ES2836743T3 - Receptores de antígeno quiméricos que seleccionan como diana CD-19 - Google Patents

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Abstract

Receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido contra CD19, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de antígeno quiméricos que seleccionan como diana CD-19
Antecedentes de la invención
Las neoplasias malignas de células B, tales como el linfoma y la leucemia, se producen cuando se interrumpe la regulación de la diferenciación y activación de las células B. Las neoplasias malignas de células B maduras incluyen linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Hodgkin, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de zona marginal y leucemia linfocítica crónica (Shaffer et al., Nature Reviews Immunology, 2: 920-933 (2002)). Las terapias convencionales tales como la quimioterapia, los anticuerpos monoclonales terapéuticos (por ejemplo, rituximab (RITUXAN™)) y el trasplante alogénico de células madre (aloHSCT) no curan las neoplasias malignas de células B (véanse, por ejemplo, Dreger et al., Leukemia, 21(1): 12-17 (2007); Gribben, J.G., Blood, 109(11): 4617-4626 (2007); y Armitage, J.O., Blood, 110(1): 29-36 (2007)). En particular, los anticuerpos monoclonales no son curativos como agentes únicos y el aloHSCT se asocia con altos niveles de morbimortalidad (véanse, por ejemplo, Dreger et al., citado anteriormente, Armitage et al., citado anteriormente, y McLaughlin et al., Journal of Clinical Oncology, 16(8): 2825-2833 (1998)). Las células T pueden modificarse genéticamente para expresar receptores de antígeno quiméricos (CAR), que son proteínas de fusión que se componen de un resto de reconocimiento de antígeno y dominios de activación de células T (véanse, por ejemplo, Kershaw et al., citado anteriormente, Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(2): 720-724 (1993), y Sadelain et al., Curr. Opin. Immunol., 21(2): 215-223 (2009)). Para neoplasias malignas del linaje de células B, se han desarrollado enfoques adoptivos de células T que utilizan CAR que seleccionan como diana CD19 (véanse, por ejemplo, Jensen et al., Biology of Blood and Marrow Transplantation, 16: 1245-1256 (2010); Kochenderfer et al., Blood, 116(20): 4099-4102 (2010); Porter et al., The New England Journal of Medicine, 365(8): 725-733 (2011); Savoldo et al., Journal of Clinical Investigation, 121(5): 1822-1826 (2011), Cooper et al., Blood, 101(4): 1637-1644 (2003); Brentjens et al., Nature Medicine, 9(3): 279-286 (2003); Kalos et al., Science Translational Medicine, 3(95): 95ra73 (2011); Cheadle et al., Journal of Immunology, 184(4): 1885-1896 (2010); Brentjens et al., Clinical Cancer Research, 13(18 Pt 1): 5426-5435 (2007); Kochenderfer et al., Blood, 116(19): 3875-3886 (2010); Brentjens et al., Blood, 118(18): 4817-4828 (2011); y Kochenderfer et al., Blood, 8 de diciembre de 2011 (publicación electrónica antes de la edición impresa (2012)). El antígeno CD19 de células B se ha elegido como diana de los CAR debido a que su expresión se limita a células B normales y malignas (véase, por ejemplo, Nadler et al., Journal of Immunology, 131(1): 244-250 (1983)).
Una desventaja asociada con las terapias con CAR anti-CD 19 presentadas hasta la fecha es que pueden inducir toxicidad significativa asociada con niveles elevados de citocinas en suero. La generación de respuestas inmunitarias de anticuerpos humanos anti-IgG de ratón también es un riesgo potencial asociado con los actuales CAR anti-CD19, que contienen secuencias murinas (véanse, por ejemplo, Jensen et al., citado anteriormente; Lamers et al., Blood, 117(1): 72-82 (2011); y Maus et al., Cancer Immunol Res, 2: 112-120 (2014)).
Por tanto, sigue existiendo la necesidad de composiciones que puedan usarse en métodos para tratar neoplasias malignas de células B que tengan toxicidad e inmunogenicidad reducidas en seres humanos. Esta invención proporciona tales composiciones, que se incluyen para su uso en tales métodos.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido contra CD19, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13.
Breve descripción de las varias vistas del/de los dibujo(s)
La figura 1 es un gráfico que representa resultados experimentales que ilustran la supervivencia in vitro de células T que expresan los CAR indicados tal como se describe en el ejemplo 2. Los porcentajes de células T que expresan los CAR indicados en el día 7 de cultivo fueron los siguientes: FMC63-28Z, 71%; FMC63-CD828Z, 88%; y FMC63-CD8BBZ, 87%.
Las figuras 2A-2D son imágenes de representaciones gráficas de FACS que ilustran la expresión de los CAR completamente humanos indicados que comprenden dominios de señalización intracelular de CD27 en la superficie de células T. Las representaciones gráficas se seleccionan en linfocitos CD3+ vivos.
Las figuras 3A y 3B son imágenes de representaciones gráficas de FACS que ilustran la expresión del CAR 47G4-CD828Z (figura 3A) en la superficie de células T en comparación con el control sin transducir (figura 3B). Las representaciones gráficas se seleccionan en linfocitos CD3+ vivos.
Las figuras 4A y 4B son gráficos que representan los resultados experimentales que ilustran la producción de TNF por células T que expresan los CAR FMC63-28Z, FMC63-CD828Z o FMC63-CD8BBZ en líneas de células T CD19+ CD19-K562 (figura 3A) y NALM6 (figura 3B). Se realizó un ELISA de TNF convencional para medir la cantidad de TNF (pg/ml) en los sobrenadantes de cultivo. Se normalizó el nivel de TNF a la fracción de células T en cada cultivo que expresaba cada CAR. Los resultados muestran la media y el error estándar de la media de niveles de TNF normalizados a partir de dos donantes diferentes.
La figura 5 es un gráfico que representa los resultados experimentales que ilustran la producción de IFNy por células T que expresan el CAR 47G4-CD828Z en líneas de células T CD19+ CD19-K562 y NALM6. A549, TC71 y CCRF-CEM son líneas celulares negativas para CD19.
Las figuras 6A-6D son representaciones gráficas de FACS que ilustran que las células T transducidas con los CAR indicados se desgranularon de una manera específica para CD19, tal como se mide mediante regulación por incremento de CD107a.
Las figuras 7A-7C son representaciones gráficas de FACS que ilustran que las células T que expresan los CAR indicados pueden proliferar en respuesta a CD19, tal como se midió mediante fluorescencia de éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE). Las células T que expresan los CAR indicados se cultivaron con o bien la línea celular CD19+ CD19-K562 (curva rellena en negro) o bien la línea celular negativa para CD19 NGFR-K562 (curva en blanco) en medios que no contenían IL-2 durante cuatro días. Todas las representaciones gráficas se seleccionan en linfocitos CD3+CAR+ vivos.
La figura 8 es un gráfico que representa los resultados experimentales que ilustran que las células T transducidas con el plásmido MSGV-FMC63-CD828Z, que codifica para el CAR FMC63-CD828Z, son citotóxicas para células primarias de leucemia linfocítica crónica (LLC).
La figura 9 es un gráfico que representa los resultados experimentales que ilustran que las células T que expresan o bien el CAR FMC63-28Z o bien el CAR 47G4-CD8CD28Z reducen el tamaño de tumores NALM6 en ratones NSG inmunodeprimidos.
Descripción detallada de la invención
La invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR), en el que el CAR comprende un resto de reconocimiento de antígeno y un resto de activación de células T. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) es una proteína o un polipéptido híbrido construido artificialmente que contiene un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, un fragmento variable de cadena sencilla (scFv)) unido a dominios de señalización de células T o activación de células T. Los CAR tienen la capacidad de redirigir la especificidad y reactividad de las células T hacia una diana seleccionada de una manera no restringida por CMH, que explota las propiedades de unión a antígeno de los anticuerpos monoclonales. El reconocimiento de antígeno no restringido por CMH proporciona a las células T que expresan CAR la capacidad de reconocer un antígeno independiente del procesamiento del antígeno, desviando así un mecanismo principal del escape tumoral. Además, cuando se expresan en células T, los CAR no se dimerizan ventajosamente con las cadenas alfa y beta del receptor de células T (TCR) endógenas.
Por “aislado” se entiende la eliminación de una sustancia (por ejemplo, una proteína o un ácido nucleico) de su entorno natural. Por “purificado” se entiende que una sustancia dada (por ejemplo, una proteína o un ácido nucleico), ya sea una que se haya eliminado de la naturaleza (por ejemplo, ARNm y ADN genómico) o sintetizado (por ejemplo, ADNc) y/o amplificado en condiciones de laboratorio, ha aumentado su pureza, donde “pureza” es un término relativo, no “pureza absoluta”. Sin embargo, debe entenderse que los ácidos nucleicos y las proteínas pueden formularse con diluyentes o adyuvantes y aun así aislarse con fines prácticos. Por ejemplo, las proteínas se mezclan normalmente con un portador o diluyente aceptable cuando se usan para su introducción en las células. El CAR de la invención comprende un resto de reconocimiento de antígeno que se dirige contra CD19 (también conocido como antígeno de linfocitos B CD19, B4 y CVID3). CD19 es una molécula de la superficie celular expresada sólo por linfocitos B y células dendríticas foliculares del sistema hematopoyético. Es el más temprano de los antígenos restringidos al linaje B en expresarse y está presente en la mayoría de los precursores de células B y en la mayoría de las células de leucemia linfocítica aguda que no son células T y en las células de leucemia linfocítica crónica de tipo células B (Tedder e Isaacs, J. Immun., 143: 712-717 (1989)). CD19 actúa principalmente como un correceptor de células B junto con CD21 y CD81 (Bradbury et al., J. Immunol., 149(9): 2841-2850 (1992); Horvath et al., J. Biol. Chem., 273 (46): 30537-30543 (1998); e Imai et al., J. Immunol., 155 (3): 1229-1239 (1995)). Tras la activación, la cola citoplásmica de CD19 se fosforila, lo que conduce a la unión de las cinasas de la familia Src y al reclutamiento de PI-3 cinasa. También se ha demostrado que CD19 interacciona con otras proteínas de señalización celular, tales como la proteína tirosina cinasa Lyn, que es la cinasa Src predominante en las células B (Fujimoto et al., Immunity, 13: 47-57 (2000)), CD82 (Imai et al., citado anteriormente), receptor del complemento 2 (Bradbury et al., citado anteriormente; y Horvath et al., citado anteriormente) y VAV2 (Doody et al., EMBO J., 19 (22): 6173-6184 (2000)).
El CAR de la invención comprende un resto de reconocimiento de antígeno que contiene una porción de unión a antígeno de un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD19. El término “anticuerpos monoclonales”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a anticuerpos que se producen por un único clon de células B y se unen al mismo epítopo. Por el contrario, los “anticuerpos policlonales” se refieren a una población de anticuerpos que se producen por diferentes células B y se unen a diferentes epítopos del mismo antígeno. Un anticuerpo completo consiste normalmente en cuatro polipéptidos: dos copias idénticas de un polipéptido de cadena pesada (H) y dos copias idénticas de un polipéptido de cadena ligera (L). Cada una de las cadenas pesadas contiene una región variable (VH) N-terminal y tres regiones constantes (CH1, CH2 y CH3) C-terminales, y cada cadena ligera contiene una región variable (VL) N-terminal y una región constante (CL) C-terminal. Las regiones variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Las regiones VH y VL tienen la misma estructura general, y cada región comprende cuatro regiones de entramado, cuyas secuencias están relativamente conservadas. Las regiones de entramado están conectadas por tres regiones determinantes de complementariedad (CDR). Las tres CDR, conocidas como CDR1, CDR2 y c DR3, forman la “región hipervariable” de un anticuerpo, que es responsable de la unión a antígeno.
