1370-1373), carcinoma de células renales (Thompson y col., 104 (10) (2005), 2084-91), carcinoma de esófago (Ohigashi y col., 11 (8) (2005), 2947-2953), glioma (Wintterle y col., Cancer Res. 63 (21) (2003), 7462-7467), cáncer urotelial (Nakanishi y col., Cancer Immunol Immunother. 56 (8) (2007), 1173-1182), retinoblastoma (Usui y col., Invest Ophthalmol Vis Sci.47 (10) (2006), 4607-4613), cáncer de mama (Ghebeh y col., Neoplasia 8 (3) (2006), 190 -198), linfoma no de Hodgkin (Xerri y col., Hum Pathol. 39 (7) (2008), 1050-1058), carcinoma pancreático (Geng y col., J Cancer Res Clin Oncol. 134 (9) (2008), 1021-1027), linfoma de Hodgkin (Yamamoto y col., Blood 111 (6) (2008), 3220-3224), mieloma (Liu y col., Blood 110 (1) (2007), 296-304), carcinoma hepatocelular (Gao y col., Clin Cancer Res. 15 (3) (2009), 971-979), leucemia (Kozako y col., Leucemia 23 (2) (2009), 375-382), carcinoma cervicouterino (Karim y col., Clin Cancer Res. 15 (20) (2009), 6341-6347), colangiocarcinoma (Ye y col., J Surg Oncol. 100 (6) (2009), 500-504), cáncer bucal (Malaspina y col., Cancer Immunol Immunother. 60 (7) (2011), 965 -974), cáncer de cabeza y cuello (Badoual y col., Cancer Res. 73 (1) (2013), 128-138), o mesotelioma (Mansfield y col., J Thorac Oncol. 9 (7) (2014), 1036-1040).

La composición farmacéutica que comprende la presente célula transducida como se describe en el presente documento o una célula transducida producida por el procedimiento como se describe en el presente documento ha de administrarse en una combinación de protocolos de tratamiento intermedios. Los ejemplos de dichos protocolos de tratamiento intermedios incluyen, pero sin limitación, administración de analgésicos, administración de quimioterapéuticos, manejo quirúrgico de la enfermedad o un síntoma de la misma.

Por consiguiente, los regímenes de tratamiento que se divulgan en el presente documento abarcan la administración de la célula transducida que expresa una proteína de fusión como se describe en el presente documento junto con ninguno, uno o más de un protocolo de tratamiento adecuado para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, o un síntoma de la misma, como se describe en el presente documento o como se conoce en la técnica.

Por consiguiente, la célula transducida que expresa la proteína de fusión como se describe en el presente documento puede usarse para el tratamiento de una enfermedad proliferativa, preferiblemente cáncer. Más preferiblemente, la célula transducida proporcionada en el presente documento que expresa la proteína de fusión de la presente divulgación se usa para el tratamiento de una enfermedad (preferiblemente un cáncer), en la que las células tumorales expresan un ligando para PD-1 (es decir, PD-L1 y/o PD-L2). Los tipos de cáncer que se tratan preferiblemente con la célula transducida proporcionada en el presente documento que expresa la proteína de fusión de la presente divulgación se describen en el presente documento anteriormente. Por tanto, la célula transducida que expresa una proteína de fusión de la presente divulgación codificada por una molécula de ácido nucleico descrita en el presente documento puede usarse en un procedimiento para tratar cualquier enfermedad en la que las células tumorales expresen un ligando para PD-1 (es decir, PD-L1 y/o PD-L2). El procedimiento de tratamiento implica preferiblemente la recolección de células mediante un procedimiento descrito anteriormente como aislamiento/recolección de las células por extracción de sangre o extracción de médula ósea. Posteriormente, las células aisladas se modifican víricamente o mediante electroporación de ARNm con el receptor de fusión (y opcionalmente se cotransducen con moléculas de ácido nucleico adicionales, p. ej., con una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T o un receptor quimérico). Después de la expansión celular, como se destaca anteriormente, las células se transfieren de nuevo al paciente por vía intravenosa. Además, la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento de enfermedades que comprende las etapas de aislar células (p. ej., células T, preferiblemente células T CD8+) de un sujeto, transducir dichas células aisladas con un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión PD-1-CD28 como se describe en el presente documento anteriormente, cotransducir dichas células aisladas con moléculas de ácido nucleico adicionales, p. ej., con una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T o un receptor quimérico como se describe anteriormente, expandir las células transducidas y administrar las células transducidas de nuevo a dicho sujeto. Este procedimiento de tratamiento descrito en el presente documento puede repetirse, p. ej., una o dos veces por semana.

Los términos "tratar", "tratamiento" y similares se usan en la presente generalmente para referirse a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente una enfermedad o un síntoma de esta y/o puede ser terapéutico en términos de curar parcial o totalmente una enfermedad y/o un efecto adverso atribuido a la enfermedad. El término "tratamiento" como se usa en el presente documento cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un sujeto e incluye: (a) prevenir y/o mejorar la aparición de una enfermedad proliferativa (preferiblemente cáncer) en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo, como la inhibición de la progresión del cáncer; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad, como la represión del cáncer. Preferiblemente, el término "tratamiento" como se usa en el presente documento se refiere a la intervención médica de un trastorno ya manifestado, como el tratamiento de un cáncer diagnosticado.

Para los propósitos de la presente divulgación, el "sujeto" (o "paciente") puede ser un vertebrado. Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" incluye tanto a seres humanos como a otros animales, en particular mamíferos y otros organismos. Por tanto, los procedimientos proporcionados en el presente documento son aplicables tanto a la terapia humana como aplicaciones veterinarias. Por consiguiente, dicho sujeto puede ser un animal tal como un ratón, rata, hámster, conejo, cobaya, hurón, gato, perro, pollo, oveja, especie bovina, caballo, camello o primate. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero. Lo más preferiblemente, el sujeto es un ser humano.

Como se describe anteriormente, la presente divulgación se refiere a una "composición farmacéutica" que comprende la célula transducida proporcionada en el presente documento que expresa la proteína de fusión divulgada en el presente documento (codificada por la molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento). Dicha composición farmacéutica además puede comprender un vehículo, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, etc. El vehículo puede ser una solución isotónica con la sangre del receptor. Las composiciones que comprenden tales vehículos se pueden formular mediante procedimientos convencionales bien conocidos. El régimen de dosificación lo determinará el médico tratante y los factores clínicos. Tal como es bien conocido en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluido el tamaño del paciente, el área superficial del cuerpo, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, la salud general y otros fármacos que se administren simultáneamente. Por ejemplo, la composición farmacéutica divulgada en el presente documento se puede administrar al sujeto en una dosis de 104 a 101° células/kg de peso corporal, preferiblemente 105 a 106 células/kg de peso corporal. La composición farmacéutica se puede administrar de tal manera que se realice un escalado de las células que se van a administrar comenzando con una dosis de sujeto de aproximadamente 105 a 106 células/kg de peso corporal y entonces subir a la dosis de 101° células/kg de peso corporal. La composición farmacéutica como se describe en el presente documento se puede administrar por vía intravenosa (es decir, mediante infusión intravenosa) pero también por vía intraperitoneal, intrapleural, intratecal, subcutánea o intranodal. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer), y también pueden estar presentes conservantes similares y otros aditivos en la composición farmacéutica como se describe en el presente documento, tales como, p. ej., antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y similares.

La composición farmacéutica de la presente divulgación puede usarse en coterapia junto con, p. ej., moléculas capaces de proporcionar una señal de activación para las células efectoras inmunitarias, para la proliferación celular o para la estimulación celular. Dicha molécula puede ser, p. ej., una señal de activación primaria adicional para células T (p. ej., una molécula coestimuladora adicional: moléculas de la familia B7, Ox40L, 4,1 BBL, CD40L, anti-CTLA-4, anti-PD-1), o una interleucina de citocina adicional (p. ej., IL-2).

En el contexto de la presente divulgación, los componentes de la composición farmacéutica que se usarán para la administración terapéutica son preferiblemente estériles. La esterilización puede lograrse fácilmente, p. ej., mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (p. ej., membranas de 0,2 micrómetros). La composición farmacéutica divulgada en el presente documento se puede preparar poniendo en contacto los componentes de la composición farmacéutica de manera uniforme con vehículos líquidos. Después de su producción, la composición farmacéutica divulgada en el presente documento puede colocarse en un recipiente que tenga un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

La divulgación también se refiere a un procedimiento para el tratamiento de enfermedades que se caracterizan por expresar un ligando para PD-1 (es decir, PD-L1 y/o PD-L2) tal como, p. ej., cáncer de pulmón, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de colon, cáncer gástrico, carcinoma de células renales, carcinoma de esófago, glioma, cáncer urotelial, retinoblastoma, cáncer de mama, linfoma no de Hodgkin, carcinoma pancreático, linfoma de Hodgkin, mieloma, carcinoma hepatocelular, leucemia, carcinoma cervicouterino, colangiocarcinoma, cáncer bucal, cáncer de cabeza y cuello o mesotelioma que comprende la administración de una célula transducida como se describe en el presente documento a un sujeto. En el contexto de la presente divulgación, dicho sujeto es un ser humano (como se explica anteriormente). En el contexto de la presente divulgación, se describe un procedimiento para el tratamiento de una enfermedad que comprende las etapas de aislar células (p. ej., células T, preferiblemente células T CD8+) de un sujeto, transducir dichas células aisladas con un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión PD-1-CD28 como se describe en el presente documento anteriormente, y administrar las células transducidas a dicho sujeto. En el contexto de la presente divulgación, dichas células transducidas se administran a dicho sujeto mediante infusión intravenosa. Además, la presente divulgación proporciona un procedimiento para el tratamiento de enfermedades que comprende las etapas de aislar células (p. ej., células T, preferiblemente células T CD8+) de un sujeto, transducir dichas células aisladas con un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión PD-1-CD28 como se describe en el presente documento anteriormente, cotransducir dichas células aisladas con moléculas de ácido nucleico adicionales, p. ej., con una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor de células T o un receptor quimérico como se describe anteriormente, expandir las células transducidas y administrar las células transducidas de nuevo a dicho sujeto.

La etapa paso de expansión mencionada anteriormente de las células transducidas puede realizarse en presencia de citocinas (estimulantes) tales como interleucina-2 (IL-2) y/o interleucina-15 (IL-15). La etapa de expansión también se puede realizar en presencia de interleucina-12 (IL-12), interleucina-7 (IL-7) y/o interleucina-21 (IL-21). De acuerdo con la presente divulgación, la etapa de expansión de las células transducidas también se puede realizar en presencia de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28.

Las proteínas de fusión PD-1-CD28 divulgadas en el presente documento también se pueden combinar con otros polipéptidos manipulados como se divulga en el presente documento o como se conoce en la técnica. Tales combinaciones incluyen la coexpresión de las proteínas de fusión PD-1-CD28 como se describe en el presente documento y polipéptidos manipulados en la misma población celular y/o dentro de la misma celda. Por consiguiente, combinación en el contexto de la proteína de fusión PD1-CD28 con otro polipéptido manipulado puede hacer referencia a una población celular que, en su conjunto, expresa una o más proteínas de fusión PD1-CD28 como se divulga en el presente documento y uno o más polipéptidos manipulados, en la que las células individuales dentro de la población se han manipulado según procedimientos estándares conocidos en la técnica o como se describe en el presente documento para expresar (a) una o más de una proteína de fusión PD1-CD28 como se divulga en el presente documento o uno o más polipéptidos manipulados; o (b) uno o más de una proteína de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento y uno o más polipéptidos manipulados.

Se prefiere que la combinación de una o más proteínas de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento y uno o más polipéptidos manipulados sea coexpresión dentro de la misma célula, de tal modo que la célula exprese simultáneamente tanto la una o más proteínas de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento como el polipéptido manipulado y/o de tal manera que la expresión tanto de la una o más proteínas de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento como del uno o más polipéptidos manipulados pueda detectarse dentro de la misma célula.

Los polipéptidos manipulados que pueden coexpresarse con una o más proteínas de fusión PD1-CD28 descritas en el presente documento incluyen

• receptores de antígenos quiméricos tales como los descritos en Milone y col., Mol. Ther. 17(2009), 1453-1464; Carpenito y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009), 3360-3365; Wang y col., Hum. Gene Ther. 18 (2007), 712­ 725; Pule y col., Mol. El r. 12 (2005), 933-941; y Wang y col., Cancer Immunol. Res. 3(2015): 815-826;

• células T manipuladas con alfa/beta TCR tales como las proporcionadas en Rapoport y col., Nature Medicine, 21 (2015), 914-921;

• TCR naturales expresados en TIL tales como los proporcionados en Rosenberg y col., Clin. Cancer Res. 17 (2011), 4550-4557;

• acopladores de células T anti-CD3 expresados como polipéptidos solubles o presentados como proteína transmembrana en la superficie celular; y

• proteínas de fusión del receptor de células T (TCR) (TFP) que comprenden una subunidad de TCR y un dominio de anticuerpo humano o humanizado. Por ejemplo, como se conoce en la técnica, la subunidad de TCR puede comprender un dominio extracelular de TCR, un dominio transmembrana de TCR y/o un dominio intracelular de TCR.

