ES2732067T3 - Receptor de antígeno quimérico (CAR) que contiene un dominio de unión a CD19 - Google Patents
Receptor de antígeno quimérico (CAR) que contiene un dominio de unión a CD19 Download PDFInfo
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Abstract
Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a CD19 que comprende a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias: CDR1 - GYAFSSS (Id. de Sec. nº 1); CDR2 - YPGDED (Id. de Sec. nº 2) CDR3 - SLLYGDYLDY (Id. de Sec. nº 3); y b) una región variable de la cadena ligera (VL) que tiene CDR con las siguientes secuencias: CDR1 - SASSSVSYMH (Id. de Sec. nº 4); CDR2 - DTSKLAS (Id. de Sec. nº 5) CDR3 - QQWNINPLT (Id. de Sec. nº 6).
Description
DESCRIPCIÓN
Receptor de antígeno quimérico (CAR) que contiene un dominio de unión a CD19
Campo de la invención
La presente descripción se refiere a un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une al antígeno de linfocitos B CD19 (cúmulo de diferenciación 19). Las células T que expresan dicho CAR son útiles en el tratamiento de enfermedades cancerosas como las leucemias y linfomas de células B.
Antecedentes de la invención
Receptores de antígenos quiméricos
Tradicionalmente, las células T específicas de antígeno se han generado por expansión selectiva de células T de sangre periférica nativas que son específicas para el antígeno diana. Sin embargo, es difícil y a menudo imposible seleccionar y expandir grandes cantidades de células T específicas para la mayoría de los antígenos del cáncer. La terapia génica con vectores de integración nos brinda una solución a este problema: la expresión transgénica del receptor de antígeno quimérico (CAR) permite que grandes cantidades de células T específicas de cualquier antígeno de superficie se generen fácilmente mediante la transducción de vectores virales ex vivo de una población general de células T de sangre periférica.
Las formas más comunes de estas moléculas son las fusiones de fragmentos variables de cadena única (scFv) derivados de anticuerpos monoclonales que reconocen un antígeno diana, fusionado a través de un espaciador y un dominio transmembrana a un endodominio de señalización. Dichas moléculas dan como resultado la activación de la célula T en respuesta al reconocimiento por parte del scFv de su diana relacionada. Cuando las células T expresan dicho CAR, reconocen y matan a las células diana que expresan el antígeno diana. Se han desarrollado varios CAR contra los antígenos asociados a tumores, y actualmente se están realizando ensayos clínicos para el tratamiento de diversos tipos de cáncer con el uso de tales células T que expresan CAR. Hasta la fecha, sin embargo, la exploración clínica principal y la posible aplicación de la terapia CAR es como tratamiento para las neoplasias malignas de células B.
CAR dirigido contra CD19
El CD19 es un antígeno de células B que se expresa muy temprano en la diferenciación de las células B y solo se pierde en la diferenciación de la célula B terminal en células plasmáticas. Por lo tanto, CD19 se expresa en todas las neoplasias malignas de células B, aparte del mieloma múltiple. No se expresa en otras poblaciones hematopoyéticas o células no hematopoyéticas y, por lo tanto, el tratamiento de este antígeno no debe causar toxicidad en la médula ósea o en órganos no hematopoyéticos. La pérdida del compartimento normal de células B se considera una toxicidad aceptable cuando se tratan neoplasias malignas linfoides, ya que aunque la terapia eficaz con células T CD19 CAR generará una aplasia de las células B, la hipogammaglobulinemia resultante puede tratarse con inmunoglobulina combinada.
El CD19 es, por lo tanto, una diana atractiva del CAR. Hasta la fecha, el principal foco clínico del campo CAR ha sido los estudios dirigidos a CD19 en cánceres de células B refractarios, como se resume en la Tabla 1.
Se han probado diferentes diseños de CAR contra CD19 en diferentes centros, como se describe en la Tabla 1: Tabla 1. Resumen de la ex eriencia CAR diri ida contra CD19
La mayoría de los estudios han probado el CAR contra CD19 basado en un scFv derivado del hibridoma fmc63. Las más prometedoras han sido en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda (LLA).
Experiencia clínica con CAR contra CD19
La terapia con CAR dirigida contra CD19 parece ser la más efectiva en la LLA. Los primeros estudios en LLA se publicaron en la primavera de 2013, por grupos del Memorial Sloane Kettering (Brentjens, et al. (2013) Leukemia. Sci. Transl. Med. 5, 177ra38) y la Universidad de Pennsylvania. Recientemente se ha realizado un informe
actualizado de este último estudio (Maude et al. (2014) N. Engl. J. Med. 371, 1507-1517). Aquí, 25 pacientes menores de 25 años y 5 mayores de esta edad fueron tratados. El 90% logró una respuesta completa al mes, 22 de 28 casos evaluables lograron un estado negativo de ERM y la tasa de supervivencia libre de eventos de 6 meses fue del 67%. 15 pacientes no recibieron más terapia después del estudio.
Brentjens et al. (como en el caso anterior) en el caso de adultos, trató a 5 pacientes con LLA (2 con recaída refractaria, 2 con una ERM positiva y 1 que tenía una ERM negativa) con células T autólogas transducidas retrovíricamente para expresar una CAR contra CD19 incorporando un scFv derivado del hibridoma SJ25C1 y un dominio coestimulador CD28. Todos estos lograron una remisión molecular profunda, permitiendo que 4 de estos pacientes recibieran un SCT alogénico. Esta evaluación excluyó la durabilidad de las respuestas, pero las células CAR T solo fueron detectables en la sangre o en la médula ósea durante 3-8 semanas después de la infusión. El paciente que no fue trasplantado recidivó a los 90 días con enfermedad CD19+. Posteriormente, Davila et al. ((2014). Sci. Transl. Med. 6, 224ra25) han actualizado esta cohorte. 14 de 16 pacientes adultos tenían enfermedades detectables en el punto de infusión de células T CAR, a pesar de la quimioterapia de rescate y el acondicionamiento con ciclofosfamida. 14 de 16 lograron una remisión completa con o sin recuperación del recuento, incluidos 7 de 9 pacientes con evidencia morfológica de enfermedad residual detectable después de la quimioterapia de rescate. 12 de los 16 pacientes lograron la negatividad de la ERM y esto permitió que 7 se sometieran a un trasplante alogénico en el momento de la publicación. Las respuestas fueron duraderas en algunos pacientes, 4 de los 8 pacientes no trasplantados continuaron en remisión morfológica a los 24 meses de seguimiento, aunque las curvas de supervivencia de esta cohorte aún no son estables.