Los términos “fragmento de un anticuerpo”, “fragmento de anticuerpo”, “fragmento funcional de un anticuerpo” y “porción de unión a antígeno” se usan indistintamente en el presente documento para significar uno o más fragmentos o porciones de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (véase, en general, Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)). El resto de reconocimiento de antígeno del CAR de la invención comprende un Fv de cadena sencilla (scFv) anti-CD 19 derivado o bien del anticuerpo monoclonal murino FMC63 (Nicholson et al., Molecular Immunology, 34(16-17): 1157-1165 (1997)) o bien del anticuerpo monoclonal completamente humano 47G4 (publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0104509).
El CAR de la invención comprende una secuencia señal. La secuencia señal se coloca en el extremo amino terminal del resto de reconocimiento de antígeno (por ejemplo, la región variable del anticuerpo anti-CD 19). La secuencia señal es una secuencia señal del receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) humano o una secuencia señal de CD8a. Por ejemplo, un CAR de la invención que comprende un scFv anti-CD 19 murino puede comprender una secuencia señal de GM-CSF, mientras que un CAR de la invención que comprende un scFv anti-CD 19 humano puede comprender una secuencia señal de CD8a.
El CAR de la invención comprende una secuencia espaciadora extracelular. La secuencia espaciadora extracelular es una secuencia de aminoácidos corta que facilita la flexibilidad del anticuerpo (véase, por ejemplo, Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004)), y se coloca entre el resto de reconocimiento de antígeno (por ejemplo, un scFv anti-CD 19) y el resto de activación de células T. La secuencia espaciadora extracelular puede comprender toda o una porción de una región extracelular de la molécula CD8a humana.
El CAR de la invención también comprende un dominio transmembrana de una molécula CD8a. CD8 es una glicoproteína transmembrana que actúa como correceptor del receptor de células T (TCR) y se expresa principalmente en la superficie de las células T citotóxicas. La forma de CD8 más común existe como un dímero compuesto por una cadena de CD8a y CD8p. La CD8a es humana.
El CAR de la invención comprende un resto de activación de células T. El resto de activación de células T comprende múltiples (es decir, dos o más) dominios de señalización de células T intracelulares (es decir, citoplásmicos) (también denominados “dominios coestimuladores”). Los dominios de señalización de células T intercelulares pueden obtenerse a partir de una molécula CD28, una molécula CD3 zeta (Q, la cadena gamma de un receptor de alta afinidad de IgE humana (FceRI), una molécula CD27 o una molécula 4-1BB. CD28 es un marcador de células T importante en la coestimulación de células T. 4-1BB, también conocido como CD137, transmite una potente señal coestimuladora a las células T, que fomenta la diferenciación y mejora la supervivencia a largo plazo de los linfocitos T. CD27 es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF y es necesario para la generación y el mantenimiento a largo plazo de la inmunidad de las células T. El receptor de alta afinidad de IgE humana (FceRI) es un complejo de receptor tetramérico que consiste en una cadena alfa, una cadena beta y dos puentes disulfuro conectados a cadenas gamma. FceRI se expresa constitutivamente en mastocitos y basófilos y es inducible en eosinófilos.
Los dominios de señalización de células T intracelulares son humanos.
El CAR de la invención puede comprender uno cualquiera de los dominios transmembrana mencionados anteriormente y uno cualquiera o 2 ó 3 de los dominios de señalización de células T intracelulares mencionados anteriormente en cualquier combinación. Por ejemplo, el CAR de la invención puede comprender un dominio transmembrana de CD8a y dominios de señalización de células T intracelulares de CD28, CD3 y^ la cadena gamma de FceRI, o 4-1BB. En otra realización, el CAR de la invención puede comprender un dominio transmembrana de CD8a y dominios de señalización de células T intracelulares de CD28, CD3 y^ CD27.
La invención proporciona además una secuencia de ácido nucleico que codifica para el receptor de antígeno quimérico (CAR) de la invención. “Secuencia de ácido nucleico” pretende abarcar un polímero de ADN o ARN, es decir, un polinucleótido, que puede ser monocatenario o bicatenario y que puede contener nucleótidos no naturales o alterados. Los términos “ácido nucleico” y “polinucleótido”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos (ARN) o desoxirribonucleótidos (ADN). Estos términos se refieren a la estructura primaria de la molécula y, por tanto, incluyen ADN bicatenario y monocatenario y ARN bicatenario y monocatenario. Los términos incluyen, como equivalentes, análogos de ARN o ADN preparados a partir de análogos de nucleótidos y polinucleótidos modificados tales como, aunque sin limitarse a, polinucleótidos metilados y/u ocupados en los extremos.
El CAR dado a conocer puede comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que el CAR retenga su actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente a un antígeno, detectar células enfermas en un mamífero o tratar o prevenir una enfermedad en un mamífero, etc. Por ejemplo, el CAR puede comprender 50 o más (por ejemplo, 60 o más, 100 o más, o 500 o más) aminoácidos, pero menos de 1.000 (por ejemplo, 900 o menos, 800 o menos, 700 o menos, o 600 o menos) aminoácidos. Preferiblemente, el CAR es de aproximadamente 50 a aproximadamente 700 aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 550, o aproximadamente 650 aminoácidos), de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 aminoácidos (por ejemplo, aproximadamente 125, aproximadamente 175, aproximadamente 225, aproximadamente 250, aproximadamente 275, aproximadamente 325, aproximadamente 350, aproximadamente 375, aproximadamente 425, aproximadamente 450, o aproximadamente 475 aminoácidos), o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores.
En el alcance de la divulgación se incluyen porciones funcionales del CAR de la invención descrito en el presente documento. El término “porción funcional”, cuando se usa en referencia a un CAR, se refiere a cualquier parte o fragmento del CAR de la invención, parte o fragmento que retiene la actividad biológica del CAR del que forma parte (el CAR original). Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un CAR que retienen la capacidad de reconocer las células diana, o detectar, tratar o prevenir una enfermedad, en un grado similar, en el mismo grado o en un grado mayor que el CAR original. En referencia a una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR original, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una porción funcional del CAR puede codificar para una proteína que comprende, por ejemplo, aproximadamente el 10%, el 25%, el 30%, el 50%, el 68%, el 80%, el 90%, el 95% o más del CAR original.
Una porción funcional de un CAR puede contener aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxilo terminal de la porción, o en ambos extremos terminales, aminoácidos adicionales que no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del CAR original. De manera deseable, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la porción funcional, por ejemplo, reconocen las células diana, detectan el cáncer, tratan o previenen el cáncer, etc. De manera más deseable, los aminoácidos adicionales mejoran la actividad biológica del CAR, en comparación con la actividad biológica del CAR original.
La divulgación también proporciona variantes funcionales del CAR de la invención. El término “variante funcional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un CAR, a un polipéptido o a una proteína que tiene una identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con el CAR de la invención, variante funcional que retiene la actividad biológica del CAR del cual es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del CAR descritas en el presente documento (el CAR original) que retienen la capacidad de reconocer células diana en un grado similar, en el mismo grado o en un grado mayor que el CAR original. En referencia a una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR original, una secuencia de ácido nucleico que codifica para una variante funcional del CAR puede ser, por ejemplo, aproximadamente un 10% idéntica, aproximadamente un 25% idéntica, aproximadamente un 30% idéntica, aproximadamente un 50% idéntica, aproximadamente un 65% idéntica, aproximadamente un 80% idéntica, aproximadamente un 90% idéntica, aproximadamente un 95% idéntica o aproximadamente un 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR original.
Una variante funcional puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del CAR de la invención con al menos una sustitución conservadora de aminoácidos. La expresión “sustitución conservadora de aminoácidos” o “mutación conservadora” se refiere al reemplazo de un aminoácido por otro aminoácido con una propiedad común. Una forma funcional de definir propiedades comunes entre aminoácidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de cambios de aminoácidos entre proteínas correspondientes de organismos homólogos (Schulz, G. E. y Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, Nueva York (1979)). Según tales análisis, pueden definirse grupos de aminoácidos en los que los aminoácidos dentro de un grupo se intercambian preferentemente entre sí y, por tanto, se parecen más entre sí en su impacto sobre la estructura general de la proteína (Schulz, G. E. y Schirmer, R. H., citado anteriormente). Los ejemplos de mutaciones conservadoras incluyen sustituciones de aminoácidos de aminoácidos dentro del mismo subgrupo de aminoácidos, por ejemplo, lisina por arginina y viceversa, de manera que pueda mantenerse una carga positiva; ácido glutámico por ácido aspártico y viceversa, de manera que pueda mantenerse una carga negativa; serina por treonina, de manera que pueda mantenerse un -OH libre; y glutamina por asparagina, de manera que pueda mantenerse un -NH2 libre.
Alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del CAR original con al menos una sustitución no conservadora de aminoácidos. Las “mutaciones no conservadoras” implican sustituciones de aminoácidos entre diferentes grupos, por ejemplo, lisina por triptófano o fenilalanina por serina, etc. En este caso, es preferible que la sustitución no conservadora de aminoácidos no interfiera o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. La sustitución no conservadora de aminoácidos puede potenciar la actividad biológica de la variante funcional, de manera que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con el CAR original.
El CAR dado a conocer (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales del mismo) puede comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos que se producen de manera natural. En la técnica se conocen tales aminoácidos sintéticos, e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexanocarboxílico, norleucina, ácido a-amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3-hidroxiprolina y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina, p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolin-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida de ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metillisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentanocarboxílico, ácido aaminociclohexanocarboxílico, ácidoa-aminocicloheptanocarboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido aj-diaminobutírico, ácidoa,p-diaminopropiónico, homofenilalanina ya-terc-butilglicina.
El CAR de la invención (así como las porciones funcionales y las variantes funcionales del mismo dadas a conocer) pueden glicosilarse, amidarse, carboxilarse, fosforilarse, esterificarse, N-acilarse, ciclarse a través de, por ejemplo, un puente disulfuro, o convertirse en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizarse o polimerizarse, o conjugarse.
La invención también proporciona un CAR dirigido a cualquier molécula diana de interés (es decir, comprende cualquier resto de reconocimiento de antígeno) que puede comprender (i) un espaciador extracelular de CD8a, (ii) un dominio transmembrana de una molécula CD8a humana y (iii) dominios de señalización de células T intracelulares de (a) una o ambas de una molécula CD28 humana y una molécula CD27 humana y (b) una molécula CD3 hûmana (tal como se emplea en el CAR de SEQ ID NO: 4). En otra realización, el CAR de la invención puede comprender (i) un espaciador extracelular de CD8a, (ii) un dominio transmembrana de una molécula CD8a humana y (iii) dominios de señalización de células T intracelulares de (a) una o ambas de una molécula CD28 humana y una molécula CD27 humana y (b) la cadena gamma de FceRI (tal como se emplea en el CAR de SEQ ID NO: 10). En aún otra realización, el CAR de la invención puede comprender (i) un espaciador extracelular de CD8a, (ii) un dominio transmembrana de una molécula CD8a humana y (iii) dominios de señalización de células T intracelulares de una molécula CD28 humana y la cadena gamma de FceRI (tal como se emplea en el CAR de SEQ ID NO: 12).