Cuando la proteína de fusión PD1-CD28 y el polipéptido manipulado han de coexpresarse en la misma célula, la proteína de fusión PD-1-CD28 divulgada en el presente documento y el segundo polipéptido pueden codificarse por diferentes ácidos nucleicos que se introducen ambos en la misma célula. Por tanto, la divulgación proporciona una composición que comprende un ácido nucleico que codifica una o más de una proteína de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento (p. ej., SEQ ID NO.:14 o SEQ ID NO.:24, preferiblemente SEQ ID NO:24) y un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos manipulados (segundo polipéptido como se comprende en el presente documento). La divulgación también proporciona una composición que comprende un primer y un segundo vector, comprendiendo el primer vector un ácido nucleico que codifica una o más de una proteína de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento (p. ej., de SEQ ID NO.: 14 o SEQ ID NO.: 24, preferiblemente SEQ ID NO.: 24) y comprendiendo el segundo vector un ácido nucleico que codifica uno o más polipéptidos manipulados (segundo polipéptido como se comprende en el presente documento). El primer y segundo vectores pueden ser los mismos o diferentes. Por ejemplo, como se conoce en la técnica, el primer y segundo vectores (que comprenden ácidos nucleicos que codifican una o más fusiones PD1-CD28 como se describe en el presente documento (p. ej., SEQ ID NO.:14 o SEQ ID NO.:24, preferiblemente SEQ ID NO:24) y el uno o más (segundos) polipéptidos manipulados, respectivamente) pueden ser el mismo vector (p, ej., el mismo vector de expresión) pero para el inserto que codifica la proteína de fusión PD1-CD28 o el (segundo) polipéptido manipulado. Como alternativa, el primer y segundo vectores pueden ser vectores diferentes, p. ej., que comprenden diferentes promotores de expresión. Por tanto, la expresión de los polipéptidos codificados del primer y segundo vectores puede ser impulsada por los mismos o diferentes promotores. Por consiguiente, la divulgación proporciona una composición que comprende (a) un primer ácido nucleico que comprende un primer promotor ligado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento, y/o un primer vector que comprende el primer ácido nucleico; y (b) un segundo ácido nucleico que comprende un segundo promotor ligado operativamente a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un (segundo) polipéptido manipulado, en el que el primer y segundo vectores, y/o el primer y segundo promotores son los mismos o diferentes.

Como alternativa, cuando la proteína de fusión PD1-CD28 y el polipéptido manipulado han de coexpresarse en la misma célula, la proteína de fusión PD-1-CD28 divulgada en el presente documento y el segundo polipéptido pueden estar codificados por el mismo ácido nucleico, es decir un ácido nucleico único que comprende una secuencia que codifica una proteína de fusión divulgada en el presente documento y una secuencia que codifica el segundo polipéptido. Por tanto, la divulgación proporciona un único ácido nucleico que comprende una fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento y/o un polipéptido manipulado como se describe anteriormente. Un único ácido nucleico que comprende tanto el gen que codifica la proteína de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento como el gen que codifica el polipéptido coexpresado puede usarse según procedimientos estándares conocidos en la técnica o descritos en el presente documento para replicación/duplicación del ácido nucleico y/o componentes del mismo (p. ej., la replicación de las secuencias de ácido nucleico que codifican la PD1-CD28 y/o el polipéptido manipulado), puede usarse para modificar el ácido nucleico y/o componentes del mismo, o puede usarse para expresar las proteínas codificadas separada o simultáneamente. Por consiguiente, la divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende un gen que codifica una proteína de fusión PD-1-CD28 como se describe en el presente documento (p. ej., SeQ ID NO.:14 o SEQ ID NO.:24, preferiblemente SEQ ID NO:24) y un gen que codifica un polipéptido manipulado (p. ej., un receptor de antígeno quimérico, un receptor alfa/beta de células T, un receptor de células T natural, un acoplador de células T anti-CD3 expresado como polipéptido soluble o presentado como proteína transmembrana en la superficie celular, y/o una proteína de fusión de receptor de células T (TCR) (TFP) (p. ej., que comprende una subunidad de TCR y un dominio de anticuerpo humano o humanizado) como se describe anteriormente). La divulgación proporciona también un vector que comprende un ácido nucleico que comprende un gen que codifica una proteína de fusión PD-1-CD28 divulgada en el presente documento (p. ej., SEQ ID NO.: 14 o SEQ ID NO.: 24, preferiblemente SEQ ID NO.: 24), un gen que codifica un polipéptido manipulado (p. ej., un receptor de antígeno quimérico, un receptor alfa/beta de células T, un receptor de células T natural, un acoplador de células T anti-CD3 expresado como polipéptido soluble o presentado como proteína transmembrana en la superficie celular, y/o una proteína de fusión de receptor de células T (TCR) (TFP) (p. ej., que comprende una subunidad de TCR y un dominio de anticuerpo humano o humanizado) como se describe anteriormente) y/o que comprende tanto un gen que codifica una proteína de fusión PD-1-CD28 de la divulgación como un gen que codifica un (segundo) polipéptido manipulado como se describe en el presente documento. La divulgación también proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más ácidos nucleicos y/o vectores como se describe en este párrafo.

Cuando una o más proteínas de fusión PD1-CD28 de la divulgación (p .ej., SEQ ID NO.:14 o SEQ ID NO.:24, preferiblemente SEQ ID NO:24) y el uno o más (segundos) polipéptidos manipulados se coexpresan en la misma célula a partir de un único ácido nucleico, la expresión de la proteína de fusión PD-1-CD28 y el segundo polipéptido puede ser impulsada independientemente por promotores idénticos o diferentes. Los promotores pueden disponerse de forma bidireccional en configuraciones divergentes que coordinen la regulación de dos o más transgenes (vectores promotores bidireccionales como se conoce en la técnica). Los promotores también pueden disponerse en una orientación unidireccional (vectores promotores duales) coordinando independientemente la regulación de dos o más transgenes como se conoce en la técnica. Por consiguiente, la divulgación proporciona un ácido nucleico que comprende un primer promotor ligado operativamente a una secuencia que codifica una proteína de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento y un segundo promotor ligado operativamente a un segundo polipéptido, en el que el primer y segundo promotores son el mismo o diferentes. Como alternativa, la proteína de fusión PD-1-CD28 y el segundo polipéptido que se coexpresan pueden estar bajo el control de un único promotor (es decir, el mismo). Las diferentes proteínas pueden manipularse para expresarse bajo el control del mismo promotor usando cualquier procedimiento conocido en la técnica o divulgado en el presente documento. Por ejemplo, como es bien conocido en la técnica, el gen que codifica la primera proteína (p. ej., una proteína de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento (p. ej., SEQ ID NO.:14 o SEQ ID No .:24, preferiblemente SEQ ID NO:24)) puede estar enlazado a una secuencia que codifica un péptido 2A o secuencias similares a 2A (p. ej., Szymczak y col., Nature Biotechnol. 22 (2004), 589-594; Provost y col, Genesis 45 (2007), 625-629; Diao y White, Genetics 190 (2012), 1139­ 1144) seguido del segundo polipéptido. Como alternativa, la proteína de fusión divulgada en el presente documento y las secuencias codificantes del segundo polipéptido pueden ligarse mediante un IRES (sitio de entrada ribosómico interno).

Los ácidos nucleicos que se proporcionan en el presente documento (incluidos los vectores que comprenden tales ácidos nucleicos) se pueden introducir en las células diana mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitación, procedimiento de lípidos catiónicos o procedimiento de liposomas, procedimiento de electroporación o de fosfato de calcio. Como se usa en el presente documento, las células en las que los ácidos nucleicos y/o los vectores se introducen también se denominan "células transducidas".

La coexpresión de la proteína de fusión PD1-CD28 y el segundo polipéptido puede ser independientemente constitutiva o constitucional, dependiendo del sistema usado. La proteína de fusión PD-1-CD28 y el segundo polipéptido pueden expresarse en la superficie de la célula transducida proporcionada en el presente documento o pueden ser detectables de otro modo dentro o sobre la célula según procedimientos estándares conocidos en la técnica. La célula transducida para la coexpresión de una PD1-CD28 como se describe en el presente documento y un segundo polipéptido puede ser, p. ej., una célula T CD4+, una célula T CD8+, una célula T y§, una célula T citolítica natural (NK), una célula citolítica natural (NK), una célula linfocítica infiltrante de tumor (TIL), una célula mieloide o un citoblasto mesenquimatoso. Preferiblemente, la célula transducida proporcionada en el presente documento para coexpresión es una célula T (por ejemplo, una célula T autóloga), más preferiblemente, la célula transducida es una célula T CD8+ o una célula T c D4+. Por consiguiente, la célula transducida puede ser una célula T CD8+ que coexpresa tanto una fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento (p. ej., SEQ ID NO.:14 o SEQ ID NO.:24, preferiblemente SEQ ID NO:24) como un segundo polipéptido (p. ej., un receptor de antígeno quimérico, un receptor alfa/beta de células T, un receptor de células T natural, un acoplador de células T anti-CD3 expresado como polipéptido soluble o presentado como proteína transmembrana en la superficie celular, y/o una proteína de fusión de receptor de células T (TCR) (TFP) (p. ej., que comprende una subunidad de TCR y un dominio de anticuerpo humano o humanizado) como se describe anteriormente). Además, la célula transducida para coexpresión puede ser una célula T autóloga o una célula T alogénica como se describe en el presente documento. Como alternativa o adicionalmente, la célula transducida puede ser una célula T CD4+ que coexpresa tanto una proteína de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento (p. ej., SEQ ID No .:14 o SEQ ID NO.:24, preferiblemente SEQ ID NO:24) como un segundo polipéptido (p. ej., un receptor de antígeno quimérico, un receptor alfa/beta de células T, un receptor de células T natural, un acoplador de células T anti-CD3 expresado como polipéptido soluble o presentado como proteína transmembrana en la superficie celular, y/o una proteína de fusión de receptor de células T (TCR) (TFP) (p. ej., que comprende una subunidad de TCR y un dominio de anticuerpo humano o humanizado) como se describe anteriormente). La célula T CD4+ transducida puede ser una célula T CD4+ autóloga o una célula T CD4+ alogénica. Como alternativa o adicionalmente, la divulgación proporciona poblaciones de células T CD4+ y/o células T CD8+ transducidas (incluidas, pero sin limitación, poblaciones que comprenden células T CD4+ transducidas, poblaciones que comprenden células T CD8+ transducidas y poblaciones que comprenden células T CD4+ transducidas y células T CD8+ transducidas), en las que cada una de las células transducidas expresa una proteína de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento, un (segundo) polipéptido manipulado como se describe anteriormente, o expresa tanto una fusión PD1-CD28 como se divulga en el presente documento como un (segundo) polipéptido manipulado como se describe anteriormente. La población de células T CD4+ y/o CD8+ transducidas coexpresadas pueden ser autólogas y/o alogénicas (p. ej., la población puede comprender solo células autólogas, solo células alogénicas o combinaciones de células tanto autólogas como alogénicas). Las poblaciones que coexpresan las células T de la divulgación como se describe en el presente documento pueden comprender tanto células T transducidas como no transducidas, de tal modo que la población como un todo expresa, o una muestra representativa de la población expresa, tanto una proteína de fusión PD1-CD28 como se describe en el presente documento como un (segundo) polipéptido manipulado como se describe anteriormente.

Como se describe en el presente documento, la presente divulgación proporciona un kit que comprende la molécula de ácido nucleico como se describe anteriormente, el vector de la divulgación y/o la proteína de fusión como se describe anteriormente. Por tanto, los procedimientos de tratamiento proporcionados en el presente documento se pueden realizar usando este kit. Ventajosamente, el kit que se proporciona en el presente documento comprende además opcionalmente (a) tampón o tampones de reacción, soluciones de almacenamiento (es decir, conservantes), soluciones de lavado y/o los reactivos o materiales restantes requeridos para la realización de los ensayos como se describe en el presente documento. Además, las partes del kit de la divulgación se pueden empaquetar individualmente en viales o botellas o en combinación en recipientes o unidades de recipientes múltiples. Además, el kit puede contener instrucciones de uso. La fabricación del kit como se describe en el presente documento sigue preferiblemente procedimientos estándares que son conocidos por el experto en la técnica. Como se menciona anteriormente, el kit proporcionado en el presente documento es útil para tratar un sujeto (preferiblemente un paciente humano) que tiene una enfermedad que se caracteriza por expresar un ligando para PD-1 (es decir, PD-L1 y/o PD-L2) tal como, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de colon, cáncer gástrico, carcinoma de células renales, carcinoma de esófago, glioma, cáncer urotelial, retinoblastoma, cáncer de mama, linfoma no de Hodgkin, carcinoma pancreático, linfoma de Hodgkin, mieloma, carcinoma hepatocelular, leucemia, carcinoma cervicouterino, colangiocarcinoma, cáncer bucal, cáncer de cabeza y cuello o mesotelioma.