Un estudio publicado recientemente en una cohorte de pacientes pediátricos y adultos jóvenes, predominantemente con LLA, proporciona el primer análisis por intención de tratar de sus resultados. Esto puede ayudar a eliminar el sesgo inherente a excluir a los pacientes que no reciben la dosis anticipada de células CAR T (Lee et al. (2014) Lancet. Doi: 10.1016/S0140-6736 (14) 61403-3). 21 pacientes fueron tratados con un CAR de segunda generación que contiene el dominio CD28. Todos menos 2 pacientes recibieron la dosis anticipada de células T, lo que destaca la posibilidad de administrar este tratamiento a aquellos con LLA refractaria o con recaídas múltiples. Este estudio muestra la siguiente eficacia: el 67% logró una remisión completa y el 60% de las personas con lLa logró un estado negativo de ERM.
Inmunotoxicidad de la terapia CAR contra CD19
El síndrome de liberación de citoquinas (SLC) abarca una gama de síntomas inflamatorios que van desde una insuficiencia leve a multiorgánica con hipotensión e insuficiencia respiratoria. Algún grado de SLC ocurre comúnmente en pacientes tratados con células T CD19 CAR. Aproximadamente el 30% (21/73) de los pacientes tratados en cohortes recientes mostraron algún grado de SLC (Davila et al. (2014) como anteriormente; Lee et al. (2014) como anteriormente; Kochenderfer (2014) J. Clin. Oncol. Off. J . Am. Soc. Clin. Oncol.. doi: 10.1200/JCO.2014.56.2025). También se ha observado SLC en pacientes tratados con blinatumomab, un anticuerpo recombinante de cadena única biespecífico que reconoce tanto CD19 como CD3. El SLC ocurre típicamente 5-21 días después de la infusión de células T CAR.
El SLC puede ser potencialmente mortal y requiere tratamiento en un entorno de cuidados intensivos. El SLC se asocia con niveles elevados de citoquinas en suero. Las citoquinas más elevadas significativamente son IL-6, IL-10 e interferón gamma (IFNy). Las manifestaciones clínicas de SLC grave (fiebre, hepatoesplenomegalia, coagulopatía e hiperferritinemia) se asemejan al síndrome de activación de macrófagos (MAS) encontrado, por ejemplo, en pacientes con defectos congénitos en las células T. Esto sugiere que los procesos inmunopatológicos comunes están involucrados. En la actualidad, no está claro qué tipo de célula (las células CAR T, las células tumorales moribundas o los macrófagos activados localmente) son responsables de la producción de las citoquinas clave, particularmente la IL-6. Sin embargo, un factor de iniciación clave en el MAS es la liberación de abundante interferón gamma (López-Alvarez et al. (2009). Clin. Vaccine Immunol. CVI 16, 142-145).
Neurotoxicidad
Varios pacientes en estudios de CD19 CAR en instituciones han desarrollado neurotoxicidad transitoria con un espectro de gravedad desde la afasia hasta la disgregación, el delirio y las convulsiones (Davilia et al (2014) como anteriormente). Esto parece estar restringido a pacientes con LLA y se ha documentado un síndrome similar después de la terapia con blinatumomab. Las imágenes del cerebro parecen normales. La neurotoxicidad puede reflejar altos niveles de citoquinas sistémicas que cruzan la barrera hematoencefálica.
Persistencia, recaída y agotamiento de células T
Las respuestas duraderas parecían correlacionarse con niveles máximos más altos de células T transducidas con CAR en circulación, así como con la duración de la aplasia de células B. Con excepción de los pacientes que recaen con la enfermedad de CD19, la recaída se asoció generalmente con la pérdida de células CAR T circulantes y la recuperación de las células B normales.
El agotamiento de las células T es un estado de disfunción de las células T que surge durante muchas infecciones crónicas y el cáncer. Se define por una función efectora deficiente, expresión sostenida de receptores inhibitorios y un estado transcripcional distinto del de las células T efectoras o de memoria funcionales. El agotamiento evita el control óptimo de infecciones y tumores. Recientemente, ha surgido una imagen más clara del perfil funcional y fenotípico de las células T agotadas con la expresión del receptor inhibitorio de la muerte programada 1 (PD-1; también conocido como PDCD1), un regulador negativo de las células T activadas, siendo una característica clave (Day et al. (2006) Nature 443, 350-354).
Las respuestas en los estudios CD19 CAR sugieren que la persistencia de las células T durante un período prolongado en niveles altos parece ser importante para lograr respuestas duraderas. Un CD19 CAR que reduce el agotamiento de las células T puede resultar en mejores respuestas clínicas.
El documento WO2014184143 describe un CAR específico para CD19 que comprende un scFv derivado del anticuerpo monoclonal 4G7.
Por lo tanto, existe la necesidad de un CAR alternativo dirigido contra CD19 que no esté asociado con las desventajas anteriores.
Descripción de las figuras
Figura 1. Secuencias anotadas y numeradas (a) CAT19 VH (b) CAT19 VL
Las secuencias de VH y VL se numeran utilizando la numeración de Chothia. Se muestran las regiones marco y las regiones CDR. También se muestran las inserciones.
Figura 2. Tinción de células CD19 positivas con células recombinantes CAT19
SupT1 normalmente no expresa CD19, pero se diseñó para hacerlo en este estudio. Las secuencias CAT19 VH y VL se clonaron en el formato de cadena pesada de IgG2a de ratón y en el formato de cadena ligera kappa de ratón, ambos en plásmidos de expresión de mamíferos. Las células 293T se transfectaron simultáneamente con ambas cadenas pesada y ligera y el anticuerpo resultante se purificó con proteína A. Las células SupT1 y SupT1.CD19 se tiñeron con este anticuerpo recombinante (o sobrenadante de 293T simple) y se tiñeron con un anticuerpo anti-ratón conjugado con fluorescencia. La unión del anticuerpo CAT19 recombinante podría detectarse fácilmente mediante citometría de flujo.
Figura 3. Tinción de células CD19 positivas con scFv CAT19
El VH y el VL de CAT19 se clonaron de manera que forman un scFv en el que el VH y el VL se separan mediante un enlazador (SGGGGS)3. Se generaron dos scFv con CAT scFv en ambas orientaciones VH-VL y VL-VH. Además, se generaron scFv, también en cualquier orientación, a partir de los anticuerpos anti-CD19 fmc63 y 4g7. (a) Formato de presentación de scFv: este es un vector retroviral por el cual el scFv se clona en un espaciador Fc de IgG1 humano que tiene el dominio transmembrana CD8 y los primeros 12 residuos del endodominio CD8. Esto, a su vez, está en el marco del péptido FMV-2A TaV y CD34 humano truncado. De esta manera, el scFv se muestra en la superficie de una célula, y la expresión del transgén se puede controlar detectando CD34 por separado. Se generaron células SupT1 que expresan cualquiera de los 6 formatos diferentes de scFv y estas células se tiñeron con Fc humana truncada recombinante de fusión de CD19 - IgG2a de ratón y anti-CD34; (b) Tinción con formato fmc63 VH-VL y VL-VH; (c) Tinción con formato 4g7 VH-VL y VLVH; y (d) tinción con formato CAT19 VH-VL y v L-VH. Sorprendentemente, el scFv CAT19 VH-VL se unió bien, mientras que el scFv VL-VH dio una unión significativamente menos detectable.