El CAR de la invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13.
El CAR de la invención puede generarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico, los polipéptidos y las proteínas pueden producirse de manera recombinante usando la metodología de ADN recombinante convencional (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons, NY, 1994). Además, una secuencia de ácido nucleico producida de manera sintética que codifica para el CAR puede obtenerse a partir de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto o un mamífero, por ejemplo, una rata, un ser humano, etc. En la técnica se conocen bien los métodos de obtención. Alternativamente, las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden sintetizarse comercialmente. A este respecto, la secuencia de ácido nucleico puede ser sintética, recombinante, aislada y/o purificada.
La invención también proporciona un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR de la invención. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un vector viral (por ejemplo, retroviral o adenoviral) o un fago. En la técnica se conocen vectores adecuados y métodos de preparación de vectores (véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente, y Ausubel et al., citado anteriormente,).
Además de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR de la invención, el vector comprende preferiblemente secuencias de control de la expresión, tales como promotores, potenciadores, señales de poliadenilación, terminadores de la transcripción, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) y similares, que proporcionan la expresión de la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped. En la técnica se conocen secuencias de control de la expresión a modo de ejemplo, y se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).
En la técnica se conoce bien un gran número de promotores, incluyendo promotores constitutivos, inducibles y reprimibles, a partir de una variedad de fuentes diferentes. Las fuentes representativas de promotores incluyen, por ejemplo, virus, mamífero, insecto, planta, levadura y bacterias, y los promotores adecuados a partir de estas fuentes están fácilmente disponibles, o pueden fabricarse de manera sintética, basándose en secuencias disponibles al público, por ejemplo, a partir de depósitos tales como la ATCC, así como otras fuentes comerciales o individuales. Los promotores pueden ser unidireccionales (es decir, inician la transcripción en una dirección) o bidireccionales (es decir, inician la transcripción en una dirección 3' ó 5'). Los ejemplos no limitativos de promotores incluyen, por ejemplo, el sistema de expresión bacteriano T7, el sistema de expresión bacteriano pBAD (araA), el promotor del citomegalovirus (CMV), el promotor de VS40 y el promotor de VSR. Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo, el sistema Tet (patentes estadounidenses 5.464.758 y 5.814.618), el sistema inducible por ecdisona (No et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351 (1996)), el sistema T-REX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), el sistema LACSWITCH™ (Stratagene, San Diego, CA) y el sistema de recombinasa inducible por tamoxifeno de Cre-ERT (Indra et al., Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); patente estadounidense 7.112.715; y Kramer y Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144 (2005)).
El término “potenciador”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ADN que aumenta la transcripción de, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico a la que está unida operativamente. Los potenciadores pueden ubicarse a muchas kilobases de la región codificante de la secuencia de ácido nucleico y pueden mediar en la unión de factores reguladores, patrones de metilación del ADN o cambios en la estructura del ADN. En la técnica se conoce bien un gran número de potenciadores a partir de una variedad de fuentes diferentes y están disponibles como o dentro de polinucleótidos clonados (de, por ejemplo, depósitos tales como la ATCC, así como de otras fuentes comerciales o individuales). Varios polinucleótidos que comprenden promotores (tales como el promotor de CMV usado comúnmente) también comprenden secuencias potenciadoras. Los potenciadores pueden ubicarse en el sentido de 5', dentro o en el sentido de 3' de las secuencias codificantes. El término “potenciadores de Ig” se refiere a elementos potenciadores derivados de regiones potenciadoras mapeadas dentro del locus de inmunoglobulina (Ig) (tales potenciadores incluyen, por ejemplo, los potenciadores 5' de cadena pesada (mu), potenciadores 5' de cadena ligera (kappa), potenciadores intrónicos kappa y mu, y potenciadores 3' (véanse, en general, Paul W.E. (ed), Fundamental Immunology, 3a edición, Raven Press, Nueva York (1993), páginas 353­ 363; y la patente estadounidense 5.885.827).
El vector también puede comprender un “gen marcador seleccionable”. El término “gen marcador seleccionable”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico que permite que las células que expresan la secuencia de ácido nucleico se seleccionen específicamente a favor o en contra, en presencia de un agente selectivo correspondiente. En la técnica se conocen genes marcadores seleccionables adecuados, y se describen, por ejemplo, en las publicaciones de solicitudes de patentes internacionales WO 1992/08796 y WO 1994/28143; Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981); Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150: 1 (1981); Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984); Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977); Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962); Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980); y las patentes estadounidenses 5.122.464 y 5.770.359.
En algunas realizaciones, el vector es un “vector de expresión episómico” o “episoma”, que puede replicarse en una célula huésped y persiste como un segmento extracromosómico de ADN dentro de la célula huésped en presencia de una presión selectiva apropiada (véase, por ejemplo, Conese et al., Gene Therapy, 11: 1735-1742 (2004)). Los vectores de expresión episómicos disponibles comercialmente representativos incluyen, pero no se limitan a, plásmidos episómicos que utilizan el antígeno nuclear 1 de Epstein Barr (EBNA1) y el origen de replicación del virus de Epstein Barr (VEB) (oriP). Los vectores pREP4, pCEP4, pREP7 y pcDNA3.1 de Invitrogen (Carlsbad, CA) y pBK-CMV de Stratagene (La Jolla, CA) representan ejemplos no limitativos de un vector episómico que usa antígeno de células T y el origen de replicación de VS40 en lugar de EBNA1 y oriP.
Otros vectores adecuados incluyen vectores de expresión integrantes, que pueden integrarse de manera aleatoria en el ADN de la célula huésped o pueden incluir un sitio de recombinación para permitir la recombinación específica entre el vector de expresión y el cromosoma de la célula huésped. Tales vectores de expresión integrantes pueden utilizar las secuencias de control de la expresión endógenas de los cromosomas de la célula huésped para efectuar la expresión de la proteína deseada. Los ejemplos de vectores que se integran de una manera específica del sitio incluyen, por ejemplo, componentes del sistema flp-in de Invitrogen (Carlsbad, CA) (por ejemplo, pcDNA™5/FRT) o el sistema cre-lox, tal como pueden encontrarse en los vectores pExchange-6 Core de Stratagene (La Jolla, CA). Los ejemplos de vectores que se integran de manera aleatoria en los cromosomas de la célula huésped incluyen, por ejemplo, pcDNA3.1 (cuando se introduce en ausencia de antígeno de células T) de Invitrogen (Carlsbad, CA) y pCI o pFN10A (ACT) FLEXI™ de Promega (Madison, WI).
También pueden usarse vectores virales. Los vectores de expresión viral representativos incluyen, pero no se limitan a, los vectores basados en adenovirus (por ejemplo, el sistema Per.C6 basado en adenovirus disponible de Crucell, Inc. (Leiden, Países Bajos)), vectores basados en lentivirus (por ejemplo, el pLP1 basado en lentivirus de Life Technologies (Carlsbad, CA)) y vectores retrovirales (por ejemplo, el pFB-ERV más pCFB-EGSH de Stratagene (La Jolla, CA)). En una realización preferida, el vector viral es un vector de lentivirus.
El vector que comprende un ácido nucleico que codifica para el CAR de la invención puede introducirse en una célula huésped que pueda expresar el CAR, incluyendo cualquier célula procariota o eucariota adecuada. Las células huésped preferidas son aquellas que pueden hacerse crecer de forma fácil y fiable, tienen tasas de crecimiento razonablemente rápidas, tienen sistemas de expresión bien caracterizados y pueden transformarse o transfectarse de forma fácil y eficaz.
Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión. La célula huésped puede ser una célula eucariota, por ejemplo, una planta, un animal, hongos o algas, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacterias o protozoos. La célula huésped puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente a partir de un organismo, por ejemplo, un ser humano. La célula huésped puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. En la técnica se conocen células huésped adecuadas, e incluyen, por ejemplo, células de E. coli DH5a, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Con el fin de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula huésped puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5a. Con el fin de producir un CAR recombinante, la célula huésped puede ser una célula de mamífero. Preferiblemente, la célula huésped es una célula humana. La célula huésped puede ser de cualquier tipo de célula, puede originarse a partir de cualquier tipo de tejido y puede estar en cualquier fase de desarrollo. La célula huésped también puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL), una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC), un linfocito citolítico natural (NK) o una célula T. Preferiblemente, la célula huésped es una célula T. En la técnica se conocen métodos para seleccionar células huésped de mamífero adecuadas y métodos para la transformación, el cultivo, la amplificación, el cribado y la purificación de células.
La invención proporciona una célula T que comprende un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR de la invención descrito en el presente documento. La célula T de la invención puede ser cualquier célula T, tal como una célula T cultivada, por ejemplo, una célula T primaria, o una célula T de una línea de células T cultivadas, o una célula T obtenida a partir de un mamífero. Si se obtiene a partir de un mamífero, la célula T puede obtenerse a partir de numerosas fuentes, incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, timo u otros tejidos o fluidos. Las células T también pueden enriquecerse o purificarse. La célula T es preferiblemente una célula T humana (por ejemplo, aislada de un ser humano). La célula T puede estar en cualquier fase de desarrollo, incluyendo, pero sin limitarse a, una célula T doble positiva CD4+/CD8+, una célula T auxiliar CD4+, por ejemplo, células Th1 y Th2, una célula T CD8+ (por ejemplo, una célula T citotóxica), una célula infiltrante de tumor, una célula T de memoria, una célula T indiferenciada, y similares. En una realización, la célula T es una célula T CD8+ o una célula T CD4+. Las líneas de células T están disponibles, por ejemplo, de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA) y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ), e incluyen, por ejemplo, células Jurkat (ATCC TIB-152), células Sup-T1 (ATCC CRL-1942), células RPMI 8402 (DSMZ ACC-290), células Karpas 45 (DSMZ ACC-545) y derivados de las mismas.
Una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR de la invención puede introducirse en una célula mediante “transfección”, “transformación” o “transducción”. Los términos “transfección”, “transformación” o “transducción”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a la introducción de uno o más polinucleótidos exógenos en una célula huésped mediante el uso de métodos físicos o químicos. En la técnica se conocen muchas técnicas de transfección, e incluyen, por ejemplo, la coprecipitación de ADN con fosfato de calcio (véase, por ejemplo, Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-dextrano; electroporación; transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Pueden introducirse fagos o vectores virales en las células huésped después del crecimiento de partículas infecciosas en células de empaquetamiento adecuadas, muchas de las cuales están disponibles comercialmente.
Sin estar ligado a una teoría o un mecanismo particular, se cree que provocando una respuesta específica de antígeno contra CD19, los CAR de la invención proporcionan uno o más de lo siguiente: seleccionar como diana y destruir células cancerosas que expresan CD19, reducir o eliminar células cancerosas, facilitar la infiltración de células inmunitarias al/a los sitio(s) tumoral(es) y mejorar/aumentar las respuestas anticancerígenas. Por tanto, la invención proporciona un método de destrucción de células B malignas in vitro, que comprende poner en contacto una o más de las células T mencionadas anteriormente con una población de células B malignas que expresan CD19, mediante lo cual el CAR se une a CD19 en las células B malignas y se destruyen las células B malignas. Tal como se comentó anteriormente, el tratamiento de neoplasias malignas de células B implica normalmente quimioterapia, anticuerpos monoclonales terapéuticos y trasplante alogénico de células madre; sin embargo, es común una alta tasa de recaída en pacientes que se han sometido a tal tratamiento. Tal como se comentó anteriormente, CD19 se expresa altamente por células B malignas (véase, por ejemplo, Nadler et al., citado anteriormente,). Las neoplasias malignas de células B maduras incluyen, pero no se limitan a, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de Burkitt, mieloma múltiple, linfoma difuso de células B grandes, linfoma de Hodgkin, linfoma linfoplasmacítico, linfoma de zona marginal y leucemia linfocítica crónica (Shaffer et al., citado anteriormente).