Las Figuras muestran

Figura 1: Caracterización in vitro de la proteína de fusión PD-1-CD28 (dominio transmembrana de PD-1, proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)) y 14 (proteína))

(A) Se estimularon células T de murino/ratón primarias transducidas con proteína de fusión de PTM (como se representa en la SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)) o no transducidas con anticuerpo antic D3, anticuerpos anti-CD3 más anti-CD28 o con anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: 37 (ácido nucleico (ADNc)); 38 (proteína)) y se midió la liberación de IFN-^y resultante mediante ELISA. (B) Se dejaron células T de murino primarias transducidas con proteína de fusión de PTM o no transducidas sin estimular o se estimularon con anticuerpo anti-CD3 o con anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante y se midió la fosforilación de AKT mediante citometría de flujo. (C) Se estimularon células T de murino primarias transducidas con proteína de fusión de PTM o no transducidas con anticuerpo anti-CD3, anticuerpos anti-CD3 más anti-CD28 o con anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: 37 (ácido nucleico); 38 (proteína)) y el número de células se normalizó con esferas de recuento estandarizadas. (D) Se estimularon células T de murino primarias transducidas con proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)) o no transducidas con anticuerpo anti-CD3, anticuerpos anti-CD3 más anti-CD28 o con anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 37 (ácido nucleico (ADNc)); 38 (proteína)) durante 24 h y se tiñeron intracelularmente para el marcador de mitosis ki67. (E) Se cocultivaron células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico); 14 (proteína)) o no transducidas con Panc02-OVA-PD-L1 en presencia o ausencia de anticuerpo anti-PD-1 o anticuerpo H2kb SIINFEKL anti-ratón y se midió la producción de IFN-^y resultante mediante ELISA. (F) Se preestimularon células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)) o no transducidas con anticuerpo anti-CD3 y con PD-L1 recombinante. Mientras tanto, las células Panc02-OVA-PD-L1 se sembraron y se hicieron crecer antes de la adición de células T preestimuladas (flecha). Las condiciones son las siguientes Panc02-OVA-PD-L1 solamente (1), Panc02-OVA-PD-L1 células T no transducidas preestimuladas (2), Panc02-OVA-PD-L1 células T transducidas con proteína de fusión de PTM prestimuladas (3), proteína de fusión de PTM (4) y células T no transducidas (5) y medio (6). La viabilidad de las células Panc02-OVA se midió mediante una medición basada en la impedancia. Los experimentos A a E son representativos de al menos tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. El Experimento F es representativo de tres experimentos independientes realizados por duplicado por razones técnicas. Las barras representan la DE y se muestran los valores p de la prueba t de Student. Todas las pruebas son bilaterales.

Figura 2: Comparación funcional de diferentes proteínas de fusión PD-1-CD28

(A) Vista general esquemática de la estructura de las diferentes proteínas de fusión PD-1-CD28: PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)): dominio extracelular (PD-1-ex) y dominio transmembrana (PD-1-trans) de PD-1 (como se muestra en la SEQ ID NO: 5 (ácido nucleico); 6 (proteína)) fusionados al dominio intracelular de CD28 (CD28-intra; SEQ ID NO: 11 (ácido nucleico (ADNc)); 12 (proteína)). CTM (SEQ ID NO: 43 (ácido nucleico (ADNc)); 44 (proteína)): dominio extracelular de PD-1 (S^eQ ID ⁿ O: 39 (ácido nucleico (ADNc)); 40 (proteína)) fusionado con el dominio transmembrana CD28 (CD28-trans) e intracelular (SEQ ID NO: 41 (ácido nucleico); 42 (proteína) de CD28); y CEX (SEQ ID NO: 49 (ácido nucleico (ADNc)); 50 (proteína)): dominio extracelular de PD-1 (SEQ ID NO: 45 (ácido nucleico (ADNc)); 46 (proteína)) fusionado con el segmento extracelular (CD28-ex) y el dominio transmembrana e intracelular de CD28 (SEQ ID NO: 47 (ácido nucleico (ADNc)); 48 (proteína)). (B) Se estimularon células T de murino primarias transducidas con PTM (SEQ ID NO: 49, 50), ^cT^m (^s E^q ID NO: 43, 44), CEX (SEQ ID NO: 49, 50) o no transducidas con anticuerpo anti-CD3, anticuerpos anti-CD3 más anti-CD28 o anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: 37 (ácido nucleico); 38 (proteína)) y se midió la producción de IFN-^y mediante ELISA. (C) Se estimularon células T primarias de murino transducidas con proteína de fusión de PTM, CTM, CEX o no transducidas con anticuerpo anti-CD3, anticuerpos anti-CD3 más anti-CD28 o anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante 37 (ácido nucleico); 38 (proteína)) y los números de células resultantes se normalizaron con esferas de recuento. (D) Se incubaron células T transducidas con proteína de fusión de PTM, CTM, CEX o no transducidas con PD-L1 recombinante 37 (ácido nucleico); 38 (proteína)) y se midió la unión de PD-L1 mediante citometría de flujo. (E) Cotinción representativa para la expresión de CD8 y PD-1 de células T transducidas con PTM, CTM, CEX o no transducidas. Todos los experimentos son representativos de al menos tres experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. Las barras representan la DE y se muestran los valores p de la prueba t de Student. Todas las pruebas son bilaterales.

Figura 3: Comparación funcional de diferentes proteínas de fusión de PTM mutadas en sus supuestos dominios de señalización.

(A) Vista general esquemática de los diferentes mutantes de la proteína de fusión de PTM: PTM (YMNM-PYAP, tipo silvestre (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)), PTM-FMNM (mutado en tirosina, Y a F (SEQ iD NO: 51 (ácido nucleico (a Dnc)); 52 (proteína)), Pt M-AyAA (mutado en prolina, P a A (SEQ ID NO: 53 (ácido nucleico (ADNc))); 54 (proteína)) y PTM-Fm NM-a Ya A (mutado en prolina y tirosina (SEC ID NO: 55 (ácido nucleico (ADNc)); 56 (proteína)). (B) Se estimularon células T transducidas con PTM (SEC ID NO: 13, 14), PTM-mutado en tirosina (PTM-FMNM; SEQ ID NO: 51, 52)), PTM-mutado en prolina (PTM-AYAA; SEQ ID NO: 53, 54)) y PTM-mutado en tirosina y prolina (PTM-FMNM-A^yAA; SEQ ID NO: 55, 56) o no transducidas con anticuerpo anti-CD3 o con anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: 37 (ácido nucleico (ADNc)); 38 (proteína)) y se midió la producción de IFN-^y mediante ELISA. (C) Se estimularon células T no transducidas o transducidas con PTM, PTM-FMNM, PTM-AYAA o PTM-FMNM-AYAA con anticuerpo anti-CD3 o anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante y se cuantificó la cantidad de células viables mediante normalización con esferas de recuento. (D) No transducido, PTM (SEC ID NO: 13 (ácido nucleico); 14 (proteína)) -, PTM-FMNM (SEC ID NO: 51 (ácido nucleico (ADNc)); 52 (proteína)) -, PTM-AYAA (SEQ ID NO: 53 (ácido nucleico (cDNA)); 54 (proteína)) - o PTM-FMNM-AYAA (SEQ ID NO: 55 (ácido nucleico (cDNA)); 56 (proteína)) -transducido Las células T se estimularon con anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: 37 (ácido nucleico (cDNA)); 38 (proteína)) y la liberación de citocinas se analizó semicuantitativamente usando una matriz de citocinas murinas. La matriz criba la expresión de un amplio panel de 40 citocinas. Los valores de P menores de 0,05 se marcan con* en la Figura 3D. Los experimentos B y C son representativos de al menos tres experimentos independientes realizados por triplicado. El Experimento C se realizó tres veces por duplicado por razones técnicas. Las barras representan la DE y se muestran los valores p de la prueba t de Student. Todas las pruebas son bilaterales.

Figura 4: Eficacia terapéutica de células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM in vivo e inducción de memoria inmunológica

(A) Se inyectaron 18 ratones por vía subcutánea con células Panc02-OVA. Una vez que se establecieron los tumores, se asignaron aleatoriamente 6 ratones a cada uno de sin tratamiento, transferencia adoptiva de células T OT-1 no transducidas o transferencia adoptiva de células T OT-1 transducidas con proteína PTM. El tamaño del tumor se midió de forma anonimizada cada dos días. El experimento es representativo de tres experimentos independientes con 6 ratones por grupo. (B) Los ratones supervivientes (n= 12) de dos experimentos independientes se volvieron a exponer a células Panc02-OVA al mismo tiempo que ratones de tipo silvestre sin tumores (n= 7). (C) Los ratones supervivientes después de la primera reexposición (n= 11, del experimento representado en el panel B) y ratones de tipo silvestre sin tumores (n= 6) se volvieron a exponer a una dosis subletal de células Panc02. (D) Los ganglios linfáticos de los ratones supervivientes de la reexposición a Panc02 (experimento representado en el panel C) se estimularon en cultivo de órganos in vitro con el péptido de control T^rP2, el péptido P15E o SIINFEKL (SEQ ID NO: 65, en referencia a los aminoácidos (AA) 258-265 del péptido de ovoalbúmina de pollo (entrada de Uni Prot: P01012 (versión 147 de la entrada y versión 2 de la secuencia))). El número de productores de células T CD8+ productoras de IFN-y se analizó mediante citometría de flujo y se normalizó al número de células T CD8+ productoras de IFN-y después de estimulación con TRP2 para cada ratón. (E) Los esplenocitos de ratones que habían eliminado tumores de Panc02-OVA después de la transferencia de células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM o de ratones de tipo silvestre se transfirieron adoptivamente a ratones de tipo silvestre. Estos ratones se expusieron a células Panc02-OVA. La transferencia de esplenocitos de ratones libres de tumor prevenía el crecimiento tumoral en 3 de 9 ratones. El análisis de supervivencia se realizó usando la prueba de rango logarítmico. Para la comparación de las condiciones experimentales de ratones individuales, se usó la prueba de Mann-Whitney. Todas las pruebas son bilaterales.

Figura 5: Modo de acción in vivo de células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM

(A) Se inyectaron por vía subcutánea a 18 ratones células Panc02-OVA. Una vez que se establecieron los tumores, los ratones se asignaron aleatoriamente a cada uno de transferencia adoptiva de células T OT-1 no transducidas o de células T transducidas con un receptor de PD-1 eliminado (SEQ ID NO: 57 (ácido nucleico (ADNc)); 58 (proteína)) o con proteína de fusión de PTM no modificada (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)). El tamaño del tumor se midió de forma anonimizada cada dos días. El experimento es representativo de tres experimentos independientes con 6 ratones por grupo. (B) Se transdujeron células T de ratones CD45.1-OT-1 con proteína de fusión de PTM y se dejaron sin transducir células T de ratones CD90.1-OT-1. Las células T se coinyectaron en cantidades iguales en ratones de tipo silvestre (n= 2) o en ratones portadores de tumores Panc02-OVA (n= 6). Cuatro días después, se analizaron las células T en los diferentes compartimentos y se comparó la relación de células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico); 14 (proteína)) a no transducidas. El experimento es representativo de tres experimentos independientes con 6 ratones por grupo portador de tumor. (C) Se aislaron células T CD90.1-OT-1 no transducidas y células T CD45.1-OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico); 14 (proteína)) del tumor, bazo y ganglios linfáticos obtenidos en el experimento (B) y se analizaron para determinar la expresión de IFN-y mediante citometría de flujo. El experimento es representativo de tres experimentos independientes con 6 ratones por grupo portador de tumor. (D) Se transdujeron células T CD45.1 OT-1 con proteína de fusión de PTM, se transdujeron células T CD90.1 o T-1 con cualquiera de las proteínas de fusión mutantes PTM-FMNM (SEQ ID NO: 52 (proteína), 51 (ADNc)), PTM-AYAA (SEQ ID NO: 54 (proteína), 53 (ADNc)) o PTM-FMNM-AYAA (SEQ ID NO: 56 (proteína), 55 (ADNc)) y se mezclaron en cantidades iguales con células T CD45.1 OT-1 transducidas con PTM antes de la transferencia a ratones portadores de tumor Panc02-OVA (n= 3 por grupo). Cuatro días después de la transferencia, se analizó mediante citometría de flujo la relación de células T transducidas con el receptor de PTM a células T transducidas con proteína de fusión mutante. El experimento es representativo de tres experimentos independientes con 3 ratones por grupo portador de tumor. (E) Se transfirieron adoptivamente células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM o no transducidas en ratones portadores de tumores Panc02-OVA (n= 17, respectivamente). Una semana después, se analizó el número de MDSc infiltrantes de tumor (CD45+, CD11b+, Ly6+, Intermedio Gr-1+). Los datos representan los resultados de ratones agrupados de tres experimentos independientes. Las barras representan la DE. El análisis de supervivencia se realizó usando la prueba de rango logarítmico. Para la comparación de las condiciones experimentales de ratones individuales, se usó la prueba de Mann-Whitney. Todas las pruebas son bilaterales.