Figura 4. Diferentes generaciones de CAR y CAR iniciales probadas
(a) Un formato CAR típico que comprende un dominio de unión a antígeno (que generalmente es un scFv), un dominio espaciador, un dominio transmembrana y uno o varios dominios de señalización. (b) Los CAR de primera generación transmiten una señal de activación; su endodominio se deriva del endodominio del receptor FcGamma o del endodominio CD3 Zeta; (c) Los receptores de segunda generación transmiten dos señales: sus endodominios comprenden un dominio coestimulador conectado al endodominio de CD3-Zeta. El dominio coestimulador suele ser el endodominio de CD28, el endodominio de OX40 o el endodominio de 41BB. (d) Los receptores de tercera generación transmiten tres señales: sus endodominios comprenden una fusión del endodominio CD28 con el endodominio 41BB y con el endodominio CD3-Zeta, o el endodominio CD28 con el endodominio OX40 y con el endodominio CD3-Zeta. (e) El CAR basado en CAT19 inicialmente probado que comprende un scFv en la orientación VH-VL, un espaciador de tallo de CD8 y un endodominio de segunda generación que comprende 41BB-Zeta (formato Campana CAR).
Figura 5. Comparación in vitro de la función CAT19 CAR frente a fmc36 CAR
Se transdujeron células T humanas primarias de 5 donantes diferentes con vectores lentivirales que codifican CAR CAT19 en formato Campana o el propio Campana CAR. Estas células T se usaron luego en varios ensayos. (a) El ensayo de liberación de cromo se realizó contra células SupT1. Estas células son CD19 negativas. Ninguna de las células T CAR respondieron a esta línea celular (líneas de puntos). El ensayo de liberación de cromo se realizó contra SupT1.CD9. Ambos CAR se comportaron igual contra esta línea celular (líneas continuas). A continuación, se realizó un ensayo de desgranulación utilizando células NT T, células Fmc63 CAR T o células T CAT19 CAR contra SupT1 o SupT1.CD19. se muestran (b) los datos de células T CD4+, y (c) células T CD8+. La desgranulación se incrementó con células T CAR19 CAR. (d) La proliferación se estimó utilizando la incorporación de timidilación tritiada. NT, células T fmc63 CAR, células T CAT19 CAR se probaron contra SupT1. CD19. En este experimento, también se probó un CAR irrelevante dirigido a contra GD2. Hubo una tendencia de incrementar la proliferación con células T CAR19 CAR. (e) liberación de interferón gamma a partir de las células NT T, células T Fmc63 CAR, células T CAT19 CAR o células T GD2 CAR 24 horas después de enfrentarlas contra las células SupT1 o SupT1.CD19. Las células T CAR CAT19 produjeron significativamente menos IF-y que las células T CAR fmc63 cuando se enfrentaron con dianas CD19+.
Figura 6. Modelo in vivo de la eficacia de CAT19.
(a) Esquema de configuración experimental para el modelo in vivo. A los ratones NSG se les inyectaron 2.5x105 células Raji.FLuc mediante inyección en la vena de la cola. 24 horas más tarde, se administraron 4x106 de cualquiera de las células T primarias humanas NT, o las células T transducidas con fmc63 CAR, o las células T transducidas con CAT19 CAR se administraron a través de la vena de la cola. La respuesta del tumor se midió secuencialmente mediante imágenes de bioluminiscencia. Se tomó una muestra de sangre de la vena de la cola el día 4 para injerto y citoquina sérica. Los animales se sacrificaron el día 11 y se estudiaron los tejidos para determinar la persistencia de las células T CAR y la carga tumoral. (b) Imágenes de bioluminiscencia de las diferentes cohortes de ratones en el día 10. Se observa una enfermedad extensa en la pelvis, la columna vertebral, las costillas, el cráneo y el bazo de ratones tratados con células T NT, mientras que la señal mínima es evidente en los ratones que recibieron cualquiera de las células T CAT19 CAR, o células T fmc63 CAR. (c) Señal bioluminiscente cuantitativa promediada de diferentes cohortes de ratón a lo largo del tiempo. El eje Y es una escala logarítmica; Se observa una clara diferencia entre la acumulación de señal en ratones que recibieron células T NT y ratones que recibieron células T CAR. No se observan diferencias en la acumulación de señal en ratones que recibieron células T fmc63 CAR o células T CAT19CAR. (d) Carga de tumor determinada por citometría de flujo en médula ósea de ratones al final del experimento. Prácticamente no se pudieron detectar células Raji en la médula ósea de ratones que recibieron células T fmc63 o CAT19 CAR.
Figura 7. Caracterización de las células T CAR persistentes in vivo
(a) Números absolutos de células T CAR en los bazos de ratones de animales tratados con células T fmc63 CAR o células T CAT19 CAR en el modelo descrito anteriormente. Esto muestra que los mismos números están presentes en ambos; (b) Números absolutos de células T CAR en la médula ósea de ratones tratados con células T fmc63 CAR o células T CAT19 CAR. Esto muestra que los mismos números de células están presentes en ambos; (c) números absolutos de células T CAR que expresan PD1 en el bazo y (d) médula ósea de ratones tratados con células T fmc63 CAR o células T CAT19 CAR. Menos células T CAT19 son PD1+ en ambos compartimentos.
Resumen de los aspectos de la invención.
Los presentes inventores han desarrollado un nuevo CAR específico para CD19 con CDR que no se han descrito previamente. Tiene una potencia equivalente al CAR basado en fmc63 utilizado en los estudios UPENN, pero produce una toxicidad reducida y un agotamiento reducido de las células T.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a c D19 que comprende a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias:
CDR1 - GYAFSSS (Id. de Sec. n° 1);
CDR2 - YPGDED (Id. de Sec. n° 2)
CDR3 - SLLYGDYLDY (Id. de Sec. n° 3); y
b) una región variable de la cadena ligera (VL) que tiene CDR con las siguientes secuencias:
CDR1 - SASSSVSYMH (Id. de Sec. n° 4);
CDR2 - DTSKLAS (Id. de Sec. n° 5)
CDR3 - QQWNINPLT (Id. de Sec. n° 6).
El dominio de unión a CD19 puede comprender un dominio VH que tiene la secuencia mostrada como Id. de Sec. n° 7 y/o un dominio VL que tiene la secuencia mostrada como Id. de Sec. n° 8 o una variante de la misma que tiene al menos el 95% de identidad de secuencia.
El dominio de unión a CD19 puede comprender un scFv en la orientación VH-VL.
El dominio de unión a CD19 puede comprender la secuencia mostrada como Id. de Sec. n° 9 o una variante de la misma que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia.
El dominio de unión a CD19 puede comprender los 6 CDR definidos en la reivindicación 1 injertadas en un armazón de anticuerpo humano.
El dominio de unión a CD19 y el dominio transmembrana pueden estar conectados por un espaciador, que puede comprender uno de los siguientes: un dominio Fc de IgG1 humano; una bisagra IgG1; o un tallo de c D8. El espaciador puede comprender un tallo de CD8.