Una o más células T que comprenden un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un CAR anti-CD 19 de la invención descrito en el presente documento pueden ponerse en contacto con una población de células B malignas que expresan CD19 ex vivo, in vivo o in vitro. “Ex vivo" se refiere a métodos realizados dentro o sobre células o tejidos en un ambiente artificial fuera de un organismo con mínima alteración de las condiciones naturales. Por el contrario, el término “in vivo" se refiere a un método que se realiza dentro de organismos vivos en su estado normal e intacto, mientras que un método “in vitro" se realiza usando componentes de un organismo que se han aislado de su contexto biológico habitual. El método dado a conocer implica preferiblemente componentes ex vivo e in vivo. A este respecto, por ejemplo, las células T descritas anteriormente pueden cultivarse ex vivo en condiciones para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR anti-CD 19 de la invención, y luego se transfieren directamente a un mamífero (preferiblemente un ser humano) afectado por una neoplasia maligna de células B. Un método de transferencia celular de este tipo se denomina en la técnica “transferencia celular adoptiva (ACT)”, en el que las células derivadas del sistema inmunitario se transfieren de forma pasiva a un nuevo huésped receptor para transferir la funcionalidad de las células derivadas del sistema inmunitario del donante al nuevo huésped. En la técnica se conocen métodos de transferencia celular adoptiva para tratar diversos tipos de cánceres, incluyendo los cánceres hematológicos tales como las neoplasias malignas de células B, y se dan a conocer, por ejemplo, en Gattinoni et al., Nat. Rev. Immunol., 6(5): 383-393 (2006); June, CH, J. Clin. Invest., 117(6): 1466-76 (2007); Rapoport et al., Blood, 117(3): 788-797 (2011); y Barber et al., Gene Therapy, 18: 509-516 (2011)).
Cuando se administran células T a un mamífero, las células pueden ser alogénicas o autólogas del mamífero. En los métodos de administración “autólogos”, las células (por ejemplo, linfocitos o células madre hematopoyéticas) se extraen de un mamífero, se almacenan (y opcionalmente se modifican) y se devuelven al mismo mamífero. En los métodos de administración “alogénicos”, un mamífero recibe células (por ejemplo, linfocitos o células madre hematopoyéticas) de un donante genéticamente similar, pero no idéntico. Preferiblemente, las células son autólogas del mamífero.
De manera deseable, las células T se administran a un ser humano en forma de una composición, tal como una composición farmacéutica. Alternativamente, una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR de la invención, o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR, puede formularse en una composición, tal como una composición farmacéutica, y administrarse a un ser humano. La composición farmacéutica dada a conocer puede comprender una población de células T que expresa el CAR de la invención. Además de una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR de la invención, o las células huésped que expresan el CAR de la invención, la composición farmacéutica puede comprender otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterápicos, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende una célula T aislada que expresa el CAR de la invención, más preferiblemente una población de células T que expresa el CAR de la invención.
Las células T de la invención pueden proporcionarse en forma de una sal, por ejemplo, una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen las derivadas de ácidos minerales, tales como ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, tales como ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo, ácido p-toluenosulfónico.
La elección del portador se determinará en parte por el CAR de la invención particular, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR, el vector o las células huésped que expresan el CAR, así como por el método particular usado para administrar el CAR de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR, el vector o las células huésped que expresan el CAR. Por consiguiente, existe una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la divulgación. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sodio y cloruro de benzalconio. Opcionalmente, puede usarse una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o las mezclas de los mismos están normalmente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,0001% a aproximadamente el 2% en peso de la composición total.
Además, pueden usarse agentes tamponantes en la composición. Los agentes tamponantes adecuados incluyen, por ejemplo, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido fosfórico, fosfato de potasio y diversos otros ácidos y sales. Opcionalmente, puede usarse una mezcla de dos o más agentes tamponantes. El agente tamponante o las mezclas de los mismos están normalmente presentes en una cantidad de aproximadamente el 0,001% a aproximadamente el 4% en peso de la composición total.
Los expertos en la técnica conocen métodos para preparar composiciones administrables (por ejemplo, administrables por vía parenteral), y se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: The Science And Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21a ed. (2005).
La composición que comprende el CAR de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR, el vector o las células huésped que expresan el CAR pueden formularse como un complejo de inclusión, tal como un complejo de inclusión de ciclodextrina, o como un liposoma. Los liposomas pueden servir para dirigir las células huésped (por ejemplo, células T o linfocitos citolíticos naturales) o la secuencia de ácido nucleico de la invención a un tejido particular. Los liposomas también pueden usarse para aumentar la semivida de la secuencia de ácido nucleico de la invención. Existen muchos métodos disponibles para preparar liposomas, tales como los descritos en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980) y las patentes estadounidenses 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.
La composición puede emplear sistemas de administración de liberación prolongada, de liberación retardada y de liberación sostenida, de manera que la administración de la composición dada a conocer se produzca antes y con tiempo suficiente para provocar la sensibilización del sitio que va a tratarse. Están disponibles muchos tipos de sistemas de administración de liberación y se conocen por los expertos en la técnica. Tales sistemas pueden evitar administraciones repetidas de la composición, aumentando así la conveniencia para el sujeto y el médico, y pueden ser particularmente adecuados para determinadas realizaciones de la composición de la divulgación.
De manera deseable, la composición comprende las células huésped que expresan una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR de la invención o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de este tipo, en una cantidad que es eficaz para tratar o prevenir una neoplasia maligna de células B. Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratamiento”, “tratar” y similares se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. Preferiblemente, el efecto es terapéutico, es decir, el efecto cura parcial o completamente una enfermedad y/o un síntoma adverso atribuible a la enfermedad. Con este fin, el método dado a conocer comprende administrar una “cantidad terapéuticamente eficaz” de la composición que comprende las células huésped que expresan el CAR de la invención o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar según factores tales como el estadio de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad del CAR de provocar una respuesta deseada en el individuo. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz del CAR de la invención es una cantidad que se une a CD19 en células de mieloma múltiple y las destruye.
Alternativamente, el efecto farmacológico y/o fisiológico puede ser profiláctico, es decir, el efecto previene total o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma. A este respecto, el método dado a conocer comprende administrar una “cantidad profilácticamente eficaz” de la composición que comprende las células huésped que expresan el CAR de la invención o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR a un mamífero con predisposición a una neoplasia maligna de células B. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, en las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado profiláctico deseado (por ejemplo, prevención de la aparición de la enfermedad).
Una cantidad típica de células huésped administrada a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) puede estar, por ejemplo, en el intervalo de un millón a 100.000 millones de células; sin embargo, las cantidades por debajo o por encima de este intervalo a modo de ejemplo están dentro del alcance de la divulgación. Por ejemplo, la dosis diaria de células huésped de la invención puede ser de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 50.000 millones de células (por ejemplo, aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1000 millones de células, aproximadamente 5.000 millones de células, aproximadamente 20.000 millones de células, aproximadamente 30.000 millones de células, aproximadamente 40.000 millones de células, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores), preferiblemente de aproximadamente 10 millones a aproximadamente 100.000 millones de células (por ejemplo, aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 30 millones de células, aproximadamente 40 millones de células, aproximadamente 60 millones de células, aproximadamente 70 millones de células, aproximadamente 80 millones de células, aproximadamente 90 millones de células, aproximadamente 10.000 millones de células, aproximadamente 25.000 millones de células, aproximadamente 50.000 millones de células, aproximadamente 75.000 millones de células, aproximadamente 90.000 millones de células, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores), más preferiblemente de aproximadamente 100 millones de células a aproximadamente 50.000 millones de células (por ejemplo, aproximadamente 120 millones de células, aproximadamente 250 millones de células, aproximadamente 350 millones de células, aproximadamente 450 millones de células, aproximadamente 650 millones de células, aproximadamente 800 millones de células, aproximadamente 900 millones de células, aproximadamente 3.000 millones de células, aproximadamente 30.000 millones de células, aproximadamente 45.000 millones de células, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores).
La eficacia terapéutica o profiláctica puede monitorizarse mediante la evaluación periódica de los pacientes tratados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo del estado, el tratamiento se repite hasta que se produce la supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otras pautas posológicas pueden ser útiles y están dentro del alcance de la divulgación. La dosificación deseada puede administrarse mediante la administración de un bolo individual de la composición, mediante múltiples administraciones en bolo de la composición o mediante la administración por infusión continua de la composición.
La composición que comprende las células huésped que expresan el CAR de la invención o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR puede administrarse a un mamífero usando técnicas de administración convencionales, incluyendo administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorios. Preferiblemente, la composición es adecuada para administración parenteral. El término “parenteral”, tal como se usa en el presente documento, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. Más preferiblemente, la composición se administra a un mamífero usando administración sistémica periférica mediante inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.
La composición que comprende las células huésped que expresan el CAR de la invención o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR puede administrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales, que pueden administrarse conjuntamente al mamífero. Por “administración conjunta” se entiende la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales y la composición que comprende las células huésped de la invención o el vector de la invención lo suficientemente próximas en el tiempo para que el CAR de la invención pueda mejorar el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. A este respecto, la composición que comprende las células huésped de la invención o el vector de la invención puede administrarse en primer lugar, y el uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse en segundo lugar, o viceversa. Alternativamente, la composición que comprende las células huésped de la invención o el vector de la invención y el uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse simultáneamente. Un ejemplo de un agente terapéutico que puede administrarse conjuntamente con la composición que comprende las células huésped de la invención o el vector de la invención es IL-2.
Una vez que se administra la composición que comprende células huésped que expresan el CAR de la invención o un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el CAR a un mamífero (por ejemplo, un ser humano), la actividad biológica del CAR puede medirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Según el método dado a conocer, el CAR se une a CD19 en las células B malignas y se destruyen las células B malignas. La unión del CAR a CD19 en las células B malignas de la superficie puede someterse a ensayo usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ELISA y citometría de flujo. La capacidad del CAR de destruir células B malignas puede medirse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como los ensayos de citotoxicidad descritos en, por ejemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), y Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). La actividad biológica del CAR también puede medirse sometiendo a ensayo la expresión de determinadas citocinas, tales como CD107a, IFNy, IL-2 y TNF.
Un experto en la técnica apreciará fácilmente que el CAR, tal como se describe en el presente documento, puede modificarse de varias formas, de manera que la eficacia terapéutica o profiláctica del CAR se aumenta a través de la modificación. Por ejemplo, el CAR puede conjugarse directa o indirectamente a través de un ligador con un resto de direccionamiento. En la técnica se conoce la práctica de conjugación de compuestos, por ejemplo, el CAR, con restos de direccionamiento. Véanse, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995), y la patente estadounidense 5.087.616.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención
Ejemplo 1
Este ejemplo demuestra métodos para generar los receptores de antígeno quiméricos (CAR) anti-CD 19 de la invención.