Figura 6: Fundamentos del uso de una proteína de fusión PD1-CD28 (PTM; SEQ ID NO: 13 (ADNc), 14 (proteína): regulación positiva de PD1 por células T intratumorales y expresión de PD-L1 en la célula tumoral

(A) Las células T OT-1 transducidas con GFP se transfirieron adoptivamente a ratones portadores de tumores Panc02-OVA. Una semana después, se analizó la infiltración del tumor, así como del bazo por células T OT-1 GFP+ y la expresión de PD-1 de células T infiltrantes mediante citometría de flujo. Casi todas las células T OT-1 infiltrantes en el tumor eran positivas de PD-1 en contraste con las células T OT-1 en el bazo. (B) Ejemplos de histogramas de expresión de PD-1 en células OT-1-T infiltrantes en tumor (gris oscuro) y células OT-1-T infiltrantes en el bazo (gris claro). (C) Se estimularon las células Panc02-OVA in vitro con IFN-^y (2, 2o y 100 ng/ml) y se analizó la expresión de PD-L1 mediante citometría de flujo 48 h más tarde. La IFN-y regulaba positivamente la expresión de PD-L1 de forma dependiente de la dosis. (D) Ejemplos de histogramas de expresión de PD-L1 en células tumorales Panc02-OVA después de la estimulación con ⁱFN-^y 100 ng/ml (gris oscuro) y sin estimulación (gris claro). (E) Vista general esquemática del mecanismo de acción: la proteína de fusión del dominio extracelular y transmembrana de PD-1 con el dominio intracelular de CD28 protege a las células T específicas de antígeno de la anergia mediada por PD-1-PD-L1 y convierte la señal inhibidora en una coestimulación. (F) Se estimularon células T transducidas con proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)) con anticuerpo anti-CD3, PD-L1 recombinante (SEQ ⁱD NO: 37 (ADNc), 38 (proteína)) o ambos. La inducción de IL-2 se analizó 48 h después mediante ELISA. La estimulación combinada con ambos compuestos conduce a una fuerte inducción de IL-2.

Figura 7: Eficacia terapéutica de células T transducidas con proteína de fusión PD1-CD28 (PTM; SEQ ID NO: 13 (ADNc), 14 (proteína)) en el modelo Panc02-OVA que sobreexpresa PD-L1 y dependencia del efecto del tratamiento sobre IFN-y

(A) Se estimularon células T transducidas con proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico); 14 (proteína)) con anticuerpo anti-CD3, anticuerpo anti-CD28, PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: 37 (ácido nucleico); 38 (proteína)), anticuerpo anti-CD3 y PD-L1 recombinante o los tres estímulos. La inducción de IFN-^y se analizó 48 h después mediante ELISA. La estimulación combinada con todos los compuestos conduce a una fuerte inducción de IFN-^y. (B) Se cocultivaron células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ADNc), 14 (proteína)) con Panc02-PD-L1 en presencia o ausencia de anticuerpo anti-CD3 (1 pg/ml) durante 48 h y se cuantificó el IFN-^y en el sobrenadante. (C) Se inyectaron por vía subcutánea a 24 ratones células Panc02-OVA-PD-L1. Una vez que se establecieron los tumores, se asignaron aleatoriamente los ratones (n= 8 por grupo) a cada uno de quedar sin tratar o ser tratados dos veces con células T OT-1 no transducidas o células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ADNc), 14 (proteína)). El tamaño del tumor se midió de forma anonimizada cada dos días. Las células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM aumentaban significativamente el número de ratones libres de tumores en comparación con los dos grupos de control. (D) Se inyectaron por vía subcutánea a 10 ratones células Panc02-OVA. Una vez que se establecieron los tumores, se asignaron aleatoriamente los ratones (n= 5 por grupo) a ser tratados con células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM junto con 200 |jg de anticuerpo neutralizante de IFN-^y o control de isotipo. Los anticuerpos se aplicaron ip cada tres días durante cuatro dosis desde el momento de la asignación aleatoria. El tamaño del tumor se midió de forma anonimizada cada dos días. Los anticuerpos neutralizantes de IFN-^y anulaban el impacto terapéutico de las células T OT-1 transducidas con PTM. (E) Se transfirieron adoptivamente células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM o no transducidas a ratones portadores de tumores Panc02-OVA (n= 17, respectivamente). Una semana más tarde, se cuantificó en el tumor el número de células T reguladoras infiltrantes en el tumor y el número de células T PD-1-CD8. Los ratones tratados con células T transducidas con proteína de fusión de PTM tenían una relación de células T PD-1-CD8 a Treg más alta que los ratones tratados con células T no transducidas. Las barras representan EEM.

Figura 8: Análisis funcional de proteína de fusión PD-1-CD28 humana (hPTM; SEQ ID NO: 23 (ácido nucleico), 24 (proteína)) Se estimularon hPTM (SEQ ID NO: 23 (ácido nucleico); 24 (proteína)) o células T humanas primarias no transducidas con anticuerpo anti-CD3, anticuerpos anti-CD3 más anti-CD28 o anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante (adquirido en R&D, número de catálogo: 156-B7-100) y se midió la producción de IFN-^y mediante ELISA. Las diferencias entre los grupos de estimulación se evaluaron mediante la prueba t de Student para datos no apareados. Las flechas exhiben el EEM y los valores de p exactos se representan en la Figura.

Figura 9: Caracterización in vitro de la proteína de fusión PD-1-CD28 (dominio transmembrana PD-1, proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)) y 14 (proteína)) células T CD4+ transducidas.

La proteína de fusión de PTM (como se representa en la SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (células T CD4+ primarias de murino/ratón, transducidas o no transducidas, se estimularon con el anticuerpo anti-CD3, con el anticuerpo anti-CD3 más el anticuerpo anti-CD28 o con el anticuerpo anti-CD3 más el PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: 37 (ácido nucleico (ADNc)); 38 (proteína)).

(A) La liberación de IFN-y se midió mediante ELISA.

(B) La proliferación se determinó por células viables/esferas. Los números de células se normalizaron a esferas de recuento estandarizadas.

(C) Viabilidad, tinte de viabilidad fijable (AmCyan, BioLegend) por citometría de flujo.

(D) Tinción intracelular del marcador de mitosis ki67.

(^e ) Tinción intracelular del marcador de transcripción/activación EOMES.

Los experimentos A a E son representativos de al menos dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. Las barras representan la DE. Todas las pruebas son bilaterales.

Figura 10: Caracterización fenotípica in vitro de la proteína de fusión PD-1-CD28 (dominio transmembrana PD-1, proteína de fusión de PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)) y 14 (proteína)) transducida en células T CD4+

La proteína de fusión de PTM (como se representa en la SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (transducidas o no transducidas células T CD4+ primarias de murino/ratón fueron estimuladas con anticuerpo anti-CD3, anticuerpos anti-CD3 más anti-CD28 o con anticuerpo anti-CD3 más PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: 37 (ácido nucleico (ADNc)); 38 (proteína)).

(A) Se evaluó la expresión de IL-17 mediante tinción anti-IL17 (FITC, clon TC11-18H10.1, BioLegend) y se midió mediante citometría de flujo.

(B) Se evaluó la expresión de FoxP3 mediante tinción anti-FoxP3 (PE, clon 150D, BioLegend) y se midió mediante citometría de flujo.

Los experimentos A y B son representativos de al menos dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. Las barras representan la DE. Todas las pruebas son bilaterales.

Figura 11: Caracterización fenotípica in vitro de células T transducidas con proteína de fusión PD-1-CD28 (dominio transmembrana de PD-1, proteína de fusión PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)) y 14 (proteína))

Se cocultivaron células T primarias de murino transducidas con PTM preestimulado específico de antígeno (OVA) (como se representa en la SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)) o no transducidas con células tumorales PancOVA. El punto temporal 1 es después de 36 h de estimulación con anticuerpo anti-CD3e agonista y PD-L1 de murino recombinante. El punto temporal 2 es después de 12 h de cocultivo posterior con células PancOVA.

(A) Porcentaje de células CD8+ CD62L- CCR7- viables.

(^b ) Porcentaje de células CD8+ CD62L+ CCR7+ viables.

(c ) Porcentaje de células CD4+ CD62L- CCR7- viables.

(d ) Porcentaje de células CD4+ CD62L+ CCR7+ viables.

(e ) Porcentaje de células CD8+ CD69+ viables.

(^f ) Porcentaje de células CD4+ CD69+ viables.

(G) Porcentaje de células viables CD8+ PD1+ viables.

En los experimentos A a G, todos los valores se determinaron mediante citometría de flujo y son representativos de al menos dos experimentos independientes, cada uno realizado por triplicado. Las barras representan la DE. Todas las pruebas son bilaterales.

Figura 12: Eficacia terapéutica de células T OT-1 transducidas con proteína de fusión de PTM in vivo en el modelo tumoral EG7-PD-L1

Se inyectaron a 14 ratones por vía subcutánea células EG7-PD-L1. Una vez que se establecieron los tumores, se asignaron aleatoriamente 6, 3 y 5 ratones a sin tratamiento (PBS), transferencia adoptiva de células T OT-1 no transducidas o transferencia adoptiva de células T OT-1 transducidas con proteína PTM. Las figuras son representativas de 3 experimentos independientes con 3 a 6 ratones por grupo. El tamaño del tumor se midió de forma anonimizada cada 2 a 3 días, (A). Curvas de supervivencia del experimento de la Figura 12A, (B). Los ratones supervivientes (n= 2) se volvieron a exponer a células EG7-PD-L1 al mismo tiempo que los ratones de tipo silvestre sin tumores (n= 2), (C).

El análisis de supervivencia se realizó usando la prueba de rango logarítmico. A modo de comparación, se usó ANOVA bidireccional de crecimiento tumoral con corrección para pruebas múltiples. Todas las pruebas son bilaterales. Los siguientes ejemplos ilustran la invención.

De forma ilustrativa, en los siguientes Ejemplos 1 a 3 y 5, la proteína de fusión se construyó con las secuencias de murino del polipéptido PD-1 y el polipéptido CD28. El Ejemplo 4 se refiere al análisis funcional de una proteína de fusión PD-1-CD28 humana (SEQ ID NO: 23 (ácido nucleico (ADNc)); 24 (proteína)) que comprende un polipéptido PD-1 que está ligado/fusionado operativamente a través de su extremo C al extremo N de un dominio intracelular de un polipéptido CD28 humano (SEQ ID NO: 21 (ácido nucleico (ADNc)); 22 (proteína)), en la que el polipéptido PD-1 comprende el dominio extracelular de PD-1 (SEQ ID NO: 17 (ADNc), 18 (proteína)) y el dominio transmembrana de PD-1 (SEQ ID NO: 19 (ADNc), 20 (proteína) como se representa en la SEQ ID NO: 15 (ácido nucleico) y 16 (proteína). La proteína de fusión PD-1-CD28 preparada en el Ejemplo 4 tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 24 (codificada por un ADNc mostrado en la SEQ ID NO: 23).

Ejemplo 1: Generación de las proteínas de fusión PD-1-CD28

Ejemplo 1.1 Proteínas de fusión PD-1-CD28 de murino PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)) y 14 (proteína), CTM (SEQ ID NO: 43 (ácido nucleico (ADNc)) y 44 (proteína)), CEX (SEQ ID NO: 49 (ácido nucleico (ADNc)) y 50 (proteína)), PTM-FMNM (SEQ ID NO: 51 (ácido nucleico (ADNc)) y 52 (proteína)), PTM-AYAA (SEQ ID NO: 53 (ácido nucleico (ADNc)); 54 (proteína)) y PTM-FMNM-AYAA (SEQ ID NO: 55 (ácido nucleico (ADNc)); 56 (proteína))

Las proteínas de fusión PD-1-CD28 se generaron mediante PCR de extensión de superposición y clonación de expresión recombinante en el vector retrovírico pMP71 (Schambach y col., Mol Ther 2(5) (2000), 435-45;EP-B1 0955 374). La amplificación se realizó en tres etapas: primero, se amplificó el dominio extracelular y transmembrana de PD-1 con una superposición parcial para el dominio intracelular de CD28 (5'-ATAGCGGCCG CGCCACCATG TGGGTCCGG-3' (SEQ ID NO: 59); 5'-CCTTCTACTA TTGCAGAAGA CAG-3' (SEQ ID NO: 60)). Al mismo tiempo, se amplificó CD28 intracelular con una superposición parcial para el dominio transmembrana de PD-1 (5'-CTGTCTTCTG CAATAGTAGA AGG-3' (SEQ ID NO: 61); 5'-TATGAATTCT CAGGGGCGGT ACGCTGCA-3' (SEQ ID NO: 62)). En la tercera etapa de reacción, ambos productos se usaron como moldes de amplificación usando el cebador 5'-PD-1 (5'-ATAGCGGCCG CGCCACCATG TGGGTCCGG-3' (SEQ ID NO: 63) y el cebador 3'-CD28 (5-TATGAATTCT CAGGGGCGGT ACGCTGCA-3' (SEQ ID NO: 64)). Después de la amplificación, el inserto se enlazó en el vector pMP71 usando corte de enzima de restricción EcoRI y NotI y ligadura de ADN.

La proteína de fusión de PD-1 transmembrana de murino resultante (PTM; SEC ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)) y 14 (proteína)) consiste en PD-1 de murino (mPD-1) (entrada de Uniprot Q02242 (número de acceso con número de versión: 125 y versión 1 de la secuencia) aminoácidos (AA) 1-190; SEQ ID NO: 5 (ácido nucleico (ADNc)) y 6 (proteína)) y CD28 de murino (mCD28) (n.° de entrada de Uniprot: P31041 (número de acceso con número de versión: 127 y versión 2 de la secuencia) Aa 178-218; SEQ ID NO: 11 (ácido nucleico (ADNc)) y 12 (proteína)).