El CAR puede comprender o asociarse con un dominio de señalización de células T intracelular.
El dominio de señalización de células T intracelular puede comprender uno o más de los siguientes endodominios: endodominio CD28; endodominio 41BB, endodominio OX40 y endodominio CD3-Zeta.
En particular, el CAR puede comprender un espaciador de tallo de CD8 y un dominio de señalización de células T intracelular que comprende el endodominio 41BB y el endodominio CD3-Zeta.
En particular, el CAR puede comprender un espaciador de tallo de CD8 y un dominio de señalización de células T intracelular que comprende el endodominio OX40 y el endodominio CD3-Zeta.
En una realización alternativa, el dominio de señalización de células T intracelular puede comprender todos los siguientes endodominios: endodominio CD28; OX40 y CD3-Zeta.
El CAR puede comprender la secuencia mostrada como cualquiera de las Id. de Sec. n° 10 a 15 o una variante de las mismas que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia pero retiene la capacidad de i) unirse a CD19 y ii) inducir la señalización de las células T. El CAR puede tener propiedades ventajosas en comparación con el CAR basado en fmc63 utilizado en los estudios UPENN. Por ejemplo, el CAR, cuando se expresa por una célula T y se usa para reconocer a una célula que expresa CD19, puede causar una liberación menor de IFNy por la célula diana que expresa CD19 que la causada por una célula T que expresa un CAR que comprende un dominio de unión a CD19 que comprende: a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias: CDR1 - Gv SlPDY (Id. de Sec. n° 16); CDR2 - WGSET (Id. de Sec. n° 17); CDR3 - HYYYGGSYAMDY (Id. de Sec. n° 18); y b) una región variable (VL) de la cadena ligera que tiene CDR con las siguientes secuencias: CDR1 - RASQDISKYLN (Id. de Sec. n° 19); CDr2 - HTSRLHS (Id. de Sec. n° 20) CDR3 - QQGNTLPYT (Id. de Sec. n° 21). Los CDR pueden ser injertados en un armazón humano o humanizado.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
En un tercer aspecto, se proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.
En un tercer aspecto, se proporciona una célula que comprende un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
La célula puede ser una célula inmune citolítica, tal como una célula T o una célula asesina natural (NK).
En un cuarto aspecto se proporciona una composición celular que comprende una pluralidad de células de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.
En un quinto aspecto, se proporciona un método para fabricar una célula de acuerdo con el tercer aspecto de la invención, que comprende la etapa de transducir o transfectar una célula con un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.
En un sexto aspecto, se proporciona un método para preparar una composición celular de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención que comprende la etapa de transducir o transfectar una muestra de células de un sujeto ex vivo con un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención.
La muestra de células puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre o un derivado de la misma, tal como una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En un séptimo aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o una composición celular de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. .
En un octavo aspecto, se proporciona un método para tratar el cáncer que comprende la etapa de administrar una célula de acuerdo con el primer aspecto de la invención, una composición celular de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con el séptimo aspecto de la invención a un sujeto. El método puede comprender la etapa de transducir o transfectar células del sujeto ex vivo con un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la invención, y luego administrar las células transfectadas, o algunas de ellas, al sujeto. También se proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con el séptimo aspecto de la invención para uso en el tratamiento del cáncer.
También se proporciona el uso de una célula de acuerdo con el tercer aspecto de la invención en la fabricación de una composición farmacéutica para tratar el cáncer.
El cáncer puede, por ejemplo, ser un tumor maligno de células B.
Descripción detallada
Receptores de antígenos quiméricos (CAR)
Los receptores de antígeno quimérico (CAR), también conocidos como receptores de células T quiméricos, receptores de células T artificiales e inmunoreceptores quiméricos, son receptores modificados por ingeniería genética, que injertan una especificidad arbitraria en una célula efectora inmune. En una CAR clásica, la especificidad de un anticuerpo monoclonal se injerta en una célula T. Los ácidos nucleicos que codifican CAR pueden transferirse a células T utilizando, por ejemplo, vectores retrovirales. De esta manera, se puede generar un gran número de células T específicas del cáncer para la transferencia de células adoptivas. Los ensayos clínicos de fase I de este enfoque muestran eficacia.
El dominio de unión al antígeno diana de un CAR se fusiona comúnmente a través de un espaciador y un dominio transmembrana a un endodominio. El endodominio puede comprender o asociarse con un dominio de señalización de células T intracelular. Cuando el CAR se une al antígeno objetivo, esto se traduce en la transmisión de una señal de activación a la célula T en la que se expresa.
El CAR de la presente invención comprende un dominio de unión a CD19 que se basa en un anticuerpo monoclonal anti-CD19 de ratón, que comprende
a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias:
CDR1 - GYAFSSS (Id. de Sec. n° 1);
CDR2 - YPGDED (Id. de Sec. n° 2)
CDR3 - SLLYGDYLDY (Id. de Sec. n° 3); y
b) una región variable de la cadena ligera (VL) que tiene CDR con las siguientes secuencias:
CDR1 - SASSSVSYMH (Id. de Sec. n° 4);
CDR2 - DTSKLAS (Id. de Sec. n° 5)
CDR3 - QQWNINPLT (Id. de Sec. n° 6).
Puede ser posible introducir una o más mutaciones (sustituciones, adiciones o eliminaciones) en cada CDR sin afectar negativamente a la actividad de unión a CD19. Cada CDR puede, por ejemplo, tener una, dos o tres mutaciones de aminoácidos.
Las CDR pueden estar en el formato de un fragmento variable de una sola cadena (scFv), que es una proteína de fusión de la región variable pesada (VH) y la región variable de la cadena ligera (VL) de un anticuerpo, conectado con un péptido enlazador corto de entre 10 a aproximadamente 25 aminoácidos. El scFv puede estar en la orientación VH-VL, es decir, el VH está en el extremo amino de la molécula CAR y el dominio VL está vinculado al espaciador y, a su vez, al dominio transmembrana y el endodominio.
Las CDR pueden estar injertadas en el armazón de un anticuerpo humano o scFv. Por ejemplo, el CAR de la presente invención puede comprender un dominio de unión a CD19 que consiste o comprende una de las siguientes secuencias.
El CAR de la presente invención puede comprender la siguiente secuencia de VH: Id. de Sec. n° 7 - secuencia de VH de anticuerpo monoclonal murino
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El CAR de la presente invención puede comprender la siguiente secuencia de VL: Id. de Sec. n° 8 - secuencia de VL de anticuerpo monoclonal murino
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El CAR de la invención puede comprender la siguiente secuencia de scFv: Id. de Sec. n° 9 - secuencia de scFv de VH-VL de anticuerpo monoclonal murino
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El CAR puede consistir en o comprender una de las siguientes secuencias:
Id. de Sec. n° 10 - CAR CAT19 usando la arquitectura "Campana" (ver Ejemplos)
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Id. de Sec. n° 11 - CAR CAT19 con un endodominio OX40-Zeta
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Id. de Sec. n° 12 - CAT19 CAR con un endodominio CD28-Zeta.