Se diseñaron y sintetizaron una serie de CAR anti-CD 19. Todos los CAR contenían un dominio de reconocimiento de antígeno que se componía de un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) derivado de o bien el anticuerpo monoclonal murino FMC63 (Nicholson et al., Molecular Immunology, 34(16-17): 1157-1165 (1997)) o bien el anticuerpo monoclonal completamente humano 47G4 (publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0104509). Los CAR comprendían una secuencia señal del receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) humano, o una secuencia señal de la molécula CD8 humana. Los CAR contenían una combinación de dos o más dominios de señalización de células T intracelulares (o “dominios coestimuladores”) derivados de la molécula CD3 zeta (CD3Q humana, la molécula CD28 humana, la molécula 4-1BB humana, la molécula CD27 humana y/o la cadena gamma de FccRI.
Más específicamente, se construyó un plásmido denominado FMC63-CD828Z, que codifica para un CAR que comprende un scFv derivado de FMC63, una secuencia de señal del receptor de GM-CSF, componentes extracelulares y transmembrana de CD8 y dominios de señalización de células T intracelulares de las moléculas CD3^ y CD28 humanas usando el plásmido MSGV-FMC63-28Z (descrito en Kochenderfer et al., Journal of Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)) como material de partida. Se escindió en primer lugar el plásmido MSGV-FMC63-28Z con las enzimas de restricción NotI y BmgBI (New England Biolabs, Ipswich, MA), que eliminó toda la porción de CD28 de este plásmido. A continuación, se ligó un fragmento de ADN (sintetizado por Invitrogen, Carlsbad, CA) que codifica para parte de la región extracelular y toda la región transmembrana de la molécula CD8 humana, la porción citoplásmica de la molécula CD28 y la parte citoplásmica de la molécula CD3^ en el plásmido MSGV-FMC63-28Z escindido. Las secuencias de CD8, CD28 y CD3^ humanas se obtuvieron del sitio web del Centro Nacional para la Información Biotecnológica. Las instrucciones con respecto a las porciones de cada molécula para incluir en los CAR se obtuvo de Kochenderfer et al., Journal of Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009).
Se generaron CAR anti-CD 19 completamente humanos mediante la utilización de secuencias del anticuerpo monoclonal 47G4 completamente humano (descrito en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0104509). Se generó el anticuerpo 47G4 vacunando ratones de la raza KM, que portan un transgén de cadena ligera kappa humana y un transcromosoma de cadena pesada humana. Las secuencias de las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo 47G4 se obtuvieron de la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0104509. Se diseñó un scFv de 47G4 que comprendía los siguientes elementos desde 5' hasta 3': una secuencia señal de CD8, la región variable de cadena ligera del anticuerpo 47G4, un péptido ligador que comprende la secuencia de aminoácidos GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 14) (véase Cooper et al., Blood, 101(4): 1637-1644 (2003)) y la región variable de cadena pesada del anticuerpo 47G4. Luego se diseñó una secuencia de ADN que codifica para un CAR que comprendía los siguientes componentes desde 5' hasta 3': el scFv de 47G4 descrito anteriormente, parte de la región extracelular y toda la región transmembrana de la molécula CD8 humana y las porciones citoplásmicas de la molécula CD28 humana y la molécula CD3^ humana. Este CAR se denominó 47G4-CD828Z y la secuencia se sintetizó por Invitrogen (Carlsbad, CA).
Usando métodos convencionales, se modificó el plásmido lentiviral pRRLSIN.cPPT.MSCV.coDMF5.oPRE (descrito en Yang et al., Journal of Immunotherapy, 33(6): 648-658 (2010)) para reemplazar la porción coDMF5 del plásmido por la secuencia del CAR 47G4-CD828Z descrita anteriormente. El plásmido resultante se denominó LSIN-47G4-CD8CD28Z.
Se construyó un plásmido denominado MSGV-47G4-CD8BBZ modificando el plásmido MSGV-FMC63-CD828Z descrito anteriormente usando métodos convencionales. El plásmido MSGV-47G4-CD8BBZ codifica para un CAR denominado 47G4-CD8BBZ que comprende, desde 5' hasta 3': el scFv de 47G4 descrito anteriormente, parte de la región extracelular y toda la región transmembrana de la molécula CD8 humana, una porción de la molécula 4-1BB humana (CD137) que comprende la secuencia de aminoácidos RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 15) y la porción citoplásmica de la molécula CD3^.
Se construyó un plásmido denominado MSGV-FMC63-CD8BBZ que codifica para un CAR denominado CAR FMC63-CD8BBZ reemplazando la secuencia de CD28 del plásmido MSGV-FMC63-CD828Z por la misma secuencia de 4-1BB incluida en MSGV-47G4-CD8BBZ.
Se ligó el ADN que codifica para un scFv de SP6 (Ochi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(20):6351-6355 (1983)) en el vector retroviral MSGV-FMC63-CD828Z después de la escisión del ADN que codifica para el scFv de Fm C63 para formar el MSGV-SP6-CD828Z, que reconoció el ácido hapteno-2,4,6-trinitrobencenosulfónico y sirvió como control negativo en algunos experimentos.
Todos los CAR anti-CD 19 generados usando los métodos descritos anteriormente se muestran en la tabla 1.
Tabla 1
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Los resultados de este ejemplo demuestran la generación de CAR anti-CD 19 basados en un anticuerpo monoclonal anti-CD 19 completamente humano y un anticuerpo monoclonal anti-CD 19 murino.
Ejemplo 2
Este ejemplo demuestra un método de generación de células T que expresan secuencias de ácido nucleico que codifican para los CAR de la invención.
Se produjeron gammaretrovirus o lentivirus incompetentes para la replicación que codifican para los CAR descritos anteriormente y se usaron para transducir células T. Para producir de manear transitoria gammaretrovirus incompetentes para la replicación, se transfectaron células de empaquetamiento 293GP (Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90(17): 8033-8037 (1993)) con plásmidos que codifican para los CAR descritos en el ejemplo 1 junto con un plásmido que codifica para la proteína de la envuelta RD114 (Porter et al., Human Gene Therapy, 7(8): 913-919 (1996)) usando LIPOFECTAMIn E™ 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Se incubaron las células transfectadas a 37°C durante 6-8 horas en medio D10 sin antibióticos. Luego se reemplazó el medio usado para la transfección por medio D10 recién preparado y se incubaron las células durante otras 36-48 horas. Durante y después de la transfección, se cultivaron las células 293GP en placas recubiertas de poli-D-lisina (BD Biosciences, San José, CA). Se retiró de las placas el sobrenadante que contenía los retrovirus y se centrifugó para eliminar los residuos celulares. Se almacenó el sobrenadante a -80°C.
Se produjo el sobrenadante que contenía los lentivirus que codifican para cada uno de los CAR descritos en el ejemplo 1 usando el protocolo descrito en Yang et al., Journal of Immunotherapy, 33(6): 648-658 (2010)).
Se descongelaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se lavaron una vez en medio de células T. Se suspendieron las PBMC a una concentración de 1x106 células/ml en medio de células T que contenía 50 ng/ml del anticuerpo monoclonal anti-CD3 OKT3 (Ortho, Bridgewater, NJ) y 300 Ul/ml de IL-2. Se añadieron veinte ml de esta suspensión a matraces de cultivo de 75 cm2 (Corning, Corning, NY). Se cultivaron los matraces en posición vertical a 37°C y el 5% de CO2 (véase, por ejemplo, Kochenderfer et al., Journal of Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)).
Se llevó a cabo la transducción gammaretroviral de células T disolviendo en primer lugar RETRONECTIN™ (Takara/Clontech Laboratories, Mountain View, CA) a una concentración de 10 g/ml en PBS, y se añadieron dos ml de este RetroNectin™ en disolución de PBS a cada pocillo de placas de 6 pocillos recubiertas sin cultivo de tejido (BD Biosciences). Se incubaron las placas durante 2 horas a temperatura ambiente (TA). Después de la incubación, se aspiró la disolución de RETRONECTIN™ y se añadieron 2 ml de una disolución de bloqueo que consistía en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) más albúmina sérica bovina (BSA) al 2% a cada pocillo recubierto con RETRONECTIN™. Se incubaron las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se aspiró la disolución de bloqueo y se enjuagaron los pocillos con una disolución de HBSS+HEPES al 2,5%. Se descongeló rápidamente el sobrenadante gammaretroviral y se diluyó 1:1 en medio de células T. Luego se añadieron dos ml del sobrenadante diluido a cada pocillo revestido con RETRONECTIN™.
Después de la adición de los sobrenadantes, se centrifugaron las placas a 2000 x g durante 2 horas a 32°C. Luego se aspiró el sobrenadante de los pocillos y se añadieron a cada pocillo 2x106 células T cultivadas con OKT3 e IL-2 durante 2 días. Cuando se añadieron las células T a las placas recubiertas con retrovirus, se suspendieron a una concentración de 0,5x106 células por ml en medio de células T más 300 Ul/ml de IL-2. Después de añadir las células T a cada pocillo, se centrifugaron las placas durante 10 minutos a 1000 x g y se incubaron durante la noche a 37°C. Después de una incubación de 24 a 30 horas, se retiraron las células T de las placas y se suspendieron en medio de células T recién preparado con 300 Ul/ml de IL-2 a una concentración de 0,5x106 células por ml y se cultivaron a 37°C y el 5% de CO2.
Para la transducción lentiviral de células T, se suspendieron PBMC activadas en sobrenadante lentiviral con sulfato de protamina y 300 Ul/ml de IL-2. Se centrifugaron las células durante 1 hora a 1200 x g. Luego se cultivaron las células durante 3 horas a 37°C. A continuación, se diluyó 1:1 el sobrenadante con RPMI (Mediatech, Inc., Manassas, VA) suero bovino fetal al 10% (Invitrogen, Carlsbad, CA) e IL-2. Se cultivaron las células en el sobrenadante diluido durante la noche y luego volvieron a cultivarse en medio AIM V más suero AB humano al 5% con IL-2.
Se evaluó la expresión de los CAR basados en FMC63 en células T transducidas. Específicamente, se lavaron las células T transducidas y se suspendieron en tampón FACS (solución salina tamponada con fosfato (PBS) más azida sódica al 0,1% y BSA al 0,4%). Se añadieron anticuerpos policlonales de cabra anti-F(ab)2 de ratón marcados con biotina (anti-Fab, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) para detectar el scFv de FMC63. Se incubaron las células a 4°C durante 25 minutos y se lavaron una vez. Se suspendieron las células en tampón FACS y se bloquearon con IgG de ratón normal (Invitrogen, Carlsbad, CA). Luego se tiñeron las células con estreptavidina marcada con ficoeritrina (PE) (BD Pharmingen, San Diego, CA), anticuerpo anti-CD4, anticuerpo anti-CD8 y anticuerpo anti-CD3. Se realizó la adquisición de citometría de flujo con un citómetro de flujo LSR II (BD Biosciences) y se realizó el análisis con el software FlowJo (Treestar, Inc. Ashland, OR). Se evaluó la expresión de los CAR basados en 47G4 en células T transducidas usando un método casi idéntico, excepto que se usó proteína L marcada con biotina (GenScript, Piscataway, NJ) en lugar de los anticuerpos policlonales de cabra anti-F(ab)2 de ratón.