La proteína de fusión transmembrana de CD28 de murino resultante (CTM (SEQ ID NO: 43 (ácido nucleico (ADNc))) y 44 (proteína)) consiste en PD-1 de murino (AA 1-169; SEQ ID NO: 39 (ácido nucleico (ADNc)) y SEQ ID NO: 40 (proteína)) y c D28 de murino (AA 151-218 (s Eq ID NO: 41 (ácido nucleico (ADNc)) y 42 (proteína)).

La proteína de fusión extramembrana y transmembrana de CD28 de murino resultante (CEX (SEQ ID NO: 49 (ácido nucleico (ADNc)) y SEQ ID NO: 50 (proteína)) consiste en PD-1 de murino (AA 1-169 (SEQ ID No ): 45 (ácido nucleico (ADNc)) y SEQ ID NO: 46 (proteína)) y CD28 de murino (AA 115-218 (SEQ ID NO: 47 (ácido nucleico (ADNc)) y SEQ ID NO: 48 (proteína)).

Las variantes de PTM de murino se generaron a partir del receptor de fusión PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)) mediante mutaciones puntuales de la siguiente manera: mutación de YMNM (AA 189-192; SEQ ID NO: 29) a FMNM (SEQ ID NO: 31) dando como resultado el constructo PTM-FMNM (SEQ ID NO: 51 (ácido nucleico (ADNc)); 52 (proteína)); mutación de PYAP (AA 206-209; SEQ ID NO: 30)) a AYAA (SEQ ID NO: 32) dando como resultado el constructo ^pT^m -AYAA (SEQ ID ⁿO: 53 (ácido nucleico (ADNc)); 54 (proteína)); y el doble mutante PTM-FMNM-AYAA (SEQ ID NO: 55 (ácido nucleico (ADNc)); 56 (proteína)). Las variantes de la proteína de fusión PTM de murino se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio usando ell constructo de tipo silvestre usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Gene Art (Life Technologies) para intercambiar uno (YMNM (SEQ ID NO: 29) a FMNM (SEQ ID NO: 31)) o dos pares de bases (PYAP (SEQ ID NO: 30) a AYAA (SEQ ID NO: 32)).

Ejemplo 1.2 Mutante de deleción de PD-1 (SEQ ID NO: 57 (ácido nucleico (ADNc)) y 58 (proteína))

El mutante de deleción de PD-1 ha sido descrito anteriormente por Okazaki T y col., Proc Natl Acad Sci USA 98 (24) (2001), 13866-13871. El mutante de deleción de PD-1 contiene las secuencias representadas en las SEQ ID NO: 57 (ácido nucleico (ADNc)) y 58 (proteína).

Ejemplo 2: Transducción de células T y ensayos de destrucción citotóxica

2.1 Líneas celulares

La línea celular de cáncer de páncreas de murino Panc02 y su contraparte transfectada con ovoalbúmina Panc02-OVA se han descrito anteriormente (Jacobs y col., Int J Cancer 128 (4) (2011), 897-907). La línea celular Panc02 se generó mediante la inyección del carcinógeno metilcolantreno A en el páncreas de ratones C57B1/6 de tipo silvestre para inducir la carcinogénesis. Panc02-OVA-PD-L1 y Panc02-PD-L1 se generaron por transducción con pMXs-puro (Kitamura y col., Exp. Hematol. 31 (2003), 1007-1014) que contiene PD-L1 de murino de longitud completa (SEQ ID NO: 29 (ácido nucleico (ADNc)) y 30 (proteína)) y selección con puromicina con una concentración final de 10 pg/ml. La línea celular de empaquetamiento Plat-E ha sido descrita anteriormente por Morita y col., Gene Ther 7 (2000), 1063-6). Todas las células se cultivaron en DMEM con suero bovino fetal al 10 % (FBS, Life Technologies, EE. UU.), 1 % de penicilina y estreptomicina (PS) y 1 % de L-glutamina (todos de PAA, Alemania). Se añadieron 10 pg/ml de puromicina y 1 pg/ml de blasticidina (Sigma, Alemania) al medio Plat-E (Platinum-E). Se cultivaron células T primarias de murino (véase la sección 2.5 siguiente para el cultivo) en RPMI 1640 con 10 % de FBS, 1 % de PS y se añadieron 1 % de L-glutamina, 1 % de piruvato de sodio, HEPES 1 mM y p-mercaptoetanol 50 pM al medio de células T.

2.2 Animales

Los ratones transgénicos de un receptor de células T específico de ovoalbúmina (OT-1) se obtuvieron del Jackson Laboratory, EE. UU. (número de inventario 003831) y se criaron en una instalación para animales en condiciones libres de patógenos específicos (SPF). Los ratones OT-1 se cruzaron con ratones marcadores congénicos CD45.1 (obtenidos del Jackson Laboratory, número de inventario 002014) y con ratones marcadores congénicos CD90.1 (número de inventario: 000406) para generar ratones CD45.1-OT-1 y CD90.1-OT-1, respectivamente. Los ratones C57B1/6 de tipo silvestre se adquirieron en Janvier, Francia. Se indujeron tumores mediante inyección subcutánea de 2 x 106 células tumorales y los ratones se trataron mediante inyección iv de células T como se indica. Para experimentos de reexposición, se inyectaron a los ratones por vía subcutánea 0,5 x 106 células en el flanco opuesto al sitio del tumor anteriormente rechazado. Todos los experimentos eran de asignación aleatoria y anonimizados. Para los experimentos de neutralización, se aplicó por vía ip el anticuerpo anti-IFN-Y R4-6A2 (BioXcell, EE. UU.) o el control de isotipo (BioXcell, EE. UU.) a una dosis de 200 |jg por animal cada tres días durante cuatro dosis. El crecimiento del tumor y el estado de los ratones se controlaron cada dos días.

2.4 Transducción de células T

Se usó el vector retrovírico pMP71 (Schambach y col., Mol Ther 2 (5) (2000), 435-45;EP-B1 0955374) para la transfección de la línea celular de empaquetamiento ecotrófica Plat-E (Platinum-E). La transducción se realizó según el procedimiento descrito por Leisegang y col., J Mol Med 86 (2008), 573-83; Mueller y col., J Virol. 86 (2012), 10866­ 10869; Kobold y col., J Natl Cancer Inst (2014), en prensa. En resumen, la línea celular de empaquetamiento Plat E (como se describe por Morita y col., Gene Ther 7 (2000), 1063-6) se sembró en placas de 6 pocillos y se hizo crecer durante la noche hasta una confluencia del 70-80 %. El día 1, se mezclaron 16 jg de ADN junto con CaCl2 100 mM (Merck, Alemania) y cloroquina 126,7 jM (Sigma, EE. UU.). Las células Plat-E se privaron de alimento durante 30 min en medio de suero bajo (3 %) y entonces se incubaron durante 6 h con el ADN precipitado. Se retiró entonces el medio y se intercambió por medio de cultivo. El día 2, se recolectaron esplenocitos primarios de ratones C57B1/6 (Harlan Laboratories, Holanda). Se estimularon suspensiones unicelulares de esplenocitos con anti-CD3 (clon 145-2c11 BD Pharmingen, EE. UU.), anti-CD28 (clon 37.51, BD Pharmingen, EE. UU.) e IL-2 de murino recombinante (Peprotech, Alemania) en medio de células T durante una noche. El día 3, se recubrieron las placas de 24 pocillos con 12,5 jg/ml de retronectina recombinante (Takara Biotech, Japón) durante 2 h a temperatura ambiente, se bloquearon con 2 % de albúmina de suero bovino (Roth, Alemania) durante 30 min a 37 °C y se lavaron con PBS. Se recolectó el sobrenadante de Plat E y se pasó a través de un filtro (40 jm, Milipore, EE. UU.). Se añadió entonces medio de células T fresco a las células Plat E. Se distribuyó 1 ml de sobrenadante filtrado en cada pocillo y se inoculó por centrifugación durante 2 h a 4 °C. Se retiró entonces el sobrenadante de la placa de 24 pocillos. Se sembraron 106 células T en un medio de células T ml suplementado con 10 U de IL-2 y 400.000 esferas anti-CD3 y anti-CD28 (Invitrogen, Alemania) por pocillo y se inocularon por centrifugación a 800 g durante 30 min a 32 °C. El día 4, se recolectó de nuevo el sobrenadante de Plat E y se filtró. Se añadió 1 ml a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se inoculó por centrifugación a 800 g durante 90 min a 32 °C. Posteriormente, las células se incubaron durante 6 horas más a 37 °C. Se reemplazó 1 ml de sobrenadante por medio de células T con IL-2. El día 5, se recolectaron las células, se contaron y se volvieron a sembrar a una densidad de 106 células/ml en medio de células T suplementado con 10 ng de IL-15 por ml (Peprotech, Alemania). Las células T se mantuvieron a esta densidad hasta el día 10 cuando se realizaron análisis de células o ensayos funcionales.

2.5 Cocultivo de células T y células tumorales

Las células T y las células tumorales se cocultivaron durante 48 h a una relación de 10:1 en presencia o ausencia de anticuerpo bloqueante anti-PD-1 (10 jg/ml, clon RPM1-14, Biolegend) o anticuerpo SIINFEKL anti-H2kb de ratón (20 jg/ml, clon 25.D1-16, Miltenyi Biotech, Alemania). En los sobrenadantes se analizó IFN-^y mediante ELISA (BD).

Ejemplo 3: Ensayos de liberación de citocinas, proliferación y destrucción de células T

3.1 Ensayos funcionales de células T

Se estimularon células T con un anticuerpo anti-CD3e (100 ng/ml, clon 145-2C11, eBioscience), anticuerpo anti-CD28 (2 jg/ml, clon 37.51, eBioscience) o quimera Fc PD-L1 recombinante (5 jg/ml, R&D Systems) o la combinación de estos durante 48 h. Se cuantificaron las citocinas en los sobrenadantes mediante ELISA (IL-2 e IFN-y, ambos BD; número de catálogo: DY402 y DY485, respectivamente) o se detectaron cualitativamente mediante inmunotransferencia (matriz de citocinas de murino de R&D; número de catálogo: ARY006). Para los ensayos de proliferación, se estimularon las células como se describe anteriormente durante 24 h antes de teñir como se describe. Se contaron las células mediante la adición de esferas de recuento (Life Technologies, Alemania; número de catálogo: C36950) y análisis posterior mediante citometría de flujo. Para los ensayos de destrucción, se estimularon 300.000 células T transformadas con las proteínas de fusión durante 40 h con anticuerpo anti-CD3e y PD-L1 recombinante (R&D, número de catálogo: 1019-B7-100), como se indica anteriormente. Mientras tanto, se sembraron células tumorales PancOVA a una densidad de 15.000 por pocillo de una placa de 8 pocillos y se hicieron crecer durante una noche. Después de 16 h, se añadieron células T estimuladas a los pocillos que contenían células tumorales y se monitorizó continuamente el número de células mediante medición de impedancia usando un instrumento ICELLigence (ACEA Bioscience, EE. UU.).

3.2 Estimulación de células T humanas

Se transdujeron retrovíricamente PBMC CD3+ humanas con la proteína de fusión PTM humana (hPTM) (SEQ ID NO: 23 (ácido nucleico (ADNc)) y 24 (proteína)), y se expandieron durante 4 días usando IL-2 (Peprotech) e IL-15 (Peprotech). La estimulación de las células T se determinó realizando un ensayo de estimulación. Por lo tanto, se recubrieron placas de 96 pocillos de fondo plano con PBS que contenía 0,1 pg/ml de anticuerpo anti-CD3 humano (clon: HIT3a; eBioscience) o 0,1 pg/ml de anticuerpo anti-CD3 humano y 5 pg/ml de quimera Fc B7-H1 humana recombinante (R&D) o 0,1 pg/ml de anticuerpo anti-CD3 humano y 2 pg/ml de anticuerpo anti-CD28 humano (clon: cd28.2; eBioscience) durante una noche a 4 °C. Se colocaron 3,0 x 105 células transducidas por pocillo en la placa de 96 pocillos recubierta. Después de 48 h de incubación a 37 °C, 5 % de CO² , se recolectaron los sobrenadantes celulares. Se cuantificó la liberación de IFN-^y humano usando ELISA de IFN-^y humano (BD Bioscience) según las pautas del fabricante.

3.3 Reestimulación de esplenocitos

Se incubaron esplenocitos de ratones después de rechazo del tumor o de ratones de control durante 4 h (ICS), 1 pg/ml de los péptidos SIINFEKL (SEQ ID NO: 65), TRP2 o P15E (todos de JPT Peptides, Alemania) antes del análisis por citometría de flujo. La normalización de fondo se realizó calculando la relación de estimulación con el péptido activo frente al de control TRP2: calculada con la fórmula: % de células CD8+ IFNy+ de la condición diana/ % de CD8+ IFNy+ de la condición de TRP2.