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Id. de Sec. n° 13 - CD19 CAR de tercera generación.
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Id. de Sec. n° 14 - CD19 CAR con espaciador de bisagra IgG1.
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Id. de Sec. n° 15 - CD19 CAR con bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana. Con los sitios de unión de FcR mutados
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El CAR de la invención puede comprender una variante de la secuencia mostrada como Id. de Sec. n° 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 que tiene al menos 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad de secuencia, siempre que la secuencia variante retenga la capacidad de unirse a CD19 (cuando esté junto con un dominio VL o VH complementario, si corresponde).
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de polipéptidos se puede determinar fácilmente mediante programas como BLAST que está disponible gratuitamente en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.
Dominio transmembrana
El CAR de la invención también puede comprender un dominio transmembrana que se extiende por la membrana. Puede comprender una hélice alfa hidrófoba. El dominio transmembrana puede derivarse de CD28, que proporciona una buena estabilidad del receptor.
El dominio de transmembrana puede comprender la secuencia mostrada como Id. de Sec. n° 22.
Id. de Sec. n° 22
FWVLWVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
Dominio de señalización de células intracelulares (endodominio)
El endodominio es la porción de transmisión de señal del CAR. Después del reconocimiento de antígenos, los receptores se agrupan y se transmite una señal a la célula. El componente de endodominio más utilizado es el de CD3-zeta que contiene 3 ITAM. Esto transmite una señal de activación a la célula T después de que el antígeno se une. Es posible que CD3-zeta no proporcione una señal de activación totalmente competente y que se necesite una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, los endodominios de CD28, OX40 o 41BB se pueden usar con CD3-Zeta para transmitir una señal de proliferación/supervivencia, o los tres se pueden usar juntos.
Los primeros diseños de CAR tenían endodominios derivados de las partes intracelulares de la cadena y de FceRI o CD3^. En consecuencia, estos receptores de primera generación transmitieron la señal inmunológica 1, que fue suficiente para desencadenar la muerte de las células T de las células dianas afines, pero no logró activar completamente la célula T para proliferar y sobrevivir. Para superar esta limitación, se construyeron endodominios compuestos. La fusión de la parte intracelular de una molécula coestimuladora de células T con el CD3^ dio lugar a receptores de segunda generación que podían transmitir una señal de activación y coestimulación simultáneamente después del reconocimiento del antígeno. El dominio coestimulador más utilizado fue el de CD28. Esto proporciona la señal coestimuladora más potente, a saber, la señal inmunológica 2, que desencadena la proliferación de células T. También se describieron algunos receptores que incluían endodominios de la familia de receptores de TNF, como OX40 y 41BB, que transmiten señales de supervivencia. Finalmente, se describieron CAR aún más potentes de tercera generación que tenían endodominios capaces de transmitir señales de activación, proliferación y supervivencia. Los CAR y sus diferentes generaciones se resumen en la Figura 4.
El endodominio del CAR de la presente invención puede comprender combinaciones de uno o más del endodominio CD3-Zeta, el endodominio 41BB, el endodominio OX40 o el endodominio CD28.
El dominio de señalización intracelular de células T (endodominio) del CAR de la presente invención puede comprender la secuencia mostrada como Id. de Sec. n° 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 o una variante de la misma que tenga al menos 80% de identidad de secuencia.
Id. de Sec. n° 23 (endodominio CD3 zeta) RSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNE LQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Id. de Sec. n° 24 (endodominio 41BB)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
Id. de Sec. n° 25 (endodominio OX40)
RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI
Id. de Sec. n° 26 (endodominio CD28)
KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAY
Los ejemplos de combinaciones de tales endodominios incluyen 41BB-Z, OX40-Z, CD28-Z y CD28-OX40-Zeta. Id. de Sec. n° 27 (fusión de endodominio 41BB-Z) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLY NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGK GHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Id. de Sec. n° 28 (fusión de endodominio OX40-Z) RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNL GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGL YQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Id. de Sec. n° 29 (fusión de endodominio CD28Z) KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHD GLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Id. de Sec. n° 30 (CD28OXZ) KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQE EQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Una secuencia de variante puede tener al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de identidad de secuencia con el Id. de Sec. n° 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 siempre que la secuencia proporcione un dominio transmembrana efectivo/dominio de señalización de células T intracelular.
Peptido señal
El CAR de la presente invención puede comprender un péptido señal de manera que cuando el CAR se expresa dentro de una célula, como las células T, la proteína naciente se dirige al retículo endoplásmico y, posteriormente, a la superficie celular, donde se expresa.
El núcleo del péptido señal puede contener un largo tramo de aminoácidos hidrófobos que tiene una tendencia a formar una única hélice alfa. El péptido señal puede comenzar con un tramo corto de aminoácidos cargados positivamente, lo que ayuda a imponer una topología adecuada del polipéptido durante la translocación. Al final del péptido señal hay típicamente un tramo de aminoácidos que se reconoce y se escinde mediante la peptidasa señal. La peptidasa señal puede escindirse durante o después de la finalización de la translocación para generar un péptido señal libre y una proteína madura. Los péptidos de señal libre son luego digeridos por proteasas específicas. El péptido señal puede estar en el extremo amino de la molécula.
El CAR de la invención puede tener la fórmula general: péptido de señal - dominio de unión a CD19 - dominio espaciador - dominio de transmembrana/dominio de señalización de células T intracelular.
El péptido señal puede comprender el Id. de Sec. n° 31 o una variante del mismo que tenga 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones de aminoácidos (inserciones, sustituciones o adiciones) siempre que el péptido señal aún funcione para causar la expresión de la superficie celular del CAR.
Id. de Sec. n° 31: METDTLLLVVVLLLVVVVPGSTG
El péptido señal del Id. de Sec. n° 31 es compacto y altamente eficiente. Se predice que proporcionará una escisión del 95% después de la glicina terminal, lo que proporcionará una eliminación eficiente mediante la peptidasa señal. Espaciador
El CAR de la presente invención puede comprender una secuencia espaciadora para conectar el dominio de unión a CD19 con el dominio transmembrana y separar espacialmente el dominio de unión a CD19 del endodominio. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a CD19 se oriente en diferentes direcciones para habilitar la unión a CD19.
La secuencia espaciadora puede, por ejemplo, comprender una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8, o una combinación de los mismos. El espaciador puede comprender alternativamente una secuencia alternativa que tiene una longitud y/o propiedades de espaciado de dominio similares a las de una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un tallo de CD8.
Se puede alterar un espaciador de IgG1 humano para eliminar los motivos de unión a Fc.