Se calculó el porcentaje de células T que expresan CAR (CAR+) como el porcentaje de células T en cultivos transducidos con CAR que se tiñeron con los anticuerpos anti-Fab o la proteína L menos el porcentaje de células T no transducidas cultivadas de manera idéntica del mismo donante que se tiñeron con anticuerpo anti-Fab o proteína L en cada experimento.
El día 7 de cultivo, los porcentajes de células T que expresan CAR que comprenden un scFv derivado del anticuerpo FMC63 murino fueron los siguientes: FMC63-28Z, 71%; FMC63-CD828Z, 88%; y FMC63-CD8BBZ, 87%. Las células T que expresan el CAR FMC63-28Z presentaron una supervivencia in vitro más corta en comparación con las células T que expresan el CAR FMC63-CD828Z o el CAR FMC63-CD8BB en cultivos que contienen IL-2, tal como se muestra en la figura 1. También se detectaron altos niveles de expresión de CAR en células T transducidas con gammaretrovirus que codifican para FMC63-CD828Z, FMC63-CD8BBZ y FMC63-CD827Z.
Los CAR que comprenden un scFv derivado del anticuerpo 47G4 se expresaron a niveles elevados en la superficie de las células T humanas. En particular, las figuras 2A-2D muestran la expresión de CAR basados en 47G4 que comprenden el dominio de señalización intracelular de CD27, mientras que las figuras 3A y 3B muestran la expresión del CAR 47G4-CD828Z.
Los resultados de este ejemplo demuestran que las células T pueden modificarse por ingeniería para expresar los CAR anti-CD 19 de la invención.
Ejemplo 3
Este ejemplo describe una serie de experimentos usados para determinar la especificidad de los CAR de la invención para CD19.
Muestras de pacientes y líneas celulares
Se obtuvieron muestras de PBMC no leucémicas de pacientes con melanoma, leucemia linfocítica crónica (LLC) o linfoma que se inscribieron en protocolos aprobados por la junta de revisión institucional en la Rama de Cirugía del Instituto Nacional del Cáncer (NCI). Se usaron células de 5 pacientes diferentes. El donante 1 tenía LLC, el donante 2 era un donante normal, el donante 3 y el donante 5 tenían linfoma y el donante 4 tenía melanoma. Se crioconservaron las PBMC en FBS al 90% más DMSO al 10% (Sigma, St. Louis, MO). En experimentos que usaron células de LLC primarias como células diana, se usaron PBMC sin manipular de pacientes con LLC. Se usaron las siguientes líneas celulares inmortalizadas que expresan CD19: NALM-6 (leucemia linfoide aguda de la DSMZ, Braunschweig, Alemania) y CD19-K562. Se usaron las siguientes líneas celulares negativas para CD19: A549 (carcinoma de pulmón, de la ATCC), CCRF-CEM (leucemia de células T de la ATCC), MDA231 (carcinoma de mama de la ATCC) y TC71 (sarcoma de Ewing, un amable obsequio del Dr. M. Tsokos, Instituto Nacional del Cáncer, Bethesda, m D). Se mantuvieron todas las líneas celulares en medio R10. Cuando se usaron PBMC de LLC como dianas en los ensayos, se cultivaron las células en medio R10 durante 12-18 horas antes del ensayo.
Ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) de interferón y TNF
La aparición de hipotensión y otras toxicidades en pacientes que recibieron infusiones de células T que expresan el CAR FMC63-28Z en ensayos clínicos impulsó una comparación de la producción de TNF por células T que expresan FMC63-28Z con la producción de TNF por células T que expresan los CAR de la invención.
Se lavaron las células diana y se suspendieron a 1x106 células por ml en medio de células T sin IL-2. Se añadieron 100.000 células diana de cada tipo de célula diana a cada uno de los dos pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Corning, Tewksbury, MA). También se prepararon pocillos que contenían células T solas. Se incubaron las placas a 37°C durante 18-20 horas. Después de la incubación, se realizó un ensayo de ELISA de IFNy o TNF usando métodos convencionales (Pierce, Rockford, IL). En algunos experimentos, se normalizaron los resultados de ELISA de TNF dividiendo los niveles de TNF entre el porcentaje de células T en los cultivos durante la noche que expresan un CAR dado. Se determinó la expresión de CAR tal como se describe en el ejemplo 2.
Cuando se normalizaron para la expresión de CAR en la superficie celular, las células T que expresan FMC63-28Z produjeron consistentemente más Tn F que el CAR FMC-CD828Z y el CAR FMC63-CD8BBZ, tal como se muestra en las figuras 4A y 4B. La única diferencia entre el CAR FMC63-28Z y el CAR FMC63-CD828Z es el reemplazo de los componentes extracelulares y transmembrana de CD28 humana de FMC63-28Z por componentes extracelulares y transmembrana de la proteína CD8 humana en FMC63-CD828Z. La marcada diferencia en la persistencia de las células T y la producción de citocinas inflamatorias entre FMC63-28Z y FMC63-CD828Z condujo al uso del espaciador extracelular de CD8 y componentes transmembrana en los diseños de CAR posteriores.
Las células T transducidas con los CAR anti-CD 19 produjeron grandes cantidades de IFNy cuando se cultivaron durante la noche con la línea celular que expresa CD19 CD19-K562, pero las células T transducidas con CAR solas produjeron niveles de fondo de IFNy cuando se cultivaron con las líneas de la línea celular de control negativo, tal como se indica en las tablas 2 y 3 (todas las unidades son pg/ml de IFNy). En la figura 5 se muestran los resultados del ELISA de IFNy para el CAR 47G4-CD828Z.
Tabla 2
Dianas positivas para CD19 Dianas negativas para CD19
Células CD19-efectoras K562 LLC NGFR- CEM A549 Células T % de células T K562 solas CAR+
47G4-CD8BBZ 33926 10498 5885 6342 8188 5300 90
FMC63-
CD8BBZ 44327 13919 4211 4405 5407 4003 86
Sin transducir <12 1060 16 <12 <12 0
Tabla 3
Dianas positivas para CD19 Dianas negativas para CD19
Células efectoras CD19-K562 LLC NGFR-K562 MDA231 Células T solas
47G4-CD827Z 7435 1833 39 87 37
47G4-CD828Z 13819 1300 22 45 16
47G4-CD828GAMMA 9963 866 19 30 <12
47G4-CD82827Z 11874 2436 32 68 27
47G4-CD82827GAMMA 8351 870 23 46 18
47G4-CD8BBZ 13381 2394 87 175 82
Sin transducir 18 16 16 32 <12 La alta secreción de fondo de IFNy fue una observación consistente con los CAR que contienen un resto de 4-1BB. Las células T transducidas con el CAR FMC63-CD827Z produjeron IFNy de una manera específica de CD19. Se obtuvieron niveles mucho más bajos de IFNy cuando las células FMC63-CD827Z se cultivaron con células NGFR-K562 y CCRF-CEM, que son negativas para CD19. Las células T transducidas con FMC63-CD827Z también produjeron TNF de una manera específica de antígeno.
Ensayo de CD107a
Para cada cultivo de células T que se sometió a prueba, se prepararon dos o tres tubos por separado. Un tubo contenía células CD19-K562, un tubo contenía células de LLC primarias sin manipular y el otro tubo contenía células NGFR-K562. En algunos experimentos, se omitió el tubo de CD19-K562. Todos los tubos contenían células T transducidas con los CAR anti-CD 19 descritos anteriormente, 1 ml de medio AIM V™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) suero humano al 5%, una concentración titulada de un anticuerpo anti-CD 107a (eBioscience, Inc., San Diego, CA; clon eBioH4A3) y 1 |il de Golgi Stop (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Se incubaron todos los tubos a 37°C durante cuatro horas y luego se tiñeron para determinar la expresión de CD3, CD4 y CD8.
Las células T de diferentes sujetos que expresan los CAR FMC63-CD828Z, FMC63-CD827Z, FMC63-CD8BBZ, 47G4-CD827Z, 47G4-CD82827Z, 47G4-CD827BBZ o 47G4-CD8BBZ regularon por incremento CD107a específicamente en respuesta a la estimulación de células diana que expresan CD19, y los resultados del ensayo de CD107a para los CAR 47G4-CD827Z, 47G4-CD82827Z, 47G4-CD827BBZ se muestran en las figuras 6A-6D. Esto indica la aparición de desgranulación específica de CD19 de las células T, que es un requisito previo para la citotoxicidad mediada por perforina (véase, por ejemplo, Rubio et al., Nature Medicine, 9(11): 1377-1382 (2003)). Ensayos de proliferación
Se evaluó la capacidad de las células T transducidas con los CAR anti-CD 19 de proliferar cuando se estimulan con células diana que expresan CD19. Específicamente, se cultivaron conjuntamente 0,5x106 células CD19-K562 irradiadas o 0,5x106 células NGFR-K562 irradiadas con 0,75 x 106 células T totales transducidas con un CAR anti-CD 19. Se marcaron las células T con éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) (Life Technologies, Carlsbad, CA) tal como se describe en Mannering et al., J. Immunological Methods, 283(1-2): 173-183 (2003). El medio usado en los cocultivos fue medio AIM V™ (Life Technologies, Carlsbad, CA) suero AB humano al 5%. No se añadió IL-2 al medio. Cuatro días después del inicio, se contaron las células vivas en cada cocultivo con azul trípano para determinar la exclusión de células muertas y se realizó una citometría de flujo tal como se describe en el ejemplo 2.
Las células T que expresan los CAR FMC63-CD8BBZ, FMC63-CD828Z y 47G4-CD8BBZ presentaron todas una mayor dilución de CFSE cuando se cultivaron con las células CD19-K562 que cuando se cultivaron con células NGFR-K562 de control negativo, tal como se muestra en las figuras 7A-7C. Estos resultados indican que las células T transducidas con los CAR anti-CD 19 proliferaron específicamente cuando se estimularon con células diana que expresan CD19.
Los resultados de este ejemplo demuestran que las células T que expresan los CAR de la invención presentan producción, desgranulación y proliferación de citocinas específicas de c D19.
Ejemplo 4
Este ejemplo demuestra que las células T que expresan un CAR anti-CD 19 de la invención pueden destruir las células de leucemia linfocítica crónica (LLC).
Se realizaron ensayos de citotoxicidad para determinar si las células T transducidas con el CAR FMC63-CD828Z de la invención podían destruir las PBMC sin manipular que expresan CD19 de pacientes con LLC. Específicamente, se midió la citotoxicidad de las células diana comparando la supervivencia de las células diana que expresan CD19 (es decir, PBMC de LLC) en relación con la supervivencia de las células CCRF-CEM de control negativo usando un ensayo descrito en, por ejemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), y Hermans et al., J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004).
Se suspendieron células CCRF-CEM en medio R10 a una concentración de 1,5x106 células/ml, y se añadió el tinte fluorescente 5-(y-6)-(((4-clorometil)benzoil)amino)tetrametilrodamina (CMTMR) (Life Technologies, Carlsbad, CA) a una concentración de 5 M. Se mezclaron las células y luego se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Luego se lavaron las células, se suspendieron en medio de citotoxicidad y se incubaron a 37°C durante 60 minutos. Luego se lavaron las células dos veces y se suspendieron en medio de citotoxicidad. Se suspendieron PBMC de CLL en PBS BSA al 0,1% a 1x106 células/ml. Se añadió el tinte fluorescente éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) (Life Technologies, Carlsbad, CA) a esta suspensión celular a una concentración de 1 M. Se incubaron las células durante 10 minutos a 37°C. Después de la incubación, se detuvo la reacción de marcado añadiendo un volumen de FBS que era igual al volumen de la suspensión celular, y se incubaron las células durante dos minutos a temperatura ambiente. Luego se lavaron las células y se suspendieron en medio de citotoxicidad.