3.4 Citometría de flujo

La citometría de flujo multicolor en un BD FACS Canto II (BD Bioscience, Alemania) usaba los siguientes paneles de anticuerpos: para análisis de células T OT-1 transferidas adoptivamente, anti-PD-1 (PE-Cy7, clon 29F.1A12) y anti-CD8 (APC, clon 53,6-7, ambos de Biolegend, EE. UU.); para análisis de p-Akt, anti-CD8a de ratón (Pacific Blue, clon 53-6,7) y anti-PD-1 de ratón (PeCy7, clon 29F.1A12, ambos de Biolegend, EE. UU.), fijación y permeabilización posterior usando un conjunto de tampón de tinción Foxp3/factor de transcripción (eBioscience, EE. UU.) y tinción con anti-Akt (pS473) (AlexaFluor 647, clon M89-61, eBioscience). Para ki67 y análisis de proliferación, las células se tiñeron con tinte de viabilidad fijable (eFluorTM 780, eBioscience), anti-CD8a de ratón y anti-PD-1 de ratón (APC clon 29F.1A12, Biolegend) y posteriormente se fijaron y permeabilizaron. Después de la tinción intracelular con anti-Ki67 (PE, clon 16A8, Biolegend), las células se lavaron y se resuspendieron en PBS que contenía esferas de recuento absoluto Count Bright (Life Technologies). Para los experimentos de seguimiento, las células se tiñeron con anti-CD8a de ratón (APC-Cy7, clon 53-6.7, Biolegend), anti-CD45.1 de ratón (APC, clon A20, eBioscience) o anti-CD90.1 de ratón (PeCy7 o Pacific BlueTM, clon OX7 de Biolegend). Para los experimentos de seguimiento conjunto, se calculó la relación entre las células CD45.1 y CD90.1. Se fijaron/permeabilizaron las células y se tiñeron intracelularmente con anticuerpo anti-IFN-Y de ratón (FITC, clon XMG1.2, Biolegend). Para la reestimulación in vitro, las células se tiñeron con anticuerpos anti-CD3e-APC (clon 145-2C11, Biolegend), anti-CD8-PerCP (clon 53-6.7, Biolegend) y anti-IFN-Y-FITC (clon XMG1.2, Biolegend). Para la capacidad de unión de PD-L1, las células se incubaron con 5 pg/ml de PD-L1-Fc recombinante (R&D) y se tiñeron con anticuerpo anti-IgG-APC humana (clon HP6017, Biolegend). Para el análisis de expresión de PD-L1, las células tumorales se estimularon con IFN-^y recombinante como se indica (Peprotech, Alemania) durante 48 h. Se tiñeron las células con anticuerpo anti-PD-L1-APC (clon 10F.9G2, Biolegend). Se realizó la tinción de células supresoras derivadas de mieloides usando anticuerpos anti-CD45 (PacBlue, clon 30F11, Biolegend), anti-CDllb (Percp-Cy5.5, clon M1/70, Biolegend), anti-Ly6 (APC-Cy7, HK1.4, Biolegend) y anti-Grl (FITC, clon RB6-8C5, Biolegend). Se detectaron las células T reguladoras mediante anticuerpos anti-CD4 (APC-Cy7, clon GK1.5, Biolegend), anti-CD8 (Percp, 53-6.7, Biolegend) y tinción intracelular para Foxp3 (eFluor450, clon ^fJK-16s, eBioscience) .

3.5 Análisis estadístico

Para estadísticas, se usó el software GraphPad Prism versión 5,0b. Todas las variables reseñadas son continuas. Las diferencias entre las condiciones experimentales se analizaron usando la prueba t de Student bilateral de datos no apareados. Para comparación de las condiciones experimentales de ratones individuales, se usó la prueba de Mann-Whitney, los valores de p <0,05 se consideraron significativos. Para los experimentos in vivo, las diferencias entre los grupos se analizaron usando ANOVA bidireccional con corrección para pruebas múltiples por el procedimiento de Bonferroni.

La supervivencia global se analizó mediante una prueba de rango logarítmico. La supervivencia se define en días desde la inducción del tumor hasta la muerte natural o hasta que los ratones fueron sacrificados porque se alcanzó uno de los siguientes criterios predefinidos: tamaño del tumor > 225 mm2, pérdida de peso > 15 % o angustia grave. Los datos se muestran como valores medios ± EEM de un mínimo de tres repeticiones biológicas o experimentos independientes, como se indica.

3.6 Resultados

3.6.1 Fundamentos y diseño de un nuevo receptor de fusión PD-1-CD28

Se evaluó la eficacia de la transferencia adoptiva de células T CD8+ específicas de OVA en ratones portadores de tumores Panc02 que expresan OVA (Panc02-OVA) establecidos. Las células T transferidas no consiguieron rechazar los tumores en la mayoría de los animales. Esto fue paralelo a la regulación positiva de PD-1 en las células T transferidas infiltrantes en el tumor (Figura 5A y 5B). Dado que las células Panc02-OVA expresan el ligando para PD-1 (PD-L1), que está regulado positivamente por IFN-^y (Figura 5C y 5D), esto apunta a un papel relevante del eje PD-1-PD-L1 en la supresión de la respuesta de células T específicas de antígeno en el tumor. Sin estar ligado a la teoría, se supuso que la protección de las células T transferidas de la supresión mediada por PD-1 puede potenciar la eficacia de la terapia de células T adoptivas. Debido a que PD-1 es miembro de la familia de CD28/CTLA-4, parecía posible que la señalización del receptor pudiera ser compatible y que un constructo del receptor de fusión PD-1-CD28 podría convertir el acoplamiento de PD-1 con PD-L1 en actividad coestimuladora de CD28 (esquema en la Figura 5E). Por lo tanto, se diseñaron receptores de fusión que consisten en la porción extramembrana y transmembrana de PD-1 con el dominio intracelular de CD28 para la transducción en células T primarias de murino.

3.6.2 Análisis funcional de células T transducidas in vitro

Para probar la funcionalidad de la proteína de fusión PD-1-transmembrana PD-1-CD28 de murino (PTM, SEQ ID NO: 13 (ADNc) y 14 (proteína)), se transdujeron células T primarias de murino y se estimularon con anticuerpos anti-CD3 agonistas y PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: 29 y 30). Las células T transducidas con PTM mostraban IFN-^y notablemente aumentado (170 /- 26 frente a 0,5 /-0,5 ng/ml, p= 0,003, Figura 1A) e inducción de IL-2 en comparación con células T no transducidas (Figura 6F). La estimulación adicional con anticuerpo anti-CD28 fortalecía aún más la producción de citocinas (Figura 7A). La inducción de citocinas era paralela a la fosforilación posterior de AKT tras el acoplamiento de PD-L1 (Figura 1B), lo que demuestra la señalización de CD28 en células T transducidas. La activación del receptor PTM potenciaba de manera estadísticamente significativa el número de células viables en comparación con las células T no transducidas (42 /- 4 frente a 6 /- 1 células por esfera, p= 0,001, Figura 1C). Este aumento en el número de células se asoció con una fuerte regulación positiva de ki67 por las células T transducidas (Figura 1D), lo que indica una fuerte actividad mitótica. Cuando se cocultivaron células T OT-1 transducidas con PTM con células Panc02-OVA o Panc02, se observó una fuerte actividad coestimulatoria, como evidenciaba la liberación de IFN-y en células T transducidas en comparación con no transducidas (545 /- 37 frente a 191 /- 0,5 ng/ml, p<0,001, Figura 1E). La actividad coestimuladora de la proteína de fusión PTM de murino dependía de la presencia de PD-L1, de la expresión de OVA por las células tumorales y del acoplamiento de TCR, como evidencia el bloqueo de MHC-I (Figura 1E) y el cocultivo con células Panc02-PD-L1 negativas de OVA (Figura 7B). Las células T transducidas con el receptor PTM preestimuladas con anticuerpos anti-CD3 y PD-L1 mediaban la lisis inmediata y completa de las células tumorales, mientras que las células T no transducidas eran ineficaces (p <0,001 a partir de las 22 h, Figura IF). Juntos, estos hallazgos indican que las células T transducidas con la proteína de fusión PTM de murino se han vuelto resistentes a la anergia mediada por PD-1-PD-L1. Estos resultados demuestran la funcionalidad y el potencial terapéutico del receptor proteína de fusión PD-1-CD28 de murino (PTM, SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (^a D^nc)); 14 (proteína)) in vitro.

3.6.3 Comparación funcional de diferentes constructos de fusión PD-1-CD28

Se han descrito dos proteínas de fusión PD-1-CD28 con una inducción de citocinas de hasta dos veces, poca actividad proliferativa y cierto potencial citolítico (Ankri y col., J. Immunol 191 (8) (2013), 4121-4129yProsser y col., Mol. Immunol.

51 (3-4) (2012), 263-272). Dados los fuertes efectos observados con la proteína de fusión PTM de murino, se analizó si la diferencia con estos resultados está relacionada con la estructura de la proteína de fusión PD-1-CD28 (PTM). Por lo tanto, se generaron proteínas de fusión adicionales para los constructos de receptor de fusión PD-1-CD28 que contenían el dominio transmembrana de CD28 (de murino) (CTM, SEQ ID NO: 43 (ácido nucleico (ADNc)); 44 (proteína)) o el dominio transmembrana de CD28 más parte del dominio extracelular de CD28 (CEX, SEQ ID NO: 49 (ácido nucleico (ADNc)); 50 (proteína)); véase la Figura 2A. Cuando se estimulaban con anticuerpos anti-CD3 y PD-L1 recombinante, todos los receptores eran funcionales como se evaluó mediante liberación de IFN-^y (79 /- 0,9 frente a 4 /- 1 frente a 7 /- 2 ng/ml, p <0,001, Figura 2B) y mediante inducción de la proliferación (540 /- 45 frente a 278 /-37 frente a 279 /- 46 células por esfera, p= 0,01 y 0,02, respectivamente, Figura 2C). Sin embargo, la proteína de fusión PTM era muy superior a los receptores CTM y CEX en términos de secreción y proliferación de IFN-^y. En cuanto al mecanismo, la actividad potenciada era paralela a la unión potenciada de PD-L1 a la proteína de fusión PTM en oposición a la proteína de fusión CTM y C^eX (MFI 9315 /- 165 frente a 2311 /- 144 frente a 2997 /- 167, p <0,001, Figura 2D). La unión potenciada de la proteína de fusión PTM solo puede explicarse en parte por el aumento de la expresión en superficie de este constructo, ya que la expresión en células T CD8 por citometría de flujo no era muy superior para todas las proteínas de fusión (Figura 2E). La unión potenciada de la proteína de fusión PTM puede ser responsable de su actividad funcional notablemente superior en comparación con las otras proteínas de fusión CEX y CTM.

3.6.4 Dominios funcionales necesarios para la función de la proteína de fusión PTM

Para examinar aún más los mecanismos subyacentes a la actividad de PTM, se generaron proteínas de fusión PD-1-CD28 PTM mutantes en las que los dominios de señalización de CD28 se volvieron no funcionales. El motivo YMNM del dominio intracelular de CD28 es necesario para la secreción óptima de citocinas tras la activación de CD28 y el motivo PYAP es esencial tanto para la producción de citocinas como para la actividad proliferativa celular (Boomer y Green, Cold Spring Harb Perspect Biol 8 (2010), a002436). Se generaron un constructo mutante PTM-FMNM (S^eQ ID NO: 51 (ácido nucleico (A^d N^c)); 52 (proteína)), un constructo mutante PTM-AYAA (SEQ ID NO: 53 (ácido nucleico (ADNc)); 54 (proteína)) y un constructo doble mutante PTM-FMNM-AYAA (SEQ ID NO: 55 (ácido nucleico (ADNc)); 56 (proteína)) para expresión en células T primarias de murino (Figura 3A). Se estimularon células T que expresan el constructo PTM o uno de los tres constructos mutantes con anticuerpos anti-CD3 y PD-L1 recombinante. Las células T transducidas con constructo de fusión PTM producían más IFN-y de forma estadísticamente significativa que PTM-FMNM, PTM-AYAA o PTM-FMNM-AYAA (22 /- 2 frente a 8 /- 1 vs 1 /- 0,07 frente a 0,1 /- 0,05 ng/ml, p<0,001, Figura 3B). El acoplamiento del constructo de fusión PTM inducía la proliferación de una manera dependiente de PYAP, mientras que YMNM era prescindible para el efecto proliferativo (Figura 3C). En contraste, la producción de diversas citocinas y quimiocinas mediante el acoplamiento del constructo de fusión PTM parece depender de ambos motivos, ya que los constructos mutantes eran inductores más débiles en comparación con la proteína de fusión PTM nativa (Figura 3D).