Los ejemplos de secuencias de aminoácidos para estos espaciadores se proporcionan a continuación:
Id. de Sec. n° 32 (bisagra-CH2CH3 de IgG1 humana) AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCWVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKKD
Id. de Sec. n° 33 (tallo de CD8 humano):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
Id. de Sec. n° 34 (IgG1 humano) :
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
Id. de Sec. n° 35 (IgG1 bisagra-Fc) AEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDP EVKF N WYVDGVEVH N A KTKP R E EQYNSTYR VVSVLTVLH Q DWLNGKEY KC KVSN K ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWGQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKKDPK
Id. de Sec. n° 36 (Bisagra IgG1 - Fc modificada para eliminar los motivos de reconocimiento del receptor Fc) AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVA*GPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCWVDVSHEDP EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GGPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLSLSPGKKDPK
Los residuos modificados están subrayados; * denota una eliminación.
Liberación de interferón y agotamiento de células T CAR
Los presentes inventores han encontrado que un CD19 CAR basado en el scFv CAT19 tiene propiedades que pueden dar como resultado una menor toxicidad y una mejor eficacia.
Dado que la experiencia principal con la terapia CD19 CAR ha sido con CAR basados en fmc63 scFv, y que el conjunto de datos clínicos más antiguo, más grande y quizás más significativo es con Campana CAR basado en fmc63, los presentes inventores tomaron el Campana CAR como el "patrón oro". Por lo tanto, se realizó una comparación entre el CAR fmc63-Campana y un CAR similar pero con CAT19 scFv en lugar de fmc63. Sorprendentemente, los presentes inventores encontraron que mientras que las células T CAT19 CAR efectuaban la destrucción de las células diana que expresaban CD19, y proliferaban en respuesta a las dianas que expresaban CD19, la liberación de interferón gamma era menor. Además, un pequeño modelo animal de un linfoma de células B agresivo mostró la misma eficacia y el mismo injerto entre los CAR basados en fmc63 y CAT19, pero, sorprendentemente, se agotaron menos células T CAT19 CAR que las células T fmc63 CAR.
El CAR de la invención puede causar un 25, 50, 70 o 90% menos de liberación de IFNy en un ensayo comparativo que implica poner células T CAR en contacto con células diana.
El CAR de la invención puede dar como resultado que una proporción menor de células T CAR se agoten en comparación con las células T fmc63 CAR. El agotamiento de las células T se puede evaluar utilizando métodos conocidos en la técnica, como el análisis de la expresión de PD-1. El CAR de la presente invención puede causar un 20, 30, 40, 50, 60% menos de células T CAR expresen PD-1 que células T fmc63 CAR en un ensayo comparativo que implica poner células T CAR en contacto con células diana.
Secuencia de acido nucleico
El segundo aspecto de la invención se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR del primer aspecto de la invención.
La secuencia de ácido nucleico puede ser capaz de codificar un CAR que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como cualquiera de los Id. de Sec. n°: 10-15.
Vector
La presente invención también proporciona un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención. Un vector de este tipo puede usarse para introducir la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped de manera que exprese y produzca una molécula de acuerdo con el primer aspecto de la invención. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un vector viral, tal como un vector retroviral o un vector lentiviral. El vector puede ser capaz de transfectar o transducir una célula, tal como una célula T.
Célula
La invención también proporciona una célula que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la invención. La invención proporciona una célula que expresa un CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención en la superficie celular.
La célula puede ser una célula inmune citolítica, tal como una célula T o una célula asesina natural (NK).
Una célula capaz de expresar un CAR de acuerdo con la invención puede fabricarse mediante transducción o transfectación de una célula con ácido nucleico que codifica CAR.
La célula que expresa CAR de la invención puede generarse ex vivo. La célula puede ser de una muestra de células, como una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) del paciente o un donante. Las células pueden activarse y/o expandirse antes de ser transducidas con ácido nucleico que codifica CAR, por ejemplo mediante tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD3.
Composición farmacéutica
La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene una célula que expresa CAR, o una pluralidad de células de la invención junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más polipéptidos farmacéuticamente activos y/o compuestos. Dicha formulación puede estar, por ejemplo, en una forma adecuada para infusión intravenosa.
Método de tratamiento
Las células que expresan CAR de la presente invención pueden ser capaces de destruir células cancerosas, tales como células de linfoma de células B. Las células que expresan CAR, como las células T o las células NK, pueden crearse ex vivo a partir de la propia sangre periférica del paciente (primera fuente) o en el contexto de un trasplante de células madre hematopoyéticas de sangre periférica de donante (segunda fuente), o sangre periférica de un donante no conectado (tercera fuente). Alternativamente, las células que expresan CAR pueden derivarse de la diferenciación ex vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias a células tales como células T. En estos casos, las células CAR se generan mediante la introducción de DNA o RNA codificante de CAR por uno de los muchos medios que incluyen la transducción con un vector viral, la transfección con DNA o RNA. Las células T o NK que expresan una molécula CAR de la presente invención se pueden usar para el tratamiento de una enfermedad cancerosa, en particular una enfermedad cancerosa asociada con la expresión de CD19.
Un método para el tratamiento de la enfermedad se refiere al uso terapéutico de una célula o población de células de la invención. A este respecto, las células pueden administrarse a un sujeto que tiene una enfermedad o afección existente para disminuir, reducir o mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad y/o para disminuir, reducir o bloquear la progresión de la enfermedad. El método de la invención puede causar o promover la muerte mediada por células de células que expresan CD19, tales como las células B.
La invención se describirá ahora adicionalmente a modo de ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto en la técnica a llevar a cabo la invención y no están destinados de ninguna manera a limitar el alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1 Clonación de VH y VL y demostración de la unión a CD19
El VH y el VL se clonaron a partir de un anticuerpo monoclonal anti-CD19 de ratón y se fusionaron en el marco con la región constante kappa humana y la región constante IgG1 humana. Estas cadenas pesadas y ligeras quiméricas se clonaron en un vector de expresión y se usaron para transfectar células 293t . El anticuerpo producido posteriormente se usó para teñir las células SupT1 (una línea de células T que es negativa para CD19), y las células SupT1 que se han diseñado para que sean positivas para CD19. Esta tinción muestra la unión específica del CD19 (Figura 2).
Ejemplo 2: Demostración de que el VH/VL puede formar un scFv que se une a CD19
Luego se investigó si el VH y VL clonados podían unirse a CD19 en un formato scFv. El VH y el VL se clonaron como un scFv en dos orientaciones: VH-VL y VL-VH, donde las dos regiones variables se separaron mediante un enlazador que comprende (SGGGG)4. Estos scFv se clonaron en un CAR sin señalización coexpresado con CD34 truncado como se muestra en la Figura 3a. Brevemente, esto comprende un péptido señal, scFv, bisagra-CH2-CH3 de IgG1 humana, el dominio transmembrana de CD8, los primeros 12 residuos del endodominio CD8, un péptido TeV de FMD-2A, CD34 humano truncado. Para permitir la comparación, se clonaron scFv de fmc63 y scFv de otro anti-CD19 hibridoma 4g7 en el mismo formato en ambas orientaciones VH-VL y VL-VH.