Se combinaron aproximadamente 50.000 PBMC de LLC que expresan CD19 y 50.000 células CCRF-CEM en los mismos tubos con diferentes números de células T transducidas con CAR. En todos los experimentos, se comparó la citotoxicidad de las células T efectoras que se transdujeron con el CAR FMC63-CD828Z con la citotoxicidad de las células T efectoras de control negativo del mismo sujeto que se transdujeron con el CAR de control SP6-28Z o no se transdujeron. Se establecieron cocultivos en tubos de ensayo estériles de 5 ml (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) por duplicado en las siguientes razones de células T:células diana: 20:1, 6,7:1, 2,2 y 0,7:1. Se incubaron los cultivos durante cuatro horas a 37°C. Inmediatamente después de la incubación, se añadió 7-aminoactinomicina D (7AAD; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) según lo recomendado por el fabricante y se realizó la adquisición de citometría de flujo con un dispositivo BD FacsCanto II (BD Biosciences). Se realizó el análisis con el software FlowJo (Treestar, Inc. Ashland, OR). Se seleccionó el análisis en células negativas para 7AAD (vivas), y se determinaron los porcentajes de células diana de LLC vivas y células CCRF-CEM de control negativo vivas para cada cultivo de células T más células diana.
Para cada cultivo, se determinó el porcentaje de supervivencia de PBMC de LLC dividiendo el porcentaje de PBMC de LLC vivas entre el porcentaje de células CCRF-CEM de control negativo vivas. Se calculó el porcentaje de supervivencia corregido de PBMc de LLC dividiendo el porcentaje de supervivencia de PBMC de LLC en cada cultivo de células T más células diana entre la razón del porcentaje de células diana de LLC:porcentaje de células CCRF-CEM de control negativo en tubos que contenían sólo células diana de LLC y células CCRF-CEM de control negativo sin células T efectoras. Esta corrección fue necesaria para tener en cuenta la variación en el número de células iniciales y la muerte espontánea de las células diana. Se calculó la citotoxicidad como el porcentaje de citotoxicidad de PBMC de LLC = 100-porcentaje de supervivencia corregido de PBMC de LLC. Para todas las razones efectoras:diana, se determinó la citotoxicidad por duplicado y se promediaron los resultados.
En la figura 8 se muestran los resultados del ensayo de citotoxicidad, y demuestran que puede usarse un CAR anti-CD 19 de la invención en un método de destrucción de células B malignas.
Ejemplo 5
Este ejemplo demuestra que las células T que expresan un CAR anti-CD 19 de la invención pueden reducir el crecimiento de tumores de células B malignas en un modelo animal.
Se inyectaron por vía subcutánea a ratones NSG inmunodeprimidos 4 millones de células tumorales CD19+ NALM6. Seis días después, después de que se formaran tumores palpables, se trataron los ratones con una única inyección intravenosa de células T humanas que se habían transducido con un vector de CAR MSGV-FMC63-28Z (descrito en Kochenderfer et al., Journal of Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)) o el vector de CAR LSIN-47G4-CD8CD28Z (descrito en el ejemplo 1). Se midieron los tumores cada tres días y se compararon con los tumores en ratones sin tratar.
Los resultados de este experimento, mostrados en la figura 9, indican que las células T que expresan o bien el CAR FMC63-28Z o bien el CAR 47G4-CD8CD28Z redujeron notablemente el tamaño del tumor en los ratones tratados.
El uso de los términos “un” y “una” y “el/la” y “al menos uno” y referencias similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe interpretarse como que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso del término “al menos uno” seguido por una lista de uno o más elementos (por ejemplo, “al menos uno de A y B”) debe interpretarse como un elemento seleccionado de los elementos enumerados (A o B) o cualquier combinación de dos o más de los elementos enumerados (A y B), a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. Los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan “que incluye, pero sin limitarse a”), a menos que se indique lo contrario. La mención de intervalos de valores en el presente documento está destinada simplemente a servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor por separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor por separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se enumerara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos o expresiones a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionados en el presente documento está destinados simplemente a iluminar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna expresión en la

Claims (10)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Receptor de antígeno quimérico (CAR) dirigido contra CD19, que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13.
  2. 2. CAR según la reivindicación 1, en el que el CAR comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
    10.
  3. 3. Ácido nucleico aislado o purificado que codifica para el CAR según la reivindicación 1 ó 2.
  4. 4. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 3.
  5. 5. Célula T o linfocito citolítico natural aislados que comprenden el vector según la reivindicación 4.
  6. 6. Célula T o linfocito citolítico natural según la reivindicación 5, para su uso en la prevención o el tratamiento de una neoplasia maligna de células B en un sujeto.
  7. 7. Método de destrucción de células B malignas in vitro, método que comprende poner en contacto una o más de las células T o los linfocitos citolíticos naturales según la reivindicación 5 con una población de células B malignas que expresan CD19, mediante lo cual el CAR se une a CD19 en las células B malignas y se destruyen las células B malignas.
  8. 8. Método según la reivindicación 7, en el que las células B malignas son células de linfoma.
  9. 9. Método según la reivindicación 7, en el que las células B malignas son células de leucemia.
  10. 10. Método de elaboración de una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR), comprendiendo el método introducir un vector que codifica para el CAR según la reivindicación 1 ó 2 en una célula T o un linfocito citolítico natural aislados.
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Families Citing this family (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112877291A (zh) 2014-04-10 2021-06-01 西雅图儿童医院 (Dba西雅图儿童研究所) 基因修饰的t细胞产品、其制备方法和用途
EP3149044B1 (en) * 2014-06-02 2020-10-21 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Chimeric antigen receptors targeting cd-19
WO2016149578A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Dual specific anti-cd22-anti-cd19 chimeric antigen receptors
HK1256087A1 (zh) 2015-08-07 2019-09-13 Seattle Children's Hospital, Dba Seattle Children's Research Institute 用於实体瘤靶向的双特异性cart细胞
WO2017070042A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods of producing t cell populations using akt inhibitors
WO2017075451A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting pou2af1
WO2017075465A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses by detecting and targeting gata3
CN105906720A (zh) * 2016-05-16 2016-08-31 武汉汉密顿生物科技股份有限公司 靶向性嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
CN105949324B (zh) * 2016-06-30 2019-08-27 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向gpc3的嵌合抗原受体及其用途
CN105949325B (zh) * 2016-07-08 2019-07-16 重庆精准生物技术有限公司 包含cd27胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体及其应用
CN109843922B (zh) 2016-09-02 2023-10-03 莱蒂恩技术公司 用DuoCAR治疗癌症的组合物和方法
WO2018049025A2 (en) 2016-09-07 2018-03-15 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for evaluating and modulating immune responses
CN107936120B (zh) * 2016-10-13 2021-03-09 上海赛比曼生物科技有限公司 Cd19靶向性的嵌合抗原受体及其制法和应用
CA3049652A1 (en) 2017-01-10 2018-07-19 Intrexon Corporation Modulating expression of polypeptides via new gene switch expression systems
US11963966B2 (en) 2017-03-31 2024-04-23 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating ovarian tumors
US11913075B2 (en) 2017-04-01 2024-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for detecting and modulating an immunotherapy resistance gene signature in cancer
WO2018191553A1 (en) 2017-04-12 2018-10-18 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Tumor signature for metastasis, compositions of matter methods of use thereof
US12226479B2 (en) 2017-05-11 2025-02-18 The General Hospital Corporation Methods and compositions of use of CD8+ tumor infiltrating lymphocyte subtypes and gene signatures thereof
IL270415B2 (en) 2017-05-12 2024-08-01 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for cell engineering and their uses in immuno-oncology
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
JP7656401B2 (ja) 2017-05-15 2025-04-03 アメリカ合衆国 バイシストロン性キメラ抗原受容体及びそれらの使用
CN110997920A (zh) 2017-06-07 2020-04-10 英特拉克森公司 新型细胞标签的表达
WO2018232195A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
WO2019014581A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING THE ACTIVITY OF A CYTOTOXIC LYMPHOCYTE
WO2019030757A1 (en) * 2017-08-09 2019-02-14 Ctg Pharma Ltd. CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR FOR HER2 / NEU AND LYMPHOCYTES T THE EXPRESSANT
US12043870B2 (en) 2017-10-02 2024-07-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for detecting and modulating an immunotherapy resistance gene signature in cancer
US20200316122A1 (en) 2017-10-11 2020-10-08 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Methods of producing t cell populations using p38 mapk inhibitors
WO2019084055A1 (en) 2017-10-23 2019-05-02 Massachusetts Institute Of Technology CLASSIFICATION OF GENETIC VARIATION FROM UNICELLULAR TRANSCRIPTOMS
EP3710039A4 (en) 2017-11-13 2021-08-04 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH
US12171783B2 (en) 2017-11-13 2024-12-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for targeting developmental and oncogenic programs in H3K27M gliomas
EP3730519B1 (en) * 2017-12-22 2023-09-13 AbClon Inc. Antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically recognizes b cell malignancies, chimeric antigen receptor comprising same, and uses thereof
US11994512B2 (en) 2018-01-04 2024-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity
ES3052818T3 (en) 2018-02-09 2026-01-14 Us Health Tethered interleukin-15 and interleukin-21
EP3757133A4 (en) 2018-02-11 2021-12-01 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. ISOLATED ANTIGENIC CHEMICAL RECEPTOR, MODIFIED T LYMPHOCYTE INCLUDING IT AND ASSOCIATED USE
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
WO2019215500A1 (en) 2018-05-11 2019-11-14 Crispr Therapeutics Ag Methods and compositions for treating cancer
IL321548A (en) 2018-05-22 2025-08-01 Immunitybio Inc Recombinant NK cells expressing a chimeric antigen receptor (CAR) for epsilon-FC and uses thereof
WO2019232542A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
US12036240B2 (en) 2018-06-14 2024-07-16 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
CN108841792A (zh) * 2018-06-14 2018-11-20 浙江大学 靶向cd19和ebna1基因修饰的t细胞及其制备方法与应用
CN108864307A (zh) * 2018-07-23 2018-11-23 北京多赢时代科技有限公司 信号肽优化靶向cd19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的t细胞及制备方法和应用
CN110819678A (zh) * 2018-08-07 2020-02-21 上海恒润达生生物科技有限公司 一种评估cart细胞有效性的方法
CA3112584A1 (en) * 2018-09-17 2020-03-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bicistronic chimeric antigen receptors targeting cd19 and cd20 and their uses