3.6.5 Eficacia terapéutica de las células T OT-1 transducidas con la proteína de fusión PD-1-CD28 en un modelo de cáncer de páncreas de murino

Para evaluar adicionalmente la potencia de células T específicas de antígeno transducidas con proteína de fusión PD-1-CD28 de murino (PTM; SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)), se trataron ratones portadores de tumores Panc02-OVA subcutáneos con células T OT-1 no transducidas o células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM. Las células T transducidas con el receptor PTM inducían una inmunidad antitumoral superior en comparación con los ratones que recibieron células T no transducidas (Figura 4A). Curiosamente, las células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM conservaban su potencial terapéutico en el modelo de Panc02-OVA-PD-L1 que sobreexpresa fuertemente PD-L1, mientras que el efecto de las células OT-1 no transducidas se anuló casi por completo (Figura 7C). Cuando se volvieron a exponer a células Panc02-OVA, 11 de 12 ratones tratados anteriormente con células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM permanecían libres de tumores en comparación con 0 % de ratones de control (p <0,001, Figura 4B). Además, cuando se volvieron a exponer a células Panc02 de tipo silvestre, 9 de 11 ratones tratados anteriormente con células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM permanecían libres de tumores (p <0,001, Figura 4C). Estos resultados sugieren la propagación del epítopo en ratones curados que conduce a inmunidad contra otros antígenos asociados a tumores específicos de Panc02, tales como p15E (Bauer y col., Gut 56 (9) (2007), 1275-1282). Por lo tanto, se analizó en los ganglios linfáticos de ratones libres de tumor la presencia de SIINFEKL (OVA; SeQ ID NO: 65)) y de células T CD8+ específicas de p15E (gp70). Se encontró un aumento estadísticamente significativo en el número de células CTL específicas de SIINFEKL en ratones después de la transferencia de células T transducidas en comparación con CTL específicas del péptido de control (13 /- 3 frente a 1 /- 0, p=0,008, Figura 4D). También se detectaba un aumento pequeño, pero estadísticamente significativo, de CTL específicas de p15E (3 /- 1 frente a 1 /- 0, p= 0,008, Figura 4D). La inmunidad resultante era transferible como se muestra por la protección tumoral en 3 de los 9 ratones transferidos adoptivamente con esplenocitos de ratones curados y el retraso en el crecimiento del tumor, en comparación con ninguno de los 3 ratones transferidos con esplenocitos no expuestos (Figura 4E).

3.6.6 Distribución de células T transferidas adoptivamente en ratones portadores de tumores

Para diferenciar si la eficacia terapéutica de las células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM frente a las no transducidas se debe a la presencia del dominio CD28 en la proteína de fusión PTM o simplemente a la expresión de una PD-1 no señalizadora en la superficie de células T, se expresó un mutante de deleción de PD-1, desprovisto de la porción intracelular de PD-1 (PD-1del, SEQ ID NO: 57 (ácido nucleico (ADNc)); 58 (proteína)). La inyección de células T OT-1 transducidas con PD-1del no mejoraba la eficacia terapéutica en comparación con las células T OT-1 no transducidas en el modelo de Panc02-OVA, en contraste con la inyección de células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM (Figura 5A). Estos resultados indicaban una dependencia del dominio CD28 intracelular de la proteína de fusión PTM. Se investigó entonces el destino de las células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM (SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)) frente a no transducidas en ratones portadores de tumores. Las células T transducidas con proteína de fusión PTM mostraban enriquecimiento en los tumores Panc02-OVA en comparación con las células T no transducidas (59 /- 2 frente a 49 /- 1 %, p= 0,002). Este efecto no se observó en los ganglios linfáticos ni en los órganos de ratones no portadores de tumores (Figura 5B). Además, las células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM producían de forma estadísticamente significativa más IFN-Y que las células T OT-1 no transducidas en el tumor en comparación con otros órganos o con ratones no portadores de tumor (relación de 1,5 /- 0,2 frente a 0,6 /- 0,02 frente a 0,9 /- 0,03 de células T IFN-Y+ transducidas con PTM a IFN-Y+ no transducidas, p= 0,002, Figura 5C). La neutralización de IFN-y in vivo anulaba casi por completo el impacto terapéutico de las células T OT-1 transducidas con PTM, lo que indica la importancia de esta citocina para la función del receptor (Figura 7D). Para examinar aún más los motivos de señalización responsables de la acumulación de células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM en el tumor, se usaron células T transducidas con los constructos mutantes PTM-FMNM (SEQ ID NO: 51 (ácido nucleico (ADNc)); 52 (proteína)), PTM-AYAA (SEQ ID NO: 53 (ácido nucleico (ADNc)); 54 (proteína)) y PTM-FMNM-AYAA (SEQ ID NO: 55 (ácido nucleico (ADNc)); 56 (proteína)) descritos anteriormente para comparar su destino con las células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM en animales portadores de tumores. La infiltración de células T y la persistencia de células T transducidas con proteína de fusión PTM en el sitio del tumor parecen depender tanto de los motivos YMNM (SEQ ID NO: 29) como PyAp (SEQ ID NO: 30), ya que las células T portadoras de los mutantes se encontraron en cantidades menores en comparación con las células T portadoras del receptor de tipo silvestre (Figura 5D). El aumento de células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM desplazaba la relación de células T CD8+ infiltrantes a células supresoras derivadas de mieloide (MDSC) en favor de la relación de células T OT-1 transducidas con proteína de fusión PTM (0,7 /- 0,1 frente a 0,1 /- 0,03, p <0,001, relación de células T PTM-CD8+ a MDSC, Figura 5^e ). Se observó un efecto similar para la relación de células T CD8+ a células T reguladoras (Figura 7E). Juntos, estos hallazgos indican que la transferencia adoptiva de células T transducidas con proteína de fusión de PTM inclinaba la balanza de la inmunosupresión hacia la inmunidad productiva.

Ejemplo 4: Generación de un receptor PD-1-CD28 con secuencia humana (SEQ ID NO: 23 (ácido nucleico (ADNc) y 24 (proteína))

En conformidad con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.1 anterior, se generó la proteína de fusión PD-1-CD28 homóloga humana y se clonó en el vector pMP71 después de digestión y ligación con NotI y EcoRI. La proteína de fusión PD-1-transmembrana humana resultante (hPTM (SEQ ID NO: 23 (ácido nucleico (ADNc)) y 24 (proteína)) consiste en la PD-1 extracelular (n.° de entrada de Uniprot: Q15116 (número de acceso con el número de versión de entrada138 y versión 3 de la secuencia), AA 1-170; SEQ ID NO: 17 (ácido nucleico (ADNc)) y 18 (proteína)), la secuencia transmembrana de PD-1 humana (N.° de entrada de Uniprot: Q15116 (número de acceso con el número de versión de entrada 138 y versión 3 de la secuencia), AA 171-191, SEQ ID NO: 19 (ácido nucleico) y 20 (proteína)) y la región intracelular de CD28 humana (número de entrada de Uniprot: P10747 (número de acceso con la versión de entrada: 164 y la versión 1 de la secuencia), AA 180-220, SEQ ID NO: 21 (ácido nucleico (ADNc)) y 22 (proteína)).

4.1 Funcionalidad de la proteína de fusión PD-1-CD28 humana (SEQ ID NO: 23 (ácido nucleico (ADNc)) y 24 (proteína)) en células T humanas

Se transdujeron células T primarias humanas con la proteína de fusión PD-1-CD28 humana (hPTM, SEQ ID NO: 23 (ADNc) y 24 (proteína)) y se estimularon con anticuerpo anti-CD3, solo o en combinación con anticuerpo anti-CD28 o con PD-L1 recombinante (R&D, N.° de catálogo: 156-B7-100). La estimulación simultánea de células T con anticuerpo anti-CD3 y PD-L1 conduce a una inducción significativamente aumentada de IFN-^y en células T transducidas, pero no en células T no transducidas, en comparación con células estimuladas con anticuerpos anti-CD3. Esto demuestra la funcionalidad y la ventaja de estimulación de las células T transducidas con la proteína de fusión PD-1-CD28 humana. Ejemplo 5: Transducción de células T y ensayos de destrucción citotóxica

Se repitieron experimentos seleccionados del Ejemplo 3 usando una población de células T CD4+ clasificadas y/o la línea de células tumorales, EG7-PD-L1. Los materiales y procedimientos para estos experimentos eran idénticos a los destacados en los Ejemplos 2 y 3 con las excepciones que se indican a continuación.

5.1 Líneas celulares

La línea celular de cáncer de páncreas de murino Panc02 y su contraparte Panc02-OVA transfectada con ovoalbúmina era como se describe en la sección 2.1, anteriormente.

La línea celular tumoral EG7-PD-L1 se basaba en la línea celular EL4. La línea de células tumorales EL4 se creó mediante la inducción de linfoma en un ratón C57BL mediante 9,10-dimetil-1,2-benzantraceno. La transfección basada en electroporación con el plásmido pAc-neo-OVA, portador de una copia de ARNm de ovoalbúmina de pollo (OVA) y un gen de resistencia a neomicina (G418), conducía al establecimiento del derivado de EL4 E.G7-OVA (Moore MW y col., Cell 54; 777-785, 1988). Se generó entonces EG7-OVA-PDL1 mediante transducción retrovírica con pMX-s (Kitamura y col., Exp. Hematol. 31 (2003), 1007-1014) que contiene PD-L1 de murino de longitud completa SEQ ID NO: 29 (ácido nucleico (ADNc)) y 30 (proteína) y por clasificación de células basada en FACS posterior para células positivas de PD-L1 (anti-PD-L1, ApC, clon 10F.9G2, BioLegend). Se cultivaron células tumorales EG7-PD-L1 en RPMI 1640 con 10 % de F^bS, 1 % de PS y 1 % de L-glutamina, se añadieron piruvato de sodio al 1 %, HEPES 1 mM y pmercaptoetanol 50 pM al medio de células T.

5.2 Animales

Se obtuvieron ratones transgénicos de un receptor de células T CD8+ específico de ovoalbúmina (OT-1) y de un receptor de células T CD4+ específico de ovoalbúmina (OT2) del Jackson Laboratory, EE. UU., y se criaron en instalaciones para animales en condiciones libres de patógenos específicos (SPF). Los ratones C57BL/6 de tipo silvestre se adquirieron en Janvier, Francia.

5.3 Clasificación y transducción de células T CD4+

Se usó el vector retrovírico pMP71 (Schambach y col., Mol Ther 2 (5) (2000), 435-45;EP-B1 0955374) para la transfección de la línea celular de empaquetamiento ecotrófica Plat-E (Platinum-E). Se realizó la transducción según el procedimiento descrito por Leisegang y col., J Mol Med 86 (2008), 573-83; Mueller y col., J Virol. 86 (2012), 10866­ 10869; Kobold y col., J Natl Cancer Inst (2014), en prensa. En resumen, la línea celular de empaquetamiento Plat-E (como se describe por Morita y col., Gene Ther 7 (2000), 1063-6) se sembró en placas de 6 pocillos y se hizo crecer durante la noche hasta una confluencia del 70-80 %. En día 1, se mezclaron 18 pg de ADN junto con CaCb 100 mM (Merck, Alemania). Las células Plat-E se incubaron durante 6 h con el ADN precipitado. Se retiró entonces el medio y se intercambió por medio de cultivo. El día 2, se recolectaron esplenocitos primarios de ratones C57B1/6 (Harlan Laboratories, Holanda) y se clasificaron las células T CD4+ con un kit de aislamiento de células T MACS CD4+ (L3T4) (Miltenyi Biotec, Alemania). Las células T CD4+ se estimularon con anti-CD3 (clon 145-2c11 BD Pharmingen, EE. UU.), anti-CD28 (clon 37.51, BD Pharmingen, EE. UU.), IL-2 de murino recombinante (Peprotech, Alemania) y pmercaptoetanol 50 pM en medio de células T durante la noche. El día 3, se recubrieron las placas de 24 pocillos con 12,5 pg/ml de retronectina recombinante (Takara Biotech, Japón) durante 2 h a temperatura ambiente, se bloquearon con 2 % de albúmina de suero bovino (Roth, Alemania) durante 30 min a 37 °C y se lavaron con PBS. Se reclectó el sobrenadante que contenía virus de los cultivos de Plat-E y se pasó a través de un filtro (45 pm, Millipore, EE.UU.). Se añadió entonces medio de células T fresco a las células Plat-E. Se distribuyó un ml de sobrenadante filtrado en cada pocillo de las placas de 24 pocillos y se inoculó por centrifugación durante 2 h a 4 °C. Se retiró entonces el sobrenadante de la placa de 24 pocillos. Se sembraron 1x106 células T en un medio de células T ml suplementado con 100 U de IL-2 y 400.000 esferas anti-CD3 de ratón y anti-CD28 de ratón (Invitrogen, Alemania) por pocillo y se inocularon por centrifugación a 800 g durante 30 min a 32 °C. El día 4, el sobrenadante de Platinum-E se recolectó de nuevo y se filtró. Se añadió 1 ml del sobrenadante filtrado a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se inoculó por centrifugación a 800 x g durante 90 min a 32 °C. Posteriormente, las células se incubaron durante 6 horas a 37 °C. Posteriormente, las células se recolectaron, se contaron y se volvieron a sembrar a 1 x 106 células/ml de densidad en medio de células T suplementado con 10 ng de IL-15 por ml (Peprotech, Alemania) y p-mercaptoetanol 50 pM. Las células T se mantuvieron a esta densidad hasta el día 10 cuando se realizaron análisis de células o ensayos funcionales.