De esta manera, se pueden estudiar varios parámetros: (1) la unión del antígeno diana al CAR mediante el uso de antígeno diana cognado recombinante fusionado con Fc murino, suelto para la internalización del receptor debido a la señalización; (2) La estabilidad del receptor puede determinarse utilizando anti-Fc policlonal; (3) los niveles de expresión del casete se pueden controlar mediante tinción conjunta para CD34.
Estas construcciones se transdujeron en células SupT1. Se generó una fusión de IgG2aFc recombinante de CD19 de ratón. Las células SupT1 se tiñeron para Fc de ratón, Fc humana y anti-CD34 con anticuerpos conjugados a diferentes fluoróforos y la estabilidad/unión se analizó mediante citometría de flujo.
Las secuencias de los diferentes scFv utilizados se detallan a continuación:
> scFv_fmc63_VH-VL (Id. de Sec. n° 37) EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSAL KSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRL
HSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKA
> scFv_fmc63_VL-VH (Id. de Sec. n° 38) DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFS GSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSEV KLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKS
RLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
> scFv_4g7_VH-VL (Id. de Sec. n° 39) EVQLQQSGPELIKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEK FKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTYYYGSRVFDYWGQGTTLTVSSGGGGS GGGGSGGGGSDIVMTQAAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLNSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLI
YRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLELKR
> scFv_4g7_VL-VH (Id. de Sec. n° 40) DIVMTQAAPSIPVTPGESVSISCRSSKSLLNSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGV PDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGAGTKLELKRSGGGGSGGGGSGG GGSEVQLQQSGPELIKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKY NEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARGTYYYGSRVFDYWGQGTTLTVSS
> scFv_CAT_VH-VL (Id. de Sec. n° 9) QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGK FKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGG GGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLAS
GVPDRFSGSGSGTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKR
> scFv_CAT_VL-VH (Id. de Sec. n° 41)
>
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSG SGSGTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKRSGGGGSGGGGSGGGGSQVQ LQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKD KATLTADKSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSS
La construcción usada y los resultados de la tinción se resumen en la Figura 3. Sorprendentemente, el CAT CAR con scFv en la orientación VH-VL se une a CD19, mientras que el CAT19 CAR con scFv en la orientación VL-VH dio una unión mínima a CD19. Esto contrasta con los fmc63 CAR y 4g7 CAR que se unieron a CD19 en ambas orientaciones VL y VH. La unión y la estabilidad del VL CAT CAR parecían ser iguales a las de fmc63.
Ejemplo 3 - Comparación in vitro de la función CAT19 CAR contra fmc36 CAR
El CAT scFv en orientación VL se clonó en un armazón CAR diseñado por Campana (Imai et al (2004) Leuk. Off. J. Leuk. Soc, Am. Leuk, Res. Fund. UK 18: 676-684) . Efectivamente, el fmc63 scFv se reemplazó con un CAT scFv, y se comparó con el CAR original basado en fmc63. Este CAR comprende un péptido señal, el scFv, un espaciador de tallo de CD8 y los endodominios transmembrana de 41BB y Zeta. Las secuencias de aminoácidos de CAT CAR y fmc63 CAR se proporcionan a continuación:
> CAT 19_CAR (Id. de Sec. n° 10) MGTSLLCWMALCLLGADHADAQVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAFSSSWM NWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDEDTNYSGKFKDKATLTADKSSTTAYMQLSSLTSED SAVYFCARSLLYGDYLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIM SASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPDRFSGSGS GTSYFLTINNMEAEDAATYYCQQWNINPLTFGAGTKLELKRSDPTTTPAPRPPTPAP TIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKR GRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQ GQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAE AYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
> Fmc63_CAR, según lo descrito por Imai et al (2004) como anteriormente (Id. de Sec. n° 42) METDTLLLWVLLLWVPGSTGDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQ
QKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTL
PYTFGGGTKLEITKAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLS VTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKS
QVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSDPTTTPAPRPP
TPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLY CKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKM AEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Las células T humanas primarias de 5 donantes diferentes se transdujeron con vectores lentivirales que codifican CAT19 CAR en formato Campana, o el propia Campana CAR fmc63. Estas células T se usaron luego en varios ensayos. El ensayo de liberación de cromo se realizó contra células SupTI. Estas células son CD19 negativas. Ninguna de las células T CAR respondió a esta línea celular, lo que demuestra que CAR19 CAR no tiene actividad destructiva inespecífica contra las células CD19 negativas. [Figura 5 (a)]. (b) El ensayo de liberación de cromo también se realizó contra células SupTI diseñadas para expresar CD19. Ambos CAR se desempeñaron de manera igual contra esta línea celular en este ensayo con altos niveles de destrucción [Figura 5 (b)]. A continuación, se realizó un ensayo de desgranulación mediante tinción para CD107 en la superficie de las células efectoras después del co-cultivo con células diana. En este caso, se utilizaron células T NT, células T CAR fmc63 o células T CAT19 CAR como efectores y se usaron células SupTI o SupT1.CD19 como dianas. El CD107 de superficie se detectó
mediante citometría de flujo que permitió la medición diferencial de la desgranulación de las células CD4+ y CD8+.
[Figura 5 (c) y (d) respectivamente]. La desgranulación se incrementó con las células T CAT19 CAR en comparación con las células T fmc63 CAR. La proliferación se estimó utilizando la incorporación de timidilato tritiado. Aquí, las células NT, células T Fmc63 CAR, células T CAT19 CAR se cultivaron conjuntamente con células SupT1 diseñadas para expresar CD19. También se analizó la incorporación de la timidina en este experimento, de un CAR irrelevante dirigido a GD2. Hubo una tendencia a una mayor proliferación con células T CAT19 CAR. [Figura 4 (e)]. A continuación, se midió mediante ELISA la liberación de interferón-gamma de células T NT, células T fmc63 CAR, células T CAT19 CAR o células T GD2 CAR 24 horas después de enfrentarlas contra células SupT1 o SupT1.CD19. Las células T CAR CAT19 produjeron significativamente menos interferón-gamma que las células T fmc63 CAR cuando se desafiaron con dianas CD19+.