WO2020072700A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
WO2020081730A2 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating microenvironment
WO2020092455A2 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Car t cell transcriptional atlas
KR20210125978A (ko) 2018-11-01 2021-10-19 그라셀 바이오테크놀로지스 (상하이) 컴퍼니, 리미티드 T 세포 조작을 위한 조성물 및 방법
WO2020114358A1 (zh) * 2018-12-03 2020-06-11 广东东阳光药业有限公司 Cd19抗体及其应用
CN120005921A (zh) 2018-12-12 2025-05-16 凯德药业股份有限公司 嵌合抗原和t细胞受体及使用的方法
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
CN109734813B (zh) * 2019-01-28 2022-06-17 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
KR20210137085A (ko) 2019-03-05 2021-11-17 엔카르타, 인크. Cd19 유도된 키메라 항원 수용체 및 면역 요법에서 이의 용도
US20220154282A1 (en) 2019-03-12 2022-05-19 The Broad Institute, Inc. Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
RU2742000C2 (ru) * 2019-03-13 2021-02-01 Общество С Ограниченной Ответственностью "Анабион" Выделенный альтернативный внутриклеточный сигнальный домен химерного антигенного рецептора и включающий его химерный антигенный рецептор
WO2020191079A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity
US20220249558A1 (en) * 2019-04-30 2022-08-11 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
CN113784732B (zh) 2019-05-07 2024-03-22 亘喜生物科技（上海）有限公司 靶向bcma的工程化免疫细胞及其用途
WO2020236967A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Random crispr-cas deletion mutant
AU2020307673A1 (en) * 2019-06-27 2022-01-20 Eutilex Co., Ltd. Chimeric antigen receptor with 4-1BB costimulatory domain
US20220249565A1 (en) * 2019-06-27 2022-08-11 Eutilex Co., Ltd. Chimeric antigen receptor with 4-ibb costimulatory domain
BR112021026382A2 (pt) * 2019-06-27 2022-02-08 Crispr Therapeutics Ag Uso de células t de receptor de antígenos quimérico e inibidores de células nk para tratamento de câncer
CN110305849B (zh) * 2019-08-01 2021-03-30 广东万海细胞生物科技有限公司 稳定表达car的t细胞及其制备方法与应用
US20220282333A1 (en) 2019-08-13 2022-09-08 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof
US12421557B2 (en) 2019-08-16 2025-09-23 The Broad Institute, Inc. Methods for predicting outcomes and treating colorectal cancer using a cell atlas
US20220298501A1 (en) 2019-08-30 2022-09-22 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
US12297426B2 (en) 2019-10-01 2025-05-13 The Broad Institute, Inc. DNA damage response signature guided rational design of CRISPR-based systems and therapies
US12394502B2 (en) 2019-10-02 2025-08-19 The General Hospital Corporation Method for predicting HLA-binding peptides using protein structural features
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US12195725B2 (en) 2019-10-03 2025-01-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for modulating and detecting tissue specific TH17 cell pathogenicity
US11793787B2 (en) 2019-10-07 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
IL292329A (en) * 2019-11-13 2022-06-01 Crispr Therapeutics Ag Manufacturing process for making t cells expressing chimeric antigen receptors
US12165747B2 (en) 2020-01-23 2024-12-10 The Broad Institute, Inc. Molecular spatial mapping of metastatic tumor microenvironment
US20230085724A1 (en) 2020-03-05 2023-03-23 Neotx Therapeutics Ltd. Methods and compositions for treating cancer with immune cells
CN113402612A (zh) 2020-03-17 2021-09-17 西比曼生物科技（香港）有限公司 靶向cd19和cd20的联合嵌合抗原受体及其应用
WO2022055946A1 (en) 2020-09-08 2022-03-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell phenotypes associated with response to adoptive cell therapy
EP4243937A2 (en) 2020-11-13 2023-09-20 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Enhanced antigen reactivity of immune cells expressing a mutant non-signaling cd3 zeta chain
CN116635064A (zh) 2020-12-18 2023-08-22 世纪治疗股份有限公司 具有适应性受体特异性的嵌合抗原受体系统
AU2021413365A1 (en) 2020-12-30 2023-07-20 Precigen, Inc. Recombinant vectors comprising polycistronic expression cassettes and methods of use thereof
WO2022165419A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Kyverna Therapeutics, Inc. Methods for increasing t-cell function
WO2022180586A1 (en) * 2021-02-25 2022-09-01 Senthil Natesan Car t-cell product and method of preparation thereof
EP4298250A1 (en) 2021-02-26 2024-01-03 Fundació Institut de Recerca Contra la Leucèmia Josep Carreras Markers of prediction of response to car t cell therapy
EP4376873A1 (en) * 2021-07-26 2024-06-05 CRISPR Therapeutics AG Methods for manufacturing genetically engineered car-t cells
AU2022326908A1 (en) * 2021-08-12 2024-03-28 Cellogen Therapeutics Pvt. Ltd. Chimeric antigen receptors (car) for b cell malignancies
US20240342282A1 (en) 2021-08-13 2024-10-17 Ludwig-Maximilians-Universität München Anti-csf1r car expressing lymphocytes for targeted tumor therapy
KR20240099280A (ko) * 2021-10-18 2024-06-28 카이트 파마 인코포레이티드 키메라 항원 수용체에 대한 신호전달 도메인
EP4456911A2 (en) 2021-12-31 2024-11-06 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services T cell therapy with vaccination as a combination immunotherapy against cancer
US20230210900A1 (en) 2022-01-04 2023-07-06 Kyverna Therapeutics, Inc. Methods for treating autoimmune diseases
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
EP4598949A1 (en) 2022-10-07 2025-08-13 The General Hospital Corporation Methods and compositions for high-throughput discovery of peptide-mhc targeting binding proteins
WO2024124044A1 (en) 2022-12-07 2024-06-13 The Brigham And Women’S Hospital, Inc. Compositions and methods targeting sat1 for enhancing anti¬ tumor immunity during tumor progression
EP4658298A1 (en) 2023-01-30 2025-12-10 Ludwig-Maximilians-Universität München, in Vertretung des Freistaates Bayern Anti-cd86 car expressing lymphocytes for targeted tumor therapy
CN121127253A (zh) 2023-02-28 2025-12-12 朱诺治疗学股份有限公司 治疗系统性自身免疫性疾病的细胞疗法
CN121666232A (zh) 2023-05-31 2026-03-13 开普斯坦治疗公司 脂质纳米颗粒制剂和组合物
WO2025006799A1 (en) 2023-06-27 2025-01-02 Capstan Therapeutics, Inc. Extracorporeal and ex vivo engineering of select cell populations from peripheral blood
WO2025049631A1 (en) * 2023-08-28 2025-03-06 Kyverna Therapeutics, Inc. Allogeneic car-t cell therapies and manufacture thereof
WO2025059533A1 (en) 2023-09-13 2025-03-20 The Broad Institute, Inc. Crispr enzymes and systems
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
WO2025076127A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025096878A1 (en) 2023-11-02 2025-05-08 Capstan Therapeutics, Inc. Rna for in vivo transfection with increased expression
WO2025097055A2 (en) 2023-11-02 2025-05-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of t cells in immunotherapy
WO2025117544A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 The Broad Institute, Inc. Engineered omega guide molecule and iscb compositions, systems, and methods of use thereof
US20250332281A2 (en) 2023-12-15 2025-10-30 Capstan Therapeutics, Inc. Humanized anti-cd8 antibodies and uses thereof
WO2025147545A1 (en) 2024-01-03 2025-07-10 Juno Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids and related methods and uses
WO2025160480A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Enhanced tumor reactivity of t cells lacking sit1, lax1, or trat1
WO2025179294A2 (en) 2024-02-22 2025-08-28 Capstan Therapeutics, Inc. Immune engineering amplification
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025250587A1 (en) 2024-05-29 2025-12-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Drug-regulatable, inducible cytokine expression
WO2026020055A2 (en) 2024-07-18 2026-01-22 Juno Therapeutics, Inc. Methods for assessing exosomes in a cell composition and related uses
US20260061053A1 (en) 2024-08-28 2026-03-05 Juno Therapeutics, Inc. Cd19-directed chimeric antigen receptor cell therapy for treating autoimmune and neurological diseases

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
IN165717B (es) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
DK0557459T3 (da) 1990-11-13 1997-12-15 Immunex Corp Bifunktionelle, selekterbare fusionsgener
US8211422B2 (en) 1992-03-18 2012-07-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Chimeric receptor genes and cells transformed therewith
IL104570A0 (en) 1992-03-18 1993-05-13 Yeda Res & Dev Chimeric genes and cells transformed therewith
AU6953394A (en) 1993-05-21 1994-12-20 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US5464758A (en) 1993-06-14 1995-11-07 Gossen; Manfred Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US5885827A (en) 1996-01-23 1999-03-23 The Regents Of The Universtiy Of California Eukaryotic high rate mutagenesis system
FR2814642B1 (fr) 2000-10-03 2005-07-01 Ass Pour Le Dev De La Rech En Souris transgenique pour la recombinaison ciblee mediee par la cre-er modifiee
US20130266551A1 (en) 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
US20050113564A1 (en) * 2003-11-05 2005-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with 4-1BB stimulatory signaling domain
EP2801583B1 (en) * 2004-07-10 2018-04-25 Fox Chase Cancer Center Genetically modified human natural killer cell lines
CL2007003622A1 (es) 2006-12-13 2009-08-07 Medarex Inc Anticuerpo monoclonal humano anti-cd19; composicion que lo comprende; y metodo de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales.
BRPI0807952A2 (pt) 2007-02-20 2014-06-10 Anaptysbio Inc Sistemas de hipermutação somática
WO2009091826A2 (en) * 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
JP5934099B2 (ja) * 2009-10-01 2016-06-15 アメリカ合衆国 抗血管内皮増殖因子受容体−２キメラ抗原受容体及び癌の治療のためのその使用
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
ES2872077T3 (es) * 2011-04-08 2021-11-02 Us Health Receptor de antígenos quiméricos anti-variante III del receptor de factor de crecimiento epidérmico y uso de los mismos para el tratamiento de cáncer
EP2814846B1 (en) * 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
EA201990959A1 (ru) * 2012-04-11 2020-02-10 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретари, Департмент Оф Хелс Энд Хьюман Сёрвисез Химерные антигенные рецепторы, нацеленные на антиген созревания b-клеток
WO2014055771A1 (en) * 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
ES2794088T3 (es) * 2014-01-29 2020-11-17 Dana Farber Cancer Inst Inc Anticuerpos contra el dominio extracelular de MUC1-C (MUC1-C/ECD)
EP3149044B1 (en) * 2014-06-02 2020-10-21 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Chimeric antigen receptors targeting cd-19
AU2016338747B2 (en) * 2015-10-15 2023-05-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD30 chimeric antigen receptors
PT3436079T (pt) * 2016-04-01 2021-10-06 Kite Pharma Inc Recetores de antigénios quiméricos e de células t e métodos de uso
JP7656401B2 (ja) * 2017-05-15 2025-04-03 アメリカ合衆国 バイシストロン性キメラ抗原受容体及びそれらの使用
WO2020009868A1 (en) * 2018-07-03 2020-01-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-slamf7 chimeric antigen receptors
CN113015750A (zh) * 2018-11-07 2021-06-22 克里斯珀医疗股份公司 抗liv1免疫细胞癌症疗法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015187528A1 (en) 2015-12-10
AU2015270912B9 (en) 2021-01-21
JP7004470B2 (ja) 2022-02-10
JP2017522862A (ja) 2017-08-17
NZ764530A (en) 2024-07-05
IL291292A (en) 2022-05-01
AU2024205043A1 (en) 2024-08-15
JP7485650B2 (ja) 2024-05-16
JP7799744B2 (ja) 2026-01-15
US20220153838A1 (en) 2022-05-19
US11236161B2 (en) 2022-02-01
JP2024105415A (ja) 2024-08-06
IL249305A0 (en) 2017-02-28
JP2021042224A (ja) 2021-03-18
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