5.4 Ensayos funcionales de células T

Para los ensayos de estimulación basados en anticuerpos, se prepararon placas de 96 pocillos recubriéndolas con PBS (solución de vehículo) que contenía anticuerpo anti-CD3 de murino (100 ng/ml, clon 145-2C11, eBioscience) solo o en combinación con un anticuerpo anti-CD28 (2 pg/ml, clon 37.51, eBioscience) o quimera Fc PD-L1 recombinante (5 pg/ml, R&D Systems) durante 12 horas a 4 °C. También se prepararon como controles pocillos que contenían solo PBS. Posteriormente, se añadieron 300.000 células T por pocillo y se incubaron durante 36 horas. Se contaron las células mediante la adición de esferas de recuento (Life Technologies, Alemania; número de catálogo: C36950) y análisis posterior de proliferación, viabilidad y fenotipo mediante citometría de flujo (como se describe a continuación). Las citocinas se cuantificaron en los sobrenadantes mediante ELISA (para IL-2 e IFN-y, ambos BD según las instrucciones del fabricante).

Para el análisis de proliferación y fenotipo de células T en experimentos de cocultivo de células tumorales, se estimularon células T CD8+ y/o CD4+ transducidas o no transducidas en una placa de 96 pocillos anteriormente recubierta con anticuerpo anti-CD3e de murino y PD-L1 recombinante de murino como se describe anteriormente a 0,3 x106 células por pocillo (para células CD4+ aisladas, 0,15 x 106 células por pocillo) durante 36 horas (el final de la estimulación era el punto temporal 1). 4 horas antes del final de la estimulación, se sembraron 0,030 x106 células tumorales PancOVA por pocillo (en los experimentos con células CD4+ aisladas, 0,04 x 106 células PancOVA por pocillo) en una nueva placa de 96 pocillos. Al final de la estimulación de 36 horas, se añadieron dos tercios del volumen de un pocillo que contenía las células T preestimuladas a un pocillo que contenía las células tumorales diana y se cocultivó durante 12 horas más (punto temporal 2). Las células se contaron mediante la adición de esferas de recuento (Life Technologies, Alemania). Los fenotipos de células T (CD62L, CCR7) y los marcadores de activación (CD69, PD-1) se determinaron mediante citometría de flujo (como se describe a continuación) en los puntos temporales 1 y 2. Para ensayos de destrucción in vitro, se estimularon células T CD8+ y/o CD4+ transducidas o no transducidas por pocillo durante 36 horas como se describe anteriormente con anticuerpo anti-CD3e y quimera Fc PD-L1 recombinante.

4 horas antes del final de la estimulación, se sembraron células tumorales en una placa de 96 pocillos como se describe anteriormente. El número exacto de células tumorales dependía de las células tumorales aplicadas: 0,03-0,040 x106 PancOVA y 0,02 x106 EG7-PD-L1. Después de la estimulación, se añadieron dos tercios del volumen de un pocillo que contenía las células T preestimuladas a un pocillo que contenía las células tumorales diana. Los cocultivos transcurrieron de 8 a 18 horas, dependiendo de las células tumorales aplicadas (8 horas para las células tumorales PancOVA, 18 horas para EG7-PDL1). Se recolectó entonces el sobrenadante y se analizó la capacidad de destrucción de las células T usando un ensayo de citotoxicidad basado en LDH (Promega, EE. UU.) o ELISA de Granzima B de murino (R&D Systems, EE. UU.). Los niveles de IFN-y en los sobrenadantes se cuantificaron mediante ELISA (IFN-y, BD).

Para experimentos in vivo, se inyectaron por vía subcutánea 200.000 células EG7-PD-L1 por ratón. Cuando los tumores eran palpables, se inyectaron por vía intravenosa 10 x 106 células T transducidas con PTM u OT-1 no transducidas a través de la vena de la cola. El tamaño del tumor se midió cada 2-3 días y los ratones se sacrificaron cuando los tumores habían alcanzado un tamaño máximo de 225 mm2. Los ratones curados y animales de control se volvieron a exponer a 30.000 células tumorales (por ratón, de nuevo inyectadas por vía subcutánea) 30 días después del rechazo tumoral.

5.5 Citometría de flujo

La citometría de flujo multicolor se realizó usando un BD FACS Canto II (BD bioscience, Alemania) y se usaron los siguientes paneles de anticuerpos.

Para los ensayos de estimulación basados en anticuerpos, las células se tiñeron con Fixable tinte de viabilidad fijable (AmCyan, BioLegend), anti-CD4 de ratón (PacBlue, clon GK1.5, BioLegend) y anti-PD-1 de ratón (APC clon 29F.1A12, Biolegend). Posteriormente, las células se fijaron y permeabilizaron. Después de tinción intracelular con anti-Ki67 (PE, clon 16A8, Biolegend) y anti-EOMES (PeCy7, clon Dan11mag, eBioscience), se lavaron las células y se resuspendieron en PBS que contenía esferas de recuento absoluto Count Bright (Life Technologies, EE. UU.). Como alternativa, se incluyeron anti-IL17 (FITC, clon TC11-18H10.1, BioLegend) y anti-FoxP3 (PE, clon 150D, BioLegend) en el proceso de tinción intracelular para la diferenciación de subconjuntos específicos de células T.

Para los experimentos de fenotipado, las células se tiñeron con tinte de viabilidad fijable (AmCyan, BioLegend), anti-CD8a de ratón (APCCy7, clon 53-6.7, BioLegend), anti-CD4 de ratón (PE, clon g K1.5, BioLegend), anti-CD62L de ratón (PacBlue, clon MEL-14, BioLegend), anti-CCR7 de ratón (PerCP/Cy5.5, clon 4B12, BioLegend), anti-CD69 de ratón (PeCy7, clon H1.2F3, BioLegend) y anti-PD-1 de ratón (clon APC 29F.1A12, Biolegend).

5.6 Resultados

5.6.1 Análisis funcional y fenotípico de células T CD4 transducidas in vitro

Para probar la funcionalidad de la proteína de fusión PD-1-transmembrana PD-1-CD28 de murino (PTM, SEQ ID NO: 13 (ADNc) y 14 (proteína)), se transdujeron células T CD4+ primarias de murino y se estimularon con anticuerpos anti-CD3 agonistas o anticuerpos anti-CD3 agonistas en combinación con PD-L1 recombinante (SEQ ID NO: 29 y 30) o anticuerpos anti-CD28. Las células T CD4+ transducidas con PTM mostraban un aumento notable de IFN-^y (19998 frente a 291 pg/ml, p <0,001, Figura 9A) en comparación con las células T CD4+ no transducidas. La activación del receptor PTM daba como resultado mejoras estadísticamente significativas de proliferación y viabilidad respecto a los controles (para proliferación: 151 frente a 68 células por esfera (anticuerpo anti-CD3 y PD-L1 recombinante frente a anticuerpo anti-CD3, respectivamente), p <0,001 Figura 9B; y para viabilidad: 60 % frente a 40 %, (anticuerpo anti-CD3 y PD-L1 recombinante frente a anticuerpo anti-CD3, respectivamente), p <0,001, Figura 9C). Este aumento en el número de células se asoció con una fuerte regulación positiva de ki67 y eosmesdermina/Tbr2 (EOMES), lo que indica una fuerte actividad mitótica y una transcripción potenciada/estado de activación pronunciado (Figura 9^d y 9E, respectivamente).

La activación del receptor PTM tampoco se asoció con ningún aumento en la producción de IL-17 o FoxP3. La expresión de IL-17 y FoxP3 en células T CD4+ transducidas con PTM era similar a la de las células de control (Figura 10A y 10B, respectivamente), lo que indica que la activación del receptor PTM no da como resultado un desplazamiento fenotípico hacia el subtipo celular Th17 o Treg dentro de la población de células T colaboradoras. El cocultivo de células T transducidas con PTM preestimuladas con células PancOVA daba como resultado una disminución del porcentaje de células T efectoras y un aumento del porcentaje de células T de memoria central para ambas poblaciones CD8+ (Figuras 11A y 11B) y c D4+ (Figuras 11C y 11D). Estos resultados también pueden explicar parcialmente la actividad favorable de las células T transducidas con PTM in vivo, ya que se ha descrito que las células T de memoria central tienen una actividad efectora antitumoral mejorada respecto a las células T de memoria efectoras. La expresión del marcador de activación temprana CD69 disminuía durante el cocultivo tanto para células T CD4+ y CD8+ transducidas con PTM como no transducidas (Figuras 11E y 11F), mientras que la expresión del marcador de activación tardía PD1 aumentaba (Figura 11G).

5.6.2 Eficacia terapéutica de las células T transducidas con la proteína de fusión PD-1-CD28 en un modelo de cáncer de páncreas de murino

Se usaron células T específicas de antígeno transducidas con proteína PD-1-CD28 (PTM; SEQ ID NO: 13 (ácido nucleico (ADNc)); 14 (proteína)) (células T OT-1 como se describe en los Ejemplos 2 y 3), para tratar ratones portadores de tumores EG7-PD-L1 subcutáneos. Ratones portadores de tumores similares tratados con PBS o células T OT-1 no transducidas sirvieron como controles. Las células T transducidas con receptor PTM también inducían una inmunidad antitumoral superior en este modelo en comparación con ratones de control (Figuras 12A) mejorando significativamente la supervivencia (p= 0,03; Figura 12B). Cuando se volvieron a exponer a células EG7-PD-L1, los ratones tratados anteriormente con PTM transducido se curaron eficazmente y permanecieron libres de tumores en comparación con los ratones de control no expuestos (Figura 12C).

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión que comprende un polipéptido PD-1 que está ligado operativamente a través de su extremo C al extremo N de un dominio intracelular de un polipéptido CD28, en la que el polipéptido PD-1 comprende el dominio extracelular y el dominio transmembrana de PD-1 y comprende la secuencia SEQ ID NO: 16 o una secuencia que tiene de 1 a 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la SEQ ID NO: 16, que se caracteriza por tener una actividad de unión a PD-L1 y/o PD-L2.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el dominio transmembrana de PD-1 tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el polipéptido CD28 comprende una secuencia derivada del dominio intracelular de un polipéptido CD28 que tiene las secuencias YMNM (SEQ ID NO: 29) y/o PYAP (SEQ ID NO: 30).

4. La proteína de fusión de la reivindicación 1 a 3, en la que el polipéptido CD28 tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:22.

5. La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína de fusión consiste en la SEQ ID NO: 24.

6. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que dicha proteína de fusión tiene

(a) un polipéptido PD-1 que comprende una secuencia que tiene de 1 a 10 sustituciones, deleciones o inserciones en comparación con la SEQ ID NO: 18 y que se caracteriza por tener una actividad de unión a PD-L1 y/o PD-L2; (b) un dominio transmembrana de PD-1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20, y

(c) un polipéptido CD28 que comprende una secuencia derivada del dominio intracelular de un polipéptido CD28 que tiene las secuencias YMNM (SEQ ID NO: 29) y/o PYAP (SEQ ID NO: 30).

7. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7 que además codifica un segundo polipéptido.

9. Una composición que comprende una primera molécula de ácido nucleico que es la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7 y una segunda molécula de ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido.

10. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8, o la composición de la reivindicación 9, en la que el segundo polipéptido es un receptor de antígeno quimérico, un receptor alfa/beta de células T, un receptor de células T natural, un acoplador de células T anti-CD3 o una proteína de fusión de receptor de células T (TCR) (TFP).

11. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 y 10.

12. La composición de la reivindicación 9 o 10, en la que dicha primera molécula de ácido nucleico y dicha segunda molécula de ácido nucleico están comprendidas en un primer vector y un segundo vector.

13. La composición de la reivindicación 12, en la que el primer y segundo vectores son el mismo o diferentes vectores.

14. Una célula transducida que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 y 10; la composición de cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 12 y 13; o el vector de la reivindicación 11.

15. Una célula transducida que expresa una proteína de fusión codificada por la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7.

16. Una célula transducida que expresa una proteína de fusión y un segundo polipéptido, comprendiendo dicha célula la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8 o 10; la composición de cualquiera de las reivindicaciones 9, 10, 12 y 13; o el vector de la reivindicación 11.

17. Un procedimiento para la producción de una célula transducida que expresa una proteína de fusión como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende las siguientes etapas:

(a) transducción de una célula con un vector de la reivindicación 11, o la composición de la reivindicación 12 o 13; (b) cultivo de la célula transducida en condiciones que permitan la expresión de la proteína de fusión en o sobre dicha célula transducida; y

(c) recuperación de la célula transducida del cultivo.

18. Una célula transducida que expresa una proteína de fusión codificada por una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7 obtenible mediante el procedimiento de la reivindicación 17.

19. Una composición farmacéutica que comprende una célula transducida que expresa una proteína de fusión codificada por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 y 10, una célula transducida de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 y 18, o una célula transducida producida por el procedimiento de la reivindicación 17.

20. Una célula transducida que expresa una proteína de fusión codificada por una molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 y 10, una célula transducida de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16 y 18, o una célula transducida producida por el procedimiento de la reivindicación 17 para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer de pulmón, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de colon, cáncer gástrico, carcinoma de células renales, carcinoma de esófago, glioma, cáncer urotelial, retinoblastoma, cáncer de mama, linfoma no de Hodgkin, carcinoma pancreático, linfoma de Hodgkin, mieloma, carcinoma hepatocelular, leucemia, carcinoma cervicouterino, colangiocarcinoma, cáncer bucal, cáncer de cabeza y cuello o mesotelioma.

21. Un kit que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7 u 8, el vector de la reivindicación 11 y/o la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.