Ejemplo 4 - Demostración de la eficacia in vivo de la terapia CAT19 CAR
Un esquema de configuración experimental para este modelo in vivo está presente en la figura 6 (a). Brevemente, los ratones NSG (NOD scid gamma, NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ) están lo suficientemente inmunodeprimidos que son permisivos para el injerto de líneas celulares humanas y células T primarias humanas. Las células Raji son una línea de células B derivada del linfoma de Burkitt. Estas células se injertan fácilmente dentro de la médula ósea de ratones NSG causando un síndrome agresivo similar al de la leucemia. Las células Raji fueron diseñadas para expresar la luciferasa de luciérnaga para permitir el seguimiento no invasivo utilizando imágenes de bioluminiscencia (BLI). A los ratones se les inyectaron 2.5x105 células Raji.FLuc mediante inyección en la vena de la cola. 24 horas más tarde, se administraron 4x106 de cualquiera de las células T primarias humanas NT, o las células T transducidas con fmc63CAR, o las células T transducidas con CAT19 CAR se administraron a través de la vena de la cola. La respuesta del tumor se midió secuencialmente mediante BLI. Se tomó una muestra de sangre de la vena de la cola el día 4 para el injerto y la citoquina sérica. Los animales se sacrificaron el día 11 y se estudiaron los tejidos para determinar la persistencia de las células T CAR y la carga tumoral. Las imágenes BLI de las diferentes cohortes de ratón en el día 10 se muestran en la figura 6 (b). Se observa una enfermedad extensa en la pelvis, la columna vertebral, las costillas, el cráneo y el bazo de ratones tratados con células T NT, mientras que la señal mínima es evidente en ratones que recibieron células T CAT19 CAR o células T fmc63 CAR. La señal bioluminiscente cuantitativa promediada de diferentes cohortes de ratón a lo largo del tiempo se muestra en una escala logarítmica en la figura 6 (c). Se observa una clara diferencia entre la acumulación de señales en los ratones que recibieron células T NT y en los ratones que recibieron células T CAR. No se observan diferencias en la acumulación de señales en ratones que recibieron células T fmc63 CAR o células CAT19 CAR. Finalmente, después del sacrificio, se realizó un análisis de citometría de flujo de la médula ósea de cada ratón para determinar directamente la carga tumoral. Las células Raji son fácilmente distinguibles de las células hematopoyéticas de ratón y de las células T transferidas de forma adoptiva, ya que expresan marcadores de células B humanas. Se pudieron detectar células Raji mínimas en la médula ósea de ratones que recibieron células T fmc63 o CAT19 CAR.
Ejemplo 5 - Caracterización de células T CAR persistentes in vivo
A partir de los modelos animales anteriores, los presentes inventores intentaron determinar si ambos tipos de células T CAR se injertaron dentro de la médula ósea y el bazo de estos ratones NSG. El análisis de citometría de flujo de médula ósea y bazo con cuentas de recuento permitió la determinación de números absolutos de células T CAR. Estos datos se muestran en las figuras 7 (a) y (b). Los números absolutos de células T CAR en bazos de ratones de animales tratados con células T fmc63 CAR o células T CAT19 CAR fueron similares. A continuación, los presentes inventores procedieron a determinar si había alguna diferencia en el número de células T agotadas en estos tejidos diferentes. Mediante co-tinción se pudo determinar el número de células T anteriores agotadas que expresan PD1 en las muestras. Estos datos se muestran en las figuras 7 (c) y (d). Sorprendentemente, menos células T agotadas estaban presentes en ambos compartimentos de tejido con el CAT19 CAR que con el fmc63 CAR.
Claims (15)
1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un dominio de unión a CD19 que comprende a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias:
CDR1 - GYAFSSS (Id. de Sec. n° 1);
CDR2 - YPGDED (Id. de Sec. n° 2)
CDR3 - SLLYGDYLDY (Id. de Sec. n° 3); y
b) una región variable de la cadena ligera (VL) que tiene CDR con las siguientes secuencias:
CDR1 - SASSSVSYMH (Id. de Sec. n° 4);
CDR2 - DTSKLAS (Id. de Sec. n° 5)
CDR3 - QQWNINPLT (Id. de Sec. n° 6).
2. Un CAR de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a CD19 comprende un dominio VH que tiene la secuencia mostrada como Id. de Sec. n° 7 y/o un dominio VL que tiene la secuencia mostrada como Id. de Sec. n° 8 o una variante de la misma que tiene al menos 95% de identidad de secuencia.
3. Un CAR de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el dominio de unión a CD19 comprende un scFv en la orientación VH-VL; preferiblemente en el que el dominio de unión a CD19 comprende la secuencia mostrada como Id. de Sec. n° 9 o una variante de la misma que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia.
4. Un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el dominio de unión a CD19 y el dominio transmembrana están conectados por un espaciador; opcionalmente, en el que el espaciador comprende uno de los siguientes: un dominio Fc de IgG1 humano; una bisagra IgG1; o un tallo de CD8.
5. Un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que también comprende un dominio de señalización de células T intracelular; opcionalmente, en el que el dominio de señalización de células T intracelular comprende uno o más de los siguientes endodominios: endodominio CD28; endodominio 41BB, endodominio OX40 y endodominio CD3-Zeta; preferiblemente en el que el dominio de señalización de células T intracelular comprende:
(i) el endodominio 41BB y el endodominio CD3-Zeta;
(ii) el endodominio OX40 y el endodominio CD3-Zeta; o
(iii) todos los siguientes endodominios: endodominio CD28; OX40 y CD3-Zeta.
6. Un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende la secuencia mostrada como cualquiera de las Id. de Sec. n° 10 a 15 o una variante de la misma que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia pero retiene la capacidad de i) unirse a CD19 y ii) inducir la señalización de células T.
7. Un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que, cuando se expresa por una célula T y se usa para localizar una célula que expresa CD19, causa una liberación menor de IFNy por la célula diana que expresa CD19 que la causada por una célula T que expresa un CAR que comprende un dominio de unión a CD19 que comprende
a) una región variable de cadena pesada (VH) que tiene regiones determinantes de complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias:
CDR1 - GVSLPDY (Id. de Sec. n° 16);
CDR2 - WGSET (Id. de Sec. n° 17);
CDR3 - HYYYGGSYAMDY (Id. de Sec. n° 18); y
b) una región variable (VL) de la cadena ligera que tiene una CDR con las siguientes secuencias:
CDR1 - RASQDISKYLN (Id. de Sec. n° 19);
CDR2 - HTSRLHS (Id. de Sec. n° 20)
CDR3 - QQGNTLPYT (Id. de Sec. n° 21).
8. Un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que las CDR están injertadas en un armazón humano o humanizado.
9. Una secuencia de ácido nucleico que codifica un CAR de acuerdo con cualquier reivindicación precedente.
10. Un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9.
11. Una célula que comprende un CAR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8; preferiblemente en el que la célula es una célula T o una célula asesina natural (NK).
12. Una composición celular que comprende una pluralidad de células de acuerdo con la reivindicación 11.
13. Un método para fabricar (i) una célula de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende la etapa de transducir o transfectar una célula con un vector de acuerdo con la reivindicación 10; o (ii) una composición celular de acuerdo con la reivindicación 12 que comprende la etapa de transducir o transfectar una muestra de células de un sujeto ex vivo con un vector de acuerdo con la reivindicación 10.
14. Una composición farmacéutica que comprende una célula de acuerdo con la reivindicación 11, o una composición celular de acuerdo con la reivindicación 12, junto con un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. Una célula de acuerdo con la reivindicación 11, una composición celular de acuerdo con la reivindicación 12 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 para uso en el tratamiento del cáncer, preferiblemente en la que el cáncer es una neoplasia maligna de células B.
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